KR20160110368A - 박테리아 표면 수용체 단백질로부터 유래된 면역원성 조성물 및 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. HIBP 표면 수용체 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 결합할 수 없는 방식으로 변형된다. 동물 및 인간 백신을 제조하기 위해 이 면역원성 위치를 만들고 사용하는 방법이 또한 제공된다.
Description
관련 출원
본 특허 협력 조약 출원은 35 USC §119(e) 하에 2013년 12월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/910,817호 및 2014년 6월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/007,068호(둘 다 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 유익을 주장한다.
본 발명의 분야
본 발명은 면역원성 조성물 및 백신 및 이를 제조하고 평가하는 방법에 관한 것이다. 더 특히, 본 발명은 박테리아 표면 수용체 단백질로부터 유래된 면역원성 조성물 및 파스퇴렐라세아에(Pasteurellaceae), 나이세리아세아에(Neisseriaceae) 및 모락셀라세아에(Moraxellaceae)의 박테리아 과에 속하는 박테리아 유기체(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 그람 음성 박테리아 유기체에 대한 백신에 관한 것이다.
하기 문단은 이하의 더 상세한 설명을 독자에게 소개하고 본 발명의 청구된 대상을 한정하거나 제한하지 않도록 의도된다.
효과적인 면역 반응을 매개할 수 있는 백신은 미생물 병원균에 의해 발생한 질환을 싸우는 데 목표를 두는 건강 전략에서 중요하다. 숙주에서 효과 면역 반응을 유도하기 위한 2개의 기본적인 전략은 숙주 내에 복제할 수 있는 '살아 있는' 물질의 대상체(숙주)에 대한 투여, 또는 숙주에서 복제할 수 없는 재료 또는 물질의 투여를 포함한다. 살아 있는 백신의 투여는, 상기 물질 또는 오염시키는 유기체가 복제하고 면역화된 대상체에 부정적으로 영향을 미치는 경우, 면역손상 개체에 대한 안전성 위험을 나타낼 수 있다. 이 위험은, 흔히 구성단위 백신(subunit vaccine)이라 칭해지는, 사멸된 전체 병원균, 병원균으로부터의 추출물 또는 정제 성분에 기초한 백신과 연관되지 않는다. 구성단위 백신은 살아 있는 백신과 연관된 안전성 문제점을 피하지만, 정제 성분은 홀로 감염성 미생물 유기체에 대해 대상체에서 원하는 보호성 효과를 전달할 수 없고, 면역 반응을 향상하는, 아쥬번트(adjuvant)라 칭하는, 적절한 성분을 요할 수 있다.
그람 음성 박테리아 유기체에 대한 백신의 설계에 대한 접근법은 흔히 박테리아의 외부 막과 천연으로 연관되고 박테리아 세포의 표면에서 노출된 단백질의 사용에 집중한다. 백신접종에 대한 특히 매력적인 표적은 숙주에서 생존에 중요한 것으로 추정되는 단백질인데, 왜냐하면 이것이 숙주 면역 반응을 피하기 위해 손실되거나 극적으로 변경될 수 없기 때문이다. 숙주 철 결합 단백질과 상호작용하고 이에 결합할 수 있는 박테리아 표면 수용체 단백질과 관련하여, 트랜스페린 및 락토페린은 이전부터 백신의 제제에서 사용하기 위한 적합한 성분인 것으로 생각된다(1-3). "HIBP"(숙주 철 결합 단백질) 표면 수용체 단백질이라 이하 칭해지는, 표면 수용체 단백질의 이 군은 파스퇴렐라세아에, 모락셀라세아에 및 나이세리아세아에의 박테리아 과에 속하는 인간 및 동물의 병원균에 존재한다(4). 따라서, 이 단백질은 인간 및 식품 생성 동물의 다양한 상이한 병원균에 대한 백신의 개발을 위한 잠재적인 표적으로서 인식된다(5)(6-10).
HIBP 표면 수용체는 보통 트랜스페린 결합 단백질 B(transferrin binding B: TbpB) 또는 락토페린 결합 단백질 B(lactoferrin binding protein B: LbpB), 및 TonB 의존적, 필수적 막 단백질, 트랜스페린 결합 단백질 A(transferrin binding protein A: TbpA) 또는 락토페린 결합 단백질 A(lactoferrin binding protein A: LbpA)인 표면 리포단백질인 2개의 단백질로 이루어진다(11). 최근에 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 나이세리아 메닌기티디스로부터의 TbpB의 상세한 3차원 구조는 고해상도로 결정되었다(12-14). TbpB 또는 LbpB 단백질의 고유 특성은 TbpA 및 LbpA인 필수적 외부 막 단백질과 꽤 다르고, 백신 개발에 사용되는 전략에 실질적으로 영향을 미친다. 예를 들어, 구성단위 백신의 생성을 위해 이. 콜라이 세포질로부터 비교적 고수율로 TbpB 또는 LbpB를 제조하고 정제할 수 있다. 그러나, 이 단백질은 추출 과정 동안 이의 제거로 인해 선택적 세제 추출에 의해 제조된 외부 막 소포(outer membrane vesicle: OMV) 백신에서 현저히 부재하거나 결핍된다. 반대로, 기능적 TbpA 또는 LbpA는 오직 외부 막에서 제조될 수 있어서, 구성단위 백신에서 사용되는 고수율의 정제된 단백질을 제조하는 데 대한 제한을 제공한다. 큰 봉입체로 응집하는 미스폴딩된 단백질을 제조하기 위한 교대하는 접근법 및 농후화된 봉입체 제제로부터 단백질을 재폴딩하기 위한 후속하는 시도는 상업용 제조에 또한 문제가 된다. 따라서, TbpA 또는 LbpA 기반 백신에 대한 대부분의 전략은 OMV의 제조 또는 약독화된 균주의 개발을 보통 포함할 것이다.
침습적 박테리아 병원균에 대해 성공적으로 사용되는 교대하는 접근법은 1차 항원으로서 세포외 구형 폴리사카라이드를 사용하고, T 세포 도움을 유도하기 위해 이것을 단백질 운반체에 커플링시키는 것이다. 이 접합 구형 백신은 특이적인 구형 폴리사카라이드를 발현하는 균주에 의한 감염으로부터 보호를 제공하는 데 매우 효과적이지만, 다른 구형 유형에 대한 교차보호성을 제공하지 않는 것으로 밝혀졌다. 인간 병원균 에이치. 인플루엔자, 엔. 메닌기티디스 및 스트렙토코커스 뉴모니아에에 대한 접합 구형 백신이 원래 침습적 감염을 예방하기 위해 개발되었지만, 면허 취득 후 캐리지 연구는 전신으로 투여된 백신이 특이적인 표적화된 폴리사카라이드를 발현하는 병원균에 의한 콜로니화를 제거한다는 것을 입증하였다(15-17). 이것은 집단 면역을 제공하여서, 집단 내의 감소한 캐리지 빈도로 인해 비면역화된 개체에 보호를 제공하는, 부가 이익을 가진다. 이 초기 백신의 초기 의도는 없지만, 집단 면역을 부여하는 가능성은 새롭고 다가올 박테리아 백신을 평가하기 위한 중요한 기준이 된다. 그러나, 새로운 백신이 콜로니화(캐리지)에 영향을 미치거나 이를 예방하는지를 결정하거나 예측하는 것은 주요한 도전과제이다(18).
단백질 항원이 다양한 일련의 질환 단리물에 대해 광범위한 보호를 궁극적으로 제공할 수 있는지를 평가하는 능력은 또한 상당한 도전과제이다(19). 이 능력을 시험하는 데 있어서의 초기 노력은 흔히 다른 동물 종(마우스, 토끼)을 면역화하는 것 및 이후 생성된 혈청의 교차반응성 및 교차보호성 특성을 분석하는 것을 포함한다. 표면 리포단백질과 같은 가용성 형태로 용이하게 제조될 수 있는 표면 항원의 경우, 제1 단계는 대개 일련의 변이체 단백질을 제조하고 정제하는 것 및 변이체 단백질을 인식하는 항혈청의 능력을 평가하기 위해 표준 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay: 효소 결합 면역 흡착 검정)에서 이를 사용하는 것이다. 이것은 꽤 노동 집약적이어서 광범위한 일련의 변이체의 분석이 값비싼 사업이 되게 하고, ELISA 플레이트에 대한 항원의 결합이 무작위여서 모든 단백질 표면이 프로빙될 수 있다는 가정에 기초한다.
항원에 대해 길러진 항혈청의 교차보호성 및 교차반응성 특성을 평가하고 예측하기 위해 사용된 다양한 검정에서의 제한을 고려하여, 새로운 및 개선된 단백질 기반 백신의 선택 및 설계는 개선된 검정의 개발과 함께 추구되어야 하고, 이래서 개발 중인 백신을 최적화하고 개선하는 것이 합리적인 기준에서 근접될 수 있다.
이의 초기 발견 이후로 상당한 노력에도 불구하고(20, 21), HIBP 표면 수용체 단백질이 그람 음성 박테리아 병원균에 대해 효율적인 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있는지의 여부 및 그 방법, 및 특히 광범위하게 보호성인 백신이 개발될 수 있는지의 여부 및 그 방법이 명확하지 않다. 따라서, 그람 음성 박테리아 유기체에 대해 HIBP 표면 수용체 단백질에 기초한 면역원성 조성물 및 백신을 개선하고자 하는 수요가 당해 분야에 존재한다.
본 발명은 새로운 면역원성 조성물 및 특히 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질에 기초한 면역원성 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 적어도 하나의 실시형태에서, 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 유래된 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, HIBP 표면 수용체 단백질로부터 유래된 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다.
본 발명은, 적어도 하나의 실시형태에서, 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 적어도 2개의 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 각각의 폴리펩타이드는 C 로브 도메인을 포함하고, C 로브 도메인은 적어도 2개의 그람 음성 박테리아 종 또는 적어도 2개의 그람 음성 박테리아 균주로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 추가의 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인은 항원상 다양한 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 얻어진다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 및/또는 C 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 추가로 제공하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인의 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형되고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 바람직한 실시형태에서, 변형은 루프 도메인 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변형을 포함한다.
추가의 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 및/또는 N 로브 도메인 내의 복수의 루프 도메인의 적어도 2개의 루프 도메인은 변형된다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, (ⅱ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질, 또는 이의 일부를 포함하는 제2 폴리펩타이드에 연결된, (ⅰ) 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드(여기서, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인의 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형됨)를 제공하고, 연결된 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 단백질의 일부는 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 단백질의 일부는 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인이고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인의 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
추가의 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 파스퇴렐라세아에, 모락셀라세아에 또는 나이세리아세아에의 박테리아 과에 속하는 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인이고, 추가의 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 악티노바실루스(Actinobacillus), 나이세리아(Neisseria), 헤모필루스(Haemophilus), 만헤이미아(Mannheimia), 히스토필루스(Histophilus), 파스퇴렐라(Pasteurella) 또는 모락셀라(Moraxella)의 박테리아 속에 속하는 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인이다.
추가의 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질은 HIB 표면 수용체 단백질의 N 말단 앵커 폴리펩타이드 또는 이의 일부가 제거되는 방식으로 변형되고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다.
다른 양상에서, 본 발명은 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a)
작동 가능하게 연결된 성분으로서
(ⅰ)
그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음); 및
(ⅱ)
재조합 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열
을 포함하는 키메라 핵산 서열을 제공하는 단계;
(b)
키메라 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하고 숙주 세포를 성장시켜 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드
를 제조하는 단계;
(c)
숙주 세포로부터 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
(d)
면역원성 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
훨씬 추가의 양상에서, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명은 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음); 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하고; 면역원은 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기에 충분한 양으로 투여되거나 발현된다.
바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 면역원을 추가로 포함하고, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명은 감염의 예방, 예를 들어 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하는, 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 콜로니화 또는 질환의 예방에 의해 사용되는 HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 면역원을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명은 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하는, 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 감염 또는 질환의 예방을 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한, HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인 및/또는 N 로브 도메인을 포함하는 면역원을 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 유래된 항원을 포함하는 백신 조성물을 추가로 제공하고, HIBP 표면 수용체 단백질로부터 유래된 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물을 추가로 또한 포함하고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다.
추가의 실시형태에서, 백신 조성물은 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 적어도 하나의 루프 도메인은 변형되고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다.
본 발명은 척추동물 대상체에게 백신을 투여하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 백신은 그람 음성 박테리아 종에 의해 발생한 질환을 예방하거나 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명은 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하는, 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 감염 또는 질환의 예방에서 사용하기 위한, HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 백신을 추가로 포함한다.
바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명확할 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당해 분야의 당업자에게 명확하므로, 상세한 설명이, 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서, 오직 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 이의 도면과 관련하여 하기 제공된 문단에 있다. 본 명세서에 제공된 도면은 예시 목적을 위해 제공되고, 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
도면의 간단한 설명
도 1은 단백질(각각 pdb 3HOL, 3PQS 및 3PQU)의 돼지 TbpB 병원균 및 구조 모델로부터 몇몇 TbpB, 특히 ApH49 TbpB(서열 번호 2), ApH87 TbpB(서열 번호 10) 및 AsH57TbpB(서열 번호 28)의 폴리펩타이드 서열의 정렬을 도시한다. 이들 3개의 단백질은 돼지 병원균으로부터의 TbpB 중에서 서열 다양성의 우수한 표시를 제공한다(도 4, 큰 검정색 화살표). 상부 패널은 폴리펩타이드 서열 정렬을 예시하지만, 하부 패널은 구조 모델을 예시한다. 서열 정렬에서, 도메인 구조는 배경 음영에 의해 경계 표시되고, 이렇게 라벨링된다. 2차 구조 요소가 예시되어 있고, β 가닥("β1"-"β31") 및 루프(L1-L32)에 대한 명명법 및 넘버링은 정렬된 서열 바로 위해 예시되어 있다. 이 도면에서의 루프 8에 대한 하위구역(8a; 8b; 및 8c)은 몇몇 루프 변이체에서 2차 구조 요소와 TbpB 변이체 사이의 차이인 루프 8의 큰 크기인 것이라 말해진다. 각각 "C 로브 캡 구역" 및 "N 로브 캡 구역"으로 라벨링된 C 로브 및 N 로브 캡 구역, 및 각각 "C 로브 핸들" 및 "N 로브 핸들" 구역으로 라벨링된 C 로브 핸들 및 N 로브 핸들 구역이 추가로 표시되어 있다. 상부 패널에서의 정렬에서의 3개의 TbpB에 대한 구조 모델은 하부 패널에 도시되어 있고, 도메인은 다른 2개의 모델과 동일한 배향으로 도시된 제3 구조 모델(AsH57TbpB)에 대해 라벨링된다.
도 2는 이 종류의 단백질에 대해 추천된 명명법에 의해 TbpB 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 소정의 2차 구조 특징의 도식적 도면을 도시한다. 폴리펩타이드의 N 및 C 말단이 표시되고 각각 "N" 및 "C" 라벨링된다. β 가닥은 화살표로 표시되고, N 말단으로부터 시작하여 순차적으로 "β1" 내지 "β31" 라벨링된다. 루프 도메인이 표시되고 "L1" 내지 "L32" 라벨링된다. 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49 TbpB(서열 번호 2)로부터의 TbpB 폴리펩타이드의 루프의 서열은 이 특허 출원에 포함된다(서열 번호 41 내지 서열 번호 106). 각각 C 로브 캡 구역 및 N 로브 캡 구역으로 라벨링된 C 로브 및 N 로브 캡 구역, 및 "C 로브 핸들" 및 "N 로브 핸들" 구역으로 라벨링된 C 로브 핸들 및 N 로브 핸들 구역이 추가로 표시되어 있다.
도 3a는 아쥬번트로서 33% 에물시겐(Emulsigen) D를 사용한 상이한 숙주 종(마우스, 토끼 또는 돼지)에서 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(균주 B16B6 - 서열 번호 117)로부터의 온전한 TbpB 단백질 또는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49 - 서열 번호 2)로부터의 온전한 TbpB 단백질에 대한 항체 반응의 규모의 비교를 도시한다. 악티노바실루스 플루로뉴모니아로부터의 TbpB에 대한 항체 역가(회색 막대)는 나이세리아 메닌기티디스로부터의 TbpB에 대해서보다 마우스 및 토끼에서 약간 더 높지만(검정색 막대), 돼지에서 실질적으로 더 낮다. 이 결과는 숙주 트랜스페린의 결합이 항체 반응의 발생에 영향을 미칠 수 있다는 것을 암시한다.
도 3b는 소 병원균 만헤미아 헤몰리티카(균주 H196 - 서열 번호 206)로부터의 온전한 TbpB 또는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49)로부터의 온전한 TbpB(서열 번호 2), TbpB N 로브(서열 번호 8) 또는 TbpB C 로브(서열 번호 6)에 대한 돼지에서의 항체 반응의 규모의 비교를 도시한다. 막대의 클러스터는 0일(제1 면역화 전), 21일(제1 면역화 후), 42일(제2 면역화 후) 및 56일(제3 면역화 후)에 면역화된 개별 돼지로부터 취한 혈청 샘플을 나타낸다. 엠. 헤몰리티카(Mh 온전한; 균주 H196 - 서열 번호 206)로부터의 온전한 TbpB에 의해 면역화된 돼지로부터의 혈청을 ELISA 플레이트에 결합된 온전한 엠. 헤몰리티카 TbpB에 의해 시험하였다. 에이. 플루로뉴모니아 TbpB(Ap 온전한), TbpB N 로브(Ap N 로브) 또는 TbpB C 로브(Ap C 로브)에 의해 면역화된 돼지로부터의 혈청을 ELISA 플레이트에 결합된 온전한 에이. 플루로뉴모니아 TbpB에 의해 분석하였다.
도 3c는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49)로부터의 TbpB의 C 로브 폴리펩타이드 도메인(서열 번호 6), TbpB의 N 로브 폴리펩타이드 도메인(서열 번호 8) 및 온전한 TbpB(서열 번호 2)에 대한 항혈청의 교차반응성의 비교를 도시한다. 막대의 클러스터는, 항원상 다양한 TbpB를 나타내도록 선택된, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2, 검정색 막대), 헤모필루스 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115, 진회색 막대) 및 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12, 연회색 막대)인, 3개의 상이한 돼지 병원균으로부터의 온전한 TbpB에 대한 혈청의 반응성을 나타낸다(도 4). 결과는 온전한 TbpB(왼쪽으로부터 제1 클러스터, "온전한" 라벨링됨), TbpB N 로브(왼쪽으로부터 제2 클러스터, "N 로브" 라벨링됨), TbpB C 로브(왼쪽으로부터 제3 클러스터, "C 로브" 라벨링됨) 또는 N 로브와 C 로브의 혼합물(왼쪽으로부터 제4 클러스터, "N+C 로브" 라벨링됨)에 의해 면역화된 혈청의 반응성을 예시한다. 평균의 표준 오차(SEM) 오차 막대가 도시되어 있다. 사후로서 수행된 터키 HSD(honest significant difference: 정직한 유의차) 시험에 의해 ANOVA를 통해 통계학을 수행한다. 도면에 도시된 별은 H49에 대해 시험된 C 로브 또는 N+C 로브로부터 상당히 다른 특이적 면역화/단백질 쌍을 나타낸다.
도 4는 북아메리카, 유럽 및 아시아에서의 돼지로부터 단리된 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로부터의 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. 최대 확률 계통발생 나무는 임상 단리물의 수집으로부터 얻거나 공중 데이터베이스로부터 얻은 서열에 기초한 56개의 TbpB 사이의 관계식을 예시한다. TbpB 서열은 화살표로 표시된 대표적인 단리물을 가지는 3개의 주요 군으로 클러스터링된다(서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28 및 서열 번호 107 내지 서열 번호 115). 도 3에 예시된 ELISA 검정에서 사용된 TbpB 변이체를 발현하는 균주는 큰 검정색 별로 표시된다; 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2) 및 에이치. 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115). 큰 검정색 화살표는 도 1에 예시된 정렬에서 사용된 3개의 TbpB를 도시한다; 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2) 및 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 28).
도 5는, ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 융합 단백질(즉, TbpB N 로브에 융합된 말토스 결합 단백질(Mbp)) 전구체보다 정제된 TbpB 단백질을 사용할 때(패널 A 및 패널 B의 왼쪽 부분), 라벨링된 트랜스페린의 결합의 실질적인 감소에 의해 예시된, 에이. 플루로뉴모니아 H49로부터 ELISA 플레이트로의 TbpB N 로브(서열 번호 8)의 비무작위 결합을 도시한다. 도면은 N 말단 바이오티닐화된 펩타이드의 사용이 어떻게 무작위 결합을 극복하는지를 또한 예시한다(패널 A 및 패널 B의 오른쪽 부분). 패널 A의 왼쪽 부분은 정기적인 ELISA 플레이트에 대한 결합된 정제된 Mbp-TbpB N 로브 또는 TbpB N 로브를 측정하기 위해 라벨링된 트랜스페린(Tf)을 사용하는 검정의 결과를 예시한다. 오른쪽 부분은 재조합 단백질이 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트에 부착하기 위해 사용된 바이오티닐화된 N 말단 펩타이드 태그를 함유할 때의 결과를 예시한다. 패널 B는 패널 A에서 바로 위에 도시된 상응하는 결과에 대해 상이한 ELISA 웰에서 일어난다고 생각되는 것을 예시하는 카툰이다.
도 6은 3개의 상이한 돼지 병원균으로부터 TbpB C 로브로 이루어진 다합체의 설계 및 제조를 도시한다. 패널 A는 그 순서에서 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 6), 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 35) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 22)로부터의 C 로브의 삼합체(서열 번호 39; 서열 번호 40)에 대한 DNA 및 단백질 서열을 보여준다. 밑줄은 개별 C 로브를 연결하거나 제1 C 로브 앞의 펩타이드 서열을 표시한다. 패널 B는 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 N 로브 및 C 로브의 제제와 비교된 C 로브 삼합체의 제제의 SDS-PAGE 분석을 예시한다. 1㎕의 샘플은 1, 4 및 7 레인에 적용되고, 5㎕는 2, 5 및 8 레인에 적용되고, 10㎕는 3, 6 및 9 레인에 적용된다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(molecular weight standard: MWS)은 93, 70, 63, 41, 30 및 22이다.
도 7은 에이. 플루로뉴모니아 H49, 에이. 수이스 H57 및 에이. 플루로뉴모니아 H87(C 로브 삼합체, 서열 번호 40)로부터의 TbpB C 로브로부터의 C 로브로 이루어진 삼합체에 대한 면역 반응과 비교된 에이. 플루로뉴모니아(H49 C 로브, 서열 번호 6)로부터의 TbpB C 로브에 대한 면역 반응을 도시한다. 도면의 왼쪽 측의 막대의 클러스터는 H49 C 로브에 대한 면역 반응을 나타내지만, 도면의 왼쪽 측의 막대의 클러스터는 C 로브 삼합체에 대한 면역 반응을 나타낸다. 검정색 막대는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2)로부터의 TbpB에 대한 면역 반응을 나타내고, 진회색 막대는 에이치. 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115)로부터의 TbpB에 대한 면역 반응을 나타내고, 연회색 막대는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 22)로부터의 TbpB에 대한 면역 반응을 나타낸다.
도 8은 루프 감소에 표적화된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H49 TbpB N 로브("루프 1"; "루프 5"; "루프 8a"; "루프 8c" 및 "루프 12" 라벨링된)(각각 서열 번호 41; 서열 번호 49; 서열 번호 55; 및 서열 번호 63)의 루프 구역 및 원래 및 변형된 루프의 서열을 도시한다. 루프 8a 및 루프 8c는 균주 H49로부터의 TbpB에 존재하는 루프 8의 부분을 의미한다. 패널 A는, 라벨링된 표적화된 구역을 가지는, (세포 표면에서의 예측된 우세 배향에 대한) 측면에서 본 악티노바실루스 플루로뉴모니아 TbpB N 로브의 구조 모델이다. 패널 B는 루프 1 및 5와 핸들 도메인의 회합 및 루프 8a, 8c 및 12와 배럴 도메인의 회합을 예시하기 위해 상부로부터 본 동일한 구조 모델이다. 패널 C는 네이티브 TbpB 및 표적화된 루프 구역의 감소를 가지는 TbpB의 정렬이다. 루프를 코딩하는 서열의 구역은 회색으로 강조되고, 루프 수에 의해 라벨링된다.
도 9는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 10), 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 38) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 26)로부터의 TbpB N 로브의 조작된 루프 감소가 이의 제조 또는 안정성에 부정적으로 영향을 미치지 않지만, 돼지 Tf에 의한 결합을 제거한다는 것을 예시한다. 상부 패널은 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 10), 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 38) 또는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 26)로부터의 온전한 H49 TbpB(서열 번호 2), 네이티브 h49 TbpB N 로브(서열 번호 8) 및 조작된 TbpB N 로브의 제조를 예시한다. 이들은 폴리히스티딘 태그를 가지는 N 말단 말토스 결합 단백질과의 융합 단백질로서 발현되고, Ni-NTA 수지에서 포획된다. 결합된 단백질은 SDS-PAGE 완충제에서 방출되고, 10% SDS-PAGE 겔에서 분석된다. 중간 패널은 세파로스에 커플링된 돼지 트랜스페린(pTf-세파로스)로 이루어진 친화도 수지에 의해 포획되고 SDS-PAGE 완충제 중에 용리된 동일한 제제를 나타낸다. 하부 패널은, Ni-NTA 수지로부터 용리되고 니트로셀룰로스 수지에 점 표시되고, 차단 용액 중의 겨좌무과산화효소 접합된 돼지 트랜스페린(HRP-pTf), 및 HRP 기질 중의 항온처리에 의해 검출된 결합 HRP에 차단되고 노출된, 상부 패널로부터의 재료에 의한 점 검정을 예시한다.
도 10은 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스로부터의 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. BIGSDB 공중 데이터베이스(http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/ - 박테리아 단리물 게놈 서열 데이터베이스)에서 입수 가능한 대형 서열 수집과 조합된 100개 초과의 균주의 수집으로부터 서열분석된 tbpB 유전자의 하위세트가 이 도면에 표시되어 있다. 서열의 수집은 거의 50년의 연장된 시간 기간에 걸친 단리물의 전세계 수집을 나타내고, 따라서 이것은 전체 TbpB 다양성의 꽤 포괄적인 표시이다. 도 10a는 온전한 TbpB의 서열 다양성을 예시한다. 확인된 군에 대해 대표적인 서열을 제공하기 위해 화살표, 이중 화살표 또는 선으로 표시된 균주로부터의 TbpB에 대한 서열이 첨부된다(서열 번호 117; 서열 번호 124; 서열 번호 132 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 및 서열 번호 178). 1군 및 2-4군으로 표시된 2개의 1차 계통군이 아이소타입 I 및 아이소타입 II TbpB 혈통에 상응하는 이 나무 내에 확인된다(22). 1차 가지에 대한 지지 값이 도시되어 있고, "*"는 100%의 지지를 가지는 가지를 확인시켜준다. 균주 B16B6(서열 번호 117, 검정색 화살표)로부터의 TbpB로부터 유래된 항원은 도 11에서 분석된 항혈청을 생성하기 위해 사용되고, 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정(도 5)을 이용하여 회색 화살표로 표시된 균주(서열 번호 123; 및 서열 번호 132 내지 서열 번호 139)로부터의 TbpB에 대한 반응성에 대해 스크리닝된다. 도 10b는 TbpB 서열로부터 유래된 TbpB C 로브의 서열 다양성을 도시한다. 대표적인 서열을 제공하기 위해 화살표 또는 선으로 표시된 균주로부터의 TbpB C 로브에 대한 서열이 첨부된다(서열 번호 119; 서열 번호 125; 및 서열 번호 179 내지 서열 번호 195). 이중 머리 화살표로 표시된 2개의 균주는 C 로브 다양성의 더 포괄적인 표시를 제공하도록 포함되지만, 도 11에 예시된 항혈청의 분석에 이용 가능하지 않다.
도 11은 대표적인 아이소타입 I 균주 of 엔. 메닌기티디스인 B16B6으로부터 유래된 절두된 온전한 TbpB(서열 번호 148, aa 43-575) 및 TbpB C 로브(서열 번호 119 aa 342-575)에 지향된 항혈청의 반응성을 도시한다. 항혈청을 엔. 메닌기티디스에서의 TbpB의 전체 서열 다양성을 나타내는(화살표, 도 10) TbpB의 패널에 대해 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정(도 5)에서 시험하였다. TbpB의 패널은 엔. 메닌기티디스 균주 B16B6(서열 번호 117), H44/76(서열 번호 133), S3131(서열 번호 132), M990(서열 번호 134), M978(서열 번호 135), M992(서열 번호 138), P3006(서열 번호 139), 120M(서열 번호 137), MC58(서열 번호 136) 및 M982(서열 번호 123)로부터 유래된다. 결과는 C 로브 항혈청이 B16B6 및 H44/76으로부터의 TbpB를 제외하고 모든 TbpB에 대해 TbpB 항혈청보다 더 높은 역가를 가진다는 것을 입증한다.
도 12는 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(서열 번호 118)의 2개의 상이한 균주로부터의 TbpB C 로브로 이루어진 이합체의 설계 및 제조를 도시한다. 패널 A는 그 순서에서 엔. 메닌기티디스 균주 B16B6(서열 번호 118; 및 서열 번호 119) 및 M982(서열 번호 124; 및 서열 번호 125)로부터의 C 로브의 이합체에 대한 DNA 및 단백질 서열을 보여준다. 밑줄은 개별 C 로브를 연결하는 펩타이드 구역의 DNA 서열을 나타낸다. 패널 B는 엔. 메닌기티디스 균주 M982 및 B16B6으로부터의 개별 C 로브의 제제와 비교된 C 로브 이합체의 제제의 SDS-PAGE 분석을 예시한다.
도 13은 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(서열 번호 150)의 2개의 상이한 균주로부터의 TbpB C 로브로 이루어진 이합체에 대한 면역 반응의 분석을 도시한다. 막대의 쌍은 도 12에 예시된 아쥬번트 단독(나이브), B16B6 C 로브(서열 번호 119), M982 C 로브(서열 번호 125) 또는 B16B6 및 M982 C 로브의 이합체(서열 번호 150)에 의해 면역화된 토끼로부터 얻은 혈청을 나타낸다. 흰색 막대는 부동화된 온전한 M982 TbpB(서열 번호 123)를 가지는 새로운 맞춤형 ELISA 검정의 결과를 나타내고, 검정색 막대는 부동화된 온전한 B16B6 단백질(서열 번호 117)에 의한 결과를 나타낸다.
도 14는 엔. 메닌기티디스 M982의 TbpB 폴리펩타이드의 C 로브의 루프 도메인의 감소를 도시한다. 패널 A에서, 네이티브 C 로브(서열 번호 125) 및 변형된 C 로브(서열 번호 129)의 구조 모델은 4개의 루프(L18, L21, L23 및 L27)의 감소를 예시하도록 도시되어 있다. 왼쪽 측에서의 모델(서열 번호 125)에서, 감소에 표적화된 루프는 점으로 된 검정색 선으로 표시된다. 중간 모델(서열 번호 129)은 변형된 루프 도메인을 예시한다. 오른쪽 측에서의 모델에서, 2개의 이전 구조는 전체 단백질 구조에 영향을 미치지 않으면서 어떻게 큰 가변 루프가 제거되는지를 보여주기 위해 중첩된다. 패널 B는 네이티브 C 로브, 단일 루프가 변형된 것을 가지는 조작된 C 로브 및 모든 4개의 루프(L18, L21, L23 및 L27)가 변형된 C 로브("루프무" 라벨링된 서열)의 서열을 비교하는 폴리펩타이드 서열 정렬이다. 표적화된 루프를 포함하는 서열의 구역은 회색으로 강조되고, 루프 수는 회색 폰트로 표시된다.
도 15는 도 14에 기재된 엔. 메닌기티디스 M982의 변형된 C 로브의 미생물 제조를 도시한다. 야생형(WT) C 로브(서열 번호 125)는 도 14의 패널 A에서 왼쪽 측에서의 모델에 상응한다. 다른 샘플은 L18, L21, L23 및 L27 루프의 절두를 가지는 단백질 및 모든 4개의 루프가 제거된 단백질(모든 루프)을 나타낸다. 이 단백질(서열 번호 129)에 대한 구조 모델은 도 14에서 패널 A의 중간에 예시되어 있다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(MWS)은 93, 70 및 41kDa이다.
도 16은 균주 M982 및 B16B6으로부터의 네이티브 C 로브에 대한 엔. 메닌기티디스 균주 M982의 변형된 C 로브의 면역원성을 도시한다. 마우스 항혈청의 종점 역가는 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정에 의해 결정된다. 마우스를 균주 M982(서열 번호 125, 제1 막대)로부터의 C 로브, 균주 B16B6(서열 번호 119, 제2 막대)으로부터의 C 로브 TbpB 또는 '루프무' M982 C 로브(서열 번호 129, 마지막 2개의 막대)에 의해 면역화하였다. 혈청을 균주 M982(서열 번호 123)(제1 막대 및 제3 막대) 또는 균주 B16B6(서열 번호 117)(제2 막대 및 제4 막대)으로부터의 부동화된 온전한 TbpB에 대해 시험하였다. 결과는 변형된 C 로브가 모 C 로브 단백질보다 균주 M982로부터의 온전한 TbpB에 대한 더 높은 역가를 발생시키므로 더 면역원성이라는 것(막대 3 및 막대 1을 비교)을 보여준다. 놀랍게도, 변형된 C 로브는 심지어 비상동성 B16B6 TbpB에 대해 이 균주로부터의 C 로브와 유사한 수준의 반응성을 생성하였다(막대 4 및 막대 2를 비교).
도 17은 TbpB C 로브 스캐폴드에서의 TbpA의 구역을 디스플레이하는 하이브리드 단백질의 설계를 도시한다. 패널 A는 TbpB C 로브로 '이식'하도록 선택된 구역을 강조하는 TbpA(서열 번호 152)의 구조 모델이다. TbpA 루프 3 나선, 루프 10, 루프 11 및 플러그 루프는 공간 매움 구역으로 도시되어 있다. 패널 B는 네이티브 C 로브(C 로브)(서열 번호 125), 루프무 C 로브 스캐폴드(루프무 C)(서열 번호 129) 및 디스플레이된 TbpA의 모든 구역을 가지는 하이브리드 단백질(서열 번호 131)의 정렬을 보여준다. 하이브리드 단백질에서, TbpA 루프 3 나선은 TbpB C 로브의 루프 18을 대체하고, TbpA 루프 10은 TbpB C 로브의 루프 21을 대체하고, TbpA 루프 11은 TbpB C 로브의 루프 23을 대체하고, TbpA 플러그 루프는 TbpB C 로브의 루프 27을 대체한다.
도 18은 도 17에 기재된 전략을 이용하여 제조된 하이브리드 TbpA-TbpB C 로브의 미생물 제조를 도시한다. 패널 A는 N 말단 말토스 결합 단백질(Mbp) 융합 파트너를 가지는 재조합 융합 단백질의 제조를 예시하고, 패널 B는 TEV 프로테아제에 의한 절단 후 단백질을 예시한다. 야생형(WT) 단백질은 네이티브 M982 C 로브(서열 번호 125)이고, 마이너스 루프는 TbpA 구역을 디스플레이하기 위해 스캐폴드로서 효과적으로 작용하는 모든 4개의 루프가 제거된 C 로브(서열 번호 129)이다. 루프 10은 TbpB C 로브 루프 21로 삽입된 TbpA의 세포외 루프 구역을 가지는 단백질(서열 번호 154)을 의미한다. 루프 11은 TbpB C 로브 루프 23으로 삽입된 TbpA의 세포외 루프 구역을 가지는 단백질(서열 번호 156)을 의미한다. 나선 3은 TbpB C 로브 루프 18로 삽입된 TbpA의 세포외 루프 3의 분절(서열 번호 158)을 의미한다. 플러그 루프는 TbpB C 로브 루프 27로 삽입된 TbpA의 플러그 도메인으로부터의 구역(서열 번호 160)을 의미한다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(MWS)은 93, 70, 53, 41 및 22이다.
도 19는 변형된 루프 부위로 스플라이싱된 TbpA로부터의 외래 루프 구역을 가지는 변형된 C 로브와 비교된 엔. 메닌기티디스 균주 M982의 변형된 C 로브의 면역원성을 도시한다. 마우스 항혈청의 종점 역가는 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정에 의해 결정된다. 마우스를 (ⅰ) 모든 4개의 루프가 제거된 '루프무' C 로브(서열 번호 129), (ⅱ) TbpB C 로브 루프 21로 삽입된 TbpA 루프 10을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 154), (ⅲ) TbpB C 로브 루프 23으로 삽입된 TbpA 루프 11을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 156), (ⅳ) TbpB C 로브 루프 18로 삽입된 TbpA 루프 나선 3을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 158), 또는 (ⅴ) TbpB C 로브 루프 27로 삽입된 TbpA 플러그 루프를 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 160)에 의해 면역화하였다. 혈청을 '루프무' C 로브가 삽입된 TbpA 루프(서열 번호 131)의 모든 4개를 가지는 하이브리드 TbpA-TbpB 항원에 대해 시험하였다. 결과는 모든 하이브리드 항원이, 적어도 '루프무' C 로브의 면역원성만큼, 면역원성이라는 것을 보여준다.
도 20은 TbpB C 로브 스캐폴드에서의 LbpA(서열 번호 162)의 구역을 디스플레이하는 하이브리드 단백질의 설계 및 제조를 도시한다. 패널 A는 TbpB C 로브로 '이식'하도록 선택된 구역을 강조하는 LbpA의 구조 모델이다. LbpA 루프 3 나선은 더 어두운 회색 색상이고, 루프 2는 검정색 색상이다. 패널 B는 네이티브 C 로브(C 로브, 서열 번호 125), 루프무 C 로브 스캐폴드(루프무 C, 서열 번호 129) 및 디스플레이된 LbpA의 구역을 가지는 하이브리드 단백질의 정렬을 보여준다. 하이브리드 단백질에서, LbpA 루프 2는 TbpB C 로브(서열 번호 164)의 루프 21을 대체하고, LbpA 루프 3 나선은 TbpB C 로브(서열 번호 166)의 루프 18을 대체한다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(MWS)은 100, 75, 63 및 48이다.
도 21은 인간 병원균 헤모필루스 인플루엔자로부터의 TbpB C 로브에서의 '접합 루프'의 설계를 도시한다. 패널 A는 더 큰 폰트로 도시된 접합 루프(서열 번호 167)를 코딩하는 DNA 구역을 가지는 하이브리드 유전자를 코딩하는 유전자에 대한 DNA 및 단백질 서열을 도시되어 있다. 아미노산은 라이신이 K 철자로 표시된 1 철자 코드로 도시되어 있고, 여기서 전체 C 로브(서열 번호 168)에서 24개와 비교하여 접합 루프에서 42개가 존재한다. 패널 B는 접합 루프의 삽입에 대한 위치를 나타내는 에이치. 인플루엔자 TbpB C 로브의 구조 모델을 예시한다. 예시된 바대로, 접합 루프는 C 로브의 루프 L23을 대체하는 C 로브의 핸들 도메인으로 삽입된다(본 발명에 걸쳐 사용된 루프 명명법을 이용)(도 2). 예시적인 목적을 위해 모델이 실제 단백질에서 91개 대신에 11개의 아미노산의 접합 루프에 의해 생선된다는 것에 주목한다.
도 22는 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 에이치. 파라수이스로부터의 재조합 절두된 TbpB 단백질로부터 유래된 부위 지정 돌연변이체 TbpB 단백질의 트랜스페린 결합 특성을 도시한다. 재조합 절두된 TbpB 단백질은 융합 단백질로서 발현되고, 결합 활성에 대해 시험된다. 재조합 융합 단백질을 고상 결합 검정 및 친화도 포획 검정에 의해 초기에 트랜스페린 결합에 대해 스크리닝한다. 정제된 돌연변이체 단백질을 이후 등온 열량계, 표면 플라스몬 공명 또는 2중층 간섭법에 의해 pTf에 대한 결합에 대해 평가한다(23-25). 돌연변이 중 몇몇, 예컨대 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49로부터의 TbpB에서의 F171A 돌연변이, 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87로부터의 TbpB에서의 Y174A 돌연변이 또는 에이치. 파라수이스 균주 HP5로부터의 TbpB에서의 Y167A 돌연변이는 친화도 상수(Kd)를 100배 이상 증가시켰다. 이 돌연변이체가 모두 루프 8로 맵핑된다는 것에 주목하는 것이 흥미롭다.
도 23은 네이티브 숙주에서 보호성 면역 반응을 유도하는 부위 지정 돌연변이체 단백질의 능력의 증대를 도시한다. 이 도면에서, 에이치. 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 174)로부터의 부위 지정 Y167A TbpB의 능력을 야생형 TbpB(서열 번호 115), 및 상업용 백신(Porcillis Glasser) 및 아쥬번트 단독을 포함하는 대조군과 비교하였다. 돼지를 108 콜로니 형성 단위(colony-forming unit: cfu)의 Hp5(나가사키) 균주에 의해 기관내 접종에 의해 시험감염하고, 실험의 기간에 걸쳐 임상 징후 및 증상에 대해 모니터링하였다. 심각한 종합증상을 가지는 동물을 실험의 종료 전에 안락사시켰다. 그래프는 12시간 증분으로 24시간으로부터 108시간으로의 생존 곡선을 도시하고, 이후 14일에 최종 시점에 연결한다.
도 24는 네이티브 및 돌연변이체 TbpB 항원에 의해 유도된 세포내 면역 반응을 도시한다. 패널 A 및 패널 B는 각각 시험감염의 일(2개의 IM 면역화 후) 및 시험감염 후 4일(96시간)에 B 세포 반응을 예시한다. 패널 C 및 패널 D는 시험감염의 일 및 시험감염 후 4일에 T 보조 세포 반응을 예시한다. 다이아몬드, 삼각형 및 정사각형은 각각 네이티브 TbpB, Y167A 돌연변이체 TbpB 및 포르실리스 글라서(: PG) 백신에 의해 면역화된 돼지를 나타낸다. 시험감염 후 4일에 네이티브 TbpB 및 PG 백신 치료된 돼지에 대한 샘플의 수가 감소하였다. 말초 혈액 단핵 세포에 의한 FACS 분석에 의해 분석을 수행하였다. 군 간의 유의차: *p<0.05, *** p<0.001.
도 25는 엔. 메닌기티디스로부터의 재조합 절두된 TbpB, 재조합 절두된 TbpB N 로브 또는 재조합 TbpB C 로브에 의한 면역화가 인간화 형질전환 마우스 모델에서 콜로니화로부터 보호를 제공한다는 것을 도시한다. 패널 A에 예시된 실험에서, 인간 CEACAM1 수용체를 발현하는 형질전환 C57 검정색 마우스를 1일 및 21일에 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 재조합 절두된 TbpB 또는 아쥬번트 단독에 의해 면역화하였다. 마우스를 35일에 대략 1 x 107 CFU의 엔. 메닌기티디스 균주 M982에 의해 기관내 접종으로 처리하였다. 정사각형 및 원형은 시험감염 후 3일(38일)에 개별 마우스로부터 회수된 CFU를 나타낸다. 패널 B는 마우스를 1일 및 21일에 재조합 절두된 TbpB, 재조합 절두된 TbpB N 로브, 재조합 TbpB C 로브, 재조합 H 인자 결합 단백질 또는 아쥬번트 단독에 의해 면역화한 추적관찰 실험을 예시한다. 패널 A에서처럼, 개별 마우스에서 시험감염 후 3일에 회수된 엔. 메닌기티디스 균주 M982의 CFU의 수가 그래프에 작도된다.
도 26은 인간 병원균 나이세리아 고노레아로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브의 서열 다양성을 도시한다. 패널 A(도 26a)는 온전한 TbpB의 서열 다양성을 예시하고, 패널 A(도 26b)는 TbpB C 로브에 대한 서열 다양성을 나타낸다. 대표적인 엔. 메닌기티디스 TbpB 및 TbpB C 로브에 대한 서열(도 10, 화살표 및 이중 화살표)은 엔. 고노레아로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브에 대한 서열이 어느 정도로 엔. 메닌기티디스에 존재하는 것의 서열 다양성의 하위세트인지를 결정하기 위해 이 분석에 포함된다. 도 10에서처럼, 화살표로 표시된 대표적인 엔. 고노레아 TbpB 서열(서열 번호 207 내지 서열 번호 212) 및 TbpB C 로브 서열(서열 번호 213 내지 서열 번호 218)은 전체 서열 다양성의 표시를 제공하도록 첨부에 포함된다. 패널 A에 예시된 것처럼, 메닝고코커스 아이소타입 2 TbpB의 하위가지인 엔. 고노레아 TbpB의 2개의 클러스터가 존재한다. 메닝고코커스 균주 H44/76으로부터의 TbpB와 가장 밀접히 연관된 하나의 더 큰 클러스터 및 균주 P3306으로부터의 TbpB와 가장 밀접히 연관된 더 작은 클러스터가 존재한다. 패널 B에서의 C 로브 나무는 엔. 고노레아 TbpB C 로브가 메닝고코커스 아이소타입 2 TbpB와 가장 밀접히 연관된 메닝고코커스 TbpB C 로브로부터 구별되는 클러스터를 형성한다는 것을 나타낸다.
도 27은 인간 병원균 헤모필루스 인플루엔자로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브의 서열 다양성을 도시한다. 패널 A(도 27a)는 온전한 TbpB의 서열 다양성을 예시하고, 패널 B(도 26b)는 TbpB C 로브에 대한 서열 다양성을 나타낸다. 화살표로 표시된 대표적인 에이치. 인플루엔자 TbpB 서열(서열 번호 196-204)은 전체 서열 다양성의 표시를 제공하도록 첨부에 포함된다. 패널 A에 예시된 바대로, b형 및 섞인 유형 구별 불가 에이치. 인플루엔자 균주를 포함하는 에이치. 인플루엔자 TbpB의 3개의 주요 클러스터(군)가 존재하여서, TbpB 다양성이 캡슐의 존재와 같은 임의의 다른 속성과 연결되지 않는다는 것을 나타낸다. C 로브 다양성의 3개의 주요 군이 또한 존재한다.
도 28은 반추동물 병원균 만헤이미아 헤몰리티카, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시(각각 파스퇴렐라 헤몰리티카 및 피. 트레할로시로서 당해 분야에 또한 공지됨) 중에서 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. 화살표는 서열 번호 목록에 포함된 대표적인 서열을 나타낸다.
도 29는 모락셀라 카타르할리스로부터의 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. 화살표는 서열 번호 목록에 포함된 3개의 주요 클러스터로부터의 TbpB의 대표적인 서열을 나타낸다.
도 30은 예시적인 계통발생 나무를 도시한다.
표 1 내지 3은 본 발명에 따라 변형될 수 있는 HIBP 폴리펩타이드의 루프 도메인 L1-L32로부터 선택된 각각 1, 2 또는 3 루프 도메인의 조합을 나타낸다.
본 발명의 소정의 실시형태에 따라 변형될 수 있는 루프 도메인 또는 루프 도메인의 조합을 보여준다.
본 발명의 소정의 실시형태에 따라 루프 도메인의 허용되지 않는 조합을 보여준다.
허용되는 루프 도메인의 조합을 보여준다.
그 외 본 발명의 소정의 실시형태에 따라 동일한 표에서.
도면의 간단한 설명
도 1은 단백질(각각 pdb 3HOL, 3PQS 및 3PQU)의 돼지 TbpB 병원균 및 구조 모델로부터 몇몇 TbpB, 특히 ApH49 TbpB(서열 번호 2), ApH87 TbpB(서열 번호 10) 및 AsH57TbpB(서열 번호 28)의 폴리펩타이드 서열의 정렬을 도시한다. 이들 3개의 단백질은 돼지 병원균으로부터의 TbpB 중에서 서열 다양성의 우수한 표시를 제공한다(도 4, 큰 검정색 화살표). 상부 패널은 폴리펩타이드 서열 정렬을 예시하지만, 하부 패널은 구조 모델을 예시한다. 서열 정렬에서, 도메인 구조는 배경 음영에 의해 경계 표시되고, 이렇게 라벨링된다. 2차 구조 요소가 예시되어 있고, β 가닥("β1"-"β31") 및 루프(L1-L32)에 대한 명명법 및 넘버링은 정렬된 서열 바로 위해 예시되어 있다. 이 도면에서의 루프 8에 대한 하위구역(8a; 8b; 및 8c)은 몇몇 루프 변이체에서 2차 구조 요소와 TbpB 변이체 사이의 차이인 루프 8의 큰 크기인 것이라 말해진다. 각각 "C 로브 캡 구역" 및 "N 로브 캡 구역"으로 라벨링된 C 로브 및 N 로브 캡 구역, 및 각각 "C 로브 핸들" 및 "N 로브 핸들" 구역으로 라벨링된 C 로브 핸들 및 N 로브 핸들 구역이 추가로 표시되어 있다. 상부 패널에서의 정렬에서의 3개의 TbpB에 대한 구조 모델은 하부 패널에 도시되어 있고, 도메인은 다른 2개의 모델과 동일한 배향으로 도시된 제3 구조 모델(AsH57TbpB)에 대해 라벨링된다.
도 2는 이 종류의 단백질에 대해 추천된 명명법에 의해 TbpB 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 소정의 2차 구조 특징의 도식적 도면을 도시한다. 폴리펩타이드의 N 및 C 말단이 표시되고 각각 "N" 및 "C" 라벨링된다. β 가닥은 화살표로 표시되고, N 말단으로부터 시작하여 순차적으로 "β1" 내지 "β31" 라벨링된다. 루프 도메인이 표시되고 "L1" 내지 "L32" 라벨링된다. 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49 TbpB(서열 번호 2)로부터의 TbpB 폴리펩타이드의 루프의 서열은 이 특허 출원에 포함된다(서열 번호 41 내지 서열 번호 106). 각각 C 로브 캡 구역 및 N 로브 캡 구역으로 라벨링된 C 로브 및 N 로브 캡 구역, 및 "C 로브 핸들" 및 "N 로브 핸들" 구역으로 라벨링된 C 로브 핸들 및 N 로브 핸들 구역이 추가로 표시되어 있다.
도 3a는 아쥬번트로서 33% 에물시겐(Emulsigen) D를 사용한 상이한 숙주 종(마우스, 토끼 또는 돼지)에서 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(균주 B16B6 - 서열 번호 117)로부터의 온전한 TbpB 단백질 또는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49 - 서열 번호 2)로부터의 온전한 TbpB 단백질에 대한 항체 반응의 규모의 비교를 도시한다. 악티노바실루스 플루로뉴모니아로부터의 TbpB에 대한 항체 역가(회색 막대)는 나이세리아 메닌기티디스로부터의 TbpB에 대해서보다 마우스 및 토끼에서 약간 더 높지만(검정색 막대), 돼지에서 실질적으로 더 낮다. 이 결과는 숙주 트랜스페린의 결합이 항체 반응의 발생에 영향을 미칠 수 있다는 것을 암시한다.
도 3b는 소 병원균 만헤미아 헤몰리티카(균주 H196 - 서열 번호 206)로부터의 온전한 TbpB 또는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49)로부터의 온전한 TbpB(서열 번호 2), TbpB N 로브(서열 번호 8) 또는 TbpB C 로브(서열 번호 6)에 대한 돼지에서의 항체 반응의 규모의 비교를 도시한다. 막대의 클러스터는 0일(제1 면역화 전), 21일(제1 면역화 후), 42일(제2 면역화 후) 및 56일(제3 면역화 후)에 면역화된 개별 돼지로부터 취한 혈청 샘플을 나타낸다. 엠. 헤몰리티카(Mh 온전한; 균주 H196 - 서열 번호 206)로부터의 온전한 TbpB에 의해 면역화된 돼지로부터의 혈청을 ELISA 플레이트에 결합된 온전한 엠. 헤몰리티카 TbpB에 의해 시험하였다. 에이. 플루로뉴모니아 TbpB(Ap 온전한), TbpB N 로브(Ap N 로브) 또는 TbpB C 로브(Ap C 로브)에 의해 면역화된 돼지로부터의 혈청을 ELISA 플레이트에 결합된 온전한 에이. 플루로뉴모니아 TbpB에 의해 분석하였다.
도 3c는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49)로부터의 TbpB의 C 로브 폴리펩타이드 도메인(서열 번호 6), TbpB의 N 로브 폴리펩타이드 도메인(서열 번호 8) 및 온전한 TbpB(서열 번호 2)에 대한 항혈청의 교차반응성의 비교를 도시한다. 막대의 클러스터는, 항원상 다양한 TbpB를 나타내도록 선택된, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2, 검정색 막대), 헤모필루스 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115, 진회색 막대) 및 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12, 연회색 막대)인, 3개의 상이한 돼지 병원균으로부터의 온전한 TbpB에 대한 혈청의 반응성을 나타낸다(도 4). 결과는 온전한 TbpB(왼쪽으로부터 제1 클러스터, "온전한" 라벨링됨), TbpB N 로브(왼쪽으로부터 제2 클러스터, "N 로브" 라벨링됨), TbpB C 로브(왼쪽으로부터 제3 클러스터, "C 로브" 라벨링됨) 또는 N 로브와 C 로브의 혼합물(왼쪽으로부터 제4 클러스터, "N+C 로브" 라벨링됨)에 의해 면역화된 혈청의 반응성을 예시한다. 평균의 표준 오차(SEM) 오차 막대가 도시되어 있다. 사후로서 수행된 터키 HSD(honest significant difference: 정직한 유의차) 시험에 의해 ANOVA를 통해 통계학을 수행한다. 도면에 도시된 별은 H49에 대해 시험된 C 로브 또는 N+C 로브로부터 상당히 다른 특이적 면역화/단백질 쌍을 나타낸다.
도 4는 북아메리카, 유럽 및 아시아에서의 돼지로부터 단리된 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로부터의 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. 최대 확률 계통발생 나무는 임상 단리물의 수집으로부터 얻거나 공중 데이터베이스로부터 얻은 서열에 기초한 56개의 TbpB 사이의 관계식을 예시한다. TbpB 서열은 화살표로 표시된 대표적인 단리물을 가지는 3개의 주요 군으로 클러스터링된다(서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28 및 서열 번호 107 내지 서열 번호 115). 도 3에 예시된 ELISA 검정에서 사용된 TbpB 변이체를 발현하는 균주는 큰 검정색 별로 표시된다; 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2) 및 에이치. 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115). 큰 검정색 화살표는 도 1에 예시된 정렬에서 사용된 3개의 TbpB를 도시한다; 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2) 및 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 28).
도 5는, ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 융합 단백질(즉, TbpB N 로브에 융합된 말토스 결합 단백질(Mbp)) 전구체보다 정제된 TbpB 단백질을 사용할 때(패널 A 및 패널 B의 왼쪽 부분), 라벨링된 트랜스페린의 결합의 실질적인 감소에 의해 예시된, 에이. 플루로뉴모니아 H49로부터 ELISA 플레이트로의 TbpB N 로브(서열 번호 8)의 비무작위 결합을 도시한다. 도면은 N 말단 바이오티닐화된 펩타이드의 사용이 어떻게 무작위 결합을 극복하는지를 또한 예시한다(패널 A 및 패널 B의 오른쪽 부분). 패널 A의 왼쪽 부분은 정기적인 ELISA 플레이트에 대한 결합된 정제된 Mbp-TbpB N 로브 또는 TbpB N 로브를 측정하기 위해 라벨링된 트랜스페린(Tf)을 사용하는 검정의 결과를 예시한다. 오른쪽 부분은 재조합 단백질이 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트에 부착하기 위해 사용된 바이오티닐화된 N 말단 펩타이드 태그를 함유할 때의 결과를 예시한다. 패널 B는 패널 A에서 바로 위에 도시된 상응하는 결과에 대해 상이한 ELISA 웰에서 일어난다고 생각되는 것을 예시하는 카툰이다.
도 6은 3개의 상이한 돼지 병원균으로부터 TbpB C 로브로 이루어진 다합체의 설계 및 제조를 도시한다. 패널 A는 그 순서에서 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 6), 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 35) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 22)로부터의 C 로브의 삼합체(서열 번호 39; 서열 번호 40)에 대한 DNA 및 단백질 서열을 보여준다. 밑줄은 개별 C 로브를 연결하거나 제1 C 로브 앞의 펩타이드 서열을 표시한다. 패널 B는 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 N 로브 및 C 로브의 제제와 비교된 C 로브 삼합체의 제제의 SDS-PAGE 분석을 예시한다. 1㎕의 샘플은 1, 4 및 7 레인에 적용되고, 5㎕는 2, 5 및 8 레인에 적용되고, 10㎕는 3, 6 및 9 레인에 적용된다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(molecular weight standard: MWS)은 93, 70, 63, 41, 30 및 22이다.
도 7은 에이. 플루로뉴모니아 H49, 에이. 수이스 H57 및 에이. 플루로뉴모니아 H87(C 로브 삼합체, 서열 번호 40)로부터의 TbpB C 로브로부터의 C 로브로 이루어진 삼합체에 대한 면역 반응과 비교된 에이. 플루로뉴모니아(H49 C 로브, 서열 번호 6)로부터의 TbpB C 로브에 대한 면역 반응을 도시한다. 도면의 왼쪽 측의 막대의 클러스터는 H49 C 로브에 대한 면역 반응을 나타내지만, 도면의 왼쪽 측의 막대의 클러스터는 C 로브 삼합체에 대한 면역 반응을 나타낸다. 검정색 막대는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2)로부터의 TbpB에 대한 면역 반응을 나타내고, 진회색 막대는 에이치. 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115)로부터의 TbpB에 대한 면역 반응을 나타내고, 연회색 막대는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 22)로부터의 TbpB에 대한 면역 반응을 나타낸다.
도 8은 루프 감소에 표적화된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H49 TbpB N 로브("루프 1"; "루프 5"; "루프 8a"; "루프 8c" 및 "루프 12" 라벨링된)(각각 서열 번호 41; 서열 번호 49; 서열 번호 55; 및 서열 번호 63)의 루프 구역 및 원래 및 변형된 루프의 서열을 도시한다. 루프 8a 및 루프 8c는 균주 H49로부터의 TbpB에 존재하는 루프 8의 부분을 의미한다. 패널 A는, 라벨링된 표적화된 구역을 가지는, (세포 표면에서의 예측된 우세 배향에 대한) 측면에서 본 악티노바실루스 플루로뉴모니아 TbpB N 로브의 구조 모델이다. 패널 B는 루프 1 및 5와 핸들 도메인의 회합 및 루프 8a, 8c 및 12와 배럴 도메인의 회합을 예시하기 위해 상부로부터 본 동일한 구조 모델이다. 패널 C는 네이티브 TbpB 및 표적화된 루프 구역의 감소를 가지는 TbpB의 정렬이다. 루프를 코딩하는 서열의 구역은 회색으로 강조되고, 루프 수에 의해 라벨링된다.
도 9는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 10), 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 38) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 26)로부터의 TbpB N 로브의 조작된 루프 감소가 이의 제조 또는 안정성에 부정적으로 영향을 미치지 않지만, 돼지 Tf에 의한 결합을 제거한다는 것을 예시한다. 상부 패널은 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 10), 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 38) 또는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 26)로부터의 온전한 H49 TbpB(서열 번호 2), 네이티브 h49 TbpB N 로브(서열 번호 8) 및 조작된 TbpB N 로브의 제조를 예시한다. 이들은 폴리히스티딘 태그를 가지는 N 말단 말토스 결합 단백질과의 융합 단백질로서 발현되고, Ni-NTA 수지에서 포획된다. 결합된 단백질은 SDS-PAGE 완충제에서 방출되고, 10% SDS-PAGE 겔에서 분석된다. 중간 패널은 세파로스에 커플링된 돼지 트랜스페린(pTf-세파로스)로 이루어진 친화도 수지에 의해 포획되고 SDS-PAGE 완충제 중에 용리된 동일한 제제를 나타낸다. 하부 패널은, Ni-NTA 수지로부터 용리되고 니트로셀룰로스 수지에 점 표시되고, 차단 용액 중의 겨좌무과산화효소 접합된 돼지 트랜스페린(HRP-pTf), 및 HRP 기질 중의 항온처리에 의해 검출된 결합 HRP에 차단되고 노출된, 상부 패널로부터의 재료에 의한 점 검정을 예시한다.
도 10은 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스로부터의 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. BIGSDB 공중 데이터베이스(http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/ - 박테리아 단리물 게놈 서열 데이터베이스)에서 입수 가능한 대형 서열 수집과 조합된 100개 초과의 균주의 수집으로부터 서열분석된 tbpB 유전자의 하위세트가 이 도면에 표시되어 있다. 서열의 수집은 거의 50년의 연장된 시간 기간에 걸친 단리물의 전세계 수집을 나타내고, 따라서 이것은 전체 TbpB 다양성의 꽤 포괄적인 표시이다. 도 10a는 온전한 TbpB의 서열 다양성을 예시한다. 확인된 군에 대해 대표적인 서열을 제공하기 위해 화살표, 이중 화살표 또는 선으로 표시된 균주로부터의 TbpB에 대한 서열이 첨부된다(서열 번호 117; 서열 번호 124; 서열 번호 132 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 및 서열 번호 178). 1군 및 2-4군으로 표시된 2개의 1차 계통군이 아이소타입 I 및 아이소타입 II TbpB 혈통에 상응하는 이 나무 내에 확인된다(22). 1차 가지에 대한 지지 값이 도시되어 있고, "*"는 100%의 지지를 가지는 가지를 확인시켜준다. 균주 B16B6(서열 번호 117, 검정색 화살표)로부터의 TbpB로부터 유래된 항원은 도 11에서 분석된 항혈청을 생성하기 위해 사용되고, 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정(도 5)을 이용하여 회색 화살표로 표시된 균주(서열 번호 123; 및 서열 번호 132 내지 서열 번호 139)로부터의 TbpB에 대한 반응성에 대해 스크리닝된다. 도 10b는 TbpB 서열로부터 유래된 TbpB C 로브의 서열 다양성을 도시한다. 대표적인 서열을 제공하기 위해 화살표 또는 선으로 표시된 균주로부터의 TbpB C 로브에 대한 서열이 첨부된다(서열 번호 119; 서열 번호 125; 및 서열 번호 179 내지 서열 번호 195). 이중 머리 화살표로 표시된 2개의 균주는 C 로브 다양성의 더 포괄적인 표시를 제공하도록 포함되지만, 도 11에 예시된 항혈청의 분석에 이용 가능하지 않다.
도 11은 대표적인 아이소타입 I 균주 of 엔. 메닌기티디스인 B16B6으로부터 유래된 절두된 온전한 TbpB(서열 번호 148, aa 43-575) 및 TbpB C 로브(서열 번호 119 aa 342-575)에 지향된 항혈청의 반응성을 도시한다. 항혈청을 엔. 메닌기티디스에서의 TbpB의 전체 서열 다양성을 나타내는(화살표, 도 10) TbpB의 패널에 대해 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정(도 5)에서 시험하였다. TbpB의 패널은 엔. 메닌기티디스 균주 B16B6(서열 번호 117), H44/76(서열 번호 133), S3131(서열 번호 132), M990(서열 번호 134), M978(서열 번호 135), M992(서열 번호 138), P3006(서열 번호 139), 120M(서열 번호 137), MC58(서열 번호 136) 및 M982(서열 번호 123)로부터 유래된다. 결과는 C 로브 항혈청이 B16B6 및 H44/76으로부터의 TbpB를 제외하고 모든 TbpB에 대해 TbpB 항혈청보다 더 높은 역가를 가진다는 것을 입증한다.
도 12는 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(서열 번호 118)의 2개의 상이한 균주로부터의 TbpB C 로브로 이루어진 이합체의 설계 및 제조를 도시한다. 패널 A는 그 순서에서 엔. 메닌기티디스 균주 B16B6(서열 번호 118; 및 서열 번호 119) 및 M982(서열 번호 124; 및 서열 번호 125)로부터의 C 로브의 이합체에 대한 DNA 및 단백질 서열을 보여준다. 밑줄은 개별 C 로브를 연결하는 펩타이드 구역의 DNA 서열을 나타낸다. 패널 B는 엔. 메닌기티디스 균주 M982 및 B16B6으로부터의 개별 C 로브의 제제와 비교된 C 로브 이합체의 제제의 SDS-PAGE 분석을 예시한다.
도 13은 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(서열 번호 150)의 2개의 상이한 균주로부터의 TbpB C 로브로 이루어진 이합체에 대한 면역 반응의 분석을 도시한다. 막대의 쌍은 도 12에 예시된 아쥬번트 단독(나이브), B16B6 C 로브(서열 번호 119), M982 C 로브(서열 번호 125) 또는 B16B6 및 M982 C 로브의 이합체(서열 번호 150)에 의해 면역화된 토끼로부터 얻은 혈청을 나타낸다. 흰색 막대는 부동화된 온전한 M982 TbpB(서열 번호 123)를 가지는 새로운 맞춤형 ELISA 검정의 결과를 나타내고, 검정색 막대는 부동화된 온전한 B16B6 단백질(서열 번호 117)에 의한 결과를 나타낸다.
도 14는 엔. 메닌기티디스 M982의 TbpB 폴리펩타이드의 C 로브의 루프 도메인의 감소를 도시한다. 패널 A에서, 네이티브 C 로브(서열 번호 125) 및 변형된 C 로브(서열 번호 129)의 구조 모델은 4개의 루프(L18, L21, L23 및 L27)의 감소를 예시하도록 도시되어 있다. 왼쪽 측에서의 모델(서열 번호 125)에서, 감소에 표적화된 루프는 점으로 된 검정색 선으로 표시된다. 중간 모델(서열 번호 129)은 변형된 루프 도메인을 예시한다. 오른쪽 측에서의 모델에서, 2개의 이전 구조는 전체 단백질 구조에 영향을 미치지 않으면서 어떻게 큰 가변 루프가 제거되는지를 보여주기 위해 중첩된다. 패널 B는 네이티브 C 로브, 단일 루프가 변형된 것을 가지는 조작된 C 로브 및 모든 4개의 루프(L18, L21, L23 및 L27)가 변형된 C 로브("루프무" 라벨링된 서열)의 서열을 비교하는 폴리펩타이드 서열 정렬이다. 표적화된 루프를 포함하는 서열의 구역은 회색으로 강조되고, 루프 수는 회색 폰트로 표시된다.
도 15는 도 14에 기재된 엔. 메닌기티디스 M982의 변형된 C 로브의 미생물 제조를 도시한다. 야생형(WT) C 로브(서열 번호 125)는 도 14의 패널 A에서 왼쪽 측에서의 모델에 상응한다. 다른 샘플은 L18, L21, L23 및 L27 루프의 절두를 가지는 단백질 및 모든 4개의 루프가 제거된 단백질(모든 루프)을 나타낸다. 이 단백질(서열 번호 129)에 대한 구조 모델은 도 14에서 패널 A의 중간에 예시되어 있다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(MWS)은 93, 70 및 41kDa이다.
도 16은 균주 M982 및 B16B6으로부터의 네이티브 C 로브에 대한 엔. 메닌기티디스 균주 M982의 변형된 C 로브의 면역원성을 도시한다. 마우스 항혈청의 종점 역가는 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정에 의해 결정된다. 마우스를 균주 M982(서열 번호 125, 제1 막대)로부터의 C 로브, 균주 B16B6(서열 번호 119, 제2 막대)으로부터의 C 로브 TbpB 또는 '루프무' M982 C 로브(서열 번호 129, 마지막 2개의 막대)에 의해 면역화하였다. 혈청을 균주 M982(서열 번호 123)(제1 막대 및 제3 막대) 또는 균주 B16B6(서열 번호 117)(제2 막대 및 제4 막대)으로부터의 부동화된 온전한 TbpB에 대해 시험하였다. 결과는 변형된 C 로브가 모 C 로브 단백질보다 균주 M982로부터의 온전한 TbpB에 대한 더 높은 역가를 발생시키므로 더 면역원성이라는 것(막대 3 및 막대 1을 비교)을 보여준다. 놀랍게도, 변형된 C 로브는 심지어 비상동성 B16B6 TbpB에 대해 이 균주로부터의 C 로브와 유사한 수준의 반응성을 생성하였다(막대 4 및 막대 2를 비교).
도 17은 TbpB C 로브 스캐폴드에서의 TbpA의 구역을 디스플레이하는 하이브리드 단백질의 설계를 도시한다. 패널 A는 TbpB C 로브로 '이식'하도록 선택된 구역을 강조하는 TbpA(서열 번호 152)의 구조 모델이다. TbpA 루프 3 나선, 루프 10, 루프 11 및 플러그 루프는 공간 매움 구역으로 도시되어 있다. 패널 B는 네이티브 C 로브(C 로브)(서열 번호 125), 루프무 C 로브 스캐폴드(루프무 C)(서열 번호 129) 및 디스플레이된 TbpA의 모든 구역을 가지는 하이브리드 단백질(서열 번호 131)의 정렬을 보여준다. 하이브리드 단백질에서, TbpA 루프 3 나선은 TbpB C 로브의 루프 18을 대체하고, TbpA 루프 10은 TbpB C 로브의 루프 21을 대체하고, TbpA 루프 11은 TbpB C 로브의 루프 23을 대체하고, TbpA 플러그 루프는 TbpB C 로브의 루프 27을 대체한다.
도 18은 도 17에 기재된 전략을 이용하여 제조된 하이브리드 TbpA-TbpB C 로브의 미생물 제조를 도시한다. 패널 A는 N 말단 말토스 결합 단백질(Mbp) 융합 파트너를 가지는 재조합 융합 단백질의 제조를 예시하고, 패널 B는 TEV 프로테아제에 의한 절단 후 단백질을 예시한다. 야생형(WT) 단백질은 네이티브 M982 C 로브(서열 번호 125)이고, 마이너스 루프는 TbpA 구역을 디스플레이하기 위해 스캐폴드로서 효과적으로 작용하는 모든 4개의 루프가 제거된 C 로브(서열 번호 129)이다. 루프 10은 TbpB C 로브 루프 21로 삽입된 TbpA의 세포외 루프 구역을 가지는 단백질(서열 번호 154)을 의미한다. 루프 11은 TbpB C 로브 루프 23으로 삽입된 TbpA의 세포외 루프 구역을 가지는 단백질(서열 번호 156)을 의미한다. 나선 3은 TbpB C 로브 루프 18로 삽입된 TbpA의 세포외 루프 3의 분절(서열 번호 158)을 의미한다. 플러그 루프는 TbpB C 로브 루프 27로 삽입된 TbpA의 플러그 도메인으로부터의 구역(서열 번호 160)을 의미한다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(MWS)은 93, 70, 53, 41 및 22이다.
도 19는 변형된 루프 부위로 스플라이싱된 TbpA로부터의 외래 루프 구역을 가지는 변형된 C 로브와 비교된 엔. 메닌기티디스 균주 M982의 변형된 C 로브의 면역원성을 도시한다. 마우스 항혈청의 종점 역가는 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정에 의해 결정된다. 마우스를 (ⅰ) 모든 4개의 루프가 제거된 '루프무' C 로브(서열 번호 129), (ⅱ) TbpB C 로브 루프 21로 삽입된 TbpA 루프 10을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 154), (ⅲ) TbpB C 로브 루프 23으로 삽입된 TbpA 루프 11을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 156), (ⅳ) TbpB C 로브 루프 18로 삽입된 TbpA 루프 나선 3을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 158), 또는 (ⅴ) TbpB C 로브 루프 27로 삽입된 TbpA 플러그 루프를 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 160)에 의해 면역화하였다. 혈청을 '루프무' C 로브가 삽입된 TbpA 루프(서열 번호 131)의 모든 4개를 가지는 하이브리드 TbpA-TbpB 항원에 대해 시험하였다. 결과는 모든 하이브리드 항원이, 적어도 '루프무' C 로브의 면역원성만큼, 면역원성이라는 것을 보여준다.
도 20은 TbpB C 로브 스캐폴드에서의 LbpA(서열 번호 162)의 구역을 디스플레이하는 하이브리드 단백질의 설계 및 제조를 도시한다. 패널 A는 TbpB C 로브로 '이식'하도록 선택된 구역을 강조하는 LbpA의 구조 모델이다. LbpA 루프 3 나선은 더 어두운 회색 색상이고, 루프 2는 검정색 색상이다. 패널 B는 네이티브 C 로브(C 로브, 서열 번호 125), 루프무 C 로브 스캐폴드(루프무 C, 서열 번호 129) 및 디스플레이된 LbpA의 구역을 가지는 하이브리드 단백질의 정렬을 보여준다. 하이브리드 단백질에서, LbpA 루프 2는 TbpB C 로브(서열 번호 164)의 루프 21을 대체하고, LbpA 루프 3 나선은 TbpB C 로브(서열 번호 166)의 루프 18을 대체한다. 이 겔에서 관찰된 단백질 분자량 표준(MWS)은 100, 75, 63 및 48이다.
도 21은 인간 병원균 헤모필루스 인플루엔자로부터의 TbpB C 로브에서의 '접합 루프'의 설계를 도시한다. 패널 A는 더 큰 폰트로 도시된 접합 루프(서열 번호 167)를 코딩하는 DNA 구역을 가지는 하이브리드 유전자를 코딩하는 유전자에 대한 DNA 및 단백질 서열을 도시되어 있다. 아미노산은 라이신이 K 철자로 표시된 1 철자 코드로 도시되어 있고, 여기서 전체 C 로브(서열 번호 168)에서 24개와 비교하여 접합 루프에서 42개가 존재한다. 패널 B는 접합 루프의 삽입에 대한 위치를 나타내는 에이치. 인플루엔자 TbpB C 로브의 구조 모델을 예시한다. 예시된 바대로, 접합 루프는 C 로브의 루프 L23을 대체하는 C 로브의 핸들 도메인으로 삽입된다(본 발명에 걸쳐 사용된 루프 명명법을 이용)(도 2). 예시적인 목적을 위해 모델이 실제 단백질에서 91개 대신에 11개의 아미노산의 접합 루프에 의해 생선된다는 것에 주목한다.
도 22는 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 에이치. 파라수이스로부터의 재조합 절두된 TbpB 단백질로부터 유래된 부위 지정 돌연변이체 TbpB 단백질의 트랜스페린 결합 특성을 도시한다. 재조합 절두된 TbpB 단백질은 융합 단백질로서 발현되고, 결합 활성에 대해 시험된다. 재조합 융합 단백질을 고상 결합 검정 및 친화도 포획 검정에 의해 초기에 트랜스페린 결합에 대해 스크리닝한다. 정제된 돌연변이체 단백질을 이후 등온 열량계, 표면 플라스몬 공명 또는 2중층 간섭법에 의해 pTf에 대한 결합에 대해 평가한다(23-25). 돌연변이 중 몇몇, 예컨대 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49로부터의 TbpB에서의 F171A 돌연변이, 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87로부터의 TbpB에서의 Y174A 돌연변이 또는 에이치. 파라수이스 균주 HP5로부터의 TbpB에서의 Y167A 돌연변이는 친화도 상수(Kd)를 100배 이상 증가시켰다. 이 돌연변이체가 모두 루프 8로 맵핑된다는 것에 주목하는 것이 흥미롭다.
도 23은 네이티브 숙주에서 보호성 면역 반응을 유도하는 부위 지정 돌연변이체 단백질의 능력의 증대를 도시한다. 이 도면에서, 에이치. 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 174)로부터의 부위 지정 Y167A TbpB의 능력을 야생형 TbpB(서열 번호 115), 및 상업용 백신(Porcillis Glasser) 및 아쥬번트 단독을 포함하는 대조군과 비교하였다. 돼지를 108 콜로니 형성 단위(colony-forming unit: cfu)의 Hp5(나가사키) 균주에 의해 기관내 접종에 의해 시험감염하고, 실험의 기간에 걸쳐 임상 징후 및 증상에 대해 모니터링하였다. 심각한 종합증상을 가지는 동물을 실험의 종료 전에 안락사시켰다. 그래프는 12시간 증분으로 24시간으로부터 108시간으로의 생존 곡선을 도시하고, 이후 14일에 최종 시점에 연결한다.
도 24는 네이티브 및 돌연변이체 TbpB 항원에 의해 유도된 세포내 면역 반응을 도시한다. 패널 A 및 패널 B는 각각 시험감염의 일(2개의 IM 면역화 후) 및 시험감염 후 4일(96시간)에 B 세포 반응을 예시한다. 패널 C 및 패널 D는 시험감염의 일 및 시험감염 후 4일에 T 보조 세포 반응을 예시한다. 다이아몬드, 삼각형 및 정사각형은 각각 네이티브 TbpB, Y167A 돌연변이체 TbpB 및 포르실리스 글라서(: PG) 백신에 의해 면역화된 돼지를 나타낸다. 시험감염 후 4일에 네이티브 TbpB 및 PG 백신 치료된 돼지에 대한 샘플의 수가 감소하였다. 말초 혈액 단핵 세포에 의한 FACS 분석에 의해 분석을 수행하였다. 군 간의 유의차: *p<0.05, *** p<0.001.
도 25는 엔. 메닌기티디스로부터의 재조합 절두된 TbpB, 재조합 절두된 TbpB N 로브 또는 재조합 TbpB C 로브에 의한 면역화가 인간화 형질전환 마우스 모델에서 콜로니화로부터 보호를 제공한다는 것을 도시한다. 패널 A에 예시된 실험에서, 인간 CEACAM1 수용체를 발현하는 형질전환 C57 검정색 마우스를 1일 및 21일에 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 재조합 절두된 TbpB 또는 아쥬번트 단독에 의해 면역화하였다. 마우스를 35일에 대략 1 x 107 CFU의 엔. 메닌기티디스 균주 M982에 의해 기관내 접종으로 처리하였다. 정사각형 및 원형은 시험감염 후 3일(38일)에 개별 마우스로부터 회수된 CFU를 나타낸다. 패널 B는 마우스를 1일 및 21일에 재조합 절두된 TbpB, 재조합 절두된 TbpB N 로브, 재조합 TbpB C 로브, 재조합 H 인자 결합 단백질 또는 아쥬번트 단독에 의해 면역화한 추적관찰 실험을 예시한다. 패널 A에서처럼, 개별 마우스에서 시험감염 후 3일에 회수된 엔. 메닌기티디스 균주 M982의 CFU의 수가 그래프에 작도된다.
도 26은 인간 병원균 나이세리아 고노레아로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브의 서열 다양성을 도시한다. 패널 A(도 26a)는 온전한 TbpB의 서열 다양성을 예시하고, 패널 A(도 26b)는 TbpB C 로브에 대한 서열 다양성을 나타낸다. 대표적인 엔. 메닌기티디스 TbpB 및 TbpB C 로브에 대한 서열(도 10, 화살표 및 이중 화살표)은 엔. 고노레아로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브에 대한 서열이 어느 정도로 엔. 메닌기티디스에 존재하는 것의 서열 다양성의 하위세트인지를 결정하기 위해 이 분석에 포함된다. 도 10에서처럼, 화살표로 표시된 대표적인 엔. 고노레아 TbpB 서열(서열 번호 207 내지 서열 번호 212) 및 TbpB C 로브 서열(서열 번호 213 내지 서열 번호 218)은 전체 서열 다양성의 표시를 제공하도록 첨부에 포함된다. 패널 A에 예시된 것처럼, 메닝고코커스 아이소타입 2 TbpB의 하위가지인 엔. 고노레아 TbpB의 2개의 클러스터가 존재한다. 메닝고코커스 균주 H44/76으로부터의 TbpB와 가장 밀접히 연관된 하나의 더 큰 클러스터 및 균주 P3306으로부터의 TbpB와 가장 밀접히 연관된 더 작은 클러스터가 존재한다. 패널 B에서의 C 로브 나무는 엔. 고노레아 TbpB C 로브가 메닝고코커스 아이소타입 2 TbpB와 가장 밀접히 연관된 메닝고코커스 TbpB C 로브로부터 구별되는 클러스터를 형성한다는 것을 나타낸다.
도 27은 인간 병원균 헤모필루스 인플루엔자로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브의 서열 다양성을 도시한다. 패널 A(도 27a)는 온전한 TbpB의 서열 다양성을 예시하고, 패널 B(도 26b)는 TbpB C 로브에 대한 서열 다양성을 나타낸다. 화살표로 표시된 대표적인 에이치. 인플루엔자 TbpB 서열(서열 번호 196-204)은 전체 서열 다양성의 표시를 제공하도록 첨부에 포함된다. 패널 A에 예시된 바대로, b형 및 섞인 유형 구별 불가 에이치. 인플루엔자 균주를 포함하는 에이치. 인플루엔자 TbpB의 3개의 주요 클러스터(군)가 존재하여서, TbpB 다양성이 캡슐의 존재와 같은 임의의 다른 속성과 연결되지 않는다는 것을 나타낸다. C 로브 다양성의 3개의 주요 군이 또한 존재한다.
도 28은 반추동물 병원균 만헤이미아 헤몰리티카, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시(각각 파스퇴렐라 헤몰리티카 및 피. 트레할로시로서 당해 분야에 또한 공지됨) 중에서 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. 화살표는 서열 번호 목록에 포함된 대표적인 서열을 나타낸다.
도 29는 모락셀라 카타르할리스로부터의 TbpB의 서열 다양성을 도시한다. 화살표는 서열 번호 목록에 포함된 3개의 주요 클러스터로부터의 TbpB의 대표적인 서열을 나타낸다.
도 30은 예시적인 계통발생 나무를 도시한다.
표 1 내지 3은 본 발명에 따라 변형될 수 있는 HIBP 폴리펩타이드의 루프 도메인 L1-L32로부터 선택된 각각 1, 2 또는 3 루프 도메인의 조합을 나타낸다.
본 발명의 소정의 실시형태에 따라 변형될 수 있는 루프 도메인 또는 루프 도메인의 조합을 보여준다.
본 발명의 소정의 실시형태에 따라 루프 도메인의 허용되지 않는 조합을 보여준다.
허용되는 루프 도메인의 조합을 보여준다.
그 외 본 발명의 소정의 실시형태에 따라 동일한 표에서.
다양한 조성물 및 방법은 각각의 청구된 대상의 실시형태의 예를 제공하기 위해 하기 기재될 것이다. 하기 기재된 실시형태는 임의의 청구된 대상을 제한하지 않고, 임의의 청구된 대상은 하기 기재된 것과 다른 방법, 공정, 조성물 또는 시스템을 포괄할 수 있다. 청구된 대상은 하기 기재된 임의의 하나의 조성물, 방법, 시스템 또는 공정의 모든 특징, 또는 하기 기재된 복수의 또는 모든 조성물, 시스템 또는 방법에 공통적인 특징을 갖는 조성물 또는 방법으로 제한되지 않는다. 하기 기재된 조성물, 시스템, 방법 또는 공정은 임의의 청구된 대상의 실시형태가 아닐 수 있다. 본 문헌에 청구되지 않은 하기 기재된 조성물, 시스템, 방법 또는 공정에 개시된 임의의 대상은 또 다른 보호 장치의 대상, 예를 들어 연속 특허 출원일 수 있고, 본 출원인들, 본 발명자들 또는 소유자들은 본 문헌에서 이의 개시내용에 의해 임의의 이러한 대상을 포기하거나, 부인하거나, 공중에게 헌정하도록 의도되지 않는다.
"실질적으로", "본질적으로" "약" 및 "대략"과 같은 정도의 용어는 본 명세서에 사용된 바대로 수식된 용어의 편차의 합당한 양을 의미하여서 최종 결과가 상당하게 변하지 않는 것에 주목해야 한다. 정도의 이 용어는 이 편차가 이것이 수식하는 용어의 의미를 무효화하지 않는 경우 수식된 용어의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 단어 "및/또는"은 포함(또는)을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, "X 및/또는 Y"는 예를 들어 X 또는 Y 또는 둘 다를 의미하는 것으로 의도된다. 추가의 예로서, "X, Y 및/또는 Z"는 X 또는 Y 또는 Z 또는 임의의 이들의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보에서처럼 동일한 정도로 그 전문이 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
상기 언급된 바대로, 본 발명은 새로운 면역원성 조성물, 및 특히 그람 음성 병원성 박테리아 종, 예컨대 나이세리아 메닌기티디스로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질에 기초한 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 감염성 병원성 그람 음성 박테리아 종에 대해 인간 및 동물을 보호하기 위해 새로운 백신 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다는 점에서 유용하다. 본 발명에 따라, 본 발명의 HIBP 표면 수용체 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다. 이러한 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질은 예상치 못하게 강한 면역원성 특성을 나타낸다. 더구나 본 발명의 면역원성 조성물은 실질적으로 안정한 폴리펩타이드이고, 따라서 용이하게 제조될 수 있다. 게다가, 중요하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들어 교차반응성인 면역 반응을 유도하고, 따라서 단일 효율적인 백신접종 화합물의 투여에 의해 다수의 병원성 미생물 유기체에 대한 보호를 허용함으로써 예상치 못하게 효과적이다. 본 발명에 따라 제조된 백신은 살아 있는 유기체 또는 미정제 추출물을 함유하지 않아서, 매우 제한된 건강 위험을 나타낸다.
따라서, 본 발명은, 적어도 하나의 실시형태에서, 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, HIBP 표면 수용체 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다.
본 발명은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 추가로 제공하고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 소정의 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 하나 이상의 루프 도메인은 변형된다.
용어 및 정의
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 상기이든 또는 하기이든, 본 명세서에 인용된 진뱅크(GenBank), 스위스프로(SwissPro) 및 다른 데이터베이스로부터의 핵산 및 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 모든 특허 및 특허 출원, 및 다른 공보는, 허용되는 경우, 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 이 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 것처럼, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이것"은 내용이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수 지칭을 포함한다는 것에 추가로 주목한다. 따라서, 예를 들어 "면역원"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 물질의 혼합물을 포함하고, "폴리펩타이드"에 대한 언급은 2개 이상의 폴리펩타이드의 혼합물에 대한 언급을 포함하고, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 세포를 포함하고, 기타 등등이다.
용어 "면역원" 및 "면역원성 조성물"은, 본 명세서에서 상호교환으로 사용되는 바대로, 이의 가장 광의의 의미에서 세포의 면역원-특이적 면역 반응 및/또는 체액 항체 반응을 생성하기 위해 숙주 유기체에서 면역 반응을 자극하는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 의미하도록 사용된다. 면역원은 핵산, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 면역원성 단백질 단편을 포함한다.
용어 "백신" 및 "백신 조성물"은, 본 명세서에서 상호교환으로 사용되는 바대로, 대상체에서 질환 또는 병증을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있는, 면역원을 함유하는 임의의 약제학적 조성물을 의미한다. 상기 용어는 따라서 구성단위 백신, 즉 면역원이 자연에서 연관된 전체 유기체로부터 분리되고 구별되는 면역원을 함유하는 백신 조성물을 포함한다.
용어 "척추동물 대상체"는 서브필룸 코르다타(subphylum cordata)의 임의의 구성원, 특히 제한 없이, 인간 및 다른 영장류를 포함하는 포유동물을 의미한다. 상기 용어는 특정 연령을 나타내지 않는다. 따라서, 신생아, 유아, 아이 및 성인 개체 둘 다가 포괄되도록 의도된다.
상호교환으로 본 명세서에 사용되는 용어 "HIBP 표면 수용체 단백질", "HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드", "숙주 철 결합 단백질 표면 수용체 단백질" 또는 "숙주 철 결합 단백질 표면 폴리펩타이드"는 숙주 철-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 임의의 막 부착 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 용어는 임의의 TbpB 및 LbpB 단백질을 포함한다. HIBP 표면 수용체 단백질은, 이의 네이티브 3차원 구조에서 폴딩될 때, N 로브 도메인 및 C 로브 도메인을 포함하는 2로브 구조로 이루어지고, N 로브 도메인 및 C 로브 도메인은 각각 β 배럴에서 조립된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 β 가닥은 β 배럴에 인접한 β 시트 구조(핸들 도메인이라 칭함)에서 조립되고, β 가닥은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된다(도 1에 추가로 예시된 바와 같음). 상기 용어는 추가로 제한 없이 서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28; 서열 번호 107 내지 서열 번호 115; 서열 번호 117; 서열 번호 123; 서열 번호 131 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 서열 번호 178; 서열 번호 196 내지 서열 번호 204; 서열 번호 206 내지 서열 번호 212; 및 서열 번호 219 내지 서열 번호 228에 기재된 것을 포함하는 모든 박테리아 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드, 및 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질을 구성하는 아미노산 서열에 실질적으로 동일하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 포함하는, 임의의 및 모든 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 상기 용어는 추가로 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질 전구체 폴리펩타이드를 포함하거나; (ⅲ) 구조 모델링 서버, 예컨대 Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) 또는 스위스-모델(http://swissmodel.expasy.org/)(후자에서 자동화 모드를 선택함)에 제출될 때 주형으로서 트랜스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질 또는 이의 하위도메인을 사용할 것이다. 상기 용어는 추가로 성숙 TbpB 폴리펩타이드, 및 임의의 프리-HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드 전구체, 또는 N 말단 또는 다른 신호 서열을 포함하는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드 전구체를 포함하는 임의의 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드 전구체를 포함한다.
상호교환으로 본 명세서에 사용되는 용어 "필수적 외부 막 단백질" 및 "IOM 단백질"은, 이의 네이티브 3차원 구조로 폴딩될 때, C 말단 베타 배럴 도메인에서 채널을 충전할 수 있는 22 가닥의 C 말단 베타 배럴 도메인 및 N 말단 플러그 또는 코르크 도메인을 포함하는, 단백질의 TonB 의존적 하위종류에 속하는 임의의 단백질을 포함하는, 그람 음성 박테리아 종으로부터의 임의의 필수적 외부 막 단백질을 의미한다. 상기 용어는 제한 없이 TbpA 및 LbpA 단백질을 포함한다. 상기 용어는 추가로 서열 번호 152; 및 서열 번호 162에 기재된 것 및 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 임의의 IOM 단백질을 구성하는 아미노산 서열에 실질적으로 동일하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 IOM 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 IOM 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 모두 포함하는, 임의의 및 모든 IOM 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 상기 용어는 추가로 임의의 IOM 단백질 전구체 폴리펩타이드를 포함하거나; (ⅲ) 구조 모델링 서버, 예컨대 Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) 또는 스위스-모델(http://swissmodel.expasy.org/)(후자에서 자동화 모드를 선택함)에 제출될 때 주형으로서 3V8X 또는 이의 하위도메인을 사용할 것이다.
용어 "N 로브 도메인"은 본 명세서에 사용된 바대로 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하는 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 말단 부분을 의미하고, β 가닥 중 몇몇은 β 배럴 및 인접한 β 시트 구조(핸들 도메인이라 칭함)를 형성하도록 구성된다(참조: 도 1; 46번 아미노산 잔기 내지 342번 아미노산 잔기). 상기 용어 N 로브 도메인은 추가로 제한 없이 서열 번호 8; 서열 번호 10; 서열 번호 24; 서열 번호 26; 서열 번호 36; 서열 번호 38; 서열 번호 121; 서열 번호 127; 서열 번호 229; 서열 번호 231; 및 서열 번호 233에 기재된 서열을 가지는 모든 폴리펩타이드를 포함한다.
용어 "C 로브 도메인"은 본 명세서에 사용된 바대로 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 말단 부분을 의미하고, β 가닥 중 몇몇은 β 배럴 및 인접한 β 시트 구조(핸들 도메인이라 칭함)를 형성하도록 구성된다. 도 1 및 도 2를 더욱 참조하면, C 로브 핸들 도메인은 β 가닥 16으로부터 위로 및 β 가닥 23(포함)까지의 인접 폴리펩타이드 도메인이고, 이것은 도 2에 도시된 ApH49, ApH57 및 ApH87 TbpB 폴리펩타이드의 경우에 344번 내지 431번 아미노산 잔기, 및 서열 번호 2에서 314번 아미노산 잔기 내지 401번 아미노산 잔기(ApH 49), 서열 번호 27에서 363번 아미노산 잔기 내지 450번 아미노산 잔기(ApH 57), 및 서열 번호 12에서 315번 아미노산 잔기 내지 401번 아미노산 잔기 (ApH 87)로 이루어진다. C 로브 β 배럴 도메인은 β 가닥 23으로부터 위로 폴리펩타이드의 C 말단까지의 인접 폴리펩타이드 도메인이고, 이것은 도 2에 도시된 ApH49, ApH57 및 ApH87 TbpB 폴리펩타이드의 경우에 443번 아미노산 잔기로부터 위로 및 C 말단까지, 및 서열 번호 2에서 413번 아미노산 잔기로부터 위로(ApH 49), 서열 번호 27에서 462번 아미노산 잔기로부터 위로(ApH 57), 및 서열 번호 12에서 413번 아미노산 잔기로부터 위로의 폴리펩타이드 사슬이다. C 로브 핸들 도메인 및 C 로브 β 배럴 도메인이 짧은 루프에 의해 연결될 수 있다(도 1 및 도 2에서 "L24"로 표시)는 것에 주목한다. 상기 용어 C 로브 도메인이, 본 명세서에 사용된 바대로, C 로브 β 배럴 도메인뿐만 아니라, β 시트 구조를 형성하는 핸들 도메인을 포함하고, 통상적으로 대략 90개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지고, C 로브 β 배럴 구조에 대해 N 말단에 위치하는 것으로 구체적으로 의도된다는 것에 추가로 주목한다. 상기 용어 C 로브 도메인은, 본 명세서에 사용된 바대로, 제한 없이 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 22; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 서열 번호 213 내지 서열 번호 218; 서열 번호 230; 서열 번호 232; 서열 번호 234 내지 서열 번호 278; 및 서열 번호 288 내지 서열 번호 292에 기재된 모든 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
용어 "루프 도메인"은 2개의 β 가닥을 연결하는 HIBP 표면 수용체 단백질에서 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 이 폴리펩타이드 서열은 몇몇 아미노산 잔기로부터 150개 이상까지의 아미노산 잔기의 길이로 상당히 변할 수 있다.
용어 "TbpB", "TbpB 단백질", "TbpB 폴리펩타이드"는, 본 명세서에서 상호교환으로 사용되는 바대로, 모든 박테리아 TbpB 폴리펩타이드 및 (ⅰ) 제한 없이 서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28; 서열 번호 107 내지 서열 번호 115; 서열 번호 117; 서열 번호 123; 서열 번호 131 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 서열 번호 178; 서열 번호 196 내지 서열 번호 204; 서열 번호 206 내지 서열 번호 212; 및 서열 번호 219 내지 서열 번호 228을 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 TbpB 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나, (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 TbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 TbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 임의의 및 모든 트랜스페린 결합 단백질 B 서열을 의미한다. 상기 용어는 추가로 성숙 TbpB 폴리펩타이드, 및 임의의 TbpB 전구체, 예컨대 임의의 프리-TbpB, 또는 N 말단 또는 다른 신호 서열을 포함하는 TbpB를 포함한다.
용어 "LbpB", "LbpB 단백질", "LbpB 폴리펩타이드"는, 본 명세서에서 상호교환으로 사용되는 바대로, 모든 박테리아 LbpB 폴리펩타이드 및 (ⅰ) 제한 없이 서열 번호 285를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 LbpB 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나, (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 LbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 LbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 임의의 및 모든 락토페린 결합 단백질 B 서열을 의미한다. 상기 용어는 추가로 프리-LbpB를 포함하는 임의의 LbpB 전구체를 포함한다.
용어 "TbpA", "TbpA 단백질", "TbpA 폴리펩타이드"는, 본 명세서에서 상호교환으로 사용되는 바대로, 모든 박테리아 TbpA 폴리펩타이드 및 (ⅰ) 제한 없이 서열 번호 152를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 TbpA 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나, (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 TbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 TbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 임의의 및 모든 트랜스페린 결합 단백질 A 서열을 의미한다. 상기 용어는 추가로 프리-TbpA를 포함하는 임의의 TbpA 전구체를 포함한다.
용어 "LbpA", "LbpA 단백질", "LbpA 폴리펩타이드"는, 본 명세서에서 상호교환으로 사용되는 바대로, 모든 박테리아 LbpA 폴리펩타이드 및 (ⅰ) 제한 없이 서열 번호 162를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 LbpA 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나, (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 LbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 LbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 임의의 및 모든 락토페린 결합 단백질 A 서열을 의미한다. 상기 용어는 추가로 프리-LbpA를 포함하는 임의의 LbpA 전구체를 포함한다.
용어 "핵산 서열"은 본 명세서에 사용된 바대로 천연 발생 염기, 당 및 당간(골격) 연결로 이루어진 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 단량체의 서열을 의미한다. 상기 용어는 또한 비천연 발생 단량체를 포함하는 변형된 또는 치환된 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 데옥시리보핵산 서열(DNA) 또는 리보핵산 서열(RNA)일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함하는 천연 발생 염기를 포함할 수 있다. 서열은 변형된 염기를 또한 함유할 수 있다. 이러한 변형된 염기의 예는 아자 및 데아자 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실, 및 잔틴 및 하이포잔틴을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환으로 사용된 용어 "HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열" 및 "HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 임의의 및 모든 핵산 서열, 및 제한 없이 서열 번호 1; 서열 번호 11; 서열 번호 27; 서열 번호 116; 서열 번호 122; 및 서열 번호 173에 기재된 것을 포함하는 HIBP 표면 수용체 단백질 전구체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "HIBP 표면 수용체 단백질 전구체"는 세포질 막에 걸친 폴리펩타이드 사슬의 배출을 수월하게 하는 N 말단 신호 서열을 부가적으로 포함하는 HIBP 표면 수용체 단백질 분자를 의미한다. HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 추가로 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 HIBP 표면 수용체 단백질 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 코딩하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질 핵산 서열에 하이브리드화하거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 이것에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화하는, 임의의 및 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환으로 사용된 용어 "IOM 단백질을 코딩하는 핵산 서열" 및 "IOM 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 임의의 IOM 단백질을 포함하는 IOM 단백질을 코딩하는 임의의 및 모든 핵산 서열, 및 제한 없이 서열 번호 151 및 서열 번호 161에 기재된 것을 포함하는 IOM 단백질 전구체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "IOM 단백질 전구체"는 세포질 막에 걸친 폴리펩타이드 사슬의 배출을 수월하게 하는 N 말단 신호 서열을 부가적으로 포함하는 IOM 단백질 분자를 의미한다. IOM 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 추가로 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 IOM 단백질 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 코딩하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 IOM 단백질 핵산 서열에 하이브리드화하거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 이것에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화하는, 임의의 및 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환으로 사용된 용어 "TbpB를 코딩하는 핵산 서열" 및 "TbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 제한 없이 서열 번호 1; 서열 번호 11; 서열 번호 27; 서열 번호 116; 서열 번호 122; 및 서열 번호 173에 기재된 서열을 포함하는 임의의 TbpB 폴리펩타이드를 포함하는 TbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 및 모든 핵산 서열, 및 추가로 TbpB 전구체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "TbpB 전구체"는 세포질 막에 걸친 폴리펩타이드 사슬의 배출을 수월하게 하는 N 말단 신호 서열을 부가적으로 포함하는 TbpB 분자를 의미한다. TbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 추가로 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 TbpB 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 코딩하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 TbpB 핵산 서열에 하이브리드화하거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 이것에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화하는, 임의의 및 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환으로 사용된 용어 "LbpB를 코딩하는 핵산 서열" 및 "LbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 제한 없이 서열 번호 284에 기재된 서열을 포함하는 임의의 LbpB 폴리펩타이드를 포함하는 LbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 및 모든 핵산 서열, 및 LbpB 전구체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "LbpB 전구체"는 세포질 막에 걸친 폴리펩타이드 사슬의 배출을 수월하게 하는 N 말단 신호 서열을 부가적으로 포함하는 LbpB 분자를 의미한다. LbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 추가로 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 LbpB 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 코딩하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 LbpB 핵산 서열에 하이브리드화하거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 이것에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화하는, 임의의 및 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환으로 사용된 용어 "TbpA를 코딩하는 핵산 서열" 및 "TbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 제한 없이 서열 번호 151에 기재된 핵산 서열을 포함하는 임의의 TbpA 폴리펩타이드를 포함하는 TbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 및 모든 핵산 서열, 및 TbpA 전구체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "TbpA 전구체"는 세포질 막에 걸친 폴리펩타이드 사슬의 배출을 수월하게 하는 N 말단 신호 서열을 부가적으로 포함하는 TbpA 분자를 의미한다. TbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 추가로 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 TbpA 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 코딩하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 TbpA 핵산 서열에 하이브리드화하거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 이것에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화하는, 임의의 및 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환으로 사용된 용어 "LbpA를 코딩하는 핵산 서열" 및 "LbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열"은 제한 없이 서열 번호 161에 기재된 핵산 서열을 포함하는 임의의 LbpA 폴리펩타이드를 포함하는 LbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 및 모든 핵산 서열, 및 LbpA 전구체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바대로 "LbpA 전구체"는 세포질 막에 걸친 폴리펩타이드 사슬의 배출을 수월하게 하는 N 말단 신호 서열을 부가적으로 포함하는 LbpA 분자를 의미한다. LbpA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 추가로 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 LbpA 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드를 코딩하거나; (ⅱ) 적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건 하에 본 명세서에 기재된 임의의 LbpA 핵산 서열에 하이브리드화하거나, 적어도 적당히 엄격한 조건 하에 이것에, 그러나 동의 코돈의 사용을 위해, 하이브리드화하는, 임의의 및 모든 핵산 서열을 포함한다.
용어 "실질적으로 동일한"이란, 2개의 폴리펩타이드 서열이 바람직하게는 적어도 50% 동일하고, 더 바람직하게는 적어도 85% 동일하고, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일하고, 예를 들어 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성의 백분율을 결정하기 위해, 이러한 2개의 서열의 아미노산 서열은 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)(27)에 의해 개정된 바대로 예를 들어 니들만(Needleman) 및 분취(Wunsch)(26)의 정렬 방법을 이용하여 정렬되어서, 최고 차수 일치는 2개의 서열 사이에 얻어지고, 2개의 서열 사이의 동일한 아미노산의 수가 결정된다. 2개의 폴리펩타이드를 정확하게 정렬하기 위한 바람직한, 광범위하게 적용 가능한, 방법은 10의 갭 오픈 패널티(gap opening penalty) 및 0.1의 갭 연장 패널티(gap extension penalty)를 사용하여 BLOSUM 62 점수 매김 매트릭스(29)에 의해 이용되는 클루스탈(Clustal) W 알고리즘(28)을 포함한다. 이것은 2개의 서열 사이의 높은 점수 매김 정렬의 확인이 가능하게 하고, 2개의 서열 중 하나의 전체 길이의 적어도 50%가 정렬에 포함된다. 2개의 정렬된 아미노산 서열 사이의 동일성의 백분율을 결정하는 방법은 일반적으로 분야에서 인정되고, 예를 들어 카릴로(Carillo) 및 립톤(Lipton)(30)에 의해 기재된 것 및 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects]에 기재된 것을 포함한다. 일반적으로, 컴퓨터 프로그램은 이러한 계산에 이용될 것이다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은 GCG(31) BLASTP, BLASTN 및 FASTA(32)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"적어도 적당히 엄격한 하이브리드화 조건"이란, 용액 중의 2개의 상보성 핵산 분자 사이의 선택적 하이브리드화를 촉진하는 조건이 선택된다는 것을 의미한다. 핵산 서열 분자의 전부 또는 일부에 하이브리드화 발생할 수 있다. 하이브리드화 부분은 통상적으로 적어도 15개(예를 들어, 20개, 25개, 30개, 40개 또는 50개)의 뉴클레오타이드의 길이이다. 당해 분야의 당업자는 핵산 이중가닥 또는 하이브리드의 안정성이 Tm에 의해 결정된다는 것을 인식할 것이고, 여기서 나트륨 함유 완충제는 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수이다(Tm=81.5℃-16.6(Log10 [Na+])+0.41(%(G+C)-600/ℓ), 또는 유사 방정식). 따라서, 하이브리드 안정성을 결정하는 세척 조건에서의 매개변수는 나트륨 이온 농도 및 온도이다. 공지된 핵산 분자에 유사하지만, 동일하지 않은 분자를 확인하기 위해, 1% 미스매치가 약 1℃의 Tm의 감소를 발생시키는 것으로 추정될 수 있고, 예를 들어 95% 초과의 동일성을 가지는 핵산 분자가 추구되는 경우, 최종 세척 온도는 약 5℃만큼 감소할 것이다. 이러한 고려에 기초하여, 당해 분야의 당업자는 적절한 하이브리드화 조건을 용이하게 선택할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 엄격한 하이브리드화 조건이 선택된다. 예로서, 엄격한 하이브리드화를 달성하기 위해 하기 조건이 이용될 수 있다: -5℃의 Tm에서의 5×염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)/5×덴하르트(Denhardt) 용액/1.0% SDS에서의 하이브리드화(상기 방정식에 기초), 이어서 60℃에서의 0.2×SSC/0.1% SDS의 세척. 적당히 엄격한 하이브리드화 조건은 42℃에서의 3×SSC 중의 세척 단계를 포함한다. 그러나, 동등한 엄격도가 대안적인 완충제, 염 및 온도를 이용하여 달성될 수 있는 것으로 이해된다. 하이브리드화 조건과 관련한 부가적인 가이던스는 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012](33)에서 발견될 수 있다.
용어 "키메라"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 핵산 서열의 맥락에서 천연으로 연결되지 않은 적어도 2개의 연결된 핵산 서열을 의미한다. 키메라 핵산 서열은 상이한 천연 기원의 연결된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, TbpB 폴리펩타이드 또는 HIBP 표면 수용체 단백질의 핵산 서열에 연결된 박테리아 프로모터를 구성하는 핵산 서열은 키메라로 생각되고, 소정의 부분이 제거되고 TbpA 폴리펩타이드의 부분에 의해 대체된 TbpB 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 키메라로 생각된다. 키메라 핵산 서열은 또한 동일한 천연 기원의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 단 이것은 천연으로 연결되지 않는다. 예를 들어, 특정한 세포형으로부터 얻어진 프로모터를 구성하는 핵산 서열은 그 동일한 세포형으로부터 얻어진 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 연결될 수 있지만, 보통 프로모터를 구성하는 핵산 서열에 연결되지 않을 수 있다. 키메라 핵산 서열은 임의의 비천연 발생 핵산 서열에 연결된 임의의 천연 발생 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 또한 포함한다.
용어 "숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다"란, 네이티브 숙주 철 결합 단백질(즉, 숙주 유기체에 존재하는 숙주 철 결합 단백질)과 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질 사이의 결합 상호작용의 결합 상수(Kd) 또는 해리 상수의 값이 네이티브 숙주 철 결합 단백질과 이의 상보성 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질 사이의 결합 상호작용의 결합 상수의 값보다 적어도 10배 높은 방식으로, HIBP 표면 수용체 단백질에 결합하는 숙주 철 결합 단백질의 능력이 감소한다는 것을 의미한다. 즉, 변형된 단백질은 네이티브 수용체 단백질보다 결합 네이티브 숙주 철 결합 단백질에 대해 10배 더 낮은 친화도를 가진다. 바람직한 실시형태에서, 변형된 단백질에 의한 네이티브 숙주 철 결합 단백질을 결합시키기 위한 상대 친화도는 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질보다 30배 더 낮고, 가장 바람직한 실시형태에서, 변형된 단백질에 의한 네이티브 숙주 철 결합 단백질을 결합시키기 위한 상대 친화도는 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질보다 100배 더 낮다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질과 네이티브 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 상수는 적어도 300nM이다. 바람직하게는, 결합 상수는 적어도 500nM이고, 가장 바람직하게는 적어도 1μM이다.
용어 "실질적으로 없는"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 조성물이 상당한 양의 화합물을 함유하지 않고, 이것이 조성물에 실질적으로 없다고 말해지는 것을 의미하는 정도의 용어이다. 조성물에 화합물이 실질적으로 없을 때, 예를 들어 N 로브 도메인이 실질적으로 없을 때, 이러한 조성물은 바람직하게는 5.0% 미만의 이러한 화합물, 더 바람직하게는 1.0% 미만의 이러한 화합물, 가장 바람직하게는 0.1% 미만의 이러한 화합물을 포함한다.
면역원성 조성물
상기 언급된 바대로, 본 발명은, 적어도 하나의 실시형태에서, 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, HIBP 표면 수용체 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다. 용어 "변형된"은 HIBP 표면 수용체 단백질과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되거나, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 또 다른 것에 의해 대체된 비네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질, 또는 2개 이상의 별개의 폴리펩타이드에서 단편화된 HIBP 표면 수용체 단백질을 의미하도록 의도된다. 따라서, 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질은, 제한 없이, 절두된 HIBP 표면 수용체 단백질(예를 들어, HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인); 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된 HIBP 표면 수용체 단백질(예를 들어, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인 내의 루프 도메인으로부터 하나 이상의 아미노산이 제거된 HIBP 표면 수용체 단백질); 부가적인 아미노산이 삽입된 HIBP 표면 수용체 단백질(예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인 내의 루프 도메인에 부가된 HIBP 표면 수용체 단백질); 다합체 또는 연장된 HIBP 폴리펩타이드(예를 들어, 이합체 및 삼합체 및 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인 이합체 및 삼합체); 하나 이상의 아미노산을 변경하기 위해 부위 지정 돌연변이유발에 의해 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질; 및 2개 이상의 HIBP 표면 수용체 단백질 폴리펩타이드의 혼합물(예를 들어, HIBP 표면 수용체 단백질의 별개의 N 로브 도메인 및 C 로브 도메인을 포함하는 혼합물)을 포함한다. 본 발명의 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질은 네이티브 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다.
상기 언급된 바대로, 본 발명은, 일 양상에서, 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 이루어진 면역원성 조성물을 제공하고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 추가의 양상에서, 본 발명은 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하고, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형되고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다.
본 발명에 따라, 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진, 임의의 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 사용할 수 있다.
네이티브 C 로브 도메인이 사용되는 본 발명의 실시형태에서, 네이티브 C 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 HIBP 표면 수용체 단백질의 네이티브 N 로브 도메인에 결합된 펩타이드를 포함하지 않고 이를 통해 화학적으로 연결되지 않고, 따라서 단리된 네이티브 C 로브 도메인, 즉 네이티브 N 로브 도메인으로부터 선택된 네이티브 C 로브 도메인이다. 따라서, 소정의 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 N 로브 도메인이 없거나 실질적으로 없는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인, 또는 이의 일부를 포함하는 제제가 제공된다. 네이티브 N 로브 도메인이 사용되는 본 발명의 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 네이티브 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 HIBP 표면 수용체 단백질의 네이티브 C 로브 도메인에 결합된 펩타이드를 포함하지 않고 이를 통해 화학으로 연결되지 않고, 따라서 단리된 네이티브 N 로브 도메인, 즉 네이티브 C 로브 도메인으로부터 분리된 N 로브 도메인이다. 따라서, 소정의 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인이 없거나 실질적으로 없는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 N 로브 도메인, 또는 이의 일부를 포함하는 제제가 제공된다. 소정의 실시형태에서, 그러나, 네이티브 C 로브 도메인, 또는 이의 일부, 및 네이티브 N 로브 도메인, 또는 이의 일부의 혼합물을 사용할 수 있고, 단 그러나 N 로브 도메인 및 C 로브 도메인은 화학적으로 연결되지 않고, 즉 이들은 펩타이드 결합에 의해 화학적으로 연결되지 않는다. 따라서, 본 발명은 N 로브 도메인의 폴리펩타이드 및 C 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 포함하는 면역원성 조성물을 포함하고, N 로브 도메인 및 C 로브 도메인은 물리적으로 연결되지 않는다.
임의의 병원성 박테리아 종 또는 균주(이들로 제한되지는 않음)를 포함하고, 파스퇴렐라세아에, 목사렐라세아에 또는 나이세리아세아에의 박테리아 과에 속하는 임의의 박테리아 종, 및 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 박테리아 속에 속하는 박테리아 종(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 본 발명 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질의 폴리펩타이드, 또는 임의의 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 TbpB 폴리펩타이드를 공급원에 사용할 수 있다. 폴리펩타이드는 임의의 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 임의의 폴리펩타이드, 또는 하기 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 임의의 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 임의의 폴리펩타이드를 추가로 포함한다: 악티노바실루스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae)(12, 34), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(35, 36), 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis)(37), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus)(당해 분야에 히스토필루스 솜누스(Histophilus somnus)로 또한 공지됨)(38), 만헤이미아 헤몰리티카(Mannheimia haemolytica)(당해 분야에 파스퇴렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica)로 또한 공지됨)(39), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)(40), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(41, 42), 만헤이미아 글루코시다(Mannheimia glucosida)(당해 분야에 파스퇴렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica)로 또한 공지됨) 및 비베르스테이니아 트레할로시(Bibersteinia trehalosi)(당해 분야에 파스퇴렐라 트레할로시(Pasteurella trehalosi)로 또한 공지됨).
본 명세서에 따라 사용될 수 있는 예시적인 C 로브 도메인 및 N 로브 도메인 폴리펩타이드는 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 22; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 서열 번호 213 내지 서열 번호 218; 서열 번호 230; 서열 번호 232; 서열 번호 234 내지 서열 번호 278, 및 서열 번호 288 내지 서열 번호 292에 기재된 임의의 C 로브 도메인, 및 서열 번호 8; 서열 번호 10; 서열 번호 24; 서열 번호 26; 서열 번호 36; 서열 번호 38; 서열 번호 121; 서열 번호 127; 서열 번호 229; 서열 번호 231; 및 서열 번호 233에 기재된 임의의 N 로브 도메인을 추가로 포함하고, 제한 없이 서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28; 서열 번호 107 내지 서열 번호 115; 서열 번호 117; 서열 번호 123; 서열 번호 131 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 서열 번호 178; 서열 번호 196 내지 서열 번호 204; 서열 번호 206 내지 서열 번호 212; 및 서열 번호 219 내지 서열 번호 228에 기재된 폴리펩타이드를 포함하는 HIBP 폴리펩타이드 또는 TbpB 폴리펩타이드로부터 또는 서열 번호 1; 서열 번호 11; 서열 번호 27; 서열 번호 116; 서열 번호 122; 및 서열 번호 173에 의해 코딩된 핵산 서열을 사용함으로써 제조될 수 있는 임의의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 추가로 포함한다. 이 핵산 서열 및 폴리펩타이드 서열을 사용하여, 부가적인 새로운 HIBP 표면 수용체 단백질 및 TbpB 서열, 및 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 발현 라이브러리, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리는 스크리닝될 수 있고, 서열 정보를 포함하는 데이터베이스는 유사한 서열에 대해 조사될 수 있다.
본 발명의 면역원성 제제는, 척추동물 대상체에 대한 이의 투여 시, 척추동물 대상체에 의한 항체 생성의 자극의 형태로 이러한 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시킨다. 본 명세서에 따라, 이러한 항체는 적어도 하나의 그람 음성 박테리아 균주에 대해 반응성이다. 바람직하게는, 그러나, 항체는 복수의 박테리아 균주 또는 종에 대해 교차반응성 및/또는 교차보호성이고, 바람직하게는 이러한 교차반응성 및/또는 교차보호성은 하나 이상의 숙주 철 결합 단백질, 예컨대 트랜스페린 또는 락토페린을 발현하는 숙주에서 획득된다. 용어 "교차반응성"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 상이한 박테리아 균주 또는 상이한 종과 부가적으로 반응할 수 있는 항체의 생성을 자극하기 위해 하나의 박테리아 균주로부터 얻은 면역원성 조성물에 의해 유도된 면역 반응의 능력을 의미한다. 용어 "교차보호성"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 적어도 하나의 부가적인 박테리아 균주 또는 박테리아 종에 의한 감염 또는 질환을 예방하거나 경감시키기 위해 하나의 박테리아 균주로부터 얻은 면역원성 조성물에 의해 유도된 면역 반응의 능력을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 복수의 박테리아 균주 또는 박테리아 종, 예를 들어 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 또는 10종의 박테리아 종 또는 박테리아 균주에 대해 교차반응성 및/또는 교차보호성이다. 교차반응성은 교차보호성의 표시자인 것으로 생각된다. 본 발명의 상기 양상이 다수의 감염성 박테리아 균주 또는 박테리아 종에 대해 보호를 제공하는, 하나의 면역원성 화합물, 즉 하나의 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 얻을 수 있는 면역원성 화합물의 생성을 허용함으로써 백신 제조를 용이하게 한다는 것이 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 이해될 것이다.
본 발명의 면역원성 제제는, 네이티브 HIBP 단백질을 사용하는 면역화 제제를 사용할 때, 면역 반응의 유효성을 초과하는, 척추동물 대상체에서의, 특히 숙주 철 결합 단백질, 예컨대 트랜스페린 락토페린을 발현하는 척추동물 대상체에서의 예상치 못하게 효과적인 면역 반응을 생성한다. 효과적인 면역 반응의 일 양상은 면역 반응의 규모이다. 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용하여 얻은 항체 역가는 적어도 2배의 인자로, 더 바람직하게는 적어도 5배의 인자로, 가장 바람직하게는 적어도 10배의 인자로 네이티브 HIBP 단백질의 항체 역가를 초과한다.
바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 폴리펩타이드(각각의 폴리펩타이드는 C 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어짐)를 포함하는 혼합물을 사용하거나; 적어도 2개의 폴리펩타이드(각각의 폴리펩타이드는 N 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어짐)를 포함하는 혼합물을 사용하거나; 적어도 2개의 C 로브 도메인 및 적어도 하나의 N 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진 적어도 3개의 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 사용하거나; 적어도 2개의 N 로브 도메인 및 적어도 하나의 C 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진 적어도 3개의 폴리펩타이드를 포함하는 혼합물을 사용한다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 폴리펩타이드는 동일한 척추동물 종을 감염시킬 수 있는 그람 음성 박테리아 속 또는 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 따라서, 적어도 2개의 폴리펩타이드는 예를 들어 TbpB 폴리펩타이드의 2개의 C 로브 도메인(여기서, C 로브 도메인 둘 다는 돼지를 감염시킬 수 있는 악티노바실루스 균주로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어짐), 또는 예를 들어 TbpB 폴리펩타이드의 2개의 C 로브 도메인(여기서, C 로브 도메인 둘 다는 소를 감염시킬 수 있는 헤모필루스 균주로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어짐)으로부터 선택될 것이다. 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하는 실시형태에서, 혼합물은 바람직하게는 N 로브 도메인 또는 이의 일부가 없거나 실질적으로 없다. 적어도 2개의 N 로브 도메인을 사용하는 실시형태에서, 혼합물은 바람직하게는 C 로브 도메인 또는 이의 일부가 없거나 실질적으로 없다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라, 적어도 2개의 폴리펩타이드의 혼합물을 사용하고, 각각의 폴리펩타이드는 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 이러한 실시형태에서, 혼합물은 바람직하게는 N 로브 도메인 또는 이의 일부가 없다. 특히 바람직한 실시형태에서, 서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28; 서열 번호 107 내지 서열 번호 115; 서열 번호 117; 서열 번호 123; 서열 번호 131 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 서열 번호 178; 서열 번호 196 내지 서열 번호 204; 서열 번호 206 내지 서열 번호 212; 및 서열 번호 219 내지 서열 번호 228에 기재된 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 임의의 2개의 C 로브 도메인을 사용하거나; 서열 번호 1; 서열 번호 11; 서열 번호 27; 서열 번호 116; 서열 번호 122; 및 서열 번호 173에 기재된 핵산 서열로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 임의의 2개의 C 로브 도메인을 사용한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 22; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 및 서열 번호 213 내지 서열 번호 218; 서열 번호 230: 서열 번호 232; 서열 번호 234 내지 서열 번호 278; 및 서열 번호 288 내지 서열 번호 292에 기재된 C 로브 도메인으로부터 선택된 임의의 2개의 C 로브 도메인을 사용한다.
추가의 특히 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 적어도 하나의 C 로브 도메인은 악티노바실루스, 헤모필루스, 히스토필루스, 만헤이미아, 모락셀라, 나이세리아, 파스퇴렐라 및 비베르스테이니아의 박테리아 속에 속하는 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 적어도 하나의 C 로브 도메인은 악티노바실루스 플루로뉴모니아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질, 바람직하게는 서열 번호 6 또는 서열 번호 22에 기재된 C 로브 도메인으로부터 얻어질 수 있거나 얻어지거나, 적어도 하나의 C 로브 도메인은 악티노바실루스 수이스로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질, 바람직하게는 서열 번호 34에 기재된 C 로브 도메인으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 적어도 하나의 C 로브 도메인은 만헤이미아 헤몰리티카로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질, 바람직하게는 서열 번호 232 또는 서열 번호 234에 기재된 C 로브 도메인으로부터 얻어질 수 있거나 얻어지거나, 적어도 하나의 C 로브 도메인은 만헤이미아 글루코시다로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 적어도 하나의 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질, 바람직하게는 서열 번호 213 내지 서열 번호 218에 기재된 C 로브 도메인 중 하나로부터 얻어질 수 있거나 얻어지거나, 적어도 하나의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질, 바람직하게는 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 128; 서열 번호 129; 서열 번호 130; 서열 번호 131; 서열 번호 152; 서열 번호 154; 서열 번호 156; 서열 번호 158; 서열 번호 160; 서열 번호 164; 서열 번호 166; 서열 번호 168; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 및 서열 번호 235 내지 서열 번호 278에 기재된 C 로브 도메인 중 하나로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 적어도 하나의 C 로브 도메인은 비베르스테이니아 트레할로시로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질, 바람직하게는 서열 번호 292에 기재된 C 로브 도메인으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 바람직하게는 서열 번호 6 또는 서열 번호 22에 기재된 C 로브 도메인, 악티노바실루스 수이스, 바람직하게는 서열 번호 34에 기재된 C 로브 도메인 및 헤모필루스 파라수이스, 바람직하게는 서열 번호 294에 기재된 C 로브 도메인으로부터 선택된 2개의 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, HIPB 표면 수용체 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 중 하나는 나이세리아 고노레아, 바람직하게는 서열 번호 213 내지 서열 번호 218에 기재된 C 로브 도메인 중 하나로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스, 바람직하게는 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 128; 서열 번호 129; 서열 번호 130; 서열 번호 131; 서열 번호 152; 서열 번호 154; 서열 번호 156; 서열 번호 158; 서열 번호 160; 서열 번호 164; 서열 번호 166; 서열 번호 168; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 및 서열 번호 235 내지 서열 번호 278에 기재된 C 로브 도메인 중 하나로부터 얻어질 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, HIPB 표면 수용체 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 중 하나는 만헤이미아 헤몰리티카, 바람직하게는 서열 번호 232; 또는 서열 번호 234에 기재된 C 로브 도메인으로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 비베르스테이니아 트레할로시, 바람직하게는 서열 번호 292에 기재된 C 로브 도메인으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 2개의 박테리아 종으로부터 또는 이것 중 하나로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 이로부터 얻어진 TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 도메인은 항원상 다양하다. TbpB 또는 C 로브 도메인은 바람직하게는 TbpB 변이체를 교환할 수 있는 박테리아 종 또는 박테리아 균주로부터 얻어진다. 용어 "항원상 다양한"은 2개의 TbpB 폴리펩타이드 또는 TbpB 폴리펩타이드의 C 로브 도메인과 관련하여 본 명세서에 사용된 바대로 2개의 TbpB 폴리펩타이드 또는 TbpB 폴리펩타이드의 C 로브 도메인이 대표적인 수의 TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드를 사용하여 계통발생 나무(phylogenetic tree)를 구성하도록 사용할 때 계통발생 나무의 다양한 가지 또는 군에 속한다는 것을 의미한다. 본 명세서에 따라, 임의의 양의 TbpB 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드를 가지는 계통발생 나무가 구성될 수 있고, 그러나 바람직하게는 계통발생 나무는 적어도 25개의 TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드, 더 바람직하게는 적어도 30개, 적어도 40개 또는 적어도 50개의 TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드를 사용하여 구성되고, 바람직하게는 계통발생 나무는 뿌리 수준 위의 적어도 2개의 마디 차수를 포함하도록 구성되고, 더 바람직하게는 계통발생 나무는 뿌리 수준 위의 적어도 3, 4 또는 5 마디 차수, 가장 바람직하게는 뿌리 수준 위의 적어도 6, 7, 8, 9 또는 10 마디 차수(하기 및 도 30에 추가로 설명된 바와 같음)를 포함한다. 항원상 다양한 TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드는 바람직하게는 (ⅰ) 계통발생 나무의 최고 차수 마디의 적어도 2 마디 차수 아래의 마디에서 다양하고(예를 들어, 계통발생 나무의 최고 차수 마디가 9차 마디인 경우, 항원상 다양한 폴리펩타이드는 7차 마디, 또는 더 낮은 차수 마디, 즉 6차, 5차, 4차, 3차, 2차 또는 1차 마디에서 다양한 폴리펩타이드임); 및/또는 (ⅱ) 계통발생 나무의 1차, 2차 또는 3차 차수에서 다양한, 구별되는 가지에 속한다. TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드를 사용하여 계통발생 나무를 구성하는 것을 수월하게 하도록, (ⅰ) 서열 정렬을 수행하는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 T-커피 서버 사이트(http://www.www.tcoffee.org/)에서 실행된 M-커피 정렬 알고리즘을 이용한 프로그램(43); (ⅱ) 정렬을 편집하는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Geneious Pro(44); (ⅲ) 정렬을 자동으로 깨끗하게 하는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GBlocks(45); (ⅳ) 정렬과 호환 가능한 진화 모델을 선택하는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 ProtTest v3.2(Darriba et al, 2011) 및 (ⅳ) 계통발생 나무를 발생시키는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 최대 확률 방법을 이용한 프로그램, 가역적 일반 시간(general time reversible: GTR) 모델(47)(48, 49)에서 실행된 PhyML(46), 또는 다른 모델, 예컨대 JTT+I+G+F 모델, 또는 WAG+G=F 모델, 또는 PHYLIP 및 PAUP(워싱턴 대학교)와 같은 프로그램을 포함하는, 몇몇 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 이들 프로그램의 각각은 나무 가지가 통계학적으로 유의적인 것으로 생각되도록 바람직하게 구성된다. 그러나, 더 원위에 위치한 가지가 덜 통계학적으로 유의적일 수 있고, 따라서 최저 차수 마디로부터 기초한 군에 속하는 균주의 선택이 바람직하다는 것에 유의한다.
도 30을 이제 참조하면, 예시 목적을 위해 뿌리(120), 중간 가지(130, 131, 140, 141, 142 및 143으로 예시됨), 및 전체 38개의 원위 가지(원위 가지 150, 151, 152, 153, 154 및 155로 예시됨)를 가지는 계통발생 나무(100)가 도시되어 있고, 각각의 원위 가지는 38개 중 1개의 박테리아 균주(균주 1 - 38(110))로부터 얻어진 관련 폴리펩타이드를 나타낸다. 도시된 각각의 가지는 마디(마디 161, 171, 172, 181, 182, 183 및 184로 예시됨)로부터 생긴다. 따라서, 예를 들어 가지(130)는 마디(161)로부터 생기고, 가지(143)는 마디(172)로부터 생긴다. 나무 뿌리(120)에 가장 근위인 마디(161)는 더 구체적으로 제1 차수 마디(161)라 칭해지고; 마디(171 및 172)는 더 구체적으로 2차 마디(171 및 172)라 칭해지고; 마디(181, 182, 183 및 184)는 더 구체적으로 3차 마디(181, 182, 183 및 184)라 칭해지고, 추가의 마디는, 필요 부분만 수정하여, 4차, 5차, 6차, 7차 등의 마디라 칭해질 수 있다. 추가의 4개의 군(1군(105), 박테리아 균주(110) 1-17의 폴리펩타이드; 2군(106), 박테리아 균주(110) 18-24의 폴리펩타이드; 3군(107), 박테리아 균주(110) 25-30의 폴리펩타이드; 및 4군(108), 박테리아 균주(110) 26-38의 폴리펩타이드)이 도 30에 도시되어 있다. 1군(105) 또는 2군(106) 중 어느 하나에 속하는 박테리아 균주의 폴리펩타이드는 둘 다 계통발생 나무(100)의 제1 차수 마디(161)에서 분기하는 가지(131)에 속한다. 유사하게, 3군(105) 또는 4군(106) 중 어느 하나에 속하는 박테리아 균주의 폴리펩타이드는 둘 다 계통발생 나무(100)의 제1 차수 마디(161)에서 분기하는 가지(131)에 속한다. 따라서, 1군(105) 또는 2군(106)에 속하는 모든 박테리아 균주의 폴리펩타이드는 3군(107) 또는 4군(108)에 속하는 모든 박테리아 균주의 폴리펩타이드로부터 항원상 다양하다. 1군(105) 또는 2군(106)에 속하는 박테리아 균주의 폴리펩타이드는 계통발생 나무(100)의 2차 마디(172)에서 분기하는 군에 속한다. 1군(105)에 속하는 박테리아 균주의 폴리펩타이드는 본 명세서에 따라 또한 2군(106)에 속하는 박테리아 균주로부터 항원상 다양하다. 계통발생 나무가 상이한 포맷, 예를 들어 도 30에서와 같은 직사각형 포맷 또는 예를 들어 도 10에서와 같은 원형 포맷으로 표시될 수 있다는 것에 주목한다. TbpB 폴리펩타이드 또는 C 로브 또는 TbpB 폴리펩타이드를 사용하여 구성된 예시적인 계통발생 나무는 도 4(악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 헤모필루스 파라수이스의 균주를 포함), 도 10(나이세리아 메닌기티디스의 균주를 포함), 도 26(나이세리아 메닌기티디스 및 나이세리아 고노레아의 균주를 포함), 도 27(헤모필루스 인플루엔자의 균주를 포함), 도 28(만헤이미아 헤몰리티카 및 비베르스테이니아 트레할로시의 균주를 포함) 및 도 29(모락셀라 카타르할리스의 균주를 포함)에 제공된다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 4에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 4에 도시된 계통발생 1군, 계통발생 2군 또는 계통발생 3군에 속하는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 또는 헤모필루스 파라수이스 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은, 제1 C 로브 도메인이 선택되는 계통발생 군 이외에, 도 4에 도시된 계통발생 군에 속하는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 또는 헤모필루스 파라수이스 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 선택된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 3개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 도 4에 도시된 계통발생 1군에 속하는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 또는 헤모필루스 파라수이스 박테리아 균주에 속하는 제1 C 로브 도메인을 사용하고, 도 4에 도시된 계통발생 2군에 속하는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 또는 헤모필루스 파라수이스 박테리아 균주에 속하는 제2 C 로브 도메인을 사용하고, 도 4에 도시된 계통발생 3군에 속하는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 또는 헤모필루스 파라수이스 박테리아 균주에 속하는 제3 C 로브 도메인을 사용한다. 따라서, 구체적인 예로, 악티노바실루스 수이스 H57로부터의 C 로브 도메인(계통발생 1군; 도 4 검정색 화살표))은 악티노바실루스 플뢰로뉴모나이에 H87로부터의 C 로브 도메인(계통발생 2군; 도 4 검정색 화살표) 및 악티노바실루스 플뢰로뉴모나이에 H49로부터의 C 로브 도메인(계통발생 3군; 도 4 검정색 화살표)과 조합될 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 10a에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 10a에 도시된 계통발생 1군, 계통발생 2군, 계통발생 3군 또는 계통발생 4군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은, 제1 C 로브 도메인이 선택되는 계통발생 군 이외에, 도 10a에 도시된 계통발생 군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주 중 임의의 하나로부터 얻어진다. 따라서, 오직 예로서, 나이세리아 메닌기티디스 균주 B16B6(계통발생 1군; 도 10a, 검정색 화살표)으로부터 얻어진 TbpB C 로브 도메인은 균주 M982(계통발생 4군; 도 10a, 검정색 화살표)로부터의 TbpB C 로브 도메인과 조합될 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 3개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 C 로브 도메인은 도 10a에 도시된 3개의 상이한 군에 속하는 균주(예를 들어, 각각의 계통발생 1군, 계통발생 2군 및 계통발생 3군으로부터 선택된 C 로브 도메인)로부터 선택된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 4개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 도 10a에 도시된 1군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 박테리아 균주에 속하는 제1 C 로브 도메인을 사용하고, 도 10a에 도시된 2군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 박테리아 균주에 속하는 제2 C 로브 도메인을 사용하고, 도 10a에 도시된 계통발생 3군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 박테리아 균주에 속하는 제3 C 로브 도메인을 사용하고, 도 10a에 도시된 계통발생 4군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 박테리아 균주에 속하는 제4 C 로브 도메인을 사용한다. 따라서, 오직 구체적인 예로서, B16B6(계통발생 1군; 도 10a, 검정색 화살표), BZ169(계통발생 2군; 도 10a, 검정색 화살표), S3131(계통발생 3군; 도 10a, 검정색 화살표) 및 M982(계통발생 4군; 도 10a, 검정색 화살표)의 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터의 TbpB C 로브 도메인이 선택될 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 중 하나는 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 26b에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 3군에 속하는 나이세리아 고노레아 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 1군 또는 2군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어진다. 더 바람직하게는, 적어도 3개의 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 바람직하게는, C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 3군에 속하는 나이세리아 고노레아 박테리아 균주로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 2군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제3 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 1군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어진다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 4개의 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 3개의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 바람직하게는, C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 3군에 속하는 나이세리아 고노레아 박테리아 균주로부터 선택되고, 제2 및 제3 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 2군의 2개의 상이한 하위군(예를 들어, 계통발생 2.1 하위군 및 계통발생 2.2 하위군)에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 선택된 임의의 C 로브 도메인으로부터 얻어지고, 제4 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 1군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어진다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 4개의 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 2개의 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 바람직하게는, 제3 및 제4 C 로브 도메인인, 도 26b에 도시된 계통발생 3군의 2개의 상이한 계통발생 하위군(예를 들어, 3.1 하위군 및 3.2 하위군)에 속하는 나이세리아 고노레아 박테리아 균주로부터 선택된 2개의 C 로브 도메인은 각각 계통발생 1군 및 계통발생 2군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 얻어진다. 추가의 실시형태에서, 적어도 5개의 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 3개의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 2개의 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 바람직하게는, 제3 및 제4 C 로브 도메인인, 도 26b에 도시된 계통발생 3군의 2개의 상이한 계통발생 하위군(예를 들어, 3.1 하위군 및 3.2 하위군)에 속하는 나이세리아 고노레아 박테리아 균주로부터 선택된 2개의 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 2군의 2개의 상이한 계통발생 하위군(예를 들어, 2.1 하위군 및 2.2 하위군)에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 얻어지고, 제5 C 로브 도메인은 도 26b에 도시된 계통발생 1군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주에 속한다. 훨씬 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 6개의 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 C 로브 도메인을 사용한다. 이 실시형태에서, 적어도 하나의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어지거나 얻어질 수 있고, 적어도 하나의 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어지거나 얻어질 수 있고, 다른 C 로브 도메인은 도 26b에 따라 항원상 다양한 균주로부터 얻어지거나 얻어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 3개의 C 로브 도메인은 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 3개의 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 26b를 참조하면, 바람직하게는 나이세리아 고노레아 균주로부터 얻어진 3개의 C 로브 도메인은 3개의 항원상 다앙한 군에 속하고, 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어진 3개의 C 로브 도메인은 3개의 항원상 다양한 균주에 속한다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 중 하나는 나이세리아 메닌기티디스로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 나이세리아 고노레아로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 26a에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 26a에 도시된 계통발생 3군 또는 계통발생 1군에 속하는 나이세리아 고노레아 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은 도 26a에 도시된 계통발생 2군, 4군 또는 5군에 속하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 헤모필루스 인플루엔자로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 27a 및 도 27b에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 27a 및 도 27b에 도시된 계통발생 1군, 계통발생 2군 또는 계통발생 3군에 속하는 헤모필루스 인플루엔자 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은, 제1 C 로브 도메인이 선택되는 계통발생 군 이외에, 도 27a 및 도 27b에 도시된 계통발생 군에 속하는 헤모필루스 인플루엔자 균주 중 임의의 하나로부터 얻어진다. 따라서, 오직 예로서, 헤모필루스 인플루엔자 균주 H216(계통발생 3군; 도 27b, 검정색 화살표)로부터 얻어진 TbpB C 로브 도메인은 균주 H214(계통발생 1군; 도 27b, 검정색 화살표)로부터 얻어진 TbpB C 로브 도메인과 조합될 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 3개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 C 로브 도메인은 도 27a 및 도 27b에 도시된 3개의 상이한 군에 속하는 균주(즉, 각각의 계통발생 1군, 계통발생 2군 및 계통발생 3군으로부터 선택된 C 로브 도메인)로부터 선택된다. 따라서, 오직 구체적인 예로서, H216(계통발생 3군; 도 27b, 검정색 화살표), H214(계통발생 1군; 도 27b, 검정색 화살표) 및 H011(계통발생 2군; 도 27b, 검정색 화살표)의 헤모필루스 인플루엔자 균주로부터의 TbpB C 로브 도메인이 선택될 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 만헤이미아 헤몰리티카로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 28에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 28에 도시된 계통발생 1군에 속하는 만헤이미아 헤몰리티카 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은 계통발생 3군에 속하는 만헤이미아 헤몰리티카 균주 중 임의의 하나로부터 얻어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 중 하나는 비베르스테이니아 트레할로시로부터 얻어질 수 있거나 얻어지고, 다른 C 로브 도메인은 만헤이미아 헤몰리티카로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 28을 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 28에 도시된 계통발생 2군에 속하는 비베르스테이니아 트레할로시 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은 도 28에 도시된 계통발생 1군, 또는 3군에 속하는 만헤이미아 헤몰리티카 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 2개의 C 로브 도메인 둘 다는 모락셀라 카타르할리스로부터 얻어질 수 있거나 얻어진다. 도 29에 도시된 계통발생 나무를 참조하면, 바람직한 실시형태에서, 적어도 2개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 제1 C 로브 도메인은 도 29에 도시된 계통발생 1군, 계통발생 2군 또는 계통발생 3군에 속하는 모락셀라 카타르할리스 박테리아 균주로부터 선택된 C 로브 도메인 중 임의의 하나로부터 얻어지고, 제2 C 로브 도메인은, 제1 C 로브 도메인이 선택되는 계통발생 군 이외에, 도 29에 도시된 계통발생 군에 속하는 모락셀라 카타르할리스 균주 중 임의의 하나로부터 얻어진다. 따라서, 오직 예로서, 모락셀라 카타르할리스 균주 AAC34279.1(계통발생 3군; 도 29, 검정색 화살표)로부터 얻어진 TbpB C 로브 도메인은 균주 AAD12263.1(계통발생 1군; 도 29, 검정색 화살표)로부터 얻어진 TbpB C 로브 도메인과 조합될 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 3개의 C 로브 도메인을 사용하고, 여기서 C 로브 도메인은 도 29에 도시된 3개의 상이한 군에 속하는 균주(즉, 각각의 계통발생 1군, 계통발생 2군 및 계통발생 3군으로부터 선택된 C 로브 도메인)로부터 선택된다. 따라서, 오직 구체적인 예로서, AAC34279.1(계통발생 3군; 도 29, 검정색 화살표), AAD12263.1(계통발생 1군; 도 29, 검정색 화살표) 및 003664398.1(계통발생 2군; 도 29, 검정색 화살표)의 모락셀라 카타르할리스 균주로부터의 TbpB C 로브 도메인이 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드의 상기 언급된 혼합물은 제한 없이 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 22; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 및 서열 번호 213 내지 서열 번호 218; 서열 번호 230; 서열 번호 232; 및 서열 번호 234 내지 서열 번호 278에 도시된 C 로브 도메인을 포함하는 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 C 로브 도메인이다.
C 로브 도메인의 상기 혼합물은 개별 C 로브 도메인을 포함하는 제제를 혼합함으로써 또는 2개 이상의 C 로브 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 재조합으로 생성함으로써 제조될 수 있다.
상기 언급된 바대로, 본 발명의 면역원성 제제는 바람직하게는 교차반응성 및/또는 교차보호성이다. 상기 언급된 바대로, 단일 C 로브 도메인을 포함하는 제형이 교차반응성 및/또는 교차보호성일 수 있지만, C 로브 도메인의 혼합물은 더 넓은 범위의 박테리아 균주 및/또는 종에 대해 교차반응성 및/또는 교차보호성을 실질적으로 확대시키는 면역원성 제형을 제조하고, 백신 제형의 제제가 복수의 박테리아 종 또는 박테리아 균주에 의해 전달된 감염 또는 질환으로부터 보호를 제공하게 하도록 사용될 수 있다는 점에서 특히 바람직하다.
다른 실시형태에 따라, HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인 및/또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 내의 2개의 β 가닥을 연결하는 루프 도메인이 변형되고, 폴리펩타이드가 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 제조된다. 용어 "변형된"은, 루프 도메인과 관련하여 본 명세서에 사용된 바대로, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되거나 대체된 루프를 의미한다. 따라서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 내의 생성된 루프는 절두될 수 있거나, 다른 실시형태에서 아미노산 잔기는 하나 이상의 교대하는 아미노 잔기에 의해 대체될 수 있다. 도 1 및 도 2는 예시적인 HIBP 표면 수용체 단백질의 루프 도메인을 보여준다. 도 8 및 도 14는 각각 N 로브 도메인 및 C 로브 도메인에서의 루프 감소의 예를 제공한다. 본 명세서에 따라, HIBP 결합 막 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 내의 2개의 β 가닥을 연결하는 루프 도메인 중 적어도 하나는 루프 도메인으로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기를 제거하도록 변형되고, 생성된 폴리펩타이드는 변형된 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인을 포함하고, 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 다른 실시형태에서, 더 많은 아미노산 잔기가 제거되고, 예를 들어 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개의 아미노산 잔기가 루프 도메인으로부터 제거된다. 다른 실시형태에서, 루프 도메인은 그 전체가 제거된다. 임의의 루프 도메인은 본 발명에 따라 변형되도록 선택될 수 있고, 단 이러한 변형은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 폴리펩타이드를 생성시킨다. 따라서, 도 1의 예시적인 돼지 TbpB 폴리펩타이드를 참조하면, 하나의 루프 도메인이 변형된 본 발명의 실시형태에서, 이러한 루프 도메인은 표 1에 추가로 기재된 바대로 임의의 하나의 루프 도메인 L1-L32(각각 서열 번호 42; 서열 번호 44; 서열 번호 46; 서열 번호 48; 서열 번호 50; 서열 번호 52; 서열 번호 54; 서열 번호 56; 서열 번호 58; 서열 번호 60; 서열 번호 62; 서열 번호 64; 서열 번호 66; 서열 번호 68; 서열 번호 70; 서열 번호 72; 서열 번호 74; 서열 번호 76; 서열 번호 78; 서열 번호 80; 서열 번호 82; 서열 번호 84; 서열 번호 86; 서열 번호 88; 서열 번호 90; 서열 번호 92; 서열 번호 94; 서열 번호 96; 서열 번호 98; 서열 번호 100; 서열 번호 102; 서열 번호 104; 및 서열 번호 106의 악티노바실루스 플루로뉴모니아 루프 L1-L32 폴리펩타이드 서열에 의해 예시되고, 각각 서열 번호 41; 서열 번호 43; 서열 번호 45; 서열 번호 47; 서열 번호 49; 서열 번호 51; 서열 번호 53; 서열 번호 55; 서열 번호 57; 서열 번호 59; 서열 번호 61; 서열 번호 63; 서열 번호 65; 서열 번호 67; 서열 번호 69; 서열 번호 71; 서열 번호 73; 서열 번호 75; 서열 번호 77; 서열 번호 79; 서열 번호 81; 서열 번호 83; 서열 번호 85; 서열 번호 87; 서열 번호 89; 서열 번호 91; 서열 번호 93; 서열 번호 95; 서열 번호 97; 서열 번호 99; 서열 번호 101; 서열 번호 103; 및 서열 번호 105의 핵산 서열에 의해 코딩되는 것과 같음)이도록 선택될 수 있다. 2개의 루프 도메인이 변형된 본 발명의 실시형태에서, 이러한 2개의 루프 도메인은 (다시 도 1의 예시적인 TbpB 폴리펩타이드를 참조하면) 표 2에 추가로 기재된 바대로 루프 도메인 L1-L32 도메인으로부터 선택된 임의의 2개의 루프 도메인일 수 있다. 3개의 루프 도메인이 변형된 본 발명의 실시형태에서, 이러한 3개의 루프 도메인은 (다시 도 1의 예시적인 TbpB 폴리펩타이드를 참조하면) 표 3에 추가로 기재된 바대로 루프 도메인 L1-L32 도메인으로부터 선택된 임의의 3개의 루프 도메인일 수 있다. 4개의 루프 도메인이 변형된 본 발명의 실시형태에서, 이러한 4개의 루프 도메인은 (다시 도 1의 예시적인 TbpB 폴리펩타이드를 참조하면) 표 3에 기재된 루프의 조합으로부터 선택된 임의의 3개의 루프 도메인과 루프 도메인 L1-L32으로부터 선택된 하나의 부가적인 루프 도메인일 수 있다. 다른 실시형태에서, 전체 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개의 루프 도메인이 변형될 수 있다. 2개 또는 3개의 루프 도메인이 변형된 실시형태와 관련하여 기재된 루프 도메인의 선택과 유사한 방식으로, 본 발명의 각각의 이들 실시형태에서, 변형된 루프 도메인의 정확한 수가 변할 수 있고, L1-L32 루프로부터 선택된 임의의 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개 또는 32개의 루프 도메인이 되도록 선택될 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자에게 확실할 것이다. 특히 바람직한 실시형태에서, (각각 악티노바실루스 플루로뉴모니아 서열 번호 76; 서열 번호 82; 서열 번호 86; 및 서열 번호 96에 의해 예시된 것처럼) C 로브 도메인의 루프 L18, L21, L23 및 L27 중 하나 또는 모두가 변형된다. 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, (각각 악티노바실루스 플루로뉴모니아 서열 번호 42; 서열 번호 50; 서열 번호 56; 서열 번호 64에 의해 예시된 것처럼) N 로브 도메인의 루프 L1, L5, L8 및 L12 중 하나 또는 모두가 변형된다. 변형될 수 있는 루프 도메인은 C 로브 도메인 또는 N 말단 로브 도메인의 β 배럴 또는 핸들 도메인 β 시트 내에 조립된 2개의 β 가닥을 연결하는 루프 도메인, 또는 2개의 조립된 β 가닥을 연결하는 루프 도메인, 또는 상기의 조합이다. C 로브 도메인 또는 N 말단 로브 도메인 내의 루프 도메인을 절두시키기 위해, 폴리펩타이드는 루프 도메인이 그 전체가 제거되고, 임의로 하나 이상의 연결 아미노산에 의해 대체되어서, 2개의 β 가닥 사이의 다소의 직접 연결을 생성시키는 방식으로, 또는 루프 도메인의 부분 또는 부분들이 제거되는 방식으로 제조될 수 있다. 본 명세서에 따라, 바람직하게는 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 루프 도메인 중 적어도 하나로부터의 아미노산 잔기의 적어도 절반이 제거된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 루프 도메인의 전체 아미노산 잔기의 적어도 하나의 절반이 제거된다. 따라서, 루프 도메인이 예를 들어 40개의 아미노 잔기를 포함하는 이러한 실시형태에서, 루프 도메인의 적어도 20개의 아미노산 잔기가 제거될 것이다. 추가의 실시형태에서, 루프 도메인은 루프 도메인의 아미노산 잔기의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%가 제거되는 방식으로 변형된다. 다른 실시형태에서, 루프 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개까지의 아미노산이 절두 후 보유되고, 훨씬 다른 실시형태에서, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%까지의 루프 도메인이 절두 후 보유된다. 루프 도메인의 오직 일부가 제거되는 방식으로 루프 도메인이 변형된 실시형태에서, 제거된 아미노산 잔기는 루프 도메인의 N 말단 끝에, 루프 도메인의 C 말단 끝에 또는 N 말단과 C 말단 사이에 위치할 수 있다. C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 복수의 루프 도메인이 변형된 실시형태에서, 이러한 루프 감소는 각각의 루프로부터의 동일한 수의 아미노산 잔기의 제거를 포함할 수 있고, 예를 들어 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 내의 각각의 루프로부터의 10개의 아미노산 잔기가 제거될 수 있거나, 루프 감소는 각각의 루프로부터의 상이한 양의 아미노산 잔기, 예를 들어 하나의 루프에서의 10개의 잔기 및 또 다른 루프에서의 20개의 잔기의 제거를 포함할 수 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 및/또는 N 로브 도메인의 루프 도메인 내의 아미노산 잔기는 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발에 의해 다른 것에 의해 대체되고, 생성된 폴리펩타이드는 변형된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하고, 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없다. 도 22는 다양한 TbpB 폴리펩타이드의 N 로브 도메인 루프 구역에서의 잔기 대체의 예를 제공하고, 도 23은 이 잔기 대체로 인한 Tf 결합의 감소를 예시한다. 따라서, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기는 L1-L32 루프 중 임의의 하나에서 대체될 수 있다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 (각각 악티노바실루스 플루로뉴모니아 서열 번호 42; 서열 번호 46; 서열 번호 50; 및 서열 번호 56에 의해 예시된 것처럼) N 로브 도메인의 루프 도메인 L1, L3, L5 또는 L8에서 대체된다. 바람직한 실시형태에서, 루프 도메인 L8 내의 방향족 아미노산(페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판)이 지방족 아미노산(글라이신, 발린, 류신, 이소류신)에 의해 대체된다. 이것은 달리 일반적으로 양이온성인 표면 구역에서 표면 접근 가능 방향족 아미노산 잔기이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 헤모필루스 파라수이스 TbpB 폴리펩타이드가 선택되고, Y93A(서열 번호 170; 서열 번호 171); Y117A(서열 번호 172; 서열 번호 173); Y167A(서열 번호 174; 서열 번호 175;) 또는 W176A(서열 번호 176; 서열 번호 177)의 돌연변이 중 하나 이상이 TbpB 폴리펩타이드에서 이루어져서 변형된 TbpB 폴리펩타이드가 얻어지고, 추가의 바람직한 실시형태에서, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 TbpB 폴리펩타이드가 선택되고, F171A(서열 번호 3; 서열 번호 4); Y95A(서열 번호 13; 서열 번호 14); Y121A(서열 번호 15; 서열 번호 16); Y174A(서열 번호 17; 서열 번호 18); 또는 R179E(서열 번호 19; 서열 번호 20)의 돌연변이 중 하나 이상이 폴리펩타이드에서 이루어져서 변형된 TbpB 폴리펩타이드가 얻어지고, 추가의 바람직한 실시형태에서, 악티노바실루스 수이스 TbpB 폴리펩타이드가 선택되고, F63A(서열 번호 29; 서열 번호 30) 또는 F152A(서열 번호 31; 서열 번호 32)의 돌연변이 중 하나 이상이 폴리펩타이드에서 이루어져서 변형된 TbpB 폴리펩타이드가 얻어진다. 본 발명은 각각의 상기 언급된 변형된 폴리펩타이드 및 이 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 및 이 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신 조성물을 포함한다.
하나 이상의 루프 도메인의 크기의 감소, 또는 본 발명에 따른 HIBP 폴리펩타이드의 루프 도메인에서의 아미노산의 변형은 바람직하게는 생성된 폴리펩타이드가 입체구성에서 안정한 방식으로 이루어진다. 용어 "입체구성에서 안정한"이란, 폴리펩타이드의 입체구성 상태 또는 입체구성이 루프의 크기의 변형 또는 아미노산 잔기의 대체 후에 실질적으로 동일하게 있다는 것을 의미한다. 변형된 루프 도메인의 입체구성 상태는 다소 변경될 수 있다. 폴리펩타이드의 입체구성 상태 또는 입체구성의 결정부위는 이의 아미노산 서열에서 반영되는 것처럼 폴리펩타이드의 1차 구조, 폴리펩타이드의 2차 구조(예를 들어, α 나선, β 시트 등), 폴리펩타이드의 3차 구조(즉, 폴리펩타이드 사슬의 3차원 폴딩) 및 4차 구조(즉, 폴리펩타이드와 다른 단백질 아단위의 상호작용)를 포함한다. 단백질 입체구성은 환경 인자, 예컨대 pH, 오스몰농도, 이온 농도 및 염 농도에 의해 추가로 영향을 받을 수 있다. 다수의 비상동성 서열의 정렬 및 비교, 당해 분야에 공지된 다수의 비상동성 폴리펩타이드의 3차원 입체구성 구조의 비교, 및 보존적 아미노산 치환(예를 들어, gly, ala; val, ile; leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; 및 phe, trp, tyr와 같은 조합)의 사용에 의해 루프 감소의 설계를 알아낼 수 있다. 더구나, 단백질의 입체구성 상태는 기능적 검정(예를 들어, 숙주 철 결합 단백질의 결합), 또는 물리적 방법, 예컨대 X선 결정학 또는 핵 자기 공명(NMR)에 의해 평가될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형되도록 설계된다. 이러한 루프가 그 전체가 변형된 실시형태에서, 이것은 일반적으로 적어도 25개의 아미노산 잔기의 제거를 포함할 것이고, 150개 이상의 아미노산 잔기의 제거를 발생시킬 수 있다.
바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 가장 긴 루프(즉, 대부분의 아미노산 잔기를 포함)를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형되고, 제2의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 제2 루프 도메인은 변형되도록 선택된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인, 및 제2의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 제2 루프 도메인은 변형되도록 선택되고, 제3의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 제3 루프 도메인은 변형되도록 선택된다. 훨씬 추가의 바람직한 실시형태에서, 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인, 및 제2의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 제2 루프 도메인은 변형되도록 선택되고, 제3의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 제3 루프 도메인은 변형되도록 선택되고, 제4의 가장 긴 루프를 포함하는 HIBP-표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 제4 루프 도메인은 변형되도록 선택된다. 상기 언급된 실시형태는 본 명세서의 실시예 3 및 4에 추가로 기재되어 있다.
놀랍게도, 본 명세서에 따라, 하나 이상의 루프 도메인이 변형되고, 변형된 폴리펩타이드가 입체구성에서 실질적으로 안정할 때, HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인으로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드가 예를 들어 미생물 제조 시스템에서 용이하게 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에 따라, 변형된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드는 면역원으로서 그 자체가 사용될 수 있거나, 폴리펩타이드는 추가의 변형을 포함하도록 조절될 수 있다. 본 명세서에 따라 사용될 수 있는 폴리펩타이드의 변형된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인에 대한 변형은 네이티브 또는 변형된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단 폴리펩타이드 연장의 준비를 포함한다. 이러한 N 말단 및 C 말단 폴리펩타이드 연장은 C 로브 도메인에 대한 제2 전체 길이 C 로브 도메인 폴리펩타이드의 첨가(따라서 C 로브 도메인 이합체를 제공함), N 로브 도메인에 대한 제2 전체 길이 N 로브 도메인 폴리펩타이드의 첨가(따라서, N 로브 도메인 이합체를 제공함), 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드의 일부 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드의 일부를 포함하는 첨가를 포함한다. 다합체는 동일한 단량체 폴리펩타이드(즉, 동종이합체, 동종삼합체 등)를 사용하여 조립될 수 있거나, 상이한 폴리펩타이드, 예를 들어 상이한 변이체(즉, 이종이합체, 이종삼합체 등)로부터 얻어진 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 사용하여 조립될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상이한 병원균 또는 병원성 균주를 나타내는 이종다합체 단백질이 조립된다. 따라서, 바람직한 일 실시형태에서, 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 헤모필루스 파라수이스 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 이종다합체 폴리펩타이드가 제조된다. 특히 바람직한 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 에이. 플루로뉴모니아 H49, 에이. 수이스 H57 및 에이. 플루로뉴모니아 H87 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 나이세리아 메닌기티디스의 균주로부터 선택된 적어도 2개의 TbpB C 로브 도메인으로부터 선택된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 이종다합체 폴리펩타이드가 제조된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 균주는 엔. 메닌기티디스 M982 또는 엔. 메닌기티디스 B16B6으로부터 선택된다. 이종다합체 단백질은 상이한 병원균에 면역원성을 운반할 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 (ⅱ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질, 또는 이의 일부를 포함하는 제2 폴리펩타이드에 연결된, (ⅰ) 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드(여기서, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인의 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형됨)를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질의 일부는 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 단백질의 일부는 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인이고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인의 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
추가의 실시형태에서, 다합체 폴리펩타이드가 제조되고, 이러한 다합체 단백질은 C 로브 도메인에 대한 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7의 전체 길이 C 로브 도메인 폴리펩타이드의 첨가(따라서, C 로브 도메인 다합체를 제공함), 또는 N 로브 도메인에 대한 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7의 전체 길이 N 로브 도메인 폴리펩타이드의 첨가(따라서, N 로브 도메인 이합체를 제공함), 또는 C 로브 도메인 폴리펩타이드의 일부 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드의 일부를 포함하는 첨가를 포함하는, 복수의 N 및 C 말단 연장을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 일 실시형태에서, C 로브 도메인은 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로부터 얻을 수 있는 TbpB 폴리펩타이드로부터 얻을 수 있는 적어도 2개의, 또는 적어도 3개의, C 로브 도메인이다. 이러한 실시형태에 따라, 에이. 플루로뉴모니아 H49(서열 번호 5), 에이. 수이스 H57(서열 번호 33) 및 에이. 플루로뉴모니아 H87(서열 번호 21)로부터의 TbpB C 로브 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 연결되어서 3개의 C 로브(서열 번호 6; 서열 번호 34; 서열 번호 22)를 포함하는 단일 폴리펩타이드(서열 번호 40)를 코딩하는 키메라 핵산 서열(서열 번호 39)을 형성할 수 있다. 따라서, 훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명은 (ⅱ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질, 또는 이의 일부를 각각 포함하는 복수의 폴리펩타이드에 연결된, (ⅰ) 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드(여기서, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인 of N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 변형됨)를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질의 일부는 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, HIBP 표면 단백질의 일부는 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인이고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인의 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
추가의 실시형태에서, HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 또는 N 로브의 하나 이상의 루프 도메인으로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거 시, 이 잔기는 하나 이상의 교대하는 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 일 실시형태에서, 교대하는 아미노산 잔기는 척추동물 숙주 유기체에서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 비상동성 폴리펩타이드 항원 결정부위를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 교대하는 아미노산 잔기는 척추동물 숙주 유기체에서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 2개 이상의 비상동성 폴리펩타이드 항원 결정부위를 포함한다. 비상동성 항원 결정부위는 동일한 또는 상이한 병원성 유기체에 면역 교차반응성일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 따른 변형된 HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 단백질이 하나 이상의 항원 결정부위를 생성하고 제시하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다는 것이 명확할 것이다. 바람직한 실시형태에서, TbpB의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 하나 이상의 루프 구역은 트랜스페린 결합 단백질("TbpA") 또는 락토페린 결합 단백질 A("LbpA")를 포함하는 IOM 단백질로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 하나 이상의 폴리펩타이드 부분에 의해 대체된다. 본 명세서에 따라 사용될 수 있는 LbpA 및 TbpA 폴리펩타이드는 서열 번호 162 및 서열 번호 152에 기재된 것을 포함한다. 본 명세서에 따라 사용될 수 있는 LbpA 및 TbpA 폴리펩타이드의 부분은 서열 번호 286 및 서열 번호 287에 기재된 것을 포함한다. 이 단편은 서열 번호 163; 서열 번호 164; 서열 번호 165; 서열 번호 166, 서열 번호 167; 및 서열 번호 168에 기재된 것을 포함하는 키메라 핵산 서열 및 폴리펩타이드를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이 실시형태는 본 명세서의 실시예 7 및 8에 추가로 기재되어 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, TbpB의 C 로브 또는 N 로브의 하나 이상의 루프 도메인은 실시예 9에 추가로 기재된 바대로 라이신 농후 폴리펩타이드 서열에 의해 대체된다.
N 로브 도메인을 포함하는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 상기 기재된 모든 실시형태에서, N 말단 앵커 폴리펩타이드, 또는 이의 실질적인 일부가 N 로브 도메인으로부터 제거되는 방식으로 N 로브 도메인이 변형되는 것이 바람직하다. 앵커 폴리펩타이드의 길이는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드에 따라 변할 수 있지만, 통상적으로 40개 내지 75개의 아미노산의 길이의 범위이고, 성숙 HIPB 폴리펩타이드의 N 말단 끝에 위치한다. 따라서, 도 1을 참조하면, 여기에 도시된 성숙 TbpB 폴리펩타이드의 앵커 폴리펩타이드는 43개의 아미노산의 길이이다. 따라서, N 로브 도메인을 포함하는 HIBP 폴리펩타이드를 포함하는 바람직한 실시형태에서, 앵커 폴리펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개 또는 75개의 잔기로 길이가 감소한다. 앵커 폴리펩타이드의 부분이 길이의 감소를 위해 선택된 실시형태에서, 바람직하게는 앵커 폴리펩타이드의 N 말단의 인접 부분, 예를 들어 앵커 펩타이드의 10개의 말단 아미노산 잔기가 제거되지만, 앵커 폴리펩타이드의 다른 부분이 또한 제거될 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 부착 펩타이드가 절두된 TbpB 폴리펩타이드는 서열 번호 279 내지 서열 번호 283을 포함한다. 본 발명의 본 발명자들은, 앵커 폴리펩타이드의 제거가 변형된 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 응집을 제거시켜서, 그러나 폴리펩타이드의 면역원성 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서, 폴리펩타이드를 제조하기에 더 쉽게 만드므로, 상기 실시형태가 특히 바람직하다는 것을 밝혀냈다. 따라서, HIBP 폴리펩타이드의 이 변형은, 변형된 루프 도메인을 포함하는 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 HIBP 폴리펩타이드, 및 N 로브 또는 C 로브 도메인을 포함하는 HIBP 폴리펩타이드(여기서, 단일 아미노산은 HIBP 폴리펩타이드가 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 대체됨)를 포함하는, 본 명세서에 기재된 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 임의의 변형된 펩타이드와 함께 사용될 수 있다.
상기 언급된 바대로, 본 발명에 따라 HIBP 표면 수용체 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다. 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질에 대한 숙주 철 결합 단백질의 결합은, 예를 들어 고상 결합 검정, 친화도 포획 검정 또는 생물물리 검정을 포함하는, 이러한 결합을 평가할 수 있는 임의의 화학 또는 생화학 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 이 검정을 수행하기 위한 일반적인 방법론은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 (12, 23-25, 50, 51)에 기재되어 있다. 이 검정을 수행함으로써, 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질과 네이티브 숙주 철 결합 단백질, 및 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질과 네이티브 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 특징의 차이가 용이하게 결정될 수 있고, 일련의 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 평가될 수 있다. 결합 상수(Kd)를 포함하는 상이한 결합 특징이 결정될 수 있다. 상기 언급된 바대로, 숙주 철 결합 단백질과 본 발명의 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질 사이의 결합을 규명하는 Kd는 숙주 철 결합 단백질과 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질 사이의 결합을 규명하는 Kd보다 적어도 2배 높다. 숙주 트랜스페린을 사용한 결합 상수를 결정하기 위한 일 예시적인 검정 방법은 본 명세서의 실시예 11에 추가로 기재되어 있다.
본 발명은 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질을 확인하는 방법을 추가로 포함하고, 상기 방법은
(ⅰ) 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질 및 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질을 제공하는 단계;
(ⅱ) 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 특징을 결정하여 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징을 얻는 단계;
(ⅲ) 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 특징을 결정하여 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질 결합 특징을 얻는 단계;
(ⅳ) 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질 특징의 결합 특징을 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질 특징과 비교하는 단계; 및
(ⅴ) 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징에 대해 실질적으로 조절된 결합 특징을 나타내는 HIBP 표면 수용체 단백질을 확인하는 단계를 포함한다.
"실질적으로 조절된"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 상호작용 힘이 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 상호작용 힘보다 실질적으로 더 약하다는 것을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 사용된 결합 특징은 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질의 결합 상호작용과 관련한 Kd이고, 여기서 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 상호작용의 Kd의 값은 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 상호작용의 Kd의 값보다 적어도 2배 높다. 복수의 상이한 후보 HIBP 표면 수용체 단백질을, 동시에 또는 순차적으로 스크리닝하고, 스크리닝된 후보 HIBP 표면 수용체 단백질 중에서, 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질에 비해 다소 뚜렷한 결합 특징의 조절을 나타내는 것을 확인하기 위해 상기 방법이 사용될 수 있다는 것에 추가로 주목한다.
본 발명은 추가로 백신으로서 사용하기 위한 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질을 제조하는 방법을 포함하고, 상기 방법은
(ⅰ) 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질 및 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질을 제공하는 단계;
(ⅱ) 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 특징을 결정하여 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징을 얻는 단계;
(ⅲ) 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질과 숙주 철 결합 단백질 사이의 결합 특징을 결정하여 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질 결합 특징을 얻는 단계;
(ⅳ) 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징을 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징과 비교하는 단계;
(ⅴ) 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징에 대해 실질적으로 조절된 결합 특징을 나타내는 HIBP 표면 수용체 단백질을 확인하는 단계; 및
(ⅵ) 백신으로서 사용하기 위해 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징에 대해 실질적으로 조절된 결합 특징을 나타내는 HIBP 표면 수용체 단백질을 제조하는 단계를 포함한다.
상기에 따라, 네이티브 HIBP 표면 수용체 단백질의 결합 특징에 대해 실질적으로 조절된 결합 특징을 나타내는 확인된 HIBP 표면 수용체 단백질은 예를 들어 HIBP 표면 수용체 단백질을 재조합으로 제조하고, HIBP 표면 단백질을 단리하고, HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 백신 제형을 제조함으로써 면역원성 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 표면 수용체 단백질 변이체에 대해 항혈청의 교차반응성을 평가하는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 표면 수용체 단백질 변이체에 대해 항혈청의 교차반응성을 평가하는 방법을 추가로 포함하고, 상기 방법은
(ⅰ) 표면 수용체 단백질을 코딩하는 복수의 핵산 서열을 제공하는 단계;
(ⅱ) 복수의 표면 수용체 단백질 중에 핵산 서열 변형을 결정하는 단계;
(ⅲ) 표면 수용체 단백질의 변이체 부분을 선택하는 단계;
(ⅳ) 변이체 표면 수용체 단백질의 N 말단 또는 C 말단 부분을 코딩하는 핵산 서열을 효소 바이오티닐화에 민감한 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열에 연결하여 키메라 핵산 서열을 형성하는 단계;
(ⅴ) 키메라 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하고 키메라 핵산 서열을 발현시켜 바이오티닐화에 민감한 펩타이드에 융합된 변이체 표면 수용체 단백질의 N 말단 또는 C 말단 부분을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조하는 단계;
(ⅵ) 숙주 세포로부터 세포내 용해물을 준비하는 단계;
(ⅶ) 세포 추출물을 스트렙타비딘 코팅된 면역검정 기질 재료에 적용하는 단계; 및
(ⅷ) 항혈청을 면역검정 기질 재료에 적용하고, 면역검정 기질 재료를 세척하고 라벨링된 제2 접합체를 적용하여 항혈청과 표면 수용체 단백질의 변이체 부분 사이의 교차반응성을 평가하는 단계를 포함한다.
바이오티닐화에 민감한 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은, 발현 시, 융합 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드 연장을 허용하여서, 표면 수용체 단백질이 면역검정 기질 재료로부터 멀고 이로써 항체의 결합에 완전히 접근가능하게 하는, 충분한 길이의 핵산 서열을 부가적으로 포함할 수 있다. 스트렙타비딘 코팅된 면역검정 기질 재료는 예를 들어 ELISA 플레이트를 포함하는 임의의 기질 재료일 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 항혈청 표면 수용체 단백질 변이체의 교차반응성 또는 보호성 특성을 평가하는 방법을 포함하고, 상기 방법은
(ⅰ) 표면 수용체 단백질을 코딩하는 복수의 핵산 서열을 제공하는 단계;
(ⅱ) 복수의 표면 수용체 단백질 중에 핵산 서열 변형을 결정하는 단계;
(ⅲ) 표면 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 대체할 수 있는 카운터-선택 가능한 마커를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(ⅳ) 표면 수용체 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 복수의 변이체 부분을 PCR 증폭시켜 표면 수용체 변이체를 코딩하는 복수의 PCR 생성물을 얻는 단계(여기서, PCR 증폭은 카운터-선택 가능한 마커를 포함하는 숙주 세포로의 PCR 생성물의 통합을 허용하는 방식으로 수행되고, PCR 생성물은 각각의 PCR 생성물의 확인을 허용하기 위해 독특한 외인성 핵산 서열을 포함함);
(ⅴ) 복수의 PCR 생성물을 카운터-선택 가능한 마커를 포함하는 숙주 세포로 도입하고 발현시켜 항원 HIBP 변이체의 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(ⅵ) 생체내 또는 실험실내 면역학적 검정에서 라이브러리의 전부 또는 일부를 사용하여 라이브러리 또는 이의 일부의 교차반응성 또는 교차보호성 특성을 평가하는 단계를 포함한다.
생체내 또는 실험실내 면역 검정은 임의의 ELISA 검정, 기능적 면역학적 검정 또는 동물 감염 모델을 포함하는 임의의 검정일 수 있다.
훨씬 추가의 실시형태에서, 본 발명은 표면 수용체 단백질 변이체를 발현하는 그람 음성 박테리아 균주에 의한 포유동물 상부 호흡기의 콜로니화의 예방을 위한 백신의 효율을 평가하는 방법을 포함하고, 상기 방법은
(ⅰ) (a) 백신이 지시되는 병원균의 숙주 종으로부터의 포유동물 CEACAM 수용체를 발현하는 형질전환 마우스 라인 및 (b) 형질전환 마우스 라인과 유전적으로 동일하지만 CEACAM 수용체를 발현하지 않는 마우스 라인을 제공하는 단계;
(ⅱ) 변이체 표면 수용체 단백질을 발현하는 그람 음성 박테리아 균주가 형질전환 마우스 라인의 상부 호흡기를 콜로니화할 수 있고, CEACAM 수용체를 발현하지 않는 마우스 라인의 상부 호흡기를 콜로니화할 수 없다는 것을 입증하는 단계;
(ⅲ) 표면 수용체 단백질로부터 유래된 항원에 의한 면역화가 표면 수용체 단백질 변이체를 발현하는 그람 음성 박테리아 균주에 의해 감염된 형질전환 마우스에서 상부 호흡기의 콜로니화의 부재를 발생시키는지를 결정하는 단계;
(ⅳ) 표면 수용체 단백질로부터 유래된 항원에 의해 면역화된 동물로부터의 항혈청의 제공이 표면 수용체 단백질 변이체를 발현하는 그람 음성 박테리아 균주에 의해 감염된 비형질전환 면역화된 마우스에서 상부 호흡기의 콜로니화의 부재를 발생시키는지를 결정하는 단계;
(ⅴ) 그람 음성 박테리아 균주로부터의 표면 수용체 단백질의 일부를 포함하는 라이브러리를 준비하고 동물 상부 호흡기 콜로니화 모델에서 라이브러리를 사용하여 표면 수용체 변이체에 의해 시험감염된 동물의 상부 호흡기의 콜로니화를 평가하는 단계; 및
(ⅵ) 임의로, 노출 후 적절한 시점에 동물을 시험감염시키기 위해 사용된 라이브러리 및/또는 시험감염된 동물로부터 얻은 샘플로부터 얻은 DNA를 추출하고 준비하고, 상이한 수용체 변이체를 발현하는 균주의 부분을 결정하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 따라 일련의 상이한 조절된 폴리펩타이드가 제조되고 얻어질 수 있고, 이들은 모두 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질이고, 변형된 HIBP 표면 수용체 단백질 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형이 이루어진다는 것이 본 발명을 읽은 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 이 조절된 폴리펩타이드 및 이러한 조절된 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 모두 본 명세서에 제공된 조성물 및 방법의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
변형된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드는 편리하게는 HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하고, 변형된 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 재조합 숙주 유기체, 예를 들어 미생물 세포에서 발현되는 방식으로 네이티브 핵산 서열을 조절함으로써 제조된다. 예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발, 표적화된 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 유기 용매의 첨가, 유전자 셔플링 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 이들 기법 및 다른 기법의 조합을 포함하는, 당해 분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 핵산 변형 기법을 이용하여 핵산 서열에 대한 조절이 이루어질 수 있고, 각각의 방법론은 내부의 루프 도메인이 변형되는 방식으로 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인의 표적 루프 도메인으로 설계된다. 대안적으로, 변형된 인 사이즈-C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드를 코딩하는 조절된 핵산 서열은 유전자 합성 기법을 이용하여 처음부터(ab initio) 제조될 수 있다. 핵산 서열을 제조하고 변형시키는 일반적인 기법은 예를 들어 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012](33)에서 당업자에게 용이하게 입수 가능하다.
다른 본 발명의 실시형태에서, 면역원성 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명은 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a)
작동 가능하게 연결된 성분으로서,
(ⅰ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형됨); 및
(ⅱ)
재조합 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열
을 포함하는 키메라 핵산 서열을 제공하는 단계;
(b)
키메라 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하고 숙주 세포를 성장시켜 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계;
(c)
숙주 세포로부터 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
(d)
면역원성 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형되고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a)
작동 가능하게 연결된 성분으로서,
(ⅰ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 제1 C 로브 도메인 또는 제1 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열;
(ⅱ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 제2 C 로브 도메인 또는 제2 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열; 및
(ⅲ) 재조합 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열
을 포함하는 키메라 핵산 서열을 제공하는 단계;
(b)
키메라 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하고 숙주 세포를 성장시켜 제1 및 제2 C 로브 도메인 또는 제1 및 제2 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계;
(c)
숙주 세포로부터 제1 및 제2 C 로브 도메인 또는 제1 및 제2 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
(d)
면역원성 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산은 제1 및 제2 C 로브 도메인 또는 제1 및 제2 N 로브 도메인을 포함하는 이종다합체 융합 폴리펩타이드가 제조되고, 이종다합체 융합 폴리펩타이드가 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 작동 가능하게 연결된다.
본 명세서에 따라, HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에서 HIBP 표면 수용체 단백질의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열에 연결된다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 프로모터에 연결된 HIBP 표면 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 또한 제공한다. 본 명세서에 사용될 수 있는 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열은 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 제어할 수 있는 임의의 전사 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 박테리아 숙주가 본 명세서에 따라 선택될 때 박테리아 세포로부터 얻은 프로모터를 사용하지만, 진균 숙주가 선택될 때 진균 프로모터를 사용할 것이고, 식물 세포가 선택될 때 식물 프로모터를 사용할 것이고, 기타 등등이다. 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 추가의 핵산 요소는 전사 종결자, 인핸서 등을 포함하고, 이들은 모두 본 발명의 키메라 핵산 서열에 포함될 수 있다.
본 발명에 따라, 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 연결된 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 프로모터를 포함하는 키메라 핵산 서열(여기서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형됨)은 숙주 세포에서 우수한 발현을 보장하기 위해 재조합 발현 벡터로 통합될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 작동 가능하게 연결된 성분으로서,
(ⅰ)
숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열; 및
(ⅱ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻어질 수 있거나 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형됨)
을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하고,
발현 벡터는 숙주 세포에서 발현에 적합하다. 용어 "숙주 세포에서의 발현에 적합한"은 재조합 발현 벡터가 숙주 세포에서 발현을 달성하기 위해 필요한 유전적 요소에 연결된 본 발명의 키메라 핵산 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 이와 관련하여 발현 벡터에 포함될 수 있는 유전적 요소는 전사 종결 구역, 마커 유전자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열, 하나 이상의 복제 기원 등을 포함한다. 유전적 요소는 예를 들어 전사의 5'→3' 방향에서의 프로모터를 코딩 서열에 연결함으로써 당해 분야의 당업자에게 통상적으로 또한 공지된 바대로 작동 가능하게 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 숙주 세포의 게놈에서 벡터 또는 이의 일부의 통합에 필요한 유전적 요소를 추가로 포함한다. 추가의 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명에 따라, 발현 벡터는 마커 유전자를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 마커 유전자는 모든 선택 가능하고 스크리닝 가능한 마커 유전자를 포함하여 비형질전환된 세포로부터 형질전환된 세포의 구별이 가능하게 하는 모든 유전자를 포함한다. 마커 유전자는 예를 들어 카나마이신 또는 암피실린에 대한 내성 마커, 예컨대 항생제 내성 마커일 수 있다. 육안 검사를 통해 형질전환체를 확인하기 위해 사용될 수 있는 스크리닝 가능한 마커는 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(GUS)(미국 특허 제5,268,463호 및 제5,599,670호) 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP)을 포함한다(52).
특히 편리하게 사용될 수 있는 일 숙주 세포는 에스체리치아 콜라이이다. 이. 콜라이 벡터의 제제는 흔히 공지된 기법, 예컨대 제한 분해, 결찰, 결찰 독립적 클로닝, 겔 전기영동, DNA 서열분석, 중합효소 사슬 반응(PCR), 및 다른 방법론을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명자들이 개발한 맞춤형 벡터를 포함하여 재조합 발현 벡터를 제조하기 위해 필요한 필수 단계를 수행하는 데 매우 다양한 클로닝 벡터가 적용 가능하다. 이. 콜라이에서 기능적인 복제 시스템을 가지는 벡터 중에 벡터의 pUC 또는 pET 시리즈 등과 같은 벡터가 있다. 통상적으로, 이 클로닝 벡터는 형질전환된 세포의 선택이 가능하게 하는 마커를 함유한다. 핵산 서열은 이 벡터에서 도입될 수 있고, 벡터는 수용 세포를 제조함으로써, 전기천공에 의해 또는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 다른 방법론을 이용하여 이. 콜라이에서 도입될 수 있다. 이. 콜라이는 적절한 배지, 예컨대 루리아-브로쓰(Luria-Broth) 배지 중에 성장하고 수확될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 세포의 수확 및 용해 시 세포로부터 용이하게 회수될 수 있다. 추가로, 재조합 벡터의 제조 및 재조합 유기체의 성장과 관련한 일반적인 가이던스는 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, Third Ed](33)에서 발견될 수 있다.
상당한 바이오매스를 달성하기 위해 이. 콜라이 균주의 성장을 통해, 바람직하게는 성장의 기간 후 발현의 유도에 의해 재조합 단백질의 제조가 발생할 수 있다. 이것은 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 또는 변형된 루프를 가지는 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 제조를 발생시킬 것이다. 폴리펩타이드는 예를 들어 금속-킬레이트 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과 등을 포함하는 다양한 상이한 단백질 정제 기법에 의해 다른 숙주 세포 성분으로부터 후속하여 회수되고 단리되고 분리될 수 있다. 단백질 정제와 관련한 추가의 일반적인 가이던스는 예를 들어 문헌[Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications](53)에서 발견될 수 있다. 용어 "회수된"은, 본 명세서에 사용된 바대로, 폴리펩타이드가 다소 순수한 형태로 얻어진다는 것을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인을 포함하는 실질적으로 면역원성인 폴리펩타이드(여기서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형됨)는 본 명세서에 따라 얻어질 수 있다. 따라서, 본 명세서에 따라 얻어진 HIBP 폴리펩타이드는 실질적으로 순수한 형태로 제조될 수 있다. "실질적으로 순수한"이란, 면역원성 단백질이 다른 숙주 세포 성분으로부터 분리된다는 것을 의미한다. 본 명세서에 따라, 면역원성 단백질은 적어도 95% 순수하고, 더 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 순수하다. 대안적으로, HIBP 폴리펩타이드를 포함하는 비교적 미정제인 분획, 예를 들어 폴리펩타이드를 함유하는 세포, 폴리펩타이드를 함유하는 세포 용해물, 또는 폴리펩타이드를 함유하는 세포 분획이 얻어질 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 면역원성 단백질의 전달에 의해 또는 면역원성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터의 전달에 의해 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명은 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은, 대상체에게,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음); 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음)
를 투여하는 단계를 포함하고;
면역원은 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기에 충분한 양으로 투여되거나 발현된다.
본 발명은, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기 위한,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음); 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음)
의 용도를 또한 제공한다.
본 발명은, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기 위한 약제의 제조에서의,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음); 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음)
의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기 위한,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음); 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없음)
를 더욱 또한 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 2개의 C 로브 도메인 또는 적어도 2개의 N 로브 도메인을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 3개의 C 로브 도메인 또는 적어도 3개의 N 로브 도메인을 포함한다.
소정의 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다.
본 발명은 HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 추가로 포함하고, 여기서 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 적어도 하나의 루프 도메인은 약제로서의 용도를 위해 변형된다.
본 발명은 HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 추가로 포함하고, 여기서 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 적어도 하나의 루프 도메인은 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하여 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 감염 또는 질환의 예방에서 사용하기 위해 변형된다.
본 발명은 HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 추가로 포함하고, 여기서 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 적어도 하나의 루프 도메인은 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하여 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 감염 또는 질환의 예방을 위한 약제로서의 용도를 위해 변형된다.
백신 제제
본 발명은 백신 제제를 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 유래된 항원을 포함하는 백신 조성물을 추가로 제공하고, 여기서 HIBP 표면 수용체 단백질로부터 유래된 단백질은 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다. 본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는, 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, HIPB 표면 수용체 단백질, HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 포함하고, 여기서 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된다. 바람직한 실시형태에서, 백신 제제는 2개의 상이한 박테리아 종 또는 2개의 상이한 박테리아 균주에 속하는 C 로브 도메인의 혼합물을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 2개의 또는 적어도 3개의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 적어도 2개의 또는 적어도 3개의 N 로브 도메인 또는 C 로브 도메인은 이종다합체를 형성한다. 추가의 실시형태에서, C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된다.
본 발명의 백신 제제는 다소 순수한 형태의 면역원성 HIBP 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 따라, 백신 제형을 제조하기 위해 실질적으로 순수한 HIBP 폴리펩타이드가 얻어지고 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 백신 제형을 제조하기 위해 더 미정제인 HIPB 폴리펩타이드 제제가 얻어지고 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 이러한 실시형태에서 HIBP 폴리펩타이드를 포함하는 세포, 세포 용해물 또는 세포 분획은 백신 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
대상체에서 면역 반응을 증대시키기 위해, 본 명세서에 제공된 조성물은 추가로 바람직하게는 아쥬번트, 예컨대 약리학적 물질, 사이토카인 등을 포함한다. 적합한 아쥬번트는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 대상체의 면역 반응을 증대시키는 임의의 물질을 포함한다. 아쥬번트의 비제한적인 예는 사이토카인, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-12, IL-6을 포함하고, 윌슨(Wilson)-웰더(Welder) 등의 문헌(54)에 검토된 바대로 무기 염, 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 인산칼슘; 오일 에멀션, 예를 들어 광유, MF59, QS-21, 몬타미드(Montamide) ISA51 및 ISA-720; 이소콤(Isocom), 예를 들어 이스코매트릭스(ISCOMATRIX); 미생물 유도체, 예를 들어 MPLA, 대식세포 활성화 단백질-2, 비로솜(virosome), LT/CT, CpG; 천연 중합체, 예를 들어 폴리사카라이드; 및 합성 중합체, 예를 들어 폴리언하이드라이드 및 폴리에스터를 추가로 포함한다. 아쥬번트는 폴리펩타이드 항원의 투여와 동시에, 이것 전에 또는 후에 예를 들어 단백질 또는 다른 거대분자로서 투여될 수 있다.
면역원성 단백질에 대한 용량은 일반적으로 인간 대상체에 대해 약 0.1㎍ 내지 약 20㎎, 바람직하게는 10㎍ 내지 약 3㎎의 범위이다. 그러나, 필요한 정확한 양은 치료되는 수혜자 대상체의 연령 및 일반 상태, 치료되는 병태의 중증도, 전달되는 특정한 제제, 투여 부위, 및 다른 인자에 따라 달라질 것이다. 적절한 치료학적 유효량은 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 따라서, 본 조성물의 "치료학적 유효량"은 질환 또는 병태 증상의 치료 또는 예방을 발생시키거나, 병원성 박테리아에 의한 콜로니화를 방지하기에 충분한 양일 것이고, 일상적 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 해당할 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 백신 제제는 바람직하게는 추가로 비히클, 부형제 및 보조제 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등을 포함하고, 부형제 또는 비히클에 존재할 수 있다. 이 비히클, 부형제 및 보조제 물질은 일반적으로 수혜자 대상체에서 면역 반응을 유도하지 않는 약제학적 물질이고, 부당한 독성 없이 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 액체, 예컨대 물, 식염수, 폴리에틸렌글라이콜, 히알우론산, 글라이세롤 및 에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 광산 염, 예컨대 염산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 벤조산염 등이 또한 여기에 포함될 수 있다. 상기 제제가 특히 본 발명의 폴리펩타이드를 안정화시키기 위해 안정화제로서 작용하는 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 것이라는 것이 또한 바람직하지만, 필요한 것은 아니다. 펩타이드에 대한 안정화제로서 또한 작용하는 적합한 담체의 예는, 제한 없이, 약제학적 등급의 덱스트로스, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 이노시톨, 덱스트란 등을 포함한다. 다른 적합한 담체는, 다시 제한 없이, 전분, 셀룰로스, 나트륨 또는 인산칼슘, 시트르산, 글라이신, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 및 이들의 조합물을 포함한다.
본 발명의 백신 제제는, 제한 없이, 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스, 헤모필루스 파라수이스, 나이세리아 메닌기티디스를 포함하는, 제한 없이, 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하는, 감염성 그람 음성 박테리아에 의해 야기된 감염 또는 질환을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 백신 제제는 숙주 철 결합 단백질을 발현하는 임의의 척추동물 대상체를 포함하고, 제한 없이, 임의의 인간 대상체, 돼지 대상체, 소 대상체, 말 대상체, 양 대상체, 염소 대상체, 개 대상체, 고양이 대상체, 토끼 대상체 및, 추가로 임의의 반추동물 대상체, 및 쥣과 대상체를 포함하는 임의의 포유동물 대상체를 포함하는, 임의의 척추동물 대상체를 면역화하기 위해 사용될 수 있다. 면역화될 수 있는 다른 척추동물 대상체는 임의의 조류 대상체 및 물고기 대상체를 포함한다. 본 발명의 백신 제제는 수혜자 숙주 유기체에서 증대된 교차반응성 및/또는 교차보호성 면역학적 반응을 나타낼 수 있다. 본 발명의 백신 제제가 척추동물 대상체의 호흡기 또는 생식기의 박테리아 콜로니화를 포함하는 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 감염 및/또는 콜로니화를 방지할 수 있다는 것에 추가로 주목한다.
본 발명은 HIPB 표면 수용체 단백질, HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 추가로 포함하고, 여기서 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 적어도 하나의 루프 도메인은 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 속에 속하는 박테리아를 포함하는, 감염성 그람 음성 박테리아에 의한 감염 또는 질환의 예방에서 사용하기 위해 변형된다.
백신 제제의 시험
본 명세서에 따라, 본 발명의 백신 제제의 효율은 예를 들어 백신 제제에 의해 면역화된 대상체의 혈액 혈청에 존재하는 항체 역가를 결정함으로써, 예를 들어 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)의 수행에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 백신 제제의 효율을 평가하는 방법을 추가로 포함하고, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형되고, 상기 방법은,
(a) 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, HIPB 표면 수용체 단백질, 또는 HIBP 표면 수용체의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 백신 제제를 척추동물 대상체에게 투여하는 단계(여기서, 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형됨);
(b) 척추동물 대상체로부터 혈액 혈청을 얻는 단계; 및
(c) HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드에 대한 항체의 존재에 대해 혈액 혈청을 평가하는 단계를 포함한다.
척추동물 혈액 혈청은 백신 제제의 단일 또는 다수(예를 들어, 2, 3 또는 4)의 용량의 투여 후에 평가될 수 있다. ELISA 검정과 같은 검정은 단일 또는 다수의 미생물 상이한 균주 또는 종으로부터의 HIBP 표면 수용체 단백질 단리물을 사용하여 수행될 수 있다. ELISA 검정은 운반 단백질, 예컨대 말토스 결합 단백질에 대한 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 연결을 포함할 수 있다. 다수의 HIBP 표면 수용체 단백질 단리물에 대한 항체의 반응성이 평가되는 경우, 교차반응성에 대해 백신 제제를 평가할 수 있다.
백신접종 섭생
본 명세서의 교시내용의 관점에서 당해 분야의 당업자에게 명확한 것처럼, 상기 기재된 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 의한 백신접종(DNA 백신)은 치료의 과정에 걸쳐 일 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 수행될 수 있다. 투여의 가장 효과적인 수단 및 용량을 결정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고, 전달 벡터, 조성물의 성질, 추구되는 구체적인 예방책 또는 치료, 표적 세포, 및 치료되는 대상체에 따라 변할 것이다. 단일 및 다중 투여는 적합한 의료인에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다.
상기 기재된 약제학적 제제의 투여는 치료의 과정에 걸쳐 일 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 수행될 수 있다. 전달은 가장 통상적으로 액체 조성물 및 미립자 조성물을 함유하는 액체 현탁액에 대해 종래의 바늘침 및 주사기를 통해 이루어질 것이다. 또한, 다양한 액체 제트 주사기는 당해 분야에 공지되어 있고, 본 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 백신 전달의 경로는 변할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 정맥내, 피하, 근육내, 질내, 복강내, 비강내, 경구 또는 다른 점막 경로를 통해 전달될 수 있다. 투여의 가장 효과적인 수단 및 용량을 결정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고, 전달 비히클, 치료의 조성물, 표적 세포, 및 치료되는 대상체에 따라 변할 것이다. 단일 및 다중 투여는 주치의 또는 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다.
실시예
본 발명을 수행하기 위한 구체적인 실시형태의 실시예가 하기 있다. 실시예는 오직 예시적인 목적을 위해 제공되고, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
1 -
TbpB
C
로브
도메인,
TbpB
N
로브
도메인 및 이의 혼합물에 의한 면역 반응.
이 실시예는 더 바람직한 면역 반응을 얻기 위해 TbpB 수용체 단백질의 하위도메인을 사용하는 것의 가치의 예시를 제공한다. 더 바람직한 면역 반응에 의해 본 발명자들이 의미하는 것과 관련하여, 본 발명자들은 항체 반응의 규모 및 항체와 변이체 TbpB 단백질의 교차반응성 둘 다를 고려한다.
도 3a는 상이한 숙주 종(마우스, 토끼 및 돼지)이 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스(균주 B16B6 - 서열 번호 117) 또는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49 - 서열 번호 2)로부터의 온전한 TbpB에 의해 면역화된 이 실시예에 대한 제1 실험으로부터의 결과를 예시한다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정(하기 참조)에서 면역화 항원에 대해 시험하였다. 결과는 돼지 병원균 에이. 플루로뉴모니아로부터의 TbpB에 의한 돼지에서의 항체 반응의 규모(역가)(회색 막대)가 인간 병원균 엔. 메닌기티디스로부터의 TbpB와 비교하여 다른 숙주 종보다 실질적으로 더 낮다(검정색 막대)는 것을 예시하여서, 숙주 트랜스페린의 결합이 TbpB에 대한 항체 반응의 발생에 영향을 미친다는 것을 제시한다.
제2 실험(도 3b)은 소 병원균 만헤미아 헤몰리티카(균주 H196 - 서열 번호 206)로부터의 온전한 TbpB 또는 돼지 병원균 악티노바실루스 플루로뉴모니아(균주 H49)로부터의 온전한 TbpB(서열 번호 2), TbpB N 로브(서열 번호 8) 또는 TbpB C 로브(서열 번호 6)에 의한 돼지의 면역화를 포함한다. 도 3b는 면역화 전(흰색 막대), 제1 면역화 후(연회색 막대), 제2 면역화 후(진회색 막대) 및 제3 면역화 후(검정색 막대) 개별 돼지에서의 면역 반응(막대의 클러스터)을 예시한다. 역가가, 역가를 평가하는 데 사용된 2배 희석을 반영하기 위해, 2원 로그로서 표시된다는 것에 주목한다. 대부분의 돼지는 제3 면역화 후 높은 역가의 항체(26,000 내지 256,000)를 나타냈지만, 에이. 플루로뉴모니아로부터의 온전한 TbpB 또는 TbpB N 로브에 의해 면역화된 돼지 중 몇몇은 실질적으로 감소한 역가(5,300 내지 8,000)를 나타냈다. 온전한 TbpB에 의해 면역화된 4마리 중 2마리의 돼지 및 TbpB N 로브에 의해 면역화된 돼지의 3마리의 돼지는 실질적으로 감소한 역가를 나타낸다는 관찰은 숙주 트랜스페린의 결합이 오직 동물의 하위세트에서 항체 반응의 발생에 영향을 미친다는 것을 제시한다.
항혈청의 교차반응성을 평가하기 위해 돼지 병원균으로부터의 상이한 대표적인 TbpB와 반응하는 온전한 TbpB 및 이의 하위도메인에 대한 혈청의 능력을 평가하기 위해 이 실시예에 예시된 제3 실험(도 3c)을 설계하였다. 돼지를 온전한 TbpB(서열 번호 2), TbpB C 로브 도메인(서열 번호 6), TbpB N 로브 도메인(서열 번호 8) 또는 TbpB N 로브 및 TbpB C 로브의 혼합물에 의해 면역화하였다. 혈청을 (ⅰ) 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2)로부터의 온전한 TbpB, (ⅱ) 헤모필루스 파라수이스 균주 HP5(서열 번호 115)로부터의 온전한 TbpB 또는 (ⅲ) 악티노바실루스 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12)로부터의 온전한 TbpB에 대해 시험하였다.
도 3c에서의 결과는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49로부터의 TbpB C 로브 도메인이 온전한 TbpB(균주 H87로부터의 비상동성 TbpB에 대한 더 높은 역가) 또는 TbpB N 로브(균주 H87 및 HP5에 대한 더 높은 역가)보다 더 교차반응성인 면역 반응을 유도한다는 것을 예시한다. 이 검정에서 사용된 TbpB는 전세계의 돼지로부터의 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 헤모필루스 파라수이스(서열 번호 2; 서열 번호 12; 서열 번호 28; 및 서열 번호 107 내지 서열 번호 115)의 임상 질환 단리물에 존재하는 전체 서열 및 구조 다양성을 나타내도록 설계되었다(도 4). 따라서, 이 실시예에서 본 발명자들은 본 발명자들의 분석을 단일 돼지 병원균에 제한하지 않지만, 전세계 양돈 산업에서 문제가 되는 3개의 명확한 돼지 병원균을 표적화한다. 숙주로부터 철을 얻기 위한 공통 기전을 공유하기 위해 이 병원균이 발생한다는 사실은 TbpB인 공통 항원으로부터의 3개의 병원균을 표적화하는 백신을 개발할 독특한 기회를 제공한다. 이 결과는 항원으로서 하나 이상의 C 로브 도메인을 사용함으로써 전세계 돼지 병원균에 대해 광범위한 교차반응성 반응을 생성하는 것이 실현 가능하고, 따라서 세계적으로 이 병원균의 존재를 제거하기 위해 백신접종을 고려한다는 것을 나타낸다.
놀랍게도, C 로브 도메인에 의해 유도된 증대된 교차반응성은 C 로브가 면역화 혼합물에서 N 로브와 혼합될 때에도(도 3c, "N + C 로브") 보유된다. 이 결과는 더 작은 가변 루프 구역("N 로브"와 비교된 "C 로브", 도 1)을 가지는 항원이 더 교차반응성인 항체 반응을 유도할 수 있고, 교차반응성인 면역 반응을 유도하는 이 증대된 능력이 C 로브가 면역화 혼합물에서 다른 항원과 조합될 때에서 보유된다는 것을 본 발명자들에게 교시한다. 더 구체적으로, 이 결과는 더 균주 특이적인 면역 반응을 생성하는 N 로브에 대한 경향이, N 로브와 물리적으로 연결될 때, 오직 C 로브에 의한 교차반응성인 면역 반응의 유도를 효과적으로 저해할 수 있다는 것을 나타낸다. 즉, 놀랍게도, 더 특이적인 면역 반응을 생성하는 N 로브의 경향은 N 로브가 C 로브와 혼합될 때 실질적으로 감소한다. 본 발명자들의 지식의 최고에서, 이 현상은 이전에 기재되어 있지 않다.
결과는 C 로브에 대한 온전한 TbpB 및 TbpB N 로브에 대한 반응이 감소한다(도 3b, 도 3c)는 것을 또한 제시하고, 이것은 온전한 TbpB 및 TbpB N 로브에 오직 존재하는 특징인, 숙주 트랜스페린의 결합이 돼지에서 면역 반응을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
이전에 공개된 연구와 반대로, 본 발명자들이 표준 ELISA 방법에서 주요 결핍을 확인할 수 있으므로, 본 발명자들이 항체 수준을 결정하기 위해 표준 ELISA 방법을 사용할 수 없다는 것을 언급하는 것이 중요하다. 본 발명자들은, 흔히 추정되는 것과 반대로, 정제된 단백질이 ELISA 플레이트에 무작위로 반드시 결합하지 않아서, 단백질의 표면에서 에피토프에 대한 항체의 결합을 평가하는 데 있어서 잠재적으로 강한 편차 또는 결핍을 제공한다는 것을 관찰하였다. 특히 본 발명자들은 TbpB, 특히 TbpB의 N 로브가 N 로브의 캡 구역을 마스킹하면서 본질적으로 일 방향으로 ELISA 플레이트의 고체 표면에 결합하여서, 트랜스페린의 결합이 검출될 수 없다(도 5)는 것을 언급하였다. 반대로, 정제된 TbpB N 로브에 대한 전구체인 N 말단 말토스 결합 단백질(Mbp) 파트너를 가지는 재조합 융합 단백질은 트랜스페린 결합에서 능숙하다(도 5). 이 현상은 인간, 돼지 및 소 병원균으로부터의 TbpB N 로브, 및 더 적은 정도로, 온전한 TbpB에 의해 관찰되었다. 이 단백질은 서열이 꽤 상이하므로(30% 미만의 전체 서열 동일성), 이것은 특이적인 단백질의 독특한 특성이 없지만, 비무작위 결합이 고상 결합 검정에 영향을 미치는 정도가 변할 수 있다는 것을 나타낸다.
이 결핍을 극복하기 위해, 본 발명자들은 세포질에서의 단백질 발현 동안 N 말단에 효소로 첨가되는 바이오틴 잔기에 의해 재조합 단백질을 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트에 결합하기 위한 방법을 고안하였다. 도 5에 도시된 바대로, 효소로 바이오티닐화된 N 말단 펩타이드의 첨가는 트랜스페린에 결합하는 TbpB N 로브의 능력을 회복시켰다. 이 접근법은 도면의 왼쪽 측 및 오른쪽 측에서의 Mbp에 융합된 Tbp N 로브에 의한 결과의 비교가 나타내는 것처럼, 트랜스페린 결합 구역을 노출시키는 데 있어서 더 효과적일 수 있다. 이 새롭고 신규한 ELISA 검정 포맷은, 표적 단백질에서 모든 에피토프에 대한 완전하고 동일한 접근을 보장하여서, 따라서 교차반응성의 정도를 평가하는 데 있어서 진정한 비교를 제공하므로, 항체 반응성을 모니터링하기 위한 모든 본 발명자들의 ELISA 검정에서 사용되었다.
N 말단 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 및 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus: TEV) 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 맞춤형 T7 발현 벡터를 사용하여 이. 콜라이의 세포질에서 면역화 실험을 위한 재조합 항원을 제조하였다. 재조합 융합 단백질을 Ni-NTA 크로마토그래피, (TEV) 절단에 의해 방출된 항원에 의해 단리하고, Ni-NTA 및 Q-세파로스 크로마토그래피의 조합에 의해 정제하였다.
FVB 마우스(챨스 리버(Charles River)로부터의 알비노 MHC 단상형 H2q), 3월령 뉴질랜드 화이트 토끼 및 51일령 라지 화이트 간드라스(Large White Landrace) F1 교차 돼지를 도 3a에서 면역화 실험에 사용하였다. 정제된 재조합 단백질을 마우스에 대해 0.1㎖ 중의 25㎍, 토끼에 대해 0.5㎖ 중의 50㎍ 및 돼지에 대해 2㎖ 중의 100㎍의 최종 농도로 인산염 완충 식염수 및 33%(도 3a) 또는 20%(도 3b, 도 3c)의 에물시겐 D(MVP 기술)와 혼합하였다. 3회 주사를 마우스 및 토끼에 대해 피하로 및 돼지에 대해 피하로(도 3a) 또는 근육내로(도 3b, 도 3c) 투여하였다. 동물을 0일, 21일, 42일에 면역화하고, 최종 혈액을 56일에 수집하였다.
8주에 취한 혈청을 본 발명자들의 맞춤형 고상 ELISA 검정에서 대표적인 단백질에 대해 시험하였다. N 말단 최적화된 바이오티닐화된 서열, 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 및 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 맞춤형 T7 발현 벡터를 사용하여 이. 콜라이의 세포질에서 ELISA 검정에서 사용된 재조합 융합 단백질을 제조하였다. 이 단백질을 N 말단 바이오티닐화된 서열에서 생체내 바이오티닐화하여서 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트에 적용할 수 있다.
바이오티닐화된 융합 단백질을 위한 발현 벡터에 의한 소규모 밤샘 단백질 발현 실험으로부터의 미정제 추출물은 이전의 최적화 실험에 기초하여 ELISA 플레이트를 포화시키기에 충분하였다. 관심 있는 항혈청의 희석을 인산염 완충 식염수(PBST) 중의 2.5% 탈지유 중에 제조하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트에 적용하였다. 제거 및 세척 후, 1차 항체를 실온에서 1시간 동안 1:100,000(항돼지에 대해 1:25,000)의 희석에서 HRP 접합 염소 항마우스, 항토끼 또는 항돼지 IgG에 의해 검출하였다. 역가는 A450 > 0.3으로 마지막 희석의 역수로서 표시된다(혈청 첨가 없는 웰의 배경 판독의 평균 + 3회 표준 편차보다 큼).
사후로서 수행된 터키 HSD(정직한 유의차) 시험에 의해 ANOVA를 통해 SEM 오차의 계산을 수행하였다. 통계학은 모든 혈청에 대해, H49가 H87과 상당히 다르고, N 로브가 C 로브 또는 the N+C 로브와 상당히 다르다는 것을 보여준다. 도 3c에 도시된 별은 H49에 대해 시험된 C 로브 또는 N+C 로브로부터 상당히 다른 특이적 면역화/단백질 쌍을 나타낸다.
실시예 2 - 돼지 병원균 TbpB C 로브의 삼합체의 제조
이 실시예에서, 본 발명자들은 3개의 돼지 병원균에 존재하는 TbpB의 광범위한 다양성을 나타내는 3개의 재조합 조작된 C 로브가 함께 연결되고 항원성을 보유할 수 있다는 것을 입증하였다. 여기서 사용된 조작된 C 로브는 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로부터 얻어진 것이다(도 4). 따라서, 균주 에이. 플루로뉴모니아 H49(서열 번호 6), 에이. 수이스 H57(서열 번호 35) 및 에이. 플루로뉴모니아 H87(서열 번호 22)로부터의 TbpB C 로브를 코딩하는 유전자는 연결되어서, 3개의 C 로브(서열 번호 40)를 포함하는 단일 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 형성하였다(도 6의 패널 A). 이 C 로브 삼합체에서 (밑줄로 표시된) C 로브의 2차 구조 요소를 연결하는 비교적 짧은 펩타이드가 존재한다. 연결 펩타이드는 개별 C 로브 도메인으로부터 진정한 로브 간 서열로 이루어진다. 도 6의 패널 B는 C 로브 삼합체의 제조를 예시하고, 인간 병원균 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 재조합 조작된 TbpB N 로브 및 C 로브의 제제와 비교되었다. 결과는 C 로브 삼합체가 우수한 분량으로 제조되고 안정하다는 것을 나타낸다. 그러나, 도 6에 예시된 제제는 면역화 실험에서 사용 전에 부가적인 정제를 필요로 한다.
안정한 C 로브 삼합체의 제조에 대한 주요 장벽이 없으므로, C 로브 삼합체가 면역원성을 보유하는지를 결정하기 위해 면역화 실험을 위해 이것을 제조하고 정제하였다. 도 7에 예시된 바대로, C 로브 삼합체는 3개의 대표적인 TbpB에 대해 면역 반응을 유도할 수 있어서, 3개의 개별 C 로브를 함께 연결하는 것은 이의 면역학적 특성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 나타낸다. 결과는 단일 단백질 항원이 돼지 병원균인 플루로뉴모니아에, 에이. 수이스 및 헤모필루스 파라수이스의 모두는 아니지만 대부분의 균주와 반응할 수 있는 면역 반응을 유도할 수 있어서, 광범위하게 교차보호성 돼지 백신의 발생에 대한 잠재적인 가능성을 보여준다는 것을 또한 제시한다.
실시예 3 - 에이. 플루로뉴모니아 TbpB의 N 로브에서의 루프 구역의 감소
이 실시예에서, 돼지 병원균으로부터의 3개의 대표적인 TbpB로부터의 N 로브 도메인의 루프 구역은 교차반응성인 면역 반응의 유도에 대한 이의 영향을 결정하기 위해 변형되었다. 3개의 대표적인 TbpB는 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 28), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 12) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 2)로부터 유래하였다. 이 특정한 TbpB는 서열 다양성을 나타낸다는 것 이외로 입수 가능한 고해상도 구조 데이터가 존재하므로 선택되었다; 에이. 수이스 균주 H57(3PQU.pdb), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(3PQS.pdb) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(3HOL.pdb). 루프 감소 과정은 에이. 수이스 균주 H57(서열 번호 36, 38)로부터의 TbpB N 로브에 대한 74개의 아미노산(297-224), 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87(서열 번호 24, 26)로부터의 TbpB N 로브에 대한 45개의 아미노산(248-203) 및 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49(서열 번호 8, 10)로부터의 TbpB N 로브에 대한 27개의 아미노산(274-247)의 전체 소실을 발생시켰다. 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49에 대한 루프 감소의 설계는 예시적인 목적을 위해 이하 더 자세히 기재되어 있다. 각각의 경우에, 제1 수록 서열 번호는 TbpB N 로브 서열을 나타내고, 제2 서열 번호는 조작된 루프 감소를 나타낸다.
루프 감소를 설계하기 위해, 돼지 병원균으로부터의 일련의 대표적인 TbpB로부터의 다수의 서열 정렬을 동시에 보면서, 균주 H49(3HOL.pdb)로부터의 TbpB의 구조는 균주 H87(3PQS.pdb)로부터의 TbpB의 구조와 중첩되었다. 변형의 구조 및 구역을 검사함으로써, N 로브의 전체 구조를 교란시키지 않는 것으로 예측된, 잠재적인 루프 감소를 위한 몇몇 구역이 확인되었다. 이것은 표준 명명법에 따라 1, 5, 8a, 8c 및 12 루프를 포함하고(도 2), TbpB N 로브의 측면도(패널 A) 및 상면도(패널 B)의 구조 모델에서 도 8에 예시되어 있다. 루프 감소는 아미노산의 제거 이외에 필요한 바대로 적절한 아미노산 대체를 선택함으로써 N 로브의 전체 폴딩 및 구조에 대한 잠재적인 교란을 최소화하도록 설계되었다. 원래의 N 로브(상부 서열) 및 변형된 N 로브(하부 서열)의 아미노산 서열이 도 8, 패널 C(여기서, 루프 구역은 회색으로 강조되고, 회색 폰트로 라벨링됨)에서 서열 정렬로 예시되어 있다. 패널 C에 예시된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 이. 콜라이 균주에서 발현을 위해 최적화하고 이후 합성하였다.
에이. 플루로뉴모니아 균주 H87 및 에이. 수이스 균주 H57로부터의 TbpB N 로브에 대한 루프 감소를 생성하기 위해 유사한 전략이 채택되었는데, 왜냐하면 이것이 돼지 병원균으로부터의 TbpB의 상당한 서열 및 구조 다양성을 나타내고(도 4), 관련 구조가 입수 가능하기 때문이다(3PQS.pdb 및 3PQU.pdb)(12). 모두는 아니지만 대부분의 임상 단리물의 N 로브 구역에 대한 교차반응성 반응을 총체적으로 유도하는 조작된 항원을 제조하는 가능성은 3개의 돼지 병원균을 표적화하는 백신의 유효성을 증대시키기 위한 상당한 가능성을 가질 것이다.
생성된 유전자를 N 말단 폴리히스티딘 구역, 말토스 결합 단백질 및 클로닝된 N 로브에 대한 코딩 서열 이전의 TEV(담배 식각 바이러스) 절단 부위를 코딩하는 맞춤형 발현 벡터로 클로닝하였다. 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49로부터의 TbpB N 로브의 조작된 버전에 대한 발현 플라스미드를, lacZ 프로모터의 하류에 삽입된 T7 RNA 중합효소 유전자의 염색체 카피를 보유하는 이. 콜라이 발현 균주 ER256으로 형질전환시켰다. lac 프로모터의 글루코스 억제 및 락토스 유도를 활용하는 자가 유도 배지(55)를 사용하여 소규모 발현 분석을 수행하였다. 따라서, 배리로의 글루코스 대 락토스의 고유비율을 사용함으로써, T7 RNA 중합효소의 발현은 성장의 중간대수기에서 최적으로 개시된다. 세포를 비드 비터(beater)에 의해 밤샘 성장 후 용해시켜 세포를 용해시키고, 재조합 단백질을 Ni-NTA 수지 또는 돼지 Tf-세파로스 수지에 의해 포획하고 세척하고, 결합된 단백질은 SDS-PAGE 완충제 중에 용리되었다.
도 9에 예시된 바대로, 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49, 에이. 수이스 균주 H57 또는 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87로부터의 TbpB N 로브에서의 루프 감소는 안정한 단백질을 제조시켜서, N 로브의 전체 폴딩을 방해하지 않고, 면역화에 적합한 재료를 제공하였다. 상부 패널은 대조군으로서의 야생형 온전한 TbpB 및 TbpB N 로브에 의해 Ni-NTA 수지에 포획된 소규모 발현 실험에서 제조된 재조합 단백질을 나타낸다. 결과는, 이 야생형 단백질과 달리, 돌연변이체 단백질이 돼지 트랜스페린(Tf)에 더 이상 실질적으로 결합할 수 없다는 것을 또한 보여준다. 따라서, 중간 패널에서 조작된 N 로브가 돼지 Tf-세파로스에 의해 포획되지 않았다. 하부 패널에서, 상부 패널에 예시된 재료를 HRP 접합 돼지 트랜스페린을 사용하여 고상 결합 검정에서 사용하였고, 대조군과 달리, 조작된 N 로브는 임의의 결합 활성을 나타내지 않았다. 본 발명자들은 돼지인 네이티브 숙주에서 이 단백질의 면역원성이 증대될 것이라고 기대하였다. 따라서, 이 실시예는 TbpB 단백질의 N 로브에서의 항원상 가변 구역의 제거를 위한 전략이 실행 가능하고, 이러한 제거가 증대된 면역원성을 발생시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4 - 엔. 메닌기티디스 TbpB의 C 로브의 교차반응성
이 실시예는 본 발명에 따라 인간 병원균 나이세리아 메닌기티디스로부터의 TbpB의 조작된 유도체의 용도를 예시한다. 제1 단계로서, 본 발명자들은 엔. 메닌기티디스로부터의 TbpB의 다양성을 조사하였고, 본 발명자들이 교차반응성의 본 발명자들의 평가를 위해 TbpB의 대표적인 세트를 가질 것이라는 것을 보장하였다. 도 10은 나이세리아 박테리아 단리물 게놈 서열 데이터베이스(Neisseria Bacterial Isolate Genome Sequence Database)(BIGSDB http://pubmlst.org/neisseria/)(56)(41)로부터의 부가적인 서열과 함께 긴 시간 동안 세계적으로 수집된 엔. 메닌기티디스의 균주에서의 TbpB의 전체 다양성을 예시한다. 도 10a에서 화살표, 이중 화살표 또는 선으로 표시된 균주로부터의 TbpB(서열 번호 117; 서열 번호 123; 서열 번호 132 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 및 서열 번호 178)의 대표적인 세트에 대한 서열은 각각의 군에서 서열 다양성을 한정하기 위해 본원에 포함되었다. 엔. 메닌기티디스 TbpB의 4개의 주요 계통발생 그룹화가 존재한다. 1군은 아이소타입 I TbpB를 보유하는 균주를 포함한다. 아이소타입 I TbpB는 특징적으로 아이소타입 II TbpB(80-85kDa)와 비교하여 더 작은 TbpB(대략 65-70kDa)를 가진다. 다수의 서열 정렬에 의한 서열의 비교는 크기의 차이가 주로 아이소타입 II TbpB에서 더 큰 C 로브 때문이라는 것을 밝혀냈다. 아이소타입 II TbpB는 3개의 주요 계통발생 군(2 내지 4군, 도 10a)으로 클러스터링되었다.
TbpB C 로브의 서열 다양성을 예시하는 계통발생 나무(도 10b)는 C 로브 서열이 주로 2개의 TbpB 아이소타입의 확인을 담당한다는 결론을 지지한다. 도 10a에서의 2군의 구성원은 C 로브 계통발생 나무에서 함께 클러스터링되지 않지만, 도 10b에서 나무에 걸쳐 분포되어서, 2군이 N 로브 서열에 의해 주로 한정된다는 것을 나타낸다. 이것은, 면역학적 교차반응성이 진행되어 C 로브에 대한 반응성에 의해 결정되는 경우, 2군의 구체적인 대표가 필요하지 않을 것이라는 것을 나타낸다. 반대로, 전체 TbpB 다양성을 나타내기 위해 일련의 TbpB 서열을 확인하기 위해 사용된 화살표 및 선은 전체 C 로브 다양성을 적절히 나타내지 않아서, C 로브 다양성의 더 포괄적인 표시를 제공하도록 2개의 부가적인 균주를 선택하였다. 화살표, 이중 화살표 또는 선으로 확인된 균주로부터의 C 로브 서열은 서열 다양성의 대표적인 샘플을 제공하기 위해 본원에 포함되었다(서열 번호 87; 서열 번호 93; 및 서열 번호 147 내지 서열 번호 163).
엔. 메닌기티디스로부터의 TbpB를 표적화하는 백신이 엔. 고노레아에 대해 지향된 면역 반응을 유도하는지에 관한 질문을 해결하기 위해, 본 발명자들은 엔. 고노레아로부터의 TbpB 및 TbpB C 로브의 서열 다양성의 분석을 수행하였다. 엔. 메닌기티디스 연구로부터의 대표적인 TbpB 및 TbpB C 로브의 서열(도 10; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 서열 번호 117; 서열 번호 123; 서열 번호 132 내지 서열 번호 147; 서열 번호 177; 및 서열 번호 178)은 분석에서 포함되었다. 도 26a에 예시된 바대로, 엔. 고노레아 TbpB는 아이소타입 2 TbpB와 가장 밀접히 연관되고, 엔. 메닌기티디스 아이소타입 2 클러스터 내의 2개의 하위군을 형성한다. 이것은 바람직한 백신 항원으로서 재조합 TbpB의 부위 지정 돌연변이체를 사용하는 전략에 의해, 주로 메닝고코커스 TbpB로부터 유래된 항원에 의해 광범위한 교차보호성을 달성할 수 있다는 것을 제시한다. 도 26b는, 온전한 TbpB에 의한 상황과 반대로, 엔. 고노레아 TbpB C 로브가 엔. 메닌기티디스 C 로브로부터 구별되는 하위군이라는 것을 예시한다. 따라서, 광범위한 교차보호성을 제공하기 위해 C 로브를 사용하는 전략에 의해, 엔. 고노레아 균주로부터의 C 로브가 필요할 것이다.
교차반응성 항체 반응을 유도하는 절두된 TbpB 및 TbpB C 로브의 능력을 비교하기 위해, B16B6(도 10에서 검정색 화살표로 표시됨)인, 엔. 메닌기티디스 균주로부터 유래된 재조합 절두된 TbpB 및 TbpB C 로브를 면역학적 분석을 위해 선택하였다. 균주 B16B6으로부터의 재조합 절두된 TbpB 및 TbpB C 로브를 토끼를 면역화하도록 사용하였고, 본 발명자들의 새로운 ELISA 검정(도 5)을 이용하여 교차반응성에 대해 혈청을 시험하였다. 본원에 포함된 C 로브의 많은 서열이 N 로브에서 배럴 도메인의 마지막 베타 가닥의 말단 바로 후에 시작하여서, N 로브와 C 로브 사이의 링커 구역(L15, 도 2)을 포함한다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 따라서, 면역화 실험을 위해 L15 구역(B16B6 C 로브 내의 14개의 아미노산)을 제거하는 N 말단 절두를 가지는 안정한 기능적 C 로브를 제조할 수 있다.
계통발생 나무(검정색 및 회색 화살표, 도 10)에 걸쳐 분포된 균주로부터 유래된 대표적인 세트의 TbpB는 혈청의 교차반응성을 평가하기 위해 선택되었다. 2개의 이중 머리 화살표로 표시된 2개의 부가적인 TbpB는 더 완전한 커버리지(coverage)를 제공하기 위해 분석에 포함되지만, 분석의 시간에 입수 가능하지 않았다.
단백질은 N 말단 바이오티닐화된 서열을 가지는 본 발명자들의 맞춤형 발현 벡터에서 발현되었고, 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트에 적용되었다. 균주 B16B6로부터 유래된 절두된 TbpB 및 조작된 C 로브에 의해 면역화된 토끼로부터의 혈청을 일련의 TbpB 변이체를 인식하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 절두된 TbpB에 대한 항혈청은 상동성 TbpB(B16B6)에 대해 항-C 로브 항혈청보다 더 높은 역가를 가지고, 비상동성 균주(H44/76) 중 하나로부터의 TbpB에 대해 약간 더 높거나 동등한 역가를 가졌다. 그러나, 항-C 로브 항혈청은 모든 다른 비상동성 균주로부터의 TbpB에 대해 이 항-TbpB 항혈청보다 더 높은 항체의 역가를 가졌다. 따라서, C 로브는 온전한 TbpB보다 교차반응성 항체를 유도하는 이의 능력이 더 우수하다.
이 면역화 실험에서, 재조합 항원을 상기 기재된 바대로 제조하고 사용하여 20% 에물시겐 D(VSA) 아쥬번트 중의 50㎍의 정제된 항원을 사용하여 토끼(뉴질랜드 화이트, 3월령, 암컷)를 뒤 부위에서 피하로 면역화하였다. 토끼를 0, 3 및 6주에 면역화하였다.
본 발명자들의 맞춤형 고상 ELISA 검정에서 대표적인 단백질에 대해 8주에 취한 혈청을 시험하였다. ELISA 검정에서 사용된 재조합 융합 단백질을 상기 기재된 바대로 제조하였다. 맞춤형 ELISA 검정에서 시험된 재조합 단백질은 엔. 메닌기티디스 균주로부터의 온전한 TbpB(처음의 19 내지 36개의 아미노산이 소실)의 절두된 버전이었다; (ⅰ) B16B6(서열 번호 117), (ⅱ) H44/76(서열 번호 133), (ⅲ) S3131(서열 번호 132), (ⅳ) M990(서열 번호 134), (ⅴ) M978(서열 번호 135), (ⅵ) M992(서열 번호 138), (ⅶ) P3006(서열 번호 139), (ⅷ) 120M(서열 번호 137), (ⅸ) MC58(서열 번호 136) 및 (ⅹ) M982(서열 번호 123).
바이오티닐화된 융합 단백질을 위한 발현 벡터에 의한 소규모 밤샘 단백질 발현 실험으로부터의 미정제 추출물은 이전의 최적화 실험에 기초하여 ELISA 플레이트를 포화시키기에 충분하였다. 관심 있는 항혈청의 희석을 인산염 완충 식염수(PBST) 중의 2.5% 탈지유 중에 제조하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트에 적용하였다. 1차 항체를 실온에서 1시간 동안 1:100,000의 희석에서 HRP 접합 염소 항토끼 IgG에 의해 검출하고, 역가는 A450 > 0.3으로 마지막 희석의 역수로서 표시된다.
실시예
5 - 엔.
메닌기티디스
TbpB
C
로브의
이합체의
제조
도 11에서의 결과는 인간 병원균 엔. 메닌기티디스로부터의 TbpB C 로브 도메인이 온전한 TbpB에 대한 증대된 교차반응성 반응을 유도할 수 있다는 것을 예시한다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 안정한 및 면역원성인 2개의 C 로브를 포함하는 단일 폴리펩타이드를 생성할 수 있다는 것을 입증하였다. 2개의 C 로브는 TbpB의 2개의 아이소타입을 나타내는, 균주 B16B6 및 M982인, 항원상 다양한 TbpB를 가지는 균주 유래이다(도 10). 도 12의 패널 A는 실시예 4에 기재된 면역화 실험에 사용된 2개의 대표적인 TbpB C 로브(서열 번호 150)를 코딩하도록 작제된 단일 유전자를 예시한다. 도 12의 패널 B는 개별 성분 TbpB C 로브의 제제와 비교된 C 로브 이합체의 제조를 예시한다. 비교적 안정하게 보이는 C 로브 이합체의 합당한 수준의 제조가 있지만, 부가적인 정제가 면역화 실험에서의 사용 전에 필요할 것이다.
도 13은 엔. 메닌기티디스 균주 M982 및 B16B6로부터의 TbpB C 로브로 이루어진 이합체가 종 둘 다로부터의 온전한 TbpB에 대해 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 예시한다.
실시예 6 - 엔. 메닌기티디스의 C 로브로부터의 루프 구역의 감소.
이 실시예에서, 본 발명자들은 엔. 메닌기티디스의 C 로브로부터의 루프 구역을 실질적으로 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 감소는 다른 항원 또는 다른 병원균으로부터의 에피토프를 디스플레이하기 위한 편리한 '스캐폴드'로서 사용될 수 있고, 원하는 면역학적 특성을 추가로 나타낼 수 있는 큰 루프 구역이 결여된 유도체를 제공한다는 점에서 유용하다.
이 실시예에서, 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 C 로브 도메인의 루프 구역이 큰 가요성 루프 구역으로부터 전체 82개의 아미노산을 제거하도록 변형되었다. 큰 가요성 루프의 4개의 실질적인 감소를 가지는 네이티브 C 로브 및 조작된 C 로브의 구조 모델이 도 14의 패널 A에 예시되어 있다. 감소를 위해 표적화된 4개의 루프는 구조(3VE2.pdb)에 기초하여 단백질 결정학에서 해상되지 않아서, 루프의 입체구성에서 변형이 있다는 것을 나타내고, 이것이 패널 A에서 왼쪽에서의 모델에서 루프가 점선으로 표시된 이유이다.
루프 제거를 위한 전략은, 선택된 C 로브의 서열 정렬에서 서열 가변성을 평가하면서, 상세한 구조(3VE2.pdb)의 조사에 의해 개발되었다. 그러나, 구조를 가능하게 파괴하지 않으면서 루프 사이의 가장 효과적인 브릿지를 제공하는 것은 아미노산을 브릿징하는 것의 선택을 위한 우세한 기준이다. 네이티브 C 로브(서열 번호 125), 표적화된 루프의 각각이 결여된 조작된 유도체 및 모든 4개의 루프가 제거된 '루프무' C 로브(서열 번호 129)의 서열의 정렬이 도 14의 패널 B에 예시되어 있다.
중첩 연장 접근법(SOEing)(57)에 의한 스플라이싱을 이용하여, 개별 루프 결실 및 모든 4개의 루프가 제거된 '루프무' C 로브를 코딩하는 유전자를 제조하였다. SOEing 접근법을 엔. 메닌기티디스 M982로부터의 재조합 C 로브의 제조에 사용된 발현 플라스미드에서 수행하여서, 생성된 조작된 단백질의 안정성을 용이하게 평가할 수 있었다. 벡터는 N 말단 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질을 코딩하는 유전자 및 TbpB C 로브를 코딩하는 삽입된 유전자 전의 TEV(담배 식각 바이러스) 절단 부위를 코딩한다. 발현 플라스미드는 lacZ 유전자로 삽입된 T7 RNA 중합효소 유전자의 염색체 카피를 보유하는 이. 콜라이 발현 균주 ER2566로 형질전환되고, 따라서 lac 프로모터의 제어 하에 있다. 자가 유도 배지(55)를 사용하여 소규모 발현 분석을 수행하였다. 밤샘 성장 후, 세포를 수집하고 용해시키고, 원심분리 후의 상청액 분획을 Ni-NTA 수지에 적용하고 세척하고, 결합된 단백질은 SDS-PAGE 완충제 중에 용리되었다.
도 15에 예시된 바대로, 루프 18, 루프 21, 루프 23 또는 루프 27의 실질적인 감소를 가지는 재조합 C 로브의 수율은 네이티브 C 로브 단백질(WT)에 필적하여서, 개별 루프의 제거가 단백질 안정성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 도 15는 모든 4개의 루프에서의 81개의 아미노산의 제거가 제조된 단백질의 수준에 영향을 미치지 않는다는 것을 또한 보여주어서, 모든 4개의 루프의 제거가 C 로브의 전체 폴딩을 방해하지 않는다는 것을 보여준다. '루프무' C 로브가 용이하게 제조되고 우수한 분량으로 정제되고, 결정 구조가 정제된 '루프무' C 로브로부터 얻어진다는 것은 말할 필요가 없다. 이것은 조작된 항원이 상업 분야에 적합한 제조의 수준에서 실질적으로 안정한 형태로 용이하게 제조될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 실시예는 항원상 가변 구역의 제거를 위한 전략이 실현 가능하다는 것을 보여줄 뿐만 아니라, 코어 구조의 폴딩이 루프의 크기 및 성질에서 변형에 의해 영향을 받지 않으므로, 생성된 단백질이 에피토프 디스플레이 스캐폴드로서 적합할 수 있다는 것을 보여준다.
마지막으로, 도 16에 예시된 바대로, '루프무' C 로브(서열 번호 129, 마지막 2개의 막대)는 면역원성이고, 온전한(네이티브) TbpB 항원(서열 번호 123)에 대해 강한 항체 반응을 유도할 수 있다. 이 도면은 루프무 C 로브가 마우스에서 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 TbpB에 대해 원래의 TbpB C 로브(서열 번호 125) 항원보다 더 높은 항체의 역가를 실제로 유도한다는 것을 예시한다(도면에서 제3 막대와 제1 막대를 비교). '루프무' C 로브가, 서열이 꽤 분기한다(도 10)는 사실에도 불구하고, 균주 B16B6으로부터의 비상동성 TbpB에 대해 B16B6으로부터의 네이티브 TbpB C 로브와 유사한 수준의 항체를 유도한다는 관찰은 아주 놀랍다. 도 16에서의 제2 막대와 제4 막대의 비교는 이 2개의 단백질이 균주 B16B6으로부터의 온전한 TbpB에 대해 유사한 수준의 항체를 유도한다는 것을 예시한다.
이 실험에서, FvB 암컷 마우스를 0일, 21일 및 42일에 25㎍의 정제된 단백질 항원과 20% 에물리스겐에 의해 면역화하고, 56일에 취한 혈청을 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정을 이용하여 종점 역가에 대해 평가하였다. 각각 4마리의 마우스를 면역화하기 위해 B16B6 TbpB C 로브, M982 TbpB C 로브, 또는 변형된 M982 TbpB('루프무')를 사용하였다. 종점 역가를 바이오티닐화된 온전한 M982 또는 B16B6 TbpB 단백질에 대해 평가하였다. 역가를 1:100,000의 염소 항마우스 IgG H+L 퍼옥시다제 접합 항체에 의해 결정하였다. 종점 역가를 양성 신호가 확실히 검출되는 마지막 희석의 반대로서 결정하였다. 각각의 혈청을 3회 실행하고, 결과가 이 치료에 의해 모든 마우스의 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
실시예
7 -
TbpB
의 조작된 C
로브로의
TbpA
의 일부의 삽입.
이 실시예에서, TbpA인, 필수적 외부 막 단백질 트랜스페린 결합 단백질 A의 세포외 표면 루프의 분절을 코딩하는 DNA를 엔. 메닌기티디스 균주 M982로부터의 변형된 또는 '루프무' TbpB C 로브를 코딩하는 유전자로 스플라이싱하여서, 다양한 하이브리드 TbpA-TbpB 단백질을 코딩하는 유전자를 생성시켰다. TbpA의 선택된 구역을 TbpB C 로브 스캐폴드로 스플라이싱하는 이유는 이것이 온전한 TbpA 단백질보다 더 효과적인 제조 방식을 제공하고, 항체의 유도에 대해 TbpA의 표면 구역을 특이적으로 표적화하는 능력을 제공한다는 것이다.
실시예 6에 제조된 TbpB 폴리펩타이드(서열 번호 97)의 변형된 C 로브를 코딩하는 유전자를 시작점으로 사용하였다(도 14의 패널 A(중간 모델) 추가로 참조). TbpA의 상이한 표면 루프로부터의 분절을 코딩하는 DNA(도 17, 패널 A)를 더 큰 루프가 TbpB C 로브 폴리펩타이드로부터 제거된 부위(도 17, 패널 B)로 스플라이싱하였다. TbpA의 베타 배럴 세포외 루프 3, 10 및 11로부터의 일부(58)(패널 A에서 공간 충전되고 라벨링된 구역)를 조작된 TbpB C 로브의 변형된 루프 구역 18, 21 및 23(패널 B)으로 삽입하였다. 유사하게, TbpA-트랜스페린 구조에서 인간 트랜스페린의 C1 도메인과 C2 도메인에 삽입하는 N 말단 플러그 구역으로부터의 분절(플러그 루프, 패널 A)을 변형된 TbpB C 로브의 변형된 루프 27로 삽입하였다.
중첩 연장 접근법(SOEing)(57)에 의한 스플라이싱을 이용하여 TbpB C 로브에서의 TbpA 루프의 조립을 수행하였다. 엔. 메닌기티디스 M982로부터의 재조합 C 로브의 제조에 사용된 발현 플라스미드에서 SOEing 접근법을 수행하여서, 생성된 조작된 단백질의 안정성을 용이하게 평가할 수 있었다. 벡터는 N 말단 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질을 코딩하는 유전자 및 TbpB C 로브를 코딩하는 삽입된 유전자 전의 TEV(담배 식각 바이러스) 절단 부위를 코딩한다. 발현 플라스미드를 lacZ 유전자로 삽입된 T7 RNA 중합효소 유전자의 염색체 카피를 보유하는 이. 콜라이 발현 균주 ER2566으로 형질전환시키고, 따라서 lac 프로모터의 제어 하에 있다. 자가 유도 배지(55)를 사용하여 소규모 발현 분석을 수행하였다. 밤샘 성장 후, 세포를 수집하고 용해시키고, 원심분리 후의 상청액 분획을 Ni-NTA 수지에 적용하고 세척하고, 결합된 단백질은 SDS-PAGE 완충제 중에 용리되었다.
도 18의 패널 A에 예시된 바대로, 변형된 TbpB C 로브의 루프로의 외래 TbpA 분절의 삽입은 안정한 재조합 단백질의 제조를 발생시켰다. 도 18의 패널 A에 예시된 재조합 단백질은 N 말단 폴리히스티딘 태그, 말토스-결합 단백질 융합 파트너 및 TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위를 함유한다. 도 18의 패널 B는 TEV 프로테아제에 의한 절단에 의한 재조합 단백질 융합 파트너로부터의 야생형 및 돌연변이체 C 로브의 방출을 예시한다. 결과는 외래 단백질 분절의 삽입이 조작된 C 로브의 안정성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하여서, 외래 분절이 C 로브의 코어 구조 요소의 정상 폴딩을 방해하지 않는다는 것을 제시한다. 이 결과의 함축의미는 C 로브가 다양한 항원 및 항원 변이체로부터의 에피토프의 디스플레이에 궁극적으로 사용되는 외래 에피토프의 디스플레이를 위한 안정하고 다양한 단백질 스캐폴드인 것으로 보여서, 광범위하게 교차보호성인 면역 반응을 생성하는 능력을 가지는 조작된 항원을 생성하기 위한 부가적인 전략을 제공한다는 것이다.
마지막으로, 도 19에 예시된 바대로, 큰 루프가 감소하거나 제거된 구역으로 스플라이싱된 TbpA의 구역을 함유하는 변형된 TbpB C 로브는 면역원성이다. 이 도면은 하이브리드 TbpA-TbpB C 로브 단백질이 모 변형된('루프무') C 로브와 같거나 이보다 높은 항체 역가를 유도한다는 것을 예시한다. 특히, TbpA로부터의 루프 10 및 루프 11로부터의 구역을 디스플레이하는 단백질은 최고 역가를 가졌다(도 19에서 제2 막대 및 제3 막대).
이 실험에서, FvB 암컷 마우스를 0일, 21일 및 42일에 25㎍의 정제된 단백질 항원과 20% 에물리스겐에 의해 면역화하고, 56일에 취한 혈청을 본 발명자들의 맞춤형 ELISA 검정을 이용하여 종점 역가에 대해 평가하였다. 3마리의 마우스를 모든 4개의 루프가 제거된 '루프무' C 로브(서열 번호 97)에 의해 면역화하였다. 4개의 다른 하이브리드 항원의 각각에 의해 면역화하기 위해 5마리의 마우스를 사용하였다; (ⅰ) TbpB C 로브 루프 21로 삽입된 TbpA 루프 10을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 154), (ⅱ) TbpB C 로브 루프 23으로 삽입된 TbpA 루프 11을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 156), (ⅲ) TbpB C 로브 루프 27로 삽입된 TbpA 루프 3 나선을 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 158), 또는 (ⅳ) TbpB C 로브 루프 18로 삽입된 TbpA 플러그 루프를 가지는 '루프무' C 로브(서열 번호 160). 삽입된 모든 4개의 TbpA 루프를 디스플레이하는 변형된 M982 C 로브(서열 번호 131)의 바이오티닐화된 재조합 형태에 대해 혈청을 시험하였다. 역가를 1:100,000의 염소 항마우스 IgG H+L 퍼옥시다제 접합 항체에 의해 결정하였다. 종점 역가를 양성 신호가 확실히 검출되는 마지막 희석의 반대로서 결정하였다. 각각의 혈청을 3회 실행하고, 결과가 이 치료에 의해 모든 마우스의 평균 ± SEM으로 기재되어 있다.
실시예
8 -
TbpB
의 변형된 C
로브로의
LbpA
의 일부의 삽입.
이 실시예에서, 균주 MC58(서열 번호 162)로부터의, LbpA인, 필수적 외부 막 단백질 락토페린 결합 단백질 A의 세포외 표면 루프의 분절을 실시예 6에 기재된 엔. 메닌기티디스 균주 M982(서열 번호 129)로부터의 변형된 TbpB C 로브로 스플라이싱하였다. TbpB C 로브 스캐폴드로 LbpA의 선택된 구역을 스플라이싱하는 이유는 이것이 온전한 LbpA 단백질보다 더 효과적인 제조 방식을 제공하고, 항체의 유도를 위해 LbpA의 표면 구역을 특이적으로 표적화하는 능력을 제공한다는 것이다. 실시예 7과 관련하여, 본 발명자들은 하이브리드 단백질의 생성이 어떻게 엔. 메닌기티디스의 표면에 존재하는 3개의 상이한 단백질에 대해 면역 반응을 유도하는 기회를 제공하여서, 중요한 표적 단백질의 항원 변이체가 백신 항원에 대해 생성된 면역 반응의 영향을 탈출할 수 있는, 잠재적인 '백신 탈출(vaccine escape)'에 대한, 더 큰 장벽을 제공할 수 있는지를 예시할 수 있다.
LbpA에 이용 가능한 구조가 없으므로, 가장 적절한 모델을 획득하고자 하는 시도로 스위스 SWISS 모델, I-TASSER 및 PHYRE2의 3개의 웹 기반 단백질 예측 서버를 사용하여 LbpA의 구조 모델링을 수행하였다. 초기에, BLAST 조사는 공지된 TbpA 구조(58)에 의한 모델링을 위한 가장 적절한 LbpA를 발견하기 위해 수행되었고, 균주 MC58(서열 번호 130)로부터의 LbpA가 가장 적절하다는 것을 밝혀냈다. MC58 LbpA와 K454 TbpA의 정렬은 ClustalW에 의해 생성되고, SWISS 모델에서 정렬 모드를 위해 입력으로 제공되었다. PHYRE2에서, K454 TbpA 구조에 대한 PDB ID 및 MC58 LbpA의 FASTA 서열은 각각 주형 및 표적으로 제출되었다. MC58 LbpA의 FASTA 서열만이 I-TASSER로 제출되었다. 평균 제곱근 편차(root-mean-square deviation: RMSD)를 사용하여 이들을 Pymol(http://www.pymol.org/)에서 중첩한 후 주형 구조에 의해 생성된 상이한 모델의 유사성을 평가하였다. PHYRE2에 의해 생성된 LbpA 모델은 가장 적절한 모델로 선택되었고, 하이브리드 또는 키메라 단백질을 생성하기 위한 루프 구역을 선택하도록 사용되었다(도 20, 패널 A).
실시예 6에서 제조된 TbpB 폴리펩타이드의 '루프무' C 로브(서열 번호 129)를 시작점으로서 사용하였다. LbpA 세포외 루프 3 및 루프 2로부터의 구역을 코딩하는 DNA를 조작된 TbpB C 로브의 루프 18 및 21을 플랭킹하는 베타 가닥을 코딩하는 DNA 사이에 삽입하였다(도 20, 패널 B). Pymol을 사용하여 거리에 대해 삽입을 위한 TbpB C 로브에서의 루프 구역 및 LbpA에서의 상응하는 루프를 분석하여, LbpA 대체 루프가 이 루프에 의해 예측된 거리 매개변수 내에 맞도록 구조화되도록 보장하였다. TbpB C 로브에서의 LbpA 루프의 조립을 실시예 6 및 7에서처럼 SOE PCR을 사용하여 수행하고, 서열 분석은 루프무 M982 TbpB C 로브에서의 MC58 LbpA 나선 3 및 루프 2의 삽입을 확인시켜준다. 하이브리드 단백질의 설계는 LbpA 나선 3 구역(단백질 서열: 383-YGTDEAEKFRDKSGV)으로부터 M982 C 로브(서열 번호 166)의 루프 18 구역으로의 15개의 아미노산의 삽입, 및 LbpA 루프 2 구역(단백질 서열: LNRWVKERIEQL)으로부터 M982 C 로브(서열 번호 164)의 루프 21 구역으로의 11개의 아미노산의 삽입을 포함한다(도 20, 패널 B).
재조합 플라스미드의 형질전환 및 예비 발현 실험의 수행을 위한 방법은 실시예 7에 기재되어 있다. 예비 스크린은 재조합 단백질의 수율이 높고(하부 왼쪽, 패널 B, 도 20), 스캐폴드로서 사용된 네이티브 C 로브 또는 루프무 C 로브에 의한 결과(데이터 비도시)에 필적하거나 이보다 우수하다는 것을 입증한다. 명확하게, 결과는 외래 단백질 분절의 삽입이 조작된 C 로브의 안정성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 입증하여서, 외래 분절이 C 로브의 코어 구조 요소의 정상 폴딩을 방해하지 않는다는 것을 제시한다.
실시예
9 - 에이치. 인플루엔자의
TbpB
C
로브를
사용하는 접합체 구형 백신 분야를 위한 루프의 조작
현재까지 개발된 대부분의 접합체 구형 백신은 폴리사카라이드 구형 물질을 접합시기 위한 캐리어로서 독신 기반 백신 성분 중 하나를 사용하였다. 파상풍 또는 디프테리아 독소 또는 톡소이드에 구형 폴리사카라이드를 접합하는 전략에 몇몇 단점이 존재한다. 하나는 일상적 면역화에 사용된 백신에 또한 존재하는 운반 단백질에 대한 계속적인 노출로 인한 효과적인 면역 반응의 유도에 부정적으로 영향을 미치는 가능성(면역 관용의 발생)이다. 둘째는 캐리어가 병원균에 대한 자연 노출과 관련되지 않고, 따라서 병원균이 맞닥뜨려질 때 가장 관련된 T 세포 도움을 불러일으키는 이점을 완전히 취하지 않을 것이라는 것이다.
접합체 구형 백신은, 혈청형 또는 혈청군이라 보통 칭해지는, 특이적인 구형 폴리사카라이드를 발현하는 박테리아 병원균에 의해 감염을 예방하고, 사실 콜로니화를 방지하는 데 있어서 매우 성공적이다. 그러나, 백신에 의해 다뤄지지 않은 폴리사카라이드를 발현하는 균주에 의해 야기되는 질환을 결국 발생시킬 수 있는, 다른 폴리사카라이드 구형 유형을 발현하는 박테리아에 대해 본질적으로 교차보호성이 없다. 접합체 구형 백신에 의해 다뤄지는 폴리사카라이드 구형 유형의 스펙트럼을 확대할 이에 따른 필요성은 확대된 스펙트럼 백신의 계속하는 개발의 가망을 발생시키고, 궁극적인 해결책은 실질적인 교차보호성을 제공할 수 있는 단백질 기반 백신에 있다는 견해를 발생시켰다. 그러나, 광범위한 교차보호성을 유도할 수 있는 단백질 기반 백신이 개발되는 경우, 이것이 기존의 접합체 구형 백신을 대체하기 위해 수용될 것 같아 보이지 않는다. 이미 알려진 일상적인 면역화 스케줄에 대한 훨씬 또 다른 백신의 첨가는 단백질 기반 백신의 도입에 대한 가능한 장벽으로서 생각될 수 있다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 중요한 에피토프에서 라이신의 변형을 최소화하는 것으로 예측되는, 라이신 잔기인, TbpB C 로브의 나머지에서의 전체 수의 라이신을 실질적으로 배제한, 42개의 라이신 잔기를 함유하는 에이치. 인플루엔자로부터의 TbpB C 로브로 접합 루프를 조작하였는데, 왜냐하면 활성화된 탄수화물 모이어티와 반응하는 오직 이 라이신이 변형될 것이고, 탄수화물 대 단백질의 비율이 접합 과정 동안 제어될 수 있기 때문이다.
균주 H36으로부터의 조작된 에이치. 인플루엔자 TbpB C 로브를 코딩하는 유전자의 서열이 증가한 폰트 크기(12에 대해 14)(서열 번호 167)로 표시된 접합 루프를 코딩하는 DNA 구역으로 도 21의 패널 A에 예시되어 있다. 모델(59)로서 엔. 메닌기티디스 균주 MC58로부터의 LbpB에서 큰 음으로 하전된 루프를 사용하여 삽입의 부위 및 접합 루프의 서열을 설계하였다. 본질적으로, 주형으로서 LbpB 루프의 서열을 사용하고, 루프에서 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 대체하도록 라이신을 사용하였다. 루프 23의 위치에서 베타 가닥 22와 23 사이에 TbpB C 로브의 핸들 도메인으로 접합 루프를 조작하였다(도 2). 루프의 위치는 루프 23을 대체하는 (11개의 아미노산으로 이루어진) 훨씬 더 적은 루프에 의해 생성된 에이치. 인플루엔자 C 로브에 대한 구조 모델을 사용하여 도 21의 패널 B에 예시되어 있다. 삽입된 잔기는 공간 충전 구로서 예시되어 있다. 조작된 루프는 전체 C 로브(352개의 아미노산 잔기)의 크기의 ¼를 넘게 구성하는 91개의 아미노산으로 실제로 이루어지고, 루프는 전체 C 로브에서 강조된 잔기로서 기재되어 있고, 조작된 루프는 서열 번호 205에 기재되어 있다. 이것은 루프 도메인이 많은 수의 부가적인 아미노산을 수용할 수 있다는 것을 보여준다.
접합 구역의 포함은 N 로브 또는 C 로브의 루프 구역으로의 삽입으로 제한되지 않지만, 예를 들어 온전한 TbpB 또는 TbpB 로브의 N 말단에서 라이신 잔기의 클러스터를 포함함으로써 제공될 수 있었다.
실시예
10 -
TbpB의
표면 결합 루프에서 아미노산 치환을 생성하는 것 및 이의
Tf
결합 특성을 평가하는 것
기능적 및 면역학적 특성에 대한 영향을 조사하기 위해 TbpB 단백질의 표면 루프에서의 일련의 부위 지정 돌연변이체를 작제하였다. 변형에 대해 표면 노출된 아미노산을 표적화하기 위해, 본 발명자들이 X선 결정학 유도 구조를 가지는 TbpB에서 부위 지정 돌연변이를 만들었다(12, 13). 돼지 병원균 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 에이치. 파라수이스로부터 유래된 절두된 TbpB 단백질을 코딩하는 유전자로 돌연변이를 도입하기 위해 중첩 연장 중합효소 사슬 반응(SOE PCR) 접근법에 의한 스플라이싱을 이용하였다. 이것은 균주 H49(ApH49 TbpB, 서열 번호 2)로부터 유래된 에이. 플루로뉴모니아 TbpB20 -528(20-528번 아미노산), 및 ApH49 TbpB20 -528의 F171A 돌연변이체(서열 번호 4)를 포함하였다. 균주 H87(ApH87 TbpB, 서열 번호 12)로부터 유래된 에이. 플루로뉴모니아 TbpB26 -528(26-528번 아미노산) 및 Y95A 돌연변이체(서열 번호 14), Y121A 돌연변이체(서열 번호 16), Y174A 돌연변이체(서열 번호 18) 및 R179E 돌연변이체(서열 번호 20)가 또한 포함되었다. 균주 H57(AsH57 TbpB, 서열 번호 28)로부터 유래된 에이. 수이스 TbpB27 -577(27-577번 아미노산), F63A 돌연변이체(서열 번호 30) 및 F152A 돌연변이체(서열 번호 32)를 또한 생성하였다. 마지막으로, 나가사키 균주 Hp5(Hp5 TbpB, 서열 번호 115)로부터 유래된 에이치. 파라수이스 TbpB27 -577(27-577번 아미노산), Y93A 돌연변이체(서열 번호 170), Y117A 돌연변이체(서열 번호 172), Y167A 돌연변이체(서열 번호 174) 및 W176A 돌연변이체(서열 번호 176)를 또한 제조하였다.
폴리-히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 함유하는 N 말단 융합 파트너에 의해 초기에 재조합 단백질을 제조하였다. 이것은 본 발명자들이 니트로셀룰로스 막 및 효소로 라벨링된 돼지 트랜스페린을 사용하여 또는 돼지-세파로스 친화도 수지에 의해 미정제 추출물로부터 재조합 융합 단백질을 포획함으로써 고상 결합 검정에 적합한 재조합 단백질을 단리하게 한다(13). 이 검정을 이용하여, 네이티브 TbpB에 의한 강한 결합이 용이하게 관찰되지만, 많은 부위 지정 돌연변이체에 의한 결합이 감소하였다.
이 실험으로부터 돼지 Tf의 결합에 대해 반정량적 결합 상수를 도출할 수 있지만, 본 발명자들은 결합 친화도의 더 정확하고 정량적인 측정을 얻기 위해 다양한 상이한 생물물리 및 생화학 접근법을 이용하는 것을 선택했다. 도 22에 도시된 바대로, 등온 열량계, 표면 플라스몬 공명 또는 2중층 간섭법(23-25)을 사용하여, 네이티브 TbpB에 대한 친화도 상수(Kd)는, 결합 동역학이 다소 독특하고 120nM의 예측 Kd를 가지는 악티노바실루스 수이스로부터의 TbpB를 제외하고, 일반적으로 20 내지 60nM 범위이다(12).
돌연변이 중 몇몇, 예컨대 에이. 플루로뉴모니아 균주 H49로부터의 TbpB에서의 F171A 돌연변이, 에이. 플루로뉴모니아 균주 H87로부터의 TbpB에서의 Y174A 돌연변이 또는 에이치. 파라수이스 균주 HP5로부터의 TbpB에서의 Y167A 및 W176A 이중 돌연변이는 100배 이상 친화도 상수(Kd)를 증가시켰다. 이 돌연변이체가 모두 루프 8로 맵핑된다는 것을 주목하는 것이 흥미롭다.
실시예
11 - 표면 결합 루프에서 아미노산 치환을 가지는
TbpB의
유도체의 면역학적 특성의 평가
결합 Tf에서 결함이 있는 TbpB로부터 유도된 돌연변이체 단백질의 면역학적 특성을 시험하기 위해, 네이티브 숙주에서 이것을 시험하고, 바람직하게는 표적화된 병원균에 의한 감염으로부터 숙주를 보호하는 이의 능력을 직접적으로 시험하는 것이 중요하다. 따라서, 헤모필루스 파라수이스에 대한 널리 확립된 감염 모델에서 실험을 개시하였고, 이 모델에서 초유를 못 먹은 새끼돼지를 출생 후 28일에 시작하여 면역화하고, 63일에 헤모필루스 파라수이스에 의해 시험감염하였다(37, 60). 이 감염 모델에서, 시험감염 균주(포르실리스 글라서)로부터 유래된 상업용 백신은 사망으로부터 완전한 보호를 제공하고, 트랜스페린 수용체의 재조합 형태는 시험감염 후 15일에 이전에 20-30% 생존율을 제공하였다.
5마리 또는 6마리의 돼지의 군을 Hp5 시험감염 균주로부터의 재조합 온전한 TbpB, 부위 지정 Y167A TbpB 단백질, 포르실리스 글라서 백신 또는 아쥬번트 단독에 의해 면역화하였다. 돼지를 표준 108 시험감염 용량의 에이치. 파라수이스 Hp5(나가사키) 균주에 의해 시험감염하고, 15일 기간 동안 모니터링하였다. 도 23에 예시된 바대로, 대조군 포르실리스 글라서 백신에 의해 면역화된 5마리의 중 오직 1마리의 돼지가 시험감염에 생존하여서, 이 실험에서 Hp5 균주의 더 독성인 변이체가 사용된다는 것을 제시한다. 감염된 돼지로부터의 균주의 단리물에 의한 추적관찰 실험은 더 낮은 생존율을 가져서, 이 결론을 지지한다. 시험감염 균주의 증대된 독성에도 불구하고, Y167A TbpB에 의해 면역화된 모든 6마리의 돼지가 15일에 생존하였고, 6마리 중 5마리의 돼지가 증상이 거의 없거나 없고, 부검에서 병리학이 거의 관찰되지 않았거나 않았다. 이 보호의 수준은 야생형 단백질에 의해 면역화된 6마리의 돼지와 대조적이고, 여기서 오직 3마리의 돼지가 시험감염에 생존하였다. 3마리의 생존한 돼지가 시험감염 후 상당한 임상 증상을 가지고, 부검 시 뚜렷한 병리학을 나타냈다. 요약하면, 이 실험은 Y167A TbpB 돌연변이체 단백질이 야생형 단백질과 비교하여 더 우수한 보호성 면역학적 반응을 유도하고, 2개의 단백질이 트랜스페린 결합 특성을 제외하고 실제로 동일하므로(도 22), 네이티브 단백질에 의한 차선 면역 반응이 숙주 트랜스페린의 결합에 기인할 수 있다는 것을 예시한다.
돌연변이가 면역 반응에 대해 가지는 영향의 추가의 증거를 제공하기 위해, B 세포 및 T 세포 반응을 평가하였다. (2회 면역화 후) 시험감염 직전에 및 시험감염 후 96시간에 취한 혈액 샘플을 후천성 면역 반응에 대해 분석하였다. 성숙 B 세포(αIgM+CD21+) 및 T 헬퍼 세포(CD4+CD8α-) 하위세트에 대한 FACS 분석에 의해 샘플을 평가하였다. 도 24에서의 결과는 시험감염 전에 Y167A 돌연변이체 TbpB 항원이 네이티브 TbpB 항원 또는 상업용 포르실리스 글라서 백신보다 더 강한 B 세포 반응(패널 A) 및 T 헬퍼 세포 반응(패널 B)을 유도한다는 것을 입증한다. 시험감염 후 96시간에 돌연변이체 TbpB에 대한 반응(51.48% ± 1.18%)은 네이티브 TbpB(45.65% ± 1.20%) 또는 PG 백신(44.83% ± 1.59%)에 대한 반응보다 상당히 더 높았다(도 24, 패널 C). T 헬퍼 세포 반응에서 유사한 경향이 관찰되었지만, 3개의 군 사이의 백분율의 차이는 덜 명확하다(도 24, 패널 D). 그러나, 96시간 후 네이티브 TbpB 또는 포르실리스 글라서 백신에 의해 면역화된 군에서 오직 3/6 및 2/5의 돼지가 생존하였고, 낮은 반응자들은 이전에 죽는 경향이 있는 것들이므로, 96시간 시점에서의 군 사이의 관찰된 차이는 실제로 과소평가이다.
실시예
12 -
TbpB의
유도체에 대해 지향된 면역 반응은
콜로니화를
방지할 수 있다
감염 모델이 백신의 잠재적인 효율을 평가할 기회를 제공하지만, 이것은 좀처럼 천연 감염성 과정을 모방하지 않고, 여기서 병원균의 전파는 보통 감염의 확립 전에 숙주 상부 호흡기의 콜로니화를 발생시킨다. 접합체 구형 백신은 뇌수막염, 폐렴을 예방하도록 설계되고, 침습적 감염은 상부 호흡기로부터 표적화된 박테리아를 제거하여(17), 비면역화된 개체를 보호하는 집단 면역의의 부가적인 이점을 제공하는 것으로 나타났다. 콜로니화를 방지하는 능력은 이후로 백신 실행을 결정하는 데 중요한 특징이 된다(18). 따라서, 콜로니화를 방지하는 백신을 설계하는 것이 신중할 수 있어서, 감염을 예방하는 것에 덧붙여 이것은 질환 야기 병원균의 저장소를 제거할 수 있다.
엔. 메닌기티디스 및 인간 CEACAM 수용체의 상호작용을 규명하는 이전 연구의 이점을 취하면서(61), 본 발명자들은 나이세리아 메닌기티디스에 의한 콜로니화를 지지할 수 있는 형질전환 인간화 마우스 모델을 개발하였다(62). 이 모델은 나이세리아 메닌기티디스 Opa 단백질과 인간 CEACAM1 수용체의 특이적인 상호작용에 기초하고, 이 상호작용을 천연으로 또는 인공으로 이용하는 다른 병원균에 잠재적으로 연장될 수 있었다. 메닝고코커스 C군 접합체 구형 백신에 의한 형질전환 마우스의 면역화는 콜로니화 모델에서 살균 점막 면역력을 발생시키거나, 또는 즉 다른 구형 유형을 가지는 균주에 의해서가 아니라 C군 나이세리아 메닌기티디스에 의한 콜로니화를 방지하였다.
엔. 메닌기티디스에 의한 콜로니화를 방지하는 TbpB 및 이의 유도체의 능력을 시험하기 위해 이 모델을 사용하였다. 면역화 단계 동안 이 마우스에 존재하는 인간 트랜스페린이 없으므로, 실시예 11에 기재된 바대로 조작된 비결합 TbpB를 사용하는 것이 필요하지 않았다. 도 25a에 예시된 바대로, 재조합 절두된 TbpB에 의해 면역화된 9마리 중 8마리의 마우스는 1 x 107 CFU의 엔. 메닌기티디스 균주 M982에 의한 비강 시험감염 후 3일에 검출 가능한 수준의 엔. 메닌기티디스를 가지지 않았다. 아쥬번트 단독에 의해 치료된 대조군 마우스에서, 8마리 중 6마리의 마우스는 존재하는 검출 가능한 수준의 엔. 메닌기티디스를 가졌다. 이것이 콜로니화를 방지할 수 있는 것으로 나타난 제1 단백질 항원이고, 이 특징이 관여된 기전의 본 발명자들의 제한된 이해로 인해 표면 단백질 항원에 일반적인 것으로 추정될 수 없다는 것은 말할 필요도 없다.
추적관찰 실험에서, 본 발명자들은 TbpB를, 2개의 백신에서 중요한 성분인, H 인자 결합 단백질인, 또 다른 표면 리포단백질, 및 개별 TbpB 하위도메인과 비교하였다. 도 25b에 예시되 바대로, C 로브는 온전한 TbpB 또는 TbpB N 로브만큼 또는 이보다 더 우수하게 콜로니화를 방지할 수 있어서, 결국 이 실험에서 살균 면역을 유도하는 데 있어서 H 인자 결합 단백질만큼 효과적이거나 이보다 더 효과적이었다. 전신 면역화에 의해 살균 점막 면역을 유도하는 TbpB C 로브의 능력은, 이것이 네이티브 숙주에서 동등하게 효과적일 것이고, 교차반응성인 면역 반응을 유도하는 이의 증대된 능력(도 3, 도 11)이 광범위하게 교차보호성인 백신의 개발을 수월하게 할 것이라는 것을 의미하면서, 이의 Tf 결합의 결여로서 특히 유망한 발견이다.
이전에 기재된 바대로 콜로니화 연구를 수행하였다(62). 인간 CEACAM-1 전이유전자를 발현하는 8마리 이상의 C57/Bl6의 군(인하우스 번식)은 0일 및 21일에 피하로 100㎕의 지정된 면역화를 받았다. 군은 주사마다 100㎕의 용적으로 지정된 단백질(25㎍) 또는 무균 인산염 완충 식염수(PBS)(Gibco) 중에 희석된 20% 에물시겐 D(MVP Laboratories)와 아쥬번트화된 비단백질 대조군을 받았다.
35일에, 마우스를 이소플루란(Baxter)에 의해 마취시키고, 2회 동물 계대배양된 엔. 메닌기티디스 균주 M982에 의한 비강 주입을 통해 접종하였다. 접종원을 제조하기 위해, 감염을 위한 박테리아 균주를 GC 한천(Beckton Dickinson)에서 밤새 성장시키고; 성장의 밤샘 면포(lawn)를 1mM의 MgCl2(PBS/Mg)를 함유하는 1㎖의 PBS로 수확하고, OD600을 측정하여 박테리아의 수를 조정하였다. 배양을 조정하여 각각의 최종 10㎖의 접종원은 대략 1 x 107의 콜로니 형성 단위를 함유하였다. 콜로니화 용량의 밀도는 GC 한천에서 연속 희석 도말을 통해 확인되었다.
감염 후 3일(38일)에, 마우스를 이산화탄소 질식에 의해 마취시켰다. 250㎕의 PBS/Mg에 의한 기관 세척, 이어서 500㎕의 PBS/Mg 중에 재현탁된 폴리에스터가 묻혀진 어플리케이터(푸리탄 메디칼 프로덕츠(Puritan Medical Products))에 의한 비강 통로의 직접적인 면봉 문지름에 의해 콜로니화의 부담을 평가하였다. 샘플을 VCNT 저해제(Becton Dickinson)가 보충된 GC 한천에서 밤샘 성장 후 나열하여서 비강 세균총의 성장을 방지하였다. 토론토 대학교(University of Toronto)의 동물 윤리 심의 의원회(Animal Ethics Review Committee)에 따라 동물 실험을 수행하였다.
실시예 13 - TbpB 또는 이의 일부의 혼합물을 포함하는 백신 제제
TbpB를 보유하는 병원균이 배타적으로 이의 특이적인 숙주(인간, 돼지, 소 및/또는 관련 반추동물)에서 있고, TbpB가 콜로니화를 방지할 수 있으므로(도 25), TbpB를 표적화하는 조작된 항원에 기초한 광범위하게 교차보호성인 백신은 병원균을 제거할 가능성을 가진다.
TbpB인, 그람 음성 병원균, 또는 이의 일부의 스펙트럼에 대한 백신 제제의 효율을 확대하기 위해, 상이한 박테리아 종 또는 균주로부터 얻은 예를 들어 C 로브 도메인을 조합할 수 있다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 백신 제제의 제조에서 사용하기 위한 TbpB 폴리펩타이드 또는 이의 조합의 바람직한 조합을 제공한다.
TbpB 폴리펩타이드의 효율적인 조합을 확인하는 것에 있어서의 하나의 중요한 고려는 상이한 균주, 종 및 속이 tbpB 유전자를 용이하게 교환할 수 있는 정도(따라서, 백신에 의해 다뤄지지 않는 TbpB 변이체에 대한 잠재적인 저장소로서 작용함)이다. tbpB 유전자의 수평 교환에 영향을 미치는 중요한 인자 중 하나는 이 천연으로 형질전환 가능한 종에 본래 존재하는 유입 신호 서열(USS)의 성질이다(63, 64). 이 박테리아는 특이적인 USS를 함유하는 DNA를 우선적으로 흡수하고 이것을 이의 게놈으로 통합하여서, 이의 표면 항원의 항원 변이체를 통합하기 위한 매우 효과적인 기전을 제공한다.
나이세리아 메닌기티디스의 경우에, 본 발명자들은 전체 서열 다양성을 적절히 나타내는 광범위한 균주 수집을 가진다(도 10a). 서열 다양성의 매우 포괄적인 이해를 나타내는 이 병원균에 대해 공중 데이터베이스에서 입수 가능한 세계도처로부터의 서열의 대형 수집이 특히 존재한다. TbpB를 보유하고 보통 인간 상부 호흡기에 있는 다른 인간 병원균(헤모필루스 인플루엔자, 모락셀라 카타르할리스)이 이의 게놈 DNA에서 나이세리아에 특이적인 USS를 함유하지 않으므로, 이것은 항원 변이체에 대한 준비된 저장소를 구성하지 않는다. 따라서, 본 실시예는 도 10a에 도시된 2개의 상이한 계통발생 클러스터로부터 선택된 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 얻은, 적어도 2개의 TbpB 폴리펩타이드 또는 이의 일부(예를 들어, C 로브 도메인)를 포함하는, 조작된 TbpB 항원의 조합을 포함하는 백신 제제를 포함한다. 이러한 백신 제제는 교차반응성(도 11) 및 교차보호성 항체 반응을 잠재적으로 유도할 수 있고, 인간 집단으로부터의 엔. 메닌기티디스를 제거하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있었다.
보통 인간 비뇨생식관에 있는, 엔. 고노레아인, 관련 병원균은 동일한 USS를 공유하여서, 동일한 점막 표면에서 이들 2개의 종의 때때로의 존재로 인해 잠재적으로 항원 변형에 대한 저장소로서 작용할 수 있었다. 그러나, 엔. 메닌기티디스에서의 다양성에 대한 고노코커스 TbpB의 서열 다양성의 분석(도 26a)은 이들이 대부분 엔. 메닌기티디스에 존재하는 서열 다양성의 하위세트라는 것을 나타내고, 본 발명자들의 접근법의 약간의 연장에 의해 일련의 조작된 항원이 어느 한 병원균에 의한 콜로니화를 잠재적으로 제거할 수 있는 백신에 사용된다는 가능성을 발생시킨다. 조작된 C 로브(도 26b)의 경우, 이것은 엔. 고노레아 TbpB 변이체를 특이적으로 표적화하는 C 로브의 포함을 수반할 것이다. 공생 나이세리아 단리물 중 몇몇에서의 TbpB의 존재는 항원 변이체에 대한 또 다른 잠재적인 저장소를 나타내고, 따라서 공생 나이세리아로부터의 대표적인 변이체를 포함하는 본 발명자들의 접근법의 연장은 질환을 야기할 수 있는 나이세리아를 발현하는 TbpB를 효과적으로 제거하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 본 실시예는, 나이세리아 메닌기티디스 TbpB 폴리펩타이드 또는 이의 일부(예를 들어, C 로브 도메인), 및 나이세리아 고노레아 TbpB 폴리펩타이드 또는 이의 일부(예를 들어, C 로브 도메인)를 포함하는, 조작된 TbpB 항원의 조합을 포함하는 백신 제제를 포함한다.
돼지 병원균 에이. 플루로뉴모니아, 에이. 수이스 및 에이치. 파라수이스는 동일한 USS를 공유하고, 그 결과, TbpB 서열 다양성은 3개의 종 중에 분포되어서(도 4), 주요 계통발생 클러스터는 적어도 2개의 종으로부터의 대표를 가진다. 따라서, 이들 병원균에 대한 TbpB 기반 백신을 개발할 때 모든 3개의 종에서 전체 TbpB 서열 변형을 고려하는 것이 중요하다. 이것은 하나 초과의 종으로부터의 항원에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 조작된 항원을 개발하는 본 발명자들의 다소 독특한 접근법에 대한 기본토대이고(도 6, 도 7), TbpB가 콜로니화를 방지할 수 있으므로, 돼지 숙주로부터의 모든 3개의 병원균을 제거하기 위해 사용될 수 있는 접근법을 이용하는 것이다. 따라서, 본 실시예는, 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로부터 얻어진, 적어도 2개의 TbpB 폴리펩타이드 또는 이의 일부(예를 들어, C 로브 도메인)를 포함하는, 조작된 TbpB 항원의 조합을 포함하는 백신 제제를 포함한다.
헤모필루스 인플루엔자와 관련하여, b형 폴리사카라이드 캡슐을 보유하는 균주 및 폴리사카라이드 캡슐이 결여된 유형 구별 불가 균주에 의해 야기된 질환의 명확하게 상이한 스펙트럼은 각각의 군을 별개로 표적화하는 백신에 대한 관심을 촉발한다. A군 폴리사카라이드 캡슐을 발현하는 균주로 인한 침습적 질환의 최근의 증가는 A군 균주를 표적화하는 백신의 개발에 대한 고려를 촉발한다(65). 에이치. 인플루엔자의 균주에서의 TbpB 다양성의 평가는 3개의 주요 계통발생 클러스터(도 27a)가 존재한다는 것을 나타내고, 유형 구별 불가 균주는 모든 3개의 군 중에 분포된다. 에이치. 인플루엔자의 모든 균주가 동일한 USS를 공유하므로, TbpB 다양성의 분포는 구형 유형에 의해 영향을 받지 않을 것이고, TbpB 기반 조작된 항원으로부터 유래된 교차보호성 백신의 개발은 b형 균주, 유형 구별 불가 균주 및 다른 구형 유형을 발현하는 균주를 효과적으로 표적화할 것이다. 따라서, 본 발명자들의 접근법은 독립형 백신으로서, 또는 접합체 구형 백신에 대한 캐리어로서 에이치. 인플루엔자에 대해 광범위하게 보호성인 TbpB 기반 백신의 개발을 수월하게 해야 한다(도 21). 따라서, 본 실시예는, 도 27a에 기재된 2개의 상이한 계통발생 클러스터로부터 선택된 에이치. 인플루엔자 균주로부터 얻어진, 적어도 2개의 TbpB 폴리펩타이드를 포함하는, 조작된 TbpB 항원의 조합을 포함하는 백신 제제를 포함한다.
나이세리아 메닌기티디스 및 헤모필루스 인플루엔자와 달리, 모락셀라 카타르할리스 균주의 게놈에 존재하는 명확한 USS가 없지만, 이들은 엠. 카타르할리스 DNA에 대한 강한 선호도로 천연으로 형질전환 가능하다. 따라서, 엠. 카타르할리스에 대해 TbpB를 표적화하는 조작된 항원에 의한 광범위하게 교차보호성인 백신의 개발은 엠. 카타르할리스로부터의 TbpB의 다양성을 오직 고려할 필요가 있다(도 29). 3개의 주요 군을 구성하는 균주로부터 유래된 항원은 엠. 카타르할리스에 의한 콜로니화를 방지할 수 있는 광범위하게 교차보호성인 백신을 유도하기에 충분해야 한다. 따라서, 본 실시예는, 도 29에 기재된 2개의 상이한 계통발생 클러스터로부터 선택된 엠. 카타르할리스 균주로부터 얻어진, 적어도 2개의 TbpB 폴리펩타이드를 포함하는, 조작된 TbpB 항원의 조합을 포함하는 백신 제제를 포함한다.
이전에 파스퇴렐라 헤몰리티카로서 공지된, 소 병원균 만헤미아 헤몰리티카는 소에서의 소 호흡기 질환(수송열) 및 양에서의 호흡기 감염의 주요 원인이다. 2개의 종 만헤미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시로 재분류화되는, 파스퇴렐라 트레할로시인, 양 병원균은 만헤미아 헤몰리티카와 USS를 공유한다. 이것은 이들 종이 공통 유전자 풀을 공유한다는 발견에 주로 원인이 될 수 있다(66). 소 병원균과 반대로, 이전에 헤모필루스 솜누스로서 공지된, 히스토필루스 솜니는 구별되는 USS를 가지고, 따라서 엠. 헤몰리티카에 대한 항원 변이체의 저장소가 아니다. 소 또는 양으로 주로 제한되는 변이체의 클러스터를 가지는, 양 및 소의 병원균을 명확히 포함하는(66)(도 28), 엠. 헤몰리티카, 엠. 글루코시다 및 비. 트레할로시로부터의 TbpB의 3개의 주요 계통발생 혈통이 존재한다. 따라서, 소, 양 또는 반추동물 종 둘 다에서 질환을 표적화하는 TbpB 유래 조작된 항원의 발생을 고려할 수 있다. 따라서, 본 실시예는, 도 28에 기재된 2개의 상이한 계통발생 클러스터로부터 선택된 만헤이미아 헤몰리티카, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시 균주로부터 얻어진, 적어도 2개의 TbpB 폴리펩타이드를 포함하는, 조작된 TbpB 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 C 로브 도메인의 조합을 포함하는 백신 제제를 포함한다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 그 전문이 참조문헌으로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 1
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tatttaaacg acgattatta tactaaattt ataggtaaac gggtgggctt ggtttcggga 600
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65 70 75 80
Lys Val Asp Ile Ser Asp Ile Glu Val Ile Thr Asn Gly Asn Leu Asp
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Asp Val Pro Tyr Lys Ala Asn Ser Ser Lys Tyr Asn Tyr Pro Asp Ile
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Lys Thr Lys Asp Ser Ser Leu Gln Tyr Val Arg Ser Gly Tyr Val Ile
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Leu Thr Asn Phe Ser Ile Ser Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 4
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Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
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Arg Pro Asn Lys Thr Thr Gly Val Ser Lys Glu Glu Tyr Lys Asp Val
35 40 45
Glu Thr Ala Lys Lys Glu Lys Glu Gln Leu Gly Glu Leu Met Glu Pro
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Ala Leu Gly Tyr Val Val Lys Val Pro Val Ser Ser Phe Glu Asn Lys
65 70 75 80
Lys Val Asp Ile Ser Asp Ile Glu Val Ile Thr Asn Gly Asn Leu Asp
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Asp Val Pro Tyr Lys Ala Asn Ser Ser Lys Tyr Asn Tyr Pro Asp Ile
100 105 110
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Lys Arg Val Gly Leu Val Ser Gly Asp Ala Lys Pro Ala Lys His Lys
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210 215 220
Lys Leu Ser Asp Lys Glu Lys Thr Ile Tyr Thr Val Asn Ala Asp Ile
225 230 235 240
Arg Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ser Asp Lys Asn Lys
245 250 255
Gly Lys Gly Glu Ser Tyr Asn Phe Phe Ser Ala Asp Ser Gln Ser Leu
260 265 270
Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe
275 280 285
Val Ala Asn Asp Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ser Ala Lys His Asn
290 295 300
Gly Ser Asn Val Asp Thr Val Arg Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile Asp
305 310 315 320
Leu Thr Asn Phe Ser Ile Ser Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser
325 330 335
Val Leu Ile Ile Asp Gly Lys Lys Ile Lys Leu Ala Gly Ser Gly Phe
340 345 350
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<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 6
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Ser Gly Ser Ser Arg Tyr Glu Asn Val Lys Phe Asn Asp Val Ala Val
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Ser Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Thr Ala Ala Glu Leu Gly Gly Gln Phe
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<212> DNA
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<400> 7
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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180 185 190
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aataagaaat tgaatggtca gttacttact aaaacaaaag aaaatcaaga aaaattacgc 720
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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Lys Ala Val Glu Pro Glu Lys Thr Lys Val Asn Tyr Thr Asp Glu Glu
20 25 30
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Leu Gly Tyr Val Thr Lys Ile Pro Val Asn Ile Pro Ser Val Arg Lys
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Val Pro Asn Glu Asp Lys Leu Arg Thr Ile Ala Asn Glu Asn Tyr Gly
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Val Tyr Tyr Lys Gly Val His Pro Ser Lys Glu Leu Pro Lys Gly Asn
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Ile Ile Val Tyr Gln Gly Glu Trp Asp Phe Thr Ser Asn Ala Asp Leu
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<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 26
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Val Gly Pro Gly Ser Glu Ile Ser Glu Ile Asp Thr Val Thr Asp Glu
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Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Val Val Asn Ser Gly Tyr Thr Ile Asp
35 40 45
Val Val His Tyr Gly Leu Arg Asp Lys Gly Ser Val Ser Tyr Lys Gly
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Val Ala Cys Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp
420 425 430
Gln Lys Glu Gly Lys Gln Gln Val Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln
435 440 445
Gly Glu Arg Thr Ala Thr Asp Lys Met Pro Ala Gly Gly Asn Tyr Lys
450 455 460
Tyr Val Gly Thr Trp Asp Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp Ile
465 470 475 480
Ala Glu Ala Asp Asn Asn Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp
485 490 495
Val Asn Phe Ser Asp Lys Lys Val Asn Gly Lys Leu Phe Asp Lys Gly
500 505 510
Gly Val Asn Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly
515 520 525
Phe Ile Gly Ser Ala Lys Thr Ser Asp Ser Gly Phe Ala Leu Asp Ala
530 535 540
Gly Ser Ser Gln His Gly Asn Ala Val Phe Ser Asp Ile Lys Val Asn
545 550 555 560
Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Glu Leu Gly Gly Gln Phe His
565 570 575
His Lys Ser Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala
580 585 590
<210> 33
<211> 730
<212> DNA
<213> Actinobacillus suis
<400> 33
tgaaaacggc gagacgacca cagaacgaat cattgatgca actaaaattg atttaaccca 60
atttaatgct aaagaactca acaattttgg tgatgcctct gttttaatta ttgatggaca 120
aaaaatagat ctagcaggtg tcaattttaa aaatagtaaa acggttgaaa tcaacggcaa 180
aacaatggta gccgtagctt gctgtagtaa tctggaatat atgaaatttg gtcaattgtg 240
gcaaaaagag ggcaaacaac aagttaaaga taatagttta ttcctacaag gtgaacgtac 300
tgcaacggat aaaatgcccg caggaggtaa ctataagtat gttggaactt gggatgcact 360
cgtatctaaa gggacgaact ggatagcgga agcagataat aatcgagaat cgggctatcg 420
cactgaattt gatgttaatt ttagtgataa aaaagtaaac ggtaagttat ttgataaagg 480
cggtgtaaat cctgtattta ccgtagatgc gacaattaat ggtaatggct ttatcggcag 540
tgcgaaaacc tctgatagtg gctttgcttt agatgcaggc tctagccaac acggaaatgc 600
ggtatttagt gatataaaag tcaatggtgg cttctatggt ccaaccgctg gagaacttgg 660
cggacaattc catcataaat cagacaatgg cagtgttggc gctgtctttg gtgcaaaacg 720
acaaatagaa 730
<210> 34
<211> 240
<212> PRT
<213> Actinobacillus suis
<400> 34
Ser Glu Asn Gly Glu Thr Thr Thr Glu Arg Ile Ile Asp Ala Thr Lys
1 5 10 15
Ile Asp Leu Thr Gln Phe Asn Ala Lys Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp
20 25 30
Ala Ser Val Leu Ile Ile Asp Gly Gln Lys Ile Asp Leu Ala Gly Val
35 40 45
Asn Phe Lys Asn Ser Lys Thr Val Glu Ile Asn Gly Lys Thr Met Val
50 55 60
Ala Val Ala Cys Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu
65 70 75 80
Trp Gln Lys Glu Gly Lys Gln Gln Val Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu
85 90 95
Gln Gly Glu Arg Thr Ala Thr Asp Lys Met Pro Ala Gly Gly Asn Tyr
100 105 110
Lys Tyr Val Gly Thr Trp Asp Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp
115 120 125
Ile Ala Glu Ala Asp Asn Asn Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Thr Glu Phe
130 135 140
Asp Val Asn Phe Ser Asp Lys Lys Val Asn Gly Lys Leu Phe Asp Lys
145 150 155 160
Gly Gly Val Asn Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Thr Ile Asn Gly Asn
165 170 175
Gly Phe Ile Gly Ser Ala Lys Thr Ser Asp Ser Gly Phe Ala Leu Asp
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Gln His Gly Asn Ala Val Phe Ser Asp Ile Lys Val
195 200 205
Asn Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Glu Leu Gly Gly Gln Phe
210 215 220
His His Lys Ser Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys
225 230 235 240
<210> 35
<211> 1050
<212> DNA
<213> Actinobacillus suis
<400> 35
atgcatttta aacttaatcc ctatgcgtta gcgtttactt cgctgtttct tgtcgcttgt 60
tctggcggaa aaggaggttt tgatttagaa gatgttcggc caaatcaaac tgcaaaagca 120
gaaaaagcaa caacctctta tcaagatgag gaaacgaaga aaaagacaaa ggaagaatta 180
gataagttga tggagcctac tttgggagtt gaggcaaaga tacctcgccg gaatagagct 240
ttatttgata aagaaggaaa tcgaaaagca acacctgata caactgatga attatctgaa 300
gcacaaatta tggcgatttg gaatgaaaat atagatgaaa ttcctcactt gaaagagtta 360
aacgataaaa caacgagtgg tttaatttat cactctcacg atggtaaaca ggaggacaaa 420
aaacgaaatt tacaatatgt gcgttcaggc tatgttttcg atgaatctta tagtgaaata 480
gtaaaaaata agaatggtgt accctatatt tttaaaaatg ggatcgatgg ttacatttac 540
tatttaggga caagcccgtc aaaagaactc cctaaaggaa ataaagttac ctataaaggt 600
acttgggatt tcaccagcga tgttaaaaca agctacgagt taagtggatt tagtgatgct 660
ggtaatggta aaaatgttgc agctacatct atttcggata atgtcaatcg agatcataaa 720
gttggtgaaa aactaggtga taatgaagtt aaaggggtag ctcattctag tgaatttgca 780
gtagattttg ataacaaaaa attgacaggt agtttatatc gtaatggtta tatcaacaga 840
aataaagcgc aagaagtaac gaaacgctat agcattgaag ctgatataac aggcaaccgg 900
tttacaggaa aagccaaagc agaaaaagca ggtgatccga tctttactga ttcaaattat 960
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aataaatctc tctttgcagt atttgcagct 1050
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> Actinobacillus suis
<400> 36
Cys Ser Gly Gly Lys Gly Gly Phe Asp Leu Glu Asp Val Arg Pro Asn
1 5 10 15
Gln Thr Ala Lys Ala Glu Lys Ala Thr Thr Ser Tyr Gln Asp Glu Glu
20 25 30
Thr Lys Lys Lys Thr Lys Glu Glu Leu Asp Lys Leu Met Glu Pro Thr
35 40 45
Leu Gly Val Glu Ala Lys Ile Pro Arg Arg Asn Arg Ala Leu Phe Asp
50 55 60
Lys Glu Gly Asn Arg Lys Ala Thr Pro Asp Thr Thr Asp Glu Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ala Gln Ile Met Ala Ile Trp Asn Glu Asn Ile Asp Glu Ile Pro
85 90 95
His Leu Lys Glu Leu Asn Asp Lys Thr Thr Ser Gly Leu Ile Tyr His
100 105 110
Ser His Asp Gly Lys Gln Glu Asp Lys Lys Arg Asn Leu Gln Tyr Val
115 120 125
Arg Ser Gly Tyr Val Phe Asp Glu Ser Tyr Ser Glu Ile Val Lys Asn
130 135 140
Lys Asn Gly Val Pro Tyr Ile Phe Lys Asn Gly Ile Asp Gly Tyr Ile
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Gly Thr Ser Pro Ser Lys Glu Leu Pro Lys Gly Asn Lys
165 170 175
Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Thr Ser Asp Val Lys Thr Ser
180 185 190
Tyr Glu Leu Ser Gly Phe Ser Asp Ala Gly Asn Gly Lys Asn Val Ala
195 200 205
Ala Thr Ser Ile Ser Asp Asn Val Asn Arg Asp His Lys Val Gly Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Asp Asn Glu Val Lys Gly Val Ala His Ser Ser Glu Phe
225 230 235 240
Ala Val Asp Phe Asp Asn Lys Lys Leu Thr Gly Ser Leu Tyr Arg Asn
245 250 255
Gly Tyr Ile Asn Arg Asn Lys Ala Gln Glu Val Thr Lys Arg Tyr Ser
260 265 270
Ile Glu Ala Asp Ile Thr Gly Asn Arg Phe Thr Gly Lys Ala Lys Ala
275 280 285
Glu Lys Ala Gly Asp Pro Ile Phe Thr Asp Ser Asn Tyr Leu Glu Gly
290 295 300
Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe Phe Thr
305 310 315 320
Asn Asn Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ala
325 330
<210> 37
<211> 675
<212> DNA
<213> Actinobacillus suis
<400> 37
ggatccaagt tgatggagcc tactttggga gttgaggcaa agatacctcg ccggggtgca 60
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cctcacttga aagagttaaa cgataaaaca acgagtggtt taatttatca ctctgcgggt 180
tctaatttac aatatgtgcg ttcaggctat gttttcgatg aatctccggg tgggatcgat 240
ggttacattt actatttagg gacaagcccg tcaaaagaac tccctaaagg aaataaagtt 300
acctataaag gtacttggga tttcaccagc gatgttaaag gtaaaaatgt tgcagctaca 360
tctatttcgg ataatgtcgg tgctggtcat tctagtgaat ttgcagtaga ttttgataac 420
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ccgatcttta ctgattcaaa ttatcttgaa gggggattct atggtcctaa agctgaagaa 600
atggcaggga aatttttcac aaataataaa tctctctttg cagtatttgc agctaaaagt 660
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<210> 38
<211> 195
<212> PRT
<213> Actinobacillus suis
<400> 38
Gly Ser Lys Leu Met Glu Pro Thr Leu Gly Val Glu Ala Lys Ile Pro
1 5 10 15
Arg Arg Gly Ala Ala Thr Thr Asp Glu Leu Ser Gln Ile Met Ala Ile
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Trp Asn Glu Asn Ile Asp Glu Ile Pro His Leu Lys Glu Leu Asn Asp
35 40 45
Lys Thr Thr Ser Gly Leu Ile Tyr His Ser Ala Gly Ser Asn Leu Gln
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Tyr Val Arg Ser Gly Tyr Val Phe Asp Glu Ser Pro Gly Gly Ile Asp
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Gly Tyr Ile Tyr Tyr Leu Gly Thr Ser Pro Ser Lys Glu Leu Pro Lys
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Gly Asn Lys Val Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Thr Ser Asp Val
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Ala Ala Thr Ser Ile Ser Asp Asn Val Gly Ala
115 120 125
Gly His Ser Ser Glu Phe Ala Val Asp Phe Asp Asn Lys Lys Leu Thr
130 135 140
Gly Ser Leu Tyr Arg Asn Pro Ile Phe Thr Asp Ser Asn Tyr Leu Glu
145 150 155 160
Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe Phe
165 170 175
Thr Asn Asn Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ala Ala Lys Ser Glu Asn
180 185 190
Gly Glu Thr
195
<210> 39
<211> 2154
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<220>
<221> misc_feature
<223> Organism: Actinobacillus suis (as well)
<400> 39
gacaccgttc gtattattga tgcctcaaaa attgatttaa ctaatttcag catttcagaa 60
cttaacaatt ttggtgatgc ttccgtttta attattgatg ggaaaaaaat aaagctagct 120
ggtagcgggt ttacaaataa gcacactatt gaaatcaatg gcaaaacaat ggtagccgta 180
gcctgctgta gtaatctgga atatatgaag tttggtcaat tatggcaaca agcagagggc 240
ggaaaacccg agaataatag tttattccta caaggcgaac gtaccgcaac agataagatg 300
ccaaaaggcg gaaactataa atatattggt acttgggatg ctcaggtttc aaaagaaaat 360
aactgggttg ctacggcaga tgatgataga aaagctggct atcgcacaga atttgatgtt 420
gattttggca acaaaaattt aagtggtaag ttatttgata aaaacggtgt aaatcctgtg 480
tttaccgtag atgcaaaaat tgatggtaat ggttttactg gcaaagctaa aacctcagat 540
gctggtttcg ctctagattc aggtagttca cgttatgaga atgtgaaatt taacgatgta 600
gcagttagtg gtggcttcta tggtccaacg gcagcagagc ttggcggaca attccaccat 660
aaatcagaaa atggcagtgt aggtgctgtc tttggtgcaa aacaacaagt aaaaaaactt 720
gaaacagtca agatcattga tgcctcaaaa attgatttaa ctacttttga atcatcggaa 780
ctcaacaatt tcggcaacgc taatgtgtta attattgatg gacagaaaat agatctagca 840
ggtgcagatt ttaaaaatag aaaaaccgtt gatatcaatg gtaagacaat ggtagccata 900
gcttgctgta gtaatttgga atatatgaaa tttggtcaat tatggcaaaa agagggcgaa 960
caaactaaag ataatagctt attcctgcaa ggtgagcgta ctgccacaga taaaataccc 1020
gtaggtggaa actataaata tgtaggaacc tgggatgcac tcgtttcaaa aggaacgaac 1080
tgggtagctg aggcggataa taatcgagaa tcgggctatc gctcagaatt tgatgttaat 1140
tttggtgata aaaaagtaag cggcaagtta tttgataaag ggggcatagt acctgtcttt 1200
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tgctgtagta atctggaata tatgaaattt ggtcaattgt ggcaaaaaga gggcaaacaa 1680
caagttaaag ataatagttt attcctacaa ggtgaacgta ctgcaacgga taaaatgccc 1740
gcaggaggta actataagta tgttggaact tgggatgcac tcgtatctaa agggacgaac 1800
tggatagcgg aagcagataa taatcgagaa tcgggctatc gcactgaatt tgatgttaat 1860
tttagtgata aaaaagtaaa cggtaagtta tttgataaag gcggtgtaaa tcctgtattt 1920
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ggctttgctt tagatgcagg ctctagccaa cacggaaatg cggtatttag tgatataaaa 2040
gtcaatggtg gcttctatgg tccaaccgct ggagaacttg gcggacaatt ccatcataaa 2100
tcagacaatg gcagtgttgg cgctgtcttt ggtgcaaaac gacaaataga aaaa 2154
<210> 40
<211> 718
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Organism: Actinobacillus suis (as well)
<400> 40
Asp Thr Val Arg Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile Asp Leu Thr Asn Phe
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Ser Ile Ser Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val Leu Ile Ile
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Asp Gly Lys Lys Ile Lys Leu Ala Gly Ser Gly Phe Thr Asn Lys His
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Thr Ile Glu Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala Val Ala Cys Cys Ser
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Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Gln Ala Glu Gly
65 70 75 80
Gly Lys Pro Glu Asn Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Ala
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Thr Asp Lys Met Pro Lys Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr Ile Gly Thr Trp
100 105 110
Asp Ala Gln Val Ser Lys Glu Asn Asn Trp Val Ala Thr Ala Asp Asp
115 120 125
Asp Arg Lys Ala Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asp Phe Gly Asn
130 135 140
Lys Asn Leu Ser Gly Lys Leu Phe Asp Lys Asn Gly Val Asn Pro Val
145 150 155 160
Phe Thr Val Asp Ala Lys Ile Asp Gly Asn Gly Phe Thr Gly Lys Ala
165 170 175
Lys Thr Ser Asp Ala Gly Phe Ala Leu Asp Ser Gly Ser Ser Arg Tyr
180 185 190
Glu Asn Val Lys Phe Asn Asp Val Ala Val Ser Gly Gly Phe Tyr Gly
195 200 205
Pro Thr Ala Ala Glu Leu Gly Gly Gln Phe His His Lys Ser Glu Asn
210 215 220
Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Gln Gln Val Lys Lys Leu
225 230 235 240
Glu Thr Val Lys Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile Asp Leu Thr Thr Phe
245 250 255
Glu Ser Ser Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asn Ala Asn Val Leu Ile Ile
260 265 270
Asp Gly Gln Lys Ile Asp Leu Ala Gly Ala Asp Phe Lys Asn Arg Lys
275 280 285
Thr Val Asp Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala Ile Ala Cys Cys Ser
290 295 300
Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Lys Glu Gly Glu
305 310 315 320
Gln Thr Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Ala Thr
325 330 335
Asp Lys Ile Pro Val Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Gly Thr Trp Asp
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Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Ile Glu Lys Thr Thr
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Thr Glu Arg Ile Ile Asp Ala Thr Lys Ile Asp Leu Thr Gln Phe Asn
485 490 495
Ala Lys Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val Leu Ile Ile Asp
500 505 510
Gly Gln Lys Ile Asp Leu Ala Gly Val Asn Phe Lys Asn Ser Lys Thr
515 520 525
Val Glu Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala Val Ala Cys Cys Ser Asn
530 535 540
Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Lys Glu Gly Lys Gln
545 550 555 560
Gln Val Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Ala Thr
565 570 575
Asp Lys Met Pro Ala Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Gly Thr Trp Asp
580 585 590
Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp Ile Ala Glu Ala Asp Asn Asn
595 600 605
Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asn Phe Ser Asp Lys
610 615 620
Lys Val Asn Gly Lys Leu Phe Asp Lys Gly Gly Val Asn Pro Val Phe
625 630 635 640
Thr Val Asp Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Phe Ile Gly Ser Ala Lys
645 650 655
Thr Ser Asp Ser Gly Phe Ala Leu Asp Ala Gly Ser Ser Gln His Gly
660 665 670
Asn Ala Val Phe Ser Asp Ile Lys Val Asn Gly Gly Phe Tyr Gly Pro
675 680 685
Thr Ala Gly Glu Leu Gly Gly Gln Phe His His Lys Ser Asp Asn Gly
690 695 700
Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Ile Glu Lys
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<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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Lys Val Pro Val Ser Ser Phe Glu Asn Lys Lys Val Asp Ile Ser Asp
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Ile
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 43
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<212> DNA
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Lys Thr Lys Asp Ser Ser Leu Gln Tyr
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
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<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 55
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 56
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 58
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<400> 61
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1
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<400> 63
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<210> 64
<211> 18
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 64
Ala Ser Asp Lys Asn Lys Gly Lys Gly Glu Ser Tyr Asn Phe Phe Ser
1 5 10 15
Ala Asp
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 65
tatggtccaa aagcagaaga a 21
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 66
Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu
1 5
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 67
gtagctaacg acaaatctct t 21
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 68
Val Ala Asn Asp Lys Ser Leu
1 5
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 69
cacaatggct ctaatgttga c 21
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 70
His Asn Gly Ser Asn Val Asp
1 5
<210> 71
<211> 6
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 71
cgtatt 6
<210> 72
<211> 2
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 72
Arg Ile
1
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 73
gatttaacta atttc 15
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 74
Asp Leu Thr Asn Phe
1 5
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 75
gaacttaaca attttggtga tgcttcc 27
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 76
Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 77
attgatggg 9
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 78
Ile Asp Gly
1
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 79
aagctagctg gtagcgggtt taca 24
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 80
Lys Leu Ala Gly Ser Gly Phe Thr
1 5
<210> 81
<211> 12
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 81
atcaatggca aa 12
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 82
Ile Asn Gly Lys
1
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 83
tgctgtagta atctggaata tatg 24
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 84
Cys Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 85
caacaagcag agggcggaaa accc 24
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 86
Gln Gln Ala Glu Gly Gly Lys Pro
1 5
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<211> 42
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 87
ggcgaacgta ccgcaacaga taagatgcca aaaggcggaa ac 42
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 88
Gly Glu Arg Thr Ala Thr Asp Lys Met Pro Lys Gly Gly Asn
1 5 10
<210> 89
<211> 15
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 89
tcaaaagaaa ataac 15
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 90
Ser Lys Glu Asn Asn
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 91
gctacggcag atgatgatag aaaagctggc tatcgc 36
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 92
Ala Thr Ala Asp Asp Asp Arg Lys Ala Gly Tyr Arg
1 5 10
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<211> 18
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 93
gattttggca acaaaaat 18
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 94
Asp Phe Gly Asn Lys Asn
1 5
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 95
ttatttgata aaaacggtgt aaatcctgtg ttt 33
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 96
Leu Phe Asp Lys Asn Gly Val Asn Pro Val Phe
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 97
gatggtaatg gt 12
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 98
Asp Gly Asn Gly
1
<210> 99
<211> 69
<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 99
aaaacctcag atgctggttt cgctctagat tcaggtagtt cacgttatga gaatgtgaaa 60
tttaacgat 69
<210> 100
<211> 23
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 100
Lys Thr Ser Asp Ala Gly Phe Ala Leu Asp Ser Gly Ser Ser Arg Tyr
1 5 10 15
Glu Asn Val Lys Phe Asn Asp
20
<210> 101
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<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 101
tatggtccaa cg 12
<210> 102
<211> 4
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 102
Tyr Gly Pro Thr
1
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<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 103
tcagaaaatg gc 12
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 104
Ser Glu Asn Gly
1
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<212> DNA
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 105
aaaaaa 6
<210> 106
<211> 2
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 106
Lys Lys
1
<210> 107
<211> 540
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 107
Met His Phe Lys Leu Asn Pro Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Ser Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
20 25 30
Gln Pro Asn Lys Thr Thr Gly Met Ser Lys Glu Glu Tyr Lys Asp Val
35 40 45
Glu Thr Ala Lys Lys Glu Lys Glu Gln Leu Gly Glu Leu Met Glu Pro
50 55 60
Ala Leu Gly Tyr Val Val Lys Val Pro Val Ser Gln Asn Gly Val Arg
65 70 75 80
Arg Thr Glu Ile Ser Asn Leu Glu Ala Ile Thr Asp Glu Asp Leu Asn
85 90 95
Lys Ile Pro Asn His Asp Ile Ile Lys Asp Val Ala Tyr Gln Asn Tyr
100 105 110
Gly Glu Leu Val Asp Lys Thr Ala Ala Lys Lys Met Thr Tyr Val Arg
115 120 125
Ser Gly Tyr Ala Ile Asp Val Phe His Tyr Gly Thr Arg Asp Lys Gly
130 135 140
Tyr Val Phe Tyr Lys Gly Ile Thr Pro Ser Lys Glu Leu Pro Gln Gly
145 150 155 160
Pro Val Leu Thr Tyr Gln Gly Glu Trp Asp Phe Thr Ser Asp Ala Asn
165 170 175
Leu Asp Ala Lys Arg Pro Asn Ser Asn Pro Glu Phe Asn Gly Tyr Gly
180 185 190
Pro Gly Gln Arg Ile Ala Ala Thr Ser Ala Asp Ala Lys Gly Arg Thr
195 200 205
Tyr Thr Ser Glu Phe Glu Val Asp Phe Ser Thr Lys Lys Leu Lys Gly
210 215 220
Lys Leu Ser Ser Lys Thr Ala Asn Ala Glu Ser Leu Glu Arg Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Glu Ala Glu Leu Lys Gly Asn Arg Phe Arg Gly Lys Ala Ile Ala
245 250 255
Lys Asn Asp Ser Asp Ala Ser Leu Gly Lys Ser Ser Asp Asn Leu Glu
260 265 270
Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Ile
275 280 285
Thr Asn Asp Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ser Ala Lys His Asn Gly
290 295 300
Ser Asn Val Asp Thr Val Arg Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile Asp Leu
305 310 315 320
Thr Asn Phe Ser Ile Ser Glu Leu Thr Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val
325 330 335
Leu Ile Ile Asp Gly Gln Lys Met Glu Leu Ala Gly Ser Gly Phe Thr
340 345 350
Asn Lys His Thr Ile Glu Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala Val Ala
355 360 365
Cys Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Gln
370 375 380
Ala Glu Gly Glu Lys Ala Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu
385 390 395 400
Arg Thr Ala Thr Asp Lys Met Pro Lys Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr Ile
405 410 415
Gly Thr Trp Asp Ala Gln Val Ser Lys Glu Asn Asn Trp Val Ala Thr
420 425 430
Ala Asp Asp Asp Arg Lys Ala Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asp
435 440 445
Phe Gly Asn Lys Asn Leu Ser Gly Lys Leu Phe Asp Lys Asn Gly Val
450 455 460
Asn Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Lys Ile Asn Gly Asn Gly Phe Thr
465 470 475 480
Gly Lys Ala Lys Thr Ser Asp Ala Gly Phe Ala Leu Asp Ser Gly Ser
485 490 495
Ser Arg Tyr Asp Asn Val Lys Phe Ser Asp Val Ala Val Asn Gly Gly
500 505 510
Phe Tyr Gly Pro Thr Ala Ala Glu Leu Gly Gly Gln Phe Phe His Lys
515 520 525
Ser Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala
530 535 540
<210> 108
<211> 590
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 108
Met His Phe Lys Leu Asn Pro Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Ser Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
20 25 30
Gln Pro Asn Gln Thr Ala Lys Val Glu Lys Ala Thr Thr Ser Tyr Gln
35 40 45
Asp Glu Glu Thr Lys Lys Lys Thr Lys Glu Glu Leu Asp Lys Leu Met
50 55 60
Glu Pro Ala Leu Gly Tyr Glu Thr Gln Ile Leu Arg Arg Asn Arg Ala
65 70 75 80
Pro Lys Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Asn Glu Arg Ala Val Gly Leu
85 90 95
Ser Glu Asp Gln Ile Thr Lys Leu Tyr Gln Glu Asn Ile Glu Ile Ile
100 105 110
Pro His Leu Asp Glu Leu Asn Arg Arg Thr Thr Ser Tyr Glu Val Tyr
115 120 125
His Ser His Asp Gly Lys Gly Leu Asp Lys Lys Arg Asp Leu Lys Tyr
130 135 140
Val Arg Ser Gly Tyr Val Tyr Asp Gly Ala Phe Arg Glu Val Gln Arg
145 150 155 160
Asn Glu His Gly Phe His Val Phe Lys Gln Gly Ile Asp Gly Tyr Ile
165 170 175
Tyr Tyr Leu Gly Val Ile Pro Ser Lys Glu Leu Pro Lys Gly Lys Ile
180 185 190
Val Thr Tyr Lys Gly Ser Trp Asp Phe Val Ser Asn Ile Asn Leu Asp
195 200 205
Arg Glu Ile Asp Gly Phe Asp Thr Ser Gly Asp Gly Lys Asn Val Ser
210 215 220
Ala Thr Ser Ile Thr Glu Thr Val Asn Arg Glu His Lys Ile Gly Asp
225 230 235 240
Lys Val Gly Glu Asn Glu Val Lys Gly Val Ala His Ser Ser Glu Phe
245 250 255
Ala Val Asp Phe Asp Asn Lys Lys Leu Thr Gly Ser Leu Tyr Arg Asn
260 265 270
Gly Tyr Ile Asn Arg Asn Lys Ala Gln Glu Val Thr Lys Arg Tyr Ser
275 280 285
Ile Glu Ala Asp Ile Ala Gly Asn Arg Phe Arg Gly Lys Ala Lys Ala
290 295 300
Glu Lys Ala Asp Asp Pro Ile Phe Thr Asn Ser Asp Tyr Leu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Ile Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe Phe Thr
325 330 335
Asn Asn Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ala Ala Lys Ser Glu Asn Gly
340 345 350
Glu Thr Thr Thr Glu Arg Ile Ile Asp Ala Thr Lys Ile Asp Leu Thr
355 360 365
Gln Phe Asn Ala Lys Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val Leu
370 375 380
Ile Ile Asp Gly Gln Lys Met Asp Leu Ala Gly Val Asp Phe Lys Asn
385 390 395 400
Ser Lys Thr Val Glu Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala Val Ala Cys
405 410 415
Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Lys Glu
420 425 430
Gly Glu Gln Gln Val Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu Arg
435 440 445
Thr Ala Thr Asp Lys Met Pro Ala Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Gly
450 455 460
Thr Trp Asp Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp Ile Ala Glu Ala
465 470 475 480
Asp Asn Asn Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asn Phe
485 490 495
Ser Asp Lys Lys Val Asn Gly Lys Leu Phe Asp Lys Gly Gly Val Asn
500 505 510
Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Phe Ile Gly
515 520 525
Ser Ala Lys Thr Ser Asp Ser Gly Phe Ala Leu Asp Ser Gly Ser Ser
530 535 540
Gln His Gly Asn Ala Val Phe Ser Asn Val Asp Val Lys Gly Gly Phe
545 550 555 560
Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Glu Leu Gly Gly Gln Phe His His Lys Ser
565 570 575
Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln
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<210> 109
<211> 590
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 109
Met His Phe Lys Leu Asn Pro Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Ser Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
20 25 30
Gln Pro Asn Gln Thr Ala Lys Val Glu Lys Ala Thr Thr Ser Tyr Gln
35 40 45
Asp Glu Glu Thr Lys Lys Lys Thr Lys Glu Glu Leu Asp Lys Leu Met
50 55 60
Glu Pro Ala Leu Gly Tyr Glu Thr Gln Ile Leu Arg Arg Asn Arg Ala
65 70 75 80
Pro Lys Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Asn Glu Arg Ala Val Gly Leu
85 90 95
Ser Glu Asp Gln Ile Thr Lys Leu Tyr Gln Glu Asn Ile Glu Ile Ile
100 105 110
Pro His Leu Asp Glu Leu Asn Arg Arg Thr Thr Ser Asp Glu Val Tyr
115 120 125
His Ser His Asp Gly Lys Arg Leu Asp Lys Lys Arg Asp Leu Lys Tyr
130 135 140
Val Arg Ser Gly Tyr Val Tyr Asp Gly Ser Phe Arg Glu Ile Gln Arg
145 150 155 160
Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Val Phe Lys Gln Gly Ile Asp Gly Tyr Val
165 170 175
Tyr Tyr Leu Gly Val Ile Pro Ser Lys Glu Leu Pro Lys Gly Lys Val
180 185 190
Val Ser Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Val Ser Asn Ile Asn Leu Asp
195 200 205
Arg Glu Ile Asp Gly Phe Asp Thr Ala Gly Asp Gly Lys Asn Val Ser
210 215 220
Ala Thr Ser Ile Thr Glu Thr Val Asn Arg Glu His Lys Ile Gly Asp
225 230 235 240
Lys Val Gly Glu Asn Glu Val Lys Gly Val Ala His Ser Ser Glu Phe
245 250 255
Ala Val Asp Phe Asp Asn Lys Lys Leu Thr Gly Ser Leu Tyr Arg Asn
260 265 270
Gly Tyr Ile Asn Arg Asn Lys Ala Gln Glu Val Thr Lys Arg Tyr Ser
275 280 285
Ile Glu Ala Asp Ile Ala Gly Asn Arg Phe Arg Gly Lys Ala Lys Ala
290 295 300
Glu Lys Ala Asp Asp Pro Ile Phe Thr Asn Ser Asp Tyr Leu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe Phe Thr
325 330 335
Asn Asn Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ala Ala Lys Ser Glu Asn Gly
340 345 350
Glu Thr Thr Thr Glu Arg Ile Ile Asp Ala Thr Lys Ile Asp Leu Thr
355 360 365
Gln Phe Asn Ala Lys Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val Leu
370 375 380
Ile Ile Asp Gly Gln Lys Met Asp Leu Ala Gly Val Asp Phe Lys Asn
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Ser Lys Thr Val Glu Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala Val Ala Cys
405 410 415
Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Lys Glu
420 425 430
Gly Glu Gln Gln Val Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu Arg
435 440 445
Thr Ala Thr Asp Lys Met Pro Ala Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Gly
450 455 460
Thr Trp Asp Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp Ile Ala Glu Ala
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Asp Asn Asn Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asn Phe
485 490 495
Ser Asp Lys Lys Val Asn Gly Lys Leu Phe Asp Lys Gly Gly Val Asn
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Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Phe Ile Gly
515 520 525
Ser Ala Lys Thr Ser Asp Ser Gly Phe Ala Leu Asp Ala Gly Ser Ser
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Gln His Gly Asn Ala Val Phe Ser Asn Val Asp Val Lys Gly Gly Phe
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Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln
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<210> 110
<211> 540
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 110
Met His Phe Lys Ser Asp Leu Tyr Ile Val Ala Leu Thr Ser Thr Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Asp Asp Val
20 25 30
Gln Pro Asn Lys Ala Val Glu Pro Glu Lys Thr Lys Val Asn Tyr Thr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Arg Lys Thr Glu Ile Ser Glu Ile Asp Thr Val Thr Asp Glu Ser
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Leu Ser Leu Val Pro Asn Glu Asp Lys Leu Arg Thr Ile Ala Asn Glu
100 105 110
Asn Tyr Gly Ser Val Val Thr Lys Ser Gly Ser Asn Thr Met Asn Phe
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Val Arg Ser Gly Tyr Thr Ile Asp Val Asp His Tyr Gly Leu Arg Asp
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Lys Gly Tyr Val Tyr Tyr Lys Gly Val His Pro Ser Lys Glu Leu Pro
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Lys Gly Asn Ile Ile Val Tyr Gln Gly Glu Trp Asp Phe Thr Ser Asn
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Ala Asp Leu Asp Ala Lys Arg Pro Asn Tyr Asn Pro Glu Phe Asn Gly
180 185 190
Tyr Gly Ala Gly Gln Arg Val Gly Val Thr Ser Ala Asp Ala Lys Glu
195 200 205
Arg Thr Tyr Ile Ser Lys Phe Asn Ile Asp Phe Ser Asn Lys Lys Leu
210 215 220
Asn Gly Gln Leu Leu Thr Lys Thr Lys Glu Asn Gln Glu Lys Leu Arg
225 230 235 240
Tyr Thr Val Glu Ala Asn Ile Ser Gly Asn Arg Phe Arg Gly Lys Ala
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Thr Ala Thr Asp Lys Thr Asp Pro Ile Leu Gly Lys Asp Ser Glu His
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Leu Glu Gly Gly Leu Tyr Gly Pro Lys Ser Glu Glu Leu Ala Gly Lys
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Phe Val Ala His Asp Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ser Gly Lys Arg
290 295 300
Gly Asn Asp Val Leu Glu Thr Val Lys Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile
305 310 315 320
Asp Leu Thr Thr Phe Glu Ser Ser Glu Leu Asn Asn Phe Gly Asn Ala
325 330 335
Asn Val Leu Ile Ile Asp Gly Gln Lys Ile Asp Leu Ala Gly Ala Asp
340 345 350
Phe Lys Asn Arg Lys Thr Val Asp Ile Asn Gly Lys Thr Met Val Ala
355 360 365
Ile Ala Cys Cys Ser Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp
370 375 380
Gln Lys Glu Gly Glu Gln Thr Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly
385 390 395 400
Glu Arg Thr Ala Thr Asp Lys Ile Pro Val Gly Gly Asn Tyr Lys Tyr
405 410 415
Val Gly Thr Trp Asp Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp Val Ala
420 425 430
Glu Ala Asp Asn Asn Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Ser Glu Phe Asp Val
435 440 445
Asn Phe Gly Asp Lys Lys Val Ser Gly Lys Leu Phe Asp Lys Gly Gly
450 455 460
Ile Val Pro Val Phe Met Ile Asn Ala Asp Ile Lys Gly Asn Gly Phe
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485 490 495
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Gly Phe Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Glu Leu Gly Gly Gln Phe His His
515 520 525
Lys Ser Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly
530 535 540
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<211> 590
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 111
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180 185 190
Val Ser Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Phe Val Ser Asn Ile Asn Leu Asp
195 200 205
Arg Glu Ile Asp Gly Phe Asp Thr Ser Gly Asp Gly Lys Asn Val Ser
210 215 220
Ala Thr Ser Ile Thr Glu Thr Val Asn Arg Glu His Lys Ile Gly Asp
225 230 235 240
Lys Val Gly Glu Asn Glu Val Lys Gly Val Ala His Ser Ser Glu Phe
245 250 255
Ala Val Asp Phe Asp Asn Lys Lys Leu Thr Gly Ser Leu Tyr Arg Asn
260 265 270
Gly Tyr Ile Asn Arg Asn Lys Ala Gln Glu Val Thr Lys Arg Tyr Ser
275 280 285
Ile Glu Ala Asp Ile Ala Gly Asn Arg Phe Arg Gly Lys Ala Lys Ala
290 295 300
Glu Lys Ala Asp Asp Pro Ile Phe Thr Asn Ser Asp Tyr Leu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe Phe Thr
325 330 335
Asn Asn Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ala Ala Lys Ser Glu Asn Gly
340 345 350
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450 455 460
Thr Trp Asp Ala Leu Val Ser Lys Gly Thr Asn Trp Ile Ala Glu Ala
465 470 475 480
Asp Asn Asn Arg Glu Ser Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asn Phe
485 490 495
Ser Asp Lys Lys Val Asn Gly Lys Leu Phe Asp Lys Gly Gly Val Asn
500 505 510
Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Thr Ile Asn Gly Asn Gly Phe Ile Gly
515 520 525
Ser Ala Lys Thr Ser Asp Ser Gly Phe Ala Leu Asp Ala Gly Ser Ser
530 535 540
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545 550 555 560
Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Glu Leu Gly Gly Gln Phe His His Lys Ser
565 570 575
Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln
580 585 590
<210> 112
<211> 540
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 112
Met His Phe Lys Leu Asn Pro Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Ser Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
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65 70 75 80
Lys Val Asp Ile Ser Asp Ile Glu Val Ile Thr Asn Gly Asn Leu Asp
85 90 95
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Gly Arg Pro Asn Tyr Leu Asn Asp Asp Tyr Tyr Thr Lys Phe Ile Gly
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210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
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275 280 285
Val Ala Asn Asp Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ser Ala Lys His Asn
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Val Leu Ile Ile Asp Gly Lys Lys Ile Lys Leu Ala Gly Ser Gly Phe
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<210> 113
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<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 113
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<210> 114
<211> 540
<212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae
<400> 114
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Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
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Gly Lys Gly Glu Ser Tyr Asn Phe Phe Ser Ala Asp Ser Gln Ser Leu
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275 280 285
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325 330 335
Val Leu Ile Ile Asp Gly Lys Lys Ile Lys Leu Ala Gly Ser Gly Phe
340 345 350
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485 490 495
Ser Ser Arg Tyr Glu Asn Val Lys Phe Asn Asp Val Ala Val Ser Gly
500 505 510
Gly Phe Tyr Gly Pro Thr Ala Ala Glu Leu Gly Gly Gln Phe His His
515 520 525
Lys Ser Glu Asn Gly Ser Val Gly Ala Val Phe Gly
530 535 540
<210> 115
<211> 545
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 115
Met His Phe Lys Leu Asn Pro Tyr Ala Leu Ala Phe Thr Ser Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Cys Ser Gly Gly Lys Gly Ser Phe Asp Leu Glu Asp Val
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Gln Pro Asn Lys Thr Thr Gly Val Ser Lys Glu Glu Tyr Gln Asp Val
35 40 45
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Ala Leu Gly Tyr Val Val Lys Val Pro Val Ser Gln Ser Gly Ala Arg
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Ile Glu Ala Glu Pro Lys Gly Asn Arg Phe Arg Gly Lys Ala Ile Ala
245 250 255
Lys Asp Thr Ser Asp Ala Ile Leu Gly Lys Ser Ser Asp Tyr Leu Glu
260 265 270
Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Ile
275 280 285
Thr Asn Asp Lys Ser Leu Phe Ala Val Phe Ser Ala Lys His Asn Gly
290 295 300
Ser Asn Val Asp Thr Val Arg Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile Asp Leu
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Thr His Phe Asn Ser Ser Glu Leu Thr Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val
325 330 335
Leu Ile Ile Asp Gly Lys Lys Met Asp Leu Ala Gly Thr Asp Phe Lys
340 345 350
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Pro Val Phe Thr Val Asp Ala Lys Ile Asn Gly Asn Gly Phe Thr Gly
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Lys Ala Lys Thr Ser Asp Ala Gly Phe Ala Leu Asp Ser Asp Ser Ser
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500 505 510
Tyr Gly Pro Thr Ala Ala Glu Leu Gly Gly Gln Phe Phe His Lys Ser
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Asp Asn Gly Ser Val Gly Ala Ile Phe Gly Ala Lys Arg Gln Val Lys
530 535 540
Lys
545
<210> 116
<211> 1740
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 116
tgtctgggtg gcggcggcag tttcgatttg gacagcgtgg aaaccgtgca agatatgcac 60
tccaaaccta agtatgagga tgaaaaaagc cagcctgaaa gccaacagga tgtatcggaa 120
aacagcggcg cggcttatgg ctttgcagta aaactacctc gccggaatgc acattttaat 180
cctaaatata aggaaaagca caaaccattg ggttcaatgg attggaaaaa actgcaaaga 240
ggagaaccaa atagttttag tgagagggat gaattggaaa aaaaacgggg tagttctgaa 300
cttattgaat caaaatggga agatgggcaa agtcgtgtag ttggttatac aaatttcact 360
tatgtccgtt cgggatatgt ttaccttaat aaaaataata ttgatattaa gaataatata 420
gttctttttg gacctgacgg atatctttac tataaaggga aagaaccttc caaggagctg 480
ccatcggaaa agataactta taaaggtact tgggattatg ttactgatgc tatggaaaaa 540
caaaggtttg aaggattggg tagtgcagca ggaggagata aatcgggggc gttgtctgca 600
ttagaagaag gggtattgcg taatcaggca gaggcatcat ccggtcatac cgattttggt 660
atgactagtg agtttgaggt tgatttttct gataaaacaa taaagggcac actttatcgt 720
aacaaccgta ttactcaaaa taatagtgaa aacaaacaaa taaaaactac gcgttacacc 780
attcaagcaa ctcttcacgg caaccgtttc aaaggtaagg cgttggcggc agataaaggt 840
gcaacaaatg gaagtcatcc ctttatttcc gactccgaca gtttggaagg cggattttac 900
gggccgaaag gcgaggaact tgccggtaaa ttcttgagca acgacaacaa agttgcagcg 960
gtgtttggtg cgaagcagaa agataagaag gatggggaaa acgcggcagg gcctgcaacg 1020
gaaaccgtga tagatgcata ccgtattacc ggcgaggagt ttaagaaaga gcaaatagac 1080
agttttggag atgtgaaaaa gctgctggtt gacggagtgg agctttcact gctgccgtct 1140
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tgttgttcca acttggatta catgagtttt gggaagctgt caaaagaaaa taaagacgat 1260
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gccaaatatc gcggtacttg gtacggatat attgccaacg gcacaagctg gagcggcgaa 1380
gcctccaatc aggaaggtgg taatagggca gagtttgacg tggatttttc cactaaaaaa 1440
atcagtggca cactgacggc aaaagaccgt acgtctcctg cgtttactat tactgccatg 1500
attaaggaca acggtttttc aggtgtggcg aaaaccggtg aaaacggctt tgcgctggat 1560
ccgcaaaata ccggaaattc ccactatacg catattgaag ccactgtatc cggcggtttc 1620
tacggcaaaa acgccatcga gatgggcgga tcgttctcat ttccgggaaa tgcaccagag 1680
ggaaaacaag aaaaagcatc ggtggtattc ggtgcgaaac gccaacagct tgtgcaataa 1740
<210> 117
<211> 579
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 117
Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Gln Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu Lys Ser Gln Pro
20 25 30
Glu Ser Gln Gln Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala Ala Tyr Gly Phe
35 40 45
Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn Pro Lys Tyr Lys
50 55 60
Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys Lys Leu Gln Arg
65 70 75 80
Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu Glu Lys Lys Arg
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Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp Gly Gln Ser Arg
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Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser Gly Tyr Val Tyr
115 120 125
Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile Val Leu Phe Gly
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Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro Ser Lys Glu Leu
145 150 155 160
Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Tyr Val Thr Asp
165 170 175
Ala Met Glu Lys Gln Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser Ala Ala Gly Gly
180 185 190
Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly Val Leu Arg Asn
195 200 205
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Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly Thr Leu Tyr Arg
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Asn Asn Arg Ile Thr Gln Asn Asn Ser Glu Asn Lys Gln Ile Lys Thr
245 250 255
Thr Arg Tyr Thr Ile Gln Ala Thr Leu His Gly Asn Arg Phe Lys Gly
260 265 270
Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly Ser His Pro Phe
275 280 285
Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Gly
290 295 300
Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn Lys Val Ala Ala
305 310 315 320
Val Phe Gly Ala Lys Gln Lys Asp Lys Lys Asp Gly Glu Asn Ala Ala
325 330 335
Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg Ile Thr Gly Glu
340 345 350
Glu Phe Lys Lys Glu Gln Ile Asp Ser Phe Gly Asp Val Lys Lys Leu
355 360 365
Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Glu Gly Asn Lys
370 375 380
Ala Ala Phe Gln His Glu Ile Glu Gln Asn Gly Val Lys Ala Thr Val
385 390 395 400
Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys Leu Ser Lys Glu
405 410 415
Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gln Gly Val Arg Thr Pro Val Ser Asp
420 425 430
Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr
435 440 445
Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu Ala Ser Asn Gln
450 455 460
Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe Ser Thr Lys Lys
465 470 475 480
Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser Pro Ala Phe Thr
485 490 495
Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly Val Ala Lys Thr
500 505 510
Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gln Asn Thr Gly Asn Ser His
515 520 525
Tyr Thr His Ile Glu Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe Tyr Gly Lys Asn
530 535 540
Ala Ile Glu Met Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly Asn Ala Pro Glu
545 550 555 560
Gly Lys Gln Glu Lys Ala Ser Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln
565 570 575
Leu Val Gln
<210> 118
<211> 762
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 118
cagaaagata agaaggatgg ggaaaacgcg gcagggcctg caacggaaac cgtgatagat 60
gcataccgta ttaccggcga ggagtttaag aaagagcaaa tagacagttt tggagatgtg 120
aaaaagctgc tggttgacgg agtggagctt tcactgctgc cgtctgaggg caataaggcg 180
gcatttcagc acgagattga gcaaaacggc gtgaaggcaa cggtgtgttg ttccaacttg 240
gattacatga gttttgggaa gctgtcaaaa gaaaataaag acgatatgtt cctgcaaggt 300
gtccgcactc cagtatccga tgtggcggca aggacggagg caaacgccaa atatcgcggt 360
acttggtacg gatatattgc caacggcaca agctggagcg gcgaagcctc caatcaggaa 420
ggtggtaata gggcagagtt tgacgtggat ttttccacta aaaaaatcag tggcacactg 480
acggcaaaag accgtacgtc tcctgcgttt actattactg ccatgattaa ggacaacggt 540
ttttcaggtg tggcgaaaac cggtgaaaac ggctttgcgc tggatccgca aaataccgga 600
aattcccact atacgcatat tgaagccact gtatccggcg gtttctacgg caaaaacgcc 660
atcgagatgg gcggatcgtt ctcatttccg ggaaatgcac cagagggaaa acaagaaaaa 720
gcatcggtgg tattcggtgc gaaacgccaa cagcttgtgc aa 762
<210> 119
<211> 254
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 119
Gln Lys Asp Lys Lys Asp Gly Glu Asn Ala Ala Gly Pro Ala Thr Glu
1 5 10 15
Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu
20 25 30
Gln Ile Asp Ser Phe Gly Asp Val Lys Lys Leu Leu Val Asp Gly Val
35 40 45
Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Glu Gly Asn Lys Ala Ala Phe Gln His
50 55 60
Glu Ile Glu Gln Asn Gly Val Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu
65 70 75 80
Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met
85 90 95
Phe Leu Gln Gly Val Arg Thr Pro Val Ser Asp Val Ala Ala Arg Thr
100 105 110
Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn
115 120 125
Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu Ala Ser Asn Gln Glu Gly Gly Asn Arg
130 135 140
Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe Ser Thr Lys Lys Ile Ser Gly Thr Leu
145 150 155 160
Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser Pro Ala Phe Thr Ile Thr Ala Met Ile
165 170 175
Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly Val Ala Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe
180 185 190
Ala Leu Asp Pro Gln Asn Thr Gly Asn Ser His Tyr Thr His Ile Glu
195 200 205
Ala Thr Val Ser Gly Gly Phe Tyr Gly Lys Asn Ala Ile Glu Met Gly
210 215 220
Gly Ser Phe Ser Phe Pro Gly Asn Ala Pro Glu Gly Lys Gln Glu Lys
225 230 235 240
Ala Ser Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Leu Val Gln
245 250
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<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 120
tgtctgggtg gcggcggcag tttcgatttg gacagcgtgg aaaccgtgca agatatgcac 60
tccaaaccta agtatgagga tgaaaaaagc cagcctgaaa gccaacagga tgtatcggaa 120
aacagcggcg cggcttatgg ctttgcagta aaactacctc gccggaatgc acattttaat 180
cctaaatata aggaaaagca caaaccattg ggttcaatgg attggaaaaa actgcaaaga 240
ggagaaccaa atagttttag tgagagggat gaattggaaa aaaaacgggg tagttctgaa 300
cttattgaat caaaatggga agatgggcaa agtcgtgtag ttggttatac aaatttcact 360
tatgtccgtt cgggatatgt ttaccttaat aaaaataata ttgatattaa gaataatata 420
gttctttttg gacctgacgg atatctttac tataaaggga aagaaccttc caaggagctg 480
ccatcggaaa agataactta taaaggtact tgggattatg ttactgatgc tatggaaaaa 540
caaaggtttg aaggattggg tagtgcagca ggaggagata aatcgggggc gttgtctgca 600
ttagaagaag gggtattgcg taatcaggca gaggcatcat ccggtcatac cgattttggt 660
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 121
Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Gln Asp Met His Ser Lys Pro Lys Tyr Glu Asp Glu Lys Ser Gln Pro
20 25 30
Glu Ser Gln Gln Asp Val Ser Glu Asn Ser Gly Ala Ala Tyr Gly Phe
35 40 45
Ala Val Lys Leu Pro Arg Arg Asn Ala His Phe Asn Pro Lys Tyr Lys
50 55 60
Glu Lys His Lys Pro Leu Gly Ser Met Asp Trp Lys Lys Leu Gln Arg
65 70 75 80
Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg Asp Glu Leu Glu Lys Lys Arg
85 90 95
Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys Trp Glu Asp Gly Gln Ser Arg
100 105 110
Val Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr Tyr Val Arg Ser Gly Tyr Val Tyr
115 120 125
Leu Asn Lys Asn Asn Ile Asp Ile Lys Asn Asn Ile Val Leu Phe Gly
130 135 140
Pro Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Lys Glu Pro Ser Lys Glu Leu
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Pro Ser Glu Lys Ile Thr Tyr Lys Gly Thr Trp Asp Tyr Val Thr Asp
165 170 175
Ala Met Glu Lys Gln Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser Ala Ala Gly Gly
180 185 190
Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly Val Leu Arg Asn
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Gln Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly Met Thr Ser Glu
210 215 220
Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly Thr Leu Tyr Arg
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Asn Asn Arg Ile Thr Gln Asn Asn Ser Glu Asn Lys Gln Ile Lys Thr
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Thr Arg Tyr Thr Ile Gln Ala Thr Leu His Gly Asn Arg Phe Lys Gly
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Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly Ser His Pro Phe
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Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Gly
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Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn Lys Val Ala Ala
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<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 122
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 123
Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu
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Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gln Asp Val Ser Ser Glu Lys Pro
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Gln Ala Gln Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Leu Lys
35 40 45
Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ser Glu Val Lys Leu Asn
50 55 60
Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Lys Pro Lys Glu Leu
65 70 75 80
Pro Lys Arg Gln Lys Ser Val Ile Glu Lys Val Glu Thr Asp Gly Asp
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Ser Asp Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Asn His Gln Asn
100 105 110
Gly Ser Ala Gly Asn Gly Val Asn Gln Pro Lys Asn Gln Ala Thr Gly
115 120 125
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Gly Tyr Ile Phe Tyr His Gly Glu Lys Pro Ser Arg Gln Leu Pro Ala
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Ser
210 215 220
Asn Lys Asn Glu Ser Thr Leu Lys Asp Asp His Glu Gly Tyr Gly Phe
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Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe Gly Asn Lys Lys Leu Thr Gly Lys
245 250 255
Leu Ile Arg Asn Asn Ala Ser Leu Asn Asn Asn Thr Asn Asn Asp Lys
260 265 270
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275 280 285
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Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Val
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<213> Neisseria meningitidis
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Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser Glu Asn Ser Lys
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115 120 125
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Ala Gly Gly Asn Ser Ser Gln Ala Asp Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu
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Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro
180 185 190
Thr Asp Gln Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala
195 200 205
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Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gln Ala Gln Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met
245 250 255
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260 265 270
Phe Asp Leu Asp Gln Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr Ile
275 280 285
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aatgcgagcc taaataataa tactaataat gacaaacata ccacccaata ctacagcctt 840
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<213> Neisseria meningitidis
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Ala Ser Glu Lys Asp Phe Ser Asn Lys Lys Ile Lys Ser Gly Asp Asp
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165 170 175
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180 185 190
Lys Lys Gly Gln Asp Phe Arg Glu Ile Ile Gln Pro Ser Lys Lys Gln
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Gly Asp Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Ser
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275 280 285
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<213> Neisseria meningitidis
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180 185 190
Asp Lys Ser Gly Ala Leu Ser Ala Leu Glu Glu Gly Val Leu Arg Asn
195 200 205
Gln Ala Glu Ala Ser Ser Gly His Thr Asp Phe Gly Met Thr Ser Glu
210 215 220
Phe Glu Val Asp Phe Ser Asp Lys Thr Ile Lys Gly Thr Leu Tyr Arg
225 230 235 240
Asn Asn Arg Ile Thr Gln Asn Asn Ser Glu Asn Lys Gln Ile Lys Thr
245 250 255
Thr Arg Tyr Thr Ile Gln Ala Thr Leu His Gly Asn Arg Phe Lys Gly
260 265 270
Lys Ala Leu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Thr Asn Gly Ser His Pro Phe
275 280 285
Ile Ser Asp Ser Asp Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Gly
290 295 300
Glu Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Asn Lys Val Ala Ala
305 310 315 320
Val Phe Gly Ala Lys Gln Lys Asp Lys Lys Asp Gly Glu Asn Ala Ala
325 330 335
Gly Pro Ala Thr Glu Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg Ile Thr Gly Glu
340 345 350
Glu Phe Lys Lys Glu Gln Ile Asp Ser Phe Gly Asp Val Lys Lys Leu
355 360 365
Leu Val Asp Gly Val Glu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Glu Gly Asn Lys
370 375 380
Ala Ala Phe Gln His Glu Ile Glu Gln Asn Gly Val Lys Ala Thr Val
385 390 395 400
Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe Gly Lys Leu Ser Lys Glu
405 410 415
Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gln Gly Val Arg Thr Pro Val Ser Asp
420 425 430
Val Ala Ala Arg Thr Glu Ala Asn Ala Lys Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr
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Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu Ala Ser Asn Gln
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Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe Ser Thr Lys Lys
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Ile Ser Gly Thr Leu Thr Ala Lys Asp Arg Thr Ser Pro Ala Phe Thr
485 490 495
Ile Thr Ala Met Ile Lys Asp Asn Gly Phe Ser Gly Val Ala Lys Thr
500 505 510
Gly Glu Asn Gly Phe Ala Leu Asp Pro Gln Asn Thr Gly Asn Ser His
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<213> Neisseria meningitidis
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ggcggatggt ttgcctatcc gggcgataaa caaacggaaa aggcaacagc tacatccagc 900
gatggaaatt cagcaagcag cgcgaccgtg gtattcggtg cgaaacgcca acagcctgtg 960
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
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Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu
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Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser Asn
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ala Gln Ala Gly Thr Gln Thr Asn Gly Ala Gln Thr Ala Ser Asn
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Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Met Leu Thr Arg Lys
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Asn Ser Lys Ser Ala Met Gln Ala Gly Gly Asn Ser Ser Gln Ala Asp
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Ala Lys Thr Glu Gln Val Glu Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg
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165 170 175
Ser Trp Tyr Gly His Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala
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Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Ala
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Asp Lys Lys Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gln Ala Gln
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Thr Phe Thr Ile Glu Gly Met Ile Gln Gly Asn Gly Phe Glu Gly Thr
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Ala Lys Thr Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gln Lys Asn Thr Thr
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Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly
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Asp Lys Gln Thr Glu Lys Ala Thr Ala Thr Ser Ser Asp Gly Asn Ser
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Ala Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Pro Val
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Tyr Arg Ile Thr Gly Glu Glu Phe Lys Lys Glu Gln Ile Asp Ser Phe
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Gly Val Lys Ala Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Asp Tyr Met Ser Phe
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Gly Lys Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Asp Met Phe Leu Gln Gly Val
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Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser
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Gly Glu Ala Ser Asn Gln Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Asp Val
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<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 151
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 152
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Met Thr Ala Leu Pro Ala Tyr Ala Glu Asn Val Gln Ala Gly Gln Ala
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Gln Glu Lys Gln Leu Asp Thr Ile Gln Val Lys Ala Lys Lys Gln Lys
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Arg Tyr Asp Pro Gly Ile Ala Val Val Glu Gln Gly Arg Gly Ala Ser
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165 170 175
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Leu Ala Gly Arg Ile Gly Gly Ala Glu Ala Leu Leu Ile His Thr Gly
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Arg Arg Ala Gly Glu Ile Arg Ala His Glu Asp Ala Gly Arg Gly Val
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Gln Ser Phe Asn Arg Leu Val Pro Val Glu Asp Ser Ser Glu Tyr Ala
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Tyr Phe Ile Val Glu Asp Glu Cys Glu Gly Lys Asn Tyr Glu Thr Cys
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Lys Ser Lys Pro Lys Lys Asp Val Val Gly Lys Asp Glu Arg Gln Thr
275 280 285
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Leu Ser Tyr Glu Ser Arg Ser Trp Leu Phe Arg Pro Gly Phe Arg Phe
305 310 315 320
Glu Asn Lys Arg His Tyr Ile Gly Gly Ile Leu Glu His Thr Gln Gln
325 330 335
Thr Phe Asp Thr Arg Asp Met Thr Val Pro Ala Phe Leu Thr Lys Ala
340 345 350
Val Phe Asp Ala Asn Ser Lys Gln Ala Gly Ser Leu Pro Gly Asn Gly
355 360 365
Lys Tyr Ala Gly Asn His Lys Tyr Gly Gly Leu Phe Thr Asn Gly Glu
370 375 380
Asn Gly Ala Leu Val Gly Ala Glu Tyr Gly Thr Gly Val Phe Tyr Asp
385 390 395 400
Glu Thr His Thr Lys Ser Arg Tyr Gly Leu Glu Tyr Val Tyr Thr Asn
405 410 415
Ala Asp Lys Asp Thr Trp Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Ser Tyr Asp Arg
420 425 430
Gln Gly Ile Gly Leu Asp Asn His Phe Gln Gln Thr His Cys Ser Ala
435 440 445
Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Cys Arg Pro Ser Ala Asp Lys Pro Phe Ser
450 455 460
Tyr Tyr Lys Ser Asp Arg Val Ile Tyr Gly Glu Ser His Arg Leu Leu
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Gln Ala Ala Phe Lys Lys Ser Phe Asp Thr Ala Lys Ile Arg His Asn
485 490 495
Leu Ser Val Asn Leu Gly Phe Asp Arg Phe Asp Ser Asn Leu Arg His
500 505 510
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515 520 525
Pro Pro Lys Thr Ala Asn Pro Asn Gly Asp Lys Ser Lys Pro Tyr Trp
530 535 540
Val Ser Ile Gly Gly Gly Asn Val Val Thr Gly Gln Ile Cys Leu Phe
545 550 555 560
Gly Asn Asn Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Pro Arg Ser Ile Asn Gly Lys
565 570 575
Ser Tyr Tyr Ala Ala Val Arg Asp Asn Val Arg Leu Gly Arg Trp Ala
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Asp Gly Ser Val Ser Thr Gly Thr His Arg Thr Leu Ser Trp Asn Ala
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Gly Ile Val Leu Lys Pro Ala Asp Trp Leu Asp Leu Thr Tyr Arg Thr
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<213> Neisseria meningitidis
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Leu Leu Gly Ser Arg Ala Leu Leu Asn Gly Asn Ser Arg Asn Thr Lys
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<213> Neisseria meningitidis
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aacgacaaga aaatcaaaaa tctcgacaac ttcagcaatg ccgcccaact ggttgtcgac 120
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<211> 269
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 156
Gly Ser Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
1 5 10 15
Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser
20 25 30
Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Asp Leu Ala Gly
35 40 45
Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu His Thr Ile Asn Gly Lys Thr Tyr
50 55 60
Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Met
65 70 75 80
Leu Thr Arg Lys Val Thr Trp Glu Asn Val Arg Gln Thr Ala Gly Gly
85 90 95
Ala Val Asn Gln His Lys Asn Val Gly Val Tyr Asn Arg Tyr Ala Val
100 105 110
Glu Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile
115 120 125
Pro Thr Asp Gln Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly His Ile
130 135 140
Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly
145 150 155 160
Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys Ile Thr Gly
165 170 175
Lys Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gln Ala Gln Thr Phe Thr Ile Glu Gly
180 185 190
Met Ile Gln Gly Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Glu Ser
195 200 205
Gly Phe Asp Leu Asp Gln Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lys Ala Tyr
210 215 220
Ile Thr Asp Ala Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala Tyr His Lys Ser Asp Asn Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Pro Val Gln
260 265
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<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 157
ggatcctcgt ctgaaaacag taagctgacc acggttttgg atgcggttga attgacacta 60
aacgacaaga aaatcaaaaa tctcgacaac ttcagcaatg ccgcccaact ggttgtcgac 120
ggcattatga ttgatctggc cggaacagaa tttacccgca aatttgaaca cacgattaac 180
ggcaaaacct atgaagtcga agtctgctgt tccaacctca attatctgaa atacggaatg 240
ttgacgcgca aaggcaaaca ggttgaacaa agtatgttcc tccaaggcga gcgtaccgat 300
gaaaaagaga ttccaaccga ccaaaacgtc gtttatcggg ggtcttggta cgggcatatt 360
gccaacggca caagctggag cggcaatgct tctgataaag agggcggcaa cagggcggaa 420
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 158
Gly Ser Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
1 5 10 15
Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser
20 25 30
Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Asp Leu Ala Gly
35 40 45
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50 55 60
Glu Val Glu Val Cys Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Met
65 70 75 80
Leu Thr Arg Lys Gly Lys Gln Val Glu Gln Ser Met Phe Leu Gln Gly
85 90 95
Glu Arg Thr Asp Glu Lys Glu Ile Pro Thr Asp Gln Asn Val Val Tyr
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Asn Ala Ser Asp Lys Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val Asn
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala Tyr
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Thr Ala Gln Ala Ala Leu Gly Gly Thr Arg Thr Ala Gly Ser Ser Ala
225 230 235 240
Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Pro Val Gln
245 250
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<211> 774
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 159
ggatcctcgt ctgaaaacag taagctgacc acggttttgg atgcggttga attgacacta 60
aacgacaaga aaatcaaaaa tctcgacaac ttcagcaatg ccgcccaact ggttgtcgac 120
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
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Gly Ser Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
1 5 10 15
Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser
20 25 30
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35 40 45
Ala Thr Lys Ala Val Phe Asp Glu Asn Arg Lys Tyr Gly Pro Glu Phe
50 55 60
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100 105 110
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Thr Pro Lys Ala Tyr Ile Thr Asp Ala Lys Val Lys Gly Gly Phe Tyr
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Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala Tyr His Lys Ser
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Asp Asn Gly Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Pro
245 250 255
Val Gln
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<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 161
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atgaagtttt aa 2832
<210> 162
<211> 943
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 162
Met Asn Lys Lys His Gly Phe Pro Leu Thr Leu Thr Ala Leu Ala Ile
1 5 10 15
Ala Thr Ala Phe Pro Ala Tyr Ala Ala Gln Ala Gly Gly Ala Thr Pro
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Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ser Leu Lys Glu Ile Thr Val Arg Ala Ala
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Lys Val Gly Arg Arg Ser Lys Glu Ala Thr Gly Leu Gly Lys Ile Val
50 55 60
Lys Thr Ser Glu Thr Leu Asn Lys Glu Gln Val Leu Gly Ile Arg Asp
65 70 75 80
Leu Thr Arg Tyr Asp Pro Gly Val Ala Val Val Glu Gln Gly Asn Gly
85 90 95
Ala Ser Gly Gly Tyr Ser Ile Arg Gly Val Asp Lys Asn Arg Val Ala
100 105 110
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115 120 125
Ser Leu Ser Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Ser Gly Ala Ile Asn Glu
130 135 140
Ile Glu Tyr Glu Asn Ile Ser Thr Val Glu Ile Asp Lys Gly Ala Gly
145 150 155 160
Ser Ser Asp His Gly Ser Gly Ala Leu Gly Gly Ala Val Ala Phe Arg
165 170 175
Thr Lys Glu Ala Ala Asp Leu Ile Ser Asp Gly Lys Ser Trp Gly Ile
180 185 190
Gln Ala Lys Thr Ala Tyr Gly Ser Lys Asn Arg Gln Phe Met Lys Ser
195 200 205
Leu Gly Ala Gly Phe Ser Lys Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu Ile Arg
210 215 220
Thr Glu Arg Gln Gly Arg Glu Thr Arg Pro His Gly Asp Ile Ala Asp
225 230 235 240
Gly Val Glu Tyr Gly Ile Asp Arg Leu Asp Ala Phe Arg Gln Thr Tyr
245 250 255
Asp Ile Lys Arg Lys Thr Arg Glu Pro Phe Phe Ser Val Glu Gly Glu
260 265 270
Arg Glu Ser Lys Pro Val Ala Lys Leu Ala Gly Tyr Gly Lys Tyr Leu
275 280 285
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290 295 300
Pro Leu Ser Ala Glu Glu Glu Ala Gln Val Arg Glu Ala Gln Ala Arg
305 310 315 320
His Glu Asn Leu Ser Ala Gln Ala Tyr Thr Gly Gly Gly Arg Ile Leu
325 330 335
Pro Asp Pro Met Asp Tyr Arg Ser Gly Ser Trp Leu Ala Lys Leu Gly
340 345 350
Tyr Arg Phe Gly Gly Arg His Tyr Val Gly Gly Val Phe Glu Asp Thr
355 360 365
Lys Gln Arg Tyr Asp Ile Arg Asp Met Thr Glu Lys Gln Tyr Tyr Gly
370 375 380
Thr Asp Glu Ala Glu Lys Phe Arg Asp Lys Ser Gly Val Tyr Asp Gly
385 390 395 400
Asp Asp Phe Arg Asp Gly Leu Tyr Phe Val Pro Asn Ile Glu Glu Trp
405 410 415
Lys Gly Asp Lys Asn Leu Val Arg Gly Ile Gly Leu Lys Tyr Ser Arg
420 425 430
Thr Lys Phe Ile Asp Glu His His Arg Arg Arg Arg Met Gly Leu Leu
435 440 445
Tyr Arg Tyr Glu Asn Glu Ala Tyr Ser Asp Asn Trp Ala Asp Lys Ala
450 455 460
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465 470 475 480
Lys Leu Asn Cys Ala Val Tyr Pro Ala Val Asp Lys Ser Cys Arg Ala
485 490 495
Ser Ala Asp Lys Pro Tyr Ser Tyr Asp Ser Ser Asp Arg Phe His Tyr
500 505 510
Arg Glu Gln His Asn Val Leu Asn Ala Ser Phe Glu Lys Ser Leu Lys
515 520 525
Asn Lys Trp Thr Lys His His Leu Thr Leu Gly Phe Gly Tyr Asp Ala
530 535 540
Ser Lys Ala Ile Ser Arg Pro Glu Gln Leu Ser His Asn Ala Ala Arg
545 550 555 560
Ile Ser Glu Ser Thr Gly Phe Asp Glu Asn Asn Gln Asp Lys Tyr Leu
565 570 575
Leu Gly Lys Pro Glu Val Val Glu Gly Ser Val Cys Gly Tyr Ile Glu
580 585 590
Thr Leu Arg Ser Arg Lys Cys Val Pro Arg Lys Ile Asn Gly Ser Asn
595 600 605
Ile His Ile Ser Leu Asn Asp Arg Phe Ser Ile Gly Lys Tyr Phe Asp
610 615 620
Phe Ser Leu Gly Gly Arg Tyr Asp Arg Lys Asn Phe Thr Thr Ser Glu
625 630 635 640
Glu Leu Val Arg Ser Gly Arg Tyr Val Asp Arg Ser Trp Asn Ser Gly
645 650 655
Ile Leu Phe Lys Pro Asn Arg His Phe Ser Val Ser Tyr Arg Ala Ser
660 665 670
Ser Gly Phe Arg Thr Pro Ser Phe Gln Glu Leu Phe Gly Ile Asp Ile
675 680 685
Tyr His Asp Tyr Pro Lys Gly Trp Gln Arg Pro Ala Leu Lys Ser Glu
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725 730 735
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900 905 910
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Ala Ala Pro Gly Arg Asn Phe Ser Leu Ala Leu Glu Met Lys Phe
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<210> 163
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<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 163
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aacgacaaga aaatcaaaaa tctcgacaac ttcagcaatg ccgcccaact ggttgtcgac 120
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 164
Gly Ser Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
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Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser
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Asn Ala Ala Gln Leu Val Val Asp Gly Ile Met Ile Asp Leu Ala Gly
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Gly His Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asp Lys
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Glu Gly Gly Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lys Lys
145 150 155 160
Ile Thr Gly Lys Leu Thr Ala Glu Asn Arg Gln Ala Gln Thr Phe Thr
165 170 175
Ile Glu Gly Met Ile Gln Gly Asn Gly Phe Glu Gly Thr Ala Lys Thr
180 185 190
Ala Glu Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gln Lys Asn Thr Thr Arg Thr Pro
195 200 205
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210 215 220
Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala Tyr His Lys Ser Asp Asn
225 230 235 240
Gly Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Gln Pro Val Gln
245 250 255
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<211> 777
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 165
ggatcctcgt ctgaaaacag taagctgacc acggttttgg atgcggttga attgacacta 60
aacgacaaga aaatcaaaaa tctcgacaac ttcagcaatg ccgcccaact ggttgtcgac 120
ggcattatga ttccactcct cccatacggt acggacgagg cggaaaagtt tagagacaag 180
agcggggtgg aatttacccg caaatttgaa cacacgatta acggcaaaac ctatgaagtc 240
gaagtctgct gttccaacct caattatctg aaatacggaa tgttgacgcg caaaggcaaa 300
caggttgaac aaagtatgtt cctccaaggc gagcgtaccg atgaaaaaga gattccaacc 360
gaccaaaacg tcgtttatcg ggggtcttgg tacgggcata ttgccaacgg cacaagctgg 420
agcggcaatg cttctgataa agagggcggc aacagggcgg aatttactgt gaattttgcc 480
gataaaaaaa ttaccggcaa gttaaccgct gaaaacaggc aggcgcaaac ctttaccatt 540
gagggaatga ttcagggcaa cggctttgaa ggtacggcga aaactgctga gtcaggtttt 600
gatctcgatc aaaaaaatac cacccgcacg cctaaggcat atatcacaga tgccaaggta 660
aagggcggtt tttacgggcc taaagccgaa gagttgggcg gatggtttgc ctatcataaa 720
agcgataacg gcagcgcgac cgtggtattc ggtgcgaaac gccaacagcc tgtgcaa 777
<210> 166
<211> 259
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 166
Gly Ser Ser Ser Glu Asn Ser Lys Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val
1 5 10 15
Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Lys Ile Lys Asn Leu Asp Asn Phe Ser
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aattacgaga ttatcaaagg tgtagcttat ccaaattatg gcgagctagt agataaaaca 300
gcagctgaga cgatgaaata tgttcgttct ggttatgtaa ttgatgtata tcattctggt 360
actcgtgata aaggttatgt gttttataaa ggtattactc cctcaaaaga attaccgcag 420
gggccagccc ttacctacca aggtgaatgg gattttacct cagatgctaa tttaaataat 480
gaagagggaa gacctactta tttaaacgac gattattata ctacatggat aggtaaacgg 540
gcgggcttgg tttcgggaga tgcgaaacct tcaaagcata aatacacaag ccagtttaaa 600
gttgattttg caactaaaaa aatgacaggt aagttatccg ataaagagaa aacgatttat 660
acagtcaatg ctgatattag aggtaatcgt tttacgggtt ctgctacagc aagtgataaa 720
gacaaaggga aaggtgcatc atataacttc tttagtgtcg attctcagtc tttagaaggc 780
ggcttctatg gtccaaaagc ggaagaaatg gcaggtaaat ttgtagccga cgacaaatct 840
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gcttctgttt taattattga tgggaaaaaa atggagctag ctggtagcga gtttacaaat 1020
aagcacacta ttgatatcaa tggtaaaaaa atggtagctg tagcctgctg tagtaatttg 1080
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tataaatata ttggtacttg ggatgctcag gtttcaaaag aaaataatta ctgggttgct 1260
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gcaaaaattg atggtaatgg ttttactggc gaagctaaaa cctcagatgc tggcttcgtt 1440
ctagatccag gtagtttacg tcatgacaat gtgaaattta gcgatgtagc agttagtggt 1500
ggcttctatg gtccaacggc agcagagctt ggcggacaat tccgttatca atcagacaat 1560
ggcagtgtag gtgtaggtgc tgtctttggt gcaaaacaac aagtaaaaaa ataa 1614
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Phe Ser Thr Lys Lys Thr Asp Ala Thr Ala Asn Ala Thr Thr Asn Thr
340 345 350
Thr Thr Asp Val Lys Asn Asn Ala Thr Thr Asp Thr Thr Ala Asn Ala
355 360 365
Glu Asn Phe Thr Thr Lys Asp Ile Ser Ser Phe Gly Glu Ala Asp Tyr
370 375 380
Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Pro Val Pro Leu Leu Pro Glu Asn Thr Asn
385 390 395 400
Asp Phe Ile Ser Ser Lys His His Glu Val Gly Gly Lys Arg Tyr Lys
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Val Glu Ala Cys Cys Lys Asn Leu Ser Tyr Val Lys Phe Gly Met Tyr
420 425 430
Tyr Glu Asp Lys Glu Asn Asn Lys Asn Glu Thr Asp Lys Glu Lys Glu
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450 455 460
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465 470 475 480
Arg Gly Ser Trp Phe Gly Tyr Ile Gly Asp Asp Lys Thr Ser Tyr Ser
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Val Asp Phe Asn Asn Lys Lys Leu Thr Gly Thr Leu Lys Arg His Asp
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530 535 540
Asn Asp Phe Glu Gly Thr Ala Thr Ala Glu Asn Phe Val Ile Asp Gly
545 550 555 560
Lys Asp Ser Gln Gly Asn Thr Pro Ile Asn Ile Thr Thr Lys Val Asn
565 570 575
Gly Ala Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Leu Gly Gly Tyr Phe Thr
580 585 590
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<211> 620
<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 202
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Lys Ser Asp Leu Gln Lys Leu Ser Ile Pro Ser Leu Gly Gly Gly Met
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<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 203
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Ser Ser Ser Lys Pro Arg Tyr Gln Asp Asp Thr Ser Ser Ser Arg Thr
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Lys Ser Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ile Pro Ser Leu Gly Gly Gly Met
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610
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<211> 640
<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 204
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<210> 205
<211> 91
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 205
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<210> 206
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<212> PRT
<213> Mannheimia haemolytica
<400> 206
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Ser Ser Thr Thr Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Gly Glu Ala Gln Glu
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Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asp Lys Ser Val Phe Val Val Phe
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Ala Gly Thr Arg Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ser Glu Ser Ala Phe Asp
275 280 285
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355 360 365
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515
<210> 207
<211> 688
<212> PRT
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 207
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Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Thr Leu Arg Gly Asn
275 280 285
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290 295 300
Thr Lys Leu His Pro Phe Val Phe Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly
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Phe Phe Gly Pro Gln Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Thr Tyr Glu Thr Thr Tyr Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Asp Thr Lys
435 440 445
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450 455 460
Val Asn Gly Gly Gln Val Gly Thr Lys Thr Tyr Lys Val Gln Val Cys
465 470 475 480
Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Leu Leu Thr Arg Glu Asn
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Asp Glu Asn Lys Ile Pro Gln Glu Gln Gly Ile Val Tyr Leu Gly Phe
530 535 540
Trp Tyr Gly Arg Ile Ala Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Lys Ala Ser
545 550 555 560
Asn Ala Thr Asp Gly Asn Arg Ala Lys Phe Thr Val Asn Phe Asp Arg
565 570 575
Lys Glu Ile Thr Gly Thr Leu Thr Ala Glu Asn Arg Ser Glu Ala Thr
580 585 590
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595 600 605
Lys Thr Gly Asn Asp Gly Phe Ala Pro Asp Gln Asn Asn Ser Thr Val
610 615 620
Thr His Lys Val His Ile Ala Asn Ala Glu Val Gln Gly Gly Phe Tyr
625 630 635 640
Gly Pro Asn Ala Glu Glu Leu Gly Gly Trp Phe Ala Tyr Pro Gly Asn
645 650 655
Glu Gln Thr Lys Asn Ala Thr Val Glu Ser Gly Asn Gly Asn Ser Ala
660 665 670
Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Gly Ala Lys Arg Gln Lys Leu Val Lys
675 680 685
<210> 208
<211> 683
<212> PRT
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 208
Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp Thr Glu
1 5 10 15
Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lys Tyr Gln Asp Val Pro Ser Lys Lys Pro
20 25 30
Glu Ala Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Gly Phe Ala Met Arg Phe Lys
35 40 45
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50 55 60
Leu Ser Glu Gly Asp Trp Glu Gln Thr Gly Asn Gly Asn Ile Lys Asn
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Ala Pro Leu Gln Asp Ser Ser Gln Gln Gly Glu Gly Ile Ser Lys Val
100 105 110
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115 120 125
Gln Ile Gly Asn Thr Ile Lys Lys Asp Asp Ser Ser Ser Lys Ile Ile
130 135 140
Glu Ala Arg Asn Gly Pro Asp Gly Tyr Ile Phe Tyr Lys Gly Thr Asp
145 150 155 160
Pro Ser Arg Lys Leu Pro Val Ser Gly Ser Val Glu Tyr Lys Gly Thr
165 170 175
Trp Asp Phe Leu Thr Asp Val Gln Ala Asn Gln Lys Phe Thr Asp Leu
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Thr Lys Ser Gly Asp Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gly
195 200 205
Glu Leu Asp Tyr Ile Val Arg Lys Glu Glu Asp Lys Lys Asp Gly His
210 215 220
Val Gly Leu Gly Leu Thr Thr Glu Ile Thr Val Asn Phe Glu Lys Lys
225 230 235 240
Thr Leu Ser Gly Lys Leu Ile Lys Asn Asn Met Val Ile Asn Asn Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Thr Thr Gln Tyr Tyr Ser Leu Glu Ala Gln Val Thr Gly
260 265 270
Asn Arg Phe Asn Gly Lys Ala Met Val Thr Asp Lys Pro Glu Asn Ser
275 280 285
Lys Ser Lys Gln His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly
290 295 300
Gly Phe Phe Gly Pro Gln Gly Glu Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser
305 310 315 320
Asn Asp Asn Lys Val Ala Val Val Gly Ser Ala Lys Thr Lys Asp Glu
325 330 335
Thr Ala Ser Ser Gly Gly Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Ser Ala Ser
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355 360 365
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<400> 229
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130 135 140
Val Lys Thr Asp Lys Leu Trp Asn Leu Gly Pro Val Gly Gly Val Phe
145 150 155 160
Tyr Asn Gly Thr Thr Thr Ala Lys Glu Leu Pro Thr Gln Asp Ala Val
165 170 175
Lys Tyr Lys Gly His Trp Asp Phe Met Thr Asp Val Ala Asn Arg Arg
180 185 190
Asn Arg Phe Ser Glu Val Lys Glu Asn Ser Gln Ala Gly Trp Tyr Tyr
195 200 205
Gly Ala Ser Ser Lys Asp Glu Tyr Asn Arg Leu Leu Thr Lys Glu Asp
210 215 220
Ser Ala Pro Asp Gly His Ser Gly Glu Tyr Gly His Ser Ser Glu Phe
225 230 235 240
Thr Val Asn Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Gly Lys Leu Phe Ser Asn
245 250 255
Leu Gln Asp Arg His Lys Gly Asn Val Thr Lys Thr Glu Arg Tyr Asp
260 265 270
Ile Asp Ala Asn Ile His Gly Asn Arg Phe Arg Gly Ser Ala Thr Ala
275 280 285
Ser Asn Lys Asn Asp Thr Ser Lys His Pro Phe Thr Ser Asp Ala Asn
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Asn Arg Leu Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ala
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Gly Lys Phe Leu Thr Asn Asp Asn Lys Leu Phe Gly Val Phe Gly Ala
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Lys Arg Glu Ser Lys Ala
340
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<212> PRT
<213> Moraxella catarrhalis
<400> 230
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210 215 220
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245 250 255
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<213> Mannheimia haemolytica
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<211> 235
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<213> Mannheimia haemolytica
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<213> Mannheimia haemolytica
<400> 234
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 278
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Ala Lys Arg Gln
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 279
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<213> Neisseria meningitidis
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<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 281
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Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ser Ser
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<210> 282
<211> 303
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 282
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1 5 10 15
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Tyr Lys Gly Val Trp His Phe Val Thr Asp Thr Lys Lys Gly Gln Asp
145 150 155 160
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<210> 283
<211> 513
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 283
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Gly Asp Ala Lys Pro Ser Lys His Lys Tyr Thr Ser Gln Phe Lys
165 170 175
Val Asp Phe Ala Thr Lys Lys Met Thr Gly Lys Leu Ser Asp Lys Glu
180 185 190
Lys Thr Ile Tyr Thr Val Asn Ala Asp Ile Arg Gly Asn Arg Phe Thr
195 200 205
Gly Ser Ala Thr Ala Ser Asp Lys Asp Lys Gly Lys Gly Ala Ser Tyr
210 215 220
Asn Phe Phe Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr Gly
225 230 235 240
Pro Lys Ala Glu Glu Met Ala Gly Lys Phe Val Ala Asp Asp Lys Ser
245 250 255
Leu Phe Ala Val Phe Ser Ala Lys His Asn Ala Ser Asn Val Asn Thr
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Asp Ile Asn Gly Lys Lys Met Val Ala Val Ala Cys Cys Ser Asn Leu
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Lys
<210> 284
<211> 2114
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis
<400> 284
tgtatcggcg gcaatttcgg cgtgcagcct gttgtcgaat caacgccgac gtcactttca 60
agtctaagga cgttcccact ccgccccctg ccaaaccttc tatagaaatc acgccggtca 120
accggcccgc cgtcggtgcg gcaatgcggc tgccaaggcg gaatactgct tttcatcgtg 180
aagatggcac ggaaattcca aatagcaaac aagcagaaga aaagctgtcg tttcaagaag 240
gtgatgttct gtttttatac ggttcaaaag gaaataaact tcaacaactt aaaagcgaaa 300
ttcataaacg tgattccgat gtagaaatta ggacatcaga aaaggaaaat aaaaaatatg 360
attataaatt tgtagatgca ggttatgtat atgtaaaggg aaaagatgaa attaagtgga 420
cttcagatta caagcagttt tccaaccgct taggttatga cggttttgta tattattccg 480
gagaacgtcc ttcccaatct ttaccgagtg cgggaacggt ggaatatttt ggtaactggc 540
aatatatgac cgatgccaaa cgtcatcgag caggtaaggc ggttggcatt gacaatttgg 600
gttattacac attttatggt aacgatgttg gtgcaacttc ttatgcggct aaggatgtcg 660
acgaaaggga aaaacatcct gctaaatata cggtagattt cggtaacaaa accctgacgg 720
gcgagctgat taaaaaccaa tatgtcaaac ccagtgagaa gcaaaaaccg ctgaccattt 780
acaacatcac tgccgattta aacggcaacc gctttaccgg cagtgccaag gtcaatcctg 840
atttagcgaa aagccatgcc aataaggagc atttgttttt ccatgccgat gccgatcagc 900
ggcttgaggg cggttttttc ggcgataagg gggaagagct tgccggacgg tttatcagca 960
acgacaacag cgtattcggt gtattcgcag gcaaacaaaa tagccccgtg ccgtctggaa 1020
aacacaccaa aatcttggat tctctgaaaa tttccgttga tgaggcaagt ggtgaaaatc 1080
cccgaccgtt tgccatttct cctatgcccg attttggtca tcccgacaaa cttcttgtcg 1140
aagggcatga aattcctttg gttagccaag agaaaaccat cgagcttgcc gacggcagga 1200
aaatgaccgt cagtgcttgt tgcgactttt tgacctatgt gaaactcgga cggataaaaa 1260
ccgaacgtcc cgccgccaaa ccgaaggcgc aggacgaaga ggattcggac attgataatg 1320
gcgaagaaag cgaagacgaa atcggcgatg aagaagaagg caccgaagat gcagccgcag 1380
gagatgaagg cagcgaagaa gacgaagcca cagaaaacga agacggcgaa gaagacgaag 1440
ctgaagaacc tgaagaagaa tcgtcggcag aaggcaacgg cagttcaaac gccatcctgc 1500
ctgtcccgga agcctctaaa ggcagggata tcgacctttt cctgaaaggt atccgcacgg 1560
cagaaacgaa tattccgcaa actggagaag cacgctatac cggcacttgg gaagcgcgta 1620
tcggcaaacc cattcaatgg gacaatcatg cggataaaga agcggcaaaa gcagtattta 1680
ccgttgattt cggcaagaaa tcgatttccg gaacgctgac ggagaaaaac ggtgtagaac 1740
ctgctttccg tattgaaaac ggcgtgattg agggcaacgg tttccatgcg acagcgcgca 1800
ctcgggatga cggcatcgac ctttccgggc agggttcgac caaaccgcag atcttcaaag 1860
ctaatgatct tcgtgtagaa ggaggatttt acggcccgaa ggcggaggaa ttgggcggta 1920
ttattttcaa taatgatggg aaatctcttg gtataactga aggtactgaa aataaagttg 1980
aagctgatgt tgatgttgat gttgatgttg atgttgatgt tgatgctgat gttgaacagt 2040
taaaacctga agttaaaccc caattcggcg tggtattcgg tgcgaagaaa gataataaag 2100
aggtggaaaa atga 2114
<210> 285
<211> 707
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 285
Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser Thr Pro
1 5 10 15
Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr Pro Pro
20 25 30
Pro Ala Lys Pro Ser Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro Ala Val
35 40 45
Gly Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His Arg Glu
50 55 60
Asp Gly Thr Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Ser
65 70 75 80
Phe Gln Glu Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Gly Asn Lys
85 90 95
Leu Gln Gln Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asp Ser Asp Val Glu
100 105 110
Ile Arg Thr Ser Glu Lys Glu Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys Phe Val
115 120 125
Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Val Lys Gly Lys Asp Glu Ile Lys Trp Thr
130 135 140
Ser Asp Tyr Lys Gln Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val
145 150 155 160
Tyr Tyr Ser Gly Glu Arg Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser Ala Gly Thr
165 170 175
Val Glu Tyr Phe Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala Lys Arg His
180 185 190
Arg Ala Gly Lys Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Tyr Thr Phe
195 200 205
Tyr Gly Asn Asp Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp
210 215 220
Glu Arg Glu Lys His Pro Ala Lys Tyr Thr Val Asp Phe Gly Asn Lys
225 230 235 240
Thr Leu Thr Gly Glu Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Lys Pro Ser Glu
245 250 255
Lys Gln Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asn Ile Thr Ala Asp Leu Asn Gly
260 265 270
Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Ser
275 280 285
His Ala Asn Lys Glu His Leu Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg
290 295 300
Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg
305 310 315 320
Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Gln
325 330 335
Asn Ser Pro Val Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu
340 345 350
Lys Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Ala
355 360 365
Ile Ser Pro Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu
370 375 380
Gly His Glu Ile Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala
385 390 395 400
Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Ser Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr
405 410 415
Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Ala Lys Pro Lys
420 425 430
Ala Gln Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu Ser Glu
435 440 445
Asp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Glu Gly Thr Glu Asp Ala Ala Ala Gly
450 455 460
Asp Glu Gly Ser Glu Glu Asp Glu Ala Thr Glu Asn Glu Asp Gly Glu
465 470 475 480
Glu Asp Glu Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ala Glu Gly Asn
485 490 495
Gly Ser Ser Asn Ala Ile Leu Pro Val Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg
500 505 510
Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr Asn Ile
515 520 525
Pro Gln Thr Gly Glu Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile
530 535 540
Gly Lys Pro Ile Gln Trp Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala Ala Lys
545 550 555 560
Ala Val Phe Thr Val Asp Phe Gly Lys Lys Ser Ile Ser Gly Thr Leu
565 570 575
Thr Glu Lys Asn Gly Val Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn Gly Val
580 585 590
Ile Glu Gly Asn Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asp Gly
595 600 605
Ile Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser Thr Lys Pro Gln Ile Phe Lys Ala
610 615 620
Asn Asp Leu Arg Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu
625 630 635 640
Leu Gly Gly Ile Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr
645 650 655
Glu Gly Thr Glu Asn Lys Val Glu Ala Asp Val Asp Val Asp Val Asp
660 665 670
Val Asp Val Asp Val Asp Ala Asp Val Glu Gln Leu Lys Pro Glu Val
675 680 685
Lys Pro Gln Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn Lys Glu
690 695 700
Val Glu Lys
705
<210> 286
<211> 15
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 286
Tyr Gly Thr Asp Glu Ala Glu Lys Phe Arg Asp Lys Ser Gly Val
1 5 10 15
<210> 287
<211> 15
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 287
Leu Asn Arg Trp Val Lys Glu Arg Ile Glu Gln Asn Gln Pro Leu
1 5 10 15
<210> 288
<211> 852
<212> DNA
<213> Haemophilus somnus
<400> 288
gaaacccgct ttgatgccgt taaaatcagc acggatagta ataaattaga aaaagaaacg 60
atggatacgt tcggcaatgc ggcgtattta gtgttggacg gcagacagtt tcctttggtg 120
ccggaaagta atgccggtac gacgggcgct ggcaacacag gcaagaatga gtttatcagc 180
accatagacg gtagccattt aaacaaaaca aatcatgaaa accacaaaaa atacaaagtt 240
accgtatgtt gcagtaattt ggtgtatgtg aaattcggca gctatgggga acaaacaaca 300
gcaaacgatg cttcaaacag cactgccggt gcagcaacta cgcataacag cacattaaca 360
aacggacacc ttttcctaac aggtgaacgt acttcgctta ctgatatggc gaagcaaagt 420
ggtgcagcaa agtatattgg cacatggcaa gccaactttt taagtagcaa aggacaggtt 480
ggcagtgttg acgccggtga tccgcgtaac gatagtggta aaagccgtgc tgaatttgat 540
gttaattttg gtggtaagac agttacaggc aagttttttg atgccgacgg tattcaaccc 600
gccctcacaa tggatagtac caagattgaa ggtaacggct tctcgggtac agctaagaca 660
actggtagtt tgcaattaga taaaggcagt acaggtgcgg gtataacagt aaccttcacc 720
gatgctaaag tcgatggcgc attctacggt ccgaatgcag aagaaatcgg cggtaccatc 780
acatcgaatg gcacgggcga taaagtcggt ggggtgttcg gtgcgaaacg ccaagaacta 840
tcgcaacaga aa 852
<210> 289
<211> 284
<212> PRT
<213> Haemophilus somnus
<400> 289
Glu Thr Arg Phe Asp Ala Val Lys Ile Ser Thr Asp Ser Asn Lys Leu
1 5 10 15
Glu Lys Glu Thr Met Asp Thr Phe Gly Asn Ala Ala Tyr Leu Val Leu
20 25 30
Asp Gly Arg Gln Phe Pro Leu Val Pro Glu Ser Asn Ala Gly Thr Thr
35 40 45
Gly Ala Gly Asn Thr Gly Lys Asn Glu Phe Ile Ser Thr Ile Asp Gly
50 55 60
Ser His Leu Asn Lys Thr Asn His Glu Asn His Lys Lys Tyr Lys Val
65 70 75 80
Thr Val Cys Cys Ser Asn Leu Val Tyr Val Lys Phe Gly Ser Tyr Gly
85 90 95
Glu Gln Thr Thr Ala Asn Asp Ala Ser Asn Ser Thr Ala Gly Ala Ala
100 105 110
Thr Thr His Asn Ser Thr Leu Thr Asn Gly His Leu Phe Leu Thr Gly
115 120 125
Glu Arg Thr Ser Leu Thr Asp Met Ala Lys Gln Ser Gly Ala Ala Lys
130 135 140
Tyr Ile Gly Thr Trp Gln Ala Asn Phe Leu Ser Ser Lys Gly Gln Val
145 150 155 160
Gly Ser Val Asp Ala Gly Asp Pro Arg Asn Asp Ser Gly Lys Ser Arg
165 170 175
Ala Glu Phe Asp Val Asn Phe Gly Gly Lys Thr Val Thr Gly Lys Phe
180 185 190
Phe Asp Ala Asp Gly Ile Gln Pro Ala Leu Thr Met Asp Ser Thr Lys
195 200 205
Ile Glu Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala Lys Thr Thr Gly Ser Leu
210 215 220
Gln Leu Asp Lys Gly Ser Thr Gly Ala Gly Ile Thr Val Thr Phe Thr
225 230 235 240
Asp Ala Lys Val Asp Gly Ala Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Glu Glu Ile
245 250 255
Gly Gly Thr Ile Thr Ser Asn Gly Thr Gly Asp Lys Val Gly Gly Val
260 265 270
Phe Gly Ala Lys Arg Gln Glu Leu Ser Gln Gln Lys
275 280
<210> 290
<211> 272
<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 290
Thr Lys Lys Pro Asp Ala Thr Thr Ser Thr Thr Ala Asn Ala Lys Thr
1 5 10 15
Asp Ala Thr Thr Asn Ala Glu Asn Phe Thr Thr Lys Asp Ile Ser Ser
20 25 30
Phe Gly Glu Ala Asp Tyr Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Pro Val Pro Leu
35 40 45
Leu Pro Glu Thr Glu Asn Ser Gly Asp Phe Ala Thr Ser Lys His Tyr
50 55 60
Glu Val Arg Asp Lys Thr Tyr Lys Val Glu Ala Cys Cys Lys Asn Leu
65 70 75 80
Ser Tyr Val Lys Phe Gly Met Tyr Tyr Glu Asp Asn Lys Lys Asn Asn
85 90 95
Lys Asn Glu Thr Glu Gln Tyr His Gln Phe Leu Leu Gly Leu Arg Thr
100 105 110
Ala Ser Ser Lys Ile Pro Thr Thr Gly Asn Val Lys Tyr Arg Gly Ser
115 120 125
Trp Phe Gly Tyr Ile Ser Asp Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Thr Thr Gly
130 135 140
Asp Lys Arg Gln Asp Lys Asn Ala Val Ala Glu Phe Asp Val Asn Phe
145 150 155 160
Ala Glu Lys Thr Leu Lys Gly Ser Leu Lys Arg Ala Asp Ser Gln Asn
165 170 175
Pro Val Phe Ser Ile Glu Ala Asn Phe Lys Asn Gly Gly Asn Ala Phe
180 185 190
Thr Gly Thr Ala Thr Ala Lys Asp Leu Val Ile Asp Gly Lys Asn Ser
195 200 205
Gln Thr Lys Asn Thr Pro Ile Asn Ile Thr Thr Lys Val Asn Gly Ala
210 215 220
Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Ser Glu Leu Gly Gly Tyr Phe Thr Tyr Asn
225 230 235 240
Gly Lys Asn Pro Thr Asp Lys Asn Ser Pro Thr Ala Ser Ser Pro Ser
245 250 255
Asn Ser Glu Lys Ala Arg Ala Ala Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Gln
260 265 270
<210> 291
<211> 254
<212> PRT
<213> Moraxella bovis
<400> 291
Val Gln Thr Gln Phe Asp Ala Thr Ala Ile Asp Ser Lys Thr Leu Thr
1 5 10 15
Lys Thr Asn Met Asp Thr Phe Gly Gln Ala Ser His Leu Val Ile Asp
20 25 30
Gly Lys Leu Val Ser Leu Leu Pro Glu Gly Val Ser Ser Phe Ala Asp
35 40 45
Met Lys Phe Ile Asn Thr His Gln Ile Ala His Gly Asp Lys Lys Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Val Cys Cys Asn Asn Leu Asp Tyr Val Lys Phe Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Gly Thr Val Gly Gly Thr Ala Asp Thr Pro Val Leu Ser Asp Gly
85 90 95
Lys Leu Phe Leu Val Gly Glu Arg Thr Asp Thr Ser Ala Ile Pro Thr
100 105 110
Ser Gly Thr Ala His Tyr Arg Gly Thr Trp Glu Gly Tyr Ile Asp Ser
115 120 125
Lys Asp Gly Arg Arg Trp Ala Ser Ser Ala Ser Asn Leu Thr Thr Gly
130 135 140
Thr Arg Ser Arg Phe Asp Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Leu Ile Gly
145 150 155 160
Lys Leu Ile Ala Asp Asn Gly Leu Glu Asp Asn Pro Val Leu Thr Leu
165 170 175
Asn Gly Thr Ile Thr Gly Asn Gly Phe Ser Gly Thr Ala Lys Thr Gly
180 185 190
Val Asn Gly Phe Asn Leu Asp Pro Asn Ser Thr Gly Ala Ser Ala Ile
195 200 205
Ala His Ile Asn Ala Asp Phe His Gly Gly Phe Tyr Gly Val Asn Ala
210 215 220
Ser Glu Leu Gly Gly Val Ile His His Asp Lys Val Gly Glu Asp Lys
225 230 235 240
Ile Gly Val Val Phe Gly Gly Lys Arg Gln Thr Asn Thr Pro
245 250
<210> 292
<211> 232
<212> PRT
<213> Bibersteinia trehalosi
<400> 292
Leu Lys Asp Leu Ser Lys Ser Glu Met Asp Thr Phe Gly Asn Ala Thr
1 5 10 15
His Leu Ile Ile Asn Asn Lys Gln Leu Pro Leu Ile Ala Glu Gly Lys
20 25 30
Gln Ser Phe Ala Asp Met Gln Phe Asn Asp Thr Val Thr His Asn Ile
35 40 45
Gly Gly Lys Thr Tyr Arg Val Ser Val Cys Cys Asn Asn Leu Asp Tyr
50 55 60
Val Lys Phe Gly Thr Tyr Ser Glu Glu Asp Asn Lys Asp Ser Ala His
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Val Gly Glu Arg Thr Ala Val Ser Asp Leu Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Ala Gln Tyr Arg Gly Thr Trp Asn Gly Val Ile His Ser His Ser
100 105 110
Gly Thr Val Gly Gly Glu Ser Pro Ser Asn Ser Glu Ser Gly Thr Arg
115 120 125
Ser Leu Phe Asp Val Asp Phe Ala Asn Lys Lys Ile Asn Gly Lys Leu
130 135 140
Ile Ala Asn Asp Gly Val Glu Glu Arg Pro Met Leu Ser Leu Glu Gly
145 150 155 160
Glu Ile Lys Ala Asn Gly Phe Ser Gly Ser Ala Lys Thr His Asp Ser
165 170 175
Gly Phe Asn Ile Asp Pro Lys Ser Thr Ala Gly Gly Thr Glu Val His
180 185 190
Leu Asp Ser Arg Phe Glu Gly Ala Phe Tyr Gly Lys Asn Ala Leu Glu
195 200 205
Leu Gly Gly Ile Val His Asp Ser His Ser Lys Asp Lys Val Ser Ile
210 215 220
Thr Phe Ala Gly Lys Arg Gln Ile
225 230
<210> 293
<400> 293
000
<210> 294
<211> 243
<212> PRT
<213> Haemophilus parasuis
<400> 294
Asn Thr Val Arg Ile Ile Asp Ala Ser Lys Ile Asp Leu Thr Asn Phe
1 5 10 15
Ser Ile Ser Glu Leu Thr Asn Phe Gly Asp Ala Ser Val Leu Ile Ile
20 25 30
Asp Gly Lys Lys Met Glu Leu Ala Gly Ser Glu Phe Thr Asn Lys His
35 40 45
Thr Ile Asp Ile Asn Gly Lys Lys Met Val Ala Val Ala Cys Cys Ser
50 55 60
Asn Leu Glu Tyr Met Lys Phe Gly Gln Leu Trp Gln Gln Thr Glu Gly
65 70 75 80
Glu Lys Gln Val Lys Asp Asn Ser Leu Phe Leu Gln Gly Glu Arg Thr
85 90 95
Ala Thr Asp Lys Met Pro Lys Asp Gly Asn Tyr Lys Tyr Ile Gly Thr
100 105 110
Trp Asp Ala Gln Val Ser Lys Glu Asn Asn Tyr Trp Val Ala Thr Ala
115 120 125
Asp Asp Asp Arg Lys Ala Gly Tyr Arg Thr Glu Phe Asp Val Asp Phe
130 135 140
Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gly Lys Leu Phe Asp Lys Asn Gly Val Asn
145 150 155 160
Pro Val Phe Thr Val Asn Ala Lys Ile Asp Gly Asn Gly Phe Thr Gly
165 170 175
Glu Ala Lys Thr Ser Asp Ala Gly Phe Val Leu Asp Pro Gly Ser Leu
180 185 190
Arg His Asp Asn Val Lys Phe Ser Asp Val Ala Val Ser Gly Gly Phe
195 200 205
Tyr Gly Pro Thr Ala Ala Glu Leu Gly Gly Gln Phe Arg Tyr Gln Ser
210 215 220
Asp Asn Gly Ser Val Gly Val Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Gln Gln
225 230 235 240
Val Lys Lys
<210> 295
<211> 50
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 295
Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala Ala Lys Ala Val Phe Thr Val Asp
1 5 10 15
Phe Gly Lys Lys Ser Ile Ser Gly Thr Leu Thr Glu Lys Asn Gly Val
20 25 30
Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly Asn Gly Phe
35 40 45
His Ala
50
Claims (68)
- 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질(host iron binding protein)에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된, 면역원성 조성물.
- 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 면역원성 조성물.
- 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 면역원성 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 및 상기 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된, 면역원성 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 및 상기 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 2개의 루프 도메인은 변형된, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 파스퇴렐라세아에(Pasteurellaceae), 목사렐라세아에(Moxarellaceae) 또는 나이세리아세아에(Neisseriaceae)의 박테리아 과에 속하는 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 악티노바실루스(Actinobacillus), 나이세리아(Neisseria), 헤모필루스(Haemophilus), 만헤이미아(Mannheimia), 히스토필루스(Histophilus), 파스퇴렐라(Pasteurella) 또는 모락셀라(Moraxella)의 박테리아 속에 속하는 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 TbpB 폴리펩타이드인, 면역원성 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 C 로브 도메인은 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 22; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 서열 번호 213 내지 서열 번호 218; 서열 번호 230; 서열 번호 232; 서열 번호 234 내지 서열 번호 278; 및 서열 번호 288 내지 서열 번호 292에 기재된 군으로부터 선택된 C 로브 도메인인, 면역원성 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 N 로브 도메인은 서열 번호 8; 서열 번호 10; 서열 번호 24; 서열 번호 26; 서열 번호 36; 서열 번호 38; 서열 번호 121; 서열 번호 127; 서열 번호 229; 서열 번호 231; 및 서열 번호 233에 기재된 군으로부터 선택된 N 로브 도메인인, 면역원성 조성물.
- 적어도 2개의 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 면역원성 조성물로서, 각각의 폴리펩타이드는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 C 로브 도메인은 적어도 2개의 상이한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, 면역원성 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 C 로브 도메인은 적어도 2개의 상이한 박테리아 균주로부터 얻을 수 있는, 면역원성 조성물.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 2개의 박테리아 종 또는 2개의 박테리아 균주는 상기 동일한 척추동물 종을 감염시킬 수 있는, 면역원성 조성물.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 C 로브는 항원상 다양한, 면역원성 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 악티노바실루스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 만헤이미아 헤몰리티카(Mannheimia haemolytica), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 만헤이미아 글루코시다(Mannheimia glucosida) 및 비베르스테이니아 트레할로시(Bibersteinia trehalosi)로 이루어진 박테리아의 군으로부터 얻을 수 있는 HIBP 수용체 표면 수용체로부터 얻을 수 있는, 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 박테리아 종은 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 파라수이스, 헤모필루스 솜누스, 만헤이미아 헤몰리티카, 모락셀라 카타르할리스, 모락셀라 보비스, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌기티디스, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 파라수이스, 헤모필루스 솜누스, 만헤이미아 헤몰리티카, 모락셀라 카타르할리스, 모락셀라 보비스, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌기티디스, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 2개의 종은 나이세리아 고노레아 및 나이세리아 메닌기티디스인, 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 2개의 종은 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로 이루어진 박테리아 종의 군으로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 2개의 종은 만헤이미아 헤몰리티카 및 비베르스테이니아 트레할로시로 이루어진 박테리아 종의 군으로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제4항에 있어서, 변형된 상기 적어도 하나의 루프는 루프 L1 내지 루프 L32 중 임의의 하나로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제4항에 있어서, 변형된 상기 적어도 하나의 루프는 L1, L5, L8, L12, L18, L21, L23 및 L27로 이루어진 루프 중 임의의 하나로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제4항에 있어서, 변형된 상기 적어도 하나의 루프는 서열 번호 42; 서열 번호 44; 서열 번호 46; 서열 번호 48; 서열 번호 50; 서열 번호 52; 서열 번호 54; 서열 번호 56; 서열 번호 58; 서열 번호 60; 서열 번호 62; 서열 번호 64; 서열 번호 66; 서열 번호 68; 서열 번호 70; 서열 번호 72; 서열 번호 74; 서열 번호 76; 서열 번호 78; 서열 번호 80; 서열 번호 82; 서열 번호 84; 서열 번호 86; 서열 번호 88; 서열 번호 90; 서열 번호 92; 서열 번호 94; 서열 번호 96; 서열 번호 98; 서열 번호 100; 서열 번호 102; 서열 번호 104; 및 서열 번호 106으로 이루어진 임의의 루프로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 적어도 2개의 루프 도메인은 표 2에 기재된 루프 도메인의 조합인, 면역원성 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 및 상기 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 3개의 루프 도메인은 변형되고, 상기 3개의 루프 도메인은 표 3에 기재된 루프 도메인의 조합으로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 단백질은 서열 번호 170; 서열 번호 172; 서열 번호 174; 서열 번호 176; 서열 번호 4; 서열 번호 14; 서열 번호 16; 서열 번호 18; 서열 번호 20; 서열 번호 30; 및 서열 번호 32로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 단백질은 서열 번호 6; 서열 번호 22; 및 서열 번호 40으로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 단백질은 서열 번호 164; 서열 번호 166; 및 서열 번호 168로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된, 면역원성 조성물.
- 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 작동 가능하게 연결된 성분으로서,
(ⅰ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된, 핵산 서열; 및
(ⅱ) 재조합 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열
을 포함하는 키메라 핵산 서열을 제공하는 단계;
(b) 상기 키메라 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하고 상기 숙주 세포를 성장시켜 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 단계;
(c) 상기 숙주 세포로부터 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
(d) 면역원성 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법. - 제30항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
- 작동 가능하게 연결된 성분으로서,
(ⅰ) 숙주 세포에서 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열; 및
(ⅱ) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있거나 이로부터 얻어진 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된, 핵산 서열
을 포함하는, 재조합 발현 벡터. - 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법으로서, 상기 대상체에게,
(a) 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된, 면역원; 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하고;
상기 면역원은 상기 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기에 충분한 양으로 투여되거나 발현되는, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법. - 제33항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
- 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된, 백신 조성물.
- 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 백신 조성물.
- 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 백신 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 및 상기 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된, 백신 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 및 상기 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 2개의 루프 도메인은 변형된, 백신 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 파스퇴렐라세아에, 목사렐라세아에 또는 나이세리아세아에의 박테리아 과에 속하는 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, 백신 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 악티노바실루스, 나이세리아, 헤모필루스, 만헤이미아, 히스토필루스, 파스퇴렐라 또는 모락셀라의 박테리아 속에 속하는 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, 백신 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 TbpB 폴리펩타이드인, 백신 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 C 로브 도메인은 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 22; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 119; 서열 번호 125; 서열 번호 179 내지 서열 번호 195; 서열 번호 213 내지 서열 번호 218; 서열 번호 230; 서열 번호 232; 서열 번호 234 내지 서열 번호 278; 및 서열 번호 288 내지 서열 번호 292에 기재된 군으로부터 선택된 C 로브 도메인인, 백신 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 N 로브 도메인은 서열 번호 8; 서열 번호 10; 서열 번호 24; 서열 번호 26; 서열 번호 36; 서열 번호 38; 서열 번호 121; 서열 번호 127; 서열 번호 229; 서열 번호 231; 및 서열 번호 233에 기재된 군으로부터 선택된 N 로브 도메인인, 백신 조성물.
- 적어도 2개의 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 백신 조성물로서, 각각의 폴리펩타이드는 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드의 C 로브 도메인을 포함하는, 백신 조성물.
- 제45항에 있어서, 상기 C 로브 도메인은 적어도 2개의 상이한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는, 백신 조성물.
- 제45항에 있어서, 상기 C 로브 도메인은 적어도 2개의 상이한 박테리아 균주로부터 얻을 수 있는, 백신 조성물.
- 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 2개의 박테리아 종 또는 2개의 박테리아 균주는 상기 동일한 척추동물 종을 감염시킬 수 있는, 백신 조성물.
- 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 C 로브는 항원상 다양한, 면역원성 조성물.
- 제46항에 있어서, 상기 HIBP 표면 수용체 폴리펩타이드는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 파라수이스, 헤모필루스 솜누스, 만헤이미아 헤몰리티카, 모락셀라 카타르할리스, 모락셀라 보비스, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌기티디스, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시로 이루어진 박테리아의 군으로부터 얻을 수 있는 HIBP 수용체 표면 수용체로부터 얻을 수 있는, 백신 조성물.
- 제46항에 있어서, 상기 박테리아 종은 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 파라수이스, 헤모필루스 솜누스, 만헤이미아 헤몰리티카, 모락셀라 카타르할리스, 모락셀라 보비스, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌기티디스, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제47항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스, 헤모필루스 인플루엔자, 헤모필루스 파라수이스, 헤모필루스 솜누스, 만헤이미아 헤몰리티카, 모락셀라 카타르할리스, 모락셀라 보비스, 나이세리아 고노레아, 나이세리아 메닌기티디스, 파스퇴렐라 트레할로시, 만헤이미아 글루코시다 및 비베르스테이니아 트레할로시로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제46항에 있어서, 상기 2개의 종은 나이세리아 고노레아 및 나이세리아 메닌기티디스인, 백신 조성물.
- 제46항에 있어서, 상기 2개의 종은 악티노바실루스 플루로뉴모니아, 악티노바실루스 수이스 및 헤모필루스 파라수이스로 이루어진 박테리아 종의 군으로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제46항에 있어서, 상기 2개의 종은 만헤이미아 헤몰리티카 및 비베르스테이니아 트레할로시로 이루어진 박테리아 종의 군으로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제38항에 있어서, 변형된 상기 적어도 하나의 루프는 루프 L1 내지 루프 L32 중 임의의 하나로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제38항에 있어서, 변형된 상기 적어도 하나의 루프는 L1, L5, L8, L12, L18, L21, L23 및 L27로 이루어진 루프 중 임의의 하나로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제38항에 있어서, 변형된 상기 적어도 하나의 루프는 서열 번호 42; 서열 번호 44; 서열 번호 46; 서열 번호 48; 서열 번호 50; 서열 번호 52; 서열 번호 54; 서열 번호 56; 서열 번호 58; 서열 번호 60; 서열 번호 62; 서열 번호 64; 서열 번호 66; 서열 번호 68; 서열 번호 70; 서열 번호 72; 서열 번호 74; 서열 번호 76; 서열 번호 78; 서열 번호 80; 서열 번호 82; 서열 번호 84; 서열 번호 86; 서열 번호 88; 서열 번호 90; 서열 번호 92; 서열 번호 94; 서열 번호 96; 서열 번호 98; 서열 번호 100; 서열 번호 102; 서열 번호 104; 및 서열 번호 106으로 이루어진 임의의 루프로부터 선택된, 백신 조성물.
- 제39항에 있어서, 상기 적어도 2개의 루프 도메인은 표 2에 기재된 루프 도메인의 조합인, 백신 조성물.
- 제36항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 및 상기 N 로브 도메인은 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 3개의 루프 도메인은 변형되고, 상기 3개의 루프 도메인은 표 3에 기재된 루프 도메인의 조합으로부터 선택된, 백신 조성물.
- HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단백질은 서열 번호 170; 서열 번호 172; 서열 번호 174; 서열 번호 176; 서열 번호 4; 서열 번호 14; 서열 번호 16; 서열 번호 18; 서열 번호 20; 서열 번호 30; 및 서열 번호 32로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된, 백신 조성물.
- HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단백질은 서열 번호 6; 서열 번호 22; 및 서열 번호 40으로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된, 백신 조성물.
- HIBP 표면 수용체 단백질을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단백질은 서열 번호 164; 서열 번호 166; 및 서열 번호 168로 이루어진 서열의 군으로부터 선택된, 백신 조성물.
- 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법으로서, 상기 대상체에게,
(a) 그람 음성 병원성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 적어도 2개의 C 로브 도메인 또는 적어도 2개의 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 면역원; 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는 방식으로 변형된, 상기 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하되;
상기 면역원은 상기 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기에 충분한 양으로 투여되거나 발현되는, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법. - 제64항에 있어서, 상기 C 로브 도메인 중 적어도 하나 또는 상기 N 로브 도메인 중 하나는 복수의 루프 도메인에 의해 연결된 복수의 β 가닥을 포함하고, 상기 복수의 루프 도메인의 적어도 하나의 루프 도메인은 변형된, 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
- 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기 위한,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 면역원; 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 발현 벡터의 용도. - 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기 위한 약제의 제조에서의,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 면역원; 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 발현 벡터의 용도. - 척추동물 대상체에서 면역 반응을 발생시키기 위한,
(a) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 면역원; 또는
(b) 그람 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 HIBP 표면 수용체 단백질의 C 로브 도메인 또는 N 로브 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 폴리펩타이드는 숙주 철 결합 단백질에 실질적으로 결합할 수 없는, 상기 발현 벡터의 용도.
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