NO346497B1 - Overflateeksponert haemophilus influenzae protein (protein E, pE) - Google Patents
Overflateeksponert haemophilus influenzae protein (protein E, pE) Download PDFInfo
- Publication number
- NO346497B1 NO346497B1 NO20082827A NO20082827A NO346497B1 NO 346497 B1 NO346497 B1 NO 346497B1 NO 20082827 A NO20082827 A NO 20082827A NO 20082827 A NO20082827 A NO 20082827A NO 346497 B1 NO346497 B1 NO 346497B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- seq
- polypeptide
- sequence
- polynucleotide
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 155
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 114
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 title claims description 104
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 title claims description 25
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 title description 112
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 title description 111
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 305
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 261
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 244
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 89
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 73
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 60
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 50
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 36
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 26
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 23
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 19
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 claims description 14
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 13
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 claims description 13
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 claims description 13
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 5
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 claims description 5
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 claims description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 4
- 101100406392 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) omp26 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000024188 Andala Species 0.000 claims description 2
- BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N Ser-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRKHVZNDAOMAHX-BIIVOSGPSA-N 0.000 claims description 2
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 claims description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 220
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 220
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 219
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 description 82
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 63
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 239000000047 product Substances 0.000 description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 42
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 36
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 21
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 18
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 18
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 14
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 13
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 11
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 208000022760 infectious otitis media Diseases 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 5
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- -1 and variants thereof Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 101150074154 pe gene Proteins 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000003405 preventing effect Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 5
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 241001501603 Haemophilus aegyptius Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 4
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000159901 Haemophilus influenzae 3655 Species 0.000 description 3
- 241001235200 Haemophilus influenzae Rd KW20 Species 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 3
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101100245206 Dictyostelium discoideum psmC4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000606788 Haemophilus haemolyticus Species 0.000 description 2
- 101001015673 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Glycerophosphodiester phosphodiesterase Proteins 0.000 description 2
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- NZXKDOXHBHYTKP-UHFFFAOYSA-N Metohexital Chemical compound CCC#CC(C)C1(CC=C)C(=O)NC(=O)N(C)C1=O NZXKDOXHBHYTKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010031133 Transferrin-Binding Protein A Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 101150095556 tbpB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 description 1
- 241000589568 Brucella ovis Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical class ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 101150036540 Copb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000000832 Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 101000874355 Escherichia coli (strain K12) Outer membrane protein assembly factor BamA Proteins 0.000 description 1
- 101100463953 Escherichia coli (strain K12) phoE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000873843 Homo sapiens Sorting and assembly machinery component 50 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- KTHDTJVBEPMMGL-VKHMYHEASA-N N-acetyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)=O KTHDTJVBEPMMGL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KTHDTJVBEPMMGL-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-L-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(C)=O KTHDTJVBEPMMGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVLMCRFQGHWOPM-ZKWNWVNESA-N N-arachidonoyl vanillylamine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 QVLMCRFQGHWOPM-ZKWNWVNESA-N 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 208000006816 Neonatal Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101150093941 PORA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 101710110023 Putative adhesin Proteins 0.000 description 1
- 108090000919 Pyroglutamyl-Peptidase I Proteins 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 102100035853 Sorting and assembly machinery component 50 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 206010044314 Tracheobronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101500008190 Turnip yellow mosaic virus Methyltransferase/Protease Proteins 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 108091027569 Z-DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000893 auditory nerve damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229940038698 brucella melitensis Drugs 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091016312 choline binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024035 chronic otitis media Diseases 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 101150023807 copB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 208000001606 epiglottitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010048607 glycerophosphodiester phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 208000030500 lower respiratory tract disease Diseases 0.000 description 1
- 101150082581 lytA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002683 methohexital Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 101150047779 ompB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 101150031507 porB gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229940093609 tricaprylin Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N trioctanoin Chemical compound CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/012—Coccidia antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Område for oppfinnelsen
Den foreliggende beskrivelsen vedrører det overflateeksponerte protein E, en virulensfaktor, som eksisterer i alle innkapslete ikke-typebestembare Haemophilus influenzae. Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse en vaksinesammensetning for anvendelse i behandling eller hindring av otitt media, sinusitt eller infeksjoner i lavere respirasjonskanal eller kronisk obstruktiv pulmonær sykdom, omfattende et overflateeksponert protein, som kan detekteres i Haemophilus influenzae.
Bakgrunn for oppfinnelsen.
Både Haemophilus influenzae type b (Hib) og ikke-typebestembare H. influenzae (NTHi) forårsaker en rekke sykdommer i barn og i voksne. Hib forårsaker bakteriell meningitt og andre invasive infeksjoner i barn med alder under 4 år, mens NTHa har blitt isolert fra tilfeller av otitt media, sinusitt, epiglotitt, trakeobronkitt, og pneumoni og kan forårsake neonatal sepsis. Der er for tiden ingen kommersielt tilgjengelige vaksiner mot NTHi, men et antall vaksiner er i anvendelse mot Hib. Disse vaksiner består av Hib- kapsular polysakkarid, polyribosyl ribitol fosfat, konjugert til forskjellige proteinbærere (meningokokkal yttermembran kompleks, tetanus toksoid, ikke- toksisk mutant difteria toksin, eller difteria toksoid) for å overkomme den svake immunrespons til kapsular polysakkarid i barn som er yngre enn 18 måneders alder. H. influenzae yttermembran proteiner (OMPs) er også vurdert å være bærere av polyribosyl ribitol fosfat siden de er kjent å være mål for vertsantistoff som etterfølger Hib- og NTHi- injeksjoner. Antistoff til OMPer P1, P2, P4, P5, og P6 og et 98-kDa protein har blitt testet i in vivo beskyttelse og i in vitro baketerisidale analyser mot H. influenzae infeksjoner, med antistoff til P1, P4, og P6 viser biologisk aktivitet mot både homologe og heterologe H. influenzae stammer. Mangel på heterolog beskyttelse fra antistoff til andre OMPer er delvis grunnet i den antigeniske diversitet av disse proteiner blant forskjellige H. influenzae stammer. Et ideelt antigen må derfor både eksponeres for den bakterielle overflate og være antigenisk godt konservert. I dette laboratorium har et 42-kDa membran protein (protein D) som er godt distribuert og som er antigenisk konservert blant både Hib og NTHi stammer blitt isolert, klonet, sekvensert, og vist å være en patogenisitetsfaktor og en mulig vaksinekandidat (1-5).
For to tiår siden ble Haemophilus influenzae og M. catarrhalis vist å oppvise en sterk affinitet for både løselig og overflatebundet humant IgD (6).IgD-bindingen synes å være parallell med en tilsvarende interaksjon med overflatebundet IgD ved cellulært nivå, et fenomen som forklarer de sterke mitogene effekter på humane lymfocytter av H. influenzae og M. catarrhalis (7-9). Et IgD-bindende yttermembranprotein fra H. influenzae (protein D) ble isolert og klonet, og vist å være en viktig patogenisitetsfaktor (1-5). Imidlertid binder protein D ikke universelt til alle IgD myelomaer (10).
Sammendrag av oppfinnelsen.
I lys av det faktum at H. influenzae har blitt funnet å være en slik ledende årsak til infeksjoner i øvre og nedre luftveier, er der et pågående behov for å utvikle vaksiner som kan anvendes mot H. influenzae.
Formålet med foreliggende oppfinnelse har derfor vært å finne ut på hvilken måte H. influenzae interagerer med celler i kroppen og interagerer med immunsystemet, og være i stand til å tilveiebringe en ny type vaksine.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en vaksinesammensetning for anvendelse i behandling eller hindring av otitt media, sinusitt eller infeksjoner i lavere respirasjonskanal eller kronisk obstruktiv pulmonær sykdom, omfattende et overflateeksponert protein, som kan detekteres i Haemophilus influenzae, som har en aminosyresekvens som har avvik fra SEQ ID NO: 1, hvor nevnte avvik er valgt blant gruppen som består av; Thr i stedet for Ile ved posisjon 20 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ala ved posisjon 23 i SEQ ID NO 1, Glu i stedet for Lys ved posisjon 24 i SEQ ID NO 1, Met i stedet for Val ved posisjon 28 i SEQ ID NO 1, Thr i stedet for Ala ved posisjon 31 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ile ved posisjon 41 i SEQ ID NO 1, Ala i stedet for Val ved posisjon 47 i SEQ ID NO 1, Lys i stedet for Arg ved posisjon 76 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ile ved posisjon 107 i SEQ ID NO 1, Lys i stedet for Gly ved posisjon 152 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ala ved posisjon 154 i SEQ ID NO 1, en Ser-Ala-Pro-tilsetning ved C-terminus av SEQ ID NO: 1, Val i stedet fro Pro i posisjon 32 i DEQ ID NO 1, og Ala i stedet for Pro i posisjon 32 i SEQ ID NO 1, hvilket fragment er i stand til å rette en immunrespons som gjenkjenner polypeptidet ifølge SEQ ID NO 1.
I en utførelse av oppfinnelsen omfatter vaksinesammensetningen ytterligere en eller flere farmasøytisk akseptable adjuvanter, vehikler, eksipienter, bindere, bærere, konserverende midler, bufringsmidler, emulsifiserende midler, fuktmidler eller transfeksjonsfremmende forbindelser.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er nevnte polypeptid én di-, tri- eller multimer av et polypeptid.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen omfatter vaksinesammensetningen en immunogenisk del av et annet molekyl.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen omfatter vaksinesammensetningen en immunogenisk del av et annet molekyl, hvor det annet molekyl er et yttermembranprotein av et respirasjonskanalpatogen.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen omfatter vaksinesammensetningen en immunogenisk del av et annet molekyl, hvor det annet molekyl er valgt blant gruppen som består av pneumolysin fra Streptococcus pneumonia; MID, OMP106, UspA1, UspA2, Hly3, OmpCD og D15 fra Moraxella catarrhalis; og OMP26, P6, Protein D, NlpC2 and Slp fra Haemophilus influenza.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er polypeptidet fusjonert rekombinant med minst ett annet protein.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er polypeptidet kovalent eller ikkekovalent bundet til et protein, karbohydrat eller matriks.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen omfatter vaksinesammensetningen ytterligere en membran av en celle, som omfatter proteinet.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et overflateeksponert protein, som kan detekteres i Haemophilus influenzae, som har en aminosyresekvens i samsvar med Seq ID No.1, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonierings eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prosesseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et immunogenisk fragment av nevnte overflateeksponerte protein, hvor fragmentet kan detekteres i Haemophilus influenzae, eller er naturlig forekommende eller artifisielt modifisert varianter derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et rekombinant immunogenisk protein basert på det overflateeksponerte protein nevnt over, hvor aminosyrene i posisjon 1 til 21 av SEQ ID No.1 har blitt deletert eller erstattet av en eller flere aminosyrer. I en utførelse har aminosyrene i posisjon 1 til 21 av SEQ ID No.1 blitt erstattet av en sekvens av 0 til 21 valgfrie aminosyrer. I en annen utførelse har det rekombinante immunogene protein en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No. 2, eller et fragment, homolog, funksjonelt ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.3, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.4, eller et fragment, homolog, funksjonelt ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.5, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No 6, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.7, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.8, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.9, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No 10, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet anvendelse av minst et protein eller fragment eller peptid som beskrevet over for fremstilling av et medikament for profylakse eller behandling av en infeksjon. I en utførelse er infeksjonen forårsaket av Haemophilus influenzae, og i en ytterligere utførelse er Haemophilus influenzae innkapslet eller ikke-typebestembar. I en ytterligere utførelse er nevnte anvendelse for profylakse eller behandling av otitt media, sinusitt eller infeksjoner i lavere respirasjonskanal, i barn og likeledes i voksne, for eksempel med kronisk obstruktiv pulmonar sykdom (COPD).
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et medikament omfattende i det minste et protein, fragment eller peptid som beskrevet over og et eller flere farmasøytisk akseptable adjuvanter, vehikler, eksipienter, bindere, bærere, konserverende midler, bufringsmidler, emulsifiserende midler, fuktmidler eller transfeksjonsfremmende forbindelser.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en vaksinesammensetning omfattende minst et protein, fragment eller peptid som beskrevet over. I en utførelse omfatter nevnte vaksinesammensetning minst en di-, tri- eller multimer av nevnte protein, fragment eller peptid. I en ytterligere utførelse tilveiebringer vaksinesammensetningen ytterligere en eller flere farmasøytisk akseptable adjuvanter, vehikler, eksipienter, bindere, bærere, konserverende midler, bufringsmidler, emulsifiserende midler, fuktmidler eller transfeksjonsfremmende forbindelser. I ytterligere utførelser omfatter nevnte vaksinesammensetning minst en ytterligere vaksine, og i en ytterligere utførelse omfatter den en immunogenisk porsjon av et annet molekyl, hvor den immunogeniske porsjon av det andre molekyl kan velges fra gruppen omfattende Protein D av H. influenzae (EP 594610), MID av Moraxella catarrhalis (WO 03/004651, WO 97/41731 og WO96/34960), UspA1 eller UspA2 av Moraxella catarrhalis (WO93/03761), og yttermembran protein eller karbohydrat kapsel, av ethvert respirasjonskanalspatogen, eller DNA- oligonukleotider, så som CpG motiv.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en nukleinsyresekvens som koder for et protein, fragment eller peptid som beskrevet over, og likeledes homologe, polymorfismer, degenerater og spleisevarianter derav. I en utførelse er nevnte nukleinsyresekvens fusjonert til minst ett ytterligere gen.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et plasmid eller fag omfattende en nukleinsyresekvens som beskrevet over.
I en ytterligere utførelse vedrører foreliggende beskrivelse en ikke- human vert omfattende minst et plasmid som beskrevet over og i stand til å produsere et protein, fragment eller peptid som beskrevet over, og likeledes homologer, polymorfismer, degenerater og spleisevarianter derav, hvor verten er valgt blant bakterier, gjær og planter. I en utførelse er nevnte vert E. coli.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et fusjonsprotein eller et polypeptid, hvor et protein, fragment eller peptid som beskrevet over kombineres med minst ett ytterligere protein ved anvendelse av en rekombinant nukleinsyresekvens som beskrevet over. I en utførelse er nevnte fusjonsprotein en di-, tri eller multimer av et protein, fragment eller peptid som beskrevet over.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et fusjonsprodukt, hvor et protein, fragment eller peptid som beskrevet over er kovalent, eller ved annen måte, bundet til et protein, karbohydrat eller matriks.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for å isolere et protein, fragment eller peptid som beskrevet over, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene:
a) dyrke Haemophilus influenzae eller E. coli omfattende DNA som koder for nevnte protein, fragment eller peptid, høste bakteriene og isolere yttermembraner eller inklusjonslegemer;
b) solubilisere inklusjonslegemene med et sterkt solvatiserende middel; c) tilsette et renaturerende middel; og
d) dialysere den resulterende suspensjon mot en buffer med en pH på fra 8 til 10.
I en utførelse av nevnte fremgangsmåte er det solvatiserende middel guanidium hydroklorid, og i en ytterligere utførelse er det renaturerende middel arginin.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et medikament eller en vaksinesammensetning som beskrevet over, omfattende nevnte fusjonsprotein eller polypeptid, eller nevnte fusjonsprodukt.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for å hindre eller behandle en infeksjon i et individ omfattende å administrere en farmasøytisk effektiv mengde av et medikament eller en vaksinesammensetning som beskrevet over. I en utførelse er nevnte infeksjon forårsaket av Haemophilus influenzae, både innkapslet eller ikke-typebestembar, og i en ytterligere utførelse er infeksjonen valgt blant gruppen omfattende otitt media, sinusitt eller lavere respirasjonskanalsinfeksjoner.
Den foreliggende beskrivelse vedrører protein E, fortrinnsvis protein E polypeptider og protein E polynukleotider, rekombinante materialer og fremgangsmåter for deres produksjon.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet fremgangemåter for anvendelse av slike polypeptider og polynukleotider, inkluderende hindring og behandling av mikrobielle sykdommer, blant annet.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet diagnostisk analyse for å detektere sykdommer assosiert med mikrobielle infeksjoner og tilstander assosiert med slike infeksjoner, så som analyser for å detektere uttrykking eller aktivitet av protein E polynukleotider eller polypeptider.
Forskjellige forandringer og modifikasjoner innen rammen og ånden av foreliggende oppfinnelse vil være åpenbare for de fagkyndige innen fagfeltet ved lesing av de påfølgende beskrivelser og fra lesing av andre deler av foreliggende oppfinnelse.
Beskrivelse av figurene.
Fig. 1. Det 16,3 kDa Haemophilus influenzae protein E detekteres med et IgD(λ) myelom protein. I A, vises flowcytometrianalyse av pE ekspresjon i H. influenzae 772. SDS-PAGE og Western blot (B) og 2-dimensjonal SDS-polyakrylamid gel elektroforese analyser (C) av Empigen<®>-behandlet yttermembranproteiner av H. influenzae MinnA er vist. Andre membranproteinekstrakter er vist før (B) og etter separasjon på Q-Sepharose (C). Pilen i panel C indikerer den predikerte lokalisering for pE basert på et Western blot (ved anvendelse av IgD(λ) som en probe) på en korresponderende gel. I A ble bakterier applisert med IgD(λ) myelom protein etterfulgt av inkubering med kanin FITC-konjugert anti-IgD pAb og flow cytometri analyser. I B, vises en Coomassie blue farget SDS-gel (farget) og Western blot probet med human myeloma IgD(λ) etterfulgt av inkubering med pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-human IgD polyklonale antistoffer. Prøvene ble kokt i nærvær av 2-merkaptoetanol i 10 min før applisering.
Fig. 2. Flow cytometri profiler av pE-uttrykkende E. coli sammenlignet med H. influenzae 3655 villtype og en pE-manglende mutant. E. coli som bærer en tom pUC18 vektor (A) sammenlignes med bakterier transformert med pUC18 inneholdende genomisk DNA fra H. influenzae 772 (gener HI0175 til HI0178) (B). pE ekspresjon i ikke-typebestembar H. influenzae 3655 villtype (C) og den korresponderende mutant (D) er vist. E. coli stamme JM83 og H. influenzae fikk vokse i væskekulturer over natten. E. coli ble inkubert med human myeloma IgD(λ) på is. Etter 1 t og vaskinger ble FITC-konjugert kanin anti-humant IgD pAb tilsatt for ytterligere 30 min etterfulgt av vasketrinn og påfølgende flow cytometri analyse. Den samme prosedyre ble utført med H. influenzae 3655 eller den avledete pE mutant ved anvendelse av spesifikke kanin anti-pE polyklonale antistoff og FITC-konjugert geit anti-kanin pAb.
Fig. 3. pE ekspresjon av H. influenzae og relaterte arter som vist med flow cytometri og en IgD(λ) myelom serum.22 stammer av NTHi og 27 stammer av haemophilus arter eller beslektede bakterier ble analysert. Bakteriene fikk vokse til stasjonær fase og ble inkubert med en human myelom IgD(λ) på is. Etter 1 t og vaskinger ble FITC-konjugert kanin anti-human IgD polyklonale antistoff (pAb) tilsatt i ytterligere 30 min etterfulgt av vasketrinn og påfølgende flow cytometri analyse.
Fig. 4. pE uttrykkes i NTHi og innkapslet H. influenzae som vist med Western blot. Bakterielle proteiner fra de angitte stammer ble fremstilt ved anvendelse av Empigen<® >og underlagt en SDS-gel etterfulgt av Western blot probet med human myelom IgD(λ) og pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-human IgD polyklonalt pAb som deteksjonsantistoff.
Fig. 5. Rekombinant pE22-160 basert på sekvensen fra NTHi 772 sammenlignet med nativ pE fra H. influenzae MinnA. I A ble aminoterminalsekvens av pE-avdekket fragment A sammenlignet med den predikerte aminoterminale sekvens av nativt protein pE. I B vises en skjematisk illustrasjon av pE (A) med histidin markøren vist. I C vises størrelse og renhet på en Commassie-farget PAGE. I D og E, vises et yttermembran protein (OMP) ekstrakt fra H. influenzae MinnA sammenlignet med rekombinant produsert pE(A) i en Coomassie-farget gel og Western Blot, respektivt. I A ble signalpeptidsekvensen fjernet i tillegg til aminosyreenhet glutamin 21. Ni aminosyrer ble avledet fra ekspresjonsvektoren pET26(+) som angitt. Tallene representerte aminosyreposisjoner startende fra den translasjonale start av of pE. Rekombinant pE(A) ble produsert i E. coli, renset, og underlagt Edman-degradering for å analysere signalpeptidase spaltingssete. I D og E ble to geler kjørt samtidig, en ble farget med Coomassie brilliant blue og en ble blottet på Immobilon-P membraner, probet med human IgD(λ) myelom protein etterfulgt av inkubering med egnete pepperrot peroksidase- konjugerte sekundære antistoff. OMP-fraksjonen ble renset ved anvendelse av Empigen® som beskrevet i materialer og metoder.
Fig. 6. Protein E er ekstraordinært konservert. Frekvensen av punkmutasjoner i 13 til 31 Haemophilus influenzae stammer (Tabell 2) inkluderende både innkapslete og ikke-typebestembare isolater er vist. Resultatene ble oppnådd ved å sekvensere ved anvendelse av flankerende primere. Alle sekvenser ble sammenlignet til pE – sekvensen av H. influenzae Rd som ble anvendt som en referansesekvens og som er vist her.
Fig. 7. Den hydropatiske profil for pE. De hydrofobe og hydrofile deler av de individuelle aminosyreenheter er angitt. Det predikerte signalpeptid er også uthevet. Data ble oppnådd ved anvendelse av en standard metode som beskrevet (21) Fig. 8. SDS-PAGE som viser rekombinant pE22-160 (fragment A) og en serie trunkerte fragmenter angitt B til H. I A er en utheving av de forskjellige fragmenter vist, mens i B er en SDS-PAGE vist. DNA som koder for de forskjellige proteiner ble ligert inn i ekspresjonsvektor pET26(+) og rekombinant uttrykt i E. coli. Resulterende overuttrykte proteiner ble renset på nikkel resiner og underlagt separering på en SDS-PAGE etterfulgt av farging med Coomassie brilliant blue.
Fig. 9. En pE-manglende mutantstamme (NTHi 3655) har en 100 til 1,000-gangers lavere kapasitet for å indusere akutt otitt media i rotter. Infeksjon ble indusert i hannkjønn Sprague-Dawley rotter med et ventralt midtlinjeinnsnitt i halsen etterfulgt av injeksjon inn i midtre ørekavitet av de angitte antall bakterier i 0,05 ml. Dataene som er vist er fra dag 3 av utførelsen og er en representasjon av 5 dyr i hver gruppe.
Fig. 10. Gjennomsnittlige konsentrasjoner av IgG og IgA antistoff rettet mot pE i sera fra forskjellige ladersgrupper. Anti pE antistoff ble analysert med en sandwich ELISA ved anvendelse av rekombinant pE(A) som agn. Renheten av pE (A) var som indikert i fig 5.
Fig. 11 pE er ekstraordinært konservert innen forskjellige stammer av haemophilus. pE- genet ble sekvensert i kapslet H. influenzae type a (n=2), b (n=2), c (n=2), d (n=1), e (n=2), og f (n=3), NTHi (n=8), H. influenzae biovar aegypticus (n=6) og H. aegypticus (n=5), ved anvendelse av flankerende primere. Rd angir H. influenzae stamme Rd (Hi0178) og 772 angir NTHi stamme 772. Tallene 65 til 577 korresponderer til stammene som er angitt i Tabell 1.
Beskrivelse av oppfinnelsen.
Før foreliggende oppfinnelse blir beskrevet i detalj er det viktig å forstå at oppfinnelsen ikke er begrenset i denne søknad til detaljer av utførelsen av trinnene som er beskrevet heri. Eksemplene som nevnes er illustrerende for oppfinnelsen men skal ikke være begrensende på noen måte. Andre utførelser av oppfinnelsen er mulig og kan praktiseres eller utføres på en rekke måter. Det skal forstås at frasiologi og terminologisom benyttes heri er for formål å beskrive å ikke for å begrense.
Den foreliggende søknad beskriver kloning og ekspresjon av et nytt H. influenzae yttermembran protein angitt som protein E (pE). Proteinet ble oppdaget ved anvendelse av human IgD (λ) myelom serum med spesifikk affinitet for pE.
For å maksimere utbyttet av rekombinant pE ble et trunkert pE-fragment som består av aminosyreenheter lysin 22 til lysin 160 fremstilt. Det N-terminale signalpeptid inkluderende aminosyreglutamin 21 ble således fjernet og erstattet med et lederpeptid i tillegg til ni enheter som var fra vektoren pET26(+). Trunkatet pE (det vil si., pE22-160) ble angitt som pE(A).
Den foreliggende beskrivelse omfatter Haemophilus yttermembran protein pE og de pE- avledete peptider pE22-60, pE22-95, pE22-125, pE41-68, pE56-125, pE56-160, pE86-160, pE115-160, og di-, tri- eller oligomerer derav. Nærmere bestemt, sekvenser av pE eller de avledete peptider som er overflateeksponert er gitt en høyere prioritet.
Således, vaksinesammensetninger i samsvar med foreliggende beskrivelse omfatter som immunogeniske komponenter et overflateeksponert protein, som kan detekteres i alle Haemophilus influenzae, et immunogenisk fragment av nevnte overflateeksponerte protein, en rekombinant immunogenisk protein basert på nevnte overflateeksponerte protein, et rekombinant immunogenisk protein som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.2, og/eller et peptid som har en aminosyresekvens i samsvar med SEQ ID No.3- 10, eller et fragment, homolog, funksjonell ekvivalent, derivat, degenerat eller hydroksylering/sulfonering eller glykosyleringsprodukt eller annet sekundært prossiseringsprodukt derav.
Vaksinesammensetningene kan også omfatte et fusjonsprotein eller polypeptid, eller et fusjonsprodukt i samsvar med foreliggende beskrivelse som immunogeniske komponenter. De immunogeniske komponenter er i stand til å utløse et antistoff eller annen immunrespons til Haemophilus influenzae, hvor antistoffene som utløses inhiberer patogenese av Haemophilus influenzae bakterien til celler av individet. En ”immunogenisk dosering” av en vaksinesammensetning i samsvar med foreliggende beskrivelse er en som genererer, etter administrering, en detekterbar humoral og/eller cellulær immunrespons sammenlignet med en standard immunrespons før administrering.
Nukleinsekvensene som anvendes i vaksinesammensetningene ifølge foreliggende beskrivelse for å generere antigenet kan innsettes i enhver av et bredt spekter av ekspresjonsvektorer ved en rekke prosedyrer. Slike prosedyrer er innen kompetansen til den fagkyndige innen fagfeltet.
Vaksinesammensetninger kan alt i alt produseres ved anvendelse av kjente metoder og teknikker, og kan administreres på en rekke måter, fortrinnsvis parenteralt eller intranasalt. Formuleringer som er egnet for parenteral eller intranasal administrering inkluderer vandige og ikke- vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostata og løsninger som gjør formuleringen isoton med kroppsfluidet av det aktuelle individ.; og vandige og ikke- vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderende midler eller tykningsmidler. Den aktive immunogeniske ingredienser blandes ofte med eksipienter som er farmasøytisk akseptable, for eksempel vann, saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol eller lignende. I tillegg kan vaksinesammensetningen også inneholde mindre mengder av hjelpesubstanser så som fuktmidler eller emulsifiserende midler, pH- bufringsmidler, bindere, bærere eller konserverende midler.
Vaksinesammensetningene kan også inkludere adjuvanter for å forsterke immunogenisitet av sammensetningen, så som Freunds Adjuvanter og andre systemer kjent innen fagfeltet.
De immunogeniske komponenter av vaksinesammensetningene, det vil si proteinene, fragmentene, peptidene, fusjonsproteinene eller polypeptidene eller fusjonsproduktene ifølge foreliggende beskrivelse, kan formuleres i vaksinen i nøytral form eller i saltformer.
Doseringen av vaksinesammensetningene vil avhenge av den spesifikke aktivitet av vaksinen og kan enkelt bestemmes ved rutinemessig eksperimentering. Vaksinesammensetningene administreres i en slik mengde at de vil være terapeutisk effektive og immunogene, og mengden avhenger av individet.
Foreliggende beskrivelse vedrører protein E polypeptider og polynukleotider som beskrevet i større detalj nedenfor. Nærmere bestemt, beskrivelsen relaterer seg til polypeptider og polynukleotider av protein E av ikke-typebestembar H. Influenzae.
Protein E polypeptider har en signalsekvens og er eksponert ved overflaten av bakterien. Signalpeptidet er lokalisert fra enhet 1 til enhet 20 av protein E polypeptid En referanse til ”protein E” heri er en referanse til ethvert av peptidene, immunogene fragmenter, fusjoner, polypeptider eller proteiner ifølge beskrivelse diskutert heri (så som SEQ ID No.1 med eller uten signalsekvens). Et ”polynukleotid som koder for protein D” refererer til ethvert polynukleotidsekvens som koder for ethvert av peptidene, immunogene fragmenter, fusjoner, polypeptider eller proteiner ifølge oppfinnelsen diskutert heri.
Termen ”omfattende” heri kan alternativt substitueres med termen ”består av”: Beskrivelsen vedrører spesielt protein E polynukleotider og kodete polypeptider angitt heri.
Det skal forstås at sekvenser angitt i sekvenslisten nedenfor som ”DNA” representerer en eksemplifisering av en utførelse ifølge beskrivelsen, siden de med ordinær fagkunnskap vil anerkjenne at slike sekvenser kan nyttig benyttes i polynukleotider generelt, inkluderende ribopolynukleotider.
Sekvensene av protein E polynukleotider er angitt i SEQ ID NO: 11 (fra ntHi stamme 772).
Sekvensene av protein E kodete polypeptider er angitt i SEQ ID NO:1 (fra ntHi stamme 772), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
Polypeptider
I denne beskrivelsen er det også beskrevet polypeptider av H. influenzae (spesielt ikke-typebestembar H. influenzae) referert til heri som ”protein E” og protein E polypeptider og likeledes biologisk, diagnostisk, profylaktisk, klinisk eller terapeutiske nyttige varianter derav, og sammensetninger omfattende samme.
Foreliggende beskrivelse tilveiebringer videre:
(a) et isolert polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som har minst 85 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet, mer fortrinnsvis minst 95 % identitet, mer fortrinnsvis minst 97- 99 % eller eksakt identitet, til enhver av sekvensene ifølge SEQ ID No. 1- 10;
(b) et polypeptid som kodes for av et isolert polynukleotid omfattende en polynukleotidsekvens som har minst 85 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet, mer fortrinnsvis minst 95 % identitet, enda mer foretrukket minst 97- 99 % eller eksakt identitet til enhver av sekvensene SEQ ID No.11 over hele lengden av den selekterte sekvens av SEQ ID No. 0; eller
(c) et polypeptid som koder for et isolert polynukleotid omfattende en polynukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har minst 85 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet, foretrukket minst 95 % identitet, enda mer foretrukket minst 97-99 % eller eksakt identitet, til aminosyresekvensen av en av sekvensene SEQ ID No.
1- 10.
Protein E polypeptidene tilveiebrakt i SEQ ID No.1- 10 er protein E polypeptider fra …. H. influenzae stammer. Ytterligere protein E sekvenser har blitt tilveiebrakt fra H. influenzae stammer angitt i Tabell 1.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et immunogenisk fragment av et protein E polypeptid, det vil si en kontigøs porsjon av protein E polypeptider som har den samme eller i hovedsak den samme immunogeniske aktivitet som polypeptidet omfattende korresponderende aminosyresekvens valgt blant SEQ ID No.1- 10; det vil si, fragmentet (dersom nødvendig idet den kobles til bæreren) er i stand til å reise en immunrespons som gjenkjenner protein E polypeptid. Alternativt, eller i tillegg, det immunogeniske fragment kan opprettholde en IgD bindings funksjon av fullengdeproteinet (som beskrevet i eksempelseksjonen, for eksempel evne til å binde IgD(λ) fra The Binding Site (Birmingham, England). Et slikt immunogenisk fragment kan inkludere, for eksempel, protein E polypeptid som mangler en N-terminal ledersekvens, og/eller et transmembrandomene og/eller en C-terminal forankringsdomene. I et foretrukket aspekt omfatter det immunogeniske fragment eller protein E i samsvar med beskrivelsen i hovedsak hele det ekstracellulære domene av et polypeptid som har minst 85 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet, mer foretrukket minst 95 % identitet, mer foretrukket minst 97- 99 % identitet, til en sekvens valgt blant SEQ ID No.1- 10 over hele lengden av nevnte sekvens.
Et fragment av et polypeptid som har en aminosyresekvens som er fullstendig den samme som en del av men ikke hele av aminosyresekvensen av et polypeptid ifølge beskrivelsen. Som med protein E polypeptider, fragmenter kan være ”frittstående” eller være omfattet innen et større polypeptid eller de kan være del av en region, mest fortrinnsvis som en enkelt kontigøs region i et enkelt større polypeptid. Et fragment kan derfor være kortere enn fullengde nativ sekvens, eller, dersom det er innen et større polypeptid, kan være en fullengde nativ sekvens eller et lengre fusjonsprotein.
Foretrukne fragmenter inkluderer for eksempel, trunkerings polypeptider som har en porsjon av en aminosyresekvens valgt blant SEQ ID No: 1-10, eller varianter derav, så som en kontigøs serie av enheter som inkluderer en amino- og/eller karboksylterminal aminosyresekvens. Degraderingsformer av polypeptidene ifølge beskrivelsen produsert av eller i en vertscelle, er også foretrukket. Ytterligere foretrukket er fragmenter karakterisert med strukturelle eller funksjonelle egenskaper så som fragmenter som omfatter alfa-heliks og alfa-heliks dannende regioner, beta ark og beta ark dannende regioner, snu og snudannende regioner, kveil og kveildannende regioner, hydrofile regioner, hydrofobe regioner, alfa amfifatiske regioner, beta amfifatiske regioner, fleksible regioner, overflatedannende regioner, substratbindende regioner, og høye antigeniske indeksregioner.
Ytterligere foretrukne fragmenter inkluderer et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens som har minst 15, 20, 30, 40, 50 eller 100 kontigøse aminosyrer fra en aminosyre valgt blant SEQ ID No.1- 10 eller et isolert polypeptid omfattende en aminosyresekvens som har minst 15, 20, 30, 40, 50 eller 100 kontigøse aminosyrer trunkert eller deletert fra en aminosyresekvens valgt blant SEQ ID No.1-10.
Ytterligere foretrukne fragmenter er de som omfatter en B- celle epitop, for eksempel fragmenter/peptider beskrevet i eksempel 10.
Fragmenter av polypeptidene ifølge beskrivelsen kan benyttes for å produsere den korresponderende fullengde polypeptid med peptidsyntese, og derfor kan disse fragmenter benyttes som mellomprodukt for å produsere fullengdepeptider ifølge oppfinnelsen.
Spesielt foretrukket er varianter hvor flere, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 eller 1 aminosyrer er substituert, deletert, eller tilføyd i enhver kombinasjon.
Polypeptidene, eller immunogene fragmenter, ifølge beskrivelsen kan være i form av ”modent” protein eller kan være del av et større protein så som en forløper eller et fusjonsprotein. Det er ofte fordelaktig å inkludere en ytterligere aminosyresekvens som inneholder sekretoriske eller ledersekvenser, prosekvenser, sekvenser som hjelper til med rensing så som multiple histidinenheter, eller en ytterligere sekvens for stabilitet under rekombinant produksjon. Videre, tilsetning av eksogent polypeptid eller lipidhale eller polynukleotidsekvenser for å øke det immunogene potensiale til det finale molekyl vurderes også.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet genetisk konstruerte løselige fusjonsproteiner omfattende et polypeptid ifølge oppfinnelsen, eller et fragment derav, og forskjellige porsjoner av de konstante regioner av tung- eller lettkjeder av immunoglobuliner av forskjellige underklasser (IgG, IgM, IgA, IgE). Foretrukket som et immunglobulin er den konstante del av tungkjeden av human IgG, fortrinnsvis IgG1, hvor fusjon foregår ved hinge-region. I en bestemt utførelse kan Fc- delen enkelt fjernes ved inkorporering av en spaltingssekvens som kan spaltes med blodklottingsfaktor Xa.
Videre, i denne beskrivelsen er det også beskrevet fremgangsmåter for fremstilling av disse fusjonsproteiner med genetisk konstruksjon, og anvendelse derav for medikamentscreening, diagnose og terapi. I denne beskrivelsen er det også beskrevetpolynukleotider som koder for slike fusjonsproteiner. Eksempler på fusjonsprotein teknologi kan finnes i Internasjonal patentsøknad WO94/29458 og WO94/22914.
Proteinene kan være kjemisk konjugert, eller uttrykkes som rekombinante fusjonsproteiner som muliggjør produksjon av økete nivåer i et ekspresjonssystem sammenlignet med ikke- fusjonert protein. Fusjonspartneren kan assistere i å tilveiebringe T- hjelper epitoper (immunologisk fusjonspartner), fortrinnsvis T- hjelper epitoper so gjenkjennes av mennesker, eller assistere i uttrykking av protein-(ekspresjonsforsterker) ved høyere utbytter enn det native rekombinante protein. Fortrinnsvis vil fusjonspartneren være både en immunologisk fusjonspartner og ekspresjonsforsterkende partner.
Fusjonspartnere inkluderer protein D fra Haemophilus influenzae (EP 594610) og ikke- strukturelt protein fra influenza virus, NS1 (hemaglutinin). En annen fusjonspartner er proteinet kjent som Omp26 (WO 97/01638). EN annen fusjonspartner er proteinet kjent som LytA. Fortrinnsvis anvendes den C- terminale porsjon av molekylet. LytA er avledet fra Streptococcus pneumoniae som syntetiserer en N-acetyl-L-alanin amidas, amidas LytA, (kodet for lytA gene {Gene, 43 (1986) side 265-272}) et autolysin som spesifikt degraderer visse bindinger i peptidoglykan backbone. Det Cterminale domene av LytA proteinet er ansvarlig for affiniteten til kolin eller til noen kolinanaloger så som DEAE. Denne egenskap har blitt benyttet for utvikling av E.coli C-LytA uttrykkende plasmider som er nyttige for ekspresjon av fusjonsproteiner.
Rensing av hybridproteiner inneholder C-LytA fragmentet ved dets aminoterminus som har blitt beskrevet i {Biotechnology: 10, (1992) side 795-798}. Det er mulig å anvende den repeterende porsjon av LytA molekylet funnet i C- terminal ende startende ved enhet 178, for eksempel enheter 188 - 305.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer også varianter av ovenfor nevnte polypeptider, det vil si polypeptider som varierer fra referentene med konservative aminosyresubstitueringer, hvor en rest substitueres med en annen med like karakteregenskaper. Typisk er slike substitueringer blant Ala, Val, Leu og Ile; blant Ser og Thr; blant sure enheter Asp og Glu; blant Asn og Gln; og blant de basiske enheter Lys og Arg; eller aromatiske enheter Phe og Tyr.
Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på enhver egnet måte. Slike polypeptider inkluderer isolerte naturlig forekommende polypeptider, rekombinant produserte polypeptider, syntetisk produserte polypeptider, eller polypeptider produsert ved en kombinasjon av disse metoder. Fremgangsmåter for å fremstille slike polypeptider er innen kompetansen i fagfeltet.
Det er mest foretrukket at et polypeptid ifølge oppfinnelsen er avledet fra ikketypebestembar H. influenzae, imidlertid kan det være foretrukket oppnådd fra andre organismer av samme taksonomiske genus. Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan også oppnås, for eksempel fra organismer av den samme taksonomiske familie eller orden.
Polynukleotider.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet polynukleotider som koder for protein E polypeptider, fortrinnsvis polynukleotider som koder for polypeptidene angitt heri som protein E.
I en spesielt foretrukket utførelse omfatter polynukleotidene en region som koder for protein E polypeptider omfattende sekvenser angitt i SEQ ID NO: 11 som inkluderer fullengde genet, eller en variant derav.
Protein E polynukleotidet gitt i SEQ ID NO: 11 er protein E polynukleotider fra ikke-typebestembar H. influenzae stamme 772. Andre sekvenser har blitt bestemt fra gener som koder for protein E fra H. influenzae stammer angitt i Tabell 1.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet isolerte nukleinsyremolekyler som koder og/eller uttrykker protein E polypeptider og polynukleotider, fortrinnsvis ikke-typebestembar H. influenzae protein E polypeptider og polynukleotider, inkluderende for eksempel ikke- prosiserte RNAer, ribozym RNAer, mRNAer, cDNAer, genomiske DNAer, B- og Z-DNAer. Ytterligere utførelser inkluderer biologisk, diagnostisk, profylaktisk, klinisk eller terapeutisk nyttige polynukleotider og polypeptider, og varianter derav, og sammensetninger omfattende samme.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet isolerte polynukleotider, inkluderende minst en fullengde gen, som koder for et protein E polypeptid som har en dedusert aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 1-10 og polynukleotider som er nært beslektet dertil og varianter derav.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet protein E polypeptid fra ikketypebestembar H. influenzae omfattende eller som består av en aminosyresekvens valgt blant SEQ ID NO: 1-10 eller en variant derav.
Ved anvendelse av informasjonen som er tilveiebrakt heri, så som polynukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 11, kan et polynukleotid ifølge beskrivelsen som koder for protein E polypeptider oppnås ved anvendelse av standard kloning og screeningsmetoder, så som de for kloning og sekvensering av kromosomale DNA- fragmenter fra bakterier ved anvendelse av ikke-typebestembar H. influenzae stamme 3224A (eller 772) celler som utgangsmateriale, etterfulgt av å oppnå en fullengde klon. For eksempel, for å oppnå en polynukleotidsekvens ifølge beskrivelsen, så som en polynukleotidsekvens gitt i SEQ ID NO: 0, blir typisk et bibliotek av kloner av kromosomal DNA av ikke-typebestembar H. influenzae stamme 3224A (eller 772) i E.coli eller en annen egnet vert probet med en radiomerket oligonukleotid, fortrinnsvis en 17-mer eller lengre, avledet fra en partiell sekvens. Kloner som bærer DNA som er identiske til proben kan deretter skilles ved anvendelse av stringente hybridiseringsbetingelser. Ved å sekvensere de individuelle kloner som identifiseres med hybridisering med sekvenseringsprimere konstruert fra det opprinnelige polypeptid eller polynukleotidsekvens er det deretter mulig å forlenge polynukleotidsekvensen i begge retninger for å bestemme et fullengde gensekvens. Hensiktsmessig, slik sekvensering utføres for eksempel ved anvendelse av denaturert dobbelttrådet DNA fremstilt fra en plasmidklon. Egnete teknikker er beskrevet i Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). (se spesielt Screening By Hybridization 1.90 og Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Direkte genomisk DNA- sekvensering kan også utføres for å oppnå et fullengde gensekvens. Som illustrerende for oppfinnelsen ble polynukleotidet angitt i SEQ ID NO: 11 oppdaget i et DNA- bibliotek avledet fra ikke-typebestembar H. influenzae.
Videre, hver DNA- sekvens angitt i SEQ ID NO: 11 inneholder en åpen leseramme som koder for et protein som har ca antallet aminosyreenheter som er angitt i SEQ ID NO: 1 med en dedusert molekylvekt som kan beregnes ved anvendelse av aminosyreenheters molekylvektverdier som er kjent for de fagkyndige innen feltet.
Polynukleotidene ifølge SEQ ID NO: 0, mellom startkoder og stoppkoden koder respektivt for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et isolert polynukleotid omfattende eller bestående av:
(a) en polynukleotidsekvens som har minst 85 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet, mer foretrukket minst 95 % identitet, enda mer foretrukket minst 97- 99 % eller eksakt identitet, til en polynukleotidsekvens fra SEQ ID NO: 11 over hele lengden av polynukleotidsekvensen fra SEQ ID NO: 0; eller
(b) en polynukleotidsekvens som koder for et polypeptid som har minst 85 % identitet, fortrinnsvis minst 90 % identitet, mer foretrukket minst 95 % identitet, enda mer foretrukket minst 97- 99 % eller 100 % eksakt identitet, til en amin valgt blant SEQ ID NO: 1-10 (eller fragment derav), over hele lengden av aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 1-10 (eller fragment).
Et polynukleotid som koder for et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderende homologer og ortologer fra arter andre enn ikke-typebestembar H. influenzae, kan oppnås med en fremgangsmåte som omfatter trinnene å skreene et egnet bibliotek under stringente hybridiseringsbetingelser (for eksempel ved anvendelse av en temperatur i området 45- 65 °C og en SDS konsentrasjon fra 0,1 – 1 %) med en merket eller detekterbar probe bestående av eller omfattende enhver sekvens valgt blant SEQ ID NO: 11 eller et fragment derav: og isolere en fullengde gen og/eller genomiske kloner bestående av nevnte polynukleotidsekvens.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en polynukleotidsekvens identisk over hele dets lengde til en kodesekvens (åpen leseramme) angitt i SEQ ID NO: 11. Også tilveiebrakt ifølge beskrivelsen er en kodesekvens for et modent polypeptid eller fragment derav, i seg selv, og likeledes en kodesekvens for et modent polypeptid eller et fragment i leserammen med en annen kodesekvens, så som en sekvens som koder for en leder eller sekretorisk sekvens, en pre- , eller pro- eller prepro- proteinsekvens.
Polynukleotidet ifølge beskrivelsen kan også inneholde minst en ikke- kodende sekvens, inkluderende for eksempel, men ikke begrenset til minst en ikke- kodende 5’ og 3’ sekvens, så som den transkriberte men ikke- translaterte sekvenser, termineringssignaler (så som rho-avhengig og rho-uavhengig termineringssignaler), ribosom bindingsseter, Kozak sekvenser, sekvenser som stabiliserer mRNA, introner og polyadenyleringssignaler. Polynukleotidsekvensen kan også omfatte ytterligere kodesekvens som koder for ytterligere aminosyrer. For eksempel kan en markørsekvens som fremmer rensing av det fusjonerte polypeptid kodes for. I visse utførelser er markørsekvensen en heksahistidinpeptid, som tilveiebrakt i pQE vektoren (Qiagen, Inc.) og beskrevet i Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), eller en HA peptid tag (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), som begge kan være nyttige i rensing av polypeptidsekvens fusjonert til disse. Polynukleotidet ifølge beskrivelsen inkluderer også, men er ikke begrenset til, polynukleotider som omfatter et strukturgen og dets naturlige assosierte sekvenser som regulerer genekspresjon.
Nukleotidsekvensen som koder for protein E polypeptid ifølge SEQ ID NO: 1-10 kan være identisk til det korresponderende polynukleotid som koder for sekvensen SEQ ID NO: 11 (eller omfattet innen SEQ ID NO: 11 ). Alternativt kan det være enhver sekvens, som et resultat av redundans/degenerasitet av den genetiske kode, også koder for et polypeptid ifølge SEQ ID NO: 1-10.
Termen ”polynukleotid som koder for et polypeptid” som anvendt heri omfatter polynukleotidet som inkluderer en sekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et bakterielt polypeptid og mer fortrinnsvis et polypeptid av ikketypebestembar H. influenzae protein E som har en aminosyresekvens som angitt i en av sekvensene SEQ ID NO: 1-10 eller fragmenter derav. Termen omfatter også polynukleotider som inkluderer en enkelt kontigøs region eller diskontinuerlige regioner som koder for polypeptider (for eksempel polynukleotider som er avbrutt av integrert fag, en integrert innskuddsekvens, en integrert vektorsekvens, en integrert transkripsjonssekvens, eller som skyldes RNA- editering eller genomisk DNA reorganisering) sammen med ytterligere regioner, som også kan inneholde kodene og/eller ikke- kodende sekvenser.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet videre varianter av polynukleotidene beskrevet heri som koder for varianter av et polypeptid som har en dedusert aminosyresekvens av en av sekvensene ifølge SEQ ID NO: 1-10. Fragmenter av polynukleotidene ifølge beskrivelsen kan anvendes for eksempel for å syntetisere fullengde polynukleotider ifølge oppfinnelsen.
Foretrukne fragmenter er de polynukleotider som koder for en B- celle epitop, for eksempel fragmentene/peptidene beskrevet i eksempel 10, og rekombinante, kimeriske gener omfattende nevnte polynukleotidfragmenter.
Ytterligere spesielt foretrukne utførelser er polynukleotider som koder for protein E varianter, som kan ha aminosyresekvensen av protein E polypeptid av en av sekvensene fra SEQ ID NO: 1-10 hvor flere, noen få, 5 til 10, 1 til 5, 1 til 3, 2, 1 eller ingen aminosyreenheter er substituert, modifisert, deletert og/eller tilføyd, i enhver kombinasjon. Spesielt foretrukket blant disse er stille substitueringer, addisjoner og deleteringer, som ikke forandrer på egenskapene og aktivitetene av protein E polypeptid (for eksempel de egenskaper som er beskrevet i eksempelseksjonen heri).
Ytterligere foretrukne utførelser er polynukleotider som er minst 85 % identiske over deres hele lengde til polynukleotider som koder for protein E polypeptider som har en aminosyresekvens som angitt i en av sekvensene ifølge SEQ ID NO: 1-10 , og polynukleotider som er komplementære til slike polynukleotider. Alternativt, mest foretrukket er polynukleotidet som omfatter en region som er minst 90 % identiske over dets hele lengde til polynukleotider som koder for protein E polypeptider og polynukleotider som er komplementære dertil. I denne sammenheng er polynukleotider som er minst 95 % identiske over deres hele lengde til samme spesielt foretrukket.
Videre, de med minst 97 % er sterkt foretrukket og de med minst 95 %, blant disse de med minst 98 % og minst 97 % er spesielt foretrukket, med minst 99 % som mest foretrukket.
Foretrukne utførelser er polynukleotider som koder for polypeptider som opprettholder i hovedsak den samme biologiske funksjon eller aktivitet som det modne polypeptid som kodes for av en DNA- sekvens valgt blant SEQ ID NO: 11 (for eksempel de aktiviteter som er beskrevet i eksempelseksjonen heri).
I samsvar med visse foretrukne utførelser av tilveiebringes polynukleotider som hybridiserer, fortrinnsvis under stringente betingelser, til protein E polynukleotidsekvenser, så som polynukleotidene ifølge SEQ ID NO: 11.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet polynukleotider som hybridiserer til polynukleotidsekvensene tilveiebrakt heri. I denne sammenheng vedrører beskrivelsen spesielt polynukleotider som hybridiserer under stringente betingelser til polynukleotidene beskrevet heri. Som anvendt heri, termene ”stringente betingelser” og ”stringente hybridiseringsbetingelser” betyr av hybridisering foregår kun dersom der er minst 95 % og fortrinnsvis minst 97 % identitet mellom sekvensene. Et spesifikt eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser er inkubering over natten ved 42 °C i en løsning omfattende: 50 % formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisnatrium sitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5 x Denhardt's løsning, 10 % dekstransulfat, og 20 mikrogram/ml denaturert, kuttet laksesperm DNA, etterfulgt av vasking av hybridiseringsstøtte i 0,1 x SSC ved ca 65 ºC. Hybridiserings- og vaskebetingelser er godt kjent og eksemplifisert i Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), fortrinnsvis kapittel 11 deri. Løsningshybridisering kan også anvendes med polynukleotidsekvensene tilveiebrakt ifølge beskrivelsen.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet et polynukleotid bestående av eller omfattende et polynukleotidsekvens oppnådd ved screening av et egnet bibliotek inneholdende det komplette gen for en polynukleotidsekvens angitt i en av sekvensene i SEQ ID NO: 11 under stringente hybridiseringsbetingelser ved en probe som har sekvensene av nevnte polynukleotidsekvens angitt i den korresponderende sekvens av SEQ ID NO: 11 eller et fragment derav: og isolere nevnte polynukleotidsekvens. Fragmenter som er nyttige for å oppnå en slik polynukleotid inkluderer for eksempel prober og primere som er beskrevet annet sted heri.
Som diskutert annet sted heri ved hensyn til polynukleotidanalyser, for eksempel polynukleotidene ifølge beskrivelsen, kan anvendes som en hybridiseringsprobe for RNA, cDNA og genomisk DNA for å isolere fullengde cDNAer og genomiske kloner som koder for protein E og for å isolere cDNA og genomiske kloner av andre gener som har en høy identitet, fortrinnsvis høy sekvensidentitet, til protein E genene. Slike prober vil generelt omfatte minst 15 nukleotidenheter eller basepar. Fortrinnsvis vil slike prober ha minst 30 nukleotidenheter eller basepar og kan ha minst 50 nukleotidenheter eller basepar. Spesielt foretrukne prober vil ha minst 20 nukleotidenheter eller basepar og vil ha mindre enn 30 nukleotidenheter eller basepar.
En kodende region av protein E gener kan isoleres ved å skreene ved anvendelse av en DNA-sekvens tilveiebrakt i SEQ ID NO: 11 for å syntetisere en oligonukleotidprobe. En merket oligonukleotid som har en sekvenskomplementaritet til genet anvendes deretter for å skreene et bibliotek av cDNA, genomisk DNA eller mRNA for å bestemme de medlemmer av biblioteket som proben hybridiserer til.
Der er flere metoder tilgjengelig og godt kjent for de fagkyndige innen fagfeltet for å oppnå fullengde DNAer, eller for å forlenge korte DNAer, for eksempel de som er basert på metoden ifølge Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) (see, for example, Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Recent modifications of the technique, exemplified by the Marathon ™ technology (Clontech Laboratories Inc.) for eksempel har signifikant forenklet søket for lengre cDNAer.i Marathon ™ technology, kan cDNAer fremstilles fra mRNA ekstrahert fra et valgt vev og en ”adaptor ”sekvens ligert på hver ende. Nukleinsyremangfoldiggjøring (PCR) blir deretter utført for å mangfoldiggjøre den ”manglende” 5'-enden av DNAen ved anvendelse av en kombinasjon av genspesifikke og adaptorspesifikke oligonukleotid primere. PCR- reaksjonen blir deretter repetert ved anvendelse av ”nestere” primere, det vil si primere konstruert for å annile innen det mangfoldiggjorte produkt (typisk en adaptor spesifikk primer som anniler ytterligere 3' i adaptorsekvensen og en genspesifikk primer som anniler ytterligere 5' i den utvalgte gensekvens). Produktene av denne reaksjon kan deretter analyseres med DNA sekvensering og et fullengde DNA konstruert enten ved å koble produktet direkte til det eksisterende DNA for å gi en komplett sekvens, eller ved å utføre en separat fullengde PCR ved anvendelse av den nye sekvensinformasjon for konstruksjon av 5' primeren.
Polynukleotidene og polypeptidene kan benyttes, for eksempel som forskningsreagenser og materialer for å oppdage behandlinger for, og diagnostiske midler for sykdommer, fortrinnsvis sykdommer hos menneske, som ytterligere beskrevet heri relatert til polynukleotid analyser.
Polynukleotidene som er oligonukleotider avledet fra en sekvens av SEQ ID NO: 11 kan anvendes i prosessene heri som beskrevet, men fortrinnsvis for PCA, for å bestemme om eller ikke polynukleotidene identifiseres heri i hele eller delvis er transkribert i bakterier i infisert vev. Det anerkjennes at slike sekvenser også vil ha anvendelse i diagnose av infeksjonsstadium og type infeksjon patogenet har oppnådd.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet polynukleotider som koder for et polypeptid som er det modne protein pluss ytterligere amino- eller karboksylterminale aminosyrer, eller aminosyrer innen det modne polypeptid (idet den modne form har mer enn 1 polypeptidkjede, for eksempel). Slike sekvenser kan spille en funksjon i prossisering av et protein fra forløper til en moden form, kan muliggjøre proteintransport, kan forlenge eller forkorte protein halveringstid eller kan fremme manipulering av et protein for analyser eller produksjon, blant annet. Som generelt tilfellet er in vivo kan de ytterligere aminosyrer prossiseres bort fra det modne protein med cellulære enzymer.
For hver og alle polynukleotidene tilveiebringes et polynukleotid som er komplementært til dette. Det er foretrukket at disse komplementære polynukleotider er fullstendig komplementære til hvert polynukleotid fra hvilke de er komplementære til.
Et forløper protein, som har en moden form av polypeptidet fusjonert til en eller flere prosekvenser kan være en inaktiv form av polypeptidet. Idet prosekvensene fjernes blir slike inaktive forløpere generelt aktivert. Noen eller alle av prosekvensene kan fjernes før aktivering. Generelt benevnes slike forløpere for proproteiner.
I tillegg til standardene A, G, C, T/U representasjonene for nukleotider kan termen ”N” også anvendes for å beskrive visse polynukleotider. ”N” angir at enhver av de fire DNA- eller RNA- nukleotider kan fremkomme i en slik angitt posisjon i DNA-eller RNA- sekvensen, med unntak av det er foretrukket at N ikke er en nukleinsyre som idet den tas i kombinasjon med tilgrensende nukleotidposisjoner, idet den leses i den korrekte leseramme, vil ha effekten av å generere et prematurt termineringskolon i en slik leseramme.
I sum, et polynukleotid kan kode for et modent protein, et modent protein pluss en ledersekvens (som kan refereres til som et preprotein), en forløper av et modent protein som har en eller flere prosekvenser som ikke er ledersekvenser av et preprotein, eller et preproprotein, som er en forløper til et proprotein, som har en ledersekvens og en eller flere prosekvenser, som generelt fjernes under prossiseringstrinn som produserer aktive og modne former av polypeptidet.
I denne beskrivelsen er det også beskrevetanvendelse av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen for terapeutiske eller profylaktiske formål, fortrinnsvis for genetisk immunisering.
Anvendelse av et polynukleotid for genetisk immunisering vil fortrinnsvis benytte en egnet avleveringsmetode så som direkte injisering av plasmid DNA til muskel (Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), avgivelse av DNA kompleksert med spesifikke proteinbærere (Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), kopresipitering av DNA med kalsiumfosfat (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), innkapsling av DNA i forskjellige former av liposomer (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), partikkel bombardering (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) og in vivo infeksjon ved anvendelse av klonete retrovirale vektorer (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).
Vektorer, Verts celler, Ekspresjonssystem
I denne beskrivelsen er det også beskrevet vektorer som omfatter et polynukleotid eller polynukleotider ifølge oppfinnelsen, verts celler som er genetisk konstruert med vektorer og produksjon av polypeptider ifølge oppfinnelsen med rekombinante teknikker. Cellefrie translasjonssystemer kan også benyttes for å produsere slike proteiner ved anvendelse av RNAer avledet fra DNA- konstrukter.
Rekombinante polypeptider ifølge oppfinnelsen kan fremstilles med prosesser godt kjent for de fagkyndige innen feltet, fra genetisk konstruerte verts celler omfattende ekspresjonssystemer. Således, i et ytterligere aspekt, vedrører foreliggende oppfinnelse ekspresjonssystemer som omfatter et polynukleotid eller polynukleotider ifølge oppfinnelsen, vertssystemer som er genetisk konstruert med slike ekspresjonssystemer, og produksjon av polynukleotider ifølge oppfinnelsen med rekombinante teknikker.
For rekombinant produksjon av polypeptidene ifølge beskrivelsen kan verts celler generelt konstrueres til å inkorporere ekspresjonssystemer eller porsjoner derav eller polynukleotider. Introdusering av et polynukleotid inn i en verts celle kan effektueres med fremgangsmåter beskrevet i mange standard laboratoriemanualer, så som Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) og Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), så som kalsiumfosfat transfeksjon, DEAE-dekstran mediert transfeksjon, transfeksjon, mikroinjeksjon, kationisk lipidmediert transfeksjon, elektroporering, konjugering, transduksjon, skrapeapplisering, ballistisk introdusering og infeksjon.
Representative eksempler på egnete verter inkluderer bakterieceller, så som celler av streptococci, stafylococci, enterococci, E. coli, streptomyces, cyanobacteria, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae og Moraxella catarrhalis; soppceller, så som celler av gjær, Kluveromyces, Saccharomyces, Pichia, en basidiomycete, Candida albicans og Aspergillus; insektsceller så som celler av Drosophila S2 og Spodoptera Sf9; animalske celler så som CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 og Bowes melanoma celler; og planteceller så som celler av gymnosperm eller angiosperm.
En stor variasjon av ekspresjonssystemer kan anvendes for å produsere polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Slike vektorer inkluderer, blant andre, kromosomale, episomale og virusavledete vektorer, for eksempel vektorer avledet fra bakterielle plasmider, fra bakteriofag, fra transposoner, fra gjærepisomer, fra innskuddselementer, fra kromosomale elementer fra gjær, fra virus som baculovirus, papova virus, så som SV40, vaccinia virus, adenovirus, fugle poks virus, pseudorabies virus, picornavirus, retrovirus, og alfavirus og vektorer avledet fra kombinasjoner derav, så som de som er avledet fra plasmid og bakteriofag genetiske elementer, så som kosmider og fargemider. Ekspresjonssystem konstruktene kan inneholde kontrollregioner som regulerer og likeledes fremkaller ekspresjon. Generelt, ethvert system eller vektor egnet for å opprettholde, propagere eller uttrykke polypeptider og/eller for å uttrykket et polypeptid i en vert kan anvendes for ekspresjon i denne sammenheng. Den egnete DNA-sekvens kan innsettes i ekspresjonssystemet med en rekke godt kjente rutinemessige teknikker, så som for eksempel de som er angitt i Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).
I rekombinante ekspresjonssystemer i eukaryote kan det innsettes egnete sekresjonssignaler inn i det uttrykte polypeptid for sekresjon av et translatert protein inn i lumen i endoplasmatisk retukilum, inn i det plasmatiske rom eller inn i det ekstracellulære miljø.
Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan gjenvinnes og renses for rekombinante cellekulturer med godt kjente metoder inkluderende ammoniumsulfat- eller etanolpresipitering, sur ekstrahering, anion eller kation utbyttekromatografi, fosforcellulose kromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, affinitetskromatografi, hydroksylapatitt kromatografi og lektin kromatografi. Mer fortrinnsvis, ionemetall affinitetskromatografi (IMAC) benyttes for rensing. Godt kjente teknikker for å refolde proteinet kan benyttes for å regenerere aktiv konformasjon idet polynukleotidet er denaturert under den intracellulære syntese, isolering og/rensing.
Ekspresjonssystemet kan også være et rekombinant levende mikroorganisme, så som en virus eller bakterie. Det aktuelle gen kan innsettes inn i genomet av en levende rekombinant virus eller bakterie. Innokkulering og in vivo infeksjon med denne levende vektor vil føre til in vivo ekspresjon av antigenet og induksjon av immunresponser. Virus og bakterier anvendt for dette formål er for eksempel: poksvirus (for eksempel; vaccinia, fuglepoks, canarypoks), alfavirus (Sindbis virus, Semliki Forest Virus, Venezuelian heste Encephalitis Virus), adenovirus, adenoassosiert virus, picornavirus (poliovirus, rhinovirus), herpesvirus (varicella zoster virus, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG, streptococci. Disse virus og bakterier kan være virulente, eller attenuert på forskjellige måter for å oppnå levende vaksiner. Slike levende vaksiner er også en del av oppfinnelsen.
Diagnostiske, prognostiske, Serotyping og Mutasjonsanalyser.
I denne beskrivelsen er det også beskrevetanvendelse av protein E polynukleotider og polypeptider for anvendelse som diagnostiske reagenser. Deteksjon av protein E polynukleotider og/eller polypeptider i en aukariot, fortrinnsvis et pattedyr, og spesielt menneske, vil tilveiebringe en diagnostisk metode for å diagnostisere en sykdom, fase i sykdommen eller respons for et infeksiøst organisme til medikament. Aukariote, fortrinnsvis pattedyr, og spesielt mennesker, spesielt de som er infisert eller forventes å bli infisert med en organisme omfattende protein E gener eller proteiner, kan detekteres for nukleinsyre- eller aminosyrenivå med en rekke godt kjente teknikker og likeledes fremgangsmåter tilveiebrakt heri.
Polypeptider og polynukleotider for prognose, diagnose eller andre analyser kan oppnås fra en putativt infisert og/eller infisert individs kroppsmaterialer. Polynukleotider fra enhver av disse kilder, fortrinnsvis DNA eller RNA, kan anvendes direkte for deteksjon eller kan mangfoldiggjøres enzymatisk ved anvendelse av PCR eller en annen mangfoldiggjøringsteknikk for analyser. RNA, fortrinnsvis mRNA, cDNA og genomisk DNA kan også anvendes på samme måte. Ved anvendelse av mangfoldiggjøring kan karakterisering av spesis og stamme av infeksiøst eller residerende organisme som foreligger i et individ, utføres med analysering av genotype av et selektert polynukleotid for organismen. Deletering og innskudd kan detekteres med en forandring i størrelse av det mangfoldiggjorte produkt sammenlignet med en genotype av en referanse sekvens valgt blant en beslektet organisme, fortrinnsvis en forskjellig art av samme genus eller en forskjellig stamme av samme art. Punktmutasjoner kan identifiseres med hybridisering av mangfoldiggjort DNA til merket protein E polynukleotidsekvenser. Perfekt eller signifikant matchete sekvenser kan skille fra ikke- perfekt eller mer signifikant miss matchete duplekser med genase eller RNase oppkutting, for DNA eller RNA, respektivt, eller ved å detektere forskjeller i smeltetemperaturer eller renatureringsgenetikk. Polynukleotidsekvens forskjeller kan også detekteres ved alterering i elektroforetisk mobilitet av polynukleotidfragmenter i geler sammenlignet med en referansesekvens. Dette kan utføres med eller uten denaturerende midler. Polynukleotid forskjeller kan også detekteres med direkte DNA- eller RNA- sekvensering. Se for eksempel Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). Sekvensforandringer ved spesifikke lokalisasjoner kan også påvises med nukleaseproteksjonsanalyse, så som RNase, V1- og S1- proteksjonsanalyse eller med en kjemisk spaltingsmetode. Se for eksempel Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).
I en ytterligere utførelse tilveiebringes et arrangement av oligonukleotidprober omfattende protein E nukleotidsekvenser eller fragmenter derav konstruert til å utføre effektiv screening av for eksempel genetiske mutasjoner, serotype, taksonomisk klassifisering eller identifisering. Array teknologimetoder er godt kjent og har generell appliserbarhet og kan anvendes for å undersøke en rekke spørsmål innen molekylær genetikk inkluderende genekspresjon, genetisk kopling og genetisk variabilitet (se for eksempel, Chee et al., Science, 274: 610 (1996)).
Således, i denne beskrivelsen er det også beskrevet et diagnostisk kitt som omfatter:
(a) et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis en av nukleotidsekvensene ifølge SEQ ID NO: 11, eller et fragment derav;
(b) en nukleotidsekvens komplementær til den av (a);
(c) et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis et av polypeptidene ifølge SEQ ID NO: 1-10 eller et fragment derav; eller
(d) et antistoff til et polypeptid ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis til et av polypeptidene ifølge SEQ ID NO: 1-10.
Det skal anerkjennes at i et slikt kitt kan (a), (b), (c) eller (d) omfatte en vesentlig komponent. Et slikt kitt vil være til anvendes ei diagnostisering av sykdom eller mottagelighet for en sykdom, blant andre.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet anvendelse av polynukleotidet som diagnostiske reagenser. Deteksjon av en mutert form av et polynukleotid, fortrinnsvis en sekvens ifølge SEQ ID NO: 11, som er assosiert med en sykdom eller patogenisitet vil tilveiebringe et diagnostisk redskap som kommer i tillegg til, eller definere, en diagnose av en sykdom, en prognose av en årsak til sykdom, en bestemmelse av sykdomsfase, eller en mottagelighet til en sykdom, som resulterer av underekspresjon, overekspresjon eller forandret ekspresjon av polynukleotidet. Organismer, fortrinnsvis infeksiøse organismer, som bærer mutasjoner i et slikt polynukleotid kan detekteres ved polynukleotidnivå ved en rekke teknikker, slik som de som er beskrevet annet steds heri.
Celler fra en organisme som bærer mutasjoner eller polymorfismer (alleliske variasjoner) i et polynukleotid og/eller polypeptid kan også detekteres ved polynukleotid- eller polypeptidnivå med en rekke teknikker, ved å muliggjøre for serotyping, for eksempel. For eksempel kan RT-PCR anvendes for å detektere mutasjoner i RNA. Det er spesielt foretrukket å anvendes RT-PCR i forbindelse med automatiserte deteksjonssystemer, så som for eksempel GeneScan. RNA, cDNA eller genomisk DNA kan også anvendes for samme formål, PCR. Som et eksempel kan PCR-primere som er komplementære til et polynukleotid som koder for protein E polypeptider anvendes for å identifisere og analysere mutasjoner.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet primere med 1, 2, 3 eller 4 nukleotider fjernet fra sin 5' og/eller 3' ende. Disse primere kan anvendes for, blant andre ting, mangfoldiggjøring av protein E DNA og/eller RNA isolert fra en prøve avledet fra et individ, så som et kroppsmateriale. Primerne kan anvendes for å mangfoldiggjøre et polynukleotid isolert fra et infisert individ, slik at polynukleotidet deretter kan underlegges forskjellige teknikker for å bestemme polynukleotidsekvensen. På denne måte kan mutasjoner i polynukleotidsekvensen detekteres å anvendes for å diagnostisere og/eller stille prognose om infeksjonen eller dets fase eller årsak, eller å serotype og/eller klassifisere det infeksiøse middel.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for å diagnostisere, sykdom, fortrinnsvis bakterielle infeksjoner, mer fortrinnsvis infeksjoner forårsaket av ikke-typebestembar H. influenzae, omfattende å bestemme fra en prøve avledet fra et individ, så som et kroppsmateriale, et øket nivå av ekspresjon av polynukleotid som har en sekvens som en av sekvensene i SEQ ID NO: 11. Øket eller redusert ekspresjon av protein E polynukleotid kan måles ved anvendelse av enhver metode kjent innen fagfeltet for kvantifisering av polynukleotider, så som for eksempel mangfoldiggjøring,
PCR, RT-PCR, RNase beskyttelse, Northern blotting, spektrometri og andre hybridiseringsmetoder.
I tillegg kan et diagnostisk analyse i samsvar med beskrivelsen for deteksjon av overuttrykking av protein E polypeptider sammenlignes med normalkontroll vevsprøver for å detektere nærvær av en infeksjon, for eksempel. Analyseteknikker som kan anvendes for å bestemme nivåer av protein E polypeptider, i en prøve avledet fra en vert, så som et kroppsmateriale er godt kjent for de fagkyndige innen feltet. Slike analysemetoder inkluderer radioimmunoanalyser, kompetitive bindingsanalyser, Western Blot analyser, antistoff sandwich analyser, antistoff deteksjon og ELISA- analyser.
Polynukleotidene ifølge beskrivelsen kan anvendes som komponenter i polynukleotid arrays, fortrinnsvis høytetthets array eller grids. Disse høytetthets arrays er spesielt nyttige for diagnostiske og prognostiske formål. For eksempel, et sett av spot som hver omfatter et forskjellig gen, og som ytterligere omfatter et polynukleotid eller polynukleotider ifølge beskrivelsen, kan anvendes for å probe, så som ved anvendelse av hybridisering eller nukleinsyre mangfoldiggjøring, anvendelse av prober oppnådd eller avledet fra en kroppsprøve, for å bestemme nærvær av en bestemt polynuklotidsekvens eller relatert sekvens i et individ. Et slikt nærvær kan indikere nærvær av et patogen, fortrinnsvis ikke-typebestembar H. influenzae, og kan være nyttig i diagnostisering og/eller prognostisering av sykdom eller årsak til sykdom. Et grid som omfatter et antall varianter av en polynukleotidsekvens ifølge SEQ ID NO: 11 er foretrukket. Også foretrukket er et antall varianter av en polynukleotidsekvens som koder for en polypeptidsekvens ifølge SEQ ID NO: 1-10.
Antistoff
Polypeptidene og polynukleotidene ifølge beskrivelsen eller varianter derav, eller celler som uttrykker samme kan anvendes som immunogener for å produsere antistoff som er immunspesifikke for slike polypeptider eller polynukleotider, respektivt.
Alternativt, minotoper, fortrinnsvis peptid minotoper, av epitoper innen polypeptidsekvensen kan også anvendes som immunogener for å produsere antistoff som er immunspesifikke for polypeptidet ifølge beskrivelsen. Termen ”immunspesifikk” angir at antistoffene har en vesentlig høyere affinitet for polypeptidene ifølge beskrivelsen, enn deres affinitet for andre beslektete polypeptider innen teknikkens stilling.
I visse foretrukne utførelser tilveiebringes antistoff mot protein E polypeptider eller polynukleotider.
Antistoff generert mot polypeptidene eller polynukleotidene ifølge beskrivelsen kan oppnås ved administrering av polypeptidene og/eller polynukleotidene ifølge beskrivelsen, eller epitopbærende fragmenter av det ene eller begge, analoger av en eller begge, eller celler som uttrykker enten en eller begge, til et dyr, fortrinnsvis ikke et menneske, ved anvendelse av rutinemessige protokoller. For fremstilling av monoklonal antistoff kan enhver teknikk kjent innen fagfeltet som tilveiebringer antistoff produsert av kontinuerlige cellelinje kulturer anvendes. Eksempler inkluderer forskjellige teknikker som de som beskrevet i Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pg.77-96 i MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Teknikker for produksjon av enkeltkjede antistoffer (U.S. Patent.4,946,778) kan tilpasses for å produsere enkeltkjede antistoff til polypeptider eller polynukleotider ifølge beskrivelsen. Videre, transgene mus, eller andre organismer eller dyr, så som andre pattedyr, kan anvendes for å uttrykke humaniserte antistoff som er immunospesifikke til polypeptidene eller polynukleotidene ifølge beskrivelsen.
Alternativt kan fagdisplay teknologi anvendes for å selektere antistoffgener med bindingsaktiviteter mot et polypeptid ifølge beskrivelsen enten fra repertoar av PCR-mangfoldiggjorte V- gener av lymfocytter fra mennesker screenet for å oppvise antiprotein E eller fra naive bibliotek (McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). Affiniteten av disse antistoff kan også forbedres for eksempel ved kjede- shuffling (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).
De ovenfor beskrevne antistoff kan benyttes for å isolere eller for å identifisere kloner som uttrykker polypeptidene eller polynukleotidene ifølge beskrivelsen for å rense polypeptidene eller polynukleotidene for eksempel med affinitetskromatografi.
Således, blant andre, antistoff mot protein E polypeptider eller protein E polynukleotider kan benyttes for å behandle infeksjoner, fortrinnsvis bakterielle infeksjoner.
Polypeptid varianter inkluderer antigeniske, epitopikalske eller immunogeniske ekvivalente varianter danner et bestemt aspekt av foreliggende beskrivelse.
Fortrinnsvis, antistoffer eller varianten derav er modifisert for å gjøre dem mindre immunogenisk i et individ. For eksempel, dersom individet er et menneske kan antistoffet mest fortrinnsvis ”humaniseres” hvor den komplementaritetsbestemmende region eller regioner av det hybridon avledete antistoff har blitt transplantert til en human monoklonal antistoff, for eksempel som beskrevet i Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 or Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273.
Antagonister og agonister – Analyser og molekyler
Polypeptider og polynukleotider ifølge beskrivelsen kan også anvendes for å undersøke binding av småmolekylsubstrater og ligander for eksempel i celler, cellefrie preparater, kjemiske biblioteker og naturlige produktblandinger. Disse substrater og ligander kan være naturlige substrater og ligander eller kan være strukturelle eller funksjonelle etterligninger. Se for eksempel Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991).
Screeningsmetodene kan enkelt måle binding av en kandidatforbindelse til polypeptidet eller polynukleotidet, eller til celler eller membraner som bærer polypeptidet eller polynukleotidet, eller et fusjonsprotein av polypeptidet ved hjelp av en eller indirekte assosiert med kandidatforbindelsen. Alternativt, screeningsmetoden kan involvere konspiranser med en merket kompetitor. Videre, disse screeningsmetoder kan teste om kandidatforbindelsen resulterer i et signal generert ved aktivering eller inhibering av polypeptidet eller polynukleotidet, ved anvendelse av deteksjonssystemer som er egnet for cellene som omfatter polypeptidet eller polynukleotidet. Inhibitorer av aktivering analyseres generelt i nærvær av en kjent agonist og effekten av aktivering av agonisten ved nærvær av kandidatforbindelsen observeres. Konstitutivt aktivt polypeptid og/eller konstitutivt uttrykte polypeptider og polynukleotider kan benyttes i screeningsmetoder for inverse agonister eller inhibitorer, i fravær av en agonist eller inhibitor, ved å teste om kandidatforbindelsen resulterer i inhibering av aktivering av polypeptidet eller polynukleotidet, som tilfellet måtte være. Videre, screeningsmetodene kan enkelt omfatte trinnet å blande en kandidatforbindelse med en løsning inneholdende et polypeptid eller polynukleotid, for å danne en blanding, måle protein E polypeptider og/eller polynukleotider aktivitet i blandingen, og sammenligne protein E polypeptid og/eller polynukleotid aktivitet av blandingen med en standard. Fusjonsproteinet, så som de som er fremstilt fra Fc- porsjonen og protein E polypeptidet, som nevnt over, kan også anvendes for høygjennomstrømnings screeningsanalyser for å identifisere antagonister av polypeptidet, og likeledes fylogenetisk og/eller funksjonelt beslektete polypeptider (se D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); and K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).
Polynukleotidene, polypeptidene og antistoff som binder til og/eller interagerer med et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å konfigurere screeningsmetoder og å detektere effekten av tilsatte forbindelser på produksjon av mRNA og/eller polypeptid i celler. For eksempel, en ELISA- analyse kan konstrueres for å måle utskilte eller celleassosierte nivåer av polypeptid ved anvendelse av monoklonale og polyklonale antistoff med standard metoder kjent innen fagfeltet. Dette kan anvendes for å oppdage midler som inhiberer eller forsterker produksjon av polypeptid (også benevnt antagonist eller agonist, respektivt) fra egnete manipulerte celler eller vev.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for screening av forbindelse for å identifisere de som forsterker (agonist) eller blokkerer (antagonist) virkning av protein E polypeptidet eller polynukleotidet, fortrinnsvis de forbindelser som er bakeller antagonister kan en syntetisk reaksjonsblanding, et cellulært kompartment, så som en membran, cellelomme eller cellevegg, eller en fremstilling av enhver derav, omfattende protein E polypeptider og et merket substrat eller ligand av slikt polypeptid inkuberes i fravær eller nærvær av et kandidatmolekyl som kan være en protein E agonist eller antagonist. Evnen til kandidatmolekyler til å agonisere eller antagonisere protein E polypeptidet reflekteres i redusert binding av den merkete ligand eller redusert produksjon av produkt fra et slikt substrat. Molekyler som binder unøding, det vil si uten å indusere effektene av protein E polypeptid er mest sannsynlig gode antagonister.
Molekyler som binder godt, og som tilfellet kan være, øker hastigheten av produktproduksjon fra substrat, øker signaltransduksjon, eller øker kjemisk kanalaktivitet er agonister. Deteksjon av hastighet eller nivå av, som tilfellet måtte være, produksjon av produkt fra substrat, signaltransduksjon eller kjemisk kanalaktivitet kan forsterkes ved anvendelse av et reportersystem. Reportersystemer som kan være nyttige i denne sammenheng inkluderer men er ikke begrenset til kolorimetriske, merket substrat som omdannes til produkt, et reportergen som er responsiv til forandringer i protein E polynukleotid eller polypeptid aktivitet, og bindingsanalyser kjent innen fagfeltet.
Et annet eksempel på en analyse for protein E agonister er en kompetitiv analyse som kombinerer protein E og en potensiell agonist med protein E bindende molekyler, rekombinante protein E bindende molekyler, naturlige substrater eller ligander, eller substrater eller ligandetterligninger, under egnete betingelser for en kompetitiv inhiberingsanalyse. Protein E kan merkes, så som med radioaktivitet eller en kolorimetrisk forbindelse, slik at antallet protein E molekyler som er bundet til et bindingsmolekyl eller omdannet til et produkt kan bestemmes nøyaktig for å undersøke effektiviteten av den potensielle antagonist.
Potensielle antagonister inkluderer, blant andre, små organiske forbindelser, peptider, polypeptider og antistoff som binder til et polynukleotid og/eller polypeptid ifølge beskrivelsen og dermed inhiberer eller demper dets aktivitet eller uttrykking. Potensielle antagonister kan også være små organiske molekyler, et peptid, et polypeptid så som et nært beslektet protein eller antistoff som binder til de samme seter som et bindingsmolekyl, så som et bindingsmolekyl, uten å injisere protein E induserte aktiviteter, og dermed hindrer virkning eller uttrykking av protein E polypeptider og/eller polynukleotider ved å ekskludere protein E polypeptider og/eller polynukleotider fra binding.
Potensielle antagonister inkluderer et lite molekyl som binder til å okkuperer bindingssete av polypeptidet og dermed hindrer binding til cellulære bindingsmolekyler, slik at normal biologisk aktivitet hindres. Eksempler på småmolekyler inkluderer men er ikke begrenset til små organiske molekyler, peptider eller peptidlignende molekyler.
Andre potensielle antagonister inkluderer antisense molekyler (se Okano, J. Neurochem.
56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), for en beskrivelse av disse molekyler). Foretrukne potensielle antagonister inkluderer forbindelser relatert til og varianter av protein E.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet genetisk konstruerte løselige fusjonsproteiner omfattende et polypeptid ifølge forliggende beskrivelsen, eller et fragment derav, og forskjellige porsjoner av de konstante regioner av tunge eller lette kjeder av immunoglobuliner av forskjellige undergrupper (IgG, IgM, IgA, IgE).
Foretrukket som et immunoglobulin er den konstante del av tungkjeden av human IgG, fortrinnsvis IgG1, hvor fusjon foregår ved hinge- regionen. I en bestemt utførelse kan Fc- delen enkelt fjernes ved inkorporering av en spaltingssekvens som kan spaltes med blodplottingsfaktor Xa. Videre, i denne beskrivelsen er det også beskrevet fremgangsmåter for fremstilling av disse fusjonsproteiner med genetisk engineering, og anvendelse av disse for medikamentscreening, diagnose og terapi.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet polynukleotider som koder for slike fusjonsproteiner. Eksempler på fusjonsproteinteknologi kan finnes i Internasjonal patentsøknad nr WO94/29458 og WO94/22914.
Hver av polynukleotidsekvensene som tilveiebringes heri kan anvendes i oppdagelse og utvikling av antibakterielle forbindelser. Det kodete protein, ved uttrykking, kan anvendes som et mål for screening av antibakterielle medikamenter. Videre, polynukleotidsekvensene som koder for aminoterminale regioner av det kodete protein eller Shine-Delgarno av andre translasjonsfremmende sekvenser av det respektive mRNA kan anvendes for å konstruere antisensesekvenser for å regulere uttrykking av den aktuelle kodesekvens.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet anvendelse av polypeptidet, polynukleotidet, agonist eller antagonist ifølge beskrivelsen for å interferere med den innledende fysikalsk interaksjon mellom et patogen eller patogener og en eukariot, fortrinnsvis pattedyr, vert som er ansvarlig for ettersykdom av infeksjonen. Fortrinnsvis, molekylene ifølge beskrivelsen kan anvendes: i å hindre addisjon av bakterie, spesielt gram positive og/eller gram negative bakterier, til eukariote, fortrinnsvis pattedyr, ekstracellulære matriksproteiner for iboende anordninger eller til ekstracellulære matriksproteiner i sår; for å blokkere bakteriell adhesjon mellom eukariote, fortrinnsvis pattedyr. Ekstracellulære matriksproteiner og bakterielle protein E proteiner som medierer vevsskaden og/eller for å blokkere normal progresjon av patogenese av infeksjoner i initiert på andre måter enn ved implantering av iboende anordninger eller ved andre kirurgiske teknikker.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet protein E agonister og antagonister, fortrinnsvis bakteriostatiske eller baktericidale agonister og antagonister.
Antagonistene og agonistene ifølge beskrivelsen kan benyttes for eksempel for å hindre, inhibere og/eller behandle sykdommer.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet minotoper av polypeptidet ifølge beskrivelsen. En mimotop er en peptidsekvens, tilstrekkelig lik til det native peptid (sekvensvis eller strukturelt), som er i stand til å bli gjenkjent av antistoff som gjenkjenner det native protein; eller som er i stand til å rette antistoff som gjenkjenner det native protein idet det kobles til en egnet bærer.
Peptidmimotoper kan konstrueres for et bestemt formål ved addisjon, delesjon eller substituering av utvalgte aminosyrer. Således, peptidene kan modifiseres for formål for enkelthet i forbindelse med konjugering til en proteinbærer. For eksempel kan det være ønskelig for noen kjemiske, konjugeringsmetoder å inkludere terminalt cystein. I tillegg kan det være vankelig for peptider konjugert til en proteinbærer å inkludere en hydrofob terminus distalt fra den konjugerte terminus av peptidet, slik at den frie ikke- konjugerte ende av peptidet forblir assosiert med overflaten på bærerproteinet. Dermed kan man presentere peptidet i en konformasjon som mest mulig etterligner den til peptidet slik det finnes i konteksten av det hele native molekyl. For eksempel, peptidene kan forandres til å ha en N- terminal cystein og en C- terminal hydrofobisk amidert hale. Alternativt, tilsetning eller substituering av en D- stereoisomer form av en eller flere av aminosyrene (inverso sekvenser) kan utføres for å etablere et nyttig derivat, for eksempel for å forbedre stabilitet av peptidet. Minotoper kan også være retrosekvenser av de naturlige peptidsekvenser, i det sekvensorienteringen er reversert. Mimotoper kan også være retroinverse i karakter. Retro, inverso og retroinverso peptider er beskrevet i WO 95/24916 og WO 94/05311.
Alternativt kan peptidmimotopene identifiseres ved anvendelse av antistoff som er i stand til i seg selv å binde til polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av teknikker så som fagdisplay teknologi (EP 0552 267 B1). Denne teknikk genererer et stort antall peptidsekvenser som etterligner strukturen av de native peptider og er derfor i stand til binding til antinative peptidantistoff, men trenger i seg selv ikke å dele tilstrekkelig sekvenshomologi til native polypeptider.
Vaksiner
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for å indusere en immunologisk respons i et individ, fortrinnsvis et pattedyr, fortrinnsvis mennesker, som omfatter å innokkulere med protein E polynukleotid og/eller polypeptid, eller et fragment eller variant derav, som er adekvat for å produsere antistoff og/eller T- celle immunrespons for beskytte nevnte individ fra infeksjon, fortrinnsvis bakteriell infeksjon og mest fortrinnsvis ikke-typebestembar H. influenzae infection. Også tilveiebrakt er fremgangsmåter hvor slike immunologiske responser senker bakteriell replikasjon. I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangmåte for å indusere immunologisk respons i et individ som omfatter å avgi til et slikt individ en nukleinsyrevektor, sekvens eller ribosom for å rette ekspresjon av protein E polynukleotider og/eller polypeptider, eller et fragment eller en variant derav, for å uttrykke protein E polynukleotider og/eller polypeptider, eller et fragment eller en variant derav in vivo for å indusere en immunologisk respons, så som for eksempel å produsere antistoff og/eller T- celle immunrespons, inkluderende for eksempel cytokin produserende T- celler eller cytotoksiske T- celler, for å beskytte nevnte individ, fortrinnsvis et menneske, fra sykdom, uavhengig av om sykdommen allerede er etablert i individet eller ikke. Et eksempel på administrering av genet er ved å akselerere det inn i de ønskete celler som coating på partikler, eller på annen måte. Slike nukleinsyrevektorer kan omfatte DNA. RNA, et ribozym, en modifisert nukleinsyre, et DNA/RNA-hybrid, et DNA-protein-kompleks eller et RNA- protein- kompleks.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en immunologisk sammensetning som idet den introduseres inn i et individ, fortrinnsvis et menneske, er i stand til å indusere inne i dette en immunologisk respons, indusere en immunologisk respons i et slikt individ til en protein E polynukleotid og/eller polypeptid som er kodet derfra, hvor sammensetningen omfatter et rekombinant protein E polynukleotid og/eller polypeptid som kodes derfra og/eller omfatter DNA og/eller RNA som koder for å uttrykke et antigen av nevnte protein E polynukleotid, polypeptid kodet derfra, eller andre polypeptid. Den immunologiske respons kan anvendes terapeutisk eller profylaktisk og kan ha form av antistoff immunitet og/eller cellulær immunitet, så som en cellulær immunitet som oppstår fra CTL eller CD4+ T-celler.
Protein E polypeptider eller et fragment derav kan fusjoneres med ko- protein eller kjemisk enhet som kan men ikke trenger i seg selv å produsere antistoff, men som er i stand til å stabilisere det første protein og produsere et fusjonert eller modifisert protein som vil ha antigenisk og/eller immunogeniske egenskaper, og fortrinnsvis beskyttende egenskaper. Det således fusjonerte rekombinante protein, som fortrinnsvis ytterligere omfatter et antigenisk ko- protein, så som lipoprotein eller protein D fra Haemophilus influenzae (EP 594610), Glutation-S-transferase (GST) eller betagalaktosidase, eller et annet relativt stort ko- protein som solubiliserer proteinet og fremmer produksjon og rensing derav. Videre, ko- proteinet kan fungere som en adjuvant i betydning og tilveiebringe en generalisert stimulering av immunsystemet til organismen som mottar proteinet. Ko- proteinet kan være tilfestet til enten amino- eller karboksyterminus av det første protein.
I en vaksinesammensetning i samsvar med beskrivelsen kan protein E polypeptidet og/eller polynukleotidet, eller et fragment, eller en mimotop, eller en variant derav foreligge i en vektor, så som en levende rekombinant vektor beskrevet ovenfor for eksemplene levende bakterielle vektorer. Også egnet er ikke- levende vektorer for protein E polypeptid, for eksempel bakterielle yttermembran vesikler eller ”bobler”. OM- bobler er avledet fra yttermembran av to sjiktmembranen av gram negative bakterier og har blitt dokumentert i mange gram negative bakterier (Zhou, L et al.1998. FEMS Microbiol. Lett.163:223-228) inkluderende C. trachomatis og C. psittaci. En ikke- altomfattende liste av bakterielle patogener rapportert til å produsere bobler inkluderer: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa and Yersinia enterocolitica.
Boblene har den fordel at de tilveiebringer yttermembranproteinet i deres native konformasjon og er således spesielt nyttige for vaksine. Boblene kan også forbedres for vaksinebruk ved å konstruere bakterien slik at den modifiserer uttrykking av en eller flere molekyler ved yttermembranen. Således, for eksempel kan uttrykking av et ønsket immunogenisk protein ved yttermembranen, så som protein E polypeptider, introduseres eller oppreguleres (for eksempel ved forandring av promotoren). I stedet for, eller i tillegg, kan uttrykking av yttermembranmolekyler som enten ikke er relevante (for eksempel ikke beskyttende antigener eller immundominant med variable proteiner) eller skadelige (for eksempel toksiske molekyler som LPS, eller potensielle indiserere av en autoimmun respons) nedreguleres. Disse løsninger diskuteres mer i detalj nedenfor.
De ikke- kodende flankerende regioner av protein E genene inneholder regulatoriske elementer som er viktige i uttrykkingen av genet. Denne regulering foregår både på transkripsjons og transalasjonsnivå. Sekvensene av disse regioner, enten oppstrøms eller nedstrøms for den åpne leseramme av genet, kan oppnås ved DNA- sekvensering. Denne sekvensinformasjon muliggjør for bestemmelse av potensielle regulatoriske motiver så som forskjellige promotorelementer, terminatorsekvenser, induserbare sekvenselementer, repressorer, elementer som er ansvarlig for fasevariasjon, shine-dalgarno sekvens, regioner med potensiell sekundær struktur involvert i regulering, og likeledes andre typer regulatoriske motiver eller sekvenser. Denne sekvens er et ytterligere aspekt av beskrivelsen.
Denne sekvensinformasjon muliggjør modulering av naturlig ekspresjon av protein E genet. Omregulering av genekspresjon kan utføres ved å forandre promotoren, shine-dalgarno sekvensen, potensielle repressor eller operatorelementer, eller et annet element som er involvert. Likeledes, nedregulering av ekspresjon kan oppnås med tilsvarende type modifisering. Alternativt, ved å forandre fasevariasjonssekvenser kan uttrykking av genet plasseres under fasevariasjonskontroll, eller det kan frakobles fra sin regulering. I en annen tilnærming kan ekspresjon av genet plasseres under kontroll av en eller flere induserbare elementer som muliggjør regulert uttrykking. Eksempler på slik regulering inkluderer, men er ikke begrenset til, induksjon av temperaturforandring, tilsetning av induktursubstrator så som utvalgte karbohydrater eller deres derivater, sporelementer, vitaminer, kofaktorer, metallioner, etc.
Slike modifiseringer som beskrevet over kan introduseres på forskjellige måter. Modifisering av sekvensene involvert i genuttrykking kan utføres in vivo med vilkårlig mutagenese etterfulgt av seleksjon for den ønskete fenotype. En annen tilnærming består i å isolere den aktuelle region og modifisere den med vilkårlig mutagenese, eller seterettet erstatning, innskudd eller deleteringsmutagenese. Den modifiserte region kan deretter reintroduseres inn i det bakterielle genom med homolog rekombinasjon, og effekten på genuttrykking kan undersøkes. I en annen løsning kan sekvenskunnskapen om den aktuelle region anvendes for å erstatte eller deletere hele eller en del av de naturlige regulatoriske sekvenser. I dette tilfellet isoleres det aktuelle regulatoriske region og modifiseres slik at det inneholder de regulatoriske elementer fra et annet gen, en kombinasjon av regulatoriske elementer fra forskjellige gener, en syntetisk regulatorisk region, eller en annen regulatorisk region, eller å delektere utvalgte deler av villtype regulatoriske sekvenser. Disse modifiserte sekvenser kan deretter reintroduseres inn i bakterien via homolog rekombinasjon inn i genomet. En ikke utfyllende liste av foretrukne promotorer som kan anvendes for oppregulering av genuttrykking inkluderer promotorene porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB fra N. meningitidis or N. gonorroheae; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB from M. Catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 fra H. influenzae.
I et eksempel kan ekspresjon av genet moduleres ved å utbytte promotoren med en sterkere promotor (gjennom isolering av oppstrømssekvensen av genet, in vitro modifisering av denne sekvens, og reintrodusering inn i med homolog rekombinasjon). Oppreguler ekspresjon kan oppnås både i bakterien og likeledes i yttermembranvehiklene avledet (eller fremstilt) fra bakterien.
I ytterligere eksempler kan de beskrevne tilnærminger anvendes for å generere rekombinante bakterielle stammer med forbedrete karakteristika for vaksineapplikasjoner. Disse kan, men er ikke begrenset til, atenuerte stammer, stammer med økt ekspresjon av utvalgte antigener, stammer med knock-outs (eller redusert ekspresjon) av gener som interfererer med immunresponsen, stammer med modulert ekspresjon av immundominante proteiner, stammer med modulert utgytelse av yttermembranvesikler.
Således, i denne beskrivelsen er det også beskrevet en modifisert oppstrømsregion av protein E genene, hvor den modifiserte oppstrømsregion inneholder et heterologt regulatorisk element som forandrer ekspresjonsnivået av protein E proteiner lokalisert ved yttermembranen. Oppstrømsregionen i samsvar med dette aspekt av beskrivelsen inkluderer sekvensen oppstrøms for protein E genet. Oppstrømsregionen starter umiddelbart oppstrøms for protein E genet og fortsettes vanligvis til en posisjon som ikke er mer enn ca 1000 gp oppstrøms for genet fra ATG start kodon. I tilfellet et gen er lokalisert i en polysistronisk sekvens (operon) kan oppstrømsregionen starte umiddelbart før det aktuelle gen, eller komme foran det første gen i operon.
Fortrinnsvis, en modifisert oppstrømsregion i samsvar med dette aspekt av beskrivelsen inneholder en heterolog promotor ved en posisjon mellom 500 og 700 bp oppstrøms for ATGen.
Anvendelse av de beskrevne oppstrømsregioner for å oppregulere ekspresjon av protein E genet, en fremgangsmåte for å oppnå dette gjennom homolog rekombinasjon (for eksempel som beskrevet i WO 01/09350 inkorporert med referanse heri), en vektor som omfatter oppstrømssekvens egnet for dette formål, og en vertscelle som er forandret på denne måte er alle ytterligere aspekter av beskrivelsen.
Således, i denne beskrivelsen er det også beskrevet et protein E polypeptider, i en modifisert bakteriell boble. I denne beskrivelsen er det også beskrevet modifiserte vertsceller i stand til å produsere ikke- levende membranbaserte lommevektorer. I denne beskrivelsen er det også beskrevet nukleinsyrevektorer omfattende protein E genene som har en modifisert oppstrømsregion inneholdende et heterologt regulatorisk element.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet fremgangsmåter for å fremstille vertscellene og bakterielle bobler i samsvar med beskrivelsen.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet sammensetninger, fortrinnsvis vaksinesammensetninger, og fremgangsmåter omfattende polypeptidene og/eller polynukleotidene ifølge beskrivelsen og immunstimulatoriske DNA- sekvenser, så som de som er beskrevet i Sato, Y. et al. Science 273: 352 (1996).
I denne beskrivelsen er det også beskrevet fremgangsmåter for anvendelse av det beskrevne polynukleotid eller bestemte fragmenter derav, som har blitt vist å kode for ikke- variable regioner av bakterielle celleoverflateproteiner, i polynukleotidkonstrukter anvendt i slike genetiske immuniseringseksperimenter i dyremodeller for infeksjon med … H. influenzae. Slike eksperimenter vil være spesielt nyttige for å identifisere protein epitoper i stand til å frembringe en profylaktisk eller terapeutisk immunrespons. Det antas at denne tilnærming vil muliggjøre for påfølgende fremstilling av monoklonale antistoff av bestemt verdi, avledet fra det nødvendige organ av syret som med suksess motstår eller klarner infeksjon, for utvikling av profylaktiske midler eller terapeutiske behandlinger av bakterielle infeksjoner, fortrinnsvis ikke-typebestembar H. influenzae i pattedyr, fortrinnsvis mennesker.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en vaksineformulering som omfatter en immunogenisk rekombinant polypeptid og/eller polynukleotid ifølge beskrivelsen sammen med en egnet bærer, så som en farmasøytisk akseptabel bærer. Siden polypeptidene og polynukleotidene kan brytes ned i magen, så administreres disse fortrinnsvis parenteralt, inkluderende for eksempel administrering som er subcutanøs, intramuskulær, intravenøs, eller intradermal. Formuleringer egnet for parenteral administrering inkluderer vandige og ikke- vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske forbindelser og løst stoff som gjør at formuleringen blir isoton med kroppsfluidet, fortrinnsvis blodet, til individet; og vandige og ikke- vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderende midler eller fortykningsmidler. Formuleringene kan presenteres i enhetsdosering eller multidoseringsbeholdere, for eksempel forseglete ampuller eller medisinflasker og kan lagres i en frysetørket tilstand som krever kun tilsetning av steril væskebærer umiddelbart før bruk.
Vaksineformuleringen ifølge beskrivelsen kan også inkludere adjuvantsystemer for å forbedre immunogenitet av formuleringen. Fortrinnsvis reiser adjuvantsystemet en TH1 type respons.
En immunrespons kan bredt deles i to ekstreme kategorier, det vil si at den er enten humoral eller cellemediært immunresponser (tradisjonelt karakterisert ved antistoff og cellulære effektor mekanismer for beskyttelse, respektivt). Disse responskategorier har litt benevnt TH1 type Responser (cellemedierte responser), og TH2 type immunresponser (humorale responser).
Ekstreme TH1 type immunresponser kan karakteriseres ved generering av antigen spesifikke, haplotype begrensete cytotoksiske T lymfocytter, og naturlige drepecelleresponser. I mus blir TH1 type responser ofte karakterisert ved generering av antistoff av IgG2a- undergruppe, mens i menneske korresponderer disse til IgG1-type antistoff. TH2- type immunresponser er karakterisert ved generering av et bredt spekter av immunoglobulinisotyper inkluderende i mus IgG1, IgA, og IgM.
Det kan vurderes at den drivende kraft bak utvikling av disse typer immunresponser er cytokinene. Høye nivåer av TH1 type cytokiner tenderer til å fremme induksjon av cellemediert immunrespons for et gitt antigen, mens høye nivåer av TH2 type cytokiner tenderer til å favorisere induksjon av humorale immunresponser til antigener.
Denne forskjell på TH1- og TH2- type immunresponser er ikke absolutt. I realiteten vil et individ støtte en immunrespons som beskrives som å være hovedsakelig TH1 eller hovedsakelig TH2. Imidlertid, det er imidlertid ofte hensiktsmessig å vurdere familiene av cytokiner i termer av det som er beskrevet i murine CD4 ve T- cellekloner av Mosmann and Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradisjonelt er TH1- type responser assosiert med produksjon av INF- γ og IL-2 cytokiner av T lymfocytter. Andre cytokiner som ofte er direkte assosiert med induksjon av TH1 type immunresponser er ikke produsert av T celler, så som IL-12. I motsetning, TH2- type responser er assosiert med sekresjon av IL-4, IL-5, IL-6 og IL-13.
Det er kjent at visse vaksineadjuvanter er spesielt egnet for å stimulere enten TH1- eller TH2 type cytokinresponser. Tradisjonelt vil de beste indikatorer for TH1: TH2- balansen av immunresponsen etter en vaksinering eller infeksjon inkludere direkte måling av produksjon av TH1 eller TH2 cytokiner med T- lymfocytter in vitro etter restimulering med antigen, og/eller måling av IgG1:IgG2a- forhold av antigenspesifikke antistoffresponser.
Således, en TH1 type adjuvant er en som fortrinnsvis stimulerer isolerte T-celle populasjoner til å produsere høye nivåer av TH1 type cytokiner idet de restimuleres med antigen in vitro, og fremmer utvikling av både CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter og antigen spesifikke immunoglobulin responser assosiert ved TH1 type isotyp.
Adjuvanter som er i stand til å fortrinnsvis stimulere TH1- celleresponsene beskrevet i Internasjonal patentsøknad WO 94/00153 og WO 95/17209.
3 De-O-asylert monofosforyl lipid A (3D-MPL) er en slik adjuvant. Denne er kjent fra GB 2220211 (Ribi). Kjemisk er det en blanding av 3 De-O-asylert monofosforyl lipid A med 4, 5 eller 6 asylerte kjeder og produseres av Ribi Immunochem, Montana. En foretrukket form av 3 De-O-asylert monofosforyl lipid A er beskrevet i Europeisk patent 0689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).
Fortrinnsvis er partiklene av 3D-MPL tilstrekkelig små til å kunne sterilt filtreres gjennom et 0,22 µm membran (Europeisk patentnummer 0689454).
3D-MPL vil foreligge i området av 10 µg – 100 µg, fortrinnsvis 25-50 µg per dosering hvor antigenet typisk vil foreligge i området 2-50 µg per dosering.
En ytterligere foretrukket adjuvant omfatter QS21, en Hplc- renset ikketoksisk fraksjon avledet fra barken til Quillaja Saponaria Molina. Valgfritt kan denne samblandes med 3 De-O-asylert monofosforyl lipid A (3D-MPL), valgfritt sammen med en bærer.
Fremgangsmåten for produksjon av QS21 er beskrevet i US patent 5,057,540. Ikke- reaktogeniske adjuvantformuleringer inneholdende QS21 har blitt beskrevet tidligere (WO 96/33739). Slike formuleringer som omfatter QS21 og kolesterol har blitt vist å med suksess være TH1- stimulerende adjuvanter idet de formuleres sammen med et antigen.
Ytterligere adjuvanter som er foretrukne stimulatorer av TH1 celleresponser inkluderer immunmodulatoriske oligonukleotider, for eksempel ikke- metylerte CpG-sekvenser som beskrevet i WO 96/02555.
Kombinasjoner av forskjellige TH1- stimulerende adjuvanter, så som de som er nevnt over, vurderes også som å kunne tilveiebringe en adjuvant som fortrinnsvis stimulerer TH1- celleresponsen. For eksempel kan QS21 formuleres sammen med 3D-MPL. Forholdet av QS21: 3D-MPL vil typisk være i størrelsesorden 1: 10 til 10: 1; fortrinnsvis 1:5 til 5 : 1 og ofte omtrentlig 1: 1. Det foretrukne område for optimal synergi er 2,5: 1 til 1: 13D-MPL: QS21.
Fortrinnsvis er en bærer også tilstede i vaksinesammensetningen i samsvar med beskrivelsen. Bæreren kan være en olje-i-vann-emulsjon, eller et aluminiumsalt, så som aluminiumfosfat eller aluminiumhydroksid.
En foretrukket olje-i-vann-emulsjon omfatter en metaboliserbar olje, så som squalen, alfa tocoferol og Tween 80. I et bestemt foretrukket aspekt kombineres antigenene i vaksinesammensetningen i samsvar med beskrivelsen med QS21 og 3D-MPL i en slik emulsjon. Videre, olje- i- vann- emulsjonen kan inneholde span 85 og/eller lesitin og/eller trikaprylin.
Typisk for human administrering vil QS21 og 3D-MPL foreligge i en vaksine i området 1µg – 200 µg, så som 10-100 µg, fortrinnsvis 10 µg – 50 µg per dosering. Typisk vil olje-i-vann omfatte fra 2 til 10 % squalene, fra 2 til 10 % alfa tokoferol og fra 0,3 til 3 % tween 80. Fortrinnsvis vil forholdet squalen: alfa tokoferol være lik eller mindre enn 1 idet dette tilveiebringer en mer stabil emulasjon. Span 85 kan også foreligge i et nivå på 1 %. I noen tilfeller vil det være fordelaktig at vaksinene ifølge foreliggende beskrivelse ytterligere vil inneholde et stabiliserende middel.
Ikke- toksiske olje-i-vann-emulsjoner inneholder fortrinnsvis en ikke- toksisk olje, for eksempel squalan eller squalene, et emulsifiserende middel, for eksempel Tween 80, i en vandig bærer. Den vandige bærer kan for eksempel være fosfatbufret saltløsning.
En bestemt potent adjuvantformulering involverer QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje-i-vann-emulsjon som beskrevet i WO 95/17210.
Idet oppfinnelsen er blitt beskrevet med referanse til visse protein E polypeptider og polynukleotider skal det forstås at dette dekker fragmenter av de naturlig forekommende polypeptider og polynukleotider, og tilsvarende polypeptider og polynukleotider med tilføyinger, deleteringer eller substitueringer som ikke i vesentlig grad påvirker de immunogeniske egenskaper av de rekombinante polypeptider eller polynukleotider. Foretrukne fragmenter/peptider er beskrevet i eksempel 10.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet en polyvalent vaksinesammensetning omfattende en vaksineformulering ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med andre antigener, fortrinnsvis antigener som er nyttige i å behandle otitis media. En slik polyvalent vaksinesammensetning kan inkludere en TH1 induserende adjuvant som beskrevet over.
I en foretrukket utførelse formulerer polypeptidene, fragmentene og immunogenene en eller flere av følgende grupper antigener: a) en eller flere pneumococcal kapsulare polysakkarider (enten rene eller konjugerte til et bærerprotein); b) en eller flere antigener som kan beskytte en vert mot M. catarrhalis infeksjon; c) en eller flere proteinantigener som kan beskytte en vert mot Streptococcus pneumoniae infeksjon; d) en eller flere ytterligere ikke-typebestembare Haemophilus influenzae protein Antigener; e) en eller flere antigener som kan beskytte en vert mot RSV; og f) en eller flere antigener som kan beskytte en vert mot influensavirus. Kombinasjoner med: grupper a) og b); b) og c); b), d), og a) og/eller c); b), d), e), f), og a) og/eller c) er foretrukket. Slike vaksiner kan fortrinnsvis anvendes som globale otitt media vaksiner.
De pneumococcale kapsulære polysakkarid antigener er fortrinnsvis valgt blant serotyper 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F (mest foretrukket fra serotyper 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F).
Foretrukne pneumococcale protein antigener er de pneumococcale proteiner som er eksponert på ytteroverflaten av pneumococcus (i stand til å kunne gjenkjennes av en verts immunsystem under i det minste en del av livssyklusen til pneumococcus), eller er proteiner som utskilles eller frigjøres av pneumococcus. Mest foretrukket, proteinet er et toksin, adhesin, tokomponent signaltransduser, eller lipoprotein av Streptococcus pneumoniae, eller fragmenter derav. Spesielt foretrukne proteiner inkluderer, men er ikke begrenset til: pneumolysin (fortrinnsvis detoksifisert med kjemisk behandling eller mutasjon) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res.1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA og transmembrane deleteringsvarianter derav (WO 92/14488; WO 99/53940; US 5804193 - Briles et al.); PspC og transmembrane deleteringsvarianter derav (WO 99/53940; WO 97/09994 - Briles et al); PsaA og transmembrane deleteringsvarianter derav (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); pneumococcal choline binding proteins and transmembrane deletion variants thereof; CbpA og transmembrane deleteringsvarianter derav (WO 97/41151; WO 99/51266);
Glyceraldehyd–3-fosfat – dehydrogenase (Infect. Immun.1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); M lignende protein, SB patentsøknad nummer. EP 0837130; og adhesin 18627 (SB patentsøknad nummer EP 0834568). Ytterligere foretrukne pneumococcale protein antigener er de som er beskrevet i WO 98/18931, fortrinnsvis de som er selektert i WO 98/18930 og PCT/US99/30390.
Foretrukne Moraxella catarrhalis protein antigener som kan inkluderes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for hindring av otitt media) er: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA og/eller LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA og/eller TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun.61:2003-2010]; UspA1 og/eller UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); og OmpE.
Ytterligere foretrukne ikke-typebestembare Haemophilus influenzae protein antigener som kan inkluderes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for hindring av otitt media) inkluderer: Fibrin protein [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] og fusjoner omfattende peptider derav [for eksempel LB1(f) peptid fusjoner; US 5843464 (OSU) eller WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; protein D (EP 594610); TbpA og/eller TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; P5 (WO 94/26304); NlpC2 (BASB205) [WO 02/30971]; Slp (BASB203) [WO 02/30960]; og iOMP1681 (BASB210) [WO 02/34772].
Foretrukne influensavirus antigener inkluderer hele, levende eller inaktiverte virus, splitt influensavirus, som har vokset i egg eller MDCK- celler, eller Veroceller eller hele influensavirosomer (som beskrevet av R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) eller rensete eller rekombinante proteiner derav, så som HA, NP, NA, eller M proteiner, eller kombinasjoner derav.
Foretrukne RSV (Respiratory Syncytial Virus) antigener inkluderer F glykoprotein, G glykoprotein, HN-protein, eller derivater derav.
Sammensetninger, kitt og administrering.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet sammensetninger omfattende protein E polynukleotider og/eller protein E polypeptider for administrering til en celle eller en multicellulær organisme.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet sammensetninger omfattende polynukleotid og/eller et polypeptid beskrevet heri eller deres agonister eller antagonister. Polypeptidene og polynukleotidene kan benyttes i kombinasjon med en ikke- steril eller steril bærer eller bærere for anvendelse med celler, vev eller organismer, så som en farmasøytisk bærer egnet for administrering til et individ. Slike sammensetninger omfatter for eksempel et mediumtilsetning eller en terapeutisk effektiv mengde av et polypeptid og/eller polynukleotid og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient. Slike bærere kan inkludere, men er ikke begrenset til, saltløsning, bufret saltløsning, dekstrose, vann, glyserol, etanol og kombinasjoner derav. Formuleringen bør være tilpasset administrasjonsmodus. I denne beskrivelsen er det også beskrevet diagnostiske og farmasøytiske pakker og kitt omfattende en eller flere beholdere fylt med en eller flere av ingrediensene av ovenfor nevnte sammensetninger ifølge oppfinnelsen.
Polypeptider, polynukleotider og andre forbindelser kan benyttes alene eller sammen med andre forbindelser, så som terapeutiske forbindelser.
De farmasøytiske sammensetninger kan administreres i enhver effektiv, hensiktsmessig måte inkluderende for eksempel administreres med topikal, oral, anal, vaginal, intravenøs, interperitonial, intramuskulær, subkutanøs, intranasal eller intradermale ruter, blant andre.
Som terapi eller som et profylaktisk middel kan det aktive middel administreres til et individ som en injiserbar sammensetning, for eksempel som en steril vandig dispersjon, fortrinnsvis isoton.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet farmasøytiske sammensetninger omfattende en terapeutisk effektiv mengde av et polypeptid og/eller polynukleotid, så som den løselige form av et polypeptid og/eller polynukleotid ifølge beskrivelsen, agonist eller antagonist peptid eller småmolekylforbindelser, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient. Slike bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, saltløsning, bufret saltløsning, dekstrose, vann, glyserol, etanol og kombinasjoner derav. I denne beskrivelsen er det også beskrevet farmasøytiske pakker og kitt omfattende en eller flere beholdere fylt med en eller flere av ingrediensene av ovenfor nevnte sammensetninger ifølge beskrivelsen. Polypeptider, polynukleotider og andre forbindelser ifølge foreliggende beskrivelse kan benyttes alene eller i forbindelse med andre forbindelser, så som terapeutiske forbindelser.
Sammensetningen vil tilpasses til den rute av administrering, for eksempel ved systemisk eller oral rute. Foretrukne former for systemisk administrering inkluderer injeksjon, typisk ved intravenøs injeksjon. Andre injeksjonsruter, så som subkutanøs, intramuskulær eller intraperitonial kan også anvendes. Alternative midler for systemisk administrasjon inkluderer transmukosal og transdermal administrering ved anvendelse av penetrerende midler så som gallesalter og fysiske syrer eller andre detergenter. I tillegg, dersom et polypeptid eller andre forbindelser ifølge beskrivelsen kan formuleres i en enterisk eller en innkapslet form, kan oral administrering også være mulig.
Administrering av disse forbindelser kan også være topikal og/eller lokalisert, i form av salver, pastaer, geler eller løsninger, pulvere og lignende.
For administrering til pattedyr, og fortrinnsvis mennesker, er det forventet at det daglige doseringsnivå av det aktive middel vil være fra 0,01 mg/kg til 10 mg/kg, typisk ca 1 mg/kg. Legen vil i hvert tilfelle bestemme den aktuelle dosering som vil være mest egnet for et individ og dette vil variere med alder, vekt og respons av det bestemte individ. De ovenfor nevnte doseringer er eksempler på gjennomsnittstilfeller. Det kan selvsagt være individuelle forhold hvor høyere eller lavere doseringsområder er fordelaktig, og slike er også innen rammen av foreliggende beskrivelse.
Det nødvendige doseringsområde avhenger av valg av peptid, administrasjonsrute, naturen til formuleringen, naturen til individets tilstand, og vurdering av den ansvarlige lege. Egnete doseringer, er imidlertid innen området 0,1- 100 µg/kg av individet.
En vaksinesammensetning er hensiktsmessig i injiserbar form. Konvensjonelle adjuvanter kan benyttes for å forsterke immunresponsen. En egnet enhetsdosering for vaksinering er 0,5- 5 µg/kg antigen, og en slik dosering administreres fortrinnsvis 1-3 ganger og med et intervall på 1-3 uker. Med de angitte doseringsområder vil ingen skadelige toksiske effekter observeres med forbindelsen ifølge beskrivelsen som kan forkludre deres administrering til egnete individer.
Brede variasjoner i de nødvendige doseringer kan imidlertid forventes i lys av varieteten av forbindelser tilgjengelig og de forskjellige effektiviteter av de forskjellige administrasjonsruter. For eksempel vil oral administrering forventes å kreve høyere doseringer enn administrering ved intravenøs injeksjon. Variasjoner i disse doseringsnivåer kan justeres ved anvendelse av standard empiriske ruter for optimalisering, og disse er godt forstått innen fagfeltet.
Sekvens databaser, Sekvenser i virkelig medium, og algoritmer.
Polynukleotid og polypeptidsekvenser danner en nyttig informasjonskilde for å bestemme deres 2- og 3- dimensjonale struktur og likeledes for å identifisere ytterligere sekvenser med tilsvarende homologi. Disse tilnærminger kan fremmes ved å lagre sekvensen i et datamaskinlesbart medium og deretter anvender de lagrete data på kjent makromolekylstrukturprogram eller for å søke sekvensdatabase ved anvendelse av kjente søkeredskaper så som GCG- programpakken.
I denne beskrivelsen er det også beskrevet fremgangsmåter for analyse av karaktersekvenser eller strenger, fortrinnsvis genetiske sekvenser eller kodete proteinsekvenser. Foretrukne fremgangsmåter for sekvensanalyse inkluderer for eksempel fremgangsmåter for sekvenshomologi analyse, så som identitet og likhetsanalyse, DNA, RNA og proteinstrukturanalyser, sekvenssammenstilling, kladistiske analyser, sekvensmotiv analyser, bestemmelse av åpen leseramme, nukleinsyrebase melding, kodan analyse, nukleinsyrebase trimming, og sekvenskromatogram toppanalyser.
En datamaskinbasert metode tilveiebringes for å utføre homologi identifisering. Denne fremgangsmåte omfatter trinnene å: tilveiebringe en første polynukleotidsekvens omfattende sekvensen av et polynukleotid i et datamaskinlesbart medium; og sammenligne nevnte første polynukleotidsekvens til i det minste en andre polynukleotid eller polypeptidsekvens for å identifisere homologi.
En datamaskinbasert fremgangsmåte er også tilveiebrakt for å utføre homologi identifisering, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: tilveiebringe en første polypeptidsekvens omfattende sekvensen av et polypeptid i et datamaskinlesbart medium; og sammenligne den første polypeptidsekvens til minst en andre polynukleotid eller polypeptidsekvens for å identifisere homologi.
Alle publikasjoner og referanser, inkluderende men ikke begrenset til patenter og patentsøknader, angitt i denne beskrivelse inkorporeres heri med referanse i sine helheter som om de individuelle publikasjoner eller referanser spesifikt og individuelt var oppgitt til å være inkorporert med referanse heri som fullstendig fremsatt. Enhver patentsøknad som denne søknad krever prioritet fra inkorporeres også med referanse heri i sine helheter på den måte som er beskrevet over for publikasjoner og referanser.
Definisjoner.
"Identitet," som kjent innen fagfeltet, er forholdet mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser, som tilfellet måtte være, som bestemt ved sammenligning av sekvensene. Innen fagfeltet betyr ”identitet” også graden av sekvens relaterthet mellom polypeptid- eller polynukleotidsekvenser, slik tilfellet måtte være, som bestemt med match mellom strenger av slike sekvenser. ”identitet” kan enkelt beregnes ved kjente fremgangsmåter inkluderende men ikke begrensende til de som er beskrevet i (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;
Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Fremgangsmåter for å bestemme identitet er konstruert for å gi den største match mellom sekvensene som testes. Videre, fremgangsmåtene for å bestemme identitet er kodifisert i offentlig tilgjengelige datamaskinprogrammer.
Datamaskinsprogrammetoder for å bestemme identitet mellom to sekvenser inkluderer, men er ikke begrenset til, GAP- programmet i GCG-programpakken (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol.215: 403-410 (1990), and FASTA (Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). BLAST- familien av programmer er offentlig tilgjengelig fra NCBI og andre kilder (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990). Den kjente Smith Waterman algoritme kan også anvendes for å bestemme identitet.
Parametere for polypeptidsekvens sammenligninger inkluderer følgende:
Algoritme: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol.48: 443-453 (1970)
Sammenligningsmatriks: BLOSSUM62 fra Henikoff og Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)
Gap Penalty: 8
Gap Lengde Penalty: 2
Program som er nyttig med disse parametere er offentlig tilgjengelig som "gap"-programmet fra Genetics Computer Group, Madison WI. De ovenfor nevnte parametere er default parametere for peptidsammenligning (sammen med ingen penalty for ende-gap).
Parametere for polynukleotid sammenligning inkluderer følgende:
Algoritme: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol.48: 443-453 (1970) Sammenligningsmatriks: matcher = 10, mismatch = 0
Gap Penalty: 50
Gap Lengde Penalty: 3
Tilgjengelig som "gap"-programmet fra Genetics Computer Group, Madison WI. Disse er default parametere for nukleinsyresammenligninger.
En foretrukket betydning for ”identitet” for polynukleotider og polypeptider, slik tilfellet måtte være, er tilveiebrakt i (1) og (2) nedenfor.
(1) Polynukleotid utførelser inkluderer ytterligere en isolert polynukleotid omfattende en polynukleotidsekvens som har minst 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 eller 100 % identitet til referansesekvensen ifølge SEQ ID NO: 11 , hvor nevnte polynukleotidsekvens kan være identisk til referansesekvensen ifølge SEQ ID NO: 11 eller kan inkludere opptil et visst heltall tall en nukleotidforandring sammenlignet med referansesekvensene, hvor nevnte forandringer er valgt blant gruppen omfattende minst en nukleotiddeletering, substituering, inkluderende transisjon og transasjon, eller innskudd, og hvor nevnte forandringer kan forekomme ved 5' eller 3' – terminale posisjoner av referansenukleotidsekvensen eller ethvert sted mellom disse terminale posisjoner, enten spredt individuelt blant nukleotidene i referansesekvensen eller i en eller flere kontigøse grupper innen referansesekvensen, og hvor nevnte antall nukleotidforandringer bestemmes ved å multiplisere totale antall nukleotider i SEQ ID NO: 11 med heltallet som definerer prosentidentitet delt med 100 og deretter subtrahere produktet fra nevnte totale antall nukleotider i SEQ ID NO: 11 , eller:
nn ≤ xn - (xn • y),
hvor nn er antallet nukleotidforandringer, xn er det totale antall nukleotider i SEQ ID NO: 11 , y er 0,50 for 50 %, 0,60 for 60 %, 0,70 for 70 %, 0,80 for 80 %, 0,85 for 85 %, 0,90 for 90 %, 0,95 for 95 %, 0,97 for 97 % eller 1,00 for 100 %, og • er symbolet for multipliserings operatoren, og hvor ethvert ikke- heltallprodukt av xn og y avrundes ned til nærmeste heltall før man subtraherer det fra xn. Forandringer av polynukleotidsekvensene som koder for polypeptidene ifølge SEQ ID NO:1-10 kan etablere ikkesense, miss sense eller frameshift mutasjoner i denne kodende sekvens og dermed forandre polypeptidet som kodes for av polynukleotidet etterfulgt av slike forandringer.
Som et eksepel, en polynukleotidsekvens kan være identisk til referansesekvensene ifølge SEQ ID NO: 11 , det vil si den kan være 100 % identisk, eller den kan inkludere opptil et visst heltall antall av nukleinsyreforandringer sammenlignet med referansesekvensen slik at prosent identitet er mindre enn 100 % identitet. Slike forandringer utvelges fra gruppen omfattende i det minste en nukleinsyredeletering, substituering, inkluderende transisjon og transversjon, eller innskudd, og hvor nevnte forandringer kan forekomme ved 5' eller 3' terminale posisjoner av referanse polynukleotidsekvensen eller ethvert sted mellom disse terminale posisjoner, spredt enten individuelt langs nukleinsyren i referansesekvensen eller i en eller flere kontigøse grupper innen referansesekvensen. Antallet nukleinsyreforandringer for en gitt prosentidentitet bestemmes ved å multiplisere totalt antall nukleinsyrer i SEQ ID NO: 11 med heltallet som definerer prosentidentitet delt med 100 og deretter subtrahere dette produkt fra nevnte totale antall nukleinsyrer i SEQ ID NO: 11, eller:
nn ≤ xn - (xn • y),
hvor nn er antallet nukleinsyreforandringer, xn er det totale antall nukleinsyrer i SEQ ID NO: 11, y er for eksempel 0,70 for 70 %, 0,80 for 80 %, 0,85 for 85 % etc., • er symbolet for multiplikasjonsoperator, og hvor ethvert ikkeheteroprodukt av xn og y avrundes ned til nærmeste heltall før subtrahering fra xn.
(2) Polypeptidutførelser inkluderer ytterligere et isolert polypeptid omfattende en polypeptid som har minst 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 eller 100 % identitet til polypeptid referansesekvensen ifølge SEQ ID NO:1-10, hvor nevnte polypeptidsekvens er identisk til referansesekvensen ifølge SEQ ID NO:1-10 eller kan inkludere opptil et visst heltallnummer av aminosyreforandringer sammenlignet med referansesekvensen, hvor nevnte forandringer er valgt blant gruppen omfattende minst en aminosyredeletering, substituering, inkluderende konservative og ikke- konservative substitueringer, eller innskudd, og hvor nevnte forandringer kan forekomme ved amino eller karboksyterminale posisjoner av referanse polypeptidsekvensen eller ethvert sted mellom disse terminale posisjoner, spredt enten individuelt blant aminosyrene i referansesekvensen eller i en eller flere kontigøse grupper innen referansesekvensen, og hvor nevnte antall aminosyreforandringer bestemmes ved å multiplisere det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:1-10 med et heltall som definere prosentidentitet delt på 100 og deretter subtrahere dette produkt fra nevnte totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:1-10, respektivt, eller:
na ≤ xa - (xa • y),
hvor na er antallet aminosyreforandringer, xa er det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:1-10, y er 0,50 for 50 %, 0,60 for 60 %, 0,70 for 70 %, 0,80 for 80 %, 0,85 for 85 %, 0,90 for 90 %, 0,95 for 95 %, 0,97 for 97 % eller 1,00 for 100 %, og • er symbolet for multiplikasjonsoperatoren, og hvor ethvert ikke- heltallprodukt av xa og y avrundes ned til nærmeste heltall før subtrahering fra xa.
Som eksempel, en polypeptidsekvens kan være identisk til referansesekvensen ifølge SEQ ID NO:1-10, det vil si den kan være 100 % identisk, eller kan inkludere opptil et visst heltall antall av aminosyreforandringer sammenlignet med referansesekvensen slik at prosentidentitet er mindre enn 100 % identitet. Slike forandringer utvelges blant gruppen omfattende i det minste en aminosyredeletering, substituering, inkluderende konservative og ikke- konservativ substituering, eller innskudd, og hvor nevnte altereringer kan forekomme ved amino- eller karboksyterminale posisjoner av referanse polypeptidsekvensen eller ethvert sted mellom disse terminale posisjoner, spredt enten individuelt blant aminosyrene i referansesekvensen eller i en eller flere kontigøse grupper innen referansesekvensen. Antallet aminosyreforandringer for en gitt prosentidentitet bestemmes ved å multiplisere det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:1-10 med heltallet som definerer prosentidentitet delt med 100 og deretter subtrahere dette produkt fra nevnte totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:1-10, eller:
na ≤ xa - (xa • y),
hvor na er antallet aminosyreforandringer, xa er det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:1-10, y er for eksempel 0,70 for 70 %, 0,80 for 80 %, 0,85 for 85 % etc., og • er symbolet for multiplikasjonsoperatoren, og hvor ethvert ikke- heltallprodukt av xa og y avrundes ned til nærmeste heltall før subtrahering fra xa.
"Individ(er)," idet det anvendes heri med referanse til en organisme angir en multicelle eukariot, inkluderende men ikke begrenset til metazoan, pattedyr, ovid, bovid, simian, primat og et menneske.
"Isolert" betyr forandret ”med menneskehånd” fra dets naturlige form, det vil si dersom det forekommer i naturen så har det blitt forandret eller fjernet fra sitt opprinnelige miljø, eller begge deler. For eksempel, et polynukleotid eller et polypeptid som naturlig forekommer i en levende organisme er ikke ”isolert”, men det samme polynukleotid eller polypeptid separert fra det koeksisterende materiale i sin naturlige tilstand er ”isolert”, som termen benyttes heri. Videre, et polynukleotid eller polypeptid som introduseres i en organisme ved transformasjon, genetisk manipulering eller på enhver annen rekombinant måte er ”isolert” selv om den fremdeles foreligger i nevnte organisme, og hvor organismen kan være levende eller- ikke levende.
"Polynukleotid(er)" refererer generelt til enhver polyribonukleotid eller polydeoksyribonukleotid, som kan være ikke- modifisert RNA eller DNA, eller modifisert RNA eller DNA inkluderende enkelt og dobbelttrådete regioner.
“Variant” refererer til et polynukleotid eller polypeptid som avviker fra en referanse polynukleotid eller polypeptid, men som opprettholder essensielle egenskaper. En typisk variant av et polynukleotid avviker i nukleotidsekvens fra et annet referanse polynukleotid. Forandringer i nukleotidsekvensen av varianten kan eller trenger ikke å forandre aminosyresekvensen av et polypeptid som kodes for av referanse polynukleotider. Nukleotidforandringer kan resultere i aminosyresubstitueringer, addisjoner, deleteringer, fusjoner og trankeringer i polypeptidet som kodes for av referansesekvensen, som diskutert nedenfor. En typisk variant av et polypeptid avviker i aminosyresekvens fra et annet, referansepolypeptidet. Generelt, forskjeller er begrenset slik at sekvensene av referansepolypeptidet og variantene er nært totalt lignende, og i mange regioner identiske. En variant og referansepolypeptidet kan avvike i aminosyresekvens med en eller flere substitueringer, addisjoner, deleteringer i enhver kombinasjon. En substituert eller innsatt aminosyreenhet kan eller trenger ikke å være en som kodes for av den genetiske kode. En variant av et polynukleotid eller polypeptid kan være naturlig forekommende så som en allelisk variant, eller det kan være en variant som er kjent å forekomme naturlig. Ikke- naturlig forekommende varianter av polynukleotider og polypeptider kan fremstilles med mutageneseteknikker eller med direkte syntese.
"Sykdom(er)" betyr enhver sykdom forårsaket eller relatert til infeksjon av en bakterie, inkluderende for eksempel otitt media i spedbarn og barn, lungebetennelse i eldre, sinusitt, nasokomiale infeksjoner og invasive sykdommer, kronisk otitt media med hørselstap, fluidakkumulering i midtøre, auditiv nerveskade, forsinket talelæring, infeksjon av øvre respirasjonstrakt og informasjon i midtøre.
Eksperimentell seksjon
Eksemplene nedenfor er utført ved anvendelse av standard teknikker, som er godt kjent for, og rutinemessige for de fagkyndige innen feltet, eller de er beskrevet i detaljer. Eksemplene er illustrerende, og begrenser ikke oppfinnelsen.
Foreliggende undersøkelser beskriver isolering, rensing, karakterisering, kloning og ekspresjon av det nye yttermembranprotein benevnt protein E (pE) av H. influenzae og det nye trunkerte rekombinante pE(A), som ble oppdaget ved anvendelse av et humant IgD(λ) myelom serum.
Materialer og metoder.
Reagenser
Type b H. influenzae stammer MinnA og NTHi3655 var tilgjengelig fra Robert S. Munson Jr. (Washington University School of Medicine (St. Louis, Mo). Ikketypebestembar H. influenzae stamme NTHi772 var et klinisk isolat fra en nasofaryngeal swabkultur ved vår avdeling (2). En serie forskjellige Haemophilus arter ble også analysert og er beskrevet i Tabell 1. Human IgD myelom helserum IgD( λ) ble innkjøpt fra The Binding Site (Birmingham, England). For å produsere et spesifikt anti-pE antiserum, ble kaniner immunisert intramuskulært med 200 μg rekombinant pE22-160 [pE(A)] emulsifisert i komplett Freunds adjuvant (Difco, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) eller pE41-68 peptid konjugert til keyhole limpet hemocyanin (KLH) og boostet ved dag 18 og 36 med samme dosering av protein i ukomplett Freunds adjuvans. Blod ble opptatt 2 til 3 uker senere. Resulterende polyklonale antistoff ble isolert med affinitetskromatografi ved anvendelse av pE(A) eller spesifikt pE peptid (pE41-68) konjugert til CnBr-Sepharose (11). Pepperrot peroksidase (HRP)-konjugert geit antihuman IgD var fra Biosource (Camarillo, CA). Kanin antihuman IgD pAb var fra Dakopatts (Gentofte, Denmark).
Fluoresinisotiocyanat (FITC)- konjugert mus anti-human IgD, HRP-konjugert kanin anti-human lettkjede ( κ og λ), og FITC-konjugert svin anti-kanin polyklonale immunoglobuliner ble innkjøpt fra Dakopatts.
Ekstrahering og rensing av protein E
H. influenzae type b (MinnA) fikk vokse natten over i brain heart infusjon (BHI) løsning (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) tilsatt NAD og hemin (Sigma, St. Louis, MO), hver ved 10 μg/ml. Etter to vask ble bakteriene ekstrahert i 0,05 M Tris-HClbuffer (pH 8,8) inneholdende 0,5 % Empigen<® >(Calbiochem Novabiochem, Bedford, MA). Den bakterielle suspensjon ble blandet med magnetisk omrøring i 2 t ved 37 °C. Etter sentrifugering ved 8000 x g i 20 min ved 4 °C, ble supernantanten filtrert med sterilfilter (0,45 μm; Sterivex-HV, Millipore). H. influenzae ekstrakt i 0,5 % Empigen<® >ble applisert på en Q-sefarose kolonne (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrert med 0,05 M Tris-HCl (pH 8,8) inneholdende 6 M urea. Kolonnen ble eluert ved anvendelse av en 0 til 1 M NaCl lineær gradient i den samme buffer. Fraksjoner som ble detektert med IgD(λ) myelomserum ble samlet, dialysert i en Spectraphor membran rør (molekylvekt cut off 6-8,000; Spectrum, Laguna hills, CA) mot 0,05 M Tris-HCl, pH 8,8, og konsentrert på YM100 skivemembraner (molekylvekt cut off 10,000; Amicon, Beverly, MA).
SDS-PAGE og deteksjon av proteiner på membraner (Western blot)
SDS-PAGE ble kjørt ved 150 konstant spenning ved anvendelse av 10 % Bis-Tris geler med kjørebuffer (MES), prøvebuffer (LDS), og overføringsbuffer, og likeledes et blottinginstrument fra Novex (San Diego, CA). Prøvene ble regelmessig oppvarmet ved 100 °C i 10 min. Gelene ble farget med Coomassie Brilliant Blue R-250 (13; Bio-Rad, Sundbyberg, Sweden). Elektroforetisk overføring av proteinbånd fra gelen til en immobilon-P membran (Millipore, Bedford, MA) ble utført ved 30 v i 2 til 3 t. Etter overføring ble immobilon-P membranen blokkert i PBS ved 0,05 % Tween 20 (PBS-Tween) inneholdende 5 % melkepulver. Etter flere vask i PBS-Tween, ble membranen inkubert med renset IgD myelom protein (0,5 μg/ml, hu IgD(λ) myelom; The Bindingsite) i PBS-Tween inkluderende 2 % melkepulver i 1 t ved romtemperatur. HRP-konjugert geit antihuman IgD fortynnet 1/1000 ble tilsatt etter flere vask i PBS-Tween. Etter inkubering i 40 min ved romtemperatur og flere ytterligere vaskinger i PBS-Tween, ble utviklingen utført med ECL Western blotting deteksjonsreagenser (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
Todimensjonale SDS-polyakrylamid gel elektroforese (2-D PAGE) og Western blot Etter ioneutbytte kromatografi ble Empigen<® >ekstrakter av H. influenzae (MinnA) underlagt isoelektrisk fokusering (IEF) ved anvendelse av IPGphor IEF System (Amersham Pharmacia Biotech) (5,12). For gelkalibrering ble en standard anvendt (katalog nr.161-0320; Bio-Rad). 2-D polyakrylamidgeler ble elektroblottet til Immobilon-PVDF filtere (0,45 mm; Millipore, Bedford, US) ved 120 mA natten over. Etter metting ble inkubering, blokkering og vasketrinn utført som beskrevet over.
Aminosyre sekvensanalyser.
Automatiserte aminosyresekvensanalyser ble utført med Applied Biosystems (Foster City, CA) 470A gassvæske fastfasesekvensator.
Konstruksjon av et H. influenzae genomisk bibliotek.
Kromosomalt DNA ble preparert fra stamme 772 ved anvendelse av en modifisering av metoden ifølge Berns and Thomas (2,13). Kort forklart, et H. influenzae 772 genomisk bibliotek ble konstruert fra 40 μg DNA som var partielt oppkuttet med Sau3A i 1 t. Det oppkuttete DNA ble fraksjonert på en sukrosegradient (14). Fraksjoner inneholdende DNA- fragmenter av egnete størrelser (2 til 7 kbp) ble samlet, og DNAen ble ligert til BamHI-oppkuttet pUC18 etterfulgt av transformasjon inn i Escherichia coli JM83 med elektroporering ved anvendelse av en Gene pulser (Bio-Rad, Richmond CA). Bakteriene ble utsådd på LB agar tilsatt ampicillin og X-Gal (5-brom-4-klor-3-indolyl- β-D-galaktopyranosid).
Koloni immunoanalyse, DNA isolering og sekvensering.
E. coli transformantene, dyrket natten over på LB agar, ble overført til nitrocellulose filtere (Sartorius, Göttingen, Germany) ved å dekke agaroverflatene med tørre filtere. Platene ble satt til henstand i 15 min, og cellene ble lysert med eksponering til mettet kloroformdamp i 20 min. Resterende proteinbindingssete på filtrene ble blokkert med inkubering av filtrene i Tris balansert saltløsning inneholdende ovalbumin (50 mM Tris-hydroklorid, 154 mM NaCl, 1,5 % ovalbumin [pH 7,4]) i 30 min. Etter blokkering ble filtrene inkubert med human IgD(λ) i 30 min. HRP-konjugert antihuman IgD polyklonale antistoff ble tilsatt etter vask og filtrene ble inkubert i 30 min. Alle innkuberinger ble utført ved romtemperatur. Til slutt ble filtrene utviklet ved anvendelse av 4-klor-1-naftol og H2O2. Positive kloner ble plukket og pUC18 plasmid DNA inneholdende NTHi772 genomisk DNA ble renset. Det resulterende NTHi772 DNA innskudd ble sekvensert ved anvendelse av flankerende primere M13+ og M13- og BigDye Terminator Cycle Sequencing v.2.0 Ready reaction sekvenserings kitt (Perkin-Elmer, Foster City, Ca). Den oppnådde innskuddsekvens (3,55 kbp) korresponderte til et strekk inneholdende DNA som koder for proteinen HI0175, HI0176, HI0177, og til slutt HI0178 (15).
DNA- kloning og proteinekspresjon.
Alle konstrukter ble fremstilt ved anvendelse av PCR mangfoldiggjorte fragmenter. pUC18 inneholdende NTHi 772 genomisk DNA (HI0175 til HI0178) ble anvendt som templat. Taq DNA polymerase var fra Roche (Mannheim, Germany) og PCR. Betingelser var som anbefalt av leverandøren. De åpne leserammer for de fire prediktive proteiner HI0175 til HI0178 ble klonet, men kun prosedyren for beskrivelse av kloning av HID (HI0178) har blitt inkludert heri. pE<22-160 >[angitt som pE(A)] manglet det endogene signalpeptid inkluderende aminosyreenhet glutamine<21 >og ble mangfoldiggjort ved PCR ved anvendelse av primere 5 ́-ctcaggatccaaaggctgaacaaaatgatgtg-3 ́ og 5 ́-ggtgcagattaagcttttttttatcaactg-3 ́ som introduserer restriksjonsenzymsetene BamHI og HindIII. For å fusjonere 6 histidinenheter som kodes for av ekspresjonsvektoren ble pE<22-160 >stoppkodon mutert. Det resulterende 417 bp åpne leseramme av pe genet ble ligert inn i pET26(+) (Novagen, Darmstadt, Germany). For å unngå sannsynlig toksisitet ble de resulterende plasmider frøst transformert inn i vert E. coli DH5 α. Deretter ble plasmidene som koder for pE og pE(A) transformert inn i den uttrykkende vert BL21(DE3). I tillegg til fullengde pE og pE(A), ble en serie trunkerte pE varianter fremstilt. En oversikt er vist i fig 8. Primere inneholdende BamHI og HindIII ble anvendt for alle konstrukter. Prosedyrene for de trunkerte varianter var som beskrevet over. Alle konstrukter ble sekvensert ved anvendelse av BigDye Terminator Cycle Sequencing v.2.0 Reaksjonssekvenserings kitt (Perkin-Elmer, Foster City, Ca).
For å produsere rekombinante proteiner fikk bakteriene vokse til mid-log fase (OD6000,6 til 0,8) etterfulgt av induksjon med 1 mM isopropyl-1-tio- β-D-galaktosid (IPTG) resulterende i overekspresjon av pE(A). Idet OD600 nådde 1,5 til 1,7,
ble bakteriene høstet og inklusjonslegemer isolert i samsvar med standard protokoll. Rekombinante proteiner kan ytterligere renses med affinitetskromatografi ved anvendelse av nikkelkolonner. Rensete rekombinante proteiner ble deretter analysert med SDS-PAGE.
H. influenzae DNA-rensing, PCR- betingelser og sekvensering.
Genomisk DNA fra H. influenzae kliniske isolater ble isolert ved anvendelse av DNeasy Tissue kitt (Qiagen, Hilden, Germany). Taq DNA polymerase var fra Roche (Mannheim, Tyskland) og PCR- betingelser var som anbefalt av leverandør. For å isolere pe genet, ble primerpar 5 ́-gcatttattaggtcagtttattg-3 ́ og
5 ́-gaaggattatttctgatgcag-3 ́, som anniler til flankerende gener HI0177 respektivt HI0179 anvendt. Resulterende PCR produkter (948 bp) ble sekvensert med genewalking ved anvendelse av ovenfor nevnte primere i tillegg til primerene 5 ́-cttgggttacttaccgcttg-3 ́ og 5 ́-gtgttaaacttaacgtatg-3 ́. Kappilær elektroforese ble kjørt på en Beckman CEQ 2000 ved anvendelse av et (CEQ DTCS kit, Beckman Coulter, Stockholm, Sweden). Editering og aligment av de resulterende DNA- sekvenser ble utført ved anvendelse av PHRED (CodonCode, Deadham, USA) og SEQUENCHER (MedProbe, Oslo, Norway).
Fremstilling av en pE-manglende H. influenzae (NTHi 3655 Δpe)
Genomisk DNA isolert fra NTHi 772 ble anvendt som templat.5’- og 3 ́-endene av pe- inkluderende deler av genene HI0177 og HI0179 ble mangfoldiggjort som to kassetter (815 bp og 836 bp, respektivt) ved anvendelse av DyNAzyme™ II DNA polymeras (Finnzymes, Espoo, Finland) som introduserer restriksjonsenzymsetene XhoI og EcoRI respektivt EcoRI og SpEI i tillegg til spesifikke opptakssekvenser i de to kassetter (18). Resulterende PCR- fragmenter ble oppkuttet og klonet inn i pBluescript SK (+/-). Et kanamycin resistent genkassett (1282 bp) ble oppnådd fra pUC4K ved anvendelse av restriksjonsenzymsete for EcoRI. Etter oppkutting ble PCR- produktet ligert inn i det trunkerte pe-genfragment inneholdende deler av HI0177 og HI0179 genene. H. influenzae stammer Eagan og RM804ble transformert i samsvar med M-IV metoden ifølge Heriott et al. (19). Resulterende mutanter ble verifisert med PCR og pE ekspresjon ble analysert med Western blot og flow cytometri.
Programvare for molekylær biologi.
Oppnådde sekvenser ble sammenlignet med tilgjengelige H. influenzae KW20 genom (http://www.tigr.org) (15). Signalpeptidet ble dedusert ved anvendelse av SignalP V1.1 World Wide Web Prediction Server Center for Biological Sequence Analysis (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/) (16). pE hydrofobisitetsprofil ble analysert med metoden ifølge Kyte and Doolittle (17).
Dyr, kirurgiske prosedyrer og rotte otitt media modell.
Friske hannkjønn Sprague-Dawley rotter, med en vekt 200-250 g ble anvendt. Alle dyrene var fri for midtøreinfeksjoner som bestemt med otomikroskopi før operasjon. Ved intervensjonene ble rottene anestetisert med metoheksital (Brietal®, Elli Lilly and Company, Indianapolis, IN) intravenøst eller kloral hydrat (apoteksbolaget, Lund, Sweden) intraperitonealt. Bakterier for dyreeksperimenter fikk vokse som beskrevet over. Etter høsting med sentrifugering ble bakteriene resuspendert i ferskt dyrkningsmedium til en konsentrasjon av 2x10<10 >kolonidannende enheter (cfu) for både NTHi 3655 og korresponderende pE mutant. Preparatene ble holdt på is inntil bruk. For å indusere akutt otittis media (AOM), ble det midtre øret nådd med en ventral midtlinjeinnsnitt i halsen, og ca 0,05 ml av bakteriesuspensjonen ble innstillert inn i midtre øre hulrom. Otomikroskopi ble utført på dager 3 og 5 etter operativt inngrep. Otittis media med perulent effusjon, det vil si en opaque effusjon og ofte en uttalt dilatering av karene ved dag 3 ble referert til som AOM.
Resultater
Ekstrahering og separering av en H. influenzae protein (pE) som detekteres av en IgD( λ) myelomserum.
Det har tidligere vært antatt at ikke-typebestembar H. influenzae (NTHi) ikke binder IgD (19), mens innkapslet H. influenzae sterkt binder IgD. Vi har vist at en IgD( λ) myelomserum spesifikt binder også til NTHi. En typisk cytometri profil av NTHi772 er vist i fig 1. Et sterkt skifte og øket fluoressens ble funnet i nærvær av IgD( λ) myelomprotein sammenlignet med kontroll uten IgD.
For i detalj å analysere H. influenzae yttermembranprotein som ble detektert med IgD( λ) myelom, ble en yttermembran fraksjon solubilisert i detergenten Empigen<®>. Fig.1B viser at en svært sterk IgD-bindende aktivitet ble oppnådd på Western blots for et protein med en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 16 kDa. Imidlertid, intet distinkt proteinbånd korresponderende til IgD-bindingsaktivitet kunne detekteres på Coomassie Brilliant blue-farget SDS-PAGE. Etter separering på en Q-Sepharose kolonne ble det samme yttermembran ekstrakt applisert til todimensjonal gelelektroforese og sølvfarging (fig 1C). Parallelt, et korresponderende Western blot probet med human IgD( λ) ble utført. Arealet hvor pE ble lokalisert kunne således innsirkles. Imidlertid, intet synlig protein ble observert (Fig.1C).
Kloning av protein E og fremstilling av en ikke-typebestembar. H. influenzae mutant som mangler pE.
Siden vi ikke kunne detektere noe protein i 2-D analysene etter separering ble et H. influenzae DNA – bibliotek konstruert ved anvendelse av ikke-typebestembar H. influenzae (NTHi) stamme 772. Genomisk DNA- inneholdende fragmenter i området 2 til 7 kbp ble ligert inn i pUC18 etterfulgt av transformasjon inn i E. coli JM83. Transformantene ble analysert for IgD-binding ved anvendelse av koloni immunoanalyse som består av human IgD( λ) og HRP-konjugert anti-human IgD polyklonale antistoff. Tre positive kloner ble funnet av 20,000 kolonier som ble testet og ble underlagt en andre runde for screening med IgD( λ). Vi sekvenserte en av de positive kloner og fant et 3,55 kb innskudd inneholdende DNA som koder for de fire proteiner HI0175 til HI0178 i samsvar med det fysiske kart for H. influenzae KW20 (15). For ytterligere å verifisere den spesifikke interaksjon med IgD( λ) ble de selekterte transformanter også analysert med flow cytometri. Som det fremgår fra fig.
2B, E. coli JM83 som huser H. influenzae 772 genomisk DNA korresponderende til sekvensen som koder for HI0175 til HI0178 ble detektert med IgD( λ) sammenlignet med kun en tom vektor (Fig.2A).
I tillegg til analyser av E. coli JM83 klonen, ble de fire H. influenzae proteiner (HI0175 til HI0178) klonet inn i ekspresjonsvektoren pET26(+) og produsert i E. coli BL21DE3. De resulterende rekombinante proteiner ble analysert med IgD( λ) på Western blots og HI0178 ble funnet til å være det eneste protein som ble detektert med IgD( λ) (data ikke vist).
En ikke-typebestembar H. influenzae (NTHi 3655) ble mutert med introdusering av et kanamycin resistans genkassett i genet som koder for pE. Resulterende mutanter ble bekreftet med PCR og fravær av pE- ekspresjon ble vist med analyser av yttermembranproteinet i Western blots ved anvendelse av et spesifikt anti-pE antiserum (data ikke vist). NTHi 3655 Δpe-mutanten ble også testet med flow cytometri og en klart redusert fluoressens ble funnet med mutanten sammenlignet med korresponderende NTHi 3655 villtype idet det ble analysert med et kanin antipE monovalent antiserum og et FITC-konjugert geit anti-kanin sekundært pAb (Fig. 2C og D).
Protein E ble detektert i alle H. influenzae, mens andre subspesis var negative.
For å analysere pE- ekspresjon i kliniske isolater og klassifisere stammer av NTHi utviklet vi en direkte bindings flow cytometri analyse bestående av IgD( λ) serum og et FITC-konjugert sekundært antistoff rettet mot human IgD. I innledende eksperimenter ble bakterier samlet ved forskjellig tidspunkt analysert for pE-ekspresjon. Ingen forskjell ble observert med hensyn til pE- ekspresjon mellom logaritmisk vekst eller stasjonær fase bakterier, noe som antyder at NTHi overflate pE ikke var avhengig av vekstfase. Stasjonær fase bakerier ble således anvendt i alle ytterligere analyser. Gjennomsnitt fluoressens intensitet (mfi) per bakteriecelle ble analysert og et total på 22 NTHi stammer ble inkludert i vårt studium.
Fluoressens intensitet varierte mellom forskjellige NTHi- stammer, skjønt pE ble detektert i en hovedandel av NTHi i denne bestemte analyse som anvender IgD(λ) myelom serum som deteksjonsantistoff (Fig.3).
I andre eksperimenter ble spesifikke kanin anti-pE antistoff anvendt for deteksjon av overflateeksponert pE. Spesifikke anti-pE antiserum gjenkjenner spesifikt pE også i innkapslete stammer av H. influenzae, H. aegypticus, og H. haemolyticus.(data ikke vist).
For ytterligere å analysere pE- ekspresjonsnivåer ble Empigen<®>-behandlete yttermembranekstrakter av forskjellige haemophilus arter testet i Western blots ved anvendelse av IgD( λ) som deteksjonsantistoff (Tabell 1). I disse eksperimenter ble ingen forskjell mellomhøy og lavt uttrykkende haemophilus stammer funnet, det vil si i Western blots oppviste alle stammer pE i samme intensitet og i samme posisjon korresponderende til 16 kDa. Innkapslet H. influenzae (type a til f) uttrykte også pE som vist med Western blots (Tabell 1). For eksempel, pE – uttrykking i fire H. influenzae kapsel type b (Hib) sammenlignes med NTHi i fig.4. H. aegypticus, og H. haemolyticus uttrykt i pE (Tabell 1), mens for de andre relaterte haemophilus arter, som var negative i flow cytometri (fig.3), ble intet pE detektert i Western blot analyser. Det spesifikke anti-pE antiserum gjenkjenner spesifikt pE også i innkapslete stammer (data ikke vist).
Tabell 1
Rekombinant produsert pE22-160 [pE(A)] detekteres med IgD( λ)
I innledende eksperimenter forsøkte vi rekombinant å fremstille pE, men kun små konsentrasjoner ble oppnådd. For å maksimere proteinutbytte ble et trunkert pE fragment bestående av aminosyreenheter lysine22 til lysine160 konstruert. Det N-terminale signalpeptid inkluderende aminosyre glutamin 21 ble således fjernet og erstattet med et lederpeptid i tillegg til ni enheter fra vektoren pET26(+) (fig.5A). Det trunkerte pE22-160 ble angitt som pE(A) (fig.5B). For å bekrefte at det rekombinante proteinprodukt korresponderte til ”villtype pE”, ble rekombinant uttrykt pE (A) sammen med pE isolert fra NTHi 772 analysert med SDS-PAGE og Western blot ved anvendelse av IgD( λ) som probe. Som vist i fig.5D, korresponderte rekombinant pE(A) signifikant til villtype pE i SDS-PAGE. Videre, pE(A) produsert i E. coli kunne detekteres ned til 0,01 mikrogram med IgD( λ) antiserum (Fig.5E).
pE(A) ble anvendt for immunisering av kaniner og etter fullføring av immuniseringsregimet som beskrevet i detalj i materialer og metoder ble anti-pE antiserum renset på en kolonne bestående av et beregnet immunodominant peptid (aminosyrer pE41-68). De resulterende antistoff detekterte klart pE både ved den bakterielle overflate (fig 2C) og i Western blots (ikke vist).
DNA sekvens av protein E- genet og åpen leseramme.
DNA og aminosyresekvens pE1-160 fra stamme NTHi 772 er gitt i fig.6. Den åpne leseramme (ORF) er 160 aminosyrer lang og det predikerte signalpeptid har en lengde på 20 aminosyrer. Datamaskinanalyser antyder at signalpeptidase gjenkjenner aminosyreenheter allanin 18 til lysin 22 og spalter mellom enheter isoleusin 20 og glutamin 21 (38). Parallelt, HID hydropati profil (39) viser at pE har et hydrofobt signalpeptid, mens resten av molekylet er i hovedsak hydrofilt. (fig.7).
For i detalj å bestemme signalpeptidase spaltingssete ble rekombinant fullengde pE underlagt Edman- degradering. Imidlertid, den aminoterminale ende av pE polypeptidkjeden var sannsynligvis blokkert. En mulig forklaring for denne feil kan være at den første aminosyre var en pyroglutamylenhet som tidligere beskrevet for M. catarrhalis UspA familie proteiner (11).
Imidlertid, forsøk på å fjerne denne putative enhet med pyroglutamat aminopeptidas feilet. I motsetning til fullengde pE1-160, ble den N-terminale sekvens for pE(A) (pE22-160) som mangler det endogene H. influenzae signalpeptid (Fig.5) med suksess karakterisert med Edman degradering og funnet å inneholde den predikerte vektorsekvens, det vil si signalpeptidasen i E. coli spaltet ved en korrekt posisjon (fig.
5A).
Protein E ble sekvensert i en serie forskjellige Haemophilus arter inkluderende NTHi og innkapslet H. influenzae (Tabell 1). Interessant, pE var i ekstraordinær grad konservert. Kun noen få aminosyrer var punktmutert og disse ble mutert i de fleste stammer etter et spesifikt mønster (fog 6 og Tabell 2).
Tabell 2
a) pe genet ble sekvensert i innkapslet H. influenzae type a (n=2), b (n=2), c (n=2), d (n=1), e (n=2), og f (n=3), NTHi (n=8), H. influenzae biovar aegypticus (n=6) og H. aegypticus (n=5), ved anvendelse av flankerende primere.
b) NTHi 772 (Sekvens ID No:1)
c) Rd angir H. influenzae stamme Rd.
Forskjellige fragmenter av pE kan enkelt produseres i E. coli
Åtte cDNA- sekvenser avledet fra fullengde pE ble klonet inn i pET26b(+) og uttrykt i E. coli. Resulterende proteiner ble renset på nikkelresiner med affinitet for histidinmarkører (fig 8). De rekombinante proteiner dekket hele den modne pE-proteinprodukt og deres individuelle lengder posisjoner var som vist i fig 8A og de rensete produkter er vist i fig 8B.
pE er en avgjørende virulensfaktor i rotte akutt otittis media (AOM)
For å undersøke funksjonen av pE som en virulens faktor for NTHi, ble rotter utfordret i midtøre med 10<5 >til 10<9 >NTHi 3655 Δpe eller korresponderende villtype NTHi 3655 (fig.9). Interessant, 100 til 1000 ganger mer NTHi 3655 Δpe var nødvendig for å indusere en tilsvarende AOM sammenlignet med villtype bakterien. Således, pE er en avgjørende virulensfaktor for NTHi-indusert AOM.
pE er sterkt immunogenisk i en definert populasjon.
For å måle antistoffnivåer i barn og bloddonorer ble rekombinant pE(A) renset fra E. coli (fig.5B) og anvendt i en ELISA. Resultatene av ELISA-analysene av antistoff mot pE(A) er vist i fig.9. Barn i en alder av mindre enn 6 mnd hadde detekterbar IgG og IgA mot pE(A). IgG- antistoff viste toppnivåer i barn av alder 5 til 10 år. I motsetning, IgA antistoff øker gradvis med økende alder og den høyeste verdi ble detektert i aldersgruppen 70 til 80 år.
Nyttige epitoper.
B-celle epitoper av et protein er i hovedsak lokalisert på dets overflate. For å predikere B- celle epitoper av protein E polypeptider ble to metoder kombinert: 2D strukturprediksjon og antigenisk indeksprediksjon.2D strukturprediksjon ble utført ved anvendelse av <PSIPRED >program (fra David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK). Den antigeniske indeks ble beregnet på basis av metoden beskrevet i Jameson and Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]). Parametrene anvendt i dette program er den antigeniske indeks og den minimale lengde for et antigenisk peptid. En antigenisk indeks på 0,9 for et minimum av 5 konsekutive aminosyrer ble anvendt som terskelverdi i programmet. Peptider som omfatter gode, potensielle B-celle epitoper er angitt i Tabell 3. Disse kan være nyttige (fortrinnsvis konjugert eller rekombinant koplet til et større protein) i en vaksinesammensetning for hindring av ntHi- infeksjoner, som også tilsvarende peptidet omfattende konservative mutasjoner (fortrinnsvis 70, 80, 85, 95, 99 eller 100 % identiske til sekvensene i Tabell 3) eller trunkater omfattende 5 eller flere (for eksempel 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 eller 25) aminosyrer derfra eller ekstensjoner omfattende for eksempel 1, 2, 3, 5, 10 ytterligere aminosyrer ved N- og/eller C-terminale ender av peptidet fra den native kontekst av protein (SEQ ID NO: 1 eller naturlige homologer derav som vist i Tabell 2 over) polypeptid som reserverer en effektiv epitop som kan utløse en immunrespons i en vert mot protein E polypeptid.
Tabell 3
Konklusjoner.
Overflateeksponert Haemophilus yttermembranprotein pE er en avgjørende virulensfaktor for NTHi-indusert AOM, er sterkt immunogenisk i en definert populasjon og er således en svært egnet vaksinekandidat for en rekke sykdommer i menneske.
Referanser.
1. Ruan, M., M. Akkoyunlu, A. Grubb, and A. Forsgren.1990. Protein D of Haemophilus influenzae. A novel bacterial surface protein with affinity for human IgD. J. Immunol.145:3379.
2. Janson, H., L.-O. Hedén, A. Grubb, M. Ruan, and A. Forsgren.1991.
Protein D, an immunoglobulin D-binding protein of Haemophilius influenzae: cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli. Infect. Immun.59:119.
3. Janson, H., Å. Melhus, A. Hermansson, and A. Forsgren.1994. Protein D, the glycerophosphodiester phosphodiesterase from Haemophilus influenzae with affinity for human immunoglobulin D, influences virulence in a rat otitis model. Infect. Immun. 62:4848.
4. Janson, H., B. Carlén, A. Cervin, A. Forsgren, A. Björk-Magnusdottir, S. Lindberg, and T. Runer.1999. Effects on the ciliated epithelium of protein D-producing and –nonproducing nontypeable Haemophilus influenzae in nasopharyngeal tissue cultures. J. Infect. Dis.180:737.
5. Ahren, I. L., H. Janson, A. Forsgren, K. Riesbeck.2001. Protein D expression promotes the adherence and internalization of non-typeable Haemophilus influenzae into human monocytic cells. Microb. Pathog. 31:151.
6. Forsgren, A. and Grubb, A. (1979) Many bacterial species bind human IgD. J. Immunol.122, 1468-1472.
7. Banck, G. and Forsgren, A. (1978) Many bacterial species are mitogenic for human blood lymphocytes. Scand. J. Immunol.8, 347-354.
8. Calvert, J.E. and Calogeres, A. (1986) Characteristics of human B cells responsive to the T-independent mitogen Branhamella catarrhalis. Immunology 58, 37-41.
9. Forsgren, A., Penta, A., Schlossman, S.F. and Tedder, T.F. (1988) Branhamella catarrhalis activates human B lymphocytes following interactions with surface IgD and class I major histocompatibility complex antigens. Cell. Immunol. 112, 78-88.
10. Sasaki, K. and Munson Jr., R.S. (1993) Protein D of Haemophilus influenzae is not a universal immunoglobulin D-binding protein. Infect. Immun.61, 3026-3031.
11. Forsgren, A., M. Brant, A. Möllenkvist, A. Muyombwe, H. Janson, N. Woin, and K. Riesbeck,.2001. Isolation and characterization of a novel IgD-binding protein from Moraxella catarrhalis. J. Immunol.167:2112.
12. Gorg, A., C. Obermaier, G. Boguth, W. Weiss.1999. Recent developments in two-dimensional gel electrophoresis with immobilized pH gradients: wide pH gradients up to pH 12, longer separation distances and simplified procedures. Electrophoresis 20:712.
13. Berns, K. I. and C. A. Thomas, Jr.1965. Isolation og high molecular weight DNA from Haemophilus influenzae. J. Mol. Biol.11:476.
14. Clark-Curtiss, J. E., W. R. Jacobs, M. A. Docherty, L. R. Ritchie, and R. Curtiss, 3rd.1985. Molecular analysis of DNA and construction of genomic libraries of Mycobacterium leprae. J Bacteriol.161:1093.
15. Fleischmann, R. D., M. D. Adams, O. White, R. A. Clayton, E. F. Kirkness, A. R. Kerlavage, C. J. Bult, J. F. Tomb, B. A. Dougherty, J. M. Merrick, et al.1995. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269:496.
16. Nielsen, H., J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. von Heijne.1997.
Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1.
17. Kyte, J. and R. F. Doolittle.1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol.157:105.
18. Poje, G., and J. R. Redfield.2003. Transformation of Haemophilus influenzae. Methods. Mol. Med. 71:57-70.
19. Hussain, M., K. Becker, C. Von Eiff, J. Schrenzel, G. Peters, and M.
Herrmann. 2001.J. Bacteriol.183(23):6778-6786.
Claims (9)
1. Vaksinesammensetning for anvendelse i behandling eller hindring av otitt media, sinusitt eller infeksjoner i lavere respirasjonskanal eller kronisk obstruktiv pulmonær sykdom, omfattende et overflateeksponert protein, som kan detekteres i Haemophilus influenzae, som har en aminosyresekvens som har avvik fra SEQ ID NO: 1, hvor nevnte avvik er valgt blant gruppen som består av; Thr i stedet for Ile ved posisjon 20 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ala ved posisjon 23 i SEQ ID NO 1, Glu i stedet for Lys ved posisjon 24 i SEQ ID NO 1, Met i stedet for Val ved posisjon 28 i SEQ ID NO 1, Thr i stedet for Ala ved posisjon 31 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ile ved posisjon 41 i SEQ ID NO 1, Ala i stedet for Val ved posisjon 47 i SEQ ID NO 1, Lys i stedet for Arg ved posisjon 76 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ile ved posisjon 107 i SEQ ID NO 1, Lys i stedet for Gly ved posisjon 152 i SEQ ID NO 1, Val i stedet for Ala ved posisjon 154 i SEQ ID NO 1, en Ser-Ala-Pro-tilsetning ved C-terminus av SEQ ID NO: 1, Val i stedet fro Pro i posisjon 32 i DEQ ID NO 1, og Ala i stedet for Pro i posisjon 32 i SEQ ID NO 1, hvilket fragment er i stand til å rette en immunrespons som gjenkjenner polypeptidet ifølge SEQ ID NO 1.
2. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1, hvor den ytterligere omfatter én eller flere farmasøytisk akseptable adjuvanter, vehikler, eksipienter, bindere, bærere, konserverende midler, bufringsmidler, emulsifiserende midler, fuktmidler, eller transfeksjonsfremmende forbindelser.
3. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1 hvor polypeptidet er én di-, tri- eller multimer av et polypeptid.
4. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1, hvor sammensetningen omfatter en immunogenisk del av et annet molekyl.
5. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 4, hvor det annet molekyl er et yttermembranprotein av et respirasjonskanalpatogen.
6. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 4, hvor det annet molekyl er valgt blant gruppen som består av pneumolysin fra Streptococcus pneumonia; MID, OMP106, UspA1, UspA2, Hly3, OmpCD og D15 fra Moraxella catarrhalis; og OMP26, P6, Protein D, NlpC2 and Slp fra Haemophilus influenza.
7. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1, hvor polypeptidet er fusjonert rekombinant med minst ett annet protein.
8. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav1, hvor polypeptidet er kovalent eller ikke-kovalent bundet til et protein, karbohydrat eller matriks.
9. Vaksinesammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1, hvor sammensetningen ytterligere omfatter en membran av en celle, som omfatter proteinet.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US75898706P | 2006-01-17 | 2006-01-17 | |
PCT/SE2007/000034 WO2007084053A1 (en) | 2006-01-17 | 2007-01-17 | A NOVEL SURFACE EXPOSED HAEMOPHILUS INFLUENZAE PROTEIN (PROTEIN E; pE) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20082827L NO20082827L (no) | 2008-10-17 |
NO346497B1 true NO346497B1 (no) | 2022-09-05 |
Family
ID=38287906
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20082827A NO346497B1 (no) | 2006-01-17 | 2007-01-17 | Overflateeksponert haemophilus influenzae protein (protein E, pE) |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8617565B2 (no) |
EP (1) | EP1973933B1 (no) |
JP (3) | JP5275814B2 (no) |
KR (2) | KR20080096775A (no) |
CN (2) | CN104436180B (no) |
AU (1) | AU2007206114B2 (no) |
BR (1) | BRPI0707154B8 (no) |
CA (1) | CA2636566C (no) |
EA (1) | EA015561B1 (no) |
ES (1) | ES2809167T3 (no) |
IL (2) | IL192674B (no) |
MA (1) | MA30309B1 (no) |
MX (1) | MX2008009280A (no) |
MY (1) | MY150105A (no) |
NO (1) | NO346497B1 (no) |
NZ (1) | NZ569417A (no) |
SG (2) | SG175492A1 (no) |
UA (1) | UA92782C2 (no) |
WO (1) | WO2007084053A1 (no) |
ZA (1) | ZA200805602B (no) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0410866D0 (en) | 2004-05-14 | 2004-06-16 | Chiron Srl | Haemophilius influenzae |
ES2537274T3 (es) | 2005-08-10 | 2015-06-05 | Arne Forsgren Ab | Interacción de Moraxella catarrhalis con células epiteliales, proteínas de la matriz extracelular y el sistema del complemento |
BRPI0707154B8 (pt) * | 2006-01-17 | 2022-12-20 | Forsgren Arne | composição de vacina |
TW201302779A (zh) * | 2011-04-13 | 2013-01-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 融合蛋白質及組合疫苗 |
BR112013029024A2 (pt) * | 2011-05-11 | 2017-10-31 | Riesbeck Healthcare Sweden Ab | proteína f - uma nova adesina de haemophilus influenzae com propriedades de ligação à laminina e vitronectina |
KR20150072444A (ko) * | 2012-10-17 | 2015-06-29 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 하나 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 캡슐 사카라이드 컨쥬게이트 및 해모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 E 및/또는 PilA를 포함하는 단백질 성분을 포함하는 면역원성 조성물 |
GB201218660D0 (en) | 2012-10-17 | 2012-11-28 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
TW201620927A (zh) * | 2014-02-24 | 2016-06-16 | 葛蘭素史密斯克藍生物品公司 | Uspa2蛋白質構築體及其用途 |
CN105175549B (zh) * | 2015-09-30 | 2019-08-16 | 康希诺生物股份公司 | 一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用 |
GB201621686D0 (en) | 2016-12-20 | 2017-02-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods for inducing an immune response |
WO2018178265A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Immunogenic composition, use and method of treatment |
CN110662557A (zh) | 2017-03-31 | 2020-01-07 | 葛兰素史克知识产权开发有限公司 | 免疫原性组合物、用途和治疗方法 |
IE87414B1 (en) | 2017-05-30 | 2023-07-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods for manufacturing an adjuvant |
EP3641808A1 (en) | 2017-08-14 | 2020-04-29 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Methods of boosting immune responses |
BR112020010790A2 (pt) | 2017-12-01 | 2020-11-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | purificação da saponina |
CN108037277A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-05-15 | 中国兽医药品监察所 | 一种区分牛布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染状态的方法 |
WO2020030572A1 (en) | 2018-08-07 | 2020-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Processes and vaccines |
WO2020109365A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-04 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Methods for manufacturing an adjuvant |
AU2020270920A1 (en) * | 2019-04-12 | 2021-11-04 | Geltor, Inc. | Recombinant elastin and production thereof |
JP2022535091A (ja) | 2019-06-05 | 2022-08-04 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | サポニン精製 |
EP4010014A1 (en) | 2019-08-05 | 2022-06-15 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
US20230248816A9 (en) | 2019-08-05 | 2023-08-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide |
EP4294433A1 (en) | 2021-02-22 | 2023-12-27 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Immunogenic composition, use and methods |
WO2024017827A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Continuous process for vaccine production |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002028889A2 (en) * | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Shire Biochem Inc. | Haemophilus influenzae antigens and corresponding dna fragments |
WO2005111066A2 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Chiron Srl | Polypeptides from non-typeable haemophilus influenzae |
Family Cites Families (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5173294A (en) | 1986-11-18 | 1992-12-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
JP3237842B2 (ja) | 1988-12-16 | 2001-12-10 | オランダ国 | ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン |
SE466259B (sv) | 1990-05-31 | 1992-01-20 | Arne Forsgren | Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal |
GB9022190D0 (en) | 1990-10-12 | 1990-11-28 | Perham Richard N | Immunogenic material |
US5843463A (en) * | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
DK0571538T5 (da) | 1991-02-15 | 2002-03-04 | Uab Research Foundation | Strukturgen for pneumokokprotein |
US5476929A (en) | 1991-02-15 | 1995-12-19 | Uab Research Foundation | Structural gene of pneumococcal protein |
US6592876B1 (en) | 1993-04-20 | 2003-07-15 | Uab Research Foundation | Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products |
US5552146A (en) | 1991-08-15 | 1996-09-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis |
ATE188613T1 (de) | 1992-06-25 | 2000-01-15 | Smithkline Beecham Biolog | Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung |
BR9306984A (pt) | 1992-08-27 | 1999-01-12 | Deakin Res Ltd | Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo |
GB9224584D0 (en) | 1992-11-23 | 1993-01-13 | Connaught Lab | Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases |
HU219056B (hu) | 1993-03-23 | 2001-02-28 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény |
CA2160011A1 (en) | 1993-04-06 | 1994-10-13 | Philip D. Greenberg | Chimeric cytokine receptors in lymphocytes |
EP1300156A3 (en) | 1993-05-18 | 2003-05-07 | The Ohio State University Research Foundation | Otitis media vaccine |
EP0705341A1 (en) | 1993-06-07 | 1996-04-10 | Amgen Inc. | Hybrid receptor molecules |
GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
FR2717081B1 (fr) | 1994-03-14 | 1996-06-21 | Centre Nat Rech Scient | Rétropeptides, anticorps dirigés contre ces derniers, et leurs utilisations pour la vaccination et le diagnostic in vitro. |
ATE420171T1 (de) | 1994-07-15 | 2009-01-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
US5565204A (en) | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
US6440425B1 (en) | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
US5843464A (en) | 1995-06-02 | 1998-12-01 | The Ohio State University | Synthetic chimeric fimbrin peptides |
JPH11507214A (ja) | 1995-06-07 | 1999-06-29 | バイオケム ヴァシーンズ インク. | Hsp70ファミリーに属する連鎖球菌の熱ショック蛋白質メンバー |
GB9513074D0 (en) | 1995-06-27 | 1995-08-30 | Cortecs Ltd | Novel anigen |
US6290970B1 (en) | 1995-10-11 | 2001-09-18 | Aventis Pasteur Limited | Transferrin receptor protein of Moraxella |
US6090576A (en) | 1996-03-08 | 2000-07-18 | Connaught Laboratories Limited | DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella |
ATE323721T1 (de) | 1996-05-01 | 2006-05-15 | Univ Rockefeller | Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird |
US7341727B1 (en) | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
US5882896A (en) | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | M protein |
US5882871A (en) | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | Saliva binding protein |
EP0941335A2 (en) | 1996-10-31 | 1999-09-15 | Human Genome Sciences | Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences |
AU739129B2 (en) | 1997-06-03 | 2001-10-04 | Connaught Laboratories Limited | Lactoferrin receptor genes of moraxella |
KR100619350B1 (ko) | 1997-07-21 | 2006-09-05 | 박스터 헬쓰케어 에스.에이. | 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물 |
EP1067962B1 (en) | 1998-04-07 | 2010-03-24 | MedImmune, LLC | Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines |
AU770378B2 (en) | 1998-04-23 | 2004-02-19 | Uab Research Foundation | Pneumococcal surface protein C(PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor |
GB9812613D0 (en) | 1998-06-11 | 1998-08-12 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
CZ303653B6 (cs) * | 1999-03-19 | 2013-01-30 | Smithkline Beecham Biologicals S. A. | Imunogenní prostredek |
GB9918319D0 (en) | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
GB0003502D0 (en) | 2000-02-15 | 2000-04-05 | Smithkline Beecham Sa | Vaccine |
PT1296715E (pt) * | 2000-06-29 | 2012-01-19 | Smithkline Beecham Biolog | Composição vacinal multivalente |
GB0025171D0 (en) | 2000-10-13 | 2000-11-29 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB0025170D0 (en) | 2000-10-13 | 2000-11-29 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB0025998D0 (en) | 2000-10-24 | 2000-12-13 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
BRPI0707154B8 (pt) | 2006-01-17 | 2022-12-20 | Forsgren Arne | composição de vacina |
US9473463B2 (en) | 2014-07-29 | 2016-10-18 | Combined Conditional Access Development & Support, LLC | Control word and associated entitlement control message caching and reuse |
-
2007
- 2007-01-17 BR BRPI0707154A patent/BRPI0707154B8/pt active IP Right Grant
- 2007-01-17 SG SG2011003233A patent/SG175492A1/en unknown
- 2007-01-17 KR KR1020087020155A patent/KR20080096775A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-01-17 CN CN201410569401.9A patent/CN104436180B/zh active Active
- 2007-01-17 CA CA2636566A patent/CA2636566C/en active Active
- 2007-01-17 US US12/161,040 patent/US8617565B2/en active Active
- 2007-01-17 WO PCT/SE2007/000034 patent/WO2007084053A1/en active Application Filing
- 2007-01-17 EP EP07701118.7A patent/EP1973933B1/en active Active
- 2007-01-17 UA UAA200810445A patent/UA92782C2/ru unknown
- 2007-01-17 JP JP2008551220A patent/JP5275814B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-01-17 AU AU2007206114A patent/AU2007206114B2/en active Active
- 2007-01-17 NZ NZ569417A patent/NZ569417A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-01-17 SG SG10201600336RA patent/SG10201600336RA/en unknown
- 2007-01-17 KR KR1020147017243A patent/KR101737464B1/ko active IP Right Grant
- 2007-01-17 NO NO20082827A patent/NO346497B1/no unknown
- 2007-01-17 MY MYPI20082409A patent/MY150105A/en unknown
- 2007-01-17 CN CN200780003278.2A patent/CN101374859B/zh active Active
- 2007-01-17 ES ES07701118T patent/ES2809167T3/es active Active
- 2007-01-17 EA EA200870176A patent/EA015561B1/ru unknown
- 2007-01-17 MX MX2008009280A patent/MX2008009280A/es active IP Right Grant
- 2007-01-17 ZA ZA200805602A patent/ZA200805602B/xx unknown
-
2008
- 2008-07-07 IL IL192674A patent/IL192674B/en active IP Right Grant
- 2008-08-12 MA MA31171A patent/MA30309B1/fr unknown
-
2013
- 2013-01-17 JP JP2013006549A patent/JP6008747B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-20 US US14/085,007 patent/US20150071956A1/en not_active Abandoned
- 2013-12-17 US US14/109,573 patent/US9309293B2/en active Active
-
2015
- 2015-10-30 US US14/929,011 patent/US9744225B2/en active Active
-
2016
- 2016-01-07 JP JP2016001727A patent/JP2016135770A/ja active Pending
-
2017
- 2017-07-26 US US15/660,455 patent/US11400148B2/en active Active
-
2018
- 2018-05-13 IL IL259316A patent/IL259316B2/en unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002028889A2 (en) * | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Shire Biochem Inc. | Haemophilus influenzae antigens and corresponding dna fragments |
WO2005111066A2 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Chiron Srl | Polypeptides from non-typeable haemophilus influenzae |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11400148B2 (en) | Surface exposed Haemophilus influenzae protein (protein E; pE) | |
NO326994B1 (no) | Polypeptid og fragmenter derav, polynukleotid, ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmate, vaksinesammensetning, anvendelse samt antistoff. | |
US20140286977A1 (en) | Protein F - A Novel Haemophilus Influenzae Adhesin with Laminin and Vitronectin binding Properties | |
US20040241638A1 (en) | Novel compounds | |
US20040043456A1 (en) | Novel compounds | |
US20040047875A1 (en) | Novel compounds | |
US20040067238A1 (en) | Novel compounds | |
EP1326886A2 (en) | Basb208 nucleotide and amino acid sequences from haemophilus influenzae |