EA015561B1

EA015561B1 - НОВЫЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ БЕЛОК HAEMOPHILUS INFLUENZAE (БЕЛОК E; pE)

Info

Publication number: EA015561B1
Application number: EA200870176A
Authority: EA
Inventors: Арне Форсгрен; Кристиан Риесбекк
Original assignee: Арне Форсгрен
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2011-08-30
Also published as: IL259316B; US9309293B2; US8617565B2; BRPI0707154B1; KR20080096775A; EP1973933A1; NO346497B1; JP2013126986A; EP1973933B1; CA2636566C; NO20082827L; MX2008009280A; UA92782C2; IL259316A; US9744225B2; EA200870176A1; MA30309B1; JP2009523790A; US20170326223A1; CN101374859B

Abstract

Настоящее изобретение относится к поверхностному белку (белку Е; рЕ), фактору вирулентности, который можно обнаружить у Haemophilus influenzae, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, иммуногенному фрагменту указанного поверхностного белка и рекомбинантному иммуногенному (рЕ(А)) или его процессированным вариантам на основе указанного поверхностного белка. Также описаны последовательности нуклеиновых кислот, вакцины, плазмиды и фаги, хозяева, не являющиеся человеком, последовательности рекомбинантных нуклеиновых кислот, слитые белки и продукты слияния. Также описан способ рекомбинантного получения указанного белка или его процессированных фрагментов.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к поверхностному белку Е, фактору вирулентности, который существует у всех инкапсулированных и атипичных Наеторййик шПиеп/ае.

Предпосылки к созданию изобретения

Как НаеторЫ1и8 шПиеп/ае Ь типа (Н1Ь), так и атипичная Н. шПиеп/ае (ΝΤΗί) вызывают целый ряд заболеваний у детей и взрослых. Н1Ь вызывает бактериальный менингит и другие инвазивные инфекции у детей младше 4 лет, тогда как ΝΤ^ была выделена в случаях среднего отита, синусита, эпиглоттита, трахеобронхита и пневмонии и может вызывать сепсис у новорожденных. В настоящее время отсутствует коммерчески доступная вакцина против №ГН1, а против Н1Ь используют ряд вакцин. Эти вакцины состоят из капсульного полисахарида Н1Ь, полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного с различными белковыми носителями (комплексом белков наружной мембраны менингококка, столбнячным токсоидом, нетоксичным мутантом дифтерийного токсина или дифтерийным токсоидом) для преодоления слабого иммунного ответа на капсульный полисахарид у детей младше 18 месяцев. Белки наружной мембраны Н. шПиеп/ае (ОМР) также рассматриваются в качестве носителей полирибозилрибитолфосфата, поскольку показано, что они являются мишенями для антител хозяина, сопровождая Н1Ь и №ГН1 инфекции. Антитела к ОМР Р1, Р2, Р4, Р5 и Р6 и белок 98-кДа были протестированы в ίη νίνο протективных и ίη νίίτο бактерицидных исследованиях в отношении инфекций, вызванных Н. шПиеп/ае. с антителами к Р1, Р4 и Р6, демонстрируя биологическую активность как в отношении гомологичных, так и в отношении гетерологичных штаммов Н. шПиеп/ае. Недостаточная гетерологичная защита со стороны антител в отношении других ОМР отчасти имеет место вследствие антигенной вариабельности этих белков среди различных штаммов Н. шПиеп/ае. Следовательно, идеальный антиген должен быть как представленным на поверхности бактерии, так и иметь стабильные антигенные свойства. Лабораторно был выделен, клонирован, секвенирован мембранный белок 42-кДа (белок Ό), который широко распространен и является антигенно-стабильным среди обоих штаммов Н1Ь и №ГН1, и было показано, что он является патогенетическим фактором и возможным кандидатом для вакцины (1-5).

Два десятилетия назад, было показано, что НаеторШик шПиеп/ае и М. са1аггНа118 демонстрируют высокую аффинность в отношении как растворимого, так и поверхностно-связанного 1дО человека (6). Представляется, что 1дО-связывание сравнимо с подобным взаимодействием с поверхностно-связанным 1дО на клеточном уровне, феноменом, который объясняет сильные митогенные воздействия Н. шПиеп/ае и М. са1агг11а1к на лимфоциты человека (7-9). Был выделен и клонирован 1дЭ-связывающий белок наружной мембраны Н. шПиеп/ае (белок Ό) и было показано, что он является важным патогенетическим фактором (1-5). Однако белок Ό не связывается повсеместно со всеми 1дЭ-миеломами (10).

Краткое изложение сущности изобретения

Принимая во внимание тот факт, что было обнаружено, что Н. шПиеп/ае является ведущей причиной инфекций верхних и нижних дыхательных путей, в настоящее время существует необходимость разработать вакцины, которые можно использовать против Н. шПиеп/ае.

Таким образом, задачей настоящего изобретения было выяснить, каким образом Н. шПиеп/ае взаимодействует с клетками в организме и взаимодействует с иммунной системой, и получить новый тип вакцины.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к поверхностному белку, который можно обнаружить у НаеторЫ1и8 хпйиепгае, с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности 8Еф ΙΌ N0: 1, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидрокслирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к иммуногенному фрагменту указанного поверхностного белка, этот фрагмент может быть обнаружен у Наеторййик хпйиепгае, или его природным или искусственно модифицированным вариантам.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к рекомбинантноиммуногенному белку на основе упомянутого выше поверхностного белка, в котором аминокислоты в положении с 1 по 21 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 1 были удалены или заменены одной или несколькими аминокислотами. В одном варианте осуществления аминокислоты в положении с 1 по 21 последовательности 8Еф ΙΌ N0: 1 были заменены последовательностью от 0 до 21 необязательных аминокислот. В другом варианте осуществления рекомбинантный иммуногенный белок имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, вырожденный вариант или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой продукт вторичного процессинга.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Еф ΙΌ N0: 3, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с другим дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к пептиду,

- 1 015561 имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 4, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 5, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 6, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с другим дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 7, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 8, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую пследовательности 8Е0 ΙΌ N0: 9, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 10, или его фрагменту, гомологу, функциональному эквиваленту, производному, вырожденному варианту или продукту гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другому продукту вторичного процессинга.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного белка, фрагмента или пептида, описанного выше, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции. В одном варианте осуществления эта инфекция вызвана НасшорЫНак тПиспхас. а в другом аспекте НасшорШик шПиспхас является инкапсулированной или атипичной. Еще в одном варианте осуществления указанное применение служит для профилактики или лечения среднего отита, синусита или инфекций нижних дыхательных путей у детей, а также у взрослых, например, с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему по меньшей мере один белок, фрагмент или пептид, описанный выше, и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, эксципиентов, связующих, носителей, консервантов, буферных агентов, эмульгаторов, увлажнителей или соединений, облегчающих трансфекцию.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композиции вакцины, содержащей по меньшей мере один белок, фрагмент или пептид, описанный выше. В одном варианте осуществления указанная композиция вакцины содержит по меньшей мере ди-, три- или мультимер указанного белка, фрагмента или пептида. В другом варианте осуществления композиция вакцины дополнительно содержит один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, эксципиенов, связующих, носителей, консервантов, буферных агентов, эмульгаторов, увлажнителей или соединений, облегчающих трансфекцию. Еще в одном варианте осуществления указанная композиция вакцины содержит по меньшей мере одну дополнительную вакцину, а еще в одном варианте осуществления композиция вакцины содержит иммуногенную часть другой молекулы, где эта иммуногенная часть другой молекулы может быть выбрана из группы, включающей белок Ό Н. тПиспхас (ЕР 594610), ΜΙΌ Могахс11а са1аггйа118 (А0 03/004651, А0 97/41731 и XV0 96/34960), икрА1 или ИкрА2 Могахс11а са!аттйайк (\ν0 93/03761) и белок наружной мембраны или углеводную капсулу любого патогена респираторного тракта или ДНК олигонуклеотиды, такие как мотив СрС.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, фрагмент или пептид, описанный выше, а также ее гомологам, полиморфизмам, вырожденным вариантам и вариантам сплайсинга. В одном варианте осуществления указанная последовательность нуклеиновой кислоты слита по меньшей мере с другим геном.

- 2 015561

В другом аспекте настоящее изобретение относится к плазмиде или фагу, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, описанную выше.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к хозяину, не являющемуся человеком, содержащему по меньшей мере одну плазмиду, описанную выше, и способному продуцировать белок, фрагмент или пептид, описанный выше, а также их гомологи, полиморфизмы, вырожденные варианты и варианты сплайсинга, этот хозяин выбран среди бактерий, дрожжей и растений. В одном варианте осуществления указанным хозяином является Е. со11.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку или полипептиду, где белок, фрагмент или пептид, описанный выше, объединен по меньшей мере с другим белком, путем использования рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, описанной выше. В одном варианте осуществления указанный слитый белок представляет собой ди-, три- или мультимер белка, фрагмента или пептида, описанного выше.

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к продукту слияния, в котором белок, фрагмент или пептид, описанный выше, ковалентно или посредством любого другого способа связан с белком, углеводом или матрицей.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выделения белка, фрагмента или пептида, описанного выше, указанный способ включает стадии:

a) выращивания НаеторЫ1и8 тПиепхае или Е. со11, содержащей ДНК, кодирующую указанный белок, фрагмент или пептид, сбора бактерий и выделения наружных мембран или телец включения;

b) растворения телец включения сильным растворителем;

c) добавления ренатурирующего агента и

б) диализа полученной в результате суспензии против буфера рН от 8 до 10.

В одном варианте осуществления указанного способа сильный растворитель представляет собой гуанидина гидрохлорид, а в другом варианте осуществления ренатурирующим агентом является аргинин.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к лекарственному средству или композиции вакцины, описанной выше, содержащей указанный слитый белок или полипептид, или указанный продукт слияния.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения инфекции у индивидуума, предусматривающему введение фармацевтически эффективного количества лекарственного средства или композиции вакцины, описанной выше. В одном варианте осуществления указанная инфекция вызывается НаеторЫ1и8 тПиепхае как инкапсулированной, так и атипичной, а в другом варианте осуществления инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из среднего отита, синусита или инфекций нижних дыхательных путей.

Настоящее изобретение относится к полипептидам белка Е и полинуклеотидам белка Е, рекомбинантному материалу и способам их получения. В другом аспекте изобретение относится к способам использования таких полипептидов и полинуклеотидов, включая среди прочего профилактику и лечение микробных заболеваний. В дополнительном аспекте изобретение относится к диагностическим анализам для выявления заболеваний, связанных с микробными инфекциями, и состояний, связанных с такими инфекциями, например анализы для выявления экспрессии или активности полинуклеотидов белка Е или полипептидов.

Различные изменения и модификации сущности и объема описанного изобретения будут очевидны специалистам в данной области из следующих описаний и из других частей настоящего изложения.

Описание чертежей

Фиг. 1. Белок Е 16,3 кДа НаеторЫ1и8 тПиепхае выявляют с помощью миеломного белка Ι§Ό(λ). На А показан анализ экспрессии рЕ с помощью проточной цитометрии у Н. тПиепхае 772. Показаны 808РАСЕ и Вестерн-блот (В) и 2-мерный 8О8-полиакриламидный гель-электрофорез (С) белков наружной мембраны Н. тПиепхае МшиА, обработанных Етрщеп'. Показаны экстракты белка наружной мембраны до (В) и после разделения на О-сефарозе (С). Стрелка на панели С указывает ожидаемую локализацию рЕ на основе данных Вестерн-блоттинга (используя Ι§Ο(λ) в качестве зонда) соответствующего геля. На А бактерии нагружали миеломным белком Ι§Ό(λ) с последующей инкубацией с кроличьими Е1ТСконъюгированными анти-1дО рАЬ и анализом с помощью проточной цитометрии. На В показаны 808гель. окрашеный Кумасси голубым (пятно), и Вестерн-блот, зондированный Ι§Ό(λ) миеломы человека с последующим инкубированием с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими поликлональными антителами к 1дО человека. Образцы кипятили в присутствии 2-меркаптоэтанола в течение 10 мин до загрузки.

Фиг. 2. Профили проточной цитометрии рЕ-экспрессирующей Е. сой по сравнению с Н. тПиепхае 3655 дикого типа и мутанта с дефицитом рЕ. Е. со11, содержащую пустой вектор рИС18 (А) сравнивают с бактерией, трансформированной рИС18, содержащей геномную ДНК из Н. тПиепхае 772 (гены с Н10175 по Н10178) (В). Показана экспрессия рЕ у атипичной Н. тПиепхае 3655 дикого типа (С) и у соответствующего мутанта (Ό). Е. со11 штамм ДМ83 и Н. тПиепхае выращивали в жидких культурах в течение но

- 3 015561 чи. Е. со11 инкубировали с Ι§Ο(λ) миеломы человека на льду. Через 1 ч и после промывания добавляли конъюгированные с Е1ТС кроличьи рЛЬ к Ι§ϋ человека в течение дополнительных 30 мин с последующими стадиями промывки и последующим анализом с помощью проточной цитометрии. Те же самые операции проводили с Н. тПиеп/ае 3655 или производным мутантом рЕ, используя специфические кроличьи поликлональные антитела к рЕ и конъюгированные с Е1ТС козьи антикроличьи рАЬ.

Фиг. 3. Экспрессия рЕ Н. тПиспхас и родственных видов, обнаруженная по данным проточной цитометрии и с использованием Ι§ϋ(λ) миеломной сыворотки. Было проанализировано двадцать два штамма ΝΤΗί и 27 штаммов гемофильных видов или родственных бактерий. Бактерии выращивали до стационарной фазы и инкубировали с Ι§Ρ(λ) миеломы человека на льду. Через 1 ч и после промываний добавляли конъюгированные с Б1ТС кроличьи поликлональные антитела к Ι§0 человека (рАЬ) дополнительно на 30 мин с последующими стадиями промывания и последующим анализом с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 4. рЕ экспрессируется у ΝΤΗί и инкапсулированных Н. тПиспхас по данным Вестерн-блотов. Бактериальные белки указанных штаммов получали, используя Етрщсп*. и наносили на 808-гель с последующим проведением Вестерн-блоттинга, зондированного Ι^ϋ(λ) миеломы человека и козьими поликлональными рАЬ к Ι§ϋ человека, конъюгированными с пероксидазой хрена, в качестве детектирующих антител.

Фиг. 5. Рекомбинантный рЕ22-160, основанный на последовательности ΝΤΗί 772 по сравнению с нативным рЕ Н. тПиспхас ΜίππΑ. На А показана аминоконцевая последовательность рЕ-производного фрагмента А в сравнении с предполагаемой аминокислотной последовательностью нативного белка рЕ. На В показана схематическая иллюстрация рЕ(А) с гистидиновой меткой. На С показан размер и чистота на РАСЕ, окрашенном Кумасси. На Ό и Е экстракт белка наружной мембраны (ОМР) Н. тПиспхас МшпА сравнивают с рЕ(А), полученным рекомбинантным путем, на геле, окрашенном Кумасси, и Вестерн-блоте соответственно. На А сигнальная пептидная последовательность была удалена, кроме аминокислотного остатка глутамина 21. Девять аминокислот получали на основе вектора экспрессии рЕТ26(+), как указано. Числа представляют положения аминокислот, начиная с начала трансляции рЕ. Рекомбинантный рЕ(А) получали в Е. со1г очищали и подвергали разрушению по Эдману для анализа сайта расщепления сигнальной пептидазы. На Ό и Е два геля прогоняли одновременно, один окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым, а другой блотировали на Иммобилон-Р мембраны, зондированные белком Ι§Ο(λ) миеломы человека с последующим инкубированием с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Фракцию ОМР очищали, используя Етрщсп'\ как описано в разделе Материалы и методы.

Фиг. 6. Белок Е является необычайно консервативным. Показана частота точковых мутаций в 13-31 штаммах НаеторЫ1и8 тПиспхас (табл. 2), включая как инкапсулированные, так и атипичные изоляты. Результаты были получены секвенированием, с использованием фланкирующих праймеров. Все последовательности сравнивали с последовательностью рЕ Н. шПиеп/ае Кб, которую использовали в качестве эталонной последовательности и представили здесь.

Фиг. 7. Профиль гидрофобности рЕ. Указаны гидрофобные и гидрофильные части индивидуальных аминокислотных остатков. Также отмечен предполагаемый сигнальный пептид. Данные были получены с использованием стандартного способа, как описано (21).

Фиг. 8. 808-РАСЕ, демонстрирующий рекомбинантный рЕ22-160 (фрагмент А), и серии усеченных фрагментов, обозначенные с В по Н. На А показана схема различных фрагментов, а на В показан 808РАСЕ. ДНК, кодирующую различные белки, лигировали в вектор экспрессии рЕТ26(+) и рекомбинантно экспрессировали в Е. со1г Полученные в результате гиперэкспрессированные белки очищали на никелевых смолах и разделяли на 8О8-РАСЕ с последующим окрашиванием Кумасси бриллиантовым голубым.

Фиг. 9. Мутантный штамм, дефицитный по рЕ (№ТН1 3655) обладает в 100-1000 раз меньшей способностью вызывать острый средний отит у крыс. Инфицирование вызывали у самцов крыс 8ргадиеОа\\!еу вентральным срединным разрезом на шее, с последующим введением в полость среднего уха указанного числа бактерий в 0,05 мл. Данные показаны с 3 дня заражения и являются репрезентативными по 5 животным в каждой группе.

Фиг. 10. Средние концентрации антител ^С и ΙβΛ, направленных против рЕ, в сыворотках различных возрастных групп. Анти-рЕ антитела анализировали с помощью сэндвич ЕЬКА, используя рекомбинантный рЕ(А). Чистота рЕ(А) была, как показано на фиг. 5.

Фиг. 11. рЕ является необычайно консервативным в пределах различных гемофильных штаммов. Ген ре был секвенирован у Н. тПиеп/ае инкапсулированного типа а (п=2), Ь (п=2), с (п=2), б (п=1), е (п=2) и ί (п=3), ΝΊΠί (п=8), Н. шПиеп/ае биовар аедурбсик (п=6) и Н. аедурйсик (п=5), используя фланкирующие праймеры. Кб обозначает Н. тПиеп/ае штамм Кб (Н10178), а 772 НТН| штамм 772. Числа с 65 по 577 соответствуют штаммам, отмеченным в табл. 1.

Описание изобретения

Перед подробным объяснением настоящего изобретения важно понять, что изобретение не ограничено этой заявкой подробностями описанных здесь вариантов осуществления и стадий. Приведенные

- 4 015561 примеры иллюстрируют изобретение, а не ограничивают его каким-либо образом. Изобретение может иметь другие варианты осуществления, и его можно осуществить на практике и выполнить различными способами. Должно быть понятно, что используемая здесь фразеология и терминология предназначена для описания, а не для ограничения.

В настоящей заявке описывается клонирование и экспрессия нового белка наружной мембраны Н. тПиспхас. обозначенного белком Е (рЕ). Этот белок был открыт с использованием Ι§Ό(λ) сыворотки миеломы человека со специфической аффинностью в отношении рЕ.

Для максимального увеличения выхода рекомбинантного рЕ был получен усеченный фрагмент рЕ, состоящий из аминокислотных остатков с лизина 22 до лизина 160. Ν-концевой сигнальный пептид, содержащий аминокислоту глутамин 21, был, таким образом, удален и заменен лидерным пептидом в дополнение к девяти остаткам, происходящим из вектора рЕТ26(+). Усеченный рЕ (т.е. рЕ22-160) обозначили рЕ(А).

Настоящее изобретение включает белок наружной мембраны НаешорЫ1и8 рЕ и рЕ-производные пептиды рЕ22-60, рЕ22-95, рЕ22-125, рЕ41-68, рЕ56-125, рЕ56-160, рЕ86-160, рЕ115-160, и их ди-, триили олигомеры. В частности, последовательностям рЕ или производных пептидов, которые являются поверхностными, придается более важное первостепенное значение.

Таким образом, композиции вакцины по настоящему изобретению содержат в качестве иммуногенных компонентов поверхностный белок, который может быть обнаружен у всех НаеторЫ1и8 тПием/ае, иммуногенный фрагмент указанного поверхностного белка, рекомбинантный иммуногенный белок на основе указанного поверхностного белка, рекомбинантный иммуногенный белок, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с последовательностью БЕР ΙΌ N0: 2, и/или пептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с БЕР ΙΌ N0: 3-10, или их фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, вырожденный вариант или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой продукт вторичного процессинга. Композиции вакцины также могут содержать слитый белок или полипептид или продукт слияния в соответствии с настоящим изобретением в качестве иммуногенных компонентов. Иммуногенные компоненты способны вызывать антительный или другой иммунный ответ на НаеторЫ1и§ тПием/ае, при котором образованные антитела ингибируют патогенное действие бактерий НаеторЫ1и8 шПиеп/ае на клетки индивида. Иммуногенная доза композиции вакцины в соответствии с изобретением представляет собой дозу, которая индуцирует после введения детектируемый гуморальный и/или клеточный иммунный ответ по сравнению со стандартным иммунным ответом до введения.

Последовательности нуклеиновых кислот, используемые в композиции вакцины по настоящему изобретению, для получения антигенов могут быть вставлены в любой из широкого разнообразия векторов экспрессии с помощью целого ряда способов. Считается, что такие способы известны специалистам в данной области.

Композиции вакцины легко получить, используя известные способы и методики, и их можно вводить различными путями, предпочтительно парентерально или интраназально. Составы, подходящие для парентерального или интраназального введения, включают водные или неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворы, которые придают составу изотоничность с физиологической жидкостью конкретного пациента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты или загустители. Активный иммуногенный ингредиент зачастую смешивают с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми, например водой, физиологическим раствором, декстрозой, глицерином, этанолом или подобными. Кроме того, композиция вакцины также может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, рН буферные агенты, связующие, носители или консерванты.

Композиции вакцины также могут включать адъюванты для усиления иммуногенности композиции, такие как адъюванты Фрейнда или другие системы, известные в данной области. Иммуногенные компоненты композиций вакцины, т. е. белки, фрагменты, пептиды, слитые белки или полипептиды или продукты слияния в соответствии с настоящим изобретением, могут быть составлены в вакцину в виде нейтральных или солевых форм.

Дозировка композиций вакцины будет зависеть от специфической активности вакцины, и ее легко определить с помощью общепринятых экспериментов. Композиции вакцины вводят в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным, и количество зависит от индивида.

Изобретение относится к полипептидам белка Е и полинуклеотидам, более подробно описанным ниже. В частности, изобретение относится к полипептидам и полинуклеотидам белка Е атипичной Н. 1пГ1иепхае. Полипептиды белка Е имеют сигнальную последовательность и представлены на поверхности бактерии. Сигнальный пептид расположен от остатка 1 до остатка 20 полипептида белка Е.

В настоящем изобретении ссылка на белок Е является ссылкой на любой из пептидов, иммуногенных фрагментов, слияний, полипептидов или белков по изобретению, рассматриваемых здесь (таких как БЕр ΙΌ N0: 1 с сигнальной последовательностью или без нее). Полинуклеотид, кодирующий белок

- 5 015561

Е, относится к любой полинуклеотидной последовательности, кодирующей любой из пептидов иммуногенных фрагментов, слияний, полипептидов или белков по изобретению, рассматриваемых здесь.

Термин содержащий в контексте настоящего изобретения альтернативно может быть заменен термином состоящий из.

Изобретение главным образом относится к полинуклеотидам белка Е или перечисленным здесь кодируемым полипептидам.

Понятно, что последовательности, изложенные в приведенном ниже списке последовательностей как ДНК, представляют иллюстрацию одного варианта осуществления изобретения, поскольку специалистам будет понятно, что такие последовательности могут быть успешно использованы, по существу, включая рибополинуклеотиды.

Последовательности полинуклеотидов белка Е представлены в 8ЕО ΙΌ N0: 11 (из ηίΗί штамм 772). Последовательности кодируемых полипептидов белка Е представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 1 (из ηίΗί штамма 772), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Полипептиды.

В одном аспекте изобретение относится к полипептидам Η. шПиепхае (в частности, атипичной Η. шПисп/ас). называемым здесь белок Е и полипептиды белка Е, а также к их биологически, диагностически, профилактически, клинически или терапевтически пригодным вариантам, и композициям, содержащим вышеупомянутое.

Настоящее изобретение дополнительно относится к (a) выделенному полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, наиболее предпочтительно по меньшей мере 97-99% или полную идентичность любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-10;

(b) полипептиду, кодируемому выделенным полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере 97-99% или полную идентичность любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 11 на протяжении полной длины выбранной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 0; или (c) полипептиду, кодируемому выделенным полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий по меньшей мере 85% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере 97-99% или полную идентичность, аминокислотной последовательности любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 1-10.

Полипептиды белка Е, представленные в 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, представляют собой полипептиды белка Е из атипичных штаммов Н. шПиепхае. Дополнительные последовательности белка Е были выявлены из штаммов Н. [пПпепхае, перечисленных в табл. 1.

Изобретение также относится к иммуногенному фрагменту полипептида белка Е, то есть смежной части полипептида белка Е, который имеет такую же или, по существу, такую же иммуногенную активность, что и полипептид, содержащий соответствующую аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 1-10; другими словами, этот фрагмент (при необходимости, когда соединен с носителем) способен индуцировать иммунный ответ, который распознает полипептид белка Е. Альтернативно, или дополнительно, иммуногенный фрагмент может сохранять 1дЭ связывающую функцию полноразмерного белка (как описано в разделе примеры, например, способность связывать Ι§Ό(λ) от Тйе Βίηάίη§ Зйе (В1гтшдйаш, ЕпДапб). Такой иммуногенный фрагмент может включать, например, полипептид белка Е, лишенный ^концевой лидерной последовательности и/или трансмембранного домена и/или Сконцевого якорного домена. В предпочтительном аспекте иммуногенный фрагмент белка Е в соответствии с изобретением содержит, по существу, внеклеточные домены полипептида, который имеет по меньшей мере 85% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, наиболее предпочтительно по меньшей мере 97-99% идентичность последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, по всей длине указанной последовательности.

Фрагмент представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является полностью аналогичной как часть, а не как целое, любой аминокислотной последовательности любого полипептида по изобретению. Как и в случае полипептидов белка Е, фрагменты могут быть самостоятельными или заключены в более крупный полипептид, часть или область которого они образуют, наиболее предпочтительно в виде отдельного непрерывного участка в отдельном более крупном полипептиде. Таким образом, фрагмент может быть короче нативной последовательности полной длины или, в случае заключения в более крупном полипептиде, может представлять собой полноразмерную нативную последовательность или более длинный слитый белок.

Предпочтительные фрагменты включают, например, усеченные полипептиды, имеющие часть аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, или их варианты, такие как непрерыв

- 6 015561 ные серии остатков, которые содержат амино- и/или карбоксиконцевую аминокислотную последовательность.

Предпочтительными также являются расщепленные формы полипептидов по изобретению, продуцируемые клеткой-хозяином или в клетке-хозяине. Кроме того, предпочтительными являются фрагменты, характеризующиеся структурными или функциональными свойствами, например фрагменты, которые содержат α-спираль и области, образующие α-спираль, β-складку и области, образующие β-складку, изгиб и области, образующие изгиб, гидрофильные области, гидрофобные области, α-амфипатические области, β-амфипатические области, шарнирные области, области, формирующие поверхность, участки связывания с субстратом и области с высоким антигенным индексом.

Кроме того, предпочтительные фрагменты включают выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 15, 20, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности, выбранной из БЕР ΙΌ N0: 1-10, или выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 15, 20, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот, отсеченных или удаленных из аминокислотной последовательности, выбранной из БЕр ΙΌ N0: 1-10.

Кроме того, другие предпочтительные фрагменты представляют собой фрагменты, содержащие Вклеточный эпитоп, например те фрагменты/пептиды, которые описаны в разделе Подходящие эпитопы.

Фрагменты полипептидов по изобретению могут быть использованы для получения соответствующего полноразмерного полипептида с помощью пептидного синтеза; следовательно, эти фрагменты могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения полноразмерных полипептидов по изобретению.

Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 или 1 аминокислота заменены, удалены или добавлены в любом сочетании.

Полипептиды или иммуногенные фрагменты по изобретению могут быть в форме зрелого белка или могут быть частью более крупного белка, такого как предшественник или слитый белок. Зачастую предпочтительно включать дополнительную аминокислотную последовательность, содержащую секреторные или лидерные последовательности, пропоследовательности, последовательности, которые помогают очистке, такие как многочисленные остатки гистидина, или дополнительная последовательность для стабильности при получении рекомбинантным путем. Более того, также рассматривается добавление экзогенного полипептида или липидного хвоста или полинуклеотидных последовательностей для повышения иммуногенного потенциала конечной молекулы.

В одном аспекте изобретение относится к генно-инженерным растворимым слитым белкам, содержащим полипептид по настоящему изобретению или его фрагмент и различные части константных областей тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов различных подклассов (1дО, 1дМ, 1дА, 1дЕ). Предпочтительной в качестве иммуноглобулина является константная область тяжелой цепи 1дО человека, в частности 1дО1, в которой слияние имеет место в шарнирной области. В конкретном варианте осуществления Бс-часть может быть просто удалена путем включения расщепляемой последовательности, которая может расщепляться фактором свертывания крови Ха.

Более того, это изобретение относится к способам получения таких слитых белков с помощью генной инженерии и к их применению для скрининга лекарственных средств, диагностики и лечения. Дополнительный аспект изобретения также относится к полинуклеотидам, кодирующим такие слитые белки. Примеры технологии получения слитых белков можно найти в международных патентных заявках №№ νθ 94/29458 и νθ 94/22914.

Белки могут быть конъюгированы химически или экспрессированы в виде рекомбинантных слитых белков, давая возможность получать повышенные уровни в экспрессионной системе по сравнению с неслитым белком. Партнер слияния может способствовать обеспечению эпитопов Т-хелперов (иммунологический партнер слияния), предпочтительно эпитопов Т-хелперов, распознаваемых людьми, или способствовать экспрессии белка (энхарсер экспрессии) с более высокими выходами, чем нативный рекомбинантный белок. Предпочтительно партнер слияния будет как иммунологическим партнером слияния, так и партнером, усиливающим экспрессию.

Слитые белки включают белок Ό из НаеторЫ1и8 шПисп/ас (ЕР 594610) и неструктурный белок вируса гриппа, №1 (гемагглютинин). Другим партнером слияния является белок, известный как 0тр26 (νθ 97/01638). Другой партнер слияния представляет собой белок, известный как Ьу1А. Предпочтительно используют С-концевую часть молекулы. Ьу1А получают из Б1гер1ососси8 рпеитошае, который синтезирует Ν-ацетил-Ь-аланинамидаза, амидаза Ьу1А (кодируется геном 1у1А {Репе, 43 (1986) стр. 265-272}), аутолизин, который специфически разрушает определенные связи в остове пептидогликанов. С-концевой домен белка Ьу1А отвечает за аффинность в отношении холина или некоторых аналогов холина, таких как ЭЕЛЕ. Это свойство было использовано для разработки экспрессирующих плазмид Е.соН С-Ьу1А, пригодных для экспрессии слитых белков. Была описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-Ьу1А на их аминоконцах {Вю1есйпо1о§у: 10, (1992) стр. 795-798}. Возможно использовать повторяющуюся часть молекулы Ьу1А, найденной на С-конце, начиная с остатка 178, например остатки 188- 7 015561

305.

Настоящее изобретение также включает варианты упомянутых выше полипептидов, то есть полипептидов, которые отличаются от эталонных полипептидов консервативными аминокислотными заменами, при которых остаток заменяется другим остатком с аналогичными свойствами. Такие характерные замены находятся среди А1а, Уа1, Ьеи и Не; среди 8ег и ТЬг; среди кислых остатков Акр и О1и; среди Аки и С1п и среди основных остатков Ьук и Агд или ароматических остатков РЬе и Туг.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены любым подходящим способом. Такие полипептиды включают выделенные природные полипептиды, полипептиды, полученные рекомбинантным путем, полипептиды, полученные синтетически, или полипептиды, полученные с помощью комбинации этих способов. Средства для получения таких полипептидов широко распространены в уровне техники.

Наиболее предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению был получен из атипичной Н. 1пДиепхае. однако предпочтительно он может быть получен из других организмов того же таксономического рода. Полипептид по изобретению также может быть получен, например, из организмов того же таксономического семейства или порядка.

Полинуклеотиды.

Объектом изобретения являются полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды белка Е, в частности полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, обозначенные здесь белком Е.

В особенно предпочтительном варианте осуществлления изобретения полинуклеотиды содержат область, кодирующую полипептиды белка Е, содержащую последовательности, представленные в 8ΕΟ ΙΌ N0: 11, которая включает полноразмерный ген или его вариант.

Полинуклеотиды белка Е, приведенные в 8Ε0 ΙΌ N0: 11, представляют собой полинуклеотиды белка Е из атипичной Н. тПиепхае штамма 772. Другие последовательности были определены у генов, кодирующих белок Е из штаммов Н. тПиеи/ае, перечисленных в табл. 1.

В качестве дополнительного аспекта изобретения представлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие и/или экспрессирующие полипептиды белка Е, и полинуклеотиды, главным образом, полипептиды и полинуклеотиды белка Е атипичной Н. тПиен/ае, в том числе, например, непроцессированные РНК, рибозимные РНК, мРНК, кДНК, геномные ДНК, В- и Ζ-ДНК. Дополнительные варианты осуществления изобретения включают биологически, диагностически, профилактически, клинически или терапевтически пригодные полинуклеотиды и полипептиды и их варианты и композиции, содержащие их.

Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенным полинуклеотидам, в том числе по меньшей мере к одному полноразмерному гену, который кодирует полипептид белка Е, имеющий расшифрованную аминокислотную последовательность 8Εβ ΙΌ N0: 1-10, и полинуклеотидам, близкородственным ему, и их вариантам.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду белка Е из атипичной Н. шПиепгае, содержащему или состоящему из 8Εβ ΙΌ N0: 1-10, или его варианту.

Используя представленную здесь информацию, такую как полинуклеотидные последовательности, представленные в 8Ε0 ΙΌ N0: 11, полинуклеотид по изобретению, кодирующий полипетиды белка Е, может быть получен с использованием стандартных способов клонирования и скрининга, например, для клонирования и секвенирования фрагментов хромосомной ДНК из бактерий, используя клетки атипичной Н. тПиепхае штамма 3224А (или 772) в качестве исходного материала, с последующим получением полноразмерного клона. Например, для получения полинуклеотидной последовательности по изобретению, например полинуклеотидной последовательности, приведенной в 8Ε0 ΙΌ N0: 0, обычно библиотеку клонов хромосомной ДНК атипичной Н. тПиепхае штамма 3224А (или 772) в Ε.οο1ί или каком-то другом подходящем хозяине зондируют радиоактивно меченным олигонуклеотидом, предпочтительно 17мер или длиннее, полученным из неполной последовательности. Клоны, несущие ДНК, идентичную к ДНК зонда, затем могут быть выделены с помощью гибридизации в строгих условиях. Путем секвенирования индивидуальные клоны, таким образом, идентифицируют гибридизацией с праймерами для секвенирования, сконструированными из исходной полипептидой или полинуклеотидной последовательности, затем возможно продолжить полинуклеотидную последовательность в обоих направлениях для определения последовательности всего гена. Такое секвенирование удобно проводить, например, используя денатурированную двухспиральную ДНК, полученную из плазмидного клона. Подходящие методики описаны у Машабк, Т., Егйксй, Ε.Ε. и 8атЬгоок е1 а1., Μ0ΕΕ0υΕΛΒ С’^0NIN^ А ЕАВ0ВАТ0ЕУ МАНиАТ, 2пб Ε6.; Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, №\ν Уотк (1989). (в частности, см. разделы 8сгеепшд Ву НуЬпб|/абоп 1.90 апб 8ес.|иепсшд ЭепаШгеб ОоиЫе-81гапбеб ЭХА Тетр1а!ек 13.70). Также можно провести прямой сиквенс геномной ДНК для получения полной длины последовательности гена. Иллюстрирующие это изобретение полинуклеотиды, представленные в 8Ε0 ΙΌ N0: 11, были открыты в библиотеке ДНК, полученной из атипичной Н. шПиепхае.

Кроме того, каждая последовательность ДНК, представленная в 8Ε0 ΙΌ N0: 11, содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок, имеющий приблизительно ряд аминокислотных остатков,

- 8 015561 изложенных в 8ЕЦ ГО N0: 1, с установленной молекулярной массой, которую можно вычислить, используя значения массы аминокислотных остатков, хорошо известных специалистам в данной области.

Полинуклеотиды 8ЕЦ ГО N0: 0 между стартовым кодоном и стоп-кодоном кодируют соответственно полипептид последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему или состоящему из (a) полинуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере имеет 85% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере 97-99% или полную идентичность любой полинуклеотидной последовательности из 8ЕЦ ГО N0: 11 по всей длине полинуклеотидной последовательности от 8ЕЦ ГО N0: 0; или (b) полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который имеет по меньшей мере 85% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере 97-99% или 100% полную идентичность любой аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 1-10 (или ее фрагменту), по всей длине аминокислотной последовательности из 8ЕЦ ГО N0: 1-10 (или ее фрагмента).

Полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, включая гомологи или ортологи видов, отличных от атипичной Н. шПиепхае. может быть получен способом, который включает стадии скрининга соответствующей библиотеки в строгих условиях гибридизации (например, используя температуру в интервале 45-65°С и концентрацию 8Ό8 от 0,1 до 1%) с меченым или детектируемым зондом, состоящим из или содержащим любую последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 11, или ее фрагмент; и выделения полноразмерного гена и/или геномных клонов, содержащих указанную полинуклеотидную последовательность.

Изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, идентичной по всей ее длине кодирующей последовательности (открытая рамка считывания), представленной в 8ЕЦ ГО N0: 11. Кроме того, изобретение относится к кодирующей последовательности зрелого полипептида или его фрагмента, как таковой, а также кодирующей последовательности зрелого полипептида или фрагмента в рамке считывания с другой кодирующей последовательностью, такой как последовательность, кодирующая лидерную или секреторную последовательность, пре-, или про-, или препробелковую последовательность. Полинуклеотид по изобретению также может содержать по меньшей мере одну некодирующую последовательность, в том числе, например, по меньшей мере одну некодирующую 5'- и З'-последовательность, такие как транскрибируемые, но нетранслируемые последовательности, сигналы терминации (такие как гйо-зависимые и гйо-независимые сигналы терминации), сайты связывания с рибосомой, последовательности Кохак, последовательности, которые стабилизируют мРНК, интроны и сигналы полиаденилирования, но не только. Полинуклеотидная последовательность также может содержать дополнительную кодирующую последовательность, кодирующую дополнительные аминокислоты. Например, может быть закодирована маркерная последовательность, которая облегчает очистку слитого полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид, обеспечиваемый вектором рОЕ (Цхадеп, 1пс.) и описанный у Сеп1х е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8с1., И8А 86: 821-824 (1989), или пептидный таг НА (^бкоп е! а1., Се11 37: 767 (1984), оба из которых могут быть пригодны для очистки полипептидной последовательности, слитой с ними. Полинуклеотиды по изобретению также включают, но не только, полинуклеотиды, содержащие структурный ген и последовательности, связанные с ним в природе, которые контролируют экспрессию гена.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид белка Е последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1-10, может быть идентична соответствующей полинуклеотидной кодирующей последовательности 8ЕЦ ГО N0: 11 (или содержащейся в пределах 8ЕЦ ГО N0: 11). Альтернативно это может быть любая последовательность, которая в результате избыточности (вырожденности) генетического кода также кодирует полипептид последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1-10.

Термин полинуклеотид, кодирующий полипептид в контексте настоящей заявки охватывает полинуклеотиды, которые включают последовательность, кодирующую полипептид по изобретению, в частности бактериальный полипептид, и более конкретно полипептид белка Е атипичной Н. хпДиепгае, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1-10, или ее фрагмент. Этот термин также охватывает полинулеотиды, которые включают отдельную непрерывную область или дискретные области, кодирующие этот полипептид (например, полинуклеотиды, прерванные интегрированным фагом, интегрированной вставочной последовательностью, интегрированной векторной последовательностью, интегрированной транспозонной последовательностью или вследствие редактирования РНК или реорганизации геномной ДНК) вместе с дополнительными областями, которые также могут содержать кодирующие и/или некодирующие последовательности.

Изобретение дополнительно относится к вариантам полинуклеотидов, описанных здесь, которые кодируют варианты полипептида, имеющего расшифрованную аминокислотную последовательность

- 9 015561 любой из последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 1-10. Фрагменты полинуклеотидов по изобретению могут быть использованы, например, для синтеза полной длины полинуклеотидов по изобретению.

Предпочтительными фрагментами являются те полинуклеотиды, которые кодируют В-клеточный эпитоп, например фрагменты/пептиды, описанные в разделе Подходящие эпитопы, и рекомбинантные химерные гены, содержащие указанные полинуклеотидные фрагменты.

Дополнительными особенно предпочтительными вариантами осуществления являются полинуклеотиды, кодирующие варианты белка Е, которые имеют аминокислотную последовательность полипептида белка Е любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, в которых несколько, немного, 5-10, 1-5, 1-3, 2, 1 или ни одного аминокислотного остатка заменено, модифицировано, удалено и/или добавлено в любой комбинации. Особенно предпочтительными среди них являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не изменяют свойств и активности полипептида белка Е (например, свойства, описанные здесь и в экспериментальной части).

Дополнительными предпочтительными вариантами осуществления изобретения являются полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 85% идентичны по всей длине полинуклеотидам, кодирующим полипептиды белка Е, имеющие аминокислотную последовательность, представленную в любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, и полинуклеотидам, которые комплементарны таким полинуклеотидам. Альтернативно, наиболее предпочтительными являются полинуклеотиды, которые содержат область, которая по меньшей мере на 90% идентична по всей длине полинуклеотидам, кодирующим полипептиды белка Е, и полинуклеотидам, комплементарным им. В этом смысле, особенно предпочтительными являются полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 95% идентичны полноразмерной нуклеотидной последовательности. Кроме того, полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 97% идентичны полноразмерной последовательности более предпочтительны, чем полинуклеотиды по меньшей мере с 95% идентичносью, а наиболее предпочтительны полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 98% и по меньшей мере на 99% идентичны полноразмерной последовательности, причем самыми предпочтительными являются последовательности, которые по меньшей мере на 99% идентичны полноразмерной последовательности.

Предпочтительными вариантами осуществления являются полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, которые сохраняют, по существу, ту же биологическую функцию или активность, что и зрелый полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 11 (например, те активности, которые описаны в настоящей заявке в экспериментальной части).

В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления, изобретение относится к полинуклеотидам, которые гибридизируются, в частности в строгих условиях, с полинуклеотидными последовательностями белка Е, такими как полинуклеотиды 8Е0 ΙΌ N0: 11.

Изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, которые гибридизуются с представленными здесь полинуклеотидными последовательностями. В этом смысле изобретение относится к полинуклеотидам, которые гибридизируются в строгих условиях с описанными здесь полинуклеотидами. В контексте настоящей заявки термины строгие условия и гибридизации в строгих условиях означает гибридизацию, происходящую только в том случае, если существует по меньшей мере 95% и предпочтительно по меньшей мере 97% идентичность между последовательностями. Конкретным примером гибридизации в строгих условиях является инкубация в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамида, 5х 88С (150 мМ N301, 15 мМ тринатрия цитрат), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5х раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, расщепленной ДНК спермы лосося с последующим промыванием гибридизационной подложки в 0,1 х 88С примерно при 65°С. Условия гибридизации и промывки хорошо известны и пояснены на примерах у 8ашЬгоок, с1 а1., Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 8есоп4 Ебйюп, Со14 8рппд НагЬог, КУ., (1989), в частности в части 11. Раствор для гибридизации также может быть использован с полинуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к полинуклеотиду, состоящему из или содержащему полинуклеотидную последовательность, полученную скринингом соответствующей библиотеки, содержащей полный ген для полинуклеотидной последовательности, изложенной в любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 11, в строгих условиях гибридизации с зондом, имеющим последовательность указанной полинуклеотидной последовательности, изложенной в соответствующей последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 11, или ее фрагменту; и выделение указанной полипептидной последовательности. Фрагменты, подходящие для получения такого полинуклеотида, включают, например, зонды и праймеры, описанные в этой заявке в других местах.

Рассматриваемые в других местах настоящего описания полинуклеотидные анализы в соответствии с изобретением, например полинуклеотиды по изобретению, могут быть использованы в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК и геномной ДНК для выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих белок Е, и для выделения кДНК и геномных клонов других генов, которые имеют высокую идентичность, в частности высокую идентичность последовательностей, с генами белка Е. Такие зонды, в основном, будут содержать по меньшей мере 15 нуклеотидных остатков или пар оснований.

- 10 015561

Предпочтительно такие зонды будут иметь по меньшей мере 30 нуклеотидных остатков или пар оснований и могут иметь по меньшей мере 50 нуклеотидных остатков или пар оснований. Особенно предпочтительные зонды будут иметь по меньшей мере 20 нуклеотидных остатков или пар оснований и будут иметь менее 30 нуклеотидных остатков или пар оснований.

Кодирующая область генов белка Е может быть выделена скринингом с использованием ДНК последовательности, приведенной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 для синтеза олигонуклеотидного зонда. Меченый олигонуклеотид, имеющий последовательность, комплементарную последовательности гена по изобретению, затем используют для скрининга библиотеки кДНК, геномной ДНК или мРНК для определения, с какими членами библиотеки гибридизируется этот зонд.

Существует несколько доступных и хорошо известных специалисту в уровне техники способов получения полноразмерных ДНК или удлинения коротких ДНК, например те, которые основаны на методе быстрой амплификации концов кДНК (ВАСЕ) (см., например, Егойтап, с1 а1., ΡΝΑ8 И8А 85: 8998-9002, 1988). Недавние модификации этого метода, примером которых является технологический процесс МагаШоп™ (С1оп1ссй ЬаЬога1ог1с8 1пс.), значительно упростили поиск длинномерных кДНК. В методе МагаШоп™, кДНК получают из мРНК, выделенной из выбранной ткани, и адапторную последовательность лигируют к каждому концу. Затем проводят амплификацию нуклеиновой кислоты (ПЦР) для амплифицирования пропущенного 5'-конца данной ДНК, с использованием комбинации ген-специфичных и адаптор-специфичных олигонуклеотидных праймеров. Затем ПЦР-реакцию повторяют с использованием гнездовых праймеров, то есть праймеров, сконструированных для отжига внутри амплифицированного продукта (обычно, адаптор-специфичный праймер, который отжигается после 3' в адаптерной последовательности, и ген-специфичный праймер, который отжигается после 5' в выбранной последовательности гена). Затем анализ продуктов этой реакции можно провести с помощью секвенирования ДНК, и полноразмерная ДНК может быть сконструирована путем присоединения этого продукта непосредственно к существующей ДНК для образования полной последовательности, или проведения отдельной ПЦР протяженных участков ДНК с использованием информации о новой последовательности для конструкции 5'праймера.

Полинуклеотиды и полипептиды по изобретению могут быть использованы, например, в качестве реактивов для исследований и материалов для поиска способов лечения и диагностики заболеваний, в частности заболеваний людей, как рассмотрено далее в этой заявке в отношении полинуклеотидных анализов.

Полинуклеотиды по изобретению, которые представляют собой олигонуклеотиды, происходящие из последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, могут быть использованы в описанных здесь способах, но предпочтительно для ПЦР, для определения, транскрибируются ли идентифицированные здесь полинуклеотиды полностью или частично в бактерии в инфицированной ткани или нет. Понятно, что такие последовательности также будут применимы в диагностике стадий инфекционного процесса и получении типа инфекционного патогена.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, которые кодируют полипептид, который представляет собой зрелый белок плюс дополнительные амино- или карбоксиконцевые аминокислоты или аминокислоты внутри зрелого полипептида (когда зрелая форма имеет более одной полипептидной цепи, например). Такие последовательности могут играть роль в процессинге белка из предшественника в зрелую форму, могут обеспечивать транспорт белка, могут удлинять или укорачивать период полужизни белка или могут облегчать обработку белка для анализа или получения, помимо всего прочего. Как правило, это случай ш у1уо, дополнительные аминокислоты могут быть процессированы вдали от зрелого белка клеточными ферментами.

Для каждого и всех полинуклеотидов по изобретению здесь представлен полинуклеотид, комплементарный ему. Предпочтительно, чтобы эти комплементарные полинуклеотиды были полностью комплементарными каждому полинуклеотиду, которому они комплементарны.

Белок-предшественник, имеющий зрелую форму полипептида, слитого с одной или несколькими пропоследовательностями, может представлять собой неактивную форму полипептида. Когда пропоследовательности удалены, такие неактивные предшественники, как правило, активируются. Некоторые или все пропоследовательности могут быть удалены до активации. В основном, такие предшественники называются пробелками.

Помимо стандартных А, С, С, Т/и обозначений нуклеотидов также может использоваться термин Ν при описании некоторых полинуклеотидов по изобретению. N означает, что любой из четырех ДНК или РНК нуклеотидов может присутствовать в этом обозначенном положении в ДНК или РНК последовательности, за исключением того, что предпочтительно, чтобы N не представлял собой нуклеиновую кислоту, которая в комбинации со смежными положениями нуклеотидов при считывании в правильной рамке считывания не приводила бы к появлению кодона преждевременной терминации в такой рамке считывания.

В целом, полинуклеотид по изобретению может кодировать зрелый белок, зрелый белок плюс лидерную последовательность (который можно назвать пребелком), предшественника зрелого белка,

- 11 015561 имеющего одну или несколько пропоследовательностей, которые не являются лидерными последовательностями пребелка, или препробелок, который является предшественником пробелка, имеющего лидерную последовательность и одну или несколько пропоследовательностей, которые, как правило, удаляются во время стадий процессинга, которые дают активные и зрелые формы полипептида.

В соответствии с одним аспектом изобретение относится к применению полинуклеотида по изобретению для терапевтических или профилактических целей, в частности генетической иммунизации.

Применение полинуклеотида по изобретению в генетической иммунизации будет предпочтительно использоваться в подходящем способе доставке, таком как прямое внесение плазмидной ДНК в мышцы (\Υο1ΓΓ е! а1., Нит Мо1 Оепе! (1992) 1: 363, Мал1йогре е! а1., Нит. Оепе ТНег. (1983) 4: 419), доставка ДНК в комплексе со специфическими белками-переносчиками (\Уи е! а1., 1 ΒίοΙ СНет. (1989) 264: 16985), совместная преципитация ДНК с фосфатом кальция (Вепуешйу & КеккеГ, ΡΝΆ8 и8А, (1986) 83: 9551), инкапсуляция ДНК в различные формы липосом (Капеба е! а1., 8с1епсе (1989) 243: 375), бомбардировка частиц (Тапд е! а1., №1Щге (1992) 356:152, Е1кепЬгаип е! а1., ΌΝΑ Се11 Βίο1 (1993) 12: 791) и ш νΐνο инфицирование с использованием клонированных ретровирусных векторов (8еедег е! а1., ΡΝΑ8 И8А (1984) 81: 5849).

Векторы, клетки-хозяева, системы экспрессии.

Изобретение также относится к векторам, которые содержат полинуклеотид или полинуклеотиды по изобретению, клеткам-хозяевам, которые созданы методами генной инженерии с векторами по изобретению, и получению полипептидов по изобретению с помощью рекомбинантных технологий. Бесклеточные системы трансляции также могут быть использованы для получения таких белков с использованием РНК, полученных из конструкций ДНК в соответствии с изобретением.

Рекомбинантные полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области, из генетически сконструированных клеток-хозяев, содержащих экспрессионные системы. В соответствии с этим в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессионным системам, которые содержат полинуклеотид или полинуклеотиды по настоящему изобретению, к клеткам-хозяевам, которые генетически сконструированы с такими экспрессионными системами, и к получению полипептидов по изобретению с помощью рекомбинантных технологий.

Для рекомбинантного получения полипептидов по изобретению клетки-хозяева могут быть генетически сконструированы для включения экспрессионных систем или их частей или полинуклеотидов по изобретению. Включение полинуклеотида в клетку-хозяин может осуществляться способами, описанными во многих типовых лабораторных руководствах, таких как Όηνίδ. е! а1., ВА81С МЕТНОБ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬОбУ, (1986) и 8атЬ^οοк, е! а1., МОБЕСиБАК С1.О\1\С: А БАВОКАТОКУ МА^АБ, 2пб Еб., С.о1б 8рппд ΗηώοΓ ^аЬο^а!ο^у Ргекк, С.о1б 8рпп§ На^г, Ν.Υ. (1989), такими как трансфекция с фосфатом кальция, БЕЛЕ-декстран-опосредованная трансфекция, трансвекция, микроинъекция, катионная липид-опосредованная трансфекция, электропорация, конъюгация, трансдукция, введение при соскабливании, введение баллистическим методом и инфицирование.

Характерные примеры соответствующих хозяев включают бактериальные клетки, такие как клетки стрептококков, стафилококков, энтерококков, Е. οοΐί, стрептомицетов, цианобактерий, ВасШик киЬ!Шк, №1ккепа тешпдйгбт, Наен-юркИнк тПиепхае и Μο^аxе11а са1аггйа11к; клетки грибов, например клетки дрожжей, К1цуеготусек, 8ассйаготусек, Р1сЫа, бизидомицетов, Сапб1ба а1Ысапк и АкрещШик; клетки насекомых, таких как ΌΓοκορΗΐΐΗ 82 и 8рοбοр!е^а 8Г9; клетки животных, такие как СНО, СО8, НеБа, С127, 3Т3, ВНК, 293, СУ-1 и клетки меланомы Βο\νек; и клетки растений, такие как клетки голосеменных или покрытосеменных.

Огромное разнообразие экспрессионных систем может быть использовано для получения полипептидов по изобретению. Такие векторы включают, среди прочего, векторы хромосомного, эписомального или вирусного происхождения, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из дрожжевых эписом, из вставочных элементов, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, таких как бакуловирусы, папиломавирусы, такие как 8У40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства, пикорнавирусы, ретровирусы и альфавирусы, и векторы, полученные из их комбинаций, например те, которые получены из генетических элементов плазмиды и бактериофага, например космиды и фагемиды. Конструкции экспрессионных систем могут содержать контрольные области, которые регулируют, а также вызывают экспрессию. В основном, любая система или вектор, подходящий для содержания, репродукции или экспрессии полинуклеотидов и/или для экспрессии полипептида в хозяине могут быть использованы для экспрессии в этом смысле. Соответствующая последовательность ДНК может быть вставлена в экспрессионную систему любым из различных хорошо известных и обычно используемых способов, например такими, которые описаны у 8;ιιι+ιόοΙχ е! а1., МОБЕСиБАК СБОМ^, А БАВОКАТООТ МАХиАк (выше).

В рекомбинантных системах экспрессии эукариот, для секреции транслируемого белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное окружение, соответствующие секреторные сигналы могут быть включены в экспрессируемый полипептид. Эти сигналы могут быть эндогенными в отношении полипептида или они могут быть гетерологичными сигна

- 12 015561 лами.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть восстановлены и очищены из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными способами, в том числе преципитацией сульфатом аммония или этанолом, кислой экстракцией, анион- или катион-обменной хроматографией, фосфоцеллюлозной хроматографией, хроматографией гидрофобных взаимодействий, аффинной хроматографией, гидроксилапатитной хроматографией и лектиновой хроматографией. Наиболее предпочтительно для очистки используют аффинную хроматографию иона металла (1МАС). Хорошо известные способы переукладки белка могут быть использованы для регенерации активной конформации, когда полипептид денатурируют при внутриклеточном синтезе, выделении и/или очистке.

Экспрессионная система также может представлять собой рекомбинантный живой организм, такой как вирус или бактерия. Представляющий интерес ген может быть вставлен в геном живого рекомбинантного вируса или бактерии. Инокуляция и ίη νίνο инфицирование этим живым вектором приведет к ίη νίνο экспрессии антигена и индукции иммунных реакций. Вирусы и бактерии, используемые для этой цели, представляют собой, например, поксвирусы (например, коровьей оспы, оспы птиц, оспы канареек), альфавирусы (вирус Синдбис, вирус 8ет11к1 Еогс51. вирус венесуэльского энцефалита лошадей), аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, пикорнавирусы (полиовирус, риновирус), вирусы герпеса (вирус ветряной оспы и т.п.), Листерия, Сальмонелла, Шигелла, БСС, стрептококки. Эти вирусы и бактерии могут быть вирулентными или аттенуированы различными путями для получения живых вакцин. Такие живые вакцины также составляют часть изобретения.

Диагностические, прогностические анализы, серотипирование и исследование мутаций.

Это изобретение также относится к применению полинуклеотидов белка Е и полипептидов по изобретению для использования в качестве диагностических реактивов. Выявление полинуклеотидов и/или полипептидов белка Е у эукариот, в частности млекопитающих и особенно у людей, обеспечит диагностический способ для диагностики заболевания, стадии заболевания или реакции возбудителя инфекции на лекарственные средства. Эукариоты, в частности млекопитающие, и особенно люди, в частности инфицированные организмом или у которых подозревают инфекцию, содержащим гены белка Е или белки, можно выявить на уровне нуклеиновых кислот или аминокислот целым рядом известных методик, а также способами, описанными здесь.

Полипептиды и полинуклеотиды для прогнозирования, диагностики или другого анализа могут быть получены из предположительно инфицированных и/или инфицированных материалов организма индивидуума. Полинуклеотиды из любых этих источников, в особенности ДНК или РНК, могут быть использованы для детекции непосредственно или могут быть ферментативно амплифицированы с помощью ПЦР или любых других способов амплификации перед анализом. РНК, в частности мРНК, кДНК и геномная ДНК, также могут быть использованы таким же образом. Используя амплификацию, характеристика видов и штаммов возбудителя инфекции или резидентного организма, находящегося у индивидуума, может быть осуществлена с помощью анализа генотипа выбранного полинуклеотида организма. Делеции и вставки можно обнаружить путем изменения размера амплифицированного продукта по сравнению с генотипом эталонной последовательности, выбранной из родственного организма, предпочтительно различных видов того же рода или различных штаммов одних и тех же видов. Точковые мутации могут быть идентифицированы путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченными полинуклеотидными последовательностями белка Е. Точно спаренные или спаренные в значительной степени последовательности можно отличить от неполностью или значительно в большей степени неправильно спаренных дуплексов с помощью расщепления ДНазой или РНазой, для ДНК или РНК соответственно, или путем выявления различий в температурах плавления или кинетики ренатурации. Различия полинуклеотидных последовательностей также можно выявить с помощью изменений электрофоретической подвижности полинуклеотидных фрагментов в гелях по сравнению с эталонной последовательностью. Это можно проводить с денатурирующими агентами или без них. Различия полинуклеотидов также можно выявлять непосредственным сиквенированием ДНК или РНК. См., например, Муегк е! а1., 8с1епсе, 230: 1242 (1985). Изменения последовательности в определенных локализациях также могут быть обнаружены с помощью методов защиты от нуклеазы, например методом защиты от РНазы, VI и 81 или способом химического расщепления. См., например, Со!!оп е! а1., Ргос. Иа11. Асаб. 8сЕ, И8А, 85: 4397-4401 (1985).

В другом варианте осуществления может быть сконструирована матрица олигонуклеотидных зондов, содержащих нуклеотидные последовательности белка Е или их фрагменты, для проведения эффективного скрининга, например генетических мутаций, серотипа, таксономической классификации или идентификации. Способы матричных технологий хорошо известны и имеют повсеместное применение и могут быть использованы для решения целого ряда вопросов в молекулярной генетике, включая генную экспрессию, сцепленное наследование и генетическую вариабельность (см., например, Сйее е! а1., 8с1епсе, 274: 610 (1996)).

Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к диагностическому набору, который содержит:

(а) полинуклеотид по настоящему изобретению, предпочтительно любую из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 11 или их фрагмент;

- 13 015561 (b) нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности (а);

(c) полипептид по настоящему изобретению, предпочтительно любой из полипептидов 8ЕО ΙΌ N0: 1-10 или его фрагмент; или (б) антитело к пептиду по настоящему изобретению, предпочтительно к любому из полипептидов 8ЕС) ΙΌ N0: 1-10.

Будет понятно, что в любом таком наборе (а), (Ь), (с) или (б) может содержать основной компонент. Такой набор будет применяться в диагностике заболевания или подозрения на заболевание, среди прочего.

Это изобретение также относится к применению полинуклеотидов по настоящему изобретению в качестве диагностических реактивов. Выявление мутантной формы полинуклеотида по изобретению, предпочтительно любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 11, связанной с заболеванием или патогенно стью, будет обеспечивать диагностический инструмент, который может дополнить или установить диагноз заболевания, прогноз течения заболевания, определение стадии заболевания или подверженности заболеванию, которое является результатом недостаточной экспрессии, гиперэкспресии или измененной экспрессии этого полинуклеотида. Организмы, в частности возбудители инфекции, несущие мутации в таком полинуклеотиде, могут быть обнаружены на полинуклеотидном уровне с помощью целого ряда методик, например, описанных в любом месте этой заявки.

Клетки организма, несущего мутации или полиморфизмы (аллельные варианты) в полинуклеотиде и/или полипептиде по изобретению, также можно выявить на полинуклеотидном или полипептидном уровне с помощью целого ряда методик, например, для возможности осуществления серотипирования. Например, может быть использована ОТ-ПЦР для выявления мутаций в РНК. Особенно предпочтительно использовать ОТ-ПЦР совместно с автоматизированными системами детекции, например, такими как Сепе8сап. РНК, кДНК или геномная ДНК также могут быть использованы для той же цели ПЦР. В качестве примера ПЦР-праймеры, комплементарные полинуклеотиду, кодирующему полипептиды белка Е, могут быть использованы для идентификации и анализа мутаций.

Изобретение дополнительно относится к праймерам с 1, 2, 3 или 4 нуклеотидами, удаленными с 5'и/или 3'-конца. Эти праймеры могут быть использованы, среди прочего, для амплификации ДНК белка Е и/или РНК, выделенной из образца, полученного от индивидуума, такого как биологический материал. Праймеры могут быть использованы для амплификации полинуклеотида, выделенного от инфицированного индивидуума, таким образом, чтобы этот полинуклеотид затем можно было подвергнуть различным методикам для выяснения полинуклеотидной последовательности. Следовательно, мутации в полинуклеотидной последовательности могут быть детектированы и использованы для диагностики и/или прогноза инфекции или ее стадии, или течения или для серотипирования и/или классификации инфекционного агента.

Изобретение дополнительно относится к способу диагностики заболевания, предпочтительно бактериальных инфекций, более предпочтительно инфекций, вызываемых атипичной Н. тПиепхае. включающему выявление из образца, полученного от индивидуума, такого как биоматериал, повышенного уровня экспрессии полинуклеотида, имеющего последовательность любую из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 11. Повышенная или сниженная экспрессия полинуклеотида белка Е может быть измерена с помощью любого из хорошо известных в этой области способов для количественной оценки полинуклеотидов, например, таких как амплификация, ПЦР, ОТ-ПЦР, защита от РНазы, Нозерн-блоттинг, спектрометрия и других способов гибридизации.

Кроме того, диагностическое исследование в соответствии с изобретением для выявления гиперэкспрессии полипептидов белка Е по сравнению с образцами нормальных контрольных тканей может быть использовано, например, для выявления наличия инфекции. Методики исследования, которые могут быть использованы для определения уровней полипептидов белка Е, в образце, полученном от хозяина, таком как биоматериал, хорошо известны специалистам в этой области. Такие способы исследования включают радиоиммуноанализы, анализы конкурентного связывания, Вестерн-блот анализ, сэндвичанализы с использованием антител, детекция антитела и ЕЫ8Л.

Полинуклеотиды по изобретению могут быть использованы в качестве компонентов полинуклеотидных матриц, предпочтительно матриц высокой плотности, или гридов. Эти матрицы высокой плотности главным образом используют с диагностическими и прогностическими целями. Например, набор пятен, каждое, содержащее различный ген и дополнительно содержащее полинуклеотид или полинуклеотиды по изобретению, может быть использован для зондирования, например, с использованием гибридизации или амплификации нуклеиновой кислоты, с использованием зондов, полученных из биологического образца или происходящих из него, для определения наличия у индивидуума конкретной полинуклеотидной последовательности или родственной последовательности. Такое наличие может указывать на присутствие патогена, в частности атипичной Н. тПием/ае, и может быть использовано в диагностике и/или прогнозировании заболевания или течения заболевания. Предпочтительным является грид, содержащий ряд вариантов любой полинуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 11. Также предпочтительным является ряд вариантов полинуклеотидной последовательности, кодирующей любую полипептидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1-10.

- 14 015561

Антитела.

Полипептиды и полинуклеотиды по изобретению, или их варианты, или клетки, экспрессирующие их, могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител, иммунологически специфичных в отношении таких полипептидов или полинуклеотидов соответственно. Альтернативно, мимотопы, в частности пептидные мимотопы, эпитопов в пределах полипептидной последовательности также могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител, иммунологически специфичных в отношении полипептида по изобретению. Термин иммунологически специфичные означает, что эти антитела имеют, по существу, более высокую аффинность в отношении полипептидов по изобретению, чем их аффинность в отношении других родственных полипептидов, известных из уровня техники.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к антителам против полипептидов или полинуклеотидов белка Е.

Антитела, вырабатываемые против полипептидов или полинуклеотидов по изобретению, могут быть получены путем введения полипептидов и/или полинуклеотидов по изобретению или фрагментов, несущих эпитоп, одного из них или обоих, аналогов одного или обоих или клеток, экспрессирующих любой или оба вместе, животному, предпочтительно не человеку, используя обычные протоколы. Для получения моноклональных антител может быть использована любая методика, известная в уровне техники, которая обеспечивает получение антител, продуцируемых культурами стабильных клеточных линий. Примеры включают различные методики, такие как у КоЫет, 6. и МПМсш. С, №1Шгс 256: 495-497 (1975); Κοζϋοτ е! а1., 1шшипо1о§у Тобау 4: 72 (1983); Со1е е! а1., рд. 77-96 в ΜΟΝΟίΤΟΝΑΙ. ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8 ΑΝΏ ΟΑΝΟΕΗ ΤΗΕΒΑΡΥ, А1ап В. Ыкк, 1пс. (1985).

Методики получения одноцепочечных антител (патент США № 4946778) могут быть приспособлены для получения одноцепочечных антител к полипептидам или полинуклеотидам по изобретению. Также трансгенные мыши или другие организмы или животные, такие как другие млекопитающие, могут быть использованы для экспрессии гуманизированных антител, иммунологически специфичных в отношении полипетидов или полинуклеотидов по изобретению.

Альтернативно, технология фагового дисплея может быть использована для отбора генов антител со связывающими активностями в отношении полипептида по изобретению либо из репертуара амплифицированных с помощью ПЦР ν-генов лимфоцитов людей, подвергнутых скринингу на наличие антибелка Е, либо из природных библиотек (МсСайеПу, е! а1., (1990), №1Шге 348, 552-554; Магкк, е! а1., (1992) Вю!есйпо1оду 10, 779-783).

Аффинность этих антител также может быть улучшена, например, цепьевым шаффлингом (С1асккоп е! а1., (1991) №Шге 352: 628).

Описанные выше антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды или полинуклеотиды по изобретению, для очистки полипептидов или полинуклеотидов, например, с помощью аффинной хроматографии.

Таким образом, среди прочего, антитела против полипептидов белка Е или полинуклеотидов белка Е могут быть использованы для лечения инфекций, в частности бактериальных инфекций.

Полипептидные варианты, включающие антигенно, эпитопно или иммунологически эквивалентные варианты, составляют особый аспект изобретения.

Предпочтительно антитело или его вариант модифицируют для уменьшения его иммуногенности у индивидуума. Например, если индивидуумом является человек, наиболее предпочтительно антитело может быть гуманизировано, где область или области, определяющие комплементарность, гибридомного антитела были трансплантированы в моноклональное антитело человека, например, как описано у 1опек е! а1. (1986), №1Шге 321, 522-525 или Тетрек! е! а1., (1991) Вю1ес1то1оду 9, 266-273.

Антагонисты и агонисты - исследования и молекулы.

Полипептиды и полинуклеотиды по изобретению также могут быть использованы для оценки связывания мелкомолекулярных субстратов и лигандов, например, в клетках, бесклеточных препаратах, химических библиотеках и смесях природных продуктов. Эти субстраты и лиганды могут быть природными субстратами и лигандами или могут быть структурными или функциональными миметиками. См., например, СоНдап е! а1., Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду 1(2): Сйар!ег 5 (1991).

Способами скрининга можно просто измерять связывание кандидатного соединения с полипептидом или полинуклеотидом или с клетками или мембранами, несущими полипептид, или полинуклеотид, или слитый белок полипептида, посредством метки, непосредственно прямо или опосредованно связанной с кандидатным соединением. Альтернативно, способ скрининга может включать конкуренцию с меченым конкурентным веществом. Кроме того, этими способами скрининга можно протестировать, приводит ли кандидатное соединение в результате к сигналу, генерированному активацией или ингибированием полипептида или полинуклеотида, используя системы детекции, соответствующие клеткам, содержащим этот полипептид или полинуклеотид. Ингибиторы активации в основном исследуют в присутствии известного агониста и наблюдают за влиянием присутствующего кандидатного соединения на активацию под действием агониста. Конститутивно активный полипептид и/или конститутивно экспрессируемые полипептиды и полинуклеотиды могут быть использованы в способах скрининга на инверсию

- 15 015561 агонистов или ингибиторов, в отсутствие агониста или ингибитора, путем тестирования, приведет ли кандидатное соединение к ингибированию или активации полипептида или полинуклеотида в зависимости от конкретного случая. Кроме того, способы скрининга могут просто включать стадии смешивания кандидатного соединения с раствором, содержащим полипептид или полинуклеотид по настоящему изобретению, с получением смеси, измерения активности полипептидов и/или полинуклеотидов белка Е в смеси, и сравнения активности полипептидов и/или полинуклеотидов белка Е в смеси со стандартом. Слитые белки, такие как белки, полученные из Ес-части и полипептидов белка Е, описанные здесь ранее, также могут быть использованы для скрининговых исследований с высокой пропускной способностью для идентификации антагонистов полипептидов по настоящему изобретению, а также филогенетически и/или функционально родственных полипептидов (см. Ό. Всиисй с! а1., 1. Мо1. Вссодийюи, 8:52-58 (1995) и К. .(оКапкоп с! а1., 1. Вю1. СКст., 270(16):9459-9471 (1995)).

Полинуклеотиды, полипептиды и антитела, которые связываются и/или взаимодействуют с полипептидом по настоящему изобретению, также могут быть использованы для создания способов скрининга для определения действия дополнительных компонентов на продукцию мРНК и/или полипептида в клетках. Например, ЕЫ8А можно проводить для измерения секретируемых или клеточносвязанных уровней полипептида, используя моноклональные и поликлональные антитела, с помощью стандартных способов, известных в уровне техники. Этот анализ может быть использован для выявления агентов, которые могут ингибировать или усиливать продукцию полипептида (также называемых антагонистом или агонистом соответственно) из обработанных соответствующим образом клеток или тканей.

Изобретение также относится к способу скрининга соединений для идентификации тех, которые усиливают (агонист) или блокируют (антагонист) действие полипептидов или полинуклеотидов белка Е, особенно тех соединений, которые являются бактериостатическими и/или бактерицидными. Способ скрининга может включать методики с высокой пропускной способностью. Например, для скрининга агонистов или антагонистов, синтетическую реакционную смесь, клеточный компартмент, такой как мембрана, клеточная оболочка, или клеточная стенка, или препарат любого из них, содержащих полипептиды белка Е и меченый субстрат или лиганд такого полипептида, инкубируют в отсутствии или присутствии кандидатной молекулы, которая может быть агонистом или антагонистом белка Е. Способность кандидатной молекулы вызывать агонизм или антагонизм в отношении полипептида белка Е отражается в снижении связывания меченого лиганда или снижении образования продукта из этого субстрата. Молекулы, которые связываются необоснованно, т.е. не оказывая воздействия на полипептид белка Е, наиболее вероятно являются хорошими антагонистами. Молекулы, которые связываются хорошо, и, соответственно, увеличивают скорость образования продукта из субстрата, усиливают передачу сигнала, или повышают активность химического канала, являются агонистами. Определение скорости или уровня, в зависимости от каждого конкретного случая, образования продукта из субстрата, передачи сигнала или активности химического канала можно улучшить использованием репортерной системы. Репортерные системы, которые могут быть использованы в этом отношении, включают, но не только, колориметрические, превращение меченого субстрата в продукт, репортерный ген, который отвечает за изменения активности полинуклеотидов или полипептидов белка Е, и анализы связывания, известны в уровне техники.

Другим примером исследования в отношении агонистов белка Е является конкурентный анализ, который объединяет белок Е и потенцильнаый агонист с молекулами, связывающимися с белком Е, рекомбинантными молекулами, связывающимися с белком Е, природными субстратами или лигандами или миметиками субстрата или лиганда, в соответствующих условиях для анализа конкурентного ингибирования. Белок Е можно пометить, например, радиоактивным или колориметрическим соединением таким образом, чтобы можно было точно определить количество молекул белка Е, связавшихся со связывающей молекулой или преобразовавшихся в продукт, для оценки эффективности потенциального антагониста.

Потенциальные антагонисты включают, среди прочего, низкомолекулярные органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полинуклеотидом и/или полипептидом по изобретению и, тем самым, ингибируют или подавляют их активность или экспрессию. Потенциальные антагонисты также могут представлять собой низкомолекулярные органические молекулы, пептид, полипептид, например близкородственный белок или антитело, который связывается с теми же сайтами на связывающей молекуле, такой как связывающая молекула, не индуцируя активность, индуцируемую белком Е, тем самым предотвращая действие или экспрессию полипептидов белка Е и/или полинуклеотидов, исключая полипептиды и/или полинуклеотиды белка Е из связывания.

Потенциальные антагонисты включают малую молекулу, которая связывается и занимает сайт связывания полипептида, тем самым предотвращая связывание с клеточными молекулами связывания так, чтобы не допустить нормальную биологическую активность. Примеры низкомолекулярных молекул включают, но не только, низкомолекулярные органические молекулы, пептиды или пептидоподобные молекулы. Другие потенциальные антагонисты включают антисмысловые молекулы (описание этих молекул см. у 0каио, .1. ХсигосКст. 56: 560 (1991); 0ЬЮ0ПЕ0Х¥ЕГиСЬЕ0ТГОЕ§ А8 Λ\ΤΙ8Ε\8Ε ЕЫΗΙΒΙΤ0Ρ8 0Е СЕНЕ ЕXРΚЕ88ЮN, СКС Ргскк, Воса Ва1ои, ЕЬ (1988)). Предпочтительные антагонисты

- 16 015561 включают соединения, родственные белку Е, или варианты белка Е.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к генно-инженерным растворимым слитым белкам, содержащим полипептид по настоящему изобретению или его фрагмент и различные части константных областей тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов различных подклассов (1дС, 1дМ, 1дА, 1дЕ). В качестве иммуноглобулина предпочтительной является константная область тяжелой цепи 1дС человека, в частности 1дС1, где слияние имеет место в шарнирной области. В отдельном варианте осуществления Ес-часть может быть удалена простым включением расщепляемой последовательности, которая может расщепляться под действием фактора свертывания крови Ха. Кроме того, это изобретение относится к способам получения этих слитых белков с помощью генной инженерии, и к их применению для скрининга лекарственных средств, диагностики и лечения. Дополнительный аспект изобретения также относится к полинуклеотидам, кодирующим такие слитые белки. Примеры технологии слитых белков можно найти в международных патентных заявках АО 94/29458 и АО 94/22914.

Каждая из представленных здесь полинуклеотидных последовательностей может быть использована для обнаружения и разработки антибактериальных соединений. Кодируемый белок после экспрессии может быть использован в качестве мишени для скрининга антибактериальных лекарственных средств.

Дополнительно полинуклеотидные последовательности, кодирующие аминоконцевые области кодируемого белка или последовательность Шайна-Дальгарно или другие последовательности, облегчающие трансляцию соответствующей мРНК, могут быть использованы для конструирования антисмысловых последовательностей для контроля экспрессии интересующей кодирующей последовательности.

Изобретение также относится к применению полипептида, полинуклеотида, агониста или антагониста по изобретению для оказания противодействия исходному физическому взаимодействию между патогеном или патогенами и эукариотическим хозяином, предпочтительно млекопитающим, отвечающим на последствия инфицирования. В частности, молекулы по изобретению могут быть использованы для предотвращения адгезии бактерий, в частности грамположительных и/или грамотрицательных бактерий, к белкам внеклеточного матрикса эукариот, предпочтительно млекопитающих, на имплантированных устройствах или к белкам внеклеточного матрикса в ранах; для блокирования бактериальной адгезии между белками внеклеточного матрикса эукариот, предпочтительно млекопитающих, и белка Е бактерий, которые опосредуют повреждение тканей, и/или для блокирования нормального развития патогенеза при инфекциях, вызванных иными причинами, помимо имплантации постоянных устройств или другой хирургической техники.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к агонистам и антагонистам белка Е, предпочтительно бактеристатическим или бактерицидным агонистам и антагонистам.

Антагонисты и агонисты по изобретению могут быть использованы, например, для профилактики, ингибирования и/или лечения заболеваний.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к мимотопам полипептида по изобретению. Мимотоп представляет собой пептидную последовательность, в достаточной степени сходую с нативным пептидом (по последовательности и структурно), которая может распознаваться антителами, распознающими нативный пептид; или способный индуцировать образование антител, которые распознают нативный пептид при соединении с подходящим носителем.

Пептидные мимотопы могут создаваться для конкретной цели путем добавления, делеции или замены выбранных аминокислот. Следовательно, пептиды могут быть модифицированы с целью облегчения конъюгации с белком-переносчиком. Например, может быть желательным для некоторых химических способов конъюгации включать концевой цистеин. Дополнительно может быть желательным для пептидов, конъюгированных с белком-переносчиком, включать гидрофобный конец в отдалении от конъюгированного конца пептида таким образом, чтобы свободный неконъюгированный конец пептида оставался связанным с поверхностью белка-переносчика. Тем самым, представляя пептид в конформации, которая наиболее близко напоминает конформацию пептида, находящегося в окружении целостной природной молекулы. Например, пептиды могут быть изменены для приобретения Ν-концевого цистеина и С-концевого гидрофобного амидированного хвоста. Альтернативно, добавление или замена Όстереоизомерной формы одной или нескольких аминокислот (инвертированные последовательности) можно проводить для создания благоприятного производного, например, для усиления стабильности пептида. Мимотопы также могут быть ретропоследовательностями природных пептидных последовательностей, которые имеют обратную ориентацию последовательнсти. Мимотопы также могут быть по характеру ретро-инвертированными. Ретро, инвертированные и ретро-инвертированные пептиды описаны в АО 95/24916 и АО 94/05311.

Альтернативно, пептидные мимотопы могут быть идентифицированы с использованием антител, которые сами способны связываться с полипептидами по настоящему изобретению, с помощью таких методик, как технология фагового дисплея (ЕР 0552267 В1). В этой технологии генерируется огромное число пептидных последовательностей, которые имитируют структуру нативных пептидов и, следовательно, способны связываться с антителами к нативным пептидам, но сами не обязательно могут иметь существенную гомологию последовательности с нативным полипептидом.

- 17 015561

Вакцины.

Другой аспект изобретения относится к способу индукции иммунологического ответа у индивидуума, в частности у млекопитающего, предпочтительно у людей, включающему инфицирование индивидуума полинуклеотидом и/или полипептидом белка Е или его фрагментом или вариантом, подходящим для продукции антитела и/или Т-клеточного иммунного ответа для защиты указанного индивидуума от инфекции, в частности бактериальной инфекции и наиболее предпочтительно инфекции, вызванной атипичной Н. шПиепхае. Также предусматриваются способы, посредством которых такой иммунологический ответ замедляет репликацию бактерий. Еще один аспект изобретения относится к способу индукции иммунологического ответа у индивидуума, который включает введение этому индивидууму нуклеотидного вектора, последовательности или рибозима для направления экспрессии полинуклеотидов и/или полипептидов белка Е или их фрагмента или вариантов, для экспрессии полинуклеотидов и/или полипептидов белка Е или их фрагмента или варианта ш у1уо для индукции иммунологического ответа, в том числе, например, цитокин-продуцирующих Т-клеток или цитотоксических Т-клеток, для защиты указанного индивидуума, предпочтительно человека, от заболевания независимо от того, развилось ли уже у индивидуума это заболевание или нет. Одним примером введения гена является введение путем запуска их в желаемые клетки в виде нанесения на частицы или иным путем. Такой нуклеотидный вектор может содержать ДНК, РНК, рибозим, модифицированную нуклеиновую кислоту, гибрид ДНК/РНК, комплекс ДНК-белок или комплекс РНК-белок.

Дополнительный аспект изобретения относится к иммунологической композиции, которая при введении индивидууму, предпочтительно человеку, способному иметь индуцированный иммунологический ответ, индуцирует иммунологический ответ у этого индивидуума на полинуклеотид и/или полипептид белка Е, кодируемого им, где эта композиция содержит рекомбинантный полинуклеотид белка Е и/или полипептид, кодируемый им и/или содержит ДНК и/или РНК, которая кодирует и экспрессирует антиген указанного полинуклеотида белка Е, полипептида, кодируемого им, или другого полипептида по изобретению. Иммунологический ответ может быть использован терапевтически или профилактически и может принимать форму антительного иммунитета и/или клеточного иммунитета, например, клеточного иммунитета, обусловленного СТЬ или СЭ4+ Т-клетками.

Полипептиды белка Е или их фрагменты могут быть слиты с ко-белком или химической частью, которая сама может или не может продуцировать антитела, но которая способна стабилизировать первый белок и продуцировать слитый или модифицированный белок, который будет обладать антигенными и/или иммуногенными свойствами и предпочтительно протективными свойствами. Следовательно, слитый рекомбинантный белок предпочтительно дополнительно содержит антигенный ко-белок, такой как липопротеин или белок Ό Наеторййик тПиепхае (ЕР 594610), глутатион-8-трансферазу (С8Т) или βгалактозидазу, или любой другой относительно крупный ко-белок, который солюбилизирует белок и облегчает его продукцию и очистку. Кроме того, ко-белок может действовать в качестве адъюванта в смысле обеспечения генерализированой стимуляции иммунной системы организма, получающего этот белок. Ко-белок может быть присоединен либо к амино-, либо к карбоксиконцу первого белка.

В композиции вакцины по изобретению полипептиды и/или полинуклеотиды белка Е, или их фрагмент, или мимотоп, или вариант могут находиться в векторе, например живых рекомбинантных векторах, описанных выше, например живых бактериальных векторах.

Также подходят неживые векторы для полипептидов белка Е, например везикулы наружной мембраны бактерий или пузырьки. Пузырьки наружной мембраны образуются из наружной мембраны двухслойной мембраны грамотрицательных бактерий и были документально зафиксированы у многих грамотрицательных бактерий (2йои, Ь. е1 а1., 1998. ЕЕМ8 МюгоЬю1. йен. 163:223-228), в том числе С. ПасйотаШ и С. райасЕ Неполный перечень бактериальных патогенов, которые, как сообщается, образуют пузырьки, также включает ВогПе1е11а репи8818, Вопейа ЬигдйогЕеп, Вшсе11а теШеикЦ, Вшсе11а оуЦ, ЕкйепсЫа сой, Наеторййик тПиен/ае, Ьедюиейа рпеиторйПа, Могахейа са1аггйай§, №188епа допоггйоеае, №155епа тешпдйЕйЦ, Ркеийотопак аегидтока и Уегыша еШегосоййса.

Преимущество пузырьков состоит в том, что белки наружной мембраны представлены в их нативной конформации и, следовательно, особенно подходят для вакцин. Пузырьки также можно усовершенствовать для использования в вакцинах путем создания бактерии, таким образом, чтобы модифицировать экспрессию одной или нескольких молекул на наружной мембране. Таким образом, например, экспрессия желаемого иммуногенного белка на наружной мембране, например полипептидов белка Е, может быть интродуцирована или активирована (например, путем изменения промотора). Вместо этого или в дополнение к этому, экспрессия молекул наружной мембраны, которые либо не релевантны (например, непротективные антигены или иммунодоминантные, но вариабельные белки), либо являются вредными (например, токсические молекулы, такие как ЬР8, или потенциальные индукторы аутоиммунной реакции) может быть подавлена. Эти подходы более подробно рассматриваются ниже.

Некодирующие фланкирующие области генов белка Е содержат регуляторные элементы, важные для экспрессии этого гена. Эта регуляция имеет место как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Последовательность этих областей либо выше, либо ниже открытой рамки считывания этого

- 18 015561 гена может быть получена путем секвенирования ДНК. Эта информация о последовательности дает возможность определить потенциальные регуляторные мотивы, такие как различные промоторные элементы, терминаторные последовательности, индуцибельные элементы последовательностей, репрессоры, элементы, ответственные за фазовую вариацию, последовательность Шайна-Дальгарно, области с потенциальной вторичной структурой, вовлеченной в регуляцию, а также другие типы регуляторных мотивов или последовательностей. Эта последовательность представляет собой дополнительный аспект изобретения.

Эта информация о последовательности позволяет модулировать природную экспрессию генов белка Е. Активация генной экспрессии может осуществляться путем изменения промотора, последовательности Шайна-Дальгарно, потенциальных репрессорных или операторных элементов или любых других, вовлеченных в этот процесс, элементов. Подобным образом, подавление экспрессии может достигаться аналогичными типами модификации.

Альтернативно, путем изменения последовательностей вариации фаз, экспрессия гена может быть поставлена под контроль вариации фаз, или может быть не связана с этой регуляцией. В другом подходе экспрессия гена может быть поставлена под контроль одного или нескольких индуцибельных элементов, позволяющих осуществлять регулируемую экспрессию. Примеры такой регуляции включают, но не только, индукцию температурным сдвигом, добавление субстрата-индуктора наподобие выбранных углеводов или их производных, микроэлементов, витаминов, кофакторов, ионов металла и т. п.

Такие модификации, как описано выше, могут быть введены несколькими различными способами. Модификацию последовательностей, вовлеченных в генную экспрессию, можно осуществлять ш у1уо путем случайного мутагенеза с последующей селекцией желаемого фенотипа. Другой подход состоит в выделении области, представляющей интерес, и модификации этой области посредством случайного мутагенеза или сайт-направленным мутагенезом замены, вставочным или делеционным мутагенезом. Модифицированную область затем можно снова ввести в бактериальный геном посредством гомологичной рекомбинации и можно оценить воздействие на генную экспрессию. В другом подходе знание о последовательности в представляющей интерес области может быть использовано для замены или делеции всех природных регуляторных последовательностей или части из них. В этом случае намеченную регуляторную область выделяют и модифицируют таким образом, чтобы она содержала регуляторные элементы другого гена, сочетание регуляторных элементов различных генов, синтетическую регуляторную область или любую другую регуляторную область, или для делеции выбранных частей регуляторных последовательностей дикого типа. Эти модифицированные последовательности затем могут быть повторно введены в бактерию посредством гомологичной рекомбинации в геном. Неполный перечень предпочтительных промоторов, которые могли быть использованы для активации генной экспрессии, включает промоторы рогА, рогВ, 1ЬрВ, 1ЬрВ, р110, 181, йрцАВ из Ν. тешпдШбщ или Ν. допоггойеае; отрСЭ. сорВ, 1ЬрВ, отрЕ, и§рА1; и§рА2; ТЬрВ из М. СЖаггНаНз; р1, р2, р4, р5, р6, 1рЭ. 1ЬрВ, Ό15, Н1а, Нтет1, Нт\\'2 из Н. тПиепхае.

В одном примере экспрессию гена можно модулировать путем замены его промотора более сильным промотором (посредством выделения последовательности гена перед сайтом инициации транскрипции, ш у11го модификации этой последовательности и повторного введения в геном путем гомологичной рекомбинации).

Активированную регуляцию экспрессии можно получить и у бактерий, а также и в везикулах наружной мембраны, сбрасываемых с бактерий (или вырабатываемых).

В других примерах описанные подходы могут быть использованы для получения рекомбинантных бактериальных штаммов с улучшенными характеристиками для применений в вакцинах. Это могут быть, но не только, аттенуированные штаммы, штаммы с повышенной экспрессией выбранных антигенов, штаммы с нокаутом (или сниженной экспрессией) генов, препятствующих иммунной реакции, штаммы с модулированной экспрессией иммунодоминатных белков, штаммы с модулированным шеддингом везикул наружной мембраны.

Таким образом, изобретение также относится к модифицированной 3'-5'-области генов белка Е, которая содержит гетерологичный регуляторный элемент, который изменяет уровень экспрессии белков белка Е, расположенных на наружной мембране. 3'-5'-Область в соответствии с этим аспектом изобретения включает последовательность, расположенную перед сайтом инициации транскрипции генов белка Е. 3'-5'-Область начинается непосредственно выше генов белка Е и продолжается обычно до положения примерно не более 1000 п.н. выше гена от стартового кодона АТО. В случае расположения гена в полицистонной последовательности (оперон) 3'-5'-область может начинаться непосредственно перед интересующим геном или перед первым геном в опероне. Предпочтительно модифицированный участок, расположенный в направлении 3'-5', в соответствии с этим аспектом изобретения содержит гетерологичный промотор в положении между 500 и 700 п.н. выше АТО.

Применение описанных 3'-5'-областей для активации экспрессии генов белка Е, способ осуществления этого посредством гомологичной рекомбинации (например, как описано в νθ 01/09350, включено здесь в качестве ссылки), вектор, содержащий 3'-5'-последовательность, подходящую для этой цели, и клетка-хозяин, измененная таким образом, составляют дополнительные аспекты этого изобретения.

- 19 015561

Таким образом, изобретение относится к полипептидам белка Е в модифицированном бактериальном пузырьке. Изобретение дополнительно относится к модифицированным клеткам-хозяевам, способным продуцировать неживые мембраносвязанные пузырьковые векторы. Изобретение дополнительно относится к нуклеотидным векторам, содержащим гены белка Е, с модифицированной 3'-5'-областью, содержащей гетерологичный регуляторный элемент.

Дополнительно изобретение относится к способам получения клеток-хозяев и бактериальных пузырьков в соответствии с изобретением.

Изобретение также относится к композициям, в частности к композициям вакцины, и способам, включающим полипептиды и/или полинуклеотиды по изобретению и иммуностимулирующие ДНК последовательности такие, которые описаны у 8а1о, Υ. е1 а1. 8с1епсе 273: 352 (1996).

Изобретение также относится к способам применения описанного полинуклеотида или его отдельных фрагментов, который, как было покзано, кодирует невариабельные области белков клеточной поверхности бактерий, в полинуклеотидных конструкциях, используемых в таких экспериментах по генной иммунизации на животных моделях инфекции, вызванной атипичной Н. тПиепхае. Такие эксперименты будут особенно полезны для идентификации белковых эпитопов, способных вызывать профилактический или терапевтический иммунный ответ. Считается, что этот подход позволит в дальнейшем получить моноклональные антитела особой важности, происходящие из нужного органа животного, с успехом сопротивляющегося или освобождающегося от инфекции, для разработки профилактических средств или терапевтического лечения бактериальной инфекции, в частности инфекции, вызванной атипичной Н. ίπΠικί'^·^ у млекопитающих, главным образом, у людей.

Изобретение также включает композицию вакцины, которая содержит иммуногенный рекомбинантный полипептид и/или полинуклеотид по изобретению вместе с подходящим носителем, таким как фармацевтически приемлемый носитель. Поскольку полипептиды и полинуклеотиды могут разрушаться в желудке, каждый из них предпочтительно вводить парентерально, в том числе, например, введением, которое является подкожным, внутримышечным, внутривенным или внутрикожным. Композиции, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические соединения и растворы, которые сохраняют изотоничность состава с жидкостью организма, предпочтительно с кровью, индивидуума; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители. Композиции могут быть представлены в контейнерах с однократной дозой или множественными дозами, например в герметично закрытых ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном виде, требуя только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением.

Композиция вакцины по изобретению также может включать адъювантные системы для усиления иммуногенности композиции. Желательно, чтобы адъювантная система индуцировала предпочтительно ТН1-тип ответа.

Иммунный ответ ориентировочно можно разделить на две различные категории, гуморальные или клеточно-опосредованные иммунные реакции (традиционно характеризуемые антительным и клеточноэффекторными механизмами защиты соответственно). Эти категории ответа были названы ответами ТН1-типа (клеточно-опосредованный ответ), и иммунными реакциями ТН2-типа (гуморальный ответ).

Выраженные иммунные реакции ТН1-типа могут быть охарактеризованы выработкой антигенспецифичных, ограниченных гаплотипом, цитотоксических Т-лимфоцитов и реакциями естественных клеток-киллеров. У мышей реакции ТН1-типа зачастую характеризуются выработкой антител 1дС2а подтипа, тогда как у людей это соответствует антителам типа 1дС1. Иммунные реакции ТН2-типа характеризуются выработкой широкого спектра изотипов иммуноглобулинов, включающих у мышей 1дС1, 1дА, и 1дМ.

Можно предположить, что движущей силой этих двух типов иммунных реакций, являются цитокины. Высокие уровни цитокинов ТН1-типа направлены на поддержание индукции клеточноопосредованных иммунных реакций на заданный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов ТН2типа направлены на поддержание индукции гуморальных иммунных реакций на этот антиген.

Различие между иммунными реакциями ТН1 и ТН2-типа не является абсолютным. В действительности, у индивидуума будет обеспечиваться иммунная реакция, которую описывают как преимуществено ТН1 или преимущественно ТН2. Однако зачастую удобно рассматривать семейства цитокинов в выражениях, описанных в СИ4+ Т-клеточных клонах мышей или крыс авторами Мо^тапп и СойГтап (Мобтапп, Т.К. апб СоГГтап, К.Ь. (1989) ТН1 апб ТН2 се11§: б1ГГегеп1 райетк ой 1утр1юкте кесгейоп 1еаб [о бйГегепй ГипсПопа1 ргорегйек. Аппиа1 Кеуйете ой 1ттипо1оду, 7, р. 145-173). Традиционно, реакции ТН1типа связаны с продукцией ΙΝΤ-γ и 1Ь-2 цитокинов Т-лимфоцитами. Другие цитокины, зачастую непосредственно связанные с индукцией иммунных реакций ТН1-типа, не продуцируются Т-клетками, например Ш-12. Напротив, реакции ТН2-типа связаны с секрецией Ш-4, Ш-5, Ш-6 и Ш-13.

Известно, что определенные вакцинные адъюванты особенно подходят для стимуляции цитокиновых реакций либо ТН1, либо ТН2-типа. Традиционно, самые лучшие показатели ТН1:ТН2 баланса иммунной реакции после вакцинации или инфекции включают непосредственное измерение продукции

- 20 015561

ТН1 или ТН2 цитокинов Т-лимфоцитами ш М11го после повторной стимуляции антигеном, и/или измерение [8С1:[8С2а соотношения антиген-специфичных реакций антител.

Таким образом, адъювантом ТН1-типа является адъювант, который предпочтительно стимулирует выделенные популяции Т-клеток к выработке высоких уровней цитокинов ТН1-типа при повторной стимуляции антигеном ш М11го и способствует развитию как СЭ8+ цитотоксических Т-лимфоцитарных, так и антиген-специфичных иммуноглобулиновых реакций, связанных с изотипов ТН1-типа.

Адъюванты, способные предпочтительно стимулировать ТН1-клеточный ответ, описаны в международной патентной заявке № А0 94/00153 и А0 95/17209.

3-Дез-0-ацилированный монофосфориллипид А (3Ό-ΜΡΕ) представляет собой один из таких адъювантов. Он известен из СВ 2220211 (К1Ь1). Химически этот адъювант представляет собой смесь 3-дез-Оацилированного монофосфорил липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями и производится компанией К1Ь1 [ттиηос11ет. Моп!апа. Предпочтительная форма 3-дез-0-ацилированного монофосфориллипида А описана в европейском патенте № 0689454 В1 (8тйБК1ше ВеесЕат Вю1одюак 8А).

Предпочтительно частицы 3Ό-ΜΡΕ являются достаточно мелкими для того, чтобы их можно было стерильно профильтровать через мембрану 0,22 мкм (европейский патент № 0689454).

3Ό-ΜΡΕ будет находиться в диапазоне 10-100 мкг, предпочтительно 25-50 мкг на дозу, где антиген обычно будет присуствовать в диапазоне 2-50 мкг на дозу.

Другой предпочтительный адъювант содержит 0821. Нр1с-очищенную нетоксичную фракцию, полученную из коры Ош11а)а 8аропапа Мо1ша. Необязательно этот адъювант можно смешать с 3-дез-0ацилированным монофосфориллипидом А (3П-МРЬ), необязательно вместе с носителем.

Способ получения 0821 описан в патенте США № 5057540.

Нереактогенные адъювантные композиции, содержащие 0821, были описаны ранее (А0 96/33739). Было показано, что такие композиции, содержащие 0821 и холестерин, являются адъювантами, успешно стимулирующими ТН1 при составлении в композицию вместе с антигеном.

Дополнительные адъюванты, которые являются селективными стимуляторами ТН1-клеточного ответа, включают иммуномодулирующие олигонуклеотиды, например неметилированные последовательности СрС, описанные в А0 96/02555.

Комбинации различных ТН1-стимулирующих адъювантов, например упомянутых выше, также рассматриваются обеспечивающими адъювант, который является селективным стимулятором ТН1клеточного ответа. Например, 0821 может быть составлен в композицию вместе с 30-МРБ. Соотношение 0821:3О-МРБ обычно будет порядка от 1:10 до 10:1; предпочтительно от 1:5 до 5:1 и зачастую в основном 1:1. Предпочтительным диапазоном для оптимального синергизма является диапазон от 2,5:1 до 1:1 3О-МРЬ:0821.

Предпочтительно носитель также присутствует в композиции вакцины по изобретению. Носитель может представлять собой эмульсию масло-в-воде или соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.

Предпочтительная эмульсия масло-в-воде содержит метаболизируемое масло, такое как сквален, αтокоферол и Твин 80. В особенно предпочтительном аспекте антигены в композиции вакцины по изобретению объединяют с 0821 и 30-МРБ в такую эмульсию. Дополнительно эмульсия масло-в-воде может содержать спан 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин.

Обычно для введения людям 0821 и 30-МРБ будет присутствовать в вакцине в диапазоне 1-200 мкг, например 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. Обычно масло в воде будет содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% α-токоферола и от 0,3 до 3% Твина 80. Предпочтительно соотношение сквален: α-токоферол равно или менее 1, поскольку такое соотношение обеспечивает более стабильную эмульсию. Спан 85 также может присутствовать на уровне 1%. В некоторых случаях может быть полезным, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.

Нетоксичные эмульсии масло-в-воде предпочтительно содержат нетоксичное масло, например сквалан или сквален, эмульгатор, например Твин 80, в водном носителе. Водным носителем, например, может быть фосфатно-буферный солевой раствор.

Особенно сильная адъювантная композиция, содержащая 0821, 30-МРБ и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описана в А0 95/17210.

Хотя изобретение было описано со ссылкой на определенные полипептиды и полинуклеотиды белка Е, должно быть понятно, что оно также распространяется на фрагменты природных полипептидов и полинуклеотидов, и аналогичные полипептиды и полинуклеотиды с добавлениями, делециями или заменами, которые, по существу, не влияют на иммуногенные свойства рекомбинантных полипептидов или полинуклеотидов. Предпочтительные фрагменты/пептиды описаны в разделе Подходящие эпитопы.

Настоящее изобретение также относится к поливалентной композиции вакцины, содержащей композицию вакцины по изобретению в сочетании с другими антигенами, в частности антигенами, пригодными для лечения среднего отита. Такая поливалентная композиция вакцины может включать ТН1индуцирующий адъювант, как описано выше в этой заявке.

В предпочтительном варианте осуществления полипептиды, фрагменты и иммуногены по изобре

- 21 015561 тению составляют в композицию с одним или несколькими из следующих групп антигенами: а) одним или несколькими капсульными полисахаридами пневмококка (либо в чистом виде, либо конъюгированным с белком-переносчиком); Ь) одним или несколькими антигенами, которые могут защищать хозяина от инфекции М. са1аггНаПк; с) одним или несколькими белковыми антигенами, которые могут защищать хозяина от инфекции 81гер1ососсик рпеитошае; б) одним или несколькими дополнительными белковыми антигенами атипичной НаеторЬбик тПиепхае; е) одним или несколькими антигенами, которые могут защищать хозяина от Κ8ν; и ί) одним или несколькими антигенами, которые могут защищать хозяина от вируса гриппа. Предпочтительными являются комбинации с группами а) и Ь); Ь) и с); Ь) , б) и а) и/или с); Ь), б), е), ί) и а) и/или с). Такие вакцины могут быть преимущественно использованы в качестве универсальных вакцин против среднего отита.

Антигены полисахаридной капсулы пневмококка предпочтительно выбирают из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9ν, 10А, НА, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р (наиболее предпочтительно из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9ν, 14, 18С, 19Р и 23Р).

Предпочтительными белковыми антигенами пневмококка являются те антигены, которые представлены на наружной поверхности пневмококка (способные распознаваться иммунной системой хозяина в течение по меньшей мере части жизненного цикла пневмококка), или белки, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Наиболее предпочтительно белок представляет собой токсин, адгезии, 2-компонентный трансдуктор сигнала или липопротеин 81гер1ососсик рпеитошае или их фрагменты. Особенно предпочтительные белки включают, но не только, пневмолизин (предпочтительно детоксицированный химической обработкой или мутацией) [Мйсйеб е( а1. ШсШс Астбк Кек. 1990 би1 11; 18(13): 4010 Сотрапкоп οί рпеито1укт депек апб рго!етк Ггот 81гер1ососспк рпеитошае !урек 1 апб 2 , МйсЬеб е( а1. ВюсЫт ВюрНук Ас!а 1989 1ап 23; 1007(1): 61-72 Ехргеккюп οί (Не рпеито1укт депе т ЕксНепсЫа соб: гар1б рипйсабоп апб Ью1одюа1 ргорегбек , \¥0 96/05859 (А. Суапат1б), \¥0 90/06951 (Ра!оп е( а1.), \У0 99/03884 (NАVА)]; РкрА и его трансмембранные делеционные варианты (\У0 92/14488; XVО 99/53940; И8 5804193 - Вгбек е( а1.); РкрС и его трансмембранные делеционные варианты (νθ 99/53940; νθ 97/09994 Вгбек е( а1.); РкаА и его трансмембранные делеционные варианты (Веггу & Ра!оп, 1пГес( 1ттип 1996 Эес; 64(12):5255-62 8ес.|иепсе Ье!егодепейу оГ РкаА, а 37-кПобабоп рШабуе абйекш еккепба1 Гог У1ги1епсе оГ 81гер1ососспк рпеитошае); хлорин-связывающие белки пневмококка и их трансмембранные делеционные варианты; СЬрА и его тансмембранные делеционные варианты (νθ 97/41151; νθ 99/51266); глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (1пГес(. 1ттип. 1996 64:3544); Н8Р70 (νθ 96/40928); РсрА (8апсНех-Веа1о е( а1. РЕМ8 МюгоЬю1. Ьеб. 1998, 164:207-14); М-подобный белок, патентная заявка 8В ЕР 0837130; и адгезии 18627 (патентная заявка 8тйЬКбпе ВеесНат ЕР 0834568). Дополнительные предпочтительные белковые антигены пневмококка представляют собой антигены, описанные в ν0 98/18931, предпочтительно выбранные в ν0 98/18930 и РСТ/И8 99/30390.

Предпочтительными белковыми антигенами Могахе11а са1аггНаНк, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (главным образом для профилактики среднего отита) являются ОМР106 [ν0 97/41731 (Ап!ех) и νθ 96/34960 (РМС)]; ОМР21; ЬЬрА и/или ЬЬрВ [νθ 98/55606 (РМС)]; ТЬрА и/или ТЬрВ [ν0 97/13785 и νθ 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1ттеп М.Е., е! а1. (1993) 1пГес!. 1ттип. 61:20032010]; ИкрА1 и/или ИкрА2 [νθ 93/03761 (ипгуегкйу оГ Техак)]; ОтрСО; НакК (РСТ/ЕР 99/03824); Р1Ю (РСТ/ЕР 99/03823); ОМР85 (РСТ/ЕР 00/01468); 11ро06 (СВ 9917977.2); 11ро10 (СВ 9918208.1); 11ро11 (СВ 9918302.2); Про 18 (СВ 9918038.2); Р6 (РСТ/ЕР 99/03038); Ό15 (РСТ/ЕР 99/03822); Отр1А1 (РСТ/ЕР 99/06781); Н1у3 (РСТ/ЕР 99/03257) и ОтрЕ.

Предпочтительные дополнительные белковые антигены атипичной НаеторЬбик шйиепхае, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (главным образом для профилактики среднего отита) включают белок фимбрин [(И8 5766608 - О1ио 8(а!е КекеагсН Роипбабоп)] и слитые конструкции, содержащие пептиды, на его основе [например, ЬВ1(Г) пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или νθ 99/64067]; ОМР26 ^О 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (8!а!е Еш\егкИ\ оГ Уотк)]; белок Ό (ЕР 594610); ТЬрА и/или ТЬрВ; Н1а; НкГ; Нш47; Н1Г; Нтет1; Нт\г2; Нт\г3; Нт\г4; Нар; Ό15 (^О 94/12641); Р2; Р5 ν 94/26304); МрС2 (ВА8В205) [№О 02/30971]; 81р (ВА8В203) ^О 02/30960] и 1ОМР1681 (ВА8В210) [№О 02/34772].

Предпочтительные антигены вируса гриппа включают вирус целиком, живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или клетках МОСК, или клетки Vе^ο или целые виросомы гриппа (описанные авторами К. С1иск, Vасс^ηе, 1992, 10, 915-920) или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как НА, ΝΓ, NА, или М-белки, или их сочетания.

Предпочтительные антигены Κ8ν (респираторно-синцитиального вируса) включают Ргликопротеин, С-гликопротеин, Н^белок или их производные.

Композиции, наборы и введение.

В дополнительном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим полинуклеотиды белка Е и/или полипептиды белка Е для введения в клетку или в многоклеточный организм.

Изобретение также относится к композициям, содержащим полинуклеотид и/или полипептиды, рассматриваемые здесь, или их агонисты или антагонисты. Полипептиды и полинуклеотиды по изобре

- 22 015561 тению могут быть использованы в комбинации с нестерильным или стерильным носителем или носителями для использования с клетками, тканями или организмами, например фармацевтическим носителем, подходящим для введения индивидууму. Такие композиции содержат, например, вспомогательные средства или терапевтически эффективное количество полипептида и/или полинуклеотида по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Такие носители могут включать, но не только, солевой раствор, буферный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Композиция должна соответствовать способу введения. Изобретение дополнительно относится к диагностическим и фармацевтическим упаковкам и наборам, содержащим один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами упомянутых выше композиций по изобретению.

Полипептиды, полинуклеотиды и другие соединения по изобретению могут быть использованы отдельно или совместно с другими соединениями, например терапевтическими соединениями.

Фармацевтические композиции можно вводить любым эффективным, удобным способом, в том числе, например, введением местным, пероральным, анальным, вагинальным, внутривенным, внутрибрющинным, внутримышечным, подкожным, интраназальным или внутрикожным путем, среди прочего.

При лечении или в качестве профилактики активный агент можно вводить индивидууму в виде инъекционной композиции, например в виде стерильной водной дисперсии, предпочтительно изотонической.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество полипептида и/или полинуклеотида, например растворимую форму полипептида и/или полинуклеотида по настоящему изобретению, пептидного агониста или антагониста или мелкомолекулярного соединения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Такие носители включают, но не только, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим упаковкам и наборам, содержащим один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами упомянутых выше композиций по изобретению. Полипептиды, полинуклеотиды и другие соединения по изобретению могут быть использованы по отдельности или совместно с другими соединениями, например терапевтическими соединениями.

Композиции будут адаптированы к пути введения, например системному или пероральному пути. Предпочтительные формы системного введения включают инъекцию, обычно посредством внутривенной инъекции. Могут быть использованы другие инъекционные пути введения, например подкожный, внутримышечный или внутрибрюшинный. Альтернативные средства системного введения включают введение через слизистую и через кожу, используя проникающие вещества, например соли желчных кислот или фусидовые кислоты или другие детергенты. Кроме того, если полипептид или другие соединения по настоящему изобретению могут быть составлены в энтеральную или инкапсулированную композицию, также может быть возможным пероральное введение. Введение этих соединений также может быть местным и/или локализованным, в форме мазей, паст, гелей, растворов, порошков и подобного.

Для введения млекопитающим, и, в частности, людям, ожидается, что уровень ежедневной дозы активного вещества составит от 0,01 до 10 мг/кг, обычно около 1 мг/кг. Лечащий врач в любом случае определит конкретную дозу, которая будет наиболее подходящей для индивидуума, и она будет зависеть от возраста, массы тела и реакции конкретного индивидуума. Указанные выше дозы иллюстрируют случай в среднем. Конечно, могут существовать индивидуальные примеры, которые заслуживают более высоких или более низких интервалов доз, и они находятся в объеме этого изобретения.

Необходимый интервал доз зависит от выбора пептида, пути введения, характера композиции, характера состояния пациента и решения лечащего врача. Подходящие дозы, однако, находятся в диапазоне 0,1-100 мкг/кг массы тела пациента.

Удобно, когда композиция вакцины находится в инъекционной форме. Могут быть использованы обычные адъюванты для усиления иммунного ответа. Подходящая однократная доза для вакцинации составляет 0,5-5 мкг антигена на 1 кг, и такую дозу предпочтительно вводят 1-3 раза и с интервалом 1-3 недели. С указанным интервалом дозы не будет наблюдаться неблагоприятных токсикологических эффектов соединений по изобретению, которые могли бы прервать их введение соответствующим индивидуумам.

Однако ожидается широкое разнообразие необходимых доз, принимая во внимание разнообразие доступных соединений и различную эффективность различных путей введения. Например, можно было бы ожидать, что для перорального введения потребуются более высокие дозы, чем для введения путем внутривенной инъекции. Колебания этих уровней доз могут быть скорректированы с помощью стандартных эмпирических методик оптимизации, которые широко распространены в этой области.

Базы данных последовательностей, последовательности на материальном носителе и алгоритмы.

Полинуклеотидные и полипептидные последовательности образуют ценный информацинный ресурс, с помощью которого определяют их 2- и 3-мерные структуры, а также идентифицируют дополнительные последовательности аналогичной гомологии. Эти подходы в наибольшей степени облегчают хранение последовательности на машиночитаемом носителе и последующее использование сохраненных данных в известной программе для макромолекулярной структуры или для поиска в базе данных после

- 23 015561 довательностей, используя хорошо известные инструменты поиска, такие как программный пакет ССС.

Изобретение также относится к способам анализа характера последовательностей или цепочек, в частности генетических последовательностей или кодированных белковых последовательностей. Предпочтительные способы анализа последовательностей включают, например, способы анализа гомологии последовательностей, например анализ идентичности и подобия, анализ структуры ДНК, РНК и белка, сборки последовательности, кладистический анализ, анализ мотивов последовательности, определение открытой рамки считывания, обращение к нуклеотидным основаниям, анализ использования кодонов, выравнивание нуклеотидных оснований и пошаговый анализ хроматографического пика.

Автоматизированный способ предоставляется для проведения идентификации гомологии. Этот способ включает стадии предоставления первой полинуклеотидной последовательности, содержащей последовательность полинуклеотида по изобретению на машиночитаемом носителе; и сравнения указанной первой полинуклеотидной последовательности по меньшей мере с одной другой полинуклеотидной или полипептидной последовательностью для идентификации гомологии.

Автоматизированный способ также предусмотрен для проведения идентификации гомологии, указанный способ включает стадии предоставления последовательности первого полипептида, содержащей последовательность полипептида по изобретению на машиночитаемом носителе; и сравнения указанной первой полипептидной последовательности по меньшей мере с одной другой полинуклеотидной или полипептидной последовательностью для идентификации гомологии.

Все публикации и ссылки, включая, но не только, патенты и патентные заявки, цитируемые в этом описании, включены здесь в качестве ссылки в полном объеме, как если бы каждая отдельная публикация или ссылка была особо и отдельно указана как включенная здесь в качестве ссылки в полном объеме. Любая патентная заявка, по которой испрашивается приоритет, также включена здесь в качестве ссылки в полном объеме, описанным выше образом для публикаций и ссылок.

Определения.

Идентичность, как известно в уровне техники, представляет собой сходство между двумя или несколькими полипептидными последовательностями или двумя или несколькими полинуклеотидными последовательностями, в зависимости от конкретного случая, определенное путем сравнения последовательностей. В уровне техники идентичность также означает степень родства последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями в зависимости от конкретного случая, определенную комплементарностью цепей таких последовательностей. Идентичность можно легко вычислить с помощью известных способов, в том числе, но не только, описанными в (Сошри1абопа1 Мо1еси1аг Вк1оду, Ьевк, А.М., еб., 0хГогб Ишуегвбу Ргевв, №\ν Уогк, 1988; Вксошрибпд: 1пГогша11св апб Сепоше Рго.)еск, 8шбб, Ό.^., еб., Асабешк Ргевв, №\ν Уогк, 1993; Сошрикг Апа1увк оГ 8ес.|иепсе Эа1а, Раг1 I, Сгййп, А.М., апб СйГйп, ΗΌ., ебв., Мишана Ргевв, №\ν кшеу, 1994; 8ес.|иепсе Апа1увк ίη Мо1еси1аг Вк1оду, уоп Иеше, С., Асабешк Ргевв, 1987; и 8ес.|иепсе Апа1увк Ришей СйЬвкоу, М. апб Эеуегеих, 1., ебв., М 81оск1оп Ргевв, №\ν Уогк, 1991; и Сап11о, Η., апб Ыршап, Ό., 81АМ ί. Аррбеб Ма1б., 48: 1073 (1988). Способы для определения идентичности разработаны для предоставления наибольшего совпадения тестируемых последовательностей. Кроме того, способы для определения идентичности систематизированы в общедоступных компьютерных программах. Компьютерные программы для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не только, программу САР в программном пакете ССС (Оеуегеих, 1., е! а1., №.1с1ек Аабв Вевеагсб 12(1): 387 (1984)), ВЙА8ТР, ВЬАЗ'ТЫ (А1ксби1, 8.Е. е! а1., 1. Мо1ес. Вк1. 215: 403-410 (1990), и ЕА8ТА (Реагвоп апб Ыршап Ргос. №16. Асаб. 8ск И8А 85; 2444-2448 (1988). Семейство программ ВЬА8Т общедоступно на NСΒI и из других источников (ВЬА8Т Мапиа1, А1ксби1, 8., е1 а1., №В1 №А1 ΜΗ ВеЫевба, МО 20894; А1ксби1, 8., е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 215: 403-410 (1990) . Для определения идентичности также может быть использован хорошо известный алгоритм Смита Ватермана.

Параметры для сравнения полипептидной последовательности включают следующее.

Алгоритм: №еб1ешап и ^ипвсб, 1. Мо1. Вю1. 48: 443-453 (1970).

Матрица сравнения: ВЬ088ИМ62 от Чешкой апб Чешкой, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А. 89:1091510919 (1992).

Штраф за разрыв: 8.

Штраф за длину разрыва: 2.

Программа, используемая с этими параметрами, является общедоступной как программа дар от Сепебсв Сошрикг Сгоир, Мабкоп ЭД1. Вышеупомянутые параметры представляют собой параметры по умолчанию для сравнений пептидов (наряду с отсутствием штрафа за концевые разрывы).

Параметры для сравнения полинуклеотидов включают следующее.

Матрица сравнения: соответствия = +10, несоответствия = 0.

Штраф за разрыв: 50.

Штраф за длину разрыва: 3.

Доступен как программа дар от Сепебсв Сошрикг Сгоир, Мабкоп ^1. Это параметры по умолча

- 24 015561 нию для сравнений нуклеиновых кислот.

Предпочтительные значения идентичности для полинуклеотидов и полипептидов в зависимости от конкретного случая представлены ниже в пп. (1) и (2).

(1) Полинуклеотидные варианты осуществления дополнительно включают выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 или 100% идентичность с эталонной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 11, где указанная полинуклеотидная последовательность может быть идентичной эталонной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 11 или может включать нуклеотидные изменения вплоть до определенного целого числа по сравнению с эталонной последовательностью, где указанные изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставки, и где указанные изменения могут встречаться в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, рассеянные либо по отдельности среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в пределах эталонной последовательности, и где указанное число нуклеотидных изменений определяется умножением общего количества нуклеотидов в 8Е0 ΙΌ N0: 11 на целое число, определяющее процент идентичности, разделенное на 100, а затем вычитанием этого результата из указанного общего числа нуклеотидов в 8Е0 ΙΌ N0: 11, или

Пп<Хп - (Хп-У), где п_п представляет собой число нуклеотидных изменений, х_п представляет собой общее количество нуклеотидов в 8Е0 ΙΌ N0: 11, у составляет 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, и - представляет собой символ оператора умножения, и где любое не целое число результата хп и У округляют в меньшую сторону до наиболее близкого целого числа до вычитания его из хп. Изменения полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды 8Е0 ΙΌ N0:1-10, могут создавать нонсенс, миссенс мутации или мутации со сдвигом рамки считывания в этой кодирующей последовательности и, тем самым, изменять полипептид, кодируемый полинуклеотидом после таких изменений.

В качестве примера полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть идентична эталонным последовательностям 8Е0 ΙΌ N0: 11, то есть она может быть 100% идентичной, или она может содержать изменения нуклеиновой кислоты вплоть до определенного целого числа по сравнению с эталонной последовательностью так, что процент идентичности составляет менее 100%. Такие изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставки, и где указанные изменения могут встречаться в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, рассеянные либо по отдельности среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в пределах эталонной последовательности. Число изменений в нуклеиновой кислоте для заданного процента идентичности определяется умножением общего числа нуклеиновых кислот в 8Е0 ΙΌ N0: 11 на целое число, определяющее процент идентичности, разделенное на 100, а затем вычитанием этого результата из указанного общего числа нуклеиновых кислот в 8Е0 ΙΌ N0: 11, или

Пп <Хп - (Хп-У), где пп представляет собой число изменений в нуклеиновой кислоте, хп представляет собой общее число нуклеиновых кислот в 8Е0 ΙΌ N0: 11, у составляет, например, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85% и т. д., - представляет собой символ оператора умножения, и любое не целое число результата Хп и У округляют в меньшую сторону до наиболее близкого целого числа до вычитания его из Х_п.

(2) Полипептидные варианты осуществления дополнительно включают выделенный полипептид, содержащий полипептид, имеющий по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 или 100% идентичность с полипептидной эталонной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, где указанная полипептидная последовательность может быть идентичной эталонной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-10 или может содержать аминокислотные изменения, вплоть до определенного числа, по сравнению с эталонной последовательностью, где указанные изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставки, и где указанные изменения могут встречаться в амино- или карбоксиконцевых положениях эталонной полипептидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, разбросанные либо по отдельности среди аминокислот в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в пределах эталонной последовательности, и где указанное число аминокислотных изменений определяется умножением общего числа аминокислот в 8Е0 ΙΌ N0: 1-10 на целое число, определяющее процент идентичности, разделенное на 100, а затем вычитанием этого результата из указанного общего числа аминокислот в 8Е0 ΙΌ N0: 1-10 соответственно, или па <Ха - (Ха-У), где па представляет собой число аминокислотных изменений, Ха представляет собой общее число аминокислот в 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, у составляет 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для

- 25 015561

85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, и · представляет собой символ оператора умножения, и любое не целое число результата Х_а и у округляют в меньшую сторону до наиболее близкого целого числа до вычитания его из Х_а.

В качестве примера полипептидная последовательность по настоящему изобретению может быть идентична эталонной последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-10, то есть она может быть 100% идентичной, или она может содержать аминокислотные изменения, вплоть до определенного числа, по сравнению с эталонной последовательностью так, что процент идентичности составляет менее 100% идентичности. Такие изменения выбраны из группы, состоящей по меньшей мере из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставки, и где указанные изменения могут встречаться в амино- или карбоксиконцевых положениях эталонной полипептидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, разбросанные либо по отдельности среди аминокислот в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в пределах эталонной последовательности. Число аминокислотных изменений для заданного % идентичности определяется умножением общего числа аминокислот в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-10 на целое число, определяющее процент идентичности разделенное на 100, а затем вычитанием этого результата из указанного общего числа аминокислот в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-10, или п_а <Х_а - (Х_а2у), где п_а представляет собой число аминокислотных изменений, Х_а представляет собой общее число аминокислот в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-10, у составляет, например, 0,70 для 70%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85% и т.д., а · представляет собой символ оператора умножения, и любое не целое число результата Ха и у округляют в меньшую сторону до наиболее близкого целого числа до вычитания его из Ха.

Индивидуум(ы) в контексте настоящего изобретения со ссылкой на организм означает многоклеточный эукариот, в том числе, но не только, многоклеточное животное, млекопитающее, овцы и крупный рогатый скот, обезьяну, примата и человека.

Выделенный означает преобразованный руками человека из его природного состояния, т.е. если встречается в природе, его изменили или удалили из исходного окружения, или и то, и другое. Например, природный полинуклеотид или полипептид живого организма не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих с ним веществ его природного окружения, является выделенным, как этот термин используется в контексте данного изобретения. Кроме того, полинуклеотид или полипептид, который введен в организм путем трансформации, генетического воздействия или любым другим рекомбинантным способом, является выделенным, даже если он всетаки присуствует в указанном организме, который может быть живым или неживым.

Полинуклеотид(ы) в основном относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК, включая односпиральные и двухспиральные участки.

Вариант относится к полинуклеотиду или полипептиду, который отличается от эталонного полинуклеотида или полипептида, но сохраняет необходимые свойства. Обычный вариант полинуклеотида отличается по нуклеотидной последовательности от другого, эталонного полипептида. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта могут изменять или могут не изменять аминокислотную последовательность полипептида, кодируемого эталонным полипептидом. Нуклеотидные изменения могут приводить к аминокислотным заменам, добавлениям, делециям, слияниям и усечениям в полипептиде, кодируемом эталонной последовательностью, как рассмотрено ниже. Обычный вариант полипептида отличается по аминокислотной последовательности от другого, эталонного полипептида. В основном, различия ограничены таким образом, что последовательности эталонного полипептида и варианта в целом очень сходны и во многих областях идентичны. Вариант и эталонная последовательность могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или несколькими заменами, добавлениями, делециями в любом сочетании. Замененный или вставленный аминокислотный остаток может кодироваться или может не кодироваться генетическим кодом. Вариант полинуклеотида или полипептида может быть природным, например аллельным вариантом, или может быть вариантом, который не известен в природе. Неприродные варианты полинуклеотидов и полипептидов могут быть получены методиками мутагенеза или прямым синтезом.

Заболевание(я) означает любое заболевание, вызванное или относящееся к бактериальной инфекции, в том числе, например, средний отит у новорожденных и детей, пневмония у пожилых, синусит, внутрибольничные инфекции и инвазивные заболевания, хронический средний отит с потерей слуха, накопление жидкости в среднем ухе, повреждение слухового нерва, замедленное изучение речи, инфекция верхних дыхательных путей и воспаление среднего уха.

Экспериментальная часть

Приведенные ниже примеры выполняются с использованием стандартных методик, которые хорошо известны и являются общепринятыми у специалистов в данной области, за исключением того, что описано подробно. Примеры являются иллюстрирующими, а не ограничивающими изобретение.

Настоящее исследование описывает выделение, очистку, характеристику, клонирование и экспрес

- 26 015561 сию нового белка наружной мембраны Н. тПиеи/ае, названного белком Е (рЕ), и нового усеченного рекомбинантного рЕ(А), который был обнаружен с использованием ^Ό(λ) сыворотки при миеломе человека.

Материалы и методы.

Реактивы.

Штаммы МшпА и УТШ3 655 Н. ШЗиепгае, тип Ь, были любезно предоставлены КоЬей 8. Мипкоп 1г. (№акЬ^идΐοи Ищуегкйу 8сЬоо1 ой Мебюше (8ΐ. Ьошк, Мо)). Штамм ЫТН1772 атипичной Н. тПиепхае был выделен клинически из культуры носоглоточного мазка в департаменте (2). Ряд различных видов НаеторЫ1ик также был проанализирован и описан в табл. 1. !дЭ(л) цельной сыворотки ^Э-миеломы человека покупали у ТЬе Втбшд 8йе (В1гтшдйат, Нпд1апб). Для получения специфической анти-рЕ антисыворотки кроликов иммунизировали внутримышечно 200 мкг рекомбинантного рЕ22-160 [рЕ(А)], эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (Эйсо, ВесЮп ^^ск^икοи, Не1бе1Ьегд, Сегтапу), или пептидом рЕ41-68, конъюгированным с гемоцианином лимфы улитки (КЬН), и ревакцинировали на 18 и 36 день такой же дозой белка в неполном адъюванте Фрейнда. Кровь брали спустя 2-3 недели. Полученные в результате поликлональные антитела выделяли с помощью аффинной хроматографии, используя рЕ(А) или специфический пептид рЕ (рЕ41-68), конъюгированный с СпВг-сефарозой (11). Козьи антитела к ЦЬ человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР), были из Вюкоигсе (СатагШо, СА). Кроличьи рАЬ к ЦЬ человека были из ЭакораИк (СеШойе, Эептагк).

Мышиные поликлональные иммуноглобулины к ЦЬ человека, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (ЕГГС), кроличьи поликлональные иммуноглобулины к легким цепям (х и λ) человека, конъюгированные с НКР, НТС-конъюгированные антикроличьи поликлональные иммуноглобулины свиньи покупали у Эакорайк.

Экстракция и очистка белка Е.

Н. тПиепхае тип Ь (МтиА) выращивали в течение ночи в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (ВШ) (ЭгГсо ЬаЬогаФпек, Эекой, Мюй.), дополненным УАЭ и гемином (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО), каждого по 10 мкг/мл. После двух промываний бактерии экстрагировали в 0,05М Трис-НС1-буфере (рН 8,8), содержащем 0,5% Бтрхдеп® (Са1Ь1осЬет ^уаИоЛет, Вебйогб, МА). Бактериальную суспензию перемешивали магнитной мешалкой в течение 2 ч при 37°С. После центрифугирования при 8000 х д в течение 20 мин при 4°С, супернатант фильровали с использованием стерильного фильтра (0,45 мкм; 81ейуех-НУ, Мййроге). Экстракт Н. тПиепхае в 0,5% Бтрхдеп® наносили на колонку с β-сефарозой (Атегкйат РЬагтас1а Вю!есй), уравновешенной 0,05М Трис-НС1 (рН 8,8), содержащим 6М мочевины. Колонку элюировали с использованием линейного градиента №1С1 от 0 до 1М в том же буфере. Фракции, которые были выявлены с помощью ^Ω(λ) миеломной сыворотки, объединяли, диализировали в мембранных трубках 8рес1гарЬог (исключение молекулярной массы 6-8000; 8ресйит, Ьадипа Ы11к, СА) против 0,05М ТрисНС1, рН 8,8, и концентрировали на дисковых мембранах УМ100 (исключение молекулярной массы 10000; Атсоп, Веуег1у, МА).

8^8-РΛСΕ и выявление белков на мембранах (Вестерн-блот).

8^8-РΛСΕ проводили при постоянном напряжении 150, используя 10% бис-трис-гели с подвижным буфером (МБ8), буфером для образца (ЬЭ8) и буфером для блоттинга, а также средства для блоттинга от Шуех (8ап Э1едо, СА). Образцы равномерно нагревали при 100°С в течение 10 мин. Гели окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым К-250 (13; Вю-Каб, 8иибЬуЬе^д, 8\\'ебеп). Электрофоретический перенос белковых полос с геля на мембрану иммунобилон-Р (Мййроге, ВебГогб, МА) осуществляли при 30 В в течение 2-3 ч. После переноса мембрану иммунобилон-Р блокировали в РВ8 с 0,05% Твином 20 (РВ8-Ттеец), содержащим 5% сухого молока. После нескольких промываний в РВ8-Тνееи. мембрану инкубировали с очищенным белком ^Э-миеломы (0,5 мкг/мл, ^Ό(λ) миеломы человека; ТЬе Вшбтдкйе) в РВ8-Ттеещ включающем 2% сухого молока, в течение 1 ч при комнатной температуре. НКРконъюгированные козьи антитела к ЦЬ человека, разбавленные 1/1000 добавляли после нескольких промываний в РВ8-Т\гееп. После инкубации в течение 40 мин при комнатной температуре и нескольких дополнительных промываний в РВ8-Тνееи. проводили выявление с использованием проявляющих реактивов БСЬ для Вестерн-блоттинга (АтегкЬат Рйагтааа Вю!есй, Иррка1а, 8\\'ебеп).

Двумерный электрофорез в 8Э8-полиакриламидном геле 2-Ό РАСБ) и Вестерн-блоттинг.

После ионообменной хроматографии Бюрхдеп® экстракты Н. тПиепхае (МтиА) подвергали изоэлектрическому фокусированию (ΙΕΕ), используя систему КСрЬю!· ΙΕΕ 8ук1ет (АтегкЬат РЬагтааа Вю1есЬ) (5, 12). Для калибровки геля использовали стандарт (номер в каталоге 161-0320; Вю-Каб). 2-Ό полиакриламидные гели подвергали электроблоттингу на фильтры IттοЬ^1οи-РV^Ε (0,45 мм; Мййроге, ВебГогб, И8) при 120 мА в течение ночи. После насыщения стадии инкубации, блокирования и промывки проводили, как описано выше.

Анализ аминокислотной последовательности.

Автоматизированный анализ аминокислотной последовательности проводили с помощью Аррйеб Вюкуйетк (Еойег Сйу, СА) 470А газожидкостного твердофазного секвенатора.

Конструирование геномной библиотеки Н. тПиепхае.

- 27 015561

Хромосомную ДНК получали из штамма 772, используя модификацию способа Вегпк и Тйотак (2, 13). Коротко, геномную библиотеку Н, шПиеп/ае 772 конструировали из 40 мкг ДНК, которая была частично расщеплена 8аи3А в течение 1 ч. Расщепленную ДНК фракционировали на градиенте сахарозы (14). Фракции, содержащие фрагменты ДНК соответствующих размеров (от 2 до 7 т.н.п.), объединяли и ДНК лигировали в рИС18, расщепленную ВатШ, с последующей трансформацией в ЕксйепсЫа сой 1М83 путем электропорации, используя Сепе ри1§ег (Вю-Кай, КЫнпопй СА). Бактерии помещали на агар ЬВ, дополненный ампициллином и Х-Са1 (5-бром-4-хлор-3-индолил-в-О-галактопиранозид).

Иммуноанализ колоний, выделение и секвенирование ДНК.

Трансформанты Е. сой, культивированные в течение ночи на агаре ЬВ, переносили на нитроцеллюлозные фильтры (8айогш8, Сойшдеп, Сегтапу) путем покрытия поверхностей агара сухими фильтрами. Чашки оставляли на 15 мин и клетки лизировали, подвергая воздействию насыщенных паров хлороформа в течение 20 мин. Оставшиеся на фильтрах белок-связывающие участки блокировали инкубированием фильтров в сбалансированном Трис-солевом растворе, содержащем овальбумин (50 мМ Трисгидрохлорид, 154 мМ №С1, 1,5% овальбумин [рН 7,4]) в течение 30 мин. После блокировки фильтры инкубировали с Ι§Ρ(λ) человека в течение 30 мин. Поликлональные антитела к Ι§Ό человека, конъюгированные с НКР, добавляли после промываний и фильтры инкубировали в течение 30 мин. Все инкубации проводили при комнатной температуре. В конце фильтры проявляли, используя 4-хлор-1-нафтол и Н₂0₂. Положительные клоны собирали и ДНК плазмиды рИС18, содержащую геномную ДНК №ТШ772, очищали. Полученную в результате вставку ДНК №ГН1772 секвенировали, используя фланкирующие праймеры М13+ и М13- и набор для сиквенсовой реакции ВщЬуе ТегтшаЮг Сус1е 5>ес.|иепстд ν. 2.0 Кеайу (Регкш-Е1тег, ЕоЧег С11у, Са). Полученная вставочная последовательность (3,55 т.н.п.) соответствовала участку, содержащему ДНК, кодирующую белки НЮ175, НЮ176, НЮ177 и, наконец, НЮ178 (15).

Клонирование ДНК и экспрессия белка.

Все конструкции были разработаны с использованием фрагментов, амплифицированных в результате ПЦР. В качестве матрицы использовали рИС18, содержащую геномную ДНК ЭТШ 772 (с НЮ175 по НЮ178). Тас.| ДНК-полимераза была производства Косйе (Маппйет, Сегтапу), условия проведения ПЦР соответствовали рекомендованным фирмой-изготовителем. Были клонированы открытые рамки считывания четырех предсказанных белков с НЮ 175 по НЮ 178, но сюда включена только методика, описывающая процесс клонирования НГО (ШО178). рЕ^22-160 [обозначенный рЕ(А)] лишали эндогенного сигнального пептида, в том числе аминокислотного остатка глутамина²¹, и амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймеров 5'-с1садда1ссаааддс1даасаааа1да1д1д-3' и 5'-дд1дсадайаадсййййа1саас1д3', вводящих сайты для ферментов рестрикции ВатШ и НшйШ. Для слияния 6 остатков гистидина, кодируемых этим экспрессирующим вектором, стоп-кодон рЕ^22-160 был видоизменен. Полученную открытую рамку считывания гена ре размером 417 н.п. лигировали в рЕТ26(+) (Nονадеη, ЬаппЫайЕ Сегтапу). Во избежание возможной токсичности полученные в результате плазмиды сначала трансформировали в хозяине Е. сой ИН5а. Затем плазмиды, кодирующие рЕ и рЕ(А), трансформировали в экспрессирующем хозяине ВЬ21(ИЕ3). В дополнение к полноразмерным рЕ и рЕ(А) были получены последовательности процессированных вариантов рЕ. Схема представлена на фиг. 8. Для всех конструкций использовали праймеры, содержащие в себе сайты рестрикции для ВатШ и НшйШ. Процедуры для процессированных вариантов были описаны выше. Все конструкции были секвенированы с использованием набора для сиквенсовой реакции ВщЬуе ТегтшаЮг Сус1е 5>ес.|иепстд ν. 2.0 Кеайу (Регкт-Е1тег, ЕоЧег Сйу, Са).

Для получения рекомбинантных белков бактерии выращивали до середины фазы логарифмического роста (0Ό₆₀₀ от 0,6 до 0,8) с последующей индукцией с использованием 1 мл изопропил-1-тио-3-Эгалактозида (ГОТС), что приводило к гиперэкспрессии рЕ(А). Когда 0Ό₆₀₀ достигала 1,5-1,7, бактерии собирали и выделяли тельца включения, используя стандартный протокол.

Рекомбинантные белки могут быть дополнительно очищены с помощью аффинной хроматографии с использованием никелиевых колонок. Затем проводили анализ очищенных рекомбинантных белков в δΌδ-РАСЕ.

Очистка ДНК Н.шПиепгае, условия ПЦР и секвенирование.

Геномную ДНК из клинических штаммов Н. шПиеп/ае выделяли с использованием набора И№а8у Т|55ие (О1адеп, Нййеп, Сегтапу). Тас.| ДНК-полимераза была производства Косйе (Маппйет, Сегтапу), а условия проведения ПЦР соответствовали рекомендованным фирмой-изготовителем. Для выделения гена ре использовали пару праймеров 5'-дсаШайадд1садШайд-3' и 5'-дааддайаЮс1да1дсад-3', которые отжигаются с фланкирующими генами НЮ177 и НЮ179 соответственно. Последовательности полученных продуктов ПЦР (948 п.н.) определяли посредством шаговой полимеразной цепной реакции целевого гена с использованием вышеуказанных праймеров в дополнение к праймерам 5'-сйдддйасйассдсйд-3' и 5'д1дйааасйаасд!а1д-3'.

Капиллярный электрофорез проводили на приборе Весктап СЕф 2000 с использованием набора Оуе-1епшпа1ог сус1е 5ес.|иепснщ (СЕО ИТС8 кй, Весктап СоиЙег, ЗЮскМт, 8^ейеп). Обработку и выравнивание полученных последовательностей ДНК осуществляли с использованием РНКЕЭ (СойопСойе, □еайПат, И8А) и 5>ЕОиЕЖ.’НЕК (МейРгоЬе, 0к1о, №г\гау).

- 28 015561

Получение Н. тПиепхае с дефицитом рЕ (ΝΤΜί 3655 Дре).

В качестве матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из ΝΤ4ί 772. 5'- и 3'-Концы гена ре, содержащие части генов Н10177 и Н10179, были амплифицированы как две кассеты (815 н.п. и 836 н.п. соответственно) с использованием ДНК-полимеразы БуХА/уте™ II (Иппгутек, Екроо, Е1п1апф, вводя сайты для ферментов рестрикции Х1о1 и ЕсоК1 соответственно, ЕсоК1 и БрЕ1 в дополнение к специфическим захватывающим последовательностям в этих двух кассетах (18). Полученные фрагменты ПЦР были расщеплены и клонированы в рЫиекспр! БК (+/-). Кассета гена устойчивости к канамицину (1282 н.п.) была получена из рИС4К с использованием сайта фермента рестрикции ЕсоК1. После расщепления продукт ПЦР лигировали в процессированный фрагмент гена ре, включающий части генов Н10177 и Н10179. Штаммы Н. тПиепхае Еадап и ИМ804 были трансформированы в соответствии с методом Μ-ΐν, описанным НепоИ е! а1. (19). Полученных мутантов проверяли с помощью ПЦР и экспрессию рЕ анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и проточной цитометрии.

Программное обеспечение для молекулярной биологии.

Полученные последовательности сравнивали с имеющимся геномом Н. тПиепхае КА20 (1Шр://\\л\лу.1щг.огд) (15). Сигнальный пептид был установлен с помощью Б1дпа1Р VI. 1 Аог1б АИе АеЬ РгеФсйоп Бегуег Сеп!ег Гог Вю1ощса1 Бесщепсе Апа1ум8 (ййр://те^те.сЬ8.й!и.йк/8егу1се8/Б1дпа1Р/) (16). Профиль гидрофобности рЕ анализировали способом по Ку!е и Боойй1е (17).

Животные, хирургиеские процедуры и крысиная модель среднего отита.

Использовали здоровых самцов крыс Бргадие-БаМеу, массой 200-250 г. До операции у всех животных отсутствовали инфекционные заболевания среднего уха по данным отомикроскопии. При вмешательствах крыс анастезировали метогекситалом (Впе!а1®, Е1й ЬШу апб Сотрапу, 1пб1апароЙ8, ΙΝ) внутривенно или хлоралгидратом (аро!ек8Ьо1аде!, Ьипб, Б\уейеп) внутрибрюшинно. Бактерии для экспериментов с животными выращивали, как описано выше. После сбора центрифугированием бактерии ресуспендировали в свежей культуральной среде до концентрации 2х10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) как для ΝΊΉί 3655, так и для соответствующего мутанта рЕ. До использования препараты держали на льду. Для индукции острого среднего отита (АОМ) среднего уха достигали вентральным срединным разрезом на шее и приблизительно 0,05 мл бактериальной суспензии вводили по каплям в полость среднего уха. Отомикроскопию проводили на 3 и 5 день после операции. Средний отит с гнойным экссудатом, т.е. непрозрачным экссудатом и зачастую резко выраженным расширением сосудов на 3 день, называли АОМ.

Результаты.

Экстракция и разделение белка Н. тПиепхае (рЕ), выявленного с помощью Ι§Ρ(λ) сыворотки при миеломе.

Ранее считалось, что атипичная Н. тПиепхае (ΝΤΒί) не связывается с Ιβϋ (19), тогда как инкапсулированная Н. тПиепхае прочно связывается с Ιβϋ. Авторы изобретения установили, что Ι§Ρ(λ) сыворотки при миеломе специфически связывается также с ΝΊΉί. Характерный профиль ΝΤΜί772 по данным проточной цитометрии представлен на фиг. 1. Сильный сдвиг и повышенная флуоресценция были обнаружены в присутствии миеломного белка Ι§Ρ(λ) по сравнению с контролем без Ιβϋ.

Для тщательного анализа белка наружной мембраны Н. МПием/ае, который был обнаружен с помощью Ι§Ρ(λ) миеломы, фракцию наружной мембраны солюбилизировали в детергенте Етрщеп*. На фиг. 1В показано, что очень сильная ^Б-связывающая активность была получена на Вестерн-блотах для белка со средней молекулярной массой приблизительно 16 кДа. Однако различимой полосы белка, соответствующей ^Б-связывающей активности, не могло быть обнаружено при окрашивании БББ-РАОЕ Кумасси бриллиантовым голубым. После разделения на колонке с Р-сефарозой, тот же экстракт наружной мембраны наносили на 2-мерный гель-электрофорез и окрашивали серебром (фиг. 1С). Одновременно проводили соответствующий Вестерн-блоттинг, зондированный Ι§ϋ(λ) человека. Область, где находился рЕ, могла, следовательно, быть охвачена. Однако видимого белка не наблюдалось (фиг. 1С).

Клонирование белка Е и получение мутанта атипичной Н. тПиеп/ае, лишенного рЕ.

Поскольку авторы изобретения не могли выявить какого-либо белка в 2-Б анализе после разделения, была сконструирована ДНК библиотека Н. ИтПиепхае с использованием атипичной Н. тПиепхае (ΝΙΜ), штамм 772. Геномную ДНК, содержащую фрагменты в интервале от 2 до 7 т.п.н., лигировали в риС18 с последующей трансформацией в Е. сой 1М83. Трансформанты анализировали на связывание с Ι§Ό, используя иммуноанализ колоний, состоящий из Ι§Ρ(λ) человека и поликлональных антител к Ι§Ό человека, конъюгированных с НИР. Было выявлено три положительные колонии из 20000 тестируемых колоний и их подвергали второму раунду скрининга с Ι§ϋ(λ). Авторы изобретения секвенировали один из положительных клонов и обнаружили 3,55 т.н. вставку, содержащую ДНК, кодирующую четыре белка с НЮ175 по НЮ178 в соответствии с физической картой Н. тПиепхае КА20 (15). Для дальнейшего подтверждения специфического взаимодействия с Ι^Ό(λ), выбранный трансформант также анализировали с помощью проточной цитометрии. Как видно на фиг. 2В, Е. сой ДМ83, содержащая геномную ДНК Н. тПиепхае 772, соответствующую последовательности, кодирующей НЮ175 НЮ178, была обнаружена с помощью Ι§Ρ(λ) по сравнению с отрицательной контрольной Е. сой, трансформированной только пустым вектором (фиг. 2А).

- 29 015561

В дополнение к анализу клона Е. сой ΙΜ83 четыре белка Н. тПиепхае (ΗΙ0175-ΗΙ0178) клонировали в экспрессионный вектор рЕТ26(+) и продуцировали в Е. сой ВБ2ЮЕ3. Полученные в результате рекомбинантные белки анализировали с использованием Ι§Ό(λ) на Вестерн-блотах, и было обнаружено, что ΗΙ0178 является единственным белком, который выявляется с помощью ΙβΩ(λ) (данные не показаны).

Мутацию атипичной Н. тПиепхае (ΧΤΗι 3655) проводили путем введения кассеты с геном резистентности к канамицину в ген, кодирующий рЕ. Полученные в результате мутанты подтверждали с помощью ПЦР и отсутствие экспрессии рЕ проверяли анализом белков наружной мембраны в Вестернблотах, используя специфическую анти-рЕ антисыворотку (данные не показаны). Мутант ΧΤΗί 3655Дре также тестировали с помощью проточной цитометрии, и явно сниженная флуоресценция была обнаружена с этим мутантом по сравнению с соответствующей №ГН1 3655 дикого типа при анализировании с кроличьей анти-рЕ моновалентной антисывороткой и НТС-конъюгированными козьими антикроличьими вторичными рАЬ (фиг. 2С и Ό).

Белок Е был обнаружен у всех Н. тПиен/ае, несмотря на то, что другие подвиды были отрицательными.

Для анализа экспрессии рЕ клинических изолятов и типа штаммов ХТН| авторы изобретения разработали прямой анализ связывания с помощью проточной цитометрии, состоящий из сывороточного Ι§ϋ(λ) и НТС-конъюгированного вторичного антитела, направленного против Ι§Ό человека. В исходных экспериментах бактерии, собранные в различные моменты времени, анализировали на экспрессию рЕ. Отличий в отношении экспрессии рЕ между фазой логарифмического роста или стационарной фазой не наблюдалось, что указывает на то, что поверхностный рЕ №ТН1 не зависел от фазы роста. Бактерии в стационарной фазе, таким образом, были использованы во всех последующих анализах. Была проанализирована средняя интенсивность флуоресценции (шП) на бактериальную клетку, и все 22 штамма ХТН| были включены в это исследование. Интенсивность флуоресценции варьировала между различными штаммами №ТН1, тем не менее рЕ был обнаружен у большинства ХТН| в этом конкретном исследовании с использованием Ι§Ό(λ) миеломной сыворотки в качестве детектирующего антитела (фиг. 3).

В других экспериментах специфические кроличьи антитела к рЕ использовали для выявления поверхностного рЕ. Специфическая анти-рЕ антисыворотка специфически распознавала рЕ также у инкапсулированных штаммов Н. шЛиепгае, Н. аедурйсик и Н. Йаето1убси8 (данные не показаны).

Для дополнительного анализа уровней экспрессии рЕ экстракты наружной мембраны различных гемофильных видов, обработанные Етр1деп®, тестировали в Вестерн-блоттинге с использованием ΙβΩ(λ) в качестве детектирующего антитела (табл. 1). В этих экспериментах не было обнаружено различий между гемофильными штаммами с высокой и низкой экспрессией, т.е. в Вестерн-блотах у всех штаммов демонстрировалась одинаковая интенсивность рЕ и в том же положении, соответствующем 16 кДа. Инкапсулированная Н. шПиепхае (тип с а по ί) также экспрессировала рЕ по данным Вестерн-блотов (табл. 1). Например, экспрессию рЕ у четырех Н. тПиепхае капсула типа Ь (Н1Ь) сравнивают с ХТН| на фиг. 4. Н. аедурйсик и Н. Йаето1уйси8 экспрессировали рЕ (табл. 1), тогда как для других родственных гемофильных видов, которые являются отрицательными в проточной цитометрии (фиг. 3), в Вестерн-блот анализах не было обнаружено рЕ. Специфическая анти-рЕ антисыворотка специфически распознавала рЕ также у инкапсулировнных штаммов (данные не показаны).

Таблица 1

	Инкапсулированная или атипичная (ΝΤ)	Вестерн-блот (положительны й/отрицательный; 0)
556	Н₊ шЯиепгае СССС ЕР 6881 I капсула типа а	положительный
557	Н. шЯиепгае СС1КЗ ЕР 7315 I капсула типа а	положительный
94	Η.ΐ. типа а	положительный
479	Н. гпПиепхае Μίηη А типа Ь	положительный
547	Н. тЯиепгае Еадап типа Ь	положительный
485	Η. ίηίΙυβηζΒβ 85 05 30 Ь	положительный
539	Н. шПцепгае Р-22 капсула типа Ь	положительный
541	Н. тЛиепгае НК 695 капсула типа Ь	положительный
542	Н. тЛиепгае НК 691 капсула типа Ь	положительным
577	Н. тЯпелгае НК 713 капсула типа Ь	положительный
57«	Н. шЛиепхае НК 7!4 капсула типа Ь	положительный
582	Н. 1пЛцепгае НК 83458 капсула типа Ь	положительный
581	Н, шДиепгае НК 163 капсула типа Ь	положительный
580	Н. тЛиепгае НК 729 капсула типа Ь	положительный

- 30 015561

569	Н. «пЛиепгае 17 В ЦаПаа капсула типа Ь	положительный
568	Н, тЯиелуае ПЬ 42/2Р4 капсула типа Ь	положительный
579	Н. шЯиепгае НК 720 капсула типа Ь	положительный
477	Н. тПиепгае 6-460 капсула типа Ь	положительный
570	Η. ίπΐΙιιβηζΛβ ПЬ 42 капсула типа Ь	положительный
	Н. шЛиепгае КМ 804 без капсулы типа Ь	положительный
583	Н. тЛиепхае НК 705 без капсулы типа Ь	положительный

551	Н₊ шЯиепгае ССПС ЕГ 4851 II капсула типа с	положительный
552	Н. 1п(1иепгае ССЕГС ЕР 4852 II капсула типа с	положительный
95	Η.ί. типар с	положительный
555	Н. тЯиепгае ССИб ЕЕ 6878 IV капсула типа б	положительный
560	Н. 1\|1Лиеп'/ае ССЕЮ ЕР 1ЧСТС 8470 капсула типа (1	положительный
96	Η.ί. типа ά	положительный
554	Н. тПиептае ССЕЮ ЕР 6877 IV капсула типа е	положительный
88	Η.ί. типае А11/01	положительный
89	Η.ί. типае А76/0!	положительный
90	Η.ί. типа е А77/99	положительный
559	Н. тПиепгае ССиС ЕГ 15519 II капсула типа ί	положительный
78	Η.ί. ссио 15435 капсула типа!	положительный
91	Η.ί. типаГА1/01	положительный
92	Η.ί. типа ΓΑ58/0Ι	положительный
93	Η.ί. типа ГА91/01	положительный

67	Η.ί. КТ 6-9547 Ь.типа I	положительный
478	Н. 1пПиепгае 6-601 ΝΤ	положительный
484	Н. тЛиепгае 6-6200 ΝΤ ΝΤ	положительный
507	Н. тПиепгае 6-102 ΝΤΝΤ	положительный
65	Η.ί.ΝΤ 7-68/99 С1агеп. 1ауа§е	положительный
68	Η.ί. ΝΤ 7-758	положительный
546	Н. тйиепгае 6-9547 ΝΤ	положительный
480	Н. «пЯиепгае 772 ΝΤ	положительный
476	Н. (пЯиепгае 6-П5 ΝΤ	положительный
481	Н. тПиепгае 6-504 ΝΤ	положительный
482	Н. тЙиепгае 6-7702 ΝΤ	положительный
483	Н. тЯиепгае82 10 23 ΝΤ	положительный
486	Н. тЯиепгае 6-121 ΝΤ	положительный
506	Н. (пЛиепгае 6-6267 ΝΤ	положительный
540	Н. тйиепгае ϋ-26 ΝΤ	положительный

- 31 015561

543	Н. тЯиепгае Ви1Та1о 1479 ΝΤ	положительный
544	Н. тйиепгае ВиГГа1о С 7961 ΝΤ	положительный
64	Η.ί. 56-2934 000428 ΝΤ	положительный
69	Η.ϊ. 7-120/99 бронх. ΝΤ	положительный
70	Η.ί, 7-161/99 бронх, ΝΤ	положительный
66	Η,ΐ. 56-2952 000428 ΝΤ	положительный
105	Η.Ι ΚΜ 3655 ΝΤ	положительный

531	Н. ае&урбсиз ЕР 628 ΝΤ, без Ь	положительный
73	Н,ае&ур0си5 СС1КЭ 25716	положительный
74	Н.аеёурйоиз ССТО 26840	положительный
76	Н.аекурОсиз СССО 39154	положительный
79	Н.аекурйсиз НК 1247	положительный
80	Н.ае^урбсиз НК 1229	положительный
81	Н.ае^урОсиз НК 1242	положительный
82	Η.ί. биовар ае^ургкиз НК 865	положительный
83	Η.ί. биовар ае§ур1киз НК 871	положительный
84	Η.ί. биовар ае^урскиз НК 1222	положительный
85	Η.ί. биовар аевурбсиз НК 1239	положительный
86	ВРГ-подобное заболевание НК 1212	положительный
87	ВРР-подобное заболевание НК 1213	положительный
72	Н.ЬаепкИуйсиз ССиС 15642	положительный
101	Н.Ьаегпо1у1кл13 34669/83	положительный
102	Н.Ьаето1у(1си5 47802/88	положительный
103	Н.Ьаето1у11си5 937016	положительный
104	Н.11аето1у1киз 74108/81	положительный
520	Н. рагатДиепгае биотип I НК 409	0
521	Н. рага1пНиепгае биотип II НК 23	0
58	59004 Н.рагатЯ. биовар III	0
59	75834 Н.рагмпЛ. биовар III	0
60	78909 Н,рага1пЛ. биовар III	0
97	Н. рагатДиепгае 947172	0
98	Н. рагатйиепгае 59257/91	0
99	Н. рагатДиепгае 59004/91	0
100	Н. рагатДиелгае 977101	0
545	Н-рагатЛиепаае ВиГГа1о 3198 ΝΤ	0

75	Н-зошпцз ССиС 37617	0
512	Н. рагазшз 9918	0
516	Н. рагазшз 99 19	0
527	Н. рагазиЬ ЕР 3712	0
524	Н. рагарЬгорИПиз НК 319	0
525	Н. рагарЬгорЬДиз НК 415	0
517	Н. рагарЬгорИДиз 12894	0
71	Η.«οηί₅ ссио 14834	0
526	Н. ар11горН11из НК 327	0
529	Н. аркгоркНиз 11832 А	0
532	Н. р1еигарпеитошае ЕЕ 9917	0

61	39612 ЕДсспеПа соггоДепз	0
62	49064 Е\|кспс11а соггоОегк	0
63	959074 Е\|кепе11асо1то0еп5	0
537	АсНпоЬас\|]1и5 асипотус. НК 666	0
	Р.тиИ.78908/90	0

- 32 015561

Рекомбинантно полученный рЕ22-160 [рЕ (А)] выявляется с помощью Ι§ϋ(λ).

В первоначальных экспериментах авторы пытались рекомбинантно получить рЕ, но были получены только незначительные концентрации. Для максимального увеличения выхода белка был сконструирован усеченный фрагмент рЕ, состоящий из аминокислотных остатков с лизина 22 до лизина 160. ΝКонцевой сигнальный пептид, включающий аминокислоту глутамин 21, был, таким образом, удален и заменен лидерным пептидом в добавление к девяти остаткам, происходящим из вектора рЕТ26(+) (фиг. 5А). Усеченный рЕ22-160 был обозначен рЕ(А) (фиг. 5В). Для подтверждения того, что рекомбинантный белковый продукт соответствовал рЕ дикого типа, рекомбинантно экспрессированный рЕ(А) вместе с рЕ, выделеным из КТН 772, анализировали с помощью 8Б8-РАСЕ и Вестерн-блота, используя в качестве зонда Ι§Ό(λ). Как показано на фиг. 5Ό, рекомбинантный рЕ(А) в значительной степени соответствовал рЕ дикого типа по данным 8Б8-РАСЕ. Кроме того, рЕ(А), полученный в Е. сο1^. можно было определить вплоть до 0,01 мкг с помощью Ι§Ό(λ) антисыворотки (фиг. 5Е).

рЕ(А) использовали для иммунизации кроликов и после завершения схемы иммунизации, как описано подробно в разделе Материалы и методы, анти-рЕ антисыворотку очищали на колонке, состоящей из рассчитанного иммунодоминантного пептида (аминокислоты рЕ41-68). Полученные в результате антитела отчетливо выявляли рЕ как на поверхности бактерий (фиг. 2С), так и на Вестерн-блотах (не показано).

ДНК последовательность гена белка Е и открытая рамка считывания.

ДНК и аминокислотная последовательность рЕ1-160 из штамма Ν^τ 772 приведена на фиг. 6. Открытая рамка считывания (ОКЕ) составляет в длину 160 аминокислот, и предполагаемый сигнальный пептид имеет длину 20 аминокислот. Компьютерный анализ указывает на то, что сигнальная пептидаза распознает аминокислотные остатки аланин 18 - лизин 22 и расщепляет между остатками изолейцин 20 и глутамин 21 (38). Одновременно профиль гидрофобности НГО (39) показывает, что рЕ имеет гидрофобный сигнальный пептид, тогда как остаток молекулы, главным образом, является гидрофильным (фиг. 7).

Для тщательного определения сайта расщепления сигнальной пептидазы, рекомбинантный полноразмерный рЕ подвергали разрушению по Эдману. Однако аминоконец полипептидной цепи рЕ, вероятно, был заблокирован. Возможным объяснением этого нарушения могло быть то, что первая аминокислота была пироглутамилом, как ранее описано для семейства белков М. са!аггйа11к икрА (11). Однако попытки удалить этот предполагаемый остаток с помощью пироглутаматаминопептидазы оказались неудачными. В отличие от полноразмерного рЕ1-160 Ν-концевая последовательность для рЕ(А) (рЕ22-160), не имеющая эндогенного сигнального пептида Н. тПиепхае (фиг. 5), была с успехом охарактеризована с помощью разрушения по Эдману, и было обнаружено, что она содержит предполагаемую векторную последовательность, т.е. сигнальная пептидаза в Е. той расщепляла в правильном положении (фиг. 5А).

Белок Е секвенировали в серии различных видов ΗаетοрЫ1ик, в том числе Ν^τ и инкапсулированной Н. тПиепхае (табл. 1). Интересно то, что рЕ был чрезвычайно консервативным. Только некоторые аминокислоты подверглись точковым мутациям, и они мутировали в большинстве штаммов, следуя определенной системе (фиг. 6 и табл. 2).

Таблица 2

Точковые мутации в гене ре в различных видах ΗаетοрЫ1ик по сравнению с Н. тПиепхае Кб в качестве штамма сравнения ^а)

Точковая мутация	Число штаммов с мутациями (%)	Анализируемое кол-во
11е20 > Ώιτ20	1В (58%)	31
А1а23 > Ча123	5 (16%)	31
21и24 > Ьуе24	1^{а) Ь)} (3,2%)	31
Уа128 > Ме£28	2 (6,5%)	31
А1а31 > ТНгЗ!	19 (61%)	31
Рго32 > Уа132	3 (9,7%)	31
Рго32 > А1а32	5 (16%)	31
11е41 > Уа141	8 (26%)	31
Уа147 > А1а47	3 (10%)	30
Агд76 > Ьуа76	2 (7,7%)	26
11е107 > Уа1107	16 (62%)	26
Ьуз153 > С1и153	1^Ь\| (3,2%)	13
А1а154 > Уа1154	2 (15%)	13

Удлиненный С-конец (3 дополнительных аа)
ЗУРКК стоп (=Кб)^с) 11(85%)	13
ЗУРКК8АР стоп 2 (15%)	13

а) Ген ре был секвенирован у инкапсулированной Н. тПиепхае типа а (п=2), Ь (п=2), с (п=2), б (п=1), е (п=2) и Г (п=3), ЭТН1 (п=8), Н. тПиепхае биовар аедурйсик (п=6) и Н. Аедурйсик (п=5), с использованием фланкирующих праймеров.

- 33 015561

b) ΝΊΉί 772 (последовательность БЕР ΙΌ N0: 1).

c) КД обозначает Н. тПиепхае штамм КД.

Различные фрагменты рЕ могут легко продуцироваться в Е. со11.

Восемь последовательностей кДНК, полученных из полноразмерного рЕ, клонировали в рЕТ26Ь(+) и экспрессировали в Е. со11. Полученные в результате белки очищали на никелевых колонках с аффинностью к гистидиновым меткам (фиг. 8). Рекомбинантные белки охватывали полностью зрелый белковый продукт рЕ, и их индивидуальные длины и положения были показаны на фиг. 8А и очищеные продукты представлены на фиг. 8В.

рЕ является ключевым фактором вирулентности при остром среднем отите у крыс (АОМ).

Для изучения роли рЕ как фактора вирулентности у ΝΊΉί инфицировали среднее ухо крыс 10⁵-10⁹ΝΊΉί 3655 Дре или соответствующим диким типом ΝΊΉί 3655 (фиг. 9). Интересно то, что 100-1000 раз больше ΝΤΗί 3655 Дре требовалось для индукции аналогичного АОМ по сравнению с бактериями дикого типа. Следовательно, рЕ является ключевым фактором вирулентности для АОМ, индуцированного ΝΤΗί.

рЕ является высокоиммуногенным у определенных популяций.

Для измерения уровней антител у детей и доноров крови, рекомбинантный рЕ(А) очищали из Е. соП (фиг. 5В) и использовали в ЕЫБА. Результаты ЕЬ1БА-анализов антител против рЕ(А) показаны на фиг. 9. Дети младше 6-месячного возраста имели детектируемые 1дО и 1дА против рЕ(А). 1дО антитела демонстрировали максимальные уровни у детей в возрасте от 5 до 10 лет. Напротив, 1дА антитела увеличивались постепенно с увеличением возраста и наивысшие значения определялись в возрастной группе от 70 до 80 лет.

Подходящие эпитопы.

В-клеточные эпитопы белка главным образом расположены на его поверхности. Для определения В-клеточных эпитопов полипептидов белка Е объединяли два способа: определение 20-структуры и определение антигенного индекса. Определение 20-структуры осуществляли, используя программу РБ1РКЕО (от Иау1Д 1опе8, Вгипе1 ВюшГогтаДск Огоир, Иер!. В1о1ощса1 Баепсек, Вгипе1 ип1уег811у, ИхЬДДде ИВ8 3РН, ИК) . Антигенный индекс рассчитывали на основе способа, описанного 1ате5оп и Vо1Г (САВЮБ 4:181-186 [1988]). Параметрами, используемыми в этой программе, являются антигенный индекс и минимальная длина для антигенного пептида. Антигенный индекс 0,9 для минимум 5 последовательных аминокислот использовали в качестве пороговой величины в этой программе. Пептиды, содержащие приемлемые потенциальные В-клеточные эпитопы, перечислены в табл. 3. Они могут быть использованы (предпочтительно конъюгированные или рекомбинантно соединенные с более крупным белком) в композиции вакцины для профилактики инфекций, вызванных п1Нк как и аналогичные пептиды, содержащие консервативные мутации (предпочтительно 70, 80, 85, 95, 99 или 100% идентичные последовательностям, табл. 3) или усеченные формы, содержащие 5 или более (например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 или 25) аминокислот от них, или удлинения, содержащие, например, 1, 2, 3, 5, 10 дополнительных аминокислот на Ν- и/или С-концах пептида из нативного окружения полипептида белка Е (БЕр ΙΌ Ν0: 1 или ее природные гомологи, как показано выше в табл. 2), которые предохраняют эффективный эпитоп, который может вызывать иммунный ответ у хозяина на полипептид белка Е.

Таблица 3

Положение

Потенциальные В-клеточные эпитопы из БЕр ΙΌ Ν0: 1 (или их природные гомологи)

Последовательность

21	(2ΚΑΚΏΝΟ
21	ι2ΚνΚζ)Ν0
21	ΟΚΑΟΟΝΟ
21	ΟΚνΩΟΝΟ
59
82	РБРККУАВЗУКО
106	ΏΙΚΤϋΓΥβΕΓΚΟςίΕ
106	βνΜΌΓΪϋΕΠίΟδΟ
123	ΑΡΚΚβΚΚΗ
136	ΡϋΤΤΣ

Выводы.

Поверхностный белок рЕ наружной мембраны НаеторЬДик, представляющий собой ключевой фактор вирулентности для АОМ, индуцированного ХТН1, является высокоиммуногенным у определенной популяции и, следовательно, является очень подходящим кандидатом для вакцины против целого ряда заболеваний человека.

- 34 015561

Ссылки.

1. Киап, М., Аккоуип1и, М., СгиЬЬ, А. апб Еогкдгеп А. 1990. Рго(ет Ό оГ НаеторНбик тПиепхае. А поуе1 Ьас(епа1 кигГасе рго(ет \\ЙН аГПп11у £ог Нитап Ι§Ό. I. Iттиπо1. 145:3379.

2. 1апкоп, Н., Небеп, Ь.-Ο., СгиЬЬ, А., Киап, М. апб Еогкдгеп, А. 1991. Рго(ет Ό, ап 1ттипод1оЬи1т ΌЬтбтд рго(ет оГ НаеторН11тк тПиепхае: с1оптд, пис1еоббе кециепсе, апб ехргеккюп т ЕксНепсЫа со11. Шесб Iттип. 59:119.

3. 1апкоп, Н., Ме1Ник, А., Негтапккоп, А. апб Еогкдгеп, А. 1994. Рго1ет Ό, (Не д1усегорНокрНоб1ек1ег рНокрНоб1ек(егаке Ггот НаеторНПпк тПиепхае \\ЙН аГПп1(у Гог Нитап 1ттипод1оЬи1т Ό, тПпепсек У1ги1епсе 1п а га! о11(1к тобе1. Шесб Iттип. 62:4848.

4. 1апкоп, Н., Саг1еп, В., Сегут, А., Еогкдгеп, А., Вргк-Мадпикбобп, А., ЬтбЬегд, 8. апб Кипег, Т. 1999. ЕГГес(к оп (Не сШа!еб ерННеНит оГ рго1ет Ό-ргобистд апб попргобистд поп(уреаЬ1е НаеторНПпк тПиепхае ш пакорНагупдеа1 бккие сиНигек. I. ПчГесБ Э|к. 180:737.

5. АНгеп, ЕЬ., 1апкоп, Н., Еогкдгеп, А., К1екЬеск, К. 2001. РгсПет Ό ехргеккюп ргото(ек (Не абНегепсе апб т(егпаНха(юп о Г поп-(уреаЬ1е НаеторНПпк тПиепхае 1п(о Нитап топосу бс се11к. МгегоЬ. Ра(Нод. 31:151.

6. Еогкдгеп, А. апб СгиЬЬ, А. (1979). Мапу Ьас(ег1а1 креаек Ьтб Нитап Ι§Ό. I. ^типок 122, 14681472.

7. Вапск, С. апб Еогкдгеп, А. (1978). Мапу Ьас1ег1а1 креаек аге тйодешс Гог Нитап Ь1ооб 1утрНосу1ек. 8сапб. I. Iттипо1. 8, 347-354.

8. Сакеб, ЕЕ. апб Са1одегек, А. (1986). СНагас(епкбск оГ Нитап В се11к гекропкгуе (о (Не Т-тберепбеп( тНодеп ВгапНате11а са!аггНабк. Питипокду 58, 37-41.

9. Еогкдгеп, А., Реп(а, А., 8сН1окктап, 8.Е. апб Теббег, Т.Е. (1988). ВгапНате11а са(аггНаНк ас(ка(ек Нитап В 1утрНосу(ек ГобоМпд Ыегасбопк \\ЙН кигГасе Ι§Ό апб с1акк Ι та.)ог Ык1осотрабЬ11Ну сотр1ех апбдепк. Се11. Iттипо1. 112, 78-88.

10. 8акак1, К. апб Мипкоп 1г., К.8. (1993). Рго1ет Ό оГ НаеторНбик тПиепхае 1к по( а ишуегка1 1ттипод1оЬибп Ό-Ьшбтд рго1ет. Шесб Iттип. 61, 3026-3031.

11. Еогкдгеп, А., Вгап1, М., Мо11епку1к1, А., МиуотЬ^е, А., 1апкоп, Н., \УоН1. Ν. апб К1екЬеск, К. 2001. Ео1абоп апб сНагас(епха(юп оГ а поуе1 кЭ-Ьтбищ рго(ет Егот Могахе11а са(аггНаНк. I. Iттиπо1. 167:2112.

12. Согд, А., Ο^πικ^γ С., Води(Н, С. ^е1кк, ^. 1999. Кесей беуе1ортеп1к ш 1\\'о-бппепкюпа1 де1 е1ес(горНогек1к νίΐΠ 1ттоЫНхеб рН дгаб1ейк: \\Пбе рН дгаб1ейк ир (о рН 12, 1опдег керагабоп б1к(апсек апб ЦтрбПеб ргосебигек. Е1есбпрНогек1к 20:712.

13. Вегпк, Κ.Ι. апб ТНотак, С.А., 1г. 1965. бок-Шоп од Н1дН то1еси1аг \\'е1дН( ЭХА Егот НаеторНбик тПиепхае. I. Мо1. Вю1. 11:476.

14. С1агк-Сигбкк, ЕЕ., 1асоЬк, ^.К., ОосНейу, М.А., КйсЫе, Ь.К. апб Сигбкк, К. 3гб. 1985. Мо1еси1аг апа1ук1к оГ ЭНА апб сопк(гпс(юп оГ депотю НЬгапек оГ МусоЬас(еппт 1ергае. I. Вас(епо1. 161:1093.

15. Е1е1ксНтапп, К.О., Абатк, М.О., ХУННе, Ο., С1ау1оп, К.А., Кикпекк, Е.Е., Кег1ауаде, А.К., ВиН, С.Е, ТотЬ, ЕЕ., ОоидНейу, В.А., Метск ЕМ., е( а1. 1995. \УНо1е-депоте гапбот кециепстд апб аккетЬ1у оГ НаеторНбик НтПпепхае Кб. 8с1епсе 269:496.

16. №е1кеп, Н., Епде1ЬгесЙ, I., Вгипак, 8. апб уоп Неупе С. 1997. ШепбПсаНоп оГ ргокагуобс апб еикагуобс к1дпа1 рерббек апб ргебюбоп оГ (Неб с1еауаде кНек. РгсПет Епдтеегтд 10: 1.

17. Ку1е, I. апб Ооо1йбе, К.Е. 1982. А к1тр1е те(Ноб Гог б1кр1аутд (Не НубгораПис сНагас(ег оГ а рго1ет. I. Мо1. Вю1. 157:105.

18. Ро_)е, С. апб КебПе1б, ЕК. 2003. ТгапкГогтайоп оГ НаеторНбик тПиепхае. Ме(Нобк. Мо1. Меб. 71:57-70.

19. Никкат, М., Вескег, К., Уоп Е1Е£, С., 8сНгепхеН I., Ре(егк, С. апб Неггтапп, М. 2001. I. Вас(епо1. 183 (23):6778-6786.

- 35 015561

Список последовательностей <110> Аше Еогздгеп еЬ аЬ <120> Новый поверхностный белок НаеторНИ из 1г>^1иепгае (белок Е; рЕ) <130> 21030217 <160> 11 <170> РаСепЫп уегзтоп 3.3 <210> 1 <211> 160 <212> РКТ <213> НаеторЬЫиз ЬпЬЬиепгае (рЕ) <400> 1

Μβΐ. 1

Ьуз

Пе

Не 5

Ьеи

ТЫ

Ьеи

Зег

Ьеи 10

СЬу

Ьеи

ТЬг

АЬа 15

Суз

Зег

АЬа

СЬп

Не

СЬп

Ьуз

АЬа

Ьуз

С1п

Азп

Азр

Уа1

Ьуз

Ьеи

АЬа

Рго

20

25

30

Рго

ТЬг

Азр

УаЬ

Агд

Зег

СЬу

Туг

Не

Агд

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Азп

Уа1

Азп

35

40

45

Туг

Не

Азр

Зег

СЬи

Зег

Не

Тгр

Уа 1

Азр

Азп

С1п

СЬи

Рго

С1п

50

55

60

Не

Уа1

Н1з

РЬе

Азр

АЬа

УаЬ

Азп

Ьеи

Азр

Агд

СЬу

Ьеи

Туг

УаЬ

65

70

75

80

Туг

Рго

СЬи

Рго

Ьуз

Агд

Туг

АЬа

Агд

Зег

Уа1

Агд

СЬп

Туг

Ьуз

Не

85

90

95

Ьеи

Азп

Суз

АЬа

Азп

Туг

НЬз

Ьеи

ТЬг

СЬп

11е

Агд

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

100

105

110

Азр

СЬи

РЬе

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

Ьеи

Агд

АЬа

Рго

Ьуз

СЬп

Ьуз

115

120

125

Ьуз

ΗΪ3

ТЬг

Ьеи

5ег

Ьеи

ТЬг

Рго

Азр

ТЬг

Ьеи

Туг

Азп

АЬа

130

135

140

СЬп

11е

Суз

А1а

Азп

Туг

СЬу

СЬи

АЬа

РЬе

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

145

150

155

160

<210> 2 <211> 139 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторЫ1из ЬпГЬцепсае или синтетический белок (рЕ(А))

- 36 015561 <400> 2

Ьуз 1

А1а

Ьуз

С1п

Азп 5

Азр

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а 10

Рго

ТЬг

Азр

Уа1 15

Агд

5ег

С1у

Туг

Не

Агд

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азп

Уа1

Азп

Туг

11е

Азр

Зег

20

25

30

С1и

Зег

Не

Тгр

Уа1

Азр

Азп

С1п

С1и

Рго

С1п

Не

ν31

Н1з

РЬе

Азр

35

40

45

А1а

Уа1

Азп

Ьеи

Азр

Агд

С1у

Ьеи

Туг

Уа1

Туг

Рго

С1и

Рго

Ьуз

50

55

60

Агд

Туг

А1а

Агд

Зег

Уа1

Агд

С1п

Туг

Ьуз

Не

Ьеи

Азп

Суз

А1а

Азп

65

70

75

80

Туг

Н13

Ьеи

ТЬг

С1п

Не

Агд

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

Азр

О1и

РЬе

Тгр

С1у

85

90

95

С1п

С1у

Ьеи

Агд

А1а

Рго

Ьуз

С1п

Ьуз

Ъуз

ΗΪ5

ТЬг

Ьеи

Зег

100

105

НО

Ьеи

ТЬг

Рго

Азр

ТЬг

Ьеи

Туг

Азп

А1а

Й1п

Не

Суз

А1а

115

120

125

Азп

Туг

С1у

С1и

А1а

РЬе

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

130

135

<210> 3 <211> 28 <212> РГ-.Т <213> Фрагмент белка из НаеторЫЬиз ίηίΐυβηζββ или синтетический пептид (РЕ41-68) <400?3

Не Агд Пей Уа1 Ьуз Азп Ча1 Азп Туг Туг Не Азр Зег (Ни Зег Не

1015

Тгр Уа1 Азр Азп С1п 31и Рго С1п Т1е Уа1 Н1з РЬе

2025 <210>4 <211>39 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторЬНиз хпНиепхае или синтетический пептид (рЕ22-60) <400>4

- 37 015561

Ьуз

АЬа

Ьуз

С1п

Азп

Азр

Уа1

Ьуз

Ьеи

АЬа

Рго

ТЬг

Азр

УаЬ

Агд

1

5

10

15

Зег

СЬу

Туг

Не

Агд

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азп

Уа1

Азп

Туг

Ые

Азр

Зег

20

25

30

СЬи

Зег

Не

Тгр

УаЬ

Авр

Азп

<210> 5 <2И> 74 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторАЬЬиэ (рЕ22-95)

ЬпЕЬиепгае или синтетический пептид <400> 5

Ьуз 1

АЬа

Ьуз

СЬп

Азп 5

Азр Уа1

Ьуз

Ьеи АЬа 10

Рго

ТНг

Азр

УаЬ 15

Агд

Зег

СЬу

Туг

1Ье

Агд

Ьеи

Уа1

Ьуз

Адп

УаЬ

Азп

Туг

Ые

Авр

Зег

20

25

30

СЬи

Зег

Ые

Тгр

УаЬ

Азр

Азп

СЬп

СЬи

Рго

СЬп

ЬЬе

УаЬ

НЬз

РЬе

Азр

35

40

45

АЬа

УаЬ

Азп

Ьеи

Азр

Агд

СЬу

Ьеи

Туг

УаЬ

Туг

Рго

СЬи

Рго

Ьуз

50

55

60

Агд

Туг

АЬа

Агд

Зег

УаЬ

Агд

СЬп

Туг

Ьуз

65

70

<210> 6 <211> 104 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторНЬЬиз ЬпЬЬиепгае или синтетический пептид (рЕ22-125) <400> 6

Ьуз 1

АЬа

Ьуз

СЬп

Азп 5

Азр

УаЬ

Ьуз

Ьеи

АЬа 10

Рго

ТАг

Азр

УаЬ Ь5

Агд

Зег

СЬу

Туг

ЬЬе

Агд

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азп

УаЬ

Азп

Тут

Туг

Ые

Азр

Зег

20

25

30

СЬи

Зег

ЬЬе

Тгр

УаЬ

Авр

Азп

СЬп

СЬи

Рго

СЬп

Ые

УаЬ

НЬз

Р1пе

Азр

35

40

45

АЬа

УаЬ

Азп

Ьеи

Азр

Агд

СЬу

Ьеи

Туг

УаЬ

Туг

Рго

СЬи

Рго

Ьуз

50

55

60

- 38 015561

Агд Туг А1а Агд 65

Зег Уа1 70

Агд

С1п Туг Ьуз

Не 75

Ьеи

Азп

Суз

А1а

Азп 80

Туг

Ηί з

Ьеи

ТЬг

С1п

Не

Агд

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

Азр

<Ии

РЬе

Тгр

61 у

85

90

95

С1п

С1у

Ьеи

Агд

А1а

Рго

Ьуз

100 <210>7 <211>70 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаешорЬНиз ЬпГЬиепзае или синтетический пептид (рЕ56-125) <400>7

11е Тгр 1

Уа1

Азр Азп 5

С1п

С1и

Рго

С1п

11е 10

Уа1

НЬв

РЬе

Азр

А1а 15

Уа1

Азп

Ьеи

Азр

Агд

С1у

Ьеи

Туг

Уа1

Туг

Рго

61и

Рго

Ьуз

Агд

Туг

20

25

30

А1а

Агд

Зег

Уа1

Агд

61п

Туг

Ьуз

11е

Ьеи

Азп

Суз

А1а

Азп

Туг

ΗΪ5

35

40

45

Ьеи

ТЬг

С1п

11е

Агд

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

Азр

С1и

РЬе

Тгр

С1у

С1п

31у

50

55

60

Ьеи Агд А1а А1а Рго Ьуз

6570 <210> 8 <211>105 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторЬНиз (рЕ56-160}

ЬпПиепгае или синтетический пептид <400> 8

Не 1	Тгр	Уа1	Азр	Азп 5	61п	С1и	Рго
Уа1	Азп	Ьеи	Азр 20	Агд	С1у	Ьеи	Туг
А1а	Агд	Зег 35	Уа1	Агд	С1п	Туг	Ьуз 40
Ьеи	ТЬг 50	С1п	Не	Агд	ТЬг	Азр 55	РЬе

61п	Не 10	Уа1	ΗΪ3	РЬе	Азр	А1а 15	Уа1
Уа1 25	Туг	Рго	С1и	Рго	Ьуз 30	Агд	Туг
Не	Ьеи	Азп	Суз	А1а 45	Азп	Туг	Ηί3
Туг	Азр	С1и	РЬе 60	Тгр	С1у	С1п	С1у

- 39 015561

Ьеи 65

Агд

А1а

Рго

Ъуз 70

Ьув

С1п

Ьуз

ΗΪ® 75

ТЬг

Ьеи

8ег

Ьеи

ТЬг 80

Рго

Азр

ТЬг

Ьеи

Туг

Азп

А1а

С1п

Не

Суз

А1а

Азп

Туг

85

90

95

С1у

С1и

А1а

РЬе

5ег

Уа1

Азр

Ьуз

100

105

<210> 9 <211> 75 ' <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторЬНиз 1пЕ1иепгае или синтетический пептид (рЕвб-160) <400> 9

Агд 1

Туг

А1а

Агд

Зег Уа1 5

Агд

С1п

Туг

Ьуз 10

Не

Ъеи

Азп

Суз

А1а 15

Азп

Туг

ΗΪ5

Ьеи

ТЬг

С1п

Не

Агд

ТЬг

Азр

РЬе

Туг

Азр

С1и

РЬе

Тгр

С1у

20

25

30

С1п

С1у

Ьеи

Агд

А1а

Рго

Ьуз

С1п

Ьуз

Н13

ТЬг

Ьеи

Зег

35

40

45

Ьеи

ТЬг

Рго

Азр

ТЬг

Ъеи

Туг

Азп

А1а

С1п

Не

Су®

А1а

50

55

60

Азп

Туг

С1у

(31и

А1а

РЬе

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

65

70

75

<210> 10 <211> 46 <212> РКТ <213> Фрагмент белка из НаеторЬНиз ЬпИиепзае или (рЕ115-160) синтетический пептид <400> 10

РЬе 1

Тгр

С1у

С1п

С1у 5

Ьеи Агд

А1а

Рго 10

Ьуз

С1п

Ъуз

Ьуз 15

Н13

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

рго

Азр

ТЬг

Ьеи

Туг

Азп

А1а

С1п

Не

20

25

30

Не

Суз

А1а

Азп

Туг

С1у

С1и

А1а

РЬе

Зег

Уа1

Азр

Ьуз

Ъуз

35

40

45

<210> <211> <212> <213>

11 483 ДНК НаеторЬНиз ЬпНиепгае

- 40 015561

<400> 11
абдааааааа	НаП Ссаас	аЫаЕсасЫ:	дддЬГасЪСа	сЬдссГдССс	ЬдсЬсаааЬс	60
сааааддсба	аасааааЬда	СдСдаадсЬд	дсассдссда	сЬдаСдГасд	аадсддаСаС	120
аГасдЬЛЬдд	ЬааадааЬд-Ь	дааЫаЬЪ ас	а£сда£адЬд		ддЬддаЬаас	180
саададссас	аааССдЕаса	ЬЬЫдаСдса	д£дд£дааъе	ЬадаЬадддд	аОСдЬаОдГО	240
СаЬссПдадс	сГааасдЬЪа	ЬдсасдССсЬ	д^Хсд-Ьсаде	аГаада£.сЫ:	дааЪГдГдса	300
ааН аЬсаЫ:	ЬаасЬсаааЬ	асдаасЬдаЬ	ЬЬсЪаЪдаЪд	ааП1 Ьдддд	асадддГЫд	360
сдддсадсас	сЬааааадса	ааадаааса!	асдЁЬаадЬЬ	ЕаасассЕда	СасаасдсСС	420
^аЬааГдсСд	сЬсадаСИаС	ЬСдОдсдаас	ЬаЬддСдаад	саШГсадЬ	гдасаааааа	480
1аа						483

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Поверхностный белок, который может быть обнаружен у НаеторЫ1и8 шГшепгае, с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1 или его фрагмент, где фрагмент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 15 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1, где фрагмент (при необходимости связанный с носителем) способен индуцировать иммунный ответ на полипептид 8Е0 ΙΌ N0: 1.

2. Композиция вакцины, содержащая иммуногенный фрагмент поверхностного белка по п.1.

3. Композиция вакцины, содержащая иммуногенный фрагмент поверхностного белка по п.1, где фрагмент может быть обнаружен у НаеторЫ1и8 тГшепхае.

4. Композиция вакцины, содержащая рекомбинантный иммунногенный белок на основе белка по п.1, где аминокислоты в положениях 1-21 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 были удалены или заменены одной или несколькими аминокислотами.

5. Композиция вакцины по п.4, имеющая аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, или ее фрагмент, где фрагмент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 15 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2, где фрагмент (при необходимости связанный с носителем) способен индуцировать иммунный ответ на полипептид 8ЕО ΙΌ N0: 2.

6. Композиция вакцины, содержащая пептид с любой аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3-10 или его фрагмент, где фрагмент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 15 последовательных аминокислот любой аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3-10, где фрагмент (при необходимости связанный с носителем) способен индуцировать иммунный ответ против любого полипептида с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3-10.

7. Композиция вакцины по любому из пп.2-6, содержащая иммуногенную часть другой молекулы, где иммуногенная часть выбрана из группы, включающей белок Ό Н. тПиеи/ае, ΜΙΌ Могахе11а са1аггбаШ, и§рА1 или и§рА2 Могахе11а са1аггНа115 и белок наружной мембраны любого патогена дыхательных путей.

8. Композиция вакцины по любому из пп.2-6, дополнительно слитый продукт, в котором белок, фрагмент или пептид ковалентно или любым другим способом связаны с белком, углеводом или матрицей.

9. Выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 при сравнении с полноразмерной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1.

10. Композиция вакцины, содержащая выделенный полипептид по п.9.

11. Композиция вакцины, содержащая выделенный полипептид по п.9, где указанный полипептид представляет собой часть более крупного слитого белка.

12. Композиция вакцины по п.11, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент.

13. Композиция вакцины по п.11, где указанная композиция содержит по меньшей мере еще один другой антиген НаеторЫ1и8 тПиепхае.

14. Композиция вакцины, содержащая эффективное количество полипептида по п.9 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

15. Композиция вакцины по п.14, где указанная композиция содержит по меньшей мере еще один другой антиген НаеторЫ1и8 тПиепхае.

16. Композиция вакцины по любому из пп.2-8 и 10-15, в состав которой входит белок Ό НаеторЫ- 41 015561

1ик тПиепхае.

17. Применение поверхностного белка по п.1 для получения лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции, где инфекция вызвана НаеторЫ1и8 тПиепхае.

18. Применение выделенного белка по п.9 для получения лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции, где инфекция вызвана НаеторЫ1и8 тПиепхае.