ES2293892T3 - Polipeptido antimicrobiano/neutralizante de endotoxina. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado de fórmula: B1-R2-B2-R2 en la que: (i) B1 y B2 representan racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 amino ácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos, (ii) R1 está comprendido entre 17 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0, 609 y un valor del índice alifático de al menos 35, 45, (iii) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA, (iv) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple y (v) el polipéptido tiene una actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina.

Description

Polipéptido antimicrobiano/neutralizante de endotoxina.

Antecedentes de la invención

Aunque los seres humanos están en continuo riesgo de infección por patógenos microbianos, la mayoría de ellos sobreviven a estos violentos ataques repetidos creando respuestas rápidas que emplean una serie de proteínas antimicrobianas y pequeños polipéptidos. Esta rama del sistema inmune innato del ser humano representa un mecanismo de defensa del huésped más fundamental que los sistemas clonales de actuación más lenta, ya que los polipéptidos antimicrobianos son también utilizados por animales primitivos, insectos o incluso las plantas (H.G. Boman, J. Marsh and J.A. Goode, Eds., Antimicrobial Peptides, (John Wiley & Sons, Ltd., Nueva York, NY, 1994); Hoffmann y cols., Curr. Opin. Immunol. 8: 8-13 (1996)).

Además de la inhibición del crecimiento de patógenos microbianos, el sistema inmune también neutraliza diversas toxinas producidas por microbios invasores. Un producto particularmente tóxico producido por bacterias Gram-negativas es la endotoxina. La endotoxina (lipopolisacárido; LPS) es un componente constitutivo de la membrana exterior de bacteria gram-negativa y se libera cuando la bacteria muere o se multiplica (Rietschel y cols., Inmunobiology, 187: 169-190 (1993)). Se estima que, anualmente, aproximadamente 400.000 pacientes en los Estados Unidos presentan sepsis bacteriana, de los cuales 100.000 mueren finalmente de shock séptico y aproximadamente la mitad de estos casos están provocados por bacteria Gram-negativa (Parrillo, J.E. Shock syndromes related to sepsis. En Cecil Textbook of Medicine (20ª edición). J. C. Bennett and F. Plum Editors, W.B. Saunders Company, Filadelfia. 496-501 (1996). La sepsis gram-negativa y el shock séptico son principalmente el resultado de la producción excesiva y liberación de citoquinas inflamatorias a través de células del sistema inmune, en particular, macrófagos, inducida por endotoxina (Beutler, B. and A. Cerami, Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988); Rosenstreich, D.L. y S. Vogel, Central role of macrophages in the host response to endotoxin, p. 11-15. En D. Schlessinger (ed.), Microbiology. American Society for Microbiology. Washington, D.C. (1980)). TNF-\alpha es el mediador principal de la toxicidad sistémica de endotoxina (Beutler, B. y A. Cerami, Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988); Heumann y cols., J. Endotoxin Res. 3: 87-92 (1996).

Lípido A es la porción tóxica de endotoxina (Rietschel y cols. Immunobiology. 187: 169-190 (1993)). Se han sometido a prueba anticuerpos anti-lípido A monoclonales para el tratamiento de sepsis gram-negativas y shock séptico, pero no se ha demostrado su eficacia clínica de una forma sólida (Verhoef y cols., J. Antimicrob. Chemother. 38: 167-182 (1996)), probablemente debido a su escasa capacidad para unirse y neutralizar endotoxina (Warren y cols., J. Exp. Med. 177: 89-97 (1993)). Entre los desarrollos más recientes se incluyen la identificación de polipéptidos anti-endotoxina sintéticos que imitan polimixina B (Rustici y cols., Science 259: 361-365 (1993)) y una serie de polipéptidos anti-endotoxina catiónicos derivados de proteínas de defensa del huésped. Entre ellas se incluyen un fragmento de 23 kDa recombinante derivado de proteína bactericida/aumento de la permeabilidad (Fischer y cols., Crit. Care Med. 22: 553-558 (1994); Marra y cols. Crit. Care Med. 22: 559-565 (1994)), un péptido de 28 meros derivado de melitina de abeja (Gough y cols., Infect. Immun. 64: 4922-4927 (1996)), un péptido de 33 meros derivado de una proteína antibacteriana catiónica 18 kDa (Larrick y cols., Infect. Immun. 63: 1291-1297 (1995)), y polipéptidos sintéticos basados en una estructura cristalina de factor anti-LPS de Limulus (Reid y cols., J. Biol. Chem. 271: 28120-28127 (1996)).

Lactoferrina (LF) es una glucoproteína de unión a hierro de 80 kDa que se sintetiza exclusivamente a través de los neutrófilos y el epitelio mucosal y se libera extracelularmente tras su activación a través de estímulos inflamatorios (Sánchez y cols. Arch. Dis. Child. 67: 657-61 (1992); P.F. Levay and M. Viljoen, Haematologica 80: 252-67 (1995); B. Lonnerdal y S. Iyer, Annu. Rev. Nutr. 15: 93-110 (1995); R.T. Ellison, Adv. Exp. Med. Biol. 357: 71-90 (1994)). Se cree que se trata de una proteína de defensa del huésped mamífero cuyo mecanismo de protección apenas se comprende. LF in vivo proporciona un efecto profiláctico antibacteriano (Trumpler y cols., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8: 310-3 (1989)). Se ha descrito que el tratamiento con LF in vivo reduce la incidencia de bacteremia gram-negativa (Trumpler y cols., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8: 310-313 (1989)). Se ha demostrado in vitro que inhibe el crecimiento de diversos microbios a través de la quelación de hierro (J.D. Oram. and B. Reiter, Biochim. Biophys Acta 170: 351-65 (1968); A. Bezkorovainy, Adv. Exp. Med. Biol. 135: 139-54 (1981).

LF contiene una región fuertemente básica cercana a su término N y se une a diversas moléculas biológicas aniónicas incluyendo lípido A (Appelmelk y cols., Infect. Immun. 62: 2628-2632 (1994)) y glucosaminoglucanos que se dan en la superficie de la mayoría de las células y en la mayoría de las matrices extracelulares (Mann. y cols. J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)). Se liberan lactoferricina H (radicales 1-47) y lactoferricina B (radicales (17-41) a través de la pepsinolisis de LF humana y bovina, respectivamente y pueden tener una actividad antibacteriana más potente que las proteínas nativas (Bellamy y cols. Biochim. Biophys. Acta. 1121: 130-136 (1992)). Se señala que existe una región compuesta de los radicales 28-34 que contribuye a la alta afinidad de unión de LF humana y lactoferricina H a endotoxina (Elass-Rochard y cols. Biochem. J. 312: 839-845 (1995)). Se ha demostrado que LF y lactoferricina B inhiben la respuesta a interleucina-6 inducida por endotoxina en células monocíticas humanas (Mattsby-Baltzer y cols. Pediatr. Res. 40: 257-262 (1996)). Se han aislado fragmentos de LF identificados previamente que presentan actividad antimicrobiana a desde hidrolisatos de pepsina de LF (Tomita y cols., (1993) patente EE.UU. 5.214.028; Tomita y cols. (1994) patente EE.UU. Nº 5.304.633; Tomita y cols. (1994) patente EE.UU. Nº 5.317.084; Tomita y cols. (1997), patente EE.UU. Nº 5.656.591).

Los estudios anteriores han establecido que los 33 radicales N-terminales de LF humana representan la secuencia mínima que media la unión de la proteína a polisacáridos aniónicos como glucosaminoglucanos (Mann y cols. J. Biol. Chem. 269:23661-7 (1994))). Esta secuencia contiene una cabeza catiónica (radicales 1-6) y cola (radicales 28-33) que se combinan para formar el sitio de unión a glucosaminoglucano. No obstante, estos estudios no proporcionan pruebas que indiquen que este polipéptido tuviera actividad antimicrobiana o neutralizante de endotoxina.

Compendio de la invención

Se describe aquí un polipéptido de defensa de huésped de 6 kDa que se genera mediante la digestión proteolítica de la molécula de lactoferrina. El polipéptido de defensa de huésped de 6 kDa tiene actividad antimicrobiana y también actividad neutralizante de endotoxina. Se describen asimismo variantes funcionales del polipéptido de defensa de huésped de 6 kDa, que incluyen truncaciones N-terminales y C-terminales del polipéptido 6 kDa, y otras modificaciones del polipéptido, como por ejemplo sustituciones de amino ácido que preservan y potencian la actividad del polipéptido.

Por consiguiente la invención proporciona un polipéptido aislado de fórmula: B_{1}-R2-B_{2}-R2 en el que (i) B_{1} y B_{2} representan racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 amino ácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos, (ii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45, (iii) R2 comprende PVSCIKRDS
PIQCIQAIA, (iv) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple y (v) el polipéptido tiene una actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina. En otro modo de realización, la invención proporciona un polipéptido aislado de fórmula: B_{1}-R2-B_{2}-R2 en el que (i) B_{1} y B_{2} representan racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 aminoácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos (ii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45, (iii) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA o la truncación C-terminal del mismo y (iv) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple, comprendiendo dicho polipéptido aislado (a) SEQ ID NO:2 o (b) un fragmento de SEQ ID NO: 2 que carece de hasta 17 y aminoácidos del C-terminal y/o que carece de 3 aminoácidos del N-terminal; y teniendo dicho polipéptido actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina.

En otro modo más de realización, la invención proporciona un polipéptido aislado de fórmula B_{1}-R2-B_{2}-R2 en el que (i) B_{1} tiene la secuencia de aminoácido GRRRRS, (ii) B_{2} representa racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 aminoácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos (iii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45, (iv) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA o una truncación C-terminal del mismo y (v) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple, (vi) el polipéptido tiene actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina. La invención proporciona también un polipéptido aislado de fórmula B_{1}-R2-B_{2}-R2 en el que (i) B_{1} representa un racimo de aminoácidos que contienen de 2 a 7 amonoácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básico; (ii) B_{2} tiene una secuencia de aminoácidos MRKVRG, (iii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45, (iv) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA o una truncación C-terminal del mismo y (v) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple, y (vi) dicho polipéptido tiene actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido según la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad que es el resultado de una infección microbiana de un individuo que comprende la administración de una cantidad terapéutica de un polipéptido antimicrobiano o una variante funcional del mismo al individuo. Este medicamento es útil en el tratamiento de infecciones bacterianas. Este medicamento se utiliza también para tratar enfermedades que son el resultado de infecciones causadas por una micobacteria, como por ejemplo tuberculosis o lepra. Este medicamento también es útil para el tratamiento de infecciones bacterianas que causan sepsis bacteriana en el individuo infectado. Dicho medicamento se puede utilizar también para tratar infecciones causadas por otros microbios, como por ejemplo infecciones fúngicas. La presente invención se puede utilizar también para potenciar la acción terapéutica de un fármaco antimicrobiano en un paciente, a través de la administración del polipéptido de la presente invención con el fármaco antimicrobiano.

En otro de sus aspectos, la presente invención se refiere al uso del polipéptido neutralizante de endotoxina o a una variante funcional del mismo según la presente invención en la fabricación de un medicamento para neutralizar endotoxina en circulación en un paciente. Otros métodos similares de uso de la presente invención incluyen la neutralización de endotoxina en un producto por contacto de la endotoxina con el polipéptido neutralizante de endotoxina o una variante funcional del mismo según la invención.

También se describen aquí métodos para potenciar la actividad antimicrobinana y neutralizante de endotoxina del polipéptido de la presente invención. Esto se puede llevar a cabo por ejemplo ajustando la concentración iónica del entorno inmediato. Por otra parte, se describen también métodos para aumentar la producción in vivo del fragmento de LF de 6 kDa en un paciente a través de proteasas in vivo. Dichos métodos implican la sensibilización de LF a proteolisis, así como aumentar la actividad de proteasas que generan el fragmento kDa a partir de LF.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación en diagrama de la inhibición del crecimiento de E. Coli variando las dosis de polipéptido de 6 kDa purificado con heparina generado desde el término N de LF humano mediante catepsina D (cuadrados) o pepsina (círculos). Todos los puntos representan la media de triplicados y las barras de desviación típica son más reducidas que los símbolos.

La figura 2 es una curva de crecimiento de E. coli 0111 en presencia de 50 \muM de LF o los fragmentos de polipéptido de LF de 72-meros, 26 mero, 33-mero N-terminales, a lo largo de un período de tiempo de 7 horas.

La figura 3 es una representación en diagrama del crecimiento de E. coli 0111 a las 5 horas en presencia de diferentes concentraciones de polipéptidos de 33-mero o 27- mero que se corresponden con secuencias de aminoácido del término-N de LF.

La figura 4 es una representación en diagrama del efecto de la concentración iónica en la actividad antimicrobiana del fragmento de polipéptido de LF catéptico de 6 kDa.

La figura 5 es una representación en diagrama de la capacidad de los polipéptidos, fragmento de LF de 6 kDa, 33-mero y 27-mero, para potenciar la actividad antimicrobiana de rifampicina.

La figura 6 es una representación en diagrama de la capacidad de las concentraciones indicadas del polipéptido de defensa de huésped de 6 kDa, 33-mero, 27-mero, LF y polimixina B para neutralizar la actividad de entodoxina de lípido A aislado.

La figura 7 es una representación en diagrama de la supresión dependiente de dosis mediante LF-33 (el 33-mero) de la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina a través de la línea celular de leucocitos mononucleares RAW 264 7. Se incubó la endotoxina a 10 ng/ml a 37ºC durante 1 hora con LF-33 a las concentraciones indicadas antes de la exposición a células RAW 264.7. Los datos son las medias de triplicados en experimentos representativos.

La figura 8 es una representación en diagrama de la supresión dependiente de dosis mediante LF-33 de la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina con células RAW 264.7 en presencia de suero humano. Se incubó LPS de E. coli a 10 ng/ml a 37ºC durante 1 hora con suero humano y LF-33 a las concentraciones indicadas antes de su exposición a células RAW 264.7. Los datos son las medias de triplicados en experimentos representativos.

La figura 9 es una representación en diagrama del potencial de protección in vivo del fragmento de LF 6 kDa en la defensa de huésped contra infección bacteriana.

La figura 10 es una representación en diagrama de los efectos antimicrobianos de varias concentraciones de LF-33 (33-mero) del crecimiento de Mycobacteria, M. smegmatis BH1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo de que un polipéptido de defensa de huésped generado a partir de lactoferrina (LF) demuestra una actividad antimicrobiana y neutralizante de endotoxina significativamente más fuerte que los fragmentos de LF caracterizados anteriormente. El polipéptido de defensa de huésped generado a partir de LF también difiere de la LF de origen en el mecanismo según el cual inhibe el crecimiento microbiano. Si bien se cree que LF actúa uniendo iones de hierro y privando temporalmente a los microbios de este hierro necesario, el polipéptido de 6 kDa generado a partir de LF actúa a través de un mecanismo independiente del hierro, uniéndose a la superficie exterior del microbio y dañando la membrana celular causando la filtración de la célula. La actividad antimicrobiana que presenta el polipéptido de 6 kDa es más estable (no transitoria) que la que presenta el LF de longitud completa. El polipéptido de defensa de huésped se general in vitro y posiblemente in vivo, a partir de la digestión de LF mediante catepsina D. El producto, un fragmento de polipéptido de 6 kDa aproximadamente, consiste en 49 aminoácidos N-terminales de LF estando los aminoácidos unidos para formar un esqueleto de amida continuo simple. De particular interés, los polipéptidos de la presente invención presentan una actividad significativamente más alta en condiciones de pH y concentración iónica fisiológicas con respecto a los fragmentos de LF identificados previamente generados a partir de la digestión de pepsina (Bellamy y cols., Biochimica et Biophysica Acta 1121: 130-136 (1992); Tomita y cols., (1993) patente EE.UU. Nº 5.214.028; Tomita y cols., (1994) patente EE.UU. Nº 5.304.633; Tomita y cols., (1994) patente EE.UU. Nº 5.317.084; Tomita y cols., (1997) patente EE.UU. Nº 5.656.591). Uno de dichos fragmentos generados de pepsina (Bellamy y cols., Biochimica et Biophysica Acta 1121: 130-136 (1992)) es similar al fragmento de polipéptido de 6 kDa de la presente invención en el sentido de que consiste en aminoácidos 1-47 de LF. Sin embargo, el polipéptido de la técnica anterior no tiene unión amida entre el aminoácido 11 y 12. En su lugar, los fragmentos de polipéptido a cada lado de la interrupción se mantienen juntos a través de un puente disulfuro. Los experimentos en detalle que se exponen en la sección de los ejemplos más adelante indican que el esqueleto de unión de amida continuo simple de los aminoácidos del polipéptido de la presente invención confiere una actividad superior al polipéptido y las variantes funcionales del mismo.

La secuencia de aminoácidos del fragmento de polipéptido de 6 kDa producida por la digestión de catepsina D de LF corresponde a los aminoácidos 1-49 de SEQ ID NO: 2 (Tabla 1). Dado que los polipéptidos que consisten en esta secuencia (o secuencias funcionalmente análogas que se describen con más detalle más adelante) producidos por síntesis química también demuestran actividades comparables, el polipéptido de la presente invención y las variantes funcionales del mismo, pueden generarse y/o aislarse a través de medios conocidos en la especialidad. La presencia de uniones sulfuro internas es innecesaria para las actividades antimicrobianas y neutralizante de endotoxina de los polipéptidos que se reivindican aquí, siempre y cuando se unan los aminoácidos del polipéptido mediante un esqueleto de unión de amida continuo simple. Se predice que los homólogos de los polipéptidos de defensa de huésped aislados de otras especies animales, y sus variantes funcionales tengan actividades análogas a las del fragmento de LF de 6 kDa humano y se engloban también en la presente invención.

TABLA 1 Números ID de secuencia

SEQ ID NO: 1

GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGP

SEQ ID NO: 2

GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIA

SEQ ID NO: 3

PVSCIKRDSPIQCIQAIA

SEQ ID NO: 4

GRRRRS

SEQ ID NO: 5

MRKVRG

SEQ ID NO: 6

VQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGP

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La secuencia y los análisis funcionales indican que el polipéptido que abarca los primeros 51 radicales de la proteína LF (el polipéptido de 6 kDa con 2 aminoácidos adicionales de la secuencia de LF en el término C) presenta esencialmente la misma actividad que el polipéptido de 6 kDa. La secuencia de aminoácidos de este polipéptido ligeramente más largo se enumera como el aminoácido 1-51 en la SEQ ID NO: 2. Los experimentos detallados en la sección de los ejemplos que se exponen más adelante indican que se pueden eliminar hasta 17 aminoácidos en el término C y hasta 3 aminoácidos en el término N del polipéptido de 51 aminoácidos sin que se pierda completamente la actividad, tanto antimicrobiana como neutralizante de endotoxina. En este sentido, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado con una secuencia que corresponde a los aminoácidos 1-51 de la SEQ ID NO: 2, que carecen de 17 aminoácidos del término C, y hasta 3 aminoácidos del término N. En los modos de realización preferibles, no se eliminan más de 5 radicales del término C.

Sin pretender establecer una teoría, la doble actividad del polipéptido a) antimicrobiana y b) neutralizante de endotoxina, surge de la interacción de regiones específicas del polipéptido con diferentes moléculas diana. Se cree que el crecimiento microbiano es inhibido por un mecanismo similar a otras defensinas: interrupción de la organización de membrana de la envuelta celular de un microbio interactuando con diferentes componentes de la membrana microbiana. Las membranas microbianas están hechas principalmente de una capa doble de fosfolípidos, estando presentes las cabezas de fosfato hidrófilas en la parte exterior de la capa doble (v.g., la superficie celular) y las colas de lípido hidrófobas enterradas en la parte interior de la capa doble. El polipéptido contiene dos racimos de radicales básicos separados por una extensión de aminoácidos que tienen un alto contenido de radicales hidrófobos. La combinación de racimos básicos separadas por una extensión más hidrófoba permite al polipéptido de la presente invención interactuar con la superficie de membrana hidrófila y también con la cola de lípidos hidrófoba dentro de la capa doble. Esta combinación de interacciones lleva a la intercalación del polipéptido en la membrana, lo que conduce a la interrupción de la membrana. Los componentes bioquímicos de los polipéptidos que interactúan con los componentes de la capa doble de lípidos interactúan de manera muy similar con los lipopolisacáridos localizados en la superficie bacteriana, que tienen actividad de endotoxina, que consiste también en una porción hidrófila y una porción hidrófoba. La endotoxina, cuando está presente en la superficie bacteriana, es un componente de una molécula de lipopolisacárido más grande (LPS). LPS es un componente de la membrana exterior de todos los microbios gram-negativos. El componente hidrófilo (polisacárido) de LPS está localizado en la superficie exterior de la membrana y el componente hidrófobo (lípido) está localizado en la parte interior de la capa doble. La porción de lípido A de la molécula de LPS es la porción inflamatoria o endotoxina de la molécula de LPS. Se cree que los racimos de radicales básicos se unen a los sitios cargados negativamente en la porción polisacárido de LPS y en el grupo de cabeza más expuesto de su cola de lípido A, lo que permite la región de intervención hidrófoba unirse y neutralizar el lípido A.

En condiciones que difieren de las de la superficie del microbio, se pueden dar otros tipos de unión. Los resultados que se presentan en los ejemplos más adelante indican que un polipéptido que tiene los componentes funcionales que se han descrito, pero que contiene solamente un racimo básico funcional, por ejemplo LF-27, que tiene la secuencia de aminoácido enumerada en SEQ ID NO: 6 (figura 1), tiene una actividad neutralizante significativa hacia la endotoxina que no está en el contexto de la superficie del microbio (v.g., cuando se desprende de la bacteria o se extrae a través de un medio preparativo como por ejemplo en los alimentos o productos farmacéuticos). En tales circunstancias, la porción de lípido A de la molécula queda más expuesta y por lo tanto, la endotoxina es más accesible al polipéptido. En concentraciones altas de polipéptido, o en condiciones salinas anormales, o cuando se extrae o desprende LPS, o cuando se desorganiza estando aún en la membrana, la región de intervención hidrófoba del polipéptido puede seguir mediando la unión a LPS a través del lípido A, llevando a la inactivación de los efectos endotóxicos de la porción de lípido A de LPS.

Las personas especializadas en este campo reconocerán que las sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácido de la secuencia de fragmento de polipéptido LF de 6 kDa que preservan las propiedades bioquímicas de la molécula relacionada con estas interacciones preservan la actividad antimicrobiana y neutralizante de endotoxina en los polipéptidos resultantes. Los polipéptidos que resultan de dichas sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácido se consideran como variantes funcionales del fragmento de LF de 6 kDa y como tales quedan también abarcadas dentro del marco de la invención. Tal como se ha introducido anteriormente, las regiones específicas del fragmento de LF participan en la actividad antimicrobiana y neutralizante de endotoxina. Más específicamente, estas regiones incluyen dos racimos básicos, uno localizado en el término N y el otro desde el radical 28 al 31 inclusive. Por otra parte, la hidrofobidad relativa de las secuencias de aminoácido que flanquean estos racimos básicos también contribuye a la actividad del polipéptido. La siguiente fórmula define los componentes críticos del polipéptido de 6 kDa de la presente invención y variantes funcionales del mismo:

B_{1}-R1-B_{2}-R2

en la que B_{1} y B_{2} representan racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 aminoácidos siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos, y R1 está comprendido entre los aminoácidos 17 y 21 que tienen un promedio general del valor de hidropaticidad (GRAVY) (J. Kyte and Doolite, R.F., J. Mol. Biol., 157: 105-132 (1982)) de al menos -0,609 y un valor del índice alifático (A. Ikai, J. Biochem. 88: 1895-1898 (1980)) de al menos 35,45, y R2 está comprendido entre los aminoácidos 1 y 17 y tiene un valor GRAVY de al menos 0,174 y un valor del índice alifático de al menos 97,14, uniéndose los aminoácidos del polipéptido para formar un esqueleto de unión de amida continuo simple.

Los aminoácidos lisina, arginina, histidina y cualquier variante de aminoácido que se sintetiza o modifica químicamente para tener un grupo cargado positivamente sobre su cadena lateral, se califican como aminoácidos fuertemente básicos en el contexto de la presente descripción y otras definiciones de la presente invención que aparecen más adelante.

El índice alifático se calcula con arreglo a la siguiente fórmula: índice alifático = X (Ala) + a \cdot X (Val) + b \cdot (X(Ile) + X(Leu)) siendo X(Ala), X(Val, X(Ile, y X(Leu) por ciento en moles (100 x fracción molar) de alanina, valina, isoleucina y leucina. a y b son el volumen relativo de la cadena lateral valina (a = 2,9) y de cadenas laterales Leu/Ile (b = 3,9) para la cadena lateral de alanina.

En los modos de realización preferibles, R1 y R2 del polipéptido aislado no tienen más de 1 aminoácido ácido cada uno. Ácido aspártico, ácido glutámico y una variante de aminoácido que se sintetiza o se modifica químicamente para que tenga un grupo cargado negativamente en su cadena lateral, se califican como aminoácidos ácidos en el contexto de la presente descripción y otras definiciones de la presente invención que se presentan más adelante. En un modo de realización, R2 del polipéptido aislado es PVSCIKRDSPIQCIQAIA (SEQ ID NO:3). Alternativamente, R2 puede ser una truncación C-terminal de esta secuencia (SEC ID NO:3). En otro modo de realización, B_{1} del polipéptido aislado es GRRRRS (SEQ ID NO. 4) o una truncación del mismo, que retiene la menos dos R's consecutivas en la secuencia. Algunos ejemplos de B_{1} producido a través de dicha truncación son GRR, RRS, RRR, Y RR. En otro modo de realización, B_{2} del polipéptido aislado es MRKVRG (SEQ ID NO: 5).

En un modo de realización preferible, el polipéptido aislado tiene la secuencia de aminoácidos 1-51 enumerada en la SEQ ID NO: 2. En un modo de realización alternativo, el polipéptido aislado comprende esta secuencia con una sustitución de aminoácido en la posición 16, disminuyendo la sustitución la hidrofilicidad relativa de la región de polipéptido en la que descansa, y aumentando así la hidrofobicidad relativa de esa región. Es probable que aumentar la hidrofobicidad de esta región de la molécula potencie la actividad antimicrobiana y neutralizante de endotoxina del polipéptido. Un ejemplo de dicha sustitución es una sustitución de aminoácido de carga neutra en la posición 16, por ejemplo glicina. Un aminoácido de carga neutra se define como un aminoácido que no tiene carga neta cuando se da dentro del contexto de un polipéptido a un pH fisiológico. Otro ejemplo de dicha sustitución es con un aminoácido hidrófobo sin carga, como valina o alinina. Debe advertirse que se espera que sustituciones similares a las antes descritas directamente, en la posición 41, tengan el mismo efecto potenciador global. Se espera a su vez que estos tipos de sustituciones de aminoácido hechas en variantes funcionales del polipéptido potencien la actividad de estas variantes.

Otro aspecto se basa en el hallazgo de que el polipéptido LF-33 aislado, un 33-mero que es el resultado de la eliminación de los 17 aminoácidos C-terminales del polipéptido de defensa de huésped de 6 kDa, uniéndose los aminoácidos para formar un esqueleto de unión de amida continuo simple, presenta actividad antimicrobiana y neutralizante de endotoxina equivalente a la del fragmento de LF de 6 kDa antes descrito. La secuencia de aminoácidos de LF-33 se enumera en SEQ ID NO: 1 (tabla 1).

Se excluyen específicamente LF-33 y LF-27 de las reivindicaciones de polipéptido de la presente invención a la luz del hecho de que se han descrito anteriormente como polipéptidos que unen polisacáridos aniónicos como glucosaminoglucanos (Mann y cols., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994).

En lo que se refiere al fragmento de LF de 6 kDa, los polipéptidos que son el resultado de sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácido de la secuencia de polipéptido LF-33 que preservan las propiedades bioquímicas de la molécula criticas para la actividad, incluyendo las 2 racimos básicos y la hidrofobicidad de las secuencias que intervienen, son variantes funcionales de LF-33 ya que funcionan a través de los mismos mecanismos y presentan actividades similares. La fórmula:

B_{1}-R1-B_{2}

define componentes críticos de LF-33 y variantes funcionales de los mismos, siendo B_{1} y B_{2} y R1 como se han definido antes.

R1 del polipéptido aislado puede tener 1 aminoácido ácido como máximo que califica los aminoácidos ácidos que se han descrito. B_{1} del polipéptido aislado puede ser GRRRRS (SEQ ID NOº:4) o una truncación del mismo, que retiene al menos dos R consecutivas en la secuencia, cuyos ejemplos se han expuesto antes. B_{2} del polipéptido aislado puede ser MRKVRG (SEQ ID NO: 5).

El polipéptido aislado puede consistir en la secuencia de aminoácidos enumerada en SEQ ID NO: 1 con una sustitución de aminoácido en la posición 16, teniendo como resultado la sustitución una menor hidrofobicidad relativa de la región de polipéptido en la que descansa, aumentando así la hidrofobicidad relativa de la región. Se espera que esta sustitución potencie la actividad del polipéptido. Es de esperar que sustituciones similares hechas en otras variantes funcionales del polipéptido potencien la actividad de esas variantes. Anteriormente se han dado ejemplos de dichas sustituciones.

El polipéptido antimicrobiano y neutralizante de endotoxina de la presente invención también puede caracterizarse por la presencia de aminoácidos característicos en posiciones específicas dentro del polipéptido. Los polipéptidos con secuencias de aminoácido que son análogas a los aminoácidos 1-51 de SEQ ID NO: 2 y los fragmentos funcionales de los mismos (en los que hasta 20 aminoácidos están suprimidos del término C) en relación con estas posiciones específicas son también variantes funcionales y como tales quedan englobadas en la presente invención. Más específicamente, la variante funcional tiene un radical básico en las posiciones 2, 3, 4, 5, 28, 29, 31, 39, y 40 y el radical hidrófobo en las posiciones 7, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 20, 21, 23, 32, 35, 37, 38, 44, 46, 47, 49 y 50, y un radical ácido en la posición 16, y 41. Tal como se ha descrito anteriormente, los aminoácidos del polipéptido antimicrobiano o una variante funcional se unen para formar un esqueleto de unión de amida continuo simple. Los aminoácidos que se califican como radicales básicos y como radicales ácidos en este contexto se han explicado anteriormente. En el contexto de esta definición y otras definiciones o descripciones de la presente invención, radicales hidrófobos incluyen fenilalanina, leucina, isoleucina, tirosina, triptofano, valina, metionina y prolina. Alternativamente, los radicales en la posición 10, 20, 37 y 46 pueden ser cisteínas, como en las secuencias de aminoácido de tipo silvestre de LF. En los modos de realización preferibles, los radicales de la variante funcional en posiciones no específicas se designan a través de los aminoácidos correspondientes del polipéptido de 51 aminoácidos, que se enumeran en la SEQ ID NO: 2, o son sustituciones conservadoras de estos radicales.

Un modo de realización alternativo de la presente invención consiste en el polipéptido antimicrobiano o variante funcional del mismo descrito directamente anteriormente, que tiene una sustitución de aminoácido de carga neutra en la posición 16 y/o la posición 41. En los modos de realización preferibles, se sustituye un aminoácido de carga neutra con una cadena lateral hidrófoba en la posición 16 y/o la posición 41. Tal como se ha explicado anteriormente, se espera también que dicha sustitución análogo potencie la actividad de cualquiera de las variantes funcionales en las que se haga.

La evidencia experimental indica que el polipéptido antimicrobiano que consiste en los aminoácidos 1-51 de la SEQ ID NO: 2 mantiene una significativa actividad con la supresión de hasta 3 aminoácidos del término N. Por consiguiente, las variantes funcionales del polipéptido antimicrobiano también incluyen las variantes funcionales antes descritas con la supresión de 1-3 aminoácidos más del término N.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión que promueve la eliminación rápida de endotoxina del organismo de un animal a través de una ruta de eliminación de endocitosis. La proteína de fusión es el resultado de la fusión de un primer polipéptido que es el polipéptido neutralizante de endotoxina de la presente invención o una variante funcional del mismo, con un segundo polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido que es reconocido e internalizado por células a través de una ruta de eliminación por endocitosis. Los polipéptidos adecuados para el primer componente de la proteína de fusión se han descrito anteriormente. En un modo de realización preferible, el primer componente de polipéptido de la proteína de fusión consiste en los aminoácidos 1-51 de la SEQ ID NO: 2.

La proteína de fusión resultante tiene el primer polipéptido (el fragmento neutralizante de endotoxina) N-terminal con el segundo polipéptido (el fragmento de eliminación por endocitosis) o alternativamente, el segundo polipéptido N-terminal con el primer polipéptido. La proteína de fusión retiene las actividades correspondientes de los componentes individuales. Es posible que sean necesarias algunas modificaciones menores (v.g., una región de unión entre los dos fragmentos de polipéptido) para preservar estas funciones.

Otros aspectos de la presente invención se refieren a métodos de utilización del polipéptido y variantes funcionales de los mismos según la presente invención. Por motivos de brevedad, el término polipéptidos de la presente invención se utiliza aquí para incluir tanto el fragmento de polipéptido LF de 6 kDa original como todas las variantes funcionales descritas antes en detalle. Tal como se ha explicado ya LF-33 y LF-27 no se excluyen de las reivindicaciones de los métodos aquí descritas.

Otro aspecto de la presente invención consiste en un método para inhibir el crecimiento microbiano. Los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar para inhibir el crecimiento microbiano en diversas circunstancias. Por ejemplo, se pueden administrar los polipéptidos de la presente invención terapéuticamente para tratar o prevenir la enfermedad de un individuo que es resultado de una infección microbiana.

Se pueden inhibir diversas infecciones microbianas por tratamiento con los polipéptidos que se han descrito. Los experimentos que se exponen en la sección de los ejemplos indican que la administración terapéutica de estos polipéptidos inhibe y puede invertir la progresión de una infección bacteriana. Cierta evidencia adicional indica que también se pueden reducir algunas infecciones fúngicas. Dado que se cree que los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención inhiben el crecimiento microbiano interrumpiendo la membrana celular del microbio, cualquier microbio que posea dicha membrana celular es potencialmente susceptible de la inhibición de crecimiento mediante polipéptidos antimicrobianos. Los virus que contienen envueltas de lípidos también son susceptibles de los efectos antimicrobianos de los polipéptidos de la presente invención.

En los modos de realización preferibles, la infección microbiana es una infección bacteriana. Esto incluye, sin limitación, infecciones bacterianas que son causadas por micobacterias. Las micobacterias son resistentes a muchos fármacos antimicrobianos. Las micobacterias son causantes de dos de las enfermedades más importantes a lo largo de la historia, la tuberculosis y la lepra. La mayoría de los casos de tuberculosis humana son causados por Mycobacterium tuberculosis, sin embargo un número significativo de casos viene dado por Mycobacterium bovis. El desarrollo y propagación de nuevas cepas de bacterias resistentes, especialmente micobacterias, está suponiendo cada vez más una amenaza para la salud pública. Los polipéptidos antimicrobianos que se han descrito son útiles en el tratamiento de pacientes que sufren de estas cepas de microbios resistentes, que amenazan actualmente a la salud
pública.

Muchas de las infecciones bacterianas causan sepsis bacteriana en individuos infectados. Los resultados que se detallan en la sección de los ejemplos más adelante indican que los polipéptidos descritos tienen también actividad neutralizante de endotoxina. La administración de estos polipéptidos de actividad dual a individuos que padecen de una infección bacteriana séptica produce un importante efecto terapéutico al reducir tanto la sepsis causada por la infección como la propia infección.

Un individuo adecuado para el tratamiento es cualquier animal (mamífero o no) que esté afligido o que sea susceptible de padecer una o más de las infecciones microbianas que se han descrito. En un modo de realización preferible, el individuo es un ser humano. En otro modo de realización, el individuo es un animal de ganado. En otro modo de realización, el animal es un animal de espectáculo o un animal de compañía.

La administración del polipéptido al individuo es o bien sistémica o bien localizada, y se determina en gran medida según la infección específica que se esté tratando. La administración sistémica puede realizarse a través de diversas rutas, incluyendo, sin limitarse sólo a ellas la administración intravenosa, inhalación e ingestión. La administración localizada puede ser tópica o interna. Dicha administración se puede realizar a través de diversas rutas incluyendo, sin limitarse sólo a ellas, administración subcutánea, dérmica, intradérmica e intraperitoneal, inhalación e
ingestión.

Frecuentemente será útil administrar una formulación de los polipéptidos de la presente invención que incluya un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las posibles formulaciones para la administración terapéutica incluyen diversas composiciones farmacéuticas, cuyo uso apropiado dependerá de la ruta de administración que se considere necesario para el tratamiento. Algunas formulaciones útiles para la administración tópica son por ejemplo gotas oculares, gotas para los oídos y aplicaciones gingivales (v.g., gotas, enjuagues bucales, crema o pasta). El régimen de administración (v.g., ruta, dosis y curso) que sea terapéutico para el paciente variará con el individuo que se esté tratando (v.g., salud, peso, metabolismo), sitio de infección y el patógeno infectante. Se deberá desarrollar un régimen terapéutico por extrapolación a partir de un tratamiento con agentes terapéuticos similares en combinación con la observación empírica. La administración de los polipéptidos de la presente invención para prevenir una infección microbiana en un individuo va en paralelo a los métodos antes descritos.

Otro aspecto de la presente invención se basa en el hallazgo de que los polipéptidos de la presente invención también presentan actividad en potenciar la acción terapéutica de otros fármacos o agentes antimicrobianos. Los experimentos detallados en la sección de los ejemplos demuestran que la administración conjunta de otros agentes antimicrobianos con los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención produce un efecto antibiótico sinérgico. Estos resultados indican que los polipéptidos de la presente invención aumentan significativamente la actividad antibiótica de rifampicina o isoniazid. Sin pretender establecer ninguna teoría, se piensa que esto ocurre porque los polipéptidos de la presente invención interrumpen la integridad de las membranas bacterianas y esta interrupción tiene como resultado una concentración más alta del antibiótico dentro de la bacteria individual.

Estos resultados indican que los polipétidos de la presente invención pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la actividad de diversos agentes o fármacos antimicrobianos. La administración conjunta de los polipéptidos de la presente invención con un agente antimicrobiano permite el tratamiento terapéutico de un paciente con una dosis más baja de agente antimicrobiano. Son preferibles las dosis más bajas en situaciones como cuando se trata con un fármaco caro, o un fármaco que produce efectos secundarios no deseables, o un fármaco cuya corta vida media in vivo podría reducir si no rápidamente su concentración por debajo de lo necesario para su eficacia. Por otra parte, la administración conjunta con agentes o fármacos antimicrobianos puede dar cabida también a un período de terapia más corto y/o una inversión de fenotipos resistentes. Sin limitación, se espera que los microbios que resisten a un fármaco antimicrobiano disminuyendo su concentración de fármaco interna (v.g., con una menor permeabilidad de membrana o una mayor exportación celular o metabolismo del fármaco) sean especialmente susceptibles a la actividad potenciadora de estos polipéptidos.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar para potenciar cualquier agente o fármaco antimicrobiano cuya actividad requiere la entrada más allá de la superficie más exterior del microbio. En los modos de realización preferibles, el fármaco antimicrobiano es un antibiótico y la infección microbiana es una infección bacteriana. El agente causante es o bien una bacteria que es susceptible al antibiótico, o bien alternativamente es resistente al antibiótico en ausencia de potenciación de antibiótico. En un modo de realización preferible, el antibiótico es rifampicina o una molécula estructuralmente relacionada. En otro modo de realización, el antibiótico es isoniazid o una molécula estructural relacionada. En otro modo de realización, el fármaco antimicrobiano es un agente antifúngico y la infección es una infección fúngica. Los pacientes incluyen cualquier individuo (animal, mamífero, ser humano, etc.) que sufra o esté en riesgo de contraer una infección de un microbio susceptible.

El régimen de administración del fármaco antimicrobiano y el polipéptido aislado o la variante funcional según la presente invención varía según el paciente y la infección en particular, y puede ser determinada por una persona especializada en este campo en función de cada caso. Las formulaciones del polipéptido dependerán del régimen de administración, cuyos ejemplos se han descrito antes.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los polipéptidos que se han descrito para neutralizar endotoxina. Los polipéptidos de la presente invención tienen actividad neutralizante de endotoxina y pueden utilizarse para neutralizar endotoxina dentro del organismo de un individuo (v.g., al circular en la corriente sanguínea). La endotoxina puede ser el resultado de un patógeno que haya infectado el organismo o, alternativamente, puede provenir de un agente contaminante al que ha sido expuesto el cuerpo (v.g., sangre u otro fluido, tejido o superficie del cuerpo contaminado de endotoxina). Los polipéptidos de la presente invención se administran al individuo de manera similar a su administración para el tratamiento de un paciente con una infección microbiana, antes descrita. El régimen terapéutico de administración de los polipéptidos variará con cada caso y se puede desarrollar por extrapolación a partir del tratamiento con agentes terapéuticos similares en combinación con la observación empírica. Se pueden utilizar asimismo formulaciones similares a las descritas anteriormente para el tratamiento de una infección microbiana en este método. Los regímenes de administración y las formulaciones útiles también son como las que se han descrito anteriormente en el presente documento.

Alternativamente, la endotoxina en un paciente puede neutralizarse por administración de una proteína de fusión que comprenda un polipéptido con actividad neutralizante de endotoxina condensado con un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido que es reconocida e internalizada por células a través de una ruta de eliminación por endocitosis. La proteína de fusión administrada se ha descrito anteriormente en detalle.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar no solamente como agentes farmacéuticos y neutralicéuticos sino también como aditivos para cualquier producto, como por ejemplo alimentos y productos medicinales y no medicinales que se introducen en el organismo o se aplican de otra forma o se ponen en contacto con la superficie del cuerpo de seres humanos y otros animales, o los fluidos, órganos y células derivados de los mismos. La neutralización y/o eliminación de endotoxina desde productos potencialmente contaminados es enormemente beneficiosa en circunstancias en las que la endotoxina podría dañar potencialmente a los organismos vivos que entran en contacto, directamente o indirectamente con dicho producto.

Para neutralizar la endotoxina y/o inhibir el crecimiento microbiano en un producto, se pone en contacto el producto con un polipéptido o variante funcional descrita en detalle anteriormente. El contacto del producto con el polipéptido puede realizarse de diversas formas incluyendo, sin limitarse sólo a ellas, inmersión, rociado, mezclado, adsorción y exposición a vapores y dependerá de las propiedades del producto específico.

El método de la presente invención es útil para tratar una serie de productos. Los productos biológicos, aquí definidos como productos que se derivan de organismos o procesos biológicos, se encuentran de forma particular en riesgo de contaminación por microorganismos y endotoxinas. Entre los ejemplos de productos biológicos se incluyen sin limitación, productos de alimentos, tejidos, células vivas, productos derivados de células vivas, sangre y componentes de la misma, así como otros fluidos del organismo, fármacos u otros preparados moleculares. Pueden tratarse también productos no biológicos, definidos aquí como un producto no derivado directamente de un organismo o proceso biológico, como por ejemplo material de cristal, equipo quirúrgico, fármacos sintéticos y otras preparaciones moleculares. Para un uso efectivo de la presente invención, el producto que ha de tratarse no deberá poseer ninguna actividad que inactive completamente la actividad neutralizante de endotoxina de toda la cantidad de polipéptido que se aplique de esta forma. Los polipéptidos de la presente invención se pueden añadir, distribuir, rociar, adherir, recubrir, adsorber reticular químicamente o impregnar en cualquier producto en el que se desee de forma general prevenir la contaminación o inhibir la contaminación de endotoxinas o microorganismos proliferantes.

Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención pueden inmovilizarse sobre una superficie sobre la que se pasa un producto para eliminar la endotoxina o inhibir el crecimiento microbiano en el producto. Un producto que se trata con el polipéptido neutralizante de endotoxina y lo retiene puede utilizarse además para tratar otro producto con el que entra en contacto.

Se describe aquí también la inducción de la producción in vivo del polipéptido de defensa de huésped de LF en un individuo. La evidencia presentada en los ejemplos más adelante indica que el fragmento de polipéptido de defensa de huésped de 6 kDa de LF se produce a través de la digestión con la protesasa de ácido aspártico catepsina D y que la sensibilidad de LF a esta digestión aumenta tras la exposición a polianiones. Estas conclusiones indican que la administración de un polianión (v.g., heparina, glucosaminoglucanos, ácidos nucleicos o sulfato de dextrano) a un paciente aumentarán la producción del polipéptido de 6 kDa desde LF (ya sea LF endógeno o LF administrado) mediante catepsina D o una enzima relacionada. Alternativamente, el aumento de la concentración total y la actividad proteolítica de catepsina D, u otras proteasas que participen en la generación in vivo de polipéptido de 6 kDa también aumentará la producción in vivo del polipéptido.

Otras proteasas de ácido aspártico que pueden segmentar también el fragmento de 6 kDa de LF incluyen, sin limitación, catepsina E, renina y la proteasa aspártica de VIH. Estas proteasas funcionan óptimamente a un pH de 3,5 a 5. El ajuste del pH del entorno inmediato de las proteasas que participan en la generación del polipéptido de 6 kDa desde L, a niveles óptimos para la actividad de proteasa, aumentarán por lo tanto la producción in vivo del polipéptido desde LF.

Se describe también aquí la potenciación de la actividad antimicrobiana y la actividad neutralizante de endotoxina del polipéptido de defensa de huésped de LF y las variantes funcionales, a través de la manipulación de la concentración iónica del entorno inmediato del polipéptido. Dado que las actividades de los polipéptidos de la presente invención están influidas por la concentración iónica del entorno inmediato, siendo óptima una concentración iónica por debajo de la fisiológica, los ajustes realizados en el entorno inmediato del polipéptido afectarán a la actividad.

Los resultados que se presentan en la sección de los ejemplos más adelante indican que los polipéptidos de la presente invención funcionan inhibiendo el crecimiento microbiano a una concentración iónica inferior a 200 mM de NaCl, observándose la actividad óptima a 50 mM NaCl (la concentración más baja sometida a prueba). Estos resultados indican que cualquier tratamiento en virtud del cual se exponen los polipéptidos de la presente invención a un microbio infeccioso o endotoxina en condiciones de una menor concentración iónica, conseguida por ejemplo al administrar el polipéptido en soluciones de concentración iónica por debajo de la fisiológica o en combinación con cualquier agente que cause una dilución de las concentraciones de sal de los fluidos tisulares en la vecindad de la infección (como por ejemplo un diurético de actuación local), aumentará significativamente la potencia de la formulación de polipéptido. A lo largo de estas líneas, se pueden designar variantes de los polipéptidos que permanecen activos a concentraciones iónicas por encima de las fisiológicas. Por ejemplo, al aumentar el número de aminoácidos de carga positiva dentro de uno o ambos racimos de radicales básicos, o al disminuir el número de radicales de carga negativa general dentro del polipéptido, se podría predecir la reducción de la inhibición de sal de los polipéptidos variantes.

Ejemplos Generación in vivo de polipéptido de defensa de huésped desde LF

LF es inusualmente resistente a proteolisis (R.D. Brines y J.H. Brock, Biochim. Biophys. Acta. 759: 229-35 (1983)) y se conoce muy poco sobre su procesado in vivo durante la inflamación. Así pues, se examinaron tejidos humanos inflamados para determinar la presencia del domino N-terminal como un polipéptido pequeño (v.g., <12 kDa). Se utilizaron anticuerpos específicos para 17 radicales N-terminales de LF humana madura para sondear inmunomanchados de esputo de un individuo con un profundo catarro bronquial y exudados purulentos ("pus") obtenidos de piel humana infectada. Esto sirvió para identificar el domino N-terminal de LF presente como un polipéptido de bajo peso molecular (Pm 6.000-8.000) en todos los exudados sometidos a prueba. Una comparación densitométrica de exploración de la intensidad de inmunomanchado de la muestra de polipéptido de 6 kDa con el patrón sugiere que este patrón estaba presente en los exudados a 1-10 \muM. Se detectó también el polipéptido N-terminal en esputo humano, si bien no se detectó en placa gingival o en saliva humana. En algunas de las muestras de tejido, los polipéptidos de tamaño intermedio (v.g., de 10-20 kDa) que contenían el dominio N-terminal pudieron detectarse como componentes menores probablemente como resultado de un procesado incompleto del dominio liberado. Estos datos proporcionan la primera evidencia directa de que el dominio antimicrobiano de LF se libera in vivo durante los eventos inflamatorios y que permanece intacto como un polipéptido pequeño dentro del tejido.

Leucocitos activados liberan el dominio 6 kDa N-terminal de LF

Dado que un punto crítico de la mayoría de las infecciones microbianos es la infiltración de fagocitos profesionales, se examinó estas células para determinar su capacidad para liberar el dominio antimicrobiano desde LF. Se activaron co-cultivos primarios de monocitos y neutrófilos y se examinaron para determinar el procesado de LF derivado de neutrófilos. Se aislaron moléculas de unión a heparina de extractos celulares combinados y se obtuvo un extracto de cultivo desde los neutrófilos humanos primarios y los monocitos que se cultivaron conjuntamente y se activaron por FMLP. El inmunomanchado de estos con anticuerpo de polipéptido N-terminal anti-LF detectó un duplete tensamente espaciado de 6-8 kDa, que correspondió al dominio antimicrobiano, producido desde LF derivado de neutrófilos mediante fagocitos activados. No se pudo detectar polipéptidos inmunoreactivos en neutrófilos antes de la activación, lo que indica que la liberación proteolítica tiene lugar después de la desgranulación de neutrófilos. Esto confirmó que los fagocitos activados liberan el dominio N-terminal como un pequeño polipéptido que retiene la función de unión a heparina. La comparación de LF intacta obtenida de un número igual de neutrófilos reveló que una proporción sustancial de la proteína era procesada por los co-cultivos activados. Los controles incluyeron el dominio de antibiótico liberado con un polipéptido de 6 kDa desde LF purificada por pepsinolisis, así como los polipéptidos purificados con heparina desde calostro humano. NO se detectó el péptido N-terminal en calostro humano a pesar de contener concentraciones muy altas de LF (\sim5-7 mg/ml) (Sánchez y cols., Arch. Dis. Child. 67: 657-61 (1992)), lo que indica que no se genera espontáneamente. Más bien, es probable que este procesado tenga lugar como respuesta a un evento inflamatorio.

Se cultivaron monocitos y neutrófilos y se activaron por separado para determinar qué tipo de fagocito podría liberar el polipéptido LF N-terminal. Para estos experimentos, se suplementaron monocitos con LF de leche purificada exógenamente (50 \mug) ya que no tuvieron LF endógeno. Se eliminó el medio de cultivo antes de extraer las células con detergente y después se aislaron moléculas de unión de heparina por separado desde ambas fracciones y se inmunomancharon. Se detectó el dominio antimicrobiano de 6 kDa en los medios de cultivo y los extractos celulares de ambos tipos de células. Estos resultados indican que ambos tipos de células son capaces de liberar el dominio antimicrobiano desde LF. En ambos cultivos, se detectó extracelularmente el dominio antimicrobiano así como en el extracto celular. La mayoría de los fragmentos generados por los monocitos permanecieron asociados a células, en lugar de solubles, mientras que en el caso de los neutrófilos se produjo lo contrario. La importancia de esta distribución diferencial entre los compartimentos extracelulares y celulares en los dos tipos de células se corresponde con un modelo en el que se segmenta LF liberado de neutrófilo extracelularmente a través de proteasas derivadas de neutrófilo, e intracelularmente a través de fagocitos mononucleares seguido de su internalización por éstos últimos (Britigan y cols., J. Immunol. 147: 4271-7 (1991); Courtoy y cols., Lab. Invest. 50: 329-34 (1984)) al llegar al sitio de la inflamación. Estos estudios demuestran que los fagocitos profesionales pueden liberar el dominio antimicrobiano de LF y podrían ser responsables así de la generación del polipéptido N-terminal detectado en tejidos infectados.

Liberación de un polipéptido de 6 kDa desde LF a través de la proteasa lisosómica catepsina D

Para establecer qué proteasa(s) podrían ser la(s) responsable(s) de la liberación del dominio N-terminal, se examinó el procesado de LF a través de varias proteasas relevantes en inflamación o infecciones microbianas, incluyendo elastasa, catepsinas G y D, una metaloproteinasa de matriz, y la protesa "V8" de S. aureus. Entre ellas, solamente catepsina D, una proteasa lisosómica abundante en fagocitos (Bever y cols., Inflammation 13: 309-16 (1989); Levy y cols., Infect. Immun. 57: 1632-4 (1989)) fue capaz de liberar el término N intacto como un pequeño polipéptido de unión a heparina. La exposición a LF saturada con hierro o libre de hierro incluso a pequeñas cantidades de catepsina D (1/200º, p:p) durante un período de tan sólo cinco minutos produjo polipéptido de 6 kDa N-terminal, detectable por análisis de inmunomanchado, utilizando el anticuerpo específico de péptido N-terminal. La mayor acumulación de este polipéptido se dio con exposiciones mayores a catepsina D y la presencia de polipéptido se mantuvo estable y resistente a una posterior degradación durante al menos tres días. La secuencia N-terminal del polipéptido de 6 kDa purificado reveló un único término amino que correspondió a Gly-1 en la molécula de LF madura. El análisis de espectrometría de masa MALDI indicó una masa molecular de 5741 Da, un valor muy cercano al valor de 5744 Da esperado para el polipéptido de LF partiendo de Gly-1 y terminando con Ala-49. Tomados juntos, estos resultados demuestran que catepsina D libera el dominio N-terminal de LF como un polipéptido que, en virtud de sus similitudes bioquímicas y estructurales con otros polipéptidos de defensa de huésped (H.G. Boman, J. Marsh, y J.A. Goode, Eds. Antimicrobial Peptides, (Johh Wiley & Sons Ltd. Nueva York, NY, 1994); Hoffman y cols., Curr. Opin. Immunol. 8: 8-13 (1996); Martin y cols., J. Leukoc, Biol. 58: 128-36 (1995); T. Ganz y R.I. Lehrer, Curr. Opin. Hematol. 4: 53-8 (1997) inhibe el crecimiento microbiano según las previsiones.

Efectos de pH en la liberación de fragmento de LF de 6 kDa a través de catepsina D

Catepsina D es una protesa degradativa principal que se encuentra en los lisosomas de células fagocíticas y otros tipos de células. Segmenta proteínas que son endocitadas o fagocitadas por células o que se distribuyen después al compartimento lisosómico de pH bajo de la célula. Al igual que muchas proteasas lisosómicas, la catepsina D es proteolíticamente activa con un pH ácido óptimo (\simpH 3,5) (Tang, J. y Wong, R.N.S. J. Cell. Biochem. 33: 53-63 (1987)), un poco por debajo del lisosoma típico (pH \sim4,5-5,0) (Shoji Ohkuma y Brian Poole, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 3327-3331 (1978)). Se llevaron a cabo los experimentos en los que se comparó la liberación del polipéptido de 6 kDa desde LF a través de catepsina D a un pH diferente.

Se digirió LF humana purificada desde leche humana con catepsina D a pH de 3,5, 4,0, 4,6, 5,0 o 7,4. Tras la digestión, se sometieron a electroforesis las muestras por SDS-PAGE con TRIS-glicina en condiciones no reductoras. A continuación, se sometieron a inmunomanchado los productos fraccionados con antisuero policlonal de conejo que reconoce específicamente únicamente los polipéptidos que contienen los primeros 17 aminoácidos del polipéptido de 6 kDa. El análisis identificó una banda que se desplazó a aproximadamente el mismo tamaño que el polipéptido de 6 kDa desde las muestras de LF que habían sido incubadas con catepsina D a pH 3,5, 4,0, 4,6 o 5,0. No obstante, no se detectó ningún producto de 6 kDa a partir de la incubación a un pH 7,4. Estos resultados demuestran que la liberación del polipéptido de 6 kDa aumenta significativamente un pH por debajo del fisiológico.

La unión de LF a heparina aumenta en gran medida la capacidad de catespina D de liberar el fragmento de 6 kDa a pH lisosómico

Se cree que una de las funciones de los polisacáridos es conferir a las proteínas resistencia al ataque de proteasas. Dado que LF se une a polisacáridos aniónicos y esta unión está medida a través de sus 33 radicales amino terminales (Mann y cols., J. Biol. chem. 269: 23661-23667 (1994)), se realizaron experimentos para determinar si el polisacárido heparina, un polianión modelo que se da de manera natural, protege LF de la proteolisis de catepsina D y reduce la liberación del polipéptido LF de 6 kDa.

Se digirió LF con catepsina D a un pH 5 durante 1 hora o 24 horas en ausencia o presencia de un exceso molar 10 veces mayor de heparina. Se fraccionaron los productos del digesto en condiciones sin reducción por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de inmunomanchado utilizando un anticuerpo específico para los primeros 17 radicales de la proteína LF como sonda. Se detectaron cantidades significativamente mayores del polipéptido de 6 kDa desde las muestras que incluyeron catepsina D y heparina, frente a las muestras incubadas en ausencia de heparina. El análisis de inmunomanchados similares de incubaciones de LF realizadas en ausencia de catepsina D o en presencia de pepstatina A, un inhibidor de catepsina D, no llegaron a identificar un fragmento de 6 kDa. Estos controles indicaron que la mayor degradación fue causada por catepsina D, y no fue debida a una proteasa contaminante en las preparaciones de heparina. Estos resultados demostraron que la liberación del polipéptido 6 kDa desde LF a través de catepsina D aumenta de manera espectacular la presencia de un polianión como heparina. Este resultado sorprendente fue lo contrario de lo que se esperaba. La explicación de este resultado no se conoce, pero puede estar relacionada con que los polianiones proporcionen un microentorno de un pH bajo (debido a sus numerosos grupos con función ácida) que produce condiciones optimas para proteasas de ácido aspártico como catepsina D. Estas conclusiones indican que es probable que la liberación del fragmento de 6 kDa desde LF se facilite in vivo por la presencia de polianioines como glucosaminogluconanos o ácidos nucleicos.

El fragmento de LF de 6 kDa liberado por catepsina D es un agente antimicrobiano más potente que un fragmento similar liberado por pepsina

Se midió la actividad antimicrobinana del polipéptido catéptico frente a un aislado clínico, E. coli 0111. Se inhibió el crecimiento microbiano a una concentración iónica fisiológica con una concentración inhibidora mínima (MIC) de \sim1-5 \muM de polipéptido y una reducción superior a 10.0000 veces más en el crecimiento celular a 100 \muM, siendo el número de CFUs viable menos de la mitad del inóculo original (de 2,14 x 10^{4} a 8,8 x 10^{3} CFU/ml) (fig. 1). El fragmento catéptico de 6 kDa de LF es por lo tanto al menos igual de potente que doce de los polipéptidos antimicrobianos naturales (H. G. Boman, J. March, y J.A. Goode, Eds., Antimicrobial Peptides, (John Wiley & Sons Ltd., Nueva York, NY, 1994)), y puede funcionar como un agente bactericida. El fragmento antimicrobiano liberado por catespina D es \sim10 veces más potente contra las bacterias que el liberado por pepsina ya que la MIC para este último estuvo comprendida entre 11-33 \muM, un valor perfectamente de acuerdo con el valor de 18 \muM registrado anteriormente para este fragmento pepsinolítico (Bellamy cols., Biochim. Biophys. Acta 1121: 130-6 (1992)). A 100 \muM de polipéptido, el número de bacterias viable fue más de 1.000 veces mayor en los cultivos tratados con el pepsinolítico frente al fragmento catepsinolítico (figura 1). La base de esta diferencia de potencia puede estar relacionada con las segmentaciones de pepsina internas adicionales que se dan entre los dos puentes de disulfuro en el dominio de 6 kDa (Mann. y cols., J. Biol. Chem. 269 : 23661-7 (1994); Bellamy y cols. Biochim. Biophys. Acta 1121: 130-6 (1992)).

La eficacia de la catepsina D para generar el polipéptido antimicrobiano desde LF es significativa por varias razones. Si bien es un miembro de la familia de proteasas aspártica que incluye quimosina, renina, la proteasa de VIH-1, y pepsina (K. Takahashi, Ed. Aspartic Proteinasas: Structure, Function, Biology and Biomedical Impliations (Plenum Press, Nueva York, 1995)) y tiene características estructurales y requisitos de pH similares a la pepsina, la catepsina D es distinta de estas proteasas en que se encuentra por lo general en el compartimento lisosómico de todas las células y es abundante en fagocitos profesionales (J. Tang y R.N.S. Wong, J. Cell, Biochem. 33: 53-63 (1987)). La catepsina D también es secretada desde las células como una proteasa activa que puede degradar moléculas extracelulares siempre y cuando esté presente un entorno adecuadamente ácido (Briozzo y cols., Cancer Research 48: 3688-3692 (1988)). Por otra parte, es abundante en el tejido inflamado (S. Bazin y A. Delaunay en Inflammation, Biochemistry and Drug Interaction, A. Bertelli y J.C. Houck, Eds., (Excerpta Medica, Amsterdam, 1969), pp. 21-28) y se sabe que es importante para generar otros polipéptidos farmacológicamente activos (L.M. Greenbaum en Proteases and Biological control, E. Reich, D.B. Rifkin y E. Shaw. Eds., (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1975), pp. 223-228). En lo que se refiere a su distribución y función in vivo, así como su capacidad específica para procesar LF, la catepsina D se adapta pues de manera única para funcionar en la producción de respuesta inflamatoria de este polipéptido de defensa.

La abundancia del polipéptido cateptico de LF en el esputo sugiere que puede tener una importante función durante la inflamación o infección pulmonar. Tomado junto con la observación de que el polipéptido antimicrobiano puede generarse tras el procesado celular de LF derivada de epitelio, su presencia en el esputo también se corresponde con un potencial para funcionar en la inmunidad mucosal así como la inmunidad mediada por neutrófilos.

Inhibición del crecimiento bacteriano a través de un polipéptido que corresponde a los primeros 33 aminoácidos de LF

Los estudios anteriores indicaron que el fragmento de polipéptido de 6 kDa N-terminal de LF funciona como un sitio de unión de glucosaminoglucano y la actividad de unión de glucosaminoglucano (GAG) de LF estaba contenida dentro de los 33 aminoácido N-terminales del polipéptido. Este 33-mero contiene dos racimos de radicales (básicos) con carga positiva, que según se piensa son necesarios para la interacción de GAG. Un 27-mero que correspondía a los aminoácidos 7-33 de lactoferrina, que carecía del primer racimo de radicales básicos en LF, pero que contenía el segundo racimo, solamente se unión débilmente a GAG. Un 27- mero que correspondía a los aminoácidos 1-27 de LF que carecía del segundo racimo de radicales básicos también presentó una unión más débil a GAG que el 33-mero que contenía ambos racimos básicos (Mann y cols., J. Biol. Chem. 269: 23661-23667 (1994)).

Para investigar si las regiones de la molécula implicadas en la actividad de unión a GAG del polipéptido LF de 6 kDa (generado de la digestión de pepsina) participan también en la actividad antimicrobiana del polipéptido de 6 kDa de la presente invención, se sometieron a ensayo diversos polipéptidos de varias longitudes correspondientes a la secuencia de aminoácido N terminal de LF para determinar la capacidad para inhibir el crecimiento de E. coli 0111. Se prepararon cultivos de toda la noche a lo largo de un período de tiempo de siete horas en presencia de 50 \muM de LF, un 33-mero correspondiente a los aminoácidos 1-33, un 27-mero correspondiente a los aminoácidos 7-33 de LF, un 27-mero correspondiente a los aminoácidos 1-27 de LF. El 33-mero suprimió completamente el crecimiento de estos cultivos a lo largo de todo el período de tiempo. LF, en contraposición, tan sólo tuvo un efecto de supresión del crecimiento transitorio (figura 2). Este se corresponde con el hecho de que LF y el 33-mero inhiben el crecimiento bacteriano a través de diversos mecanismos. El efecto inhibidor del crecimiento de LF intacta, pero no el 33-mero, puede abolirse por saturación de la proteína con hierro, lo que sugiere que el modo de acción primario de LF es a través de la privación de hierro de la bacteria. La diferencia en los datos cinéticos para el 33-mero frente a LF sugiere que la actividad del 33-mero no puede manifestarse mientras permanece dentro de la proteína intacta. El hecho de que el 26-mero y el 27 mero no inhiban el crecimiento de cultivo enfatiza la importancia de retener ambos racimos de radicales básicos, en los términos del 33-mero, para la funcionalidad antimicrobiana de los polipéptidos derivados de la secuencia LF N-terminal. Estos resultados también indican que los aminoácidos responsables de la unión a GAG en LF descrita anteriormente puede dar cuenta de la actividad antimicrobiana observada anteriormente para el fragmento de LF de 6 kDa derivado de pepsina.

Comparación de la respuesta a dosis antimicrobiana de los polipéptidos con o sin dos racimos básicos

Para comparar la actividad del 33-mero antes descrito que contiene ambos racimos básicos, y el 27- mero antes descrito, que contiene solamente un racimo básico, se desarrollaron cultivos de E. coli durante 5 horas en presencia de varias dosis de los dos polipéptidos. Tal como se muestra en la figura 3, el 33-mero de unión a GAG inhibió el crecimiento bacteriano con una concentración inhibidora mínima (MIC) de 2-5 \muM. En contraposición, el 27-mero no inhibió el crecimiento (incluso a concentraciones de hasta 200 \muM). Estos datos demuestran que la inhibición del crecimiento microbiano a través del 33-mero requiere un primer racimo intacto de radicales básicos y la inhibición depende de la dosis.

Efecto de concentración iónica en la actividad antimicrobiana del polipéptido LF 6 kDa

Se cree que una primera etapa de la función antimicrobiana de muchos polipéptidos de defensa de huésped catiónicos naturales implica la unión del polipéptido a la superficie del microbio a través de débiles interacciones electrostáticas con sitios cargados negativamente en la superficie microbiana. En correspondencia con esto se puede mencionar la observación de que muchos de estos polipéptidos de defensa de huésped no actúan contra la diana microbiana en condiciones elevadas de concentración iónica, en las que se inhibiría la primera etapa de unión. Este tipo de atenuación de las propiedades protectores de los polipéptidos de defensa del huésped pueden ser fisiológicamente relevantes para infecciones que tienen lugar en determinados tejidos en los que tiene lugar una acumulación de sal, como el riñón o la vejiga normal, o el pulmón de pacientes con fibrosis cística. Para definir la sensibilidad de la actividad antimicrobiana de un representante de los fragmentos de polipéptido LF antimicrobiano de aumentar la concentración iónica.

Los resultados del experimento, presentados en la figura 4, indican que el crecimiento de la actividad de inhibición del polipéptido de 6 kDa se reduce a medida que aumenta su concentración iónica hasta que se pierde esencialmente cuando aumenta la concentración de NaCl a 50 mM por encima de la fisiológica (concentraciones iónicas iguales o superiores a 200 mM de NaCl). En contraposición, a concentraciones iónicas por debajo de las fisiológicas el polipéptido es significativamente más potente en inhibir el crecimiento bacteriano que a concentraciones de sal fisiológicas. Por ejemplo, al reducir la concentración iónica de 150 mM NaCl a 50 mM NaCl se reduce el número de bacterias viables tras la exposición \sim10.000 veces.

Estos resultados son significativos por varias razones. En primer lugar, demuestran la exquisita sensibilidad del polipéptido antimicrobiano representativo a perturbaciones sutiles en la concentración iónica y sugiere que el polipéptido inhibe el crecimiento microbiano a través de un mecanismo que requiere una interacción electrostática con algunas moléculas diana microbianas (aún desconocidas), siendo muy probablemente LPS. En segundo lugar, estos resultados marcan la probabilidad de que los polipéptidos de defensa de huésped derivados de LF, y muy probablemente otros polipéptidos de defensa de huésped endógenos, de la secuencia original (de tipo silvestre) no protejan a los pacientes con fibrosis cística de infecciones pulmonar. Esto se debe a que el fluido de la superficie del pulmón en estos pacientes, según se ha registrado, tiene una concentración de ión cloruro 50-100 mM más alta que en el pulmón normal y estos polipéptidos tienen poca actividad antimicrobiana o ninguna a esta concentración iónica.

El polipéptido LF de 6 kDa y 33-mero aumentan la permeabilidad de membrana bacteriana

Las similitudes bioquímicas y estructurales de los polipéptidos de la presente invención con otros polipéptidos antibióticos conocidos, defensinas humanas HNP-1 y NHP-2, péptido antimicrobiano traqueal bovino (TAP), protegrinas porcinas, y otros, sugiere que este dominio en LF pueda actuar inhibiendo el crecimiento bacteriano dañando las características de permeabilidad de las membranas bacterianas. Para someter a ensayo esta hipótesis, se sometió a prueba la capacidad de los polipéptidos de la presente invención para aumentar la potencia de rifampicina. Rifampicina es un fármaco de bajo peso molecular (< 1 kDa) que tiene una baja permeabilidad de membrana pero que envenena efectivamente las células bacterianas tras su entrada en el citosol.

Se expusieron cultivos de E. coli a dosis por debajo de la óptima de Rifampicina en presencia o ausencia de dosis por debajo de la óptima de los polipéptidos indicados (figura 5) y se incubaron durante 6 horas, punto en el cual se determinaron las CFU. Se potenciaron de manera espectacular los efectos de inhibición del crecimiento de una dosis por debajo de la óptima de rifampicina cuando se administraron en combinación con una dosis baja de los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención. Por ejemplo, la adición de una dosis por debajo de la activa (5 \muM) del polipéptido de 6 kDa a cultivos expuestos a rifampicina redujo el número de bacterias viables que resultaron tras el período de crecimiento de 6 horas en más de tres órdenes de magnitud. Si bien el control negativo de polipéptido de 27 meros no tuvo ningún efecto significativo en la actividad antimicrobiana de rifampicina, el 33-mero, al igual que el polipéptido de 6 kDa potenció el antibiótico. La sinergia entre el 33-mero y la rifampicina produjo aproximadamente 1% tantas bacterias viables como el tratamiento de rifampicina en solitario. Se observó un efecto de potenciación similar utilizando el antibiótico isoniazid. Esto indica que los polipéptidos de la presente invención funcionan, al menos en parte, dañando la envuelta exterior de los microbios.

Estos resultados demuestran también la capacidad de los polipéptidos de potenciar la actividad antimicrobiana de otros agentes antimicrobianos, en particular antibióticos convencionales. Esto indica que los polipéptidos pueden utilizarse para convertir determinados tipos de microbios resistentes a antibióticos en el fenotipo sensible a antibiótico. Por ejemplo, las concentraciones prácticas de un antibiótico, que sería ineficaz si no debido a la resistencia desarrollada, se convierten en eficaces a través de la administración en combinación con los polipéptidos de la presente
invención.

Neutralización de endotoxina in vitro o in vivo mediante polipéptido derivado de LF

Los estudios anteriores han establecido que los 33 radicales N-terminales de LF humana representan la secuencia mínima que media en la unión de la proteína a glucosaminoglucanos (Mann y cols. J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)). Esta secuencia contiene una cabeza catiónica (radicales 1-6) y una cola (radicales 28-33) que se combina para formar un sitio de unión a glucosaminoglucano. En este estudio, se valoró la capacidad neutralizante de endotoxina de un polipéptido sintético, designado LF-33, que corresponde a los primeros 33 radicales de la forma secretada de LF humano.

Inhibición de coagulación de lisado de amebocito Limulus inducido por endotoxina

Se midió la inhibición de la coagulación de lisado de amebocito de Límulus (LAL) inducida por endotoxina mediada por péptido con un ensayo LAL sensible (Zhang y cols., J. Clin. Microbiol. 32: 416-422 (1994)). El ELISA Limulus es un ensayo de endotoxina basado en la activación de la coagulación LAL por endotoxina y la detección de inmunorreactividad de péptido C generada con un ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal para el polipéptido. Se definió que la endotoxina estaba neuralizada cuando se perdió su capacidad para activar las enzimas LAL. El 50% de concentración neutralizante de endotoxina (ENC_{50}) refleja la potencia de un agente anti-endotoxina; una ENC_{50} baja indica una alta potencia. En la tabla 2 se indica el valor ENC_{50} determinado de cada agente anti-endotoxina contra lípido A y cuatro tipos de LPS diferentes. La potencia de cada agente anti-endotoxina varió dependiendo del tipo de endotoxina. El LF-33 fue más potente que polimixina B, sobre una base molar, en neutralizar todas las formas de endotoxina sometidas a ensayo. En contraste, LF-27 fue aproximadamente 10 veces menos potente que LF-33 en la neutralización de lípido A y LPS de E. coli y no tenía actividad detectable contra los otros tres LPS. La única diferencia entre la secuencia de LF-33 y LF-27 es que LF-27 carece de los primeros seis radicales (GRRRRS) en el término N de LF-33. Notablemente, esta supresión condujo a una notable pérdida de la capacidad neutralizante de endotoxina del polipéptido en este ensayo. La unión de proteínas de suero a endotoxina neutraliza la actividad de endotoxina en este ensayo evitando que la endotoxina active LAL (Emancipator y cols., Infect. Immun. 60: 596-601 (1992)). El suero humano presentó diversos grados de inhibición de la coagulación LAL inducido por endotoxina, pero no tuvo efecto en el lípido A (tabla 2).

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TABLA 2 50% de concentración neutralizante de endotoxina (ENC_{50}) de agentes anti-endotoxina determinado con ELISA Limulus

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Los polipéptidos de LF neutralizan la actividad de endotoxina de la porción de lípido A de LPS

La región de lípido A de la molécula de LPS es responsable principal de los efectos inflamatorios y tóxicos de LPS. Cuando se libera LPS del microbio, la porción de lípido A puede hacerse más accesible. Se llevaron a cabo los siguientes ensayos para determinar el potencial de varios polipéptidos de LF amino terminales para neutralizar la actividad de endotoxina de la porción de lípido A de LPS. Se sometieron a ensayo LF, el fragmento de 6 kDa de LF, LF-33, LF-27, y polimixina B para determinar su capacidad para neutralizar la actividad de endotoxina de lípido A de E. coli 0113 (30 ng/ml) utilizando un ensayo LAL. Los resultados de este experimento se presentan en la figura 6. Si bien se demostró que LF no tenía una actividad neutralizante de lípido A apreciable, el fragmento de LF de 6 kDa, LF-33 y LF-27 neutralizaron el lípido A con potencia similar pero no idéntica, siendo cada una de ellas comparable a la de la polimixina B, el patrón en la industria. Esto indica que LF-27, que tiene solamente un racimo de aminoácidos básicos, es igual de potente en neutralizar una forma de endotoxina que carece de porción oligosacárido de masa grande de LPS que los polipéptidos que contienen dos racimos de aminoácidos básicos. Esta capacidad que se observa en el el 27-mero para neutralizar la cola de lípido A más fácilmente accesible indica que los racimos de radicales cargados positivamente en los términos del 33-mero se unen a los sitios aniónicos en la porción de oligosacárido de LPS, o el grupo de cabeza de lípido A, pero que la secuencia de intervención hidrófoba que se extiende sobre los dos racimos es críticamente importante para unirse a la región de lípido A y neutralizar su actividad inflamatoria. La actividad de endotoxina de los fragmentos más pequeños de LF indica que la actividad neutralizante de endotoxina de estos polipéptidos pequeños se enmascara cuando está en el contexto de la molécula LF
intacta.

Supresión de secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina mediante LF-33

Se midió también la supresión de la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina por una línea celular de macrófago RAW 264.7 (Kelly y cols., Infect. Immun. 59: 4491-6 (1991)). Las células RAW 264.7 secretan TNF-\alpha tras la exposición a endotoxina (M.R. Ruff. y G.E. Gifford, Lymphokines 2: 235-272 (1981)). Se observó una relación lineal entre la secreción de TNF-\alpha y la concentración de endotoxina a concentraciones de endotoxina por debajo de 20 ng/ml para el lípido A y varios LPS utilizados en este estudio, y se seleccionó la concentración de 10 ng/ml de endotoxina para los experimentos de inducción de TNF-\alpha. El mezclado de endotoxina con concentraciones en incremento de LF-33 tuvo como resultado una supresión dependiente de dosis de la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina (Figura 7). De manera similar a los resultados del ensayo LAL, la potencia de LF-33 varió dependiendo del tipo de endotoxina. La concentración de LF-33 necesaria suprimir el 50% de secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina (10 ng/ml) fue aproximadamente 0,01 \muM para LPS de E. coli y lípido A, 0,1 \muM para LPS de P. aeruginosa y 0,5 \muM para LPS de S. abortus equi y N. meningitidis. En la tabla 3 se muestran con fines comparativos los efectos de LF-27, polimixina B, y suero humano en la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina. LF-33 presentó una potencia ligeramente más alta que polimixina B en la supresión de la secreción de TNF-\alpha inducida por diferentes tipos de endotoxina, mientras que concentraciones molares iguales de LF-27 o 10% de suero humano no presentaron efecto en la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina.

TABLA 3 Supresión mediante agentes anti-endotoxina de secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina por células RAW 264.7 +

2

Efecto de suero humano en la supresión mediante LF-33 de secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina

Para someter a ensayo la secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina en condiciones más fisiológicas, se añadió LF-33 o polimixina B a suero humano (concentración final 10%) antes de la adición de endotoxina. Tal como se muestra en la tabla 4, se atenuó el efecto supresor de los polipéptidos sustancialmente en presencia de suero humano al 10%, si bien se pudo superar el efecto de suero aumentando la concentración de LF-33 (tabla 4 y la figura 8). No obstante, cuando se mezcló el polipéptido con endotoxina 5 minutos antes de la adición de suero, se redujo en gran medida el efecto del suero en la neutralización de endotoxina con los polipéptidos. (Tabla 5).

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TABLA 4 Supresión con polipéptidos anti-endotoxina de secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina por células RAW 264.7 en medio de cultivo con contenido de 10% de suero humano

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TABLA 5 Supresión con polipéptidos anti-endotoxina de secreción de TNF-\alpha inducida por endotoxina por células RAW 264.7 en medio de cultivo con contenido de un 10% de suero humano: efecto de la secuencia de mezclado con suero

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Efecto de LF-33 en la letalidad inducida por endotoxina y nivel de TNF-\alpha en suero en el modelo de ratón sensibilizado con galactosamina

Los ratones son típicamente resistentes a endotoxina. No obstante, la sensibilidad de los ratones a endotoxina se puede potenciar multiplicándola por 1000 por co-inyección con una galactosamina inhibidora específica de hígado (Freudenberg M.A. y c. Galanos, Infect. Immun. 59: 2110-2115 (1991); Galanos y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76: 5939-5943 (1979). Un rasgo esencial de este modelo in vivo es que TNF-\alpha liberado sistémicamente causa daños en el hígado debido a la muerte de célula hepática mediada por TNF-\alpha, que puede puntuarse midiendo la letalidad. La inyección intra-peritoneal de 125 ng de LPS de E. coli por animal indujo cerca de un 100% de letalidad en los ratones sensibilizados con galactosamina. Tal como se muestra en la tabla 6, la letalidad inducida por endotoxina se redujo dramáticamente inyectando LF-33. Pequeñas cantidades de LF-33 (2,5 \mug por animal), cuando se inyectó simultáneamente con endotoxina, redujo la letalidad de 93% (14 muertes de 15) a 6% (1 muerte de 15). Por otra parte, LF-33 también redujo significativamente la letalidad cuando se inyectó por vía intravenosa (i.v.) 10 minutos después de la inyección intraperitoneal (i.p.) de endotoxina (tabla 6), si bien se requirió una cantidad 40 veces mayor de LF-33. La protección se correspondió con la reducción del nivel de TNF-\alpha en suero de
ratón.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Protección de animales de la letalidad de LPS mediante LF-33 en modelo de ratón sensibilizado con galactosamina

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6

Efecto de fragmento catéptico de 6 kDa LF en letalidad bacterémica en modelo de ratón leucopénico sensibilizado con galactosamina

Se determinó el potencial protector final del polipéptido de 6 kDa de LF en una infección bacteriana contra defensa de huésped sometiendo a ensayo un sistema de modelo de ratón leucopénico sensibilizado con galactosamina agudo (Bucklin y cols., J. Infect. Dis. 174: 1249-1254 (1996)). En este modelo, se hizo leucopénicos a los ratones para suprimir sus sistemas de defensa de huésped endógenos y después se los sensibilizó para los efectos de endotoxinas gram-negativas por tratamiento con galactosamina al mismo tiempo que se les inyectaba una dosis intraperitoneal letal de E. coli. Los datos, representados en la figura 9, demuestran que la inyección simultánea con el fragmento catéptico de 6 kDa de LF humano (100 \muM, i.p.) aumentó de manera espectacular el índice de supervivencia de animales infectados, de 10% en animales sin tratar a 70% en animales tratados con polipéptido (valor P de una vía <0,01 utilizando una Prueba Exacta de Fisher). Esta recuperación de la letalidad ilustra de forma espectacular el potencial protector del polipéptido in vivo y es probable que se deba a sus propiedades antimicrobianas y anti-endotoxina combinadas. Este resultado indica que el polipéptido tiene una utilidad significativa como agente terapéutico.

Actividad anti-micobacteriana de polipéptidos antimicrobianos

Las bacterias del género Mycobacteria incluyen M. tuberculosis, M. smegmatis, M. leprae, M. bovis, y otros. Estos microbios son responsables de dos de las enfermedades más temidas a lo largo de la historia de la humanidad: la tuberculosis y la lepra. Las Mycobacteria tienen una pared celular inusualmente gruesa con una compleja composición química rica en contenido en lípidos que confiere propiedades únicas a estos microbios, especialmente una significativa resistencia a muchos tipos de antibióticos. Se llevaron a cabo experimentos para determinar si los polipéptidos derivados de LF podían inhibir el crecimiento de Mycobacteria. Se desarrollaron cultivos de igual densidad de M. smegmatis en presencia o ausencia de LF-33 (50 \muM de concentración final), durante 16 horas y se determinaron las células viables resultantes. Los resultados, presentados en la tabla 7, indicaron una media de 94% de eliminación en presencia de LF-33. En un experimento complementario, se desarrollaron cultivos de M. smegmatis en presencia de 10, 20, 30, 40, 50 o 100 \muM de LF-33, tras lo cual se determinaron las células viables resultantes. Los resultados, presentados en la figura 10, indican una inhibición dependiente de dosis de crecimiento micobacteriano mediante el polipéptido de LF-33. El mero 33 presenta un valor MIC antimicobacteriano de no más de 10 \muM y da aproximadamente un 94% de eliminación a una concentración de 50 \muM.

Estos experimentos demuestran que un miembro representativo de los polipéptidos de LF antimicrobianos, el 33-mero, inhibe el crecimiento de Mycobacteria. Si bien estos experimentos fueron realizados con la especie BH1 de M. smegmatis de crecimiento más rápido, se han producido también resultados similares con la cepa H37Ra de M. tuberculosis. La inhibición impredecible de Mycobacteria mediante LF-33 es sorprendente dadas las inusuales propiedades de baja permeabilidad y cerosidad de la membrana celular de estos microbios.

TABLA 7 Actividad antimicobacteriana de LF-33

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Métodos de la invención

Inmuno-reactivos. Se desarrollaron anticuerpos contra el N-término de LF humana en conejos inmunizados con una forma de polipéptido antigénico múltiple (J. Tam. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409-5413 (1988)) de los primeros diecisiete radicales de la forma madura de LF humana. Esta secuencia contiene el primero de dos racimos de aminoácidos básicos que se requieren simultáneamente para la unión de LF a polisacáridos aniónicos como heparina (Mann y cols., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994)). Estos anticuerpos inmunomanchan LF intacta y fragmentos que contienen su término N pero no reaccionan cruzadamente con ningún otro péptido ensayado, incluyendo tranferrina humana o fragmentos proteolíticos derivados de ella. Se utilizaron los anticuerpos para inmunomanchado como un antisuero diluido 1:3.000 en solución salina tamponada que contenía 1% de albúmina como vehículo y agente de bloqueo de membrana. El anticuerpo secundario fue IgG anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alalina de Kirkegaard & Perry Laboratories, y se utilizó el sistema de detección BCIP/NBT (E. Harlow and D Lane. Eds. Antibodies: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)), cap. 12).

Inmunomanchado. Se siguieron los procedimientos normales para electroforesis de gel e inmunomanchado (E. Harlow and D. Lane, Eds. Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)).

Preparación de muestra. Se obtuvo calostro humano congelado desactualizado del banco de leche materna local. Se obtuvieron todas las demás muestras de fluidos corporales del Tissue Procurement Center en el Health Sciences Center de la Universidad de Virginia o de donantes voluntarios en el laboratorio. Se recogieron exudados dérmicos ("pus") de furúnculos, raspados de placa gingival, saliva y muestras de expectorado de esputo en tubos de microfuga esterilizados y llevados a 1 x con tampón de muestra SDS-PAGE que contenía 1 \mug/ml de leupeptina, aprotinina y pepstatina A para inhibir proteasas. El tampón de muestra contenía 0,1% de SDS y +/- 5% de \beta-mercaptoetanol como agente de reducción. Se llevaron a ebullición inmediatamente y se almacenaron a -80ºC hasta que se separaron en geles de poliacrilamida de gradiente lineal 5-20%. El volumen del fluido de tejido original cargado por línea de gel midió entre 5- y 20 ml, dependiendo de la muestra. Se transfirieron electroforéticamente polipéptidos separados a membranas de nitrocelulosa (Millipore Corp.) en un tampón de transferencia que, según se determinó empíricamente, permitía una transferencia óptima de polipéptidos catiónicos pequeños. La transferencia electroforética tuvo lugar durante 2 horas a 150 voltios constantes en metanol al 30% que contenía 0,01% de SDS, 25 mM de base TRIS y 192 mM de glicina en un aparato de minitransferencia TE-22 Hoeffer. Se utilizó Ponceau S para manchar reversiblemente el total de proteínas transferidas a la membrana antes de la fotografía y la inmunotinción. Se llevó a cabo la densitometría de exploración de las bandas inmunoteñidas utilizando un escáner de láser de Hewlet Packard ScanJet IIcx/T y el programa de análisis de densiometría de Imagen de N.I.H).

Aislamiento de célula. Se aislaron cultivos de fagocitos primarios de sangre humana periférica inicialmente a través del método de gradiente de densidad de Ficoll (Organon Teknika Corp.) (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach and W. Strober, Eds. Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Nueva York, NY 1991), cap. 7). Se extrajeron glóbulos rojos de la sangre contaminantes de la fracción de neutrófilos por sedimentación diferencial en dextrano T-500, 0,9% de solución salina, seguido de lisis hipotónica. Se aislaron además monocitos de linfocitos por elutriación centrífuga a contracorriente en un aparato de elutriación centrífuga Beckman J2-21M (Beckman Instruments) tal como se describe (ibid). Se iniciaron todos los experimentos con células en el curso de 30 minutos de aislamiento de fagocitos nuevos. Para los experimentos de cultivo conjunto de fagocitos, se recombinaron monocitos y neutrófilos aislados de la misma unidad de sangre y se repartió en dos mitades la mezcla recuperada, una de las cuales se lisó inmediatamente como control pre-activado en tampón de lisis; solución salina tamponada con TRIS que contenía 1% de Triton X-100 y coctail de inhibidores de proteasa. Se co-cultivó el resto de las células durante 5 horas a 37ºC en medio RPMI sin suero (Life Sciences, Gaithersburg, MD) seguido de activación con 2 mM de fMet-Leu-Phe (Sigma Chemicals). A continuación, se lisaron los co-cultivos activados en tampón de lisis y el lisado de detergente combinado con el medio de cultivo de la superficie en preparación para purificación con heparina de fragmentos de LF. Se aislaron polipéptidos de unión a heparina en los lisados de co-cultivo activado y pre-activado en modo discontinuo por cromatografía con heparina seguido de clarificación de los lisados por centrifugado. A continuación se sometieron a electroforesis los polipéptidos eluidos desde heparina-Sepharosa con 750 mM de NaCl en condiciones de reducción y se inmunomancharon tal como se ha descrito anteriormente. Para los experimentos en los que se estudiaron neutrófilos y monocitos por separado, se incubó cada uno de los cultivos durante 3 horas seguido de la activación y se suplementaron los cultivos de monocitos con 50 mg de LF de leche humana purificada ya que no tenían LF endógena. A continuación, se separó el medio de cultivo antes del lisado de las células con 1% de tampón que contenía Triton X-100 antes descrito y se aislaron moléculas de unión a heparina del medio de cultivo y los extractos de células por separado.

Purificación de LF de calostro humano y liberación proteolítica del dominio antimicrobiano in vitro. Se descongeló calostro congelado a 37ºC y se desnató por centrifugado durante 40 minutos a 10.000 x g a 4ºC. Se desnató la leche desnatada subyacente una segunda vez y después se convirtió en suero por incubación durante 40 minutos a 40ºC seguido de acidulación con HCl a pH 4,7. Se separó el coágulo por centrifugado a 4ºC durante 40 minutos a 10.000 x g y se diluyó el suero de sobrenadante con 4 volúmenes de solución salina tamponada con TRIS, pH 7,4, antes de la fraccionación por cromatografía de intercambio de iones para aislar LF. Después de la unión de la LF en el suero diluido a flujo rápido de sefarosa CM (Pharmacia), se lavó la columna exhaustivamente con solución salina tamponada con fosfato y se eluyeron las proteínas unidas con un gradiente de concentración iónica comprendida entre 0,15 y 1,0 M NaCl en el mismo tampón de lavado. LF eluye típicamente como un pico único a aproximadamente 550 mM de NaCl que fue homogéneo según el análisis SDS-PAGE y secuenciado de aminoácido N-terminal. Se concentró el pico LF 4 veces por centrifugado de secado al vacío (Speed Vac) y después se dializó exclusivamente a 4ºC frente a 50 mM de NaCl utilizando un tubo MWCO 30.000 (Spectrum). Antes de la digestión con catepsina D de bazo bovino (Sigma), se llevó la LF dializada a 150 mM de NaCl y 50 mM de acetato sódico, pH 3,5 y a continuación se digerió para completado durante 36 horas a 37ºC con una relación 1:200 (p:p) de catepsina D a LF. Se determinó la concentración LF por espectrofotometría a 280 nm (utilizando E280 nm 1 cm 0,1% = 1,0402). Durante el transcurso de los experimentos de digestión, se separaron muestras equivalentes a 20 mg de la LF original a los diversos intervalos de tiempo indicados, se trataron con 1 mg/ml de pepsatina A y se sometieron a ebullición en el tampón de muestra SDS-PAGE para terminar la proteolisis y se almacenaron congelados hasta la electroforesis una vez finalizado el período de tiempo. Para preparar el fragmento antimicrobiano en volumen, se pasó el digesto de LF de 36 horas sobre una columna de pepstatina A-agarosa (Sigma) para eliminar la catepsina D activa (L.B. Larsen y T.E. Petersen en Aspartic Proteinases: Structure, Function, Biology and Biomedical Implications, K. Takaahashi, Ed. (Plenum Pres, Nueva York, 1995) pp. 279-283) y se trató la fracción en circulación con 1 mg/ml de pepstatina A para inhibir toda actividad de catepsina D residual. A continuación se diluyó la fracción en circulación a un pH y una concentración iónica fisiológicos con bicarbonato sódico, NaOH y NaCl en preparación para purificación con heparina y se llevó a 1 mM con cloruro ferroso apara saturar con hierro cualquier nivel traza de LF sin digerir que pudiera estar presente (pero no detectable por SDS-PAGE o inmunomanchado). A continuación, se unió el polipéptido antimicrobiano a heparina-Sefarosa (Pharmacia) y se eluyó con un gradiente desde 150 mM a 1 M NaCl tras un lavado de columna extensivo con solución salina tamponada con fosfato. Se dializó el polipéptido purificado contra agua destilada antes del secado para completado y almacenamiento a -80ºC. Se llevó a cabo la generación del fragmento correspondiente por pepsinolisis esencialmente como con el digesto de catpesina a excepción de que se llevó a cabo el digesto durante 4 horas a 37ºC en glicina 50 mM, pH 3,0, con una relación 3:100 (p/p) de pepsina: LF.

Digestión LF con catepsina D y heparina. Se digerió LF (10 \mug) con catpesina D a pH 5, tal como se ha descrito anteriormente, durante los períodos de tiempo indicados, en ausencia o presencia de 10 veces más el exceso molar de heparina (heparina de mucosa porcina, PM \sim7-15 kDa, de Sigma Fine Chemicals).

Espectrometría de masa. Se llevó a cabo la espectrometría de masa MALDI (W.T. Moore, Methods Enzymol 289: 520-42 (1997)) en el fragmento catéptico de 6 kDa purificado con heparina a través de la Protein and Carbohydrate Structure Facility of the University of Michigan Medical School, Ann Arbor, MI, o por la American Red Cross.

Ensayo antimicrobiano para polipéptidos LF. Se desarrollaron cultivos de E. coli 0111 (American Type Culture Collection #43887) a 37ºC en 1% de bactopeptona (BP) (Difco) solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS) (Mediatech) con ventilación mediante agitación (225 rpm). Se diluyeron cultivos de toda la noche 8.000 veces en BP/dPBS concentrado x 2 y se mezclaron con un volumen igual de agua destilada sin endotoxina esterilizada que contenía diluciones en serie del polipéptido que se iba a someter a ensayo. El volumen de ensayo final fue 300 mL en un tubo de polipropileno de 12 m x 75 mm (Falcon) con una dilución final de los cultivos de toda la noche de 1:16.000 para producir un inóculo original de \sim1-2 x 10^{4} CFU/ml. El medio de ensayo final fue fisiológico en concentración iónica, 1% de bactopeptona en 1 x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Se desarrollaron cultivos durante 6 horas a 37ºC con ventilación como en el caso anterior y a continuación se determinó la densidad celular midiendo CFU/ml para cada tubo de cultivo de ensayo. Se colocaron en placa diluciones en serie de cada tubo de ensayo en caldo de cultivo Luria bactoagar y se incubó durante 24 horas a 37ºC antes de hacer el recuento de las colonias. Se realizaron todos los ensayos por triplicado y se calculó la desviación típica para cada concentración de inhibidor. Se determinó también la densidad de cultivo en el comienzo y el final del período de crecimiento de 6 horas también desde cultivos por triplicado que carecían de inhibidores de polipéptido. Los cultivos sin tratar crecieron típicamente a 1-2 x 10^{8} CFU/ml en 6 horas en las condiciones de este ensayo.

Curso de tiempo de crecimiento de E. coli en presencia de polipéptidos de LF. Se obtuvieron células de E. coli, cepa aislada clínica 0111, de ATCC. Se desarrollaron de forma rutinaria cultivos durante toda la noche a 37ºC con ventilación mediante agitación a 220 rpm en 1% BP/PBS (1% de Bactopeptona (de Difco Laboratories, Detroit, MI) preparado a una concentración iónica fisiológica en solución salina tamponada con fosfato, "PBS" (Mediatech Inc. Herndon, VA)), a un pH 7,4. Se diluyeron cultivos de toda la noche 1:20 en BP/PBS al 1% que contenían los polipéptidos indicados a 50 \muM y se incubaron durante los tiempos indicados. Se llevó un seguimiento por espectrofotometría midiendo la densidad óptica a 600 nm en cada punto en el tiempo indicado.

Respuesta a dosis de células 0111 E. coli en presencia de polipéptidos de LF Se cultivaron E. coli tal como se ha descrito anteriormente durante 5 horas en presencia de varias concentraciones de 33-mero de polipéptido o el 27-mero relacionado. Se determinó la inhibición del crecimiento de cultivo por espectrofotometría tal como se ha descrito anteriormente.

Potenciación de Rifampicina mediante polipéptidos de LF. Se desarrollaron E. coli 0111 durante toda la noche tal como se ha descrito antes. A continuación, se diluyeron los cultivos de toda la noche 1:16.000 en 1% BP/PBS que contenían 0,9 \mug/ml de Rifampicina (Sigma-Aldrich Fine chemicals) y 5 \muM de polipéptidos de LF tal como se indica. Los cultivos de control fueron los que no fueron expuestos a ningún polipéptido. A continuación, se incubaron los cultivos diluidos a 37ºC durante 6 horas con ventilación mediante agitación. A continuación, se determinó el número de bacterias viables por dilución en placa de las muestras desde cada grupo y a continuación, el recuento de las unidades de formación de colonia (CFU). Todos los valores representan la media de experimentos independientes por duplicado.

Análisis anti-micobacteriano de LF-33. Se desarrollaron inicialmente cultivos micobacterianos, M. smegmatis BH1, hasta la fase log en caldo de cultivo 7H9 (American Type Culture Collection Culture Medium 1507, Supplemented Middlebrook 7H9 Broth) antes de determinar la densidad de cultivo por medios de espectrofotometría (densidad óptica a 600 nm, siendo el O.D. 0,23 = 10^{8} células). A continuación, se diluyeron los cultivos a 2 x 10^{4} CFU/ml con caldo de cultivo 7H9 y después se mezclaron 570 \mul de células diluidas (\sim10^{4} CFU) con 30 \mul de una solución de reserva concentrada del polipéptido LF-33 de manera que la concentración final del polipéptido en el medio de cultivo fuera la que se indica (50 \muM para la tabla 7, y variable para la figura 10). A continuación, se incubaron los cultivos durante 16 horas a 37ºC tras lo cual se separaron 50 \mul y se colocaron en placa en diluciones en serie sobre placas de agarosa 7H9 para determinar el número de células viables a través del método de colocación en placa de colonias convencional.

Determinación de efecto de concentración iónica en la actividad antimicrobiana

Se cultivaron E. coli durante toda la noche tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se diluyeron los cultivos de toda la noche 1:16.000 en 1% de BP que fue tamponado con bicarbonato sódico 4 mM y suplementado con diversas concentraciones de cloruro sódico desde 50 \muM a 1 M. A continuación, también los cultivos tratados con polipéptido recibieron 25 \muM de polipéptido de LF de 6 kDa mientras que los cultivos de control en cada una de las concentraciones salinas no recibieron polipéptido. Tras 6 horas de crecimiento a 37ºC con ventilación, se determinó el número de bacterias viables por dilución en placa de las muestras desde cada grupo y posteriormente recuento de las CFU. Para controlar los efectos de la sal solamente en el crecimiento de cultivo, se calculó la proporción de CFU en los cultivos tratados con polipéptido en relación con la de los cultivos sin tratar, desarrollados en la misma concentración de sal pero desprovistos de tratamiento con polipéptido, para cada una de las concentraciones de sal examinadas. A continuación se normalizaron estos valores con la relación calculada para las CFU medidas a 50 \mum, la concentración de sal más baja que se sometió a ensayo, y se representaron gráficamente en el eje de las Y frente al aumento de la concentración de sal en el eje de las X. Así pues, el eje de las Y presenta el efecto inhibidor de crecimiento del polipéptido de 6 kDa en cada una de las concentraciones de NaCl sometido a ensayo, en relación con su actividad antimicrobiana a 50 \muM de NaCl. El recuadro presenta un gráfico semi-log de los resultados de las condiciones de una concentración iónica por debajo de la fisiológica (v.g., < 150 mM de NaCl).

Polipéptidos. Se sintetizaron los polipéptidos 33-mero y 27-mero a través de química Fmoc convencional (N-(9-fluorenil-metoxicarbonil) tal como se ha descrito anteriormente (Mann y cols., J. Biol. Chem. 269: 23661-7 (1994). El polipéptido 33-mero (GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGP) que corresponde a los primeros 33 radicales en el término N de lactoferrina humana se designa LF-33 (PM 4.004). El polipéptido de 27 meros, LF-27 (PM 3.276), se corresponde con LF-33 que carece de sus 6 radicales N-terminales. Se generaron 26 meros Phe, que representa los radicales Gly-1 a Met-27 por segmentación de los últimos 6 radicales del 33-mero a través de segmentación con bromuro de cianógeno que segmenta polipéptidos C-terminales en radicales metionina. Se utiliza polimixina B (PM 1066, Sigma, St. Louis, MO), un polipéptido anti-endotoxina (Cooperstock, M.S. Antimicrob. Agents Chemoter. 6: 422-425 (1974) como referencia con fines comparativos a lo largo del estudio.

LPS. Las endotoxinas normales de control de Escherichia coli 0113:H10 y Salmonella abortus equi (Associates of Cape Cod. Inc., Woods Hole, MA) tuvieron una potencia de 10 unidades de endotoxina (EU) por ng. Se prepararon LPS (pureza >99%) de Neisseria maningitidis a partir de la cepa de grupo B #6275 y su potencia fue 25 EU/ng. El lípido A de E. coli K12 (List Biological Laborastories, Inc., Campbell CA) tenía una potencia de 8,6 EU/ng. La potencia de LPS a partir de Psudomonas aeruginosa (Sigma) fue 0,12 EU/ng. Se determinó la La potencia de la endotoxina anterior con el ensayo inmunoabsorbente unido a enzima con Limulus (ELISA, 43) en comparación con el patrón de referencia de la farmacopea EE.UU. endotoxina EC-5.

ELISA Limulus para determinar el 50% de concentración para neutralizar endotoxina (ENC_{50}) de agentes anti-endotoxina

Brevemente, se mezclaron 25 \mul de solución de endotoxina (200 EU/ml) con un volumen igual de materiales de ensayo en una serie de doble dilución en NaCl 0,15 M en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos esterilizada (Nunc A/S, Proskilde, Dinamarca) y se incubó a 37ºC durante 1 hora en un una incubadora de aire seco. Se diluyeron las mezclas de reacción 1000 veces con agua sin endotoxina. A continuación, se determinó cuantitativamente la actividad de endotoxina mediante el uso de ELISA Limulus (Zhang y cols., J. Clin. Microbiol. 32: 416-422 (1994)). En el ensayo ELISA Limulus, la endotoxina activó la coagulación LAL a concentraciones por debajo de un pg o 0,01 de unidad de endotoxina (EU) por ml (Zhang y cols., J. Clin. Microbiol. 32: 416-422 (1994)). La alta sensibilidad del ensayo permitió la detección de niveles muy bajos de actividad de endotoxina. Tras la incubación de endotoxina con materiales de ensayo se introdujo una dilución de 1000 veces para eliminar cualquier efecto potencial de los materiales de ensayo en el sistema de enzima LAL. Ni el suero ni ninguno de estos materiales interfirió con la cascada enzimática del ensayo LAL por sí mismo tras la dilución 1000 veces a partir de sus concentraciones más altas utilizadas en este estudio. Para cada ensayo, se llevó a cabo la reacción LAL-endotoxina en las condiciones óptimas con una relación lineal entre la concentración de la endotoxina y la densidad óptica a 490 nm (OD_{490}). Normalmente se obtuvo una curva sigmoide entre OD_{490} y la concentración logarítmica de un agente anti-endotoxina. La concentración correspondiente al punto medio de la curva se designó ENC_{50}.

Secreción de TNF-\alpha inducida por Endotoxina por células RAW 264.7. Se obtuvo la línea celular de macrófago murínica RAW 264.7 del American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se mantuvo tal como se ha descrito anteriormente (Jeremy, B., Immunol. Today. 16: 417-419 (1995)). Se controló la concentración de endotoxina en todos los tampones y medios por debajo de 0,1 EU/ml. El protocolo que se siguió fue esencialmente el antes descrito con modificaciones menores (Kelly cols. Infect. Immuno. 59: 4491-6 (1991)). Se sembró cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos con 150 \mul de células RAW 264.7 a 10^{6} células por ml de DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero bovino fetal tratado térmicamente (Life Technologies), 25 mM de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico; pH 7,3), penicilina (60 (U/ml) y estreptomicina (60 \mug/ml). Después de la incubación durante toda la noche a 37ºC en una incubadora de CO_{2} al 6%, se aspiró el medio y se lavaron las células con 3 cambios de solución salina equilibrada con solución de Hank sin endotoxina (HBSS, Life Technologies), suplementada con 25 mM de HEPES (pH 7,3). Se prepararon endotoxina de control (10 ng/ml) y materiales de ensayo en HBSS-HEPES. Tras la incubación en un lote de agua a 37ºC durante 1 hora, se añadieron 0,2 ml de estas soluciones por triplicado a cada pocillo y se incubó a 37ºC durante 6 horas. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC antes de medir la actividad de TNF-\alpha. Los controles incluyeron HBSS-HEPES y materiales de ensayo en ausencia de endotoxina. La actividad de TNF-\alpha del medio y los materiales de ensayo fue por debajo de 160 pg/ml. El suero humano utilizado en algunos experimentos fue una reserva de donantes normales.

Determinación de actividad TNF. Se determinó la actividad de TNF-\alpha en el sobrenadante de cultivo en función de su citotoxicidad para la línea celular de fibrosacarcoma de ratón células WEHI 164 (ATCC). Se observó que esta línea celular era 4 veces más sensible a TNF-\alpha que las células de fibroblasto L929 utilizadas comúnmente y además se aumento 5 veces más la sensibilidad incluyendo actinomicina D (Life Technologies) en el medio (M.R. Ruff y G.E. Gifford, Limphokines 2 : 235-272 (1981). En este ensayo se correlacionó la concentración de TNF-\alpha activo con la muerte celular como resultado de la exposición a TNF-\alpha. Se midió la muerte celular colorimétricamente con el método colorante MTT viable (bromuro de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Mosmann, T., J. Immunol. Methods 65: 55-63 (1983)). Se verificó la especificidad del ensayo utilizando el anticuerpo TNF-\alpha anti-ratón de conejo (Genzyme, Inc., MA). El anticuerpo en la dilución 1:100 eliminó completamente la citotoxicidad en el sobrenadante de cultivo de las células RAW 264.7 estimuladas con endotoxina y en los sueros de ratón recogidos 1 hora después de la inyección intraperitoneal de endotoxina.

Brevemente, se sembraron las placas de cultivo de tejido de 96 pocillos con 100 \mul de células WEHI164 (5 x 10^{4} células) en medio RPMI-1640 (Life Technologies) que contenían suero bovino fetal tratado térmicamente al 10%, 25 mM de HEPES (pH 7,3), penicilina (60 U/ml), estrpetomicina (60 \mug/ml) y actinomicina D (4 \mug/ml). Al cabo de 2 horas de incubación a 37ºX en una incubadora de CO_{2} al 6%, se añadieron 10 \mul de muestras diluidas en serie dos veces (sobrenadantes de cultivo) o patrones (TNF-\alpha recombinante murínico, Genzyme) a cada pocillo y se incubó durante 20 horas. A continuación, se determinó la viabilidad celular por adición de 10 \mul de solución de reserva MTT (azul de tiazolilo, Sigma) (5 mg/ml en solución salina) a cada pocillo, y se dejó continuar la incubación durante 6 horas. Se añadieron 180 \mul de ácido-isopropanol (que contenía HC, 40 mM) para disolver los cristales azul oscuro generados. Se leyó la placa a 570 nm con una referencia de 630 nm en una lectora de microplaca. La cantidad de TNF-\alpha que llevó a un 50% de eliminación de las células sembradas se definió como una unidad, equivalente a aproximadamente 15 pg de TNF-\alpha recombinante en las condiciones de la presente invención. Se obtuvo una curva patrón por incubación de cantidades conocidas de TNF-\alpha recombinante con células WEHI.

Para excluir cualquier citotoxicidad potencial de LF-33, se siguió el procedimiento anterior con la excepción de que se reemplazaron las células WEHI164 por células RAW264.7 y la concentración de células sembradas en cada pocillo fue 1,5 x 10^{5} células por cada 150 \mul de medio para imitar las condiciones en el experimento de estimulación. En la concentración más alta de LF-33 (10 \muM) utilizada en este estudio, no se detectó ninguna citotoxicidad para las células RAW264.7.

Modelo de ratón sensibilizado con galactosamina. la inyección i.p. de 125 g de E. coli junto con 15 ml de hidrocloruro de galactosamina (Sigma) en 0,5 ml de NaCl 0,15 M indujo cerca del 100% de letalidad en ratones NIH/Suizos hembra de 8 a 10 semanas de vida (peso corporal 20-25 g/ratón). Se inyectó LF-33 o bien i.v. a través de las venas de la cola 10 minutos después de la inyección i.p. de la mezcla LPS-galactosmaina o bien con co-inyección i.p. con LPS y galactosamina. Se observó la letalidad durante 72 horas tras la inyección. En los experimentos que implicaron la medida de nivel en suero de TNF-\alpha, se recogieron muestras de sangre en tubos separadores de suero (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) 60-90 minutos después de la inyección, y se obtuvieron sueros después del centrifugado. Se midió el nivel de TNF-\alpha en suero a través del ensayo citotóxico antes descrito. Se observó que el nivel pico de TNF-\alpha en suero entre 60 y 90 minutos después de la inyección i.p. de LPS.

Estadística. Se llevaron a cabo todas las medidas de endotoxina y TNF-\alpha por triplicado en cada experimento. Se llevaron a cabo al menos dos experimentos independientes para cada dato. Los valores se dan como una media +/- error típico (SD) y se compararon utilizando un ensayo de Student no pareado. La letalidad se compara utilizando la prueba exacta de Fisher.

Generación de sistema de modelo de ratón leucopénico sensibilizado con galactosamina. Se hicieron inmunocomprometidos ratones CF-1 por tratamiento con ciclofosfamida tres días antes de sensibilizarlos con galactosamina para determinar los efectos letales de la inyección con una dosis LD_{90} de E. coli 0111 (Bucklin y cols., J. Infect. Dis. 174: 1249-1254 (1996)). En estas condiciones, se redujeron los leucocitos en circulación en un 85% y se determinó la LD_{90} en 5 x 10^{3} CFU E. coli.

<110> INVESTIGACIÓN ENDÓGENO PH AB

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<120> POLIPÉPTIDO ANTIMICROBIANO/NEUTRALIZANTE DE ENDOTOXINA

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<130> Solicitud PCT

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<140> SIN ASIGNADA

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<141> 27 -01 – 2000

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<150> US 09/245.527

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<151> 05-02-1999

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<160> 6

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<170> Patente Internacional Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 33

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

8

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<210> 2

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<211> 51

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

9

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<210> 3

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 3

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\sa{Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile Gln Ala}

\sac{Ile Ala}

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<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Gly Arg Arg Arg Arg Ser}

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<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Met Arg Lys Val Arg Gly}

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<210> 6

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

10

Claims (16)

1. Un polipéptido aislado de fórmula:

B_{1}-R2-B_{2}-R2

en la que:

(i) B_{1} y B_{2} representan racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 amino ácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos,

(ii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45,

(iii) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA,

(iv) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple y

(v) el polipéptido tiene una actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina.

2. Un polipéptido aislado de fórmula:

B_{1}-R2-B_{2}-R2

en la que:

(i) B_{1} y B_{2} representan racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 aminoácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos

(ii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45,

(iii) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA o una truncación C-terminal del mismo y

(iv) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple,

comprendiendo dicho polipéptido

(a) SEQ ID NO:2 o

(b) un fragmento de SEQ ID NO: 2 que carece de 17 aminoácidos del C-terminal y/o que carece de 3 aminoácidos del N-terminal; y teniendo dicho polipéptido actividad antimicrobiana y/o actividad neutralizante de endotoxina.

3. Un polipéptido aislado según la reivindicación 2 que tiene el glutamato 16 de SEQ ID NO:2 con una carga neutra o con un aminoácido hidrófobo.

4. Un polipéptido aislado según la reivindicación 3 que tiene el glutamato 16 de SEQ ID NO: 2 sustituido con glicina, valina o alanina.

5. Un polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que B_{1} tiene una secuencia de aminoácido GRRRRS o un fragmento de la misma que contiene RR.

6. Un polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que B_{2} tiene una secuencia de aminoácido MRKVRG.

7. Un polipéptido aislado de fórmula

B_{1}-R2-B_{2}-R2

en la que:

(i) B_{1} tiene la secuencia de aminoácido GRRRRS,

(ii) B_{2} representa racimos de aminoácidos que contienen de 2 a 7 aminoácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básicos

(iii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45,

(iv) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA o una truncación C-terminal del mismo y

(v) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple, y

(vi) el polipéptido tiene actividad antimicrobiana y/o neutralizante de endotoxina.

8. Un polipéptido aislado de fórmula

B_{1}-R2-B_{2}-R2

en la que:

(i) B_{1} representa un racimo de aminoácidos que contienen de 2 a 7 aminoácidos, siendo al menos 2 de los 2 a 7 aminoácidos fuertemente básico;

(ii) B_{2} tiene una secuencia MRKVRG,

(iii) R1 está comprendido entre 17 y 21 aminoácidos y tiene un promedio general del valor de hidropaticidad de al menos -0,609 y un valor del índice alifático de al menos 35,45,

(iv) R2 comprende PVSCIKRDSPIQCIQAIA o una truncación C-terminal del mismo y

(v) los aminoácidos del polipéptido se unen para formar un esqueleto de amida continuo simple, y

(vi) dicho polipéptido tiene actividad antimicrobiana y/o actividad neutralizante de endotoxina.

9. Un polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una secuencia que se reconoce e internaliza mediante células a través de una ruta de eliminación por endocitosis.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento microbiano y/o neutrailizar endotoxina.

12. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad que es el resultado de una infección microbiana.

13. Uso según las reivindicaciones 11 ó 12 siendo los microbios bacterias, hongos o micobacterias.

14. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento microbiano en un paciente, administrándosele también a dicho paciente otro agente antimicrobiano.

15. Uso según la reivindicación 14, siendo dicho otro agente microbiano rifampicina o isoniazid.

16. Un método para neutralizar endotoxina y/o inhibir el crecimiento microbiano en un producto in vitro que comprende el contacto del producto con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.