EA014352B1 - Взаимодействие moraxella catarrhalis с эпителиальными клетками, внеклеточными матриксными белками и системой комплемента - Google Patents
Взаимодействие moraxella catarrhalis с эпителиальными клетками, внеклеточными матриксными белками и системой комплемента Download PDFInfo
- Publication number
- EA014352B1 EA014352B1 EA200800565A EA200800565A EA014352B1 EA 014352 B1 EA014352 B1 EA 014352B1 EA 200800565 A EA200800565 A EA 200800565A EA 200800565 A EA200800565 A EA 200800565A EA 014352 B1 EA014352 B1 EA 014352B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- azp
- bei
- azr
- thb
- buz
- Prior art date
Links
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title abstract description 29
- 230000004154 complement system Effects 0.000 title abstract description 12
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 title abstract description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 title abstract description 9
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 title abstract 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 title description 44
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 163
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 163
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 156
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 155
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 107
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 99
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 77
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 47
- 101100293276 Caenorhabditis elegans cra-1 gene Proteins 0.000 claims description 25
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 23
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 22
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 claims description 22
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 claims 2
- 101100397224 Bacillus subtilis (strain 168) isp gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100052502 Shigella flexneri yciB gene Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- -1 auxiliaries Substances 0.000 claims 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 claims 1
- 101150064873 ispA gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 abstract description 82
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 abstract description 82
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 74
- 239000000047 product Substances 0.000 description 52
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 29
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 28
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 28
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 28
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 27
- 101000901154 Homo sapiens Complement C3 Proteins 0.000 description 25
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 24
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 24
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 22
- 102100022133 Complement C3 Human genes 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 14
- 102100037080 C4b-binding protein beta chain Human genes 0.000 description 13
- 101000740689 Homo sapiens C4b-binding protein beta chain Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 13
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 13
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 12
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 12
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 12
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 12
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 12
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 6
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 6
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101000978703 Escherichia virus Qbeta Maturation protein A2 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 101100496164 Mus musculus Clgn gene Proteins 0.000 description 4
- 101100229966 Mus musculus Grb10 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100237027 Mus musculus Meig1 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 4
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 102000057770 human C3 Human genes 0.000 description 4
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 4
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 4
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 4
- 101000647977 Escherichia coli (strain K12) Alkanesulfonate monooxygenase Proteins 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- 101000604876 Homo sapiens Kremen protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100038173 Kremen protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 206010065838 Middle ear inflammation Diseases 0.000 description 3
- 101100038125 Mus musculus Rora gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 101710167259 Neuromedin-K receptor Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 2
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 244000117546 Melocactus communis Species 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 2
- LHJQIRIGXXHNLA-UHFFFAOYSA-N calcium peroxide Chemical compound [Ca+2].[O-][O-] LHJQIRIGXXHNLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 108091010988 fibronectin binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXCCGRRUBBGZRE-UHFFFAOYSA-N 4-[1-hydroxy-2-(propan-2-ylamino)ethyl]-2-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC(C(O)CNC(C)C)=CC=C1O XXCCGRRUBBGZRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710131943 40S ribosomal protein S3a Proteins 0.000 description 1
- 101150109698 A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710187168 Alpha-2-macroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101710136034 Alpha-2-macroglobulin homolog Proteins 0.000 description 1
- 101100125452 Arabidopsis thaliana ICR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 108010062802 CD66 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100024533 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 101710164918 Choline-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 1
- 102100023661 Coiled-coil domain-containing protein 115 Human genes 0.000 description 1
- 101710155594 Coiled-coil domain-containing protein 115 Proteins 0.000 description 1
- 102000011412 Complement 3d Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010023729 Complement 3d Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 101001017516 Drosophila melanogaster Muscle segmentation homeobox Proteins 0.000 description 1
- 206010063045 Effusion Diseases 0.000 description 1
- 101100112225 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cpa-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001056469 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001125071 Homo sapiens Neuromedin-K receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001090813 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100499365 Mus musculus Dlk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000999399 Mus musculus Eukaryotic translation initiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- 101000650589 Mus musculus Roundabout homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100533558 Mus musculus Sipa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152839 Mus musculus Tgm4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100258315 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) crc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100258328 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) crc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102100038567 Properdin Human genes 0.000 description 1
- 108010005642 Properdin Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 101150064974 ass1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000004074 complement inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000055393 human KRT3 Human genes 0.000 description 1
- 102000051411 human PSMA6 Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
- A61K39/1045—Moraxella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
- C07K14/212—Moraxellaceae, e.g. Acinetobacter, Moraxella, Oligella, Psychrobacter
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к внеклеточным матриксным белкам Moraxella catarrhalis и их способности взаимодействовать с эпителиальными клетками через ассоциированные с клеткой фибронектин и ламинин, а также к их способности ингибировать систему комплемента. Эти внеклеточные матриксные белки пригодны для приготовления вакцин. Настоящим изобретением обеспечиваются пептиды, взаимодействующие с фибронектином, ламинином и системой комплемента.
Description
Настоящее изобретение относится к внеклеточным матриксным белкам Могахе11а са(аггНа1й и их способности взаимодействовать с эпителиальными клетками через ассоциированные с клеткой фибронектин и ламинин, а также к их способности ингибировать систему комплемента. Эти внеклеточные матриксные белки пригодны для приготовления вакцин. Настоящим изобретением обеспечиваются пептиды, взаимодействующие с фибронектином, ламинином и системой комплемента.
Область техники
Настоящее изобретение относится к Могахе11а са1аггйа11к и их способности взаимодействовать с эпителиальными клетками через внеклеточные матриксные белки, такие как фибронектин и ламинин, а также к их способности ингибировать систему комплемента.
Взаимодействие с этими внеклеточными белками используется для приготовления вакцин.
Уровень техники
Способность связываться с эпителиальными клетками имеет огромное значение для нескольких видов бактерий. Например, 81арйу1ососсик аигеик и 81гер1ососсик руодепек обладают связывающими фибронектин белками (ЕпВР) с родственной организацией последовательностей. Эти ЕпВР известны как микробные поверхностные компоненты, узнающие адгезивные матриксные молекулы (М8СКАММ). При связывании с фибронектином они используют модульную структуру фибронектина, образующего обширные тандемные бета-молнии [27, 39, 47, 73]. Назначение фибронектина заключается в опосредовании адгезии бактерий и проникновения в клетки хозяина.
Важный патоген слизистой оболочки Могахе11а саЮггйайк является третьей ведущей бактериальной причиной острого воспаления среднего уха у детей после 81гер1ососсик риеишошае и НаешорЫ1ик ίπΠιιепхае [14, 40, 55]. М. са1аггйа11к также является одним из наиболее частых обитателей глотки здоровых детей.
Более того, М. са1аггйайк также является частой причиной синусита и инфекций нижних дыхательных путей у взрослых с хроническим обструктивным заболеванием легких (СОРЭ) [74]. Вероятно, частое появление этого вида у больных СОРЭ отчасти связано с наличием у него большого набора адгезинов.
В последние годы исследование фокусировалось на белках внешней мембраны и их взаимодействиях с хозяином, являющимся человеком [6, 48, 56]. Некоторые из этих белков внешней мембраны, в том числе среди прочих связывающий 1дЭ М. са1апЕайк (МЮ, также обозначаемый Над), белок СО, белок адгезии М. са1апЕайк (МсаР) и повсеместные поверхностные белки (Икр), имеют, по-видимому, адгезивные функции [1, 22, 33, 48, 61, 81, 84].
Сущность изобретения
Ввиду того факта, что М. са1аггйайк является, как обнаружено, ведущей причиной инфицирования верхних и нижних дыхательных путей, существует текущая необходимость в разработке вакцин, которые можно использовать против М. са1аггйайк.
Поэтому цель настоящего изобретения состояла в обнаружении того, каким образом М. са1аггйайк взаимодействует с эпителиальными клетками в организме и влияет на иммунную систему. Таким способом можно разработать вещества, которые могут действовать в качестве вакцин против М. са1аггйайк.
В этом исследовании авторы настоящего изобретения, используя происходящие из клинических изолятов мутанты М. са1аггйайк, смогли показать, что и ИкрА1, и А2 связывают фибронектин и ламинин. Кроме того, авторы настоящего изобретения смогли показать, что М. са1аггйайк блокирует классический путь системы активации комплемента, а также объяснить, каким образом они осуществляют блокирование.
Многие бактерии адгезируются к эпителиальным клеткам через связывающие фибронектин М8СКАММ [54, 77]. Ркеибошопак аегидшока имеет ЕпБР, который связывается с ассоциированным с клеткой фибронектином на эпителиальных клетках полости носа [69]. Блокирование взаимодействий бактерии-белок фибронектин может помочь ткани хозяина побороть инфекцию. Действительно было показано, что антитела против ЕпВР 8. кшгеик приводят к быстрому обезвреживанию бактерий у инфицированных мышей [71].
Рекомбинантные усеченные белки ИкрА1/А2 вместе с более маленькими фрагментами, перекрывающими целую молекулу, проверили в соответствии с настоящим изобретением на связывание с фибронектином. И ИкрА1, и А2 связывали фибронектин, и обнаружено, что связывающие фибронектин домены расположены в пределах ИкрА1299-452 и ИкрА2165-318. Эти два усеченных белка оба ингибировали связывание М. са1аггйайк с эпителиальными клетками конъюнктивы Чанг в степени, сходной с ингибированием с использованием антител против фибронектина. Данные наблюдения показали, что и ИкрА1, и А2 М. са1аггйайк вовлечены в адгезию к эпителиальным клеткам через ассоциированный с клеткой фибронектин. Следовательно, в качестве возможных кандидатов, которые следует включать в вакцину против М. са1аггйайк, предлагаются биологически активные сайты в пределах ИкрА1299-452 и ИкрА2165-318.
Кроме того, авторы настоящего изобретения изучили и охарактеризовали связывание М. са1аггйайк с ламинином. М. са1апЕайк является частой причиной обострений инфекций у больных С'ОРЭ. Вероятно, успех этого вида у больных С'ОРЭ отчасти связан с наличием у него большого набора адгезинов. Кроме того, существуют патологические изменения, такие как потеря целостности эпителия с обнажением базальной мембраны, где у курильщиков утолщен сам слой ламинина [4]. Показано, что некоторые патогены способны связывать ламинин, и это может вносить вклад в их способность адгезироваться к таким поврежденным и оголенным поверхностям слизистой оболочки. Эти патогены включают патогены, которые, как известно, вызывают значимое заболевание дыхательных путей, такие как, среди прочих, 8. аигеик и Р. аегидшока [7, 63]. Авторы настоящего изобретения смогли показать, что повсеместный по
- 1 014352 верхностный белок (Икр) А1 и А2 М. са1атгйа11к также связывается с ламинином. Связывающие ламинин домены икрА1 и А2 были обнаружены, среди прочих, в пределах Ν-концевых половин икрА150-491 и икрА230-351. Эти домены также содержат связывающие фибронектин домены. Однако самые маленькие фрагменты, которые связывали фибронектин, икрА1299-452 и икрА2165-318, не связывали в какой-либо заметной степени ламинин. Фрагменты, меньшие чем Ν-концевая половина икрА 1 (икрА150-491), теряют 230 170 всю свою способность связывать ламинин, в то время как в случае икрА2 только икр А - связывал ламинин, хотя на более низком уровне, чем целый рекомбинантный белок (икрА230-539). Эти открытия говорят о том, что разные части молекулы могут иметь разные функциональные роли. Также обнаружено, что икрА150-770 обладает свойствами связывать ламинин.
При сравнении самых маленьких связывающих ламинин областей икрА1 и А2 авторы настоящего изобретения обнаружили, что существует, однако, незначительное подобие в виде аминокислотной гомологии между икрА230-170 и икрА150-491 (данные не показаны). Это не удивительно, поскольку известен тот факт, что оба белка имеют структуру сферической головки в виде леденца, несмотря на то, что их Ν-концевые половины идентичны только на 22% [2, 32].
В качестве возможных кандидатов, которые следует включать в вакцину против М. са1атгйа11к, предлагаются биологически активные сайты в пределах икрА150-770 и икрА230-539.
Наконец, авторы настоящего изобретения изучили взаимодействие между повсеместными поверхностными белками А1 и А2 М. са1атгйа11к и врожденной иммунной системой и обнаружили, что М. са!аттйайк блокирует систему комплемента. Система комплемента является одной из первых линий врожденной защиты против патогенных микроорганизмов, и активация этой системы приводит к каскаду осаждения белков на поверхности бактерий, что приводит к образованию мембрано-атакующего комплекса или опсонизации патогена с последующим фагоцитозом [85, 86]. Одним из наиболее важных белков комплемента является С3, который присутствует в кровотоке в концентрации, схожей с концентрацией некоторых иммуноглобулинов (1-1,2 мг/мл). С3 не только играет решающую роль в качестве опсонина, но также является общим связующим звеном между классическим, лектиновым и альтернативным путями активации комплемента. Альтернативный путь функционирует в качестве петли усиления для классического и лектинового путей, и его можно также спонтанно активировать с помощью ковалентного присоединения С3 к поверхности микробной клетки при отсутствии ингибиторов комплемента. Для осаждения С3 требуется присутствие внутренней тиоэфирной связи, образованной в нативном белке при близости сульфгидрильной группы (Сук1010) и карбонильной группы глутамина (О1и1012) на α-цепи С3 [76]. Протеолитическое отщепление с аминоконца α-цепи С3 пептида из 77 остатков приводит к образованию С3а (анафилатоксина) и С3Ь. Присоединение С3Ь затем осуществляется через ковалентную связь между карбонильной группой метастабильного тиоэфира и/или группами белков -ΝΗ2 или -ОН, или углеводными структурами на поверхности активатора [36, 37]. Обнаружено, что икрА1 и А2 М. са1атгйа11к нековалентно и зависимым от дозы способом связываются с третьим компонентом комплемента (С3) из обработанной БОТА сыворотки и обработанным метиламином С3 (С3те1). Обнаружено, что икрА150-770 и икрА230-539 связываются с С3 и С3те1. Обнаружено, что связывающая С3 область икрА2 расположена главным образом в икрА2200-458. Однако икрА1, как обнаружено, играет минорную роль в этих взаимодействиях. В качестве возможных кандидатов, которые следует включать в вакцину против М. са1атгйа11к, предлагаются биологически активные сайты в пределах икрА150-770 и икрА230-539.
Семейство иркА состоит из икрА1 (молекулярная масса 88 кДа), икрА2 (62 кДа) и гибридного белка икрА2Н (92 кДа) [2, 43]. Эти белки мигрируют в виде высокомолекулярных комплексов при электрофорезе в δΌδ-РАОЕ, являются относительно консервативными и, следовательно, важными вакцинными кандидатами. Аминокислотные последовательности икрА1 и А2 идентичны на 43% и имеют 140 аминокислотных остатков, которые идентичны на 93% [2]. В ряду из 108 изолятов М. са1атгйа11к из носоглотки новорожденных с воспалением среднего уха гены икрА1 и икрА2 обнаружены в 107 (99%) и 108 (100%) изолятах соответственно. Двадцать один процент новорожденных были идентифицированы как имеющие гибридный вариант гена икрА2Н [50]. Кроме того известно, что естественно приобретенные антитела против икрА1 и А2 являются бактерицидными [15].
Семейству белков иркА приписывается несколько функций. Экспрессия иркА является существенной для прикрепления М. са1атгйа11к к эпителиальным клеткам конъюнктивы Чанг и к эпителиальным клеткам гортани Нер-2 [43, 49]. В более недавнем исследовании обнаружено, что иркА связывается с относящимися к канцероэмбриональным антигенам клеточными адгезивными молекулами (СЕАСАМ), экспрессируемыми линией эпителиальных клеток легкого А549 [31]. Также показано, что очищенный икрА1 связывает фибронектин в дот-блот анализах, в то время как очищенный икрА2 не связывает [49]. И икрА1, и А2 могут играть важные роли в устойчивости сыворотки к М. са1атгйа11к [1, 5, 58, 60].
В настоящем изобретении продемонстрировано, что и икрА1, и А2 являются детерминантами связывания М. са1атгйа11к с фибронектином и ламинином в клинических изолятах М. са1атгйа11к ВВН18 и ΚΗ4. Интересно, что оба рекомбинантных икрА1 и А2, происходящих из М. са1атгйа11к Вс5, связывали фибронектин в одинаковой степени. Связывающие фибронектин домены обнаружены в пределах аминокислотных остатков 229-452 икрА1 и 165-318 икрА2. Последовательности этих двух доменов идентичны
- 2 014352 по 31 аминокислотному остатку. Важно, что усеченные фрагменты белков, содержащие эти остатки в И5рЛ1 и И5рА2, были способны ингибировать связывание М. са1аггйа115 с эпителиальными клетками Чанг, что говорит о том, что взаимодействия с этими клетками осуществлялись через ассоциированный с клеткой фибронектин.
Связывающие ламинин домены обнаружили в пределах отмеченных выше аминокислотных остатков. С помощью анализов связывания с использованием рекомбинантных белков обнаружили, что главные связывающие области расположены в Ν-концевых частях, где оба белка образуют сферическую головку.
Бактериальные факторы, опосредующие адгезию к ткани, и компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) группируются вместе в одно семейство, называемое микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные матриксные молекулы (М8СКАММ).
Поскольку и и§рА1, и и§рА2 связывают фибронектин и ламинин, эти белки можно обозначить М8СКАММ.
В соответствии с одним аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 1, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 2, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии со следующим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 3, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 4, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии со следующим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 5, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии со следующим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 6, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 7, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 8, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 9, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается пептид, имеющий последовательность ГО N0. 10, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением обеспечивается применение по крайней мере одного пептида в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, предпочтительно инфекции, вызванной М. са1аггйа115, в частности вызванной носительством М. са1аггйа115 на поверхностях слизистых оболочек.
В соответствии с другим аспектом настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается включающий связывающий фибронектин домен лиганд, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности ГО N0. 1, последовательности ГО N0. 2 и последовательности ГО N0. 3, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и
- 3 014352 другие вторичные процессированные продукты.
Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается включающий связывающий ламинин домен лиганд, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности ГО N0. 4 - последовательности ГО N0. 8, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается лиганд, включающий связывающий С3 или С3ше1 домен, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности ГО N0. 4, последовательности ГО N0. 6, последовательности ГО N0. 9 и последовательности ГО N0. 10, и его фрагменты, гомологи, функциональные эквиваленты, производные, дегенеративные продукты или продукты гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования и другие вторичные процессированные продукты.
Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается лекарственное средство, содержащее один или несколько лигандов в соответствии с настоящим изобретением и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, вспомогательных веществ, связующих веществ, носителей или консервантов.
Кроме того, настоящим изобретением обеспечивается вакцина, содержащая один или несколько лигандов в соответствии с настоящим изобретением и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, вспомогательных веществ, связующих веществ, носителей или консервантов.
Настоящим изобретением также обеспечивается способ лечения или профилактики у индивидуума инфекции, предпочтительно инфекции, вызванной М. са1аггйа115, в частности вызванной носительством М. са1аггйа115 на поверхностях слизистых оболочек, который включает введение фармацевтически эффективного количества лекарственного средства или вакцины в соответствии с настоящим изобретением.
Наконец, настоящим изобретением также обеспечивается последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лиганд, белок или пептид по настоящему изобретению, а также ее гомологи, полиморфные варианты, вырожденные последовательности и варианты сплайсинга.
Дальнейшее раскрытие целей, задач, решений и особенностей настоящего изобретения будет очевидно из следующего детального описания настоящего изобретения со ссылкой на фигуры и прилагаемую формулу изобретения.
Используемое здесь выражение лиганд предназначено для обозначения и целой молекулы, которая связывается с рецептором, и любой ее части, которая включает связывающий рецептор домен так, что он сохраняет свойство связываться с рецептором. Лиганды, включающие эквивалентные связывающие рецептор домены, также включены в настоящее изобретение.
Выражения фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент и производное относятся к вариантам, модификациям и/или частям пептидов и фрагментам белков в соответствии с настоящим изобретением, которые сохраняют желаемые свойства связываться с фибронектином, ламинином, С3 или С3шс1.
Гомолог ϋκρΆΙ в соответствии с настоящим изобретением определяется как последовательность, обладающая по крайней мере 72% идентичностью, как видно из табл. 1 ниже.
Фрагмент в соответствии с настоящим изобретением определяется как любая гомологичная последовательность, которая является усеченной или удлиненной на 1, 2, 5, 10, 15, 20 аминокислот с №конца и/или усеченной или удлиненной на 1, 2, 5, 10, 15, 20 аминокислот с С-конца.
Выражения дегенеративные продукты, продукты гидроксилирования, сульфонирования и гликозилирования или другие вторичные процессированные продукты относятся к вариантам и/или модификациям пептидов и фрагментов белков в соответствии с настоящим изобретением, которые изменены по сравнению с первоначальным пептидом или фрагментом белка в результате дегенерации, гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования, но которые сохраняют желаемые свойства связываться с фибронектином, ламинином, С3 или С3шс1.
Настоящее изобретение особенно касается инфекций, вызванных Могахе11а са1аггйа115. Пептид в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для лечения или профилактики воспаления среднего уха, синусита или инфекций нижних дыхательных путей.
- 4 014352
Таблица 1
Множественное выравнивание последовательностей полноразмерных белков изрА1, сопутствующие проценты идентичности
| 012Е | 03 5Е | О46Е | Р44 | ТТА24 | ТТА37 | У1171 | |
| АТСС25238 | 81 | 75 | 83 | 83 | 84 | 79 | 84 |
| О12Е | 74 | 77 | 83 | 76 | 72 | 75 | |
| 03 5Е | 72 | 74 | 83 | 73 | 78 | ||
| 04 6Е | 81 | 81 | 82 | 80 | |||
| Р44 | 81 | 75 | 77 | ||||
| ТТА24 | 76 | 84 | |||||
| ТТА37 | 78 |
Таблица 2
Анализ сопоставления ИзрА2 - используемые штаммы и последовательности
| Номер доступа | Штамм | Обозначение | Сленг | |
| ° ΤΚΕΜΒΤ.Ό54407 МОКСА | 054407 | О35Е | Повсеместный поверхностный белок А2. | 576 |
| ϋ ТКЕМВЬ:О58ХР4 МОКСА | О58ХР4 | МСЗ 17 | изрА2. | 650 |
| П ТКЕМВЬ:О84831 МОКСА | 084881 | Е22 | Повсеместный поверхностный белок А2Н. | 877 |
| П ТКЕМВЬ:О84882 МОКСА | 084882 | VI122 | Повсеместный поверхностный белок А2. | 616 |
| С ТКЕМВЬ:О8ОН86 МОКСА | 08ОН86 | Р44 | ϋβρΑ2. | 668 |
| С ТКЕМВЕ:О9Е961 МОКСА | 091,961 | ТТА37 | и8РА2Н. | 889 |
| С ТКЕМВЬ:О9Е962 МОКСА | О9Ь962 | О46Е | и8РА2Н. | 894 |
| ° ТКЕМВЬ:О9Ь963 МОКСА | О9Е963 | О12Е | и8РА2 (повсеместный поверхностный белок А2). | 684 |
| П ТКЕМВЬ:О9ХО51 МОКСА | 09X051 | VI171 | изрА2. | 674 |
| ° ТКЕМВЬ:О9ХО53 МОКСА | 09X053 | ТТА24 | изрА2, | 613 |
| ТКЕМВЬ:О8КТВ2 МОКСА | 08КТВ2 | 8Р12-5 | иярА2 | 686 |
| П ТКЕМВЬ:09ХО55 МОКСА | 09X055 | АТСС25238 | изрА2. | 630 |
| Рог8§геп и8рА2 | изрА2. | 630 |
Соответственно настоящим изобретением обеспечивается лиганд, выделяемый из белка внешней мембраны Могахе11а са1атгйа115, который имеет свойство связываться с ламинином, и/или фибронектином, и/или С3, причем указанный лиганд представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕЦ ГО N0: 1-10, происходящих из представленных ниже последовательностей полноразмерных ИзрА1 и ИзрА2 Могахе11а са1атгйа115 ВС5, или состоящий из такой аминокислотной последовательности, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, дегенеративный продукт или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой вторичный процессированный продукт.
- 5 014352
Полноразмерный 1)зрА1 из штамма ВС5 МогахеИа саЕаггкаИз:
ΜΝΚΙΥΚνΚΚΝ ААБНЬУАСЗЕ ЕАКБНТККАУ Ь63ЬЫУ61Ь 5МАТТАЗА0К ν6ΚΑΤΝΚΙ5Ε ΟϋΝΜΤΑΝΕΤΥ ΒΤΙ606ϋΥΝΚ ΤΚ6ΚΥ3ΤΙΕ5 БЬГЦЕАТЫЕУ 3ΤΙ(3356ΥΝΚ ΑΚΘΕΥ3ΤΪΕ6 6(3ΥΝΕΑΤΝβΥ 3ΤΙ6(3ΘΟΝΝΤ АК6КУЗТ1ББ ΟΰΥΝΕΑΤΙΕΝ ЗТУбБССТЫО АКБКЫЗТУАБ ΕΥΝΝΕΑΤΘΤΡ ΞΤΙΑΕΘΗΚΝβ АТБКБЗГААБ ΙΟΝΚΑΝΑΜΊΆ УАЬСЫКПТтЕ 6ΕΝ3νΑΙ63Ν ΝΤνΚΚΟββΝν ПЬСЗЫТИТ ΝΆ0Ν63νΐΛ6 ΗΝΤΑΘΚΑΑΤΙ УКЗАЕУББЬЗ ЬТБГАБАЗКТ СЫБТУЗУСКК СКЕКО1УН7С Α6ΕΙ30Τ3ΤΠ АУНСЗОЬНУЬ АТУУАСМКАО 1КОЬООЕУеЬ ЪБЕЕЩЗЬЕБ ΕΙΕΝΝββΑΙΑ ΚΝΏΑΟΖΚΤΕΕ ЗЫУЕЕБЬШЬ ЗСКЫООКАО ΙΟΗΝΙΝΝΙΥΕ ΕΑβΟβΟβΗ£3 ΕΙΚΤΕΚΝΝΥΕ ЕСЬЬОЬЗСР.Ь ЮОКАОЬТГФ 1КАЪЕЗ№7ЕЕ БЪШЬЗБКЫ ΕβΚΑϋΙΆΚΝβ ΑβΙΑβΝβΤϋΙ □ОЬААУИЕЬС ϋΑΥΆΚδΏΤΕΑ ЮАЬЫКАЗЗА ΝΤΟΚΙΑΤΑΕΙ, 6ΙΑΞΚΚΚΒΑ0 ΙΑΚΑβΑΝΕΝΚ ПБ1АКМОАЦ1 ОЬНЕККТТКЬ БШНЗМУАКА νβΝΝΤβΟνΑΤ ΝΚΑΟΙΆΚΗβΑ ΩΙΑΝΝΙΚΝΙΥ ΕΒΆΟββΟβΗΞ ЗЩКТЬАКУЗ ΑΆΝΤΏΗΙΑΚΝ ΚΑΕΑϋΑδΓΕΤ ΙΤΚΝβΝΤΙΙΕ βΟΞΑΙΛΈβΝΚ ΆΙΝβΕΙΕΟΕΑ ΑΗΑΟνβϋΚβΙ ΙβΝΟΑϋΙΤΤΝ ΚΤΑΙΕΟΝΙΝΚ ΤΥΑΝΟΕΕΙΕΚ ΝΚΑΰΙΑΤΝΚβ ЕЫЬОЫЦЕЬМ ΚΙΚΕΤΝΝΗβΕ βΚΙΟαίΟΥΑΒ ΚΕβΟβΗΓΚΝΚ Ι3Α'/ΕΡ.βΤΆ5 ΟΙΑΝΑΙΑΙΑΤ ЬРЗРЗКАБЕН ΗνΠΡΘδεΥΗΝ БЙААУЗЬБАА СЬЗОТСКЗТУ К1БЬЗНЗЦАБ сьзеетесзу ник
Полноразмерный ПзрА2 из штамма ВС5 МогахеИа са^аггЬаНз:
МКТМКЕЬРЬК ΙΑνΤ8ΑΜΙΙ6 ΕΕΑΑδΤΑΝΑβ ΑΚΝϋΙΤΙ,ΕΟΙί ΡΥΕΙΚΚΙϋβΝ ΕΙιΕΑϋΙΘΟΙΤ АЪЕКУЬАЕЗО УБКХЬАЬЕЕЬ ΝΚΑΙΕΕΕϋΕϋ νβΗΜβΝΟΙΑΜ ΣΕϋϋνΕΤΜΚ ΝβΝΑΕΆΕβΕΕ А1КЕРЬО0ЬА ΟΚνΕΟΟΕΕΚΙ ΣβΝΕΤΒΙΚΚΝ ΤβΚΝΙ>νΝ6ΓΕ ΙΕΚΝΚΡΑΙΆΚ ΝΝΕΒΙΕΟΙ,Υβ РСНЕУАЕЗТБ ΕΙΗΑΗΝΕΑβΝ ЕТЬКБЫТИЗ ΙΕΝΤΝΝΙΤΚΝ ΚΆΟΙβΑΕΕΝΝ ννΕΕΙ>Ε№3β ΒΙιΙΟΟΚΆΟΙϋ ΝΝΙΝΝΙΥΕΣΑ βββΟβΗΒββΙ КТЬККМУЕЕС ЬЬЕЪЗЦНИО βΚΤϋΙΑβΝβΑ
ΝΙΟϋΙΛΤΥΝΕ ΙιΟΟΟΥΑΟΚβϊ ЕАЮАЬЫКАЗ 3ΕΝΤζ>ΝΖΕϋΙι ΑΑΥΝΕΙίΟΏΆΥ
ΑΚββΤΕΑΖΡΑ ΠΝΚΑ33ΕΝΤ0 ΝΖΕΟΙ,ΆΑΥΝΕ ΖβΌΑΥΑΚββΑ ΕΑΙϋΑΒΝΚΑΞ 3ΕΝΤΟΝΙΑΚΝ ΟΑϋΖΆΝΝΖΤΚ ΙΥΕΙΑΜΟΟΚ НКЗМКТЪАК Τ3ΑΆΝΤ0ΚΙΑ ΚΝΚΑΡϋΟΑ5Γ ΕΤΕΤΚΝβΝΤΪ. ΙΕΚΟΚΕΗϋΚΙι ΙΤΑΝΚΤΑΖϋΑ ΝΚΑ3ΑΕΤΚΕΑ ΑΤΑΌΑΕΤΚΝ6 ΝΑΖΤΚΝΑΚ3Ι ТОЬБТКУОБЕ ОЗКУТАЬОТК νΝΑΕϋΟΚΙΤΑ Χ,Ό3ΚνΕΝ6ΜΑ АОААЪЗбЬГЗ ΡΥ3ν6ΚΕΝΑΤ ААЕСБУСЗКЗ ΆνΑΙΕΑΟΥΚν ΝΡΝΠΑΕΚΑ6Α ΑΙΝΤ36ΝΚΚ6 3ΥΝΙΕνΝΥΕΓ
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лиганд представляет собой полипептид [или усеченный полипептид по сравнению с полипептидом дикого типа], включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1-10, или состоящий из такой аминокислотной последовательности, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, дегенеративный продукт или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой вторичный процессированный продукт.
Термин лиганд используется здесь для обозначения и целой молекулы, которая связывается с ламинином, и/или фибронектином, и/или С3, и любой ее части, которая включает связывающий ламинин, и/или фибронектин, и/или С3 домен так, что он сохраняет соответствующее связывающее свойство. Таким образом, лиганд включает молекулы, которые состоят только из связывающего ламинин, и/или фибронектин, и/или С3 домена, т. е. области или областей пептида, требуемых для связывания.
Для целей настоящего изобретения свойства полипептида связывать ламинин, фибронектин или С3 можно установить следующим образом. Полипептиды можно пометить 125йодом или другими радиоактивными соединениями и проверить на связывание в радиоиммуноанализах (РИА) в виде жидкой или твердой фазы (например, дот-блотов). Кроме того, полипептиды можно проанализировать на связывание с помощью твердофазных иммуноферментных анализов (ЕЫ8А) или проточной цитометрии с использованием подходящих антител и систем обнаружения. Взаимодействия между полипептидами и ламинином, фибронектином или С3 можно, кроме того, исследовать с помощью резонанса поверхностных плазмонов (В1асоге). Примеры методов подробно приведены в разделе Материалы и методы.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид [или усеченный полипептид по сравнению с полипептидом дикого типа] включает по крайней мере одну из консервативных последовательностей из 8Е0 ΙΌ N0: 1-10, которые идентифицированы при продемонстрированном здесь выравнивании, или состоит по крайней мере из одной такой консервативной последо- 6 014352 вательности. Следовательно, в этом варианте осуществления настоящего изобретения полипептид [или полипептид, усеченный по сравнению с полипептидом дикого типа] включает или состоит по крайней мере из одной из следующих последовательностей:
Из и§рА1 (консервативных фрагментов связывающего фибронектин домена - '/' отделяет альтернативные выборы аминокислоты в каком-либо положении)
Τ/ν V 3 V С 8/К О/Е/К/А 6/Ν Κ/Ν/β/Η/З Е й Ο I V Ν/Η V С А
С Ο/Ν/Ε/Κ I 3/К А/В Т/В 3 Т В А V N С 3 (2 Б Η/Υ АБА 5/К/Т Τ/Α/ν Ι/ν
ЗТВАУЦНЗОБ
Ъ Б Ν/β Б 3 6 К Б Ъ/1 βΟΚΆΏΙβΝΝΙΝ Ν/Η I Υ Е/В Б А Ώ0ββ0Η33βΙΚΤΕΚ
ΟΟΚΑϋΙΒΝΝΙΝ
БАОООВОНЗЗВ1КТБК
Из и§рА2 (консервативных фрагментов связывающего фибронектин домена - '/' отделяет альтернативные выборы аминокислоты в каком-либо положении)
К А О I β N N I N Ν/Η ΙΪΕΙΆΟίΟΟΟΗίΕΡ
I Κ/ΰ Τ/Ά Б Κ/Ε Κ/Ν/3 N ν/Ι Е/У Ε β/Ε Б Ь/Г Ε/Ν Б 3 ϋ/β Η/Κ
Ι/Ь I В О К Τ/Α В Ι/Б Α/Τ Ώ/Κ Ν/ϋ
Из и§рА2 (консервативных фрагментов связывающего С3 домена '/' отделяет альтернативные выборы аминокислоты в каком-либо положении)
I Е/ο ββΑΑΥΝΕΪιΰβΆΥΑΚΟβ А/Т Е А I ϋ А Ъ N КА
3 Е N Т 0 N I А К N С А β I А N N I Τ/Ν N I Υ Е Б А Ώ <2О
В К/О Н К/3 5 В I К Т Ь А К Т/А 5 А А N Т β/Ν КI
ΡΙΑΑΥΝΞΙΰϋΑΥΑΚΟβ
ΕΑΙβΑ1ΝΚΑ53ΕΝΤΩΝΐΑΚΝ<2ΑβΙΑΝΝΙ
Понятно, что являющиеся полипептидами лиганды настоящего изобретения могут включать связывающий ламинин, и/или фибронектин, и/или С3 домен упоминаемой здесь последовательности, модифицированной добавлением или делецией аминокислотных остатков к или из упоминаемой здесь последовательности с одного из двух или с обоих Ν- и С-концов, причем модифицированные пептиды сохраняют способность связывать ламинин, и/или фибронектин, и/или С3 соответственно. Соответственно настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается лиганд, включающий или состоящий из полипептида, к которому добавлены или из которого делетированы 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 или 1 аминокислотный остаток упоминаемой здесь последовательности с одного из двух или с обоих Ν- и С-концов, причем указанный модифицированный пептид сохраняет способность связывать ламинин, и/или фибронектин, и/или С3; и/или индуцировать иммунный ответ против не модифицированного пептида. Под удлинением понимается удлинение последовательности с использованием пептида из полноразмерной аминокислотной последовательности, из которой он получен.
Что касается фрагментов полипептидов настоящего изобретения, то в настоящем изобретении можно использовать фрагменты любого размера (основанные на гомологичных последовательно стях/консервативных областях/функциональных доменах, обсуждаемых здесь) при условии, что эти фрагменты сохраняют способность связывать ламинин, и/или фибронектин, и/или С3. Может быть желательным выделение минимального пептида, содержащего только такие области, которые требуются для связывания с рецептором.
Являющиеся полипептидами лиганды в соответствии с настоящим изобретением можно получить из известных белков и§рА1 или и§рА2 Могахе11а са1агтйа118 с помощью усечения одного из двух или обоих Ν- и С-концов. Усеченные полипептиды не являются полноразмерными нативными молекулами и§рА1 или и§рА2. Соответственно настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается последовательность и§рА1 дикого типа, в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160 и т.п. до 298 аминокислот с Ν-конца и/или в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 и т.п. до 450 аминокислот с С-конца. Предпочтительно усеченные полипептиды сохраняют функцию связывания с фибронектином (необязательно также связывания с ламинином и/или С3).
- 7 014352
Возможные комбинации усечений с Ν- и С-концов белка и§рЛ1 дикого шипа
Таблица 3
| Чнсло аминокислот, отсутствующих по крайней мере или точно: | |||||||||||||||||||||||||||
| с Ν-конца | с С-конца | ||||||||||||||||||||||||||
| 0 | X | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 340 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 20 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 30 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 40 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 50 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 60 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | та | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 260 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 70 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 160 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 360 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 80 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 100 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 120 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 140 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 1&0 | 6 | 20 | 30 | 40 | 50 | 80 | 70 | 80 | 100 | 120 | 1.ЛП | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 180 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 200 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 220 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | ЗВО | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 240 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | ЯП | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 260 | 0 | 20 | зп | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 260 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | ЯП | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
| 298 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 240 | 360 | 380 | 400 | 420 | 440 | 450 |
Соответственно настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается последовательность и§рА2 дикого типа, в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 164 аминокислоты с Ν-конца и/или в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 180, 200 и т.п. до 312 аминокислот с С-конца. Предпочтительно усеченные полипептиды сохраняют функцию связывания с фибронектином (необязательно также связывания с ламинином и/или С3). Возможные усеченные полипептиды можно выбрать из усеченных полипептидов, представленных в следующей таблице, все из которых находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Таблица 4
Возможные комбинации усечений с Ν- и С-концов белка и§рА2 дикого типа
| Числе аминокислот, отсутствующих по крайней мере или точно: | ||||||||||||||||||||
| с Ν-конца | с С-конца | |||||||||||||||||||
| 0 | X | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 312 |
| 20 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | ВО | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 260 | 300 | 312 |
| 30 | о | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 30 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 226 | 240 | 260 | 280 | зоо | 312 |
| 40 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 280 | 280 | зоо | 312 |
| 50 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | зоо | 312 |
| 60 | О | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | зоо | 312 |
| 70 | О | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | ТОО | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 2В0 | зоо | 312 |
| 80 | 0 | 20 | зо | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | юо | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 312 |
| 100 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | зоо | 312 |
| 120 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 60 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 312 |
| 140 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | зоо | 312 |
| 160 | О | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 312 |
| 164 | О | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | 200 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 312 |
Соответственно настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается последовательность и§рА2 дикого типа, в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 5, 10, 15, 20, 25 или 29 аминокислот с Νконца и/или в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 и т.п. до 453 аминокислот с С-конца. Предпочтительно усеченные полипептиды сохраняют функцию связывания с ламинином (необязательно также связывания с фибронектином и/или С3). Возможные усеченные полипептиды можно выбрать из усеченных полипептидов, представленных в следующей таблице, все из которых находятся в пределах объема настоящего изобретения.
- 8 014352
Таблица 5
Возможные комбинации усечений с Ν- и С-концов белка и§рА2 дикого типа
Соответственно настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается последовательность и§рА2 дикого типа, в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160 и т.п. до 301 аминокислоты с Ν-конца и/или в которой отсутствует по крайней мере (или точно) 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 160 или 172 аминокислоты с С-конца. Предпочтительно усеченные полипептиды сохраняют функцию связывания с С3 (необязательно также связывания с фибронектином и/или ламинином). Возможные усеченные полипептиды можно выбрать из усеченных полипептидов, представленных в следующей таблице, все из которых находятся в пределах объема настоящего изобретения.
- 9 014352
Таблица 6
Возможные комбинации усечений с Ν- и С-концов белка И8рЛ2 дикого типа
| Число аминокислот, отсутствующих по крайней мере или точно: | |||||||||||||
| с Ν-конца | с С-конца | ||||||||||||
| 0 | X | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 20 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 30 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 40 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 50 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 60 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 70 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 80 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 30 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 100 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 120 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 140 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 30 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 160 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 172 |
| 180 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 200 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 220 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 240 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 260 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 280 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 290 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
| 301 | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 100 | 120 | 14 0 | 160 | 172 |
Известные последовательности и§рА1 дикого типа, которые можно подвергнуть усечению таким образом, представляют собой последовательности штаммов АТСС2538 (МХ2; номер доступа в СепВапк ААЭ43495), Р44 (ΑΑΝ84895), О35Е (ААВ96359), ТТА37 (ААЕ40122), О12Е (ААЕ40118), О46Е (ААЕ36416), ν1171 (ААП43469), ТТА24 (ААП43467) (см. табл. 1/фиг. 19) или ВС5 (см. выше). Известные последовательности и§рА2 дикого типа, которые можно подвергнуть усечению таким образом, представляют собой последовательности штаммов О35Е (номер доступа в СспВапк - О4407), МС317 (номер доступа в СепВапк - Р58ХР4), Е22 (номер доступа в СепВапк - Р84881), ν1122 (номер доступа в СепВапк - Р84882), Р44 (номер доступа в СепВапк - Р8СН86), ТТА37 (номер доступа в СепВапк Р9Ь961), О46Е (номер доступа в СепВапк - Р9Ь962), О12Е (номер доступа в СепВапк - Р9Ь963), ν1171 (номер доступа в СепВапк - Ρ9ΧΌ51), ТТА24 (номер доступа в СепВапк - Ρ9ΧΌ53), 8Р12-5 (номер доступа в СепВапк - Р8КГВ2), АТСС25238 (номер доступа в СепВапк - Ρ9ΧΌ55) (см. табл. 2/фиг. 20) или ВС5 (Еог8дгеп_и8рА2) (см. выше).
Идеально, если усеченный полипептид и§рА1 или и§рА2 этого варианта осуществления настоящего изобретения включает или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1-10, или ее фрагмента, гомолога, функционального эквивалента, производного, дегенеративного продукта или продукта гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другого вторичного процессированного продукта; или включает или состоит по крайней мере из одной из консервативных последовательностей внутри этих областей, которые идентифицированы при продемонстрированном здесь выравнивании, например, из и§рА1 (консервативных фрагментов связывающего фибронектин домена - '/' отделяет альтернативные выборы аминокислоты в каком-либо положении)
- 10 014352 <3 Τ/ν V δ V 5 3/К β/Ε/Κ/Α Ε/Ν Κ/Ν/Ε/Η/3 Ε К β I V Ν/Η V С А
С β/Ν/Ε/Κ I 3/Κ Α/ϋ Τ/ϋ 3ΤϋΑνΝΕ3βΕ Η/Υ ΑΙΑ 3/Κ/Τ Τ/Α/ν Ι/ν
3ΤΟΑνΝΕ3βΣ
Ь Ъ Ν/ϋ Ь 3 С К Ь Е/Ι ϋβΚΑΟΙϋΝΝΙΝ Ν/Η I Υ Е/В Ь А 0ΟβΒΐ2Η38ΟΙΚΤΙ>Κ
В β К ΑΟΙ ϋΝΝΙ Н еао.оввонззвхктьк
Из и§рЛ2 (консервативных фрагментов связывающего фибронектин домена - '/' отделяет альтернативные выборы аминокислоты в каком-либо положении)
К А О I О NN I Ν Ν/Η ΙΥΕΕΑβββββΗ33β
Т/А β Ω
Из и§рА2 (консервативных фрагментов связывающего С3 домена - '/' отделяет альтернативные выборы аминокислоты в каком-либо положении)
I Κ/Ω Ι/Ь I
К/Е
Т/А
Κ/Ν/5 β 1/Ь
Ν ν/Ι Ε/ν Е С/Е 1 Ь/Г Е/Ν Ь 3 β/С Н/Н
А/Т β/Κ Ν/ϋ
| Ε/Ω | β Ь А А Υ N | Е | Ь | Ω | β | А | Υ А К Ω Ω | А/Т | Е А |
| 3 Е | Ν Т Ω Ν I А | К | N | Ω | А | β | I А Ν Ν I | Τ/Ν | Ν I |
| Κ/Ω | Η К/5 3 β I | К | Т | ь | А | К | Т/А 3 А А | N Т | β/Ν |
| Ь А | А Υ N Е Ь | 0 | ϋ | А | Υ | А | кос | ||
| А I | О А Ь N К | А | 8 | 8 | Е | N | т о ν ι ; | А К | N 0 |
Может быть подходящим получение слитых белков, содержащих являющиеся полипептидами лиганды, описанные здесь.
Соответственно в дополнительном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются слитые белки, включающие являющиеся полипептидами лиганды в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно слитый белок в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения идентичен менее чем на 50% любой известной полноразмерной последовательности на протяжении полной длины. Такие слитые белки могут составлять производное полипептидов настоящего изобретения. Кроме того, в производных могут использоваться полипептиды настоящего изобретения в качестве носителя для ковалентного присоединения пептидных или сахаридных составляющих. Их мож но соединить, например, с пневмококковыми капсульными олигосахаридами, или полисахаридами, или липоолигосахаридами Могахе11а са1аггйа1щ, или липоолигосахаридами не типируемых НаеторЫ1и§ 1пДи епгае.
Гомологичные пептиды настоящего изобретения можно идентифицировать с помощью сравнения последовательностей. Предпочтительно гомологичные пептиды идентичны по крайней мере на 60%, более предпочтительно по крайней мере на 70, 80, 90, 95 или 99%, в порядке восхождения предпочтения, раскрытой здесь пептидной последовательности или ее фрагментам или усеченным полипептидам настоящего изобретения на протяжении их полной длины. Предпочтительно гомологичный пептид сохраняет способность связывать фибронектин, и/или ламинин, и/или С3; и/или индуцировать иммунный ответ против раскрытых здесь пептидных последовательностей или их фрагментов.
На фиг. 19 и 20 показано выравнивание пептидных последовательностей и§рА1 и и§рА2 различного происхождения, при котором указаны области последовательности, которые можно модифицировать с образованием гомологичных последовательностей при сохранении функции (т. е. способности связывать фибронектин, и/или ламинин, и/или С3). Пептидами, гомологичными пептидам ΞΕβ Ш N0: 1-10 ВС5, являются, например, такие последовательности, которые соответствуют последовательности ВС5, из других штаммов, представленных на фиг. 19 и 20.
Вакцины настоящего изобретения
Полипептиды/пептиды/функциональные домены/гомологи/фрагменты/усеченные полипептиды/ производные настоящего изобретения в идеале готовят в виде вакцины, содержащей эффективное количество указанного(ых) компонента(ов) и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Вакцины настоящего изобретения можно использовать для назначения пациенту для профилактики или лечения инфекций, вызванных Могахе11а са1аггйа118, или воспаления среднего уха, или синусита, или инфекций нижних дыхательных путей. Их можно вводить любым известным способом, в том числе
- 11 014352 внутримышечно, парентерально, на слизистые оболочки и интраназально.
Комбинированные вакцины настоящего изобретения
Вакцины настоящего изобретения можно скомбинировать с другими антигенами Могахе11а са!атΓΐιαίίδ для профилактики или лечения отмеченных выше заболеваний.
Авторы настоящего изобретения, в частности, обнаружили, что Могахе11а саГаггйаПк имеет по крайней мере два способа торможения иммунной системы хозяина от наступления на организм. В дополнение к взаимодействию с С3 (и С4ВР), упоминаемому в приведенных ниже примерах, М. саГатгйайк имеет сильное сродство к растворимому и связанному с мембраной Ι§Ό человека благодаря белку МШ (также известному как ОМР106). Могахе11а-зависимое связывание Ιβϋ с В-лимфоцитами приводит к синтезу поликлональных иммуноглобулинов, который может препятствовать продукции специфических моноклональных антител против Могахе11а. Тот факт, что М. са1атгйа118 тормозит иммунную систему человека несколькими способами, может служить объяснением того, почему М. саГатгйаНк является таким частым обитателем дыхательных путей.
Авторы настоящего изобретения полагают, что комбинация антигенов, вовлеченных в функцию связывания Ι§ϋ (МШ) и функцию связывания С3 (икрА1 и/или икрА2), может обеспечить иммуногенную композицию, увеличивающую защитные способности хозяина против торможения бактериями рода Могахе11а иммунной системы человека, обеспечивая таким образом усиленное снижение носительства М. саГаггйайк на поверхностях слизистых оболочек.
Следовательно, дальнейшим аспектом настоящего изобретения является вакцинная композиция, содержащая эффективное количество икрА1 и/или икрА2 (особенно последнего) (например полноразмерных полипептидов или полипептидов/пептидов/функциональных доменов/гомологов/фрагментов/ усеченных полипептидов/производных настоящего изобретения, описанных здесь, которые предпочтительно сохраняют функцию связывания С3) в комбинации с эффективным количеством белка МШ (например, полноразмерных полипептидов или их полипептидов/пептидов/функциональных доменов/гомологов/фрагментов/усеченных полипептидов/производных, которые предпочтительно сохраняют функцию связывания Ι§Ό человека) и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Белок МШ и связывающие Ιβϋ его гомологи/фрагменты/усеченные полипептиды описаны в заявке АО 03/004651 (включенной сюда посредством ссылки). Особенно подходящими для этой цели фрагментами является полипептид, включающий (или состоящий из) Б2-фрагмент, описанный в заявке АО 03/004651, или последовательности, идентичные с ним на 60, 70, 80, 90, 95, 99%, которые предпочтительно сохраняют активность связывания Ι§Ό человека.
Компоненты МШ и ИкрА этой комбинированной вакцины могут быть отделены друг от друга, или они могут быть подходящим образом слиты вместе с помощью известных методов молекулярной биологии.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 демонстрируются тринадцать штаммов М. са1атгйа118, проверенных на связывание с фибронектином (А). Сильное связывание фибронектина коррелировало с экспрессией икрА1/А2, определенной с помощью рАЬ против икрА1/А2 (В-Ι). Профили проточной цитометрии М. са1агг11аКк ВВН18 дикого типа и дефицитных в отношении икрА1/А2 мутантов демонстрируют зависимое от икрА1/А2 связывание с растворимым фибронектином. Представлены профили клинического изолята дикого типа (В и Б) и соответствующих мутантов, лишенных икрА1 (С и О) или икрА2 (Ό и Н), и двойных мутантов (Е и Ι), у которых отсутствует и икрА1, и икрА2. Бактерии инкубировали с кроличьими антителами против икрА1/А2 или фибронектином, а затем с рАЬ против фибронектина. Впоследствии добавляли кроличьи БНС-конъюгированные рАЬ с последующим анализом проточной цитометрией. Продемонстрирован типичный эксперимент из трех со средней интенсивностью флуоресценции (МБЦ для каждого профиля.
На фиг. 2 демонстрируется, что дефицитные в отношении икрА2 мутанты М. саГаггйайк КН4 не связывают '^-меченный фибронектин. В качестве отрицательного контроля, не связывающего фибронектин, включили Е. со11 ВЬ21. Бактерии инкубировали с 'М-меченным фибронектином с последующими несколькими промывками и анализировали в гамма-счетчике. За 100% приняли связывание фибронектина с КН4 дикого типа, экспрессирующим и икрА1, и А2. Показаны средние значения трех независимых экспериментов. Планки погрешностей представляют стандартные отклонения (8Ό). Схожие результаты были получены с М. са1аттйа118 ВВН18.
На фиг. 3 демонстрируются фотографии, подтверждающие, что мутанты М. саГаггйаПк, лишенные икрА1 и икрА2, не связываются с иммобилизованным фибронектином. М. са1атгйа118 дикого типа мог адгезироваться к покрытым фибронектином предметным стеклам с высокой плотностью (А). Мутант М. саГаггйайк АикрА1 также сохранял высокую плотность адгезии (В), в то время как М. са1аттйа118 АикрА2 и двойные мутанты АикрА1/А2 слабо адгезировались (С и Ό). Предметные стекла покрывали фибронектином и инкубировали с М. са1атгйа118 КН4 и его соответствующими мутантами икрА1/А2. После нескольких промывок бактерии окрашивали по Граму.
Фиг. 4 представляет собой график, на котором демонстрируется, что рекомбинантные икрА1 и А2 связываются с фибронектином зависимым от дозы способом. Для икрА150-770 и икрА230-539 показано специфическое связывание фибронектина. Обоими белками ИркА (40 нМ) покрывали микротитрационные
- 12 014352 планшеты и инкубировали с возрастающими концентрациями фибронетина с последующим обнаружением с помощью кроличьих рЛЬ против фибронектина человека и НКР-конъюгированных антикроличьих рАЬ. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей указывают стандартные отклонения (8И).
Фиг. 5. Активные связывающие фибронектин домены ИкрА1 и ИкрА2 находятся между аминокислотами 299-452 и 165-318 соответственно. Показаны усеченные белки, полученные из ИкрА1 (А) и ИкрА2 (В). Все фрагменты проверяли на связывание с фибронектином в ЕЬ18А. 40 нМ каждого усеченного фрагмента покрывали микротитрационные планшеты и инкубировали с 80 мкг/мл и 120 мкг/мл фибронектина для ИкрА1 и ИкрА2 соответственно. Связанный фибронектин обнаруживали с помощью кроличьих рАЬ против фибронектина, а затем НКР-конъюгированных антикроличьих рАЬ. Показаны результаты трех наборов экспериментов. Планки погрешностей представляют стандартные отклонения (8Ό).
На фиг. 6 демонстрируется последовательность в соответствии с последовательностью ГО N0: 1 и гомология последовательностей между ИкрА1299-452 и ИкрА2165-318. В скобках находятся 31 идентичных аминокислотных остатков.
На фиг. 7 демонстрируется, что усеченные фрагменты ИкрА150-491 и ИкрА1299-452 конкурентно ингибируют зависимое от ИркА связывание М. са1атгйа11к с фибронектином. В качестве отрицательных контролей включали двойные мутанты АикрА1/А2 М. саШггНаНк, которые не связывают фибронектин. Рекомбинантные белки ИкрА1 предварительно инкубировали с 2 мг/100 мл фибронектина до инкубации с М. са1агг11аЙ5. Представлены средние значения флуоресценции (МЕ1) М. са1аггПаНк со связанным фибронектином, обнаруживаемым с помощью Е1ТС-конъюгированных рАЬ против фибронектина в анализе проточной цитометрией. ИкрА150-491 и ИкрА 1299-452 приводили к ингибированию на 95 и 63% соответственно. Планки погрешностей представляют средние значения ± стандартные отклонения (8И) трех независимых экспериментов.
На фиг. 8 демонстрируется, что ИкрА1299-452 и ИкрА2165-318 ингибируют адгезию М. са1атгйа11к к клеткам конъюнктивы Чанг через ассоциированный с клетками фибронектин. Эпителиальные клетки Чанг экспрессируют фибронектин на поверхности, что обнаружено с помощью рАЬ против фибронетина и проточной цитометрии (А). Предварительная инкубация со связывающими фибронектин белками ИкрА1299-452, ИкрА2165-318 или рАЬ против фибронектина приводила к значительному уменьшению связывания М. са1атгйа11к КН4 по сравнению с контрольными рекомбинантными белками (икрА1433-580 и ИкрА230-177) и контрольным антителом (мАЬ против 1САМ1) (В). Р<0,05 при проверке по критерию Стьюдента на основе двойной выборки. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей указывают стандартные отклонения (8И).
На фиг. 9А демонстрируется связывание М. саЮггйайк КН4 с ламинином через ИкрА1 и А2. М. са1атгйа118 КН4 дикого типа (дикий тип) сильно связывался с иммобилизованным ламинином со средней 0И, составляющей 1,27. КН4АикрА1 продемонстрировал среднюю 0И, составляющую 1,14 (89,9% дикого типа). КН4АикрА2 и двойной мутант КН4АикрА1/А2 имели среднюю 0И, составляющую 0,19 и 0,23 соответственно (15,0 и 18,1% дикого типа). Это не значительно отличалось от остающейся необъясненной адгезии к покрытым бычьим сывороточным альбумином планшетам.
Микротитрационные планшеты покрывали 30 мкг/мл ламинина или бычьего сывороточного альбумина. Их блокировали с последующей инкубацией с суспензией бактерий и, наконец, промывали. Связанные бактерии обнаруживали с помощью рАЬ против МГО и НКР-конъюгированных антикроличьих рАЬ. Показаны усредненные результаты трех представляющих экспериментов. Планки погрешностей представляют стандартные отклонения (8И).
На фиг. 9В демонстрируется связывание рекомбинантных ИкрА1 и А2 с ламинином зависимым от дозы способом. Специфическое связывание с ламинином показано для ИкрА150-770 и ИкрА230-539. Микротитрационные планшеты покрывали обоими белками ИркА (40 нМ) и инкубировали с возрастающими концентрациями ламинина с последующим обнаружением с помощью кроличьих рАЬ против ламинина и НКР-конъюгированных антикроличьих рАЬ. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей указывают стандартные отклонения (8И).
На фиг. 10А и В демонстрируется, что активные связывающие ламинин домены ИкрА150-770 (А) и ИкрА230-539 (В) находятся в Ν-концевых половинах. Микротитрационные планшеты покрывали 40 нМ 50-770 30-539 рекомбинантных ИкрА1 - и ИкрА2 - вместе с усеченными белками и инкубировали с 20 мкг/мл ламинина с последующим обнаружением с помощью кроличьих рАЬ против ламинина и НКРконъюгированных антикроличьих рАЬ. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей указывают стандартные отклонения (8И).
Фиг. 11 является схематической иллюстрацией С3, ковалентно связанного С3Ь и С3шс1. (А) С3молекула в сыворотке состоит из одной α-цепи и одной β-цепи. (В) α-Цепь содержит внутренний тиоэфирный сайт, который после активации может ковалентно присоединиться к поверхности микробов. (С) С3 обрабатывали метиламином, который становится ковалентно связанным с тиоэфиром.
На фиг. 12 иллюстрируется, что М. са1атгйа11к нейтрализует классический и альтернативные пути
- 13 014352 системы активации комплемента с помощью белков внешней мембраны и§рА1 и А2. (А) М. са!аггйа118 ΒΗ4 дикого типа (дикий тип), мутанты АикрА1, АикрА2 или АикрА1/А2 инкубировали в присутствии 10% ΝΗδ. (В) Мутант АикрА 1/А2 инкубировали с 10% ΝΗδ, дополненной или БОТА, или Мд-ЕСТА. Бактерии собирали в указанные моменты времени. После инкубации в течение ночи подсчитывали колониеобразующие единицы (сГи). За 100% принимали число бактерий в начале экспериментов. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей указывают стандартные отклонения (δΌ). (А) Средние значения после 5 мин для мутантов АикрА1, АикрА2 или АикрА1/А2 значительно отличались от дикого типа (Р <0,05). (В) Средние значения после 5 мин для мутанта АикрА1/А2 и после 10 мин для мутанта АикрА1/А2, проинкубированного с Мд-ЕСТА, значительно отличались от дикого типа (Р <0,05).
На фиг. 13 иллюстрируется, что Могахе11а са!аггйа118 связывает С3 в сыворотке независимо от активации комплемента. Профили проточной цитометрии, демонстрирующие связывание С3 с (А) М. са!агЛа118 или (В) 8!гер!ососси5 рпеишошае. Бактерии инкубировали с ΝΗδ или ΝΗδ, предварительно обработанной ЕЭТА. После этого добавляли кроличий рАЬ против С3б человека и в качестве вторичных антител козьи Е1ТС-конъюгированные антикроличьи рАЬ с последующим анализом проточной цитометрией. За фоновую флуоресценцию принимали бактерии в отсутствие ΝΗδ, но в присутствии обоих рАЬ. Показан один представляющий эксперимент из трех.
На фиг. 14 иллюстрируется, что М. са!аггйа118 нековалентно связывает очищенный обработанный метиламином С3 зависимым от дозы способом, и что связывание основывается на ионных взаимодействиях. Профили проточной цитометрии, демонстрирующие (А) связывание с возрастающими концентрациями С3ше1. (В) Показана средняя интенсивность флуоресценции (МЕ1) каждого профиля в окне (А). (С) Связывание ΚΗ4 с С3ше! уменьшается с возрастанием концентраций №С1. Бактерии инкубировали с С3ше! с или без ИаС1, как указано. Связывание С3ше! измеряли с помощью проточной цитометрии, как описано в описании к фиг. 13. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения (δΌ). *Р <0,05, **Р <0,01, ***Р <0,001.
На фиг. 15 иллюстрируется, что профили проточной цитометрии М. са!аггйа118 ΒΗ4 дикого типа и дефицитных в отношении и§рА1/А2 мутантов демонстрируют зависимое от ИкрА 1/и§рА2 связывание С3ше!/С3. Показаны профили клинического изолята дикого типа (А, Е, К) и соответствующих мутантов, лишенных белков МШ (В, С, Ь), икрА1 (С, Н, М) , икрА2 (Ό, I, Ν) или обоих белков икрА1 и икрА2 (Е, 1, О). Бактерии инкубировали с С3ше! (А-Е), ΝΗδ-ЕОТА (Е-1) или ΝΗ8 (К-О) и определяли, как указано в подписи к фиг. 3. Показан один типичный эксперимент из трех со средней интенсивностью флуоресценции (МЕ1) для каждого профиля.
На фиг. 16 иллюстрируется, что С3ше! связывается с очищенным рекомбинантным и§рА230-539, в то время как наблюдается только слабое связывание С3ше! с и§рА150-770. Кроме того определено, что связывающая С3ше! область икрА2 находится между аминокислотными остатками 200-458. (А) Рекомбинантные ЕАрАГ и икрА230-539 иммобилизовали на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали с [1251]-меченным С3ше! в течение ночи и связанный белок визуализировали с помощью Регкопа1 ЕХ (Вю-Ваб) с использованием усиливающих экранов. В качестве отрицательного контроля включали рекомбинантный белок МШ962-1200 (В)
Микротитрационные планшеты покрывали икрА150-770, икрА230-539 и рядом усеченных белков икрА2 и инкубировали с С3ше! с последующей инкубацией с козьими рАЬ против С3 человека и ΗΒΡконъюгированными антикозьими рАЬ. Показаны средние значения трех экспериментов. Из всех образцов вычитали фоновое связывание. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям (8Ό). *Р < 0,05, **Р <0,01, ***Р <0,001.
На фиг. 17 иллюстрируется, что добавление рекомбинантных икрА150-770 и икрА230-539 к сыворотке ингибирует осаждение С3Ь и гибель М. са!атЛа118 через альтернативный путь. Профили проточной цитометрии демонстрируют осаждение С3Ь на ВИ4Ан5рА1/А2 после инкубации с (А) ΝΗδ или ΝΗδ, предварительно проинкубированной с рекомбинантными икрА150-770 и икрА230-539, или (В) ΝΗδ-Мд-ЕСТА или ΝΗδ-Мд-ЕСТА, предварительно проинкубированной с и§рА150-770 и и§рА230-539. После добавления различных комбинаций ΝΗδ бактерии анализировали, как описано в подписи к фиг. 13. (С) ВЩАщрАКАЗ инкубировали с 10% ΝΗδ или ΝΗδ-Мд-ЕСТА. Для ингибирования ΝΗδ-Мд-ЕСТА инкубировали со 100 нМ ЕАр.АЕ и/или и§рА230-539 до добавления бактерий. Бактерии собирали в различные моменты времени. За 100% принимали число бактерий в начале экспериментов. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей указывают стандартные отклонения (δΌ). Моменты времени 10, 20 и 30 мин для мутанта АикрА1/А2, предварительно проинкубированного с рекомбинантными белками, значительно отличались от таких моментов времени для мутанта АикрА1/А2, проинкубированного только с Мд-ЕСТА (Р <0,05).
На фиг. 18 иллюстрируется, что рекомбинантные и§рА150-770 и и§рА230-539 уменьшают гемолиз эритроцитов кролика посредством ингибирования альтернативного пути. ΝΗδ инкубировали с или без 100 нМ ЕАрАЕ и/или и§рА230-539 при 37°С в течение 30 мин. После этого ΝΗδ в указанных концентрациях добавляли к эритроцитам кролика. После инкубации в течение 30 мин суспензии центрифугиро
- 14 014352 вали и супернатанты измеряли с помощью спектрофотометрии. Максимальный гемолиз в каждом эксперименте принимали за 100%. Показаны средние значения трех отдельных экспериментов, а планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям (8Ό). Результаты, полученные с использованием N48 + υδρΆ230-539 и N48 + ИкрЛ 150-770/υ§ρΑ230-539 при концентрациях N48. составляющих 2, 3 и 4%, значительно отличались от ХН8-контролей (Р <0,05).
На фиг. 19 иллюстрируется анализ сопоставления υ§ρΛ1 восьми различных штаммов для того, чтобы показать гомологию различных частей υ§ρΛ1.
На фиг. 20 иллюстрируется анализ сопоставления υ§ρΛ2 тринадцати различных штаммов для того, чтобы показать гомологию различных частей υ§ρΛ1.
На фиг. 21 иллюстрируется % идентичности в областях, идентифицированных в Рогкдгеппоследовательности, подсчитанный как отношение между числом точных соответствий и длиной выровненной области, причем выровненная область - это та часть вышеуказанного общего выравнивания, которая содержит Рогкдгеп-область.
Материалы и методы
Взаимодействие между М. са1агг11аЙ5 и фибронектином.
Бактериальные штаммы и условия культивирования.
В табл. 7 перечислены источники клинических штаммов М. са1аггНа115. Мутанты М. са1агг11аЙ5 ВВН18 и КН4 конструировали, как описано ранее [23, 58]. Штаммы М. са1аггНа115 в заведенном порядке культивировали в жидком бульоне с мозговым и сердечным экстрактами (ВН1) или на чашках с ВН1агаром при 37°С. Дефицитные в отношении υ§ρΛ мутанты культивировали в ВН1, дополненном 1,5 мкг/мл хлорамфеникола (81дта, 81. Ьошк, МО), а дефицитные в отношении υ§ρΛ2 - мутанты инкубировали с 7 мкг/мл зеоцина (1пуйгодеп, СагкЬаё, СА). Для выращивания двойных мутантов использовали и хлорамфеникол, и зеоцин.
Таблица 7 Клинические штаммы М. са[аггйа118, используемые в настоящем изобретении
| Штамм | Клинический источник | Ссылка |
| ВВН18 | Мокрота | [53] |
| ϋΐ | Мокрота . | [53] |
| Ηί49 | Мокрота | [53] |
| СЮ | Мокрота | [10] |
| Р16 | Мокрота | [10] |
| Вго2 | Дыхательные пути | [53] |
| Ζ14 | Глотка | [Ю] |
| 36-688 | Носоглотка | [23] |
| ВС5 | Носоглотка | [20] |
| КН4 | Кровь | [53] |
| НН 6 | Кровь | [53] |
| К14 | Не известен | [10] |
| Β4 | Не известен | [Ю] |
| 30-1914 | Материал, полученный аспирацией из барабанной полости | [23] |
Примечание: Штаммы С10, К4 не имеют гена υ§ρΑ1, в то время как у штаммов Р16, К.14, Ζ14 отсутствует ген υ§ρΑ2 [10]. Остальные штаммы содержали оба гена υ§ρΑ1 и А2 (данные не показаны).
ДНК-метод.
Для обнаружения присутствия генов ιΐδρΑΡ А2 и А2Н в тех штаммах, для которых это не известно, использовали праймеры и условия ПЦР, описанные Ме1ег и др. [50]. Частичное секвенирование υ§ρΑ1299-452 и υ§ρΑ2165-318 проводили с использованием 5'- и 3'-праймеров соответствующих генов ιιφΑ1 и υ§ρΑ2 КН4 и ВВН18. Подтверждение присутствия аминокислотных остатков ^^ΚΑ^I^NNINNIΥΕΡΑ000Ο0Η88ΟΙΚΤΡΚ также проводили с помощью ПЦР с использованием праймера (5'Сααα6СΤ6ΑСΑΤССΑΑ6СΑСΤΤ6-3'), сконструированного с 5'-конца этой последовательности, и 3'праймеров для υ§ρΑ1 и А2, как описано Ме1ег и др. [50]. Конструирование и экспрессия рекомбинантных белков Недавно были описаны рекомбинантные υ§ρΑ150-770 и υ§ρΑ2230-539, лишенные своих гидрофобных С-концов [58]. Геномную ДНК экстрагировали из М. са1агг11аЙ5 Вс5, используя набор Э№а5у Й88ие (Р1адеп, Нйёеп, Оегтапу). Кроме того, с помощью того же самого метода были также сконструированы рекомбинантные белки, соответствующие множественным областям, охватывающим υ§ρΑ150-770 и υ§ρΑ230-539. В табл. 8 перечислены использованные праймеры. Все конструкции секвенировали в соответствии со стандартными методами. Экспрессию и очистку рекомбинантных белков осуществляли, как
- 15 014352 описано ранее [59]. Белки очищали, используя колонки, содержащие смолу с никелем (№уадеп). в соответствии с инструкциями производителя для нативных условий. Рекомбинантные белки анализировали с помощью электрофореза в δΌδ-РАОЕ [21].
Таблица 8
Праймеры, используемые в настоящем изобретении
| Белок | 5'-праймер | 3'-праймер |
| изрА!30·™ | £с£1с1ёс§£а1сса£4а£§саа£§саасс | ссс(£аа£сШа£1ёса1аасс1аай£ |
| изрА15МС” | §С51с1£с^§а1сса^Са£2саа2§саасс | Й§а£сааесГ1а2сй8§йй1а£сд |
| изрА!50'”7 | 8е£(с1§с5еа1сса§1аввсаа88саасс | асс1§1§£саа§сйсйсс1§сс |
изрА!30 321 8с£1с18сё§а1сса§1а£8саае8саасс £81§1сайаа§сйасс1^сассааса18аас изрА129МЯ 88аШ§савв15са1с£8а1сс1§21аа1§81ас1 изрА143мао саШрйс^аШ^аХссасйааааас изрА!337-™ £ссааа§сасаа£о§§а1ссааа1ааа§ас изрА!380 770 еЙ2аясаааа^а1ссса1саа1сааёа§ изрА2м'Я9 с§аах§СЁёа1ссгааааа1§а1агаасйХа§ае§ ΌερΑ^30’177 с§аа(2сц§а1сс1ааааа1@а1а1аас1йа^а§2 изрА211)1’М11 §а1ай8с§еа1ссеёааеа1ба1®йвааас изрА2101·318 2а1ай8С8еа1ссёеаа§а1ва(8П§ааас изрА2143-”8 £а£ай§а£аа£йа1соа§а1(2;с1а11§с1 изрА2эвг*36 £01саааассааесе§агссссаа§аШ£ изрАг443-339 §еаа§1ос18сз§а1ссг§а1с§1ай§с1 р^сйй^аадаЮаацсйИ^аЮаа!
са1§<й§а£аа§сиасс1а1»аи§£
ЕекШ«§§£а51аа8сйа8сП85йй2 ссс1“аа£сШа£1§саиасс1аайё саПаа§сйё§С£1йаа1еса§йас с1са1§ассаааагсаа§сйа1сйс§а!а°ас1с §а1:саайа£сиасс£сйаеай;гаа1аейсйс 51саа1сйсйсаа§сисйй§аЁСаГас1ц £1саа1сдсйсааёсйсйй§а§са1ас1е 2^§а£С(^саа£сЩ£сагса£са1со£с сайаа£с11££1£1сиа1ёса&йас
Антитела.
Недавно подробно описаны кроличьи поликлональные антитела (рАЬ) против ИкрА1/А2 [58]. Другими использованными антителами были кроличьи рАЬ против фибронектина человека, свиные конъюгированные с Е1ТС (флуоресцинизотиоцианатом) антикроличьи рАЬ, свиные конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР) антикроличьи рАЬ и, наконец, мышиные моноклональные антитела (тАЬ) против СЭ54 человека (1САМ1). Антитела получали от Оакорайк (О1окйир, Дания).
Анализ проточной цитометрией.
Экспрессию белков ИкрА1/А2 и способность М. са!аггйа11к связываться с фибронектином анализировали с помощью проточной цитометрии. Штаммы М. са!аггйа11к дикого типа и дефицитные в отношении ИкрА1/А2 мутанты выращивали в течение ночи и промывали дважды забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 3% рыбьего желатина (РВ8-желатин). Затем бактерии (108) инкубировали с антисывороткой против ИкрА1/А2 или 5 мкг фибронектина (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО). Затем их промывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с Е1ТС-конъюгированными антикроличьими рАЬ (разведенными в соответствии с инструкциями изготовителя) или с 1/100 разведением кроличьих рАЬ против фибронектина человека (если сначала добавляли фибронектин) в течение 30 мин при комнатной температуре перед инкубацией с Е1ТС-конъюгированными антикроличьими рАЬ. После трех дополнительных промывок бактерии анализировали с помощью проточной цитометрии (ЕР1С8, ХЬ-МСЬ, СоиЙег, Н1а1еай, ЕЬ). Все инкубации проводили в конечном объеме 100 мкл РВ8-желатин, а промывки осуществляли с использованием того же буфера. Для каждого анализируемого штамма в качестве отрицательного контроля использовали рАЬ против фибронектина и Е1ТС-конъюгированные антикроличьи рАЬ. Исследования ингибирования фибронектина проводили с помощью предварительного инкубирования в течение 1 ч 0,25 мкмоль фрагментов ИкрА с 2 мкг фибронектина до инкубации с бактериями М. са!аггйа11к (108). Оставшееся свободным количество фибронектина, который связывался с М. са1аггВаНк, определяли с помощью проточной цитометрии, как отмечено выше.
Связывание М. са1агг11аКк с иммобилизованным фибронектином.
Предметные стекла покрывали 30 мкл-аликвотными пробами фибронектина (1 мг/мл) и высушивали на воздухе при комнатной температуре. После промывки один раз РВ8 предметные стекла инкубировали в чашках Петри с предварительно охлажденными бактериями в поздней экспоненциальной фазе (оптическая плотность (0Ό) при 600 нм = 0,9). После 2 ч при комнатной температуре предметные стекла промывали один раз РВ8 с последующим окрашиванием по Граму.
Мечение белков и радиоиммуноанализ (РИА).
Фибронектин метили 125йодом (Атегкйат, ВисктдйаткЫге, Епд1апб) до высокой специфической активности (0,05 моль йода на моль белка) методом с использованием хлорамина Т [21]. Штаммы ВВН18 и КН4 М. са!аггйа11к вместе с их соответствующими мутантами выращивали в течение ночи на твердой
- 16 014352 среде и промывали РВБ с 2% бычьего сывороточного альбумина (ВБА). Бактерии (108) инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 1251-меченным фибронектином (1600 · 103 имп/мин/образец) в РВБ, содержащем 2% ВБА. После трех промывок РВБ с 2% ВБА 1251-меченный фибронектин, связанный с бактериями, измеряли в гамма-счетчике (^а11ас, Екроо, Финляндия).
Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А)
Микротитрационные планшеты (Мшс-Ипишпо Моби1е; КоккШе, Дания) покрывали в течение ночи при 4°С 40 нМ очищенных рекомбинантных белков икрА150-770 и икрА230-539 в 75 мМ натрия карбоната, рН 9,6. Планшеты промывали четыре раза буфером для промывок (50 мМ Тпк-НС'Т 0,15 М №101 и 0,1% твин-20, рН 7,5) и блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре буфером для промывок, содержащим 3% рыбьего желатина. После четырех дополнительных промывок лунки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с фибронектином (120 мкг/мл), последовательно разведенным трехквадратично каждый раз в 1,5% рыбьем желатине (в буфере для промывок). После этого планшеты промывали и инкубировали с кроличьими рАЬ против фибронектина человека в течение 1 ч. После дополнительных промывок добавляли НКР-конъюгированные антикроличьи рАЬ и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. И рАЬ против фибронектина человека, и НКР-конъюгированные антикроличьи рАЬ разводили 1:1000 в буфере для промывок, содержащем 1,5% рыбьего желатина. Лунки промывали четыре раза и планшеты проявляли и измеряли ΘΌ450. ЕЬИЗА с усеченными белками, охватывающими 50-770 30-539 икрА150-770 и икрА230-539, выполняли с использованием установленных доз фибронектина при 80 мкг/мл и 120 мкг/мл соответственно.
Анализ ингибирования адгезии клеточной линии
Клетки конъюнктивы Чанг (АТСС ССЬ 20.2) культивировали в среде КРМ1 1640 (01Ьсо ВКЬ, БИс Тесйио1од1ек, Ра1к1еу, Шотландия), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина и 12 мкг гентамицина/мл. За день до экспериментов по ингибированию адгезии клетки собирали, дважды промывали свободной от гентамицина средой КРМ1 1640 и добавляли в 96-луночные планшеты для культуры тканей (№.тс) в конечной концентрации 104 клеток/лунку в 200 мкл свободной от гентамицина культуральной среды. После этого клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО2 и 95% воздуха. В день эксперимента ингибирование адгезии М. сИаггйаНк проводили с помощью предварительной инкубации возрастающих концентраций рекомбинантных усеченных белков икрА1/А2, содержащих связывающие фибронектин домены (икрА1229-452 и икрА2165-318), или кроличьих рАЬ против фибронектина человека (разведенных 1:50) в течение 1 ч. В качестве контролей использовали не связывающие фибронектин рекомбинантные белки (икрА1433-580 и икрА230-177). Известно, что эпителиальные клетки Чанг экспрессируют 1САМ1 [18].
Следовательно, антитела против 1САМ1 использовали для определения, является ли ингибиторный эффект антител против фибронектина вторичным по отношению к стерическому препятствию. Впоследствии на конфлюэнтные монослои наносили М. са1атгйа11к КН4 (106) в РВБ-желатине. Во всех экспериментах планшеты для культуры тканей центрифугировали при 3000/д в течение 5 мин и инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 30 мин инфицированные монослои ополаскивали несколько раз РВБжелатином для удаления не прикрепившихся бактерий и затем обрабатывали трипсином-ЕЭТА (0,05% трипсина и 0,5 мМ ЕЭТА) для отсоединения клеток Чанг от пластиковой подложки. После этого полученные в результате клетки/бактериальную суспензию помещали при разведении на чашки, содержащие ВН1-агар, и инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% СО2.
Определение экспрессии фибронектина в эпителиальных клетках конъюнктивы Чанг
Эпителиальные клетки конъюнктивы Чанг собирали соскобом с последующим ресуспендированием в РВБ-желатине. Клетки (1/106/мл) метили с использованием кроличьих рАЬ против фибронектина человека с последующими промывкой и инкубацией с НТС-конъюгированными антикроличьими рАЬ. После трех дополнительных промывок клетки анализировали с помощью проточной цитометрии, как отмечено выше.
Взаимодействие между М. саЕаггйаЩ и ламинином
Бактериальные штаммы и условия культивирования.
Клинические штаммы ВВН18 и КН4 М. са1агг11аНк и их соответствующие мутанты описаны ранее [58]. Оба штамма экспрессируют относительно больше икрА2, чем икрА1 [58]. Мутанты экспрессировали равное количество связывающего Ιβϋ белка М. са1атгйа11к (МШ) по сравнению со штаммами дикого типа. Бактерии в заведенном порядке культивировали в жидком бульоне с мозговым и сердечным экстрактами (ВН1) или на чашках с ВН1-агаром при 37°С. Дефицитные в отношении икрА1 мутанты, дефицитные в отношении икрА2 мутанты и двойные мутанты культивировали в ВН1, дополненном антибиотиками, как описано [58].
Конструирование и экспрессия рекомбинантных белков.
Были получены рекомбинантные икрА150-770 и икрА230-539, лишенные своих гидрофобных С-концов [58]. Кроме того, использовали рекомбинантные белки, соответствующие множественным областям, охватывающим икрА150-770 и икрА230-539 [78].
- 17 014352
Антитела.
Использовали кроличьи поликлональные антитела (рАЬ) против ИкрА1/А2 и МГО [22, 58]. Кроличьи рАЬ против ламинина получали от 81дта (81 Ьошк, МО, США). Свиные конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР) антикроличьи рАЬ получали от ЭакораИк (61ок1гир, Дания).
Связывание М. са1аггйа11к с иммобилизованным ламинином.
Микротитрационные планшеты (Ыипс-1ттипо Мойи1е; КоккШе, Дания) покрывали в течение ночи при 4°С ламинином саркомы мыши Епде1Ьге1й-Но1т-8^агт (81дта, 8ат1 Ьошк, США) или бычьим сывороточным альбумином (В8А) (30 мкг/мл) в Тпк-НС1, рН 9. Планшеты промывали забуференным фосфатом солевым раствором и 0,05% твин-20, рН 7,2 (РВ8-твин) и впоследствии блокировали 2% В8А в РВ8 + 0,1% твин-20, рН 7,2. Затем добавляли М. са1аггйа11к КН4 и ВВН18 (108) в 100 мкл с последующей инкубацией в течение 1 ч. Несвязанные бактерии удаляли промывкой 3 раза РВ8-твином. Оставшиеся связанными бактерии определяли посредством рАЬ против МШ с последующим обнаружением с помощью НКР-конъюгированных антикроличьи рАЬ. Планшеты проявляли и измеряли ОО450 в соответствии со стандартным протоколом.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А)
Микротитрационные планшеты (Ыипс-1ттипо Мойи1е) покрывали при 4°С 40 нМ очищенных рекомбинантных белков ИкрА150-770 и ИкрА230-539 в 75 мМ натрия карбоната, рН 9,6. Планшеты промывали четыре раза буфером для промывок (50 мМ Тпк-НС1, 0,15 М ЫаС1 и 0,1% твин-20, рН 7,5) и блокировали при комнатной температуре буфером для промывок, содержащим 3% рыбьего желатина. После дополнительных промывок лунки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с ламинином в различных разведениях, как указано, в 1,5% рыбьем желатине (в буфере для промывок). После этого планшеты промывали и инкубировали с кроличьими рАЬ против ламинина. После дополнительных промывок добавляли НКР-конъюгированные антикроличьи рАЬ и инкубировали при комнатной температуре. И рАЬ против ламинина, и НКР-конъюгированные антикроличьи рАЬ разводили 1:1000 в буфере для промывок, содержащем 1,5% рыбьего желатина. Лунки промывали, и планшеты проявляли и измеряли О1Т, . В качестве являющихся фоном контролей использовали непокрытые лунки, проинкубированные с идентичными разведениями ламинина. ЕЬ18А с усеченными белками, охватывающими ИкрА150-770 и ИкрА230-539, выполняли с использованием установленных доз ламинина (20 мкг/мл).
Взаимодействие между М. са1аггЬаЙ8 и С3 и С3ше1
Бактериальные штаммы и условия культивирования.
Недавно были подробно описаны клинические изоляты М. са1аггйа11к и родственные подвиды [21, 53]. Типовые штаммы получали из коллекции культур, Ишуегкйу о£ СоШеиЬигд (ССИС; ОераПтеЩ о£ С11шса1 Вас1епо1оду, 8аЫдгеикка Нокрйа1, СоШепЬигд, Швеция) или американской коллекции типовых культур (АТСС; Мапаккак, Уа); №1ккепа доиоггйеае ССИ6 15821, 81гер1ососсик руодепек ССИ6 25570 и 25571, 81гер1ососсик ада1асйае ССИ6 4208, 81гер1ососсик рпеитошае АТСС 49619, Ьедюпе11а рпеиторЫ1а АТСС 33152, Ркеийотопак аегидшока АТСС 10145, 81арйу1ососсик аигеик АТСС 29213 и, наконец, 81арйу1ососсик аигеик АТСС 25923. Остальные штаммы, представленные в табл. 9, были клиническим изолятами из МеФса1 М1сгоЬю1оду, Эераг1теп1 о£ ЬаЬога1огу МеФсше, Ма1то Ищуегкйу Нокрйа1, Ьипй Игауегкйу, Швеция.
Таблица 9
М. са1агг11айк является уникальной связывающей С3/С3те1 бактерией. Родственные подвиды Могахе11а и другие частые патогены человека не связывают С3/С3те1 (средняя интенсивность флуоресценции (МЕ1) <2,0). После инкубации с ЕОТА-обработанной ΝΉ8 или С3те1 бактерии анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием кроличьих рАЬ против С34 и Е1ТСконъюгированных козьих антикроличьих рАЬ.
- 18 014352
| Ν. £2ага ' | <2,0 | < 2,0 |
| N. зиЬ£2ауа | < 2,0 | < 2,0 |
| ОИдеИа игео1уЫса (п=2) | < 2,0 | < 2,0 |
| НаеторкНиз 1п£1иепгаз (п=7) | <2,0 | < 2,0 |
| 5Егереососсиа рпеитоп1ае (п=11) | <2,0 | <2,0 |
| Еед1опе11а рпеиторЬИа (п=2) | . <2,0 | < 2,0 |
| Рзеидотопаз аегидгпоза (п=2) | <2,0 | <2,0 |
| ЫзСегда топосуСодепез | < 2,0 | <2,0 |
| Уегз±п1а еп£егсоИ£1са | < 2,0 | <2,0 |
| ЗСар11у1ососсиз аигеиз (п=3) | < 2,0 | < 2,0 |
| ЗИгерРососсиз руодепез (п=2) | < 2,0 | < 2,0 |
| ЗЕгерЕососсиэ ада!асЫа . | < 2,0 | <2,0 |
| ЕпСегососсиз ЕаесаИз· | <2,0 | <2,0 |
| НеИсоЬасЬег ру1ог± | < 2,0 | < 2,0 |
| Езскег^сЫа соИ (п=2) | < 2,0 | <2,0 |
| Μ. ονίε | <2,0 | <2,0 |
| М, сатг!ае | <2,0 | <2,0 |
| Яе£ззег1а допоггкеае | <2,0 | <2,0 |
| Ν. теп1пдС1сИз | < 2,0 | <2,0 |
| Ν. тисова | < 2,0 | <2,0 |
Различные не являющиеся Могахе11а виды выращивали в соответствующих стандартных средах для культивирования. Штаммы М. са(агг11а1й в заведенном порядке культивировали в жидком бульоне с мозговым и сердечным экстрактами (ΒΗΙ) или на чашках с ΒΗΙ-агаром при 37°С. Мутанты М. са(агг11а1й ΒΒΗ18 и ΚΗ4 получали, как описано ранее [22, 23, 58]. Дефицитные в отношении ΜΙΌ мутанты выращивали в ΒΗΙ, содержащем 50 мкг/мл канамицина. Дефицитные в отношении и§рЛ1 мутанты культивировали в ΒΗΙ, дополненном 1,5 мкг/мл хлорамфеникола (81дша, 8ΐ. Ьошк, МО), а дефицитные в отношении и§рА2 мутанты инкубировали с 7 мкг/мл зеоцина Дпуйгодеп, СагйЬаб. СА). Для выращивания двойных мутантов и§рА1/А2 использовали и хлорамфеникол, и зеоцин.
Антитела
Кроликов иммунизировали внутримышечно 200 мкг рекомбинантного полноразмерного и§рА1, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (Όίίεο, Βесΐοη П1ск1И8оп, Ηе^бе1Ье^д, Германия), и на 18 и 36 день вторично инъецировали такую же дозу белка в неполном адъюванте Фрейнда [22]. Кровь брали спустя 3 недели. Для увеличения специфичности антисыворотку против и§рА1 подвергали аффинной очистке с использованием коъюгированного с Сефарозой рекомбинантного и§рА150-770 [58]. Антисыворотка в одинаковой степени связалась с и§рА1 и и§рА2, и поэтому ее обозначили рАЬ против и§рА1/А2. Кроличьи рАЬ против 036 человека и свиные конъюгированные с МТС антикроличьи рАЬ покупали у ОакораЮ (С1о8Ггир, Дания), а козьи антитела против С3 человека получали от Абуапсеб Векеагсй Тесйпо1още5 (8ап П1едо, СА). Ослиные конъюгированные с пероксидазой хрена (ΗΚΡ) антикозьи рАЬ получали от 8егоГес (ОхГогб, Соединенное Королевство).
Белки и мечение йодом
Недавно было описано получение рекомбинантных и§рА150-770 и и§рА230-539, лишенных своих гидрофобных С-концов [23]. Усеченные белки и§рА1 и и§рА2 получали, как подробно описано Таи и др. [78]. С3Ь покупали у Абуапсеб Векеагсй Тес11по1още5. С3 (Η2Ο) получали с помощью замораживания и оттаивания очищенного С3. Подобную С3Ь молекулу (С3теГ) получали с помощью инкубации очищенного С3 со 100 мМ метиламина (рН 8,0) в течение 2 ч при 37°С и последующим диализом против 100 мМ ТШ-ПО (рН 7,5), 150 мМ ЫаС1. Для исследований связывания С3теГ метили 0,05 моль 125Ι (Атегайат, Βиск^ηдйат8Й^^е, Епд1апб) на моль белка методом с использованием хлорамина Т [25].
Анализ проточной цитометрией
Связывание С3 с М. са(аггйа1й и другими видами анализировали с помощью проточной цитомет
- 19 014352 рии. Бактерии выращивали на твердой среде в течение ночи и промывали дважды РВ8, содержащим 2% В8А (81дта) (РВ8-В8А). После этого бактерии (108 колониеобразующих единиц; с£и) инкубировали с С3те1. С3Ь, С3(Н2О) или 10% N48 с или без 10 мМ НОТА или 4 мМ МдС12 и 10 мМ ЕСТА (Мд-ЕСТА) в РВ8-В8А в течение 30 мин при 37°С. После промывок бактерии инкубировали с рАЬ против С3б человека в течение 30 мин на льду с последующими отмывками и инкубацией в течение дополнительных 30 мин на льду с козьими конъюгированными с Е1ТС антикроличьими рАЬ. После трех дополнительных промывок бактерии анализировали с помощью проточной цитометрии (ЕР1С8, ХЬ-МСЬ, СоиНег, Н1а1еай, ЕЬ). Все инкубации проводили в конечном объеме 100 мкл РВ8-В8А, а промывки осуществляли с использованием того же буфера. Для каждого анализируемого штамма в качестве отрицательного контроля отдельно добавляли рАЬ против С3б человека и Е1ТС-конъюгированные антикроличьи рАЬ. В исследованиях ингибирования сыворотку предварительно инкубировали со 100 мМ рекомбинантных белков ИзрА150-770 и ИзрА230-539 в течение 30 мин при 37°С. Для анализа свойств взаимодействия С3 с М. са!агЛа118 к бактериям и С3те! добавляли возрастающие концентрации №1С1 (0-1,0 М). Для анализа экспрессии ИзрА1/А2 бактерии (108 с£и) инкубировали с рАЬ против ИзрА1/А2 и промывали, как описано выше. Для обнаружения использовали козьи Е1ТС-конъюгированные антикроличьи рАЬ, разведенные в соответствии с инструкциями производителя. Для гарантии того, что ЕЭТА не разрушало белки внешней мембраны ИзрА1 и и§рА2, М. са1атгйа118 инкубировали с или без ЕЭТА с последующим определением экспрессии ИзрА1/А2. При концентрациях, используемых в экспериментах с ΝΗδ-ЕПТА, ЕЭТА не изменял плотность ИзрА1/А2.
Сыворотка и бактерицидный анализ с использованием сыворотки
Нормальную сыворотку человека (N48) получали от пяти здоровых добровольцев. Крови предоставляли возможность коагулировать в течение 30 мин при комнатной температуре и после этого инкубировали на льду в течение 60 мин. После центрифугирования сыворотки объединяли, разливали по аликвотным пробам и хранили при -70°С. Для инактивации и классического, и альтернативного путей добавляли 10 мМ ЕЭТА. Напротив, для инактивации классического пути включали Мд-ЕСТА. Сыворотку человека, дефицитную в отношении С4ВР, готовили пропусканием свежей сыворотки через колонку Н1Тгар (Атетзйат ВюзДепсез) с присоединенными тАЬ 104, мышиными тАЬ, направленными против ССР1 α-цепи С4ВР [41]. Не связавшийся материал собирали и истощенную сыворотку хранили в аликвотных пробах при -70°С. Истощенную в отношении С1с.| сыворотку получали через первый шаг очистки С1с.| [79] с использованием ионообменной хроматографии на Вютех 70 (Вю-Ваб, Негси1ез, СА). Получаемая в результате сыворотка проявляла нормальную гемолитическую активность. Сыворотка, дефицитная в отношении фактора Ό и пропердина, была любезно предоставлена Ότ. Апбегк 8]б1ю1т (ОераПтеЩ о£ Меб1са1 МюгоЬю1оду, Бипб Ишуегайу, Еипб, Швеция). Штаммы М. саГаггНаПь разводили в 2,5 мМ νοгопа1-буфере, рН 7,3, содержащем 0,1% (вес./об.) желатина, 1 мМ МдС12, 0,15 мМ СаС12 и 2,5% декстрозы (ОСУВ++). Бактерии (108 с£и) инкубировали вместе с 10% N48 и ЕОТА или Мд-ЕСТА в конечном объеме 100 мкл. Бактерии/NН8 инкубировали при 37°С, и в различные моменты времени брали 10 мклаликвотные пробы и распределяли по чашкам с ВН1-агаром. При исследовании ингибирования до добавления бактерий 10% сыворотку инкубировали со 100 нМ рекомбинантных белков ИзрА150-770 и 1Ар-\.' в течение 30 мин при 37°С.
Дот-блот анализы
Очищенные рекомбинантные белки ИзрА150-770 и и§рА230-539, последовательно разведенные трехквадратично каждый раз (1,9-150 нМ), в 100 мкл 0,1 М ТИ8-НС1, рН 9,0 наносили на нитроцеллюлозные мембраны (8сЫе1сйет & 8сйи11, Германия), используя дот-блот устройство. После пропитки мембраны инкубировали в течение 2 ч с РВ8-твин, содержащим 5% молочного порошка, при комнатной температуре и промывали четыре раза РВ8-твин. После этого добавляли 5-103 имп/мин [1251]-меченного С3те! в РВ8-твин с 2% молочного порошка и инкубировали в течение ночи при 4°С. Связанный белок визуализировали с помощью Рег8опа1 ЕХ (Вю-Ваб) с использованием усиливающих экранов.
Резонанс поверхностных плазмонов (Ыаеоге)
Взаимодействие между ИзрА150-770 или ИзрА230-539 и С3 далее анализировали с помощью резонанса поверхностных плазмонов (В1асоге 2000; В1асоге, Ирр8а1а, Швеция), как недавно описано для взаимодействия ИзрА1/2-С4ВР [58]. Кс (константу диссоциации при равновесии) рассчитывали из кривой связывания, представленной на графике зависимости ответа при равновесии от концентрации, используя модель аффинности в стационарном состоянии, предоставляемую в программном обеспечении В|аеуа1иа1юп (В1асоге).
Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А)
Микротитрационные планшеты (Мшс-Иптипо Моби1е; Возкббе, Дания) покрывали в течение ночи при 4°С в трех повторах очищенными рекомбинантными белками изрА150-770, ИзрА230-539 или усеченными фрагментами ИзрА1 и ИзрА2 (40 нМ в 75 мМ натрия карбоната, рН 9,6). Планшеты промывали четыре раза буфером для промывок (РВ8 с 0,1% твин-20, рН 7,2) и блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре буфером для промывок, дополненным 1,5% овальбумина (блокирующим буфером). После промывок лунки инкубировали в течение ночи при 4°С с 0,25 мкг С3те! в блокирующем буфере. После
- 20 014352 этого планшеты промывали и инкубировали с козьими антителами против С3 человека в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительных промывок добавляли ослиные НКР-конъюгированные антикозьи рАЬ и инкубировали в течение еще 1 ч при комнатной температуре. Лунки промывали четыре раза и планшеты проявляли и измеряли ОЭ450.
Гемолитическое исследование
Эритроциты кролика промывали трижды охлажденным на льду 2,5 мМ Уетопа1-буфером, рН 7,3, содержащим 0,1% (вес./об.) желатина, 7 мМ МдС12, 10 мМ ЕСТА и 2,5% декстрозы (Мд ЕСТА). и ресуспендировали при концентрации 0,5х109 клеток/мл. Эритроциты инкубировали с различными концентрациями (от 0 до 4%) сыворотки, разведенной в МдЕСТА. Спустя 1 ч при 37°С эритроциты центрифугировали и количество лизированных эритроцитов определяли с помощью спектрофотометрического измерения высвободившегося гемоглобина при 405 нм. Для ингибирования белками и§рА1 и и§рА2 10% сыворотку предварительно инкубировали со 100 нМ рекомбинантных белков и§рА150-770 и/или и§рА230-539 в течение 30 мин при 37°С и после этого добавляли к эритроцитам при 0-4%.
Выделение нейтрофильных лейкоцитов и фагоцитоз
Нейтрофильные лейкоциты (РМЦ) человека выделяли из свежей крови здоровых добровольцев, используя Масгойех (РйаттаПик АВ, Ирр1апЙ8 УакЬу, Швеция). РМN центрифугировали в течение 10 мин при 300хд, отмывали в РВ3 и ресуспендировали в среде КРМ1 1640 (ЬгГе Тесйпо1од1е8, РаЫеу, Шотландия). Суспензию бактерий (0,5х108) подвергали опсоническому влиянию 3% или нормальной сыворотки человека (ΝΗ3), или ΝΗδ-ЕПТА, или 20 мкг очищенного С3те1 в течение 15 мин при 37°С. После промывок бактерии смешивали с РМN (1х107 клеток/мл) в соотношении бактерии/РМN = 1:10 с последующей инкубацией при 37°С при непрерывным вращении. Выжившие после 0, 30, 60 и 120 мин инкубации бактерии определяли с помощью счета жизнеспособных бактерий. Число поглощенных обработанных ΝΗ3 бактерий сравнивали с бактериями, подвергнутыми фагоцитозу в отсутствие ΝΗ3. В качестве положительного контроля использовали 3. аигеик, подвергнутый опсоническому влиянию нормальной сыворотки человека.
Примеры и результаты
Взаимодействие между М. са1аггйа118 и фибронектином М. са1аггйа118, лишенным и§рА1 и А2, не связывается с растворимым или иммобилизованным фибронектином.
Был отобран произвольный ряд клинических штаммов М. са1аггйа118 (п=13) (табл. 7) и проведена их проверка на связывание фибронектина относительно экспрессии ими и§рА1/А2 с помощью анализа проточной цитометрией. Высокая экспрессия и§рА1/А2, определенная по высокой средней интенсивности флуоресценции (МЕ1), коррелировала с экспрессией и§рА1/А2 (коэффициент персональной корреляции 0,77, Р<0,05) (фиг. 1А). Однако используя рАЬ против и§рА1/А2, было невозможно провести дифференциацию между экспрессией и§рА1 и А2. Более того, являлось невероятным присутствие белка и§рА2Н, вносящего вклад в связывание, поскольку в штаммах, используемых в этом исследовании, ген и§рА2Н не был обнаружен (данные не показаны).
Два изолята М. са1аггйа118 (ВВН18 и КН4) и их специфические мутанты, у которых отсутствовал и§рА1, и§рА2 или оба белка, также анализировали с помощью проточной цитометрии. М. са1аггйа118 ВВН18 сильно связывал фибронектин со средней интенсивностью флуоресценции (МЕ1), составляющей 96,1 (фиг. 1Е). Напротив ВВН18Аи§рА1 продемонстрировал уменьшенное связывание с фибронектином с МЕ1, составляющей 68,6 (фиг. 1С). При связывании фибронектина с ВВН18Аи§рА2 и двойным мутантом ВВН18Аи§рА1/А2 обнаружилась МЕ1, составляющая только 10,7 и 11,5 соответственно (фиг. 1Н, 1Ι). Похожие результаты были получены с мутантами по и§рА1/А2 клинического штамма КН4 М. са1аггйа118. Вместе взятые эти результаты говорят о том, что и§рА1 и А2 связывают фибронектин, и что способность бактерий связывать фибронектин сильно зависит от экспрессии и§рА1/А2.
Для дальнейшего анализа взаимодействия между фибронектином и М. са1аггйа1щ 1251-меченный фибронектин инкубировали с двумя клиническими изолятами М. са1аггйа118 (ВВН18 и ВН4) и их соответствующими мутантами. М. са1аггйа118 ВН4 дикого типа сильно связывал 1251-фибронектин, в то время как соответствующий мутант Аи§рА1 продемонстрировал 80% связывания дикого типа. Напротив, Аи§рА2 и двойной мутант связывали 1251-фибронектин при 14 и 12% соответственно, что было как раз выше уровней фона (5-10%) (фиг. 2). Похожие результаты были получены с М. са1аггйа118 ВВН18 и соответствующими мутантами по и§рА1/А2. Следовательно, результаты говорят о том, что для максимального связывания растворимого фибронектина бактериями М. са1атгйа118 требуется и и§рА1, и А2.
Для исследования присоединения бактерий к иммобилизованному фибронектину М. са1агг11а115 КН4 и его соответствующие мутанты Аи§рА1/А2 наносили на покрытые фибронектином предметные стекла. После инкубации в течение 2 ч предметные стекла промывали и впоследствии окрашивали по Граму. Обнаружено, что М. са1аггйа118 дикого типа и мутант Аи§рА1 сильно адгезировались к покрытым фибронектином предметным стеклам (фиг. 3А и ЗВ). Напротив, М. са1атгйа118 Аи§рА2 и двойные мутанты Аи§рА1/А2 слабо адгезировались к покрытому фибронектином предметному стеклу, при этом только малое число бактерий оставалось после промывки (фиг. 3С и 3Ό соответственно). Эксперименты с другим клиническим изолятом М. са1атгйа118 (ВВН18) и полученными из него мутантами продемонстрирова
- 21 014352 ли схожую картину, что указывает на то, что И8рА2 имеет главное значение при связывании М. са!аггйа118 с иммобилизованным фибронектином.
Связывающие фибронектин домены включают аминокислотные остатки, находящиеся между 299 и 452 И8рА1 и между 165 и 318 И8рА2.
Для дальнейшего анализа взаимодействий И8рА1 и А2 с фибронектином в Е. со11 рекомбинантно 50 770 30 539 получили усеченные И8рА1 - и И8рА2 - , ими покрывали микротитрационные планшеты и инкубировали с возрастающими концентрациями фибронетина. Связанный фибронектин обнаруживали с помощью рАЬ против фибронектина человека с последующей инкубацией с конъюгированными с пероксидазой хрена антикроличьими рАЬ. Оба рекомбинантных И8рА150-770 и И8рА230-539 связывали растворимый фибронектин, и взаимодействия зависели от дозы (фиг. 4).
Для определения связывающего фибронектин домена И8рА1 получили рекомбинантные белки, охватывающие целую молекулу И8рА150-770. Фибронектин инкубировали с иммобилизованными фрагментами белков И8рА1 и взаимодействия количественно определяли с помощью ЕЬ18А. И8рА150-491 связывал фибронектин почти также эффективно, как и И8рА150-770, что говорит о том, что связывающий домен находится в пределах этой части белка. Среди других усеченных фрагментов И8рА1299-452 эффективно связывал фибронектин (фиг. 5А). Параллельно анализировали взаимодействия между фибронектином и несколькими рекомбинантными фрагментами И8рА2, включающими аминокислоты И8рА230-539. Два фрагмента И8рА2101-318 и И8рА2165-318 сильно связывали фибронектин (фиг. 5В). Открытия обеспечивают значимое доказательство того, что связывающие домены включают остатки, обнаруживаемые в пределах И8рА1299-452 и И8рА2165-318. Сравнение последовательностей этих двух связывающих фрагментов позволило обнаружить, что для И8рА1 и А2 идентичными являются 31 аминокислотных остатков □ΟΙ<ΛΟΙΟΝΝΙΝΝΙΥΕΡ·ΛΟΟΟΟΟΗί>ί>ΟΙΙ<Τυ< (фиг. 6). Более того, эта повторяющаяся последовательность также была обнаружена в гене И8рА1 и А2 М. са1аггНа118 ВВН18 и ВН4 (данные не показаны).
Фрагменты И8рА150-491 и И8рА1299-452 конкурентно ингибируют связывание М. са(аггВа118 с фибронектином.
Для дальнейшего подтверждения открытий в отношении связывающих фибронектин доменов рекомбинантные усеченные белки И8рА1 проверяли в отношении их способности блокировать связывание фибронектина с М. са1агг11а118. Фибронектин (2 мкг) предварительно инкубировали с 0,25 мкмоль рекомбинантных фрагментов И8рА1 и впоследствии инкубировали с М. са1аггНа118. Наконец, ИрзА-зависимое связывание М. са1аггВа118 с фибронектином измеряли с помощью проточной цитометрии. Предварительная инкубация с изрА150-431 и И8рА1299-452 приводила к уменьшению связывания фибронектина с уменьшением на 95% для изрА150-491 и уменьшением на 63% для И8рА1299-452 (фиг. 7). Когда фибронектин предварительно инкубировали с усеченным И8рА2101-318, получали ингибирование на 50%.
Таким образом, связывающие фибронектин домены И8рА1 и А2 блокируют взаимодействия между фибронектином и М. са1аггНа118.
изрА1299-452 и И8рА2165-318 ингибируют адгезию М. са1аггНа118 к эпителиальным клеткам Чанг.
Известно, что эпителиальные клетки экспрессируют фибронектин, и многие бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам через ассоциированный с клетками фибронектин [46, 54, 69, 77]. Предварительные исследования показали, что М. са1аггНа118 адгезируется к эпителиальным клеткам [46, 49]. Были проанализированы клетки конъюнктивы Чанг, которые часто использовали в экспериментах по адгезии с патогенами дыхательных путей. Клетки Чанг сильно экспрессировали фибронектин, что обнаружено с помощью анализа проточной цитометрией (фиг. 8А).
Для анализа важности для адгезии бактерий ИрзА-зависимого связывания с фибронектином эпителиальные клетки Чанг предварительно инкубировали с рАЬ против фибронектина человека или рекомбинантными белками И8рА1299-452 и И8рА2165-318. После этого добавляли М. са1аггНа118 КН4 и анализировали адгезию бактерий.
Относительная адгезия (измеренная по числу колониеобразующих единиц) после предварительной инкубации с 0,4 мкмоль на 200 мкл И8рА1299-452, И8рА2165-318 или рАЬ против фибронектина человека составляла 36, 35 и 32% соответственно. Более высокие концентрации рекомбинантных пептидов не приводили к дальнейшему ингибированию. Напротив, не связывающие фибронектин фрагменты И8рА1433-580 и И8рА230-177 не ингибировали взаимодействия между М. са1аггНа118 и эпителиальными клетками Чанг (фиг. 8В). Таким образом, фибронектин на эпителиальных клетках Чанг может функционировать в качестве рецептора для М. са1агг11а118. а аминокислотные остатки 299-452 И8рА1 и 165-318 И8рА2 содержат лиганд, ответственный за взаимодействия.
Взаимодействие между М. са1аггНа118 и ламинином.
М. са1агг11а118 связывает ламинин через И8рА1 и А2. Два клинических изолята М. са1аггНа118 (ВВН18 и КН4) и их специфические мутанты, у которых отсутствовал И8рА1, И8рА2 или оба белка, анализировали с помощью ЕЫ8А с использованием целых клеток. М. са1аггНа118 КН4 сильно связывался с иммобилизованным ламинином (фиг. 9А). Напротив, мутант по и8рА1 М. са1аггНа118 ВН4 (КН4Аи8рА1) продемонстрировал связывание с ламинином, составляющее 89,9% дикого типа. Мутант по и8рА2 М. са1аггНа118 ВН4 (ВН4Аи8рА2) и двойной мутант ВН4Аи8рА1/А2 обладали 15,2 и 18,1% связывающей способности дикого типа соответственно. Это незначительно отличалось от остающейся необъясненной адгезии к
- 22 014352 покрытым В8А планшетам. Похожие результаты были получены с мутантами по И§рА1/А2, происходящими из клинического штамма ВВР18 М. са1атгйа118. В этих двух штаммах (ВВН18 и ВН4) И§рА2 является преимущественно экспрессируемым белком по сравнению с И§рА1, что является объяснением минимальной разницы в связывании между диким типом и КН4Ац§рА1. Вместе взятые эти результаты показывают, что и§рА1 и А2 связывают ламинин.
Для дальнейшего анализа связывания И§рА1/А2 с ламинином в Е. сой получили усеченные 50 770 30 539 и§рА1 - и и§рА2 - . Рекомбинантными белками покрывали микротитрационные планшеты и инкубировали с возрастающими концентрациями ламинина. Связанный ламинин обнаруживали с помощью кроличьих рАЬ против ламинина с последующей инкубацией с НКР-конъюгированными антикроличьими рАЬ. Оба рекомбинантных И§рА150-770 и И§рА230-539 сильно связывали растворимый ламинин, и связывание было зависимым от дозы и насыщаемым (фиг. 9В).
Для определения связывающих ламинин доменов получали рекомбинантные белки И§рА1 и А2, охватывающие целые молекулы. Ламинин инкубировали с иммобилизованными усеченными фрагментами белков ЕАрА1 и А2 и затем количественно определяли с помощью ЕЫ8А. И§рА150-431 связывал ламинин почти также эффективно, как и И§рА150-770, что говорит о том, что связывающий домен находится в пределах этой части белка. Однако среди других усеченных фрагментов, охватывающих эту область, ни один из них, по-видимому, не связывал ламинин. Ν-концевая часть, И§рА230-351, была способна сохранять 44,7% связывающей способности полноразмерного белка. Более короткий белок И§рА230-177 продемонстрировал 43,7% связывающей способности (фиг. 10В). Эти результаты показывают, что связывающие домены включают остатки, обнаруживаемые в Ν-концах и И§рА1, и И§рА2.
Взаимодействие между М. са1аггйа118 и С3 и С3ше1
Белки внешней мембраны И§рА1 и Ир§А2 М. са1атгйа118 ингибируют и классический, и альтернативный путь активации комплемента.
Поверхностная экспрессия Ир§А2 является решающей для выживания М. са1атгйа118 в нормальной сыворотке человека (ΝΉ8) [1, 58], т.е. дефицитные в отношении Ир§А2 мутанты Могахе11а быстро погибают под воздействием ΝΉ8. Было недавно продемонстрировано, что и И§рА1, и А2 связываются с С4ВР и, следовательно, могут ингибировать классический путь активации комплемента [58]. Чтобы далее пролить свет на взаимодействия М. са1атгйа118 с системой комплемента, исследовали выживание двойных мутантов по И§рА1/А2 в сыворотке, обработанной или ЕСТА с добавлением МдС12 (Мд-ЕСТА), или ЕЭТА. Мд-ЕСТА ингибирует классический и лектиновый пути и, следовательно, делает возможным отдельный анализ альтернативного пути. Напротив, ЕЭТА ингибирует все пути активации комплемента в результате абсорбции двухвалентных катионов (Мд24 и Са2+). М. са1атгйа118 КН4 дикого типа выживал после 30 мин инкубации, в то время как двойной мутант КН4Аи8рА1/А2 погибал под влиянием интактной ΝΉ8 после 10 мин (фиг. 12). При ингибировании классического пути (ΝΉ8 + Мд-ЕСТА) мутант КН4Аи8рА1/А2 жил в течение значительного большего периода времени по сравнению с ΝΉ8 без какихлибо хелатообразующих агентов, но не так долго, как бактерия дикого типа. Более того, при блокировании ЕЭТА и классического, и альтернативного путей М. са1атгйа118 ВН4Аи8рА1/А2 выживал. Схожую картину получали с изолятом М. са1атгйа118 ВВН18 и соответствующими мутантами ВВН 18Аи§рА1/А2 (не показано). Параллельно эксперименты с С1с.| и дефицитной в отношении фактора И/пропертина сывороткой продемонстрировали, что и классический, и альтернативный путь ингибировались М. са1атгйа118 (не показано). Таким образом, М. са1атгйа118, патоген, который часто заселяет дыхательные пути человека, не только нейтрализует классический путь, но также и альтернативный путь системы активации комплемента с помощью белков внешней мембраны И§рА1 и А2.
М. са1атгйа118 абсорбирует С3 из ЕИТА-инактивированной сыворотки.
С3 ковалентно присоединяется к поверхности микроба и, отсюда, индуцируют альтернативный путь (фиг. 11В). Для анализа того, может ли М. са1атгйа118 взаимодействовать с С3, штамм ΚΉ4 дикого типа инкубировали с Ν48 или ΝΉΕ обработанной ЕЭТА. Присоединение или осаждение (через ковалентную связь) С3/С3Ь на поверхности бактерий М. са1атгйа118 ВН4 определяли с помощью анализа проточной цитометрией с использованием поликлонального антитела (рАЬ), направленного против С3б, узнающего и С3, и С3Ь. Инкубация бактерий с ΝΉ8, содержащей интактный комплемент, приводила к осаждению С3 (фиг. 13). Интересно, что, когда путь активации комплемента был инактивирован в присутствии ЕИТА, М. са1атгйа118 ВН4 все еще связывал С3 (фиг. 13А). 81герЮсосси5 рпеитошае, включенный для сравнения, не абсорбировал С3 из обработанной ЕИТА сыворотки (фиг. 13 В). В противоположность пневмококки М. са1атгйа118, таким образом, связывал С3 безотносительно активации комплемента. Внутренний тиоэфир С3 спонтанно гидролизуется в жидкой фазе до С3(Н2О). Следовательно, интактный С3 или С3(Н2О) были наиболее вероятными формами С3, взаимодействующими с М. са1атгйа118. Поскольку М. са1атгйа118 также связывает С4ВР [58], хотели исключить вовлечение С4ВР в связывание С3 и с этой целью использовали истощенную в отношении С4ВР сыворотку. М. са1атгйа118 абсорбировал С3 из истощенной в отношении С4ВР сыворотки в той же степи, что и из ΝΉ8 (не показано).
Связывание С3те1 с М. са1атгйа118 является зависимым от дозы и нековалентным.
Из экспериментов можно заключить, что С3 связывается с поверхностью М. са1аггйа118 безотносительно активации комплемента. Поэтому проанализировали, может ли преобразованный С3, не являю
- 23 014352 щийся функциональным, связываться с бактериями. Нативный С3 очищали из сыворотки человека и обрабатывали метиламином, который преобразует С3 в молекулу С3те(, эквивалентную С3Ь, не обладающую способностью ковалентно связываться с микробами (фиг. 11С). С помощью анализа проточной цитометрией обнаружено, что штамм КН4 М. са(аггЬа11к дикого типа эффективно связывал С3шс1 зависимым от дозы и насыщаемым способом (фиг. 14 А и В). Это взаимодействие не опосредовалось С3, а частью молекулы С3, поскольку С3Ь и С3(Н20) также связывались с М. са(аггЬа11к (не показано). Связывание М. са(аггЬа11к КН4 с С3шс1 основывалось в большой степени на ионных взаимодействиях, поскольку возрастающие концентрации №1С1 ингибировали взаимодействие (фиг. 14С). Похожие результаты были получены со штаммом ВВН18 М. са1агг11аПк дикого типа (не показано).
Для определения того, является ли связывание С3 общей особенностью всех штаммов М. са(аггЬа11к, отобрали произвольный ряд клинических изолятов (п=13) и проанализировали их способность связывать С3шс1. Все штаммы М. са(аггЬа11к связывали С3шс1 как обнаружено с помощью анализа проточной цитометрией с использованием рАЬ против С36. Значения МН варьировали от 4 до 39. Однако 8. рпеитошае и Е. со11, включенные для сравнения, не связывали С3те1.
М. са(аггЬа11к является уникальной связывающей С3 и С3те1 бактерией.
Чтобы продолжить анализы в отношении абсорбции С3 из ΝΉ8 к бактериям, родственные подвиды Могахе11а (п=13), а также частые патогены человека (п=13) инкубировали в присутствии ΝΕδ-ΕΩΤΆ. Интересно, что среди всех проверенных бактериальных видов М. са1аггНаЬк был единственным видом бактерий, связывающим С3 в комплемент-инактивированной сыворотке (табл. 9). Все родственные штаммы Могахе11а, а также другие патогены человека также проанализировали на связывание С3ше1. Параллельно со связыванием С3 М. са1аггНа11К был единственным видом, связывающим С3ше1. Обобщая, М. са1аггНаЬк имеет уникальную особенность сильно связывать С3 и С3ше1 нековалентным способом.
М. са(атгЬа11к связывает С3ше1 через белки внешней мембраны ИкрА1 и ИкрА2.
Для определения белка М. са1атЛаНк, ответственного за связывание С3, проверили ряд бактериальных мутантов, лишенных белков внешней мембраны МГО, ИкрА1 и/или ИкрА2 [22, 58]. Интересно, что связывание С3ше1 значительно коррелировало с экспрессией Ирк (фиг. 15). М. са1атгйа11к КН4Ат16 связывал С3те1 в той же степени, что и соответствующий штамм дикого типа (фиг. 15А-В). Мутант КН4АикрА1 продемонстрировал только слегка сниженное связывание, в то время как КН4АикрА2 был слабым связующим по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа (фиг. 15С-Э). Параллельно полностью отсутствовало связывание С3те1 с двойным мутантом КН4АикрА1/А2 (фиг. 15Е). Более того, когда те же эксперименты проводили с использованием ΝΕΕί-ΕΟΤΆ, наблюдали ту же картину (фиг. 15ЕI). При использовании нормальной сыворотки человека все мутанты продемонстрировали на своей поверхности схожее количество С3, поскольку это была смесь ковалентного осаждения и связывания С3 (фиг. 15К-0). Похожие результаты были получены с изолятом М. са1аггНа11К ВВР18 и соответствующими мутантами ВВР18.
Для дальнейшего анализа взаимодействия между С3 и ИкрА1/А2 в Е. со11 получили ИкрА150-770 и ИкрА230-533 и их очистили. Рекомбинантные белки наносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием устройства для дот-блота с последующей инкубацией с меченным йодом С3те1. В качестве отрицательного контроля включили рекомбинантный МГО362-1200, который получен из белка МГО внешней мембраны [58]. Обнаружили слабое связывание с ИкрА150-770, в то время как [1251]-С4те( сильно связывался с ИкрА230-533 (фиг. 16А). Эти открытия в дальнейшем подкреплены с использованием резонанса поверхностных плазмонов (т.е. В1асоге). ИкрА150-770 и ИкрА230-533 иммобилизовали на поверхности СМ5чипа, используя связывание через аминогруппу, и С3те1 вносили до достижения насыщения. Кс для взаимодействия между С3те1 и ИкрА150-770 или ИкрА230-533 составляла 3 и 14 мкМ соответственно. В заключение, было обнаружено, что ИкрА2 является главным связывающим С3те1 белком М. са1аггНа11К, в то время как ИкрА1 вносит вклад в меньшей степени.
Связывающий С3 домен находится между аминокислотными остатками 200 и 458 ИкрА2.
Для определения связывающего С3 домена ИкрА2 получали рекомбинантные белки, охватывающие целую молекулу ИкрА230-539. С3те1 инкубировали с иммобилизованными полноразмерными белками икрА150-770, икрА230-539 и рядом усеченных белков ИкрА2. После этого взаимодействия количественно определяли с помощью ЕБ18А. В соответствии с дот-блот анализом (фиг. 16А) ИкрА150-770 связывал С3те1 в гораздо меньшей степени, чем ИкрА230-533 в ЕБ18А (фиг. 16В). Среди усеченных фрагментов белка ИкрА2165-318, ИкрА2200-539 и ИкрА2302-458 эффективно связывали С3те(, что говорит о том, что связывающий домен находится в пределах аминокислотных остатков 200 и 458.
Рекомбинантный ИкрА1/А2 нейтрализует активность С3.
Для того чтобы детально исследовать роль зависимого от ИкрА1/А2 ингибирования альтернативно го пути, провели ряд анализов проточной цитометрией с использованием бактерий, проинкубированных с 10% N48 или сывороткой, которую предварительно проинкубировали со 100 нМ рекомбинантного икрА150-770 и икрА230-533. Интересно, что значительное снижение осаждения/связывания С3 на поверхности М. са1аггНа11К КН4АикрА1/А2 наблюдали, когда ΝΉ8 предварительно обрабатывали ИкрА150-770 и икрА230-539 (фиг. 17А). При выключении классического пути с помощью Мд-ЕОТА получали похожие результаты (фиг. 17В). Таким образом, рекомбинантные белки ИкрА1350-770 и ИкрА230-539 абсорбировали
- 24 014352
С3 из №Н8 и ингибировали осаждение/связывание С3.
Для определения того, увеличивает ли абсорбция С3 рекомбинантными υ§ρΑ150-770 и υ§ρΑ230-539 выживаемость бактерий, двойной мутант М. са1агЛа118 ΚΗ4ΑιιφΑ1/Α2 инкубировали с сывороткой, дополненной υ§ρΑ150-770 и υ§ρΑ230-539, с последующим определением числа выживших бактерий. МдΕΟΤΑ включали в реакции для того, что ингибировать классический путь. Интересно, что добавление рекомбинантных υ§ρΑ150-770 и υ§ρΑ230-539 к ЯН8 предотвращало гибель дефицитных в отношении υ§ρΑ1/Α2 М. са1аг±а118 (фиг. 17С). υ§ρΑ230-539 был наиболее эффективен в ингибировании гибели бактерий по сравнению с υ§ρΑ150-770. Когда оба рекомбинантных белка добавляли вместе, дополнительного ингибирования альтернативного пути не определялось. 10% №Н8 соответствует приблизительно 600 нМ С3. Для исследования того, может ли большее число молекул υ§ρΑ1 нейтрализовать активность С3, добавляли υ§ρΑ150-770 и/или υ§ρΑ230-531 до 600 нМ. Однако более высокие концентрации рекомбинантных белков не увеличивали дополнительно ингибирование (не показано).
Был также включен гемолитический анализ альтернативного пути, состоящий из эритроцитов кролика и №Н8, для установления роли υ§ρΑ1 и А2 в качестве ингибиторов альтернативного пути. №Н8 предварительно инкубировали с рекомбинантными υ§ρΑ150-770, υ§ρΑ230-539 или обоими белками вместе с последующим добавлением эритроцитов. После инкубации в течение 1 ч определяли величину лизиса эритроцитов. Интересно, что значительно сниженный гемолиз наблюдали, когда №Н8 предварительно инкубировали с υ§ρΑ150-770 или υ§ρΑ230-539 по сравнению с необработанной ЯН8 (фиг. 18). Параллельно с увеличением выживаемости бактерий в присутствии υ§ρΑ150-770 или υ§ρΑ230-539 (фиг. 17С) предварительная инкубация только с υ§ρΑ230-539 приводила к более эффективному ингибированию альтернативного пути по сравнению с ингибированием в случае, когда №Н8 предварительно инкубировали с υ§ρΑ150-77.
50-770 30-539
В заключение, рекомбинантные υ§ρΑ1 - или υ§ρΑ2 - блокировали активность альтернативного пути благодаря их способности захватывать С3.
Помимо того, что С3 является ключевой молекулой в пути активации комплемента, осажденные С3Ь и 1С3Ь (инактивированный С3Ь) направляет микробы для удаления в процессе опсонофагоцитоза. Для исследования того, может ли С3 или С3те1, который нековалентно связан с поверхностью М. са!агЛа118, все еще функционировать в качестве опсонина, провели ряд исследований фагоцитоза. М. са!агЛа118 предварительно инкубировали с С3те1, ЯН8 или ЯН8, обработанной ΕΌΤΑ, с последующим добавлением нейтрофильных лейкоцитов. Интересно, что М. са1аггйа118 не поглощался в присутствии С3те1, в то время как №Н8 сильно индуцировала фагоцитоз (данные не представлены).
Однако, когда NН8 предварительно обрабатывали ΕΌΤΑ, М. са1аггйа1щ не фагоцитировался нейтрофильными лейкоцитами. Таким образом, С3/С3те1 был не активен на поверхности клеток М. са!аггйа118 и не функционировал в качестве опсонина.
Осуждение.
Взаимодействие между М. са1агЛа118 и фибронектином.
υ§ρΑ1299-452 и υ§ρΑ2165-318 из клинического штамма Вс5 М. са1аггйа118 были самыми короткими фрагментами, которые все еще связывали фибронектин. Интересно, что более длинные фрагменты, включающие аминокислотную последовательность, обнаруживаемую в пределах υ§ρΑ1299-452 и υ§ρΑ2165318, проявляли более эффективное связывание с фибронектином (фиг. 5А и В). Это может означать, что эти две области представляют частичные связывающие домены, или что сайт связывания в высокой степени зависит от специфической молекулярной структуры. υ§ρΑ1299-452 и υ§ρΑ2165-318 имеют последовательность из 31 идентичных аминокислотных остатков, включающую 23 остатка МЫГЫМУЕΕΑΟΟΟΌΟΗ88ΌΙΚΤΕ (последовательность ХМОНГУ). Эта последовательность содержит эпитоп для протективного моноклонального антитела (тΑЬ) 17С7, которое обладает общей реактивностью [2, 50, 30]. В мышиной модели пассивная иммунизация тΑЬ 17С7 обеспечивала защиту и увеличивала обезвреживание М. са1агг11а115 в легких [30]. Отсюда самое интересное то, что связывающие фибронектин домены υ§ρΑ1/Α2 содержат эти остатки, и это доказывает важность этой области в патогенезе инфицирования М. са1аггйа118 дыхательных путей.
Связывающие фибронектин М. са1аггйа118 ВВН18 и КР4, использованные в экспериментах, также несут указанный 31 аминокислотный остаток в их белке υ§ρΑ1/Α2. Большинство М. са1аггНаЙ5 имеют часть этой последовательности (т.е. последовательность МЫШМУ). Однако штаммы, подобные штамму О35Е, имеющему последовательность ИЫШМУ в гене υ§ρΑ2, не экспрессируют связывающий фибронектин белок υ§ρΑ2 [49]. Вероятным объяснением могло бы быть то, что вариации во фланкирующих областях могут влиять на взаимодействие с фибронектином. Также сама консервативная последовательность ИМГИМУ может иметь минорные единичные изменения в аминокислотных основаниях [28]. Таким образом, вероятно, что связывание с фибронектином зависит не просто от экспрессии υ§ρΑ1/Α2, но также от индивидуальной организации каждого белка υρ§Α. Интересно, что почти идентичную аминокислотную последовательность можно обнаружить в гибридном белке υ§ρΑ2Η с адгезивными свойствами (М. са1аггйа118 ΤΤΑ37 и 046Е) [43]. Это служит поддержкой открытию того, что последовательность из 31 аминокислоты важна для адгезии.
В последнем наборе экспериментов было проверено, можно ли ингибировать адгезию М. са1аггНаНь к клеткам конъюнктивы Чанг с помощью связывающих фибронектин фрагментов (υ§ρΑ1299-452 и
- 25 014352
ИкрА2165-318) (фиг. 8В). Предварительная инкубация с ИкрА1299-452, ИкрА2165-318 или рАЬ против фибронектина приводила к снижению связывания с эпителиальными клетками Чанг. Эти результаты подтверждают важность этих связывающих доменов для взаимодействий ИкрА1/А2 с эпителиальными клетками Чанг и, кроме того, говорят о том, что фибронектин является важным рецептором для ИркА. Кроме того, известно, что БпВР облегчают адгезию бактерий к недифференцированным и поврежденным дыхательным путям [54, 69]. Экспрессию фибронектина фибробластами легких также увеличивает дым от сигарет [87]. Связывание ИкрА1/А2 М. саГатткайк с фибронектином ЕСМ или ассоциированным с эпителиальными клетками фибронектином имеет, следовательно, важное значение у больных СОРЭ и может служить объяснением частых случаев инфекции М. саГаггйаНк в этой группе больных [40].
В заключение, было показано, что ИкрА1/А2 М. саГатткайк ВВН18, КН4 и Вс5 являются решающими БпВР. Оба рекомбинантных ИкрА1 и А2, происходящих из Вс5, связывают фибронектин с помощью связывающего домена, имеющего идентичные аминокислотные остатки, в том числе консервативную последовательность ΝΝΙΝΝΙΥ. Более того, взаимодействие ИкрА1/А2 М. саГатткаИк с эпителиальными клетками происходит через ассоциированный с клетками фибронектин. Следовательно, определение этих связывающих фибронектин доменов представляет собой важный шаг к разработке вакцины против М. саГатткайк.
Взаимодействие между М. саГатткайк и ламинином.
М. саГатткайк является частой причиной обострений инфекций у больных СОРЭ. Вероятно, успех этого вида у больных СОРЭ отчасти связан с наличием у него большого набора адгезивных молекул. Кроме того, существуют патологические изменения, такие как потеря целостности эпителия с обнаружением базальной мембраны, где у курильщиков утолщен сам слой ламинина [4]. Показано, что некоторые патогены способны связывать ламинин, и это может вносить вклад в их способность адгезироваться к таким поврежденным и денудированным поверхностям слизистой оболочки. Эти патогены включают патогены, которые, как известно, вызывают значимое заболевание дыхательных путей, такие как среди прочих 8. аигеик и Р. аетидшока [7, 63].
Авторы настоящего изобретения недавно показали, что и ИкрА1, и А2 связывают фибронектин [78]. Связывающие фибронектин домены находятся в пределах ИкрА1299-452 и ИкрА2165-318. В этом исследовании Ν-концевые половины ИкрА150-491 и ИкрА230-351 (содержащие связывающие фибронектин домены) также связывали ламинин. Однако самые маленькие фрагменты, которые связывали фибронектин, ИкрА1299-452 и ИкрА2165-318, не связывали ламинин в какой-либо заметной степени. В действительности фрагменты, меньшие чем Ν-концевая половина ИкрА1 (ИкрА150-491), теряют всю свою способность связывать ламинин, в то время как в случае ИкрА2 только ИкрА230-170 связывал ламинин, хотя на более низ30 539) ком уровне, чем целый рекомбинантный белок (ИкрА2 - ). Эти открытия говорят о том, что различные части молекул, возможно, могут иметь разные функциональные роли.
При сравнении самых маленьких связывающих ламинин областей ИкрА1 и А2 было обнаружено, что существует, однако, незначительная схожесть, между прочим аминокислотная гомология, между икрА230-170 и икрА150-491 (данные не показаны). Это не удивительно, поскольку известен тот факт, что оба белка имеют структуру сферической головки в виде леденца, несмотря на то, что их Ν-концевые половины идентичны только на 22% [2, 32]. Авторы настоящего изобретения постулируют, что за ίη у1уо взаимодействия с ламинином в области головки, вероятно, ответственна третичная структура. Нахождение связывающих доменов в Ν-конце было бы логичным, поскольку они были бы наиболее выставленными и контактировали с базальной мембраной человека ίη у1уо.
Бактериальные факторы, опосредующие адгезию к компонентам ткани и внеклеточного матрикса (ЕСМ), группируются вместе в одно семейство, названное микробные поверхностные компоненты, узнающие адгезивные матриксные молекулы (М8СКАММ). Поскольку ИкрА1/А2 связывают и фибронектин, и ламинин, эти белки можно обозначить М8СКАММ. Результаты говорят о том, что ИкрА1 и А2 являются многофункциональными адгезинами с различными доменами, взаимодействующими с различными лигандами в дыхательных путях. О похожих профилях связывания широкого спектра сообщалось для других бактериальных белков, таких как ΥаάА Υе^к^η^а епГетосоййса, с которым ИкрА1 и ИкрА2 структурно связаны [45, 70]. ΥаάА также связывает и фибронектин, и ламинин [32].
В итоге было показано, что ИкрА1/А2 являются решающими во взаимодействии М. саГатткайк с являющимся гликопротеином ламинином базальной мембраны, и это играет важную роль в патогенезе инфицирования больных СОРЭ [74].
Взаимодействие между М. саГатткайк и С3 и С3теГ.
Устойчивость к комплементу является один из самых важных факторов вирулентности бактерий [66]. Большинство (89%) изолятов М. са1аггкаНк от больных с инфекциями нижних дыхательных путей устойчивы к опосредуемому комплементом уничтожению [34]. ИкрА1 и А2 М. са1аггкайк являются решающими для выживания бактерий в сыворотке человека ίη у1уо [1, 15], и было показано, что эти два белка внешней мембраны связываются с жидкофазным регулятором классического пути активации комплемента, С4ВР [58]. В настоящем исследовании продемонстрировано, что М. саГатгкайк может ингибировать альтернативный путь с помощью нековалентного связывания С3 (фиг. 17 и 18). Связывание С3, наиболее вероятно, также ингибирует классический путь. Однако это невозможно было детально про
- 26 014352 анализировать, поскольку М. сайитНаНк также связывает С4ВР. Интересно, что зависимое от М. са1аггНаПк связывание С3 является уникальным, так как несколько родственных подвидов Могахе11а, а также частые патогенные для человека бактерии не связывают С3 (табл. 9). Взаимодействия с С3 и обработанным метиламином С3 опосредуются главным образом ИкрА2, в то время как ИкрА 1 имеет минорную роль (фиг. 15 и 16). Связывающая С3 область ИкрА2 находится между аминокислотными остатками 200458. Эта область содержит участок из 140 аминокислотных остатков, которые на 93% идентичны области в ИкрА1 [2]. Однако несмотря на эту схожесть последовательностей, ИкрА1 связывает С3 в гораздо меньшей степени. Это может быть следствием специфических различий в конформации белков. Различие в связывании С3 белками ИкрА1 и ИкрА2 контрастирует со взаимодействием ИкрА1/А2 с С4ВР [58].
М. са1аггНаПк одинаково устойчив и к классическому, и к альтернативному пути (фиг. 12В). Бактерии связывают С4ВР, что ингибирует классический путь [58], и в этом документе продемонстрировано взаимодействие с альтернативным путем благодаря связыванию С3. Трудно определить, какой из этих механизмов имеет наибольшее значение для устойчивости М. са1аггНаНк в сыворотке при различных ситуациях ίη у1уо. Например, важность классического пути сильно зависит от анамнеза инфицирования М. са1аггНаНк и способности вырабатывать комплемент-активирующие антитела. Однако всякий обеспечивающий защиту от комплемента механизм, конечно, полезен для патогена. Поскольку С3 является ключевой молекулой системы комплемента, наиболее вероятно, что связывание С3 приводит к регулированию всех трех путей активации комплемента и может вносить наибольший вклад в устойчивость в сыворотке.
Важность системы комплемента в качестве первичного защитного механизма отражает тот факт, что микробы выработали различные стратегии блокирования и/или нейтрализации компонентов системы комплемента [42, 35, 88]. В дополнение к М. са1аггНаНк специфические поверхностные молекулы, которые связывают С4ВР и, как следствие, защищают бактерии от классического пути активации комплемента, экспрессируют 8. руодеиек, Вогбе!е11а рейикык, Ε. сой К1, Саиб1ба а1Ьюаик и N. доиоггНоеае [8, 9, 52, 58, 64, 65, 80]. В дополнение к ингибированию классического пути несколько бактерий (например, С. а1Ысаи8, N. тешидШбек, 8. руодеиек и 8. риеитошае; для обзора см. [68, 89]) связывают фактор Н и схожую с фактором Н молекулу и, следовательно, частично защищаются от альтернативного пути активации комплемента.
ИкрА1 и А2 абсорбируют С3 из сыворотки и, следовательно, наиболее вероятно, ингибируют активацию комплементы. Схожим образом поверхностный белок А пневмококков (РкрА), по-видимому, ингибирует альтернативный путь и ш уйго, и ш у1уо. РкрА является важным фактором вирулентности 8. риеитошае. Дефицитные в отношении РкрА штаммы пневмококков легко обезвреживаются в крови, в то время как экспрессирующие РкрА штаммы выживают [82]. Кроме того, в крысиной модели бактериемии дефицитные в отношении РкрА пневмококки имеют значительно сниженную вирулентность по сравнению с пневмококками, экспрессирующими РкрА [11]. Продемонстрировано, что на РкрА-отрицательных пневмококках осаждается больше С3Ь, чем на РкрА-положительных пневмококках [67, 82]. Таким образом, экспрессия РкрА уменьшает опосредуемое комплементом обезвреживание и фагоцитоз 8. риеитошае посредством предельной опсонизации с помощью С3Ь [12, 67]. Дефицитные в отношении РкрА пневмококки, не являющиеся вирулентными для нормальных мышей, становятся вирулентными для мышей, дефицитных в отношении С3 и фактора В [82].
Насколько известно, существует только два примера бактериальных белков, которые нековалентно связывают С3 и отсюда блокируют функцию комплемента. Первым белком является внеклеточный связывающий фибронектин белок 81арНу1ососсик аигеик (ЕГЬ), который, как обнаружено, связывает С3Ь [44]. ЕГЬ ингибирует и классический, и альтернативный путь независимо от тиоэфирной конформации, т.е. связывание с С3Ь не является ковалентным. Вторым примером является связывающий холин белок пневмококков (СЬрА), который, как показано, связывает обработанный метиламином С3, что говорит о нековалентном взаимодействии, которое не зависит от активации комплемента [16]. СЬрА является компонентом клеточной стенки пневмококков, но может только связывать С3 при секреции СЬрА. Чтобы проверить эту гипотезу, для которой в литературе нет твердого доказательства, было проанализировано одиннадцать различных изолятов пневмококков на связывание С3 (обработанного метиламином С3 или ΝΗ8-ΕΌΙΆ) с помощью проточной цитометрии (фиг. 12В и табл. 9). Связанный С3 невозможно было обнаружить на поверхности 8. риеитошае. С помощью анализа лизатов 8. риеитошае и супернатантов культур вестерн-блоттингом с использованием обработанного метиламином С3 с последующим использованием рАЬ против С3 человека авторы настоящего изобретения подтвердили результаты СНеид и соавторов [16] (не показано). В свете ЕГЬ и СЬрА, оба из которых являются связывающими С3 белками, секретируемыми грамположительными бактериями, грамотрицательный М. са1аггНаПк является уникальным видом с закрепленными на мембране белками, которые связывают С3 и ингибируют альтернативный путь активации комплемента на поверхности бактерии.
Показано, что дрожжи Саиб1ба а1Ьюаик связывают С3Ь, 1С3Ь и С3б. Однако С3Ь связывается со значительно меньшим сродством, чем 1С3Ь и С3б [29]. Была обнаружена большая разница между связыванием С3 с М. са1аггНаПк и С. а1Ьюаик (не показано); несмотря на то, что Саиб1ба связывали С3те1 (56% положительных клеток), средняя интенсивность флуоресценции (МБ!) составляла только <2,0 по сравне
- 27 014352 нию с МН, составляющей 36,9 для М. са!аггЬа11к. Кроме того, связывание не определялось, когда С. а1Ь1сапк инкубировали с обработанной ЕЭТА сывороткой. Из С. а1Ь1сапк были выделены два связывающих С3 белка, и наиболее охарактеризованным белком является маннобелок с молекулярной массой 60 кДа, который первоначально определили с помощью антитела, направленного против рецептора 2 комплемента человека (СЭ21) [13]. Однако икрА1 и А2 М. са1агг11аНк не узнавались поликлональным антителом, направленным против СО21 (не показано). Параллельно со стафилококками и пневмококками существует также связывающий С34 белок, секретируемый С. а1Ьюапк [72]. Наконец, выделили рецептор для 1С3Ь С. а1Ь1сапк, и он структурно схож с СК3 человека (СЭ11Ь) [3]. Механизмы, с помощью которых эти рецепторы могут участвовать в патогенезе, полностью не известны.
Вышеуказанные примеры связывающих С3 патогенов весьма отличаются от М. са1агг11аНк тем, что эти виды часто выделяют из кровотока. М. са1аггНаНк является патогеном слизистых оболочек с редкими случаями бактериемических инфекций. Следовательно, связывание и инактивация С3, наиболее вероятно, происходят на поверхности слизистых оболочек. Это подтверждается тем фактом, что происходит сильная активация комплемента и являющееся следствием этого воспаление при таком болезненном состоянии, как острое воспаление среднего уха [57]. Полагают, что белки комплемента транспортируются на поверхность слизистых оболочек благодаря экссудации плазмы [26, 62]. В выпотах в полость среднего уха (МЕЕ), например, у детей также обнаруживаются сильно увеличенные концентрации продуктов С3 [51]. Кроме того показано, что факторы комплемента в жидкости МЕЕ важны для бактерицидной активности против других агентов слизистых оболочек, таких как не типируемые Н. тПиепхае [75]. М. са!аггНаНк является исключительно патогеном человека. Он не вызывает заболеваний, таких как воспаление среднего уха или пневмония, у животных. В нескольких случаях использовали мышиную модель очищения легких и модель воспаления среднего уха с использованием шиншиллы. Однако ни воспаления среднего уха, ни пневмонии не развивается, и бактерии быстро обезвреживаются [19, 83]. Таким образом, трудно проверить биологическое значение связывания С3 с бактериями ш у1уо. Поскольку икрА1 и А2 являются многофункциональными белками [1, 15, 31, 43, 58, 78], невозможно соотнести какое-либо различие в обезвреживании М. са1агг11аНк со связыванием С3. В частности, тот факт, что икрА1 является важным адгезином М. са1агг11аНк и связывает и СЕАСАМ1, и фибронектин [31, 78], будет, наиболее вероятно, оказывать влияние на обезвреживание. Тем не менее, благодаря сильной активации комплемента при таких болезненных состояниях, как воспаление среднего уха, зависимое от Могахе11а связывание С3, может представлять важный способ снятия защиты слизистых оболочек.
Тот факт, что М. са1агг11аНк тормозит иммунную систему человека несколькими путями, может служить объяснением того, почему М. са1агг11аНк является таким частым обитателем дыхательных путей [73]. В заключение, М. са1агг11аНк выработал усложненные способы противостояния гуморальной и врожденной иммунным системам. Представленные данные показывают, что М. са1агг11аНк обладает уникальной способностью связывать С3 на поверхности бактериальной клетки, что невозможно обнаружить у других бактериальных видов.
- 28 014352
Ссылки
1. АеЫ С, Ьа£оп£а1пе ЕВ, Соре Ы), еЪ а1. РЬепоЕурас е££еск о£ 1водеп1с изрА1 апб изрА2 тиЫЫопз оп МогахеИа зайгйаИз 035Е. 1п£ес1: 1ттип 1998/66:31139.
2. АеЫ С, Мас1уег I, ЬаЫтег бЪ, е£ а1. А ρΓΟΡβοΡΐνβ ерПаоре о£ МогахеИа саЕаггИаИз 1з епсобеб Ьу Ено б±££егеп1: депез. 1п£есЬ 1ттип 1997;65:4367-77.
3. А1ае1, 3., С. ЬагсИег, С. ЕЬепЬ1сМег, И. М. Ргоб1пдег, б. бапакоуа, апб Μ. Р. ЭаеЫсЫ 1993. 1зо1аЕ1оп апб Ыос11ет1са1 сЬагасЬегага-Ыоп о£ ЪЬе 1СЗЬ гесерког о£ СапсИда аЛЫсапв. 1п£ес£. Тлгтип. 61;1395-1399.
4. Απιίη К, ЕкЬегд-бапззоп А, Ьо£баЫ СЗ апб Уепде Р. Ке1а£1опзЬ£р ЬеЕиееп ±п£1а1гапа£огу се11з апб екгискига! сЪапдез 1п йе 1ипдз о£ азутркотаЫс апб ηθνετ зтокегз: а Ыорзу зкибу. ТЬогах 2003;58:135-42.
5. Ар-Ыа АЗ, Ьа£оп£а1пе ЕВ, ЬаЫтег бЬ, АеЫ С,у· Зугод1аппорои1оз (ЗА апб Напзеп Еб. ТЫ ЕзрА2 ргокеап о£ МогахеИа сакаггйаНз 1з бхгесЫу ίηνοίνεά ίη ЕНе ехргеззхоп о£ зегит гезбзкапсе. 1п£ес± 1ттип 2005;73:2400-10.
6. Вагкоз ЬС, МигрИу ТЕ. Согораг1зоп о£ БЬе оиЕег тетЬгапе рго1:е±пз о£ 50 зкгаапз о£ ВгапкатеЫа сакаггкаЫз. б 1п£еск ϋί3 1988; 158:761-5.
7. бе ВепЫтапп 8, Тг1з£ап А, ЕЫеппе б, Вгоиззе Ν, УапбепезсЬ. Е апб Ыпа С. ЗЪар41у1ососсиз аигеиз ±зо1акез аззоЫа£еб и±£й песгоЫЫпд рпеитопка Ыпб ко Ьазетеп£ тетЬгапе куре I апб IV со11адепз апб 1ат1п1п. б 1п£ес£ 0Ϊ3 2004;190:1506-15.
8. Вегддйгб, К., Е. боИпззоп, Е.В. Μοοί, апб С. ЫпбаЫ. 1997. Вогбе£е11а рейиззав Ыпбз Йе Ьитап сотр1етеп£ геди1аког С4ВР: го1е о£ £11атеп1:оиз Иетадд1иЫп1п. 1п£ес£. Таипип. 65:3638-3643.
- 29 014352
9. Βίοπι, Α. Μ-, А. Нуккопеп, Р. Уаздиег, С. ЫпВаЫ, В. РаЫЬйск, апд А. В. йопззоп. 2001. А ηονβΐ кпкегасккоп Ьекиееп куре IV ρχΐί о£ Ыегззегла допоггйоеае а пек кЬе китап сотркетепк геди1аког С4В-Ыпй1пд ргокеап. Л 1тп>ипо1. 166:67 64-6770.
10. Воокзта ΗόΓ, уап бег Негде НС, уап де Раз 3, ЗсЪои1з ЬМ апд Моок ЕВ. Апа1уз1з оГ МогахеИа сакаггЬаНз Ьу ϋΝΑ куркпд: еукдепсе Гог а дкзккпск зиЬрори1аккоп аззоскакед икЬИ укги1епсе кгаккз. О 1п£еск Окз 2000;181:1376-87.
11. Вгк1ез, ϋ. Е., СТ. УокЪег, Ь. 3. Мс0апке1. 1988. Ко1е оГ рпеитососса! зигГасе ргокекп А кп кке У1ги1епсе оГ Зкгеркососсиз рпеитоп1ае. Κβν. 1п£есЬ. Я±з, 10·. (5ирр1. 2)-.3372.
12. ВгНез, й. Е.г 3. К. НоИкпдаЬеад, Е. Знкак1о, А. Вгоокз-Иа1кег, А. 5га1ак, А. Укго1акпеп, Ъ. 3. Μοϋβηΐβΐ, К. А. Вепкоп, Р. ИЫке, К. РгеИпег, А. Негтапззоп, Р. С. Аегкз, Н. 7ап Вк3к, апд М. СТ. Сга1п. 1997. РзрА апд РзрС: кИекг рокепкка1 Гог изе аз рпеитососса! уасскпез. МксхоЬ. Огид Незкзк. 3:401-408.
13. Са1дегопе, А. А., Ь. ЬкпеНап, Е. ИадзиогкЪ, апд А. Ь. ЗапдЬегд. 1988. 1депкк£ксаккоп о£ СЗб гесеркогз оп СапЭкда аЗЫсапз. 1пГеск, Тпипип, 56:252-258.
14. Сак1кп ВИ. ВгапИатеИа сакаггЬа1кз: ап огдапкзш дакпкпд гезреск аз а ракИодеп. С1кп МксгоЬко1 Ηβν 1990;3:293320. .
15. СЬеп ϋ, Вагпкак V, УапРегМекд КК апд МсМксИае1 ОС. Тке Ιβνβίε апд Ьаскегкскда1 сарасхку оГ апккЬодкез дкгескед ада1пзк кИе изрА1 апд 0зрА2 оикег тетЬгапе ргокекпз о£ МогахеИа (ВгапЪатеИа) сакаггйаНз кп аби1кз апд сПккдгеп. 1п£еск Италии 1999;67:1310-6.
16. СЬепд, <2-, ϋ. Гкпке1, апд М. К. Нозкеккег. 2000. Νονεί ригк£ксаккоп зсИете апд Гипсккопз Гог а СЗ-Ькпдкпд
- 30 014352 ргоРебп £гош 3£гер£ососсив рпешпопхае. ВбосЬет. 39:5450-5457.
17. Соре Ю, ЬабопРабпе ЕН, ЗбаидЬРег СА, еР а1. СЬагасРегбгаРбоп οί РЬе МогахеИа саРаггЬаббз изрА1 апб изрА2 депез апб РЬебг епсобеб ргобисРз. О ВасРегбо! 1999;181:4026-34.
18. йе ЗабпР беап М, Ваибоибп С, ϋί Νοίίο М, еР а1. Сотрагбзоп οί тогрЬободбса1 апб РипсРбопа! скагасРегбзРбсз οί ргбтагу-сибРигеб Ьитап сопЗипсРбтаб ербРЬеббит апб οί ВДопд-КббЬоигпе бегз^аЫте οί СЬапд соп3Ш1сЕ:!^а1 се!1 1бпе. Ехр Еуе Кез 2004;78:257-74.
19. Еи1дЬшп г К. 3., апб Н. С. Маггоы. 1996. ЕхрегбтепРаб оббРбз тебба ибРЬ МогахеИа (ВгаппатеИа) саЬаггкаИз. Апл. ΟίοΙ. Βΐιίηοΐ. 1>агупдо1, 105:234-241.
20. Еогздгеп, А., апб А. СгиЬЬ. 1979. Мапу ЬасРегбаб зреобез Ьбпб Ьитап 1д0. <3. Тттипо! 122:1468-1472.
21. Еогздгеп А, ВгапР М, МоИепкубзР А, еР а1. 1зо1аРбоп апб сЬагасРегбгаРбоп οί а ηονθΐ 1дО-Ьбпббпд ргоРебп Егот МогахеИа саРаггЬаббз. О 1ттипо1 2001;167:2112-20.
22. Еогздгеп А, ВгапР М, КагатеИтеботбс М апб ВбезЬеск К. ТЬе бттиподбоЬиббп ϋ-Ьбпббпд ргоРебп ΜΙ0 бгот МогахеИа саРаггЬаббз бз а1зо ап абЬезбп. ΙηίβαΡ 1тгпип 2003; 71:3302-9.
23. Еогздгеп А, ВгапР М апб КбеэЬеск К. ХттипбгаРбоп ибРИ РЬе РгипсаРеб абЬезбоп тогахеИа саРаггЬаббз бттиподбоЬиббп ϋ-Ьбпббпд ргоРебп (МЮ764-913) бз ρηοΡβαΡίνβ адабпзр М. саРаггЬаббз бп а тоизе тобеб οί рибтопагу сбеагапсе. σ ΙηίβοΡ Обз 2004;190:352-5.
24. Ε^ότίοίί-Ибпдгеп, А., К. Набгбс, А. Еогздгеп, апб К. КбезЬеск. 2002. А ηονβΐ 1дО-Ьбпббпд ЬасРегбаб ргоРебп Ргот МогахеИа саРаггЬаббз бпбисез Ьитап В бутрЬосуРе асббтаРбоп апб бзоРуре знбРсЬбпд бп РЬе ргезепсе οί ТЬ2 суРокбпез. 3. 1нштпо1. 168:5582-5588.
- 31 014352
25. СгеепнооН ГС, Нипкег ИМ апс! αίονβΓ σε. ТЪе Ргерагакхоп о£ 1-131-ЬаЬе11е0 Нитап СгоикЬ Ногтопе о£ НхдЬ Зрес1£хс КасНоаскхУхку. ВхосЬет σ 1963;89:114-23.
26. Сгех££, Э., I. Егзе£Э1к, С. Зчепззоп, Р. Ио11гаег, ϋ. А1кпег, М. Апйегззоп, апс! С. С. Регззоп. 1993. Р1азта ехийаЫоп апс! зоХике аЬзогЬкхоп асгозз кЬе ахгиау шисоза. СИп. Р'пуз1о1. 13: 219-233.
27. Напзкх Е, Сарагоп М. Ргокехп Е, а £1Ъгопеск1п-Ыпс11пд ргокехп, хв ап айЬезхп о£ кЬе дгоир А зкгеркососсиз Зкгеркососсиз руодепез. Ргос Ыак1 Асас! 5с1 ϋ 3 А 1992;89:6172-6.
28. Науз σΡ, уап Йег ЗсЬее С, Ьоодшап А, ек а1. Тока1 депоте ро1утогрЫзт апс! 1он £гедиепсу о£ хпкга-депот!с уаг1ак1оп ίη кЬе изрА1 апс! изрА2 депез о£ Могахе11а сакаггЬа1хз ίη сиЫз ргопе апй поп-ргопе сЫШгеп ир ко 2 уеагз о£ аде. Сопзедиепсез £ог Уассхпе йезхдп? Уассхпе 2003;21:1118-24.
29. Нехс1епге1сЬ, Е., апс! Μ. Р. ОхегхсЪ. 1985. СапсИЗа а1Ысапз апс! СапсНйа акеИакохйеа, ίη сопкгазк ко окИег Салсййа зресхез, Ьхпй хСЗЬ апс! СЗЙ Ьик пок СЗЬ. 1п£ес£.. Тлипип. 50:598-600.
30. Не1т1пеп МЕ, Масхуег I, Ъак1тег Л, ек а1. А 1агде, апк1депкса11у сопзегуес! ргоке!п оп кЬе зиг£асе о£ Могахе11а сакаггНаПз хз а кагдек £ог ргокескГт'е апкхЬосЦез. 1 1п£еск ϋίβ 1994;170:867-72.
31. Ηίΐΐ ϋύΓ, νίΓ^ί Μ. Α ηονθΐ се11-Ьхпс!1пд тесЬапхзт о£ Могахе11а сакаггЬаИв иЫдихкоиз зиг£асе ргокехп ОзрА: зресх£1с кагдекхпд о£ кЬе Ы-дота1п о£ сагскпоетЬгуопхс апкхдеП“ге1акес1 се11 асИэевхоп то1еси1ез Ъу 0зрА1. Мо1 М1сгоЬхо1 2003;48:117-29.
32. Нохсгук Е, Коддепкатр А, ВехсИепЬесЪег М, Ьираз А апс!
Неезетапп <Г. Зкгискиге апс! зедиепсе апа1узхз о£ .
Уегзхпка Уас!А апс! Могахе11а изрАз τβνβ31 а ηονβΐ с1азз о£ адНез1пз. ЕМВ07 2000;19:5989-99.
- 32 014352
33. Ηοίπι ММ, Уап1егЬегд 51., Го1еу ΙΜ, 31еб]езк1 ϋϋ апб Ьа£оп£а1пе ЕВ. Тйе МогахеИа саЪаггЪ.а115 рогбп-Ике оикег шешЬгапе ргокедл СВ 15 ап абЬездп £ог Ъишап 1ипд се11з. Ιηίβαΐ: 1пипип 2004; 72:1906-13 .
34. Но1, С., С. М. Уегбихп, Е. Е. 7ал 01]ке, >7. УегЬое£, А. Г1еег, Н. уал 01]к. 1995. Сотр1етеп-Ь гез1з£апсе Ϊ5 а ухгиХепсе ГасЪог о£ ВгапЬатеИа (МогахеИа) саЬаггЪаИз. ΕΞΜΞ 1пнпипо1. Мес1. М1схоЫо1. 11:207-211.
35. Ногпе£, Μ. V?., М. 7. Ихск, М. КЬел, апс! 3. Ыогтагк.
002. Вас£ег1а1 з£га£ед1ез £ог оуегсотпд Нозк 1ппа£е апб абарЪбуе бттипе гезропеез. Ма£. Тмгаипо!. 3:10331040.
36. Ноз£е££ег, М. К., М. Ъ. Ткотаз, Г. 5. Козел, апб В. Г. Гаск. 1982. ВхпШпд о£ СЗЬ ргосеебз Ьу а £Γ3η3©3ΐθ3ίί£ΐθ3·£ϊοη геасЫол ак №е £]п1О1ез1:ег з1£е.
Д7а£иге 298:72-75.
37.
Ноз-Ьеккег, М
Кгиедег, апб ϋ
ЗсктеИпд
1004
АУЛ
ТЧ-. ϋ 1ч. 4 г-ч 'МГ, 4 чЪ ν-τί Λ ?МЧ ® у**. Л 4 П ч+- Ί ΛΤΙ
ЬА_у 'УД.
38.
кЬе геас£1уе ЪЫо1ев£.ег о£ РИе ЕЫгб сотропепЕ о£ сотр1еИ1еп£. Ιη£βαί. ΌΙξ. 150:653-661.
СГоН й, Капп ЕЕ, Кгехкетеуег В, Зрег1а1е Р апб Ноок М.
Ко1е о£ £1ЬгопесЪ1пЬ1пб1пд МЗСКАММз ΐπ Ьас£егха1 абИегепсе апб елкгу ΐϊΐΐ,ο таттаИап се11з. Ма£г1х В1о1
1999;18:211-23.
39. СГоЬ Нб, Ноизе-Ротрео К, Ра££1 йМ, Сигизхббарра 3 апб Ноок М. Г1Ьгопес£1п гесер-Ьогз £гот дгат-розхЫге ЬасЪегба: сотрагхзоп о£ асР1’ге з1£ез. ΒίοοΙηβιηΪΒΐΐΓγ 1994;33:6086-92.
40. Кага1из К, Сатрадпаг! А. МогахеИа саЪаггЬаНз: а ΓβνίβΜ о£ ап хтрогкапк Нищал тисоза1 ра£йодеп. МгсгоЬез 1п£ес£ 2000;2:547-59.
41. Казк, Ь., Ь.А. Тгоии, В. ОаЫЬаск, апб А. М. В1от,
2004. ТИе С4Ь-Ыпб1пд ρΓΟίεΐη-ρΓοΕβίη 3 сотр1ех 1пЫЫ£з £Ие рЬадосу£оз!з о£ арорЪсЫс се11з. <3. ΒίοΙ. Сйелг. 279:23869-23873.
- 33 014352
42. Ъасктапп, Р. Д. 2002. М1сгоЬка1 зиЬтегзбоп о£ кке хштипе гезропзе, Ргос. А7ак2. Асаб. Зс1. и.З.А 99:84618462.
43. Ъа£опка1пе ЕВ, Соре Ы), АеЫ С, Ьакктег ДЬ, МсСгаскеп ОН, Дг. апб Напзеп ЕД. ТНе 0зрА1 ргокекп апб а зесопб куре о£ ОзрА2 ргокехп тебкаке абЬегепсе о£ МогахеИа сакаггЬа1кз ко китап ерккке1ка1 се118 1п уккго. б Васкегко1 2000;182:1364-73.
44. Ьее, Ь. Υ. Ь., М. НйОк, О. Науккгтб, К. А. Иекзе1, Е.
О. Уопкег, Р. Зуг1Ьеуз, Д. Уегпаскко, апб Е. Ъ. Вгомп. 2004. ДпккЬкккоп о£ сотр1етепк аск^аккоп Ьу зесгекеб ЗЬар12у1ососсиз аигеиз ргокекп. Л. 1п£ес1:. ΩΪ3. 190:571579. . ·
45. Маск ϋ, Неезетапп Д апб Ьаи£з К. Сйагаскег1гаЫ.оп о£ бк££егепк оИдотегкс зрескез о£ кке Уегзкпка епкегосо11кд.са оикег тетЬгапе ргокехп УабА. Меб МксгоЬко1 1ттипо1 (Вег1) 1994;183:217-27.
46. МаЬезИиагк КК, Кебаг УР, ВЬагккуа ϋ, Сооп НС апб Капд УН. 1пЪег£егоп епЬапсез ПЬгопесЫп ехргеззкоп кп , уаггоиз се11 курез. Д Βΐοΐ Веди1 Нотеозк Адепкз 1990;4:117-24.
47. МсСаукп МД, Сигизгббарра 8, Ъкпбдгеп РЕ, ЬкпбЬегд М, Вайсс! С апб Ноок М. ЕЧЬгопесккп гесеркогз £гот Зкгеркососсиз бузда1асккае апб Зкаркукососсиз аигеиз. 1пт7о1уетепк о£ сопвегтеб гезкбиез кп Идапб Ькпбкпд. б Βΐοΐ СЬет 1993;268:23946-53.
48. МсМ1сЬае1 СТС. Уасскпез £ог МогахеИа сакаггЬаНз.. Уасскпе 2000;19 Зирр1 1:3101-7.
49. МсМксЬаё1 ДС, Гкзке МД, ЕгебепЬигд НА, ек а1. 1зо1аккоп апб скагаскегкгаккоп о£ кио ргокекпз £гот МогахеИа сакаггка1кз ккак Ьеаг а соттоп ерхкоре. 1п£еск 1ттип . 1998;66:4374-81. '
50. Мекег РЗ, ТгоНёг К, бгкуёа ΙΝ, 5угодкаппорои1оз ΘΑ апб АеЬк С. ТЬё оикег тетЬгапе ргокекпз 0зрА1 апб ПзрА2 о£ МогахеИа сакаггЬаНз аге ЬкдЬ1у сопзегуеб кп
- 34 014352 пазорйагупдеа1 1зо1а6ез £гот уоипд сйИБгеп. Уассхпе 2002;20:1754-60.
51. Мег1, 3., Т. ЬеЪк1пеп, апБ Т. Ра1та. 1984. Сошр1етепЬ 1п сЬгоп1с зесгекогу оГШз тесИа. СЗ Ьгеакдоип апБ СЗ зрИкклпд ас61У1Ъу. Агс11. ОЬо1агупдо1.. 110:774-778.
52. Мег1, Т., А. И. В1от, А. Нагктапп, ϋ. Ъепк, Б. Мег1, Р. Ε. Ζϊρίεΐ. 2004. Тйе Ьурйа1 апд уеазк Гогтз о£ СалЭББа а1Ысап8 Ыпй Ъке сотр1етеп1: геди1аког С4Ь-ЫпсНпд ргокехп. 1п£есЬ. 1штип. 72:6633-6641.
53. МоИепктГзЪ А, МогБзкгот Т, НаИйеп С, СНг^зкепзеп 70, Еогздгеп А апд ЕИезЬеск К. Тке МогахеИа сакаггйаНз 11щпипод1оЬи11п О-ЫпсНпд ргокелп ΜΙΟ каз сопзегуеб зедиепсез апс! Ϊ5 геди1акеБ Ьу а тесНаплзт соггезропсЦпд ко рЬазе уагкаккоп. О Васкегко1 2003;185:2285-95.
54. МопдосПп Е, Вадо1ек О, Сикгопа 7, еГ а1. ЕкЬгопесккпЫпсПпд ргокекпз οί 3 к арку 1 ос о с сиз аигеиз аге ϊηνοίνθά ϊη адЪегепсе ко кита л аБгмау ерккЬе1кит. 1п£еск Пптип 2002;70:620-30.
55. МигрЬу ТЕ. ВгапИатеИа сакаггЬаЫз: ер!с!еп1ко1оду, зигГасе апкхдепкс зкгискиге, апБ д-пипипе гезропзе. М1сгоЫо1 Ββν 1996;60:267-79.
56. Мигрйу ТЕ, Вгаиег АЬ, АеЬ1 С апс1 ЗекПк 3. 1бепк1£1саккоп о£ зиг£асе апМдепз ок МогахеИа сакаггйаНз аз кагдекз о£ Ьшпап зегит апк1Ьос!у гезропзез ϊη скгопкс оЬзкгиск!уе ри1топагу сПзеазе. 1п£еск Тпипип 2005;73:3471-8.
57. Ыагк1й-маке1а, М., О. 7его, апс! 3. Мегх 1999, Сотр1етепк аск!уак1оп апс! ехргеззхоп о£ тетЬгапе гедикакогз ίη кЬе πιϊάάΐβ еаг тисоза ϊη оккккз тес11а мккк е££изкоп. С11п. Ехр. 1ттило1. 116:401-409.
58. ИогБзкгот Т, В1от АМ, Еогздгеп А апБ МезЬеск К. ТИе етегдкпд ракЪодеп МогахеИа ааЪаггкаИз 1пкегаскз нккк сотркетепк хпЫЫког С4Ь ЬкпсНпд ргокекп кйгоидЬ иЫдихкоиз зигкасе ргокехпз А1 апс! А2. 7 1ттипо1 2004;173:4598-606.
- 35 014352
59. Ыогйзкгот Т, Гогздгеп А апд КхезЬеск К. ТЬе . х1гапипод1оЬи11п О-ЫпсПпд рагк о£ ЪЬе оикег тетЬгапе ргоЪехп ΜΙϋ £гот МогахеИа са+аггкаИз сотргхзез 238 атхпо асхбз апб а Ъе£гатег1с абгискиге. Д В±о1 СЪет
2002;277:34692-9.
60.
61.
62.
63.
64.
КогйзЪгот Т, В1от ДМ, Тап ТТ, Еогздгеп А апс! КхевЬеск К, 1опхс ЪхпсБхпд о£ СЗ ко £Ье Бита η раЬЬодеп МогахеИа са£аггЬа1хз хв а ипхдие тесЬапхзш £ог сотЬаЫпд хппаке хттипхЬу. Д 1тшипо1 20.05; Μ3#05-2213, ίη ргезз. Реагзоп ММ, Ьа£опка1пе ЕК, Йадпег ЫД, ЗС Сете ДИ, Зге! апс! Напзеп ЕД. А Над тикапк о£ МогахеИа сакаггНаЕкз зкгахп О35Е 1з Йе£1схепк 1п ЬетаддДиЫпакхоп, аикоаддБиЫпакхоп, апс! хттипод1оЬи11п Р-Ыпс11пд асЬхуБЫез. 1п£ес1: 1ттип 2002;70:4523-33. .
Регззоп, С. С., I. Е^е£а1Е, 0. А1кпег, С. ВаитдагЬэп, Ь. Сгех££, В. Сиз1:а£ззоп, А. Ъикз, и. Рхркогп, Г.
5ипс11ег, С. Зуепззоп е£ а1. 1991. Р1азта ехийакхоп аз а •ΡτνΌΈ ΊΊη^ тчай^·! ί*ϊΰ-ΡίϊΗι /* 7 > η Я* ν*-4
А11егду 21: 17-24.
Р1о£комзк± МС, Тоигпхег ДМ апй
РисИеНе Е. РзеисБотопаз аегид!поза зкгахпз роззезз зресх£хс абйезхпз £ог
1атхпхп. 1п£ес£ Тттип 1996;64:600-5.
Ргазадагао, N. V., А. М. В1от, В. О. УШоикгехх, апс!
Ь. С. Ыпзапдап. 2002. Α ηονθΐ хпРегасЬБоп о£ оикег тетЬгапе ргокехп А шЛИ С4Ь ЫпсБхпд ргокехп тесБхакез зегит гезхзкапсе о£ ЕзсЛегхслха со!1 К1. Д. Тпнпипо!. 169:6352-6360.
65. Кат, 8., М. СиШпапе, А. М. В1от, 3. Си1акх, β. Р. МсОихИеп, В. С. Мопкз, С. О’СоппеИ, К. ВосБеп, С. Е1кхпз, М. К. РапдЬигп, В. ОаЫЬаск, апс! Р. А. Шее. 2001. ВхпсНпд о£ С4Ь-ЬхпсБхпд ргокехп ко рог!п: а то!еси1аг теейапхзт о£ зегит гезхзкапсе о£ Мехззегха допоггЬоеае. '4. Ехр. Ме<5. 193:281-296. ,
66. Каикетаа, К., апс! 3. Мегх. 1999. Сотр1етепЪ-гезхз1:апсе тес)хап15тз о£ Ьаскегха. ШсгоЬез Σηίβσϋ. 1:785-94.
- 36 014352
67. Веп, В., А. Д. Зга1а1, 3. К. НоШпдзИеаб, ϋ. Е. ВгИез. 2004. Е££ес£з о£ РзрА апб апЫЬобхез £о РзрА оп асЫуаЫоп апб берозхЫоп о£ сотр1ешеп£ оп БЬе рпеипюсосса1 зиг£асе. 1п£есЬ. 1пипип. 72:114-122.
68. КобгЗ-диег бе СбгбоЬа, 3., О'. Езрагга-богбШо, Е. Соз-соесНеа бе СГогде, М. Борег-Тгазсаза, апб Р. ВАпсЪегСогга1. 2004. ТЬе Ьитап сотр1етеп£. £ас£ог Н: £ипсЫопа1 го1ез, депеЫс уаг1аБ1опз апб сПзеазе аззосхаЫопз. Мо1. Тлипипо!. 41:355-367.
69. Кодег Р, РисЬеНе Е, ΒΒ^οΙβΐ-ΙιΒυάϊηΗί О, е£ а1. Е1ЬгопесЫп апб а1рЪа5Ье£а1 1пЬедг1п тебхаке ЫпсПпд о£ Рзеибокюпаз аегидБпоза ίο гераъгхпд ахгиау ерίίϊτβ1хит. Еиг В.езр1г 1 1999;13:1301-9.
70. Воддепкатр А, Аскегтапп Ν, ОасоЫ СА, Тгие1хзсЬ К, Но££тапп Н апс! Неезетапп О. Мо1еаи1аг апа1уз±з о£ £гапзрог£ апб оИдотехТгаЫоп о£ Бле Уегзхпха епЪегосоНЫса абЬез±п УабА. 1 Вас£егхо1 2003;185:373544.
71. Кога1зка В, ИабзБгот Т. РгокесЫуе орзопхс асЫухку о£ * апМЪобхез адабпзк ГхЬгопесБхп-Ыпбхпд ргокехпз (ЕпВРз) о£ ЗкарИу1ососсиз аигеиз. Зсапб 1пипипо1 1993;37:57580.
72. Захепа, А., апс! К. Са1бегопе. 1990. Риг1£1саЪ1оп апб сЬагаскегхгаЫоп о£ £Ье ехЬгасе11и1аг СЗб-Ыпбхпд ргокехп о£ СапсЦба а1Ь1сап8. 1п£е.сЪ. 1ятип. 58:309-314.
73. ЗсЬнагζ-Ыпек и, Иегпег Л4, ₽1ск£огб АВ, е£ а1. РаРЬодепхс ЬасЬегха а££ас11 Со Ьитап МЬгопесЫп БЬгоидЬ а Бапбет ЬеБа-гхррег· ЫаЪиге 2003;423:177-81.
74. ЗеЪЫ, 5., апб Т. Г. МигрЬу. 2001. Вас£ег1а1 ίη£βο£ίοη 1п сЬгопхс оЬзБгисБхуе ри1шопагу б!зеазе 1п 2000: а з£а£е-о£-£Ье-аг£. геу.1еи. СИп. М1схоЪ1о1. Ββν. 14:336363.
75. ЗЬхшхги, Т., Т. Нагаба, Υ. Ма^хта, апб Υ. Закакига. 1988. Вас£егхс1ба1 αοίΐνίίγ о£ т£бб1е еаг е££из!оп оп а
- 37 014352 з!пд1е 15О1аЪе о£ ηοη-кураЫе НаешорЬИиз 1п£1иеп2ае. 1п£. ·/. Рес?1а£г. 0£огЫпо1агупдо1. 16:211-217.
76. Таек, В. Г., К. А. Нагггзоп, Д. Дапакоуа, М. Ь. ткотаз, апб б. И. РгаЫ. 198 0. Εν Шепсе £ог ргезепсе о£ ап 1пкегпа1 кк1о1езкег Ьопй ίη ккйгс! сотропепк о£ китап сотр1етепк. Ргос. МаИ. Аса<3. Зс£. и.З.А. 77: 57645768.
77. Та1ау 8К, УаХеггЫп-Иехдапб Р, ДегХзкгот РО, Т1тпйз ΚΝ апй Сккакюа! БЗ. ПЬгопескХп-ЫпсИпд ргокеХп о£ Зкгеркоаоссиз руодепез: зедиепсе о£ кке ЫпсНпд άοπιβίη ίηνοίνβά ίη аёкегепсе о£ зкгеркососсх ко ерхккеНаХ се11з. 1п£еск 1ттип 1992;60:3837-44.
78. Тап, т. т., Т. ИогбзкгОт, А. Еогздгеп, апб К. К1езЬеск.
2005. Тке КезрХгакогу Раккодеп МогахеИа саЪаггкаИз Аёкегез ко ЕртккеИа! Се11з Ьу 1пкегаск1пд м!кк Г1Ьгопеск1п ккгоидк 0Ь1ди1коиз Зиг£асе Ргоке1пз А1 апй А2. Д. ДлГеск. Р1з., МЗ# 33893, ίη ргезз.
79. Теппег, А. Д., Р. Н. Ьезауге, апб Ν. К. Соорег. 1981. РигШсаИоп апё гас!1о1аЪе11пд о£ китап Οίς. <7. ДттипоХ. 127:648-653.
80. Ткегп, А,, I·. ЗкепЬегд, В. ЕаЫЬаск, апб Б. ЫпбакХ. 1995. 1д-Ыпб1пд зиг£асе ргокехпз о£ ЗЬгерЬососсиз руодепез а1зо Ыпб китап С4Ь-Ыпс11пд ргоке1п (С4ВР) , а геди1акогу сотропепк о£ кке сотрХетепк зузкет. Д. 1ПШШПО1. 154:375-386.
81. Т1тре ДМ, Но1т ММ, УапХегЬегд ЗЬ, Вазгиг V апб Ьа£опкахпе ΕΚ. 1бепк1£1сак1оп о£ а МогахеХХа сакаггкаИз оикег тетЬгапе ргокетп ехкХЫкхпд кокк абкезхп апё Х1роХук1с аск!у1к1ез. 1п£еск 1ттип 2003;71:4341-50.
82. Ти, А. И., К. Ь. Еи1дкат, И. А. МсСгогу, Ώ. Е. Вг11ез, А. Д, ЗгаХах. 1999. РпеитососсаХ зиг£асе ргокехп А йпкхЫкз сотр1етепк асЫтаЫоп Ьу Зкгеркососсиз рпешпопЗае, 1п£есЬ. Длмпип. 67x4720.
83. ипкапапб, Μ., I. ΜβαίνβΓ, О. КатИо, О. АгепсхЫаМ1ге1ез, Д. С. Агду1е, Б. Н. МсСгаскеп Дг, апй Е. Д. Напзеп. 1992. Ри1топагу с1еагапсе о£ МогахеИа саЬаггкаИз 1п ап ап!та1 тобе1. Д. 1п£еа£. ΰίβ. 165:644-650.
- 38 014352
84. Уегбибп СМ, Ηοΐ С, Пеег Α, νΗη Η апб уап Ве1кшп
А. МогахеПа сакаггЬаПз: £гош етегдхпд ко езкаЫхзЬеб ракбодеп. С11п М1сгоЫо1 Неи 2 002;15:125-44.
85. ИаХрогк, М. 0. 2001. Сошр1етепк. Рхгзк о£ кмо рагкз. Ν.
Еп$1.д. Мед. 344:1058-1066.
86. Иа1рогк, М. б. 2001. Сотр1етепк. Зесопб о£ кио рагкз.
Ν. Епд1. σ. Мед. 344:1140-1144.
87. Иапд Н, Ии X, υιαίηο Т, ек а1. Е££еск о£ сбдагекке зтоке оп £1ЬгоЫазк-теб1акеб де1 сопкгаскбоп 1з берепбепк оп се11 бепзбку. Ат б РЬуз1о1 Ьипд Се11 Мо1 РЬуз1о1 2003;284:Ь205-13. , .
88. Ииггпег, К. 1999. Εν33ίοη ό£ ракЬодепз Ьу ауо1б1пд гесодпбкхоп ог егаббсакбоп Ьу сотр1етепк, ίη рагк νίβ то1еси1аг т1т1сгу. Мо1. 1ттипо1. 36:249-260.
89. Ζίρ£β1, Р. Г., С. Бкегка, 3. Не11маде, 5. Т. бокбгапка,
5. Мег1, V. Вгабе, Р. Кга1сау, Μ. Νογϊ3, апб 6.
Р.етихг!. 2001. Гаског Н £ат!1у ргокедпз: оп сотр1етепк, тбсгоЬез апб Нитап ббзеавез. ВбосПет. Зое. Тгапз.
30:971-978.
Claims (1)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Пептид, состоящий из последовательности ΙΌ ΝΟ. 2, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, дегенеративный продукт или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой вторичный процессированный продукт, который сохраняет свойства связывать фибронектин.2. Пептид, состоящий из последовательности ΙΌ ΝΟ. 3, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, дегенеративный продукт или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой вторичный процессированный продукт, который сохраняет свойства связывать фибронектин.3. Применение по крайней мере одного пептида по любому из пп.1, 2 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции.4. Применение по п.3, при котором инфекция вызвана МогахеПа са1аггЬа118.5. Применение по п.3 или 4 для профилактики или лечения воспаления среднего уха, синусита или инфекций нижних дыхательных путей.6. Лиганд, включающий связывающий фибронектин домен и состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности ΙΌ ΝΟ. 2 или последовательности ΙΌ ΝΟ. 3, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, дегенеративный продукт или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой вторичный процессированный продукт, который сохраняет свойства связывать фибронектин.7. Слитый белок, включающий один или несколько лигандов по п.6.8. Лекарственное средство, содержащее один или несколько лигандов по п.6 или 7 и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, вспомогательных веществ, связующих веществ, носителей или консервантов.9. Вакцина, содержащая один или несколько лигандов по п.6 или 7 и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, вспомогательных веществ, связующих веществ, носителей или консервантов.10. Способ лечения или профилактики у индивидуума инфекции, включающий введение фармацевтически эффективного количества лекарственного средства по п.8 или вакцины по п.9.11. Способ по п.10, в котором инфекция вызвана МогахеПа са1аггПа118.12. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лиганд, определенный в п.6, или пептид, определенный в п.1 или 2.13. Полипептид или усеченный полипептид, включающий по крайней мере одну из консервативных последовательностей последовательности ΙΌ ΝΟ. 2 или последовательности ΙΌ ΝΟ. 3, или его фрагмент, гомолог, функциональный эквивалент, производное, дегенеративный продукт или продукт гидроксилирования, сульфонирования или гликозилирования или другой вторичный процессированный продукт, который обладает способностью связывать фибронектин.- 39 01435214. Вакцинная композиция, содержащая эффективное количество ИкрА1 и/или ИкрА2 в комбинации с эффективным количеством белка МГО и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, наполнителей, вспомогательных веществ, связующих веществ, носителей или консервантов.15. Применение эффективного количества ИкрА1 и/или ИкрА2 в комбинации с эффективным количеством белка МГО для получения лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции.16. Применение по п.15, при котором инфекция вызвана Могахе11а са!аггйа11к.СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ате Гогздгеп АВ <120> ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОКАХЕЬЬА САТАККНЛЫЗ С ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ, ВНЕКЛЕТОЧНЫМИ МАТРИКСНЫМИ БЕЛКАМИ И СИСТЕМОЙ КОМПЛЕМЕНТА <130> 21027432 <160> 10 <170> РаСепЫп νβτείοη 3.1 <210> 1 <211>31 <212> Белок <213> Фрагмент белка из Могахе11а сайаггЬаН® (С®рА1 405-435 или 0®рА2 244274) или синтетический пептид <400>1Αερ <31п Ьуз А1а Авр Не Азр Азп Азп 11е Азп Азп 11е Туг О1ч Ьеи1015А1а <31п <31п 61п Азр <31п Н1е Зег Зег Азр 11е Ьуз ТЪ.г Ьеи Ьуз2530 <210> 2 <211>154 <212> Белок <213> фрагмент белка из Могахе11а сайаггНаНз (ЦзрА1 299-452) или синтетический пептид <400>2ТЬг 31у Азп <31у Наг Уа1 Зег Уа1 (31у Ьуз Ьуз (51у Ьуз С1и Агд С1п 15 1015- 40 014352
Не Уа1 НЬз УаЬ 20 С Ту АТ а СТ у СЬи 11е 25 8ег Азр ТЬг Зег ТЬг 30 Азр АЬа УаЬ Азп СЬу Зег СЬп Ьеи НЬз УаЬ Ьеи АЬа ТЬг УаЬ УаЬ АЬа СЬп Азп 35 40 45 Ьуз АЬа Азр Не Ьуз Азр Ьеи Азр Азр СЬи УаЬ СЬу Ьеи Ьеи СЬу 51 и 50 55 60 СЬи Не Азп Зег Ьеи СЬи СЬу СЬи Не РЬе Азп Азп СЬп Азр АЬа 11е 65 70 75 80 АЬа Ьуз Азп СЬп АЬа Азр Ые Ьуз ТЬг Ьеи СЬи Зег Азп УаЬ СЬи СЬи 85 90 95 СЬу Ьеи Ьеи Азр Ьеи Зег СЬу Агд Ьеи Ьеи Азр СЬп Ьуз АЬа Азр 11е 100 105 110 Азр Азп Азп Не Азп Азп 11е Туг СЬи Ьеи АЬа СЬп СЬп СЬп Азр СЬп 115 120 125 НЬз Зег Зег Азр 11е Ьуз ТЬг Ьеи Ьуз Азп Азп УаЬ СЬи СЬи СЬу Ьеи 130 135 140 Ьеи Азр Ьеи Зег СЬу Агд Ьеи Ые Азр СЬп 145 150 <210> 3 <211> 154 <212> Белок <213> фрагмент белка из могахеЫа са^аггИаИз (изрА2 165-318) или синтетический пептид <400> 3Ьуз 1 Азр АЬа Не АЬа 5 Ьуз Азп Азп СЬи Зег 10 Ые СЬи Азр Ьеи Туг 15 Азр РНе СЬу НЬз СЬи УаЬ АЬа СЬи Зег Не СЬу СЬи Ые Н15 АЬа НЬз Азп 20 25 30 СЬи АЬа СЬп Азп СЬи ТЬг Ьеи Ьуз СЬу Ьеи Не ТЬг Азп Зег 11е СЬи 35 40 45 Азп ТЬг Азп Азп Не ТЬг Ьуз Азп Ьуз АЬа Азр 11е СЬп АЬа Ьеи СЬи 50 55 60 - 41 014352Азп 65 АЗП ча1 Уа1 61и 61и 70 Ьеи РЬе Азп Ьеи Ёег 75 <31у Агд Ьеи Не Азр 80 61 п Ьуз А1а Азр Не 85 Авр Азп Азп Не Азп 90 Азп 11е Туг 61и ьеи 95 А1а 61П С1п (Э1П Азр 100 (31п II 1з Зег Зег Азр 105 11е Ьуз ТЬг Ьеи Ьуз 110 Ьуз Азп ча1 <31и (31и 115 61у Ьеи Ьеи 61и ьеи 120 Зег Азр Нхз Не Не 125 Авр <31п ьуз ТЬг Азр 130 Не А1а 61п Азп О1п 135 А1а Азп Т1е <31п Авр 140 ьеи А1а ТЬг туг Азп 145 С1и Ьеи С1п Азр <Э1п 150 Туг А1а <31п Ьуз с21С> 4 <211> 721 <212> Белок <213> фрагмент белка из МогахеИа саРаггЬаНз (0зрА1 50-770) или синтетический пептид <400> 4Ьуз Уа1 01у Ьуз А1а ТЬг Азп Ьуз 11 е Зег 61у С1у Авр Азп Азп ТЬг 1 5 10 15 А1а АЗП 61у ТЬг Туг Ьеи ТЬг Не 61у 01у 61у Азр Туг АЗП Ьув ТЬг 20 25 30 Ьув 61у Агд Туг Зег ТЬг Не С1у С1у 01у Ьеи РЬе Азп 61и А1а ТЬг 35 40 45 Азп 61и Туг Зег ТЬг Не 61у Зег Э1у 61 у Туг Азп Ьуз А1а Ьуз 61у 50 55 60 Агд Туг Зег ТЬг 11е С1у С1у □1у <31у Туг Азп 61и А1а ТЬг Азп 61п 65 70 75 80 Туг Зег ТЬг Не <Э1у С1у е1у Азр АЗП Азп ТЬг А1а Ьув С1у Агд туг 85 90 95 Зег ТЬг Не <31у 61у С1у С1у Туг Азп 61и А1а ТЬг Не 61и Азп Бег 100 105 110 - 42 014352ТЬг Уа1 С1у 115 61У <31у <31у Туг Азп <31п А1а Ьуз <31у Агд Азп Зег ТЬг 120 125 Уа1 АЗ. а 130 С1у 51у Туг Азп Азп 135 <31и А1а ТЬг 31у ТЬг 140 Азр Зег ТЬг Не А1а 145 <31у С1у Агд Ьуз АЗП 150 <31п А1а ТЬг 61у Ьуз 155 <31у Зег РЬе А1а А1а 160 С1у 11е Азр Азп Ьуз 165 А1а АЗП А1а Авр Азп 170 А1а Уа1 А1а Ьеи (31у 175 Азп Ьуз АЗП ТЬг Не 180 61и <31у С1и Азп Зег 185 Уа1 А1а 11е С1у Зег 190 Азп Азп ТЬг йа1 Ьуз 195 Ьуз 51у <31п 61п Азп 200 Уа1 РЬе Не Ьеи 61у 205 Зег Азп ТЬг Азр ТЬг 210 ТЬг Азп А1а <31п Азп 215 С1у Зег Уа1 Ьеи Ьеи 220 О1у Н18 Азп ТЬг А1а 225 01у Ьуз А1а А1а ТЬг 230 Не Уа1 Азп Зег А1а 235 61и Уа1 <31у <31у Ьеи 240 Зег Ьеи ТЬг С1у РЬе 245 А1а С1у А1а Зег Ьуз 250 ТЬг С1у Азп <31у ТЬг 255 Уа1 8ег Уа1 С1у Ьуз 260 Ьуз б1у Ьуз (31и Агд 265 θΐη Не Уа1 ΗΪ3 Уа1 270 С1у А1а С1у С1и Не 275 Зег Азр ТЬг Зег ТЬг 280 Азр А1а Уа1 АЗП О1у 285 Зег С1п ьеи ΗΪ3 Уа1 290 Ьеи А1а ТЬг Уа1 Уа1 295 А1а Θΐη Азп Ьуз А1а 300 Азр 11е ьуз Азр Ьеи 305 Авр Азр <31и Уа1 <31у 310 Ьеи Ьеи 61у С1и С1и 315 Не Азп Зег Ьеи С1и 320 С1у С1и 11е РЬе Азп 325 Азп <31п Азр А. 1а Не 330 А1а Ьуз Азп С1п А1а 335 Азр Не Ьуз ТЬг Ьеи 340 61и Зег Азп Уа1 С1и 345 С1и С1у Ьеи Ьеи Азр 350 Ьеи Зег С1у Агд Ьеи 355 Ьеи Азр <31п Ьуз А1а 360 Авр Не Азр Азп Азп 365 Не Азп Азп - 43 014352Не Туг СЬи Ьеи АЬа 370 СЬп СЬп СЬп Азр 375 СЬп НЬз Зег 380 Зег Азр ЬЬе Ьуз Ткг 385 Ьеи Ьуз Азп Азп УаЬ 390 СЬи СЬи СЬу Ьеи Ьеи 395 Азр Ьеи Зег СЬу Агд 400 Ьеи Не Азр СЬп Ьуз 405 АЬа Азр Ьеи ТЬг Ьуз 410 Азр ЬЬе Ьуз АЬа Ьеи 4Ь5 СЬи Зег АЗП УаЬ С1и 420 СЬи СЬу ьеи Ьеи Азр 425 Ьеи Зег СЬу Агд Ьеи 430 ьЬе Азр СЬп Ьуз АЬа 435 Азр Не АЬа Ьуз Азп 440 СЬп АЬа Азр ЬЬе АЬа 445 СЬп Азп СЬп Ткг Азр 450 Не СЬп Азр Ьеи АЬа 455 АЬа Туг Азп СЬи Ьеи 460 СЬп Азр АЬа Туг АЬа 465 Ьуз СЬп СЬп ТЬг СЬи 470 АЬа Ые Азр АЬа Ьеи 475 Азп Ьуз АЬа Зег Зег 480 АЬа Азп ТЬг Азр Агд 485 ЬЬе АЬа ТЬг АЬа СЬи 490 Ьеи СЬу ЬЬе АЬа СЬи 4 95 Азп Ьуз Ьуз Азр АЬа 500 СЬп ЬЬе АЬа Ьуз АЬа 505 СЬп АЬа Азп СЬи Азп 510 Ьуз Азр СЬу ЬЬе АЬа 515 ьуз АЗП СЬп АЬа Азр 520 ЬЬе СЬп Ьеи НЬз Азр 525 Ьуз Ьуз ЬЬе ТЬг Азп 530 Ьеи СЬу ЬЬе Ьеи НЬз 535 Зег Мер УаЬ АЬа Агд 540 АЬа УаЬ СЬу Азп Азп 545 ТЬг СЬп СЬу УаЬ АЬа 550 ТЬг Азп Ьуз АЬа Азр 555 ЬЬе АЬа Ьуз Азп СЬп 560 АЬа Азр ЬЬе АЬа Азп 565 Азп ЬЬе Ьуз Азп ЬЬе 570 Туг СЬи Ьеи АЬа СЬп 575 СЬп СЬп Азр СЬп НЬз 580 Зег Зег Азр ЬЬе Ьуз 5В5 ТЬг Ьеи АЬа Ьуз УаЬ 590 Зег АЬа АЬа Азп ТЬг 595 Азр Агд Не АЬа Ьуз 600 Азп Ьуз АЬа СЬи АЬа 605 Азр АЬа Зег РЬе СЬи 610 ТЬг Ьеи ТЬг Ьуз Азп 615 СЬп Азп ТЬг Ьеи ЬЬе 620 СЬи СЬп СЬу СЬи - 44 014352А1а 625 Ьеи Уа1 С1и С1п Азп Ьуз А1а 11е Азп (31п С1и ьеи С1и С1у РЬе 640 630 635 А1а А1а Нйв А1а Азр Уа1 С1п Авр Ьув С1п Не Ьеи <51п Авп <31п А1а 645 650 655 Азр Не ТЬг ТЬг АЗП ьуз ТЬг А1а Не С1и (31п Азп Не Азп Агд ТЬг 660 665 670 Уа1 А1а Азп С1у РЬе С1и Не С1и Ьуз Азп Ьуз А1а С1у Не А1а ТЬг 675 680 685 Азп ьуз (31п <31и Ьеи Не Ьеи βΐη АЗП Азр Агд Ьеи АЗП Агд Не Азп 690 695 700 С1и ТЬг Азп Азп Н1е С1п Авр <Э1п Ьув Не Авр С1п Ьеи О1у Туг А1а 705 710 715 720 Ьеи <210> 5 <211> 443 <212> Белок <213> фрагмент белка из Могахе11а саСаггЬаНз (0зрА1 50-491) или синтетический пептид <;400> 5Ьуз 1 Га! О1у Ьуз А1а ТЬг Азп Ьуз Не Бег С1у (31у Азр Азп Азп ТЬг 5 10 15 А1а Азп (31у ТЬг Туг Ьеи ТЬг 11е С1у <31у С1у Азр Туг Авп Ьуз ТЬг 20 25 30 Ьуз 01у Агд Туг Бег ТЬг Не <31у <31у <31у Ьеи РЬе Азп С1и А1а ТЬг 35 40 45 Азп О1и Туг Бег ТЬг· Не <31у Бег <Э1у (31у Туг Азп Ьуз А1а Ьуз С1у 50 55 60 Агд Туг Бег ТЬг Не <31у С1у С1у С1у Туг Азп б1и А1а ТЬг Авп Й1п 65 70 75 80 Туг Зег ТЬг Не О1у 31у <31у АЗр Азп Азп ТЬг А1а Ьуз (31у Агд Туг - 45 01435290 95Зег ТЬг Не С1у О1у <31у С1у Туг Азп С1и А1а ТЬг 11е С1и Азп Зег 100 105 110 ТЬг Уа1 <Э1у 115 61у С1у С1у Туг Азп 120 О1п А1а Ьуз <31у Агд 125 Азп Зег ТЬг Уа1 А1а 130 С1у С1у Туг Азп Азп 135 <31и А1а ТЬг С1у ТЬг 14 0 Азр Зег ТЬг Не А1а 145 С1у С1у Агд Ьуз Азп 150 <Э1п А1а ТЬг С1у Ьуз 155 С1у Зег РЬе А1а А1а 160 <31у 11е Азр Азп Ьуз 165 А1а АЗП А1а Азр Азп 17 0 А1а Уа1 А1а Ьеи С1у 175 Азп Ьуз Азп тЬг 11е 180 О1и 01у С1и Азп Зег 185 Уа1 А1а Не С1у Зег 190 Азп Азп ТЬг Уа1 Ьуз 195 Ьуз О1у С1п С1п Азп 200 Уа1 РЬе Не Ьеи С1у 205 Зег Азп ТЬг Азр ТЬг 210 ТЬг Азп А1а 01п Азп 215 С1у Зег Уа1 Ьеи Ьеи 220 О1у Ηί3 АЗП ТЬг А1а 225 С1у Ьуз А1а А1а ТЬг 230 Не Уа1 Азп Зег А1а 235 01и Уа1 (31у <31у Ьеи 240 Зег Ьеи ТЬг С1у РЬе 245 А1а 61у А1а Зег ьуз 250 тЬг <31у Азп С1у ТЬг 255 Уа1 Зег Уа1 С1у Ьуз 260 Ьуз О1у Ьуз (31и Агд 265 О1п 11е Уа1 ΗΪ5 Уа1 270 С1у А1а С1у С1и 11е 275 Зег Азр ТЬг Зег ТЬг 280 Азр А1а Уа1 Азп (31 у 285 Зег (31п Ьеи Н1В Уа1 290 Ьеи А1а ТЬг Уа1 Уа1 295 А1а С1п Азп Ьуз А1а 300 Азр Не Ьуз Азр Ьеи 305 Азр Азр С1и Уа1 С1у 310 Ьеи Ьеи <31у О1и (31и 315 Не Азп Зег Ьеи 01и 320 С1у С1и 11е РЬе Азп 325 Азп (31п Азр А1а Не 330 А1а Ьуз Азп Θΐη А1а 335 Азр 11е Ьуз ТЬг ьеи <31и Зег Азп Уа1 С1и С1и С1у Ьеи Ьеи Азр Ьеи Зег - 46 014352340 345 350 С1у Агд Ьеи Ьеи Азр 51п Ьуз А1а Азр Не Азр Азп Азп Не Азп Азп 355 360 365 Не Туг <31и Ьеи А1а 01п αΐη <31п Азр <31п Ηίε Зег Зег Азр Не Ьуз 370 375 330 ТЬг ьеи ьуз Азп Азп Уа1 □1и С1и С1у Ьеи ьеи Авр Ьеи Зег с1у Агд 385 390 395 400 Ьеи Не Азр Θΐη Ьуз А1а Азр Ьеи ТЬг Ьуз Азр Не Ьуз А1а Ьеи С1и 4 05 410 415 Зег Азп νβΐ О1и С1и 01у Ьеи Ьеи Азр Ьеи Зег 01у Агд Ьеи Не Азр 420 425 430 С1п Ьуз А1а Азр 11е А1а Ьуз Азп С1п А1а Азр 435 440 <210> 6 <211> 510 <212> Белок <213> фрагмент белка из МогахеИа саЬаггНаНз (ЦзрА2 30-539) или синтетический пептид <400> 6С1п А1а 1 Ьуз Азп Азр 5 Не ТЬг Ьеи 01и Азр 10 Ьеи Рго Туг Ьеи Не 15 Ьуз Ьуз Не Азр С1п Азп О1и Ьеи <31и А1а Азр Не 01у Азр Не ТЬг А1а 20 25 30 Ьеи С1и Ьуз Туг Ьеи А1а Ьеи Зег 31п Туг 01у Азп 11е Ьеи А1а Ьеи 35 40 45 С1и С1и Ьеи Азп Ьуз А1а Ьеи <31и С1и Ьеи Азр С1и Азр Уа1 <31у тгр 50 55 60 Азп С1п Азп Азр Не А1а Азп Ьеи <31и Азр Азр Уа1 С1и ТЬг Ьеи ТЬг 65 70 75 80 Ьуз Азп 01п Азп А1а РЬе А1а 01и 31п С1у О1и А1а Не Ьуз 01и Азр 05 90 95 - 47 014352Ьеи 61п б1у ьеи А1а Азр РЬе νπΐ 01и 105 61у 61п 61и 61у Ьуз 110 Не Ьеи 100 61п Азп 61и ТЬг Зег Не Ьуз ьуз АЗП ТЬг С1п Агд Азп Ьеи Уа1 Азп 115 120 125 С1у РЬе 61и Не 61и Ьуз Азп Ьуз Азр А1а Не А1а Ьуз Азп Азп С1и 130 135 140 Зег Не 61и Азр Ьеи Туг Азр РЬе С1у Н1з 61и Уа1 А1а 61и Зег Не 145 150 155 160 □1у 61и Не ΗΪΞ А1а ΗΪ3 Азп 61и А1а 61п Азп 61и ТЬг Ьеи Ьуз 61у 165 170 175 Ьеи Не ТЬг АЗП Зег Не 61и Азп ТЬг Азп Азп Не ТЬг Ьуз Азп Ьуз 180 185 190 А1а Азр Не 61п А1а Ьеи С1и Азп Азп Уа1 Уа1 С1и 61и Ьеи РЬе Азп 195 200 205 Ьеи Зег 61у Агд Ьеи Не Азр С1п Ьуз А1а Азр Не Азр Азп Азп 11е 210 215 220 Азп Азп Не Туг 61и Ьеи А1а 61п Θ1Π 61Π АЗр О1П Н13 Зег Зег Азр 225 230 235 240 Не ьуз ТЬг ьеи ьуз Ьуз Азп Уа1 61и 61и С1у Ьеи Ьеи 61и Ьеи Зег 245 250 255 Азр Н1з Не 11е Азр 61п Ьуз ТЬг Азр 11е А1а С1п Азп 61п А1а Азп 260 265 270 Не 61п Азр Ьеи А1а ТЬг Туг Азп С1и Ьеи 61п Азр 61п Туг А1а С1п 275 280 285 Ьуз С1п ТЬг 61и А1а 11е Азр А1а Ьеи Азп Ьуз А1а Зег Зег 01и Азп 290 295 300 ТЬг 61п Азп Не 61и Азр Ьеи А1а А1а Туг Азп 61и Ьеи 61п Азр А1а 305 310 315 320 Туг А1а Ьуз С1п С1п ТЬг 61и А1а 11е Азр А1а Ьеи Азп Ьуз А1а Зег 325 330 335 Зег 01и Азп ТЬг 61п Азп Не 61и Азр Ьеи А1а А1а Туг Азп 01и Ьеи 340 345 350- 48 014352СЬп Азр А1а Туг АЬа Ьуз СЬп СЬп 360 АЬа СЬи АЬа ЬЬе Азр АЬа 365 Ьеи Азп 355 Ьуз А1а Зег Зег СЬи Азп ТЬг СЬп Азп ЬЬе АЬа Ьуз Азп СЬп АЬа Азр 370 375 380 ЬЬе АЬа Азп Азп ЬЬе ТЬг Азп Не Туг СЬи Ьеи АЬа СЬп СЬп СЬп Авр 385 390 395 400 Ьуз Н1В Агд Зег Авр Ые Ьуз ТЬг Ьеи АЬа Ьуз ТЬг Зег АЬа АЬа Азп 405 4Ь0 415 ТЬг Азр Агд ЬЬе АЬа Ьуз Азп Ьуз АЬа Азр Азр Азр АЬа Зег РЬе СЬи 420 425 430 ТЬг ьеи ТЬг ьуз Азп СЬп АЗП ТЬг Ьеи ЬЬе СЬи Ьуз Авр Ьуз СЬи НЬз 435 440 445 Азр Ьуз Ьеи ЬЬе ТЬг АЬа Азп Ьуз ТЬг АЬа ЬЬе Азр АЬа Авп Ьуз АЬа 450 455 460 Зег АЬа Азр ТЬг Ьуз РЬе АЬа АЬа ТЬг АЬа Азр АЬа РЬе ТЬг Ьуз Авп 465 470 475 480 <31у Азп АЬа ьЬе ТЬг Ьуз Азп АЬа Ьуз Зег ЬЬе ТЬг Азр ьеи СЬу ТЬг 485 490 495 Ьуз УаЬ Азр СЬу РЬе Азр Зег Агд УаЬ ТЬг АЬа Ьеи Авр ТЬг 500 505 ЭТО <210>7 <211>322 <212> Белок <2ЬЗ> фрагмент белка из МогахеЬЬа саГаггкаИз (СзрА2 30-351) или синтетический пептид.<400> 7СЬп АЬа Ьуз Азп Азр ЬЬе ТЬг Ьеи СЬи Азр Ьеи 10 Рго Туг Ьеи ьЬе 15 Ьуз 1 5 Ьуз ЬЬе Азр С1П Авп СЬи Ьеи СЬи АЬа Азр Ые СЬу Азр 1Ье ТЬг АЬа 20 25 30 Ьеи СЬи ьуз Туг Ьеи АЬа Ьеи Зег С1п Туг СЬу Азп ЬЬе Ьеи АЬа Ьеи 35 40 45 - 49 014352С1и О1и Ьеи 50 Азп Ьуз А1а Ьеи С1и 55 С1и Ьеи Азр 31и 60 Азр Уа1 О1у Тгр Азп 65 01п Азп Азр Не А1а 70 АЗП Ьеи <31и Азр Авр 75 Уа1 О1и ТЬг Ьеи ТЬг 80 Ьуз Азп С1п Азп А1а 85 РЬе А1а <31и 01п О1у 90 С1и А1а Не Ьуз 01и 95 Азр Ьеи О1п С1у Ьеи 100 А1а АЗр РЬе Уа1 О1и 105 01у О1п 01и С1у Ьуз 110 Не Ьеи <31п Азп С1и 115 ТЬг Зег Не Ьуз Ьуз 120 Азп ТЬг 01п Агд Авп 125 Ьеи Уа1 Азп С1у РЬе 13 0 (Э1и Не 01и Ьуз Азп 135 Ьуз Азр А1а Не А1а 140 ьуз Азп Азп 01и Зег 145 Не 01и Азр Ьеи Туг 150 Азр РЬе С1у Нбз С1и 155 Уа1 А1а О1и Бег 11е 160 01у О1и Не Н1з А1а 165 ΗΪ3 АЗП 01и А1а С1п 170 Азп 01и ТЬг Ьеи ьуз 175 01у Ьеи Не ТЬг Азп 180 Бег 11е С1и Азп ТЬг 185 Азп Азп Не ТЬг Ьуз 190 Авп Ьуз А1а Азр Не 195 С1п А1а Ьеи 31и Азп 200 АЗП Уа1 Уа1 О1и 01и 205 Ьеи РЬе Азп Ьеи Зег 210 <31у Агд ьеи 11е Азр 215 (31П Ьуз А1а Азр Не 220 Авр Азп Азп Не Азп 225 Азп Не Туг С1и Ьеи 230 А1а С1п 01п С1П Азр 235 <Э1п Н1в Зег Бег Азр 240 11е ьуз ТЬг ьеи Ьуз 245 Ьуз Азп Уа1 01и С1и 250 С1у Ьеи Ьеи 01и Ьеи 255 Бег Азр ΗΪΒ Не Не 260 Азр О1п Ьуз ТЬг Азр 265 Не А1а Θΐη Азп С1п 270 А1а АЗП Не О1п Азр 275 Ьеи А1а ТЬг Туг Азп 280 <31и Ьеи 01п Азр С1п 285 Туг А1а 01п Ьуз <31п 290 ТЬг 01и А1а 11е Авр 295 А1а Ьеи Азп Ьуз А1а 300 Бег Бег С1и Авп - 50 014352ТЬг σΐη Азп Не С1и Азр Ьеи А1а А1а Туг Азп С1и Ьеи (31п Азр А1а305 310 315 320Туг А1а <210> 8 <211> 148 <212> Белок <213> фрагмент белка из Могахе11а саОаггЬаНз (ИзрА2 30-177) или синтетический пептид <400> 8<31п А1а 1 Ьуз Азп Азр 5 11е ТЬг Ьеи <31 и Азр 10 Ьеи Рго Туг Ьеи Не 15 Ьуз ьуз Не Азр С1п 20 АЗП (31и ьеи 61и А1а 25 Азр Не С1у Азр Не 30 ТЬг А1а ьеи 01и Ьуз 35 туг Ьеи А1а Ьеи Зег 40 (31п туг С1у Азп Не 45 Ьеи А1а Ьеи С1и <31и 50 Ьеи Азп ьуз А1а Ьеи 55 С1и С1и Ьеи Азр <31и 60 Азр Уа1 <31у Тгр Азп 65 Θ1Π Азп Азр 11е А1а 70 Азп Ьеи 01и Азр Азр 75 Уа1 31и ТЬг Ьеи ТЬг 80 Ьуз Азп <31п Азп А1а 85 РЬе А1а С1и <31п С1у 90 (31и А1а 11е Ьуз <31и 95 Азр Ьеи (31п 61у Ьеи 100 А1а Азр РЬе Уа1 <31и 105 С1у С1П <31и С1у Ьуз 110 Не Ьеи 01п Азп 01и 115 ТЬг Зег Не Ьуз Ьуз 120 Азп ТЬг О1п Агд Азп 125 Ьеи Уа1 Азп С1у РЬе 13 0 01и 11е О1и Ьуз Азп 135 Ьуз Азр А1а 11е А1а 140 ьуз Азп Азп 61и Зег Не О1и Азр145 <210> 9- 51 014352 <211> 340 <212> Белок <213> фрагмент белка из МогахеИа сайаггЬаНз (изрА2 200-539) или синтетический пептид <400> 9АЗП 1 61и ТЬг Ьеи Ьуз 5 Сйу Ьеи Не ТЬг Азп Зег 10 Не Сйи Азп ТЬг 15 Азп Азп Не ТЬг Ьуз 20 АЗП Ьуз Айа Азр Не 25 ейп Айа Ьеи Сйи АЗП 30 Азп Уай Уай Сйи Сйи 35 Ьеи РЬе Азп Ьеи Зег 40 Сйу Агд Ьеи Не Азр 45 С1П Ьуз Айа Азр Не 50 Азр Азп Азп Не Азп 55 Азп Не Туг Сйи Ьеи 60 Айа Сйп Сйп Сйп Азр 65 Сйп ΗΪ3 Зег Зег Азр 70 Не Ьуз ТЬг Ьеи ьуз 75 Ьуз Азп Уай Сйи Сйи 80 С1у Ьеи Ьеи Сйи Ьеи 85 Зег Азр Н1з 11е Не 90 Азр Сйп Ьуз ТЬг Азр 95 Не А1а Сйп Азп Сйп 100 Айа Азп 1йе Сйп Азр 105 Ьеи Айа ТЬг Туг Азп но Сйи Ьеи С1т1 Азр С1п 115 Туг Айа Сйп Ьуз Сйп 120 ТЬг Сйи Айа Не АЗр 125 Айа ьеи Азп Ьуз Айа 130 Зег Зег Сйи Азп ТЬг 135 Сйп Азп Не Сйи Азр 140 Ьеи Айа Айа Туг АЗП 145 Сйи Ьеи Сйп Азр Айа 150 Туг Айа Ьуз Сйп Сйп 155 ТЬг Сйи Айа 1йе Азр 160 А1а Ьеи Азп Ьуз Айа 165 Зег Зег С1и Азп ТЬг 170 Сйп Азп Не Сйи Азр 175 ьеи А1а А1а Туг Азп 180 61и Ьеи Сйп Азр А1а 185 Туг Айа Ьуз Сйп Сйп 190 Айа Сйи Айа Не Азр 195 А1а Ьеи Азп Ьуз Айа 200 Зег Зег Сйи Азп ТЬг 205 Сйп Азп Не А1а Ьуз АЗП С1п А1а Азр Не Айа Азп Азп Не ТЬг Азп Не Туг Сйи - 52 014352210 215 Ьеи 225 А1а <31п С1п С1п Авр 230 Ьув Ηίθ Ьув ТЬг Зег А1а А1а 245 Авп ТЬг Азр Аар Авр А1а Зег 260 РЬе С1и ТЬг Ьеи Й1и Ьуз Авр 275 Ьуз <31и Н1з Авр Ьув 280 Не Авр 290 А1а Авп Ьуз А1а Зег 295 А1а Авр 305 А1а РЬе ТЬг Ьув Авп 310 О1у Авп 11е ТЬг Авр Ьеи О1у 325 ТЬг Ьуз Уа1 А1а Ьеи Авр ТЬг 340 220 Агд Зег Азр 235 Не Ьуз ТЬг Ьеи А1а 240 Агд Не 250 А1а Ьув Азп Ьуз А1а 255 Авр ТЬг 265 Ьуз Авп <31п Азп ТЬг 270 Ьеи Не Ьеи Не ТЬг А1а Авп 285 Ьув ТЬг А1а Авр ТЬг Ьув РЬе 300 А1а А1а ТЬг А1а А1а 11е ТЬг 315 Ьуз Азп А1а Ьув Зег 320 Азр (31у 330 РЬе Азр Зег Агд Уа1 335 ТЫ <210> 10 <211> 157 <212 > Белок <213> фрагмент белка из Могахе11а са-иаггЬаНз (изрА2 302-4 58) или синтетический пептид <400> 10Не 1 <з1п Азр Ьеи А1а 5 ТЬг Туг Авп С1и Ьеи 10 (31 п Авр С1п Туг А1а 15 Θΐη. Ьуз (31п ТЬг <31и 20 А1а Не Авр А 1а ьеи 25 Авп Ьув А1а зег Бег 30 <31и Авп. ТЬг <з1п АВП 35 Не 01и Азр Ьеи А1а 40 А1а Туг Авп 01и ьеи 45 01п Авр А1а Туг А1а 50 Ьув (31п (31п ТЬг <31и 55 А1а 11е Авр А1а Ьеи 60 Азп Ьув А1а Зег - 53 014352Зег 65 <Э1и АЗП ТЫ С1п Азп Не <31 и Азр Ьеи А1а А1а Туг Азп (31и Ьеи 70 75 80 01п Авр А1а Туг А1а Ьуз С1п 31п А1а (31и А1а Не Авр А1а Ьеи Азп 85 90 95 Ьуз А1а Зег Зег 01и Авп ТЬг θΐη Авп Не А1а Ьуз АВП βΐη А1а Азр 100 105 110 Не А1а Авп Азп Не ТЬг Азп Не Туг С1и Ьеи А1а С1п 61П Б1п Авр 115 120 125 Ьуз ΗΪ5 Агд Зег Авр Не Ьуз ТЬг Ьеи А1а Ьуз ТЬг Зег А1а А1а АЗП 130 135 14 0 ТЬг Айр Агд Не А1а Ьуз Азп Ьуз А1а Азр Азр Авр А1а 145 150 155
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70674505P | 2005-08-10 | 2005-08-10 | |
| US70714805P | 2005-08-11 | 2005-08-11 | |
| PCT/SE2006/000931 WO2007018463A2 (en) | 2005-08-10 | 2006-08-08 | Interaction of moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the complement system |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200800565A1 EA200800565A1 (ru) | 2008-10-30 |
| EA014352B1 true EA014352B1 (ru) | 2010-10-29 |
Family
ID=37727738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200800565A EA014352B1 (ru) | 2005-08-10 | 2006-08-08 | Взаимодействие moraxella catarrhalis с эпителиальными клетками, внеклеточными матриксными белками и системой комплемента |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US8092811B2 (ru) |
| EP (4) | EP2548885B1 (ru) |
| JP (2) | JP5269594B2 (ru) |
| KR (1) | KR20080042865A (ru) |
| AU (1) | AU2006277076B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0614734A2 (ru) |
| CA (1) | CA2618554C (ru) |
| EA (1) | EA014352B1 (ru) |
| ES (1) | ES2537274T3 (ru) |
| IL (2) | IL189258A0 (ru) |
| MA (1) | MA29765B1 (ru) |
| MX (1) | MX2008002037A (ru) |
| NO (1) | NO20080259L (ru) |
| NZ (1) | NZ565651A (ru) |
| WO (1) | WO2007018463A2 (ru) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA014352B1 (ru) * | 2005-08-10 | 2010-10-29 | Арне Форсгрен Аб | Взаимодействие moraxella catarrhalis с эпителиальными клетками, внеклеточными матриксными белками и системой комплемента |
| TW201302779A (zh) | 2011-04-13 | 2013-01-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 融合蛋白質及組合疫苗 |
| EA201391669A1 (ru) * | 2011-05-11 | 2014-04-30 | Риесбекк Хелткеэр Свиден Аб | Белок f - новый адгезин haemophilus influenzae, способный связывать ламинин и витронектин |
| TW201620927A (zh) * | 2014-02-24 | 2016-06-16 | 葛蘭素史密斯克藍生物品公司 | Ｕｓｐａ２蛋白質構築體及其用途 |
| WO2018178265A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Immunogenic composition, use and method of treatment |
| JP2020515587A (ja) | 2017-03-31 | 2020-05-28 | グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 免疫原性組成物、使用及び処置方法 |
| WO2019034575A1 (en) | 2017-08-14 | 2019-02-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | METHODS OF AMPLIFYING IMMUNE RESPONSES |
| US20210283238A1 (en) | 2018-08-07 | 2021-09-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel processes and vaccines |
| EP4010014A1 (en) | 2019-08-05 | 2022-06-15 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| CA3148928A1 (en) | 2019-08-05 | 2021-02-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide |
| WO2021048159A1 (en) | 2019-09-11 | 2021-03-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Assay |
| EP4294433A1 (en) | 2021-02-22 | 2023-12-27 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Immunogenic composition, use and methods |
| CN114409756B (zh) * | 2022-01-21 | 2023-06-09 | 中国科学院海洋研究所 | 一种牙鲆补体成分C3（PoC3）的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998028333A2 (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-02 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | USPA1 AND USPA2 ANTIGENS OF $i(MORAXELLA CATARRHALIS) |
| RU2004105656A (ru) * | 2001-07-26 | 2005-04-10 | Чирон Срл. (It) | Вакцины, содержащие алюминиевые адъюванты и гистидин |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE454403B (sv) * | 1984-05-30 | 1988-05-02 | Alfa Laval Agri Int | Anvendning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framstellning av sarbehandlingsmedel |
| US5843463A (en) | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
| US6440425B1 (en) | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| GB0003502D0 (en) | 2000-02-15 | 2000-04-05 | Smithkline Beecham Sa | Vaccine |
| DK2088197T3 (en) | 2000-10-02 | 2016-08-01 | Id Biomedical Corp Quebec | Haemophilus influenzae antigens and corresponding DNA fragments |
| SE0102410D0 (sv) | 2001-07-04 | 2001-07-04 | Arne Forsgren | Novel surface exposed immunoglobulin D-binding protein from moraxella catarrhalis |
| GB0222764D0 (en) | 2002-10-02 | 2002-11-06 | Univ Bristol | Therapeutic peptide |
| GB0410866D0 (en) | 2004-05-14 | 2004-06-16 | Chiron Srl | Haemophilius influenzae |
| EA014352B1 (ru) | 2005-08-10 | 2010-10-29 | Арне Форсгрен Аб | Взаимодействие moraxella catarrhalis с эпителиальными клетками, внеклеточными матриксными белками и системой комплемента |
| CN104436180B (zh) | 2006-01-17 | 2021-08-31 | 阿恩·福斯格伦 | 新的表面外露流感嗜血菌蛋白质(蛋白质E；pE) |
-
2006
- 2006-08-08 EA EA200800565A patent/EA014352B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-08-08 WO PCT/SE2006/000931 patent/WO2007018463A2/en active Application Filing
- 2006-08-08 MX MX2008002037A patent/MX2008002037A/es active IP Right Grant
- 2006-08-08 BR BRPI0614734-8A patent/BRPI0614734A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-08-08 JP JP2008525959A patent/JP5269594B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-08-08 EP EP12189024.8A patent/EP2548885B1/en not_active Not-in-force
- 2006-08-08 NZ NZ565651A patent/NZ565651A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-08-08 EP EP17196588.2A patent/EP3305807B1/en active Active
- 2006-08-08 AU AU2006277076A patent/AU2006277076B2/en not_active Ceased
- 2006-08-08 KR KR1020087005428A patent/KR20080042865A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-08-08 US US12/063,408 patent/US8092811B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-08-08 ES ES06769599.9T patent/ES2537274T3/es active Active
- 2006-08-08 EP EP12189014.9A patent/EP2548884B1/en active Active
- 2006-08-08 EP EP06769599.9A patent/EP1913019B1/en not_active Not-in-force
- 2006-08-08 CA CA2618554A patent/CA2618554C/en active Active
-
2008
- 2008-01-14 NO NO20080259A patent/NO20080259L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-02-04 IL IL189258A patent/IL189258A0/en unknown
- 2008-03-07 MA MA30723A patent/MA29765B1/fr unknown
-
2011
- 2011-11-30 IL IL216703A patent/IL216703A0/en unknown
- 2011-12-08 US US13/314,727 patent/US8323667B2/en active Active
-
2012
- 2012-11-01 US US13/666,941 patent/US8895030B2/en active Active
-
2013
- 2013-02-27 JP JP2013036921A patent/JP5763113B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-10-07 US US14/508,033 patent/US9255127B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-12-31 US US14/986,104 patent/US9657067B2/en active Active
-
2017
- 2017-04-13 US US15/486,513 patent/US10183071B2/en active Active
-
2018
- 2018-12-18 US US16/223,454 patent/US10786562B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998028333A2 (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-02 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | USPA1 AND USPA2 ANTIGENS OF $i(MORAXELLA CATARRHALIS) |
| US20050137131A1 (en) * | 1996-12-20 | 2005-06-23 | The Board Of Regents, University Of Texas System | UspA1 and UspA2 antigens of Moraxella catarrhalis |
| RU2004105656A (ru) * | 2001-07-26 | 2005-04-10 | Чирон Срл. (It) | Вакцины, содержащие алюминиевые адъюванты и гистидин |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Arne Forsgren et al.: Immunization with the truncated adhesin moraxella catarrhalis immunoglobulin D-binding protein (MID764-913) is protective against M. catarrhalis in a mouse model of pulmonary clearance. J. Infect Dis. 2004, v. 190, n. 2, 352-5, PMID: 15216472, referat * |
| Arne Forsgren et al.: The Immunoglobulin D-Binding Protein MID from Moraxella catarrhalis is Also an Adhesin. Infect Immun. 2003, v. 71, n. 6, 3302-3309, PMCID: PMC 155714, referat * |
| Leslie D. Cope et al.: Characterization of the Moraxella catarrhalis uspA1 and uspA2 and their encoded products. Genes and Their Encoded Products. J. Bacteriol., 1999, v. 181, n. 13: 4026-4034, PMCID: PMC93893, referat, posledovatel'nost' Ôäû Q9XD55 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA014352B1 (ru) | Взаимодействие moraxella catarrhalis с эпителиальными клетками, внеклеточными матриксными белками и системой комплемента | |
| KR20100028558A (ko) | 녹농균 외막 단백질 ｐａ4710 | |
| CA2098296C (en) | Pseudomonas peptide composition and method for producing the same | |
| EP3892298A1 (en) | Epitopes having sequence homology to coronavirus spike protein subunit and uses thereof | |
| KR20220143577A (ko) | 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방용 중화능 개량 백신 조성물 | |
| CN101243104B (zh) | 卡他莫拉氏菌与上皮细胞、细胞外基质蛋白及补体系统的相互作用 | |
| ES2383958T3 (es) | Péptidos terapéuticos derivados de UspA1 | |
| CN108976289A (zh) | 用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段 | |
| JP2023032631A (ja) | 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単ドメイン抗体 | |
| Sakata et al. | A wild-type Japanese measles virus strain inducing predominant early down-regulation of CD46 | |
| WO2004100974A1 (fr) | Utilisation de la molecule hab18g/cd147 comme cible pour l'elaboration d'antagoniste antiviral, et antagoniste antiviral correspondant | |
| AU2012203816A1 (en) | Interaction of moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the compliment system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY KZ RU |