CN101243104B

CN101243104B - 卡他莫拉氏菌与上皮细胞、细胞外基质蛋白及补体系统的相互作用

Info

Publication number: CN101243104B
Application number: CN2006800294704A
Authority: CN
Inventors: 阿恩·福斯格伦; 克里斯蒂安·里斯贝克
Original assignee: Arne Forsgren AB
Current assignee: Arne Forsgren AB
Priority date: 2005-08-10
Filing date: 2006-08-08
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2026-08-08
Also published as: CN101243104A; ZA200800891B; UA95456C2

Abstract

本发明涉及卡他莫拉氏茵的细胞外基质蛋白质及它们通过细胞结合性纤连蛋白和层粘连蛋白与上皮细胞相互作用的能力，并且还涉及它们抑制补体系统的能力。这些细胞外蛋白用于制备疫苗。本发明提供与纤连蛋白、层粘连蛋白和补体系统相互作用的肽。

Description

卡他莫拉氏菌与上皮细胞、细胞外基质蛋白及补体系统的相互作用

发明技术领域

本发明涉及卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)及它们通过细胞外基质蛋白如纤连蛋白和层粘连蛋白与上皮细胞相互作用的能力，并且还涉及它们抑制补体系统的能力。与这些细胞外蛋白质的相互作用在疫苗的制备中是有用的。

背景技术

结合上皮细胞的能力对数个细菌物种是极其重要的。例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)具备含有相关性序列组织结构的纤连蛋白结合蛋白(FnBP)。这些FnBP称作微生物表面成分识别黏附基质分子(MSCRAMM)。这些FnBP在它们与纤连蛋白结合时利用纤连蛋白的模块结构形成扩展的串联β-拉链[27，39，47，73]。起到介导细菌黏附并侵入宿主细胞的作用。

重要的粘膜性病原体卡他莫拉氏菌是儿童急性中耳炎的第三号主要细菌性病因，位居肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae)之后[14，40，55]。卡他莫拉氏菌也是健康儿童咽部最常见的栖居者之一。

此外、卡他莫拉氏菌还是患有慢性阻塞性肺病(COPD)的成人中鼻窦炎和下呼吸道感染的常见病因[74]。该物种在COPD患者内的成功感染可能部分地与其繁多的全套黏附素有关。

近年来的研究重心落在外膜蛋白及其与与人宿主的相互作用上[6，48，56]。这些外膜蛋白中的某些似乎具有黏附功能，它们当中包括卡他莫拉氏菌IgD结合蛋白(MID，又名Hag)、蛋白质CD、卡他莫拉氏菌黏附蛋白(McaP)和遍在表面蛋白(Usp)[1，22，33，48，61，81，84]。

发明简述

鉴于如此事实，即已经发现卡他莫拉氏菌是上气道或下气道内感染的如此主要的病因，因此目前需要开发可以用于抗卡他莫拉氏菌的疫苗。

本发明的目标因此就是找到卡他莫拉氏菌与身体内上皮细胞以何种方式相互作用并影响免疫系统。以这种方法，可以开发可能作为抗卡他莫拉氏菌疫苗起作用的物质。

在本研究中，使用从临床分离株中衍生的卡他莫拉氏菌突变体，本发明人已经证实UspA1和A2均结合纤连蛋白及层粘连蛋白。此外，本发明人已经证实卡他莫拉氏菌干扰补体系统的经典途径，并且还阐明了它们以何种方式进行干扰。

众多细菌通过纤连蛋白结合性MSCRAMMS与上皮细胞黏附[54，77]。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有与鼻上皮细胞上细胞结合性纤连蛋白相结合的FnBP[69]。阻断细菌-纤连蛋白蛋白质的相互作用可以帮助宿主组织克服感染。事实上，已经证实抗金黄色葡萄球菌FnBP的抗体引起迅速清除感染小鼠内的细菌[71]。

已经根据本发明对重组截短的UspA1/A2蛋白连同覆盖整个分子的较小片段测试了纤连蛋白结合作用。UspA1和A2均结合纤连蛋白并且发现纤连蛋白结合结构域位于UspA^1299-452内及UspA2^165-318内。这两种截短的蛋白质均以如抗纤连蛋白抗体的相似程度抑制卡他莫拉氏菌对Chang结膜上皮细胞的结合。进行的观察证实卡他莫拉氏菌UspA1和A2均经细胞结合性纤连蛋白参与对上皮细胞的黏附。因此建议UspA1^299-452和UspA2^165-318内的生物活性位点作为待包含于抗卡他莫拉氏菌疫苗内的潜在候选物。

另外，本发明人已经研究并表征了卡他莫拉氏菌对层粘连蛋白的结合。卡他莫拉氏菌是COPD患者内感染性恶化的常见病因。该物种在COPD患者内的成功感染可能部分地与其繁多的全套黏附素有关。此外，吸烟者中存在病理性改变如上皮完整性丧失及基膜暴露，其中层粘连蛋白层本身增厚[4]。已经证实一些病原体能够结合层粘连蛋白并且因此可能对这些病原体黏附至这类受损及裸露粘膜表面的能力有贡献。这些病原体包括已知在气道内导致明显疾病的病原体，如其中有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌[7，63]。本发明人已经证实卡他莫拉氏菌遍在表面蛋白(Usp)A1和A2还与层粘连蛋白结合。其中UspA1和A2的层粘连蛋白结合结构域存在于UspA1^50-491和UspA2^30-351的氨基末端部分内。这些结构域还含有纤连蛋白结合结构域。然而，结合纤连蛋白的最小片段即UspA1^299-452和UspA2^165-318不以任何可觉察的程度结合层粘连蛋白。比UspA1氨基末端部分(UspA1^50-491)更小的片段丧失其全部的层粘连蛋白结合能力，而对于UspA2，仅UspA2^30-170结合层粘连蛋白，尽管在比完整重组蛋白(UspA2^30-539)的结合水平更低。这些发现表明分子的不同部分可能具有不同的功能角色。还发现UspA1^50-770具有层粘连蛋白结合特性。

然而比较UspA1和A2中最小的层粘连蛋白结合区域，我们发现就氨基酸同源性而言在UspA2^30-170与UspA1^50-491之间几乎没有相似性(数据未显示)。这不令人惊讶，因为已知这两种蛋白质具有′棒棒糖′形的球状头结构，尽管在两种蛋白质的氨基末端部分内仅有22％同一性[2，32]。

建议UspA1^50-770和UspA2^30-539内的生物活性位点作为待包含于抗卡他莫拉氏菌疫苗内的潜在候选物。

最后，本发明人研究了卡他莫拉氏菌遍在表面蛋白A1及A2与天然免疫系统间的相互作用，并且发现卡他莫拉氏菌干扰补体系统。补体系统是抵抗病原性微生物的首道防线之一，并且该系统的活化导致细菌表面上的蛋白质沉积级联，引起攻膜复合体形成或调理病原体，随后引起吞噬[85，86]。最重要的补体蛋白之一是C3，该补体蛋白以类似于某些免疫球蛋白的浓度(1-1.2mg/ml)循环存在。C3不仅作为调理素发挥重要作用，还是补体活化的经典途径、凝集素途径和旁路途径的共同枢纽。旁路途径对经典途径和凝集素途径起到放大回路的作用并且在补体抑制物不存在下还通过C3与微生物表面共价连接而自发地受到活化。C3沉积需要一个内部硫酯键存在，其中该内部硫酯键因C3α-链上的巯基(Cys¹⁰¹⁰)与谷氨酰基羰基(Gln¹⁰¹²)接近而在此天然蛋白质内形成[76]。从C3α-链的氨基末端中蛋白酶解性切割一个77个残基的肽则产生C3a(过敏毒素)和C3b。随后通过亚稳定性硫酯的羰基与激活物表面上蛋白质或糖结构的-NH₂或-OH基团间的共价连接实现C3b的结合[36，37]。已经发现卡他莫拉氏菌UspA1和A2均非共价地并以剂量依赖方式结合来自EDTA处理的血清内的第三成分(C3)和甲胺处理的C3(C3met)。已经发现UspA1^50-770和UspA2^30-539与C3和C3met结合。发现UspA2的C3-结合区域主要位于UspA2^200-458内。然而，已经发现UspA1在相互作用中的地位不重要。建议UspA1^50-770和UspA2^30-539内的生物活性位点作为待包含于抗卡他莫拉氏菌疫苗内的潜在候选物。

UspA家族由UspA1(分子量88kDa)、UspA2(62kDa)和杂合蛋白质UspA2H(92kDa)组成[2、43]。这些蛋白质在SDS-PAGE内作为高分子量复合物迁移，相对保守并且因此是重要的疫苗候选物。UspA1与A2的氨基酸序列具有43％同一性并且具有同一性是93％的140个氨基酸残基[2]。在来自患有中耳炎的年幼儿童内的一系列108株卡他莫拉氏菌鼻咽分离株中，分别在107株(99％)和108株(100％)分离株内检测到uspA1和uspA2基因。21％的分离株被鉴定为具有杂合的变异基因uspA2H[50]。此外，已知天然获得的抗UspA1和A2抗体具有杀菌性[15]。

已经赋予蛋白质UspA家族数种功能。UspA1表达对于卡他莫拉氏菌结合至Chang结膜上皮细胞和Hep-2喉上皮细胞是必需的[43，49]。在最近研究中，证实UspA1结合了表达于肺上皮细胞系A549内的癌胚抗原相关性细胞黏附分子(CEACAM)[31]。还已经证实纯化的UspA1在点印迹实验中结合纤连蛋白，而纯化的UspA2则不结合[49]。UspA1和A2均可能在卡他莫拉氏菌血清抗性中发挥重要作用[1，5，58，60]。

本发明表明UspA1和A2均是临床分离株卡他莫拉氏菌BBH18和RH4内卡他莫拉氏菌结合至纤连蛋白和层粘连蛋白的决定因素。有意义的是，从卡他莫拉氏菌Bc5中衍生的重组UspA1和A2均以相同程度结合纤连蛋白。在UspA1的氨基酸残基299至452和Usp A2的氨基酸残基165至318内找到了针对纤连蛋白的结合结构域。这两种结构域共有31个氨基酸残基序列同一性。重要的是，含有UspA1和UspA2内的这些残基的截短蛋白质片段能够抑制卡他莫拉氏菌与Chang上皮细胞结合，表明与这些细胞的相互作用借助细胞结合性纤连蛋白。

在以上提到的氨基酸残基内找到了针对层粘连蛋白的结合结构域。使用重组蛋白的结合鉴定法揭示主要的结合区域位于氨基末端部分，在此处两种蛋白质形成球状头。

将介导对组织和细胞外基质(ECM)成分黏附的细菌性因子共同划分成名为″微生物表面成分识别黏附基质分子″(MSCRAMMS)的单一家族，由于UspA1/A2既结合纤连蛋白，又结合层粘连蛋白，故这些蛋白质可以命名为MSCRAMMS。

根据一个方面，本发明提供具有序列号1的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物(degenerate)或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供具有序列号2的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据又一个方面，本发明提供具有序列号3的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供具有序列号4的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据又一个方面，本发明提供具有序列号5的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据又一个方面，本发明提供具有序列号6的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供具有序列号7的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供具有序列号8的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供具有序列号9的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供具有序列号10的肽，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物。

根据另一个方面，本发明提供本发明的至少一种肽用于产生用来治疗或预防感染的药物的用途，感染优选地是由卡他莫拉氏菌所致，特别是由粘膜表面上携带卡他莫拉氏菌所致的感染。

根据另一个方面，本发明还提供包含纤连蛋白结合结构域的配体，该配体由选自序列号1、序列号2和序列号3的氨基酸序列，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物组成。

本发明还提供包含层粘连蛋白结合结构域的配体，该配体由选自序列号4至序列号8的氨基酸序列，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物组成。

此外，本发明提供包含C3或C3met结合结构域的配体，该配体由选自序列号4、序列号6、序列号9和序列号10的氨基酸序列，及其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物以及其它次级加工产物组成。

另外、本发明提供包含本发明的一种或多种配体和一种或多种可药用的辅药、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或防腐剂的药物。

本发明还提供包含本发明的一种或多种配体和一种或多种可药用的辅药、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或防腐剂的疫苗。

本发明还提供治疗或预防个体中的感染、优选由卡他莫拉氏菌所致感染、特别由粘膜表面上携带卡他莫拉氏菌所致感染的方法，包括施用药用有效量的本发明药物或疫苗。

最后，本发明还提供编码本发明的配体、蛋白质或肽的核酸序列，以及其同系物、多态物(polymorphism)、简并物和剪接变体。

对本发明目标、问题、解决方案和特征的进一步公开将从如下对本发明的详细描述中，及参考附图及后续权利要求书而是显而易见的。

如本文中所用的表述“配体”将说明与受体结合的完整分子及该分子中包含受体结合结构域以至保留受体结合特性的部分。包含等效的受体结合结构域的配体也包括在本发明中。

表述“片段、同系物、功能性等效物和衍生物”涉及保留所需要的纤连蛋白、层粘连蛋白、C3或C3met结合特性的本发明肽和蛋白质片段的变体、修饰和/或部分。

将本发明UspA1的同系物定义为具有至少72％序列同一性的序列，如可从下表1中所见。

将本发明的片段定义为在氨基末端被截短或延长1、2、5、10、15、20个氨基酸和/或在羧基末端被截短或延长1、2、5、10、15、20个氨基酸的任意的同系物序列。

表述“简并物、羟化产物、磺化产物和糖基化产物或其它次级加工产物”涉及本发明如此的肽和蛋白质片段的变体和/或修饰，其中所述的肽和蛋白质片段与原始的肽或蛋白质片段相比，已经由简并作用、羟化、磺化或糖基化作用而被改变，但保留所需要的纤连蛋白、层粘连蛋白、C3或C3me结合特性。

本发明尤其涉及由卡他莫拉氏菌引起的感染。本发明肽可以用于治疗或预防中耳炎、鼻窦炎或下呼吸道感染。

表1：全长UspA1蛋白质序列的多重比对，附带同一性百分数

	O12E	O35E	O46E	P44	TTA24	TTA37	V1171
								ATCC25238	81	75	83	83	84	79	84
O12E		74	77	83	76	72	75
								O35E			72	74	83	73	78
O46E				81	81	82	80
								P44					81	75	77
TTA24						76	84
								TTA37							78

表2：UspA2 Pileup分析-所用菌株和序列

	acc	菌株	des	sl
					□TREMBL：O54407_MORCA	O54407	O35E	遍在表面蛋白A2.	576
□TREMBL：O58XP4_MORCA	Q58XP4	MC317	UspA2.	650
					□TREMBL：O848S1_MORCA	Q848S1	E22	遍在表面蛋白A2H.	877
□TREMBL：O848S2_MORCA	Q848S2	V1122	遍在表面蛋白A2.	616
					□TREMBL：O8GH86_MORCA	Q8GH86	P44	UspA2.	668
□TREMBL：O9L961_MORCA	Q9L961	TTA37	USPA2H.	889
					□TREMBL：O9L962_MORCA	Q9L962	O46E	USPA2H.	894
□TREMBL：O9L963_MORCA	Q9L963	O12E	USPA2(遍在表面蛋白A2).	684
					□TREMBL：O9XD51_MORCA	Q9XD51	V1171	UspA2.	674
□TREMBL：O9XD53_MORCA	Q9XD53	TTA24	UspA2.	613
					TREMBL：O8RTB2_MORCA	Q8RTB2	SP12-5	UspA2	686
□TREMBL：O9XD55_MORCA	Q9XD55	ATCC25238	UspA2.	630
					Forsgren_UspA2			UspA2.	630

因此，本发明提供从具有层粘连蛋白结合作用和/或纤连蛋白结合作用和/或C3结合作用的卡他莫拉氏菌外膜蛋白中分离的配体，其中该配体是如此的多肽或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化、磺化或糖基化产物或其它次级加工产物，其中所述的多肽包含或由选自衍生于以下所示的卡他莫拉氏菌BC5 UspA1及UspA2全长序列的SEQ IDNO：1-10的氨基酸序列组成。

来自卡他莫拉氏菌菌株BC5的全长UspA1：

MNKIYKVKKN AAGHLVACSE FAKGHTKKAV LGSLLIVGIL GMATTASAQK

VGKATNKISG GDNNTANGTY LTIGGGDYNK TKGRYSTIGG GLFNEATNEY

STIGSGGYNK AKGRYSTIGG GGYNEATNQY STIGGGDNNT AKGRYSTIGG

GGYNEATIEN STVGGGGYNQ AKGRNSTVAG GYNNEATGTD STIAGGRKNQ

ATGKGSFAAG IDNKANADNA VALGNKNTIE GENSVAIGSN NTVKKGQQNV

FILGSNTDTT NAQNGSVLLG HNTAGKAATI VNSAEVGGLS LTGFAGASKT

GNGTVSVGKK GKERQIVHVG AGEISDTSTD AVNGSQLHVL ATVVAQNKAD

IKDLDDEVGL LGEEINSLEG EIFNNQDAIA KNQADIKTLE SNVEEGLLDL

SGRLLDQKAD IDNNINNIYE LAQQQDQHSS DIKTLKNNVE EGLLDLSGRL

IDQKADLTKD IKALESNVEE GLLDLSGRLI DQKADIAKNQ ADIAQNQTDI

QDLAAYNELQ DAYAKQQTEA IDALNKASSA NTDRIATAEL GIAENKKDAQ

IAKAQANENK DGIAKNQADI QLHDKKITNL GILHSMVARA VGNNTQGVAT

NKADIAKNQA DIANNIKNIY ELAQQQDQHS SDIKTLAKVS AANTDRIAKN

KAEADASFET LTKNQNTLIE QGEALVEQNK AINQELEGFA AHADVQDKQI

LQNQADITTN KTAIEQNINR TVANGFEIEK NKAGIATNKQ ELILQNDRLN

RINETNNHQD QKIDQLGYAL KEQGQHFNNR ISAVERQTAG GIANAIAIAT

LPSPSRAGEH HVLFGSGYHN GQAAVSLGAA GLSDTGKSTY KIGLSWSDAG

GLSGGVGGSY RWK

来自卡他莫拉氏菌菌株BC5的全长UspA2：

MKTMKLLPLK IAVTSAMIIG LGAASTANAQ AKNDITLEDL PYLIKKIDQN

ELEADIGDIT ALEKYLALSQ YGNILALEEL NKALEELDED VGWNQNDIAN

LEDDVETLTK NQNAFAEQGE AIKEDLQGLA DFVEGQEGKI LQNETSIKKN

TQRNLVNGFE IEKNKDAIAK NNESIEDLYD FGHEVAESIG EIHAHNEAQN

ETLKGLITNS IENTNNITKN KADIQALENN VVEELFNLSG RLIDQKADID

NNINNIYELA QQQDQHSSDI KTLKKNVEEG LLELSDHIID QKTDIAQNQA

NIQDLATYNE LQDQYAQKQT EAIDALNKAS SENTQNIEDL AAYNELQDAY

AKQQTEAIDA LNKASSENTQ NIEDLAAYNE LQDAYAKQQA EAIDALNKAS

SENTQNIAKN QADIANNITN IYELAQQQDK HRSDIKTLAK TSAANTDRIA

KNKADDDASF ETLTKNQNTL IEKDKEHDKL ITANKTAIDA NKASADTKFA

ATADAFTKNG NAITKNAKSI TDLGTKVDGF DSRVTALDTK VNAFDGRITA

LDSKVENGMA AQAALSGLFQ PYSVGKFNAT AALGGYGSKS AVAIGAGYRV

NPNLAFKAGA AINTSGNKKG SYNIGVNYEF

在优选的实施方案中，配体是这样的多肽(或与野生型多肽相比的多肽截短物)，其包含或由选自SEQ ID NO：1-10的氨基酸序列或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化、磺化或糖基化产物或其它次级加工产物组成。

本文中使用术语“配体”以说明与层粘连蛋白和/或纤连蛋白和/或C3结合的完整分子及该分子中包含层粘连蛋白结合结构域和/或纤连蛋白结合结构域和/或C3结合结构域以至保留相应结合特性的部分。因此，“配体”包括仅由层粘连蛋白结合结构域和/或纤连蛋白结合结构域和/或C3结合结构域(即对结合作用所需要的某肽区域或某些肽区域)组成的分子。

为本发明的目的，可以如下确定多肽的层粘连蛋白结合特性、纤连蛋白结合特性或C3结合特性：多肽可以用¹²⁵碘或其它放射活性化合物标记并在放射免疫测定(RIA)中作为液相或固相(例如点印迹)对结合作用加以测试。此外，多肽可以使用适宜抗体及探测系统，用酶联免疫吸附测定(ELISA)或流式细胞术对结合进行分析。多肽与层粘连蛋、纤连蛋白或C3之间的相互作用还可以通过表面等离子体共振(Biacore)检验。方法实例在材料和方法部分中详细例举。

在另一个优选的实施方案中，多肽[或与野生型多肽相比的多肽截短物]包含或由保守序列中的至少一种组成，其中所述的保守序列来自于本文中显示的比对法内所鉴定的SEQ ID NO：1-10。因此，在该实施方案中，多肽[或与野生型多肽相比的多肽截短物]包含或由如下序列中的至少一种组成：

来自UspA1(来自纤连蛋白结合结构域的保守片段-用“/”分开在一个位置上的备选氨基酸)

G T/V V S V G S/K Q/E/K/A G/N K/N/G/H/S E R Q I V N/H V G A

G Q/N/E/K I S/R A/D T/D S T D A V N G S Q L H/Y A L A S/K/T

T/A/V I/V

S T D A V N G S Q L

L L N/D L S G R L L/I D Q K A D I D N N I N N/H I Y E/D L A

Q Q Q D Q H S S D I K T L K

D Q K A D I D N N I N

L A Q Q Q D Q H S S D I K T L K

来自UspA2(来自纤连蛋白结合结构域的保守片段-用“/”分开在一个位置上的备选氨基酸)

K A D I D N N I N N/H I Y E L A Q Q Q D Q H S S D

I K/Q T/A L K/E K/N/S N V/I E/V E G/E L L/F E/N L S D/G H/R

I/L I D Q K T/A D I/L A/T Q/K N/D

来自UspA2(来自C3-结合结构域的保守片段-用“/”分开在一个位置上的备选氨基酸)

I E/Q D L A A Y N E L Q D A Y A K Q Q A/T E A I D A L N K A

S S E N T Q N I A K N Q A D I A N N I T/N N I Y E L A Q Q Q

D K/Q H R/S S D I K T L A K T/A S A A N T D/N R I

D L A A Y N E L Q D A Y A K Q Q

E A I D A L N K A S S E N T Q N I A K N Q A D I A N N I

将理解的是本发明的多肽配体可以包含本文中所提及序列的层粘连蛋白结合结构域和/或纤连蛋白结合结构域和/或C3结合结构域，其中通过在氨基末端或羧基末端或这两个末端，向本文中所提及序列内添加或从其中缺失氨基酸残基而修饰该序列，修饰的肽相应地保留结合层粘连蛋白和/或纤连蛋白和/或C3的能力。因此，本发明还提供包含如此多肽或由其组成的配体，在所述的多肽内已经在氨基末端或羧基末端或这两个末端处，向本文中所提及的氨基酸序列添加或从其中缺失50、40、30、20、10、5、3或1个氨基酸残基，其中所述修饰的多肽保留结合层粘连蛋白和/或纤连蛋白和/或C3的能力；和/或激发对非修饰的肽的免疫应答。延长意思是指使用来自全长氨基酸序列(该序列从其衍生)中的肽序列延长该序列。

就本发明多肽的片段而言，任何大小的片段可以用在本发明中(基于本文中讨论的同系物序列/保守区域/功能性结构域功能性结构域)，只要该片段保留结合层粘连蛋白和/或纤连蛋白和/或C3的能力。可能想要的是分离仅含有对受体结合作用所需要的那些区域的最小肽。

本发明的多肽配体可以通过在氨基末端或羧基末端或这两个末端处的截短而从已知的卡他莫拉氏菌UspA1或UspA2蛋白中衍生。截短物不是全长的天然UspA1或A2分子。因此，本发明还提供从氨基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160等至298个氨基酸和/或从羧基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180、200等至450个氨基酸的野生型UspA1序列。优选地，截短物保留纤连蛋白结合功能(任选地还有层粘连蛋白结合功能和/或C3结合功能)。

表3.野生型UspA1蛋白的N末端和C末端截短的可能组合。

至少缺失或确切缺失氨基酸的数目
																												从N-末端	从C-末端
0	X	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	340	360	380	400	420	440	450
																												20	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
30	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												40	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
50	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												60	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
70	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												80	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
100	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												120	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
140	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												160	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
180	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												200	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
220	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												240	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
260	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
																												280	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450
298	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	320	240	360	380	400	420	440	450

因此，本发明还提供从氨基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、164个氨基酸和/或从羧基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、180、200等至312个氨基酸的野生型UspA2序列。优选地，截短物保留纤连蛋白结合功能(任选地还有层粘连蛋白结合功能和/或C3结合功能)。可能的截短物可以从如下表内所示的那些截短物中选择，它们均处于本发明的范围内。

表4.野生型UspA2蛋白的N末端和C末端截短的可能组合

至少缺失或确切缺失氨基酸的数目
																					从N-末端	从C-末端
0	X	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
																					20	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
30	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	100	200	220	240	260	280	300	312
																					40	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
50	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
																					60	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
70	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
																					80	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
100	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
																					120	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
140	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
																					160	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312
164	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280	300	312

因此，本发明还提供从氨基末端缺少至少(或确切地)5、10、15、20、25或29个氨基酸和/或从羧基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180、200等至453个氨基酸的野生型UspA2序列。优选地，截短物保留层粘连蛋白结合功能(任选地还有纤连蛋白结合功能和/或C3结合功能)。可能的截短物可以从如下表内所示的那些截短物中选择，它们均处于本发明的范围内。

表5.对野生型UspA2蛋白的氨基末端和羧基末端截短的可能组合

至少缺失或确切缺失氨基酸的数目
								从C-末端	从N-末端
0	X	5	10	15	20	25	29
								20	0	5	10	15	20	25	29
30	0	5	10	15	20	25	29
								40	0	5	10	15	20	25	29
50	0	5	10	15	20	25	29
								60	0	5	10	15	20	25	29
70	0	5	10	15	20	25	29
								80	0	5	10	15	20	25	29
100	0	5	10	15	20	25	29
								120	0	5	10	15	20	25	29
140	0	5	10	15	20	25	29
								160	0	5	10	15	20	25	29
180	0	5	10	15	20	25	29
								200	0	5	10	15	20	25	29
220	0	5	10	15	20	25	29
								240	0	5	10	15	20	25	29
260	0	5	10	15	20	25	29
								280	0	5	10	15	20	25	29
300	0	5	10	15	20	25	29
								320	0	5	10	15	20	25	29
340	0	5	10	15	20	25	29
								360	0	5	10	15	20	25	29
380	0	5	10	15	20	25	29
								400	0	5	10	15	20	25	29
420	0	5	10	15	20	25	29
								440	0	5	10	15	20	25	29
453	0	5	10	15	20	25	29

因此，本发明还提供从氨基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160等至301个氨基酸和/或从羧基末端缺少至少(或确切地)20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160或172个氨基酸的野生型UspA2序列。优选地，截短物保留C3结合功能(任选地还有纤连蛋白结合功能和/或层粘连蛋白结合功能)。可能的截短物可以从如下表内所示的那些截短物中选择，它们均处于本发明的范围内。

表6.对野生型UspA2蛋白的氨基末端和羧基末端截短的可能组合

至少缺失或确切缺失氨基酸的数目
														从N-末端	从C-末端
0	X	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														20	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
30	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														40	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
50	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														60	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
70	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														80	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
100	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														120	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
140	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														160	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
180	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														200	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
220	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														240	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
260	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														280	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
290	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172
														301	0	20	30	40	50	60	70	80	100	120	140	160	172

可以用这种方式加以截短的已知野生型UspA1序列是菌株ATCC25238(MX2；GenBank登录号AAD43465)、P44(AAN84895)、O35E(AAB96359)、TTA37(AAF40122)、O12E(AAF40118)、O46E(AAF36416)、V1171(AAD43469)、TTA24(AAD43467)(见表1/图19)；或BC5(见上文)的那些序列。可以用这种方式加以截短的已知野生型UspA2序列是菌株O35E(GenBank登录号O4407)、MC317(GenBank登录号Q58XP4)、E22(GenBank登录号Q848S1)、V1122(GenBank登录号Q848S2)、P44(GenBank登录号Q8GH86)、TTA37(GenBank登录号Q9L961)、O46E(GenBank登录号Q9L962)、O12E(GenBank登录号Q9L963)、V1171(GenBank登录号Q9XD51)、TTA24(GenBank登录号Q9XD53)、SP12-5(GenBank登录号Q8RTB2)、ATCC25238(GenBank登录号Q9XD55)(见表2/图20)或BC5[Forsgren_UspA2](见上文)的那些序列。

理想地，该实施方案的UspA1截短物或UspA2截短物包含或由选自SEQ ID NO：1-10的氨基酸序列或其片段、同系物、功能性等效物、衍生物、简并物或羟化产物、磺化产物或糖基化产物或其它次级加工产物组成；或包含或由保守序列中的至少一种组成，其中所述的保守序列来自于本文中所示比对法内鉴定的这些区域，例如：

G T/V V S V G S/K Q/E/K/A G/N K/N/G/H/S E R Q I V N/H V G A

G Q/N/E/K I S/R A/D T/D S T D A V N G S Q L H/Y A L A S/K/T

T/A/V I/V

S T D A V N G S Q L

L L N/D L S G R L L/I D Q K A D I D N N I N N/H I Y E/D L A

Q Q Q D Q H S S D I K T L K

D Q K A D I D N N I N

L A Q Q Q D Q H S S D I K T L K

K A D I D N N I N N/H I Y E L A Q Q Q D Q H S S D

I K/Q T/A L K/E K/N/S N V/I E/V E G/E L L/F E/N L S D/G H/R

I/L I D Q K T/A D I/L A/T Q/K N/D

来自UspA2(来自C3结合结构域的保守片段-用“/”分开在一个位置上的备选氨基酸)

I E/Q D L A A Y N E L Q D A Y A K Q Q A/T E A I D A L N K A

S S E N T Q N I A K N Q A D I A N N I T/N N I Y E L A Q Q Q

D K/Q H R/S S D I K T L A K T/A S A A N T D/N R I

D L A A Y N E L Q D A Y A K Q Q

E A I D A L N K A S S E N T Q N I A K N Q A D I A N N I

可以方便地产生含有如本文中所述的多肽配体的融合蛋白。因此，在又一个实施方案中，本发明提供包含本发明的多肽配体的融合蛋白。优选地，根据该实施方案的融合蛋白与任何已知的全长序列在其全部长度上的同一性小于50％。此类融合物可以构成本发明多肽的衍生物。其它衍生物可以是使用本发明多肽作为载体共价偶联肽或糖部分的衍生物。它们可以例如偶联至肺炎链球菌荚膜寡糖或多糖或者卡他莫拉氏菌的脂低聚糖或不可分型的流感嗜血杆菌的脂低聚糖。

本发明的同源肽可以通过序列比较进行鉴定。同源肽优选地与本发明在本文中公开的肽序列或其片段或截短物在它们的全部长度上至少60％相同，更优选地以优选递增顺序至少70％、80％、90％、95％或99％相同。优选地，同源肽保留结合纤连蛋白和/或层粘连蛋白和/或C3的能力和/或激发抗本文中公开的肽序列或其片段的免疫应答。

图19和20显示不同来源的UspA1和UspA2的肽序列的比对，该比对显示序列中能够被修饰以形成同源序列而同时保留功能(即纤连蛋白结合能力和/或层粘连蛋白结合能力和/或C3结合能力)的区域。BC5 SEQ IDNO：1-10肽的同源肽例如是与图19和20中来自其它菌株的BC5序列相对应的那些序列。

本发明的疫苗

本发明的多肽/肽/功能性结构域/同系物/片段/截短物/衍生物应当理想地配制成包含有效量的所述成分及可药用赋形剂的疫苗。

本发明的疫苗可以用于向患者施用以预防或治疗卡他莫拉氏菌感染或中耳炎或鼻窦炎或下呼吸道感染。它们可以用任何已知的方式施用，包括肌内、肠胃外、粘膜或鼻内施用。

本发明的联合疫苗

本发明的疫苗可以与其它卡他莫拉氏菌抗原组合以预防或治疗前述疾病。

本发明人尤其已经发现卡他莫拉氏菌具有阻碍宿主免疫系统攻击该生物的至少两种手段。此外，对于下文实施例中所提到的与C3(和C4BP)的相互作用，卡他莫拉氏菌通过蛋白质MID(又称作OMP106)表现对可溶性和膜结合性的人IgD的强亲和力。对B淋巴细胞的莫拉氏菌依赖性IgD结合引起多克隆免疫球蛋白合成，这可能抑制特异性抗莫拉氏菌单克隆抗体产生。卡他莫拉氏菌以数种方式阻碍人免疫系统的事实或许可以揭示为什么卡他莫拉氏菌是呼吸道的常见栖居者。

本发明人相信组合参与IgD结合功能(MID)和C3结合功能(UspA1和/或UspA2)的抗原可以提供这样的免疫原性组合物，该组合物给予宿主增强的抗莫拉氏菌阻碍人免疫系统的防御能力，因此极大减少粘膜表面上携带卡他莫拉氏菌。

本发明的又一个方面因此是这样的疫苗组合物，该组合物包含与有效量的蛋白质MID(例如全长多肽或多肽/肽/功能性结构域/同系物/片段/截短物/其衍生物，其优选地保留人IgD结合功能)组合的有效量UspA1和/或UspA2(尤其后者)(例如如本文中描述的本发明的全长多肽或多肽/肽/功能性结构域/同系物/片段/截短物/衍生物，其优选地保留C3结合功能)，和可药用赋形剂。

蛋白质MID及其结合IgD的同源物/片段/截短物在WO 03/004651(本文中引用作为参考)内描述。特别适合于此目的片段是包含在WO03/004651内描述的F2片段(或由其组成)的多肽，或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％同一性并优选保留人IgD结合活性的序列。这种联合疫苗的MID和UspA成分可以是彼此分离的，或可以通过已知分子生物学技术方便地合在一起使用。

附图简述

图1显示测试纤连蛋白结合作用的13株卡他莫拉氏菌菌株(A)。如通过抗UspA1/A2 pAb(B-I)所检测，纤连蛋白结合作用与UspA1/A2表达强烈相关。卡他莫拉氏菌BBH18野生型和UspA1/A2缺陷突变体的流式细胞术图谱显示出与可溶性纤连蛋白的UspA1/A2依赖性结合。显示野生型临床分离株(B和F)和缺少UspA1(C和G)或UspA2(D和H)的相应突变体以及同时缺少UspA1和UspA2的双突变体(E和I)的图谱。将细菌与兔抗UspA1/A2 pAb温育，或与纤连蛋白随后与抗纤连蛋白pAb温育。随后添加FITC缀合的兔pAb，然后进行流式细胞术分析。显示了三个实验中的典型实验结果和对应于每个图谱的平均荧光密度(MFI)。

图2显示卡他莫拉氏菌RH4 UspA2缺陷突变体不结合¹²⁵I-标记的纤连蛋白。包括大肠杆菌BL21作为不结合纤连蛋白的阴性对照。细菌与¹²⁵I-标记的纤连蛋白温育，随后洗涤数次并用γ计数仪分析。与同时表达UspA1和A2的RH4野生型菌的纤连蛋白结合作用设定为100％。显示三个独立实验的平均值。误差棒代表标准差(SD)。用卡他莫拉氏菌BBH18得到相似的结果.

图3显示验证缺少UspA1和UspA2的卡他莫拉氏菌突变体不与固定化纤连蛋白结合的图。卡他莫拉氏菌野生型能够高密度地黏附至纤连蛋白包被的载玻片上(A)。卡他莫拉氏菌ΔuspA1突变体也高密度地滞留(B)，而卡他莫拉氏菌ΔuspA2和ΔuspA1/A2双突变体则黏附不良(C和D)。载玻片用纤连蛋白包被并且与卡他莫拉氏菌RH4及其相应UspA1/A2突变体温育。数次洗涤后，对细菌进行革兰氏染色。

图4是显示重组UspA1和A2以剂量依赖方式与纤连蛋白结合的图。对UspA1^50-770和UspA2^30-539显示出特异性纤连蛋白结合作用。将这两种UspA蛋白质(40nM)包被在微量滴定平板上并与递增浓度的纤连蛋白温育，随后用兔抗人纤连蛋白pAb和HRP-缀合抗兔pAb检测。显示三个独立实验的平均值并且误差棒表示SD。

图5.对于UspA1和UspA2的活性纤连蛋白结合结构域分别位于氨基酸299至452和165至318之间。显示了从UspA1(A)和UspA2(B)中衍生的截短蛋白质。均在ELISA内对全部片段检测纤连蛋白结合作用。将40nM的每种截短片段包被在微量滴定平板上，并且对于UspA1而言，与80μg/ml纤连蛋白温育；对于UspA2而言，与120μg/ml纤连蛋白温育。结合的纤连蛋白用兔抗纤连蛋白pAb，随后用HRP缀合抗兔pAb检测。结果代表三组实验。误差棒代表SD。

图6显示根据序列号1的序列，以及UspA1^299-452与UspA2^165-318之间的序列同源性。31个相同的氨基酸残基位于括号内。

图7显示截短的UspA1^50-491和UspA1^299-452片段竞争性地抑制卡他莫拉氏菌的UspA依赖性纤连蛋白结合作用。包括不结合纤连蛋白的卡他莫拉氏菌ΔuspA1/A2双突变作为阴性对照。在与卡他莫拉氏菌温育前，UspA1重组蛋白与2mg/100ml纤连蛋白预温育。显示了通过FITC缀合抗纤连蛋白pAb在流式细胞术内检测到的带已结合纤连蛋白的卡他莫拉氏菌的平均荧光值(MFI)。UspA1^50-491和UspA1^299-452分别产生95％和63％的抑制。误差棒代表三个独立实验的均值±SD。

图8显示UspA1^299-452和UspA2^165-318抑制了卡他莫拉氏菌通过细胞结合性纤连蛋白黏附至Chang结膜细胞。Chang上皮细胞在表面上表达纤连蛋白，如通过抗纤连蛋白pAb和流式细胞术所示(A)。与对照重组蛋白(UspA1^433-580和UspA2^30-177)和对照抗体(抗ICAM1 mAb)相比，与纤连蛋白结合性蛋白质UspA1^299-452、UspA2^165-318或抗纤连蛋白pAb的预温育引起与卡他莫拉氏菌RH4结合的显著减少(B)。双侧配对Student t检验P＜0.05。显示三个独立实验的平均值并且误差棒表示SD。

图9A显示卡他莫拉氏菌RH4通过UspA1和A2与层粘连蛋白结合。卡他莫拉氏菌RH4野生型(wt)强烈地与固定化层粘连蛋白结合，平均OD是1.27。RH4 ΔuspA1显示平均OD为1.14(野生型平均OD的89.8％)。RH4ΔuspA2和双突变体RH4ΔuspA1/A2分别具有平均OD 0.19和0.23(野生型平均OD的15.0％和18.1％)。这与对牛血清白蛋白包被的平板的残留黏附无显著差异。将30μg/ml层粘连蛋白或牛血清白蛋白包被在微量滴定平板上。对它们进行封闭并随后与细菌混悬液温育，最后洗涤。结合的细菌用抗MID pAb和HRP缀合抗兔pAb检测。显示3个代表性实验的平均结果。误差棒代表标准差(SD)。

图9B显示重组UspA1和A2以剂量依赖性结合层粘连蛋白。UspA1^50-770和UspA2^30-539显示出特异性纤连蛋白结合作用。将这两种UspA蛋白质(40nM)包被在微量滴定平板上并与递增浓度的层粘连蛋白温育，随后用兔抗层粘连蛋白pAb和HRP-缀合抗兔pAb检测。显示三个独立实验的平均值并且误差棒表示SD

图10A和B显示UspA1^50-770(A)和UspA2^30-539(B)的活性层粘连蛋白结合结构域位于氨基末端部分。将40nM重组UspA1^50-770和UspA2^30-539连同截短蛋白质一起包被在微量滴定平板上并与20μg/ml层粘连蛋白温育，随后用兔抗层粘连蛋白pAb和HRP缀合抗兔pAb检测。显示三个独立实验的平均值并且误差棒表示SD。

图11是C3、共价结合的C3b和C3met的示意图。(A)血清内的C3-分子由一条α-链和和一条β-链组成。(B)α-链含有活化后可以与微生物表面共价结合的内部硫酯位点。(C)C3已经由甲胺处理，它与硫酯共价结合。

图12说明卡他莫拉氏菌通过外膜蛋白UspA1和A2对抗补体系统的经典途径和旁路途径。(A)将卡他莫拉氏菌RH4野生型(wt)、ΔuspA1、ΔuspA2或ΔuspA1/A2突变体在10％NHS存在下温育。(B)ΔuspA1/A2突变体与补充EDTA或Mg-EGTA的10％NHS温育。在所示时间点上收集细菌。在过夜温育后，计数集落形成单位(cfu)。将实验开始时的细菌数定义为100％。显示三个独立实验的平均值并且误差棒表示S.D。(A)5分钟后对于ΔuspA1、ΔuspA2或ΔuspA1/A2突变体的平均值显著不同于野生型(P＜0.05)。(B)5分钟后对于ΔuspA1/A2突变体的平均值和在10分钟后对于与Mg-EGTA温育的ΔuspA1/A2突变体的平均值显著不同于野生型(P＜0.05)。

图13说明卡他莫拉氏菌依赖于补体活化而结合血清内的C3。流式细胞术图谱显示C3结合至(A)卡他莫拉氏菌RH4或(B)肺炎链球菌。细菌与NHS或用EDTA预处理的NHS温育。随后，添加兔抗人C3d pAb和作为第二抗体层的FITC缀合山羊抗兔pAb，随后进行流式细胞术分析。将不存在NHS但存在两种pAb下的细菌定义为背景荧光。显示三个实验中的一个代表性实验。

图14说明卡他莫拉氏菌以剂量依赖方式非共价地结合经甲胺处理的纯化的C3并且结合基于离子性相互作用。流式细胞术图谱显示在C3met浓度增加下的结合(A)。(B)显示图板(A)内每一图谱的平均荧光密度(mfi)。(C)RH4的C3met结合随NaCl浓度增加而减少。细菌与C3met在所示的有或无NaCl下进行温育。C3met结合由流式细胞术测量为如图3内所描述。误差棒表示SD。^＊P≤0.05，^＊＊P＜0.01，^＊＊＊P≤0.001。

图15说明卡他莫拉氏菌RH4野生型和UspA1/A2缺陷突变体的流式细胞术图谱显示了UspA1/UspA2依赖性的C3met/C3结合。显示野生型临床分离株(A、F、K)和缺少蛋白质MID(B、G、L)、UspA1(C、H、M)、UspA2(D、I、N)或同时缺少UspA1和UspA2(E、J、O)的相应突变体的图谱。细菌与C3met(A-E)、NHS-EDTA(F-J)或NHS(K-O)温育并如图3所述检测。显示三个实验中的一个典型实验，显示对于每个图谱的平均荧光密度(mfi)。

图16说明C3met与纯化的重组UspA2^30-539结合，而仅观察到C3met与UspA1^50-770微弱结合。此外，确定UspA2的C3met结合区域位于氨基酸残基200至458之间。(A)将重组UspA1^50-770与UspA2^30-539固定在硝酸纤维素膜上。将膜与[¹²⁵I]标记的C3met过夜温育并且使用增感屏，用Personal FX(Bio-Rad)使结合的蛋白质显见。包含重组蛋白MID^962-1200作为阴性对照。(B)将UspA1^50-770、UspA2^30-539和一系列截短的UspA2蛋白质包被在微量滴定平板上并与C3met温育，随后与山羊抗人C3 pAb和HRP缀合抗山羊pAb温育。显示来自三个实验的平均值。将背景结合从全部样品内扣除。误差棒对应于S.D。^＊P≤0.05，^＊＊P≤0.01，^＊＊＊P≤0.001。

图17说明向血清中添加重组UspA1^50-770和UspA2^30-539抑制借助旁路途径的C3b沉积并抑制对卡他莫拉氏菌的杀伤。流式细胞术图谱显示了与(A)NHS或经重组(rec.)UspA1^50-770及UspA2^30-539预温育的NHS进行温育后，或与(B)NHS-Mg-EGTA或UspA1^50-770及UspA2^30-539预温育的NHS-Mg-EGTA进行温育后，在RH4ΔuspA2/A2上的C3b-沉积。在添加多种NHS组合后，如图13内所述分析细菌。(C)RH4ΔuspA1/A2与10％NHS或NHS-Mg-EGTA温育。为了抑制，NHS-Mg-EGTA在添加细菌前与100nM UspA1^50-770和/或UspA2^30-539温育。在所示时间点上收集细菌。将实验开始时的细菌数定义为100％。显示三个独立实验的平均值并且误差棒表示S.D。对于与重组蛋白预温育的ΔuspA1/A2突变体的时间点10、20和30分钟显著不同于单独与Mg-EGTA温育的ΔuspA1/A2突变体(P＜0.05)。

图18说明重组UspA1^50-770和UspA2^30-539通过抑制旁路途径而减少兔红细胞溶血。NHS在37℃与100nM UspA1^50-770和/或UspA2^30-539温育30分钟或不与它们温育。随后将NHS以所示的浓度添加至兔红细内，温育30分钟后，将混悬液离心并通过分光光度法测量上清液。将每个实验中的最大溶血定义为100％。显示三个独立实验的平均值并且误差棒对应于S.D。用NHS浓度为2％、3％和4％的NHS+UspA2^30-539和NHS+UspA1^50-770/UspA2^30-539所得到结果显著不同于NHS对照(P＜0.05)。

图19说明对8株不同菌株的UspA1的pileup-分析，以显示UspA1不同部分的同源性。

图20说明对13株不同菌株的UspA2的pileup-分析，以显示UspA2不同部分的同源性。

图21说明在Forsgren序列上所鉴定的区域内的％同一性，该同一性百分数计算为完全配对的数目与区域比对的长度间的比率，其中区域比对是含有Forsgren区域的上文的总比对的部分。

材料和方法

卡他莫拉氏菌与纤连蛋白间的相互作用

细菌菌株和培养条件

卡他莫拉氏菌临床菌株的来源列于表7。卡他莫拉氏菌BBH18和RH4突变体如前所述构建[23，58]。卡他莫拉氏菌菌株在脑心浸出液(BHI)液体肉汤内或在BHI琼脂平板上37℃常规培养。

UspA1缺陷突变体在补加1.5μg/ml氯霉素(Sigma，St.Louis，MO)的BHI内培养，并且UspA2缺陷突变体与7μg/ml zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA)温育。对双突变体同时使用氯霉素和zeocin。

表7.用于本研究中的卡他莫拉氏菌临床菌株

菌株	临床来源	参考文献
			BBH18D1Ri49C10F16Bro2Z14S6-688	痰痰痰痰痰呼吸道咽鼻咽	[53][53][53][10][10][53][10][23]

Bc5RH4RH6R14R4SO-1914

鼻咽血液血液未知未知鼓室吸液

[20][53][53][10][10][23]

注意：菌株C10、R4没有uspA1基因，而F16、R14、Z14缺少uspA2基因[10]。其余菌株含有uspA1基因和uspA2基因(数据未显示)。

DNA方法

为检测情况未知的那些菌株内uspA1、A2和A2H基因的存在，使用如Meier等所述的引物和PCR条件[50]。还用RH4和BBH18各自的uspA1和uspA2基因的UspA1^299-452及UspA2^165-318的5′引物及3′引物实施部分测序。氨基酸残基″DQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLK″的存在还如Meier等所述，用从该序列5′末端中设计的引物(5′-CAAAGCTGACATCCAAGCACTTG-3′)和用于uspA1及A2的3′引物，通过实施PCR予以证实[50]。

重组蛋白的构建和表达重组

最近已描述了缺少疏水性羧基末端的UspA1^50-770和UspA2^30-539[58]。使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从卡他莫拉氏菌Bc5提取基因组DNA。此外，还通过相同方法构建与覆盖UspA1^50-770和UspA2^30-539的多重区域相对应的重组蛋白。所用的引物列于表8。全部构建体根据标准方法测序。重组蛋白的表达和纯化如前所述完成[59]。蛋白质使用含有镍树脂(Novagen)的柱，根据制造商用于天然条件的说明进行纯化。重组蛋白如所述在SDS-PAGE上分析[21]。

表8.本研究中所用的引物

蛋白质	5′引物	3′引物
			UspA1^50-770UspA1^50-491UspA1^50-197UspA1^50-321UspA1^299-452UspA1^433-580UspA1^557-704UspA1^680-770UspA2^30-539UspA2^30-177UspA2^101-240UspA2^101-318UspA2^165-318UspA2^302-458UspA2^446-539	gcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccgcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccgcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccgcgtctgcggatccagtaggcaaggcaaccggtgtcactaagcttacctgcaccaacatgaacggatttgcaggtgcatcggatcctggtaatggtactcatagctctgatatggatccacttaaaaacgccaaagcacaagcggatccaaataaagacgttgagcaaaaggatcccatcaatcaagagcgaatgcggatcctaaaaatgatataactttagaggcgaatgcggatcctaaaaatgatataactttagagggatattgcggatccggaagatgatgttgaaacgatattgcggatccggaagatgatgttgaaacgagattgagaaggatccagatgctattgctgctcaaaaccaagcggatccccaagatctggcaagtgctgcggatcctgatcgtattgct	ccctgaagctttagtgcataacctaattgttgagcaagcttagcttggtttttagcgacctgtggcaagcttcttcctgccgtcttttgtaagatcaagcttttgatcaatcatgctgagaagcttacctagattggggtcttattggtagtaagcttagcttggttttgccctgaagctttagtgcataacctaattgcattaagcttggtgtctaatgcagttacctcatgaccaaaatcaagcttatcttcgatagactcgatcaataagcttaccgcttagattgaatagttcttcgtcaatcgcttcaagcttcttttgagcatactggtcaatcgcttcaagcttcttttgagcatactgggtgagcgtttcaagctttgcatcagcatcggccattaagcttggtgtctaatgcagttac

抗体

近来详细描述了兔抗UspA1/A2多克隆抗体(pAb)[58]。所用的其它抗体是兔抗人纤连蛋白pAb、FITC缀合猪抗兔pAb、辣根过氧化物酶(HRP)缀合猪抗兔pAb和小鼠抗人CD54(ICAM1)单克隆抗体(mAb)。抗体来自Dakopatts(Glostrup，丹麦)。

流式细胞术分析

通过流式细胞术分析UspA1/A2蛋白质的表达和卡他莫拉氏菌与纤连蛋白结合的能力。卡他莫拉氏菌野生型菌株和UspA1/A2缺陷突变体生长过夜并在含有3％鱼明胶的磷酸盐缓冲盐水(PBS-明胶)内洗涤两次。随后将细菌(10⁸个)与抗UspA1/A2抗血清或5μg纤连蛋白(Sigma，St Louis，MO)温育。随后洗涤细菌并将其在室温(RT)与FITC缀合抗兔pAb(根据制造商说明稀释)温育30分钟或在与FITC缀合抗兔pAb温育之前同兔抗人纤连蛋白pAb(如果首先添加纤连蛋白的话)的1/100稀释物室温温育30分钟。在三次额外洗涤后，通过流式细胞术(EPICS，XL-MCL，Coulter，Hialeah，FL)分析细菌。全部温育保持在终体积100μl PBS-明胶内并且用相同的缓冲液加以洗涤。分别添加抗纤连蛋白pAb和FITC缀合抗兔pAb作为所分析每种菌株的阴性对照。纤连蛋白抑制作用研究通过将0.25微摩尔UspA片段同2μg纤连蛋白预温育1小时，随后与(10⁸个)卡他莫拉氏菌细菌温育而实施。残留游离量的与卡他莫拉氏菌结合的纤连蛋白通过如上所述的流式细胞术确定。

卡他莫拉氏菌与固定化纤连蛋白的结合

载玻片以30μl等分试样的纤连蛋白(1mg/ml)包被并在室温下空气干燥。在用PBS洗涤一次后，将载玻片与平皿内的预冷的晚指数期细菌(在600nm上光密度(OD)＝0.9)温育。在室温2小时后，载玻片用PBS洗涤一次，随后进行革兰氏染色。

蛋白质标记和放射免疫测定(RIA)

纤连蛋白以氯胺T方法用¹²⁵碘标记(Amersham，Buckinghamshire，英格兰)至高特异性活性(每摩尔蛋白质0.05摩尔碘)[21]。卡他莫拉氏菌菌株BBH18和RH4以及它们对应的突变体在固体培养基上生长过夜并在含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS内洗涤。将(10⁸个)细菌在37℃与¹²⁵I-标记的纤连蛋白(1600kcpm/样品)于含有2％BSA的PBS内温育1小时。在用含2％BSA的PBS洗涤三次后，与细菌结合的¹²⁵I-标记的纤连蛋白在γ计数仪(Wallac，Espoo，芬兰)内测量。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

微量滴定平板(Nunc-Immuno Module；Roskilde，丹麦)用40nM纯化的重组UspA1^50-770和UspA2^30-539蛋白质在75mM碳酸钠，pH9.6内于4℃下包被过夜。平板用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl、0.15M NaCl和0.1％Tween20，pH7.5)洗涤四次并在室温用含有3％鱼明胶的洗涤缓冲液封闭2小时。在四次额外洗涤后，板孔在室温与3倍稀释于(洗涤缓冲液中的)1.5％鱼明胶内的纤连蛋白(120μg/ml)温育1小时。此后，将平板洗涤并与兔抗人纤连蛋白pAb温育1小时。在额外的洗涤后，添加HRP缀合抗兔pAb并在室温温育1小时。抗人纤连蛋白和HRP缀合抗兔pAb均在含有1.5％鱼明胶的洗涤缓冲液内1∶1,000稀释。将板孔洗涤四次并使平板显色以及在OD₄₅₀上测量。覆盖UspA1^50-770和UspA2^30-539的截短蛋白质分别与80μg/ml和120μg/ml固定剂量纤连蛋白开展ELISA。

细胞系黏附抑制分析法

Chang结膜细胞(ATCC CCL 20.2)在补加10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和12μg庆大霉素/ml的RPMI 1640培养基(Gibco BRL，LifeTechnologies，Paisley，苏格兰)内培养。在黏附抑制实验前一日，收获细胞，在无庆大霉素的RPMI 1640内洗涤两次并在200μl无庆大霉素培养基内以终浓度10⁴个细胞/孔添加到96孔组织培养平板(Nunc)。此后，细胞在37℃于5％CO₂和95％空气的湿润环境下温育过夜。在实验当日，对卡他莫拉氏菌黏附的抑制作用通过预温育浓度递增的含有纤连蛋白结合结构域(UspA1^299-452和UspA2^165-318)的重组UspA1/A2截短蛋白质或兔抗人纤连蛋白pAb(1∶50稀释)1小时而实施。使用非纤连蛋白结合性重组蛋白(UspA1^433-580和UspA2^30-177)作为对照。已知Chang上皮细胞表达ICAM1[18]。因此，使用抗ICAM1抗体以区别抗纤连蛋白抗体的抑制效应是否次于空间位阻作用。随后，将PBS-明胶内的卡他莫拉氏菌RH4(10⁶)接种到汇合的细胞单层上。在全部实验中，将组织培养平板在3,000×g离心5分钟并在37℃于5％CO₂内温育。30分钟后，感染的细胞单层用PBS-明胶淋洗数次以除去未黏附的细菌，并且随后用胰蛋白酶-EDTA(0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA)处理以将Chang细胞从塑料支持物上释放。此后，将得到的细胞/细菌混悬液于稀释物内接种在含有BHI的琼脂平板上并在37℃于5％CO2内温育过夜。

测定Chang结膜上皮细胞内的纤连蛋白表达

Chang结膜上皮细胞通过刮取收获，随后在PBS-明胶内重悬。细胞(1×10⁶个/ml)用兔抗人纤连蛋白pAb标记，随后洗涤并与FITC缀合抗兔pAb温育。在又洗涤三次后，细胞如上所述通过流式细胞术分析。

卡他莫拉氏菌与层粘连蛋白之间的相互作用

细菌菌株和培养条件

卡他莫拉氏临床菌菌株BBH18和RH4及其对应的突变体如先前所描述[58]。这两种菌株具有与UspA1相比的相对较高的UspA2表达[58]。与野生型菌株相比，突变体表达等量的卡他莫拉氏菌免疫球蛋白D结合蛋白(MID)。细菌在脑心浸出液(BHI)肉汤内或在BHI琼脂平板上37℃常规培养。UspA1缺陷突变、UspA2缺陷突变体和双突变体如所述在补加抗生物的BHI内培养[58]。

重组蛋白的构建和表达

制造了缺少疏水性羧基末端的重组UspA1^50-770和UspA2^30-539[58]。此外，使用与覆盖UspA1^50-770和UspA2^30-539的多重区域对应的重组蛋白[78]。

抗体

使用兔抗UspA1/A2和抗MID多克隆抗体(pAb)[22，58]。兔抗层粘连蛋白pAb来自Sigma(St Louis，MO，美国)。辣根过氧化物酶(HRP)缀合猪抗兔pAb来自Dakopatts(Glostrup，丹麦)。

卡他莫拉氏菌与固定化层粘连蛋白的结合

微量滴定平板(Nunc-Immuno Module；Roskilde，丹麦)用Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤层粘连蛋白(Sigma，Saint Louis，美国)或牛血清白蛋白(BSA)(30μg/ml)在Tris-HCL，pH9.0内于4℃包被过夜。平板用磷酸盐缓冲盐水和0.05％Tween 20，pH7.2(PBS-Tween)洗涤并随后用PBS+0.1％Tween 20，pH7.2内的2％BSA封闭。随后添加在100μl内的(10⁸个)卡他莫拉氏菌RH4和BBH18，然后温育1小时。通过用PBS-Tween洗涤3次去除未结合的细菌。剩下结合的细菌通过抗MID pAb检测，随后用HRP缀合抗兔pAb进行检测。使平板显色并根据标准方案在OD₄₅₀上测量。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

微量滴定平板(Nunc-Immuno Module)用40nM纯化的重组UspA1^50-770和UspA2^30-539蛋白质在75mM碳酸钠，pH9.6内于4℃下包被过夜。平板用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl、0.15M NaCl和0.1％Tween20，pH7.5)洗涤四次并在室温用含有3％鱼明胶的洗涤缓冲液封闭。在额外洗涤后，板孔与在(洗涤缓冲液中的)1.5％鱼明胶内如所示不同稀释度上的层粘连蛋白室温温育1小时。此后，将平板洗涤并与兔抗层粘连蛋白pAb温育。在额外的洗涤后，添加HRP缀合抗兔pAb并在室温温育。抗层粘连蛋白pAb和HRP缀合抗兔pAb均在含有1.5％鱼明胶的洗涤缓冲液内1∶1,000稀释。洗涤板孔并使平板显色以及在OD₄₅₀上测量。使用与相同稀释度的层粘连蛋白温育的未包被的板孔作为背景对照。截短的覆盖UspA1^50-770和UspA2^30-539的蛋白质分别与80μg/ml和120μg/ml固定剂量层粘连蛋白开展ELISA。

卡他莫拉氏菌与C3和C3met之间的相互作用

细菌菌株和培养条件

卡他莫拉氏菌临床分离株及相关亚种最近已经详细描述[21，53]。典型菌株来自哥德堡大学培养物保藏中心(CCUG；临床细菌学系，Sahlgrenska医院，瑞典哥德堡)或美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，Va)；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)CCUG 15821、酿脓链球菌CCUG25570和25571、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)CCUG 4208、肺炎链球菌ATCC 49619、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)ATCC 33152、铜绿假单胞菌ATCC 10145、金黄色葡萄球菌ATCC 29213以及金黄色葡萄球菌ATCC 25923。表9内其余菌株是来自瑞典兰德大学马尔默大学医院的实验医学系、微生物系的临床分离株。

表9.卡他莫拉氏菌是独特的C3/C3met结合细菌。相关的莫拉氏菌亚种和其它常见的人病原体不结合C3/C3met(mfi＜2.0)。在与EDTA处理的NHS或C3met温育后，使用兔抗C3d pAb和FITC缀合山羊抗兔pAb，通过流式细胞术分析细菌。

物种	NHS-EDTA(mfi)	C3met(mfi)
			卡他莫拉氏菌RH4奥斯陆莫拉氏菌(M.osloensls)牛莫拉氏菌(M.bovis)M.caniculi不液化莫拉氏菌(M.nonliquefacie)咽奈瑟氏球菌(N.pharyngis)干燥奈瑟氏球菌(N.sicca)黄色奈瑟氏球菌(N.flava)微黄奈瑟氏球菌(N.subflava)解脲寡源杆菌(Oligellaureolytica)(n＝2)流感嗜血杆菌(n＝7)肺炎链球菌(n＝11)嗜肺军团菌(n＝2)铜绿假单胞菌(n＝2)	8.7＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0	22.1＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene)小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)金黄色葡萄球菌(n＝3)酿脓链球菌(n＝2)无乳链球菌粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)大肠杆菌(n＝2)绵羊莫拉氏菌(M.ovis)豚鼠莫拉氏菌(M.caviae)淋病奈瑟氏球菌脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningtidis)粘液奈瑟球菌(N.mucosa)

＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0＜2.0

将不同的非莫拉氏菌物种在适宜的标准培养基上培育。卡他莫拉氏菌菌株在脑心浸出液(BHI)液体肉汤内或在BHI琼脂平板上37℃常规培养。卡他莫拉氏菌BBH18和RH4突变体如先前所描述产生[22、23、58]。MID缺陷突变体在含有含有50μg/ml卡那霉素的BHI内培养。UspA1缺陷突变体在补加1.5μg/ml氯霉素(Sigma、St.Louis、MO)的BHI内培养，并且UspA2缺陷突变体与7μg/ml zeocin(Invitrogen、Carlsbad、CA)温育。氯霉素和zeocin同时用于培育UspA1/A2双突变体。

抗体

兔用乳化于弗氏完全佐剂(Difco，Becton Dickinson，海德堡，德国)内的200μg重组全长UspA1肌内免疫，并在第18日和36日用弗氏不完全佐剂内的相同剂量蛋白质加强免疫[22]。3周后放血。为提高特异性，抗UspA1抗血清用重组UspA1^50-770缀合的Sepharose进行亲和纯化[58]。抗血清与UspA1和UspA2同等地结合并且因此命名为抗UspA1/A2 pAb。兔抗人C3d pAb和FITC缀合猪抗兔pAb从Dakopatts(Glostrup，丹麦)购买，并且山羊抗人C3来自Advanced Research Technologies(San Diego，CA)。从Serotec(Oxford，UK)获得辣根过氧化物酶(HRP)缀合驴抗山羊pAb。

蛋白质和碘标记

最近已描述了缺少疏水性羧基末端的重组UspA1^50-770和UspA2^30-539的制造[23]。截短的UspA1蛋白和UspA2蛋白如Tan等详细所述[78]制造。C3b从Advanced Research Technologies购买。C3(H₂O)通过冷冻和融化纯化的C3得到。C3b-样分子(C3met)通过将纯化的C3与100mM甲胺(pH8.0)在37℃温育2小时而产生，并随后对100mM Tris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl透析。对于结合研究，使用氯胺T方法[25]，以每摩尔蛋白质0.05mol¹²⁵I(Amersham，Buckinghamshire，英格兰)标记C3met。

流式细胞术分析

C3对卡他莫拉氏菌及其它物种的结合通过流式细胞术进行分析。细菌在固体培养基上生长过夜并在含有2％BSA(Sigma)的PBS(PBS-BSA)内洗涤两次。随后将细菌(10⁸个集落形成单位；cfu)与C3met、C3b、C3(H₂O)或10％NHS在存在或不存在10mM EDTA或4mM MgCl₂和10mMEGTA(Mg-EGTA)下于PBS-BSA内在37℃温育30分钟。洗涤后，将细菌与与抗人C3d pAb在冰上温育30分钟，随后洗涤并在冰上与FITC缀合山羊抗兔pAb再温育30分钟。在额外洗涤三次后，通过流式细胞术(EPICS，XL-MCL，Coulter，Hialeah，FL)分析细菌。全部温育保持在终体积100μl PBS-BSA内并且用相同的缓冲液完成洗涤。分别添加抗人C3d pAb和FITC缀合抗兔pAb作为所分析每种菌株的阴性对照。在抑制研究中，血清与100nM的重组UspA1^50-770和UspA2^30-539蛋白质在37℃预温育30分钟。为分析卡他莫拉氏菌与C3相互作用的特征，将递增浓度的NaCl(0-1.0M)添加到细菌和C3met中。为分析UspA1/A2的表达，将细菌(10⁸cfu)与抗uspA1/A2 pAb温育并如上所述洗涤。根据制造商说明稀释的FITC缀合山羊抗兔pAb用于检测。为确保EDTA不破坏外膜蛋白UspA1和UspA2，将卡他莫拉氏菌与或不与EDTA一起温育，随后检测UspA1/A2表达。在NHS-EDTA实验内所用浓度上的EDTA不改变UspA1/A2的密度。

血清和血清杀菌测定

从5位健康志愿者中得到正常人血清(NHS)。让血液在室温凝固30分钟并且随后在冰上孵育60分钟。离心后，将血清合并、等分并贮存在-70℃。为使经典途径和旁路途径失活，添加10mM EDTA。相反，加入Mg-EGTA以使经典途径失活。C4BP缺陷的人血清通过将新鲜血液通过经mAb104(一种抗C4BP的α-链CCP1的小鼠mAb)偶联的HiTrap柱(AmershamBiosciences)而制备[41]。收集流出物并将耗尽的血清以等分试样方式贮存在-70℃。使用Biorex 70离子交换色谱(Bio-Rad，Hercules，CA)，从纯化C1q的第一步骤中得到耗尽C1q的血清[79]。得到的血清显示正常的溶血活性。因子D和备解素缺陷的血清由Anders Sj

holm博士(瑞典兰德镇兰德大学医学微生物系)友好提供。卡他莫拉氏菌菌株在含有0.1％(wt/vol)明胶、1mM MgCl₂、0.15mM CaCl₂和2.5％葡萄糖(DGVB⁺⁺)的2.5mMVeronal缓冲液，pH7.3内稀释。细菌(10³个cfu)与10％NHS和EDTA或Mg-EGTA在100μl终体积内共同温育。将细菌/NHS在37℃温育，并且将10μl等分试样在不同时间点上取出并涂布在BHI琼脂平板上。在抑制研究中，在添加细菌前，将10％血清与100nM的重组UspA1^50-770和UspA2^30-539蛋白质在37℃温育30分钟。

点印迹分析

使用点印迹装置，将在100μl 0.1M Tris-HCl，pH9.0内三倍稀释的纯化重组UspA1^50-770和UspA2^30-539(1.9-150nM)施加至硝酸纤维素膜(Schleicher&Schiill，Dassel，德国)。在饱和后，将膜与含有5％脱脂乳粉的PBS-Tween在室温下温育2小时并用PBS-Tween洗涤四次。此后，添加在含有2％脱脂乳粉的PBS-Tween内的5kcpm[¹²⁵I]-标记C3met，4℃过夜。使用增感屏，用Personal FX(Bio-Rad)使结合的蛋白质显见。

表面等离子体共振(Biacore)

使用表面等离子体共振(Biacore 2000；Biacore，Uppsala，Sweden)如最近对UspA1/2-C4BP相互作用所述那样[58]进一步分析UspA1^50-770或UspA2^30-539与C3之间的相互作用。使用由Biaevaluation软件(Biacore)提供的稳态亲和力模式，从结合曲线中计算KD(平衡解离常数)，其中所述的结合曲线显示的对浓度的平衡反应。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

微量滴定平板(Nunc-Immuno Module；Roskilde，丹麦)用40nM纯化的重组UspA1^50-770、UspA2^30-539或截短的UspA1及UspA2片段(75mM碳酸钠，pH9.6)一式三份在4℃包被过夜。平板用洗涤缓冲液(具有的0.1％Tween 20的PBS，pH7.2)洗涤四次并用补充1.5％卵清蛋白的洗涤缓冲液(封闭缓冲液)在室温封闭2小时。在洗涤后，板孔与封闭缓冲液内的0.25μgC3met在4℃温育过夜。此后，将平板洗涤与封闭缓冲液内的山羊抗人C3在室温下温育1小时。在额外的洗涤后，添加HRP缀合驴抗山羊pAb，在室温又温育1小时。将板孔洗涤四次并使平板显色以及在OD₄₅₀上测量。

溶血测定

兔红细胞用含有0.1％(wt/vol)明胶、7mM MgCl₂、10mM EGTA和2.5％葡萄糖(Mg⁺⁺EGTA)的冰冷2.5mM Veronal缓冲液，pH7.3洗涤三次，并重悬为浓度0.5×10⁹个细胞/ml。红细胞与稀释于Mg⁺⁺EGTA内的多种浓度(0至4％)的血清温育。在37℃ 1小时后，将红细胞离心，并且裂解的红细胞数通过在405nm上的分光光度法测量已释放的血红蛋白而确定。对于用UspA1和UspA2的抑制，将10％血清与100nM的重组UspA1^50-770蛋白和/或UspA2^30-539蛋白质37℃预温育30分钟，并且随后添加到浓度0至4％的红细胞内。

多形核白细胞的分离和吞噬

人多形核白细胞(PMN)使用中分子右旋糖酐(Pharmalink AB，Upplands V

sby，瑞典)从健康志愿者新鲜血液中分离。将PMN在300g上离心10分钟，在PBS内洗涤并重悬于RPMI 1640培养基(Life Technologies，Paisley，苏格兰)内。细菌混悬液(0.5×10⁸)用3％的NHS或NHS-EDTA，或20μg纯化的C3met在37℃调理15分钟。洗涤后，将细菌与PMN(1×10⁷个细胞/ml)在细菌/PMN比10∶1下混合，随后在37℃以持续滚转方式温育。通过活力计数确定在温育0、30、60和120分钟后的存活细菌。将NHS处理的被吞噬的细菌数与在NH不存在下的被吞噬的细菌数比较。使用以NHS调理的金黄色葡萄球菌作为阳性对照。

实施例和结果

卡他莫拉氏菌和纤连蛋白间的相互作用

缺少UspA1和A2的卡他莫拉氏菌不结合可溶性或固定化的纤连蛋白

我们随机选择一组卡他莫拉氏菌临床菌株(n＝13)(表7)并通过流式细胞术分析对它们测试与其UspA1/A2表达相关的纤连蛋白结合作用。如高的平均荧光密度(MFI)所测定的高UspA1/A2表达与UspA1/A2表达相关(Pearson相关系数0.77，P＜0.05)(图1A)。然而，用我们的抗UspA1/A2pAb不可能区分UspA1表达与UspA2表达。此外，对结合作用有贡献的UspA2H蛋白质不可能存在，因为在本研究内中所有菌株内未找到uspA2H基因(数据未显示)。

还通过流式细胞术分析了两株卡他莫拉氏菌分离株(BBH18和RH4)及其缺少UspA1、UspA2或这两种蛋白质的特定突变体。卡他莫拉氏菌BBH18强烈地结合纤连蛋白，平均荧光密度(MFI)是96.1(图1F)。相反，BBE18ΔuspA1显示减少的纤连蛋白结合作用，MFI是68.6(图1G)。对BBH18ΔuspA2及双突变体BBH18ΔuspA1/A2的纤连蛋白结合作用分别仅显示10.7和11.5的MFI(图1H，1I)。用卡他莫拉氏菌临床菌株RH4的UspA1/A2突变体得到相似的结果。总之，这些结果表明UspA1和A2结合纤连蛋白并且表明细菌结合纤连蛋白的能力强烈依赖于UspA1/A2表达。

为进一步分析纤连蛋白与卡他莫拉氏菌间的相互作用，将¹²⁵I-标记的纤连蛋白与两株卡他莫拉氏菌临床分离株(BBH18和RH4)及其对应突变体温育。野生型卡他莫拉氏菌RH4强烈地结合¹²⁵I-纤连蛋白，而对应的ΔuspA1突变体显示80％的野生型结合作用。相反，ΔuspA2和双突变体分别以略高于背景水平(5.0至10％)的14％和12％的野生型结合作用结合¹²⁵I-纤连蛋白(图2)。用卡他莫拉氏菌BBH18和对应的UspA1/A2突变体得到相似的结果。因此，我们的结果表明UspA1和A2均是卡他莫拉氏菌最大程度结合可溶性纤连蛋白所需要的。

为研究细菌与固定化纤连蛋白的结合，卡将他莫拉氏菌RH4及其对应的ΔuspA1/A2突变体施加至纤连蛋白包被的载玻片。在温育2小时后，洗涤载玻片并随后进行革兰氏染色。发现卡他莫拉氏菌野生型和ΔuspA1突变体强烈地黏附至纤连蛋白包被的载玻片(图3A和3B)。相反，卡他莫拉氏菌ΔuspA2和ΔuspA1/A2双突变体微弱地黏附至纤连蛋白包被地载玻片，洗涤后仅留下少量细菌(分别见图3C和3D)。用另一种卡他莫拉氏菌临床分离株(BBH18)及其衍生性突变体的实验显示类似的模式，表明UspA2对卡他莫拉氏菌与固定化的纤连蛋白结合是非常重要的。

纤连蛋白结合结构域包括位于UspA1的299和452之间和UspA2的 165和318之间的氨基酸残基

为进一步分析UspA1和A2与纤连蛋白的相互作用，将截短的UspA1^50-770和UspA2^30-539在大肠杆菌内重组地产生，包被在微量滴定平板上并与递增浓度的纤连蛋白温育。结合的纤连蛋白用抗人纤连蛋白pAb检测，随后与辣根过氧化物酶缀合的抗兔pAb温育。重组UspA1^50-770和UspA2^30-539均结合可溶性纤连蛋白并且相互作用是剂量依赖性的(图4)。

为确定UspA1的纤连蛋白结合结构域，制造了覆盖UspA1^50-770完整分子的重组蛋白。将纤连蛋白与固定化的UspA1蛋白质片段温育并且通过ELISA对相互作用定量。UspA1^50-491几乎如UspA1^50-770那样对纤连蛋白的高效结合表明该结合结构域位于此蛋白质的该部分内。在其它的截短片段中，UspA1^299-452高效地结合纤连蛋白(图5A)。平行地，分析纤连蛋白与包括氨基酸UspA2^30-539的数种重组UspA2片段间的相互作用。两种片段UspA2^101-318和UspA2^165-318强烈地结合纤连蛋白(图5B)。我们的发现提供如此证据，即结合结构域包含在UspA1^299-452和UspA2^165-318内找得到的残基。在这两种结合性片段之间的序列比较表明UspA1和A2有31个氨基酸残基″DQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLK″相同(图6)。此外，这种重复序列也在卡他莫拉氏菌BBH18和RH4的UspA1和A2基因内找到(数据未显示)。

UspA1^50-491和UspA1^299-452片段竞争性地抑制卡他莫拉氏菌的纤连蛋白结合作用

为进一步验证我们在UspA1/A2纤连蛋白结合结构域上的发现，对重组的截短UspA1蛋白质测试它们阻断纤连蛋白与卡他莫拉氏菌结合的能力。纤连蛋白(2μg)与0.25微摩尔重组UspA1片段预温育并随后与卡他莫拉氏菌温育。最终，通过流式细胞术测量卡他莫拉氏菌的UspA依赖性纤连蛋白结合。与UspA1^50-491和UspA1^299-452的预温育导致减少的纤连蛋白结合，对于UspA1^50-491而言，减少95％并且对UspA1^299-452而言，减少63％(图7)。当纤连蛋白与截短的UspA2^101-318预温育时，产生50％抑制。

因此，UspA1和A2的纤连蛋白结合结构域阻断了纤连蛋白与卡他莫拉氏菌间的相互作用。

UspA1^299-452和UspA2^165-318抑制卡他莫拉氏菌黏附至Chang上皮细胞

已知上皮细胞表达纤连蛋白并且众多细菌通过细胞结合的纤连蛋白结合至上皮细胞上[46、54、69、77]。先前的研究已经证实卡他莫拉氏菌与上皮细胞黏附[43、49]。我们分析了经常在用呼吸道病原体的黏附实验中使用的Chan结膜细胞。Chang细胞高度表达纤连蛋白，如由流式细胞术分析所显示(图8A)。

为分析UspA依赖性纤连蛋白结合作用对细菌黏附是否重要，将Chang上皮细胞与抗人纤连蛋白pAb或重组蛋白UspA1^299-452和UspA2^165-318预温育。此后，添加卡他莫拉氏菌RH4并分析细菌黏附。与每200μl的0.4μ摩尔UspA1^299-452、UspA2^165-318或抗人纤连蛋白pAb预温育后的相对黏附(通过集落形成单位的数目测量)分别是36％、35％和32％。较高浓度的重组肽没有导致进一步抑制。相反，非纤连蛋白结合性片段UspA1^433-580和UspA2^30-177不抑制卡他莫拉氏菌与Chang上皮细胞间的相互作用(图8B)。因此，在Chang上皮细胞上的纤连蛋白可以起到卡他莫拉氏菌受体的作用并且UspA1的氨基酸残基299-452和UspA2的氨基酸残基165-318含有负责这种相互作用的配体。

卡他莫拉氏菌与层粘连蛋白之间的相互作用

卡他莫拉氏菌通过UspA1和A2结合层粘连蛋白

通过完整细胞ELISA分析两株卡他莫拉氏菌临床分离株(BBH18和RH4)及其缺少UspA1、UspA2或这两种蛋白质的特定突变体。卡他莫拉氏菌RH4强烈地结合至固定化的层粘连蛋白(图9A)。相反，卡他莫拉氏菌RH4 uspA1突变体(RH4ΔuspA1)粘连蛋白层结合作用显示为野生型的89.9％。卡他莫拉氏菌RH4 uspA2突变体(RH4ΔuspA2)及双突变体RH4ΔuspA1/A2结合能力分别显示为野生型的15.2％和18.1％。这与对BSA所包被平板的残余黏附无显著差异。用源自卡他莫拉氏菌临床菌株BBH18的UspA1/A2突变体得到相似的结果。在这两种菌株(BBH18和RH4)中，与UspA1相比，UspA2是优势表达的蛋白质，这解释了野生型与RH4ΔuspA1间在结合作用方面的细微差异。总之，这些结果显示UspA1和A2结合层粘连蛋白。

为进一步分析UspA1/A2与层粘连蛋白间的结合，将截短的UspA1^50-770和UspA2^30-539在大肠杆菌内产生。将重组蛋白包被在微量滴定平板上并与递增浓度的层粘连蛋白温育。结合的层粘连蛋白用兔抗层粘连蛋白pAb检测，随后与HRP缀合抗兔pAb温育。重组UspA1^50-770和UspA2^30-539均强烈地结合可溶性层粘连蛋白并且结合具有剂量依赖性和饱和性(图9B)。

为确定UspA1的层粘连蛋白结合结构域，制造了覆盖完整分子的重组UspA1和A2。将层粘连蛋白与固定化的截短UspA1和A2片段温育并且通过ELISA进行定量。UspA150-491几乎如UspA1^50-770那样对层粘连蛋白的高效结合表明该结合结构域位于此蛋白质的该部分内。然而，在覆盖该区域的其它截短片段中，似乎没有其它片段结合层粘连蛋白。与全长蛋白质相比，氨基末端部分即UspA230-351能够保留44.7％的结合能力。较短的蛋白质UspA230-177显示43.7％的结合能力(图10B)。这些结果表明这个结合结构域包括在UspA1和UspA2的氨基末端内均找得到的残基。

卡他莫拉氏菌与C3和C3met之间的相互作用

卡他莫拉氏菌外膜蛋白UspA1和UspA2既抑制补体级联的经典途径，又抑制旁路途径

UspA2的表面表达对正常人血清(NHS)内的卡他莫拉氏菌存活至关重要[1，58]，即莫拉氏菌UspA2缺陷突变体在接触NHS时被迅速杀死。我们最近已经证实UspA1和A2均结合C4BP并且因此可能抑制补体活化的经典途径[58]。为进一步阐明卡他莫拉氏菌与补体系统的相互作用。在用添加MgCl2的EGTA(Mg-EGTA)处理或用EDTA处理的血清内进行研究UspA1/A2双突变体的存活。Mg-EGTA抑制经典途径和凝集素途径，并且因此允许分别分析旁路途径。相反，EDTA通过吸附二价阳离子(Mg2+和Ca2+)而抑制所有补体途径。卡他莫拉氏菌RH4野生型在温育30分钟后存活，而RH4ΔuspA1/A2双突变体在接触NHS的10分钟后被杀死(图12)。当经典途径受到抑制(NHS+Mg-EGTA)时，与无任何螯合剂的NHS相比，RH4ΔuspA1/A2突变体的存活时间显著较长，但是不及野生型细菌的存活时间。此外，当用EDTA阻断经典途径和旁路途径时，卡他莫拉氏菌RH4ΔUspA1/A2存活。类似的模式用卡他莫拉氏菌BBH18分离株及对应的BBH18 ΔUspA1/A2突变体(未显示)得到。平行地，用C1q和因子D/备解素缺陷型血清的实验证实经典途径和旁路途径均受卡他莫拉氏菌抑制(未显示)。因此，卡他莫拉氏菌(一种经常定植于人呼吸道内的病原体)通过外膜蛋白UspA1和A2不仅对抗补体系统的经典途径，还对抗旁路途径。

卡他莫拉氏菌吸附来自EDTA灭活的血清中的C3

C3b共价地与微生物表面结合并且因此诱导旁路途径(图11B)。为分析卡他莫拉氏菌是否可与C3相互作用，将我们的RH4野生型菌株与NHS或经EDTA处理的NHS温育。用识别C3和C3b的抗C3d多克隆抗体(pAb)，通过流式细胞术分析检测C3/C3b在卡他莫拉氏菌RH4细菌表面的结合或沉积(通过共价键)。细菌与含完好补体的NHS的温育引起C3沉积(图13)。有意思的是，当补体级联在EDTA下被灭活时，卡他莫拉氏菌RH4仍结合C3(图13A)。包括用于比较的肺炎链球菌不吸附来自经EDTA处理的血清内的C3(图13B)。与肺炎链球菌不同，卡他莫拉氏菌则结合C3，无论补体活化与否。C3的内部硫酯在液相中被自发地水解成C3(H₂O)。因此，完好的C3或C3(H₂O)是最可能存在的与卡他莫拉氏菌相互作用的C3形式。由于卡他莫拉氏菌也结合C4BP[58]，我们想排除C4BP参与C3结合作用，并且为此目的，我们使用C4BP耗尽血清。卡他莫拉氏菌如对NHS那样的相同程度吸附来自C4BP耗尽血清中的C3(未显示)。

C3met对卡他莫拉氏菌的结合是剂量依赖性和非共价性的

我们的实验表明C3与卡他莫拉氏菌表面结合，无论补体活化与否。因此，我们分析无功能性的已转化C3是否可能与该细菌结合。天然C3从人血清中纯化并用甲胺处理，其中甲胺将C3转换成与C3b等效的C3met分子，其中C3met分子没有与微生物共价结合的能力(图11C)。流式细胞术分析揭示卡他莫拉氏菌RH4野生型菌株以剂量依赖性及可饱和性方式高效地结合C3met(图14A和B)。这种相互作用不由C3分子的C3a部分介导，因为C3b和C3(H₂O)也结合卡他莫拉氏菌(未显示)。卡他莫拉氏菌RH4与C3met间的结合很大程度上基于离子性相互作用，因为递增浓度的NaCl抑制这种相互作用(图14C)。用卡他莫拉氏菌BBH18野生型菌株得到相似的结果(未显示)。

为确定C3的结合是否为全部卡他莫拉氏菌菌株的一般特点，我们随机选择一系列临床分离株(n＝13)并分析它们结合C3met的能力。所分析的全部卡他莫拉氏菌菌株结合C3met，如用抗C3d pAb通过流式细胞术分析所示。Mfi值是4至39。然而，包括用于比较的肺炎链球菌及大肠杆菌不结合C3met。

卡他莫拉氏菌是独特的结合C3和C3met的细菌

为扩展我们对细菌吸附来自NHS内C3的分析，将相关的莫拉氏菌亚种(n＝13)以及常见的人病原体(n＝13)在NHS-EDTA存在下进行温育。有意义的是，在全部测试的细菌物种中，卡他莫拉氏菌是结合灭活补体的血清内C3的仅有细菌(表9)。也对全部相关的莫拉氏菌菌株以及其它人病原体分析C3met的结合作用。与C3结合作用相一致，卡他莫拉氏菌是结合C3met的仅有物种。总之，卡他莫拉氏菌具有以非共价方式强烈地结合C3和C3met的独特特性。

卡他莫拉氏菌通过外膜蛋白UspA1和UspA2结合C3met

为确定负责C3结合作用的卡他莫拉氏菌蛋白质，我们测试了一系列缺少外膜蛋白MID、UspA1和/或UspA2的细菌突变体[22、58]。有意义的是，C3met的结合作用与Usp表达显著相关(图15)。卡他莫拉氏菌RH4Δmid以如野生型对应物那样的相同程度结合C3met(图15A-B)。RH4ΔuspA1突变体仅显示轻微下降的结合作用，而与野生型对应物相比，RH4ΔuspA2是更弱的结合物(图15C-D)。与此同时，C3met与RH4ΔUspA1/A2双突变体结合被彻底消除(图15E)。此外，当使用NHS-EDTA开展相同实验，观察到相同的模式(图15F-J)。当使用正常人血清时，全部突变体均在其表面显示相似量的C3，因为这是C3共价性沉积和结合的综合结果(图15K-O)。用卡他莫拉氏菌BBH18分离株及对应的BBH18突变体得到相似的结果。

为了进一步分析C3与UspA1/A2之间的相互作用，将UspA1^50-770和UspA2^30-539在大肠杆菌内产生并纯化。将重组蛋白点样印迹至硝酸纤维素膜上，随后与碘标记的C3met温育。将从卡他莫拉氏菌外膜蛋白MID[59]中衍生的重组MID^962-1200包括在内作为阴性对照。检测到对UspA1^50-770的微弱结合，而[¹²⁵I]-C3met强烈地与UspA2^30-539结合(图16A)。使用表面等离子体共振(即Biacore)，这些结果得到进一步支持。将UspA1^50-770和UspA2^30-539使用氨基偶联法固定在CM5芯片的表面并且注射C3met直至达到饱和。对于C3met与UspA2^30-539或与UspA1^50-770间的相互作用的k_D分别是3μM和14μM。总之，我们发现UspA2是卡他莫拉氏菌的主要C3met结合蛋白，而UspA1对结合作用有较低程度的贡献。

C3结合结构域位于UspA2的氨基酸残基200和458间。

为确定UspA2的C3结合结构域，制造了覆盖UspA2^30-539完整分子的重组蛋白。将C3met与固定化的全长UspA1^50-770、UspA2^30-539和一系列截短的UspA2蛋白质温育。随后，通过ELISA对相互作用定量。与点印迹实验(图16A)一致，UspA1^50-770在ELISA中以与UspA2^30-539相比的极低程度结合C3met(图16B)。在截短的蛋白质片段当中，UspA2^165-318、UspA2^200-539和UspA2^302-458高效地结合C3met，表明结合结构域位于氨基酸残基200与458内。

重组UspA1/A2中和C3活性

为更详细检验UspA1/A2依赖性抑制旁路途径的作用，用这样的细菌开展一系列流式细胞术实验，其中所述的细菌与10％NHS或与已经同100nM重组UspA1^50-770和UspA2^30-539预温育的血清温育。有意义的是，当NHS用UspA1^50-770和UspA2^30-539预处理时，观察到在卡他莫拉氏菌RH4ΔuspA1/A2表面上显著减少的C3沉积/结合(图17A)。当经典途径用Mg-EGTA彻底切断时，得到相似的结果(图17B)。因此，重组蛋白UspA1^50-770和UspA2^30-539吸附了来自NHS的C3并抑制C3的沉积/结合。

为确定因重组UspA1^50-770和UspA2^30-539所致的C3吸附是否增加细菌存活，将双突变体卡他莫拉氏菌RH4ΔUspA1/A2与补加UspA1^50-770和UspA2^30-539的血清温育，随后测定存活细菌数。反应中包括Mg-EGTA以便抑制经典途径。有意义的是，向NHS添加重组UspA1^50-770和UspA2^30-539阻止对UspA1/A2缺陷型卡他莫拉氏菌的杀伤(图17C)。如与UspA1^50-770相比，UspA2^30-539最有效地抑制杀伤细菌。当将两种重组蛋白共同补加时，未检测到额外的旁路途径抑制。10％NHS对应于大约600nM的C3。为研究更多的UspA1分子是否可以中和C3活性，添加UspA1^50-770和/或UspA2^30-539直至多达600nM。然而，更高浓度的重组蛋白未进一步增加抑制作用(未显示)。

还包括由兔红细胞和NHS组成的旁路途径溶血测定法，以便确立UspA1和A2作为旁路途径抑制物的作用。NHS与重组UspA1^50-770、UspA2^30-539或这两种蛋白质一起预温育，随后添加红细胞。在1小时温育后，测定红细胞裂解的量。有意义的是，当NHS与UspA1^50-770或UspA2^30-539预温育时，如与未处理的NHS相比，观察到显著减少的溶血(图18)。与UspA2^30-539或UspA1^50-770存在下的细胞存活增加相一致(图17C)，如与NHS同UspA1^50-770的预温育相比，单独与UspA2^30-539的预温育引起更有效的旁路途径抑制。得到的结论是，重组UspA1^50-770或UspA2^30-539因其捕获C3的能力而干扰旁路途径的活性。

除了作为补体级联中的关键分子以外，沉积的C3b和iC3b(灭活的C3b)在调理吞噬过程中引导微生物以便清除。为研究非共价地在卡他莫拉氏菌表面结合的C3或C3met是否依然能够作为调理素发挥功能，开展一系列吞噬实验。将卡他莫拉氏菌与C3met、NHS或经EDTA处理的NHS预温育，随后添加多形核白细胞。有意义的是，在C3met存在下，卡他莫拉氏菌未被吞噬，而NHS强烈地促进吞噬(数据未显示)，然而，当NHS用EDTA预处理时，卡他莫拉氏菌不被多形核白细胞吞噬。因此，C3/C3met在卡他莫拉氏菌细胞表面上是无活性的并且不作为调理素发挥作用。

讨论

卡他莫拉氏菌和纤连蛋白之间的相互作用

来自卡他莫拉氏菌临床菌株Bc5的UspA1^299-452和UspA2^165-318是仍然结合纤连蛋白的最短片段。有意义的是，包含在UspA1^299-452和UspA2^165-318内找到的基酸序列的较长片段对纤连蛋白表现更有效的结合(图5A和B)。这可能意味着这两个区域代表部分的结合结构域或结合位点高度依赖于特定的分子结构。UspA1^299-452和UspA2^165-318共有含31个相同氨基酸残基的序列，包括23个残基″NNINNIYELAQQQDQHSSDIKTL″(NNINNIY序列)。该序列含有保护性单克隆抗体(mAb)17C7的表位，其中该单克隆抗体对此表位存在普遍反应性[2、50、30]。在小鼠模型中，采用mAb 17C7的被动免疫提供保护和改善的卡他莫拉氏菌肺部清除[30]。因此最有意义的是，UspA1/A2纤连蛋白结合结构域含有这些残基并为该区域在卡他莫拉氏菌呼吸道感染病理中的重要性提供证据。

本实验中所用的纤连蛋白结合性卡他莫拉氏菌BBH18和RH4还在它们UspA1/A2蛋白内携带31个氨基酸残基。大多数卡他莫拉氏菌具有该序列的部分(即NNINNIY序列)。然而在其UspA2基因内具有NNINNIY序列的菌株如O35E则不表达纤连蛋白结合性UspA2蛋白质[49]。可能的解释是在侧翼区域内变异可能影响与纤连蛋白的相互作用。此外，保守的NNINNIY序列本身可以具有少量的单个氨基酸碱基改变[28]。因此有可能纤连蛋白结合作用不仅依赖于UspA1/A2表达，还依赖于每种UspA蛋白质的个体组成。有意义的是，可以在(卡他莫拉氏菌TTA37和O46E)具有黏附特性的杂合蛋白UspA2H内找到几乎相同的氨基酸序列[43]。这支持我们的发现，即这个31氨基酸序列在黏附作用是重要的。

在我们最后一组实验中，我们测试卡他莫拉氏菌对Chang结膜细胞的黏附是否受纤连蛋白结合性片段(UspA1^299-452和UspA2^165-318)抑制(图8B)。与UspA1^299-452、UspA2^165-318或抗纤连蛋白pAb的预温育导致与Chang上皮细胞结合减少。这些结果证实这些结合结构域在UspA1/A2与Chang上皮细胞的相互作用中的重要性并且还表明纤连蛋白是UspA的重要受体。此外，已知FnBP促进细菌黏附于未分化及受损伤的气道[54、69]。肺成纤维细胞的纤连蛋白表达还因香烟提取物而增加[87]。卡他莫拉氏菌UspA1/A2对ECM纤连蛋白或上皮细胞结合性纤连蛋白的结合作用因此在COPD患者内是极为重要的，并且可以解释这类患者内常见发生的卡他莫拉氏菌感染[40]。

总之，我们已经证实卡他莫拉氏菌BBH18、RH4和Bc5的UspA1/A2是至关重要的FnBP。来源于Bc5的重组UspA1和A2以这样的结合结构域结合纤连蛋白，其中所述的结合结构域共有包括保守NNINNIY序列在内的相同氨基酸残基。此外，卡他莫拉氏菌UspA1/A2与上皮细胞的相互作用借助了细胞结合性纤连蛋白。确定这些纤连蛋白结合结构域因此是开发抗卡他莫拉氏菌疫苗的重要步骤。

卡他莫拉氏菌和层粘连蛋白之间的相互作用

卡他莫拉氏菌是COPD患者内感染性恶化的常见病因。该物种在COPD患者内的成功感染可能部分地与其繁多的全套黏附素有关。此外，吸烟者中存在病理性改变如上皮完整性丧失及基膜暴露，其中层粘连蛋白层本身增厚[4]。已经证实一些病原体能够结合层粘连蛋白并且因此可能促进了这些病原体黏附至这类受损及裸露的粘膜表面的能力。这些病原体包括已知在气道内导致明显疾病的病原体，如其中有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌[7，63]。

我们最近证实UspA1和A2均结合纤连蛋白[78]。纤连蛋白结合结构域位于UspA1^299-452和UspA2^165-318内。在本研究中，氨基末端部分UspA1^50-491和UspA2^30-351(含有纤连蛋白结构域)也结合层粘连蛋白。然而，结合纤连蛋白的最小片段即UspA1^299-452和UspA2^165-318不以任何可觉察的程度结合层粘连蛋白。事实上，比UspA1氨基末端部分(UspA1^50-491)更小的片段丧失其全部的层粘连蛋白结合能力，而对于UspA2，仅UspA2^30-170结合层粘连蛋白，尽管比完整重组蛋白(UspA2^30-539)结合水平更低。这些发现表明分子的不同部分可能具有不同的功能作用。

然而比较UspA1和A2中最小的层粘连蛋白结合区域，我们发现就氨基酸同源性而言在UspA2^30-170与UspA1^50-491之间很少存在相似性(数据未显示)。这并不令人惊讶，因为已知这两种蛋白质具有′棒棒糖′形的球状头结构，尽管在两种蛋白质的氨基末端部分内仅有22％同一性[2，32]。我们推测三级结构可能影响该头状区域内与层粘连蛋白在体内的相互作用。结合结构域位于氨基末端将合乎逻辑的，因此这里是暴露最充分及在体内与人基膜接触最密切的位置。

将介导对组织和细胞外基质(ECM)成分黏附的细菌性因子共同划分成名为“微生物表面成分识别黏附基质分子”(MSCRAMMS)的单一家族，由于UspA1/A2既结合纤连蛋白，又结合层粘连蛋白，故这些蛋白质可以命名为MSCRAMMS。我们的结果表明UspA1和A2是以不同的结构域与呼吸道内不同配体相互作用的多功能黏附素。已经报道过其它细菌蛋白质具有类似的广谱结合性图谱，如小肠结肠炎耶尔森氏菌的与UspA1和A2具有结构相关性的YadA[45，70]。YadA也同时结合纤连蛋白和层粘连蛋白[32]。

总之，我们已经证实UspA1/A2对卡他莫拉氏菌与基膜糖蛋白层粘连蛋白的相互作用是至关重要的并且这在COPD患者内的感染病理中将具有重要作用[74]。

卡他莫拉氏菌与C3和C3met之间的相互作用

补体抗性是最重要的细菌毒力因子之一[66]。来自下部呼吸道感染患者的大部分(89％)卡他莫拉氏菌分离株抗补体介导性杀伤作用[34]。卡他莫拉氏菌UspA1和A2对细菌在体内存活于人血清内是至关重要的[1，15]，并且我们已经证实这两种外膜蛋白与经典途径的补体液相调节物C4BP结合[58]。在本研究中，我们证实卡他莫拉氏菌可以通过非共价地结合C3而抑制旁路途径(图17和18)。对C3的结合最有可能还抑制经典途径。然而，这未经详细分析，因为卡他莫拉氏菌也结合C4BP。有意义的是，卡他莫拉氏菌依赖性C3结合作用是独特的，因为数个相关的莫拉氏菌亚种以及常见人病原细菌不结合C3(表9)。与C3和甲胺处理C3的相互作用主要由UspA2介导，而UspA1发挥很少作用(图15和16)。UspA2的C3结合区域位于氨基酸残基200至458之间。该区域含有与UspA1内的某区域具有93％同一性的一段140个氨基酸残基[2]。然而，尽管有这种序列相似性，UspA1却以低得多的程度结合C3。这可能归因于蛋白质间在构象上的具体差异。UspA1与UspA2在C3结合作用上的差异同UspA1/A2与C4BP的相互作用形成鲜明对比[58]。

卡他莫拉氏菌同等地抵抗经典途径和旁路途径(图12B)。该细菌结合了抑制经典途径的C4BP[58]，并且在本文中，我们证实与旁路途径的相互作用借助于对C3的结合。确定这些机制中的哪个机制在体内各种环境下对卡他莫拉氏菌的血清抗性最重要是困难的。例如，经典途径的重要性将主要取决于卡他莫拉氏菌的感染史和产生补体活化性抗体的能力。不过，提供保护以避开补体的每种机制对病原体当然是有益的。由于C3是补体系统内到关键分子，对C3的结合最有可能造成调节全部三种活化途径并且可能对血清抗性的贡献最大。

补体系统作为初级防御机制的重要性由微生物已经发展出干扰或中和补体系统诸成分的多种策略的事实所反映[42，35，88]。除卡他莫拉氏菌以外，酿脓链球菌、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、大肠杆菌K1、白假丝酵母(Candida albicans)和淋病奈瑟氏球菌均表达结合C4BP的特定表面分子并且因此保护细菌免受经典补体途径作用[8，9，52，58，64，65，80]。此外，为抑制经典途径，数种细菌(例如白假丝酵母、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidies)、酿脓链球菌和肺炎链球菌(综述见[68，89])结合因子H和因子H-样分子，并且因此被部分地保护免受抗旁路补体途径作用。

UspA1和A2吸附来自血清的C3并且因而最有可能抑制补体活化。类似地，肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)似乎在体外或体内均抑制旁路途径。PspA是肺炎链球菌的重要毒力因子。PspA缺陷的肺炎链球菌菌株将立即从血液中清除，而表达PspA的菌株存活[82]。此外，在菌血症的小鼠模型中，PspA缺陷的肺炎链球菌与表达PspA的肺炎链球菌相比，具有显著降低的毒力[11]。已经证实C3b在PspA阴性的肺炎链球菌上比在PspA阳性的肺炎链球菌上更多地沉积[67，82]。因此，PspA的表达通过限制由C3b所致的调理作用而减少肺炎链球菌的补体介导性清除及吞噬[12，67]。在正常小鼠内无毒力的PspA缺陷型肺炎链球菌在C3缺陷和因子B缺陷小鼠内变成有毒力的[82]。

据我们所知，目前仅有非共价地结合C3并因此干扰补体功能的两种细菌蛋白质的实例。其一是金黄色葡萄球菌的细胞外细胞血纤蛋白原结合蛋白(Efb)，其中发现该结合蛋白结合C3b[44]。Efb以硫酯构象不依赖性方式抑制经典途径和旁路途径，即对C3b结合是非共价的。第二个实例是肺炎链球菌的胆碱结合蛋白(CbpA)，已经证实该蛋白结合甲胺处理的C3，表明这是不依赖于补体活化的非共价性相互作用[16]。CbpA是肺炎链球菌细胞壁的成分，但是仅当CbpA分泌时才可以结合C3。为验证文献中并没有充分建立的这个假设，我们通过流式细胞术对11株不同的肺炎链球菌分离株分析C3结合作用(甲胺处理的C3或NHS-EDTA)(图12B和表9)。在肺炎链球菌表面不能检测到结合的C3。当使用甲胺处理的C3，随后用抗人C3 pAb在蛋白质印迹中分析肺炎链球菌的裂解物和培养上清液时，我们证实了Cheng及其合作者的结果[16](未显示)。根据Efb和CbpA(均是两种革兰氏阳性细菌分泌的C3结合蛋白)，革兰氏阴性卡他莫拉氏菌是具有在细菌表面上结合C3并抑制旁路途径的膜锚定性蛋白质的独特物种。

已经证实白假丝酵母结合C3b、iC3b和C3d。然而，C3b以比iC3b和C3d低得多的亲和力结合[29]。我们发现C3与卡他莫拉氏菌结合及与白假丝酵母结合之间寻在巨大差异(未显示)；尽管假丝酵母结合C3met(56％阳性细胞)，但与卡他莫拉氏菌的mfi36.9相比，其平均荧光密度(mfi)仅小于2.0。此外，当白假丝酵母与经EDTA处理的血清温育时，未见到可检测的结合。两种C3d结合蛋白已经从白假丝酵母中分离并且表征最充分的蛋白质是最初由抗人补体受体2(CD21)抗体识别的60kD甘露糖蛋白[13]。然而，卡他莫拉氏菌UspA1和A2不被抗CD21的多克隆抗体识别(未显示)。与葡萄球菌和肺炎链球菌[52，64]一致的是还存在来自白假丝酵母的分泌型C3d结合蛋白[72]。最后，白假丝酵母iC3b受体已经得到分离并且它在结构上与人CR3(CD11b)类似[3]。并未充分了解这些受体参与病理的可能机制。

以上C3结合性病原体实例与卡他莫拉氏菌明显不同在于这些物种经常是血流分离株。卡他莫拉氏菌是具有菌血症感染的罕见抗性的粘膜性病原体。因此，结合并灭活C3最有可能在粘膜表面发生。这受到如此事实支持，即在疾病状态如急性中耳炎中存在强烈持久的补体活化以及继发炎症[57]。据信补体蛋白质因血浆渗出而被转运到粘膜表面[26，62]。例如在来自儿童的中耳渗出物(MEE)中，还可以发现浓度大幅度升高的C3产物[51]。此外，已经证实MEE液体内的补体因子对于抗其它粘膜病原体如不可分型的流感嗜血杆菌的杀菌活性是重要的[75]。卡他莫拉氏菌是严格的人病原体。它不在动物内引起疾病如中耳炎或肺炎。已经在数例中使用了小鼠肺部清除模型和灰鼠(chinchilla)中耳炎模型。然而，中耳炎或肺炎均未发生并且细菌被迅速清除[19，83]。因此在体内检测细菌性C3结合的生物学意义是困难的。由于UspA1和A2是多功能蛋白质[1，15，31，43，58，78]，不可能把卡他莫拉氏菌清除方面的任何差异与C3结合作用联系起来。如此事实尤其最有可能影响清除率，即UspA1是卡他莫拉氏菌的重要黏附素并结合CEACAM1和纤连蛋白[31，78]。然而，因为在疾病状态如中耳炎中的强烈补体活化，C3的莫拉氏菌依赖性结合可能代表对付粘膜防御的重要途径。

卡他莫拉氏菌以数种方式阻碍人免疫系统的事实可以解释为何卡他莫拉氏菌是如此常见的呼吸道栖居者[73]。总之，卡他莫拉氏菌已经发展出对付体液免疫系统和天然免疫系的复杂途径。现有数据表明卡他莫拉氏菌在细菌细胞表面具有其它细菌物种内所不能找到的独特的C3结合能力。

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Claims

1.氨基酸序列为序列号2的肽。

2.氨基酸序列为序列号3的肽。

3.根据权利要求1至2任一项的至少一种肽的用途，用于产生用来治疗或预防由卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)引起的感染的药物。

4.根据权利要求3的用途，其中所述感染是中耳炎、鼻窦炎或下呼吸道感染。

5.包含纤连蛋白结合结构域的配体，其中所述配体的氨基酸序列为序列号2或序列号3的氨基酸序列。

6.药物，其包含根据权利要求5所述的一种或多种配体和一种或多种可药用的辅药、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或防腐剂。

7.疫苗，其包含根据权利要求5所述的一种或多种配体和一种或多种可药用的辅药、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或防腐剂。

8.药用有效量的根据权利要求6或7所述的药物或疫苗的用途，用于生产治疗或预防个体感染的药物，其中所述感染由卡他莫拉氏菌引起。

9.核酸，其序列编码权利要求1或2的肽或权利要求5的配体。