CN114025783A - 治疗和预防骨和关节感染的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及治疗或预防骨或关节感染的方法,所述方法包括:向对其有需要的受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的PlySs2溶素或其与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的变体,其中所述变体包含抗革兰氏阳性菌的杀菌和/或抑菌活性,任选地共施用一种或多种抗生素,其中所述骨或关节感染包含革兰氏阳性菌(比如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。还公开了用于预防或破坏在滑液中形成的革兰氏阳性菌生物膜(比如由表皮葡萄球菌形成的生物膜)的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月11日提交的美国临时专利申请号62/832,754、2019年5月17日提交的美国临时专利申请号62/849,672、2019年11月21日提交的美国临时专利申请号62/938,812和2020年1月23日提交的美国临时专利申请号62/964,755的权益,并且依赖于它们的申请日,它们中的每一个通过全文引用并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表,且通过全文引用并入本文。2020年4月10日创建的所述ASCII副本被命名为0341_0020-00-304_ST25.txt,并且大小为37,401字节。
技术领域
本公开总体上涉及使用溶素以及任选地一种或多种抗生素治疗和预防骨和关节感染,特别是由革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))引起的骨髓炎和假体关节感染。
背景技术
微生物可分为两种不同的生命形式,即浮游形式和生物膜形式。浮游微生物是自由漂浮的,具有活跃的代谢且复制快速。相反,生物膜微生物以多细胞、复杂的三维结构存在。它们处于稳定生长期并且代谢不太活跃。
生物膜通常以“阶段”形成,包括微生物细胞附着到表面比如宿主细胞表面,接着细胞聚集、成熟和随后脱落。在初始附着期间,宿主蛋白比如纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白被吸收到表面上,导致形成条件膜(conditioning film)。吸收的宿主蛋白通过细菌蛋白和宿主蛋白之间的相互作用增强比如细菌定殖。
在初始细胞附着到表面上之后,发生多层细胞增殖以及细胞间粘附,最终形成一种或若干种物种的微菌落。该阶段之后是成熟过程,其中粘附的细胞生长并在它们自身之间相互作用。在此阶段,例如细菌细胞开始分泌包围细胞并稳定生物膜网络的胞外多糖。在成熟时,大生物膜可从它们的表面释放浮游形式,其随后分散以引起进一步的局部侵入或远处部位的接种,从而引发全新的循环。
许多难以治疗的感染都是生物膜感染,比如许多骨感染和与植入物材料(比如假体关节)相关的感染。在这些感染中,微生物通常粘附在死骨或植入物上并形成生物膜,其不仅耐受宿主机制,而且耐受大多数抗微生物剂。因此,抗生素通常对骨和关节感染表现出较差的活性,所以需要延长抗生素疗程,通常与手术联合,这种治疗才会有效。
鉴于上述内容,需要新的策略来治疗由生物膜形成细菌引起的骨和关节感染。这些策略应包括能够根除生物膜以及杀死生物膜形成细菌的药物和/或生物制剂。
发明内容
一方面,本公开涉及治疗或预防骨或关节感染比如骨髓炎(比如急性骨髓炎)的方法,所述方法包括:向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的PlySs2溶素或其变体,其中骨或关节感染包含革兰氏阳性菌。
本公开还涉及用于预防或破坏在受试者滑液中形成的生物膜的方法,其包括:向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的PlySs2溶素或其变体,其中生物膜由革兰氏阳性菌形成。
附图说明
图1绘出了溶素的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)和编码溶素的多聚核苷酸(SEQ IDNO: 18),如具体实施方式中所述。SEQ ID NO: 1代表245个氨基酸的多肽,包括在翻译后加工期间除去的起始甲硫氨酸残基,留下244个氨基酸的多肽。
图2绘出了如实施例中所述的,溶素治疗对溴化乙锭染色的生物膜结构的影响,所述生物膜结构由表皮葡萄球菌在人滑液中形成。
图3绘出了如实施例中所述用PlySs2溶素(本文也称为CF-301和exebacase)治疗之前和之后在人滑液中形成的生物膜的荧光图像。
图4绘出了展示如实施例所述用PlySs2溶素治疗后人滑液中生物膜破坏的扫描电子显微照片。
图5绘出了如实施例所述用exebacase溶素单独或与达托霉素组合治疗后,用log10cfu/克骨表示的大鼠胫骨的定量细菌培养。
图6A-6C绘出了具有感染的假体膝的患者的状况,所述患者被选出以使用如实施例5中描述的本发明方法进行治疗。图6A是展示患者假体膝的X射线图。图6B绘出了在两个选出的患者中观察到的脓毒性关节炎的临床体征。图6C绘出了治疗后脓毒性关节炎患者的有利结果。
具体实施方式
定义
如本文所用,除非上下文另外明确指出,否则以下术语及其同源词应具有以下含义:
“载体”是指与活性化合物一起施用的溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。这样的载体可以是无菌液体(比如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液)和油,包括石油、动物、植物或合成来源的油(比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。
“药学上可接受的载体”是指生理学上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等。载体必须在以药物中通常使用的量对将被治疗的受试者无害的意义上是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其它成分相容,不会使组合物不适于其预期目的。此外,药学上可接受的载体适用于如本文提供的受试者而没有过度的不良副作用(比如毒性、刺激和过敏反应)。当副作用的风险超过由组合物提供的益处时,它们是“过度的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体,比如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液(比如油/水乳液和微乳液)。合适的药物载体描述在例如E.W. Martin第18版的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。药学上可接受的载体可以是天然不存在的载体。
“杀菌的”或“杀菌活性”是指在18-24小时期间在初始细菌群体中,引起细菌死亡或能够杀死细菌至至少3-log10 (99.9%)或更好减少的程度的性质。
“抑菌的”或“抑菌活性”是指抑制细菌生长的性质,包括抑制正在生长的细菌细胞,因此在18-24小时期间在初始细菌群体中引起2-log10 (99%)或更好且直到刚好低于3-log的减少。
“抗菌剂”是指抑菌剂和杀菌剂。
“抗生素”是指具有对细菌具有负面影响的性质的化合物,比如致死或减少生长。抗生素可对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或两者具有负面影响。例如,抗生素可影响细菌中的细胞壁肽聚糖生物合成、细胞膜完整性或DNA或蛋白合成。
“抗药性”一般是指对药物的抗菌活性具有抗性的细菌。当以某些方式使用时,抗药性可具体指抗生素抗药性。在一些情况下,一般对特定抗生素敏感的细菌可发展对抗生素的抗性,从而变成抗药性微生物或菌株。“多重抗药性”(“MDR”)病原体是发展了对各自用作单一疗法的至少两类抗微生物药物的抗性的病原体。例如,已发现金黄色葡萄球菌的某些菌株对若干种抗生素(包括甲氧西林和/或万古霉素)具有抗药性(AntibioticResistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health andServices, Centers for Disease Control and Prevention)。本领域技术人员可以使用测定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术容易地确定细菌是否是抗药的。
“有效量”是指当以适当的频率或给药方案施加或施用时,足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷或预防、减少或改善所治疗的病症(此处为革兰氏阳性菌病原体生长或感染)的发作、严重性、持续时间或进程,预防所治疗的病症的进展,引起所治疗的病症的消退,或增强或改进另一疗法(比如抗生素或抑菌疗法)的预防或治疗效果的量。
“共施用”是指以顺序方式施用两种药剂(比如溶素和抗生素或任何其它抗菌剂)以及以基本上同时的方式施用这些药剂,比如以单一混合物/组合物,或以分开给予的剂量但仍然基本上同时施用于受试者,例如在同一天或24小时期间的不同时间。两种药剂(比如溶素与一种或多种另外的抗菌剂)的这种共施用,可以作为持续多至数天、数周或数月的连续治疗提供。此外,根据用途,共施用不需要是连续的或共同延伸的。例如,如果用途是作为全身性抗菌剂来治疗比如关节或骨感染,则溶素可以仅在开始时在另外的抗生素使用的24小时内施用,且然后可以继续使用另外的抗生素而不进一步施用溶素。
“受试者”是指哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物体或细胞培养物。例如,术语“受试者”旨在包括对细菌感染(例如革兰氏阳性菌感染)敏感或遭受所述感染的生物体,比如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物,比如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中,受试者是人,比如患有革兰氏阳性菌感染、处于患有革兰氏阳性菌感染的风险中或对革兰氏阳性菌感染敏感的人,无论这样的感染是全身性的、局部的或以其它方式集中或限制于特定器官或组织。
“多肽”是指由氨基酸残基制成的聚合物,且一般具有至少约30个氨基酸残基。术语“多肽”在本文中可与术语“蛋白”和“肽”互换使用。该术语不仅包括分离形式的多肽,还包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还涵盖包含溶素多肽并维持例如溶素功能的融合蛋白或融合多肽。根据上下文,多肽或蛋白或肽可以是天然存在的多肽或重组、工程改造或合成产生的多肽。例如,特定的溶素多肽可以,比如通过酶促或化学切割从天然蛋白衍生或除去,或者可以使用常规的肽合成技术(比如固相合成)或分子生物学技术(比如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, N.Y. (1989)中公开的技术)制备或可以策略性地截短或分段,产生活性片段,维持比如抗相同或至少一种共同靶细菌的溶素活性。
“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段融合产生的表达产物,导致融合的表达产物通常具有两个或更多个结构域或区段,其通常具有不同的性质或功能。在更具体的意义上,术语“融合多肽”还指包含直接或经由氨基酸或肽接头共价连接的两种或更多种异源多肽或肽的多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常是C-末端到N-末端连接,尽管它们也可以C-末端到C-末端、N-末端到N-末端或N-末端到C-末端连接。术语“融合多肽”可与术语“融合蛋白”互换使用。因此,开放式表达“包含某结构的多肽”包括比所叙述结构更大的分子,比如融合多肽。
“异源的”是指不是天然邻接的核苷酸或多肽序列。例如,在本公开的上下文中,术语“异源的”可用于描述两种或更多种多肽的组合或融合,其中所述融合多肽通常在自然界中不存在,例如溶素多肽和阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide)(Ding等人. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008))、防御素肽(Ganz, T.Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽(其可以具有增强的裂解活性)。该定义中包括两种或更多种溶素多肽或其活性片段。这些可用于制备具有裂解活性的融合多肽。
“活性片段”是指保留分离的多肽的一种或多种功能或生物活性的一部分多肽,所述片段取自所述分离的多肽,例如抗一种或多种革兰氏阳性菌(比如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)的杀菌活性。
“协同”或“超加性”是指由两种物质组合产生的有益效果,其超过这两种试剂独立起作用的效果的总和。在某些实施方案中,协同或超加性效应显著,即统计学上显著超过这两种试剂独立起作用的效果之和。一种或两种活性成分可以在亚阈值水平使用,即如果单独使用活性物质则不产生或产生非常有限的效果的水平。可以通过本文所述的测定比如棋盘试验来测量效果。
“治疗”是指任何过程、动作、施加、疗法等,其中受试者(包括人类)直接或间接地经受医疗救助,目的是治愈病症、根除病原体或改善受试者的状况。治疗还指减少发生、缓解症状、消除复发、预防复发、预防发生、降低发生风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”可进一步涵盖减少受试者中细菌的群体、生长速率或毒力,从而控制或减少受试者中的细菌感染或器官、组织或环境的细菌污染。因此,减少发生的“治疗”可以,例如有效抑制至少一种革兰氏阳性菌在特定环境(无论其是受试者还是环境)中的生长。另一方面,已经建立的感染的“治疗”是指减少造成感染或污染的革兰氏阳性菌的群体、杀死所述革兰氏阳性菌、抑制所述革兰氏阳性菌的生长和/或根除所述革兰氏阳性菌。
“预防”是指预防病症比如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或建立。本公开不旨在限于完全预防或预防感染的建立。在一些实施方案中,延迟了发作或降低了随后感染性疾病的严重性或感染疾病的机会,且这构成预防的实例。
“感染性疾病”是指表现出临床或亚临床症状的疾病,比如发热、脓毒症或菌血症的检测,以及当与这种病理学相关的症状尚未表现时可通过细菌病原体的生长(比如在培养物中)检测到的疾病。
在肽或多肽或其活性片段的上下文中,“衍生物”旨在涵盖,例如经修饰以含有一个或多个除氨基酸以外的化学部分的多肽,所述化学部分基本上不会不利地影响或破坏多肽的活性,比如溶素活性。化学部分可以,比如经由氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基或在内部氨基酸残基处共价连接至肽。这些修饰可以是天然的或非天然的。在某些实施方案中,非天然修饰可包括在反应性部分上添加保护或封端基团、添加可检测标记比如抗体和/或荧光标记、添加或修饰糖基化或添加填充基团(bulking group)比如PEG(聚乙二醇化)和本领域技术人员已知的其它改变。在某些实施方案中,非天然修饰可为封端修饰,比如N-末端乙酰化和C-末端酰胺化。可加入溶素多肽的示例性保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记蛋白,比如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry,是可以共价或非共价结合到多肽上或融合到多肽上而不干扰细胞蛋白的正常功能的紧密蛋白。在某些实施方案中,将编码荧光蛋白的多核苷酸插入多核苷酸序列的上游或下游。这将产生融合蛋白(比如溶素多肽::GFP),其不干扰细胞功能或其附着的多肽的功能。聚乙二醇(PEG)与蛋白的缀合已被用作延长许多药物蛋白的循环半衰期的方法。因此,在多肽衍生物比如溶素多肽衍生物的上下文中,术语“衍生物”涵盖通过共价附着一个或多个PEG分子而化学修饰的多肽比如溶素多肽。预期溶素多肽比如聚乙二醇化的溶素,与未聚乙二醇化的多肽相比,将表现出延长的循环半衰期,同时保持生物和治疗活性。
“氨基酸序列同一性百分比”是指在比对序列并引入缺口(如果需要)以获得最大序列同一性百分比且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后,候选序列中与参考多肽序列(比如溶素多肽序列)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现,例如使用公众可获得的软件(比如BLAST)或例如从DNASTAR商购可获得的软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100%(其间的任何值)相同的,或其间的任何整数值。在本公开的上下文中,当至少80%的氨基酸残基(通常至少约85%、至少约90%并且通常至少约95%、至少约98%或至少99%)相同时,两个多肽是“基本上相同的”。如本文所述的术语“氨基酸序列同一性百分比(%)”也适用于肽。因此术语“基本上相同的”将涵盖分离的多肽和肽(比如本文所述的多肽和肽)的突变的、截短的、融合的或以其它方式序列修饰的变体及其活性片段,以及与参考(野生型或其它完整的)多肽相比具有相当大的序列同一性(比如,例如如通过以上提及的一种或多种方法测量的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性)的多肽。当至少约80%的氨基酸残基(通常至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%同一性或至少约99%同一性)相同或表现保守取代时,两个氨基酸序列是“基本上同源的”。当多肽(比如本文所述的溶素多肽)的一个或多个或若干个,或高达10%、或高达15%、或高达20%的氨基酸被类似的或保守的氨基酸取代所取代,并且其中所得多肽(比如本文所述的溶素)具有参考多肽(比如本文所述的溶素)的至少一种活性、抗菌效果和/或细菌特异性时,本公开的多肽序列基本上是同源的。
如本文所用,“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替代的取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(比如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(比如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(比如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(比如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(比如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(比如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
“生物膜”是指附着于表面并聚集在水合聚合基体中的细菌,所述水合聚合基体可包含细菌和/或宿主来源的组分。生物膜是微生物的聚集体,其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞频繁地包埋在由但不限于胞外聚合物质(EPS)组成的基体中。生物膜EPS,也称为粘液(slime)(尽管不是所有描述为粘液的都是生物膜)或菌斑,是一般由细胞外DNA、蛋白和多糖组成的聚合聚集物。
在适用于抗某些细菌的抗生素的上下文中,“合适的”是指发现对那些细菌有效的抗生素,即使随后发展出抗性。
骨和关节感染
本申请发明人惊讶地认识到,某些生物制剂即溶素,可用于杀死可能引起骨和关节感染的生物膜形成细菌,比如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌,包括抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和多重抗药性(MDR)表皮葡萄球菌。溶素还令人惊讶地能够破坏由比如滑液或骨中的表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌形成的成熟生物膜。这些抗微生物剂是噬菌体编码的水解酶,其通过从细胞内降解肽聚糖来从被感染的细菌中释放子代噬菌体,引起宿主细菌的裂解。溶素通过从细菌细胞外攻击肽聚糖而对抗病原菌。通常,溶素对细菌物种是高度特异性的,并且很少裂解非靶标生物包括肠道共生细菌,这可能有益于维持胃肠稳态。
一方面,本公开涉及治疗骨或关节感染的方法,所述方法包括:向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的PlySs2溶素,其中骨或关节感染包含革兰氏阳性菌。
在一些实施方案中,骨感染是骨髓炎,即骨对感染生物体的炎症反应。在一些实施方案中,骨感染比如骨髓炎是由革兰氏阳性菌比如金黄色葡萄球菌或MRSA引起的。在一些实施方案中,革兰氏阳性菌具有形成生物膜和进入成骨细胞并在其中存活的能力,因此允许革兰氏阳性菌逃脱免疫系统和许多传统抗生素。
在一些实施方案中,骨髓炎是急性骨髓炎。在其它实施方案中,骨感染是慢性骨髓炎。当感染和有效治疗之间的延迟超过4-6周时,认为骨髓炎是慢性的。
在一些实施方案中,骨髓炎包括长骨比如股骨、胫骨、肱骨和桡骨的感染。在其它实施方案中,骨髓炎包括脊柱特别是腰椎、骶骨和骨盆的感染。通常,儿童在长骨中发生骨髓炎,而成人在脊柱中发生骨髓炎。
在一些实施方案中,骨髓炎是外源性骨髓炎。在这些实施方案中,外源性骨髓炎可在骨从皮肤中伸出时发生,允许潜在感染性生物体从脓肿或烧伤、穿刺伤口或其它创伤比如开放性骨折进入。在其它实施方案中,外源性骨髓炎是植入物相关的骨髓炎。通常,植入物是机械装置,比如金属板、销、杆、线或螺钉,其用于比如稳定和连接骨折骨的端部。在一些实施方案中,当仅使用抗生素治疗感染时,植入物相关的骨髓炎变成慢性的。
在一些实施方案中,骨髓炎是血源性骨髓炎。血源性骨髓炎可从先前存在的感染(比如脓疱病、疖病(持续性疖)、水痘感染病变(水痘)和窦、耳、牙、软组织、呼吸道和泌尿生殖道感染)的生物体的传播中获得。在一些实施方案中,泌尿生殖道感染可导致骶骨或髂骨的骨髓炎。
在一些实施方案中,慢性骨髓炎发生于在前抗生素时代或在患者童年时患有急性骨髓炎的患者中。这种感染可在数十年的无症状间隔后复发,这是由于比如粘附在死骨上的生物膜的无症状持续性。
在其它实施方案中,本发明方法的溶素用于治疗关节感染。受感染的关节可包括受感染的髋、膝、踝、肩、肘或腕关节。通常,受感染的关节是膝关节或髋关节。
在一些实施方案中,感染的关节是天然关节。当穿透性损伤(比如穿刺伤口)发生在关节附近或上方,从而允许细菌直接进入关节时,可能发生天然关节的感染(在本文中也称为天然关节的脓毒性关节炎)。在其它实施方案中,当来自远处感染的细菌通过血流扩散到天然关节时发生关节感染。
在其它实施方案中,感染的关节是假体关节,包括例如假体关节的脓毒性关节炎。假体关节可包括髋、膝、肩、肘和踝假体。通常,假体关节是假体髋或假体膝。
在一些实施方案中,本公开的假体关节感染发生在手术的1年内。这种感染可以由在手术时引入微生物来引发。这可以由假体或假体周围组织的直接接触或雾化污染而发生。一旦与植入物表面接触,微生物可在表面定殖。
在其它实施方案中,由于感染从邻近部位扩散而发生假体关节感染。例如,在术后早期,浅表手术部位感染可能发展为涉及假体。在其它实施方案中,由于生物体经由血流从感染的远端部位扩散而发生假体关节感染。
在一些实施方案中,假体关节感染复发。例如,在一些实施方案中,关节感染是复发性多重抗药性感染,比如复发性多重抗药性表皮葡萄球菌假体膝感染(PKI)。
通常,当病原体通过培养从获自感染的假体关节的至少两个单独的组织或流体样品中分离时,或当存在以下六个标准中的四个时,指示假体关节感染:血清红细胞沉降率(ESR)和血清C-反应蛋白(CRP)浓度升高,滑膜白细胞计数升高,滑膜嗜中性粒细胞百分比(PMN%)升高,被感染的关节中出现脓液,假体周围组织或流体的一个培养物中分离出微生物,或在×400放大倍率下从假体周围组织的组织学分析中观察到的5个高倍视野中每个高倍视野有多于5个嗜中性粒细胞。
通常,从假体关节获得的以评估病原体的流体是滑液。如本文所用,“滑液”是在滑膜关节腔中发现的粘性流体。滑液的主要作用是减少运动期间滑膜关节的关节软骨之间的摩擦。
在一些实施方案中,滑液样品可通过抽吸获得。可以评估吸出物的总有核细胞计数和嗜中性粒细胞百分比作为假体关节感染的指示。通常,与未患假体关节感染的受试者相比,从患有假体关节感染的受试者获得的滑液中每微升总有核细胞的量和/或嗜中性粒细胞百分比更高。例如,在一些实施方案中,来自具有假体关节的受试者的滑液中1,100个总有核细胞/微升的阈值和/或64%嗜中性粒细胞的阈值指示假体关节感染比如假体膝关节感染。
在一些实施方案中,代替或除了测定嗜中性粒细胞的量,可使用比如比色条来评估白细胞酯酶的水平(一种存在于嗜中性粒细胞中的酶),所述比色条可广泛用于测定脓尿以诊断尿路感染,如Parvizi等人., “Diagnosis of periprosthetic joint infection:the utility of a simple yet unappreciated enzyme.”, J. Bone Joint Surg. Am.,2011, 93:2242–2248中所述,其通过全文引用并入本文。
然而,更典型地,培养滑液样品以确定是否指示假体关节感染的诊断并鉴定感染病原体。该信息还可告知治疗期间抗生素的选择(如果用的话)。在这些实施方案中,抽吸的滑液可以在收集时接种到血液培养瓶中,或运输到微生物实验室并接种到固体和/或液体培养基上。比如参见Fehring等人, “Aspiration as a guide to sepsis in revisiontotal hip arthroplasty,” 1996, J. Arthroplasty, 11:543–547,其通过全文引用并入本文。
致病微生物
在一些实施方案中,本发明的骨和/或关节感染由革兰氏阳性菌引起,比如链球菌属(Streptococcus)物种,包括解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)。然而,更典型地,骨和/或关节感染是由葡萄球菌属(Staphylococcus)物种引起,比如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在其它实施方案中,葡萄球菌属物种是凝固酶阴性葡萄球菌属物种,比如表皮葡萄球菌、拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)或其组合。通常,表皮葡萄球菌是在骨和/或关节感染中鉴定的凝固酶阴性葡萄球菌属物种。
在一些实施方案中,本发明的骨和/或关节感染由来自肠球菌(Enterococcus)属的革兰氏阳性菌物种引起。
在一些实施方案中,本发明的骨和/或关节感染是由多微生物感染引起的。例如,肠球菌属物种和葡萄球菌属物种的组合可被鉴定为骨和/或关节感染的病原体。典型地与特定感染结构相关的致病微生物的实例示于下表1中。
表1.骨和关节感染的革兰氏阳性菌病原体
溶素
用于在受试者中治疗和/或预防骨和关节感染和/或抑制或破坏生物膜形成的本发明方法,包括向对其有需要的受试者施用如本文所述的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,任选地与如本文所述的一种或多种抗生素组合。在一些实施方案中,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物表现出对革兰氏阳性菌的杀菌和/或抑菌活性。在一些实施方案中,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物还表现出低抗性倾向,抑制抗生素抗性和/或表现出与常规抗生素的协同。在其它实施方案中,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物抑制细菌凝集、生物膜形成和/或减少或根除生物膜,包括患有骨或关节感染的受试者中的生物膜。
本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的杀菌活性可以使用本领域已知的任何方法测定。例如,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以使用例如,如在Mueller等人, 2004, Antimicrob Agents Chemotherapy, 48:369-377中所述的时间杀菌试验在体外评估,所述文献通过全文引用并入本文。
本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的抑菌活性也可使用任何本领域已知的方法评估。例如,生长曲线可以在比如补充了人血清至50%的终浓度的阳离子调节的Mueller Hinton II肉汤中(caMHB/50% HuS)或补充了100%血清的阳离子调节的MuellerHinton II肉汤中或在非标准培养基(用马血清补充至25%和用DTT补充至0.5 mM的caMHB(caMHB-HSD))中进行。革兰氏阳性菌可用溶素悬浮,并且培养物浊度可在600nm的光密度下使用比如SPECTRAMAX ®M3多模式微板读取器(Molecular Devices)测量,伴随着比如在24℃下在搅拌下11小时内每1分钟读取一次。可以根据在Saito等人, 2014, Antimicrob Agents Chemother 58:5024-5025中所述的方法在通气的烧瓶中生长的对数期的培养物中计算倍增时间,所述文献通过全文引用并入本文,并且与在不存在本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的情况下的培养物的倍增时间进行比较。
在一些实施方案中,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物在滑液比如人滑液存在下表现出溶素活性。评估滑液中溶素活性的合适方法是本领域已知的,并描述在实施例中。简言之,可以测定滑液中溶素的MIC值(即与对照相比足以抑制至少80%的细菌生长的肽的最小浓度),并将其MIC值与比如母体溶素或不存在溶素的情况下进行比较。
更特别地,可以针对比如表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌在比如用生理盐浓度和滑液(比如人滑液)补充的Mueller-Hinton肉汤(MHB)中测定溶素的MIC值。溶素对比如表皮葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC)可根据临床和实验室标准研究所(CLSI)方法(M07-A11,2018, 其通过全文引用并入本文)在非标准培养基(用人滑液补充至50%的caMHB(caMHB-HSF))中使用肉汤微量稀释(BMD)测定。参见实施例。
在一些实施方案中,包含溶素、变体溶素、其活性片段或衍生物的本发明分离的多肽降低了在比如人血清或滑液存在下抑制细菌所需的抗生素的最小抑制浓度(MIC)。可以使用任何已知的方法来评估该MIC。在一些实施方案中,使用棋盘测定来测定溶素对抗生素浓度的影响。棋盘测定基于通过肉汤微量稀释进行MIC测定的CLSI方法的修改(参见CLSI.2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for BacteriaThat Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical andLaboratory Standards Institute, Wayne, PA等人(其通过全文引用并入本文)和Ceri等人. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776(其也通过全文引用并入本文))。
通过首先制备比如96孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘,其中每个孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在单独的板中,制备类似的行,其中每个孔具有相同量的沿垂直轴稀释比如2倍的溶素。然后组合溶素和抗生素稀释液,使得每列具有恒定量的抗生素和加倍稀释的溶素,而每行具有恒定量的溶素和加倍稀释的抗生素。因此,每个孔都具有溶素和抗生素的独特组合。例如,将细菌以在caMHB-HSF中1×105 CFU/ml的浓度加入药物组合中。然后在比如37℃下在环境空气中16小时后记录每种药物单独和组合的MIC。计算每种药物的累加部分抑制浓度(Summation fractional inhibitory concentrations) (∑FIC),并使用最小∑FIC值(∑FICmin)测定溶素/抗生素组合的效果。
可以使用本领域已知的任何方法评估细菌凝集的抑制。例如,可以使用Walke等人描述的方法,即Walker等人, 2013, PLoS Pathog, 9:e1003819,其通过全文引用并入本文。
用于评估溶素或其活性片段或变体或其衍生物在体外抑制或减少生物膜形成的能力的方法是本领域熟知的,并且包括对肉汤微量稀释最小抑制浓度(MIC)方法经修改的变型(参见Ceri等人, 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776(其通过全文引用并入本文)和Schuch等人, 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, 1-18页(其通过全文引用并入本文))。在用于评估最小生物膜根除浓度(MBEC)的该方法中,将比如金黄色葡萄球菌菌株或表皮葡萄球菌菌株的新鲜菌落悬浮于培养基中,比如在TSBg(用0.2%葡萄糖补充的胰酶大豆肉汤)中以比如1:100稀释的磷酸盐缓冲溶液(PBS),以比如0.15ml等分试样添加到卡尔加里生物膜装置(Calgary Biofilm Device)(具有带有96个聚碳酸酯桩钉的盖的96孔板; Innovotech Inc.)中并在37℃下孵育比如24小时。然后洗涤生物膜并用在比如TSBg中的比如2倍稀释系列的溶素在比如37℃下处理24小时。处理后,洗涤孔,在比如37℃下风干并用比如0.05%结晶紫染色10分钟。染色后,将生物膜在比如33%乙酸中脱色并测定比如提取的结晶紫的OD600。每个样品的MBEC是通过结晶紫定量评估的除去>95%的生物膜生物量所需的最小溶素浓度。
在一些实施方案中,针对如本文所述的从患有骨和/或关节感染的受试者中获得的革兰氏阳性菌裂解物评估本发明的溶素、变体溶素及其片段。获得这些分离株的方法是本领域熟知的,并描述在例如Schmidt-Malan等人, Diag. Microbiol. Infect. Dis. 85:77-79中,其通过全文引用并入本文。
适用于本发明方法的溶素包括如WO 2013/170015和WO 2013/170022中所述的PlySs2溶素,所述文献各自通过全文引用并入本文。如本文所用,术语“PlySs2溶素(lysin)”、“PlySs2溶素(lysins)”、“PlySs2”、“Exebacase”和“CF-301”可互换使用并且涵盖如WO 2013/170015和WO 2013/170022中所述的如本文中SEQ ID NO: 1所示的PlySs2溶素(具有或不具有初始甲硫氨酸残基)或其活性片段或变体或其衍生物。PlySs2,其被鉴定为在猪链球菌(Streptococcus suis)基因组的原噬菌体内编码的抗葡萄球菌溶素,表现出对下表2所述细菌的杀菌和抑菌活性。
表2.使用溶素PlySs2的不同细菌生长的减少和相对灭杀(部分列表)
在一些实施方案中,适用于本发明方法的溶素是SEQ ID NO: 1的PlySs2溶素。SEQID NO: 1的PlySs2溶素具有大多数噬菌体溶素特征性的结构域排列,由与细胞壁结合C-末端结构域(图1)连接的催化N-末端结构域(图1)定义。N-末端结构域属于溶素和其它细菌细胞壁修饰酶中常见的半胱氨酸-组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)家族。C-末端结构域属于常常形成溶素的细胞壁结合元件的SH3b家族。图1绘出了SEQ ID NO: 1的PlySs2溶素,其中N-和C-末端结构域以阴影区域显示。N-末端CHAP结构域对应于以LNN开始的第一个阴影氨基酸序列区域,而C-末端SH3b结构域对应于以RSY开始的第二个阴影区域。
在一些实施方案中,适用于本文公开的方法的溶素包含以下溶素的一种或多种:pp55 (SEQ ID NO: 3)、pp61 (SEQ ID NO: 4)、pp65 (SEQ ID NO: 5)、pp296 (SEQ ID NO:6)、pp324 (SEQ ID NO: 7)、pp325 (SEQ ID NO: 8)、pp338 (SEQ ID NO: 9)、pp341 (SEQID NO: 10)、pp388 (SEQ ID NO: 11)、pp400 (SEQ ID NO: 12)、pp616 (SEQ ID NO: 13)、pp619 (SEQ ID NO: 14)、pp628 (SEQ ID NO: 15)、pp632 (SEQ ID NO: 16)和pp642 (SEQID NO: 17).
在一些实施方案中,本发明方法包括向对其有需要的受试者施用变体溶素。用于本发明方法的合适的溶素变体包括相对于SEQ ID NO: 1具有至少一个取代、插入和/或缺失的那些多肽,其保留参考溶素的至少一种生物学功能。在一些实施方案中,变体溶素表现出抗细菌活性,包括对广泛范围的革兰氏阳性菌(包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)的溶菌和/或抑菌效果,和抑制凝集、抑制生物膜形成和/或减少生物膜的能力。在一些实施方案中,本发明的溶素变体使革兰氏阳性菌对抗生素更敏感。
在一些实施方案中,适用于本发明方法的溶素变体包括与SEQ ID NO: 1具有至少80%,比如至少85%、比如至少90%、比如至少95%、比如至少98%或比如至少99%序列同一性的分离的多肽序列,其中变体溶素保留具有如本文所述的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PlySs2溶素的一种或多种生物活性。
溶素变体可以通过本领域已知的且如WO2013/170015中所述的任何方法形成,比如通过定点诱变修饰SEQ ID NO: 1的PlySs2溶素或经由在产生SEQ ID NO: 1的PlySs2溶素的宿主中的突变,且其保留如本文所述的一种或多种生物功能,所述WO2013/170015通过其全文引用并入本文。例如,本领域技术人员可以合理地对比如SEQ ID NO: 1的PlySs2溶素的CHAP结构域和/或SH3b结构域进行和测试取代或替代。与Genbank数据库的序列比较可以用CHAP和/或SH3b结构域序列之一或两者或用SEQ ID NO: 1的PlySs2溶素全长氨基酸序列进行,例如,以鉴定用于取代的氨基酸。例如,在SEQ ID NO: 1的PlySs2氨基酸序列中的缬氨酸氨基酸残基19处,具有替代缬氨酸的丙氨酸的突变体或变体是有活性的,并且能够以与SEQ ID NO: 1 PlySs2溶素相似和同样有效的方式杀死革兰氏阳性菌。
此外,如图1所示,CHAP结构域含有保守的半胱氨酸和组氨酸氨基酸序列(CHAP结构域中的第一个半胱氨酸和组氨酸),其在不同多肽的CHAP结构域中是特征性的和保守的。合理地预测,例如,保守的半胱氨酸和组氨酸残基应该保持在PlySs2的突变体或变体中,以维持活性或能力。因此,保留在本公开的溶素变体中的特别期望的残基包括SEQ ID NO: 1的CHAP结构域中的活性位点残基Cys26、His102、Glu118和Asn120。特别期望的取代包括:Lys取代Arg且反之亦然,使得可以维持正电荷;Glu取代Asp且反之亦然,使得可以维持负电荷;Ser取代Thr使得可以维持游离的-OH,以及Gln取代Asn使得可以维持游离的NH2。
合适的变体溶素还描述在PCT公开申请号WO 2019/165454(国际申请号:PCT/US2019/019638)中,其通过全文引用并入本文。特别地,合适的变体溶素包括本文如SEQ IDNO: 3-17所示的变体溶素以及与SEQ ID NO: 3-17中的任一个具有至少80%,比如至少85%、比如至少90%、比如至少95%、比如至少98%或比如至少99%序列同一性的变体溶素,其中变体溶素保留具有如本文所述的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PlySs2溶素的一种或多种生物活性。
SEQ ID NO: 3-17是经修饰的溶素多肽,其相对于对应的野生型PlySs2溶素SEQID NO: 1具有至少一个氨基酸取代,同时保持抗菌活性和有效性。SEQ ID NO: 3-17可参考其相对于SEQ ID NO: 1的氨基酸取代进行描述,如下表A所示。经修饰的溶素多肽的氨基酸序列(参考与SEQ ID NO: 1的差异及其氨基酸残基的位置)使用单字母氨基酸代码总结如下:
表A
在一些实施方案中,本发明方法包括向对其有需要的受试者施用溶素的活性片段。合适的活性片段包括保留溶素实施方案的蛋白或肽片段的生物活性部分的活性片段,如本文所述。这样的变体包括包含含有比溶素蛋白的全长蛋白更少的氨基酸且表现出对应全长蛋白的至少一种活性的氨基酸序列的多肽。通常,生物活性部分包含具有对应蛋白的至少一种活性的结构域或基序。在图1中提供了PlySs2溶素的N-末端CHAP结构域的示例性结构域序列。在图1中还提供了PlySs2溶素的C末端SH3b结构域的示例性结构域序列。本公开的蛋白或蛋白片段的生物活性部分可以是在长度上为例如10、25、50、100个氨基酸的多肽。可以通过重组技术制备其中蛋白的其它区域缺失的其它生物活性部分,并评价天然形式的实施方案的多肽的一种或多种功能活性。
在一些实施方案中,合适的活性片段包括与本文所述的活性片段具有至少80%,比如至少85%、比如至少90%、比如至少95%、比如至少98%或比如至少99%序列同一性的活性片段,其中其活性片段保留CHAP和/或SH3b结构域的至少一种活性,比如如图1所示的。
本文所述的用于本发明方法的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以在用特定噬菌体感染后由细菌生物体产生,或者可以重组或合成产生或制备。由于本文描述和提及了溶素多肽序列和编码溶素多肽的核酸,本发明的溶素可以经由从噬菌体基因组中分离溶素基因,将该基因放入转移载体中,并将所述转移载体克隆到表达系统中来产生,使用如例如WO2013/170015中所述的本领域的标准方法,所述文献通过全文引用并入本文。本发明的溶素变体可以是截短的、嵌合的、改组的或“天然的”,并且可以是如例如在美国专利号5,604,109中描述的组合,所述文献通过全文引用并入本文。
可以在氨基酸序列中,或在编码本文所述的多肽和溶素的核酸序列中,包括在SEQID NO: 1所示的溶素序列中,或在其活性片段或截短物中进行突变,使得特定密码子变为编码不同氨基酸的密码子、一个氨基酸取代另一个氨基酸或缺失一个或多个氨基酸。
这种突变一般通过尽可能进行最少的核苷酸改变来进行。这种取代突变可以以非保守方式(例如,通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸改变为属于另一组的氨基酸)或以保守方式(例如,通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸改变为属于相同组的氨基酸)进行以改变所得蛋白中的氨基酸。这种保守性改变一般导致所得蛋白的结构和功能变化较小。非保守性改变更可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。本公开应被认为包括含有不显著改变所得蛋白的活性或结合特征的保守性改变的序列。因此,本领域技术人员基于对本文提供的PlySs2溶素多肽的序列的考查以及他们的知识和可获得的其它溶素多肽的公开信息,可以在溶素多肽序列中进行氨基酸改变或取代。可以进行氨基酸改变以替代或取代本文提供的溶素序列中的一个或多个、一个或几个、一个或若干个、一个至五个、一个至十个或此类其它数目的氨基酸,以产生其突变体或变体。可以预测所述其突变体或变体的功能,或测试所述其突变体或变体的如本文所述的对比如葡萄球菌、链球菌或肠球菌的抗菌活性的功能或能力,和/或具有与本文所述和特别提供的溶素相当的活性的功能或能力。因此,可以使用本领域已知的和本文描述的测定和方法,测试对溶素序列和本文描述的突变体或变体进行的改变。本领域技术人员基于本文的溶素的结构域结构可以预测一个或多个、一个或若干个适于取代或替代的氨基酸和/或一个或多个不适于取代或替代的氨基酸,包括合理的保守或非保守取代。
抗生素
在一些实施方案中,如本文所述的治疗或预防骨和关节感染的方法包括共施用治疗有效量的一种或多种抗生素和PlySs2溶素。在一些实施方案中,如本文所述的溶素或其活性片段或变体或其衍生物与一种或多种抗生素的共施用导致对革兰氏阳性菌比如金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌的协同杀菌和/或抑菌效果。通常,共施用导致对抑菌和/或杀菌活性的协同作用。在其它实施方案中,共施用用于抑制毒力表型,包括生物膜形成和/或凝集。在一些实施方案中,共施用用于减少受试者中生物膜的量。
适用于本发明方法的抗生素包括不同类型和种类的抗生素,比如β-内酰胺,包括青霉素类(比如甲氧西林、苯唑西林)、头孢菌素类(比如头孢氨苄和头孢克罗(cefactor))、单环内酰胺类(比如氨曲南)和碳青霉烯类(比如亚胺培南和恩他培南);大环内酯类(比如红霉素、阿奇霉素)、氨基糖苷类(比如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星)、糖肽类(比如万古霉素、替考拉宁)、噁唑烷酮类(比如利奈唑胺和替地唑胺)、脂肽类(比如达托霉素)和磺胺类(比如磺胺甲噁唑)。
在一些实施方案中,抗生素包括利福霉素抗生素,比如利福平或利福布汀。通常,使用利福霉素抗生素。
在一些实施方案中,抗生素是通常用于治疗骨髓炎比如急性骨髓炎的抗生素,比如万古霉素或达托霉素。在一些实施方案中,抗生素(比如达托霉素)很好地穿透骨组织。
本公开另外的方法
另一方面,本公开涉及一种预防由如本文所述的革兰氏阳性菌引起的骨或关节感染的方法,所述方法包括:向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的PlySs2溶素或其变体。任选地,与PlySs2溶素共施用本文所述的抗生素。
在一些实施方案中,如本文所述的PlySs2溶素或其变体与清创术和植入物保留(DAIR)联合施用。在这些实施方案中,对比如植入物周围的受感染和潜在受感染的组织进行清创后接着用大量液体(比如无菌盐水)关节镜下冲洗涉及的组织。在一些实施方案中,如本文所述的PlySs2溶素或其变体在关节镜检查期间、在关节镜下冲洗之前、期间或之后施用。在一些实施方案中,将如本文所述的常规抗生素比如替地唑胺随后口服或静脉内施用于受试者持续比如6-24周。
在一些实施方案中,待施用本公开的溶素的受试者是老年人或患有与骨或关节感染的较高风险相关的病况。例如,处于骨或关节感染风险的受试者可能患有肥胖症,比如35的体重指数(BMI)阈值。老年受试者例如为至少65岁,比如65-90岁、75-90岁或79-89岁。不受理论的限制,伴随肥胖症的骨或关节感染(比如假体骨或关节感染)的风险增加的可能原因包括手术持续时间延长和/或存在其它并存病。
在一些实施方案中,处于骨或关节感染特别是假体关节感染的风险中的受试者患有糖尿病。不受理论的限制,与糖尿病相关的风险可能是由于在糖尿病患者中存在葡萄糖水平升高、白细胞功能受损或微血管变化时生物膜形成增加,这可能影响伤口愈合和浅表手术部位感染的发展。
骨和/或关节感染的其它风险因素包括类风湿性关节炎、男性和吸烟。此外,植入手术前一年的菌血症诊断也是骨和/或关节感染(比如假体关节感染)的风险因素。
另一个方面,本公开涉及用于抑制革兰氏阳性菌生物膜的形成或破坏滑液中形成的革兰氏阳性菌生物膜的方法,所述方法包括施用包含如本文所述的能够杀死革兰氏阳性菌的溶素的组合物,其中所述溶素是如本文所述的PlySs2溶素,并且所述生物膜被有效抑制或分散。本公开的该方面中的革兰氏阳性菌可包括本文所述的任何革兰氏阳性菌。然而,通常革兰氏阳性菌是表皮葡萄球菌。
剂量和施用
向对其有需要的受试者施用的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的剂量取决于多种因素,包括待治疗的感染的活性,待治疗的受试者的年龄、健康和一般身体状况,特定溶素或其活性片段或变体或其衍生物的活性,与根据本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物配对的抗生素(如果有的话)的性质和活性以及这种配对的组合效果。通常,待施用的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物的有效量预期落在0.00001-200 mg/kg的范围内,比如0.2 mg/kg至约0.3 mg/kg、比如0.25 mg/kg、比如1-150 mg/kg、比如40 mg/kg至100 mg/kg,并且在长达14天的时间段内每天施用1-4次。考虑到比如协同作用,抗生素可以以标准给药方案或以较低量施用。然而,所有这样的剂量和方案(无论溶素或其活性片段或变体或其衍生物或与其联合施用的任何抗生素)都可进行优化。最佳剂量可通过进行如本领域技术范围内的体外和体内试验性药效实验来确定,但将本公开内容考虑在内。
预期本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物提供杀菌效果,并且当以较少量使用时提供抑菌效果,且对一系列的耐抗生素细菌均有活性,而与进化抗性无关。基于本公开,在临床环境中,当与某些抗生素(甚至细菌对其产生抗性的抗生素)组合时,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物是组合物的有效替代物(或添加剂或组分),所述组合物用于治疗由抗药性和多重抗药性细菌引起的骨和关节感染。革兰氏阳性菌的现有抗性机制不应影响对本发明多肽的裂解活性的敏感性。
对于本公开的任何多肽,治疗有效剂量最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(通常为小鼠、兔、狗或猪)中估计。动物模型也可用于获得期望的浓度范围和施用途径。所获得的信息然后可用于确定人的有效剂量以及施用途径。然而,通常使用全身施用,特别是静脉内施用。可以进一步调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望的效果。可考虑在内的另外的因素包括患者的疾病状态的严重程度、年龄、体重和性别;饮食,期望的治疗持续时间,施用方法,施用时间和频率,药物组合,反应敏感性和对疗法的耐受性/反应以及治疗医师的判断。
治疗方案可涉及每日施用(比如每日一次、两次、三次等),每隔一天(比如每隔一天一次、两次、三次等),半周,每周,每两周一次,每月一次等。在一个实施方案中,治疗可作为持续输注给予。单位剂量可以多次施用。间隔也可以是不规则的,如通过监测临床症状所指示的。或者,单位剂量可以作为缓释制剂施用,在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率可以根据患者而变化。本领域技术人员将理解,对于局部施用(比如鼻内、吸入、直肠等),或对于全身施用(比如口服、直肠(比如经由灌肠剂)、i.m. (肌内)、i.p. (腹膜内)、i.v. (静脉内)、s.c. (皮下)和经尿道等),这样的指导原则将被调整。
在一些实施方案中,如本文所述的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和一种或多种抗生素比如达托霉素同时施用。在其它实施方案中,本发明方法的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和一种或多种抗生素比如达托霉素,以任何顺序连续施用,比如顺序施用。在一些实施方案中,在施用标准护理抗生素治疗(比如两周疗程的苯唑西林和庆大霉素或达托霉素)期间或之后施用溶素。本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和本发明的一种或多种抗生素可以单剂量或多剂量、单独或组合施用。
本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和一种或多种抗生素可以通过相同施用模式或通过不同施用模式施用,并且可以一次、两次或多次,一种或多种组合或单独施用。因此,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以以初始剂量施用,然后施用随后的一个或多个剂量,特别是取决于反应,比如杀菌和/或抑菌效果和/或对凝集和/或生物膜形成或减少的影响,并且可以与抗生素剂量组合或交替。通常,以单次推注施用溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后是常规剂量和施用模式的本公开的一种或多种抗生素。
在更典型的实施方案中,向受试者施用单次推注的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后施用常规方案(比如标准护理(SOC)剂量)的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)。在其它典型的实施方案中,向受试者施用本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素),然后施用单次推注的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后以常规剂量施用另外剂量的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)。
在一些实施方案中,溶素或其活性片段或变体或其衍生物可以亚MIC水平施用,比如以从0.9×MIC至0.0001×MIC的亚MIC水平。在这样的亚MIC水平,本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物通常用于抑制革兰氏阳性菌的生长、减少凝集和/或抑制生物膜形成或减少或根除生物膜。
在一些实施方案中,向受试者施用单次亚MIC剂量的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后施用常规方案的一个或多个剂量的本公开的一种或多种抗生素。在其它甚至更典型的实施方案中,以常规剂量向受试者施用本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素),然后以亚MIC剂量施用单次推注的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后以常规剂量施用另外剂量的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素)。
不受理论的限制,亚MIC剂量的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物可导致对细胞被膜的非致死性损伤,由溶素或其活性片段或变体或其衍生物的肽聚糖水解活性介导。在一些实施方案中,细胞被膜中产生的物理和功能变化解释了生长延迟。这种物理和功能变化包括比如细胞壁的不稳定、膜渗透性的增加和膜电位的消散。尽管本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物通常不直接作用于细菌细胞膜,但对细胞膜渗透性和静电势的任何影响都可能是由在非常低的浓度下溶素的肽聚糖水解活性(和细胞被膜的不稳定)诱导的渗透应激的结果。还假定局部细胞壁水解可导致内膜的挤出和孔的形成以及细胞合成和水解的解偶联,细胞壁厚度的变化(导致随后的生长停滞)。
在一些实施方案中,亚MIC浓度的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物损害细菌细胞被膜,导致与不存在亚MIC剂量的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物相比,细菌对常规抗生素更敏感。
在一些实施方案中,亚MIC和/或MIC水平剂量的本发明的溶素或其活性片段或变体或其衍生物能够减少生物膜,特别是体内生物膜。如本领域已知的,体内生物膜可在结构上不同于体外生物膜。通常,体外生物膜和体内生物膜之间的差异(比如与慢性感染相关的差异)的原因是体外生物膜系统中缺乏防御机制暴露。在大多数体内生物膜环境中,可能存在吞噬细胞甚至噬菌体,以及存在脓和其它分泌的流体和聚合物。这样的可变因素在体外模型系统中一般是避免的,它们在体外模型系统中难以控制或复制。
在一些实施方案中,以MIC水平或高于MIC水平向对其有需要的受试者施用本公开的一种或多种抗生素,比如1×MIC、2×MIC、3×MIC和4×MIC。在其它实施方案中,以亚MIC水平施用抗生素(比如从0.9×MIC至0.0001×MIC范围)。
在一些实施方案中,向受试者施用单次亚MIC剂量的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后施用一个或多个剂量的本公开的一种或多种抗生素(比如达托霉素),其中抗生素剂量也以亚MIC水平施用。
在其它实施方案中,以亚MIC剂量向受试者施用一种或多种本公开的抗生素比如达托霉素,然后单次推注亚MIC剂量的本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,然后以亚MIC剂量施用一个或多个另外剂量的本公开的一种或多种抗生素比如达托霉素。
制剂
本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物,任选地单独施用或组合或连续地与本文所述的一种或多种抗生素一起施用,可以各自包含在单一药物制剂中或分别配制成溶液、悬浮液、乳液、可吸入粉末、气溶胶或喷雾剂、片剂、丸剂、团粒、胶囊、含有液体的胶囊、粉末、缓释制剂、栓剂、棉塞施用乳液、气溶胶、喷雾剂、混悬剂、锭剂、糖锭、糖果、注射剂、口香糖、软膏、涂片、定时释放贴片、液体吸收擦拭物及其组合的形式。
在一些实施方案中,药物制剂的施用可包括全身施用。全身施用可以是肠内或口服即经由消化道给予物质,胃肠外施用即通过消化道以外的其它途径给予物质,比如通过注射或吸入。因此,本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和任选地一种或多种抗生素可以经口服、肠胃外、通过吸入、局部、经直肠、经鼻、经颊或经由植入的储库或通过任何其它已知方法施用于受试者。本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素还可以通过缓释剂型的手段施用。
对于口服施用,本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物以及任选地一种或多种抗生素可以配制成固体或液体制剂,例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液和分散体。在一些实施方案中,本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素可以与赋形剂(比如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、明胶、马铃薯淀粉、海藻酸和/或硬脂酸镁)一起配制。
为了制备固体组合物比如片剂和丸剂,将本公开的溶素或其活性片段或变体或其衍生物和/或一种或多种抗生素与药物赋形剂混合以形成固体预配制组合物。如果需要,片剂可以通过标准技术包被糖衣或包被肠溶衣。片剂或丸剂可经包被或以其它方式复合以提供给予延长作用优点的剂型。例如,片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分,后者是前者的被膜形式。两种剂量组分可通过肠溶层分开,肠溶层用于抵抗在胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣,此类材料包括多种聚合酸和聚合酸与比如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。
在另一个实施方案中,本公开的药物制剂被配制为可吸入组合物。在一些实施方案中,本发明的药物制剂有利地配制为干燥的可吸入粉末。在具体的实施方案中,本发明的药物制剂可进一步与用于气溶胶递送的推进剂一起配制。合适的推进剂的实例包括但不限于:二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和二氧化碳。在某些实施方案中,制剂可以雾化。
在一些实施方案中,可吸入药物制剂包括赋形剂。合适的赋形剂的实例包括但不限于:乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯;中链脂肪酸、短链或长链的甘油三酯,或其任何组合;全氟二甲基环丁烷;全氟环丁烷;聚乙二醇;薄荷醇;月桂醇;二甘醇单乙醚;中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯;醇类;桉树油;短链脂肪酸;及其组合。
可将表面活性剂加入本公开的可吸入药物制剂中以降低药物和推进剂之间的表面和界面张力。表面活性剂可以是与本发明多肽无反应性的任何合适的无毒化合物。合适的表面活性剂的实例包括但不限于:油酸;脱水山梨糖醇三油酸酯;十六烷基吡啶氯化物;大豆卵磷脂;聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯;聚氧乙烯(10)硬脂基醚;聚氧乙烯(2)油基醚;聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物;聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯;聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯;聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物;蓖麻油乙氧基化物;及其组合。
在一些实施方案中,本公开的药物制剂包括鼻用制剂。鼻用制剂包括,例如鼻喷剂、鼻滴剂、鼻软膏剂、鼻洗剂、鼻注射剂、鼻填塞剂、支气管喷雾剂和吸入剂,或间接通过使用咽喉锭剂、漱口剂或含漱剂,或通过使用涂抹于鼻孔或面部的软膏剂,或这些和类似应用方法的任何组合。
本公开的药物制剂更典型地通过注射施用。例如,药物制剂可以肌内、鞘内、真皮下、皮下或静脉内施用以治疗革兰氏阳性菌的感染,通常为由表皮葡萄球菌引起的骨或关节感染。药学上可接受的载体可包含蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合。此外,肠胃外注射的药物制剂可包含pH缓冲溶液、佐剂(比如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、混悬剂或乳剂以及用于在临用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
在肠胃外注射是所选施用方式的情况下,通常使用等渗制剂。一般地,用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下,优选等渗溶液比如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂可包括明胶和白蛋白。可以向制剂中加入血管收缩剂。根据这类应用的药物制剂以无菌和无热原提供。
本公开的药物制剂可以以单位剂型存在并且可以通过本领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、接受者暴露于感染性细菌的持续时间、受试者的大小和重量以及特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将一般是产生治疗效果的每种化合物的量。一般地,在100%中,活性成分的总量将从约1%至约99%变化,通常为从约5%至约70%,最通常为从约10%至约30%。
实施例
实施例1. 在人滑液(HSF)中CF-301对表皮葡萄球菌的抗微生物活性。
按照CLSI方法(M07-A11, 2018)在非标准培养基(caMHB,用马血清补充至25%和用DTT补充至0.5 mM(caMHB-HSD))中使用肉汤微量稀释(BMD)测定CF-301溶素(SEQ ID NO:1)对表皮葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC),所述非标准培养基被CLSI批准用于CF-301的抗微生物敏感试验(CLSI, AST Subcommittee Meeting, Jan., 2018)。在含有50% HSF的caMHB (caMHB-HSF)中使用BMD类似地测定CF-301在HSF中对表皮葡萄球菌的活性(Discovery Life Sciences)。caMHB-HSF支持表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的生长和生物膜形成。选择53种表皮葡萄球菌临床分离株和两种MRSA菌株进行研究;在先前的研究中,每种分离株先前都被证明形成生物膜(Schuch等人. (2017) AAC, 61:e02666-16)。
如下表3所示,CF-301显示出对人滑液中的表皮葡萄球菌的有效活性,具有0.015/0.125 µg/mL的MIC50/90和0.0078-2 µg/mL的范围。还如表3所示,CF-301对表皮葡萄球菌的活性与对金黄色葡萄球菌观察到的类似。
表3.Exebacase对表皮葡萄球菌的抗微生物活性
实施例2. HSF中CF-301对表皮葡萄球菌生物膜的破坏。
CF-301对在人滑液中形成的生物膜的活性的宏观分析以Dastgheyb等人. (2015)JID 211:641-50和Dastgheyb等人. (2015) AAC 59:e04579-14中描述的方式进行。简言之,将108 CFU的表皮葡萄球菌分离株NRS6在37℃下在含有HSF的24孔板中培养24小时。生物膜形成后,将孔用溴化乙锭(EtBr)染色并用0.1或1 µg/mL CF-301处理2小时。通过UV荧光成像观察生物膜。还检查了未处理的对照。
图2示出了CF-301治疗对人滑液中由NRS6形成的被溴化乙锭染色的生物膜结构的影响。如图2所示,生物膜结构在2小时内消除。
生物膜还用Alexa Flour488-WGA(其将生物膜(和个别细菌)中的胞外多糖染色)和碘化丙啶(PI) (其将整个生物膜染色)染色。然后通过荧光显微镜观察生物膜。如图3所示,用0.1 ug/mL或1 ug/mL CF-301治疗2小时后,HSF中形成的表皮葡萄球菌生物膜被消除。
实施例3. HSF中的生物膜破坏的SEM分析。
扫描电子显微镜(SEM)也用于证明人滑液中金黄色葡萄球菌的生物膜形成,和用0.01、0.1和1 µg/mL的浓度的CF-301治疗2小时后的生物膜的消除。在该实施例中,金黄色葡萄球菌生物膜在CF-301治疗前在人滑液中形成。如图4所示,CF-301破坏了这些生物膜。
上述实施例支持溶素比如CF-301,可用于治疗骨和关节感染,特别是假体关节感染,包括由表皮葡萄球菌引起的假体关节感染,这些感染被生物膜复杂化,抗生素对所述生物膜的作用一般很差。
实施例4. 与达托霉素组合的Exebacase (CF-301)在大鼠的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌骨髓炎中比单独的达托霉素或CF-301更具活性。
10 mg/kg的单剂量后,发现CF-301在骨中的水平是血浆水平的约10-15%,从而提供了靶向骨和关节感染并裂解在这些部位引起感染的金黄色葡萄球菌的策略。为了测试CF-301对骨感染的功效,使用急性MRSA骨髓炎的动物模型。如通过肉汤微量稀释法测定的,对于CF-301和达托霉素,用于建立感染的菌株MRSA IDRL-6169均具有0.5 µg/ml的最小抑制浓度。如使用前述方法测定的,最小生物膜抑制浓度和最小生物膜杀菌浓度对于CF-301分别为1和4 µg/ml,而对于达托霉素分别为1和2 µg/ml。参见Schmidt-Malan等人, 2016,Diag. Microbiol. Infect. Dis. 85:77-79。所有CF-301测试均用0.5 mM DL-二硫苏糖醇和25%马血清补充,如Schuch R. 2016, Methods Development and StandardizationWorking Group, Clinical Laboratory Science Institute, Wayne, PA中所述。
使用实验性骨髓炎的Zak模型的修改(O'Reilly T等人. 1999. “Rat model ofbacterial osteomyelitis of the tibia, p 561-575.” In Zak O, Sande M (ed),Handbook of animal models of infection. Academic Press, San Diego, CA)在64只雄性Sprague Dawley大鼠中建立急性骨髓炎。用异氟烷麻醉动物,且将左膝剃毛并用氯己啶消毒。为了诱发骨髓炎,将膝关节弯曲45度角以暴露胫骨突的顶部。将具有21号针头的1毫升注射器插入胫骨中,所述注射器含有10 µl花生四烯酸(50 µg/ml)和50 µl的107 cfuMRSA IDRL-6169在胰蛋白酶大豆肉汤中的悬浮液。将细菌悬浮液缓慢注射到胫骨中,取出针,将膝关节拉直并对注射部位施压1分钟。
建立感染后一周(第8天),将大鼠随机分配到四个治疗组中的一个:1)不治疗,2)每12小时腹膜内施用60 mg/kg达托霉素,共4天,3)在尾静脉内施用单剂量的40 mg/kg CF-301或4)每12小时腹膜内施用单剂量的40 mg/kg CF-301加60 mg/kg达托霉素,共4天。在CF-301注射前15分钟施用达托霉素。将CF-301保持在冰上直至注射。疗法开始后4天(第12天)处死大鼠。收集每只动物的左侧胫骨,称重并冷冻粉碎用于定量细菌培养。使用SAS软件版本9.4(SAS Inc., Cary, NC)使用Kruskal-Wallis测试比较定量培养物的结果。以log10菌落形成单位(cfu)/克骨报告平均值和标准差。所有测试均为双边的;p值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
未接受治疗的大鼠具有5.13 (±0.34) log10 cfu/克骨的平均(±SD)细菌密度。达托霉素、CF-301和达托霉素加CF-301疗法组中的大鼠分别具有4.09 (±0.37)、4.65 (±0.65)和3.57 (±0.48) log10 cfu/克骨的平均值(±SD)(图5)。与未治疗的大鼠相比,用达托霉素、CF-301和达托霉素加CF-301疗法分别减少1.04、0.65和1.56 log10 cfu/克骨。与未治疗的大鼠相比,所有治疗组中的菌落计数均显著减少(P≤0.0001)。然而,用达托霉素与CF-301治疗的动物具有比单独用达托霉素(P=0.0042)或exebacase (P <0.0001)治疗的动物更低的菌落计数。
上述结果支持CF-301单独或与抗生素比如达托霉素组合可用于治疗骨髓炎。尽管单独用达托霉素或CF-301治疗显示感染减少,但CF-301和达托霉素组合显示更好的效果。
实施例5. 患有假体膝感染的患者在关节镜DAIR期间CF-301的功效。
鉴定出患有复发性多重抗药性(MDR)表皮葡萄球菌假体膝感染的老年患者(79至89岁)以进行用CF-301与DAIR组合的治疗,对于这些患者,翻修术或经股骨截肢术是不可行的,且对于这些患者没有其它口服选择可用。根据当地伦理委员会的规定,与法国卫生局讨论了每一个病例。治疗前,每名患者签署书面同意书。CF-301 (75 mg/mL; 30 mL)在关节镜检查期间直接施用至关节中,然后施用抑制性替地唑胺作为补救疗法。
治疗了4名患者。所有患者均接受过若干次既往假体膝翻修术,无假体松动(图6A)。尽管在开放性DAIR后有抑制性抗生素,3名患者复发假体膝关节感染。2名患者有脓毒性关节炎的临床体征(图6B);其它2名患者出现瘘管。关节镜检查期间未发生不良事件;所有患者均接受8 mg/kg达托霉素和利奈唑胺(600 mg,每日两次;4至6周),然后是200 mg/天替地唑胺作为抑制性疗法。6个月时,2名瘘管患者在基线时发生瘘管复发。1年随访后,两名脓毒性关节炎患者的结果良好,且脓毒性关节炎的临床体征消失(图6C)。这个有利的结果支持CF-301可以在患有复发性MDR葡萄球菌感染的患者中在关节镜DAIR期间有效地使用,以改善抑制性抗生素的功效和避免相当大的功能损失。
实施例6. pp296在大鼠骨髓炎模型中的功效。
根据如在Karau等人, Exebacase in Addition to Daptomycin Is More Active than Daptomycin or Exebacase Alone in Methicillin-Resistant Staphylococcusaureus Osteomyelitis in Rats, Antimicrob. Agents Chemother. 2019 Sept 23; 63(10).中所述的方案,在Sprague Dawley大鼠中建立抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(IDRL-6169;从患有假体髋感染的患者中分离)的感染。具体地,通过弯曲膝关节,将21G针插入胫骨突,并注射10 µl 花生四烯酸和50 µl的约106-108菌落形成单位(cfu)的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌IDRL-6169悬浮液,在大鼠中建立骨髓炎。
确定了以下6个治疗组:(1)对照/未治疗(n=18);(2)每日两次皮下施用60 mg/kg达托霉素(DAP),共4天(n=17);(3)每日静脉内施用40 mg/kg pp296,共4天(n=17);(4)每日静脉内施用40 mg/kg pp296,共4天加上每日两次皮下施用60 mg/kg DAP,共4天(n=17);(5)在治疗第1天作为单剂量静脉内一次施用100 mg/kg pp296(n=17); 和(6)在治疗第1天作为单剂量静脉内一次施用100 mg/kg pp296加上每日两次皮下施用60 mg/kg DAP,共4天(n=17)。当达托霉素与pp296一起施用时,达托霉素在pp296之前15分钟给药,pp296保持在冰上。
在施用最后一次治疗后12小时处死动物,并收集胫骨,称重,冷冻粉碎用于定量细菌培养。用Wilcoxon秩和检验测定胫骨的log10 CFU计数/g,用错误发现率法调整。结果示于下表4中。
表4-大鼠胫骨的log10 CFU/g
结果表明,与未治疗的对照相比,单剂量100 mg/kg pp296与达托霉素协同使平均log10 CFU减少1.76 CFU/g,与单独的达托霉素相比,减少0.62 CFU/g。与未治疗的对照(P=0.003)以及单独的单剂量和每日剂量的pp296(即没有达托霉素)(分别为P=0.0210和P=0.0175)相比,这种减少是显著的。pp296的这些结果与CF-301获得的结果相当。例如,与单独的达托霉素相比,单剂量40mg/kg CF-301联合达托霉素导致log10 CFU/g减少0.52。
此外,在研究期间监测动物的体重作为一般健康状况的标志物。手术时(第1天)、治疗前即刻(第8天)和处死时(第12天)动物的平均体重如下表5所示。
表5-大鼠平均体重
治疗组 | 第1天的体重 | 第8天的体重 | 第12天的体重 |
(1) 未治疗 | 337 | 308 | 314 |
(2) DAP 60 mg/kg | 339 | 312 | 312 |
(3) pp296 40 mg/kg | 342 | 313 | 311 |
(4) pp296 40 mg/kg + DAP | 335 | 307 | 298 |
(5) pp296 100 mg/kg | 344 | 312 | 312 |
(6) pp296 100 mg/kg + DAP | 342 | 309 | 308 |
注意到在感染后治疗开始前的前7天,动物体重显著减少。在所有治疗组中,在治疗的四天期间观察到很少至没有体重减轻。
病理学切片显示在所有组中都具有嗜中性粒细胞增加的细胞过多的骨髓,除了每日给予40 mg/kg的pp296(治疗组3),其仅显示可能的细胞过多。这些发现与急性骨髓炎一致,且组间无明显差异。
Claims (31)
1.一种治疗或预防骨或关节感染的方法,所述方法包括:
向对其有需要的受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PlySs2溶素或其与SEQ ID NO: 1具有至少80%同一性的变体,其中所述变体包含抗革兰氏阳性菌的杀菌和/或抑菌活性,其中所述骨或关节感染包含革兰氏阳性菌。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述骨或关节感染包含生物膜。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述骨或关节感染包括骨髓炎。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述骨髓炎是慢性骨髓炎。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述骨髓炎是急性骨髓炎。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述骨或关节感染包括假体关节感染或包括天然关节脓毒性关节炎。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述骨或关节感染包括假体关节感染。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其中所述假体关节感染包括假体髋感染或假体膝感染。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者患有肥胖症、糖尿病、类风湿性关节炎或所述受试者是老年人。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述治疗包括清创术和植入物保留(DAIR)。
11.一种预防或破坏受试者滑液中形成的生物膜的方法,其包括:
向对其有需要的受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PlySs2溶素或其与SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的变体,其中所述变体包含杀菌和/或抑菌活性,其中生物膜由革兰氏阳性菌形成。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述施用步骤进一步包括共施用治疗有效量的一种或多种抗生素。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述一种或多种抗生素选自β-内酰胺、氨基糖苷、糖肽、噁唑烷酮、脂肽和磺酰胺。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述一种或多种抗生素包括利福霉素。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述一种或多种抗生素包括万古霉素、达托霉素或替地唑胺。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述一种或多种抗生素包括达托霉素。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阳性菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌、肠球菌属(Enterococcus)细菌和/或链球菌属(Streptococcus)细菌。
18. 根据权利要求17所述的方法,其中所述葡萄球菌属细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阳性菌是耐抗生素革兰氏阳性菌。
20.根据权利要求1-17或19中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阳性菌包括凝固酶阴性葡萄球菌。
21. 根据权利要求20所述的方法,其中所述凝固酶阴性葡萄球菌选自拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)和/或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)中的至少一种。
22.根据权利要求1-17或19-21中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阳性菌包括表皮葡萄球菌。
23. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述PlySs2溶素包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
24. 根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述PlySs2溶素变体包含以下氨基酸序列的至少一个:SEQ ID NO: 3-17。
25. 根据权利要求24所述的方法,其中所述PlySs2溶素变体包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。
26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述PlySs2溶素与SEQ ID NO: 1的多肽具有至少90%的同一性。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者是人。
28.根据权利要求1-19或23-27中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阳性菌包括抗甲氧西林金黄色葡萄球菌。
29.根据权利要求11-28中任一项所述的方法,其中所述破坏包括清创术和植入物保留(DAIR)。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述PlySs2在关节镜检查期间施用。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述PlySs2在关节镜下冲洗期间施用。
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