KR101037566B1 - 감쇠된 그람 음성 박테리아 - Google Patents

감쇠된 그람 음성 박테리아 Download PDF

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Abstract

개시 및 청구된 것은 그람 음성 박테리아의 돌연변이체로; 상기 박테리아는 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하며; 상기 돌연변이는 박테리아의 발병력을 감쇠시킨다. 상기 돌연변이체를 함유하는 면역원성 조성물 및 백신이 또한 개시 및 청구된다.

Description

감쇠된 그람 음성 박테리아{ATTENUATED GRAM NEGATIVE BACTERIA}
관련 출원/참고문헌으로 포함되는 것
본 출원은, 참고문헌으로 본원에 포함되는, 2002 년 4 월 5 일에 출원된 US 가출원 시리즈 제 60/370,282 호를 우선권으로 청구한다. 상기 출원, 및 그에 인용되거나 또는 그의 기소 중인 모든 문헌들 ("출원 인용 문헌") 및 출원 인용 문헌에서 인용 및 참고된 모든 문헌, 및 본원에 인용된 모든 문헌들 ("본원 인용 문헌"), 및 본원 인용 문헌에 인용 또는 참조된 모든 문헌들은 본원에 업급되는 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 지시사항, 설명, 제품 사양 및 제품 시트지 또는 본원에 인용되어 포함되는 임의의 문헌에 기재된 것과 함께 본원에 참고문헌으로 포함되며, 본 발명의 실시에 있어 이용될 수 있다.
본 발명은 살아있는 감쇠된 그람 음성 박테리아에 관한 것이다. 감쇠된 그람 음성 박테리아는 면역원성 조성물 또는, 예컨대 박테리아 감염을 방지할 뿐 아니라 연구에서의 백신 조성물에서 연구자 및 접촉할 수 있는 대상체 (예를 들어, 동물, 인간) 에 대한 더 높은 안전성이 있는 감쇠된 균주로서 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 그람 음성 박테리아; 예를 들어 살아있는 감쇠된 그람 음성 박테리아를 함유하는 면역원 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 박테리아는 또한 조성물에서 불활성화될 수 있으나; 이는 박테리아가 살아있는 감쇠된 그람 음성 박테리아인 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 상기 조성물을 제조 및/또는 제형화하는 방법에 관한 것이다; 예를 들어 적합한 배지 상에서 또는 내에서 박테리아를 배양 또는 성장 또는 증식시키고, 상기 박테리아를 수합하고, 임의로는 상기 박테리아를 불활성화시키며, 수의학적으로 또는 약제학적으로 허용되는 적합한 담체, 부형제, 희석제 또는 비히클 및/또는 아쥬반트 및/또는 안정화제와 혼합하거나; 또는 상기 박테리아를 수의학적으로 또는 약제학적으로 허용되는 적합한 담체, 부형제, 희석제 또는 비히클 및/또는 아쥬반트 및/또는 안정화제와 혼합한다. 그러므로, 본 발명은 또한 이러한 조성물의 제형화에서의 박테리아의 용도에 관한 것이다.
감쇠된 박테리아는 또한, 핵산 분자 이종체, 예를 들어, 감쇠된 박테리아 이외의 병원과 같은 병원성 제제 유래의 면역원, 항원 또는 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 감쇠된 박테리아로 복제 및/또는 발현시키기 위한 발현 또는 복제 벡터로서 작용할 수 있다. 벡터로서 감쇠된 박테리아를 사용하는 것은, 감쇠된 박테리아로 작업하는 연구자 또는 기술자 및 이들과 접촉할 수 있는 대상체 (예를 들어, 동물, 인간) 에게 더 큰 안전도를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 벡터를 제조하는 방법, 예를 들어 박테리아가 이종성 핵산 분자를 포함 및 임의로는 발현하도록 박테리아를 형질전환하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 발현에 적합한 조건 하에 유전자 생성물을 코딩하는 이종성 핵산 분자를 포함 및 발현하도록 형질전환된 박테리아를 배양, 성장 또는 증식시키 고, 임의로는 유전자 생성물을 수합 또는 단리 또는 분리하거나; 또는 이를 발현하도록 형질전환된 박테리아로부터 유전자 생성물을 수합 또는 단리 또는 분리하는 것을 포함하는, 유전자 생성물, 예를 들어 박테리아에 대한 면역원, 에피토프 또는 항원, 이종체와 같은 폴리펩티드를 생산하는 방법; 또는, 예를 들어, 병원 및/또는 박테리아에 의해 감염되기 쉬운 동물, 예를 들어, 소 또는 칠면조와 같은 동물에게 유전자 생성물을 발현하도록 형질전환한 박테리아를 투여하는 것을 포함하는, 유전자 생성물이 유래되거나 또는 수득되는 병원 및/또는 박테리아에 대한 보호적인 면역 응답성 또는 유전자 생성물 및/또는 박테리아에 대한 면역학적 응답성을 도출하는 방법; 또는 벡터 또는 형질전환된 박테리아를 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 비히클 또는 부형제 및/또는 아쥬반트 및/또는 안정화제와 혼합하는 것을 포함하는 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 박테리아의 감쇠를 위한 표적, 예를 들어 박테리아의 감쇠를 위한 표적을 코딩하는 돌연변이화된 뉴클레오티드 서열 또는 유전자, 및 박테리아의 감쇠를 위해 폴리펩티드를 표적화하는 방법 및 감쇠된 박테리아를 생성하는 방법에 관한 것이다. 감쇠에 대한 표적은 예를 들어 면역원성 조성물에서 또는 백신 조성물에서 면역원성 화합물로서, 또는 면역원성 또는 백신 조성물에서의 사용을 위한 에피토프의 생성을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 조성물 중, 예를 들어, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클 및/또는 아쥬반트 및/또는 안정화제와 혼합한 조성물의 제조에서 감쇠를 위한 표적의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 대상체 (예를 들어, 동물) 에 파스튜렐라 (Pasteurella) 와 같은 그람 음성 박테리아에 의해 감염되기 쉬운 동물, 예컨대 칠면조 또는 소에서 면역학적 또는 면역원성 또는 보호적 면역 응답성을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 동물에서 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 상기 감쇠된 박테리아, 예를 들어, 파스튜렐라(Pasteurella) 와 같은 그람 음성 박테리아의 제조에 관한 것으로; 예를 들어, 하나 이상의 트랜스포존성 구성원 (transposable element) 을 박테리아에 도입하고 표적 종에서 치사 (mortality) 를 초래하지 않는 (따라서 감쇠되는) 트랜스포존성 구성원을 포함하는 박테리아를 단리하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 임의로는 박테리아에서 돌연변이체를 동정함으로써 감쇠된 박테리아 제조를 위한 대안적인 수단을 수득할 수도 있다.
본 발명은 또한 감쇠된 박테리아 제조를 위한 상기 대안적인 수단에 관한 것이다. 돌연변이체는 동정 또는 특징화되므로, 돌연변이체는 하나 이상의 트랜스포존성 구성원을 박테리아로 도입하는 기술, 예컨대 동종 재조합법, 예를 들어 박테리아 게놈의 일부가 최소한 그곳에 추가되거나 (삽입) 또는 그로부터 결실되거나 (2 회 이상의 부가 및/또는 결실이 또한 포함된다) 또는 치환되도록 하는 (예컨대 또다른 것에 의한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환) 동종 재조합으로 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명은 공지되거나 또는 선행기술에서 동정된 개질 또는 돌연변이, 예를 들어 본원에서 동정된 개질 또는 돌연변이를 포함하는 감쇠된 박테리아의 제조 방법으로서, 유리하게는 재조합을 통해 결실 또는 삽입 또는 치환을 박테리아 게놈에 도입하고, 임의로는 개질 또는 돌연변이를 포함하는 박테리아를 동정 및/또는 단리하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 추가로 그람 음성 박테리아의 돌연변이체에 관한 것으로서, 상기 박테리아가 서열 번호: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 로 동정된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드의 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 가지며; 상기 돌연변이가 박테리아의 발병력을 감쇠시키게 되는 돌연변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 상기 박테리아와 관련된 용도, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
살아있는 감쇠된 미생물이 매우 유효한 백신이 될 수 있다는 것은 잘 확립되어 있다; 상기 백신에 의해 유도되는 면역 응답성은 종종 비복제성 면역원에 의해 생산되는 것보다 더 큰 규모이며 더 긴 지속 기간이 있다. 상기에 관해서는, 살아있는 감쇠된 균주가 숙주 내에서 제한된 감염을 확립하고 자연적인 감염의 조기 단계를 모방한다는 한 가지 설명이 가능하다. 또한, 멸균되거나 또는 불활성화된 제제와는 달리, 생백신은 마크로파지와 같은 항원-제시 세포를 복제하는 이들의 능 력과 연계될 수 있는 강력한 세포-매개 응답성을 유도할 수 있다.
특히 화학 돌연변이유발 기술을 이용한, 동물 및 인간에서의 살아있는 감쇠된 백신의 이용의 긴 역사가 있다. 그러나, 경험에 의하면 감쇠된 백신은 발병력으로 변환될 수 있다.
박테리아 병리학의 지식 증가와 더불어 현대 분자생물학 기술은 생체내 미생물의 성장 및 생존에 수반되는 각종 유전자의 동정을 유도해왔다. 이는 감쇠를 위한 신규한 유전자 표적 및 장래 백신 균주가 발병력에 수반되는 것으로 공지된 선택된 유전자에 정해진 비-변환 돌연변이를 도입함으로써 '분별있게' 감쇠될 수 있다는 개념을 제공했으며, 예로써 참고 문헌은 다음과 같다: WO-A-00/61724, WO-A-00/68261 및 EP-A-0889120.
다수의 감쇠된 균주가 실험실에서 생산되었으나, 단지 일부만이 동물용의 잠재적인 백신 후보물질로 자격이 있다. 이는, 부분적으로는 백신의 면역원성과 반응성 및 병원성으로 되는 미생물의 변환 능력을 균형짓기 위한 필요성에 기인할 것이다.
적합한 백신 후보물질을 제공할, 감쇠에 적합한 유전자의 선별은 간단하지 않으며 쉽게 예측할 수 없다. 다수의 인자들이 백신으로서의 감쇠된 돌연변이체의 접근성에 영향을 줄 수 있으며, 결과적으로는 적합한 감쇠 유전자를 동정 및 선별하기 위해서는 연구 노력이 필요하다. 다수의 감쇠 실험이 시험관 내에서만 수행되었고, 이들의 결과는 생체 내에서 특히 백신접종된 동물에 대한 수득되는 돌연변이의 잔류하는 병원성과 연관해서는 추정될 수 없다.
참고 문헌은 하기와 같다:
Figure 112004045212417-pct00001
Kachlany 의 문헌은 Tad 유전자에 관한 것이다. Kachlany 의 문헌에서 돌연변이화된 Tad 유전자와 감쇠 사이에는 관련성이 없다. Kachlany 의 문헌에서는 동물에 대한 실험이 없고, Tad 유전자는 본 발명에서 선별되지 않는다. Fuller 의 논문은 본 발명에서 선별되지 않는 서열에 관한 것이다. Kehrenberg 는 감쇠된 돌연변이체, 또는 Signature Tagged Mutagenesis 또는 STM 기술에 대한 것이 아니고; 오히려, Kehrenberg 의 문헌은 트랜스포존 (transposon) 의 지시 삽입 (동일한 삽입 구성원의 이용) 에 관한 것이다. DeAngelis 1998a 에서는 STM 기술에 대한 일반적인 서술만을 제공할 뿐, 돌연변이체에 대한 것은 없다. DeAngelis 1998b 은 트랜스포존을 HA 생합성 부위 (HA biosynthesis locus; Genbank AF036004) 로 삽입하는 STM 기술의 이용에 관한 것이다. 상기 서열은 PM70 의 서열 Pm0775 에 대한 동종체이다. Pm0775 을 코딩하는 서열은 본 발명에서는 선별되지 않는다. Lee 의 문헌은 Tn10 트랜스포존을 이용한 STM 기술의 용도에 관한 것이다; Lee 는 동물에 대한 임의의 시험 또는 감쇠된 돌연변이체에 대한 임의의 연구를 개시 또는 제안하지 못했다; 오히려, Lee 의 문헌은 자가영양성 돌연변이체에 관한 것이다. Choi 의 문헌에서는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 트랜스포존 삽입 돌연변이체를 언급하는데, 상기 돌연변이체에 의해 유도되는 치사는 없는 것으로 추측되며, Choi 의 문헌은 트랜스포존 삽입의 위치에 대한 설명이 포함되어 있지 않아서, 재생산가능한 것으로 언급될 수 없다. Nnalue 의 문헌은 유사하게 즉제의 발명을 교시 또는 제안하지 못했다. Stocker 의 특허는 Tn10 트랜스포존을 aroA 유전자에 삽입하는 것에 관한 것이다. AroA 유전자는 본 발명에서 선별되지 않는다. Highlander 의 문헌은 Tn1545 트랜스포존을 lktC 유전자로 삽입하여 류코톡신을 불활성화시키는 것에 관한 것이다. LktC 유전자는 본 발명에서 선별되지 않는다. 따라서, 즉제의 발명이 당업계에 교시 또는 제안된 것으로 여겨지지 않는다.
더욱이, 감쇠에 수반되는 유전자 또는 핵산 서열을 특징화하여, 이를 근거로 감쇠된 박테리아 뿐만 아니라 감쇠된 백신 또는 면역원성 조성물, 예컨대 높은 수준의 면역원성을 가지면서 부작용이 제한되거나 또는 없는 우수한 안전성을 나타내는 것을 개발하는 것이 요망된다.
발명의 개요
본 발명은 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 제 1 뉴클레오티드 서열에 돌연변이가 있어 감쇠된 발병력을 가진 박테리아를 제공하는 그람 음성 박테리아의 돌연변이체로서:
제 1 폴리펩티드가 아미노산 서열을 가지며;
제 2 폴리펩티드가 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 으로 식별되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지며;
제 1 폴리펩티드의 아미노산 서열이 제 2 폴리펩티드의 것과 동일하거나, 또는 제 1 폴리펩티드의 아미노산 서열이 제 2 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 같는 돌연변이 를 제공한다.
돌연변이체 박테리아는 파스튜렐라세애 (Pasteurellaceae) 일 수 있으며, 예를 들어 상기 박테리아는 파스튜렐라세애 멀토시다, 파스튜렐라세애 해몰리티카, 파스튜렐라세애 아나티페스티페르 또는 악티노바실러스 플레우로뉴모니애일 수 있으며; 유리하게는 파스튜렐라 멀토시다이다.
돌연변이는 제 1 뉴클레오티드 서열에서의 결실, 또는 그곳으로의 삽입이거나 또는 핵산의 치환, 예컨대 전체 제 1 뉴클레오티드 서열의 결실이거나; 또는 서열 번호 2 에서 뉴클레오티드 180-181 또는 뉴클레오티드 182-183 또는 뉴클레오티드 190-191, 서열 번호 6 에서 뉴클레오티드 77-78 또는 뉴클레오티드 1026-1027 또는 뉴클레오티드 1027-1028, 서열 번호 9 에서 뉴클레오티드 416-417, 서열 번호 12 에서 뉴클레오티드 389-390, 서열 번호 16 에서 뉴클레오티드 381-382, 서열 번호 19 에서 뉴클레오티드 219-220, 서열 번호 22 에서 뉴클레오티드 1353-1354, 서열 번호 25 에서 뉴클레오티드 136-137, 서열 번호 28 에서 뉴클레오티드 384-385, 서열 번호 31 에서 뉴클레오티드 222-223 또는 뉴클레오티드 225-226, 서열 번호 34 에서 뉴클레오티드 217-218, 서열 번호 37 에서 뉴클레오티드 1411-1412, 서열 번호 40 에서 뉴클레오티드 943-944, 서열 번호 43 에서 뉴클레오티드 855-856, 서열 번호 46 에서 뉴클레오티드 369-370, 서열 번호 49 에서 뉴클레오티드 111-112, 서열 번호 52 에서 뉴클레오티드 443-444, 서열 번호 55 에서 뉴클레오티드 4-5, 서열 번호 61 에서 뉴클레오티드 573-574, 서열 번호 64 에서 뉴클레오티드 875-876, 서열 번호 70 에서 뉴클레오티드 218-219, 서열 번호 75 에서 뉴클레오티드 1072-1087, 서열 번호 78 에서 뉴클레오티드 64-65, 서열 번호 81 에서 뉴클레오티드 282-283, 서열 번호 84 에서 뉴클레오티드 1431-1432, 서열 번호 87 에서 뉴클레오티드 974-975, 서열 번호 90 에서 뉴클레오티드 802-803, 서열 번호 92 에서 뉴클레오티드 850-851; 또는 서열 번호 58 에서 바로 상류 뉴클레오티드 1; 또는 서열 번호: 67 에서 바로 상류 뉴클레오티드 1 사이의 삽입일 수 있다.
돌연변이체는 이종성 핵산 서열, 예컨대 발병력 바이러스, 기생체 또는 박테리아 제제 유래의 면역원, 치료용 단백질, 알레르겐 (allergen), 성장 인자 또는 싸이토카인을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 돌연변이체 및 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 함유하며, 임의로는 아쥬반트를 추가로 함유하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 특정 아미노산 서열을 가진 단리된 제 1 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서:
제 2 폴리펩티드는 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산 서열을 가지며;
제 1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 제 2 폴리펩티드의 것과 동일하거나 또는 제 1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 제 2 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
본 발명은 단리된 제 1 폴리펩티드, 및 약제학적으로 또는 수의학적으로 허 용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제, 및 임의로는 아쥬반트를 함유하는 면역원성 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 단리된 제 1 폴리펩티드에 특이적인 항체를 포함하는 항체 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 샘플 중에서 단리된 제 1 폴리펩티드 또는 단리된 상기 제 1 폴리펩티드에 특이적인 항체를 검출하는 것을 포함하는, 그람 음성 박테리아에 의한 감염을 검출하는 진단법을 포함한다.
본 발명은 추가로 상기 항체 제제를 투여하는 것을 포함하는 수동 면역화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 로 식별되거나, 또는 서열 번호 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 또는 97 로 식별되는 서열을 가진 단리된 핵산 분자 뿐만 아니라, 서열 번호: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 로 식별되거나, 또는 서열 번호: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 또는 97 로 식별되는 뉴클레오티드 서열의 10 개 이상 연속된 핵산인 서열을 가진 단리된 핵산 분자를 포함하는 그람 음성 박테리아를 검출하기 위한 PCR 프라이머를 제공한다. 프로브 또는 프라이머는, 증폭하기 원하는 서열에 대해 특이적이거나 또는 증폭하기 원하는 서열 내에 있고, 적어도 보존성인, 예를 들어 그람 음성 박테리아 사이에서 또는 그람 음성 박테리아의 특별한 패밀리 사이에서 또는 종 사이에서, 예컨대 파스튜렐라 (Pasteurella) 중에서, 또는 파스튜렐라 멀토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 파스튜렐라 아나티페스티페르 또는 악티노바실러스 플레우로뉴모니애 중에서; 유리하게는 파스튜렐라 멀토시다 중에서 보존성인, 8 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 더욱 바람직하게는, 12, 13, 14 또는 15 개 이상, 예컨대 20 개 이상, 예를 들어 23 또는 25 개 이상, 예를 들어 27 또는 30 개 이상의 뉴클레오티드의 임의의 스트렛치일 수 있다. PCR 또는 혼성화 프라이머 또는 프로브에 있어서 최적에 길이에 관하서는 문헌 [Kajimura 등, GATA 7(4):71-79 (1990)] 을 참조한다.
용어 "면역원성 조성물" 및 "면역학적 조성물" 및 "면역원성 또는 면역학적 조성물" 은 표적 병원에 대한 면역 응답성, 예를 들어, 동물 (예컨대 조류, 예를 들어, 칠면조 또는 소, 예를 들어 젖소) 에 투여 또는 주사한 후, 표적 병원 (예를 들어, 파스튜렐라 멀토시다) 에 대한 면역 응답성을 유도하는 임의의 조성물을 총괄한다. 용어 "백신성 조성물" 및 "백신" 및 "백신 조성물" 은 표적 병원에 대한 보호적인 면역 응답성을 유도하거나 또는 병원에 대항하여 효능적으로 보호하는, 예를 들어 동물 (예컨대 조류, 예를 들어, 칠면조 또는 소, 예를 들어 젖소) 에 투여 또는 주사한 후, 표적 병원에 대한 보호적인 면역 응답성을 유도하거나 또는 병원 (예를 들어, 파스튜렐라 멀토시다) 에 대한 효능적인 보호를 제공하는 임의의 조성물을 총괄한다. 병원의 서브유닛은 병원, 예를 들어 파스튜렐라 멀토시다와 같은 박테리아로부터 단리된 항원 또는 면역원 또는 에피토프의 서브유닛; 및 서브유닛 조성물은 명원, 예를 들어 그람 음성 박테리아, 예를 들어 파스튜렐라 멀토시다와 같은 박테리아로부터 단리된 하나 이상의 항원, 면역원 또는 에피토프를 함유하거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
본 발명에서 사용되는 "포함하다 (comprise)", "포함된", "포함하는" 등의 용어는 US 특허법에서 이에 부여하는 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "포함하다 (include)", "포함된", "포함하는" 등의 의미를 가질 수 있고; "본질적으로 ~ 로 이루어지다" 및 "본질적으로 ~ 로 이루어지는" 과 같은 용어는 US 특허법에 제시된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어 이들은 요소들이 명백하게 인용되도록 하고 있진 않지만, 발명의 기본적으로 신규한 특성에 영향을 미치는 선행기술에서 발견되는 요소들은 배제한다는 점에 주의해야 한다.
상기 및 기타 구현예들은 하기의 상세한 설명으로 개시되거나 또는 이로부터 명백해지며 이로부터 설명된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 예를 들어 그람 음성 박테리아 (예를 들어, 파스튜렐라 멀토시다)와 같은 박테리아인 미생물의 감쇠, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 생성물 (예를 들어 단백질, 항원, 면역원, 에피토프), 그러한 뉴클레오티드 서열, 생성물, 미생물의 제조 방법, 및 예를 들어 발현 벡터와 같은 벡터 (예를 들어 시험관 내 또는 생체 내 발현 벡터) 또는 면역원성 또는 면역 반응 유도를 위한 백신 또는 면 역원성 조성물 제조와 같은 그들의 용도를 제공한다.
미생물의 뉴클레오티드 서열 및 유전자에 도입된 돌연변이는, 신규하고 진보한 감쇠 돌연변이체를 생성한다. 이들 돌연변이체는, 높은 면역원성 정도를 가지는 살아 있는 감쇠 백신 또는 살아 있는 감쇠된 면역원성 조성물의 제조에 유용하다.
이들 돌연변이체는, 발현 생성물의 시험관 내 발현 및, 뉴클레오티드 서열의 복제 (예를 들어, DNA 의 복제) 또는 재생성, 그리고 생체 내 발현 생성물에 유용할 수 있는, 벡터로서 또한 유용하다.
돌연변이의 동정은, 신규하며 진보성있는 뉴클레오티드 서열 및 유전자와, 뉴클레오티드 서열 및 유전자에 의해 코딩된 신규하며 진보성 있는 유전자 생성물을 제공한다.
그러한 유전자 생성물은, 항원, 면역원 및 에피토프를 제공하며, 분리된 유전자 생성물로 유용하다.
그러한 분리된 유전자 생성물 및 그들의 에피토프는, 항체 생성에 유용하며 진단 적용에 유용하다.
에피토프, 항원 또는 면역원을 제공 또는 생성 가능한 그러한 유전자 생성물은, 백신으로 뿐만 아니라, 면역원 또는 면역 조성물로 또한 유용하다.
한 국면에서, 본 발명은, 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 중에 감쇠 돌연변이를 함유하는 박테리아를 제공하며, 여기에서 돌연변이는, 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성 및/또는 발현을 감소 또는 제거함으로 써, 박테리아의 독성을 감소시킨다.
돌연변이는 그 기능을 방해하여 감쇠에 이르게하는 코딩 서열 또는 유전자 내에 반드시 위치할 필요는 없다. 돌연변이는, 예를 들어, 전사 개시, 번역 및 전사 종결을 조절하는 영역 내에서 유전자 발현의 조절에 관계된 뉴클레오티드 서열에서 또한 만들어질 수 있다. 따라서, 또한 포함되는 것으로는, 프로모터 및 리보솜 결합 영역 (보통 이들 조절 구성원은, 코딩 서열 또는 유전자의 개시 코돈의 약 60-250 뉴클레오티드 상류에 존재한다; Doree S M 등, J.Bacteriol. 2001, 183(6): 1983-9 ; Pandher K 등, Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9 ; Chung J Y 등, FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296), 전사 종결자 (보통 종결자는, 코딩 서열 또는 유전자의 종결 코돈의 약 50 뉴클레오티드 하류 내에 존재한다; Ward C K 등, Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36)가 있다. 오페론의 경우, 그러한 조절 영역은 코딩 서열 또는 유전자의 상류의 더 먼 곳에 존재 가능하다. 유전자간 영역에서의 돌연변이 또한 감쇠에 이르게 할 수 있다.
코딩 서열 또는 유전자와 관련된 그러한 조절 서열내의 돌연변이는, 이러한 뉴클레오티드 서열의 돌연변이가 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드의 생활성 및/또는 발현을 변형, 억제 또는 제거하여, 감쇠되는 박테리아의 독성을 초래하며, 본 발명에서 동정된 코딩 서열 또는 유전자 내의 돌연변이와 균등하게 된다.
감쇠는, 박테리아의 병원성을 감소 또는 제거하고, 임상 증후 또는 상처의 정도를 감소 또는 제거하며, 박테리아의 성장 속도를 감소시키고, 박테리아에 의한 사망을 방지한다.
본 발명은 예를 들어 파스튜렐라 멀토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 파스튜렐라세애 아나티페스티페르 악티노바실러스 플레우로뉴모니애와 같은 파스튜렐라 (Pasteurella) 패밀리 박테리아와 같은 그람 음성 박테리아인 박테리아와 같은 미생물에 관한 것이다. 유리하게 박테리아는 파스튜렐라 멀토시다이다.
파스튜렐라 멀토시다는 그람 음성 박테리아로, 이는 생산성 동물의 각종 질병 원인제 및 기회성 인간 병원체이다. 이는 가금 및 야생 조류의 조류 콜레라, 소 출혈성 패혈증 및 돼지 위축성 비염과 같은 심한 파스퇴렐라증의 병인제이다 (Hunt ML 등, Vet Microbiol 2000, 72(1-2): 3-25). 분리물은, 캡슐 항원에 따라 혈청학적으로 혈청군 (A, B, D, E 및 F)으로 분류 또는 신체 LPS 항원에 따라 16 개의 혈청타입으로 분류 가능하다.
박테리아의 감쇠 관련 잠재적 뉴클레오티드 서열은, Signature Tagged Mutagenesis (STM)에 의해 동정되었다. 이 방법은, 여기에 언급된 문헌에 논의된 것으로, 또한 WO-A-96/17951을 언급할 수 있다.
STM은, 미생물의 게놈으로의, 고유하며, 사인 태깅된 트랜스포존의 삽입과 관련된다.
삽입 부위에서, 게놈 뉴클레오티드 서열은 파괴된다. 본 발명에서, 수득하는 돌연변이 (따라서 돌연변이를 가지는 돌연변이체)를 감쇠에 대해 분석한다.
감쇠된 각 돌연변이체에 대한 파괴된 영역의 서열 (즉, 유전자 또는 코딩 서열 또는 오픈 리딩 프레임 (ORF))은 PCR 증폭 (폴리머라아제 연쇄 반응), 트랜스포존 가장 자리 DNA 영역의 클로닝 및 서열 분석에 의해 결정한다.
본 발명의 구현에서, WO-A-96/17951에 언급된 STM 방법은 파스튜렐라 멀토시다에서 기능성이 되도록 적응화된다. 이들 적응은, Tn5 대신 Tn10 트랜스포존의 사용 및, 스트렙토마이신 내성 선별 대신 류신 결핍 CDM 매질의 선별을 사용하는 것을 특징적으로 포함한다. 더 자세한 것은 실시예에 언급한다.
STM 방법에 의해 동정된 잠재적 유전자에서 감쇠 관련 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 추가로 선별하는 것은, 동물에게 돌연변이 박테리아를 주사한 후 치사가 발생하지 않는 것을 근거로 하는 것이다.
수의학적 적용에서, 본 발명의 한 유리한 면은, 동물 모델에서가 아니라 목표 동물 내에서 직접 실험 선별하는 것을 시행함을 포함한다. 본 방법은, 돌연변이 박테리아의 적절한 돌연변이에 대한 보다 정확한 선별을 가능하게 한다. 파스튜렐라 멀토시다에서, 실험은 파스튜렐라 멀토시다의 자연 목표 숙주의 하나인 칠면조에 대해 직접 실행한다.
칠면조에게, 사인-태깅된 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) 돌연변이체의 충분 공급량을 근육내 주사한다 (즉, 0.5 ml, 동물 한 마리당 107 CFU). 주사 이후 특정 시점에서 재분리되지 않은 돌연변이체는 잠재적으로 감쇠된 것으로 간주한다. 재분리되지 않은 돌연변이체는, PCR 증폭 및 사인 태그 분석에 의해 재분리된 집합 (pool) 의 것과 구분된다.
각각의 잠재 감쇠된 돌연변이체는 이후 근육내 경로를 통해 칠면조에 주사한 다 (즉, 0.5 ml, 동물 한 마리당 104 CFU). 칠면조의 치사율을 주사 이후 7일 동한 매일 기록한다. 살아남은 칠면조는 감쇠된 것으로 간주한다.
특정 방법을 파스튜렐라 멀토시다 균주 P-1059 상에서 수행하여 다수의 감쇠된 돌연변이체를 수득했다. 이들 중 다섯 가지는 Pasteur Institute (파리, 프랑스)의 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 2003 년 4 월 1 일자로 기탁된 것이다. 4G11 돌연변이체는 기탁번호 CNCM I-2999로 입수가능하다. 5D5 돌연변이체는 기탁번호 CNCM I-3000으로 입수가능하다. 9C8 돌연변이체는 기탁번호 CNCM I-3001로 입수가능하다. 9H4 돌연변이체는 기탁번호 CNCM I-3002로 입수가능하다. 13E1 돌연변이체는 기탁번호 CNCM I-3003으로 입수가능하다.
트랜스포존 삽입 부위 가장 자리의 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97로 지정된다.
트랜스포존은, 파스튜렐라 멀토시다 균주 P-1059에서 서열 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 및 97의 5' 말단에 바로 삽입되며, 서열 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 및 96의 3' 말단에 바로 삽입된다. 돌연변이체 9H4에서, 트랜스포존은, 서열 번호: 92 서열의 850-851 위치의 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
본 발명의 특징적인 면은, 서열 서열 번호: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96 및 97 에서 선택되는 서열을 포함하는 이들의 조절 영역 및/또는 유전자 또는 ORF 내의 감쇠된 돌연변이 함유 파스튜렐라 멀토시다 균주 P-1059의 감쇠된 돌연변이체이다.
추가의 본 발명의 특별한 구현예는, 부다페스트 조약 조항에 따라 CNCM에 기탁된 여기에 언급한 감쇠된 돌연변이체와 같은 본 발명에 따른 감쇠된 돌연변이체를 포함한다.
감쇠된 P-1059 돌연변이체는, 예를 들어, 트랜스포존 삽입 또는 직접 돌연변이 (결실, 삽입, 치환)에 의해 수득 가능하다. 감쇠 돌연변이는, 이들 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 내에서 또는, 이들의 상보 서열 내에서 만들어질 수 있다. 감쇠 돌연변이는 또한, 상기 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 조절 영역 관련 뉴클레오티드 서열 내에서 만들어질 수 있다.
상기 서열 또는 그 일부 (적어도 그의 10, 15 또는 20 뉴클레오티드로서, 예를 들어, 그의 적어도 연속 10개 뉴클레오티드 또는, 그의 적어도 연속 15개 뉴클레오티드 및 보다 유리하게는 그의 적어도 연속 20개 뉴클레오티드 내지 서열의 전장까지)는, 트랜스포존 삽입된 돌연변이체의 검출 및 선별을 위한 PCR 프라이머로 사용 가능하다. PCR 은, 한 쌍의 프라이머, 예를 들어 트랜스포존 특이성인 것과 돌연변이시킬 유전자 또는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 것을 수반한다. PCR 증폭 생성물의 기대 크기에 따라, 상기 방법은 PCR 단편의 증폭 및/또는 검출을 가능케한다. 해당 유전자 또는 ORF 및/또는 생물체 (예를 들어, 파스튜렐라 (Pasteurella) 와 같은 그람 음성 박테리아, 예컨대 파스튜렐라 멀토시다 균주 PM70 또는 P-1059 (참고로 하기를 참조)와 같은 파스튜렐라 멀토시다 내 이들의 조절 영역에 대한 지식; 예를 들어, 해당 유전자 또는 ORF 및/또는 그들 조절 영역의 크기는, PCR 프라이머 디자인, 증폭된 PCR 단편의 스크리닝 및, 돌연변이체의 선별을 가능하게 하는 올바른 크기의 단편 검출에 이용 가능하다.
파스튜렐라 멀토시다 균주 PM70의 전체 게놈은, EMBL 데이터베이스 및 문헌에서 얻을 수 있다 (May BJ 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98(6) 3460-5). 서열 번호: 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97 서열에 대한 블라스트는, PM70 게놈 상의 동종 서열을 찾아내어, PM70 내의 해당 유전자 또는 ORF를 측정 가능하게 한다.
파스튜렐라 멀토시다 균주 PM70 내의 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,64, 67, 7O, 75, 78, 81, 84, 87, 90 으로 정한다.
P-1059 균주의 9H4 돌연변이체에 대해서는, PM70에서 동종 서열이 발견되지 않았다. P-1059 ORF 는 서열분석되어 서열 번호 93 으로 표시된다.
본 발명의 다른 면은, 서열 번호: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87 및 90에서 선택되는 뉴클레오티드 서열 및/또는 그들의 조절 영역 함유 유전자 또는 ORF 내의 하나 이상의 감쇠 돌연변이를 가지는 PM70 주의 감쇠된 돌연변이체이다.
감쇠 돌연변이는, 이들 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 및 이들의 상보 서열 내에서 만들 수 있다. 감쇠 돌연변이는 또한, 상기 유전자의 조절 영역에 수반되는 뉴클레오티드 서열 내에서 만들어질 수 있다. 감쇠 돌연변이체는 예를 들어, 트랜스포존 삽입 또는 직접 돌연변이 (결실, 삽입, 치환)에 의해 수득 가능하다.
"상보성" 이라는 용어는 이중 가닥 게놈의 나머지 가닥의 뉴클레오티드 서열을 말하며 따라서, 센스 가닥에 상응하는 안티 센스 가닥을 포함하며, 역에 대해서도 성립하다. "뉴클레오티드" 라는 용어는 또한 디옥시리보뉴클레오티드 (디옥시리보핵산 또는 DNA로 된 것), 리보뉴클레오티드 (리보핵산 또는 RNA로 된 것) 및 메신저 리보뉴클레오티드 (mRNA)를 포함한다.
보다 일반적으로 감쇠 돌연변이는, 그람 음성 박테리아, 예를 들어 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida), 파스튜렐라 해몰리티카 (P. haemolytica), 파스튜렐라세애 아나티페스티페르 (P. anatipestifer) 악티노바실러스 플레우로뉴모니애 (A. pleuropneumoniae) 와 같은 파스튜렐라 (Pasteurella) 패밀리 박테리아와 같은 박테리아의 게놈 내로 도입되며, 유리하게는, 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) 의 다양한 주 중 임의의 게놈 내의 박테리아 (즉, P-1059 균주 및 PM70 균주)이고, 돌연변이는, 서열 번호: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 로 식별되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 하나에 대해 약 70% 이상 동일성, 약 75% 이상 동일성, 약 80% 이상 동일성, 약 85% 이상 동일성, 약 90% 이상 동일성, 유리하게는 약 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일성 또는 그 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 것이다. 감쇠 돌연변이는, 이들 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 및 이들의 상보 서열 내에서 만들 수 있다. 감쇠 돌연변이는 또한, 상기 유전자의 조절 영역 관련 뉴클레오티드 서열 내에서 만들어질 수 있다. 감쇠 돌연변이체는 예를 들어, 트랜스포존 삽입 또는 직접 돌연변이 (결실, 삽입, 치환)에 의해 수득 가능하다. 수득한 감쇠 돌연변이체는 본 발명의 구현예이다. 특별한 구현예는 P-1059 감쇠 돌연변이체이다.
두 아미노산 서열간의 동일성 백분율은 표준 파라미터 (즉, “National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD., USA) 서버 및 Altschul 등, J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410에서 입수할 수 있는 BLAST 또는 BLASTX 알고리즘을 주목; 이러한 문헌은 따라서 "블라스트 (blast)" 라는 용어로 알고리즘 또는 BLAST 또는 BLASTX 및 BLOSUM62 매트릭스의 사용을 언급한다) 를 사용한 NCBI(National Cancer for Biotechnology Information) Pairwise blast 및 blosum62 matrix로 확립할 수 있다.
본원에 사용된 동사 "코드”는 핵산 서열이 실제의 코딩 서열에만 국한되는 것을 의미하는 것은 아니며, 비-코딩 서열인 이의 조절서열을 포함하는 전체 유전자를 또한 포괄한다.
핵산 서열 상동성과 같은 서열 상동성 또는 동일성은 또한 NCBI에서도 이용할 수 있는 Myers 및 Miller의 "Align" 프로그램 ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, 본원에 참조로 도입됨), 및 NCBI 사이트와 같은 사이트 상에서 인터넷을 통해 사용할 수 있는 상기와 동일하거나 또는 기타 다른 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
대안 또는 부가적으로, 핵산 또는 아미노산 서열과 관련되어, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은, 예를 들면 두 서열간의 상동성의 양적 측정을 나타낼 수 있다. 서열 상동성 백분율은 다음과 같이 계산될 수 있다:
(N ref -N dif )*100/N ref , 여기에서 N dif 는 정렬된 경우 두 서열에서의 비동일한 잔기의 총수이며 N ref 는 서열 중 하나의 잔기의 갯수이다. 그러므로, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75%의 서열 동일성을 가질 것이다(N ref = 8; N dif = 2).
대안 또는 부가적으로, 서열과 관련되어 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 두개의 서열 중에 더 짧은 것의 핵산 또는 아미노산의 수로 나눈 동일한 핵산 또는 아미노산을 갖는 위치의 수를 언급할 수 있으며 여기에서 상기 두 서열의 정렬은, 예를 들면 윈도우크기 20개 핵산, 단어길이 4개 핵산, 및 갭(gap)페널티 4를 사용한 Wilbur 및 Lipman 알고리즘(Wilbur 및 Lipman, 1983 PNAS USA 80:726, 본원에 참조로 도입됨)에 따라 결정될 수 있으며, 정렬을 포함한 서열 데이터의 컴퓨터-보조 분석 및 해석은 시중에서 구입할 수 있는 프로그램(예를 들면, IntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc. CA)을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. RNA서열이 DNA서열과 유사한 것으로, 또는 어느 정도의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 것으로 언급되는 경우에, DNA 서열의 티미딘(T)은 RNA 서열의 우라실(U)과 같은 것으로 간주된다. 따라서, RNA 서열도 본 발명의 범위내이고 DNA 서열의 티미딘(T)이 RNA 서열의 우라실(U)과 같은 것으로 간주함으로써 DNA 서열로부터 유추될 수 있다.
유리하게는, 아미노산 서열 동일성 또는 상동성과 같은 서열 동일성 또는 상동성은 NCBI에서도 이용할 수 있는 BlastP 프로그램 (Altschul 등, Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402, 본원에 참조로 도입됨), 및 NCBI 사이트와 같은 사이트 상에서 인터넷을 통해 사용할 수 있는 상기와 동일하거나 또는 기타 다른 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
하기의 문헌(각각이 본원에 참조로 도입됨)은 두 단백질의 아미노산 잔기와 같은 서열의 상대적 동일성 또는 상동성 비교용 알고리즘을 제공하며, 앞서 기술한 것과 관련하여 대안 또는 부가적으로, 이들 참조문헌의 교시는 상동성 또는 동일성 백분율 결정에 사용될 수 있다 : Needleman SB 및 Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins", J. Mol. Biol. 48:444-453(1970); Smith TF 및 Waterman MS, "Comparison of Biosequences", Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981); Smith TF, Waterman MS 및 Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains", Nucleic Acid Res., 11:2205-2220(1983); Feng DF 및 Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic tree", J. of Molec. Evol., 25:351-360(1987); Higgins DG 및 Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer", CABIOS, 5:151-153(1989); Thompson JD, Higgins DG 및 Gibson TJ, "Cluster W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acid Res., 22:4673-480(1994); 및 Devereux J, Haeberlie P 및 Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX", Nucleic Acid Res., 12:387-395(1984). 그리고 불필요한 실험 없이도 당업자라면 상동성 백분율을 결정하기 위해 많은 다른 프로그램 또는 참조문헌을 참고할 수 있다.
본 발명은 동일한 생물학적 기능을 가지는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산서열 또는 유전자의 돌연변이에 관한것이다. 기능의 유사성은 활성 부위의 보존에 의해 분석 또는 규명 또는 결정 또는 검토될 수 있다. 이는 NCBI DART 연구(Domain Architecture Retrieval Tool)로 할 수 있다.
본 발명은 그러므로 본원에서 정의된 감쇠 돌연변이를 포함하는 본원에서 기술된 박테리아의 감쇠된 돌연변이체를 제공한다.
감쇠된 그람음성 박테리아 돌연변이체는 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기에서 하나 이상의 특정 유전자 또는 핵산 서열의 전부 또는 일부는 본원에서 논의된 대로 돌연변이 된다. 상기 특정 유전자 또는 핵산 서열은 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들의 조절영역을 포함하는 것 또는 이들에 상동성이 있는 (예를 들면, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성) 것을 포함한다. 유리하게는, 상기 특정 유전자 또 는 핵산 서열은 서열 번호 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들의 조절영역을 포함하는 것 또는 이들에 상동성이 있는 것을 포함한다. 더욱 유리하게는, 상기 특정 유전자 또는 핵산 서열은 서열 번호 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들의 조절영역을 포함하는 것 또는 이들에 상동성이 있는 것을 포함한다. 그리고 더욱 특히 유리하게는, 상기 특정 유전자 또는 핵산 서열은 서열 번호 37, 40, 75, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들의 상동 서열을 포함하는 것 또는 이들에 상동성이 있는 것을 포함한다. 바람직하게 상기 돌연변이체는 파스튜렐라(Pasteurella), 예컨대 파스튜렐라 멀토시다(P. multocida), 예를 들면 P-1059 또는 PM70이다.
돌연변이는 임의의 공지의 기술, 예컨대, 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 사용하여 선택된 유전자 또는 핵산 서열에 잘 정의된 돌연변이를 도입(유도 돌연변이화) 하기위해 미생물로 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이는 동종 또는 이종 핵산서열의 도입, 결실, 치환, 예를 들면, 하나 이상의 핵산을 다른 것으로 또는 이들의 조합에 의한 치환일 수 있다. 구현예에서, 상기 돌연변이는 결실 돌연변이로, 여기에서 상기 유전자 또는 핵산 서열의 손상 (disruption) 은 일부의 결실, 및 유리하게는 전체 핵산 서열 또는 유전자의 결실로 야기된다. 핵산의 결실은 병원성으로의 복귀는 피한다. 다른 구현예에서 상기 돌연변이는 본원, 예를 들면 실시예에서 기술된 트랜스포존 삽입 위치에 해당하는 위치로의 삽입이다. 이러한 위치들은, P-1059 균주를 참조로하여, 유리하게는 서열 번호 1, 8, 11, 14, 15, 27, 33, 42, 54, 57, 66, 72, 73, 77, 80, 95 및 97 의 서열의 바로 5' 말단 및 서열 번호 4, 5, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 45, 48, 51, 60, 63, 69, 83, 86, 89 및 96 의 서열의 바로 3' 말단에 위치한다. 이러한 위치들은 또한 PM70 주에서 하기의 서열 사이에 위치하는 것들이다: 서열 번호 2 의 뉴클레오티드 180-181 또는 182-183 또는 190-191, 서열 번호 6 의 뉴클레오티드 77-78 또는 1026-1027 또는 1027-1028, 서열 번호 9 의 뉴클레오티드 416-417, 서열 번호 12의 뉴클레오티드 389-390, 서열 번호 16 의 뉴클레오티드 381-382, 서열 번호 19의 뉴클레오티드 219-220, 서열 번호 22의 뉴클레오티드 1353-1354, 서열 번호 25의 뉴클레오티드 136-137, 서열 번호 28의 뉴클레오티드 384-385, 서열 번호 31의 뉴클레오티드 222-223 또는 225-226, 서열 번호 34의 뉴클레오티드 217-218, 서열 번호 37의 뉴클레오티드 1411-1412, 서열 번호 40의 뉴클레오티드 943-944, 서열 번호 43의 뉴클레오티드 855-856, 서열 번호 46의 뉴클레오티드 369-370, 서열 번호 49의 뉴클레오티드 111-112, 서열 번호 52의 뉴클레오티드 443-444, 서열 번호 55의 뉴클레오티드 4-5, 서열 번호 61의 뉴클레오티드 573-574, 서열 번호 64의 뉴클레오티드 875-876, 서열 번호 70의 뉴클레오티드 218-219, 서열 번호 75의 뉴클레오티드 1072-1087, 서열 번호 78의 뉴클레오티드 64-65, 서열 번호 81의 뉴클레오티드 282-283, 서열 번호 84의 뉴클레오티드 1431-1432, 서열 번호 87의 뉴클레오티드 974-975, 서열 번호 90의 뉴클레오티드 802-803, 서열 번호 92의 뉴클레오티드 850-851; 또는, 서열 번호 58의 뉴클레오티드 1 의 바로 상류; 또는 서열 번호 67의 뉴클레오티드 1 의 바로 상류. 이러한 위치들은 또한, 이의 상동성 백분율로 본원에서 정의된 상동 아 미노산 서열을 코딩하는 예컨대 파스튜렐라세아 (Pasteurellacaea) 패밀리의 일원, 예를 들면 파스튜렐라 멀토시다, 파스튜렐라 헤모리티카, P. 아나티페스티페르 (P. anatipestifer), A. 플루로뉴모니애(A. pleuropneumoniae)와 같은 다른 그람 음성 박테리아의 핵산 서열에서 유사한 서열 쌍(PM70에 대해 언급된 것 보다)간에 위치하는 것들이다. 따라서, 돌연변이체는 그람음성 박테리아이며 유리하게는 파스튜렐라, 예컨대 P. 멀토시다, P. 헤모리티카, P. 아나티페스티페르, A. 플루로뉴모니애, 예를 들면 P-1059 또는 PM70과 같은 P. 멀토시다일 수 있다.
정의에 의하면, 결실 돌연변이체는 본 발명에 따른 핵산서열에 또는 핵산서열의 하나 이상의 결실을 포함한다. 이러한 결실 돌연변이체는 특정 유전자 서열 또는 특정 핵산 서열의 전부 또는 일부가 결실된 것들을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 돌연변이는 유전자 또는 특정 핵산 서열의 적어도 하나의 핵산, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 결실을 초래한다. 바람직하게 전체 유전자 또는 특정 핵산서열이 결실된다.
돌연변이체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이는 부가적 또는 상승적 정도의 감쇠를 초래할 수 있으며, 감쇠의 복귀 예방에 더 좋을 수 있다.
이러한 다수 돌연변이는 예컨대 aro 유전자, 예를 들면 aroA (Homchampa P. 등, Veterinary Microbiology, 1994, 42:35-44)와 같은 이들의 감쇠 성질이 알려진 유전자 또는 핵산 서열로의 돌연변이 및 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 유전자로의 돌연변이를 연합할 수 있다.
하나의 구현예에서 돌연변이체는 두개 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기에서 각각의 돌연변이의 경우 특정 유전자 또는 핵산 서열의 전부 또는 일부가 본원에서 언급된 대로 돌연변이 된다. 이러한 특정 유전자 또는 핵산 서열은 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들에 상동성이 있는 것 또는 이들의 조절영역을 포함하는 것을 포함한다. 따라서, 두개 이상의 앞서 언급한 돌연변이된 서열, 예를 들면 본원에서 논의된 대로 결실된 돌연변이를 갖는 돌연변이체가 본 발명에 포괄된다. 유리하게는, 돌연변이체는 두개 이상의 하기의 서열 또는 예를 들면, 본원에서 논의된 대로 결실된, 하기의 돌연변이된 서열을 포함하거나 또는 이에 상동인 서열을 가진다: 서열 번호 2, 6, 9, 12, 25, 31, 37, 40, 43, 46, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들의 조절 영역. 더욱 유리하게는 돌연변이된 상기 특정 유전자 또는 핵산 서열(예를 들면, 돌연변이된 두개 이상)은 서열 번호 6, 12, 25, 31, 37, 40, 46, 70, 75, 84, 87, 90 또는 93 의 서열, 또는 이들의 조절영역을 포함하는 것 또는 이들에 상동인 것을 포함한다. 상기 돌연변이체는 그람음성 박테리아일 수 있으며, 유리하게는 상기 돌연변이체는 파스튜렐라, 예컨대 P. 멀토시다, 예를 들면 P-1059 또는 PM70이다.
유리하게는, 본원에서 논의된 대로 예를 들면 결실로 돌연변이된 두개 이상의 하기 서열, 또는 이들의 조절영역을 갖는 돌연변이체가 본 발명에 포함된다: 서열 번호 37, 40, 75, 90 및 93, 또는 이들의 상동 핵산서열.
다양한 구현예는 서열 서열 번호 37 및 40; 서열 번호 37 및 75; 서열 번호 37 및 90; 서열 번호 37 및 93; 서열 번호 40 및 75; 서열 번호 40 및 90; 서열 번호 40 및 93; 서열 번호 75 및 90; 서열 번호 75 및 93; 서열 번호 90 및 93, 또는 이들의 조절 영역을 포함하는 또는 이들에 상동인 유전자 또는 핵산서열의 또는 핵산서열에 결실이 있는 돌연변이체를 포함한다. 상기 돌연변이체는 그람음성 박테리아일 수 있으며 유리하게는, 파스튜렐라, 예컨대 P. 멀토시다, 예를 들면 P-1059 또는 PM70이다.
특정한 게놈 부위에 돌연변이를 도입하는 방법은 공지되어 있으며, 당업계의 상기 문헌 및 지식으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 돌연변이되는 모든 유전자 또는 서열 또는 단편은 벡터로 클로닝되고, 변형되어 이의 발현 및/또는 이의 생물학적 활성을 파괴한다. 벡터는, 예를 들어 전기천공에 의해서 (예, Jablonski L. et al., Microbial Pathogenesis, 1992, 12, 63-68), 또는 접합에 의해서 (Lee M.D. et al., Vet. Microbiol., 1996, 50, 143-148) 박테리아에 도입된다. 변형된 DNA 단편은 유전자 재조합에 의해서, 유리하게는 박테리아 염색체와 벡터간의 동종 재조합에 의해서 박테리아 게놈에 재도입된다. 예로서, 벡터는 Cardenas (Cardenas M et al., Vet Microbiol 2001 May 3; 80(1):53-61) 에 기재된 바와 같은 자살 플라스미드 (suicide plasmid) 일 수 있다. 유리하게는, 상기 벡터는 (동종 재조합에 사용되는) 2 개의 측면 팔 또는 영역 사이에, 임의의 가능한 번역을 차단하기 위해 폴리스톱 서열 (예를 들어, 6 개의 정지 코돈, 각 리딩 프레임 중 하나) 을 추가로 포함한다.
본 발명의 감쇠 미생물, 예를 들면 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) 와 같은 그램 음성 박테리아는 이의 게놈에 삽입된 하나 이상의 동종 또는 이종 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 생체내 또는 생체외에서, 이종 핵산 분자의 재생 또는 복제 및/또는 이종 핵산 분자의 발현에 유용하다. 이종 핵산 서열은 유리하게는, 감쇠 미생물에 의해 자연적으로 발현되는 것과는 상이한 병원성 바이러스, 기생체 또는 박테리아제로부터 면역원, 항원 또는 에피토프를 코딩한다. 상기 이종 서열은 미생물 또는 박테리아의 또다른 균주, 예를 들면 또다른 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) 균주로부터 면역원, 항원 또는 에피토프를 코딩할 수 있다. 면역원 또는 항원은 병원성제 또는 병원성 제제의 분비된 항원에 대해 면역 응답성을 유도할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드이며, 하나 이상의 에피토프를 함유하고; 에피토프는 병원성제 또는 병원성제의 분비된 항원에 대해 면역 응답성을 유도할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
이러한 벡터에서의 상기 사용에 적합한 이종 핵산 서열은 당업자에게는 자명할 것이며 (Fedorova ND and Highlander SK, Infect Immun 1997, 65(7):2593-8), 예를 들면 파스튜렐라세애 패밀리 멤버 (특히 파스튜렐라 멀토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 파스튜렐라 안티페스티페르, 악티노바실러스 플레우로뉴모니애) 에서 유래하거나, E. coli, Salmonella, Campylobacter 와 같은 박테리아에서 유래하는 것을 포함한다.
이종성 서열은 유리하게는 감쇠 미생물 및 상기 발현된 면역원 모두에 대해 면역 응답성을 나타내기 위해 투여될 때, 숙주내 미생물에 의해 발현되도록 삽입된 다. 이종성 서열은 유리하게는 프로모터와 같은, 발현을 허용하는 조절 요소와 함께 삽입되거나, 상기 구성원에 작동적으로 연결되거나, 상기 구성원의 하류에 있다. 단백질의 배치 (address) 및 분비에 유용한 뉴클레오티드 서열이 또한 첨가될 수 있다. 따라서, 리더 또는 시그날 서열은 세포 벽을 통한 전달 및/또는 분비를 용이하게 하기 위해 발현 생성물내에 포함될 수 있다.
한가지 양태에 있어서, 동종성 또는 이종성 서열은 감쇠에 사용되는 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 선택된 유전자내에 삽입되고; 유리하게는 동종 또는 이종 서열은 본원에서 확인된 트랜스포존 삽입 위치에 해당하는 위치중 하나에 삽입된다.
발현을 향상시키기 위해서, 코돈 사용이 사용되는 박테리아 벡터에 적응될 수 있다.
본 발명의 감쇠 돌연변이체는 또한 치료 단백질, 알레르겐, 성장 인자 또는 시토킨 또는 면역조절제 또는 면역자극제, 예를 들면 GM-CSF, 예컨대 표적 종에 조화되는 GM-CSF 를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어, 감쇠 벡터가 소에 투여하기 위한 파스튜렐라 멀토시다인 경우, 소 GM-CSF 는, 예를 들면 또다른 이종 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항원, 면역원 또는 에피토프의 벡터에 의한 발현과 함께, 벡터에 의해서 발현될 수 있다).
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 감쇠 미생물은 살아있는 감쇠 면역원 조성물 또는 살아있는 감쇠 백신 조성물을 제조하는데 사용된다.
본 발명의 유리한 양태에 따르면, 감쇠 미생물은 본 발명에 따라서 돌연변이 된, 그램 음성 박테리아, 예를 들면 파스튜렐라 (Pasteurella), 예컨대 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida), 예를 들어 P-1059 또는 PM70 이다.
유리하게는 본원에 기재된 바와 같이, 미생물은 Pasteurella 이외의 다른 작용제에 의해 야기되는 감염에 대해서 동물 또는 사람을 면역화 및/또는 백신화하기 위한 재조합 벡터로서 작용할 수 있다.
면역원 조성물 또는 백신 조성물은 감쇠 돌연변이체 및 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 전색제, 및 임의로 안정화제 및/또는 보조제를 포함한다. 감쇠 돌연변이체는 이종성 에피토프, 항원, 면역원, 및/또는 성장 인자, 시토킨, 면역조절제 또는 면역자극제와 같은, 벡터에 이종성인 핵산 분자를 추가로 발현하는 벡터일 수 있다.
용어 "면역원 조성물" 은 본원에서 동물 또는 사람에 주입되면, 대상 병원균에 대해 면역 응답을 도출할 수 있는 임의의 조성물을 포함한다. 용어 "백신 조성물" 또는 "백신" 은 본원에서 동물 또는 사람에 주입되면, 대상 병원균에 대해 보호 면역 응답을 유도할 수 있는 임의의 조성물을 포함한다.
약제학적으로 또는 수의학적으로 허용 가능한 부형제는 물 또는 염수일 수 있으나, 예를 들면 또한 박테리아 배지를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 살아있는 감쇠 박테리아는 유리하게는 안정화제로 냉동 건조될 수 있다. 냉동 건조는 충분히 공지된 표준 냉동 건조 과정에 따라서 실시될 수 있다. 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 안정화제는 탄수화물 (예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 덱스트란, 트레할로오 스), 나트륨 글루타메이트 (Tsvetkov T et al., Cryobiology 1983, 20(3):318-23; Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5):519-23), 단백질, 예를 들어 펩톤, 알부민, 락트알부민 또는 카세인, 단백질 함유 시약, 예를 들어 탈지 우유 (Mills CK et al., Cryobiology 1988, 25(2):148-52; Wolff E et al., Cryobiology 1990, 27(5):569-75, 및 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충제, 알칼리 금속 포스페이트 완충제) 일 수 있다.
아쥬반트는 냉동 건조된 제제를 용해시키는데 사용될 수 있다.
아쥬반트의 예는 수중유, 수중유중수 에멀젼이며, 이는 광유 및/또는 식물성유 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 블록 공중합체, Tween
Figure 112008015850348-pct00002
, Span
Figure 112008015850348-pct00003
을 기재로 한다. 다른 적합한 아쥬반트는, 예를 들어 비타민 E, 사포닌, 및 Carbopol
Figure 112008015850348-pct00004
, 수산화알루미늄 또는 인산 알루미늄 ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, 1995, Plenum Press New York) 이다.
살아있는 감쇠 박테리아는 글리세롤 함유 매질내에서 -70 ℃ 에서 보관될 수 있다.
임의로는, 면역원 조성물 또는 백신은 비활성화 또는 생 형태의 다른 병원성 미생물 또는 바이러스에서 선택되는 하나 이상의 면역원, 항원 또는 에피토프와 조합될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 및 93 으로 지정된 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 유전자, 유리하게는 서열 번호 1, 4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 96, 97 로 지정된 것과 같은, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 유전자이다.
본 발명의 다른 양태는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 더욱 통상적으로는 발현 생성물, 예를 들어 면역원, 항원 또는 에피토프의 발현 및 제조를 위한 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 사용이다. 한가지 양태에 있어서, 이들 뉴클레오티드 서열 또는 유전자에 의해 인코드된 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 단백질은 면역원 조성물 또는 백신내에서 아단위 면역원 또는 항원 또는 에피토프로서 사용될 수 있다. 에피토프 결정 과정, 예를 들어 중복 펩티드 라이브러리의 생성 (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998,19(4),163-168), 펩스칸 (Pepscan) (Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81(13), 3998-4002; Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47; Geysen H. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin
Figure 112004045212417-pct00005
Peptide Synthesis Kits de Chiron) 및 알고리즘 (De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561) 이 과도한 실험없이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
유리한 폴리펩티드는 서열 번호 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94 로 식별되는 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 뉴클레오티드 서열 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 에 의해서 코딩된 것이다. 이들 폴리펩티드로부터의 에피토프가 또한 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또다른 박테리아, 예를 들면 그램 음성 박테리아, 유리하게는 파스튜렐라세애 (Pasteurellacaea) 패밀리 멤버, 예를 들어 파스튜렐라 멀토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 파스튜렐라 아나티페스티페르, 악티노바실러스 플레우로뉴모니애로부터의 동등한 폴리펩티드를 포함하며, 더욱 유리하게는 파스튜렐라 멀토시다의 다양한 균주중 임의의 하나의 게놈에서, 아미노산 서열이 서열 번호 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94 로 식별되는 아미노산 서열중 하나에 대해 약 70 % 이상, 약 75 % 이상, 약 80 % 이상, 약 85 % 이상, 약 90 % 이상, 약 95 % 이상, 및 약 96, 97, 98 또는 99 % 이상의 동일성을 갖는 동등한 폴리펩티드 및/또는 SEQ 를 갖는 상기 확인된 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 동일성 확립 기준 또는 동일한 생물학적 기능은 상기에서 기재하였다.
본 발명은 또한 폴리펩티드의 10 개 이상, 20 개 이상, 예를 들면 30 개 이상, 유리하게는 50 개 이상, 더욱 유리하게는 70 개 이상의 아미노산의 사슬을 갖는 이들 폴리펩티드의 면역원 단편, 예를 들면 폴리펩티드의 10 개 이상의 인접 아미노산, 유리하게는 폴리펩티드의 20 개 이상의 인접 아미노산, 예를 들면 폴리펩티드의 30 개 이상, 더욱 유리하게는 50 개 이상의 인접 아미노산, 더욱 더 유리하 게는 폴리펩티드의 70 개 이상의 인접 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 물론, 단편은 전체 폴리펩티드보다 작다. 단편은 다른 폴리펩티드, 예를 들면 융합 폴리펩티드와 조합될 수 있다; 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편은 또다른 부분 (또다른 폴리펩티드), 예를 들어 면역원성을 향상시키는 리포단백질 부분 또는 시그널 또는 리더 서열 부분과 같은 면역원성 촉진 부분 및/또는 분비 촉진 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 따라서, 본 발명은 융합물로서, 예를 들면 융합 폴리펩티드의 일부로서, 예컨대 유리하게는 리포단백질 부분과 같은 면역원성 촉진 부분 및/또는 시그널 또는 리더 서열 부분과 같은 분비 촉진 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부로서, 폴리펩티드, 단백질, 항원, 면역원 또는 에피토프 - 본원에서 동정된 서열 또는 이의 단편 또는 본 발명의 벡터에 이종성인 것 - 의 발현을 계획한다.
폴리펩티드 또는 단편은 유리하게는 시험관내 발현에 의해서 생성된다. 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 (예를 들면, 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93) 또는 이의 단편은 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 종결자와 같은 조절 구성원에 작동적으로 연결된 벡터에 삽입되어, 코돈을 개시하고 코돈을 종결한다. 유리한 벡터는 박테리아, 즉 대장균 (Escherichia coli) (Mahona F et al., Biochimie 1994, 46(1): 9-14 ; Watt M A et al., Cell Stress Chaperones 1997, 2(3): 180-90; Frey J Res. Microbiol. 1992, 143(3): 263-9) 에서 시험관내 발현에 유용한 플라스미드이다.
이들 폴리펩티드는 또한 화학적으로 합성될 수 있다 (Luo Y et al., Vaccine 1999, 17(7-8): 821-31).
따라서, 본 발명의 양태는 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단편 (서브유닛 면역원성 조성물 또는 백신) 또는 본원에 기재된 하나 이상의 생체내 발현 벡터 (생 재조합 면역원성 조성물 또는 백신), 및 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 전색제, 및 임의의 보조제를 포함하는 면역원 조성물 또는 백신이다. 이러한 성분의 예는 생 백신과 관련해서 본원에 기재하였다.
또다른 양태에 있어서, 이들 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 단편은 상기 뉴클레오티드 서열 또는 단편에 의해서 코딩되는 폴리펩티드를 숙주내에서 생체내 발현할 수 있는 생 재조합 면역원성 조성물 또는 백신을 생성하도록 재조합 백터에 삽입될 수 있다.
생체내 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 벡터 또는 플라스미드 (EP-A2-1001025; Chaudhuri P Res. Vet. Sci. 2001, 70(3), 255-6), 바이러스 (예컨대, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 예를 들어 파울폭스 (US-A-5,174,993, US-A-5,505,941 및 US-A-5,766,599) 또는 카나리폭스 (US-A-5,756,103)) 또는 박테리아, 즉 Escherichia coli 또는 Salmonella sp. 일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 단편은 또한 치료에 사용될 수 있다.
폴리펩티드 및 단편은 또한 항체-항원 반응에서 시약으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 양태는 그램 음성 박테리아에 의한 감염 검출용 진단 방 법 및/또는 키트이다. 키트, 예를 들어 ELISA 는 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단편 (예를 들면, 본원에서 서열에 의해 확인된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 본원에서 논의된 이의 단편) 을 포함할 수 있다.
본원에서 폴리펩티드 또는 단편 (본원에서 서열에 의해 확인된 폴리펩티드 또는 본원에서 논의된 이의 단편) 에 대한 항체는 진단 시약으로서, 또는 수동 면역화 또는 백신화에, 또는 치료에 사용될 수 있다. 수동 면역화에 투여되는 항체의 양은 당업계에서 사용되는 양과 동일 또는 비슷할 수 있으며, 따라서 당업계의 지식으로부터, 당업자는 과도한 실험없이 수동 면역화를 실시할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 단편에 특이적인 항체를 포함하는 항체 제조 및 이것을 이용한 진단법이다. 폴리펩티드에 특이적인 항체에 관해서, 이것은 항체가 바람직하게는 폴리펩티드에 결합하는 것, 예를 들면 항체가 폴리펩티드에 결합하고 다른 폴리펩티드에는 결합하지 않거나, 또는 폴리펩티드에 허용 가능하게 특별한 폴리펩티드에 대한 특이성을 가짐으로써, Sambrook 의 상기 문헌을 포함한, 당업계에 공지된 또는 본원에서 인용된 문헌에 논의된 기술을 사용하여, 항체가 샘플로부터 폴리펩티드를 분리하거나, 샘플내 그의 존재를 5 % 이하의 거짓 포지티브로 검출할 수 있도록 하는 것을 의미한다.
항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다.
항체의 제조 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
폴리클로날 항체가 요구되는 경우, 선택된 동물 (예, 쥐, 토끼, 염소, 말 등) 은 폴리펩티드 또는 단편에 의해서 면역시킨다. 면역된 동물로부터 혈청을 수 집하여, 공지의 과정에 따라 처리하고, 가능하게는 정제한다. 예를 들어, Jurgens et al. J. Chrom., 1985, 348: 363-370 참조.
하이브리도마 기술을 이용한 모노클로날 항체의 일반적인 제조 방법론은 충분히 알려져 있다. 불멸 항체 생성 세포 라인은 세포 융합에 의해서, 그리고 또한 종양 유전자 DNA 로의 B 림프구의 직접 형질전환, 또는 Epstein-Barr 바이러스로의 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들어, J. E. Liddell "A practical guide to monoclonal antibodies" ed. John Wiley and sons, 1991, p. 188; S. J. de StGroth et al. J. Immunol. Methods, 1980, 35(1-2), 1-21 참조.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 및 이들의 단편은, 예를 들어 진단 방법에서 혼성화용 프로브로서 사용될 수 있다.
엄격한 혼성화 조건이 유리하게 사용된다. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104 에 의해 기재된 것을 언급할 수 있다. 엄격한 조건하에서의 혼성화는 포지티브 혼성화 시그널이, 1 ×SSC 완충액 및 0.1 % SDS 로 55 ℃, 유리하게는 62 ℃, 더욱 유리하게는 68 ℃ 에서 1 시간 세정, 예를 들면 0.2 ×SSC 완충액 및 0.1 % SDS 중에서 55 ℃, 예컨대 62 ℃, 유리하게는 68 ℃ 에서 1 시간 세정후에도 여전히 관찰됨을 의미한다.
또한, 엄격한 혼성화 조건 하에서 결합하는 능력에 의해 뉴클레오티드 서열의 특성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건 하에서 이에 결합하는, 본 명세서에서 확인된 핵산 서열 및 핵산 분자를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 및 이의 단편은, 예를 들어 모든 매질, 예를 들어 조직 샘플, 생물학적 유체, 물, 식품 중의 그람 음성 박테리아의 검출을 위하여, PCR을 위한 또는 증폭 및/또는 혼성화를 포함하는 유사한 방법에서의 프라이머로서 사용될 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 의 20 개 이상의 인접한 핵산, 예컨대 30개 이상의 인접한 핵산, 예를 들어 50 개 이상의 인접한 핵산, 예를 들어 70 개 이상의 인접한 핵산 또는 더 유리하게는 100 개 이상의 인접한 핵산이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 동물, 유리하게는 박테리아에 감염되기 쉬운 동물, 예를 들어, 조류, 토끼, 소 및 돼지 종, 및 더 유리하게는 조류 종, 예를 들어 닭, 칠면조 및 오리(브리더(breeders), 브로일러(broilers) 및 레이어(layers)를 포함) 또는 인간에 있어서 박테리아 감염에 대해 면역성을 부여하거나 이를 예방하기 위해서, 또는 박테리아 감염을 막기 위한 방법에 관한 것이다.
상기 방법에 따라서, (1) 본 발명의 살아있는 감쇠된 면역원성 조성물 또는 백신, 또는 (2) 본 발명의 서브 유닛 면역원성 조성물 또는 백신, 또는 (3) 본 발명의 살아있는 재조합 면역원성 조성물 또는 백신, 또는 이의 배합물이 투여된다. 물론, 본 발명의 구현은 본 발명이 아닌 다른 백신 또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있고, 예를 들어 프라임-부스트 방법 (prime-boost process)에서, 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물이 먼저 투여되고 상이한 백신 또는 면역원성 조성물이 그 이후에 투여되거나, 또는 반대의 순서로 투여된다.
특히 근육내(IM), 진피내(ID) 또는 피하(SC) 주사에 의해, 또는 비강내, 기관내 또는 경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신은 유리하게는 주사기, 무침 장치 (예를 들어, Pigjet, Avijet, Dermojet 또는 Biojector (Bioject, Oregon, USA)), 스프레이, 음용수, 점안제(eye-drop)에 의해 투여된다.
살아있는 감쇠된 면역원성 조성물 또는 백신의 유리한 투여는 구강(예를 들어 음용수, 전신 스프레이), 눈(예를 들어 점안제, 전신 스프레이), 기관내(예를 들어 스프레이), 진피내, 피하(SC) 또는 기관내(IM) 경로를 통한 in ovo 투여이다.
살아있는 감쇠된 미생물의 양은 숙련자에 의해, 과도한 실험 없이, 본 개시 및 종래 기술의 지식으로부터 결정 및 최적화될 수 있다. 일반적으로 동물(사람 포함)은 단일 제형 단위에서, 대략 104 내지 109 CFU, 유리하게는 대략 105 내지 108 CFU 및 더 유리하게는 대략 106 내지 107 CFU가 투여될 수 있다.
근육내 경로에 의해서, 조류 동물은 단일 제형 단위에서, 대략 104 내지 107 CFU, 유리하게는 대략 105 내지 106 CFU가 투여될 수 있다. 단일 제형 단위의 부 피는 약 0.2 ml 내지 약 0.5 ml일 수 있고 유리하게는 약 0.3 ml이다. 구강, 기관내 또는 눈 경로에 의해, 조류 동물은 단일 제형 단위에서, 대략 105 내지 108 CFU, 유리하게는 대략 106 내지 107 CFU가 투여될 수 있다. 스프레이 투여에 대하여, 부피는 장치 및 물방울의 크기에 맞추어지고, 약 1000 마리 동물에 대하여 약 30 내지 약 600 ml이고 유리하게는 동물 당 약 0.2 ml이다.
소 및 돼지 동물에 대하여, 유리한 경로는 IM 및 SC이다. 상기 동물은 단일 제형 단위에서, 대략 104 내지 109 CFU, 유리하게는 대략 105 내지 10 8 CFU가 투여될 수 있다. 단일 제형 단위의 부피는 약 0.2 ml 내지 약 5.0 ml이고 유리하게는 약 0.5 ml 내지 약 2.0 ml이며 더 유리하게는 1.0 ml이다.
토끼는 IM 또는 SC 경로를 통해, 단일 제형 단위에서, 대략 104 내지 108 CFU, 유리하게는 대략 105 내지 107 CFU가 투여될 수 있다. 단일 제형 단위의 부피는 약 0.2 ml 내지 약 0.5 ml이고 유리하게는 약 0.5 ml이다. 이들은 또한 ID 경로를 통해 단일 제형 단위에서, 대략 104 내지 108 CFU, 유리하게는 105 내지 107 CFU가 투여된다. 단일 제형 단위의 부피는 약 0.1 ml 내지 약 0.2 ml일 수 있다.
본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
실시예 1: 시그너쳐(signature) 태그된 P. multocida 트랜스포존 돌연변이체 의 라이브러리의 구축(STM 스크리닝)
태그된 SM10λpir pLOF/km 형질전환주의 구축
태그를 [Hensel et. al., (Science, 1995, 269:400-403)]에 기술된 바와 같이 제조하였다. 먼저, 혼성화를 잘 하지만 서로 크로스-혼성화 하지 않는 태그를 포함하는, 태그된-pUTminiTn5Km2 플라스미드를 선별하였다. 태그된 pUTminiTn5Km2 벡터 내의 mini-Tn5 트랜스포존은 몇몇의 파스튜렐라 멀토시다 균주에서 교차하지 않는 것으로 발견되었다. 반대로 트랜스포존 mini-Tn10은 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) 에서 기능하는 것으로 보여졌다(Lee et. al., Vet Microbiol, 1996, 50:143-8). 따라서, 미리 선별된 태그를 pUTminiTn5 벡터로부터 플라스미드 pLOF/Km를 포함하는 mini-Tn10로 이동시켰다 (Herrero et al., J. Bacteriology, 1990, 172: 6557-6567). 태그를, 이 태그가 클로닝되는, pUTn-miniTn5Km2 벡터, KpnI 부위의 어느 한 쪽에 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 상기 프라이머는 제한 효소 SalI에 대한 서열을 포함하였다. 상기 PCR 산물을 SalI로 절단하고, SalI 부위가 유일한 SfiI 클로닝 부위로 대체되는, pLOF/Km 벡터의 개질된 버전의 SalI 부위로 클로닝하였다. 태그된 pLOF/Km 플라스미드를 그 후 E. coli 균주 SM10λpir (Kmr, thi, thr, leu, tonA, lacY, supE, recA::RP4-2-Tc::Muλpir)으로 형질전환하였다(Miller V.L. et al., J. Bacteriol., 1988, 170: 2575-83). 상기 균주는 접합에 의해서 수용자 박테리아 내로 pLOF/Km 와 같은 플라스미드를 동원할 수 있다.
선별 및 반-선별 (counter selection) 의 방법
접합 방법은 플라스미드 pLOF/KM 및 E. coli SM10λpir 공여자 박테리아에 대한 반-선별 방법을 수득한, 수용자 박테리아 P. multocida에 대한 선별 방법을 요구한다.
상기 선별 방법에서, 수용자 박테리아 파스튜렐라 멀토시다의 선별 방법은 mini-Tn10 트랜스포존에 의해 코딩되는, 카나마이신 사용에 대해 선된다.
먼저 접합시 E. coli 공여자 박테리아에 대한 반-선별을 위하여, 자발적 스트렙토마이신 내성 돌연변이체인 파스튜렐라 균주 P-1059을 사용하였다. 그러나, 상기 균주는 칠면조에 대하여 발병력이 감쇠하는 것으로 보였고, 따라서 여기서 사용될 수 없었다. 파스튜렐라 멀토시다 균주는 화학 합성배지(CDM)에서 증식할 수 있다 (Hu et. al., Infection and Immunity 1986, 804-810). 한천을 포함하지만 류신을 포함하지 않는 합성배지의 개질된 버전이 E. coli 공여자 박테리아에 대한 상대-선별 가능하게 하기 위하여 사용되었다. 파스튜렐라 균주는 상기 배지에서 증식할 수 있었고, 이의 조성은 표 1에서 제시되며, 반면 류신 영양요구주인 E. coli SM10λpir은 증식할 수 없었다.
성분 농도 g/리터
노블 한천(noble agar) 20
Na2HP04.12H20 32.31
KH2PO4 1.368
NaCl 1.196
글루코즈 6.0
L-아르기닌 히드로클로라이드 0.24
L-시스테인 히드로클로라이드 0.12
L-세린 0.2
L-글루타민산 0.15
L-이소루신 0.064
L-페닐알라닌 0.095
L-아스파르트산 1.6
L-티로신 0.08
티아민 히드로클로라이드 0.0002
MgSO4.7H20 0.246
판토텐산칼슘 0.004
니코틴아미드 0.01
오르토산 0.003
P. multocida 균주의 CDM 배지 상의 계대
P. multocida 균주의 동결건조된 앰플 (USDA P-1059, American Type Culture Collection 사 제, 접근 번호 ATCC 15742)을 200 ㎕의 BHI(뇌-심장 융합물)의 첨가에 의해 소생시켰고, 현탁액의 분취물을 BHI 한천 플레이트 상에 도말(streak)하였으며, 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트로부터의 콜로니 물질을 사용하여 BHI 브로쓰 배양물로 접종하였으며, 이를 37℃에서 밤새 진탕하여 인큐베이션하였다. 글리세롤을 첨가하여 15% v/v의 최종 농도가 되게 하였으며, 분취물을 -80℃에서 동결 저장하였다. 상기 동결된 분취물 중의 하나로부터의 샘플을 BHI 한천 플레이트 상에 도말하었으며, 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 BHI 플레이트로부터의 콜로니 물질을 표 1에 제시된 조성을 가진 CDM 한천 플레이트 상에 도말하였으며, 37℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상기 CDM 플레이트로부터의 콜로니 물질을 BHI 브로쓰 배양물 내로 인큐베이션하였으며, 37 ℃에서 밤새 진탕하여 인큐베이션하였다. 글리세롤을 상기 배양물 내로 첨가하여 15% v/v의 최종 농도가 되게 하였고, 분취물을 -80℃에서 동결하였다. 상기 균주를 16084 (CDM)로 명명하였다.
돌연변이체 은행의 구축
태그된 SM10λpir pLOF/km 형질전환주를 16084 (CDM) P. multocida 균주와 접합하였다. 동기 돌연변이체(접합 과정시 돌연변이체의 복제로 인하여 발생하는, 동일한 위치에 있는 트랜스포존을 가지는 돌연변이체)의 분리를 최소화하기 위하여, 각 태그된 SM10λpir 형질전환주를 3개 이상의 분리된 접합 부위에서 파스튜렐라 멀토시다 균주와 접합하였다. 파스튜렐라 (Pasteurella) 트랜스포존 균주를 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 CDM 한천 플레이트 상에서 선별하였다.
각각의 태그된 트랜스포존에 대한 카나마이신 내성 돌연변이체를, BHI 카나마이신 50 ㎍/ml 한천 플레이트 상에서 두 번 도말하여 단일 콜로니를 형성하였다. 그 후, 단일 콜로니를 BHI 브로쓰 배양물 내로 인큐베이션하였고, 37℃에서 밤새 진탕하여 인큐베이션하였다. 그 후, 글리세롤을 첨가하여 15 % v/v의 최종 농도가 되게 하였고 돌연변이체를 각 바이알에서 -80℃로 저장하였다.
실시예 2: 칠면조에 대한 발병력이 감쇠된 돌연변이체에 대한, 시그너쳐-태그된 파스튜렐라 (Pasteurella) 돌연변이체 은행의 스크리닝
실시예 1에서 수득된, 20 ㎕의 각각의 글리세롤 보존 돌연변이체를 50 ㎍/ml의 카나마이신이 보충된, 200 ㎕의 BHI 배양 배지와 혼합함에 의해, 칠면조의 접종을 위한 P. multocida 돌연변이체의 배양물을 증식하였고, 96 웰 마이크로타이터 디쉬에 위치시켰다. 상기 마이크로타이터 디쉬를 37℃에서 약 18 시간동안 정적 조건에서 인큐베이션하였다. 그 후 상기 돌연변이체의 18 시간 배양된 10 ㎕ 분취물을, 신선한 마이크로타이터 플레이트 내에서 50 ㎍/ml의 카나마이신으로 보충된 200 ㎕의 BHI 배양 배지와 혼합하였고, 상기 플레이트를 대략 4시간동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상기 배양을 대수증식기에서 중단하였고, 각 돌연변이체의 100 ㎕ 배양물을 신선한 마이크로타이터 플레이트로 이동시켰으며, 650 nm에서의 흡광도(OD)의 측정을 위해 사용하였다.
접종물 또는 도입 풀(input pool)을, 남아있는 100 ㎕의 4시간 배양물을 혼합함에 의해 형성하였다. 각각의 도입 풀은 48개의 상이한 돌연변이체로 이루어져 있다. 상기 풀링된 현탁액의 타이터를 100 ㎕ 분취물의 FACS (형광표지세포분리기) 분석에 의해 측정하였다. 풀링된 현탁액의 분취물(1 ml)을 그 후 생리학적 완충수에서 희석하여, 2.107cfu/ml의 타이터를 가지는 현탁액을 수득하였다. 그 후, 5 마리의 3주령 칠면조의 군에 상기 현탁액의 0.5ml 분취물(한 마리 당 107cfu)을 근육내 접종하였다. 접종 전 칠면조의 혈청 상태를, 접종 하루 전 채취된 혈액 샘플 내의 Pasteurella 에 대한 항체 존재에 대한 검사에 의해 측정하였다. 나머지의 도입 풀로부터의 세포를 원심분리에 의해 수득하였고 세포 펠렛으로부터 염색체 DNA를 추출하였다.
접종 후 대략 14시간에, 1 ml의 혈액 샘플을 5 마리 칠면조 중 3 마리로부터 채취하였다. 혈액 샘플의 일련의 희석물(10-1 내지 10-7)을, 5% 양(sheep) 혈액으 로 보충된 Columbia 한천 플레이트 상에 위치시켰다. 상기 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 그 이후 대략 10000 Pasteurella 콜로니를 BHI 배지에 재현탁하였다. 도출 풀(output pool)이라고 명명되는 상기 현탁액을, 그 후 원심분리하고 염색체 DNA를 세포 펠렛으로부터 추출하였다.
도입 풀에는 존재하지만 칠면조로부터 재분리되지 않은 Pasteurella 돌연변이체를, 문헌 [Hensel et al., Science 1995, 269:400-403]에 기술된 바와 같이, 도입 및 도출 풀로부터의 DNA 샘플에 존재하는 시그너쳐 태그의 PCR 증폭, 및 시그너쳐 태그를 암호화하는 DNA로 로드된 도트 블롯(dot blot)에 대한, 증폭된 PCR 산물의 혼성화에 의해 확인하였다. 상기 돌연변이체는 발병력이 잠재적으로 감쇠된 것으로 생각되었다. 이러한 감쇠는 칠면조의 잠재적 돌연변이체의 단일 감염 이후에 치사율의 감소에 대한 스크리닝에 의해 확인된다.
실시예 3 : 파스튜렐라 멀토시다 돌연변이체의 칠면조에 대한 발병력 감쇠의 확인
글리세롤 원액 20 ㎕ 와 카나미아신 50 ㎍/mL로 보충된 BHI 배양 배지 200 ㎕ 를 마이크로타이터 접시 내에서 혼합함으로써, 실시예 2에서 잠재적으로 감쇠된 것으로 확인된 트랜스포존 돌연변이체 또는 제한된 배양 성장 능력을 갖는 돌연변이를 소생시켰다. 상기 마이크로타이터 접시를 37℃에서 18 시간 동안 정적 조건에서 배양시켰다. 그 후, 상기 배양물의 각 돌연변이체 10 ㎕ 분취량을 취하여 새로운 마이크로타이터플레이트 내에서카나미아신 50㎍/mL 이 보충된 BHI 배지 200 ㎕ 와 혼합시켜, 상기 플레이트를 약 4 시간 동안 정적 조건에서 배양하였다. 상기 배양물을 성장의 대수증식기(exponential phase)에서 정지시키고 각 돌연변이체의 배양물 100 ㎕를 새로운 마이크로타이터 플레이트로 이동시켜 650 nm에서 광학밀도(OD)의 측정을 위해 사용하였다. 이어서, 상기 돌연변이체 각각의 배양물을 생리적 완충수 내에서 10000 분의 1로 희석시켜 약 2.104 cfu/mL의 농도를 수득하였다. 그 후, 상기 희석액의 분취량 (0.5 mL)을 2 마리의 5주령 칠면조에게 근육 내로 접종하였다 (동물 당 104 cfu). 칠면조의 각 군의 몇몇의 동물의 혈청 상태를 접종 전에 취한 혈액 시료로부터 측정하였다. 상기 칠면조에 대하여 그 다음 7일 동안 치사율을 관측하였다. 상기 시험된 돌연변이체들 중 72 개가 접종된 두 조류의 어느 것에서도 사망률을 나타내지 않았다. 상기 72 개 돌연변이체는 발병력이 감쇠된 것으로 간주되었다.
실시예 4: 칠면조에서 스크리닝 후에 확인된 트랜스포존 삽입 돌연변이체의 특성분석
감쇠된 P.멀토시다 돌연변이체의 게놈에서 트랜스포존 삽입 부위는, 역방향 PCR 또는 임의적 프라이밍 PCR (arbitrarily primed PCR)에 의해 트랜스포존 삽입의 한 측면의 DNA를 클로닝함으로써 확인되었다.
상기 돌연변이체는, BHI 카나미아신 50 ㎍/mL 한천 플레이트 상으로 분취량을 도말(streaking)함으로써 -80℃ 글리세롤 원액으로부터 소생되었다. 그 후, 단일 콜로니들을 사용하여 염색체 DNA가 제조되는 BHI 브로쓰 배양물을 접종하였다.
역방향 PCR를 위하여, 4 염기쌍 인식 부위, 예컨대 Tsp509I, αTaqI 또는 RsaI를갖는 제한효소로 염색체 DNA를 절단했다. 이어서 상기 DNA를 큰 부피로 라이게이션시켜 분자내 라이게이션을 촉진시켰다. 그 후, 상기 트랜스포존 주변의 DNA 를, 트랜스포존의 공지의 서열에 결합하는 바깥쪽으로 향하는 프라이머, 예컨대 StipJ (서열 번호: 98,20 머) (5'ATC TGA TCC TTC AAC TCA GC 3'), StipA (서열 번호: 99,19 머) (5'CGC AGG GCT TTA TTG ATT C 3'), KTGRI (서열 번호: 100,27 머) (5'GCG GAA TTC GAT GAA TGT TCC GTT GCG 3'), Tn10IR1 (서열 번호: 101,20 머) (5'TTT ACC AAA ATC ATT AGG GG 3') 및 Tn10IR4 (서열 번호: 102,19 머) (5'GAT CAT ATG ACA AGA TGT G 3')를 사용하여 상기 결찰된 DNA 주형으로부터 확장시켰다. 이어서 상기 역방향 PCR 생성물을 클로닝하고 서열을 분석하였다.
임의적 프라이밍 PCR을 위하여, 트랜스포존에 결합하는 하나의 바깥쪽으로 향하는 프라이머, 예컨대 StipA, 및 임의 프라이머, 예컨대 arb1 (서열 번호: 103, 35 머) (5'GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN GAT AT 3') 또는 arb6 (서열 번호: 104, 35 머) (5'GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACN NNN NNN NNN CAG CC 3')와의 제 1 회 PCR 반응에서 염색체 DNA를 주형으로서 사용하였다. 상기 제 1 회 PCR반응의 결합 온도는 초기에 매우 낮게 설정되고, 연속되는 사이클에서 결합 온도를 승온시킨다. 이어서, 상기 제 1 회 PCR의 생성물 부분을 제 2 회 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 상기 제 2 회 PCR은 또 다른 바깥쪽을 향하는 프라이머, 예컨대 KTGRI (상기 제 1 회 PCR에서 사용되는 프라이머보다 트랜스포존의 말단에 더 가까운 위치에서 트랜스포존에 어닐링함)를 사용한다. 상기 제 2 회 PCR에서 사 용되는 다른 프라이머는 상기 제 1 회 PCR에서 사용되는 임의 프라이머, 예컨대 arb2 (서열 번호: 105,20 머)(5'GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3')의 5' 말단에서 공지 서열의 20 개 염기들과 동일한 서열을 갖는다. 이어서 상기 제 2 회 PCR의 PCR 생성물을 클로닝하고 서열을 분석하였다.
그 후 상기 수득된 서열은 트랜스포존에 의해 파괴될 수 있는 오픈 리딩 프레임 (open reading frames: ORF) 을 확인하기 위해 분석되었고, 또한 EMBL 데이터베이스 및 University of Minnesota [May BJ 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001,98 (6): 3460-5]에 의해 측정된 파스튜렐라 멀토시다 균주 PM70의 게놈 서열에서 현재 이용가능한 유사 서열을 검색하기 위해 사용되었다.
참고로 하기 뉴클레오티드 서열에서, N은 임의 핵산 (A 또는 C 또는 G 또는 T)에 대응한다.
돌연변이체 1G4, 3F4, 3G12, 12D6 및 14C10
돌연변이체 1G4, 3F4 및 12D6는 정확하게 동일한 트랜스포존 삽입 부위를 갖는다. 상기 트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열은 서열 번호: 1 (775 머)로 나타낸다. 상기 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단에서 즉시 삽입된다.
개시 코돈은 서열 서열 번호: 1 서열의 위치 179-181에 위치한다.
돌연변이체 3G12에 대하여, 상기 트랜스포존 삽입 부위를 플랭킹하는 DNA서열은 서열 번호: 95 (101 머)로 주어진다. 상기 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단에서 즉시 삽입된다.
돌연변이체 14C10에 대하여, 상기 트랜스포존 삽입 부위를 플랭킹하는 DNA서 열은 서열 번호: 96 (220 머)로 주어진다. 상기 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단에서 즉시 삽입된다.
4 개의 다른 파스튜렐라 단백질 및 유전자는 서열 번호: 1로 코딩되는 60 개 아미노산 서열로 블라스트 (blast) 를 수행하여 확인되었다.
Figure 112004045212417-pct00006
돌연변이체 1G4, 3F4 및 12D6에서 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006115 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 8507-8508 에 해당된다. 돌연변이체 3G12에서 트랜스포존의 위치는 상기 AE006115 서열의 위치 8609-8610 에 해당된다. 돌연변이체 14C10 에서 트랜스포존의 위치는 상기 AE006115 서열의 위치 8517-8518 에 해당된다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0773, PhyA 의 상동성을 손상시킨다. 상기 PhyA 유전자는 캡슐 합성에 수반되는 것으로 예측된다. PM0773 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 2 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 3 로 식별된다.
돌연변이체 1G8 9D1 및 9D8
돌연변이체 1G8에서, 트랜스포존은 서열 서열 번호: 4 (226 머)의 3' 말단에서 즉시 삽입된다. 상기 서열은 잠재적인 더 긴 단백질을 코딩하는 2 개의 오픈 리딩 프레임 (+2 및 -2) 을 갖는다. 본 발명에 따른 상기 ORF는 프레임 -2 내에 있다.
돌연변이체 9D1에서 삽입되는 트랜스포존은 서열 서열 번호: 5 (87 머)의 3' 말단에서 즉시 삽입된다.
돌연변이체 9D8에서 삽입되는 트랜스포존은 서열 서열 번호 : 4의 위치 225 다음에서 삽입된다.
돌연변이체 1G8, 9D1 및 9D8에서 트랜스포존은 PM70 유전자, PM0871 의 상동성을 파괴한다. 상기 돌연변이체에서 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006125 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 9849-9850 (돌연변이체 1G8), 8899-8900 (돌연변이체 9D1) 또는 9848-9849 (돌연변이체 9D8) 에 해당된다. PM0871 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 6 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 7 로 식별된다.
또다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질은 서열 번호 7 로 블라스트를 수행하여동정했다. 상기는 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) HI1586 (Genbank 접근 번호 U32832 및 AAC23234)이다. 본 출원인은 PM0871과 HI1586 간의 507 개 아미노산에 대하여 72% 의 동일성을 발견하였다.
돌연변이체 2F2
상기 트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열은 서열 번호 8 (78 머)로 나타낸다. 상기 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적인 더 긴 단백질을 코딩하는 3 개의 오픈 리딩 프레임 (+1, +2 및 -1) 을 갖는다. 본 발명에 따른 상기 ORF는 프레임 +2 내에 있다.
돌연변이체 2F2에서 트랜스포존은 PM70 유전자, PM1727의 상동성을 손상시킨다. 상기 트랜스포존은 Genbank 접근 번호 AE006210 (PM1727) 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 서열의 위치 644-645 에 해당하는 위치에 위치한다. PM1727의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 9 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 10 로 식별된다.
또다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질이 서열 번호 10 으로 블라스트를 수행하여 동정되었다. 상기는 해모필루스 인플루엔자 HI0621 (Genbank 접근 번호 U32744 및 AAC22281) 이다. 본 출원인은 PM1727과 HI0621 간의 183 개 아미노산에 대하여 77%의 동일성을 발견하였다.
PM1727은 가수분해효소의 슈퍼패밀리(superfamily)의 일원이며, 특히 히스티디놀 인산 포스파타제 (histidinol phosphate phosphatases)와 연관된다.
돌연변이체 3A2
상기 트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열은 서열 번호 11 (467 머)로 나타낸다. 상기 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 위치한다.
정지 코돈은 위치 428-430에 위치한다.
돌연변이체 3A2 에서 트랜스포존은 Genbank 접근 번호 AE006094 (PM0586) 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 서열의 위치 5103-5104 에 해당하는 위치에 위치한다. 본원에서 PM0586의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 12 로서 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 13 로 식별된다.
두 개의 다른 파스튜렐라세 유전자 및 단백질이 서열 번호 13 로 블라스트를 수행하여 동정되었다. 상기 유전자 및 단백질은 파스튜렐라 해몰리티카 A1 PlpD (Genbank 접근 번호 AF058703 및 AAC32565) 및 해모필루스 솜너스 (Haemophilus somnus) 31 kDa (Genbank 접근 번호 L07795 및 AAA24941) 이다. 본 출원인은 PM0586과 P. 해몰리티카 PlpD 간의 276 개 아미노산에 대하여 73%, 및 PM0586과 H. 솜너스 31 kDa 간의 273 개 아미노산에 대하여 71% 동일성을 발견하였다.
PlpD 및 PM0586은 ompA 단백질 패밀리의 일원이다.
돌연변이체 3D3
상기 트랜스포존 삽입 부위 주변의 DNA 서열은 서열 번호 14 (204 머, 5' 말단에 트랜스포존) 및 서열 번호 15 (35 머, 5' 말단에 트랜스포존) 로 나타낸다.
정지 코돈은 서열 번호 14 의 위치 7-9 및 서열 번호 15의 위치 33-35 에 위치한다.
또다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질이 서열 번호 14 및 그의 코딩된 아마노산 서열 (65 개 아미노산) 로 블라스트를 수행하여 동정되었다. 본 출원인은 PM0064 단백질과 65 개 아미노산에 대하여 100% 동일성을 발견하였다. 돌연변이체 3D3에서 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006042 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 4778-4779 또는 4787-4788, 각각 서열 번호: 14 및 15 으로부터 유래되는 위치에 해당한다. 이러한 차이는 트랜스포존 삽입 부위에서 수 개의 뉴클레오티드의 복제를 야기하는 트랜스포존의 삽입에 기인하는 것으로 보인다. 위치 4788은 PM0064 유전자 내에 위치한다. 위치 4778은 PM0064의 정지 코돈의 6 bp 하류(downstream)이다. 본원에서 PM0064의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 16 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 17 로 식별된다.
다른 그램 음성 박테리아 유전자 및 단백질은 서열 번호 17 로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자 (Genbank ref.) 단백질 (Genbank ref.) 동일성%
헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) HI0017 (U32687) HI0017 (AAC21695) 127 개 아미노산에 걸쳐 81%
대장균 (Escherichia coli) K12 YfiD (AE000344) yfiD (AAC75632) 127 개 아미노산에 걸쳐 81%
살모넬라 타이피 (Salmonella typhi) STY2839 (AL627275) yfiD (CAD02795) 127 개 아미노산에 걸쳐 81%
살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) STM2646 (AE008820) yfiD (AAL21540) 127 개 아미노산에 걸쳐 81%
세라티아 리쿠어파시엔스 (Serratia liquefaciens) 0rfX (X66505) 0rfX (CAA47136) 127 개 아미노산에 걸쳐 79%
예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) YPO2705 (AJ414153) YPO2705 (CAC92944) 127 개 아미노산에 걸쳐 79%
비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) VC2361 (AE004306) VC2361 (AAF95504) 127 개 아미노산에 걸쳐 73%
돌연변이체 3D8
트랜스포존 (transposon) 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 18 (75 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 3D8 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006080 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 7769-7770 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0445 의 상동성을 손상시킨다. PM0445 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 19 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 20 로 식별된다.
돌연변이체 3E1
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 21 (229 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 3E1 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006133 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 9195-9196 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0940 의 상동성을 손상시킨다. PM0940 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 22 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 23 으로 식별된다.
다른 그램 음성 박테리아 유전자 및 단백질은 서열 번호 17 로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자 (Genbank ref.) 단백질 (Genbank ref.) 동일성%
헤모필러스 인플루엔자 HI0075 (U32693) nrdD (AAC21751) 713 개 아미노산에 걸쳐 87%
대장균 K12 nrdD (AE000495) nrdD (AAC77195) 709 개 아미노산에 걸쳐 76%
살모넬라 타이피 STY4791 (AE627283) nrdD (CAD06912) 709 개 아미노산에 걸쳐 76%
살모넬라 타이피뮤리움 STM4452 (AE008908) nrdD (AAL23272) 709 개 아미노산에 걸쳐 76%
예르시니아 페스티스 YPO3464 (AJ414157) nrdD (CAC92683) 709 개 아미노산에 걸쳐 75%
비브리오 콜레라 VCA0511 (AE004381) VCA0511 (AAF96414) 709 개 아미노산에 걸쳐 74%
돌연변이체 3H2
트랜스포존 (transposon) 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 24 (58 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적으로 더 긴 단백질을 코딩하는 2 개의 오픈 리딩 프레임 (+1 및 -3) 을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 프레임 +1 이다.
하나의 다른 파스튜렐라세애 유전자는 서열 번호 24 및 그 코딩되는 아미노산 서열 (19 개 아미노산) 으로의 블라스트로 동정되었다. PM1951 단백질과 19 개 아미노산에 걸쳐 100% 동일성을 발견하였다. 돌연변이체 3H2 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006231 (PM1951, uvrA) 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 9418-9419 사이에 해당한다. PM1951 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 25 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 26 로 식별된다.
다른 그램 음성 박테리아 유전자 및 단백질은 서열 번호 26 으로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자 (Genbank ref.) 단백질 (Genbank ref.) 동일성%
헤모필러스 인플루엔자 UvrA (U32711) UvrA (AAC21915) 943 개 아미노산에 걸쳐 89%
대장균 K12 UvrA (AE000479) UvrA (AAC77028) 940 개 아미노산에 걸쳐 80%
예르시니아 페스티스 UvrA (AJ414142) UvrA (CAC89185) 943 개 아미노산에 걸쳐 80%
비브리오 콜레라 UvrA (AE004127) UvrA (AAF93567) 940 개 아미노산에 걸쳐 80%
살모넬라 타이피
UvrA (AL627282) UvrA (CAD09238) 941 개 아미노산에 걸쳐 80%
살모넬라 타이피뮤리움 UvrA (AE008898) UvrA (AAA27250) 941 개 아미노산에 걸쳐 80%
슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) UvrA (AE004840) UvrA (AAGO7622) 943 개 아미노산에 걸쳐 75%
UvrA 는 DNA 보수 ABC 절단 뉴클레아제이다.
돌연변이체 4D6
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 27 (54 머) 에 나타낸 다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적으로 더 긴 단백질을 코딩하는 2 개의 오픈 리딩 프레임 (+1 및 -2) 을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 틀 +1 이다.
돌연변이체 4D6 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006036 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 6492-6493 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0032 또는 hktE 의 상동성을 손상시킨다. PM0032 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 28 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 29 로 식별된다.
하나의 다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질은 서열 번호 29 로의 블라스트로 동정되었다. 이는 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans) 카탈라아제 (Genbank 접근 번호 AF162654 및 AAF17882) 이다. PM0032 와 A. 액티노마이세템코미탄스 카탈라아제 사이의 482 개 아미노산에 걸쳐 85% 동일성을 발견하였다.
HktE 는 카탈라아제이다.
돌연변이체 4F4 및 12A5
돌연변이체 4F4 에 대해서, 트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 30 (172 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 12A5 에 대해서, 트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 97 (546 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존 재한다.
4 개의 다른 파스튜렐라세애 유전자 및 단백질은 서열 번호 30 으로 코딩되는 57 개의 아미노산 서열로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자 (Genbank ref.) 단백질 (Genbank ref.) 동일성%
P. 멀토시다 (multocida) 택손 747 HyaC (AF067175) HyaC (AAC67251) 57 개 아미노산에 걸쳐 96%
P. 멀토시다 PM70 PM0776 (AE006116) AAK02860 57 개 아미노산에 걸쳐 96%
P. 멀토시다 P4218 FcbC (AF302467) FcbC (AAK17922) 57 개 아미노산에 걸쳐 91%
P. 멀토시다 P934 DcbC (AF302465) DcbC (AAK17904) 57 개 아미노산에 걸쳐 88%
돌연변이체 4F4 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006116 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 5272-5273 사이에 해당한다. 돌연변이체 12A5 중 트랜스포존의 위치는 AE006116 서열의 위치 5275-5276 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0776 의 상동성을 손상시킨다. PM0776 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 31 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 32 로 식별된다. 상기 단백질은 UDP 글루코오스 탈수소효소이다.
돌연변이체 4F12
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 33 (226 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 4F12 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006038 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 9263-9264 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0048 또는 fadR 의 상동성을 손상시킨다. PM0048 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 34 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번 호 35 로 식별된다. FadR 은 지방산 대사의 전사 조절자이며, 여러 지방산 생합성 (fab) 및 지방산 분해 (fad) 유전자에 영향을 미치는 대장균 단백질의 상동체이다.
돌연변이체 4G11
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 36 (214 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
하나의 다른 파스튜렐라세애 유전자는 서열 번호 36 및 그 코딩되는 아미노산 서열 (70 개 아미노산) 로 수행된 블라스트로 동정되었다. PM1024 단백질의 70 개 아미노산에 걸쳐 100% 동일성을 발견하였다. 돌연변이체 4G11 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006143 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 3532-3533 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM1024 또는 HtpG 의 상동성을 손상시킨다. PM1024 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 37 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 38 로 식별된다.
다른 그램 음성 박테리아 유전자 및 단백질은 서열 번호 38 로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자 (Genbank ref.) 단백질 (Genbank ref.) 동일성%
액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스 HtpG (U26968) HtpG (AAC44732) 625 개 아미노산에 걸쳐 88%
헤모필러스 인플루엔자 HtpG (U32695) HtpG (AAC21778) 625 개 아미노산에 걸쳐 86%
대장균 K12 HtpG (AEOOO153) HtpG (AAC73575) 621 개 아미노산에 걸쳐 76%
예르시니아 페스티스 HtpG (AJ414155) HtpG (CAC92355) 622 개 아미노산에 걸쳐 76%
살모넬라 타이피
STY0531 (AL627267) HtpG (CAD04972) 621 개 아미노산에 걸쳐 76%
살모넬라 타이피뮤리움 HtpG (AE008718) HtpG (AAL19441) 621 개 아미노산에 걸쳐 76%
HtpG 는 열 쇼크 (heat shock) 단백질이다.
4G11 돌연변이체는 파스퇴르 연구소 은행에 부다페스트 조약 하에 기탁되었으며, 접근 번호 CNCM I-2999 로 이용가능하다.
돌연변이체 5D5
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 39 (252 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 5D5 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006188 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 5695-5696 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM1517 또는 PlpE 의 상동성을 손상시킨다. PM1517 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 40 으로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 41 로 식별된다.
PlpE 는 막 지질단백질로 예측된다.
5D5 돌연변이체는 파스퇴르 연구소 은행에 부다페스트 조약 하에 기탁되었으며, 접근 번호 CNCM I-3000 으로 이용가능하다.
돌연변이체 5F11
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 42 (546 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다.
종결 코돈은 위치 148-150 에 위치한다.
돌연변이체 5F11 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006150 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 572-573 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM1087 또는 NifR3 의 상동성을 손상시킨다. PM1087 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 43 으로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 44 로 식별된다.
하나의 다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질은 서열 번호 44 로 수행된 블라스트로 동정되었다. 이는 헤모필러스 인플루엔자 HI0979 (Genbank 접근 번호 U32778 및 AAC22639) 였다. PM1087 및 HI0979 사이의 332 개 아미노산에 걸쳐 78% 동일성을 발견하였다.
NifR3 은 니트로게나아제 조절 유전자이다.
돌연변이체 5G9
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 45 (43 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적으로 더 긴 단백질을 코딩하는 3 개의 오픈 리딩 프레임 (+2, +3 및 -1) 을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 틀 +2 이다.
4 개의 다른 파스튜렐라세애 유전자 및 단백질은 서열 번호 45 로 코딩되는 14 개의 아미노산 서열로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자 (Genbank ref.) 단백질 (Genbank ref.) 동일성%
P. 멀토시다 P4218 FcbE (AF302467) FcbE (AAK17920) 14 개 아미노산에 걸쳐 100%
P. 멀토시다 PM70 PM0774 (AE006116) HyaE (AAK02858) 14 개 아미노산에 걸쳐 100%
P. 멀토시다 택손 747 HyaE (AF067175) HyaE (AAC67249) 14 개 아미노산에 걸쳐 100%
P. 멀토시다 P934 DcbE (AF302465)
DcbE (AAK17906) 14 개 아미노산에 걸쳐 71%
돌연변이체 5G9 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006116 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 573-574 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0774 또는 HyaE 의 상동성을 손상시킨다. PM0774 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 46 으로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 47 로 식별된다. 상기 유전자는 캡슐 합성에 관여한다.
돌연변이체 6E5
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 48 (279 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
개시 코돈은 위치 169-171 에 위치한다.
돌연변이체 6E5 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006182 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 6673-6674 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM1459 또는 pgtB 의 상동성을 손상시킨다. PM1459 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 49 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 50 으로 식별된다.
PgtB 는 포스포글리세레이트 수송 조절 단백질이다.
돌연변이체 6E6
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 51 (93 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
종결 코돈은 위치 12-14 에 위치한다.
돌연변이체 6E6 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006096 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 9051-9052 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0605 의 상동성을 손상시킨다. PM0605 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 52 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 53 으로 식별된다.
돌연변이체 6F12
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 54 (772 머) 에 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다.
개시 코돈은 위치 2-4 에 위치한다.
돌연변이체 6F12 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006192 인 파스테우렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 5362-5363 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM1556 또는 comF 유전자의 상동성을 손상시킨다. PM1556 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 55 로 식별되며, 그 아미노산 서열은 서열 번호 56 으로 식별된다.
ComF 는 적격성 (competence) 단백질 F 이다.
돌연변이체 6G4
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열은 서열 번호 57 (700 머) 로 나타낸다. 상기 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단의 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 6G4 에서의 트랜스포존의 위치는 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열인, Genbank 접근 번호 AE006206 의 위치 3758-3759 사이에 상응한다. 삽입은 PM1696 및 PM1697 유전자 사이에 있다. 트랜스포존은 프로모터 영역 및 PM1696 의 개시 코돈 사이에 삽입된다.
PM1696 의 개시 코돈은 서열 번호 57 서열에서의 위치 26-28 에 위치한다.
PM1696 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 58 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 59 로 식별된다.
기타 그람 음성 박테리아 유전자 및 단백질은 서열 번호 59 를 이용한 블라스트 (blast) 로 식별했다.
균주 유전자 (Genbank 번호) 단백질 (Genbank 번호) 상동성%
해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) HI0266 (U32713) HI0266 (AAC21932) 184 개 아미노산에 걸쳐 87%
살모넬라 타이피 (Salmonella typhi) STY3386 (AL627278) STY3386 (CAD07732) 185 개 아미노산에 걸쳐 71%
살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) STM3207
(AE008847)
ygiH (AAL22081) 185 개 아미노산에 걸쳐 71%
돌연변이체 6H1
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 60 (188 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 6H1 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006119 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 4139-4140 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0806 또는 speF 유전자의 상동성을 손상시킨다. PM0806 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 61 으로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 62 로 식별된다.
두 개의 다른 파스튜렐라세애 및 비브리오나세애(Vibrionaceae) 유전자는 서열 번호 62 로 수행된 블라스트로 동정되었다. 상기 유전자들은 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) speF (Genbank 접근 번호 U32740 및 AAC22248) 및 비브리오 콜레라 오르니틴 (Vibrio cholerae ornithine) 탈카르복실화효소 (decarboxylase) (AE004431 및 AAF96957) 이다. PM0806 과 H. 인플루엔자 (H. influenzae) speF 사이에서는 719 개의 아미노산에 걸쳐 83% 의 상동성을 발견했다.
SpeF 는 오르니틴 탈카르복실화효소이다.
돌연변이체 6H6
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 63 (101 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단의 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적인 더 긴 단백질을 코딩하는 2 개의 오픈 리딩 프레임 (+1 및 -1) 을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 프레임 +1 내에 있다.
돌연변이체 6H6 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006155 인 파스튜렐라세애 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 983-984 사이에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM 1138 의 상동성을 손상시킨다. 본원에서 PM 1138 의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 64 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 65 로 식별된다.
돌연변이체 7A7
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 66 (222 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다. 돌연변이체 7A7 의 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006170 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 7853-7854 에 해당한다 (PMI1321 및 PM1322 사이의 유전자간 영역 내). 트랜스포존은 PM1322 의 종결 영역 및 정지 코돈 사이에 삽입된다.
정지 코돈은 서열 번호 66 서열 내의 위치 25-27 에 위치한다. PM 1322 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 67 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 68 로 식별된다.
돌연변이체 7F8
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 69 (55 머) 로 나타냈다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적인 더 긴 단백질을 코딩하는 3 개의 오픈 리딩 프레임 (+1, +3 및 -3) 을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 프레임 +3 이다.
돌연변이체 7F8 내의 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006224 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 8292-8293 에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM 1866 의 상동성을 손상시킨다. PM1866 의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 70 으로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 71 로 식별된다.
돌연변이체 9C8
트랜스포존 삽입 부위의 양면의 DNA 서열을 서열 번호 72 (598 머, 5' 말단 에 트랜스포존) 및 서열 번호 73 (561 머, 5' 말단에 트랜스포존) 으로 나타낸다.
정지 코돈은 서열 번호 72 의 위치 26-28 에 위치한다. 서열 번호 72 및 73 의 서열은 함께 조합되어 ORF 를 한정한다. 생성되는 서열은 서열 번호 74 (575 머) 로 정한다.
돌연변이체 9C8 의 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006132 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 2224-2225 또는 2210-2211 에 해당하며, 상기 위치들은 각각 서열 번호 72 및 73 으로부터 추론된다. 두 위치가 모두 PM0926 (fimA) 유전자의 내측에 있다. PM0926 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 75 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 76 으로 식별된다.
또다른 파스튜렐라에 유전자/단백질은 서열 번호 76 으로 수행된 블라스트로 동정되었다. 이는 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) FimA (Genbank 접근 번호 AF053125 및 AAC08991) 이다. PM0926 와 H. 인플루엔자 (H. influenzae) FimA 사이에는 171 개의 아미노산 사이에 걸쳐 77% 의 상동성을 발견했다.
FimA 은 섬모 (fimbrial) 단백질인 어드헤신 (adhesin) 이다.
9C8 돌연변이체는 부다페스트 조약 하에 파스퇴르 연구소 (Pasteur Institute Collection) 에 기탁되었으며, 접근번호 CNCM I-3001 로 입수가능하다.
돌연변이체 9H4
트랜스포존 삽입 부위 양면의 DNA 서열을 서열 번호 92 (1391 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 위치 850-851 에서 삽입되었다. 상기 서열은 단지 1 개의 리딩 프레임을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 프레임 -2 중에 있다.
개시 코돈은 서열 번호 92 의 위치 1318-1316 에 위치하며, 종결 코돈은 상기의 위치 29-31 에 위치한다. ORF 제공 서열을 서열 번호 93 (1290 머) 로 정하고, 그의 아미노산 서열을 서열 번호 94 로 정한다.
서열 번호 92 및 서열 번호 94 로 수행된 블라스트는 임의의 동종 유전자 또는 단백질을 동정하지 못했다.
9H4 돌연변이체는 부다페스트 조약 하에 파스퇴르 연구소에 기탁되었으며, 접근 번호 CNCM I-3002 로 입수가능하다.
돌연변이체 10G11
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 77 (70 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다. 개시 코돈은 위치 62-64 에 위치한다.
돌연변이체 10G11 내 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006056 의 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 2938-2939 에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0220 (rpL3 1_1) 의 상동성을 손상시킨다. PM0220 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 78 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 79 로 식별된다.
RpL3 1-1 은 50S 리보솜 단백질이다.
돌연변이체 11E8
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 80 (506 머) 로 나타낸다. 트랜스포존의 상기 서열의 5' 말단 바로 곁에 존재한다.
개시 코돈은 서열 번호 80 의 위치 195-197 에 위치한다.
돌연변이체 11E8 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006085 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 282-283 에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0488 의 상동성을 손상시킨다. PM0488 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 81 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 82 로 식별된다.
돌연변이체 12A1
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 83 (243 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
또다른 파스튜렐라세애 유전자는 서열 번호 83 및 그의 코딩되는 아미노산 서열 (81 개의 아미노산)으로 수행된 블라스트로 동정되었다. PM0063 단백질과 81 개의 아미노산에 걸쳐 100% 의 상동성을 발견했다. 돌연변이체 12A1 중의 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006042 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 2880-2881 에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM0063 또는 lepA 유전자의 상동성을 손상시킨다. PM0063 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 84 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 85 로 식별된다.
다른 그람 음성 박테리아 유전자 및 단백질은 서열 번호 85 로 수행된 블라스트로 동정되었다.
균주 유전자
(Genbank ref.)
단백질
(Genbank ref.)
동일성%
헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) H10016 (U32687) LepA (AAC21694) 598 개의 아미노산에 걸쳐 95%
예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) YPO2716 (AJ414153) LepA (CAC92955) 597 개의 아미노산에 걸쳐 88%
대장균 K 12 (Escherichia coli K12) LepA (AE000343) LepA (AAC75622) 597 개의 아미노산에 걸쳐 89%
살모넬라 타이피 (Salmonella typhi) STY2829 (AL627275) LepA (CAD02785) 597 개의 아미노산에 걸쳐 89%
살로넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) LepA (AE008817) LepA (AAL21477) 597 개의 아미노산에 걸쳐 89%
비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) VC2463 (AE004316) LepA (AAF95605) 597 개의 아미노산에 걸쳐 84%
슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) PA0767 (AE004511) LepA (AAGO4156) 594 개의 아미노산에 걸쳐 75%
LepA 은 GTP-결합 멤브레인 단백질이다.
돌연변이체 12B3
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 서열 번호 86 (147 머) 로 나타낸다. 트랜스포존은 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다.
돌연변이체 12B3 중 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006152 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 4028-4029 에 해당한다. 트랜스포존은 PM70 유전자 PM1112 또는 deaD 유전자의 상동성을 손상시킨다. PM 1112 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 87 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 88 로 식별된다.
또다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질은 서열 번호 88 로 수행된 블라스트로 동정되었다. 이는 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) HI0231 (Genbank 접근 번호 U32709 및 AAC21900) 이다. PM1112 및 HI0231 사이의 605 개 아미노산에 걸쳐 80% 의 상동성을 발견했다.
DeaD 는 RNA 헬리케이즈이다.
돌연변이체 13E1
트랜스포존 삽입 부위 측면의 DNA 서열을 서열 번호 89 (187 머) 로 나타낸다. 트랜스포존의 상기 서열의 3' 말단 바로 곁에 존재한다. 상기 서열은 잠재적으로 더 긴 단백질을 코딩하는 2 개의 오픈 리딩 프레임 (+1 및 -3) 을 갖는다. 본 발명에 따른 ORF 는 프레임 -3 에 있다.
삭제
돌연변이체 13E1 내의 트랜스포존의 위치는 Genbank 접근 번호 AE006138 (PM0989) 인 파스튜렐라 멀토시다 PM70 게놈 서열의 위치 2173-2174 사이에 해당한다. PM0989 의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 90 로 식별되며, 그의 아미노산 서열은 서열 번호 91 로 식별된다.
또다른 파스튜렐라세애 유전자/단백질은 서열 번호 91 로 수행된 블라스트로 동정되었다. 이는 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) HI0325 (Genbank 접근 번호 U32717 및 AAC21988) 이다. PM0989 및 HI0325 사이의 414 개 아미노산에 결쳐 79% 의 상동성을 발견했다.
13E1 돌연변이체는 부다페스트 조약 하에 파스퇴르 연구소에 기탁되었으며, 접근 번호 CNCM I-3003 으로 입수가능하다.
실시예 5: 트랜스포존 삽입 돌연변이체의 PCR 선별
트랜스포존은 박테리아의 게놈 내의 임의의 위치에 삽입될 수 있다. 그러나, 올바른 돌연변이체의 선별은 PCR 을 이용하여 수행될 수 있다.
한 쌍의 프라이머가 사용되는데, 하나는 트랜스포존에 특이적인 것으로, 예컨대 Tn10IR1 (서열 번호 101), Th10IR4 (서열 번호 102), KTGRI (서열 번호 100), StipA (서열 번호 99) 및 StipJ (서열 번호 98) 이며, 다른 하나는 돌연변이화된 유전자 또는 서열에 대해 특이적이다. 상기 유전자 또는 이의 일부의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 상기 서열분석된 트랜스포존의 삽입 위치 부근 영역의 서열) 은 상기 프라이머의 고안에 도움이 된다. 이는 파스튜렐라 멀토시다의 기타 균주, 또는 기타 그람 음성 박테리아, 예컨대 파스튜렐라세애 패밀리의 박테리아, 특히 파스튜렐라 해몰리티카, 파스튜렐라 아나티페스티페르 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니애의 유전자 또는 뉴클레오티드 서열에 적용될 수 있다.
파스튜렐라 멀토시다 균주 PM70 또는 P-1059 (실시예 4) 내에서의 해당하는 유전자 또는 ORF 및/또는 이들의 조절 영역에 대한 지식, 예컨대 그의 크기는, 증폭된 PCR 단편을 스크리닝하고, 돌연변이화된 유전자 또는 서열 내에 삽입된 트랜스포존에 해당하는 크기를 가진 것을 검출하기 위해 이용된다. 트랜스포존이 유전자의 외부에 삽입된 경우, 증폭된 PCR 단편이 없을 수 있거나, 또는 크기가 너무 크게 단편을 증폭할 수 있다. 따라서, PCR 은 돌연변이의 선별을 가능케한다.
파스튜렐라 멀토시다 P-1059 균주에 대해, 상기 유전자 특이적 프라이머는 하기일 수 있다:
Figure 112004045212417-pct00007
선행기술에서 수득한 돌연변이체의 경우, PCR 은 하기의 프라이머쌍으로 수행되었으며, 증폭된 PCR 단편은 하기의 크기를 가진다:
Figure 112004045212417-pct00008
실시예 6: 상동성 공격 (homologous challenge) 에 대한 트랜스포존 삽입 돌연변이의 효능 및 보호
파스튜렐라 멀토시다 16084 균주 유래의 트랜스포존 삽입 돌연변이체 (실시 예 1) 를 3 주령의 일반적인 칠면조에게 점안에 의해 투여했다. 효능은 파스튜렐라 멀토시다 16084 균주로 인한 안내 상동성 공격 (homologous challenge) 에 대해 연구되었다.
24 개 군의 3 주령인 일반적인 칠면조를 정했다. 제 0 일째에, 군들에게 하기 표에 나타낸 돌연변이체를 약 108 CFU 으로 점안하여 접종했다.
한 군의 3 주령인 일반적인 칠면조를 백신접종하지 않고 대조군으로 제공했다 (군 25).
모든 칠면조를, 새 한 개체마다 108 CFU 의 점안으로 파스튜렐라 멀토시다 16084 균주를 사용하여 제 23 일째에 공격했다.
치사율은 공격 후 2 주 동안 매일 기록했다. 연구 종결시 (제 37 일), 임상적인 시험은 생존한 새의 건강 상태를 측정하여 수행했다.
공격당한 새의 개체수 및 제 37 일째에 건강한 새의 개체수를 고려하여 보호 율을 계산했다.
Figure 112004045212417-pct00009
일부의 군에 대해서, 상기의 실험을 재현하고, 보호율을 누적했다. 본 발명의 일부 돌연변이체는 상기 실험에서 시험되지 않았다.
실시예 7: 이종성 공격에 대한 트랜스포존 삽입 돌연변이체의 효능 및 보호
파스튜렐라 멀토시다 16084 균주로부터 유도된 트랜스포존 삽입 돌연변이체 (실시예 1) 를 3 주령의 일반적인 칠면조에 점안으로 투여했다. 효능은 파스튜렐라 멀토시다 X73 균주 (USDA) 로 안내 이종성 공격 (ocular heterogous challenge) 에 대해 연구했다.
3 주령인 10 마리의 일반적인 칠면조 5 개군을 정했다. 제 0 일 째에, 군들은 하기 표에 표시한 바와 같이 약 108 CFU 의 돌연변이체를 점안하여 접종했다.
3 주령인 10 마리의 일반적인 칠면조 한 군을 백신접종하지 않고 남겨두고 대조군으로서 제공했다 (군 6).
모든 칠면조를 새 1 마리 당 106 CFU 로 점안하여 투여되는 파스튜렐라 멀토시다 X73 균주를 이용하여 제 21 일째에 공격했다.
치사율은 공격 후 2 주 동안 매일 기록했다. 연구 종결시 (제 36 일째), 임상 시험을 수행하여 생존한 새의 건강 상태를 측정했다.
보호율은 공격한 새의 개체수 및 제 36 일째에 건강한 새의 개체수를 고려하여 계산했다.
Figure 112004045212417-pct00010
실시예 8: 콘쥬게이션에 의한 예정 결실 돌연변이체의 구축
초기에, 표적 유전자 + 부근 DNA 서열을 고성능 폴리머라제를 이용한 PCR 로 증폭하고 적합한 클로닝 벡터로 클로닝했다. 초기 구축물을 생성하기 위한 역방향 PCR 에 사용되는 경우 유전자를 결실시키는 PCR 프라이머를 고안했다. 상기 PCR 프라이머는 XbaI 부위를 포함하여 신규한 제한효소 부위를 도입하고, 따라서 유전자 결실에 대한 마커를 제공한다. 이어서, 결실 구축물은 파스튜렐라세애 염색체로의 이동을 위해 자살 벡터 (suicide vector) pCVD442 로 이동된다 (Donnenberg 등, Infection and Immunity, 1991, 59: 4310-4317). 이어서, pCVD442 플라스미드는 E. coli 균주 SM10λpir 로 형질전환된다. 상기 구축물은 E. coli SM10λpir/pCVD442 로 콘쥬게이션되어 16084 (CDM) P. multocida 균주로 도입된다. 상동 부위에 염색체로 통합된 플라스미드를 포함하는 형질전환체 및 재조합체 (자오선 이성질체 (merodiploids)) 는 pCVD442 플라스미드 상에 존재하는 항생제 내성 마커 (앰피실린 내성 유전자) 를 이용하여 선별된다. Pasteurella 돌연변이체는 1 ㎍/ml 의 앰피실린이 보충된 BHI 아가 플레이트 상에서 선별된다.
pCVD442 플라스미드는 복제를 위해서는 Pir 단백질을 필요로 한다. 상기 단백질은 pir 유전자에 의해 코딩되는데, 이는 공여자 균주 SM10λpir 내의 람다 파지 라이소겐으로서 존재하나, 수용자 파스튜렐라세애 물토시타 (P. multocida) 에는 존재하지 않는다. 따라서, pCVD442 플라스미드는 수용자 파스튜렐라세애 물토시타 (P. multocida) 균주에서는 복제하지 않는다: 따라서, 항생제 내성 콜로니는 플라스미드가 염색체에 통합된 경우에만 수득된다. 상기 자살 벡터는 또한 효소 레반 수크라아제 (enzyme levan sucrase) 를 코딩하는 sacB 유전자를 포함하는데, 이는 수크로오스 존재 하의 대부분 그람 음성 박테리아에 대해 독성이다. 따라서, 수크로오스 선별은 제 2 재조합 발생이 일어나 염색체로부터 플라스미드가 소실된 콜로니를 단리하기 위한 상대 선별법으로서 이용될 수 있다. 상기 제 2 재조합 발생은 2 가지의 결과, 즉 야생형 대립유전자의 재생성 또는 결실 돌연변이체의 생성을 초래할 수 있다. 결실 돌연변이체를 포함하는 콜로니는 콜로니 PCR 로 식별된다.
실시예 9: 전기천공에 의한 예정 결실 돌연변이의 구축
초기에, 표적 유전자 + 부근 DNA 서열을 고성능 폴리머라제를 이용한 PCR 로 증폭시키고, 적합한 클로닝 벡터에 클로닝했다. 초기 구축물 생성을 위한 역방향 PCR 에 사용되는 경우 유전자를 결실시키는 PCR 프라이머를 고안했다. 상기 PCR 프라이머는 XbaI 부위를 포함하여, 신규한 제한효소 부위를 도입함으로써, 유전자 결실에 대한 마커를 제공한다. 이어서, 결실 구축물은 파스튜렐라 (Pasteurella) 염색체로의 이동을 위해 자살 벡터 pCVD442 로 이동시킨다. 상기 구축물은 전기천공으로 16084 (CDM) P. multocida 균주에 도입된다. 16084 의 실질적인 세포외 캡슐을 제거하기 위해, 정상 (stationary phase) 세포를 양의 고환 히알루로니다아제 (타입 V, 사용 전 멸균여과, 최종 농도 25 ㎍/ml) 로 1 시간 동안 처리한 후, 수합하여 세포를 세척한다. pCVD442 (1.5 ㎍) 을 10% 글리세롤 (0.05 ml, 1010 세포/ml) 중 세포 현탁액과 혼합한 직후, 혼합물을 빙냉 1 mm 전기천용 큐벳 (Biorad, Hercules, CA, USA) 으로 피펫팅한다. GenePulser (Biorad) 를 이용하여 세포를 펄스한다 (12.5 kV/cm, 250 ohms, 40 ㎌). 펄스 직후, 세포를 1 ml BHI 로 희석하고, 배양물 일부 (5 - 50 ㎕) 를 재빨리 (1 - 5 분 이내) 1 ㎍/ml 의 앰피실린을 함유하는 BHI 아가 플레이트 상에 도말한다. 상동성 부위에서 염색체 에 통합된 플라스미드를 포함하는 재조합체 (자오선 이성체) 를 플라스미드 상에 존재하는 항생제 내성 마커 (앰피실린 내성 유전자) 를 이용하여 선별한다.
pCVD442 플라스미드는 수용자 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) 균주 내에서 복제하지 않으며, 따라서 항생제 내성 콜로니는 플라스미드가 염색체에 통합되는 경우에만 수득된다. 상기 자살 벡터는 또한 효소 레반 수크라아제를 코딩하는 sacB 유전자를 포함하는데, 이는 수크로오스 존재 하의 대부분 그람 음성 박테리아에 대해 독성이다. 따라서, 수크로오스 선별은 제 2 재조합 발생이 일어나 염색체로부터 플라스미드가 소실된 콜로니를 단리하기 위한 상대 선별법으로서 이용될 수 있다. 상기 제 2 재조합 발생은 2 가지의 결과, 즉 야생형 대립유전자의 재생성 또는 결실 돌연변이체의 생성을 초래할 수 있다.
콜로니는 37℃에서 2-4 일 동안 인큐베이션한 후 나타난다. 콜로니를 유사한 플레이트에 도말하면 개별적인 형질전환체가 단리된다. 결실 돌연변이를 포함하는 콜로니는 콜로니 PCR 로 식별된다.
실시예 10: 백신 및 효능의 시험
실시예 8 또는 9 에서 수득된 감쇠된 결실 돌연변이를 CDM 배양 배지 (Hu 등, Infection and Immunity 1986, 804-81 0) 에서 24 시간 내지 48 시간 동안의 진탕 조건 하에 배양한다.
배양물은 흡광도 또는 pH 측정을 하여 성장이 정지할 때 수합한다.
박테리아 농도는 흡광도로 측정되며, 필요한 경우 농도는 신선한 배양 배지 ml 당 109 CFU 의 최종 농도로 조정한다.
백신의 효능은 백신접종 및 공격에 의해 3 주령 칠면조에서 시험한다.
칠면조는 백신접종 전에 혈액 샘플의 ELISA 로 Pasteurella 항체의 부재성 여부에 대해 검사한다.
제 1 군의 칠면조는 안구 경로를 통해 0.1 ml 로 108 CFU 를 주사하여 백신접종했다.
제 2 군은 백신접종하지 않고 남겨두었다 (대조군).
모든 동물들은 제 21 일 또는 제 23 일째에 안구 경로를 통해 P. multocida P-1059 균주 (1 마리 당 108 CFU, 0.1 ml) 로 공격했다.
치사율은 제 35 일째까지 매일 관찰했다.
대조군에 비해 백신접종된 동물에서 더 낮은 치사율이 관찰된다.
본 발명은 하기의 항목들로 더 기술된다.
1. 그람 음성 박테리아의 돌연변이체로서, 상기 박테리아가 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 또는 93 로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 돌연변이가 있고, 상기 돌연변이가 박테리아의 발병력 감쇠를 초래하는 돌연변이체.
2. 항목 1 에 있어서, 박테리아가 파스튜렐라세애인 돌연변이체.
3. 항목 2 에 있어서, 박테리아가 파스튜렐라 멀토시다, 파스튜렐라 해몰리티카, 파스튜렐라 아나티페스티페르 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니애로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이체.
4. 항목 3 에 있어서, 박테리아가 파스튜렐라 멀토시다인 돌연변이체.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이가 뉴클레오티드 서열 중의 결실, 또는 그곳으로의 삽입 또는 핵산의 치환인 돌연변이체.
6. 항목 5 에 있어서, 돌연변이가 전체 뉴클레오티드 서열의 결실인 돌연변이체.
7. 항목 5 에 있어서, 서열 번호 2 에서 뉴클레오티드 180-181 또는 182-183 또는 190-191, 서열 번호 6 에서 뉴클레오티드 77-78 또는 1026-1027 또는 1027-1028, 서열 번호 9 에서 뉴클레오티드 416-417, 서열 번호 12 에서 뉴클레오티드 389-390, 서열 번호 16 에서 뉴클레오티드 381-382, 서열 번호 19 에서 뉴클레오티드 219-220, 서열 번호 22 에서 뉴클레오티드 1353-1354, 서열 번호 25 에서 뉴클레오티드 136-137, 서열 번호 28 에서 뉴클레오티드 384-385, 서열 번호 31 에서 뉴클레오티드 222-223 또는 225-226, 서열 번호 34 에서 뉴클레오티드 217-218, 서열 번호 37 에서 뉴클레오티드 1411-1412, 서열 번호 40 에서 뉴클레오티드 943-944, 서열 번호 43 에서 뉴클레오티드 855-856, 서열 번호 46 에서 뉴클레오티드 369-370, 서열 번호 49 에서 뉴클레오티드 111-112, 서열 번호 52 에서 뉴클레오티드 443-444, 서열 번호 55 에서 뉴클레오티드 4-5, 서열 번호 58 에서 뉴클레오티 드 1 의 바로 상류, 서열 번호 61 에서 뉴클레오티드 573-574, 서열 번호 64 에서 뉴클레오티드 875-876, 서열 번호 67 에서 뉴클레오티드 1 의 바로 상류, 서열 번호 70 에서 뉴클레오티드 218-219, 서열 번호 75 에서 뉴클레오티드 1072-1087, 서열 번호 78 에서 뉴클레오티드 64-65, 서열 번호 81 에서 뉴클레오티드 282-283, 서열 번호 84 에서 뉴클레오티드 1431-1432, 서열 번호 87 에서 뉴클레오티드 974-975, 서열 번호 90 에서 뉴클레오티드 802-803, 서열 번호 92 에서 뉴클레오티드 850-851 사이에서 삽입이 있는 돌연변이체.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 병원성 바이러스, 기생체 또는 박테리아 제제 유래의 면역원, 치료용 단백질, 알레르겐 (allergen), 성장 인자 또는 싸이토카인을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함하는 돌연변이체.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 따른 감쇠된 돌연변이체 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 함유하는 면역원성 조성물.
10. 항목 9 에 있어서, 아쥬반트를 추가로 함유하는 면역원성 조성물.
11. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 따른 감쇠된 돌연변이체 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 함유하는 백신.
12. 항목 11 에 있어서, 아쥬반트를 추가로 함유하는 백신.
13. 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 으로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제, 및 임의로는 아쥬반트를 함유하는 면역원성 조성물.
14. 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드에 특이적인 항체를 함유하는 항체 제제.
15. 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드에 특이적인 항체를 이용하여 그람 음성 박테리아에 의한 감염을 검출하기 위한 진단 방법.
16. 그람 음성 박테리아에 대한 수동 면역 조성물 또는 치료용 조성물 제조를 위한 항목 14 에 따른 항체 제제의 용도.
17. 배지 중 그람 음성 박테리아 검출용 PCR 을 위한 프라이머로서의, 서열 번호 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 으로 식별되는 뉴클리오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 20 개 이상의 뉴클레오티드의 단편의 용도.
***
본 발명의 바람직한 구현예가 상기 기재되었지만, 이들의 다수의 자명한 변형예가 본 발명의 진의를 벗어나지 않고 이용가능하기 때문에 상기 항목에 의해 정해지는 본 발명이 상기 기재된 특정 사항으로만 한정되지 않는다.












<110> MERIAL LIMITED <120> ATTENUATED GRAM NEGATIVE BACTERIA <130> 454313-3171.1 <140> 10/406,686 <141> 2003-04-03 <150> 60/370,282 <151> 2002-04-05 <160> 118 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 775 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <220> <221> modified_base <222> (580) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (599) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (617) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (637) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (668) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (698) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (703) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (707) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (715)..(716) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (718)..(719) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> 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cccagatttc attcatactc aaaaacgtaa tccacaaact 480 aacttgcgtg atgcaaacgc ggcatgggat ttctggtcac gtcatcctga atcattacac 540 caaatcatga ttcttttcag tgatcgtggt attccaactg acttacgtca tatgaacggt 600 tacggtagcc atacatatag ctttattaac gcacaaaatg agcgtttctg ggtgaaattc 660 cacttcaaaa cacaacaagg tcacaaattc tatactaatg aagaagcggc taaagtggtg 720 ggtgaaaacc gtgagtcaag ccaacaagat ttatacgaag cgattgagcg tggcgaattc 780 ccacgttgga atgttcaagt gcaaatcatg ccagaagcag atgcacacaa acataactat 840 gcgtttgact taactaaagt atggccacac aaagattatc cgatgatcga agtgggtgta 900 ttagagttaa accaaaaccc aattaactac ttcgcagaag tggaacaagc tgcgtttgca 960 ccttctaaca tcgtaccggg aattggtttc tcaccagacc gtatgttaca aggtcgtctt 1020 ttctcatacc aagacgcgca acgttatcgt ttaggggtta accatcacca aatcccagtg 1080 aacgcaccaa aatgcccata ccacaccact caccgtgatg gcgcaatgcg tgtagataac 1140 aatggtggta cacaccctaa ctatgcaccg aaccgttttg atacttatgt gccgactcac 1200 caacaagagc ctgcattaga gttagagcgt tcagcagcac actttaactt ccgtgagtat 1260 gatgaagact actacacaca acctgccgca 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acgaatgatt ctcttcatga caaactttca atgtcttctc atgacacatc caaagaaaat 240 agtcaacaat cctcctttaa agcccctcta gaacaagaaa aaaaccaacc tgcacaagaa 300 aatctcactt ggacaggtta tcatgtttca gaagtgggaa atgcgagtaa taatgtagat 360 aaagataacg ttacggtatt cactttcgta aaatataatt ctcaatacaa tgatgatcca 420 gtttttgata aaacaaaaac acaaagtaaa acaatatcat tagttgacgg aaaaaatgag 480 aataaagagg attattataa ctttacgtta aaagacgctt tattttatta tggaagttat 540 ggacaacctt cagcagatta caaaaaagta gaaaaaaatt atatttatgc aattaaacca 600 gatgcaataa ataatgagaa cctcaatgca ctaactgcaa cttattatca agaagatggt 660 tttatatatt ccgtattaag tgatgtaaat cgagttggtt cagaatatat tcctcagtat 720 ggcaatgtga ctcttacttt ccgaaatggc aagatttatg gtgaaatcta cagatataat 780 agaggacgtg atgatttgtt tcagctctca ggagaaggac aaaacttaac tataacacca 840 cacaaggaca atccccataa actatcccct acaggacccg acaacatggc aatggagctg 900 aattttatca acgcagaaaa aactgataaa aaatacgttg ttggtgtagg aaaagctgaa 960 aaatattatg ggttattatt tgctgaaaaa agtcaccaag cacaataa 1008 <210> 41 <211> 335 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 41 Met Lys Gln Ile Val Leu Lys Thr Ser Leu Leu Met Thr Leu Ser Ser 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asn Arg Ala 20 25 30 Asp Arg Val Glu Glu Lys Ala Gln Pro Val Gln Ser Asn Ser Glu Pro 35 40 45 Ser Ser Ala Pro Ile Lys Asn Pro Thr Asn Thr Ala Thr Asn Asp Ser 50 55 60 Leu His Asp Lys Leu Ser Met Ser Ser His Asp Thr Ser Lys Glu Asn 65 70 75 80 Ser Gln Gln Ser Ser Phe Lys Ala Pro Leu Glu Gln Glu Lys Asn Gln 85 90 95 Pro Ala Gln Glu Asn Leu Thr Trp Thr Gly Tyr His Val Ser Glu Val 100 105 110 Gly Asn Ala Ser Asn Asn Val Asp Lys Asp Asn Val Thr Val Phe Thr 115 120 125 Phe Val Lys Tyr Asn Ser Gln Tyr Asn Asp Asp Pro Val Phe Asp Lys 130 135 140 Thr Lys Thr Gln Ser Lys Thr Ile Ser Leu Val Asp Gly Lys Asn Glu 145 150 155 160 Asn Lys Glu Asp Tyr Tyr Asn Phe Thr Leu Lys Asp Ala Leu Phe Tyr 165 170 175 Tyr Gly Ser Tyr Gly Gln Pro Ser Ala Asp Tyr Lys Lys Val Glu Lys 180 185 190 Asn Tyr Ile Tyr Ala Ile Lys Pro Asp Ala Ile Asn Asn Glu Asn 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atgacagtgc ggataggttc ttatcagctt aaaaatcgca tttttcttgc tcctatggct 60 ggcatcactg accaaccatt tcggcgaatc tgcactcatt atggggcagg tttaactttt 120 tctgaaatga tgtcaacgaa tccgcaagtc tggcataccg aaaaatcgaa actgcgcttg 180 gctcatcatc aagaagcagg aattaatgct gtgcaaatag ctggttgtga tcccgatgag 240 atggcgaaag ctgctcaaat caatgtagaa tatggggcag aaattattga tatcaatatg 300 ggctgcccag ccaaaaaagt gaatcgtaaa atggcgggct ctgcgctgtt acaatatcct 360 gatttggtca aacaaattct taataaagtt gtgaaatctg ttactgtacc agtgacatta 420 aagataagaa caggctggga taaagacaac cgaaattgtt tagaaatcgc taaaattgca 480 gagcaatgtg gtattcaagc actgaccatc cacggacgaa caaggagttg tatgtttgag 540 ggggaggctg aatatgacaa tatcaaggcg gtcaaagagc aactttctat tccgattatt 600 gccaatggcg atattacttc cgctgaaaaa gcaaagtatg ttcttgatta taccaacgca 660 gatgcaataa tgatcggacg tggttcatta ggcaatccgt ggcttttccg agttatggaa 720 agcttaattg aaaaagactc gattgtttta gagccaagtt taaacgagaa atgtaatgtg 780 attttacagc atatccaaga actgcatcaa ttttatggtg tggagaaagg atgtcgtatt 840 gcacgtaaac acgttgcttg 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tgcattagtg atattaaaat ttaaggtggc tcaacatgtt 1980 taa 1983 <210> 50 <211> 660 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 50 Met Lys Lys Trp Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Thr Gly Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Ile Ser Gly Leu Leu Cys Leu Phe Val Gly Gly Val Gly 20 25 30 Leu Tyr Thr Trp Gln Gln Gln Arg Thr Glu Ile Asn Phe Ala Leu Asp 35 40 45 Lys Asp Phe Pro Lys Val Gln Ala Ala Phe Gln Thr Glu Glu Gln Ile 50 55 60 Asn Ile Leu His His Ala Phe Ile His Leu Val Asn Val Lys Asn Thr 65 70 75 80 Asn Glu Lys Val Glu Arg Tyr Asn His Ala Lys Gln Gln Leu Ser Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Leu Ile Ile Glu Leu Asp Glu Asn Leu Asp Glu Asp Leu 100 105 110 Met Ala Leu Leu Gln Gln Gln Ala Ser Leu Leu Glu Gln Ile Ser Gln 115 120 125 Asn Ile Thr Gly Thr Leu Thr Leu Asn Asp Glu Leu Asn Lys Thr Ile 130 135 140 Ser Gln Ile Asn Trp Leu His Asn Asp Phe His Asn Glu Phe Thr Ala 145 150 155 160 Leu Leu Gln Glu Met Ser Trp Gln Gln Ser Thr Leu Ala Asn Asn Ile 165 170 175 Val Gln Gln Pro His Asn Lys Gln Lys Ile Glu Gln 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420 caccaaggct atttattgca gaacccacaa aacagctact gtaatttagt ggcaacgcca 480 aaattcttaa aagccaaggt gaaatttgag gaaatttgga agtaa 525 <210> 53 <211> 174 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 53 Met Thr Gln Gln Ala Ile Phe Ala Gly Gly Cys Phe Trp Cys Val Glu 1 5 10 15 Ala Val Phe Asn Gln Ile Lys Gly Val Glu Lys Ala Thr Ser Gly Tyr 20 25 30 Ile Asn Gly Thr Thr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Glu Val Cys Thr Gly 35 40 45 Glu Thr Gly His Ala Glu Ala Val Lys Val Glu Phe Asp Ala Thr Val 50 55 60 Ile Ser Tyr Glu Lys Leu Leu Asp Ile Phe Phe Ser Ile His Asn Pro 65 70 75 80 Thr Gln Leu Asn His Gln Gly Glu Asp Val Gly Thr Gln Tyr Arg Thr 85 90 95 Gly Ile Tyr Tyr Leu Asn Asp Glu Gln Glu Gln Leu Ala Asn Lys Lys 100 105 110 Ile Ala Glu Leu Gln Pro His Phe Ala Glu Lys Ile Val Thr Glu Val 115 120 125 Leu Pro Ala Gln Thr Phe Tyr Pro Ala Glu Asp Tyr His Gln Gly Tyr 130 135 140 Leu Leu Gln Asn Pro Gln Asn Ser Tyr Cys Asn Leu Val Ala Thr Pro 145 150 155 160 Lys Phe Leu Lys Ala Lys Val Lys Phe Glu Glu Ile Trp Lys 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cgctgaaact gcggtatctg tcggtgacac ntgcgcataa caatctgatg 600 ttgatcacaa aannacgaac tctggatttt gcttagataa ggatctccga tggctatcta 660 tactnatntg acatcatgta cacanncatg tcgtgccatn nnnnacttag cgaagtgcag 720 nnnccgtcat cngncannca gacatcantc cnacntgcta ttaggataan nn 772 <210> 55 <211> 687 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 55 atgcggggat ttggtttttg ttgtgttcac tgccagcaac cgttagccat tgcacatcat 60 ggattatgta gtcgctgtaa tcagcaaatc agacgttttg cttattgtgg ccattgtggt 120 aaggaattaa cacgagatgc actacgttgt gggcattgtt tacaacataa agccagttgg 180 gatcgcatgg tgatcgttgg tcactatgtc gatcccttat cttgtttaat tcaccgtttt 240 aaattccaac atgccttctt tttagaccgt actttagcac gcctgctatt attagcgctc 300 tatcatgcaa gacgtactca tggacttatt tggccagaag tacttttgcc ggtgccttta 360 catcgtttac gtcattggca acgtggttac aatcaatctg cgttgattgc aaactatctt 420 gcgcattggc taaagatacc ctgcgatcat gattttctac agcgtattaa acatactcat 480 acgcaacgtg gtttaagtgc aacggaacga agaaaaaatt tacgccacgc atttcgtctt 540 catccaaaaa gtcaaacgca tcgctatcaa tctgttgcat taattgatga tgtaattaca 600 acaggtgcaa cgttgaatga gttggcactc ttattaaaaa aagcaggtgt tgagcatatt 660 caagtttggg gattagcaaa aacgtaa 687 <210> 56 <211> 228 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 56 Met Arg Gly Phe Gly Phe Cys Cys Val His Cys Gln Gln Pro Leu Ala 1 5 10 15 Ile Ala His His Gly Leu Cys Ser Arg Cys Asn Gln Gln Ile Arg Arg 20 25 30 Phe Ala Tyr Cys Gly His Cys Gly Lys Glu Leu Thr Arg Asp Ala Leu 35 40 45 Arg Cys Gly His Cys Leu Gln His Lys Ala Ser Trp Asp Arg Met Val 50 55 60 Ile Val Gly His Tyr Val Asp Pro Leu Ser Cys Leu Ile His Arg Phe 65 70 75 80 Lys Phe Gln His Ala Phe Phe Leu Asp Arg Thr Leu Ala Arg Leu Leu 85 90 95 Leu Leu Ala Leu Tyr His Ala Arg Arg Thr His Gly Leu Ile Trp Pro 100 105 110 Glu Val Leu Leu Pro Val Pro Leu His Arg Leu Arg His Trp Gln Arg 115 120 125 Gly Tyr Asn Gln Ser Ala Leu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala His Trp Leu 130 135 140 Lys Ile Pro Cys Asp His Asp Phe Leu Gln Arg Ile Lys His Thr His 145 150 155 160 Thr Gln Arg Gly Leu Ser Ala Thr Glu Arg Arg Lys Asn Leu Arg His 165 170 175 Ala Phe Arg Leu His Pro Lys Ser Gln Thr His Arg Tyr Gln Ser Val 180 185 190 Ala Leu Ile Asp Asp Val Ile Thr Thr Gly Ala Thr Leu Asn Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Leu Leu Lys Lys Ala Gly Val Glu His Ile Gln Val Trp Gly 210 215 220 Leu Ala Lys Thr 225 <210> 57 <211> 700 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <220> <221> modified_base <222> (498) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (540) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (562) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (565) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (572)..(573) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (577) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (584) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (587)..(588) <223> a, t, c, g, other or unknown <220> <221> modified_base <222> (591)..(592) <223> a, t, c, g, other or 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ggtatgttac ctgtttggtt 240 aggctattat cttggtttga ctcattttga gttagggatg gtggcattag gtgcttgttt 300 agggcacatt ttcccaatct tctttaaatt taaaggcgga aaaggggtag caacggcatt 360 tggtgctatt gcgccgattt catggggtgt cgcaggcagt atgctgggca cttggttatt 420 gattttcttc gtgagtggtt attcttcgct cagtgcagtg atgaccgcgc ttctggtacc 480 tttctatgtg tggtggtnta agcccgagtt tactttccct gtcgcttagt gtgttgcttn 540 tcgattatcg ccatcatgac anatncagcg tnngtgngtg ggcnagnnga nnanngtgna 600 atanactgaa aacaaaaang atnantnagc tanttacnaa aaanngacag acngtcnttt 660 natncncgtt nanntatnga cntatnngat ggcntnncnn 700 <210> 58 <211> 606 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 58 atgagcctat ttgcgatttt ctatctgttc ctggcgtatt tattaggatc tgtttctagt 60 gcaattttat tgtgtcgttt agcggggttg cctgatccaa gagaaagtgg ttctcataat 120 cccggtgcaa ccaatgtctt gcgtattggt gggcgttggg tggcattgag tgtactcctg 180 tttgatatgc ttaaaggtat gttacctgtt tggttaggct attatcttgg tttgactcat 240 tttgaattag ggatggtggc attaggtgct tgtttagggc acatttttcc aatcttcttt 300 aaatttaaag gcggaaaagg 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acaactacga catcaaccta tacagtcgcc aaattgaaac tgcggcgcgg 300 ttttacgaag aaaaaatcct cccacctttc tttaaaatgc taagtgaata tgtggaaatg 360 gggaattctg cttttgattg tccgggacac caaggtggac aatatttccg taaacatcct 420 gcaggacgtt atctctatga tttctacggt gaaaatattt tccgctcaga tatctgtaat 480 gccgatgtaa aattaggcga tttgctaatc catgaaggag ccgcttgtga tgctcaaaaa 540 cacgctgctc aagtctttaa tgctgataaa acctacttcg tcttaaatgg gacatcttct 600 gcaaataaag tcgtcaccaa tgcgttactc acaccgggtg atcttgtgct ctttgatcgt 660 aacaatcaca aatctatcca tcacggtgca ttaattcaag ctggtgctac ccctgtttat 720 ttggaaactg cgcgtaatcc atttggtttt atcggtggga tcgatagcca ttgttttgat 780 gaagattatt tgaaatcttt aattaaagat gttgcgcctg aaaaactaac acaagcacgt 840 cctttccgtt tagccgttat tcagctcggc acttatgacg gaaccatcta taatgcgcgc 900 caagtcgtag ataaaattgg tcatttatgt gactacatct tgtttgattc tgcgtgggta 960 ggttatgaac aattcattcc aatgatgaaa gattgctcac cgctcttgct tgaattaaat 1020 gaaaatgatc ccggcatcat cgtgacacaa tcagtacaca aacaacaagc cggcttctca 1080 caagcctcac aaattcacaa aaaagacaag cacattaaag gtcaacagcg ctactgtaat 1140 cataaacgct ttaataatgc attcatgtta cacgcctcca ccagcccatt ctaccctctt 1200 tttgccacac ttgatgtcaa tgcaaaaatt caaggtaccc ctgcgggtat tcgtttatgg 1260 catgactgtg tcaaaatcgg gatagaagca cgtaaaatgg tgctgaatag ttgtgatctg 1320 atcaaaccgt ttattccgcc ttatgtcaat ggcaaaaaat ggcaagacta cgatacagaa 1380 gaaatggcaa atgatttaac attcttcaaa ttccatgctg atgataaatg gcatcaattt 1440 gaaggctatg tagataacca atattttgtt gatccatgta aattcatgct aacgacgccg 1500 ggtattgata ttgaaacagg tgaatacgaa gacttcggtg tccctgctac gattcttgct 1560 aattatttac gtgaaaacgg cattattccg gaaaaatgtg acttaaactc aattctcttc 1620 ttattaacgc cagcagaaac cctcaccaaa atgcaaagtt tggttgcaca aattgcggca 1680 tttgaacaac acatcaaaaa agattcctta ctaaaagaag tcttaccaag tgtttatcac 1740 aacaatgaaa aacgctatga aggttatacc atccgtcgtc tttgccaaga aatgcatgat 1800 ttgtatgtca gccgtaacgt gaaaacttta caacgcaact tattcagaaa agcgaccttg 1860 cctgaatatg tgatgaatcc acatcaagct aatcttgaat ttgttcgtaa tcgtgtagaa 1920 ctggttccac taaccgaaat cgttaatcgc attgcggcag aaggagcact tccttatcca 1980 ccgggtgtgc tttgtgtcgt accgggtgaa aaatggagtc agactgcaca ggaatatttc 2040 ttagcactcg aagaaggcat taatttatta ccaggtttcg caccagaaat tcaaggggta 2100 tatctacaac aagatgcaga tggacgtatt cgtgcttatg gctacgtatt aactgaaaac 2160 taa 2163 <210> 62 <211> 720 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 62 Met Leu Asn Leu Lys Ile Ala Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Pro Tyr Phe 1 5 10 15 His Thr Asn Arg Glu Leu Val Ser Val Gln Glu Thr Asp Phe Thr Asp 20 25 30 Ile Gly Ala Ile Ile Leu Ser Ser Glu Asp Ile Glu Asp Tyr Ile Asp 35 40 45 Ser Ile Gln Ala Thr Glu Phe Asn Ile Pro Val Phe Val Ala Val Ile 50 55 60 Glu Gly Gln Phe Leu Asp Pro Gln Phe Phe Asp Lys Val Tyr His Val 65 70 75 80 Gln Asp Leu Asn Asn Tyr Asp Ile Asn Leu Tyr Ser Arg Gln Ile Glu 85 90 95 Thr Ala Ala Arg Phe Tyr Glu Glu Lys Ile Leu Pro Pro Phe Phe Lys 100 105 110 Met Leu Ser Glu Tyr Val Glu Met Gly Asn Ser Ala Phe Asp Cys Pro 115 120 125 Gly His Gln Gly Gly Gln Tyr Phe Arg Lys His Pro Ala Gly Arg Tyr 130 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Pasteurella multocida <400> 64 atgaatattc tatttgtaca taaaagcctt gtcgtcggag gcgctgaaag aattctaatt 60 aactatttaa atattctatc tggatttaat gaattcaaag ttacattact tttactagaa 120 aataaaggtg aagataacaa aaacatcaat caaatcaata aaaatattaa tatagatttt 180 attctagaca atagtgagtc aagaaaatat actgaatttg aaaataaaat aaatcagcgc 240 agcatcttca gaaaaatata taaatataaa ctatcaaaaa ttaataagat agaagaaaat 300 agaataaaaa aatacattaa aaacaaggaa tttgatttaa ttgttaattt taactcacac 360 cttgatttct tcttatcaaa caatcaaatt aacatcccga taattcgttg gatacacggt 420 caagctcatt tagatgactg gtgcaacaga agagaatggt accaaaacat tcttcctaaa 480 cacacttatt tctttgcaat tacaaaagaa atgcaaaaaa atgctcaaaa aatcttacta 540 tcttacggga tccaagaaga aagaatacat atcttataca atcctattga tattaatttt 600 gtccaggaac aatcaatcaa aaatactcat gacattcatc ataaacaata cttaattaac 660 gtttctcgtt tagatataga taagaatcat gaacaaatga ttaatattta ttatcaatta 720 aaaaaacgag gtatccaaga aaaattatat attgttgggg atggtgagtg tcgagaaaaa 780 ttagagaaac aaatagaatc actcaatcta caagaagatt gctttctttt 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gatgttatta cgccatacag gaaatttagc gcaaactgac 660 cgcactttat taaccaattt tgcgcaacaa gaaaacttaa tgttgtttgt acaagatgat 720 caacagatca cccaactaca tggcgaggca ccttactaca tactacgcga tggcaccaaa 780 ttacagtttg atatccgtga ctttatccaa gtgaatgctg ttgtaaatca gaaaatgatt 840 gatactgctc ttgagtggtt ggaactcaca tcgaacgata acgtattaga tttgttttgt 900 ggtatgggaa acttcaccct cccaatcagt cgtcaggtca atcaggttgt gggcattgaa 960 ggcgtaggag aaatggtgga gaaagcaaaa cgaaatgcgg aacaaaatca atgtgataat 1020 gtccaattct atcaggcgaa tttagatcaa ccttttgtgc aacaacattg ggcgagccaa 1080 cattttaata aaattttact ggacccacca cgtacaggcg cggcatttgc cttacatgcc 1140 ttatgtgaat tgggcgcaga aaaaatctta tatgtttcct gcaatcctgc tacattagta 1200 cgtgatacag cgattttatt acaatttaac taccgactta agaaagtcgc aatgatcgat 1260 atgttcccca atacaggaca tttagaatcc atcagtttat ttgaaaaaga atag 1314 <210> 71 <211> 437 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 71 Met Val Leu His Tyr Thr Pro His Gln Ser Ala Pro Arg Asn Thr Thr 1 5 10 15 Phe Val Ala Glu Ile Leu Asp Leu Asp Tyr 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Leu Ile Leu Pro Ala Asp Pro Ile Ile Asp Arg Lys Thr Ser Arg 435 440 445 Gly Asp Arg Gly Glu Arg Arg Glu Arg Gly Gly Arg Glu Asn Pro Arg 450 455 460 Ser Ala Glu Arg Arg Gly Tyr Gly Thr Pro Gln Ala Met Asp Leu Tyr 465 470 475 480 Arg Ile Glu Val Gly Arg Leu Asp Gly Ala Glu Val Arg His Ile Val 485 490 495 Gly Ala Ile Ala Asn Glu Gly Asp Ile Asn Ser Arg Tyr Ile Gly His 500 505 510 Ile Lys Leu Tyr Asp Asp Tyr Thr Thr Ile Glu Leu Pro Gln Gly Met 515 520 525 Pro Lys Glu Leu Leu Gly Val Phe Ala Lys Thr Arg Val Met Asn Lys 530 535 540 Gln Met Gln Met Ser Phe Val Gly Ala Ser Asn Ala Gly Ser Ser Arg 545 550 555 560 Asp Arg Asp Asp Phe Ala Asp Arg Arg Gly Gly Lys Arg Lys Gly Arg 565 570 575 Gly Asp Glu Pro Arg Phe Gly Arg Glu Asp Arg Lys Phe Lys Glu Lys 580 585 590 Ser Gln Arg Thr Phe Asn Asp Arg Pro Arg Arg Glu Arg Arg Glu Arg 595 600 605 Gln Lys 610 <210> 89 <211> 187 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 89 tctacgttaa cgccacccgt tgtattaata acattggcaa agccagaagc agcgatcatc 60 acaaaaccaa tcatcgccat taaacgtaag ccttgttgga aaatgtcatt actttctttt 120 aatttgaaaa taccacaaac agcaaaaata atcagaccgg ctaatccacc aataatagtt 180 gaactct 187 <210> 90 <211> 1359 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 90 atgttattaa ctaaccctgt cgtgatttcc attgtggttc tacttgcgct cagtttattg 60 cgtattaatg ttgtcatcgc actcgttatt tccgcattag tggcaggttt aactggcaat 120 ttgggcgtca gtgaaacaat aaaaacgttt acgaatggac taggcggagg tgcagaggtc 180 gccatgaatt atgcgatttt aggcgcgttt gcggttgcca tttcaaaatc aggcattact 240 gatttacttg cctataaagt cattaaacgt ttgggcaata caccaagcag tcgctcaatg 300 gcgggtttta aatattttat cttaacaatc ctcacgctgt ttgccgtttc atcgcaaaac 360 ttattacctg tccatatcgc gtttattcct attgtgattc ccccgcttct tgcgattttc 420 aataaactaa aattggatcg tcgtgccgtt gcttgtgttt taacttttgg tttaaccgcc 480 acttatatgt tattaccagt agggtttggg aaaattttta ttgaaagtat cctcgttaag 540 aatatcaatc aagccggcgc gactttaggc ttacagacat ctgtggctga agtgtcatta 600 gctatggcag tcccagtgat tggcatgatt cttggtttac tgacagcgat ctttattagc 660 tatcgtaaac cgagagaata tgccatgatg cgcagcgaaa tcagcacgca agatattgaa 720 tcacatgttg ctcaaatcaa gccgttccat gtcggcgcaa gtttagtggc aatcattgtt 780 acttttgccc ttcagctctt taccagttca accattattg gtggattagc cggtctgatt 840 atttttgctg tttgtggtat tttcaaatta aaagaaagta atgacatttt ccaacaaggc 900 ttacgtttaa tggcgatgat tggttttgtg atgatcgctg cttctggctt tgccaatgtt 960 attaatacaa cgggtggtgt aacggcgtta gttgaaacct tcagtcaagg ttttggcgca 1020 gaaaataaag ggattgcagc ctttttaatg ctgttagttg gcttatttat tactatgggg 1080 attggctcat cattctcaac ggtacctatt attgcctcta tttatgtacc actttgtctt 1140 tctcttggtt tctcaccttt agcaacggtt tcgcttattg gggtatccgc tgcgcttggt 1200 gatgcgggtt cgcctgcctc tgactcaaca ttaggaccaa cctcgggttt aaatgcagat 1260 ggtaaacatg atcatatttg ggattctgtc gtcccaacat ttatccatta taatatccca 1320 ctcattcttt tcggttggtt agccgccatg tatctgtaa 1359 <210> 91 <211> 452 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 91 Met Leu Leu Thr Asn Pro Val Val Ile Ser Ile Val Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ser Leu Leu Arg Ile Asn Val Val Ile Ala Leu Val Ile Ser Ala 20 25 30 Leu Val Ala Gly Leu Thr Gly Asn Leu Gly Val Ser Glu Thr Ile Lys 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Gly Leu Gly Gly Gly Ala Glu Val Ala Met Asn Tyr 50 55 60 Ala Ile Leu Gly Ala Phe Ala Val Ala Ile Ser Lys Ser Gly Ile Thr 65 70 75 80 Asp Leu Leu Ala Tyr Lys Val Ile Lys Arg Leu Gly Asn Thr Pro Ser 85 90 95 Ser Arg Ser Met Ala Gly Phe Lys Tyr Phe Ile Leu Thr Ile Leu Thr 100 105 110 Leu Phe Ala Val Ser Ser Gln Asn Leu Leu Pro Val His Ile Ala Phe 115 120 125 Ile Pro Ile Val Ile Pro Pro Leu Leu Ala Ile Phe Asn Lys Leu Lys 130 135 140 Leu Asp Arg Arg Ala Val Ala Cys Val Leu Thr Phe Gly Leu Thr Ala 145 150 155 160 Thr Tyr Met Leu Leu Pro Val Gly Phe Gly Lys Ile Phe Ile Glu Ser 165 170 175 Ile Leu Val Lys Asn Ile Asn Gln Ala Gly Ala Thr Leu Gly Leu Gln 180 185 190 Thr Ser Val Ala Glu Val Ser Leu Ala Met Ala Val Pro Val Ile Gly 195 200 205 Met Ile Leu Gly Leu Leu Thr Ala Ile Phe Ile Ser Tyr Arg Lys Pro 210 215 220 Arg Glu Tyr Ala Met Met Arg Ser Glu Ile Ser Thr Gln Asp Ile Glu 225 230 235 240 Ser His Val Ala Gln Ile Lys Pro Phe His Val Gly Ala Ser Leu Val 245 250 255 Ala Ile Ile Val Thr Phe Ala Leu Gln Leu Phe Thr Ser Ser Thr Ile 260 265 270 Ile Gly Gly Leu Ala Gly Leu Ile Ile Phe Ala Val Cys Gly Ile Phe 275 280 285 Lys Leu Lys Glu Ser Asn Asp Ile Phe Gln Gln Gly Leu Arg Leu Met 290 295 300 Ala Met Ile Gly Phe Val Met Ile Ala Ala Ser Gly Phe Ala Asn Val 305 310 315 320 Ile Asn Thr Thr Gly Gly Val Thr Ala Leu Val Glu Thr Phe Ser Gln 325 330 335 Gly Phe Gly Ala Glu Asn Lys Gly Ile Ala Ala Phe Leu Met Leu Leu 340 345 350 Val Gly Leu Phe Ile Thr Met Gly Ile Gly Ser Ser Phe Ser Thr Val 355 360 365 Pro Ile Ile Ala Ser Ile Tyr Val Pro Leu Cys Leu Ser Leu Gly Phe 370 375 380 Ser Pro Leu Ala Thr Val Ser Leu Ile Gly Val Ser Ala Ala Leu Gly 385 390 395 400 Asp Ala Gly Ser Pro Ala Ser Asp Ser Thr Leu Gly Pro Thr Ser Gly 405 410 415 Leu Asn Ala Asp Gly Lys His Asp His Ile Trp Asp Ser Val Val Pro 420 425 430 Thr Phe Ile His Tyr Asn Ile Pro Leu Ile Leu Phe Gly Trp Leu Ala 435 440 445 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aaaacatttc cttctcgtta tcattcaatt ttaatacctc ttccagaatt ctttgcattg 840 atgctggatt ctcttttatc gcattagata gcaattggaa agttaatctc tttgattcaa 900 tagaactaga gctaaatcta ggtaggttat cctcaacctt aacagctacg atatcaaaaa 960 gatttttttc tattttttca acggatgtat attcgtttgc tacatacgga taaatatcca 1020 aatctatcca agattttatt ctttttgcat tttcttcttc tctttgttgt ctaagatatt 1080 catttaattt tgttattgct tctgtaataa gttttctcgc attttcatcc atatcaacta 1140 tgctcaaatt atcactttca tttaagctgt taatagtctc tccacataaa tagacagtat 1200 agttatatcc ttgctttcta attctatttt tagtgtcata atcacaaatg aaggaataat 1260 tctctttgca tagataaaaa tctgaaacat ctttcttatc ccaaagaata attttcattt 1320 tcccatgaat atcagactct tcacctaaaa taatttcagt ttcagtgtta attaattctc 1380 gagggtctag a 1391 <210> 93 <211> 1290 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 93 ttaagaataa gttgctggta aatattcgtt gtgtttctct tttaagtact catcaacact 60 attatgatca acgttataag acaattgttc tttgtaaaaa tctaatcttg ctcttgcatt 120 attaataatt tcagcccaag tcatcacaat aacttctaca ttgtactcta gatcgtctga 180 taccacacct ttacgctttc ctcgttgatt ggattctcgt tttgcgaatt ggtcaagctc 240 atttgaaact gctataaatg tccactttgt tttactatga tcgaatcgtt catcagatga 300 cactgcgtaa gcatagtttt taatttgagt aattacttca gaattaattt tctgacttgg 360 acgctttaat tctacaacta aatattcttt ataaccttgg ctaggctttc ttgctttatg 420 aaaaaataaa tcaactcttc cttgttttcc atcagaaaga aatactggtt tatctgcatc 480 aaaactatct ttatcataat aatctaaatg tgttgcatga atctttaaaa catcatttag 540 tgtattttca cttcctgaaa aattaaaatc ttccataaaa acccaagttt cattttctaa 600 gattttatgt aactgatctc tttccaaaag agctttttta ttctctttat caaaaagaag 660 attttctaat cctttcaaaa aattaagtct atctgcaact atctttgaag aacggattat 720 agatgttaga gatgtattct ctaataattt agaaaacatt tccttctcgt tatcattcaa 780 ttttaatacc tcttccagaa ttctttgcat tgatgctgga ttctctttta tcgcattaga 840 tagcaattgg aaagttaatc tctttgattc aatagaacta gagctaaatc taggtaggtt 900 atcctcaacc ttaacagcta cgatatcaaa aagatttttt tctatttttt caacggatgt 960 atattcgttt gctacatacg gataaatatc caaatctatc caagatttta ttctttttgc 1020 attttcttct tctctttgtt gtctaagata ttcatttaat tttgttattg cttctgtaat 1080 aagttttctc gcattttcat ccatatcaac tatgctcaaa ttatcacttt catttaagct 1140 gttaatagtc tctccacata aatagacagt atagttatat ccttgctttc taattctatt 1200 tttagtgtca taatcacaaa tgaaggaata attctctttg catagataaa aatctgaaac 1260 atctttctta tcccaaagaa taattttcat 1290 <210> 94 <211> 429 <212> PRT <213> Pasteurella multocida <400> 94 Met Lys Ile Ile Leu Trp Asp Lys Lys Asp Val Ser Asp Phe Tyr Leu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Asn Tyr Ser Phe Ile Cys Asp Tyr Asp Thr Lys Asn Arg 20 25 30 Ile Arg Lys Gln Gly Tyr Asn Tyr Thr Val Tyr Leu Cys Gly Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ser Asp Asn Leu Ser Ile Val Asp Met Asp 50 55 60 Glu Asn Ala Arg Lys Leu Ile Thr Glu Ala Ile Thr Lys Leu Asn Glu 65 70 75 80 Tyr Leu Arg Gln Gln Arg Glu Glu Glu Asn Ala Lys Arg Ile Lys Ser 85 90 95 Trp Ile Asp Leu Asp Ile Tyr Pro Tyr Val Ala Asn Glu Tyr Thr Ser 100 105 110 Val Glu Lys Ile Glu Lys Asn Leu Phe Asp Ile Val Ala Val Lys Val 115 120 125 Glu Asp Asn Leu Pro Arg Phe Ser Ser Ser Ser Ile Glu Ser Lys Arg 130 135 140 Leu Thr Phe Gln Leu Leu Ser Asn Ala Ile Lys Glu Asn Pro Ala Ser 145 150 155 160 Met Gln Arg Ile Leu Glu Glu Val Leu Lys Leu Asn Asp Asn Glu Lys 165 170 175 Glu Met Phe Ser Lys Leu Leu Glu Asn Thr Ser Leu Thr Ser Ile Ile 180 185 190 Arg Ser Ser Lys Ile Val Ala Asp Arg Leu Asn Phe Leu Lys Gly Leu 195 200 205 Glu Asn Leu Leu Phe Asp Lys Glu Asn Lys Lys Ala Leu Leu Glu Arg 210 215 220 Asp Gln Leu His Lys Ile Leu Glu Asn Glu Thr Trp Val Phe Met Glu 225 230 235 240 Asp Phe Asn Phe Ser Gly Ser Glu Asn Thr Leu Asn Asp Val Leu Lys 245 250 255 Ile His Ala Thr His Leu Asp Tyr Tyr Asp Lys Asp Ser Phe Asp Ala 260 265 270 Asp Lys Pro Val Phe Leu Ser Asp Gly Lys Gln Gly Arg Val Asp Leu 275 280 285 Phe Phe His Lys Ala Arg Lys Pro Ser Gln Gly Tyr Lys Glu Tyr Leu 290 295 300 Val Val Glu Leu Lys Arg Pro Ser Gln Lys Ile Asn Ser Glu Val Ile 305 310 315 320 Thr Gln Ile Lys Asn Tyr Ala Tyr Ala Val Ser Ser Asp Glu Arg Phe 325 330 335 Asp His Ser Lys Thr Lys Trp Thr Phe Ile Ala Val Ser Asn Glu Leu 340 345 350 Asp Gln Phe Ala Lys Arg Glu Ser Asn Gln Arg Gly Lys Arg Lys Gly 355 360 365 Val Val Ser Asp Asp Leu Glu Tyr Asn Val Glu Val Ile Val Met Thr 370 375 380 Trp Ala Glu Ile Ile Asn Asn Ala Arg Ala Arg Leu Asp Phe Tyr Lys 385 390 395 400 Glu Gln Leu Ser Tyr Asn Val Asp His Asn Ser Val Asp Glu Tyr Leu 405 410 415 Lys Glu Lys His Asn Glu Tyr Leu Pro Ala Thr Tyr Ser 420 425 <210> 95 <211> 101 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 95 cttatttaag cggttttttt acccaacgct tgaaaatgtt ctctccattt gtcacatgga 60 aaaaggagag aacatgtatt ttagaatggg gatataaagc a 101 <210> 96 <211> 220 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 96 ctttttcctg aagtaataca tcttgagaaa gaattaagtt ttctaaacga gaaggctgat 60 tgatatcata ataaatacca atatcatcgt acactaatga gaaaggtgga tacccatcca 120 cacccagtcc aatagaacgt aaaaaaccat cttctatcgt cgcataaggt aaatcatgtt 180 gttgtgcaaa atgcctcgct ttctttgatg atgctttata 220 <210> 97 <211> 546 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <220> <221> 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546 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 98 atctgatcct tcaactcagc 20 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 99 cgcagggctt tattgattc 19 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 100 gcggaattcg atgaatgttc cgttgcg 27 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 101 tttaccaaaa tcattagggg 20 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 102 gatcatatga caagatgtg 19 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <220> <221> modified_base <222> (21)..(30) <223> a, t, c, g, other or unknown <400> 103 ggccacgcgt cgactagtac nnnnnnnnnn gatat 35 <210> 104 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <220> <221> modified_base <222> (21)..(30) <223> a, t, c, g, other or unknown <400> 104 ggccacgcgt cgactagtac nnnnnnnnnn cagcc 35 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Pasteurella multocida <400> 105 ggccacgcgt cgactagtac 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 106 tacgttaacg ccacccgttg 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 107 gcttccatac cttgtgaacc 20 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 108 gggtgtacgc cttctgctg 19 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 109 attgcagtca ttgcggatgc 20 <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 110 cgatatggta cgtgtcgac 19 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 111 aaaaggcgga cctaagtccg 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 112 ccgacaacat gacaatggag 20 <210> 113 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 113 tttgcagtgg cttaccgtc 19 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 114 cctgacgacc aatacggtg 19 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 115 ggatggtctg atcctaatgc 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 116 cgttcatcag atgacactgc 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 117 gtgattacgg gattatcggg 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 118 tgaagtggta acgaggcttg 20

Claims (36)

  1. 서열번호 75 로 식별되는 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내 돌연변이를 갖는 그람 음성 박테리아의 돌연변이체로서, 상기 돌연변이가 서열 번호 75 에서 뉴클레오티드 1072-1087 사이의 삽입이고, 상기 돌연변이로 인해 감쇠된 발병력을 가진 박테리아를 제공하는 그람 음성 박테리아의 돌연변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, 박테리아가 파스튜렐라세애 (Pasteurellaceae) 인 돌연변이체.
  3. 제 2 항에 있어서, 박테리아가 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 파스튜렐라 해몰리티카 (Pasteurella haemolytica), 파스튜렐라 아나티페스티페르 (Pasteurella anatipestifer) 또는 악티노바실러스 플레우로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae) 인 돌연변이체.
  4. 제 3 항에 있어서, 박테리아가 파스튜렐라 멀토시다인 돌연변이체.
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  10. 제 1 항에 따른 돌연변이체 및 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 함유하는 면역원성 조성물 또는 백신.
  11. 제 10 항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 함유하는 면역원성 조성물 또는 백 신.
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  14. 서열 번호 75 로 식별되는 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리펩티드로서, 상기 서열 번호 75 가 뉴클레오티드 1072-1087 사이의 삽입인 돌연변이를 갖는 것인 폴리펩티드.
  15. 제 14 항의 단리된 폴리펩티드 및 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제, 및 임의로는 아쥬반트를 함유하는 면역원성 또는 백신 조성물.
  16. 제 14 항의 단리된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 함유하는 수동 면역화를 위한 항체 제제.
  17. 제 14 항의 단리된 폴리펩티드 또는 상기 단리된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 샘플 중에서 검출하는 것을 포함하는, 그람 음성 박테리아에 의한 감염의 검출 방법.
  18. 삭제
  19. 서열 번호 75 로 식별되는 서열을 가진 단리된 핵산 분자로서, 상기 서열 번호 75 가 뉴클레오티드 1072-1087 사이의 삽입인 돌연변이를 갖는 것인 핵산분자.
  20. 서열 번호 75 로 식별되는 뉴클레오티드 서열의 10 개 이상의 연속적인 핵산인 서열을 가진 단리된 핵산 분자를 함유하고, 상기 서열번호 75 의 뉴클레오티드 1072-1087 사이의 삽입인 돌연변이를 갖는 그람 음성 박테리아의 검출용 PCR 프라이머로서, 서열번호 109 로 식별되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 그람 음성 박테리아 검출용 PCR 프라이머.
  21. 삭제
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  23. 제 1 항에 있어서, 접근 번호 CNCM I-3001 로 입수가능한 돌연변이체 9C8 또는 그의 모든 동정된 특성을 가진 박테리아인 돌연변이체.
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