KR20140101387A - 표면 노출된 헤모필루스 인플루엔자 단백질 （단백질 Ｅ ― ｐＥ） - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표면 노출된 단백질 (단백질 E: pE)인 유독성 인자로서, 헤모필루스 인플루엔자에서 검출될 수 있으며, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 상기 표면 노출된 단백질의 면역원성 단편, 및 재조합 면역원성 단백질 (pE (A)) 또는 상기 표면 노출된 단백질을 기재로 하는 이의 절두된 변이체를 갖는 표면 노출된 단백질에 고나한 것이다. 핵산 서열, 백신, 플라스미드 및 파아지, 인간외 숙주, 재조합 핵산 서열, 융합 단백질 또는 융합 생성물이 또한 기술되어 있다. 상기 단백질 또는 이의 절두된 단편을 재조합에 의해 생성하는 방법이 또한 기술되어 있다.

Description

표면 노출된 헤모필루스 인플루엔자 단백질 （단백질 Ｅ ― ｐＥ） {A NOVEL SURFACE EXPOSED HAEMOPHILUS INFLUENZAE PROTEIN (PROTEIN E - pE)}
본 발명은 표면 노출된 단백질 E, 즉 유동성 인자에 관한 것이며, 이는 모든 캡슐화된 무유형성 (non-typable; NT) 헤모필루스 인플루엔자에 존재한다.
헤모필루스 인플루엔자 유형 b (Hib) 및 무유형성 H. 인플루엔자 (NTHi)는 유아 및 성인에게서 다양한 질환을 초래시킨다. Hib는 4세 미만의 유아에게서 세균성 수막염 및 기타 침습성 감염을 초래시키는 반면, NTHi는 중이염, 굴염, 후두개염, 기관지기관지염, 및 폐렴의 원인물로부터 분리되었으며, 신생아 패혈증을 초래시킬 수 있다. 일반적으로 NTHi에 대한 백신은 시중에서 입수할 수 없으나, Hib에 대해서는 많은 백신이 사용되고 있다. 이들 백신은 18개월 미만의 유아에서 캡슐 폴리사카라이드에 대한 약한 면역 반응성을 극복하기 위한 다양한 단백질 담체 (메닌고코컬 외막 복합물, 테타누스 톡소이드, 비독성 변이체 디프테리아 독소, 또는 디프테리아 톡소이드)에 컨쥬게이팅된 Hib 캡슐 폴리사카라이드, 폴리리보실 리비톨 포스페이트로 이루어진다. H. 인플루엔자 외막 단백질 (OMP)은 또한, 폴리리보실 리비톨 포스페이트의 담체로서 간주되는데, 그 이유는 이들이 Hib 및 NTHi 감염 후 숙주 항체의 표적인 것으로 입증되었기 때문이다. OMP P1, P2, P4, P5 및 P6에 대한 항체 및 9-kDa 단백질은 H. 인플루엔자 감염에 대한 생체내 보호 및 실험관내 박테리아 검정으로 시험하였으며, P1, P4 및 P6에 대한 항체는 동종성 및 이종성 H. 인플루엔자 균주 둘 모두에 대해 생물학적 활성을 나타낸다. 기타 OMP에 대한 항체로부터의 이종성 보호의 결여는 부분적으로, 다양한 H. 인플루엔자 균주중에서 이들 단백질의 항원 다양성으로 인한 것이다. 따라서, 이상적인 항원은 박테리아 표면에 노출되고, 항원적으로 잘 보존되어야 한다. 본 실험에서, Hib 및 NTHi 균주중에서 넓게 분포되고 항원적으로 잘 보존된 42-kDa 막 단백질 (단백질 D)이 분리되고, 클로닝되고, 시퀀싱되었으며, 병원성 인자 및 가능한 백신 후보인 것으로 입증되었다 (1-5).
이십년 전에, 헤모필루스 인플루엔자 및 M. 카타르할리스 (M. catarrhalis)는 가용성 및 표면 결합된 인간 IgD 둘 모두에 대해 강한 친화도를 나타내는 것으로 입증되었다 (6). IgD-결합은 세포 수준에서 표면-결합된 IgD와의 유사한 상호작용에 의해 평행하게 발생하며, 이러한 현상은 H. 인플루엔자 및 M. 카타르할리스에 의한 인간 림프구에 대한 강한 분열유발성 효과를 설명한다 (7-9). H. 인플루엔자로부터의 IgD-결합 외막 단백질 (단백질 D)이 분리되고, 클로닝되고, 중요한 병원성 인자인 것으로 입증되었다 (1-5). 그러나, 단백질 D는 모든 IgD 골수중에 보편적으로 결합하지 못한다 (10).
H. 인플루엔자가 상기도 및 하기도에서 감염을 초래한다는 밝혀진 사항을 고려하여, H. 인플루엔자에 대해 사용될 수 있는 백신 개발이 현재 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 H. 인플루엔자가 신체중의 세포와 어떤 방식으로 상호작용하며, 면역계와 어떻게 반응하는 지를 밝혀내어 새로운 유형의 백신을 제공하는 것이다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물, 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 헤모필루스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 표면 노출된 단백을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 헤모필루스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 상기 표면 노출된 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 천연발생 변이체 또는 인공변형된 변이체를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 상기 언급된 표면 노출된 단백질을 기재로 하는 재조합 면역원성 단백질로서, SEQ ID NO:1의 1번 내지 21번의 아미노산이 결실되거나 하나 이상의 아미노산에 의해 치환된 재조합 면역원성 단백질을 제공한다. 일 구체예에서, SEQ ID NO:1의 1번 내지 21번의 아미노산은 0 내지 21개의 선택적 아미노산으로 치환된다. 또 다른 구체예에서, 재조합 면역원성 단백질은 SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:3에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:4에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:5에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:6에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:8에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:9에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO:10에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 갖는 펩티드를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 감염을 예방하거나 치료하기 위한 의약 제조시 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 단백질, 단편 또는 펩티드의 용도를 제공한다. 일 구체예에서, 감염은 헤모필루스 인플루엔자에 의해 초래되며, 또 다른 구체예에서, 헤모필루스 인플루엔자는 캡슐화되거나 무유형성이다. 또 다른 구체예에서, 상기 용도는 예를 들어, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD)를 갖는 성인 및 유아에서 중이염, 굴염 또는 하기도관 감염의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 단백질, 단편 또는 펩티드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 하나 이상의 애쥬번트, 비히클, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 에멀션화제, 습윤제 또는 트랜스펙션 촉진 화합물을 포함하는 의약을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 단백질, 단편 또는 펩티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 상기 단백질, 단편 또는 펩티드의 하나 이상의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 백신 조성물은 추가로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 애쥬번트, 비히클, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 에멀션화제, 습윤제 또는 트랜스펙션 촉진 화합물을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 하나 이상의 추가의 백신을 포함하며, 또 다른 구체예에서, 이는 다른 분자의 면역원성 부분을 포함하며, 이러한 또 다른 분자의 면역원성 부분은 H. 인플루엔자의 단백질 D (EP 594 610), 모락셀라 카타르할리스의 MID (WO 03/004651, WO97/41731 및 WO96/34960), 모락셀라 카타르할리스의 UspA1 또는 UspA2 (WO 93/03761) 및 기타 호흡관 병원체의 외박 단백질 또는 탄수화물 캡슐, 또는 DNA 올리고누클레오티드 예컨대, CpG 모티프를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드, 및 이의 상동물, 다형체, 변형물 및 스플라이스 변이체를 엔코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 핵산 서열은 적어도 또 다른 유전자에 융합된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 파아지에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 플라스미드를 포함하며, 상기 기술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드, 및 이의 상동물, 다형체, 변형물 및 스플라이스 변이체를 생성할 수 있는 인간외 숙주에 관한 것으로서, 이러한 숙주는 박테리아, 효모 및 식물로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 숙주는 E.coli이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드가 상기 기술된 바와 같은 재조합 핵산 서열을 사용하여 적어도 또 다른 단백질과 조합된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 상기 기술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드의 이량체, 삼량체 또는 다량체이다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드가 공유적으로 또는 다른 수단에 의해 단백질, 탄수화물 또는 매트릭스에 결합된 융합 단백질에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드를 분리하는 방법으로서,
a) 상기 단백질, 단편 또는 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 헤모필루스 인플루엔자 또는 E.coli를 성장시키고, 상기 박테리아를 채취하고, 외막 또는 봉입체 (inclusion body)를 분리하고;
b) 봉입체를 강한 용매화제로 용해시키고;
c) 탈변성제 (renaturating agent)를 첨가하고;
d) pH 8 내지 10의 완충제로 생성된 현탁액을 투석하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 일 구체예에서, 용매화제는 구아니듐 히드로클로라이드이며, 또 다른 구체예에서, 탈변성제는 아르기닌이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 상기 융합 단백질을 포함하는, 상기 기술된 바와 같은 의약 또는 백신에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 약제학적 유효량의 상기 기술된 바와 같은 의약 또는 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 개체의 감염을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 감염은 캡슐화되거나 무유형성인 헤모필루스 인플루엔자에 의해 초래되며, 또 다른 구체예에서, 감염은 중이염, 굴염 또는 하기도관 감염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 단백질 E 특히, 단백질 E 폴리펩티드 및 단백질 E 폴리누클레오티드, 재조합 물질, 및 이들의 생성 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 특히 세균성 질환의 예방 및 치료를 포함하는, 이러한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 세균성 감염과 관련된 질환 및 이러한 감염과 관련된 장애를 검출하기 위한 진단 검정법 예컨대, 단백질 E 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 검출하기 위한 검정법에 관한 것이다.
본 발명의 사상 및 범위내의 다양한 변화 및 변형은 하기 기술을 숙지하고, 본 기재의 다른 부분을 숙지한 당업자에게는 자명할 것이다.
도 1. 16.3kDa 헤모필루스 인플루엔자 단백질 E가 IgD (λ) 골수종 단백질에 의해 검출된다. A에서, H. 인플루엔자 772에서 pE 발현의 유세포 분석이 입증되었다. H. 인플루엔자 MinnA의 엠피젠 (Empigen®)-처리된 외막 단백질의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (B) 및 2-차원 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영도 분석 (C)이 도시되어 있다. Q-세파로오스에서의 분리 전 (B) 및 후 (C)의 외막 단백질 추출물을 나타낸다. 패널 C의 화살표는 상응하는 겔의 웨스턴 블롯 (프로브로서 IgD (λ) 사용)에 기초한 pE에 대한 예상되는 위치를 나타낸다. A에서, 박테리아는 IgD (λ) 골수종 단백질과 로딩된 후, 래빗 FITC-컨쥬게이팅된 항-IgD pAb와 인큐베이션시키고, 유세포 분석하였다. B는 코마시에 블루 염색된 SDS-겔 (염색) 및 인간 골수종 IgD (λ)로 프로빙된 웨스턴 블롯 후, 호스-래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이팅된 염소 항-인간 IgD 폴리클로날 항체와 인큐베이션한다. 샘플을 로딩 전 10분 동안 2-메르캅토에탄올의 존재하에 비등시켰다.
도 2. pE-발현 E.coli의 유세포 프로필을 H. 인플루엔자 3655 야생형 및 pE 결핍 변이체와 비교하였다. 빈 pUC18 벡터가 잠복된 E.coli (A)를 H. 인플루엔자 772로부터의 게놈 DNA (유전자 HI0175 내지 HI0178)를 함유하는 pUC18로 형질변형시킨 박테리아 (B)와 비교하였다. 무유형성 H. 인플루엔자 3655 야생형 (C) 및 상응하는 변이체 (D)에서의 pE 발현을 나타낸다. E.coli 균주 JM83 및 H. 인플루엔자를 밤새 액체 배지중에서 성장시켰다. E.coli를 얼음상에서 인간 골수종 IgD (λ)와 인큐베이션시켰다. 1h 후 세척하고, FITC-컨쥬게이팅된 래빗 항-인간 IgD pAb를 추가로 30분 동안 첨가하고, 세척 단계 후, 유세포 분석하였다. 동일한 공정을 H. 인플루엔자 3655 또는 특이적 래빗 항-pE 폴리클로날 항체 및 FITC-컨쥬게이팅된 염소 항-래빗 pAb를 사용하여 유래된 pE 변이체로 수행하였다.
도 3. 유세포 분석에 의해 나타난 바와 같은 H. 인플루엔자 및 관련 종의 pE 발현 및 IgD (λ) 골수종 혈청. 헤모필루스 종 또는 관련 박테리아의 27개 균주 및 NTHi의 22개 균주를 분석하였다. 박테리아를 정지상으로 성장시키고, 얼음상에서 인간 골수종 IgD (λ)와 인큐베이션시켰다. 1h 후 세척하고, FITC-컨쥬게이팅된 래빗 항-인간 IgD 폴리클로날 항체 (pAb)를 추가의 30분 동안 첨가하고, 세척 단계 후 유세포 분석하였다.
도 4. pE는 웨스턴 블롯에서 나타난 바와 같이 NTHi 및 캡슐화된 H. 인플루엔자에서 발현된다. 지시된 균주로부터의 박테리아 단백질을 엠피젠®을 사용하여 제조하고, SDS-겔 처리한 후, 인간 골수종 IgD (λ) 및 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이팅된 염소 항-인간 IgD 폴리클로날 pAb를 검출 항체로서 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 프로빙하였다.
도 5. H. 인플루엔자 MinnA로부터의 천연 pE와 비교한 NTHi 772로부터의 서열을 기초로하는 재조합체 pE22-160. A에서, pE-유래된 단편 A의 아미노-말단 서열을 천연 단백질 pE의 예견된 아미노-말단 서열과 비교하였다. B에서, 히스티딘 tag를 갖는 pE(A)의 합성법이 도시된다. C에는, 코마시에 염색된 PAGE상에서 크기 및 순도가 입증된다. D 및 E에서, H. 인플루엔자 MinnA로부터의 외막 단백질 (OMP) 추출물을 재조합에 의해 생성된 pE (A)와 코마시에-염색된 겔 및 웨스턴 블롯에서 각각 비교하였다. A에서, 아미노산 잔기 글루타민 21 이외에 단일 펩티드 서열을 제거하였다. 9개 아미노산은 나타낸 바와 같이 발현 벡터 pET26(+)로부터 유래되었다. 숫자는 pE의 번역 개시점으로부터 시작되는 아미노산 위치를 나타낸다. 재조합체 pE(A)는 E.coli에서 생성되고, 정제된 후, 단일 펩티타아제 절단 부위를 분석하기 위해 에드만 감성법으로 처리하였다. D 및 E에서, 두개의 겔을 동시에 진행시키고, 하나는 코마시에 브릴리언트 블루로 염색시키고, 하나는 임모빌론(Immobilon)-P 막으로 블롯팅시키고, 인간 IgD (λ) 골수종 단백질로 프로빙시키고, 적합한 호스-래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이팅된 이차 항체와 인큐베이션시켰다. OMP 분획을 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 엠피젠®을 사용하여 정제하였다.
도 6. 단백질 E는 현저하게 보존된다. 캡슐화된 무유형성 분리물을 포함하는 13 내지 31 헤모필루스 인플루엔자 균주 (표 2)에서 점변이의 빈도를 나타낸다. 결과는 플랭킹 프라이머를 사용하여 시퀀싱함으로써 수득하였다. 모든 서열을 기준 서열로서 사용된 H. 인플루엔자 Rd의 pE 서열과 비교하고 본원에 나타내었다.
도 7. pE의 수치료 프로필. 개별적 아미노산 잔기의 소수성 및 친수성 부분을 나타내었다. 예견된 단일 펩티드를 나타내었다. 데이타는 기술된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수득하였다 (21).
도 8. 재조합체 pE22-160 (단편 A) 및 B 내지 H로 설계된 일련의 절두된 단편을 나타내는 SDS-PAGE. A는 다양한 단편을 나타내며, B는 SDS-PAGE를 나타낸다. 다양한 단백질을 엔코딩하는 DNA를 발현 벡터 pET26(+)로 결찰시키고, E.coli에서 재조합적으로 발현시켰다. 유도된 과달발현된 단백질을 니켈 수지상에서 정제하고, SDS-PAGE상에서 분리한 후, 코마시에 브릴리언트 블루로 염색하였다.
도 9. pE-결여 변이체 균주 (NTHi 3655)는 래트에서 급성 중이염을 유도할 능력이 100 내지 1,000배 낮다. 감염은 목의 복부를 절개하고, 0.05ml의 박테리아를 지시된 횟수로 중이강에 주입함으로써 수컷 스프라그-다우레이 (Sprague-Dawley) 래트에서 유도시켰다. 도시된 데이타는 자극 3일째부터이며, 5마리의 각 그룹의 대표값이다.
도 10. 다른 연령군으로부터의 혈청중의 pE에 대해 유도된 IgG 및 IgA 항체의 평균 농도. 항-pE 항체를 베이트 (bate)로서 재조합체 pE(A)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 분석하였다. pE(A)의 순도는 도 5에 나타내었다.
도 11. pE는 다양한 헤모필루스 균주내에서 현저하게 보존된다. pE 유전자는 플랭킹 프라이머를 사용하여 캡슐화된 H. 인플루엔자 유형 a (n=2), b (n=2), c (n=2), d (n=1), e (n=2) 및 f (n=3), NTHi (n=8), H. 인플루엔자 바이오바르 에집티쿠스 (n=6) 및 H. 에집티쿠스 (n=5)에서 시퀀싱하였다. Rd는 인플루엔자 균주 Rd (Hi0178) 및 772 NTHi 균주 772를 분해한다. 번호 65 내지 577은 표 1에 요약된 균주에 상응한다.
본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 발명은 본 출원에서 본원에 기술된 상세한 구체예 및 단계에 의해 제한되지 않음을 이해해야 한다. 언급된 실시예는 본 발명을 설명하고자 함이며 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명은 다른 구체예가 가능하며, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 본원에 사용된 어구 및 용어는 기술하기 위해 사용된 것이며 제한하고자 사용된 것이 아니다.
본 출원은 신규한 H. 인플루엔자 외막 단백질인 단백질 E (pE)의 클로닝 및 발현에 대해 기술한다. 상기 단백질은 pE에 대한 특이적 친화성을 갖는 인간 IgD (λ) 골수종 혈청을 사용하여 발견되었다.
재조합체 pE의 수율을 최대화시키기 위해, 아미노산 잔기 리신 22 내지 리신 160으로 구성된 절두된 pE 단편을 제조하였다. 따라서, 아미노산 글루타민21을 포함하는 N-말단 시그널 펩티드를 제거하고, 벡터 pET26(+)로부터 기원한 9개 잔기 이외에 리더 펩티드로 대체하였다. 절두된 pE (즉, pE22-160)을 pE(A)로 나타내었다.
본 발명은 헤모필루스 외막 단백질 pE 및 pE-유래된 펩티드 pE22-60, pE22-95, pE22-125, pE41-68, pE56-125, pE56-160, pE86-160, pE115-160, 및 이의 이량체, 삼량체 또는 올리고머를 포함한다. 특히, pE 또는 노출된 표면인 유래된 펩티드의 서열이 더 높은 우선도로 제공된다.
이와 같이, 본 발명에 따른 백신 조성물은 면역원성 성분으로서, 모든 헤모필루스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 표면 노출된 단백질, 상기 표면 노출된 단백질의 면역원성 단편, 상기 표면 노출된 단백질을 기재로 하는 재조합 면역원성 단백질, SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열을 갖는 재조합 면역원성 단백질, 및/또는 SEQ ID NO: 3-10에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 이의 단편, 상동물, 작용성 등가물, 유도체, 변형물 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 기타 이차 처리 생성물을 포함한다. 백신 조성물은 또한, 면역원성 성분으로서 본 발명에 따른 융합 생성물, 또는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 면역원성 성분은 헤모필루스 인플루엔자에 대한 항체 또는 기타 면역 반응을 유도할 수 있으며, 여기서 유도된 항체는 피검체 세포에 대한 헤모필루스 인플루엔자 박테리아의 질병 발생을 억제한다. 본 발명에 따른 백신 조성물의 "면역원성 용량"은 투여 전의 표준 면역 반응과 비교하여 투여 후, 검출가능한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 생성시키는 용량이다.
항원을 생성하기 위한 본 발명의 백신 조성물에 사용된 핵산 서열이 다양한 공정에 의해 다양한 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 이러한 공정은 당업자에게 공지된 것으로 여겨진다.
백신 조성물은 널리 공지된 방법 및 기법을 사용하여 용이하게 달성될 수 있으며, 다양한 방식 바람직하게는, 비경구 또는 비내로 투여될 수 있다. 비경구 또는 비내 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제 및 해당 피검체의 체액과 등장성인 제형을 제조하기 위한 용매; 및 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 활성 면역원성 성분은 종종 약제학적으로 허용되는 부형제 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 혼합된다. 또한, 백신 조성물은 소량의 보조제 예컨대, 습윤제 또는 에멀션화제, pH 완충제, 결합제, 담체 또는 보존제를 함유할 수 있다.
백신 조성물은 또한, 조성물의 면역원성을 증강시키기 위한 애쥬번트 예컨대, 프라운트 애쥬번트 (Freund's Adjuvant) 및 공지된 다른 시스템을 포함할 수 있다. 백신 조성물의 면역원성 성분 즉, 본 발명의 단백질, 단편, 펩티드, 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 융합 생성물은 중성 또는 염 형태로 백신으로 제형화될 수 있다.
백신 조성물의 투여량은 백신의 특이적 활성도에 의존적일 것이며, 일정한 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 백신 조성물은 치료학적으로 효과적이며 면역원성인 양으로 투여되며, 적량은 피검체에 따라 다르다.
본 발명은 하기 상세하게 기술된 바와 같은 단백질 E 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 무유형성 H. 인프룰엔자의 단백질 E의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 단백질 E 폴리펩티드는 시그널 서열을 가지며, 박테리아의 표면에서 노출된다. 시그널 펩티드는 단백질 E 폴리펩티드의 잔기 1 내지 잔기 20번에 위치한다.
본원에 사용된 용어 "단백질 E"는 본원에 기술된 본 발명의 펩티드, 면역원성 단편, 융합물, 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다 (예컨대, 시그널 서열을 갖거나 갖지 않는 SEQ ID NO: 1). "단백질 D를 엔코딩하는 폴리누클레오티드"는 본원에 기술된 본 발명의 펩티드, 면역원성 단편, 융합물, 폴리펩티드 또는 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 나타낸다.
본원의 용어 "포함하는"은 대안적으로, 용어 "구성하는"으로 대체될 수 있다.
본 발명은 특히, 본원에 기술된 단백질 E 폴리누클레오티드 및 엔코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다.
하기 "DNA"로서 서열 목록에 언급된 서열은 본 발명의 일 구체예의 예시를 나타내는데, 당업자는 이러한 서열이 리보폴리누클레오티드를 포함하는 일반적인 폴리누클레오티드에 일반적으로 사용될 수 있음을 인지하고 있을 것이다.
단백질 E 폴리누클레오티드의 서열은 SEQ ID NO:11 (ntHi 균주 722로부터)에 기술되어 있다. 단백질 E 엔코딩된 폴리펩티드의 서열은 SEQ ID NO: 1 (ntHi 균주 722로부터), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10에 기술되어 있다.
폴리펩티드
본 발명의 일 양태에서, 본원에서 "단백질 E" 및 "단백질 E 폴리펩티드"로서 언급된 H. 인플루엔자 (특히, 무유형성 H. 인플루엔자)의 폴리펩티드 및 이의 생물학적으로, 진단학적으로, 예방학적으로, 임상학적으로 또는 치료학적으로 유용한 변이체, 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명을 추가로,
(a) SEQ ID NO: 1-10의 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는, 90% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 97-99%의 동일성을 갖거나 정확하게 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NO: 0의 선택된 서열의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:11에 대해 85% 이상, 바람직하게는, 90% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 97-99%의 동일성을 갖거나 정확하게 동일한 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드; 또는
(c) SEQ ID NO: 1-10의 서열의 아미노산 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는, 90% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 97-99%의 동일성을 갖거나 정확하게 동일한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO: 1-10에 제공된 단백질 E 폴리펩티드는 무유형성 H. 인플루엔자 균주로부터의 단백질 E 폴리펩티드이다. 또한, 단백질 E 서열은 표 1에 기재된 H. 인플루엔자 균주로부터 확인되었다.
본 발명은 또한, 단백질 E 폴리펩티드의 면역원성 단편 즉, SEQ ID NO: 1-10로부터의 선택된 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 면역원성 활성을 갖는 단백질 E 폴리펩티드의 연속 부분을 제공한다; 즉, 상기 단편 (필요에 따라, 담체에 결합됨)은 단백질 E 폴리펩티드를 인지하는 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 면역원성 단편은 전장 단백질의 IgD 결합 작용부를 보유할 수 있다 (실시예에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 더 바인딩 사이트 (The Binding Site; Brimingham, England)로부터의 IgD(λ)에 결합하는 능력). 이러한 면역원성 단편은 예를 들어, N-말단 리더 서열 및/또는 트랜스멤브레인 도메인 및/또는 C-말단 앵커 도메인이 결여된 단백질 E 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 단백질 E의 면역원성 단편은 실질적으로, 상기 서열의 전장 길이에 걸쳐 SEQ ID NO: 1-10으로부터의 선택된 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는, 90% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 97-99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드의 세포외 도메인 모두를 실질적으로 포함한다.
*단편은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부 (그러나, 전부는 아님)와 완전히 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 단백질 E 폴리펩티드에 있어서, 단편은 "독립적 (free-standing)"일 수 있거나, 이들이 일부 또는 영역을 형성하는 더 큰 폴리펩티드내에 포함되며, 가장 바람직하게는, 단일의 더 큰 폴리펩티드중의 단일의 연속 영역이다. 따라서, 단편은 전장의 천연 서열 보다 짧거나, 더 큰 폴리펩티드내에 포함되는 경우, 전장의 천연 서열 또는 더 긴 융합 단백질일 수 있다.
바람직한 단편은 예를 들어, SEQ ID NO: 1-10으로부터 선택된 아미노산 서열의 일부를 갖는 절두된 폴리펩티드 또는 이의 변이체 예컨대, 아미노- 및/또는 카르복실-말단 아미노산 서열을 포함하는 일련의 연속 잔기를 포함한다. 숙주 세포에 의해 또는 숙주 세포에서 생성되는 본 발명의 폴리펩티드의 변형된 형태가 또한 바람직하다. 추가로 바람직한 것은 구조적 또는 기능적 기여물 예컨대, 알파-헬릭스를 포함하는 단편, 및 알파-헬릭스 형성 영역, 베타-시이트 및 베타-시이트 형성 영역, 턴 앤 턴 (turn and turn) 형성 영역, 코일 앤 코일 형성 영역, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 친양쪽성 영역, 베타 친양쪽성 영역, 융통성 영역 (flexible region), 표면 형성 영역, 기질 결합 영역 및 고항원성 지수 영역을 포함하는 단편을 특징으로 한다.
추가로 바람직한 단편은 SEQ ID NO: 1-10으로부터 선택된 아미노산 서열로부터의 적어도 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 1-10으로부터 선택된 아미노산 서열로부터 제거되거나 절두된 적어도 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개의 연속 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
추가로 바람직한 단편은 B-세포 에피토프를 포함하는 단편 예를 들어, 실시예 10에 기술된 단편/펩티드이다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 생성하기 위해 이용된다; 따라서, 이들 단편은 본 발명의 전장 폴리펩티드를 생성하기 위한 중간체로서 사용될 수 있다.
특히 바람직한 것으로는, 수개의 아미노산, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산이 조합된 방식으로 치환되거나, 제거되거나 첨가된 변이체이다.
본 발명의 폴리페티드 또는 면역원성 단편은 "성숙한" 단백질의 형태일 수 있거나, 전구체 또는 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부일 수 있다. 분비 또는 리더 서열, 프로-서열 (pro-sequence), 정제를 돕는 서열 예컨대, 다중 히스티딘 잔기, 또는 재조합 동안의 안정성을 위한 추가적인 서열을 포함하는 것이 종종 유리하다. 게다가, 최종 분자의 면역원성 가능성을 증가시키기 위해 외인성 폴리펩티드 또는 리피드 테일 또는 폴리누클레오티드 서열의 첨가가 고려된다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 다양한 서브클래스 (IgG, IgM, IgA, IgE)의 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 부분를 포함하는 유전적으로 조작된 가용성 단백질에 관한 것이다. 면역글로불린으로서 바람직한 것은 인간 IgG, 특히 IgG1의 중쇄의 불변 부분이며, 여기서, 융합은 힌지 영역에서 발생한다. 특정 구체예에서, Fc 부분은 혈액응고 인자 Xa로 절단될 수 있는 절단 서열을 혼입시킴으로써 간단히 제거될 수 있다.
*게다가, 본 발명은 유전자 조작에 의해 이들 융합 단백질의 제조 방법 및 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가적 양태는 또한, 이러한 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기법의 예는 국제 특허 출원 WO94/29458 및 WO94/22914에서 찾아볼 수 있다.
단백질은 화학적으로 컨쥬게이팅될 수 있거나, 재조합 융합 단백질로서 발현되어 비융합된 단백질과 비교하여 발현 시스템에 증가된 수준으로 생성된다. 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프 (면역원성 융합 파트너), 바람직하게는, 인간에 의해 인지되는 T 헬퍼 에피토프를 생성하는 것을 보조할 수 있거나, 천연 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질 (발현 인핸서)을 발현시키는 것을 보조한다. 바람직하게는, 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증강 파트너일 것이다.
융합 파트너는 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D (EP 594610) 및 인플루엔자 바이러스, NS1 (헤마글루티닌)으로부터의 비구조적 단백질을 포함한다. 또 다른 융합 파트너는 Omp26 (WO 97/01638)로서 공지된 단백질이다. 또 다른 융합 파트너는 LytA로서 공지된 단백질이다. 바람직하게는, 분자의 C 말단 부분이 사용된다. LytA는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 유래되며, 이는 펩티도글리칸 주쇄에서 특정 결합을 특이적으로 저하시키는 오토리신, 아미다아제 LytA (lytA 유전자에 의해 코딩됨 {Gene, 43 (1986) page 265-272)}), N-아세틸-L-알라닌 아미다아제를 합성한다. LytA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 콜린 유사체 예컨대, DEAE에 대한 친화도에 기여한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 E.coli C-LytA 발현 플라스미드의 개발을 위해 활용되었다. 아미노 말단에 C-LytA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 기술되어 있다 {Biotechnology: 10, (1992) page 795-798}. 잔기 178에서 시작하는, C 종결 말단부에서 발견된 LytA 분자의 반복부 예를 들어, 잔기 188-305를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 폴리펩티드의 변이체 즉, 잔기가 유사 특징을 갖는 또 다른 잔기로 치환되는 보존적 아미노산 치환에 의해 기준물로부터 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 전형적인 이러한 잔기는 Ala, Val, Leu 및 Ile; Ser 및 Thr; 산성 잔기 Asp 및 Glu; Asn 및 Gln; 및 염기성 잔기 Lys 및 Arg; 또는 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 사이에 이루어 진다.
본 발명의 폴리펩티드는 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드, 재조합에 의해 생성된 폴리펩티드, 합성에 의해 생성된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드를 제조하기 위한 수단은 당해분야에 널리 공지되어 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 무유형성 H. 인플루엔자로부터 유래되나, 바람직하게는, 동일한 분류학적 종의 다른 유기체로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 동일한 분류학적 족 또는 종의 유기체로부터 수득될 수 있다.
폴리누클레오티드
본 발명의 목적은 단백질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 특히 단백질 E로 나타낸 본원의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 폴리누클레오티드는 전장 유전자를 포함하는 SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 단백질 E 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 엔코딩하는 영역을 포함한다.
SEQ ID NO: 11에 제공된 단백질 E 폴리누클레오티드는 무유형성 H. 인플루엔자 균주 772로부터의 단백질 E 폴리누클레오티드이다. 기타 서열은 표 1에 기술된 H. 인플루엔자 균주로부터의 단백질 E를 엔코딩하는 유전자로 결정되었다.
본 발명의 추가의 양태로서, 예를 들어, 프로세싱되지 않은 RNA, 리보자임 RNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, B- 및 Z-DNA를 포함하는, 단백질 E 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드, 특히 무유형성 H. 인플루엔자 단백질 E 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 엔코딩하고/거나 발현하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 추가의 구체예는 생물학적, 진단학적, 예방학적, 임상학적 또는 치료학적으로 유용한 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드, 및 이의 변이체, 및 이를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO: 1-10의 추론된 아미노산 서열을 갖는 단백질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 전장 유전자를 포함하는 단리된 폴리누클레오티드, 및 이와 밀접하게 관련된 폴리누클레오티드 및 이의 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 1-10으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 무유형성 H. 인플루엔자로부터의 단백질 E 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 관한 것이다.
상기 제공된 정보 예컨대, SEQ ID NO: 11의 폴리누클레오티드 서열을 이용하여, 단백질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드는 표준 클로닝 및 스크리닝 방법을 사용하여, 예컨대, 출발 물질로서 무유형성 H. 인플루엔자 균주 322A (또는 772) 세포를 사용하여 박테리아로부터의 크로모좀 DNA 단편을 클로닝하고 시퀀싱한 후, 전장 클론을 수득하는 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열 예컨대, SEQ ID NO:0에 제공된 폴리누클레오티드 서열을 수득하기 위해, E.coli 또는 일부 다른 적합한 숙주에서 무유형성 H. 인플루엔자 균주 322A (또는 772)의 크로모좀 DNA의 클론의 라이브러리가 방사선라벨링된 올리고누클레오티드 바람직하게는, 부분 서열로부터 유래된 17-머 또는 그 긴 다량체로 프로빙된다. 그 후, 프로브의 DNA와 동일한 DNA를 수반하는 클론은 엄격한 하이브리디제이션 조건을 사용하여 구별될 수 있다. 원래의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열로부터 설계된 시퀀싱 프라이머와 하이브리디제이션됨으로써 확인된 개체 클론을 시퀀싱함으로써, 양 방향으로 폴리누클레오티드 서열을 확장시켜 전장 유전자 서열을 결정하는 것이 가능하다. 편리하게는, 이러한 시퀀싱은 예를 들어, 플라스미드 클론으로부터 제조된 변성된 이중 가닥 DNA를 사용하여 수행된다. 적합한 기법은 문헌 [Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, New York (1989)]에 기술되어 있다. (특히 문헌 [Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70] 참조). 직접 게놈 DNA 시퀀싱은 또한, 전장 유전자 서열을 수득하기 위해 수행될 수 있다. 본 발명의 실례가 되는 SEQ ID NO:11의 폴리누클레오티드는 무유형성 H. 인플루엔자로부터 유래된 DNA 라이브러리에서 발견되었다.
게다가, SEQ ID NO:11의 각 DNA 서열은 당업자에게 널리 공지된 아미노산 잔기 분자량 값을 이용하여 계산될 수 있는 추정된 분자량을 갖는 SEQ ID NO: 1의 대략적인 수의 아미노산 잔기를 갖는 단백질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다.
출발 코돈과 정지 코돈 사이의 SEQ ID NO: 0의 폴리누클레오티드는 각각 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드를 엔코딩한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이들로 구성된 단리된 폴리누클레오티드를 제공한다:
(a) SEQ ID NO: 0의 폴리누클레오티드 서열 전장에 걸쳐 SEQ ID NO:11로부터의 폴리누클레오티드 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는, 90% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 97-99% 이상의 동일성을 갖거나 정확하게 동일한 폴리누클레오티드 서열; 또는
(b) SEQ ID NO: 1-10 (또는 단편)의 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO: 1-10 (또는 이의 단편)으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는, 90% 이상, 더욱 바람직하게는, 95% 이상, 가장 바람직하게는 97-99% 이상의 동일성을 갖거나 100% 정확하게 동일한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열.
무유형성 H. 인플루엔자 이외의 종으로부터의 호모로그 (homolog) 및 오소로그 (ortholog)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 엄격한 하이브리디제이션 조건 (예를 들어, 45-65℃ 및 0.1-1%의 SDS 농도를 이용)하에 SEQ ID NO: 11 또는 이의 단편으로부터 선택된 서열로 이루어지거나 이들을 포함하는 라벨링되거나 검출가능한 프로브로 적합한 라이브러리를 스크리닝하고; 상기 폴리누클레오티드 서열을 함유하는 전장 유전자 및/또는 게놈 클론을 분리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다.
본 발명은 전장에 있어서 SEQ ID NO: 11의 코딩 서열 (오픈 리딩 프레임)과 동일한 폴리누클레오티드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 또는 이의 단편 자체와 다른 코딩 서열 예컨대, 리더 또는 분비 서열, 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질 서열을 엔코딩하는 서열을 갖는 리딩 프레임내의 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 또는 단편을 제공한다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 예를 들어, 비제한적으로 하나 이상의 비-코딩 5' 및 3' 서열 예컨대, 전사되었으나 번역되지 않은 서열, 종결 시그널 (예컨대, rho-의존성 및 rho-비의존성 종결 서열), 리보좀 결합 부위, Kozak 서열, mRNA을 안정화시키는 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는, 하나 이상의 비-코딩 서열을 함유할 수 있다. 폴리누클레오티드 서열은 또한, 추가적인 아미노산을 엔코딩하는 추가적인 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합된 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 마커 서열이 엔코딩될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 마커 서열은 pQE 벡터 (Qiagen, Inc.)에 제공되고, 문헌 [Gentz et al., Proc. Natl. Acad, Sci., USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 바와 같은 헥산-히스티딘 펩티드 또는 HA 펩티드 tag (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)이며, 이 둘은 이들에 융합된 폴리펩티드 서열을 정제하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 또한, 비제한적으로, 구조 유전자 및 유전자 발현을 조절하는, 상기 구조 유전자와 자연적으로 관련된 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
SEQ ID NO: 1-10의 단백질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11 (또는 SEQ ID NO: 11내에 포함된)의 서열을 엔코딩하는 상응하는 폴리누클레오티드와 동일할 수 있다. 대안적으로, 과잉 (또는 중복) 유전자 코드로 인해, SEQ ID NO: 1-10을 엔코딩하는 서열일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드"는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 박테리아 폴리펩티드 및 더욱 특히, SEQ ID NO: 1-10의 서열 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 갖는 무유형성 H. 인플루엔자 단백질 E의 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 용어는 또한, 추가적인 영역과 함께 폴리펩티드를 엔코딩하는 단일의 연속 영역 또는 불연속 영역을 포함하는 폴리누클레오티드 (예를 들어, 통합된 파아지, 통합된 삽입 서열, 통합된 벡터 서열, 통합된 트랜스포존 서열에 의해, 또는 RNA 삭제 또는 게놈 DNA 재구성에 의해 중단된 폴리누클레오티드)를 포함하며, 이는 또한, 코딩 및/또는 비코딩 서열을 함유할 수 있다.
본 발명은 추가로, SEQ ID NO: 1-10의 서열의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 변이체를 엔코딩하는 본원에 기술된 폴리누클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편은 예를 들어, 본 발명의 전장 폴리누클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다.
바람직한 단편은 B-세포 에피토프 예를 들어, 실시예 10에 기술된 단편/펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 및 상기 폴리누클레오티드 단편을 포함하는 재조합체, 키메라 유전자이다.
또한, 특히 바람직한 구체예는, 단백질 E 변이체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이며, 상기 변이체는 수개의, 소수의 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 2개, 1개 또는 0개의 아미노산 잔기가 조합된 방식으로 치환되고, 변형되고, 제거되고/거나 첨가된 SEQ ID NO: 1-10의 아미노산 서열을 갖는다. 특히 바람직한 것은 침묵 치환, 추가 및 제거이며, 이는 단백질 E 폴리펩티드의 활성 및 특성 (예를 들어, 실시예에 기술된 특성)을 변경시키지 않는다.
본 발명의 추가적인 바람직한 구체예는 SEQ ID NO: 1-10의 서열에 기술된 아미노산 서열을 갖는 단배질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 전장에 걸쳐 85% 이상의 동일성이 있는 폴리누클레오티드, 및 이러한 폴리누클레오티드에 상보적인 폴리누클레오티드이다. 대안적으로, 매우 바람직한 것은 단백질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 전장에 걸쳐 90% 이상의 동일성을 지니는 영역을 포함하는 폴리누클레오티드 및 이들에 상보적인 폴리누클레오티드이다. 이와 관련하여, 전장에 걸쳐 95% 이상의 동일성을 지닌 폴리누클레오티드가 특히 바람직하다. 또한, 97% 이상의 동일성을 갖는 것이 95% 이상의 동일성을 갖는 것보다 더욱 바람직하며, 이들중 98% 이상 및 99% 이상의 동일성을 갖는 것이 특히 바람직하며, 99% 이상의 동일성을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
바람직한 구체예는 SEQ ID NO: 11로부터 선택된 DNA 서열에 의해 엔코딩된 성숙 폴리펩티드와 동일한 생물학적 작용 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이다 (예를 들어, 본원의 실시예에 기술된 활성을 갖는 것).
본 발명의 특정 바람직한 구체예에서, 특히 엄격한 조건하에 단백질 E 폴리누클레오티드 서열, 예컨대, SEQ ID NO: 11의 폴리누클레오티드에 하이브리디제이션되는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명은 또한, 본원에 제공된 폴리누클레오티드 서열에 하이브리디제이션되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히, 엄격한 조건하에 본원에 기술된 폴리누클레오티드에 하이브리디제이션되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄격한 조건" 및 "엄격한 하이브리디제이션 조건"은 서열간에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 있는 경우에만 발생하는 하이브리디제이션을 의미한다. 엄격한 하이브리디제이션 조건의 특정 예로는 50% 포름아미드, 5x SSC (150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 50mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 마이크로그램/ml의 변성되고, 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액에서 42℃하에 하룻밤 동안 인큐베이션시킨 후, 약 65℃에서 0.1x SSC로 하이브리디제이션 지지체를 세척하는 것이다. 하이브리디제이션 및 세척 조건은 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Ssambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularlyl Chapter 11]에 예시되어 있다. 하이브리디제이션 용액은 또한, 본 발명에 의해 제공된 폴리누클레오티드 서열과 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO: 11 또는 이의 단편의 상응하는 서열에 제시된 상기 폴리누클레오티드 서열을 갖는 프로브와 엄격한 하이브리디제이션 조건하에 SEQ ID NO: 11의 서열에 제시된 폴리누클레오티드 서열에 대한 완전 유전자를 함유하는 적합한 라이브러리를 스크리닝하고; 상기 폴리누클레오티드를 분리함으로써 달성된 폴리누클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리누클레오티드를 수득하는데 유용한 단편은 예를 들어, 본원에 기술된 프로브 및 프라이머를 포함한다.
*본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 폴리누클레오티드 검정에 있어서, 예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드는 RNA, cDNA 및 게놈 DNA에 대한 하이브리디제이션 프로브로서 사용되어 단백질 E를 엔코딩하는 게놈 클론 및 전장 cDNA를 분리시키고, 단백질 E 유전자에 대해 높은 동일성, 특히 높은 서열 동일성을 지닌 기타 유전자의 cDNA 및 게놈 클론을 분리시킬 수 있다. 이러한 프로브는 일반적으로, 15개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기 쌍을 포함할 것이다. 바람직하게는, 이러한 프로브는 30개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기 쌍을 가질 것이며, 50개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기 잔기를 가질 수 있다. 특히 바람직한 프로브는 20개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이며, 30개 미만의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이다.
단백질 E 유전자의 코딩 영역은, 올리고누클레오티드 프로브를 합성하기 위해 SEQ ID NO: 11에 제공된 DNA 서열을 사용하여 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 그 후, 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 라벨링된 올리고누클레오티드는, 라이브러리의 어떤 구성원에 프로브가 하이브리디제이션되는지를 측정하기 위해 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다.
전장 DNA 또는 연장된 숏 DNA를 수득하기 위해 당업자에게 널리 공지되어 있으며 이용가능한 여러 방법이 있으며, 예를 들어, cDNA 말단의 래피드 앰플리케이션 (Rapid Amplification)의 방법에 기초하는 방법이 있다 (예를 들어, 문헌 [Frohman, et al., PNAS USA 85:8998-9002, 1988] 참조). 예를 들어, 마라톤 테그놀로지 (MarathonTM technology: Clontech Laboratories Inc.)에 의해 예시된 최근 상기 기법의 변형은 더 긴 cDNA에 대한 조사를 현저하게 간소화시켰다. 마라톤 테크놀로지에서, cDNA는 선택된 조직으로부터 추출된 mRNA 및 각 말단에 결찰된 '어댑터 (adaptor)' 서열로부터 제조되었다. 그 후, 유전자 특이적 및 어댑터 특이적 올리고누클레오티드 프라이머의 조합을 사용하여 핵산 증폭 (PCR)을 수행하여 DNA의 "결여된 (missing)" 5' 말단을 증폭하였다. 그 후, "포개진 (nested)" 프라이머 즉, 증폭된 생성물내에 어닐링시키기 위해 고안된 프라이머 (전형적으로, 선택된 유전자 서열에서 추가로 5'을 어닐링하는 어댑터 서열 및 유전자 특이적 프라이머에서 추가로 3'을 어닐링하는 어댑터 특이적 프라이머)를 사용하여 PCR 반응을 반복하였다. 그 후, 이러한 반응 생성물은, 완전한 서열을 제공하기 위해 생성물을 존재하는 DNA에 직접 연결함으로써 또는 5' 프라이머의 설계에 대한 새로운 서열 정보를 이용하여 별도의 전장 PCR을 수행함으로써 작제된 전장 DNA 및 DNA 시퀀싱에 의해 분석될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드는 폴리누클레오티드 검정과 관련하여 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 예를 들어, 질환 특히, 인간 질환의 치료 및 진단을 위한 물질 및 조사 시약으로서 사용될 수 있다.
SEQ ID NO: 11의 서열로부터 유래된 올리고누클레오티드인 본 발명의 폴리누클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 공정에 사용될 수 있으나, 바람직하게는, PCR에 사용되어, 전체 또는 일부의 본원에서 확인된 폴리누클레오티드가 감염된 조직내의 박테리아에 전사되는지의 여부를 측정할 수 있다. 이러한 서열은 또한, 병원체가 달성하는 감염 유형 및 감염 단계의 진단에 유용할 것이다.
본 발명은 또한, 성숙 단백질과 추가적인 아미노 또는 카르복실-말단 아미노산, 또는 성숙 폴리펩티드 내의 아미노산인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다 (성숙 폴리펩티드가 예를 들어, 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 형성하는 경우). 이러한 서열은 전구체로부터 성숙한 형태로의 단백질 프로세싱에서 역할을 수행할 수 있으며, 단백질을 수송하고, 단백질 반감기를 연장시키거나 단축시킬 수 있거나, 무엇보다 검정 또는 생성을 위한 단백질의 조작을 용이하게 할 수 있다. 일반적으로, 생체내에서, 추가적인 아미노산이 세포 효소에 의한 성숙 단백질과는 별도로 프로세싱될 수 있다.
본 발명의 각각의 및 모든 폴리누클레오티드에 있어서, 이에 상보적인 폴리누클레오티드가 제공된다. 바람직하게는, 이들 상보적 폴리누클레오티드는 이들이 상보적인 각 폴리누클레오티드에 대해 완전히 상보적이다.
하나 이상의 프로서열에 융합된 성숙한 형태의 폴리펩티드를 갖는 전구체 단백질은 폴리펩티드의 불활성 형태일 수 있다. 프로서열이 제거되는 경우, 이러한 불활성화 전구체는 일반적으로 활성화된다. 프로서열의 일부 또는 전부는 활성화전에 제거될 수 있다. 일반적으로, 이러한 전구체를 프로단백질로 불린다.
누클레오티드에 대한 표준 A, G, C, T/U 대표 이외에, 용어 "N"이 본 발명의 특정 폴리누클레오티드를 설명하는데 사용될 수 있다. "N"은 네개의 DNA 또는 RNA 누클레오티드중 임의의 것이 DNA 또는 RNA 서열중 이러한 지정된 위치에 나타날 수 있으며, 단, 바람직하게는, N은 입접한 누클레오티드 위치와 조합되는 경우, 정확한 리딩 프레임에서 읽혀지는 경우 이러한 리딩 프레임에서 조기 말단화 코돈을 생성시키는 효과를 갖지 않는 핵산이 아니다.
종합적으로, 본 발명의 폴리누클레오티드는 성숙 단백질, 성숙 단백질과 리더 서열 (프리단백질로서 언급될 수 있음), 프리단백질의 리더 서열이 아닌 하나 이상의 프로서열을 갖는 성숙 단백질의 전구체, 또는 활성 및 성숙 형태의 폴리펩티드를 생성하는 프로세싱 단계 동안 일반적으로 제거되는, 하나 이상의 프로서열과 리더 서열을 갖는 프로단백질에 대한 전구체인 프리프로단백질을 엔코딩한다.
본 발명의 양태에 있어서, 치료학적 또는 예방학적 목적 특히, 유전자 면역화를 위한 폴리누클레오티드를 사용하는 것이 가능하다.
유전자 면역화에서 본 발명의 폴리누클레오티드의 사용은 바람직하게는, 적합한 전달 방법 예컨대, 플라스미드 DNA의 근육으로의 직접 주입 (Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), 특이적 단백질 담체로 복합된 DNA의 전달 (Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), DNA와 인산 칼슘의 공동 침점 (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), 다양한 형태의 리포좀으로의 DNA의 캡슐화 (Kaneda et al., Science (1989) 243:375), 입자 폭발 (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) 및 클로닝된 레트로바이러스 벡터를 사용한 생체내 감염 (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849)을 사용할 것이다.
벡터, 숙주 세포, 발현 시스템
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다. 무세포 번역 시스템이 또한 사용되어, 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 당업자에게 널리 공지된 공정에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 발현 시스템, 이러한 발현 시스템으로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생성에 있어서, 숙주 세포는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 발현 시스템 또는 이의 일부가 혼입되도록 유전자 조작될 수 있다. 숙주 세포로의 폴리누클레오티드의 도입은 많은 표준 실험 매뉴얼 예컨대, [Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) AND SAMBROOK, ET AL., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기술된 바와 같은 방법 예컨대, 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 트랜스벡션, 미세주입, 양이온성 리피드-매개된 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 컨쥬게이션, 형질도입, 스크레이프 로딩 (scrape loading), 충격 유입 (ballistic introduction) 및 감염에 의해 수행될 수 있다.
적합한 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포 예컨대, 박테리아 세포, 예컨대, 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 엔테로코커스, E.coli, 스트렙토마이시스, 시아노박테리아, 바실러스 서브틸리스, 나이세리아 메닌지티디스, 헤모필루스 인플루엔자 및 모락셀라 카타르할리스의 세포; 진균 세포 예컨대, 효모, 클루베로마이이스 (Kluveromyces), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia), 바시디오마이세트 (basidiomycete), 캔디다 알비칸스 및 아스퍼길루스의 세포; 곤충 세포 예컨대, 드로스필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9의 세포; 동물 세포 예컨대, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 및 보우스 멜라노마 세포; 및 식물 세포 예컨대, 짐노스펌 또는 안지오스펌의 세포를 포함한다.
매우 다양한 발현 시스템이 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 벡터로는 특히, 크로모좀-, 에피조말- 및 바이러스-유래된 벡터 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 박테리아파아지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 엘리먼트, 효모 크로모좀 엘리먼트, 바이러스 예컨대, 바쿨로바이러스, 파포바 바이러스 예컨대, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 포울 팍스 바이러스, 슈도라비스 바이러스, 피코르나 바이러스, 레트로바이러스, 및 알파바이러스로부터 유래된 벡터 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 에컨대, 플라스미드와 박테리오파아지 유전자 엘리먼트, 예컨대, 코스미드와 파아지미드로부터 유래된 벡터를 포함한다. 발현 시스템 작제물은 발현을 조절하고 발생시키는 대조군 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 폴리누클레오티드를 유지하거나 전파하거나 발현하고/거나 숙주에서 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 시스템 또는 벡터는 이와 관련된 발현에 사용될 수 있다. 적합한 DNA 서열은 다양한 널리 공지되고 일정한 기법 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra)]에 기술된 기법에 의해 발현 시스템으로 삽입될 수 있다.
진핵 세포에서의 재조합 발현 시스템에서, 번역된 단백질을 세포질 망상의 루멘, 세포내 간극 또는 세포외 환경으로 분비시키기 위해서, 적합한 분비 시그널이 발현된 폴리펩티드내로 통합될 수 있다. 이들 시그널은 폴리펩티드에 대해 내인성일 수 있거나, 이들은 이종성 시그널일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아피타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이온 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)가 정제에 사용된다. 단백질을 재폴딩하기 위해 널리 공지된 기법을 이용하여 폴리펩티드가 세포내 합성, 분리 및/또는 정제 동안 변셩되는 경우 활성 형태로 재생시키는데 사용될 수 있다.
발현 시스템은 또한, 재조합 생 미생물 예컨대, 바이러스 또는 박테리아일 수 있다. 대상 유전자가 생 재조합 바이러스 또는 박테리아의 게놈으로 삽입될 수 있다. 이러한 생 벡터로의 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역 반응을 유도할 것이다. 본 목적에 사용된 바이러스 및 박테리아는 예를 들어, 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아, 포울폭스, 카나리폭스), 알파바이러스 (신드비스 (Sindbis) 바이러스, 셈리키 포레스트 (Semliki Forest) 바이러스, 베네줄리안 에퀸 엔세팔리티스 (Venezueliam Equine Encephalitis) 바이러스), 아데노 바이러스, 아데노-결합 바이러스, 피코르나바이러스 (폴리오바이러스, 리노바이러스), 헤르페스바이러스 (바리셀라 조스터 바이러스 등), 리스테리아 (Listeria), 살모넬라 (Salmonella), 쉬겔라 (Shigella), BCG, 스트렙토코커스이다. 이들 바이러스 및 박테리아는 점염성이 강하거나, 생 백신을 수득하기 위해 다양한 방식으로 감약될 수 있다. 이러한 생 백신은 또한, 본 발명의 일부를 형성한다.
진단, 예후, 혈청형 및 변이 검정
본 발명은 또한, 진단 시약으로서 사용하기 위한 본 발명의 단백질 E 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 진핵생물, 특히 포유동물, 특히 인간에서 단백질 E 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 검출은 질환, 질환 상태 또는 약물에 대한 감영성 유기체의 반응을 진단을 위한 진단 방법을 제공할 것이다. 단백질 E 유전자 또는 단백질을 포함하는 유기체로 감염되거나 감염되는 것으로 의심되는 진핵생물, 특히 포유류, 특히 인간이 다양한 널리 공지된 기법 및 본원에 제공된 방법에 의해 핵산 또는 아미노산 수준으로 검출될 수 있다.
예후, 진단 또는 기타 분석을 위한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 감염된 것으로 추정되고/되거나 감염된 개체의 몸체 물질로부터 수득될 수 있다. 이러한 공급원으로부터의 폴리누클레오티드 특히, DNA 또는 RNA는 검출에 직접 사용될 수 있거나, 분석 전에 PCR 또는 기타 증폭 기법을 사용하여 효소에 의해 증폭될 수 있다. RNA, 특히 mRNA, cRNA 및 게놈 DNA가 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 증폭법을 이용하여, 개체중에 존재하는 감염성 또는 내재성 유기체의 종 및 균주의 특성이 유기체의 선택된 폴리누클레오티드의 유전자형의 분석에 의해 결정될 수 있다. 관련 유기체 바람직하게는, 동일한 종의 상이한 균주 또는 동일한 속의 상이한 종으로부터 선택된 기준 서열의 유전자형과 비교한 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 결실 및 삽입이 검출될 수 있다. 점변이는 라벨링된 단백질 E 폴리누클레오티드 서열로의 증폭된 DNA의 하이브리디제이션에 의해 확인될 수 있다. 완벽하게 도는 현저하게 매칭된 서열이 DNA 또는 RNA 각각에 있어서 DNase 또는 RNase 분해에 의해, 또는 용융 온도 또는 탈변성 동력의 차이를 검출하으로써 불완전하게 또는 덜 현저하게 미스매칭된 듀플렉스로부터 구별될 수 있다. 폴리누클레오티드 서열 차이는 또한, 기준 서열과 비교하여 겔에서 폴리누클레오티드 단편의 전기영동 이동성에서의 변형에 의해 검출될 수 있다. 이는 탈변성제의 존재 또는 부재하에 수행될 수 있다. 폴리누클레오티드 차이는 직접 DNA 또는 RNA 시퀀싱에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)] 참조. 특이적 위치에서의 서열 변화는 누클레아제 보호 검정 예컨대, RNase, V1 및 S1 보호 검정 또는 화학적 절단 방법에 의해 나타낼 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)] 참조.
또 다른 구체예에서, 단백질 E 누클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 올리고누클레오티드 프로브의 어레이가 작제되어 예를 들어, 유전자 변이체, 혈청형, 분류학적 분류물 또는 식별물의 효과적인 스크리닝을 수행할 수 있다. 어레이 기법은 널리 공지되어 있으며, 일반적인 적용성을 가지며, 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 포함하는 분자 유전자에서 다양한 의문을 설명하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Chee et al., Science, 274:610(1996)] 참조).
또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 폴리누클레오티드, 바람직하게는, SEQ ID NO: 11의 누클레오티드 서열 또는 이의 단편;
(b) (a)의 서열에 상보적인 누클레오티드 서열;
(c) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는, SEQ ID NO: 1-10의 폴리펩티드 또는 이의 단편; 또는
(d) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1-10의 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 이러한 키트에서 (a), (b), (c) 또는 (d)는 실질적인 성분을 포함할 수 있음이 자명할 것이다. 이러한 키트는 질환의 진단 또는 특히, 질환에 대한 민감성을 진단하는데 사용될 것이다.
본 발명은 또한, 진단 시약으로서 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다. 질환 또는 병원성과 관련된 본 발명의 폴리누클레오티드 바람직하게는, SEQ ID NO: 11의 서열의 변형된 형태의 검출에 의해 첨가될 수 있는 진단 도구가 제공되거나, 질환의 상태, 질환 경로의 예측, 질환 단계의 결정, 또는 질환에 대한 민감성이 규정되며, 상기 질환에 대한 민감성은 폴리누클레오티드의 낮은 발현, 과다 발현 또는 변형된 발현을 유도한다. 유기체 특히, 이러한 폴리누클레오티드에서 변이체를 수반하는 감염성 유기체는 다양한 기법 예컨대, 본원에 기술된 기법에 의해 폴리누클레오티드 수준으로 검출될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드에서 변이체 또는 다형체 (대립유전자 변이)를 수반하는 유기체로부터의 세포가 다양한 기법에 의해 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 수준으로 검출되어 예를 들어, 혈청형 분류를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR은 RNA에서 변이체를 검출하는데 사용될 수 있다. 자동화된 검출 시스템 예를 들어, 진스캔 (GeneScan)과 함께 RT-PCR을 사용하는 것이 특히 바람직하다. RNA, DNA 또는 게놈 DNA가 또한 동일한 목적, PCR에 사용될 수 있다. 예로서, 단백질 E 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 상보적인 PCR 프라이머가 변이체를 확인하고 분석하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로, 5' 및/또는 3' 말단으로부터 제거된 1, 2, 3, 또는 4개의 누클레오티드를 갖는 프라이머를 제공한다. 이들 프라이머는 특히, 개체 예컨대, 몸체 물질로부터 유래된 샘플로부터 분리된 단백질 E DNA 및/또는 RNA를 증식하는데 사용될 수 있다. 프라이머는 감염된 개체로부터 분리된 폴리누클레오티드를 증폭하는데 사용되어 폴리누클레오티드가 폴리누클레오티드 서열을 밝히는 다양한 기법으로 처리될 수 있다. 이러한 방식으로, 폴리누클레오티드 서열의 변이가 검출될 수 있으며, 감염 또는 이의 상태 또는 경로를 진단하고/거나 예후하거나, 혈청형 분류하고/거나 감염제를 분류하는데 사용될 수 있다.
본 발명을 추가로, 질환 바람직하게는, 박테리아 감염, 더욱 바람직하게는, 무유형성 H. 인플루엔자에 의해 초래된 감염을 진단하는 방법으로서, 개체로부터의 샘플 예컨대, 몸체 물질로부터 SEQ ID NO: 11의 서열을 갖는 폴리누클레오티드의 증가된 수준의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 단백질 E 폴리누클레오티드의 증가되거나 저하된 발현은 폴리누클레오티드의 정량을 위해 당해분야에 널리 공지된 방법 예컨대, 증폭, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블롯, 분광법 및 기타 하이브리디제이션 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
또한, 정상적인 대조군 조직 샘플과 비교하여 단백질 E 폴리펩티드의 과다 발현을 검출하기 위한 본 발명에 따른 진단 검정법이 예를 들어, 감염의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 숙주 예컨대, 몸체 물질로부터 유래된 샘플중의 단백질 E 폴리펩티드의 수준을 측정하는데 사용될 수 있는 검정 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 검정 방법은 방사선면역 검정, 경쟁-결합 검정, 웨스턴 블롯 분석, 항체 샌드위치 검정, 항체 검출 및 ELISA 검정을 포함한다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드 어레이 바람직하게는, 고밀도 어레이 또는 그리드의 성분으로서 사용될 수 있다. 이러한 고밀도 어레이는 특히, 진단 및 예후 목적에 유용하다. 예를 들어, 상이한 유전자를 포함하며, 추가로 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 스팟 (spot) 세트가 프로빙에 사용하여, 예컨대, 하이브리디제이션 또는 핵산 증폭을 이용하여, 몸체 샘플로부터 유래되거나 수득된 프로브를 사용하여 개체중에 특정 폴리누클레오티드 서열 또는 관련 서열의 존재를 측정할 수 있다. 이러한 존재는 병원체 특히, 무유형성 H. 인플루엔자의 존재를 나타낼 수 있으며, 질환 또는 질환 경로의 진단 및/또는 예지하는데 유용할 수 있다. SEQ ID NO: 11의 폴리누클레오티드 서열의 많은 변이체를 포함하는 그리드가 바람직하다. 또한, SEQ ID NO: 1-10의 폴리펩티드 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열의 많은 변이체가 바람직하다.
항체
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 또는 이의 변이체, 또는 이를 발현시키는 세포는 각가 이러한 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대해 면역특이적 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 서열내의 미모토프, 특히 펩티드 미모토프는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 면역특이적 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 용어 "면역특이적"은 항체가 종래의 다른 관련 폴리펩티드에 대한 친화도 현저하게 더 큰 보다 본 발명의 폴리펩티드에 대한 친화도를 가짐을 나타낸다.
본 발명의 특정 바람직한 구체예에서, 단백질 E 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 항체가 제공된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 항체가 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 또는 이의 에피토프 함유 단편, 유사체, 또는 이를 발현하는 세포를 동물, 바람직하게는, 인간화 동물에 일정한 프로토콜을 사용하여 투여함으로써 달성될 수 있다. 모노클로날 항체의 제조를 이해, 연속 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 당해분야에 공지된 기술이 이용될 수 있다. 예로는, 다양한 기법 예컨대, 문헌 [Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)]에 기술된 기법을 포함한다.
단일 사슬 항체를 생성하기 위한 기법 (U.S. 특허 4,946,778)이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 단일 사슬 항체를 생성하는데 적합하게될 수 있다. 또한, 유전자이식 마우스, 또는 기타 유기체 또는 동물 예컨대, 기타 포유동물을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 인간화된 면역특이적 항체를 발현시킬 수 있다.
대안적으로, 파아지 디스플레이 기법을 사용하여 항-단백질 E을 항-단백질 E를 지니기 위해 스크리닝된 인간으로부터 또는 순수한 (naive) 라이브러리로부터의 림프구의 PCR 증폭된 v-유전자의 레퍼토리로부터 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 갖는 항체 유전자를 선택할 수 있다 (McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). 이들 항체의 친화도는 예를 들어, 사슬 셔플링 (chain shuffling)에 의해 증가될 수 있다 (Clackson et al., (1991) Nature 352:628).
상기 기술된 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 발현하는 클론을 분리하거나 확인하는데 사용하여, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 정제하는데 사용될 수 있다.
따라서, 특히 단백질 E 폴리펩티드 또는 단백질 E 폴리누클레오티드에 대한 항체가 감염증, 특히 박테리아 감염증을 치료하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 변이체는 항원성, 에피토프성 또는 면역학적으로 등가인 변이체를 포함하며, 이는 본 발명의 특정 양태를 형성한다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 변이체는 개체에서 이를 덜 면역원성이 되게하기 위해 변형된다. 예를 들어, 개체가 인간인 경우, 항체는 가장 바람직하게는 "인간화"되며, 여기서 하이브리도마-유래된 항체의 상보성 결정 영역 또는 영역들이 예를 들어, 문헌 [Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 or Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273]에 기술된 바와 같이 인간 항체에 이식되었다.
안타고니스트 ( antagonist ) 및 아고니스트 ( agonist ) - 검정 및 분자
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 예를 들어, 세포, 무세포 제조물, 화학 라이브러리 및 천연 생성물 혼합물에서 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가하는데 사용될 수 있다. 이들 기질 및 리간드는 천연 기질 및 리간드일 수 있거나, 구조적 또는 기능적 모방체일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991)] 참조.
스크리닝 방법은 단순히 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 라벨에 의해 후보 화합물의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드로의 결합, 또는 상기 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 함유하는 세포 또는 멤브레인으로의 결합, 또는 상기 폴리펩티드의 융합 단백질로의 결합을 측정한다. 대안적으로, 스크리닝 방법은 라벨링된 경쟁 인자와의 경쟁을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 스크리닝 방법은, 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 포함하는 세포에 적합한 검출 시스템을 이용하여 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 활성화 또는 억제에 의해 시그널을 생성시킬 수 있는지의 여부를 시험할 수 있다. 활성의 억제제는 일반적으로, 공지된 아고니스트의 존재하에 일반적으로 검정되며, 후보 화합물의 존재하에 아고니스트에 의한 활성화 효과가 관찰된다. 때에 따라, 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 활성화를 억제할 수 있는지의 여부를 시험함으로써, 구정적 활성 폴리펩티드 및/또는 구성적 발현된 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 아고니스트 또는 억제제의 부재하에 역 아고니스트 또는 억제제에 대한 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 추가로, 스크리닝 방법은 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 함유하는 용액과 후보 화합물을 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물중의 단백질 E 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 활성을 측정하는 단계, 및 혼합물의 단백질 E 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 활성을 기준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 융합 단백질 예컨대, 상기 언급된 바와 같은 Fc 부분 및 단백질 E 폴리펩티드로부터 제조된 단백질이 또한, 고처리량 스크리닝 검정에 사용되어 본 발명의 폴리펩티드의 안타고니스트 및 계통발생적 및/또는 작용적으로 관련된 폴리펩티드를 확인할 수 있다 (D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); and K. Johanson et al., J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995)).
본 발명의 폴리펩티드에 결합하고/거나 상호작용하는 폴리누클레오티드, 폴리펩티드 및 항체가 또한 세포중의 mRNA 및/또는 폴리펩티드의 생성에 대한 첨가된 화합물을 효과를 검출하기 위한 스크리닝 방법을 구성하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, ELISA 검정은 당해분야에 공지된 표준 방법에 의해 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드의 분비되거나 세포 결합된 수준을 측정하기 위해 구성될 수 있다. 이는 적합하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드 (또한, 각각 안타고니스트 또는 아고니스트로 불림)의 생성을 억제하거나 증가시킬 수 있는 제제를 발견하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 단백질 E 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 증강시키거나 (아고니스트) 또는 차단하는 (안타고니스트) 화합물 특히, 박테리아 발육 저지제 및/또는 살균제인 화합물을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 스크리닝 방법은 고처리량 기법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아고니스트 또는 안타고니스트를 스크리닝하기 위해, 단백질 E 폴리펩티드 및 이러한 폴리페티드의 라벨링된 기질 또는 리간드를 포함하는 합성 반응 혼합물, 세포 구획물 예컨대, 멤브레인, 세포 엔벨로프 또는 세포 벽, 또는 이의 제조물이 단백질 E 아고니스트 또는 안타고니스트일 수 있는 후보 분자의 존재 또는 부재하에 인큐베이션된다. 단백질 E 폴리펩티드를 아고나이징하거나 안타고나이징하는 후보 분자의 능력은 이러한 기질로부터의 생성물의 감소된 생성 또는 라벨링된 리간드의 감소된 결합에 반영된다. 이유없이 결합하는 즉, 단백질 E 폴리펩티드의 효과를 유도하지 않는 분자는 우수한 안타고니스인 것으로 여겨진다. 잘 결합하고, 때에 따라, 기질로부터 생성물 생성율을 증가시키거나, 시그널 변환을 증가시키거나 화학 채널 활성을 증가시키는 분자는 아고니스트이다. 때에 따라, 기질로부터 생성물의 생성율 또는 생성 수준, 시그널 변환 또는 화학 채널 활성의 검출은 리포터 시스템을 사용하여 증강될 수 있다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 리포터 시스템은 생성물로 전환되는 비색형 라벨링된 기질, 단백질 E 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 활성의 변화에 대해 반응하는 리포터 유전자, 및 당해분야에 공지된 결합 검정물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
단백질 E 아고니스트의 검정의 또 다른 예는 경쟁정 억제 검정에 적합한 조건하에 단백질 E 결합 분자, 재조합 단백질 E 결합 분자, 천연 기질 또는 리간드, 또는 기질 또는 리간드 모방체와 단백질 E 및 잠재적인 아고니스트를 조합하는 경쟁 검정이다. 단백질 E는 결합 분자에 결합되거나 생성물로 전환된 단백질 E 분자의 수가 정확하게 결정되어 잠재적인 안타고니스트의 효과를 평가할 수 있도록, 예컨대, 방사선활성 또는 비색 화합물에 의해 라벨링된다.
특히, 잠재적 안타고니스트는 본 발명의 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드에 결합하는 유기 소분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 항체를 포함하며, 따라서 이의 활성 또는 발현을 억제하거나 제압한다. 잠재적 안타고니스트는 또한, 예컨대, 결합 분자 예를 들어, 단백질 E 유도된 활성화를 유도하지 않는 결합 분자상의 동일한 부위에 결합하여 단백질 E 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드를 결합으로부터 배제시켜 단백질 E 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드의 작용 또는 발현을 억제시키는, 밀접하게 관련된 단백질 또는 항체와 같은 폴리펩티드, 펩티드 유기 소분자일 수 있다.
잠재적인 안타고니스트는 폴리펩티드의 결합 부위에 결합하여 결합 부위를 점령하여, 정상적인 생물학적 활성이 억제되도록 세포 결합 분자로의 결합을 억제하는 소분자를 포함한다. 소분자의 예로는 비제한적으로, 유기 소분자, 펩티드 또는 펩티드형 분자를 포함한다. 기타 잠재적인 안타고니스트는 안티센스 분자를 포함한다 (문헌 [Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991): OLIGODEOXY-NUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, boca Raton, FL (1988)] 참조). 바람직한 잠재적인 안타고니스트는 단백질 E의 변이체와 관련된 화합물을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 다양한 하위부류의 면역글로불린 (IgG, IgM, IgA, IgE)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 유전자 조작된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다. 면역글로불린으로서 바람직한 것은, 인간 IgG 특히, IgG1의 중쇄의 불변 영역이며, 여기서 융합은 힌지 영역에서 발생한다. 특정 구체예에서, Fc 부분은 혈액응고 인자 Xa로 절단될 수 있는 절단 서열을 혼입시킴으로써 간단하게 제거될 수 있다. 게다가, 본 발명은 유전자 공학에 의한 이러한 융합 단백질의 제조 공정, 및 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태는 또한, 이러한 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기법의 예는 국제 특허 출원 WO94/29458 및 WO94/22914에서 찾아볼 수 있다.
본원에 제공된 폴리누클레오티드 서열 각각은 살균 화합물을 발견하고 개발하는데 사용될 수 있다. 발현시 엔코딩된 단백질은 살균 약물의 스크리닝에 있어서 표적으로서 사용될 수 있다. 또한, 엔코딩된 단백질의 아미노 말단 영역을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열 또는 각 mRNA의 샤인-델가노 또는 기타 번역 촉진 서열이 대상 코딩 서열의 발현을 제어하기 위한 안티센스 서열을 작제하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 감염 결과에 대해 책임이 있는 진핵세포, 바람직하게는 포유동물, 숙주와 병원체 또는 병원체들간의 초기 물리적 상호작용을 방해하는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드, 아고니스트 또는 안타고니스트의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명의 분자는 박테리아, 특히 그람 파지티브 및/또는 그람 네거티브 박테리아의 유치 기기상의 진핵성 바람직하게는, 포유동물의 세포외 매트릭스 단백질에 또는 환부의 세포외 매트릭스 단백질로의 점착을 억제하고; 진핵성 바람직하게는, 포유류 세포외 매트릭스 단백질과 조직 손상을 중개하는 박테리아 단백질 E 단백질간의 박테리아 점착을 차단하고/거나; 유치 기기의 이식 또는 기타 수술적 기법 이외에 의해 개시된 감염에서 질병 발생의 정상적인 진행을 차단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 단백질 E 아고니스트 및 안타고니스트, 바람직하게는, 정균성 또는 살균성 아고니스트 및 안타고니스트가 제공된다.
본 발명의 안타고니스트 및 아고니스트는 예를 들어, 질환을 예방하고, 억제하고/거나 치료하는데 이용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 미모토프에 관한 것이다. 미모토프는 천연 펩티드에 (서열적으로 또는 구조적으로) 충분히 유사한 펩티드 서열이며, 이는 천연 펩티드를 인지하는 하체에 의해 인지될 수 있거나; 적합한 담체에 결합되는 경우 천연 펩티드를 인지하는 항체를 발생시킬 수 있다.
펩티드 미모토프는 특정 목적을 위해 선택된 아미노산의 첨가, 삭제 또는 치환에 의해 고안될 수 있다. 이와 같이, 펩티드는 담백질 담체로의 컨쥬게이션을 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 말단 시스테인을 포함시키기 위한 일부 화학적 컨쥬게이션 방법에 바람직할 수 있다. 또한, 단백질 담체에 컨쥬게이팅된 펩티드에 있어서 펩티드의 컨쥬게이팅된 말단으로부터 원위의 소수성 말단부를 포함하게 하여, 펩티드의 유리된 비컨쥬게이팅된 말단부가 담체 단백질의 표면과 결합된채 유지되게하는 것이 바람직할 수 있다. 이렇게 해서, 전체 천연 분자에 있어서 발견된 바와 같은 펩티드와 가장 닯은 형태의 펩티드를 제시할 수 있다. 예를 들어, 페티드는 N-말단 시스테인 및 C-말단 소수성 아미드화된 테일을 갖도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 아미노산중 하나 이상의 D-입체이성질체 형태의 첨가 또는 치환 (인버소 (inverso) 서열)이 수행되어, 예를 들어, 펩티드의 안정도를 증가시키는 유리한 유도체를 생성시킬 수 있다. 미모토프는 또한, 천연 펩티드 서열의 레트로 서열일 수 있으며, 여기서 서열 배향은 전환된다. 미모토프는 또한, 레트로-인버소 특징을 가질 수 있다. 레트로, 인버소 및 레트로-인버소 펩티드는 WO 95/24916 및 WO 94/05311에 기술되어 있다.
대안적으로, 펩티드 미모토프는 파아지 디스플레이 기법과 같은 기법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 사용하여 확인될 수 있다 (EP 0 552 267 B1). 이러한 기법은 천연 펩티드의 구조를 모방하는 많은 펩티드 서열을 생성시키며, 따라서, 항-천연 펩티드 항체에 결합할 수 있으나, 천연 폴리펩티드에 대한 현저한 서열 상동성을 공유할 필요는 없다.
백신
본 발명의 또 다른 양태는 개체, 특히, 포유류 바람직하게는, 인간에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 항체 및/또는 T 세포 반응을 유도하기에 충분하게 개체를 단백질 E 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체를 접종하여 상기 개체를 감염 특히, 박테리아 감염, 더욱 특히 무유형성 H. 인플루엔자 감염으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 면역학적 반응에 의해 박테리아 복제가 느려지는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태는 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 면역 반응 예컨대, 사이토킨-생성 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 유도하기 위해 단밸질 E 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 생체내에서 발현시키기 위해서, 이러한 개체에 핵산 벡터, 서열 또는 리보좀을 전달하여 단백질 E 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체의 발현을 유도하여, 질환이 이미 개체내에서 확립되었는지의 여부에 상관없이 질환으로부터 상기 개체 바람직하게는, 인간을 보호하는 것을 포함한다. 유전자 투여의 한 예는 이를 입자 또는 그 외에 것상의 코팅으로써 목적하는 세포로 가속됨으로써 이루어진다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 리보자임, 변형된 핵산, DNA/RNA 하이브리드, DNA-단백질 복합제 또는 RNA-단백질 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 면역학적 조성물로서, 면역학적 반응을 유도할 수 있는 개체 바람직하게는, 인간에 유입되는 경우, 이러한 개체에서 단백질 E 폴리누클레오티드 및/또는 이로부터 엔코딩된 폴리펩티드에 대한 면역학적 반응을 유도하는 면역학적 조성물에 관한 것이며, 여기서, 조성물은 재조합 단백질 E 폴리누클레오티드 및/또는 이로부터 엔코딩된 폴리펩티드를 포함하고/거나 상기 단백질 E 폴리누클레오티드, 이로부터 엔코딩된 폴리펩티드 또는 본 발명의 기타 폴리펩티드의 항원을 엔코딩하는 발현하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 면역학적 반응은 치료학적으로 또는 예방학적으로 사용될 수 있으며, CTL 또는 CD4+ T 세포로부터 발생하는 세포 면역성과 같은 항체 면역성 및/또는 세포 면역성 형태를 취할 수 있다.
단백질 E 폴리펩티드 또는 이의 단편은 항체를 생성할 수 있거나 없는 공단백질 또는 화학 부분과 융합될 수 있으나, 제 1 단백질을 안정화시킬 수 있으며, 항원 및/또는 면역원 특성, 바람직하게는 보호 특성을 가질 융합되거나 변형된 단백질을 생성시킬 수 있다. 융합된 재조합 단백질은 바람직하게는, 추가로 항원성 공단백질 예컨대, 헤모필루스 인플루엔자로부터의 지질단백질 또는 단백질 D (EP 594610), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 베타-갈락토시다아제를 포함하며, 또는 단백질을 가용화시키고 이의 생성 및 정제를 촉진하는 비교적 큰 기타 공단백질을 포함한다. 게다가, 공단백질은 단백질을 수용하는 유기체의 면역 시스템의 일반화된 자극을 제공한다는 점에서 애쥬번트로서 작용할 수 있다. 공단백질은 제 1 단백질의 아미노- 또는 카르복시-말단으로 부착될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물에서, 단백질 E 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 또는 이의 단편, 또는 미모토프, 또는 변이체가 벡터, 예를 들어, 상기 기술된 생 재조합 벡터 예를 들어, 생 박테리아 벡터에 존재할 수 있다.
또한, 단백질 E 폴리펩티드에 있어서는 비생 벡터 예를 들어, 박테리아 외막 비히클 또는 "블렙(bleb)"이 적합하다. OM 블렙은 그람-네거티브 박테리아의 이중층 막의 외막으로부터 유래되며, C. 트라코마티스 (C. trachomatis) 및 C. 프시타시 (C. psittaci)를 포함하는 많은 그람-네거티브 박테리아 (Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163:223-228)가 언급될 수 있다. 블렙을 생성하는것으로 보고된 비배타적인 박테리아 병원체의 리스트에는 보르데텔라 퍼투스시스 (Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 부루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 브루셀라 오비스 (Brucella ovis), 에스체리치아 콜라이 (Esherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis), 나이세리아 고노르호애 (Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 에르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica)를 포함한다.
블렙은 이의 천연 형태에서 외막 단백질을 제공하는 이점을 가지며, 따라서, 특히 백신에 유용하다. 백신 사용을 위한 블렙은 또한, 박테리아를 조작하여 외막에서 하나 이상의 분자 발현을 변형시킴으로써 개선되었다. 이와 같이, 예를 들어, 외막에서 목적하는 면역원성 단백질 예컨대, 단백질 E 폴리펩티드의 발현은 유입되거나 상향조절될 수 있다 (예를 들어, 프로모터를 변경함으로써). 대신에 또는 추가로, 관련이 없거나 (예를 들어, 비보호성 항원 또는 면역우세성이나 가변성이 단백질) 또는 유해한 (예를 들어, 독성 분자 예컨대, LPS, 또는 자가면역 반응의 잠재적 유도체) 외막 분자의 발현이 하향조절될 수 있다. 이들한 접근법은 하기에서 더욱 상세히 논의되었다.
단백질 E 유전자의 비코딩 플랭킹 영역은 유전자 발현에서 중요한 조절 엘리먼트를 함유한다. 이러한 조절은 전사 및 번역 수준에서 발생한다. 이들 여역의 서열, 즉 유전자의 오픈 리딩 프레임의 업스트림 또는 다운스트림은 DNA 시퀀싱에 의해 수득될 수 있다. 이러한 서열 정보에 의해 잠재적인 조절 모티프 예컨대, 상이한 프로모터 엘리먼트, 종결 서열, 유도성 서열 엘리먼트, 억제인자, 상 변이를 유도하는 엘리먼트, 샤인-달가노 서열, 조절과 관련된 잠재적 이차 구로를 갖는 영역 및 다른 유형의 조절 모티프 또는 서열을 결정할 수 있다. 이러한 서열은 본 발명의 추가적 양태이다.
본 서열 정보는 단백질 E 유전자의 천연 발현을 조절가능하게 한다. 유전자 발현의 상향조절은 프로모터, 샤인-달가노 서열, 잠재적인 억제인자 또는 작동인자 엘리먼트, 또는 관련된 기타 엘리먼트에 의해 달성될 수 있다. 마찬가지로, 발현의 하향조절은 유사한 유형의 변형에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 상변이 서열을 변화시킴으로써, 유전자의 발현은 상 변이 조정하에 놓일 수 있거나, 이는 이러한 조절에 결부되지 않을 수 있다. 또 다른 접근법에서, 유전자의 발현은 발현 조절을 허용하는 하나 이상의 유도 엘리먼트의 조정하에 놓일 수 있다. 이러한 조절의 예로는 비제한적으로, 온도 변화, 유도인자 기질 예컨대, 선택된 탄수화물 또는 이들의 유도체, 미량 원소, 비타민, 보조인자, 금속 이온 등의 첨가를 포함한다.
상기 기술된 바와 같은 이러한 변형은 여러 상이한 수단에 의해 유도될 수 있다. 유전자 발현에 관련된 서열의 변형이 무작위 돌연변이원에 의해 생체내에서 수행되고, 목적하는 표현형을 선택할 수 있다. 또 다른 접근법은 대상 영역을 분리하고, 이를 무작위 돌연변이원 또는 부위 특이적 치환, 돌연변이원의 삽입 또는 제거에 의해 변형시키는 것으로 구성된다. 그 후, 변형된 영역은 상동성 재조합에 의해 박테리아 게놈으로 재유입되고, 유전자 발현에 대한 효과가 평가될 수 있다. 또 다른 접근법에서, 대상 영역의 공지된 서열이 천연 조절 서열의 전부 또는 일부를 대체하거나 삭제하여 사용될 수 있다. 이러한 경우, 표적화된 조절 영역은 분리되거나 변형되어 다른 유전자로부터의 조절 엘리먼트, 상이한 유전자로부터의 조절 엘리먼트의 조합, 합성 조절 영역 또는 다른 조절 영역을 함유하거나, 야생형 조절 서열의 선택된 부분이 제거된다. 그 후, 이러한 변형된 서열은 상동성 재조합을 통해 박테리아의 게놈으로 재유입될 수 있다. 유전자 발현의 상향 조절에 사용될 수 있는 바람직한 프로모터의 비배타적인 리스트에는 N. 메닌지티디스 또는 N. 고노르로해로부터의 프로모터 porA, porB, lbpB, tbpB, p110, 1st, hpuAB; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2: M. 카타르할리스로부터의 TbpB; H. 인플루엔자로부터의 p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2를 포함한다.
일 예에서, 유전자의 발현은 이의 프로모터를 더 강한 프로모터로 교환함으로써 조절될 수 있다 (유전자의 업스트림 서열을 분리하고, 이러한 서열을 실험관내 변형시키고, 상동성 재조합에 의해 게놈으로 재유입시킴으로써). 상향조절된 발현은 박테리아 또는 박테리아로부터 분리된 (또는 이로부터 제조된) 외막 소포에서 수득될 수 있다.
또 다른 예에서, 백신 적용을 위한 개선된 특징을 갖는 재조합체 박테리아 균주를 생성하기 이해 기술된 접근법이 사용될 수 있다. 이들로는 비제한적으로, 감약된 균주, 선택된 항원의 발현이 증가된 균주, 면역 반응을 간섭하는 유전자가 넛아웃 (knock-out)된 (또는 발현이 저하된) 균주, 면역우세 단백질의 발현이 완화된 균주, 외막 소포 분리가 완화된 균주가 있을 수 있다.
또한, 단백질 E 유전자의 변형된 업스트림 영역이 본 발명에 의해 제공되며, 변형된 업스트림 영역은 외막에 위치한 단백질 E 단백질의 발현 수준을 변경시키는 이종성 조절 엘리먼트를 함유한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 업스트림 영역은 단백질 E 유전자의 업스트림 서열을 포함한다. 업스트림 영역은 단백질 E 유전자의 업스트림에서 바로 시작되어 일반적으로 ATG 출발 코돈으로부터 약 1000bp 이하의 유전자 업스트림 위치로 연장된다. 폴리시스트론 서열에 위치한 유전자의 경우 (오페론), 업스트림 영역은 대상 유전자 바로 전부터 시작되거나, 오페론의 첫번째 유전자 바로 전부터 시작될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 양태에 따른 변형된 업스트림 영역은 ATG의 500 내지 700bp 업스트림 위치에서 이종성 프로모터를 함유한다.
단백질 E 유전자의 발현을 상향조절하기 위한 밝혀진 업스트림 영역, 상동성 재조합을 통해 이를 달성하기 위한 공정 (예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 WO 01/09350), 본 목적에 적합한 업스트림 서열을 포함하는 벡터, 및 이렇게 변형된 숙주 세포 또한, 본 발명의 추가적 양태이다.
이와 같이, 본 발명은 변형된 박테리아 블렙에서 단백질 E 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로, 비생 막-기재 블렙 벡터를 생성할 수 있는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 추가로, 이종성 조절 엘리먼트를 함유하는 변형된 업스트림 영역을 갖는 단백질 E 유전자를 포함하는 핵산 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 숙주 세포 및 박테리아 블렙을 제조하기 위한 공정이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해 문헌 [Sato, Y. et al. Science 273:352 (1996)]에 기술된 바와 같은 면역자극 DNA 서열 및 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물 특히, 백신 조성물, 및 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해 무유형성 H. 인프룰엔자로 감염된 동물 모델에서 유전자 면역화 실험에 사용되는 폴리누클레오티드 작제물에서 박테리아 세포 표면 단백질의 비가변성 영역을 엔코딩하는 것으로 입증된 기술된 폴리누클레오티드 또는 이의 특정 단편을 사용하는 방법이 제공된다. 이러한 실험은 특히, 예방학적 또는 치료학적 면역 반응을 유발시킬 수 있는 단백질 에피토프를 확인하는데 유용할 것이다. 이러한 접근법은, 감염에 성공적으로 내성을 띠거나 감염을 제거하는 동물의 필수 기관으로부터 유래된 특정 값의 모노클로날 항체의 후속 제조를 가능하게 할 것이며, 포유동물 특히, 인간에서 박테리아 감염 특히, 무유형성 H. 인플루엔자 감염의 예방학적 제제 또는 치료학적 치료제의 개발을 가능하게 할 것이다.
본 발명은 또한, 적합한 담체 예컨대, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명의 면역원성 재조합 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드를 포함하는 백신 제형을 포함한다. 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 위에서 분해되기 때문에, 이들 각각은 바람직하게는, 비경구 투여되며, 예를 들어, 피하내, 근내, 정맥내 또는 피부내 투여된다. 비경구 투여에 적합한 제형은 항-산화제, 완충제, 살균성 화합물, 및 제형을 개체의 체액 바람직하게는, 혈액과 등장성이 되게하는 용질; 및 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주입 용액을 포함한다. 제형은 단위 용량 또는 다중 용량 컨테이너, 예를 들어, 앰플 및 바이알에 존재할 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체가 첨가하면 되는 동결건조 조건하에 저장될 수 있다.
본 발명의 백신 제형은 또한, 제형의 면역원성을 증강시키기 위한 애쥬번트 시스템을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 애쥬번트 시스템은 우선적으로, TH1 타입 반응을 유발시킨다.
면역 반응은 크게 두개의 카테고리 즉, 체액성 또는 세포 매개된 면역 반응으로 구분될 수 있다 (전형적으로, 각각 보호의 항체 및 세포 이펙터 메카니즘을 특징으로 함). 이러한 반응의 부류는 TH1-타입 반응 (세포-매개 반응), 및 TH2-타입 면역 반응 (체액 반응)으로 칭한다.
최대 TH1-타입 면역 반응은 항원 특이적, 하플로타입(haplotype) 제한된 세포독성 T 림프구의 발생, 및 자연 살해 세포 반응으로 특징될 수 있다. 마우스에서 TH1-타입 반응은 종종 IgG2a 서브타입의 항체의 발생에 의해 특징되지만, 사람에서 이들은 IgG1 타입 항체에 대응한다. TH2-타입 면역 반응은 마우스에서 IgG1, IgA 및 IgM을 포함하는 광범위한 면역글로불린 동종의 발생에 의해 특징된다.
이러한 두가지 타입의 면역 반응의 발달 후의 추진력은 시토카인인 것으로 여겨질 수 있다. 높은 수준의 TH1-타입 시토카인은 제공된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유발을 촉진하는 경향이 있지만, 높은 수준의 TH2-타입 시토카인은 항원에 대한 체액 면역 반응의 유발을 촉진하는 경향이 있다.
TH1 및 TH2-타입 면역 반응의 구별은 절대적인 것이 아니다. 실제로, 각각은 주로 TH1 또는 주로 TH2인 것으로 기재되는 면역 반응을 제공할 것이다. 그러나, 종종 편리하게 모스만 및 코프만에 의해 무린 CD4+ve T 세포 클론에서 기술된 것과 관련하여 시토카인의 패밀리를 고려한다[Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173]. 통상적으로, TH1-타입 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2의 생산과 관련이 있다. 종종 TH1-타입 면역 반응의 유발과 직접적으로 관련된 다른 시토카인은 T-세포, 예를 들어 IL-12에 의해 생산되지 않는다. 반대로, TH2-타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13의 분비와 관련이 있다.
특정 백신 애쥬번트가 TH1 또는 TH2-타입 시토카인 반응의 자극에 특히 적합한 것으로 알려져 있다. 통상적으로, 백신화 또는 감염 후에 면역 반응의 TH1:TH2 균형의 최고 지표는 항원으로 재자극 후에 시험관내에서 T 림프구에 의한 TH1 또는 TH2 시토카인의 생산의 직접 측정 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a의 측정을 포함한다.
따라서, TH1-타입 애쥬번트는 시험관내에서 항원으로 재자극될 때 높은 수준의 TH1-타입 시토카인을 생산하기 위해 단리된 T-세포 개체를 선택적으로 자극하고 TH1-타입 동종과 관련된 CD8+ 세포독성 T 림프구와 항원 특이적 면역글로불린 반응 모두의 발달을 촉진한다.
TH1 세포 반응을 선택적으로 자극할 수 있는 애쥬번트는 국제특허출원번호 WO 94/00153 및 WO 95/17209에 기술되어 있다.
3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)는 이러한 하나의 애쥬번트이다. 이는 GB 2220211 (Ribi)로부터 공지되어 있다. 화학적으로, 이는 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이며, Ribi Immunochem(Montana)에 의해 제조된다. 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽특허 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA)에 기술되어 있다.
바람직하게는, 3D-MPL의 입자는 0.22 마이크론 막을 통해 멸균 여과될 정도로 충분히 작다(유럽특허번호 0 689 454).
3D-MPL은 용량 당 10 ㎍ 내지 100 ㎍, 바람직하게는 25 ㎍ 내지 50 ㎍의 범위로 존재할 것이며, 여기서 항원은 통상적으로 용량 당 2 내지 50 ㎍의 범위로 존재할 것이다.
다른 바람직한 애쥬번트는 QS21, 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질로부터 유래된 Hplc 정제된 비독성 분획물을 포함한다. 임의적으로, 이는 임의적으로 담체와 함께, 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MOL)와 혼합될 수 있다.
QS21의 생산 방법은 미국특허번호 5,057,540에 기술되어 있다.
QS21을 함유한 비반응성(non-reactogenic) 애쥬번트 제형은 종래에 기술되었다(WO 96/33739). QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 이러한 제형은 항원과 함께 제형화될 때 우수한 TH1 자극 애쥬번트인 것으로 나타났다.
TH1 세포 반응의 선택적 자극제인 또다른 애쥬번트는 면역조절 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 WO 96/02555에 기술된 비메틸화된 CpG 서열을 포함한다.
상기에서 언급된 바와 같은 상이한 TH1 자극 애쥬번트의 조합은 또한 TH1 세포 반응의 선택적 자극제인 애쥬번트를 제공하는 것으로서 예상된다. 예를 들어, QS21은 3D-MPL과 함께 제형화될 수 있다. QS21:3D-MPL의 비율은 통상적으로 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 및 종종 실질적으로 1:1일 것이다. 최적의 상승효과를 위한 바람직한 범위는 2.5:1 내지 1:1의 3D-MPL:QS21이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 조성물에 또한 담체가 존재한다. 담체는 수중유 에멀션, 또는 알루미늄 염, 예를 들어 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록사이드일 수 있다.
바람직한 수중유 에멀션은 대사가능한 오일, 예를 들어 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및 트윈 80을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 백신 조성물 중 항원은 이러한 에멀션에서 QS21 및 3D-MPL과 조합된다. 부가적으로 수중유 에멀션은 스판 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
통상적으로 사람 투여를 위하여 QS21 및 3D-MPL은 용량 당 1 ㎍ 내지 200 ㎍, 예를 들어, 10 ㎍ 내지 100 ㎍, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 50 ㎍의 범위로 백신 중에 존재할 것이다. 통상적으로, 수중유는 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3% 트윈 80을 포함할 것이다. 바람직하게는, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비율은 1과 동일하거나 1 미만으로, 이는 더욱 안정한 에멀션을 제공한다. 스판 85는 또한 1%의 수준으로 존재할 수 있다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 함유하는 것이 유리할 수 있다.
비독성 수중유 에멀션은 바람직하게는 수성 담체에 비독성 오일, 예를 들어 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 에멀션제, 예를 들어 트윈 80을 함유한다. 수성 담체는 예를 들어 포스페이트 완충 염수일 수 있다.
수중유 에멀션에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능 있는 애쥬번트 제형은 WO 95/17210에 기술되어 있다.
본 발명이 특정 단백질 E 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드와 관련하여 기술되어 있지만, 이는 천연 발생 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드의 단편, 및 재조합 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 면역원 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가, 결손 또는 치환된 유사한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 포함하는 것으로 이해된다. 바람직한 단편/펩티드는 실시예 10에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 다른 항원, 특히 중이염을 치료하기 위해 유용한 항원과 조합하여 본 발명의 백신 제형을 포함하는 다가 백신 조성물을 제공한다. 이러한 다가 백신 조성물은 상기에 기술된 바와 같이 TH-1 유발 애쥬번트를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 단편 및 면역원은 하나 이상의 하기 항원의 군과 함께 포뮬레이션된다: a) 하나 이상의 폐렴구균 협막 다당류 (플레인(plain) 또는 담체 단백질에 컨쥬게이트됨); b) M. 카타르할리스(M. catarrhalis) 감염증에 대해 숙주를 보호할 수 있는, 하나 이상의 항원; c) 스트렙토코쿠스 폐렴 감염증에 대해 숙주를 보호할 수 있는, 하나 이상의 단백질 항원; d) 하나 이상의 추가의 무유형성 헤모필루스 인플루엔자 단백질 항원; e) RSV에 대해 숙주를 보호할 수 있는, 하나 이상의 항원; 및 f) 인플루엔자 바이러스에 대해 숙주를 보호할 수 있는, 하나 이상의 항원. 군 a) 및 b); b) 및 c); b), d), 및 a) 및/또는 c); b), d), e), f), 및 a) 및/또는 c)의 조합이 바람직하다. 이러한 백신은 유리하게는 세계적인 중이염 백신으로서 사용될 수 있다.
폐렴구균 협막 다당류 항원은 바람직하게는 혈청타입 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F (가장 바람직하게는 혈청타입 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)로부터 선택된다.
바람직한 폐렴구균 단백질 항원은 폐렴구균의 외측 표면에 노출된 폐렴구균 단백질(폐렴구균의 생존 주기의 적어도 일부 동안 숙주의 면역 시스템에 의해 인식될 수 있음)이거나, 폐렴구균에 의해 분비되거나 방출되는 단백질이다. 가장 바람직하게는, 단백질은 톡신, 아드헤신, 2-성분 신호 변환체, 또는 스트렙토코쿠스 폐렴의 지질단백질, 또는 이들의 단편이다. 특히 바람직한 단백질은 폐몰리신(pneumolysin)(바람직하게는 화학적 치료 또는 돌연변이에 의해 탈독성화됨)[Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1.990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coil: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA 및 이의 막횡단 결손 변이체 (WO 92/14488; WO 99/53940; US 5804193 -Briles et al.); PspC 및 이의 막횡단 결손 변이체 (WO 99/53940; WO 97/09994 - Briles et al); PsaA 및 이의 막횡단 결손 변이체 (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12) :5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); 폐렴구균 콜린 결합 단백질 및 이의 막횡단 결손 변이체; CbpA 및 이의 막횡단 결손 변이체 (WO 97/41151; WO 99/51266); 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); M 유사 단백질, SB 특허출원번호 EP 0837130; 및 아드헤신 18627 (SB Patent application No. EP 0834568)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또다른 바람직한 폐렴구균 단백질 항원은 WO 98/18931에 기술된 것, 특히 WO 98/18930 및 PCT/US99/30390에서 선택된 것이다.
조합 백신 (특히 중이염의 예방을 위한)에 포함될 수 있는 바람직한 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 단백질 항원은 OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA 및/또는 LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA 및/또는 TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 및/또는 UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo1O (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); 및 OmpE이다.
조합 백신 (특히 중이염의 예방을 위한)에 포함될 수 있는 바람직한 또다른 무유형성 해모필루스 인플루엔자 단백질 항원은 핌브린(Fimbrin) 단백질 [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] 및 이로부터의 펩티드를 포함하는 융합물 [예를 들어, LB1(f) peptide fusions; US 5843464 (OSU) 또는 WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; 단백질 D (EP 594610); TbpA 및/또는 TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641) ; P2; P5 (WO 94/26304); NlpC2 (BASB205) [WO 02/30971]; Slp (BASB203) [WO 02/30960]; 및 i0MP1681 (BASB210) [WO 02/34772]을 포함한다.
바람직한 인플루엔자 바이러스 항원은 달걀 또는 MDCK 세포에서 성장된, 전체의 살아 있거나 비활성화된 바이러스, 스플릿 인플루엔자 바이러스, 또는 베로 세포 또는 전체 flu 비로솜(문헌[R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920]에 기술됨) 또는 이의 정제된 또는 재조합 단백질, 예를 들어 HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 이의 조합을 포함한다.
바람직한 RSV (호흡기 합포체 바이러스) 항원은 F 글리코단백질, G 글리코단백질, HN 단백질, 또는 이들의 유도체를 포함한다.
조성물, 키트 및 투여
본 발명의 또다른 양태에서, 세포 또는 다세포 유기물에 투여하기 위한 단백질 E 폴리누클레오티드 및/또는 단백질 E 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명은 또한 본원에서 논의된 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 또는 이들의 작용제 또는 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드는 세포, 조직 또는 유기물에 사용하기 위한 비멸균 또는 멸균 담체 또는 담체들, 예를 들어 개체에 투여하기에 적합한 약제학적 담체와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어 매질 첨가제 또는 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체로는 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 제형은 투여 모드에 적합하여야 한다. 본 발명은 또한 하나 이상의, 상술된 본 발명의 조성물의 구성성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 진단 및 약제학적 팩 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드 및 다른 화합물들은 단독으로 또는 다른 화합물, 예를 들어 치료학적 화합물과 함께 사용될 수 있다.
약제 조성물은 예를 들어 국소, 경구, 항문, 질, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피부내 경로 등을 포함하는 임의의 효과적이고 편리한 방식으로 투여될 수 있다.
치료에서 또는 예방으로서, 활성제는 개체에 주사가능한 조성물, 예를 들어 멸균 수성 분산액, 바람직하게는 등장액으로서 투여될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 치료학적 유효량의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드의 가용성 형태, 작용제 또는 길항제 펩티드 또는 소분자 화합물을 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 이러한 담체로는 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 하나 이상의, 본 발명의 상술된 조성물의 구성성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩(pack) 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물들, 예를 들어 치료학적 화합물들과 함께 사용될 수 있다.
조성물은 예를 들어 전신 또는 경구 경로에 의한 투여 경로에 적합하게 될 것이다. 전신 투여의 바람직한 형태는 통상적으로 정맥내 주사에 의한 주사를 포함한다. 다른 주사 경로, 예를 들어, 피하, 근육내, 또는 복막내 주사 경로가 사용될 수 있다. 전신 투여를 위한 대체 수단은 담즙산염 또는 푸시드산과 같은 침투제 또는 다른 세정제를 이용한 경점막 및 경피 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 화합물들이 장내 또는 캡슐화된 제형으로 제형화될 수 있는 경우, 경구 투여가 또한 가능할 수 있다. 이러한 화합물들의 투여는 또한 연고, 페이스트, 겔, 용액, 분말 등의 형태로 국소 및/또는 국부화될 수 있다.
포유동물, 및 특히 사람에게 투여하기 위하여, 활성제의 일일 투여량 수준은 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 통상적으로 대략 1 mg/kg일 것으로 예상된다. 모든 병에 대해 의사는 개체에 대해 가장 적합하고, 특정 개체의 나이, 체중 및 반응으로 변경되는 실제 투여량을 결정할 것이다. 상기 투여량은 대표적인 평균의 경우이다. 물론 보다 높거나 보다 낮은 투여량 범위가 가치가 있는 개개의 예가 존재할 수 있으며, 이는 본 발명의 범위내에 존재한다.
요구되는 투여량 범위는 펩티드의 선택, 투여 경로, 제형의 특성, 피검체의 상태의 특성, 및 의료인의 판단에 따른다. 그러나, 적합한 투여량은 피검체 1 kg 당 0.1 내지 100 ㎍의 범위이다.
백신 조성물은 통상적으로 주사가능한 형태이다. 통상적인 애쥬번트는 면역 반응을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 백신화를 위한 적합한 단위 용량은 항원 1 kg 당 0.5 내지 5 마이크로그램이며, 이러한 용량은 바람직하게는 1 내지 3 주의 간격으로 1 내지 3회 투여된다. 지시된 용량 범위내에서, 어떠한 독성학적 역효과도 적합한 개체에 이의 투여를 배제하는 본 발명의 화합물에서 관찰되지 않을 것이다.
그러나, 필요한 투여량에서의 넓은 변형은 입수가능한 다양한 화합물 및 다양한 투여 경로의 상이한 효능의 측면에서 예상된다. 예를 들어, 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여 보다 높은 투여량을 요구하는 것으로 예상될 것이다. 이러한 투여량 수준의 변형은 최적화를 위한 표준 경험적 절차를 사용하여 조절될 수 있으며, 이는 당업자에게 널리 이해되는 것이다.
서열 데이타베이스 , 유형 매체에서의 서열, 및 알고리즘
폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 2- 및 3-차원 구조를 결정하고 유사한 상동성의 추가 서열을 동정하기 위하여 유용한 정보 공급원을 형성한다. 이러한 방법들은 컴퓨터 기록가능한 매체에 서열을 저장한 후, 공지된 거대분자 구조 프로그램에서 저장된 데이타를 사용하므로써, 또는 널리 공지된 조사 도구, 예를 들어 GCG 프로그램 패키지를 사용하여 서열 데이타베이스를 조사하므로써 가장 용이하게 진행된다.
또한 본 발명에 의해 특징 서열 또는 스트링(string), 특히 유전학적 서열 또는 엔코딩된 단백질 서열을 분석하는 방법이 제공된다. 서열 분석의 바람직한 방법은 예를 들어, 서열 상동성 분석 방법, 예를 들어 동일성 및 유사성 분석, DNA, RNA 및 단백질 구조 분석, 서열 어셈블리, 분계적 분석, 서열 모티프 분석, 오픈 리딩 프레임 결정, 핵산 염기 판독(calling), 코돈 용법 분석, 핵산 염기 트리밍(trimming), 및 서열화 크로마토그램 피크 분석을 포함한다.
컴퓨터 계열 방법은 상동성 식별을 수행하기 위하여 제공된다. 이러한 방법은 컴퓨터 기록가능한 매체에 본 발명의 폴리누클레오티드의 서열을 포함하는 제 1 폴리누클레오티드 서열을 제공하는 단계; 및 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열을 하나 이상의 제 2 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 식별하는 단계를 포함한다.
컴퓨터 계열 방법은 또한 상동성 식별을 수행하기 위하여 제공되는 것으로서, 상기 방법은 컴퓨터 기록가능한 매체에 본 발명의 폴리펩티드의 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 서열을 제공하는 단계; 및 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열을 하나 이상의 제 2 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 식별하는 단계를 포함한다.
각 개별적인 출판물 또는 참고문헌이 전체적으로 본원에 참고문헌으로 통합되는 것으로 상세하게 및 개별적으로 지시되는 한 본 명세서에 인용된 특허 및 특허출원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 출판물 및 참고문헌들은 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본 출원에 우선권을 주장하는 임의의 모든 출원은 또한 출판물 및 참고문헌에 대해 상기에서 기술된 방식으로 이의 전문이 참고문헌으로 본원에 통합된다.
정의
당업계에 공지된 바와 같은 "동일성"은 두개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두개 이상의 폴리누클레오티드 서열 간의 관계로서, 이러한 경우는 서열을 비교하므로써 결정될 수 있다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열 간의 서열 근접(relatedness)의 정도를 의미하는 것으로, 이러한 경우는 이러한 서열들의 스트링 간의 매칭에 의해 결정될 수 있다. "동일성"은 문헌[(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기술된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 시험된 서열들 간의 가장 큰 매칭을 제공하기 위하여 디자인된다. 더욱이, 동일성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 두개의 서열 사이의 상동성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지에서의 GAP 프로그램 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), 및 FASTA( Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 프로그램의 BLAST 패밀리는 NCBI 및 다른 소스(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., at al., J. Mel. Biol. 215: 403-410 (1990))로부터 공개적으로 입수가능하다. 널리 공지된 스미스 워터맨 알고리즘은 또한 상동성을 결정하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터는 하기를 포함한다:
알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
비교 매트릭스: 문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)]으로부터의 BLOSSUM62
갭 패널티: 8
갭 길이 패널티: 2
이러한 파라미터를 지닌 유용한 프로그램은 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison WI)으로부터의 "갭" 프로그램으로서 공개적으로 입수가능하다. 상술된 파라미터들은 펩티드 비교(말단 갭에 대한 패널티를 지니지 않음)를 위한 디폴트(default) 파라미터이다.
폴리누클레오티드 비교를 위한 파라미터는 하기를 포함한다:
알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mel Biol. 48: 443-453 (1970)
비교 매트릭스: 매칭 = +10, 비매칭 = 0
갭 패널티: 50
갭 길이 패널티: 3
제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison WI)으로부터의 "갭" 프로그램으로서 입수가능함. 이들은 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터이다.
폴리누클레오티드 및 폴리펩티드를 위한 "상동성"에 대한 바람직한 의미는 하기 (1) 및 (2)에 제공된다.
(1) 폴리누클레오티드 구체예는 추가로 서열번호 11의 기준 서열에 대해 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 상동성을 갖는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리누클레오티드 서열은 서열번호 11의 기준 서열과 동일할 수 있거나, 기준 서열과 비교하여 누클레오티드 변경의 특정 정수 이하를 포함할 수 있으며, 상기 변경은 하나 이상의 누클레오티드 결손, 전이 및 전환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변경은 기준 누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 기준 서열 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기들 중의 누클레오티드 중에서 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 임의의 위치에 발생할 수 있으며, 상기 누클레오티드 변경의 수는 서열번호 11에서의 누클레오티드의 총수를 100으로 나누어진 백분율 상동성을 규정하는 정수로 곱한 후, 서열번호 11에에서의 누클레오티드의 총수에서 결과값을 차감하므로써 결정되거나 하기 수학식에 의해 결정된다:
Figure pat00001
상기 식에서, nn은 누클레오티드 변경의 수이며, xn은 서열번호 11에서의 누클레오티드의 총수이며, y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97, 또는 100%에 대해 1.00이며, ● 는 곱하기에 대한 기호이며, 여기서 xn 및 y의 임의의 비정수 결과값은 xn에서 이를 차감하기 전에 가장 가까운 정수로 우수리를 제거한다. 서열번호 1 내지 10의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열의 변형은 이러한 코딩 서열에서 무의미한, 미스센스(missense) 또는 프래임이동 돌연변이를 생성시킬 수 있으며, 이에 따라 이러한 변경 후 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 변경시킨다.
예로서, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 서열번호 11의 기준 서열과 동일할 수 있으며, 즉 이는 100% 동일할 수 있거나 상동성 백분율이 100% 상동성 미만이 되도록 기준 서열과 비교하여 핵산 변경의 특정 정수까지 포함할 수 있다. 상기 변경은 하나 이상의 누클레오티드 결손, 전이 및 전환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변경은 기준 누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 기준 서열 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기들 중의 누클레오티드 중에서 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 임의의 위치에 발생할 수 있으며, 상기 누클레오티드 변경의 수는 서열번호 11에서의 누클레오티드의 총수를 100으로 나누어진 백분율 상동성을 규정하는 정수로 곱한 후, 서열번호 11에에서의 누클레오티드의 총수에서 결과값을 차감하므로써 결정되거나 하기 수학식에 의해 결정된다:
Figure pat00002
상기 식에서, nn은 누클레오티드 변경의 수이며, xn은 서열번호 11에서의 누클레오티드의 총수이며, y는 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85이며, ● 는 곱하기에 대한 기호이며, 여기서 xn 및 y의 임의의 비정수 결과값은 xn에서 이를 차감하기 전에 가장 가까운 정수로 우수리를 제거한다.
(2) 폴리펩티드 구체예는 추가로 서열번호 1 내지 10의 폴리펩티드 기준 서열에 대해 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 10의 기준 서열과 동일할 수 있거나, 기준 서열과 비교하여 아미노산 변경의 특정 정수 이하를 포함할 수 있으며, 상기 변경은 하나 이상의 아미노산 결손, 전이 및 전환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변경은 기준 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치 또는 기준 서열 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기들 중의 누클레오티드 중에서 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 임의의 위치에 발생할 수 있으며, 상기 아미노산 변경의 수는 서열번호 1 내지 10에서의 아미노산의 총수를 100으로 나누어진 백분율 상동성을 규정하는 정수로 곱한 후, 서열번호 1 내지 10에서의 아미노산의 총수에서 결과값을 차감하므로써 결정되거나 하기 수학식에 의해 결정된다:
Figure pat00003
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 수이며, xa는 서열번호 1 내지 10에서의 아미노산의 총수이며, y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97, 또는 100%에 대해 1.00이며, ● 는 곱하기에 대한 기호이며, 여기서 xa 및 y의 임의의 비정수 결과값은 xa에서 이를 차감하기 전에 가장 가까운 정수로 우수리를 제거한다.
예로서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 서열번호 1 내지 10의 기준 서열과 동일할 수 있으며, 즉 이는 100% 동일할 수 있거나 상동성 백분율이 100% 상동성 미만이 되도록 기준 서열과 비교하여 핵산 변경의 특정 정수까지 포함할 수 있다. 상기 변경은 하나 이상의 아미노산 결손, 전이 및 전환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변경은 기준 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치 또는 기준 서열 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기들 중의 누클레오티드 중에서 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 임의의 위치에 발생할 수 있으며, 상기 아미노산 변경의 수는 서열번호 1 내지 10에서의 아미노산의 총수를 100으로 나누어진 백분율 상동성을 규정하는 정수로 곱한 후, 서열번호 1 내지 10에서의 아미노산의 총수에서 결과값을 차감하므로써 결정되거나 하기 수학식에 의해 결정된다:
Figure pat00004
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 수이며, xa는 서열번호 1 내지 10에서의 아미노산의 총수이며, y는 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이며, ● 는 곱하기에 대한 기호이며, 여기서 xa 및 y의 임의의 비정수 결과값은 xa에서 이를 차감하기 전에 가장 가까운 정수로 우수리를 제거한다.
본원에서 유기물과 관련하여 사용될 때 "개체(들)"는 후생동물, 포유동물, 오비드(ovid), 소과, 유인원, 영장류, 및 사람을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다세포 진핵생물을 의미한다.
"단리된"은 이의 천연 상태로부터 "사람의 수작업에 의해" 변경됨을 의미하며, 즉 자연에서 발생하는 경우, 이의 본래 환경으로부터 변경되거나 제거되거나, 변경되고 제거됨을 의미한다. 예를 들어 살아있는 유기물에 본래 존재하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리되지" 않지만, 이의 천연 상태의 동시존재 물질로부터 분리된 동일한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리"되며, 이러한 용어는 본원에서 사용된다. 더욱이, 변형, 유전학적 조작에 의해 또는 임의의 다른 재조합 방법에 의해 유기물에 도입되는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 살아있거나 살아있지 않을 수 있는 상기 유기물에 존재하는 경우에도 "단리"된다.
"폴리누클레오티드(들)"는 일반적으로 임의의 폴리리보누클레오티드 또는 폴리데옥시리보누클레오티드를 칭하며, 이는 단일 및 이중-가닥 영역을 포함하는 비개질된 RNA 또는 DNA 또는 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있다.
"변이체"는 기준 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드와 상이하지만 필수적인 성질을 지닌 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 칭한다. 폴리누클레오티드의 통상적인 변이체는 다른 기준 폴리누클레오티드와 누클레오티드 서열에서 상이하다. 변이체의 누클레오티드 서열에서의 변형은 기준 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킬 수 있거나 변경시키지 않을 수 있다. 누클레오티드 변형은 하기에 논의된 바와 같이 기준 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 부가, 결손, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 통상적인 폴리펩티드의 변이체는 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열에서 상이하다. 일반적으로, 차이점은, 기준 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 밀접하게 유사하고, 수많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 변이체 및 기준 폴리펩티드는 임의의 조합에서 하나 이상의 치환, 부가, 결손에 의해 아미노산 서열에서 상이할 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔부는 유전학적 코드에 의해 엔코딩된 것일 수 있거나, 이러한 것이 아닐 수 있다. 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 천연 발생 대립유전자 변이체일 수 있거나, 천연적으로 발생하는 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다. 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 비-천연 발생 변이체는 돌연변이유발 기술에 의해 또는 직접 합성에 의해 제조될 수 있다.
"질환(들)"은 예를 들어, 유아 및 어린이에서의 중이염, 성인에서의 폐렴, 정맥두염, 병원성 감염증 및 침습성 질환, 청력 손실을 갖는 만성 중이염, 중이에서의 유체 축적, 청각 신경 손상, 지연된 대화 학습, 상부 호흡기관의 감염증, 및 중이의 염증을 포함하는 박테리아에 의한 감염증에 의해 야기되거나 이와 관련된 임의의 질환을 의미한다.
실험부
하기 실시예는 표준 기술을 사용하여 수행되며, 이는 상세한 설명에서 달리 기술되는 것을 제외하고 당업자에게 널리 공지되고 일반적이다. 실시예는 기술하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하지 않는다.
본 연구는 H. 인플루엔자의 단백질 E (pE)로 명명된 신규한 외측 막 단백질 및 신규한 절단된 재조합 pE(A)의 단리, 정제, 특징화, 클로닝 및 발현을 기술하며, 이는 사람 IgD(λ) 골수종 혈청을 이용하여 발견되었다.
재료 및 방법
시약
타입 H. 인플루엔자 균주 MinnA 및 NTHi3655를 Robert S. Munson Jr. (Washing-ton University School of Medicine (St. Louis, Mc))로부터 얻었다. 비-타입형 H. 인플루엔자 균주 NTHi772를 당 부서에서 비인두 스웝 배양물로부터 분리하였다(2). 일련의 상이한 해모필루스(Haemophilus) 종을 또한 분석하였으며, 표 1에 기술하였다. 사람 IgD 골수종 전혈청 IgD(7c)를 The Binding Site (Birmingham, England)로부터 구입하였다. 특이적 안티-pE 항혈청을 생산하기 위하여, 래빗을 근육내로 완전한 프로운드 애쥬번트[Difco, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany]에 에멀션화된 200 ㎍의 재조합 pE22-160 [pE (A)] 또는 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 컨쥬게이션되고 18 내지 36일 동안 부스티된 pE41-68 펩혈액을 2 내지 3주 후에 드로잉하였다. 얻어진 폴리클로날 항체를 CnBr-세파로즈에 컨쥬게이션된 pE(A) 또는 특이적 pE 펩티드 (pE41-68)를 사용하여 친화력 크로마토그래피로 분리하였다(II). 양고추냉이 퍼옥사이드 (HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-사람 IgD를 Biosource (Camarillo, CA)로부터 입수하였다. 래빗 항-사람 IgD pAb를 Dakopatts (Gentofte, Denmark)로부터 입수하였다.
플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이션된 마우스 항-사람 IgD, HRP-컨쥬게이션된 토끼 항-사람 경쇄 (κ 및 λ), 및 FITC-컨쥬게이션된 돼지 항-토끼 폴리클로날 면역글로불린을 다코패츠(Dakopatts)로부터 구입하였다.
단백질 E의 추출 및 정제
H. 인플루엔자 유형 b (MinnA)를 NAD 및 헤민(Sigma, St. Louis, MO)이 각각 10 ㎍/ml로 보충된 뇌심장 주입(BHI) 브로쓰(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)에서 밤새 성장시켰다. 2회 세척 후, 박테리아를 0.5% 엠피겐(Empigen®)(Calbiochem Novabiochem, Bedford, MA)을 함유하는 0.05 M 트리스-HCl-완충액(pH 8.8)에서 추출하였다. 박테리아 현탁액을 2시간 동안 37℃에서 자기 교반시킴에 의해 혼합하였다. 8000 x g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리시킨 후, 상청액을 살균 필터(0.45 ㎛; Sterivex-HV, Millipore)로 여과하였다. 0.5% 엠피겐® 중의 H. 인플루엔자 추출물을 6 M 우레아를 함유하는 0.05 M 트리스-HCl(pH 8.8)로 평형을 이룬 Q-세파로스 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시켰다. 컬럼을 동일한 완충액에서 0 내지 1 NaCl 선형 구배를 이용하여 용리시켰다. IgD(λ) 골수종 혈청에 의해 검출된 분획을 푸울링(pool)하고, 0.05 M 트리스-HCl(pH 8.8)에 대해 스펙트라포르 막 튜브(분자량 컷오프 6-8,000; Spectrum, Laguna hills, CA)에서 투석하고, YM100 디스크 막(분자량 컷오프 10,000; Amicon, Beverly, MA) 상에서 농축시켰다.
막 상에서 단백질의 SDS - PAGE 및 검출( 웨스턴 블롯 )
진행되는 10% 비스-트리스 겔(MES), 샘플(LDS), 및 운반 완충액 및 노벡스(San Diego, CA)로부터의 블롯팅 장치를 이용하여 150 일정 전압에서 SDS-PAGE를 진행시켰다. 샘플을 100℃에서 10분 동안 규칙적으로 가열하였다. 겔을 코마시 브릴리언트 블루 R-250 (13; Bio-Rad, Sundyberg, Sweden)으로 염색하였다. 겔로부터 이모빌론-P 막(Millipore, Bedford, MA)으로의 단백질 밴드의 전기이동을 30 V에서 2 내지 3시간 동안 수행하였다. 이동 후, 이모빌론-P 막을 PBS에서 5% 우유 분말을 함유하는 0.05% 트윈 20(PBS-트윈)으로 차단하였다. PBS-트윈에서 수 회 세척 후, 막을 2% 우유 분말을 포함하는 PBS-트윈에서 정제된 IgD 골수종 단백질(0.5 ㎍/ml, hu IgD(λ) 골수종; The Bindingsite)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-트윈에서의 수 회 세척 후에 1/1000 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-사람 IgD를 첨가하였다. 실온에서 40분 동안 인큐베이션하고 PBS-트윈에서 수 회 추가로 세척한 후에, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)으로 현상하였다.
2-차원 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2-D PAGE ) 및 웨스턴 블롯
이온 교환 크로마토그래피 이후, H. 인플루엔자(MinnA)의 엠피겐® 추출물을 IPGphor IEF 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 등전점 전기영동(IEF)으로 처리하였다 (5,12). 겔 교정(calibration)을 위해, 표준을 이용하였다 (cat. no. 161-0320; Bio-Rad). 2-D 폴리아크릴아미드 겔을 이모빌론-PVDF 필터(0.45 mm; Millipore, Bedford, US)로 120 mA에서 밤새 전기블롯팅시켰다. 포화 후, 인큐베이션, 차단 및 세척 공정을 상기 기술한 대로 수행하였다.
아미노산 서열 분석
어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, Foster City, CA) 470A 기체-액체 고체 상 서열분석기를 이용하여 자동화된 아미노산 서열 분석을 수행하였다.
H. 인플루엔자 게놈 라이브러리의 작제
균주 772로부터 번즈 앤 토마스의 방법을 개질시켜 염색체 DNA를 제조하였다 (2,13). 간단히 말해, H. 인플루엔자 772 게놈 라이브러리를 Sau3A로 1시간 동안 부분적으로 소화된 40 ㎍의 DNA로부터 작제하였다. 절단된 DNA를 수크로스 구배상에서 분획화하였다 (14). 적합한 크기(2 내지 7 kbp)의 DNA 단편을 함유하는 분획을 푸울링하고, DNA를 BamHI-소화된 pUC18로 라이게이션한 다음 진 펄서(Gene pulser, Bio-Rad, Richmond, CA)를 이용한 일렉트로포레이션에 의해 E.coli JM83으로 형질전환시켰다. 박테리아를 암피실린 및 X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드)이 보충된 LB 아가 위로 플레이팅하였다.
콜로니 면역검정, DNA 단리 및 서열화
LB 아가 상에서 밤새 배양된 대장균(E. coli) 형질전환주를 아가 표면을 건조 필터로 덮음에 의해 니트로셀룰로스 필터(Sartorius, Gottingen, Germany)로 옮겼다. 플레이트를 15분 동안 방치하고, 세포를 포화된 클로로포름 증기에 20분 동안 노출시킴에 의해 용균시켰다. 필터 상에 남아 있는 단백질-결합 부위를, 필터를 오브알부민을 함유하는 트리스 균형 염수(50 mM 트리스-히드로클로라이드, 154 mM NaCl, 1.5% 오브알부민[pH 7.4])에서 30분 동안 인큐베이션시킴에 의해 차단하였다. 차단시킨 후, 필터를 사람 IgD(λ)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. HRP-컨쥬게이션된 항-사람 IgD 폴리클로날 항체를 세척 후에 첨가하고 필터를 30분 동안 인큐베이션하였다. 모든 인큐베이션은 실온에서 수행되었다. 마지막으로, 필터를 4-클로로-1-나프톨 및 H2O2를 이용하여 현상하였다. 포지티브 클론을 골라 내고 NTHi772 게놈 DNA를 함유하는 pUC18 플라스미드 DNA를 정제하였다. 생성된 NTHi772 DNA 삽입물을 플랭킹 프라이머 M13+ 및 M13- 및 빅다이 터미네이터 싸이클 시퀀싱 v. 2.0 레디 리액션 시퀀싱 키트(Perkin-Elmer, Foster City, Ca)를 이용하여 서열화하였다. 수득된 삽입물 서열(3.55 kbp)은 단백질 HI0175, HI0176, HI0177, 및 마지막으로 HI0178을 엔코딩하는 DNA를 함유하는 스트레치(stretch)에 상응하였다 (15).
DNA 클로닝 및 단백질 발현
모든 구성물을 PCR 증폭된 단편을 이용하여 제조하였다. NTHi 772 게놈 DNA (HI0175 내지 HI0178)를 함유하는 pUC18을 주형으로서 이용하였다. Taq DNA 폴리머라제를 로슈 (Mannheim, Germany)로부터 입수하였고 PCR 조건은 제조자가 추천한 대로였다. 4개의 예측 단백질 HI0175 내지 HI0178의 오픈 리딩 프레임을 클로닝하였으나, HID(HI0178)의 클로닝을 기술하는 공정만을 본원에 포함시켰다. pE22 -160 [pE(A)로 표시됨]은 아미노산 잔기 글루타민21을 포함하는 내인성 시그널 펩티드가 없으며 제한 효소 부위 BamHI 및 HindIII을 도입시키는 프라이머 5'-ctcaggatccaaaggctgaacaaaatgatgtg-3' 및 5'-ggtgcagattaagcttttttttatcaactg-3'을 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 발현 벡터에 의해 엔코딩된 6 히스티딘 잔기를 융합시키기 위해, pE22 -160 정지 코돈을 돌연변이시켰다. pe 유전자의 생성된 417 bp 오픈 리딩 프레임을 pET26(+)(Novagen, Darmstadt, Germany)에 라이게이션시켰다. 추정되는 독성을 피하기 위해, 생성된 플라스미드를 먼저 숙주 대장균(E. coli) DHα로 형질전환시켰다. 이후, pE 및 pE(A)를 엔코딩하는 플라스미드를 발현 숙주 BL21(DE3)로 형질전환시켰다. 전장 pE 및 pE(A)에 추가하여, 일련의 트렁케이션된 pE 변이체를 제조하였다. 개요를 도 8에 도시한다. BamHI 및 HindIII을 함유하는 프라이머를 모든 구성물에 이용하였다. 트렁케이션된 변이체에 대한 공정은 상기에 기술되어 있다. 모든 구성물을 빅다이 터미네이터 싸이클 씨퀀싱 v. 2.0 레디 리액션 시퀀싱 키트(Perkin-Elmer, Foster City, Ca)를 이용하여 서열화하였다.
재조합 단백질을 생성하기 위해, 박테리아를 대수증식기까지 성장시키고 (OD600 0.6 내지 0.8) 1 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드 (IPTG)로 유도시켜 pE(A)의 과발현을 초래하였다. OD600이 1.5 내지 1.7에 도달하면, 박테리아를 회수하고 봉입체를 표준 프로토콜에 따라 단리시켰다. 재조합 단백질은 니켈 컬럼을 이용한 친화력 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있었다. 정제된 재조합 단백질을 후속하여 SDS PAGE에 의해 분석하였다.
H. 인플루엔자 DNA 정제, PCR 조건 및 서열화
H. 인플루엔자 임상 단리물로부터의 게놈 DNA를 DNeasy 조직 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 단리시켰다. Taq DNA 폴리머라제를 로슈(Mannheim, Germany)로부터 입수하였고 PCR 조건은 제조자가 추천한 대로였다. pe 유전자를 단리시키기 위해, 플랭킹 유전자 HI0177 및 HI0179를 각각 어닐링하는 프라이머 쌍 5'-gcatttattaggtcagtttattg-3' 및 5'-gaaggattatttctgatgcag-3'을 이용하였다. 생성된 PCR 생성물 (948 bp)을 유전자-워킹(gene-walking)에 의해 프라이머 5'-cttgggttacttaccgcttg-3' 및 5'-gtgttaaacttaacgtatg-3'에 추가하여 상기 언급된 프라이머를 이용하여 서열화하였다. 모세관 전기영동을 베크만(Beckman) CEQ 2000 상에서 다이-터미네이터 싸이클 시퀀씽 키트(CEQ DTCS 키트, Beckman Coulter, Stockholm, Sweden)을 이용하여 진행시켰다. 생성된 DNA 서열의 교정 및 정렬을 PHRED (CodonCode, Deadham, USA) 및 SEQUENCHER (MeddProbe, Oslo, Norway)을 이용하여 수행하였다.
pE -결핍 H. 인플루엔자( NTHi 3655 Δ pe )의 제조
NTHi 772로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로서 이용하였다. 유전자 HI0177 및 HI0179의 일부를 포함하는 pe의 5' 및 3'-말단을, 두 카세트 중의 특정 흡수 서열 이외에 제한 효소 부위 XhoI 및 EcoRI 각각 EcoRI 및 SpEI를 도입시키는 DyNAzyme™ II DNA 폴리머라제(Finnzymes, Espoo, Finland)를 이용하여 2개 카세트로서 증폭시켰다 (각각 815 bp 및 836 bp)(18). 생성된 PCR 단편을 소화시키고 pBluescript SK(+/-)로 클로닝시켰다. 카나마이신 내성 유전자 카세트 (1282 bp)를 EcoRI에 대한 제한 효소 부위를 이용하여 pUC4K로부터 수득하였다. 소화 이후, PCR 생성물을 HI0177 및 HI0179 유전자의 일부를 함유하는 트렁케이션된 pe 유전자 단편으로 라이게이션시켰다. H. 인플루엔자 균주 Eagan 및 RM804를 헤리오트(Heriott) 등의 M-IV 방법에 따라 형질전환시켰다 (19). 생성된 돌연변이를 PCR에 의해 확인하고 pE 발현을 웨스턴 블롯 및 흐름 세포측정에 의해 분석하였다.
분자 생물학 소프트웨어
수득된 서열을 이용가능한 H. 인플루엔자 KW20 게놈(http://www.tigr.org)와 비교하였다 (15). 시그널 펩티드는 SignalP V1.1 월드 와이드 웹 프리딕션 서버 센터 포 바이올로지컬 씨퀀스 어낼리시스 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 추정되었다. pE 소수성 프로필을 카이트 앤 돌리틀(Kyte and Doolittle)의 방법에 의해 분석하였다 (17).
동물, 수술 공정 및 래트 중이염 모델
무게가 200-250 g인 건강한 수컷 Sprague-Dawley 래트를 이용하였다. 모든 동물은 수술 전에 귀현미경에 의해 검사된 대로 중이 감염이 없었다. 중재(intervention) 시에, 래트를 메토헥시탈(Brietal®, Elli Lilly and Company, Indianapolis, IN)로 정맥내 마취하거나 클로랄 히드레이트(apoteksbolaget, Lund, Sweden)로 복막내 마취시켰다. 동물 실험용 박테리아를 상기 개시된 대로 성장시켰다. 원심분리에 의해 회수한 후, 박테리아를 NTHi 3655 및 상응하는 pE 돌연변이 둘 모두에 대하여 새로운 배양 배지에서 2x1010 콜로니 형성 유닛(cfu)의 농도로 재현탁시켰다. 제조물을 사용시까지 얼음 위에 유지시켰다. 급성 중이염(AOM)을 유도하기 위해, 중이를 목의 배쪽 중선 절개에 미치게 하고, 약 0.05 ml의 박테리아 현탁액을 중이 공동에 주입시켰다. 귀현미경으로 수술 후 3일 및 5일에 검사하였다. 화농성 삼출물, 즉 불투명한 삼출물이 있고 3일째 관의 팽창이 자주 진단되는 중이염을 AOM으로서 언급하였다.
결과
IgD (λ) 골수종 혈청에 의해 검출되는 H. 인플루엔자 단백질 ( pE )의 추출 및 분리
무유형성 H. 인플루엔자(NTHi)가 IgD에 결합되지 않는 반면 (19), 캡슐화된 H. 인플루엔자가 IgD에 강하게 결합되는 것이 이전에 교시되었다. 본 발명자들은 IgD(λ) 골수종 혈청이 NTHi에도 특이적으로 결합되는 것을 발견하였다. NTHi 772의 통상적인 세포 흐름측정 프로필이 도 1에 도시된다. IgD(λ) 골수종 단백질의 존재하에 강한 이동 및 증가된 형광성이 IgD가 없는 대조군에 비해 발견되었다.
IgD(λ) 골수종에 의해 검출된 H. 인플루엔자 외막 단백질을 상세하게 분석하기 위해, 외막 분획을 세제 엠피겐®에 용해시켰다. 도 1B는 매우 강한 IgD-결합 활성이 약 16 kDa의 겉보기 분자량을 지니는 단백질에 대해 웨스턴 블롯 상에서 수득되었음을 입증한다. 그러나, IgD-결합 활성에 상응하는 다른 단백질 밴드는 코마시 브릴리언트 블루-염색된 SDS-PAGE 상에서 검출될 수 없었다. Q-세파로스 컬럼 상에서 분리시킨 후, 동일한 외막 추출물을 2-차원 겔 전기영동 및 은 염색에 적용시켰다 (도 1C). 동시에, 사람 IgD(λ)로 프로빙된 상응하는 웨스턴 블롯을 수행하였다. 따라서 pE가 국한된 영역을 에워쌀 수 있었다. 그러나, 어떠한 가시적인 단백질도 관찰되지 않았다 (도 1C).
단백질 E의 클로닝 및 pE 가 결여된 무유형성 H. 인플루엔자 돌연변이의 제조
본 발명자들이 분리 후 2-D 분석에서 어떠한 단백질도 검출할 수 없었기 때문에, 무유형성 H. 인플루엔자(NTHi) 균주 772를 이용하여 H. 인플루엔자 DNA 라이브러리를 구성하였다. 2 내지 7 kbp 범위의 단편을 함유하는 게놈 DNA를 pUC18에 라이게이션하고 대장균(E. coli) JM83으로 형질전환시켰다. 형질전환주를 사람 IgD(λ) 및 HRP-컨쥬게이션된 항-사람 IgD 폴리클로날 항체로 구성된 콜로니 면역검정을 이용하여 IgD-결합에 대해 분석하였다. 시험된 20,000개 콜로니 중에서 3개의 포지티브 콜로니가 발견되었고, 이것을 IgD(λ)를 이용한 제2 라운드의 스크리닝으로 처리하였다. 본 발명자들은 포지티브 클론 중 하나를 서열화하였고 H. 인플루엔자 KW20의 물리적 맵에 따라 4개의 단백질 HI0175 내지 HI0178을 엔코딩하는 DNA를 함유하는 3.55 kb의 삽입물을 발견하였다 (15). IgD(λ)와의 특정 상호작용을 추가로 입증하기 위해, 선택된 형질전환주를 흐름 세포측정으로도 분석하였다. 도 2B에서 볼 수 있는 바와 같이, 빈 벡터만으로 형질전환된 네거티브 대조군 대장균(E. coli)과 비교하여, HI0175 내지 HI0178을 엔코딩하는 서열에 상응하는 H. 인플루엔자 772 게놈 DNA를 제공하는 대장균(E. coli) JM83이 IgD(λ)에 의해 검출되었다 (도 2A).
대장균(E. coli) JM83 클론의 분석에 추가하여, 4개의 H. 인플루엔자 단백질 (HI0175 내지 HI0178)을 발현 벡터 pET26(+)로 클로닝시키고 대장균(E. coli) BL21DE3에서 생성하였다. 생성된 재조합 단백질을 웨스턴 블롯 상에서 IgD(λ)에 의해 분석하고, HI0178이 IgD(λ)에 의해 검출된 유일한 단백질임을 발견하였다 (데이터는 도시되지 않음).
pE를 엔코딩하는 유전자에서 카나마아신 내성 유전자 카세트를 도입시켜 무유형성 H. 인플루엔자(NTHi 3655)를 돌연변이시켰다. 생성된 돌연변이를 PCR에 의해 확인하고 pE 발현의 부재를 특정 항-pE 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯으로 외막 단백질을 분석하여 입증하였다 (데이터는 도시되지 않음). NTHi 3655Δpe 돌연변이도 흐름 세포측정에 의해 시험하였고 토끼 항-pE 일가 항혈청 및 FITC-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 이차 pAb로 분석한 경우 상응하는 NTHi 3655 야생형에 비해 돌연변이에서 명백하게 감소된 형광성을 발견하였다 (도 2C 및 D).
단백질 E가 모든 H. 인플루엔자에서 검출된 반면 , 다른 서브종들은 네거티브였다
임상 단리물 및 NTHi의 유형 균주의 pE 발현을 분석하기 위해, IgD(λ) 혈청 및 사람 IgD에 대해 유도된 FITC-컨쥬게이션된 이차 항체로 구성된 직접 결합 흐름 세포측정 검정을 전개하였다. 초기 실험에서, 상이한 시점에 수집된 박테리아를 pE 발현에 대해 분석하였다. pE 발현과 관련하여 대수증식기 또는 정지기 박테리아간에 어떠한 차이도 관찰되지 않았고, 이것은 NTHi 표면 pE가 증식 단계에 의존적이지 않음을 시사한다. 따라서, 정지기 박테리아를 모든 이후의 분석에 이용하였다. 박테리아 세포에 대한 평균 형광 강도(mfi)를 분석하였고 총 22개 NTHi 균주를 연구에 포함시켰다. 형광 세기는 상이한 NTHi 균주 간에 달라지며, 특히 pE는 검출 항체로서 IgD(λ) 골수종 혈청을 사용하는 이러한 특정 검정에서 대다수의 NTHi에서 검출되었다(도 3).
다른 실험에서, 특이적 래빗 항-pE 항체를 표면 노출된 pE를 검출하는 데 사용하였다. 특이적 항-pE 항혈청은 H. 인플루엔자, H. 에집티쿠스(aegypticus), 및 H. 헤몰리티쿠스(haemolyticus)(데이타는 미기재됨)의 캡슐화된 균주에서 특이적으로 pE를 인식하였다.
pE 발현 수준을 추가로 분석하기 위해, 다양한 헤모필루스 종의 엠피젠(Empigen)®-처리된 외막 추출물을 검출 항체로서 IgD(λ)을 사용하여 웨스턴 블롯으로 시험하였다(표 1). 이들 실험에서는 고발현 헤모필루스 균주와 저발현 헤모필루스 균주 간의 차이점은 발견되지 않았다. 즉, 웨스턴 블롯에서 모든 균주가 동일한 세기 및 상16kDa에 상응하는 동일한 위치에서의 pE를 나타내었다. 캡슐화된 H. 인플루엔자(타입 a 내지 f) 또한 웨스턴 블롯에 의해 밝혀진 바와 같이 pE를 발현시켰다(표 1). 예를 들어, 4개의 H. 인플루엔자 캡슐 타입 b(Hib)에서의 pE 발현이 도 4에서 NTHi와 비교된다. H. 에집티쿠스, 및 H. 헤몰리티쿠스는 pE를 발현시킨 반면, 유세포분석에서 네가티브인(도 3) 다른 관련된 헤모필루스 종에 대해서, 웨스턴 블롯 분석으로 pE는 검출되지 않았다. 또한, 특이적 항-pE 항혈청은 캡슐화된 균주에서 특이적으로 pE를 인식하였다(데이타 미기재).
표 1
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Figure pat00006

Figure pat00007
재조합에 의해 생성된 pE22 -160[pE(λ)]이 IgD (λ)에 의해 검출됨
최초 실험에서, 본 발명자들은 재조합에 의해 pE를 제조하기 위한 시도를 하였으나, 단지 미소한 농축물 만이 수득되었다. 단백질 수율을 최대화시키기 위해, 아미노산 잔기 리신22 내지 리신 160으로 이루어진 끝이 잘린 pE 단편을 작제하였다. 이에 따라, 아미노산 글루타민21을 포함하는 N 말단 시그널 펩티드가 제거되고, 벡터 pET26(+)로부터 기원하는 9개의 잔기 이외에 리더 펩티드로 대체되었다(도 5a). 끝이 잘린 pE22-160을 pE(A)로 명명하였다(도 5b). 재조합 단백질 생성물이 '야생형' pE에 상응하는 지를 확인하기 위해, NTHi 772로부터 분리된 pE와 함께 재조합 발현된 pE(A)를 프로브로서 IgD(λ)를 사용하는 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 도 5d에 도시된 바와 같이, 재조합 pE(A)는 SDS-PAGE에서 야생형 pE에 상당히 상응하였다. 더우기, E.coli 에서 생성된 pE(A)는 IgD(λ) 항혈청에 의해 0.01 마이크로그램으로 낮게 검출될 수 있었다(도 5e).
pE(A)를 래빗의 면역화에 사용하고, 물질 및 방법에서 자세히 기술한 바와 같은 면역화 스케쥴이 종결된 후, 항-pE 항혈청을 평가되는 면역우세 펩티드(아미노산 pE41-68)로 이루어진 컬럼 상에서 정제하였다. 형성된 항체는 박테리아 표면(도 2c), 및 웨스턴 블롯(미도시) 둘 모두에서 pE를 분명하게 검출하였다.
단백질 e 유전자 및 오픈 리딩 프레임의 DNA 서열
균주 NTHi 772로부터 pE1-160의 DNA 및 아미노산 서열이 도 6에 개략적으로 기재되어 있다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 160개의 아미노산 길이이며, 예측된 시그널 펩티드는 20개의 아미노산 길이를 갖는다. 컴퓨터 분석에서는 시그널 펩티다제가 아미노산 잔기 알라닌18 내지 리신22를 인식하고, 잔기 이소류신20과 글루타민21 사이를 분해시키는 것으로 나타났다(38). 병행하여, HID 수치법(hydropathy) 프로파일(39)은 pE가 소수성 시그널 펩티드를 갖는 반면, 분자의 나머지는 주로 친수성임을 보여준다(도 7).
시그널 펩티다제 분해 자리를 자세히 측정하기 위해, 재조합 전장 pE를 에드만(Edman) 분해 처리하였다. 그러나, pE 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단이 블록킹된 것으로 추정되었다. 이러한 실패에 대해서는, 제 1 아미노산이 M. 카타르할리스(catarrhalis) UspA 단백질류에 대해 앞서 기술된 바와 같이 피로글루타밀 잔기라는 설명이 가능할 수 있다(11). 그러나, 피로글루타메이트 아미노펩티다제로 이러한 추정된 잔기를 제거하려는 시도는 실패하였다. 전장 pE1-160에 대조적으로, 내인성 H. 인플루엔자 시그널 펩티드가 결여된(도 5) pE(A)(pE22-160)에 대한 N-말단 서열은 에드만 분해에 의해 성공적으로 특징화었고, 예측된 벡터 서열, 즉, 올바른 위치에서 분해된 E. coli 내 시그널 펩티다제를 함유하는 것으로 나타났다(도 5a).
단백질 E를 NTHi 및 캡슐화된 H. 인플루엔자를 포함하는 일련의 상이한 헤모필루스 종으로 시퀀싱하였다(표 1). 흥미롭게도, pE는 특이적으로 보존되었다. 단지 소수 아미노산이 점변이되었고, 이들은 대부분의 균주에서 특이적 패턴을 따라 변이되었다(도 6 및 표 2).
표 2. 기준 균주로서 H. 인플루엔자와 비교한 경우, 상이한 헤모필루스 종의 pE 유전자에서의 점변이a)
Figure pat00008
a) 플랭킹 프라이머를 사용하여 pe 유전자를 캡슐화된 H. 인플루엔자 타입 a (n=2), b (n=2), c (n=2), 및 d (n=1), e (n=2), 및 f (n=3), NTHi (n=8), H. 인플루엔자 비오바르 에집티쿠스(n=6) 및 H. 에집티쿠스(n=5)로 시퀀싱하였다.
b) NTHIi 772(서열 ID No:1)
c) Rd는 H. 인플루엔자 균주 Rd를 지칭한다.
pE 의 상이한 단편이 E. coli 에서 용이하게 생성될 수 있음
전장 pE로부터 유래된 8개의 cDNA 서열을 pET26b(+)에 클로닝시키고, E. coli에서 발현시켰다. 형성된 단백질을 히스티딘 태그에 대해 친화성을 갖는 니켈 수지 상에서 정제시켰다(도 8). 재조합 단백질이 전체 성숙 pE 단백질 생성물을 커버하였고, 이들의 개개의 길이 및 위치는 도 8a에서 입증되는 바와 같으며, 정제된 생성물은 도 8b에 약술된다.
pE 는 래빗 급성 중이염( AOM )의 중요한 유독성 인자임
NTHi에 대한 유독성 인자로서 pE의 역할을 조사하기 위해, 래빗의 중이를 105 내지 109 NTHi 3655 Δpe 또는 상응하는 야생형 NTHi 3655로 자극하였다(도 9). 흥미롭게도, 야생형 박테리아와 비교하여 유사한 AOM을 유도하기 위해 100 내지 1,000배 초과의 NTHi 3655 Δpe가 요구되었다. 따라서, pE는 NTHi 유도된 AOM에 대해 중요한 유독성 인자이다.
pE 는 규정된 집단에서 높은 면역원성을 가짐
어린이 및 혈액 기증자에게서 항체 수준을 측정하기 위해, 재조합 pE(A)를 E. coli로부터 정제하고(도 5b), ELISA에 사용하였다. pE(A)에 대한 항체의 ELISA 분석 결과가 도 9에 도시된다. 6개월 미만의 유아는 pE(A)에 대해 검출가능한 IgG 및 IgA를 지녔다. IgG 항체는 5 내지 10세 어린이에게서 최고 수준을 나타내었다. 대조적으로, IgA 항체는 연령이 높아짐에 따라 점차적으로 증가하였으며, 최고값은 70 내지 80세 그룹에서 검출되었다.
유용한 에피토프
단백질의 B-세포 에피토프는 주로 그 표면에 편재된다. 단백질 E 폴리펩티드의 B-세포 에피토프를 예측하기 위해, 두가지 방법을 병용하였다: 2차원 구조 예측법 및 항원성 지수 예측법. 2차원 구조 예측법은 프사이프레드 프로그램(PSIPRED program, David Jones, Brunel Bioinformations Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK)을 사용하여 이루어졌다. 항원성 지수는 제임슨(Jameson) 및 울프(Wolf)(CABIOS 4:181-186[1988])에 의해 기술된 방법을 기초로 하여 계산하였다. 상기 프로그램에 사용된 파라미터는 항원성 지수 및 항원성 펩티드에 대한 최소 길이이다. 최소 5개의 연속되는 아미노산에 대한 항원성 지수 0.9가 상기 프로그램의 한계치로서 사용되었다. 우수하고, 효능있는 B-세포 에피토프를 포함하는 펩티드가 표 3에 열거된다. 이들은 ntHi 감염의 예방을 위한 백신 조성물에 유용할 수 있으며(바람직하게는, 보다 큰 단백질로 컨쥬게이트되거나, 재조합에 의해 결합되어), 보존적 변이(바람직하게는 표 3의 서열에 대해 70, 80, 85, 95, 99 또는 100% 동일성을 갖는), 또는 이로부터 5개 또는 그 초과(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 또는 25개)의 아미노산을 포함하는 절두체, 또는 단백질 E 폴리펩티드에 대해 숙주에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 효과적인 에피토프를 보존하는 원래의 천연 단백질 E(SEQ ID NO:1 또는 상기 표 2에 기재된 바와 같은 이의 천연 동족체) 폴리펩티드로부터 펩티드의 N- 및/또는 C-종결 말단에서 예를 들어, 1, 2, 3, 5, 10개의 추가의 아미노산을 포함하는 연장체를 포함하는 유사한 펩티드도 그러할 수 있다.
표 3 : SEQ ID NO:1(또는 이의 천연 동족체)로부터의 효능있는 B-세포 에피토프
Figure pat00009
결론
표면 노출된 헤모필루스 외막 단백질 pE는 NTHi 유도된 AOM에 대한 중요한 유독성 인자이며, 규정된 집단에서 높은 면역원성을 가지며, 이에 따라 여러 인간 질병에 대해 매우 적합한 백신 후보물질이다.
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Figure pat00010
Figure pat00011
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<211> 139 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic protein (pE(A)) <400> 2 Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser 20 25 30 Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp 35 40 45 Ala Val Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys 50 55 60 Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn 65 70 75 80 Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly 85 90 95 Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser 100 105 110 Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala 115 120 125 Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys 130 135 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE41-68) <400> 3 Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile 1 5 10 15 Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe 20 25 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE22-60) <400> 4 Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser 20 25 30 Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn 35 <210> 5 <211> 74 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE22-95) <400> 5 Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser 20 25 30 Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp 35 40 45 Ala Val Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys 50 55 60 Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys 65 70 <210> 6 <211> 104 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE22-125) <400> 6 Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser 20 25 30 Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp 35 40 45 Ala Val Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys 50 55 60 Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn 65 70 75 80 Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly 85 90 95 Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys 100 <210> 7 <211> 70 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE56-125) <400> 7 Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val 1 5 10 15 Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr 20 25 30 Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His 35 40 45 Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly 50 55 60 Leu Arg Ala Ala Pro Lys 65 70 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE56-160) <400> 8 Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val 1 5 10 15 Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr 20 25 30 Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His 35 40 45 Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly 50 55 60 Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr 65 70 75 80 Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr 85 90 95 Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys 100 105 <210> 9 <211> 75 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE86-160) <400> 9 Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn 1 5 10 15 Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly 20 25 30 Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser 35 40 45 Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala 50 55 60 Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys 65 70 75 <210> 10 <211> 46 <212> PRT <213> Protein fragment from Haemophilus influenzae or synthetic peptide (pE115-160) <400> 10 Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile 20 25 30 Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys 35 40 45 <210> 11 <211> 483 <212> DNA <213> Haemophilus influenzae <400> 11 atgaaaaaaa ttattttaac attatcactt gggttactta ctgcctgttc tgctcaaatc 60 caaaaggcta aacaaaatga tgtgaagctg gcaccgccga ctgatgtacg aagcggatat 120 atacgtttgg taaagaatgt gaattattac atcgatagtg aatcgatctg ggtggataac 180 caagagccac aaattgtaca ttttgatgca gtggtgaatt tagatagggg attgtatgtt 240 tatcctgagc ctaaacgtta tgcacgttct gttcgtcagt ataagatctt gaattgtgca 300 aattatcatt taactcaaat acgaactgat ttctatgatg aattttgggg acagggtttg 360 cgggcagcac ctaaaaagca aaagaaacat acgttaagtt taacacctga tacaacgctt 420 tataatgctg ctcagattat ttgtgcgaac tatggtgaag cattttcagt tgataaaaaa 480 taa 483

Claims (1)

  1. 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에서 검출될 수 있으며, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 표면 노출된 단백질을 포함하는 백신 조성물로서,
    상기 단편이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열로부터 50개 이상의 연속 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO:1의 폴리펩티드를 인지하는 면역반응을 유발시킬 수 있는 것인 백신 조성물.
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