ES2537274T3 - Interacción de Moraxella catarrhalis con células epiteliales, proteínas de la matriz extracelular y el sistema del complemento - Google Patents
Interacción de Moraxella catarrhalis con células epiteliales, proteínas de la matriz extracelular y el sistema del complemento Download PDFInfo
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Abstract
Péptido que consiste en el ID de Secuencia nº 2.
Description
Interacción de Moraxella catarrhalis con células epiteliales, proteínas de la matriz extracelular y el sistema del complemento
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a Moraxella catarrhalis y a su capacidad para interaccionar con las células epiteliales a través de proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina y laminina, y también a su capacidad para inhibir el sistema del complemento. La interacción con estas proteínas extracelulares es útil en la preparación de vacunas.
Técnica anterior
La capacidad de unirse a células epiteliales es de gran importancia para diversas especies bacterianas. Por ejemplo, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes poseen proteínas que se unen a la fibronectina (FnBP) con una organización de secuencia relacionada. Estas FnBP son conocidas como componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas de adhesión de la matriz (MSCRAMMs). Explotan la estructura modular de la fibronectina formando estructuras en cierre beta, extendidas en tándem en su unión a la fibronectina [27, 39, 47, 73]. La función es mediar en la adhesión bacteriana y en la invasión de las células hospedadoras.
El agente patógeno relevante de la mucosa, Moraxella catarrhalis, es la tercera causa bacteriana principal de otitis media aguda en niños, después de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae [14, 40, 55]. M. catarrhalis es también una de las poblaciones más comunes en la faringe de niños sanos.
Por otra parte, M. catarrhalis también es una causa común de sinusitis y de infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) [74]. El desarrollo de esta especie en pacientes con EPOC está relacionado probablemente en parte a su gran repertorio de adhesinas.
En los últimos años, la investigación se ha enfocado hacia las proteínas de la membrana externa y sus interacciones con el hospedador humano [6, 48, 56]. Algunas de estas proteínas de la membrana externa parecen tener funciones adhesivas que incluyen entre otras, la proteína que se une a IgD de M. catarrhalis (MID, también designada Hag), la proteína CD, la proteína de adherencia de M. catarrhalis (McaP) y las proteínas de superficie ubicuas (Usp) [1, 22, 33, 48, 61, 81, 84].
Compendio de la invención
Debido a que se ha descubierto que M. catarrhalis es una causa principal de infecciones en las vías respiratorias superiores e inferiores, existe una necesidad actual de desarrollar vacunas que se puedan utilizar contra M. catarrhalis.
El objetivo de la presente invención ha sido, por tanto, averiguar en qué manera M. catarrhalis interacciona con las células epiteliales en el organismo y cómo afecta al sistema inmune. De esta manera, se pueden desarrollar sustancias que pueden actuar como vacunas contra M. catarrhalis.
En este estudio, con el uso de mutantes de M. catarrhalis obtenidos a partir de cepas aisladas clínicas, los inventores han sido capaces de mostrar que tanto UspA1 como A2 se unen a la fibronectina y la laminina. Además, los inventores han sido capaces de mostrar que M. catarrhalis interfiere con la vía clásica del sistema del complemento, y también de aclarar de qué manera interfiere.
Muchas bacterias se adhieren a las células epiteliales a través de MSCRAMMs que se unen a fibronectina [54, 77]. Pseudomonas aeruginosa tiene una FnBP que se une a la fibronectina asociada a la célula en células epiteliales nasales [69]. El bloqueo de las interacciones proteicas entre bacterias-fibronectina puede ayudar al tejido del hospedador a superar la infección. De hecho, se ha mostrado que anticuerpos contra una FnBP de S. aureus produjeron una rápida eliminación de las bacterias en ratones infectados [71].
Proteínas UspA1/A2 truncadas recombinantes, junto con fragmentos más pequeños que abarcan toda la molécula, se han sometido a ensayo de acuerdo con la presente invención para estudiar la unión a fibronectina. Tanto UspA1 como A2 se unían a la fibronectina y se encontró que los dominios de unión a la fibronectina estaban localizados dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318. Estas dos proteínas truncadas inhiben la unión de M. catarrhalis a las células epiteliales conjuntivales Chang en un grado similar a los anticuerpos anti-fibronectina. Las observaciones realizadas muestran que tanto UspA1 como A2 de M. catarrhalis están implicadas en la adherencia a las células epiteliales a través de fibronectina asociada a la célula. Por tanto, se sugiere que los sitios biológicamente activos dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318, son candidatos potenciales para ser incluidos en una vacuna contra M. catarrhalis.
Además, los inventores han estudiado y caracterizado la unión de M. catarrhalis a laminina. M. catarrhalis es una causa común de agravamientos de la infección en pacientes con EPOC. El desarrollo de esta especie en pacientes con EPOC está probablemente relacionado en parte con su gran repertorio de adhesinas. Además, hay cambios pa
tológicos tales como la pérdida de integridad epitelial con exposición de la membrana basal, en donde la misma capa de laminina está engrosada en los fumadores [4]. Algunos agentes patógenos han mostrado ser capaces de unirse a la laminina y esto puede contribuir a su capacidad para adherirse a tales superficies mucosas dañadas y denudadas. Estos incluyen agentes patógenos conocidos por causar una enfermedad significativa en las vías respiratorias, tales como S. aureus y P. aeruginosa entre otros [7, 63]. Los presentes inventores han sido capaces de mostrar que la proteína de superficie ubicua (Usp) A1 y A2 de M. catarrhalis también se une a la laminina. Los dominios de unión a laminina de UspA1 y A2 se encontraron, entre otros, dentro de las mitades N-terminales de UspA150-491 y UspA230-351. Estos dominios también contienen los dominios de unión a fibronectina. Sin embargo, los fragmentos más pequeños que se unían a fibronectina, UspA1299-452 y UspA2165-318, no se unieron a laminina de una manera apreciable. Fragmentos más pequeños que la mitad N-terminal de UspA1 (UspA150-491) pierden toda su capacidad de unión a la laminina, mientras que con UspA2, solo UspA230-170 se unía a laminina, aunque a un nivel menor que la proteína recombinante completa (UspA230-539). Estos hallazgos sugieren que diferentes partes de la molécula pueden tener diferentes funciones. Se encontró que UspA150-770 también tenía propiedades de unión a laminina.
Sin embargo, comparando las regiones más pequeñas que se unen a laminina de UspA1 y A2, encontramos que por medio de homología de aminoácidos hay poca similitud entre UspA230-170 y UspA150-491 (datos no mostrados). Esto no es sorprendente ya que es un hecho conocido que ambas proteínas tienen una estructura de cabeza globular en forma de “piruleta”, a pesar de tener solo un 22% de identidad en ambas mitades N-terminales [2, 32].
Se sugieren como posibles candidatos para ser incluidos en una vacuna contra M. catarrhalis los sitios biológicamente activos dentro de UspA150-770 y UspA230-539 .
Por último, los inventores han estudiado la interacción entre proteínas de la superficie ubicuas A1 y A2 de M. catarrhalis y el sistema inmune innato, y han encontrado que M. catarrhalis interfiere con el sistema del complemento. El sistema del complemento es una de las primeras líneas de defensa innata contra microorganismos patógenos, y la activación de este sistema produce una cascada de depósito de proteínas sobre la superficie bacteriana, lo que da como resultado la formación del complejo de ataque de la membrana o la opsonización del agente patógeno seguida de fagocitosis [85, 86]. Una de las proteínas del complemento más importantes es C3, que está presente en la circulación en una concentración similar a algunas inmunoglobulinas (1-1,2 mg/ml). C3 no solo tiene un papel crucial como opsonina, sino que también es el enlace común entre la vía clásica, de lectina y alternativa de la activación del complemento. Las funciones de la vía alternativa, como bucle de amplificación para las vías clásica y de lectina, también se pueden activar de forma espontánea mediante la fijación covalente de C3 a la superficie de un microbio en ausencia de inhibidores del complemento. El depósito de C3 requiere la presencia de un enlace tioéster interno, formado en la proteína natural mediante la proximidad de un grupo sulfhidrilo (Cys1010) y un glutamil carbonilo (Gln1012) en la cadena α de C3 [76]. La escisión proteolítica de un péptido de 77 residuos desde el extremo aminoterminal de la cadena α de C3, genera C3a (anafilatoxina) y C3b. La fijación de C3b se lleva a cabo entonces a través de un enlace covalente entre el grupo carbonilo del tioéster metaestable y, o bien grupos -NH2 o grupos -OH de proteínas o estructuras de carbohidratos en la superficie del activador [36, 37]. Se ha encontrado que UspA1 y A2 de M. catarrhalis se unen de forma no covalente y de una manera dependiente de la dosis al tercer componente del complemento (C3) procedente de suero tratado con EDTA y a C3 tratado con metilamina (C3met). Se ha encontrado que UspA150-770 y UspA230-539 se unen a C3 y C3met. Se encontró que la región que se une a C3 para UspA2 estaba localizada principalmente en UspA2200-458. Sin embargo, se ha encontrado que UspA1 tiene un papel menor en las interacciones. Los sitios biológicamente activos dentro de UspA150-770 y UspA230-539 se sugieren como posibles candidatos para ser incluidos en una vacuna contra M. catarrhalis.
La familia de UspA consiste en UspA1 (88 kDa de peso molecular), UspA2 (62 kDa) y la proteína híbrida UspA2H (92 kDa) [2, 43]. Estas proteínas migran como complejos de peso molecular elevado en SDS-PAGE, están relativamente conservadas y, por lo tanto, son importantes candidatos a vacuna. Las secuencias de aminoácidos de UspA1 y A2 tienen una identidad del 43% y tienen 140 residuos de aminoácidos que son idénticos en un 93% [2]. En una serie de 108 cepas aisladas nasofaríngeas de M. catarrhalis procedentes de niños pequeños con otitis media, los genes uspA1 y uspA2 se detectaron en 107 (99%) y 108 (100%) de las cepas aisladas, respectivamente. Veintiún por ciento se identificaron por tener el gen de la variante híbrida uspA2H [50]. Además, se sabe que los anticuerpos adquiridos de forma natural contra UspA1 y A2 son bactericidas [15].
Se han atribuido diversas funciones a la familia UspA de proteínas. La expresión de UspA1 es esencial para la fijación de M. catarrhalis a células epiteliales conjuntivales Chang y a células del epitelio de la laringe Hep-2 [43, 49]. En un estudio más reciente, se ha mostrado que UspA1 se une a moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM), expresadas en la línea de células epiteliales de pulmón A549 [31]. UspA1 purificada también se ha observado que se une a fibronectina en experimentos de transferencia de puntos, mientras que UspA2 purificada no se unía [49]. Tanto UspA1 como A2 pueden tener funciones importantes para la resistencia al suero de M. catarrhalis [1, 5, 58, 60].
La presente invención muestra que tanto UspA1 como A2 son determinantes para la unión de M. catarrhalis a la fibronectina y la laminina en cepas aisladas clínicas de M. catarrhalis BBH18 y RH4. Curiosamente, UspA1 y A2 recombinantes obtenidas a partir de M. catarrhalis Ac5, se unieron ambas a fibronectina en la misma medida. Los dominios de unión a fibronectina se encontraron dentro de los residuos de aminoácidos 299 a 452 de UspA1 y 165 a 318 de UspA2. Estos dos dominios comparten 31 residuos de aminoácidos con identidad de secuencia. Es importan3 5
te destacar que fragmentos de proteínas truncadas que contenían estos residuos en UspA1 y UspA2, eran capaces de inhibir la unión de M. catarrhalis a las células epiteliales de Chang, lo que sugiere que las interacciones con estas células eran a través de fibronectina asociada a la célula.
Los dominios de unión para la laminina se encontraron dentro de los residuos de aminoácidos mencionados anteriormente. Los ensayos de unión con proteínas recombinantes revelaron que las principales regiones de unión estaban localizadas en las partes N-terminales, en donde ambas proteínas forman una cabeza globular.
Los factores bacterianos que median en la adhesión al tejido y a componentes de la matriz extracelular (MEC), se agrupan en una sola familia llamada "componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas de adhesión de la matriz" (MSCRAMMs). Puesto que UspA1/A2 ambas se unen a la fibronectina y la laminina, estas proteínas se pueden denominar MSCRAMMs.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un péptido que consiste en el ID de secuencia nº 2 o el ID de secuencia nº 3.
De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona además un ligando que comprende un dominio de unión a fibronectina, consistiendo dicho ligando en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en el ID de secuencia nº 2 y el ID de secuencia nº 3,
Además, la presente invención proporciona un medicamento que comprende uno o varios ligandos de acuerdo con la invención y uno o varios adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, soportes o conservantes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención proporciona además una vacuna que comprende uno o varios ligandos de acuerdo con la presente invención y uno o varios adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, soportes o conservantes farmacéuticamente aceptables.
Finalmente, la presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un ligando, una proteína o un péptido de la presente invención, así como homólogos, polimorfismos, productos de degeneración y variantes por corte y empalme del mismo que tienen actividad de unión a fibronectina.
Una descripción adicional de los objetos, problemas, soluciones y características de la presente invención será evidente a partir de la siguiente descripción detallada de la invención, haciendo referencia a los dibujos y las reivindicaciones adjuntas.
El ligando de expresión tal y como se utiliza en el presente documento se entiende que designa tanto la molécula completa que se une al receptor como cualquier parte de la misma que incluye el dominio de unión al receptor, de tal manera que conserva la propiedad de unirse al receptor. Los ligandos que comprenden dominios equivalentes que se unen al receptor, también se incluyen en la presente invención.
Las expresiones fragmento, homólogo, equivalente funcional y derivado se refieren a variantes, modificaciones y/o partes de los péptidos y fragmentos de proteínas de acuerdo con la invención que conservan las propiedades de unión a fibronectina, laminina, C3 o C3met deseadas.
Un homólogo de UspA1 de acuerdo con la presente invención se define como una secuencia que tiene al menos 72% de identidad de secuencia, como se puede observar en la tabla 1 a continuación.
Un fragmento de acuerdo con la presente invención se define como cualquiera de las secuencias homólogas que están truncadas o ampliadas con 1, 2, 5, 10, 15, 20 aminoácidos en el extremo N-terminal y/o truncadas o ampliadas con 1, 2, 5, 10, 15, 20 aminoácidos en el extremo C-terminal.
Las expresiones productos de degeneración, hidroxilación, sulfonación y glicosilación u otros productos de procesamiento secundario se refieren a variantes y/o modificaciones de los péptidos y fragmentos de proteínas de acuerdo con la invención que se han alterado, en comparación con el péptido o el fragmento de proteína original, mediante degeneración, hidroxilación, sulfonación o glicosilación, pero que conservan las propiedades de unión a fibronectina, laminina, C3 o C3met deseadas.
La presente invención se refiere especialmente a infecciones causadas por Moraxella catarrhalis. Un péptido de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para el tratamiento o la profilaxis de la otitis media, sinusitis o infecciones del tracto respiratorio inferior.
Tabla 1: Alineación múltiple de secuencias de proteínas de UspA1 de longitud completa, porcentajes de identidad asociados
- O12E
- O35E O46E P44 TTA24 TTA37 V1171
- ATCC25238
- 81 75 83 83 84 79 84
- O12E
- 74 77 83 76 72 75
- O35E
- 72 74 83 73 78
- O46E
- 81 81 82 80
- P44
- 81 75 77
- TTA24
- 76 84
- TTA37
- 78
Tabla 2: Análisis Pileup de UspA2 -cepas y secuencias utilizadas
- acc
- Cepa des sl
- ▭ TREMBL:O54407 MORCA
- 054407 O35E Proteína de superficie ubicua A2. 576
- ▭ TREMBL:Q58XP4 MORCA
- Q58XP4 MC317 UspA2. 650
- ▭ TREMBL:Q848S1 MORCA
- Q848S1 E22 Proteína de superficie ubicua A2H 877
- ▭ TREMBL:Q848S2 MORCA
- Q848S2 V1122 Proteína de superficie ubicua A2. 616
- ▭ TREMBL:Q8GH86 MORCA
- Q8GH86 P44 UspA2. 668
- ▭ TREMBL:Q9L961 MORCA
- Q9L961 TTA37 USPA2H. 889
- ▭ TREMBL:Q9L962 MORCA
- Q9L962 O46E USPA2H. 894
- ▭ TREMBL:Q9L963 MORCA
- Q9L963 O12E UspA2 (Proteína de superficie ubicua A2). 684
- ▭ TREMBL:Q9XD51 MORCA
- Q9XD51 V1171 UspA2. 674
- ▭ TREMBL:Q9XD53 MORCA
- Q9XD53 TTA24 UspA2. 613
- TREMBL:Q8RTB2 MORCA
- Q8RTB2 SP12-5 UspA2 686
- ▭ TREMBL:Q9XD55 MORCA
- Q9XD55 ATCC25238 UspA2. 630
- Forsgren_UspA2
- UspA2. 630
5 Por consiguiente, la presente invención proporciona un ligando aislado a partir de la proteína de la membrana externa de Moraxella catarrhalis que se une a laminina y/o fibronectina y/o C3, en donde dicho ligando es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2-3 que se obtiene a partir de las secuencias de longitud completa de UspA1 y UspA2 de Moraxella catarrhalis BC5, mostradas a continuación.
10 UspA1 de longitud completa procedente de la cepa BC5 de Moraxella catarrhalis (SEQ ID NO: 32):
UspA2 de longitud completa procedente de la cepa BC5 de Moraxella catarrhalis (SEQ ID NO: 33):
5 El término ligando se utiliza en la presente memoria para designar tanto la molécula completa que se une a laminina y/o fibronectina y/o C3 como a cualquier parte de la misma que incluye un dominio de unión a laminina y/o fibronectina y/o C3 de modo que conserva la propiedad de unión respectiva. Por tanto, "ligando" incluye moléculas que consisten solo en el dominio de unión a laminina y/o fibronectina y/o C3, es decir, la región o regiones del péptido requeridas para la unión.
10 Las propiedades de unión a laminina, fibronectina o C3 de un polipéptido se pueden determinar del modo siguiente:
Las propiedades de unión a laminina, fibronectina o C3 de un polipéptido se pueden determinar del modo siguiente: los polipéptidos se pueden marcar con 125yodo u otros compuestos radiactivos y someterlos a ensayo para estudiar la unión en radioinmunoensayos (RIA) como fase fluida o sólida (por ejemplo, transferencias de puntos). Además, en los polipéptidos se puede analizar la unión con ensayos de inmunoabsorción ligados
15 a enzimas (ELISA) o citometría de flujo, utilizando anticuerpos y sistemas de detección apropiados. Las interacciones entre los polipéptidos y laminina, fibronectina o C3 se pueden examinar adicionalmente mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore). Ejemplos de métodos se ejemplifican con detalle en la sección de Materiales y Métodos.
El polipéptido [o el polipéptido truncado en comparación con un polipéptido de tipo silvestre] comprende o consiste
en al menos una de las secuencias conservadas dentro de SEQ ID NO: 1-10 que se identifican en la alineación que se muestra en el presente documento. Por lo tanto, en esta realización, el polipéptido [o el polipéptido truncado en comparación con un polipéptido de tipo silvestre] comprende o consiste en al menos uno de:
A partir de UspA1 (fragmentos conservados procedentes del dominio de unión a fibronectina -'/' separando opciones alternativas de un aminoácido en una posición)
S T D A V N G S Q L (SEQ ID NO: 35)
D Q K A D I D N N I N (SEQ ID NO: 37)
L A Q Q Q D Q H S S D I K T L K (SEQ ID NO: 38)
A partir de UspA2 (fragmentos conservados procedentes del dominio de unión a fibronectina -'/' separando
opciones alternativas de un aminoácido en una posición)
K A D I D N N I N N/H I Y E LA Q Q Q D Q H S S D (SEQ ID NO: 39)
A partir de UspA2 (fragmentos conservados procedentes del dominio de unión a C3 -'/' separando opciones alternativas de un aminoácido en una posición)
D L A A Y N E L Q D A Y A K Q Q (SEQ ID NO: 42)
E A I D A L N K A S S E N T Q N I A K N Q A D I A N N I (SEQ ID NO: 43)
20 Se entenderá que los ligandos de polipéptidos pueden comprender un dominio o una secuencia que se une a laminina y/o fibronectina y/o C3 indicada en el presente documento que está modificada por la adición o deleción de residuos de aminoácidos para o de las secuencias citadas en el presente documento, en cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal o ambos, cuyos péptidos modificados conservan la capacidad de unirse a laminina y/o fibronectina y/o C3, respectivamente.
25 Los ligandos de polipéptidos descritos en este documento se pueden obtener a partir de las proteínas conocidas UspA1 o UspA2 de Moraxella catarrhalis mediante el truncamiento en cualquiera o en ambos extremos N-y Cterminales. Las formas truncadas no son moléculas UspA1 o UspA2 naturales de longitud completa.
La forma truncada conserva la función de unión a laminina (opcionalmente también se une a fibronectina y/o C3). Posibles formas truncadas se pueden seleccionar a partir de las que se muestran en la siguiente tabla, estando todas ellas dentro del alcance de la invención.
Tabla 5. Posibles combinaciones de formas truncadas en los extremos N-y C-terminales de la proteína UspA2 de tipo silvestre
- Nº de aminoácidos que faltan, al menos o exactamente:
- Desde el extremo C-terminal
- Desde el extremo N-terminal
- 0
- X 5 10 15 20 25 29
- 20
- 0 5 10 15 20 25 29
- 30
- 0 5 10 15 20 25 29
- 40
- 0 5 10 15 20 25 29
- 50
- 0 5 10 15 20 25 29
- 60
- 0 5 10 15 20 25 29
- 70
- 0 5 10 15 20 25 29
- 80
- 0 5 10 15 20 25 29
- 100
- 0 5 10 15 20 25 29
- 120
- 0 5 10 15 20 25 29
- 140
- 0 5 10 15 20 25 29
- 160
- 0 5 10 15 20 25 29
- 180
- 0 5 10 15 20 25 29
- 200
- 0 5 10 15 20 25 29
- 220
- 0 5 10 15 20 25 29
- 240
- 0 5 10 15 20 25 29
- 260
- 0 5 10 15 20 25 29
- 280
- 0 5 10 15 20 25 29
- 300
- 0 5 10 15 20 25 29
- 320
- 0 5 10 15 20 25 29
- 340
- 0 5 10 15 20 25 29
- 360
- 0 5 10 15 20 25 29
- Nº de aminoácidos que faltan, al menos o exactamente:
- Desde el extremo C-terminal
- Desde el extremo N-terminal
- 380
- 0 5 10 15 20 25 29
- 400
- 0 5 10 15 120 25 29
- 420
- 0 5 10 15 20 25 29
- 440
- 0 5 10 15 20 25 29
- 453
- 0 5 10 15 20 25 29
La forma truncada conserva la función de unión a C3 (opcionalmente también se une a fibronectina y/o laminina). Posibles formas truncadas se pueden seleccionar a partir de las que se muestran en la siguiente tabla, estando todas ellas dentro del alcance de la invención.
Tabla 6. Posibles combinaciones de formas truncadas en los extremos N-y C-terminales de la proteína UspA2 de tipo silvestre
- Nº de aminoácidos que faltan, al menos o exactamente:
- Desde el extremo C-terminal
- Desde el extremo N-terminal
- 0
- X 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 20
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 30
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 40
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 50
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 60
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 70
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 80
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 100
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 120
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 140
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 160
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 180
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 200
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 220
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- Nº de aminoácidos que faltan, al menos o exactamente:
- Desde el extremo C-terminal
- Desde el extremo N-terminal
- 240
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 260
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 280
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 290
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
- 301
- 0 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 172
Las secuencias de UspA1 de tipo silvestre conocidas que se pueden truncar de esta manera son las de las cepas ATCC25238 (MX2; GenBank nº de orden AAD43465), P44 (AAN84895), O35E (AAB96359), TTA37 (AAF40122), O12E (AAF40118), O46E (AAF36416), V1171 (AAD43469), TTA24 (AAD43467) (véase la Tabla 1/Figura 19); o BC5 5 (véase más arriba). Secuencias de UspA2 de tipo silvestre conocidas que se pueden truncar de esta manera son las de las cepas O35E (GenBank nº de orden 04407), MC317 (GenBank nº de orden Q58XP4), E22 (GenBank nº de orden Q848S1), V1122 (GenBank nº de orden Q848S2), P44 (GenBank nº de orden Q8GH86), TTA37 (GenBank nº de orden Q9L961), O46E (GenBank nº de orden Q9L962), O12E (GenBank nº de orden Q9L963), V1171 (GenBank nº de orden Q9XD51), TTA24 (GenBank nº de orden Q9XD53), SP12-5 (GenBank nº de orden Q8RTB2), ATCC25238
10 (GenBank nº de orden Q9XD55) (véase la Tabla 2/Figura 20); o BC5 [Forsgren_UspA2] (véase más arriba).
La forma truncada de UspA1 o UspA2 de esta realización consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2-3
A partir de UspA1 (fragmentos conservados procedentes del dominio de unión a fibronectina -'/' separando opciones alternativas de un aminoácido en una posición)
STDAVNGSQL (SEQ ID NO: 45)
D Q K A D I D N N I N (SEQ ID NO: 47) L A Q Q Q D Q H S S D I K T L K (SEQ ID NO: 48) 20 A partir de UspA2 (fragmentos conservados procedentes del dominio de unión a fibronectina -'/' separando opciones alternativas de un aminoácido en una posición)
A partir de UspA2 (fragmentos conservados procedentes del dominio de unión a C3 -'/' separando opciones alterna25 tivas de un aminoácido en una posición)
D L A A Y N E L Q D A Y A K Q Q (SEQ ID NO: 52)
E A I D A L N K A S S E N T Q N I A K N Q A D I A N N (SEQ ID NO: 53).
Puede ser conveniente producir proteínas de fusión que contienen ligandos de polipéptidos tal y como se describe 30 en el presente documento. Por consiguiente, en una realización adicional, la invención proporciona proteínas de fu
sión que comprenden ligandos de polipéptidos de acuerdo con la invención. Preferiblemente, una proteína de fusión
de acuerdo con esta realización tiene una identidad menor del 50% con cualquier secuencia conocida de longitud completa a lo largo de toda su longitud. Tales fusiones pueden constituir un derivado de los polipéptidos de la invención. Otros derivados pueden ser el uso de los polipéptidos de la invención como un vehículo para acoplar covalentemente restos peptídicos o de sacárido. Se pueden acoplar, por ejemplo, a oligosacáridos o polisacáridos capsulares de neumococos o a lipooligosacáridos de Moraxella catarrhalis o a lipooligosacáridos no tipificables de Haemophilus influenzae.
Los péptidos homólogos se pueden identificar mediante la comparación de secuencias. Los péptidos homólogos tienen preferiblemente una identidad de al menos 60%, más preferiblemente de al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% en orden ascendente de preferencia, con la secuencia peptídica descrita en este documento o fragmentos de la misma o formas truncadas de la invención, a lo largo de toda su longitud. Preferiblemente, el péptido homólogo conserva la capacidad de unirse a fibronectina y/o laminina y/o C3; y/o de provocar una respuesta inmune contra las secuencias peptídicas descritas en este documento o un fragmento de las mismas.
Las Figuras 19 y 20 muestran una alineación de secuencias peptídicas de UspA1 y UspA2 de origen diferente que indica regiones de la secuencia que son capaces de ser modificadas para formar secuencias homólogas, mientras que la función se conserva (es decir, la capacidad de unirse a fibronectina y/o laminina y/o C3). Péptidos homólogos a los péptidos de SEQ ID NO: 1-10 de BC5 son, por ejemplo, aquellas secuencias que se corresponden a la secuencia BC5 de otras cepas en las Figuras 19 y 20.
Vacunas de la invención
Los péptidos de la invención se deberían formular idealmente como una vacuna que comprende una cantidad eficaz de dicho(s) componente(s) y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las vacunas de la invención se pueden utilizar para administrarlas a un paciente para la prevención o el tratamiento de una infección u otitis media o sinusitis o infecciones del tracto respiratorio inferior con Moraxella catarrhalis. Se pueden administrar de cualquier forma conocida, incluyendo la vía intramuscular, parenteral, mucosa e intranasal.
Vacunas de combinación de la invención
Las vacunas de la presente invención se pueden combinar con otros antígenos de Moraxella catarrhalis para la prevención o el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente.
Los presentes inventores han encontrado, en particular, que Moraxella catarrhalis tiene al menos 2 medios para obstaculizar que el sistema inmune del hospedador ataque al organismo. Además de la interacción con C3 (y C4BP) mencionada en los Ejemplos a continuación, M. catarrhalis tiene una fuerte afinidad hacia la IgD humana soluble y unida a la membrana, a través de la proteína MID (también conocida como OMP106). La unión de IgD a linfocitos B dependiente de Moraxella, da como resultado una síntesis de inmunoglobulinas policlonales que pueden prohibir la producción de anticuerpos monoclonales específicos anti-moraxella. El hecho de que M. catarrhalis obstaculice el sistema inmunitario humano de varias maneras, podría explicar por qué M. catarrhalis es una población común de este tipo del tracto respiratorio.
Los inventores creen que la combinación de antígenos implicados en la función de unión a IgD (MID) y la función de unión a C3 (UspA1 y/o UspA2) puede proporcionar una composición inmunógena, proporcionando al anfitrión unas capacidades mejoradas de defensa contra la capacidad de Moraxella para obstaculizar el sistema inmune humano, proporcionando de este modo una mayor disminución de la colonización de M. catarrhalis sobre las superficies mucosas.
En esta memoria se describe una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de UspA1 y/o UspA2 (particularmente la última) (por ejemplo, péptidos de la invención tal y como se describen en el presente documento, preferiblemente que conservan una función de unión a C3) en combinación con una cantidad eficaz de proteína MID (por ejemplo, polipéptidos de longitud completa o polipéptidos/péptidos/dominios funcionales/homólogos/fragmentos/formas truncadas/derivados de los mismos, preferiblemente que conservan una función de unión a IgD humana), y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La proteína MID, y sus homólogos/fragmentos/formas truncadas que se unen a IgD, se describe en el documento WO 03/004651. Fragmentos particularmente adecuados para este fin son un polipéptido que comprende (o consiste en) el fragmento F2 descrito en el documento WO 03/004651, o secuencias con una identidad de al menos 60, 70, 80, 90, 95, 99% con el mismo que conservan preferiblemente la actividad de unión a IgD humana.
Los componentes MID y UspA de esta vacuna de combinación se pueden separar uno de otro, o se pueden fusionar entre sí convenientemente por técnicas de biología molecular conocidas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra trece cepas de M. catarrhalis sometidas a ensayo para estudiar la unión a fibronectina. (A) Una fuerte unión a fibronectina se correlacionaba con expresión de UspA1/A2 como se detectó mediante el AcP anti
UspA1/A2. (B-I) Los perfiles de la citometría de flujo de M. catarrhalis BBH18 de tipo silvestre y de mutantes carentes de UspA1/A2 muestran una unión dependiente de UspA1/A2 a la fibronectina soluble. Se muestran los perfiles de una cepa aislada clínica de tipo silvestre (B y F) y los correspondientes mutantes carentes de UspA1 (C y G), o UspA2 (D y H), y mutantes dobles (E e I) que carece tanto de UspA1 como de UspA2. Las bacterias se incubaron con anticuerpo de conejo anti-UspA1/A2 o fibronectina seguido de un AcP anti-fibronectina. Posteriormente se añadió AcP de conejo conjugado con FITC, seguido por un análisis de citometría de flujo. Se muestra un experimento típico de cada tres con la intensidad media de la fluorescencia (IMF) para cada perfil.
La Figura 2 muestra que los mutantes de M. catarrhalis RH4 que carecen de UspA2 no se unen a fibronectina marcada con 125I. E. coli BL21 se incluyó como control negativo que no se une a fibronectina. Las bacterias se incubaron con fibronectina marcada con 125I seguido de varios lavados y se analizaron en un contador gamma. La unión a fibronectina del tipo silvestre RH4 que expresaba tanto UspA1 como A2 se estableció como el 100%. Se muestran los valores medios de tres experimentos independientes. Las barras de error representan desviaciones estándar (DE). Se obtuvieron resultados similares con M. catarrhalis BBH18.
La Figura 3 muestra imágenes que verifican que los mutantes de M. catarrhalis que carecen de UspA1 y UspA2 no se unen a la fibronectina inmovilizada. M. catarrhalis de tipo silvestre era capaz de adherirse con densidad elevada sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina (A). El mutante M. catarrhalis ΔuspA1 también conservaba una alta densidad (B), mientras que los mutantes dobles M. catarrhalis ΔuspA2 y ΔuspA1/A2 tenían poca adherencia (C y D). Los portaobjetos de vidrio se recubrieron con fibronectina y se incubaron con M. catarrhalis RH4 y sus correspondientes mutantes UspA1/A2. Después de varios lavados, las bacterias se tiñeron con Gram.
La Figura 4 es un gráfico que muestra que UspA1 y A2 recombinantes se unen a la fibronectina de una manera dependiente de la dosis. La unión específica a fibronectina se muestra para UspA150-770 y UspA230-539. Ambas proteínas UspA (40 nM) se recubrieron sobre placas de microtitulación y se incubaron con concentraciones crecientes de fibronectina, seguido de una detección con AcP (anticuerpo policlonal) de conejo anti-fibronectina humana y AcP anti-conejo conjugado con HRP. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error indican la DE.
Figura 5. Los dominios activos que se unen a fibronectina de UspA1 y UspA2 se encuentran entre los aminoácidos 299 a 452 y 165 a 318, respectivamente. Se muestran las proteínas truncadas obtenidas a partir de UspA1 (A) y UspA2 (B). Todos los fragmentos fueron sometidos a ensayo para estudiar la unión a fibronectina en ELISA. Cuarenta nM de cada fragmento truncado se recubrieron sobre placas de microtitulación y se incubaron con 80 µg/ml y 120 µg/ml de fibronectina para UspA1 y UspA2, respectivamente. La fibronectina unida se detectó con AcP de conejo anti-fibronectina seguido de AcP anti-conejo conjugado con HRP. Los resultados son representativos de tres grupos de experimentos. Las barras de error representan la DE.
La Figura 6 muestra la secuencia de acuerdo con el ID de secuencia nº 1, y la homología entre secuencias entre UspA1299-452 (SEQ ID NO: 2) y UspA2165-318 (SEQ ID NO: 3). Los 31 residuos de aminoácidos idénticos están entre corchetes.
La Figura 7 muestra que los fragmentos truncados UspA150-491 y UspA1299-452 inhiben competitivamente la unión a fibronectina dependiente de UspA de M. catarrhalis. Los mutantes dobles ΔuspA1/A2 de M. catarrhalis, que no se unen a fibronectina, se incluyeron como controles negativos. Las proteínas recombinantes UspA1 se preincubaron con 2 mg/100 ml de fibronectina antes de la incubación con M. catarrhalis. Se muestran los valores medios de la fluorescencia (IMF) de M. catarrhalis con fibronectina unida detectada por FITC conjugado con AcP anti-fibronectina en citometría de flujo. UspA150-491 y UspA1299-452 dieron como resultado 95% y 63% de inhibición, respectivamente. Las barras de error representan la media ± DE de tres experimentos independientes.
La Figura 8 muestra que UspA1299-452 y UspA2165-318 inhiben la adherencia de M. catarrhalis a células conjuntivales Chang a través de fibronectina asociada a las células. Las células epiteliales Chang expresaban fibronectina en la superficie como se mostró con un AcP anti-fibronectina y citometría de flujo. (A) La preincubación con las proteínas que se unen a fibronectina UspA1299-452, UspA2165-318 o AcP anti-fibronectina daba como resultado una reducción significativa de la unión de M. catarrhalis RH4, en comparación con proteínas recombinantes de control (UspA1433-580 y UspA230-177) y un anticuerpo de control (AcMo anti-ICAM1). (B) P <0,05 en la prueba de la t de Student de dos colas. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error indican la DE.
La Fig. 9A muestra la unión de M. catarrhalis RH4 a laminina a través de UspA1 y A2. M. catarrhalis RH4 de tipo silvestre (wt) se unía fuertemente a laminina inmovilizada con una DO media de 1,27. RH4ΔuspA1 mostraba una DO media de 1,14 (89,8% del tipo silvestre). RH4ΔuspA2 y el mutante doble RH4ΔuspA1/A2 tenían una DO media de 0,19 y 0,23 respectivamente (15,0% y 18,1% del tipo silvestre). Esto no era significativamente diferente de la adhesión residual a placas recubiertas con seroalbúmina bovina. Se recubrieron placas de microtitulación con treinta µg/ml de laminina o de seroalbúmina bovina. Se bloquearon, después se incubaron con una suspensión de bacterias y finalmente se lavaron. Las bacterias unidas se detectaron con AcP anti-MID y AcP anti-conejo conjugado con HRP. Se muestran los resultados medios de 3 experimentos representativos. Las barras de error representan las desviaciones estándar (DE).
La Fig. 9B muestra la unión de UspA1 y A2 recombinante a laminina de una manera dependiente de la dosis. La unión específica a laminina se muestra para UspA150-770 y UspA230-539. Se recubrieron placas de microtitulación con ambas proteínas UspA (40 nM) y se incubaron con concentraciones crecientes de laminina seguido por la detección con AcP de conejo anti-laminina y AcP anti-conejo conjugado con HRP. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error indican la DE.
Las Fig. 10A y B muestran que los dominios activos que se unen a laminina de UspA150-770 (A) y UspA230-539 (B) están situados en las mitades N-terminales. Se recubrieron placas de microtitulación con cuarenta nM de UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes junto con las proteínas truncadas y se incubaron con 20 µg/ml de laminina seguido por la detección con AcP de conejo anti-laminina y AcP anti-conejo conjugado con HRP. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error indican la DE.
La Fig. 11 es una ilustración esquemática de C3, C3b unido covalentemente y C3met. (A) La molécula C3 en suero se compone de una cadena α y una cadena β. (B) La cadena α contiene un sitio tioéster interno que después de la activación se puede fijar covalentemente a una superficie microbiana. (C) El C3 ha sido tratado con metilamina, con lo que se une covalentemente al tioéster.
La Fig. 12 ilustra que M. catarrhalis contrarresta las vías clásica y alternativa del sistema del complemento mediante las proteínas de la membrana externa UspA1 y A2. (A) M. catarrhalis RH4 de tipo silvestre (wt), los mutantes ΔuspA1, ΔuspA2 o ΔuspA1/A2 se incubaron en presencia de 10% de SHN. (B) El mutante ΔuspA1/A2 se incubó con 10% de SHN complementado con EDTA o Mg-EGTA. Las bacterias se recogieron en los momentos indicados. Después de una incubación durante la noche, se contaron las unidades formadoras de colonias (ufc). El número de bacterias al inicio de los experimentos se definió como 100%. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error indican la DE. (A) Los valores medios después de 5 min para los mutantes ΔuspA1, ΔuspA2 o ΔuspA1/A2 eran diferentes significativamente de los de tipo silvestre (P <0,05). (B) Los valores medios después de 5 min para el mutante ΔuspA1/A2 y después de 10 min para el mutante ΔuspA1/A2 incubado con Mg-EGTA eran diferentes significativamente de los de tipo silvestre (P <0,05).
La Fig. 13 ilustra que Moraxella catarrhalis se une a C3 en el suero, independientemente de la activación del complemento. Perfiles de citometría de flujo que muestran la unión de C3 a (A) M. catarrhalis RH4 o (B) Streptococcus pneumoniae. Las bacterias se incubaron con SHN o SHN pretratado con EDTA. A continuación, se añadieron AcP de conejo anti-C3d humano y como capa secundaria un AcP de cabra anti-conejo conjugado con FITC, seguido por análisis con citometría de flujo. Las bacterias en ausencia de SHN, pero en presencia de ambos AcP, se definieron como fluorescencia de la señal de fondo. Se muestra un experimento representativo de cada tres.
La Fig. 14 ilustra que M. catarrhalis se une de forma no covalente a C3 purificado tratado con metilamina de una forma dependiente de la dosis, y que la unión se basa en interacciones iónicas. Los perfiles de la citometría de flujo muestran (A) la unión con concentraciones crecientes de C3met. (B) Se muestra la intensidad de la fluorescencia media (imf) de cada perfil en el panel (A). (C) La unión de RH4 a C3met disminuye con concentraciones crecientes de NaCl. Las bacterias se incubaron con C3met con o sin NaCl como se indica. La unión a C3met se midió por citometría de flujo como se describe en la Figura 3. Las barras de error indican la DE. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001.
La Fig. 15 ilustra que los perfiles de la citometría de flujo de M. catarrhalis RH4 de tipo silvestre y los mutantes que carecen de UspA1/A2 muestran una unión a C3met/C3 dependiente de UspA1/UspA2. Se muestran los perfiles de una cepa clínica aislada de tipo silvestre (A, F, K) y los correspondientes mutantes carentes de la proteína MID (B, G, L), UspA1 (C, H, M), UspA2 (D, I, N), o ambas UspA1 y UspA2 (E, J, O). Las bacterias se incubaron con C3met (A-E), SHN-EDTA (F-J) o SHN (K-O) y se detectaron como se indica en la Figura 3. Se muestra un experimento típico de cada tres con la intensidad media de fluorescencia (imf) para cada perfil.
La Fig. 16 ilustra que C3met se une a UspA230-539 purificada recombinante, mientras que solo se observa una unión débil de C3met a UspA150-770. Además, la región que se une a C3met de UspA2 se determinó que se encuentra localizado entre los residuos de aminoácidos 200 a 458. (A) UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes se inmovilizaron sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó con C3met marcado con [125I] durante una noche y la proteína unida se visualizó con un Personal FX (Bio-Rad) utilizando pantallas intensificadoras. La proteína recombinante MID962-1200 se incluyó como control negativo. (B) Se recubrieron placas de microtitulación con UspA150-770, UspA230-539 y una serie de proteínas UspA2 truncadas y se incubaron con C3met, seguido de incubación con AcP de cabra anti-C3 humano y AcP anti-cabra conjugado con HRP. Se muestran los valores medios de tres experimentos. La unión de la señal de fondo se restó de todas las muestras. Las barras de error se corresponden a la DE. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001.
La Fig. 17 ilustra que la adición de UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes al suero inhibe el depósito de C3b y la destrucción de M. catarrhalis a través de la vía alternativa. Los perfiles de la citometría de flujo muestran el depósito de C3b sobre RH4ΔuspA1/A2 después de la incubación con (A) SHN o SHN preincubado con UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes (rec.), o (B) SHN-Mg-EGTA o SHN-Mg-EGTA preincubado con UspA150-770 y UspA230-539 . Después de la adición de las diversas combinaciones de SHN, se analizaron las bacterias tal y como se describe en la Figura 13. (C) RH4ΔuspA1/A2 se incubó con 10% de SHN o SHN-Mg-EGTA. Para la inhibición, el SHN-Mg-EGTA
se incubó con UspA150-770 y/o UspA230-539 100 nM antes de la adición de las bacterias. Las bacterias se recogieron en los momentos indicados. El número de bacterias al inicio de los experimentos se definió como el 100%. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error indican la DE. Los momentos 10, 20 y 30 min para el mutante ΔuspA1/A2 preincubado con proteínas recombinantes eran diferentes significativamente del mutante ΔuspA1/A2 incubado con Mg-EGTA solo (P <0,05).
La Fig. 18 ilustra que UspA150-7710 y UspA230-539 recombinantes disminuyen la hemólisis de eritrocitos de conejo mediante la inhibición de la vía alternativa. SHN se incubó con o sin UspA150-770 y/o UspA230-539 100 nM a 37°C durante 30 min. A continuación, se añadió SHN a las concentraciones indicadas, a eritrocitos de conejo. Después de incubar durante 30 min, las suspensiones se centrifugaron y los sobrenadantes se midieron mediante espectrofotometría. La hemólisis máxima en cada experimento se definió como el 100%. Se muestran los valores medios de tres experimentos distintos y las barras de error se corresponden a la DE. Los resultados obtenidos con SHN + UspA230-539 y SHN + UspA150-770/UspA230-539 a concentraciones de SHN de 2, 3 y 4%, fueron diferentes significativamente del control SHN (P <0,05).
La Fig. 19 ilustra un análisis “pileup” de UspA1 para ocho cepas diferentes, para mostrar la homología de diferentes partes de UspA1 (SEQ ID NOs: 11-18 se describen, respectivamente, por orden de aparición).
La Fig. 20 ilustra un análisis pileup de UspA2 para trece cepas diferentes para mostrar la homología de diferentes partes de UspA2 (SEQ ID NOs: 19-31 se describen, respectivamente, por orden de aparición).
La Fig. 21 ilustra el % de identidad en regiones identificadas en la secuencia Forsgren, calculado como la relación entre el número de coincidencias exactas y la longitud de la alineación de la región, en donde la alineación de la región es la parte de la alineación total anterior que contiene la región Forsgren.
Materiales y métodos
Interacción entre M. catarrhalis y cepas bacterianas de fibronectina y condiciones de cultivo
Las fuentes de las cepas clínicas de M. catarrhalis se muestran en la tabla 7. Los mutantes de M. catarrhalis BBH18 y RH4 se construyeron como se ha descrito anteriormente [23, 58]. Las cepas de M. catarrhalis se cultivaron de forma rutinaria en caldo de cultivo líquido para infusión cerebro corazón (BHI) o en placas de agar BHI a 37°C. Los mutantes carentes de UspA1 se cultivaron en BHI complementado con 1,5 µg/ml de cloranfenicol (Sigma, St. Louis, MO), y los mutantes carentes de UspA2 se incubaron con 7 µg/ml de zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tanto el cloranfenicol como la zeocina se utilizaron para el crecimiento de los mutantes dobles.
Tabla 7. Cepas clínicas de M. catarrhalis utilizadas en el presente estudio
Cepa Fuente Clínica Referencia
BBH18 Esputo [53]
D1 Esputo [53]
Ri49 Esputo [53]
C10 Esputo [10]
F16 Esputo [10]
Bro2 Vías respiratorias [53]
Z14 Faringe [10]
S6-688 Nasofaringe [23]
Ac5 Nasofaringe [20]
RH4 Sangre [53]
RH6 Sangre [53]
R14 Desconocida [10]
- Cepa
- Fuente Clínica Referencia
- R4
- Desconocida [10]
- SÖ-1914
- Aspirado de la cavidad timpánica [23]
Nota: Las cepas C10, R4 no tenían el gen uspA1, mientras que F16, R14, Z14 carecían del gen uspA2 [10]. Las cepas restantes contenían ambos genes uspA1 y A2 (datos no mostrados).
Método de ADN
Para detectar la presencia de los genes uspA1, A2 y A2H en aquellas cepas en las que esto se desconocía, se emplearon cebadores y condiciones de PCR tales como las que se describen en Meier et al. [50]. La secuenciación parcial también se llevó a cabo con los cebadores 5' y 3' de UspA1299-452 y UspA2165-318 de los genes respectivos uspA1 y uspA2 de RH4 y BBH18. La confirmación de la presencia de los residuos de aminoácidos "DQKADIDNNINNI-YELAQQQDQHSSDIKTLK" (SEQ ID NO: 1) también se realizó mediante PCR con un cebador (5'-CAAAGCTGACATCCAAGCACTTG-3') (SEQ ID NO: 54) diseñado desde el extremo 5' de esta secuencia y cebadores 3’ para uspA1 y A2 como describen Meier et al. [50].
Construcción y expresión de proteínas recombinantes
UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes que están desprovistas de su extremo C-terminal hidrófobo, han sido descritas recientemente [58]. El ADN genómico se extrajo a partir de M. catarrhalis Bc5 utilizando un kit de tejido DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). Además, las proteínas recombinantes correspondientes a regiones múltiples que abarcaban UspA150-770 y UspA230-539 también se construyeron por el mismo método. Los cebadores utilizados se muestran en la tabla 8. Todas las estructuras artificiales fueron secuenciadas de acuerdo con métodos convencionales. La expresión y la purificación de las proteínas recombinantes se realizaron como se ha descrito anteriormente [59]. Las proteínas se purificaron usando columnas que contenían una resina de níquel (Novagen) según las instrucciones del fabricante para condiciones naturales. Las proteínas recombinantes se analizaron en SDS-PAGE como se ha descrito [21].
Tabla 8. Cebadores usados en el presente estudio (los cebadores 5' se describen como SEQ ID NOS 55-69, respectivamente, por orden de aparición; los cebadores 3' se describen como SEQ ID NOS 70-84, respectivamente, por orden de aparición)
Proteína cebador 5' cebador 3'
UspA150-770 gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaacc ccctgaagctttagtgcataacctaattg
UspA150-491 gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaacc ttgagcaagcttagcttggtttttagcg
UspA150-197 gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaacc acctgtggcaagcttcttcctgcc
UspA150-321 gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaacc
ggtgtcactaagcttacctgcaccaacatgaac
UspA1299-452 ggatttgcaggtgcatcggatcctggtaatggtact gtcttttgtaagatcaagcttttgatcaat
UspA1433-580 catagctctgatatggatccacttaaaaac catgctgagaagcttacctagattgg
UspA1557-704 gccaaagcacaagcggatccaaataaagac ggtcttattggtagtaagcttagcttggttttg
UspA1680-770 gttgagcaaaaggatcccatcaatcaagag ccctgaagctttagtgcataacctaattg
UspA230-539 cgaatgcggatcctaaaaatgatataactttagagg cattaagcttggtgtctaatgcagttac
- Proteína
- cebador 5' cebador 3'
- UspA230-177
- cgaatgcggatcctaaaaatgatataactttagagg ctcatgaccaaaatcaagcttatcttcgatagactc
- UspA2101-240
- gatattgcggatccggaagatgatgttgaaac gatcaataagcttaccgcttagattgaatagttcttc
- UspA2101-318
- gatattgcggatccggaagatgatgttgaaac gtcaatcgcttcaagcttcttttgagcatactg
- UspA2165-318
- gagattgagaaggatccagatgctattgct gtcaatcgcttcaagcttcttttgagcatactg
- UspA2302-458
- gctcaaaaccaagcggatccccaagatctg ggtgagcgtttcaagctttgcatcagcatcggc
- UspA2446-539
- gcaagtgctgcggatcctgatcgtattgct cattaagcttggtgtctaatgcagttac
Anticuerpos
Anticuerpos policlonales (AcP) de conejo anti-UspA1/A2 se han descrito recientemente con detalle [58]. Los otros anticuerpos utilizados eran AcP de conejo anti-fibronectina humana, AcP de cerdo anti-conejo conjugado con FITC, AcP de cerdo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y, finalmente, un anticuerpo monoclonal (AcMo) de ratón anti-CD54 humano (ICAM1). Los anticuerpos procedían de Dakopatts (Glostrup, Dinamarca).
Análisis por citometría de flujo
La expresión de la proteína UspA1/A2 y la capacidad de M. catarrhalis para unirse a la fibronectina se analizaron mediante citometría de flujo. Cepas de tipo silvestre de M. catarrhalis y mutantes carentes de UspA1/A2 se cultivaron durante una noche y se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato que contenía 3% de gelatina de pescado (PBS-gelatina). Las bacterias (108) se incubaron a continuación con el antisuero anti-UspA1/A2 o 5 µg de fibronectina (Sigma, St Louis, MO). Después se lavaron y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (TA) con AcP anti-conejo conjugado con FITC (diluido de acuerdo con las instrucciones del fabricante) o con una dilución 1/100 de AcP de conejo anti-fibronectina humana (si la fibronectina se había añadido primero) durante 30 min a TA antes de la incubación con el AcP anti-conejo conjugado con FITC. Después de tres lavados adicionales, las bacterias fueron analizadas mediante citometría de flujo (EPICS, XL-MCL, Coulter, Hialeah, FL). Todas las incubaciones se mantuvieron en un volumen final de 100 µl de PBS-gelatina y los lavados se realizaron con el mismo tampón. AcP anti-fibronectina y AcP anti-conejo conjugado con FITC se añadieron por separado como control negativo para cada cepa analizada. Se realizaron estudios de inhibición con fibronectina mediante la preincubación de 0,25 µmoles de fragmentos de UspA durante 1 h con 2 µg de fibronectina, antes de la incubación con bacterias de M. catarrhalis (108). La cantidad residual exenta de fibronectina que se unió a M. catarrhalis se determinó por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.
Unión de M. catarrhalis a fibronectina inmovilizada
Los portaobjetos de vidrio se recubrieron con partes alícuotas de 30 µl de fibronectina (1 mg/ml) y se secaron al aire a TA. Después de lavar una vez con PBS, los portaobjetos se incubaron en placas de Petri con bacterias refrigeradas previamente en fase exponencial tardía (densidad óptica (DO) a 600 nm = 0,9). Después de 2 h a TA, los portaobjetos de vidrio se lavaron una vez con PBS seguido por tinción de Gram.
Marcado de proteínas y radioinmunoensayo (RIA)
La fibronectina se marcó con 125Iodo (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) con gran actividad específica (0,05 mol de yodo por mol de proteína) con el método de cloramina T [21]. Las cepas de M. catarrhalis BBH18 y RH4, junto con sus mutantes correspondientes se cultivaron durante una noche en medio sólido y se lavaron en PBS con seroalbúmina bovina al 2% (BSA). Las bacterias (108) se incubaron durante 1 h a 37°C con fibronectina marcada con 125I (1600 kcpm/muestra) en PBS que contenía 2% de BSA. Después de tres lavados con PBS con 2% de BSA, la fibronectina marcada con 125I unida a las bacterias se midió en un contador gamma (Wallac, Espoo, Finlandia).
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Las placas de microtitulación (Nunc-Immuno Module; Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con 40 nM de proteínas UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes purificadas, en carbonato de sodio 75 mM, pH 9,6 a 4°C durante una noche. Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, y 0,1% de Tween 20, pH 7,5) y se bloquearon durante 2 h a TA con tampón de lavado que contenía 3% de gelatina de pescado. Después de cuatro lavados adicionales, los pocillos se incubaron durante 1 h a TA con fibronectina (120 µg/ml) diluida tres veces en una etapa en 1,5% de gelatina de pescado (en tampón de lavado). A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con AcP de conejo anti-fibronectina humana durante 1 h. Después de lavados adicionales, se añadió
AcP anti-conejo conjugado con HRP y se incubó durante 1 h a TA. Tanto el AcP anti-fibronectina humana como el anti-conejo conjugado con HRP se diluyeron 1:1000 en tampón de lavado que contenía 1,5% de gelatina de pescado. Los pocillos se lavaron cuatro veces y las placas se revelaron y se midieron a DO450. Se realizaron ELISAs con proteínas truncadas que abarcaban UspA150-770 y UspA230-539 con dosis fijas de fibronectina a 80 µg/ml y 120 µg/ml, respectivamente.
Ensayo de inhibición de la adherencia de líneas celulares
Células conjuntivales Chang (ATCC CCL 20.2) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Escocia) complementado con 10% de suero de ternera fetal, L-glutamina 2 mM y 12 µg de gentamicina/ml. El día anterior a los experimentos de inhibición de la adherencia, las células se recogieron, se lavaron dos veces en RPMI 1640 exento de gentamicina, y se añadieron a placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Nunc) hasta tener una concentración final de 109 células/pocillo en 200 µl de medio de cultivo exento de gentamicina. Posteriormente, las células se incubaron durante una noche a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire. El día de los experimentos, la inhibición de la adhesión de M. catarrhalis se llevó a cabo mediante una concentración creciente de preincubación de las proteínas UspA1/A2 truncadas recombinantes que contenían los dominios de unión a fibronectina (UspA1299-452 y UspA2165-318) o AcP de conejo anti-fibronectina humana (diluido 1:50) durante 1 h. Las proteínas recombinantes que no se unían a fibronectina (UspA1433-580 y UspA230-177) se utilizaron como controles. Se sabe que las células epiteliales Chang expresan ICAM1 [18]. Por lo tanto se usó un anticuerpo anti-ICAM1 para diferenciar si el efecto inhibidor del anticuerpo anti-fibronectina era secundario al impedimento estérico. Posteriormente, se inoculó M. catarrhalis RH4 (106) en PBS-gelatina sobre las monocapas confluentes. En todos los experimentos, las placas de cultivo de tejidos se centrifugaron a 3.000 x g durante 5 min y se incubaron a 37°C en 5% de CO2. Después de 30 min, las monocapas infectadas se enjuagaron varias veces con PBS-gelatina para eliminar las bacterias no adherentes y después se trataron con tripsina-EDTA (0,05% de tripsina y EDTA 0,5 mM) para liberar las células Chang del soporte de plástico. Posteriormente, la suspensión de células/bacterias resultante se sembró en dilución sobre placas de agar que contenían BHI y se incubaron durante una noche a 37°C en 5% de CO2.
Determinación de la expresión de fibronectina en células epiteliales conjuntivales Chang
Las células epiteliales conjuntivales Chang se recogieron mediante raspado seguido de una resuspensión en PBSgelatina. Las células (1 x 106/ml) se marcaron con AcP de conejo anti-fibronectina humana, seguido por lavado e incubación con un AcP anti-conejo conjugado con FITC. Después de tres lavados adicionales, las células se analizaron mediante citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.
Interacción entre M. catarrhalis y cepas bacterianas de laminina y condiciones de cultivo
Las cepas clínicas de M. catarrhalis BBH18 y RH4 y sus correspondientes mutantes se han descrito anteriormente [58]. Ambas cepas tienen una expresión relativamente elevada de UspA2 en comparación con UspA1 [58]. Los mutantes expresaban igual cantidad de proteína que se une a IgD de M. catarrhalis (MID) en comparación con las cepas de tipo silvestre. Las bacterias se cultivaron rutinariamente en caldo de cultivo de infusión cerebro corazón (BHI)
o en placas de agar BHI a 37°C. Los mutantes carentes de UspA1, UspA2 y los mutantes dobles fueron cultivados en BHI complementado con antibióticos, como se ha descrito [58].
Construcción de proteínas recombinantes y expresión recombinante
Se prepararon UspA150-770 y UspA230-539, que están desprovistas de sus extremos C-terminales hidrófobos [58]. Además, se emplearon proteínas recombinantes correspondientes a regiones múltiples que abarcaban UspA150-77 y
UspA230-539 [78].
Anticuerpos
Se utilizaron anticuerpos policlonales (AcP) de conejo anti-UspA1/A2 y anti-MID [22, 58]. El AcP de conejo antilaminina era de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.). El AcP de cerdo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) era de Dakopatts (Glostrup, Dinamarca).
Unión de M. catarrhalis a laminina inmovilizada
Las placas de microtitulación (Nunc-Immuno Module; Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con laminina de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (Sigma, Saint Louis, EE.UU.) o albúmina de suero bovino (BSA) (30 µg/ml) en Tris-HCl, pH 9,0 a 4°C durante una noche. Las placas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y 0,05% de Tween 20, pH 7,2 (PBS-Tween) y posteriormente se bloquearon con 2% de BSA en PBS + 0,1% de Tween 20, pH 7,2. M. catarrhalis RH4 y BBH18 (108) en 100 µl se añadieron después, seguido de incubación durante 1 h. Las bacterias no unidas se eliminaron lavando 3 veces con PBS-Tween. Las bacterias unidas residuales se detectaron por medio de un AcP anti-MID, seguido por la detección con AcP anti-conejo conjugado con HRP. Las placas se revelaron y se midieron a DO450 de acuerdo con un protocolo convencional.
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Las placas de microtitulación (Nunc-Immuno Module) se recubrieron con 40 nM de proteínas UspA150-770 y UspA230539 recombinantes purificadas en carbonato de sodio 75 mM, pH 9,6 a 4°C. Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M y 0,1% de Tween 20, pH 7,5) y se bloquearon a TA con tampón de lavado que contenía 3% de gelatina de pescado. Después de lavados adicionales, los pocillos se incubaron durante 1 h a TA con laminina con diferentes diluciones como se ha indicado, en 1,5% de gelatina de pescado (en tampón de lavado). A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con AcP de conejo anti-laminina. Después de lavados adicionales, se añadió AcP anti-conejo conjugado con HRP y se incubó a TA. Tanto el AcP anti-laminina como el anti-conejo conjugado con HRP se diluyeron 1:1000 en tampón de lavado que contenía 1,5% de gelatina de pescado. Los pocillos se lavaron y las placas se revelaron y se midieron a DO450. Los pocillos no recubiertos incubados con diluciones idénticas de laminina se utilizaron como controles de la señal de fondo. Los ELISAs con proteínas truncadas que abarcaban UspA150-770 y UspA230-539 se realizaron con dosis fijas de laminina (20 µg/mL).
Interacción entre M. catarrhalis y C3 y C3met, Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Las cepas aisladas clínicas de M. catarrhalis y subespecies relacionadas han sido descritas recientemente con detalle [21, 53]. Las cepas tipo eran de la Colección de Cultivos de la Universidad de Gotemburgo (CCUG; Departamento de Bacteriología Clínica, Hospital Sahlgrenska, Gotemburgo, Suecia) o la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA); Neisseria gonorrheae CCUG 15821, Streptococcus pyogenes CCUG 25570 y 25571, Streptococcus agalactiae CCUG 4208, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Legionella pneumophila ATCC 33152, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y, finalmente, Staphylococcus aureus ATCC 25923. Las cepas restantes de la Tabla 9 eran cepas aisladas clínicas procedentes de Microbiología Médica, Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Universitario de Malmö, Universidad de Lund, Suecia.
Tabla 9. M. catarrhalis es una bacteria particular que se une a C3/C3met. Subespecies relacionadas de Moraxella y otros agentes patógenos humanos comunes no se unen a C3/C3met (imf < 2,0). Después de la incubación con SHN tratado con EDTA o C3met, las bacterias se analizaron por citometría de flujo utilizando un AcP de conejo anti-C3d y un AcP de cabra anti-conejo conjugado con FITC.
- Especies
- SHN-EDTA (imf) C3met (imf)
- Moraxella catarrhalis RH4
- 8,7 22,1
- M. osloensis
- <2,0 <2,0
- M. bovis
- <2,0 <2,0
- M. caniculi
- <2,0 <2,0
- M. nonliquefacie
- <2,0 <2,0
- N. pharyngis
- <2,0 <2,0
- N. sicca
- <2,0 <2,0
- N. flava
- <2,0 <2,0
- N. subflava
- <2,0 <2,0
- Oligella ureolytica (n = 2)
- <2,0 <2,0
- Haemophilus influenzae (n = 7)
- <2,0 <2,0
- Streptococcus pneumoniae (n = 11)
- <2,0 <2,0
- Legionella pneumophila (n = 2)
- <2,0 <2,0
- Pseudomonas aeruginosa (n = 2)
- <2,0 <2,0
- Listeria monocytogenes
- <2,0 <2,0
Especies SHN-EDTA (imf) C3met (imf)
Yersinia entercolitica <2,0 <2,0
Staphylococcus aureus (n = 3) <2,0 <2,0
Streptococcus pyogenes (n = 2) <2,0 <2,0
Streptococcus agalactia <2,0 <2,0
Enterococcus faecalis <2,0 <2,0
Helicobacter pylori <2,0 <2,0
Escherichia coli (n = 2) <2,0 <2,0
M. ovis <2,0 <2,0
M. caviae <2,0 <2,0
Neisseria gonorrhoeae <2,0 <2,0
N. meningitidis <2,0 <2,0
N. mucosa <2,0 <2,0
Las diferentes especies que no eran Moraxella, se cultivaron en medio de cultivo estándar adecuado. Las cepas de
M. catarrhalis se cultivaron de forma rutinaria en caldo de cultivo líquido de infusión cerebro corazón (BHI) o en placas de agar BHI a 37°C. Los mutantes de M. catarrhalis BBH18 y RH4 se prepararon tal y como se ha descrito anteriormente [22, 23, 58]. Los mutantes carentes de MID se cultivaron en BHI que contenía 50 µg/ml de kanamicina. Los mutantes carentes de UspA1 se cultivaron en BHI complementado con 1,5 µg/ml de cloranfenicol (Sigma, St. Louis, MO), y los mutantes carentes de UspA2 se incubaron con 7 µg/ml de zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tanto el cloranfenicol como la zeocina se utilizaron para el crecimiento de los mutantes dobles UspA1/A2.
Anticuerpos
Se inmunizaron conejos por vía intramuscular con 200 µg de UspA1 recombinante de longitud completa emulsionada en adyuvante completo de Freund (Difco, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania), y se dieron dosis de refuerzo los días 18 y 36 con la misma dosis de proteína en adyuvante incompleto de Freund [22]. La sangre fue extraída 3 semanas más tarde. Para aumentar la especificidad, el antisuero anti-UspA1 se purificó por afinidad con UspA150-770 recombinante conjugada con sefarosa [58]. El antisuero se unía igualmente a UspA1 y a UspA2 y por tanto se denominó AcP anti-UspA1/A2. El AcP de conejo anti-C3d humano y el AcP de cerdo anti-conejo conjugado con FITC fueron adquiridos en Dakopatts (Glostrup, Dinamarca), y el de cabra anti-C3 humano era de Advanced Research Technologies (San Diego, CA). El AcP de burro anti-cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se obtuvo de Serotec (Oxford, GB).
Proteínas y marcado con yodo
La preparación de UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes, que están desprovistas de sus extremos C-terminales hidrófobos, se ha descrito recientemente [23]. Las proteínas UspA1 y UspA2 truncadas se prepararon tal como se describe con detalle en Tan et al. [78]. C3b se adquirió de Advanced Research Technologies. C3(H2O) se obtuvo mediante congelación y descongelación de C3 purificado. La molécula similar a C3b (C3met) se preparó mediante incubación de C3 purificado con metilamina 100 mM (pH 8,0) durante 2 horas a 37°C, seguido de diálisis frente a Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM. Para los estudios de la unión, C3met se marcó con 125I 0,05 mol (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) por mol de proteína, utilizando el método de cloramina T [25].
Análisis por citometría de flujo
La unión de C3 a M. catarrhalis y a otras especies se analizó por citometría de flujo. Las bacterias se cultivaron en medio sólido durante una noche y se lavaron dos veces en PBS que contenía 2% de BSA (Sigma) (PBS-BSA). A continuación, las bacterias (108 unidades formadoras de colonias; ufc) se incubaron con C3met, C3b, C3(H2O) o 10% de SHN con o sin EDTA 10 mM o MgCl2 4 mM y EGTA 10 mM (Mg-EGTA) en PBS-BSA durante 30 min a
37°C. Después de los lavados, las bacterias se incubaron con AcP anti-C3d humano durante 30 min sobre hielo, seguido de lavados e incubación durante otros 30 min sobre hielo con AcP de cabra anti-conejo conjugado con FITC. Después de tres lavados adicionales, las bacterias se analizaron mediante citometría de flujo (EPICS, XL-MCL, Coulter, Hialeah, FL). Todas las incubaciones se mantuvieron en un volumen final de 100 µl de PBS-BSA y los lavados se realizaron con el mismo tampón. El AcP anti-C3d humano y el AcP anti-conejo conjugado con FITC se añadieron por separado como control negativo para cada cepa analizada. En los estudios de inhibición, el suero se preincubó con 100 nM de las proteínas UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes durante 30 min a 37°C. Para analizar las características de la interacción entre M. catarrhalis y C3, se añadieron concentraciones crecientes de NaCl (0 1,0 M) a las bacterias y C3met. Para analizar la expresión de UspA1/A2, se incubaron bacterias (108 ufc) con el AcP anti-UspA1/A2 y se lavaron como se ha descrito anteriormente. Un AcP de cabra anti-conejo conjugado con FITC, diluido de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se utilizó para la detección. Para asegurar que el EDTA no destruyera las proteínas UspA1 y UspA2de la membrana externa, M. catarrhalis se incubó con o sin EDTA seguido por una detección de la expresión de UspA1/A2. EDTA, a las concentraciones utilizadas en los experimentos con SHN-EDTA, no cambiaba la densidad de UspA1/A2.
Suero y ensayo bactericida en suero
El suero humano normal (SHN) se obtuvo a partir de cinco voluntarios sanos. La sangre se dejó coagular durante 30 min a temperatura ambiente y después se incubó sobre hielo durante 60 min. Después de la centrifugación, los sueros se reunieron, se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron a -70°C. Para inactivar las vías tanto clásica como alternativa, se añadió EDTA 10 mM. En contraste, Mg-EGTA se incluyó para inactivar la vía clásica. El suero humano carente de C4BP se preparó pasando suero de nuevo aporte a través de una columna HiTrap (Amersham Biosciences) junto con AcMo 104, un AcMo de ratón dirigido contra CCP1 de la cadena α de C4BP [41]. El flujo a través se recogió y el suero agotado se almacenó en partes alícuotas a -70°C. El suero agotado de C1q se obtuvo a través de la primera etapa de purificación de C1q [79], utilizando cromatografía de intercambio iónico Biorex 70 (Bio-Rad, Hercules, CA). Los sueros resultantes mostraron una actividad hemolítica normal. El factor D y el suero carente de properdina fueron proporcionados amablemente por el Dr. Anders Sjöholm (Departamento de Microbiología Médica de la Universidad de Lund, Lund, Suecia). Las cepas de M. catarrhalis se diluyeron en tampón Veronal 2,5 mM, pH 7,3 que contenía 0,1% (peso/vol) de gelatina, MgCl2 1 mM, CaCl2 0,15 mM y 2,5% de dextrosa (DGVB++). Las bacterias (103 ufc) se incubaron junto con 10% de SHN y EDTA o Mg-EGTA con un volumen final de 100 µl. Las bacterias/SHN se incubaron a 37°C y en varios momentos, se retiraron 10 µl de partes alícuotas y se extendieron sobre placas de agar BHI. En los estudios de inhibición, 10% de suero se incubó con 100 nM de las proteínas UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes durante 30 min a 37°C antes de añadir las bacterias.
Ensayos de transferencia de puntos
UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes purificadas diluidas por triplicado en etapas (1,9 a 150 nM) en 100 µl de Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0 se aplicaron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schull, Dassel, Alemania), utilizando un dispositivo de transferencia de puntos. Después de la saturación, las membranas se incubaron durante 2 h con PBS-Tween que contenía 5% de leche en polvo a temperatura ambiente y se lavaron cuatro veces con PBS-Tween. A continuación, C3met marcado con 5 kcpm de [125I] en PBS-Tween con 2% de leche en polvo, se añadió durante una noche a 4°C. La proteína unida se visualizó con un Personal FX (Bio-Rad) utilizando pantallas intensificadoras.
Resonancia de plasmón superficial (Biacore)
La interacción entre UspA150-770 o UspA230-539 y C3 se analizó adicionalmente empleando resonancia de plasmón superficial (Biacore 2000; Biacore, Uppsala, Suecia) como se ha descrito recientemente para la interacción UspA1/2-C4BP [58]. La KD (la constante de disociación en equilibrio) se calcula a partir de una curva de unión que muestra la respuesta en equilibrio representada frente a la concentración utilizando un modelo de afinidad en estado estacionario proporcionado por el programa informático Biaevaluation (Biacore).
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Las placas de microtitulación (Nunc-Immuno Module; Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con tripletes de UspA150770, UspA230-539 recombinantes purificadas, o los fragmentos truncados de UspA1 y UspA2 (40 nM en carbonato sódico 75 mM, pH 9,6) a 4°C durante una noche. Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado (PBS con 0,1% de Tween 20, pH 7,2) y se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con tampón de lavado complementado con 1,5% de ovoalbúmina (tampón de bloqueo). Después de los lavados, los pocillos se incubaron durante una noche a 4°C con 0,25 µg de C3met en tampón de bloqueo. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-C3 humano en tampón de bloqueo durante 1 h a TA. Después de lavados adicionales, se añadieron AcPs de burro anti-cabra conjugados con HRP durante 1 hora a TA. Los pocillos se lavaron cuatro veces y las placas se revelaron y se midieron a DO450.
Ensayo hemolítico
Los eritrocitos de conejo se lavaron tres veces con tampón Veronal 2,5 mM enfriado con hielo, pH 7,3 que contenía 0,1% (peso/vol) de gelatina, MgCl2 7 mM, EGTA 10 mM y 2,5% de dextrosa (Mg++EGTA), y se resuspendieron hasta
tener una concentración de 0,5 x 109 células/ml. Los eritrocitos se incubaron con diversas concentraciones (0 a 4%) de suero diluido en Mg++EGTA. Después de 1 h a 37°C, los eritrocitos se centrifugaron y la cantidad de eritrocitos lisados se determinó por medición espectrofotométrica de la hemoglobina liberada a 405 nm. Para la inhibición con UspA1 y UspA2, 10% de suero se preincubó con 100 nM de proteínas UspA150-770 y/o UspA230-539 recombinantes durante 30 min a 37°C, y posteriormente se añadió a los eritrocitos de 0 a 4%.
Aislamiento de leucocitos polimorfonucleares y fagocitosis
Los leucocitos polimorfonucleares (PMN) humanos se aislaron a partir de sangre fresca de voluntarios sanos, utilizando macrodex (Pharmalink AB, Upplands Väsby, Suecia). Los PMN se centrifugaron durante 10 min a 300 g, se lavaron en PBS y se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Escocia). La suspensión bacteriana (0,5 x 108) se opsonizó con 3% de SHN o SHN-EDTA, o 20 µg de C3met purificado durante 15 min a 37°C. Después de los lavados, las bacterias se mezclaron con PMN (1 x 107 células/ml) en una proporción de bacterias/PMN de 10:1 seguido de incubación a 37°C con rotación de extremo a extremo. Las bacterias supervivientes después de 0, 30, 60 y 120 minutos de incubación se determinaron mediante recuentos de microorganismos viables. El número de bacterias fagocitadas tratadas con SHN se comparó con el de bacterias fagocitadas en ausencia de SHN. S. aureus opsonizado con SHN se utilizó como control positivo.
Ejemplos y resultados
Interacción entre M. catarrhalis y fibronectina
M. catarrhalis carente de UspA1 y A2 no se une a fibronectina soluble o inmovilizada.
Se seleccionó una serie aleatoria de cepas clínicas de M. catarrhalis (n = 13) (tabla 7) y se sometieron a ensayo para estudiar la unión a fibronectina en relación con su expresión de UspA1/A2 mediante un análisis por citometría de flujo. Una expresión elevada de UspA1/A2 según se determinó por una intensidad media de fluorescencia elevada (IMF), se correlacionó con la expresión de UspA1/A2 (coeficiente de correlación de Pearson 0,77, P <0,05) (figura 1A). Sin embargo, distinguir entre la expresión de UspA1 y de A2 no era posible con nuestro AcP anti-UspA1/A2. Además, la presencia de la proteína UspA2H contribuyendo a la unión, era poco probable ya que el gen uspA2H no se encontró en las cepas utilizadas en este estudio (datos no mostrados).
Dos cepas aisladas de M. catarrhalis (BBH18 y RH4) y sus mutantes específicos que carecen de UspA1, UspA2 o ambas proteínas, también se analizaron por citometría de flujo. M. catarrhalis BBH18 se unía fuertemente a fibronectina con una intensidad media de fluorescencia (IMF) de 96,1 (Figura 1F). Por el contrario, BBH18ΔuspA1 mostraba una disminución de la unión a fibronectina con una IMF de 68,6 (figura 1G). La unión de fibronectina a BBH18ΔuspA2 y al mutante doble BBH18ΔuspA1/A2 reveló una IMF de solo 10,7 y 11,5, respectivamente (Figura 1H,1I). Se obtuvieron resultados similares con mutantes UspA1/A2 de la cepa clínica M. catarrhalis RH4. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que UspA1 y A2 se unen a fibronectina y que la capacidad de las bacterias para unirse a la fibronectina dependía en gran medida de la expresión de UspA1/A2.
Con el fin de analizar la interacción entre fibronectina y M. catarrhalis, fibronectina marcada con 125I se incubó con dos cepas clínicas aisladas de M. catarrhalis (BBH18 y RH4) y sus respectivos mutantes. M. catarrhalis RH4 de tipo silvestre se unía fuertemente a 125I-fibronectina, mientras que el mutante correspondiente ΔuspA1 mostraba 80% de unión de la de tipo silvestre. En contraste, ΔuspA2 y el mutante doble se unían a 125I-fibronectina con 14% y 12%, respectivamente, que era justo por encima de los niveles de señal de fondo (5,0 a 10%) (figura 2). Se obtuvieron resultados similares con M. catarrhalis BBH18 y los mutantes correspondientes UspA1/A2. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que tanto UspA1 como A2 son necesarias para la unión máxima de M. catarrhalis a fibronectina soluble.
Para investigar la fijación bacteriana a fibronectina inmovilizada, M. catarrhalis RH4 y sus correspondientes mutantes ΔuspA1/A2 se aplicaron sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina. Después de 2 h de incubación, los portaobjetos se lavaron y, posteriormente, se realizó una tinción de Gram. Se encontró que M. catarrhalis de tipo silvestre y el mutante ΔuspA1 se adherían fuertemente a los portaobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina (figura 3A y 3B). En contraste, ΔuspA2 y los mutantes dobles ΔuspA1/A2 de M. catarrhalis se adherían débilmente a la lámina de vidrio recubierta con fibronectina, quedando solo una pocas bacterias después del lavado (figura 3C y 3D, respectivamente). Los experimentos con otra cepa clínica aislada de M. catarrhalis (BBH18) y sus mutantes derivados mostraron un patrón similar lo que indica que UspA2 tenía una gran importancia para la unión de M. catarrhalis a fibronectina inmovilizada.
Los dominios de unión a fibronectina incluyen residuos de aminoácidos situados entre 299 y 452 de UspA1 y entre 165 y 318 de UspA2
Con el fin de analizar adicionalmente las interacciones de UspA1 y A2 con fibronectina, UspA150-770 y UspA230-539 truncadas fueron producidas de forma recombinante en E. coli, se recubrieron placas de microtitulación y se incubaron con concentraciones crecientes de fibronectina. La fibronectina unida se detectó con un AcP anti-fibronectina humana seguido de incubación con un AcP anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante. Tanto UspA150-770 como UspA230-539 recombinantes se unían a fibronectina soluble y las interacciones eran dependientes de
la dosis (figura 4).
Para definir el dominio de unión a fibronectina de UspA1, se prepararon proteínas recombinantes que incluían toda la molécula de UspA150-770. La fibronectina se incubó con los fragmentos de proteínas UspA1 inmovilizadas y las interacciones se cuantificaron mediante ELISA. UspA150-491 se unía a fibronectina casi de forma tan eficaz como UspA150-770 lo que sugiere que el dominio de unión estaba dentro de esta parte de la proteína. Entre los otros fragmentos truncados, UspA1299-452 se unía de manera eficaz a la fibronectina (figura 5A). Paralelamente, se analizaron las interacciones entre fibronectina y varios fragmentos de UspA2 recombinante que incluían los aminoácidos UspA230
539. Los dos fragmentos UspA2101-318 y UspA2165-318 se unían fuertemente a la fibronectina (figura 5B). Nuestros hallazgos proporcionan una evidencia significativa de que los dominios de unión incluyen residuos que se encuentran dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318. Una comparación de las secuencias entre estos dos fragmentos de unión reveló que los 31 residuos de aminoácidos "DQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLK" (SEQ ID NO: 1) eran idénticos para UspA1 y A2 (figura 6). Además, esta secuencia repetida también se encontró en el gen uspA1 y A2 de M. catarrhalis BBH18 y RH4 (datos no mostrados).
Los fragmentos UspA150-491 y UspA1299-452 inhiben competitivamente la unión de M. catarrhalis a fibronectina
Con el fin de validar nuestros hallazgos sobre los dominios de unión entre fibronectina y UspA1/A2, las proteínas UspA1 truncadas recombinantes se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para bloquear la unión a fibronectina de M. catarrhalis. La fibronectina (2 µg) se preincubó con 0,25 µmoles de fragmentos de UspA1 recombinante y, posteriormente, se incubó con M. catarrhalis. Finalmente, la unión de fibronectina dependiente de UspA con
M. catarrhalis se midió por citometría de flujo. La preincubación con UspA150-491 y UspA1299-452 dio como resultado una disminución de la unión a fibronectina con una reducción del 95% para UspA150-491 y una reducción del 63% para UspA1299-452 (figura 7). Cuando la fibronectina se preincubó con UspA2101-318 truncada, se obtuvo una inhibición del 50%.
Por lo tanto, los dominios de unión a fibronectina de UspA1 y A2 bloquean las interacciones entre la fibronectina y M. catarrhalis.
UspA1299-452 y UspA2165-318 inhiben la adherencia de M. catarrhalis a las células epiteliales Chang
Las células epiteliales son conocidas por expresar fibronectina y muchas bacterias se fijan a las células epiteliales a través de fibronectina asociada a las células [46, 54, 69, 77]. Estudios anteriores han mostrado que M. catarrhalis se adhiere a las células epiteliales [43, 49]. Se analizaron las células conjuntivales Chang, que con frecuencia se han utilizado en experimentos de adhesión con agentes patógenos respiratorios. Las células Chang expresaban fuertemente fibronectina según se mostró por análisis de citometría de flujo (figura 8A).
Para analizar si la unión a fibronectina dependiente de UspA era importante para la adhesión bacteriana, las células epiteliales Chang se preincubaron con AcP anti-fibronectina humana, o las proteínas recombinantes UspA1299-452 y UspA2165-318. A continuación, se añadió M. catarrhalis RH4 y se analizó la adhesión bacteriana. La adherencia relativa (medida por el número de unidades formadoras de colonias) después de la preincubación con 0,4 µmoles por 200 µl de UspA1299-452, UspA2165-318 o un AcP anti-fibronectina humana era de 36%, 35% y 32%, respectivamente. Mayores concentraciones de péptidos recombinantes no dieron como resultado una inhibición adicional. Por el contrario, los fragmentos UspA1433-580 y UspA230-177 que no se unían a fibronectina no inhibían las interacciones entre M. catarrhalis y las células epiteliales Chang (Figura 8B). Por lo tanto, la fibronectina en las células epiteliales Chang puede actuar como un receptor para M. catarrhalis y los residuos de aminoácidos 299-452 de UspA1 y 165-318 de UspA2 contienen el ligando responsable de las interacciones.
Interacción entre M. catarrhalis y laminina, M. catarrhalis se une a laminina a través de UspA1 y A2
Se analizaron dos cepas aisladas clínicas de M. catarrhalis (BBH18 y RH4) y sus mutantes específicos que carecían de UspA1, UspA2 o de ambas proteínas, mediante un ELISA de células completas. M. catarrhalis RH4 se unía fuertemente a laminina inmovilizada (figura 9A). Por el contrario, el mutante uspA1 de M. catarrhalis RH4 (RH4ΔuspA1) mostraba una unión a laminina que era el 89,9% de la de tipo silvestre. El mutante uspA2 de M. catarrhalis RH4 (RH4ΔuspA2) y el mutante doble RH4ΔuspA1/A2 mostraban el 15,2% y el 18,1% de la capacidad de unión del tipo silvestre, respectivamente. Esto no era significativamente diferente de la adhesión residual a placas recubiertas con BSA. Se obtuvieron resultados similares con mutantes UspA1/A2 procedentes de la cepa clínica M. catarrhalis BBH18. En estas dos cepas (BBH18 y RH4), UspA2 es la proteína expresada de forma predominante en comparación con UspA1, lo que explica la diferencia mínima en la unión entre el tipo silvestre y RH4ΔuspA1. En conjunto, estos resultados muestran que UspA1 y A2 se unen a laminina.
Con el fin de analizar adicionalmente la unión entre UspA1/A2 y laminina, UspA150-770 y UspA230-539 truncadas se produjeron en E. coli. Las placas de microtitulación se recubrieron con las proteínas recombinantes y se incubaron con concentraciones crecientes de laminina. La laminina unida se detectó con AcP de conejo anti-laminina seguido de incubación con un AcP anti-conejo conjugado con HRP. Tanto UspA150-770 como UspA230-539 recombinantes se unían fuertemente a la laminina soluble y la unión era dependiente de la dosis y saturable (figura 9B).
Para definir los dominios de unión a laminina, se prepararon UspA1 y A2 recombinantes que abarcaban las molécu
las completas. La laminina se incubó con fragmentos de UspA1 y A2 truncadas inmovilizadas y a continuación se realizó una cuantificación mediante ELISA. UspA150-491 se unía a laminina casi tan eficazmente como UspA150-770 lo que sugiere que el dominio de unión estaba dentro de esta parte de la proteína. Sin embargo, entre los otros fragmentos truncados que abarcaban esta región, ningún otro fragmento parecía unirse a laminina. La parte N-terminal, UspA230-351, era capaz de conservar 44,7% de la capacidad de unión, en comparación con la proteína de longitud completa. La proteína más corta UspA230-177 mostraba una capacidad de unión del 43,7% (figura 10B). Estos resultados muestran que los dominios de unión incluyen residuos que se encuentran dentro de los extremos N-terminales tanto de UspA1 como de UspA2.
Interacción entre M. catarrhalis y C3 y C3met, las proteínas de membrana externa UspA1 y UspA2 de M. catarrhalis inhiben tanto la vía clásica como la vía alternativa de la cascada del complemento
La expresión en superficie de UspA2 es crucial para la supervivencia de M. catarrhalis en suero humano normal (SHN) [1, 58], es decir, los mutantes de Moraxella que carecen de UspA2 mueren rápidamente cuando se exponen a SHN. Hemos observado recientemente que tanto UspA1 como A2 se unen a C4BP y por lo tanto pueden inhibir la vía clásica de activación del complemento [58]. Para aclarar más las interacciones de M. catarrhalis con el sistema del complemento, se estudió la supervivencia de mutantes dobles UspA1/A2 en suero tratado con EGTA con adición de MgCl2 (Mg-EGTA) o EDTA. Mg-EGTA inhibe las vías clásica y de lectina y por lo tanto permite el análisis por separado de la vía alternativa. En contraste, EDTA inhibe todas las vías del complemento mediante la absorción de cationes divalentes (Mg2+ y Ca2+). M. catarrhalis RH4 de tipo silvestre sobrevivía después de 30 minutos de incubación, mientras que el mutante doble RH4ΔuspA1/A2 era destruido por SHN intacto después de 10 min (Fig. 12). Cuando se inhibía la vía clásica (SHN + Mg-EGTA), el mutante RH4ΔuspA1/A2 sobrevivió durante un período de tiempo significativamente más largo, en comparación con SHN sin ningún quelante, pero no tanto tiempo como la bacteria de tipo silvestre. Además, cuando las vías tanto clásica como alternativa se bloqueaban con EDTA, M. catarrhalis RH4ΔuspA1/A2 sobrevivía. Un patrón similar se obtuvo con la cepa aislada M. catarrhalis BBH18 y los mutantes correspondientes ΔuspA1/A2 de BBH18 (no se muestra). De forma paralela, experimentos con suero que carecía de Clq y factor D/properdina mostraron que tanto la vía clásica como la alternativa estaban inhibidas por M. catarrhalis (no se muestra). Por lo tanto, M. catarrhalis, un agente patógeno que coloniza con frecuencia el tracto respiratorio humano, no solo contrarresta la vía clásica, sino también la vía alternativa del sistema del complemento a través de las proteínas de la membrana externa UspA1 y A2.
M. catarrhalis absorbe C3 a partir de suero inactivado con EDTA
C3b se une covalentemente a la superficie de un microbio y por lo tanto induce la vía alternativa (Fig. 11B). Para analizar si M. catarrhalis puede interaccionar con C3, nuestra cepa RH4 de tipo silvestre se incubó con SHN o SHN tratado con EDTA. La unión o el depósito (a través de un enlace covalente) de C3/C3b en la superficie bacteriana de
M. catarrhalis RH4 se detectó mediante análisis por citometría de flujo con un anticuerpo policlonal (AcP) dirigido contra C3d que reconocía tanto C3 como C3b. La incubación de las bacterias con SHN que contenía complemento intacto condujo al depósito de C3 (Fig. 13). Curiosamente, cuando la cascada del complemento se inactivaba en presencia de EDTA, M. catarrhalis RH4 seguía uniéndose a C3 (Fig. 13A). Streptococcus pneumoniae que se incluyó a modo de comparación, no absorbía C3 a partir del suero tratado con EDTA (Fig. 13B). En contraste con los neumococos, M. catarrhalis se unía de este modo a C3, independientemente de la activación del complemento. El tioéster interno de C3 se hidroliza espontáneamente en fase fluida a C3(H2O). Por lo tanto, C3 intacto o C3(H2O) eran las formas más probables de C3 que interaccionaban con M. catarrhalis. Ya que M. catarrhalis también se une a C4BP [58], hemos querido excluir que C4BP participara en la unión a C3 y para ello hemos utilizado suero agotado para C4BP. M. catarrhalis absorbía C3 a partir del suero agotado para C4BP en la misma medida que a partir de SHN (no se muestra).
La unión de C3met a M. catarrhalis es dependiente de la dosis y no covalente
Nuestros experimentos implicaban que C3 se unía a la superficie de M. catarrhalis con independencia de la activación del complemento. Por lo tanto, analizamos si C3 convertido, que no es funcional, podía unirse a las bacterias. C3 natural se purificó a partir de suero humano y se trató con metilamina, que convierte C3 en una molécula C3met equivalente a C3b pero sin la capacidad de unirse covalentemente a los microbios (Fig. 11C). Análisis por citometría de flujo mostraron que la cepa de tipo silvestre de M. catarrhalis RH4 se unía con eficacia a C3met en una manera dependiente de la dosis y saturable (Fig. 14A y B). Esta interacción no estaba mediada por la parte C3a de la molécula de C3 ya que C3b y C3(H2O) también se unían a M. catarrhalis (no se muestra). La unión entre M. catarrhalis RH4 y C3met se basaba en gran medida en interacciones iónicas ya que concentraciones crecientes de NaCl inhibían la interacción (Fig. 14C). Se obtuvieron resultados similares con la cepa de tipo silvestre de M. catarrhalis BBH18 (no se muestra).
Para determinar si la unión de C3 es una característica general de todas las cepas de M. catarrhalis, se seleccionó una serie aleatoria de cepas clínicas aisladas (n = 13) y se analizó su capacidad para unirse a C3met. Todas las cepas de M. catarrhalis se unían a C3met como se mostró en un análisis por citometría de flujo con un AcP antiC3d. Los valores de imf variaban de 4 a 39. Sin embargo, S. pneumoniae y E. coli que se incluyeron a modo de comparación, no se unieron a C3met.
M. catarrhalis es una bacteria particular que se une a C3 y C3met
Para ampliar nuestro análisis de la absorción bacteriana de C3 a partir de SHN, se incubaron subespecies relacionadas con Moraxella (n = 13), así como agentes patógenos humanos comunes (n = 13) en presencia de SHN-EDTA. Curiosamente, entre todas las especies bacterianas sometidas a ensayo, M. catarrhalis era la única bacteria que se unía a C3 en suero con el complemento inactivado (Tabla 9). También se analizaron todas las cepas de Moraxella relacionadas, así como los demás agentes patógenos humanos para estudiar la unión de C3met. De forma paralela a la unión de C3, M. catarrhalis era la única especie que se unía a C3met. Resumiendo, M. catarrhalis tiene una característica particular para unirse fuertemente a C3 y C3met de una manera no covalente.
M. catarrhalis se une a C3met a través de las proteínas UspA1 y UspA2 de la membrana externa
Para determinar la proteína de M. catarrhalis responsable de la unión a C3, se sometió a ensayo una serie de mutantes bacterianos carentes de las proteínas de la membrana externa MID, UspA1 y/o UspA2 [22, 58]. Curiosamente, la unión de C3met se correlacionaba significativamente con la expresión de Usp (Fig. 15). M. catarrhalis RH4Δmid se unía a C3met con la misma intensidad que el homólogo de tipo silvestre (Fig. 15A-B). El mutante RH4ΔuspA1 solo mostraba una ligera disminución de la unión, mientras que RH4ΔuspA2 era un aglutinante más débil en comparación con el homólogo de tipo silvestre (Fig. 15C-D). De forma paralela, la unión de C3met al mutante doble RH4ΔuspA1/A2 estaba completamente erradicada (Fig. 15E). Además, cuando se realizaron los mismos experimentos utilizando SHN-EDTA, se observó el mismo patrón (Fig. 15F-J). Cuando se utilizó suero humano normal, todos los mutantes mostraron una cantidad similar de C3 en su superficie, ya que era una mezcla de un depósito covalente y la unión de C3 (Fig. 15K-O). Se obtuvieron resultados similares con la cepa aislada de M. catarrhalis BBH18 y los mutantes de BBH18 correspondientes.
Con el fin de analizar adicionalmente la interacción entre C3 y UspA1/A2, se produjeron UspA150-770 y UspA230-539 en
E. coli y se purificaron. Las proteínas recombinantes se sometieron a transferencia de puntos sobre una membrana de nitrocelulosa seguida de incubación con C3met marcado con yodo. MID962-1200 recombinante que se obtiene a partir de la proteína de la membrana externa MID de M. catarrhalis [59], se incluyó como control negativo. Se detectó una unión débil a UspA150-770, mientras que [125I]-C3met se unía fuertemente a UspA230-539 (Fig. 16A). Estos hallazgos se reforzaron aún más empleando resonancia de plasmones superficiales (es decir, Biacore). UspA150-770 y UspA230-539 se inmovilizaron sobre la superficie de un chip CM5 usando un acoplamiento amino y C3met se inyectó hasta que se alcanzó la saturación. La KD para la interacción entre C3met y UspA230-539 o UspA150-770 era 3 y 14 µM, respectivamente. En conclusión, se encontró que UspA2 era la principal proteína que se unía a C3met de M. catarrhalis, mientras que UspA1 contribuía a la unión en menor medida.
Un dominio de unión a C3 se encuentra localizado entre los residuos de aminoácidos 200 y 458 de UspA2.
Para definir el dominio que se unía a C3 de UspA2, se prepararon proteínas recombinantes que abarcaban la molécula completa de UspA230-539. C3met se incubó con UspA150-770, UspA230-539 de longitud completa inmovilizadas y una serie de proteínas UspA2 truncadas. A continuación, las interacciones se cuantificaron con ELISA. De acuerdo con los experimentos de transferencia de puntos (Fig. 16A), UspA150-770 se unía a C3met en el ELISA en una medida mucho menor que en comparación con UspA230-539 (Fig. 16B). Entre los fragmentos de proteínas truncadas, UspA2165-318, UspA2200-539 y UspA2302-458 se unían eficazmente a C3met, lo que sugiere que había un dominio de unión dentro de los residuos de aminoácidos 200 y 458.
UspA1/A2 recombinante neutraliza la actividad de C3
Con el fin de examinar con detalle el papel de la inhibición dependiente de UspA1/A2 de la vía alternativa, se realizó una serie de experimentos de citometría de flujo con bacterias incubadas con 10% de SHN o suero que se había preincubado con UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes 100 nM. Curiosamente, se observó una disminución significativa del depósito/unión de C3 en la superficie de M. catarrhalis RH4ΔuspA1/A2 cuando SHN se trataba previamente con UspA150-770 y UspA230-539 (Fig. 17A). Cuando la vía clásica se detenía con Mg-EGTA, se obtuvieron resultados similares (Fig. 17B). Por lo tanto, las proteínas recombinantes UspA150-770 y UspA230-539 absorbían C3 a partir de SHN e inhibían el depósito/unión de C3.
Para determinar si la absorción de C3 a través de UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes aumentaba la supervivencia bacteriana, el mutante doble M. catarrhalis RH4ΔuspA1/A2 se incubó con suero complementado con UspA110-770 y UspA230-539 seguido de la determinación del número de bacterias supervivientes. Mg-EGTA se incluyó en las reacciones con el fin de inhibir la vía clásica. Curiosamente, la adición de UspA150-770 y UspA230-539 recombinantes a SHN impidió la destrucción de M. catarrhalis carente de UspA1/A2 (Fig. 17C). UspA230-539 era más eficaz en la inhibición de la destrucción bacteriana, en comparación con UspA150-770. Cuando ambas proteínas recombinantes se complementaban entre sí, no se detectó una inhibición adicional de la vía alternativa. Diez % de SHN se corresponden a aproximadamente C3 600 nM. Para investigar si más moléculas UspA1 podrían neutralizar la actividad de C3, se añadió UspA150-770 y/o UspA230-539 hasta 600 nM. Sin embargo, concentraciones más elevadas de las proteínas recombinantes no aumentaron más la inhibición (no se muestra).
También se incluyó un ensayo hemolítico de la vía alternativa que consistía en eritrocitos de conejo y SHN, con el fin
de establecer el papel de UspA1 y A2 como inhibidores de la vía alternativa. SHN se preincubó con UspA150-770, UspA230-539 recombinantes o ambas proteínas juntas, seguido de la adición a los eritrocitos. Después de 1 h de incubación, se determinó la cantidad de lisis de eritrocitos. Curiosamente, se observó una disminución significativa de la hemólisis cuando SHN se preincubaba con UspA150-770 o UspA230-539, en comparación con SHN sin tratar (Fig. 18). De forma paralela al aumento de la supervivencia de las bacterias en presencia de UspA230-539 o UspA150-770 (Fig. 17C), la preincubación solo con UspA230-539 dio como resultado una inhibición más eficaz de la vía alternativa que en comparación con cuando SHN se preincubaba con UspA150-7770. En conclusión, UspA150-770 o UspA230-539 recombinantes interferían con la actividad de la vía alternativa debido a su capacidad para capturar C3.
Además de ser una molécula clave en la cascada del complemento, C3b depositado e iC3b (C3b inactivado) se dirigían a microbios diana para eliminarlos en el proceso de opsonofagocitosis. Para investigar si C3 o C3met que estaba unido de forma no covalente a la superficie de M. catarrhalis, todavía podría actuar como una opsonina, se realizó una serie de experimentos de fagocitosis. M. catarrhalis se preincubó con C3met, SHN o SHN tratado con EDTA seguido por la adición de leucocitos polimorfonucleares. Curiosamente, M. catarrhalis no era fagocitada en presencia de C3met, mientras que SHN favorecía mucho la fagocitosis (datos no mostrados). Sin embargo, cuando SHN se trataba previamente con EDTA, M. catarrhalis no era fagocitada por los leucocitos polimorfonucleares. Por lo tanto, C3/C3met era inactivo en la superficie celular de M. catarrhalis y no actuaba como una opsonina.
Discusión
Interacción entre M. catarrhalis y fibronectina
UspA1299-452 y UspA2165-318 procedentes de la cepa clínica de M. catarrhalis Bc5 eran los fragmentos más cortos que todavía se unían a la fibronectina. Curiosamente, los fragmentos más largos que abarcaban la secuencia de aminoácido que se encuentra dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318 mostraban una unión a la fibronectina más eficaz (Figura 5A y B). Esto puede significar que estas dos regiones representan dominios de unión parciales o que el sitio de unión es altamente dependiente de una estructura molecular específica. UspA1299-452 y UspA2165-318 comparten una secuencia de 31 residuos de aminoácidos idénticos, que incluyen los 23 residuos "NNINNIYELAQQQDQHSS-DIKTL" (SEQ ID NO: 85) (secuencia NNINNIY (SEQ ID NO: 86)). Esta secuencia contiene el epítopo para el anticuerpo monoclonal (AcMo) protector 17C7 para el cual existe una reactividad universal [2, 50, 30]. En un modelo de ratón, la inmunización pasiva con AcMo 17C7 proporcionaba protección y mejoraba la eliminación pulmonar de M. catarrhalis [30]. Por tanto, es aún más interesante que los dominios de UspA1/A2 que se unen a fibronectina contienen estos residuos y se defiende la importancia de esta región en la patogénesis de la infección del tracto respiratorio con M. catarrhalis.
M. catarrhalis BBH18 y RH4 que se unen a fibronectina empleadas en nuestros experimentos también son portadoras de los 31 residuos de aminoácidos en su proteína UspA1/A2. La mayoría de las M. catarrhalis tienen una parte de esta secuencia (es decir, la secuencia NNINNIY (SEQ ID NO: 86)). Sin embargo, cepas tales como O35E que tiene la secuencia NNINNIY (SEQ ID NO: 86) en su gen uspA2, no expresan una proteína UspA2 que se une a fibronectina [49]. Una explicación probable sería que variaciones en las regiones flanqueantes podrían afectar a la interacción con fibronectina. Además, la misma secuencia NNINNIY conservada (SEQ ID NO: 86) puede tener cambios menores de una base de aminoácidos [28]. Por tanto, es probable que la unión a fibronectina dependerá no solo de la expresión de UspA1/A2, sino también de la composición individual de cada proteína UspA. Curiosamente, una secuencia de aminoácidos casi idéntica se puede encontrar en la proteína híbrida UspA2H con propiedades adhesivas (M. catarrhalis TTA37 y O46E) [43]. Esto proporciona un apoyo a nuestros hallazgos de que la secuencia de 31 aminoácidos es importante en la adhesión.
En nuestra última serie de experimentos, se ha sometido a ensayo si la adherencia de M. catarrhalis a las células conjuntivales Chang podría estar inhibida por los fragmentos que se unen a fibronectina (UspA1299-452 y UspA2165-318) (figura 8B). La preincubación con UspA1299-452, UspA2165-318 o un AcP anti-fibronectina dio como resultado una disminución de la unión a las células epiteliales Chang. Estos resultados confirman la importancia de estos dominios de unión en las interacciones de UspA1/A2 con células epiteliales Chang y además sugieren que la fibronectina es un receptor importante para UspA. Además, se sabe que FnBP facilita la adherencia de bacterias a las vías respiratorias indiferenciadas y lesionadas [54, 69]. La expresión de fibronectina en fibroblastos de pulmón también se incrementa por el extracto del humo de cigarrillos [87]. Por tanto, el papel de UspA1/A2 de M. catarrhalis en la unión a fibronectina MEC o a fibronectina asociada a las células epiteliales es de gran importancia en los pacientes con EPOC y puede explicar la aparición común de una infección con M. catarrhalis en este grupo de pacientes [40].
En conclusión, hemos mostrado que UspA1/A2 de M. catarrhalis BBH18, RH4 y Bc5 son FnBP cruciales. Tanto UspA1 como A2 recombinantes obtenidas a partir de Bc5, se unen a la fibronectina con un dominio de unión que comparte residuos de aminoácidos idénticos que incluyen la secuencia conservada NNINNIY (SEQ ID NO: 86). Además, una interacción de UspA1/A2 de M. catarrhalis con células epiteliales es a través de fibronectina asociada a las células. La definición de estos dominios de unión a fibronectina es por ello una etapa importante que fomenta el desarrollo de una vacuna contra M. catarrhalis.
Interacción entre M. catarrhalis y laminina
M. catarrhalis es una causa común de agravamiento infeccioso en pacientes con EPOC. El desarrollo de esta especie en pacientes con EPOC está relacionado probablemente en parte con su gran repertorio de adhesinas. Además, hay cambios patológicos tales como la pérdida de la integridad epitelial con exposición de la membrana basal, en donde la misma capa de laminina está engrosada en los fumadores [4]. Algunos agentes patógenos han mostrado ser capaces de unirse a la laminina y por lo tanto pueden contribuir a su capacidad para adherirse a este tipo de superficies mucosas dañadas y desnudas. Estos incluyen agentes patógenos conocidos por causar una enfermedad importante en las vías respiratorias, tales como S. aureus y P. aeruginosa, entre otros [7, 63].
Se ha mostrado recientemente que tanto UspA1 como A2 se unen a la fibronectina [78]. Los dominios de unión a fibronectina se encuentran dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318. En este estudio, las mitades N-terminales de UspA150-491 y UspA230-351 (que contienen los dominios de fibronectina) también se unen a laminina. Sin embargo, los fragmentos más pequeños que se unían a la fibronectina, UspA1299-452 y UspA2165-318, no se unían a la laminina en ninguna medida apreciable. De hecho, fragmentos más pequeños que la mitad N-terminal de UspA1 (UspA150-491) pierden toda su capacidad de unión a la laminina, mientras que con UspA2, solo UspA230-170 se une a la laminina aunque a un nivel inferior que la proteína recombinante completa (UspA230-539). Estos hallazgos sugieren que quizá diferentes partes de las moléculas pueden tener diferentes papeles funcionales.
Comparando las regiones más pequeñas que se unen a laminina de UspA1 y A2, encontramos que, sin embargo, existe poca similitud, mediante homología de aminoácidos, entre UspA230-170 y UspA150-491 (datos no mostrados). Esto no es sorprendente, ya que es un hecho conocido que ambas proteínas tienen una estructura de cabeza globular en forma de “piruleta”, a pesar de tener solo una identidad del 22% en ambas mitades N-terminales [2, 32]. Postulamos que probablemente una estructura terciaria es responsable de las interacciones con laminina en la región de cabeza in vivo. La localización de los dominios de unión en el extremo N-terminal sería lógica ya que estarían más expuestos y en contacto con la membrana basal humana in vivo.
Los factores bacterianos que median en la adhesión al tejido y a componentes de la matriz extracelular (MEC) se agrupan en una sola familia llamada "componentes de la superficie de microbios que reconocen moléculas de la matriz adhesiva" (MSCRAMMs). Puesto que UspA1/A2 se unen tanto a la fibronectina como a la laminina, estas proteínas se pueden denominar MSCRAMMs. Nuestros resultados sugieren que UspA1 y A2 son adhesinas multifuncionales con diferentes dominios que interaccionan con diferentes ligandos en el tracto respiratorio. Se han descrito perfiles de unión similares de amplio espectro para otras proteínas bacterianas como YadA de Yersinia enterocolitica, para las que UspA1 y A2 tienen una relación estructural [45, 70]. YadA también se une a la fibronectina y la laminina [32].
Resumiendo, hemos mostrado que UspA1/A2 son cruciales para la interacción de M. catarrhalis con la glicoproteína laminina de la membrana basal y esto tendrá un papel importante en la patogénesis de infecciones en pacientes con EPOC [74].
Interacción entre M. catarrhalis y C3 y C3met
La resistencia al complemento es uno de los factores más importantes de la virulencia bacteriana [66]. La mayoría (89%) de las cepas aisladas de M. catarrhalis a partir de pacientes con infecciones de las vías respiratorias inferiores, son resistentes a la destrucción mediada por el complemento [34]. UspA1 y A2 de M. catarrhalis son cruciales para la supervivencia bacteriana en suero humano in vivo [1, 15], y hemos mostrado que estas dos proteínas de la membrana externa se unen al regulador en fase soluble del complemento de la vía clásica, C4BP [58]. En el presente estudio, hemos mostrado que M. catarrhalis puede inhibir la vía alternativa mediante la unión no covalente de C3 (Figs. 17 y 18). La unión de C3 lo más probable es que también inhiba la vía clásica. Esto, sin embargo, no se pudo analizar en detalle ya M. catarrhalis también se une C4BP. Curiosamente, la unión a C3 dependiente de M. catarrhalis es particular ya que varias subespecies de Moraxella relacionadas, así como bacterias patógenas humanas comunes no se unen a C3 (Tabla 9). Las interacciones con C3 y C3 tratado con metilamina están mediadas principalmente por UspA2, mientras que UspA1 tiene un papel menor (Figs. 15 y 16). La región que se une a C3 de UspA2 se ha localizado entre los residuos de aminoácidos 200 a 458. Esta región contiene un tramo de 140 residuos de aminoácidos que es idéntico en un 93% a una región en UspA1 [2]. Sin embargo, a pesar de esta similitud de la secuencia, UspA1 se une a C3 en un grado mucho menor. Esto podría ser debido a una diferencia específica en la conformación entre las proteínas. La discrepancia en la unión a C3 entre UspA1 y UspA2 contrasta con la interacción de UspA1/A2 con C4BP [58].
M. catarrhalis es igualmente resistente tanto a la vía clásica como a la alternativa (Fig. 12B). La bacteria se une a C4BP que inhibe la vía clásica [58] y en este trabajo se muestra una interacción con la vía alternativa a través de la unión de C3. Determinar cuál de estos mecanismos tiene mayor importancia para la resistencia sérica a M. catarrhalis en varias situaciones in vivo es difícil. Por ejemplo, la importancia de la vía clásica dependerá en gran medida del historial de infecciones con M. catarrhalis y de la capacidad para generar anticuerpos activadores del complemento. Sin embargo, cada mecanismo que proporciona protección contra el complemento es sin duda beneficioso para un agente patógeno. Puesto que C3 es una molécula clave en el sistema del complemento, la unión de C3 da probablemente como resultado una regulación de las tres vías de activación y puede contribuir de forma máxima a la resistencia sérica.
La importancia del sistema del complemento como mecanismo primario de defensa se refleja en el hecho de que los microbios han desarrollado diversas estrategias para interferir con y/o neutralizar los componentes del sistema del complemento [42, 35, 88]. Además de M. catarrhalis, S. pyogenes, Bordetella pertussis, E. coli Kl, Candida albicans y N. gonorrhoeae expresan moléculas específicas de superficie que se unen a C4BP y, como consecuencia, protegen a las bacterias de la vía clásica del complemento [8, 9, 52, 58, 64, 65, 80]. Además de la inhibición de la vía clásica, diversas bacterias (por ejemplo, C. albicans, N. meningitidis, S. pyogenes y S. pneumonia: para una revisión véase [68, 89], se unen al factor H y a una molécula similar al factor H y, por tanto, están parcialmente protegidas frente a la vía alternativa del complemento.
UspA1 y A2 absorben C3 a partir del suero y, lo más probable, de este modo inhiben la activación del complemento. Del mismo modo, la Proteína A de la superficie neumocócica (PspA) parece inhibir la vía alternativa tanto in vitro como in vivo. PspA es un factor de virulencia importante para S. pneumoniae. Cepas de neumococos que carecen de PspA son eliminadas fácilmente de la sangre, mientras que las cepas que expresan PspA sobreviven [82]. Además, en un modelo murino de bacteremia, neumococos carentes de PspA tienen una virulencia reducida significativamente en comparación con neumococos que expresan PspA [11]. Se ha demostrado que se deposita más C3b sobre neumococos negativos para PspA que en positivos para PspA [67, 82]. Por lo tanto, la expresión de PspA reduce el aclaramiento mediado por el complemento y la fagocitosis de S. pneumoniae mediante la limitación de la opsonización a través de C3b [12, 67]. Neumococos que carecen de PspA que no son virulentos en ratones normales se vuelven virulentos en ratones que carecen de C3 y del factor B [82].
Según nuestra información, solo hay dos ejemplos de proteínas bacterianas que se unen de forma no covalente a C3 y, por lo tanto, interfieren con la función del complemento. La primera de ellas es la proteína extracelular que se une al fibrinógeno (Efb) de Staphylococcus aureus, que se encontró que se une a C3b [44]. Efb inhibe tanto la vía clásica como la alternativa independientemente de la conformación tioéster, es decir, la unión a C3b es no covalente. El segundo ejemplo es la proteína neumocócica que se une a colina (CbpA), que se ha observado que se une a C3 tratado con metilamina, lo que sugiere una interacción no covalente que no es dependiente de la activación del complemento [16]. CbpA es un componente de la pared de la célula neumocócica, pero solo se puede unir a C3 cuando se secreta CbpA. Con el fin de analizar esta hipótesis, que no está firmemente establecida en la bibliografía, se analizaron once cepas aisladas diferentes de neumococos para estudiar la unión a C3 (C3 tratado con metilamina
o SHN-EDTA) por citometría de flujo (Fig. 12B y Tabla 9). No se pudo detectar C3 unido en la superficie de S. pneumoniae. Cuando se analizaron lisados de S. pneumoniae y material sobrenadante de cultivos en transferencias Western usando C3 tratado con metilamina seguido de un AcP anti-C3 humano, se confirmaron los resultados de Cheng y colaboradores [16] (no se muestra). Teniendo en cuenta Efb y CbpA, que son ambas proteínas que se unen a C3 secretadas por dos bacterias Gram-positivas, M. catarrhalis Gram-negativa es una especie particular con proteínas ancladas a la membrana que se unen a C3 e inhiben la vía alternativa en la superficie de la bacteria.
Se ha mostrado que la levadura Candida albicans se une a C3b, iC3b y C3d. Sin embargo, C3b se une con una afinidad considerablemente menor que iC3b y C3d [29]. Se ha encontrado una gran diferencia entre la unión a C3 de
M. catarrhalis y C. albicans (no se muestra); a pesar de que la cándida se une a C3met (56% de células positivas), la intensidad media de fluorescencia (imf) era solo <2,0 en comparación con una imf de 36,9 para M. catarrhalis. Además, no se observó una unión detectable cuando C. albicans se incubaba con suero tratado con EDTA. Dos proteínas que se unen a C3d se han aislado a partir de C. albicans y la proteína más caracterizada es una manoproteína de 60 kDa que era reconocida inicialmente por un anticuerpo dirigido contra el receptor 2 del complemento humano (CD21) [13]. Sin embargo, UspA1 y A2 de M. catarrhalis no fueron reconocidas por un anticuerpo policlonal dirigido contra CD21 (no se muestra). De forma paralela con estafilococos y neumococos [52, 64], una proteína que se une a C3d secretada procedente de C. albicans también existe [72]. Finalmente, se ha aislado un receptor de iC3b en C. albicans y es estructuralmente similar al CR3 humano (CD11b) [3]. Los mecanismos por los que estos receptores pueden participar en la patogénesis no se conocen completamente.
Los ejemplos anteriores de agentes patógenos que se unen a C3 son notablemente diferentes de M. catarrhalis porque estas especies son frecuentemente cepas aisladas del torrente sanguíneo. M. catarrhalis es un agente patógeno de la mucosa con raros casos de infecciones con bacteremia. Por lo tanto, la unión y la inactivación de C3 es más probable que ocurra en la superficie de la mucosa. Esto se apoya en el hecho de que existe una fuerte activación del complemento en curso y una inflamación consiguiente en estados de enfermedades tales como otitis media aguda [57]. Las proteínas del complemento se cree que son transportadas a la superficie de la mucosa debido a una exudación del plasma [26, 62]. En efusiones del oído medio (MEEs), por ejemplo, de niños, también se pueden encontrar concentraciones muy elevadas de productos de C3 [51]. Además, factores del complemento en el líquido MEEs han mostrado ser importantes en la actividad bactericida contra otros agentes de la mucosa tales como H. influenzae no tipificable [75]. M. catarrhalis es un agente patógeno estrictamente humano. No causa enfermedades como otitis media o neumonía en animales. Un modelo de aclaramiento pulmonar en ratón y un modelo de otitis media con chinchilla se han utilizado en varias ocasiones. Sin embargo, no se desarrolla otitis media ni neumonía y las bacterias se eliminan rápidamente [19, 83]. Por tanto, es difícil someter a ensayo la importancia biológica de la unión a C3 de bacterias in vivo. Ya que UspA1 y A2 son proteínas multifuncionales [1, 15, 31, 43, 58, 78], sería imposible relacionar cualquier diferencia en el aclaramiento de M. catarrhalis con la unión a C3. En particular, el hecho de que UspA1 sea una adhesina importante de M. catarrhalis y se una tanto a CEACAM1 como a fibronectina [31, 78] lo más probable es que afecte al aclaramiento. Sin embargo, debido a la fuerte activación del complemento en estados de
enfermedad tales como otitis media, la unión de C3 dependiente de Moraxella puede representar una vía importante para defender la mucosa.
El hecho de que M. catarrhalis obstaculice el sistema inmune humano de varias maneras, podría explicar por qué M. catarrhalis es un habitante común de tales vías respiratorias [73]. En conclusión, M. catarrhalis ha desarrollado unas vías sofisticadas para combatir tanto el sistema inmune humoral como innato. Los datos actuales muestran que M. catarrhalis tiene una capacidad particular para unirse a C3 en la superficie celular bacteriana que no se puede encontrar en otras especies bacterianas.
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<400> 1
<210> 2
- <
- 211> 154
- <
- 212> PRT
- <
- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis ((UspA1 299-452) o péptido sintético
<400> 2
<210> 3
- <
- 211> 154
- <
- 212> PRT
- <
- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA2 165-318) o péptido sintético
<400> 3
<212> PRT
< 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA1 50-770) o péptido sintético
<400> 4
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- <
- 211> 443
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- 212> PRT
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- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA1 50-491) o péptido sintético
<400> 5
<210> 6
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- 211> 510
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- <
- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA2 30-539) o péptido sintético
<400> 6
<213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA2 30-351) o péptido sintético
<400> 7
<210> 8
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- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA2 30-177) o péptido sintético
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- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA2 200-539) o péptido sintético
<400> 9
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- <
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- <
- 213> fragmento de proteína de Moraxella catarrhalis (UspA2 302-458) o péptido sintético
<400> 10
Claims (6)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Péptido que consiste en el ID de Secuencia nº 2.
-
- 2.
- Péptido que consiste en el ID de Secuencia nº 3.
5 3. Un ligando que comprende un dominio de unión a fibronectina, consistiendo dicho ligando en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en ID de Secuencia nº 2 o ID de Secuencia nº 3. -
- 4.
- Una proteína de fusión que comprende uno o varios ligandos según la reivindicación 3.
-
- 5.
- Un medicamento que comprende uno o varios ligandos o proteínas de fusión según la reivindicación 3 o 4 y
uno o varios adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, soportes o conservantes farmacéuticamente acepta10 bles. - 6. Una vacuna que comprende uno o varios ligandos o proteínas de fusión según la reivindicación 3 o 4 y unoo varios adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, soportes o conservantes farmacéuticamente aceptables.
- 7. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, un ligando o una proteína de fusión según unacualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, así como polimorfismos y variantes por corte y empalme de los mismos que 15 tienen actividad de unión a fibronectina.
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