KR20210151188A - 뼈 및 관절 감염증의 치료 및 예방 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뼈 또는 관절 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 PlySs2 리신 또는 서열번호 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 이의 변이체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 (임의로 하나 이상의 항생제와 공동으로) 투여하는 단계로서, 상기 변이체가 그람 양성 박테리아에 대한 항균 및/또는 정균 활성을 포함하고, 상기 뼈 또는 관절 감염이 그람 양성 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 에피데르미디스 또는 스타필로코커스 아우레우스를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 활액에 형성된 그람 양성 박테리아 생물막, 예컨대 스타필로코커스 에피데르미디스에 의해 형성된 생물막을 예방 또는 훼손하는 방법도 개시되어 있다.

Description

뼈 및 관절 감염증의 치료 및 예방 방법

관련 출원의 인용

[1] 본 출원은 2019년 4월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/832,754호, 2019년 5월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/849,672호, 2019년 11월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/938,812호 및 2020년 1월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/964,755호의 이익을 주장하고, 그 출원일에 기반하며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

[2] 본 출원은 ASCII 형식의 전자문서로 제출된 서열 목록을 포함하는데, 해당 목록 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2020년 4월 10일에 생성한 상기 ASCII 복사본은 파일명이 0341_0020-00-304_ST25.txt로서, 크기는 37,401 바이트이다.

본 발명의 분야

[3] 본 발명은 일반적으로, 리신(들) 및 임의로 하나 이상의 항생제를 사용하여, 그람 양성 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스타필로코커스 에피데르미디스 (Staphylococcus epidermidis)으로 인한 뼈 및 인공 관절 감염증, 특히 골수염 및 인공 관절 감염증의 치료 및 예방에 관한 것이다.

[4] 미생물은 플랑크톤 형태와 생물막 형태의 2개의 서로 다른 생명체 형태로 분류될 수 있다. 플랑크톤 미생물은 자유롭게 떠 다니는 것으로, 신진대사가 활발하며 빠르게 복제한다. 이와는 대조적으로, 생물막 형태의 미생물은 다세포의 복잡한 3차원 구조로 존재한다. 이들은 성장이 정지 단계에 있어서 대사적으로 활동성이 덜하다.

[5] 일반적으로, 생물막은 미생물 세포를 표면, 예컨대 숙주 세포 표면에 부착한 후, 세포 응집, 성숙 및 후속 탈리를 포함하는 "단계들"에서 형성된다. 초기 부착이 이루어지는 동안, 피브리노겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴과 같은 숙주 단백질들이 표면에 흡수되어 초기막 (conditioning film)이 형성된다. 상기 흡수된 숙주 단백질들은, 박테리아 단백질과 숙주 단백질 간의 상호작용을 통해, 예컨대 박테리아 집락화를 증강시킨다.

[6] 표면에 세포의 초기 부착 후, 다층 세포 증식 뿐만 아니라 세포간 부착이 발생하여, 하나 또는 수개 종들의 미세집락 (microcolony) 형성이 절정에 달한다. 상기 단계는 부착된 세포들이 성장하여 그들 간에 상호작용하는 성숙 단계로 이어진다. 이 단계에서, 박테리아 세포들은, 예를 들어 해당 세포들을 에워싸서 생물막 망상구조를 안정화시키는 엑소폴리사카라이드의 분비를 시작한다. 성숙 과정에서는, 대형 생물막이 이들의 표면에서 플랑크톤 형태를 방출할 수 있으며, 그렇게 되면 이들이 분산되어 원위 부위에 대한 국소적 침습이나 씨딩을 더 유발하여, 완전히 새로운 주기를 개시하게 된다.

[7] 많은 난치성 감염증들은 여러가지 골감염증 및 임플란트 재료, 예컨대 인공 관절과 관련된 감염증과 같은 생물막 감염증이다. 이러한 감염증에서, 미생물들은 일반적으로 죽은 뼈나 임플란트에 부착하여 숙주 기전 뿐만 아니라 대다수의 항미생물제에도 견디는 생물막을 형성한다. 따라서, 항생제는 뼈 및 관절 감염증에 대해 저조한 활성을 나타내는 경우가 많기 때문에, 항생체 치료가 효과적이기 위해서는 통상적으로 수술과 병용하여 이러한 치료를 장기간에 걸쳐 하는 것이 필요하다.

[8] 상기 관점에서 보면, 뼈 및 관절 감염증을 치료하기 위해서는 생물막을 형성하는 박테리아 때문에 새로운 전략이 필요하다. 이러한 전략들에는 생물막을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 생물막을 형성하는 박테리아를 사멸시킬 수 있는 약물 및/또는 생물제제가 포함되어야 한다.

[9] 한 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 PlySs2 리신 또는 이의 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 뼈 또는 관절 감염증, 예컨대 골수염, 예를 들어, 급성 골수염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 뼈 또는 관절 감염증이 그람 양성 박테리아를 포함하는 것인, 상기 방법에 관한 것이다.

[10] 또한, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 PlySs2 리신 또는 이의 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 활액에 형성된 생물막의 예방 또는 제거를 위한 방법으로서, 상기 생물막이 그람 양성 박테리아에 의해 형성되는 것인, 상기 방법에 관한 것이다.

[11] 도 1은 상세한 설명에 기재된 리신 (서열번호 1) 및 상기 리신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 18)의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 서열번호 1은 해독 후 과정 동안 제거되어 244개의 아미노산 폴리펩타이드가 남게되는, 처음 메티오닌 잔기를 포함하는 245개의 아미노산 폴리펩타이드이다.
[12] 도 2는 실시예에 기재된 바와 같이 인간의 활액에서 스타필로코커스 에피데르미디스에 의해 형성된, 브롬화에티듐으로 염색된 생물막 구조에 대한 리신 처리의 영향을 도시한 것이다.
[13] 도 3은 실시예에 기재된 바와 같이 PlySs2 리신 (본원에서는 CF-301 및 엑시바카제로도 지칭함)으로 처리하기 전과 후에 인간의 활액에서 형성된 생물막의 형광 이미지를 도시한 것이다.
[14] 도 4는 실시예에 기재된 바와 같이 PlySs2 리신으로 처리한 후에 인간의 활액에서 생물막 붕괴를 보여주는 주사 전자 현미경 사진을 도시한 것이다.
[15] 도 5는 실시예에 기재된 바와 같이, 단독 또는 답토마이신과 조합된 엑시바카제 리신으로 처리한 후 뼈 1g당 랫트 경골의 박테리아 배양물의 정량 (log₁₀ cfu/g)을 도시한 것이다.
[16] 도 6A-6C는 실시예 5에 기술된 바와 같이 본 발명의 방법을 사용하는 치료를 위해 선택된 감염된 인공 무릎 관절 환자의 상태를 도시한 것이다. 도 6A는 환자의 인공 무릎 관절을 보여주는 X선 사진이다. 도 6B는 선택된 환자들 중 2명에서 관찰된 감염성 관절염 (septic arthritis)의 임상 증상을 도시한 것이다. 도 6C는 치료 후 감염성 관절염 환자들의 양호한 결과를 도시한 것이다.

정의

[17] 본 출원에서 사용되는 다음 용어들과 이의 동의어들은, 달리 문맥상 명시하지 않는 한, 하기 의미를 가질 것이다:

[18] "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면활성제, 분사제, 희석제, 비히클 등을 지칭한다. 이러한 담체는 물, 생리 식염수, 덱스트로오스 수용액, 글리세롤 수용액과 같은 멸균 액체, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등을 비롯한 오일일 수 있다.

[19] "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 첨가제, 부형제, 분산매, 가용화제, 코팅제, 보존제, 등장화제 및 흡수 지연제, 계면활성제, 분사제 희석제, 비히클 등을 지칭한다. 상기 담체(들)는 의약에서 통상적으로 사용되는 양으로 치료되는 대상체에게 유해하지 않다는 의미인 "허용가능해야" 한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 해당 조성물을 의도한 목적에 부적절하게 하지 않으면서 해당 조성물의 다른 성분들과 상용이 가능하다. 또한, 약제학적으로 허용가능한 담체는 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극 및 알러지 반응) 없이 본원에 제시된 대상체에게 사용하기에 적절하다. 부작용은 그 위험이 해당 조성물에 의해 제공되는 이익보다 클 때 "부적절하다". 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제의 비제한적인 예로는 인산염 완충 식염수 용액, 물 및 에멀전, 예컨대 오일/물 에멀젼 및 마이크로에멀젼과 같은 임의의 표준 약제학적 담체를 포함한다. 적절한 약제학적 담체는, 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Edition]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 자연계에 존재하지 않는 담체일 수 있다.

[20] "살균 (bactericidal)" 또는 "살균 (bactericidal)" 활성은 18~24 시간 동안 박테리아의 초기 대상군 중에서 적어도 3-log10 (99.9%) 정도 또는 그 이상의 감소까지 박테리아의 사멸을 유도하거나 박테리아를 사멸시킬 수 있는 특성을 가리킨다.

[21] "정균 (bacteriostatic)" 또는 "정균 (bacteriostatic)" 활성은 박테리아 세포의 성장을 억제하여 18~24 시간 동안 해당 박테리아의 초기 대상군 중에서 2-log10 (99%) 이상 및 3-log 이하의 감소를 유도하는 것을 비롯하여 박테리아 성장을 억제하는 특성을 지칭한다.

[22] "항균제"라고 하면 정균제와 살균제를 모두 지칭한다.

[23] "항생제"는 치사율 또는 증식 감소와 같은, 박테리아에 부정적인 영향을 미치는 특성을 갖는 화합물을 지칭한다. 항생제는 그람 양성 세균, 그람 음성 세균 또는 이들 모두에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 항생제는 박테리아에 있어서 세포벽 펩티도글리칸 생합성, 세포막 보전, 또는 DNA 또는 단백질 합성에 영향을 미칠 수 있다.

[24] "내약성"은 일반적으로 약물의 항균 활성에 대해 내성이 있는 박테리아를 지칭한다. 소정의 특정 방식으로 사용되는 경우, 내약성은 특히 항생제 내성을 가리킬 수 있다. 경우에 따라서는, 일반적으로 특정 항생제에 민감한 세균들은 해당 항생제에 대해 내성을 나타내어 내약성 미생물 또는 균주가 될 수도 있다. "다제내성" (multi-drug resistant: "MDR") 병원체는 각각 단일 요법으로 사용되는 적어도 2가지 부류의 항미생물성 약물에 대해 내성을 나타내는 병원체이다. 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)의 어떤 균주들은 메티실린 및/또는 반코마이신을 비롯한 수개의 항생제들에 대해 내성이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention]). 당업계의 통상의 기술자라면 누구나 약물 또는 항생제에 대한 박테리아의 감수성 또는 내성을 측정하는 통상적인 실험 기법들을 사용하여 해당 박테리아가 내약성이 있는지의 여부를 쉽게 결정할 수 있다.

[25] "유효량"은, 적절한 빈도 또는 투약 용법으로 적용되거나 투여되는 경우에, 박테리아 성장 또는 박테리아 부하를 예방, 감소, 억제 또는 제거하거나, 치료될 장애 (본원에서는 그람 양성 박테리아 병원체 성장 또는 감염)의 발병, 중증도, 지속 기간 또는 진행을 예방, 감소 또는 개선시키거나, 치료될 장애의 진전을 예방하거나, 치료될 장애의 퇴행을 유도하거나, 항생제 또는 정균 요법과 같은 또 다른 요법의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)을 증강시키거나 개선시키기에 충분한 양을 지칭한다.

[26] "공동 투여"는, 순차적인 방식으로 리신 및 항생제 또는 임의의 기타 항균제와 같은 2가지의 제제를 투여하는 것 뿐만 아니라, 이러한 제제들을 실질적으로 동시에 투여하는 방식으로, 예컨대 대상체에게 단일 혼합물/조성물로, 또는 개별적으로 제공되는 용량이지만 실질적으로 동시에, 예를 들어, 같은 날 또는 24시간 내에 서로 다른 시점에 투여되는 방식도 포함하고자 한다. 리신과 하나 이상의 추가의 항균제들의 이러한 공동 투여는 수일, 수주 또는 수개월까지 지속되는 지속적 치료로서 제공될 수 있다. 추가로, 해당 용도에 따라, 상기 공동 투여는 연속적이거나 동시적일 필요는 없다. 예를 들어, 해당 용도가, 예를 들어 관절이나 뼈의 감염증을 치료하기 위한 전신성 항균제로서 사용하는 용도인 경우, 리신은 추가의 항생제 사용 후 24시간 이내의 초기에만 투여될 수 있고, 이후 상기 추가의 항생제 사용은 리신의 추가적 투여 없이 지속될 수 있다.

[27] "대상체"는 포유동물, 식물, 하등 동물, 단세포 유기체 또는 세포 배양물을 지칭한다. 예를 들어, "대상체"라는 용어는, 박테리아 감염, 예를 들어, 그람 양성 박테리아 감염에 걸렸거나 이에 걸리기 쉬운 유기체, 예컨대 원핵생물과 진핵생물도 포함하고자 한다. 대상체의 예로는 표유동물, 예컨대 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트 및 유전자이식된 인간이 아닌 동물들이 포함된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간, 예컨대 그람 양성 박테리아에 의한 감염증을 앓고 있거나, 이러한 감염증을 앓게 될 위험에 처해 있거나, 또는 이러한 감염증에 걸리기 쉬운 인간이며, 이러한 감염증은 전신성, 국소성, 또는 그 밖에 특정한 장기 또는 조직에 집중되거나 한정되든지의 여부와는 상관없다.

[28] "폴리펩타이드"는 일반적으로 적어도 약 30개의 아미노산 잔기들로부터 만들어진 중합체를 가리킨다. "폴리펩타이드"라는 용어는 본원에서 "단백질"과 "펩타이드"라는 용어와 서로 교환하여 사용된다. 상기 용어는 분리된 형태의 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 이의 활성 단편 및 유도체도 포함한다. 또한, "폴리펩타이드"라는 용어는 리신 폴리펩타이드를 포함하고, 예를 들어 리신 기능을 유지하는 융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드도 포함한다. 해당 내용의 전후사정에 따라, 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드는 자연 발생 폴리펩타이드, 또는 재조합, 유전자조작 또는 합성 제조된 폴리펩타이드일 수 있다. 특별한 리신 폴리펩타이드는, 예를 들어 효소적 또는 화학적 절단에 의해 천연 단백질로부터 유래되거나 이로부터 제거될 수 있거나, 또는 통상적인 펩타이드 합성 기법들 (예컨대, 고체상 합성) 또는 분자 생물학 기법들 (예컨대, 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시된 것들)을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 전략적으로 절단 또는 분절화시켜, 예를 들어 동일하거나 적어도 하나의 공통의 표적 박테리아에 대해 리신 활성을 유지하는 활성 단편들을 생성해낼 수 있다.

[29] "융합 폴리펩타이드"는, 보통 서로 다른 특성 또는 기능성을 지니는 2개 이상의 도메인 또는 분절을 통상적으로 갖는 융합된 발현 산물을 생성하는, 2개 이상의 핵산 분절들의 융합으로 생성된 발현 산물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "융합 폴리펩타이드"라는 용어는 직접적으로 또는 아미노산 또는 펩타이드 링커를 통해, 공유 결합된 2개 이상의 이종성 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드도 가리킨다. 상기 융합 폴리펩타이드를 형성하는 폴리펩타이드는 일반적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결되지만, C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, N-말단에서 C-말단으로 연결될 수도 있다. "융합 폴리펩타이드"라는 용어는 "융합 단백질"이라는 용어와 서로 교환하여 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구조를 "~를 포함하는 폴리펩타이드"라는 개방형 표현은 융합 폴리펩타이드와 같이 언급된 구조보다 큰 분자를 포함한다.

[30] "이종성"은 자연적으로 인접하지 않은 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열들을 가리킨다. 예를 들어, 본 발명의 내용에서, "이종성"이라는 용어는 2개 이상의 폴리펩타이드의 조합 또는 융합을 기술하는데 사용될 수 있는데, 이 경우 융합 폴리펩타이드는, 예를 들어 증진된 용균 활성을 가질 수 있는 리신 폴리펩타이드 및 양이온성 및/또는 다가양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드, 스시 (sushi) 펩타이드 (문헌 [Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8): 1202-19 (2008)]), 디펜신 펩타이드 (문헌 [Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)]), 소수성 펩타이드 및/또는 항미생물성 펩타이드와 같이 자연계에서 통상적으로 발견되지 않는다. 2개 이상의 리신 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편이 이러한 정의에 포함된다. 이들은 용균 활성을 갖는 융합 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다.

[31] "활성 단편"은, 해당 단편을 취한 분리된 폴리펩타이드의 하나 이상의 기능 또는 생물학적 활성, 예를 들어 S. 아우레우스 또는 S. 에피데르미디스와 같은 하나 이상의 그람 양성 박테리아에 대한 항균 활성을 보유하는 폴리펩타이드의 일부분을 가리킨다.

[32] "상승적" 또는 "초상가적 (Superadditive)"은, 독립적으로 작용하는 2개의 제제의 효과의 합을 초과하는 조합의 상기 두 물질에 의해 유도되는 유익한 효과를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상승적 또는 초상가적 효과는 독립적으로 작용하는 2개의 제제의 효과의 합을 유의하게, 즉 통계상으로 유의하게 초과한다. 활성 성분들 중 하나 또는 모두는, 역치 이하의 수준 (subthreshold level), 즉 해당 활성 물질이 개별적으로 사용되는 경우에 효과가 없거나 매우 제한적인 효과를 나타내는 수준으로 사용될 수 있다. 상기 효과는 본원에 기재된 체커보드 분석 (checkerboard assay)과 같은 분석에 의해 측정될 수 있다.

[33] "치료"는, 인간을 비롯한 대상체가 직접 또는 간접적으로 장애를 치유하거나, 병원체를 근절시키거나, 또는 대상체의 병태를 개선시킬 목적으로 의료적 보조를 받게 되는 임의의 과정, 행위, 적용, 요법 등을 지칭한다. 또한, 치료는 발병의 감소, 증상의 경감, 재발의 근절, 재발의 예방, 발병의 예방, 발병 위험의 감소, 증상의 개선, 예후의 개선 또는 이들의 조합도 가리킨다. "치료"는 대상체에서 박테리아의 대상군, 증식률 또는 병독성을 감소시켜, 해당 대상체의 박테리아 감염, 또는 장기, 조직 또는 환경의 박테리아 오염을 제어하거나 감소시키는 것도 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 발병을 감소시키는 "치료"는, 예를 들어 특정 환경에서 (그것이 대상체든지 환경이든지 간에) 적어도 하나의 그람 양성 박테리아의 성장을 억제하는데 효과적이다. 다른 한편으로는, 이미 확립된 감염증의 "치료"의 경우에는, 해당 감염 또는 오염의 원인이 되는 그람 양성 박테리아의 대상군을 감소시키거나, 사멸시키거나, 이의 증식을 억제하고/하거나, 이를 근절시키는 것을 지칭한다.

[34] "예방하는"은 박테리아 감염과 같은 장애의 발병, 재발, 전염, 개시 또는 확립의 예방을 포함한다. 본 발명을 감염증 확립의 완전한 예방 또는 예방에 제한하고자 하는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 발병이 지연되거나, 차후에 걸리는 질병의 중증도 또는 해당 질병에 걸리는 가능성이 감소되며, 이러한 것들도 예방의 예를 구성한다.

[35] "걸린 질병 (Contracted disease)"은 열병, 패혈증 또는 세균혈증의 검출과 같은 임상 또는 준임상형 증상으로 나타나는 질병 뿐만 아니라, 이러한 병리학과 관련된 증상들이 아직 나타나지 않았을 경우에는 (예컨대, 배양물 중의) 세균성 병원체의 성장에 의해 검출될 수 있는 질병들도 지칭한다.

[36] 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편의 내용에서 "유도체"는, 예를 들어 용균 활성과 같은 해당 폴리펩타이드 활성에 실질적으로 유해한 영향을 미치거나 이를 훼손하지 않는 아미노산 이외의 하나 이상의 화학적 모이어티를 함유하도록 변형된 폴리펩타이드를 망라하고자 한 용어이다. 상기 화학적 모이어티는, 예컨대 아미노 말단 아미노산 잔기, 카복시 말단 아미노산 잔기 또는 내부 아미노산 잔기를 통해, 해당 펩타이드에 공유 결합될 수 있다. 이러한 변형은 자연적 또는 비자연적일 수 있다. 특정 실시형태에서, 비자연적 변형은 반응성 모이어티에 보호기 또는 캡핑기의 부가, 항체 및/또는 형광성 표지와 같은 검출가능 표지의 부가, 글리코실화의 부가 또는 변형, 또는 PEG (페길화)와 같은 벌킹기 (bulking group)의 부가 및 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 기타 변형법을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 비자연적 변형은 N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화와 같은 캡핑 변형일 수 있다. 리신 폴리펩타이드에 부가될 수 있는 예시적인 보호기로는 t-Boc 및 Fmoc가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 통상적으로 사용되느 형광 표지 단백질, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein: RFP), 시안 형광 단백질 (cyan fluorescent protein: CFP), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein: YFP) 및 mCherry는, 세포성 단백질의 정상적인 기능을 방해하지 않으면서 폴리펩타이드에 공유 또는 비공유 결합될 수 있는 콤팩트 단백질이다. 특정 실시형태에서, 형광 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 해당 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류부 또는 하류부에 삽입된다. 이로써 세포의 기능 또는 부착되는 폴리펩타이드의 기능을 방해하지 않는 융합 단백질 (예컨대, 리신 폴리펩타이드::GFP)을 생성하게 된다. 단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 접합은 여러 약제학적 단백질들의 순환 반감기를 연장시키는 방법으로서 사용되어 왔다. 따라서, 폴리펩타이드 유도체, 예컨대 리신 폴리펩타이드 유도체의 내용에서, "유도체"라는 용어는 하나 이상의 PEG 분자들의 공유적 부착에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드, 예컨대 리신 폴리펩타이드를 망라한다. 리신 폴리펩타이드, 예컨대 페길화 리신 폴리펩타이드는, 생물학적 및 치료학적 활성을 유지하면서, 페길화되지 않은 폴리펩타이드에 비해서 연장된 순환 반감기를 나타낼 것으로 예상된다.

[37] "아미노산 서열 동일성 퍼센트"는, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 필요에 따라 서열들을 정렬하고 갭들을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 리신 폴리펩타이드 서열과 같은 기준 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보물질 서열 내의 아미노산 잔기의 비율을 지칭한다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST와 같은 공중이 이용가능한 소프트웨어, 또는 예를 들어, DNASTAR에서 시판중인 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 2개 이상의 폴리펩타이드 서열들은 0~100% 동일하거나, 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 본 발명의 내용에서, 2개의 폴리펩타이드는, 아미노산 잔기들 중 적어도 80% (통상 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 및 통상 적어도 약 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%)가 동일한 경우에 "실질적으로 동일하다". 본원에 기술된 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"라는 용어는 펩타이드에도 마찬가지로 적용된다. 따라서, "실질적으로 동일한"이라는 용어는, 본원에 기재된 것들과 같은 분리된 폴리펩타이드 및 펩타이드의 돌연변이화되거나, 절단되거나, 융합되거나, 또는 그도 아니면 서열 변형된 변이체 및 이의 활성 단편 뿐만 아니라, 기준 (야생형 또는 다른 온전한) 폴리펩타이드와 비교하였을 때 실질적인 서열 동일성 (예컨대, 상기에서 언급된 하나 이상의 방법으로 측정시, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 또는 적어도 99%의 동일성)을 갖는 폴리펩타이드도 망라할 것이다. 2개의 아미노산 서열은, 아미노산 잔기들 중 적어도 약 80%가 동일 (통상 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%의 동일성, 또는 적어도 약 99%의 동일성)하거나, 보존적 치환을 나타내는 경우, "실질적으로 상동성이다". 본 발명의 폴리펩타이드의 서열들은 본원에 기재된 폴리펩타이드, 예컨대 리신 폴리펩타이드의 아미노산들 중 하나 이상 또는 수개 또는 10% 이하 또는 15% 이하 또는 20% 이하가 유사한 아미노산 치환 또는 보존적 아미노산 치환으로 치환되는 경우에 실질적으로 상동성이며, 이 경우 생성된 폴리펩타이드, 예컨대 본원에 기재된 리신은, 기준 폴리펩타이드, 예컨대 본원에 기재된 리신의 적어도 하나의 활성, 항균 효과 및/또는 박테리아 특이성을 가진다.

[38] 본원에 사용되는 "보존적 아미노산 치환"이란 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 계열들로는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다.

[39] "생물막"은 박테리아 및/또는 숙주로부터 유래한 성분들로 이루어질 수 있는 수화된 중합체성 매트릭스에서 표면에 부착하여 응집하는 박테리아를 지칭한다. 생물막은 세포가 생물 또는 무생물 표면 상에 서로 부착되는 미생물들의 응집체이다. 이러한 부착 세포들은 흔히 세포외 중합체성 물질 (extracellular polymeric substance: EPS)로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 매트릭스 내에 매립된다. 점액으로도 지칭되는 생물막 EPS (점액으로 기술되는 모든 것들이 생물막인 것은 아님) 또는 플라크는 일반적으로 세포외 DNA, 단백질 및 폴리사카라이드로 구성된 중합체성 집성체이다.

[40] 특정 박테리아에 대해 사용하기에 적합한 항생제의 내용에서 "적절(합)한"이란 내성이 차후에 발생하더라도 이러한 박테리아들에 대해 효과적인 것으로 밝혀진 항생제를 지칭한다.

뼈 및 관절 감염증

[41] 본 발명자는 놀랍게도 특정 생물제제, 즉 리신이, 메티실린 내성의 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA) 및 다제 내성 (MDR) 스타필로코커스 에피데르미디스를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스 및 스타필로코커스 에피데르미디스와 같은 뼈 및 관절 감염증을 유발할 수 있는 생물막 형성 박테리아를 사멸시키는데 사용될 수 있음을 알아내었다. 또한, 리신은 놀랍게도, 예컨대 활액 또는 뼈에 있는 스타필로코커스 에피데르미디스 또는 스타필로코커스 아우레우스에 의해 형성된 성숙한 생물막을 훼손시킬 수도 있다. 이러한 항균제들은 해당 세포 내부에서 펩티도글리칸을 분해하여, 숙주 박테리아의 용균을 유도함으로써 감염된 박테리아로부터 후대 개체의 파지를 유리시키는 박테리오파지 인코딩된 가수분해 효소이다. 리신은 박테리아 세포 외부에서 펩티도글리칸을 공격함으로써 병원성 박테리아에 대해 작용한다. 일반적으로, 리신은 박테리아 종에 매우 특이적이고, 위장관의 항상성을 유지하는데 도움이 될 수 있는 공생 관계의 장 박테리아를 비롯한 표적이 아닌 유기체들은 거의 용해시키지 않는다.

[42] 한 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 PlySs2 리신을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 뼈 또는 관절 감염증을 치료하는 방법으로서, 상기 뼈 또는 관절 감염증이 그람 양성 박테리아를 포함하는 것인, 상기 방법에 관한 것이다.

[43] 일부 실시형태에서, 뼈 감염증은 골수염, 즉 감염 유기체에 대한 뼈의 염증 반응이다. 일부 실시형태에서, 뼈 감염증, 에컨대 골수염은 그람 양성 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스 또는 MRSA에 기인한 것이다. 일부 실시형태에서, 그람 양성 박테리아는 생물막을 형성하고 뼈 모세포 내로 들어가 그 안에서 생존함으로써, 해당 그람 양성 박테리아가 면역계와 갖가지 통상적인 항생제들을 회피할 수 있도록 하는 능력을 가진다.

[44] 일부 실시형태에서, 골수염은 급성 골수염이다. 다른 실시형태에서, 뼈 감염증은 만성 골수염이다. 골수염은 감염과 효과적인 치료 사이의 지연 시간이 4-6주를 초과하는 경우에 만성으로 간주된다.

[45] 일부 실시형태에서, 골수염은 대퇴골, 경골, 상완골 및 요골과 같은 긴 뼈의 감염을 포함한다. 다른 실시형태에서, 골수염은 척추, 특히 요추, 천골 및 골반의 감염을 포함한다. 일반적으로, 어린이는 긴 뼈에 골수염이 발생하고 성인은 척추에 골수염이 발생한다.

[46] 일부 실시형태에서, 골수염은 외인성 골수염이다. 이러한 실시형태들에서, 외인성 골수염은 뼈가 피부에서부터 확장되어 나가서, 잠재적인 감염성 유기체가 농양이나 화상, 자상, 또는 개방성 골절과 같은 기타 외상으로부터 유입될 수 있는 경우에 발생할 수 있다. 다른 실시형태에서, 외인성 골수염은 임플란트 관련 골수염이다. 일반적으로, 임플란트는 금속판, 핀, 막대, 와이어 또는 나사와 같은 기계적 장치로서, 골절된 뼈들의 단부를 안정화하여 결합하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 감염증을 치료하는데 항생제만이 사용되는 경우, 임플란트 관련 골수염은 만성이 된다.

[47] 일부 실시형태에서, 골수염은 혈행성 골수염이다. 혈행성 골수염은 농가진, 종기증 (지속적인 종기), 수두 (chickenpox)의 감염 병변, 및 부비동, 귀, 치아, 연조직, 호흡기 및 비뇨생식기 감염과 같은 기존의 감염증으로부터 유기체들이 확산함으로써 걸릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 비뇨생식기 감염은 천골 또는 장골의 골수염을 유발할 수도 있다.

[48] 일부 실시형태에서, 만성 골수염은 항생제 도입 이전 시대 또는 유년 시절에 급성 골수염을 앓았던 환자들에게서 발생한다. 이러한 감염은, 예를 들어 죽은 뼈에 부착되어 있는 생물막의 무증상 지속으로 인해 수십 년의 무증상 기간 후에 재발할 수도 있다.

[49] 다른 실시형태에서, 본 방법의 리신은 관절 감염증을 치료하는데 사용된다. 감염된 관절에는 감염된 엉덩이, 무릎, 발목, 어깨, 팔꿈치 또는 손목 관절이 포함될 수 있다. 일반적으로, 감염된 관절은 무릎 관절이나 고관절이다.

[50] 일부 실시형태에서, 감염된 관절은 자연 관절이다. 자연 관절의 감염 (본원에서는 자연 관절의 감염성 관절염이라고도 함)은 자상과 같은 관통상이 관절 근처 또는 위쪽에 발생하여 박테리아가 해당 관절에 직접 침투할 수 있도록 하는 경우에 발생할 수 있다. 다른 실시형태에서, 관절 감염은 원위에 있는 감염으로부터 박테리아가 혈류를 통해 자연 관절로 확산할 때 발생한다.

[51] 다른 실시형태에서, 감염된 관절은, 예를 들어 인공 관절의 감염성 관절염을 포함하는 인공 관절이다. 인공 관절에는 엉덩이, 무릎, 어깨, 팔꿈치 및 발목 인공 관절이 포함될 수 있다. 일반적으로, 인공 관절은 인공 고관절 또는 무릎 관절이다.

[52] 일부 실시형태에서, 본 발명의 인공 관절 감염은 수술 후 1년 이내에 발생한다. 이러한 감염은 수술시 미생물의 도입을 통해 개시될 수 있다. 이는 인공보철물 또는 인공보철물 주위 조직에 대한 직접적인 접촉 또는 에어로졸화 오염을 통해 발생할 수 있다. 일단 미생물이 임플란트 표면과 접촉하면, 이들은 그 표면에서 집락화할 수 있다.

[53] 다른 실시형태에서, 인공 관절 감염은 인접 부위 감염의 확산으로 인해 발생한다. 예를 들어, 수술 후 초기 기간에는, 표재성 수술 부위 감염이 진행되어 해당 인공보철물이 관여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 인공 관절 감염은 혈류를 통해 원위 감염 부위의 유기체 확산으로 인해 발생한다.

[54] 일부 실시형태에서, 인공 관절 감염은 재발한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 관절 감염은 재발성 다제 내성 감염, 예컨대 재발성 다제 내성의 S. 에피데르미디스 인공 무릎 관절 감염 (PKI)이다.

[55] 일반적으로, 인공 관절 감염은, 감염된 인공 관절에서 얻은 적어도 2개의 개별 조직 또는 체액 샘플의 배양물에 의해 병원체가 분리되는 경우, 또는 하기의 6가지 기준들 중 4개가 존재하는 경우에 나타난다: 혈청 적혈구 침강 속도 (ESR)와 혈청 C-반응성 단백질 (CRP) 농도의 증가, 활액 백혈구 수의 증가, 활액 호중구 백분율 (PMN%)의 증가, 감염된 관절에 고름 존재, 인공보철물 주위 조직 또는 체액의 한 배양물에서의 미생물의 분리, 또는 x400 배율에서 인공보철물 주위 조직의 조직학적 분석에서 관찰된 5개의 고배율 시야에서 고배율 시야당 5개 초과의 호중구.

[56] 일반적으로, 병원체를 평가하기 위해 인공 관절에서 얻은 유체는 활액이다. 본원에 사용된 바와 같이, "활액"은 활막성 관절강에서 발견되는 점성 유체이다. 활액의 주된 역할은 관절이 움직이는 동안 활막성 관절의 관절 연골 사이의 마찰을 줄이는 것이다.

[57] 일부 실시형태에서, 활액 샘플은 흡인에 의해 수득될 수 있다. 인공 관절 감염의 지표로서 상기 흡인물의 총 유핵 세포수 및 호중구 백분율에 대해 평가할 수 있다. 일반적으로, 마이크로리터당 총 유핵 세포의 양 및/또는 호중구의 비율은, 인공 관절 감염증을 앓고 있지 않은 대상체에 비해서, 인공 관절 감염을 앓고 있는 대상체에서 수득한 활액에서 더 크다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마이크로리터당 1,100개의 총 유핵 세포의 역치 및/또는 인공 관절을 가진 대상체로부터의 활액 중 64% 호중구의 역치는, 인공 관절 감염, 예컨대 인공 무릎 관절 감염을 나타낸다.

[58] 일부 실시형태에서, 호중구의 양을 측정하는 대신 또는 이에 더해, 예컨대 본원에 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Parvizi et al., “Diagnosis of periprosthetic joint infection: the utility of a simple yet unappreciated enzyme.”, J. Bone Joint Surg. Am., 2011, 93:2242-2248]에 기재된 바와 같이, 요로 감염증 진단을 위한 농뇨 측정에 널리 이용가능한 색도 스트립을 사용하여, 호중구에 존재하는 효소인 백혈구 에스테라제의 수준을 평가할 수도 있다.

[59] 그러나, 보다 통상적으로는, 활액 샘플을 배양하여 인공 관절 감염의 진단이 되는지의 여부를 결정하고, 감염 병원체(들)를 확인한다. 이러한 정보는 치료 중에 사용된다면 항생제에 대한 선택을 알려줄 수도 있다. 이러한 실시형태들에서, 흡인된 활액을 수집시 혈액 배양 병에 혼입하거나, 미생물학 실험실로 이송하여 고체 및/또는 액체 배지에 혼입할 수도 있다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Fehring et al., “Aspiration as a guide to sepsis in revision total hip arthroplasty,” 1996, J. Arthroplasty, 11:543-547]을 참조한다.

원인 미생물

[60] 일부 실시형태에서, 본 발명의 뼈 및/또는 관절 감염증은 그람 양성 박테리아, 예컨대 스트렙토코커스 갈로리티쿠스 (Streptococcus gallolyticus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia)를 비롯한 스트렙토코커스 종에 의해 유발된다. 그러나, 보다 일반적으로는, 뼈 및/또는 관절 감염증은 스타필로코커스 종, 예컨대 S. 아우레우스 또는 S. 에피데르미디스에 의해 유발된다. 다른 실시형태들에서, 스타필로코커스 종은 스타필로코커스 에피데르미디스, 스타필로코커스 시뮬란스 (simulans), 스타필로코커스 카프라에 (caprae), 스타필로코커스 루그두넨시스 (lugdunensis) 또는 이들의 조합과 같은 응고효소 음성 스타필로코커스 종이다. 일반적으로, 스타필로코커스 에피데르미디스는 뼈 및/또는 관절 감염증에서 확인되는 응고효소 음성 스타필로코커스 종이다.

[61] 일부 실시형태에서, 본 발명의 뼈 및/또는 관절 감염증은 엔테로코커스 (Enterococcus) 속으로부터 유래한 그람 양성 박테리아 종에 의해 유발된다.

[62] 일부 실시형태에서, 본 발명의 뼈 및/또는 관절 감염증은 다균성 감염에 의해 유발된다. 예를 들어, 엔테로코커스 종과 스타필로코커스 종의 조합은 뼈 및/또는 관절 감염증의 원인 물질로 식별될 수 있다. 구체적인 감염 구조물들과 일반적으로 관련이 있는 원인 미생물들의 예를 하기 표 1에 나타내었다.

리신

[63] 대상체에서 뼈 및 관절 감염증을 치료 및/또는 예방하고/하거나 생물막 형성을 억제 또는 훼손시키기 위한 본 발명의 방법은, 본원에 기재된 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를, 임의로 본원에도 기재된 바와 같은 하나 이상의 항생제들과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 그람 양성 박테리아에 대한 살균 및/또는 정균 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 내성이 낮은 경향을 나타내고, 항생제 내성을 억제하고/하거나 통상적인 항생제와 함께 동반 상승효과를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 박테리아 응집, 생물막 형성을 억제하고/하거나, 뼈 또는 관절 감염증이 있는 대상체에서 생물막을 비롯한 생물막을 감소 또는 근절시킨다.

[64] 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 살균 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Mueller, et al., 2004, Antimicrob Agents Chemotherapy, 48:369-377]에 기술된 바와 같은 시간 사멸 분석을 사용하여 시험관 내에서 평가될 수 있다.

[65] 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 정균 활성도 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 성장 곡선은, 예컨대 인간 혈청 (caMHB/50% HuS)에 보충된 양이온 보정된 뮐러 힌튼 (Mueller Hinton) II 액체배지 중 (최종 농도 50%)에서 또는 100% 혈청 중에서 또는 비표준 배지 [caMHB가 말 혈청의 경우 25% 및 DTT (caMHB-HSD)의 경우 0.5 mM 보충된 배지] 중에서 수행될 수 있다. 그람 양성 박테리아는 리신으로 현탁될 수 있고, 배양 탁도는, 예를 들어 SPECTRAMAX® M3 다중 모드 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용하여, 교반하면서 600 nm에서의 광학 밀도에서 측정할 수 있는데, 예컨대 24℃에서 11시간 동안 매 1분마다의 판독한다. 배가 시간은 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Saito et al, 2014, Antimicrob Agents Chemother 58:5024-5025]에 기술된 방법에 따라 통기성 플라스크에서 증식시킨 배양물의 대수 증식기에서 계산할 수 있는데, 이를 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 부재 하에서의 배양물의 배가 시간과 비교하였다.

[66] 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 인간 활액과 같은 활액의 존재 하에 리신 활성을 나타낸다. 활액에서의 리신의 활성을 평가하는 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있고 실시예에도 기재되어 있다. 간략히 설명하면, MIC 값 (즉, 대조군에 비해 박테리아 성장의 적어도 80%를 억제하기에 충분한 펩타이드의 최소 농도)은, 예컨대 모체 리신 또는 리신의 부재과 비교하여 활액에서의 리신과 이의 MIC 값에 대해 측정할 수 있다.

[67] 보다 구체적으로는, 리신에 대한 MIC 값은 생리학적 염 농도 및 활액, 예컨대 인간 활액이 보충된 MHB (뮐러-힌튼 액체배지) 중에서, 예를 들어 S. 에피데르미디스 또는 S. 아우레우스에 대해 측정될 수 있다. 예컨대, S. 에피데르미디스에 대한 리신의 최소 억제 농도 (MIC)는, 비표준 배지 [인간 활액으로 50%까지 보충된 caMHB (caMHB-HSF)] 중에서 CLSI (임상 검사 표준 연구소)의 방법 (M07-A11, 2018, 전문이 참조로 본원에 포함됨)에 따라 액체배지 미량희석법 (BMD)을 사용하여 측정할 수 있다. 실시예를 참조한다.

[68] 일부 실시형태에서, 리신, 변이체 리신, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는, 예를 들어 인간 혈청 또는 활액의 존재 하에 박테리아를 억제하는데 필요한 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)를 감소시킨다. 상기 MIC를 평가하는데에는 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 체커보드 분석을 사용하여 항생제 농도에 대한 리신의 효과를 측정한다. 상기 체커보드 분석은 액체배지 미량희석법에 의한 MIC 측정을 위한 CLSI 방법을 변형시킨 것을 기초로 한다 (전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA] 및 [Ceri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776]을 참고).

[69] 체커보드는 먼저, 예컨대 96-웰 폴리프로필렌 미량역가 플레이트의 컬럼들을 준비하는 것으로 구축되며, 이 경우 각 웰들은 수평 축을 따라 2배 희석된 동량의 항생제를 함유하게 된다. 별도의 한 플레이트에는, 각 웰들이 수직 축을 따라 예컨대 2배 희석된 동량의 리신을 함유하는 비교가능한 가로열들을 준비한다. 그런 다음, 리신과 항생제 희석액을 혼합하여, 각 칼럼에는 일정량의 항생제와 리신의 2배 희석액을 보유하도록 하는 한편, 각 열에는 일정량의 리신과 항생제의 2배 희석액을 함유하도록 한다. 따라서, 각 웰에는 리신과 항생제의 고유한 조합을 함유하고 있다. 예를 들어, 박테리아를 caMHB-HSF 중 1x10⁵ CFU/ml의 농도로 해당 약물 조합에 첨가한다. 이어서, 각 약물 단독 및 조합의 경우의 MIC를, 예컨대 대기 중 37℃에서 16시간 후에 기록한다. 부분 억제 농도 (fractional inhibitory concentration)들의 합 (∑FIC)을 각 약물에 대해 계산하고, 최소 ∑FIC 값 (∑FICmin)을 리신/항생제 조합의 효과를 측정하는데 사용한다.

[70] 박테리아 응집의 억제는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 워커 (Walker) 등의 문헌, 즉 문헌 [Walker et al., 2013, PLoS Pathog, 9:e1003819]에 기술된 방법을 사용할 수 있다.

[71] 시험관 내에서 생물막 형성을 억제 또는 감소시키는 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 능력을 평가하는 방법들은 당업계에 널리 알려져 있으며, 변형을 가한 액체배지 미량희석 최소 억제 농도 (MIC) 방법의 변형법을 포함한다 (전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776] 및 [Schuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18]을 참조). 최소 생물막 제거 농도 (MBEC)를 평가하기 위한 이러한 방법에서, 예를 들어 S. 아우레우스 균주 또는 S. 에피데르미디스 균주의 신선한 콜로니를 배지, 예컨대 TSBg [0.2% 글루코스를 보충한 대두카제인소화 액상배지 (tryptic soy broth)] 중에서 1:100으로 희석된 인산염 완충 용액 (PBS)에 현탁시키고, 예를 들어 0.15 ml의 분취량으로 캘거리 생물막 장치 (Calgary Biofilm Device: 96개의 폴리카보네이트 peg를 함유하는 뚜껑이 있는 96-웰 플레이트; lnnovotech Inc.)에 첨가하여, 예를 들어 24시간 동안 37℃에서 항온배양시킨다. 이후, 생물막을 세척하고, 예를 들어 TSBg 중에서, 예컨대 24시간 동안 37℃에서 리신의 2배 연속 희석물로 처리한다. 처리 후, 웰들을 세척하고, 예컨대 37℃에서 통풍 건조시킨 후, 예를 들어 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 10분감 염색하였다. 염색 후, 생물막은 예를 들어 33% 아세트산 중에서 탈염색시키고, 예컨대 추출된 크리스탈 바이올렛의 OD600을 측정한다. 각 샘플의 MBEC는 크리스탈 바이올렛 정량에 의해 평가된 생물막 생체량 (biomass)의 >95%를 제거하는데 필요한 최소 리신 농도이다.

[72] 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신, 변이체 리신 및 이의 단편은, 본원에 기재된 바와 같은 뼈 및/또는 관절 감염증이 있는 대상체로부터 수득된 그람 양성 박테리아 용해물에 대해 평가한다. 이러한 분리주를 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 본원에 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Schmidt-Malan et al., Diag. Microbiol. Infect. Dis. 85:77-79]에 기술되어 있다.

[73] 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 리신은 WO 2013/170015호 및 WO 2013/170022호 (본 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 PlySs2 리신을 포함한다. 본원에 사용된 "PlySs2 리신", "PlySs2 리신들", "PlySs2" "엑시바카제" 및 "CF-301"라는 용어들은 서로 교환하여 사용되며, WO 2013/170015호 및 WO 2013/170022호에 기재된 바와 같은 본원에 서열번호 1로 기재된 (첫 메티오닌 잔기가 존재하거나 존재하지 않는) PlySs2 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 스트렙토코커스 수이스 (suis) 게놈의 프로파지 (prophage) 내에서 인코딩된 항-스타필로코커스 리신으로 확인되었던 PlySs2는 하기 표 2에 설명된 박테리아에 대해 살균 및 정균 활성을 나타낸다.

[74] 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 리신은 서열번호 1의 PlySs2 리신이다. 서열번호 1의 PlySs2 리신은 세포벽에 결합된 C-말단 도메인 (도 1)에 연결된 촉매성 N-말단 도메인 (도 1)에 의해 규정되는 대부분의 박테리오파지 리신들의 특징적인 도메인 배열을 갖는다. N-말단 도메인은 리신 및 기타 박테리아 세포벽을 변형시키는 효소들에서 공통되는 시스테인-히스티딘 의존성 아미도하이드롤라제/펩티다제 (CHAP) 계열에 속한다. C-말단 도메인은 보통 리신의 세포벽 결합 요소를 형성하는 SH3b 계열에 속한다. 도 1은 음영 영역으로 나타낸 N- 및 C-말단 도메인을 갖는 서열번호 1의 PlySs2 리신을 도시한 것이다. N-말단 CHAP 도메인은 LNN으로 시작하는 첫 번째로 음영 처리된 아미노산 서열 영역에 해당하고, C-말단 SH3b 도메인은 RSY로 시작하는 두 번째로 음영 처리된 영역에 해당한다.

[75] 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적절한 리신은 하기의 리신들 중 하나 이상을 포함한다: pp55 (서열번호 3), pp61 (서열번호 4), pp65 (서열번호 5), pp296 (서열번호 6), pp324 (서열번호 7), pp325 (서열번호 8), pp338 (서열번호 9), pp341 (서열번호 10), pp388 (서열번호 11), pp400 (서열번호 12), pp616 (서열번호 13), pp619 (서열번호 14), pp628 (서열번호 15), pp632 (서열번호 16) 및 pp642 (서열번호 17).

[76] 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 변이체 리신을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 리신 변이체는 기준 리신의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유하는 서열번호 1에 대한 적어도 하나의 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 리신은 S. 아우레우스 및 S. 에피데르미디스를 비롯한 광범위한 그람 양성 박테리아에 대한 용균 및/또는 정균 효과를 비롯한 항균 활성과, 응집을 억제하고, 생물막 형성을 억제하고/하거나 생물막을 감소시키는 능력을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신 변이체는 그람 양성 박테리아를 항생제에 보다 민감하게 만든다.

[77] 일부 실시형태에서, 본 방법에 사용하기에 적절한 리신 변이체는 서열번호 1과 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 분리된 폴리펩타이드 서열을 포함하는데, 이 경우 상기 변이체 리신은 본원에 기재된 바와 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PlySs2 리신의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유한다.

[78] 리신 변이체는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 WO 2013/170015호 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이 제조할 수 있는데, 예를 들어 서열번호 1의 PlySs2 리신을 생성하는 숙주에서 부위 특이적 돌연변이 유발법 또는 돌연변이 유발법을 통해 제조하며, 이러한 변이체들은 본원에 기술된 하나 이상의 생물학적 기능을 보유한다. 예를 들어, 당업자라면 누구나, 예컨대 서열번호 1의 PlySs2 리신의 CHAP 도메인 및/또는 SH3b 도메인에 대한 치환물 또는 대체물을 합리적인 수준으로 만들어 시험할 수 있다. Genbank 데이터베이스에 대한 서열 비교는, CHAP 및/또는 SH3b 도메인 서열 중 하나 또는 이들을 모두 사용하거나 서열번호 1의 PlySs2 리신 전체 아미노산 서열을 사용하여 수행하여, 예를 들어 치환 아미노산을 확인할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 PlySs2 아미노산 서열에서 발린 아미노산 잔기 19에서 발린을 알라닌으로 대체한 돌연변이 또는 변이체는 활성이어서, 서열번호 1의 PlySs2 리신과 유사하고 그만큼 효과적인 방식으로 그람 양성 박테리아를 사멸시킬 수 있다.

[79] 또한, 도 1에 도시된 바와 같이, CHAP 도메인은 서로 다른 폴리펩타이드들의 CHAP 도메인에서 특징적이고 보존되어 있는, 보존된 시스테인 및 히스티딘 아미노산 서열 (CHAP 도메인의 첫 번째 시스테인과 히스티딘)을 함유한다. 예를 들어, 활성 또는 능력을 유지하기 위해서는, 상기 보존된 시스테인과 히스티딘 잔기는 PlySs2의 돌연변이 또는 변이체에서 유지되어야 한다고 예측하는 편이 합리적이다. 따라서, 본 발명의 리신 변이체에 보유하기에 특히 바람직한 잔기들로는 서열번호 1의 CHAP 도메인에서 활성 부위 잔기들인 Cys₂₆, His₁₀₂, Glu₁₁₈ 및 Asn₁₂₀을 포함한다. 특히 바람직한 치환은 다음을 포함한다: 양전하가 유지될 수 있도록 Arg를 Lys으로 치환 및 그 반대의 치환, 음전하가 유지될 수 있도록 Asp을 Glu으로 치환 및 그 반대의 치환, 유리 -OH가 유지될 수 있도록 Thr을 Ser으로 치환 및 유리 NH₂가 유지될 수 있도록 Asn을 Gln으로 치환.

[80] 적절한 변이체 리신들에 대해서는 PCT 공보 WO 2019/165454호 (국제 출원 번호: PCT/US2019/019638호)에 설명되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 특히, 적절한 변이체 리신들로는, 서열번호 3-17로 본원에 기재된 것들 뿐만 아니라, 서열번호 3-17 중의 임의의 한 서열과 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 리신들을 포함하는데, 이 경우 상기 변이체 리신은 본원에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 PlySs2 리신의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유한다.

[81] 서열번호 3-17은, 항균 활성 및 효용성을 보존하면서도, 상응하는 야생형 PlySs2 리신 서열번호 1에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 변형된 리신 폴리펩타이드들이다. 서열번호 3-17은, 하기 표 A에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1에 대한 아미노산 치환을 언급하여 설명될 수 있다. (서열번호 1과의 차이점 및 이의 아미노산 잔기들의 위치를 언급한) 변형된 리신 폴리펩타이드의 아미노산 서열들을 1글자 아미노산 코드를 사용하여 다음과 같이 요약하였다:

[82] 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 리신의 활성 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 적절한 활성 단편으로는, 본원에 기재된 바와 같은 리신 실시형태들의 단백질 또는 펩타이드 단편의 생물학적 활성 부분을 보유하는 것들을 포함한다. 이러한 변이체들은 리신 단백질의 전장 단백질보다 적은 수의 아미노산들을 포함하고 상응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타내는 아미노산 서열들을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 생물학적 활성 부분은 상응하는 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. PlySs2 리신의 N-말단 CHAP 도메인에 대한 예시적인 도메인 서열은 도 1에 제시되어 있다. PlySs2 리신의 C-말단 SH3b 도메인에 대한 예시적인 도메인 서열도 도 1에 제시되어 있다. 본 발명의 단백질 또는 단백질 단편의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어 10, 25, 50, 100개 아미노산 길이인 폴리펩타이드일 수 있다. 단백질의 다른 영역들이 결실된 기타 생물학적 활성 부분들은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고, 해당 실시형태들의 폴리펩타이드의 천연 형태의 하나 이상의 기능적 활성들에 대해 평가될 수 있다.

[83] 일부 실시형태에서, 적절한 활성 단편은 본원에 기재된 활성 단편들과 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 것들을 포함하고, 이 경우 이의 활성 단편은, 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이 CHAP 및/또는 SH3b 도메인의 적어도 하나의 활성을 보유한다.

[84] 본 발명의 방법에 사용하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 특정 박테리오파지로 감염된 후 박테리아 유기체에 의해 생성될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성적으로 생성 또는 제조될 수 있다. 리신 폴리펩타이드 서열들 및 상기 리신 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산들이 본원에 기술되어 언급되어 있는 것과 동일하게, 본 발명의 리신은 예를 들어, WO 2013/170015호 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이 당업계의 표준 방법을 사용하여, 파지 게놈에서 유래한 분리된 리신에 대한 유전자를 이용해, 해당 유전자를 전달 벡터에 넣고, 상기 전달 벡터를 발현 시스템에 클로닝하여 제조할 수 있다. 본 발명의 리신 변이체는 절단형, 키메라형, 셔플형 또는 "천연형"일 수 있고, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,604,109호에 기재된 바와 같이 이러한 것들이 조합될 수도 있다.

[85] 돌연변이는 서열번호 1에 기재된 리신 서열을 비롯하여, 본원에 기재된 아미노산 서열에서, 또는 폴리펩타이드 및 리신을 인코딩하는 핵산 서열에서, 또는 이의 활성 단편 또는 절단부에서 이루어질 수 있는데, 이로써 특정 코돈이 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변경되거나, 한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 하나 이상의 아미노산이 결실된다.

[86] 이러한 돌연변이는 일반적으로 최소한의 가능한 뉴클레오타이드 변화를 통해 이루어진다. 이러한 종류의 치환 돌연변이는, 생성된 단백질의 아미노산을 (예를 들어, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산에서 다른 그룹에 속하는 아미노산으로 해당 코돈을 변경하는) 비보존적 방식으로 변화시키거나, 또는 (예를 들어, 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 그룹에 속하는 아미노산에서 동일한 그룹에 속하는 아미노산으로 해당 코돈을 변경하는) 보존적 방식으로 변화시켜 수행될 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로 생성된 단백질의 구조와 기능의 변화가 덜 초래된다. 비보존적 변화는 생성된 단백질의 구조, 활성 또는 기능을 변경시킬 가능성이 더 높다. 본 발명은 생성된 단백질의 활성 또는 결합 특성을 크게 변화시키지 않는 보존적 변화를 유지하는 서열들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 당업자라면 누구나, 본원에 제공된 PlySs2 리신 폴리펩타이드의 서열에 대한 검토와 자신들의 지식 및 다른 리신 폴리펩타이드들에 대해 공중이 이용가능한 정보에 기초하여, 리신 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 변화 또는 치환을 구서할 수 있다. 아미노산 변화는, 본원에 제공된 리신(들)의 서열에서 하나 이상, 하나 또는 몇 개, 하나 또는 여러 개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 또는 기타 이러한 다른 수의 아미노산들을 대체하거나 치환하여 이의 돌연변이 또는 이의 변이체들을 생성하도록 이루어질 수 있다. 이러한 돌연변이 또는 이의 변이체들은, 기능에 대해 예측되거나, 예를 들어 스타필로코커스, 스트렙토코커스 또는 엔테로코커스 박테리아에 대한 본원에 기술된 기능이나 능력, 및/또는 본원에 설명되고 구체적으로 제시된 리신(들)과 유사한 활성을 갖는지에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 리신, 및 본원에 기재된 돌연변이 또는 변이체의 서열에 대해 이루어진 변화는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 분석 및 방법들을 사용하여 시험될 수 있다. 당업자라면 누구나, 본 발명의 리신(들)의 도메인 구조에 기초하여, 치환 또는 대체에 적합한 하나 이상, 하나 또는 여러 개의 아미노산 및/또는 상당히 좋은 수준의 보존적 또는 비보존적 치환을 포함하는 치환 또는 대체에 적절하지 않은 하나 이상의 아미노산을 예측할 수 있다.

항생제

[87] 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 뼈 및 관절 감염증을 치료 또는 예방하는 방법은 치료적 유효량의 하나 이상의 항생제 및 PlySs2 리신을 공동 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항생제의 공동 투여는 S. 아우레우스 또는 S. 에피데르미디스와 같은 그람 양성 박테리아에 대한 상승작용적 살균 및/또는 정균 효과를 유도한다. 일반적으로, 상기 공동 투여는 정균 및/또는 살균 활성에 대한 상승 효과를 유도한다. 다른 실시형태들에서, 상기 공동 투여는 생물막 형성 및/또는 응집을 비롯한 독성 표현형을 억제하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 공동 투여는 대상체에서 생물막의 양을 감소시키는데 사용된다.

[88] 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 항생제로는, 페니실린 (예: 메티실린, 옥사실린), 세팔로스포린 (예: 세팔렉신 및 세팩터), 모노박탐 (예: 아즈트레오남) 및 카바페넴 (예: 이미페넴 및 엔타페넴); 마크롤리드 (예: 에리트로마이신, 아지트로마이신), 아미노글리코시드 (예: 젠타마이신, 토브라마이신, 아미카신), 글리코펩타이드 (예: 반코마이신, 테이코플라닌), 옥사졸리디논 (예: 리네졸리드 및 테디졸리드), 리포펩타이드 (예: 답토마이신) 및 설폰아미드 (예: 설파메톡사졸)을 비롯한 베타-락탐과 같은 다양한 유형과 부류의 항생제들을 포함한다.

[89] 일부 실시형태에서, 항생제는 리팜핀 또는 리파부틴과 같은 리파마이신 항생제를 포함한다. 통상적으로, 리팜신 항생제가 사용된다.

[90] 일부 실시형태에서, 항생제는 골수염, 예컨대 급성 골수염을 치료하는데 통상적으로 사용되는 항생제, 예컨대 반코마이신 또는 답토마이신이다. 일부 실시형태에서, 항생제, 예를 들어 답토마이신은 뼈 조직에 잘 침투한다.

본 발명의 추가적인 방법들

[91] 또 다른 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 PlySs2 리신 또는 이의 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 그람 양성 박테리아로 인한 뼈 또는 관절 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다. 임의로는, 본원에 기술된 항생제는 PlySs2 리신과 함께 공동 투여된다.

[92] 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 PlySs2 리신 또는 이의 변이체는 괴사조직 제거 및 임플란트 보존술 (DAIR: Debridement and Implant Retention)을 시행하면서 투여된다. 이러한 실시형태에서, 예를 들어 임플란트 주변의 감염된 조직들과 감염 가능성이 있는 조직들의 괴사조직 제거술은, 일반적으로 멸균 식염수와 같은 다량의 부피의 유체로 관련 조직들의 관절경 하의 세척을 수반하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 PlySs2 리신 또는 이의 변이체는 관절경 하의 세척 전, 세척 동안 또는 세척 후에 관절경 검사를 수행하는 중에 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 항생제, 예컨대 테디졸리드는, 후속적으로 예를 들어 6-24주 동안 해당 대상체에게 경구 또는 정맥내 투여된다.

[93] 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신이 투여될 대상체는 노인이거나, 뼈 또는 관절 감염증에 걸릴 위험성이 더 높은 병태를 앓고 있다. 예를 들어, 뼈 또는 관절 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체는 비만 (예를 들어, 체질량 지수 (BMI) 역치 35)으로 고통받고 있을 수 있다. 예를 들어, 노인 대상체는 적어도 65세, 예컨대 65-90세, 75-90세 또는 79-89세이다. 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 비만과 함께 뼈 또는 관절 감염증, 예컨대 인공 뼈 또는 관절 감염증에 걸릴 위험이 증가하는 가능한 이유로는 연장된 수술 시간 및/또는 다른 동반질환의 존재를 포함한다.

[94] 일부 실시형태에서, 뼈 또는 관절 감염증, 특히 인공 관절 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체는 진성 당뇨병을 앓고 있다. 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 당뇨병과 관련된 위험은 혈당 수치 상승, 백혈구 기능 장애 또는 진성 당뇨병 환자의 미세혈관 변화가 있는 상태에서 생물막 형성 증가로 인한 것일 수 있는데, 이는 상처 치유 및 표재성 수술 부위 감염의 발생에 영향을 미칠 수 있다.

[95] 뼈 및/또는 관절 감염의 다른 위험 요인들로는 류마티스 관절염, 남성 및 흡연을 들 수 있다. 또한, 임플란트 수술을 받기 전 해에 세균혈증 진단을 받은 것도 뼈 및/또는 관절 감염, 예컨대 인공 관절 감염의 위험 요인이다.

[96] 또 다른 양태에서, 본 발명은, 본원에 기술된 바와 같은 그람 양성 박테리아를 사멸시킬 수 있는 리신을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 활액 중에 형성된 그람 양성 박테리아 생물막의 형성을 억제하거나, 또는 그람 양성 박테리아 생물막을 훼손시키는 방법으로서, 상기 리신 역시 본원에 기재된 바와 같은 PlySs2 리신이고, 상기 생물막이 효과적으로 억제 또는 분산되는 것인, 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 양태에서의 그람 양성 박테리아는 본원에 기재된 임의의 그람 양성 박테리아를 포함할 수 있다. 그러나, 통상적으로 그람 양성 박테리아는 스타필로코커스 에피데르미디스이다.

용량 및 투여

[97] 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여량은, 치료할 감염증의 활성, 치료될 대상체의 연령, 건강 및 전반적인 신체 상태, 특정 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 활성, 항생제를 사용하는 경우라면, 본 발명에 따른 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체가 쌍을 이루는 항생제의 성질과 활성 및 상기 쌍을 이루어 만들어지는 병용 효과를 비롯한 다수의 요인들에 좌우된다. 일반적으로, 투여될 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 유효량은 0.00001-200 mg/kg, 예컨대 0.2 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 예컨대 0.25 mg/kg, 예컨대 1-150 mg/kg, 예컨대 40 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위 내인 것으로 예상되며, 이러한 유효량은 14일 이하의 기간 동안 하루에 1-4회 투여한다. 항생제는, 표준 용량 요법에 따라, 또는 예컨대 상승 효과의 관점에서 보다 소량으로 투여될 수도 있다. 그러나, 이러한 용량 및 요법은 (그것이 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 또는 이와 함께 투여되는 임의의 항생제이든) 최적화를 거치게 된다. 최적의 용량은 당업계의 기술 내에서 본 발명을 고려한 시험관내 및 생체내 선행 효능 실험 (pilot efficacy experiment)을 수행하여 결정할 수 있다.

[98] 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 살균 효과를 제공하고, 더 소량으로 사용되는 경우에는 정균 효과를 제공하며, 다양한 항생제 내성 박테리아에 대해 활성이고, 진전하는 내성과는 관련이 없는 것으로 생각된다. 본 발명에 기초하면, 임상적 환경에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는, 특정 항생제들 (심지어 내성이 발생한 항생제도 포함하여)과 함께 사용하는 경우에, 약물 내성 및 다제 내성 박테리아로부터 발생하는 뼈 및 관절 감염증을 치료하기 위한 조성물에 대한 강력한 대안 (또는 첨가제 또는 성분)이다. 그람 양성 박테리아에 대한 기존의 내성 기전은 본 발명의 폴리펩타이드의 용균 활성에 대한 민감성에 영향을 미치지 않아야 한다.

[99] 본 발명의 임의의 폴리펩타이드의 경우, 치료적 유효량은 먼저 세포 배양 분석법에서, 또는 동물 모델, 통상적으로 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 추정할 수 있다. 상기 동물 모델도 바람직한 농도 범위와 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 이후, 수득된 정보를 사용하여 인간에 있어서 유효 용량 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 그러나, 통상적으로 전신 투여, 특히 정맥내 투여가 사용된다. 용량과 투여는, 충분한 수준의 활성 성분을 제공하도록, 또는 목적한 효과를 유지하도록 더 조정할 수도 있다. 고려될 수 있는 추가의 요인들로는 해당 질병 상태의 중증도, 해당 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 바람직한 치료 지속기간, 투여 방법, 투여의 시간과 횟수, 약물 조합, 반응 민감도 및 치료에 대한 내성/반응 및 주치의의 판단을 포함한다.

[100] 치료 용법은 매일 투여 (예를 들어, 하루에 1회, 2회, 3회 등), 격일로 (예를 들어, 격일에 1회, 2회, 3회 등), 주 2회, 주 1회, 매 2주마다, 월 1회 등으로 할 수 있다. 한 실시형태에서, 치료는 연속 주입으로 제공될 수 있다. 단위 용량은 여러 차례 투여될 수 있다. 그 간격은 임상 증상의 모니터링에 나타난 대로 불규칙할 수도 있다. 다르게는, 단위 용량은 서방성 제제로 투여될 수 있으며, 이 경우 자주 투여할 필요가 없다. 용량과 횟수는 환자에 따라 다를 수 있다. 당업자라면 누구나, 이러한 가이드라인이 국소 투여용 (예: 비강내, 흡입, 직장 등), 또는 전신 투여용 [예: 구강, 직장 (예: 관장을 통해), i.m. (근육내), i.p. (복강내), i.v. (정맥내), s.c. (피하), 경요도 등]으로 조정될 수 있음을 이해할 것이다.

[101] 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항생제, 예컨대 답토마이신은 동시에 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항생제, 예컨대 답토마이신은, 임의의 순서로 연속하여, 예컨대 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 리신은 표준 진료 항생제 치료, 예를 들어 2주 과정의 옥사실린 및 젠타마이신 또는 답토마이신 투여 동안에 혹은 그 후에 투여된다. 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본 발명의 하나 이상의 항생제는 단독으로 또는 조합하여 단회 용량 또는 다회분 용량으로 투여될 수 있다.

[102] 상기 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 본 발명의 하나 이상의 항생제는 동일한 투여 방식으로, 또는 서로 다른 투여 방식으로 투여될 수 있고, 1회, 2회 또는 다회, 하나 이상으로 조합하거나, 또는 개별적으로 투여될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 특히 반응, 예컨대 살균 및/또는 정균 효과 및/또는 응집 및/또는 생물막 형성 또는 감소에 대한 효과에 따라, 초기 용량 이후 후속 용량(들)이 투여될 수 있으며, 항생제 용량(들)과 병용하거나 이와 번갈아 투여할 수도 있다. 통상적으로, 상기 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 단회 일시주사로 투여한 후, 본 발명의 하나 이상의 항생제들을 통상적인 용량과 투여 방식으로 투여한다.

[103] 보다 일반적인 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 단회 일시주사로 대상체에게 투여한 후, 본 발명의 하나 이상의 항생제, 예컨대 답토마이신의 통상적인 용법, 예컨대 표준 치료 (SOC) 용량에 따라 이를 투여한다. 다른 일반적인 실시형태에서, 답토마이신과 같은 본 발명의 하나 이상의 항생제를 대상체에게 투여한 후, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 단회 일시주사하고, 이어서 답토마이신과 같은 통상적인 용량의 본 발명의 하나 이상의 항생제를 추가로 투여한다.

[104] 일부 실시형태에서, 상기 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 MIC 이하의 수준, 예를 들어 0.9X MIC 내지 0.0001X MIC 범위의 MIC 이하의 수준으로 투여될 수 있다. 이러한 MIC 이하의 수준으로, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는, 일반적으로 그람 양성 박테리아의 성장을 억제하고, 응집을 감소시키고/시키거나, 생물막 형성을 억제하거나, 또는 생물막을 감소 또는 제거하는데 사용된다.

[105] 일부 실시형태에서, 상기 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC 이하의 단회 용량을 대상체에게 투여한 후, 본 발명의 하나 이상의 항생제의 1회 이상의 용량의 통상적인 용법을 사용하여 이를 투여한다. 보다 일반적인 다른 실시형태에서, 답토마이신과 같은 본 발명의 하나 이상의 항생제를 통상적인 용량으로 대상체에게 투여한 후, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 MIC 이하의 용량으로 단회 일시주사하고, 이어서 답토마이신과 같은 통상적인 용량의 본 발명의 하나 이상의 항생제를 추가로 투여한다.

[106] 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC 이하의 용량은, 상기 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 펩티도글리칸 가수분해 활성에 의해 매개되는 세포 외피에 대한 손상을 치명적이지 않도록 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 외피에 결과적으로 나타나는 물리적 및 기능적 변화들이 증식 지연의 이유가 된다. 이러한 물리적 및 기능적 변화들에는, 예를 들어 세포벽의 불안정화, 막 투과성의 증가 및 막 전위의 소실이 포함된다. 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는, 일반적으로 박테리아 세포막에 직접적으로 작용하지 않음에도 불구하고, 세포막 투과성 및 정전기 전위에 대한 영향은 매우 낮은 농도에서의 리신의 펩티도글리칸 가수분해 활성 (및 세포 외피의 불안정화)에 의해 유도된 삼투압 응력의 결과일 가능성이 높다. 또한, 국소적인 세포벽 가수분해는, 세포 합성과 가수분해의 분리, 차후 증식 정지를 초래하는 세포벽 두께의 변화 뿐만 아니라, 내막의 압출과 공극의 형성을 초래할 수 있는 것으로 가정된다.

[107] 일부 실시형태에서, 본 발명의 MIC 이하 농도의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 박테리아 세포 외피를 손상시켜 본 발명의 MIC 이하 용량의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 부재시의 경우보다 통상적인 항생제에 더 민감한 박테리아를 생성한다.

[108] 일부 실시형태에서, MIC 이하 및/또는 MIC 수준의 용량의 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는 생물막, 특히 생체내 생물막을 감소시킬 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 생체내 생물막은 시험관내 생물막과 구조적으로 뚜렷이 구분될 수 있다. 일반적으로, 예컨대 만성 감염과 관련하여, 시험관내 생물막과 생체내 생물막 간에 차이가 있는 이유는, 시험관내 생물막 시스템에서는 방어 기전 노출이 부족하기 때문이다. 대부분의 생체내 생물막 서식처에는, 식세포, 및 심지어 박테리오파지가 고름과 분비된 다른 체액 및 중합체와 함께 존재할 수 있다. 이러한 변수들은 제어나 재현하기 어려울 수 있는 시험관내 모델 시스템에서 일반적으로 회피한다.

[109] 일부 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항생제는 MIC 수준 또는 MIC 수준 초과, 예컨대 1X MIC, 2X MIC, 3X MIC 및 4X MIC로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 항생제는 MIC 이하의 수준, 예를 들어 0.9X MIC 내지 0.0001X MIC 범위로 투여된다.

[110] 일부 실시형태에서, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체의 MIC 이하의 단회 용량을 대상체에게 투여한 후, 본 발명의 하나 이상의 항생제, 예컨대 답토마이신의 1회 이상의 용량을 투여하는데, 이 경우 상기 항생제의 용량(들)도 MIC 이하의 수준으로 투여한다.

[111] 다른 실시형태에서, 답토마이신과 같은 본 발명의 하나 이상의 항생제를 MIC 이하의 용량으로 대상체에게 투여한 후, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체를 MIC 이하의 용량으로 단회 일시주사하고, 이어서 MIC 이하 용량의 본 발명의 하나 이상의 항생제, 예컨대 답토마이신을 추가로 투여한다.

제제

[112] 임의로는 단독으로, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 항생제와 함께 병용하여 또는 연속하여 투여되는, 본 발명의 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체는, 각각 단일 약제학적 제제에 포함될 수 있거나, 또는 용액, 현탁액, 에멀젼, 흡입형 분말, 에어로졸 또는 스프레이, 정제, 환제, 펠릿, 캡슐, 액체 함유 캡슐, 분말, 서방형 제제, 좌제, 탐폰용 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 로젠지, 트로키, 캔디, 주사제, 츄잉껌, 연고, 도말, 지효성 패치, 액체 흡수용 1회용 티슈, 및 이들의 조합 형태로 개별적으로 제제화될 수 있다.

[113] 일부 실시형태에서, 약제학적 제제의 투여는 전신 투여를 포함할 수 있다. 전신 투여는 장내 또는 경구 (즉, 물질이 소화관을 통해 제공됨), 비경구 (즉, 물질이 주사 또는 흡입과 같은 소화관 이외의 경로로 제공됨)일 수 있다. 따라서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 임의로 본 발명의 하나 이상의 항생제는 경구, 비경구, 흡입, 국소, 직장, 비강, 협측으로, 또는 이식된 저장소를 통해, 또는 기타 임의의 공지된 방법으로 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 본 발명의 하나 이상의 항생제는 서방형 제형으로 투여될 수도 있다.

[114] 경구 투여의 경우, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 임의로, 본 발명의 하나 이상의 항생제는 고체 또는 액체 제제, 예를 들어 정제, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액 및 분산액으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 본 발명의 하나 이상의 항생제는 예를 들어, 락토스, 수크로스, 옥수수 전분, 젤라틴, 감자 전분, 알긴산 및/또는 스테아린산마그네슘과 같은 부형제와 함께 제형화될 수도 있다.

[115] 정제 및 환제와 같은 고체 조성물을 제조하는 경우, 리신 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 및/또는 본 발명의 하나 이상의 항생제를 약제학적 부형제와 혼합하여 고체 초기 제형 조성물을 제조한다. 필요하다면, 정제는 표준 기술에 의해 당 코팅되거나 장용 코팅될 수도 있다. 본 발명의 정제 또는 환제는 코팅되거나, 아니면 배합되어 지효성 작용의 이점을 주는 제형을 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 조제 및 외부 조제 성분을 포함할 수 있으며, 후자가 전자에 대하여 외피 형태로 존재한다. 상기 두 조제 성분들은, 장에서의 붕해를 저지하여 내부 성분이 십이지장 내로 그대로 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 기능을 하는 장용층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질들이 이러한 장용층 또는 장용 코팅에 사용될 수 있는데, 이러한 물질들로는 다수의 중합체 산 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질들의 혼합물을 포함한다.

[116] 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제제는 흡입성 조성물로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제제는 유리하게는 건조 흡입성 분말로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제제는 에어로졸 전달을 위한 분사제와 함께 추가로 제형화될 수 있다. 적절한 분사제의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 및 이산화탄소가 포함된다.특정 실시형태에서, 상기 제제는 분무될 수 있다.

[117] 일부 실시형태에서, 흡입성 약제학적 제제는 부형제를 포함한다. 적절한 부형제의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 락토스, 전분, 중쇄 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르; 중쇄, 단쇄 또는 장쇄 지방산의 트리글리세리드 에스테르, 또는 이들의 임의의 조합; 퍼플루오로디메틸시클로부탄; 퍼플루오로시클로부탄; 폴리에틸렌 글리콜; 멘톨; 라우로글리콜; 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르; 중쇄 지방산의 폴리글리콜화 글리세리드; 알코올; 유칼립투스 오일; 단쇄 지방산; 및 이들의 조합을 포함한다.

[118] 계면활성제는 약제와 분사제 간의 표면 및 계면 장력을 낮추기 위해 본 발명의 흡입성 약제학적 제제에 첨가될 수 있다. 계면활성제는 본 발명의 폴리펩타이드와 반응하지 않는 임의의 적절한 무독성 화합물일 수 있다. 적절한 계면활성제의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 올레산; 소르비탄 트리올레이트; 세틸 피리디늄 클로라이드; 대두 레시틴; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트; 폴리옥시에틸렌 (10) 스테아릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 (2) 올레일 에테르; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 에틸렌 디아민 블록 공중합체; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체; 피마자유 에톡실레이트; 및 이들의 조합을 포함한다.

[119] 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제제는 비강 제형을 포함한다. 비강 제형은, 예를 들어 비강 스프레이, 점비액, 비강 연고, 비강 세척제, 비강 주사제, 비강 패킹, 기관지 스프레이 및 흡입기를 포함하거나, 또는 간접적으로는 인후 로젠지, 구강 세척제 또는 가글의 사용을 통한 것, 또는 콧구멍 또는 얼굴, 또는 이들의 임의의 조합에 적용되는 연고의 사용을 통한 것, 및 상기와 유사한 적용 방법들에 의한 것을 포함한다.

[120] 본 발명의 약제학적 제제는 보다 일반적으로는 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 약제학적 제형은 근육내, 경막내, 피부내, 피하 또는 정맥내로 투여되어 그람 양성 박테리아에 의한 감염, 일반적으로 S. 에피데르미디스에 의해 유발되는 뼈 또는 관절 감염을 치료할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 증류수, 식염수, 알부민, 혈청, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다. 추가로, 비경구 주사의 약제학적 제형은 pH 완충 용액, 보조제 (예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제), 리포솜 제형, 나노입자, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 뿐만 아니라, 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수도 있다.

[121] 비경구 주사가 투여 방식으로 선택되는 경우, 등장성 제제가 일반적으로 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제에는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스가 포함될 수 있다. 경우에 따라서는, 인산염 완충 식염수와 같은 등장액이 바람직하다. 안정제에는 젤라틴과 알부민이 포함될 수 있다. 혈관수축제를 제제에 첨가할 수도 있다. 이러한 유형의 용도에 따른 약제학적 제제는 무균 및 무발열원 상태로 제공된다.

[122] 본 발명의 약제학적 제제는 단위 제형으로 제공될 수 있고, 약학 분야에 익히 공지된 방법들 중 어느 한 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분들의 양은 치료되는 숙주, 감염성 박테리아에 대한 수용 대상체의 노출 기간, 해당 대상체의 크기와 체중, 및 구체적인 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 단일 제형의 제조를 위해 담체 물질과 혼합될 수 있는 활성 성분들의 양은 대체로 치료 효과를 나타내는 각 화합물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 활성 성분의 총량은 약 1% 내지 약 99%, 통상 약 5% 내지 약 70%, 가장 일반적으로는 약 10% 내지 약 30%의 범위일 것이다.

실시예

실시예 1. 인간 활액 (HSF)에서 S. 에피데르미디스 에 대한 CF-301의 항균 활성.

[123] S. 에피데르미디스에 대한 CF-301 리신 (서열번호 1)의 최소 억제 농도 (MIC)는, CF-301을 사용한 항균제 민감도 시험에서 CLSI의 사용 승인 (CLSI, AST 소위원회 회의, 2018년 1월)을 받았던 비표준 배지 [말혈청이 25% 및 DTT가 0.5 mM 보충된 caMHB (caMHB-HSD)] 중에서 CLSI 방법 (M07-A11, 2018)에 따른 액상배지 미량희석법 (BMD)를 사용하여 측정하였다. HSF (Discovery Life Sciences)에서 S. 에피데르미디스에 대한 CF-301의 활성은, 이와 유사하게 50% HSF가 포함된 caMHB (caMHB-HSF)에서 BMD를 사용하여 측정하였다. 상기 caMHB-HSF는 S. 에피데르미디스 뿐만 아니라 S. 아우레우스의 증식 및 생물막 형성을 지원한다. 53개의 S. 에피데르미디스 임상 분리주와 2개의 MRSA 균주를 연구를 위해 선택하였고; 각 분리주는 생물막을 형성하는 것으로 과거 연구에서 이미 입증된 바 있다 (Schuch et al. (2017) AAC, 61:e02666-16).

[124] 하기 표 3에 나타난 바와 같이, CF-301은 0.015/0.125 μg/mL 및 0.0078-2 μg/mL 범위의 MIC_50/90로서, 인간 활액에서 S. 에피데르미디스에 대해 강력한 활성을 나타냈다. 또한, 표 3에 나타난 바와 같이, S. 에피데르미디스에 대한 CF-301 활성은 S. 아우레우스에 대해 관찰된 것과 유사하였다.

실시예 2. HSF에서 CF-301에 의한 S. 에피데르미디스 생물막의 훼손.

[125] 인간 활액에서 형성된 생물막에 대한 CF-301 활성의 육안 분석은 문헌 [Dastgheyb et al. (2015) JID 211:641-50] 및 [Dastgheyb et al. (2015) AAC 59:e04579-14]에 기술된 방식으로 수행하였다. 간략히 설명하면, 10⁸ CFU의 S. 에피데르미디스 분리주 NRS6을, HSF를 함유하는 24-웰 플레이트 중에서 37℃로 24시간 동안 항온배양했하였다. 생물막 형성 후, 웰들을 브롬화에티듐 (EtBr)으로 염색하여 0.1 또는 1 μg/mL의 CF-301로 2시간 동안 처리하였다. 상기 생물막들을 UV 형광 영상촬영으로 육안으로 볼 수 있게 하였다. 미처리 대조군들도 조사하였다.

[126] 도 2는 인간 활액에서 NRS6에 의해 형성된 생물막 구조들의 브롬화에티듐 염색에 대한 CF-301 처리의 영향을 나타낸 것이다. 도 2로 입증된 바와 같이, 생물막 구조들은 2시간 이내에 제거되었다.

[127] 또한, 생물막 (및 개별 박테리아) 중의 엑소폴리사카라이드를 염색하는 Alexa Flour⁴⁸⁸-WGA와 전체 생물막을 염색하는 요오드화프로피듐 (PI)으로 생물막들을 염색하였다. 그런 다음, 생물막을 형광 현미경을 사용해 육안으로 관찰할 수 있도록 하였다. 도 3로 입증된 바와 같이, HSF에서 형성된 S. 에피데르미디스 생물막은 0.1 ug/mL 또는 1 ug/mL의 CF-301로 2시간 동안 처리한 후에 제거되었다.

실시예 3. HSF에서 생물막 훼손에 대한 SEM 분석.

[128] 또한, 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 인간 활액에서 S. 아우레우스에 의해 생물막이 형성되었음과 0.01, 0.1 및 1 μg/mL 농도의 CF-301로 2시간 동안 처리한 후 이들이 제거되었음도 입증하였다. 본 실시예에서, S. 아우레우스 생물막은 CF-301 처리 전에 인간 활액에서 형성되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, CF-301은 이러한 생물막들을 훼손시킨다.

[129] 상기 실시예들은, CF-301과 같은 리신이 뼈 및 관절 감염, 특히 인공 관절 감염, 예컨대 항생제가 대개 효과가 좋지 않은 생물막에 의해 정교하게 구성되는 S. 아우레우스에 의해 유발되는 감염에 대한 치료제로 사용될 수 있음을 뒷받침한다.

실시예 4. 답토마이신과 병용된 엑시바카제 (CF-301)는 랫트의 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 골수염에서 답토마이신 또는 CF-301 단독 사용보다 더 활성이다.

[130] 뼈에서 CF-301 수준은 10 mg/kg의 단회 용량 투여 후 혈장 수준의 약 10-15%인 것으로 밝혀졌기 때문에, 이로써 뼈 및 관절 감염을 표적으로 하여 그러한 부위들에 감염을 유발하는 S. 아우레우스를 용해시키는 전략을 제공한다. 뼈 감염에 대한 CF-301의 효능을 시험하기 위해, 급성 MRSA 골수염의 동물 모델을 사용하였다. 감염을 규명하는데 사용된 균주인 MRSA IDRL-6169는 액상배지 미량희석법으로 측정시, CF-301 및 답토마이신 모두에 대해 0.5 μg/ml의 최소 억제 농도를 나타냈다. 최소 생물막 억제 농도 및 최소 생물막 항균 농도는 이전에 기술된 방법들을 사용하여 측정시 각각 CF-301의 경우에 1 및 4 μg/ml 및 답토마이신의 경우에 1 및 2 μg/ml였다. 문헌 [Schmidt-Malan et al., 2016, Diag. Microbiol. Infect. Dis. 85:77-79]을 참고한다. 모든 CF-301 시험은 문헌 [Schuch R. 2016, Methods Development and Standardization Working Group, Clinical Laboratory Science Institute, Wayne, PA]에 기술된 대로 0.5 mM의 DL-디티오트레이톨 및 25% 말 혈청으로 보충하였다.

[131] 급성 골수염은 자크 (Zak)의 골수염 실험 모델을 변형시킨 것을 사용하여 64마리의 수컷 스프라그 돌리 (Sprague Dawley) 랫트에서 확립시켰다 (문헌 [O'Reilly T et al. 1999. “Rat model of bacterial osteomyelitis of the tibia, p 561-575.” In Zak O, Sande M (ed), Handbook of animal models of infection. Academic Press, San Diego, CA.] 참조) 동물들을 이소플루란으로 마취하고 좌측 무릎의 털을 밀어 클로로헥시딘으로 소독하였다. 골수염을 유발시키기 위해, 무릎 관절을 45도 각도로 구부려 경골돌기 상부를 노출시켰다. 10 ㎕의 아라키돈산 (50 ㎍/ml)과 대두카제인소화 액상배지 중 MRSA IDRL-6169의 10⁷ cfu 현탁액 50 ㎕를 함유하는 21 게이지 바늘이 구비된 1 밀리리터 주사기를 경골에 삽입하였다. 상기 박테리아 현탁액을 경골에 서서히 주입하고, 바늘을 제거한 후, 무릎 관절을 곧게 펴서 주사 부위에 1분간 압력을 가했다.

[132] 감염을 확립한 지 1주일 후 (8일차), 랫트를 4개의 처리군들 중 하나에 무작위로 배정하였다: 1) 미처리군, 2) 4일간 매 12시간마다 60 mg/kg의 답토마이신을 복강내 투여하는 군, 3) 꼬리 정맥에 단회 용량 40 mg/kg의 CF-301을 투여하는 군, 또는 4) 단회 용량 40 mg/kg의 CF-301 + 60 mg/kg의 답토마이신을 4일간 매 12시간마다 복강내 투여하는 군. 답토마이신은 CF-301 주사 15분 전에 투여하였다. CF-301은 주사하기 전까지는 얼음에 보관하였다. 랫트는 치료를 개시하고 4일 후 (12일차)에 희생시켰다. 각 동물의 좌측 경골을 수집하여 무게를 잰 후, 박테리아 정량 배양을 위해 이를 냉동 분쇄하였다. 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 검정을 사용하는 SAS 소프트웨어 버전 9.4 (미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재, SAS Inc.)를 사용하여 정량 배양의 결과들을 비교하였다. 평균 및 표준 편차는 뼈 1g당 log₁₀ 콜로니 형성 단위 (cfu)로 기록하였다. 모든 시험은 양측 검정으로서; 0.05 미만의 p-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

[133] 처리를 하지 않은 랫트의 평균 (±SD) 박테리아 밀도는 뼈 1g당 5.13 (±0.34) log₁₀ cfu였다. 답토마이신, CF-301 및 답토마이신 + CF-301 처리군의 랫트들은 각각 뼈 1g당 4.09 (±0.37), 4.65 (±0.65) 및 3.57 (±0.48) log₁₀ cfu/g의 평균치 (±SD)를 가졌다 (도 5). 처리되지 않은 랫트들과 비교하였을 때, 답토마이신, CF-301 및 CF-301 + 답토마이신 치료에서 각각 뼈 1g당 1.04, 0.65 및 1.56 log₁₀ cfu가 감소하였다. 모든 처리군들의 콜로니 수는 처리되지 않은 랫트에 비해 유의하게 감소하였다 (P≤0.0001). 그러나, 답토마이신 + CF-301 동물은 답토마이신 (P=0.0042) 또는 엑시바카제 (P <0.0001) 단독으로 처리했던 동물들보다 콜로니 수가 더 적었다.

[134] 상술한 결과들은 CF-301 단독 또는 답토마이신과 같은 항생제와 병용하여 골수염 치료에 사용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다. 답토마이신 또는 CF-301 단독 처리가 감염의 감소를 보였지만, CF-301과 답토마이신 병용 치료는 더욱 양호한 효과를 나타냈다.

실시예 5. 인공 무릎 관절 감염 환자에서 관절경 DAIR 중 CF-301의 효능.

[135] DAIR을 병용하는 CF-301 치료를 위해, 재발성 다제내성 (MDR) 스타필로코커스 에피데르미디스 인공 무릎 관절 감염이 있는 고령 환자들 (79~89세)로서 재수술 또는 대퇴 절단이 가능하지 않고 이용가능한 다른 경구 옵션이 없는 경우를 확인하였다. 각 사례들에 대해서는 지역 윤리 위원회에 따라 프랑스 보건 당국과 논의하였다. 치료 전에, 각 환자들은 서면 동의서에 서명하였다. CF-301 (75 mg/mL; 30 mL)을 관절경 검사 중 해당 관절에 직접 투여한 후, 구제 요법으로 억제성 테디졸리드를 투여하였다.

[136] 4명의 환자들이 치료를 받았다. 모두 과거 수회의 인공 무릎 관절 재수술을 받아 인공보철물이 헐거워지지 않았다 (도 6A). 3명은 개방 DAIR에 따른 억제성 항생제에도 불구하고 재발성 무릎 관절 감염이 있었다. 2명은 감염성 관절염의 임상적 징후가 있었으며 (도 6B); 다른 2명은 누공이 있었다. 관절경 검사 동안 이상 사례는 나타나지 않았으며; 모든 환자들은 답토마이신 8 mg/kg과 리네졸리드 (600 mg으로 1일 2회; 4~6주)를 투여받은 후, 억제 요법으로서 하루에 테디졸리드 200 mg을 투여받았다. 6개월 후, 기준 시점에서 누공이 있었던 2명의 환자에서 누공이 재발하였다. 1년의 추적 관찰 후, 결과는 2명의 감염성 관절염 환자에서 양호하였고, 감염성 관절염의 임상 징후들도 없어졌다 (도 6C). 이러한 양호한 결과는, CF-301이 재발성 MDR 스타필로코커스 감염 환자들의 관절경 DAIR 동안 효과적으로 사용되어, 억제성 항생제의 효능을 개선하고, 기능의 상당한 손실을 방지할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 6. 랫트 골수염 모델에서 pp296의 효능.

[1] 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 (IDRL-6169; 인공 고관절 감염 환자로부터 분리함) 감염은 문헌 [Karau et al., Exebacase in Addition to Daptomycin Is More Active than Daptomycin or Exebacase Alone in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Osteomyelitis in Rats, Antimicrob. Agents Chemother. 2019 Sept 23; 63(10)]에 기술된 바와 같은 프로토콜에 따라 스프라그 돌리 랫트에서 확립하였다. 구체적으로, 무릎 관절을 구부리고, 21G 바늘을 경골 돌기에 삽입하,여 아라키돈산 10 μl 및 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스IDRL-6169의 약 10⁶ - 10⁸ 콜로니 형성 단위 (cfu) 현탁액 50 μl을 주입하여 랫트에서 골수염을 확립시켰다.

[2] 하기의 6개의 처리군으로 나누었다: (1) 대조군/미처리 (n=18); (2) 4일간 1일 2회 60 mg/kg의 답토마이신 (DAP)을 피하 투여하는 군 (n=17); (3) 4일간 매일 40 mg/kg의 pp296 을 정맥내 투여하는 군 (n=17); (4) 4일간 매일 40 mg/kg의 pp296을 정맥내 투여 + 4일간 매일 2회 60 mg/kg의 DAP를 피하 투여 하는 군 (n=17); (5) 치료 1일차에 100 mg/kg의 pp296을 단일 용량으로 1회 정맥내 투여하는 군 (n=17); 및 (6) 치료 1일차에 100 mg/kg의 pp296을 단일 용량으로 1회 정맥내 투여 + 4일간 60 mg/kg의 DAP를 매일 2회 피하 투여하는 군 (n=17). 답토마이신을 pp296과 함께 투여하는 경우, 얼음에 보관하고 있던 pp296을 투여하기 전 15분을 기다렸다.

[3] 마지막 처리를 하고 나서 12시간 후에 동물들을 희생시키고, 경골을 수집하여 무게를 잰 후, 박테리아 정량 배양을 위해 이를 냉동 분쇄하였다. 경골 1g당 log₁₀ CFU 수는 윌콕슨 순위합 검정 (Wilcoxon rank sum test)을 사용하여 측정하여, 위발견율 (false discovery rate) 접근법으로 조정하였다. 그 결과들을 하기 표 4에 나타내었다.

[4] 상기 결과들은 100 mg/kg 단일 용량의 pp296이 답토마이신과 함께 상승 작용하여 평균 log₁₀ CFU를, 미처리 대조군에 비해 1.76 CFU/g, 답토마이신 단독 투여에 비해 0.62 CFU/g 감소시켰음을 나타낸 것이다. 이러한 감소는 미처리 대조군 (P= 0.003)과 pp296 단독 (즉, 답토마이신 부재)의 단일 용량 및 1일 용량 (각각 P= 0.0210 및 P= 0.0175)과 비교하였을 때 유의미하였다. pp296에 대한 이러한 결과들은 CF-301에 대해 얻은 결과들과 유사하였다. 예를 들어, 답토마이신과 병용된 40 mg/kg의 CF-301의 단일 용량은 답토마이신 단독에 비해 log₁₀ CFU/g이 0.52 감소하였다.

[5] 추가로, 동물들의 체중은 연구를 수행하는 동안 전반적인 건강 상태에 대한 마커로서 모니터링하였다. 수술 시 (1일차), 처리 직전 (8일차) 및 희생시 (12일차) 동물들의 평균 체중을 하기 표 5에 나타내었다.

[6] 처리 개시 전 감염 후 첫 7일 동안 동물의 체중이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 모든 처리군에서 4일간의 처리 동안 체중 감소가 거의 없거나 또는 전혀 관찰되지 않았다.

[7] 병리학 슬라이드를 통해, 오직 있을 수 있는 세포과다성만을 나타냈던 40 mg/kg의 pp296 (처리군 3) 1일 용량의 경우를 제외하고는, 모든 군에서 호중구의 증가와 세포과다성 골수가 나타났음을 알 수 있었다. 이러한 소견은 급성 골수염과 일치하며, 그룹들 간에 주목할 만한 차이는 있을 수 없었다.

<110> CONTRAFECT CORPORATION <120> METHOD OF TREATING AND PREVENTING BONE AND JOINT INFECTIONS <130> 0341.0020-00-304 <150> 62/832,754 <151> 2019-04-11 <150> 62/849,672 <151> 2019-05-17 <150> 62/938,812 <151> 2019-11-21 <150> 62/964,755 <151> 2020-01-23 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 1 Met Thr Thr Val Asn Glu Ala Leu Asn Asn Val Arg Ala Gln Val Gly 1 5 10 15 Ser Gly Val Ser Val Gly Asn Gly Glu Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Trp 20 25 30 Tyr Glu Arg Met Ile Ser Pro Asp Ala Thr Val Gly Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Val Gly Trp Val Ser Gly Ala Ile Gly Asp Thr Ile Ser Ala Lys Asn 50 55 60 Ile Gly Ser Ser Tyr Asn Trp Gln Ala Asn Gly Trp Thr Val Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Phe Lys Ala Gly Gln Ile Val Thr Leu Gly Ala Thr Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Tyr Gly His Val Val Ile Val Glu Ala Val Asp Gly Asp 100 105 110 Arg Leu Thr Ile Leu Glu Gln Asn Tyr Gly Gly Lys Arg Tyr Pro Val 115 120 125 Arg Asn Tyr Tyr Ser Ala Ala Ser Tyr Arg Gln Gln Val Val 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Claims (31)

1. 뼈 또는 관절 감염의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 PlySs2 리신 또는 서열번호 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 이의 변이체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 변이체가 그람 양성 박테리아에 대한 항균 및/또는 정균 활성을 포함하고, 상기 뼈 또는 관절 감염이 그람 양성 박테리아를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 뼈 또는 관절 감염이 생물막을 포함하는 것인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뼈 또는 관절 감염이 골수염을 포함하는 것인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 골수염이 만성 골수염인 것인, 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 골수염이 급성 골수염인 것인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뼈 또는 관절 감염이 인공 관절 감염을 포함하거나, 또는 자연 관절의 감염성 관절염을 포함하는 것인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뼈 또는 관절 감염이 인공 관절 감염을 포함하는 것인, 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 인공 관절 감염이 인공 고관절 감염 또는 인공 무릎 관절 감염을 포함하는 것인, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 비만, 진성 당뇨병, 류마티스 관절염으로 고생하고 있거나, 또는 고령자인 것인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 괴사조직 제거 및 임플란트 보존술 (Debridement and Implant Retention, DAIR)을 포함하는 것인, 방법.
11. 대상체의 활액에 형성된 생물막을 예방하거나 훼손시키는 방법으로서, 상기 방법이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 PlySs2 리신 또는 서열번호 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 이의 변이체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 변이체가 항균 및/또는 정균 활성을 포함하고, 상기 생물막이 그람 양성 박테리아에 의해 형성되는 것인 단계를 포함하는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 치료적 유효량의 하나 이상의 항생제를 공동 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 베타-락탐, 아미노글리코시드, 글리코펩타이드, 옥사졸리디논, 리포펩타이드 및 설폰아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 리파마이신을 포함하는 것인, 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 반코마이신, 답토마이신 또는 테디졸리드를 포함하는 것인, 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제가 답토마이신을 포함하는 것인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아가 스타필로코커스 박테리아, 엔테로코커스 박테리아 및/또는 스트렙토코커스 박테리아를 포함하는 것인, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 스타필로코커스 박테리아가 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 포함하는 것인, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아가 항생제 내성 그람 양성 박테리아인 것인, 방법.
20. 제1항 내지 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아가 응고효소 음성 스타필로코커스를 포함하는 것인, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 응고효소 음성 스타필로코커스가 스타필로코커스 시뮬란스 (Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 카프라에 (Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 루그두넨시스 (Staphylococcus lugdunensis) 및/또는 스타필로코커스 에피데르미디스 (Staphylococcus epidermidis) 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인, 방법.
22. 제1항 내지 제17항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아가 스타필로코커스 에피데르미디스를 포함하는 것인, 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 변이체가 서열번호 3 내지 17의 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 PlySs2 리신 변이체가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2 리신이 서열번호 1의 폴리펩타이드와 적어도 90%의 동일성을 갖는 것인, 방법.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
28. 제1항 내지 제19항 및 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람 양성 박테리아가 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스를 포함하는 것인, 방법.
29. 제11항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 훼손이 괴사조직 제거 및 임플란트 보존술을 포함하는 것인, 방법.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2가 관절경 검사를 하는 동안에 투여되는 것인, 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PlySs2가 관절경 하의 세척을 하는 동안에 투여되는 것인, 방법.

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