JP2022526624A - 骨及び関節の感染を治療及び予防する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、骨又は関節の感染を治療又は予防する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌に対する殺菌及び／又は静菌活性を備える、その変異体を含むＰｌｙＳｓ２溶解素を治療有効量、それを必要とする被験体に、任意に、１つ以上の抗生物質と同時に投与することを含み、骨又は関節の感染が、スタフィロコッカス・エピデルミディス又はスタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌を含む、方法に関する。スタフィロコッカス・エピデルミディスによって形成されるバイオフィルム等の滑液中に形成されるグラム陽性細菌バイオフィルムを予防又は破壊する方法も開示される。【選択図】図２

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１９年４月１１日付で出願された米国仮特許出願第６２／８３２，７５４号、２０１９年５月１７日付で出願された米国仮特許出願第６２／８４９，６７２号、２０１９年１１月２１日付で出願された米国仮特許出願第６２／９３８，８１２号、及び２０２０年１月２３日付で出願された米国仮特許出願第６２／９６４，７５５号の利益を主張し、これら出願日に依拠し、それらの開示それぞれの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０２０年４月１０日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０３４１＿００２０－００－３０４＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、３７４０１バイトのサイズである。

本開示は、概して、溶解素（複数の場合もある）及び任意に１つ以上の抗生物質を用いた、骨及び関節の感染、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）及びスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）等のグラム陽性細菌による骨髄炎及び人工関節感染の治療及び予防に関する。

微生物は、主に浮遊（planktonic）形態及びバイオフィルム形態の２つの異なる生命形態に分類され得る。浮遊微生物は浮動性であり、代謝が活発で、迅速に複製する。対照的に、バイオフィルム微生物は、多細胞で複雑な三次元構造として存在する。バイオフィルムは増殖の静止期にあり、代謝的に活性が低い。

典型的には、バイオフィルムは、微生物細胞が宿主細胞表面等の表面に付着し、続いて細胞凝集、成熟、及びその後の脱離を含む「段階」で形成される。初期付着時に、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びビトロネクチン等の宿主タンパク質が表面に吸収され、コンディショニングフィルムの形成をもたらす。吸収された宿主タンパク質は、細菌タンパク質と宿主タンパク質との相互作用を通じて、例えば細菌のコロニー形成を促進する。

表面への最初の細胞付着の後、多層細胞増殖並びに細胞間接着が起こり、結果的に１つ又は幾つかの種のミクロコロニーの形成をもたらす。この段階の後に成熟が続き、付着した細胞が増殖し、それらの間で相互作用する。この段階では、例えば、細菌細胞は、細胞を囲み、バイオフィルムネットワークを安定化させる菌体外多糖の分泌を開始する。成熟すると、大きなバイオフィルムはそれらの表面から浮遊形態を放出し得て、次いでそれらが分散して遠位部位の更なる局所浸潤又は播種を引き起こし、全く新しいサイクルを開始する。

治療が困難な感染症の多くは、多くの骨感染及びインプラント材料、例えば人工関節に関連する感染等のバイオフィルム感染症である。これらの感染症では、微生物は、典型的には、死骨又はインプラントのいずれかに付着し、宿主機構だけでなくほとんどの抗微生物剤にも耐えるバイオフィルムを形成する。したがって、抗生物質はしばしば骨及び関節の感染に対して活性不良を示し、かかる治療が有効になる前に、通常は手術と組み合わせて、長期にわたる抗生物質療法を必要とする。

上記の観点から、バイオフィルム形成細菌による骨及び関節の感染を治療するための新たな戦略が必要とされる。これらの戦略には、バイオフィルムを根絶するだけでなく、バイオフィルム形成細菌を死滅させることができる薬物及び／又は生物製剤が含まれる。

一態様において、本発明の開示は、骨髄炎、例えば急性骨髄炎等の骨又は関節の感染を治療又は予防する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素又はその変異体を、それを必要とする被験体に投与することを含み、骨又は関節の感染がグラム陽性細菌を含む、方法に関する。

本開示はまた、被験体の滑液中に形成されたバイオフィルムを予防又は破壊する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素又はその変異体を、それを必要とする被験体に投与することを含み、バイオフィルムがグラム陽性細菌によって形成される、方法に関する。

発明を実施するための形態に記載される、溶解素のアミノ酸配列（配列番号１）及び該溶解素をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）を示す図である。配列番号１は、翻訳後プロセッシングの間に除去されて２４４アミノ酸ポリペプチドを残す、開始メチオニン残基を含む２４５アミノ酸ポリペプチドを表す。 実施例に記載されるように、ヒト滑液中でスタフィロコッカス・エピデルミディスによって形成される臭化エチジウム染色バイオフィルム構造に対する溶解素処理の影響を示す図である。 実施例に記載されるように、ＰｌｙＳｓ２溶解素（本明細書においてＣＦ－３０１及びエクセバカーゼ（exebacase）とも称される）による処理前及び処理後にヒト滑液中に形成されたバイオフィルムの蛍光画像を示す図である。 実施例に記載されるように、ＰｌｙＳｓ２溶解素による処理後のヒト滑液中のバイオフィルム破壊を示す走査電子顕微鏡写真を示す図である。 実施例に記載されるように、単独で、又はダプトマイシンと併用したエクセバカーゼ溶解素による処理後のｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラム単位のラット脛骨の定量的細菌培養物を示す図である。 図６Ａ～図６Ｃは、実施例５に記載されるように、本発明の方法を使用した治療のために選択された感染した人工膝関節を有する患者の状態を示す図である。図６Ａは患者の人工膝関節を示すＸ線である。図６Ｂは、選択された患者のうち２名で観察された敗血症性関節炎の臨床徴候を示す図である。図６Ｃは、治療後の敗血症性関節炎患者の良好な転帰を示す図である。

定義
本明細書において使用される場合、以下の用語及びその同語源語は、文脈上そうでないことが明示されない限り、下記の意味を有するものとする。

「担体」は、活性化合物と共に投与される溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤（absorption delaying agent）、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。かかる担体は、滅菌液、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。

「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。担体（複数の場合もある）は、薬剤中で通常使用される量で治療対象の被験体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体は、組成物をその意図される目的に不適なものにすることなく組成物の他の成分に適合する。さらに、薬学的に許容可能な担体は、過度の有害な副作用（毒性、刺激及びアレルギー応答等）なしに本明細書に提示される被験体への使用に適している。副作用は、それらのリスクが組成物によってもたらされる利益を上回る場合に「過度」である。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油／水エマルション及びマイクロエマルション等のエマルションが挙げられる。好適な医薬担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Editionに記載されている。薬学的に許容可能な担体は、自然に存在しない担体であってもよい。

「殺菌」又は「殺菌活性」は、細菌の初期集団において１８時間～２４時間にわたって少なくとも３ｌｏｇ１０（９９．９％）以上の減少の程度まで細菌の死滅を引き起こす特性を有するか、又は細菌を死滅させることが可能であることを指す。

「静菌」又は「静菌活性」は、細菌細胞の増殖を阻害し、それにより細菌の初期集団において１８時間～２４時間にわたって２ｌｏｇ１０（９９％）以上かつ最大３ｌｏｇ弱の減少を引き起こすことを含む、細菌増殖を阻害する特性を有することを指す。

「抗菌剤」は、静菌剤及び殺菌剤の両方を指す。

「抗生物質」は、細菌に致死性又は増殖の低減等の負の影響を与える特性を有する化合物を指す。抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌又はその両方に負の影響を与えることができる。例としては、抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカンの生合成、細胞膜の完全性、又は細菌におけるＤＮＡ若しくはタンパク質の合成に影響を及ぼし得る。

「薬物耐性」は、概して薬物の抗菌活性に耐性を示す細菌を指す。或る特定の方法で使用される場合、薬物耐性は、特に抗生物質耐性を指し得る。場合によっては、一般に特定の抗生物質の影響を受けやすい細菌は、抗生物質に対する耐性を発現し、それにより薬物耐性微生物又は株となる可能性がある。「多剤耐性」（「ＭＤＲ」）病原体は、各々が単剤療法として使用される少なくとも２つのクラスの抗微生物薬に対する耐性を発現した病原体である。例えば、Ｓ．アウレウスの或る特定の株は、メチシリン及び／又はバンコマイシンを含む幾つかの抗生物質に耐性を示すことが見出されている（Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention）。当業者は、薬物又は抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定する日常的な実験技術を用いて、細菌が薬物耐性であるかを容易に決定することができる。

「有効量」は、適切な頻度又は投与計画で適用又は投与した場合に、細菌増殖若しくは細菌負荷を予防、低減、阻害若しくは解消するか、又は治療される障害（本明細書においては、グラム陽性細菌病原体の増殖又は感染）の発症、重症度、期間若しくは進行を予防、低減若しくは改善するか、治療される障害の進展を予防するか、治療される障害の退行を引き起こすか、又は抗生物質若しくは静菌療法等の別の療法の予防効果若しくは治療効果（複数の場合もある）を高める若しくは改善するのに十分な量を指す。

「共投与する」は、順次的な２種類の作用物質、例えば溶解素及び抗生物質又は任意の他の抗菌剤の投与、並びに実質的に同時の、例えば単一の混合物／組成物中での、又は別個に与えられるが、それでも実質的に同時に、例えば同日又は２４時間中に異なる時点で被験体に投与される用量でのこれらの作用物質の投与を指す。２種類の作用物質、例えば溶解素と１つ以上の付加的な抗菌剤とのこのような共投与は、最大数日、数週間又は数ヶ月続く継続的な治療として行うことができる。さらに、用途に応じて、共投与は、継続的又は同延的（coextensive）である必要はない。例えば、用途が全身性抗菌剤として、例えば関節又は骨の感染を治療することがであった場合、溶解素を初めのみ、追加の抗生物質の使用の２４時間以内に投与することができ、その後、追加の抗生物質の使用を溶解素の更なる投与なしに継続してもよい。

「被験体」は、哺乳動物、植物、下等動物、単細胞生物又は細胞培養物を指す。例えば、「被験体」という用語は、細菌感染、例えばグラム陽性細菌の影響を受けやすい又はそれを患う生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。或る特定の実施形態において、被験体はヒト、例えばかかる感染が全身性であるか、局所性であるか、又は別の形で特定の器官若しくは組織に集中若しくは限局しているかに関わらず、グラム陽性細菌による感染を患う、それを患うリスクがある又はその影響を受けやすいヒトである。

「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から作られ、一般に、少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有するポリマーを指す。本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語と区別なく使用される。この用語は、単離形態のポリペプチドだけでなく、その活性フラグメント及び誘導体も含む。「ポリペプチド」という用語は、溶解素ポリペプチドを含み、例えば溶解素機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドも包含する。文脈に応じて、ポリペプチド又はタンパク質又はペプチドは、自然発生ポリペプチド、又は組換え、改変若しくは合成的に作製されたポリペプチドであり得る。例えば、特定の溶解素ポリペプチドは、例えば酵素的若しくは化学的切断によって天然タンパク質から得るか若しくは取り出しても、又は従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）若しくは分子生物学的手法（例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示されるもの）を用いて調製しても、又は戦略的に切断若しくはセグメント化して、例えば、同じ若しくは少なくとも１つの一般的な標的細菌に対する溶解素活性を維持する活性フラグメントを得てもよい。

「融合ポリペプチド」は、通例、異なる特性又は機能性を有する２つ以上のドメイン又はセグメントを有するのが通例である融合発現産物を生じる、２つ以上の核酸セグメントの融合から得られる発現産物を指す。より特定の意味では、「融合ポリペプチド」という用語は、直接、又はアミノ酸若しくはペプチドリンカーを介して共有結合的に連結した２つ以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含むポリペプチド又はペプチドも指す。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは通例、Ｃ末端からＮ末端に連結されるが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」という用語と区別なく使用される場合もある。よって、或る特定の構造「を含むポリペプチド」というオープンエンドの表現は、融合ポリペプチド等の列挙される構造よりも大きい分子を含む。

「異種」は、天然では隣接しないヌクレオチド又はポリペプチドの配列を指す。例えば、本開示の文脈において、「異種」という用語は、融合ポリペプチドが通常は天然に見られない２つ以上のポリペプチドの組合せ又は融合、例えば増強した溶菌活性を有し得る、溶解素ポリペプチド、及びカチオン性及び／又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド（Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)）、ディフェンシンペプチド（Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)）、疎水性ペプチド、及び／又は抗微生物ペプチドを記載するために使用することができる。この定義には、２つ以上の溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントが含まれる。これらは、溶菌活性を有する融合ポリペプチドを作るために使用することができる。

「活性フラグメント」は、フラグメントが得られた単離ポリペプチドの１つ以上の機能又は生物活性、例えば、Ｓ．アウレウス又はＳ．エピデルミディス等の１つ以上のグラム陽性細菌に対する殺菌活性を保持するポリペプチドの部分を指す。

「相乗的」又は「超相加的」は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を超える、組合せでの２つの物質によってもたらされる有益な効果を指す。或る特定の実施形態において、相乗又は超相加的効果は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を有意に、すなわち統計的に有意に超える。一方又は両方の有効成分を閾値下レベル、すなわち活性物質が個別に用いられる場合に効果を生じないか、又は非常に限られた効果しか生じないレベルで用いることができる。効果は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイ等のアッセイによって測定することができる。

「治療」は、ヒトを含む被験体が、直接的又は間接的に、障害を治癒するか、又は病原体を根絶するか、又は被験体の状態を改善する目的で医療を受ける任意のプロセス、行為、適用、療法等を指す。治療は、発生率の低減、症状の軽減、再発の解消、再発の予防、発生の予防、発生リスクの低減、症状の改善、予後の改善、又はそれらの組合せも指す。「治療」は、被験体における細菌の集団、増殖速度又は病原性を低減することで、被験体における細菌感染、又は器官、組織若しくは環境の細菌汚染を制御又は低減することを更に包含し得る。このため、発生率を低減する「治療」は、例えば、被験体であるか又は環境であるかを問わず、特定のミリュー（milieu）での少なくとも１つのグラム陽性細菌の増殖を阻害するのに効果的となり得る。一方、既に確立された感染の「治療」は、感染又は汚染の原因となるグラム陽性細菌の集団を減少させるか、それを死滅させるか、その増殖を阻害するか、及び／又はそれを根絶することを指す。

「予防する」は、細菌感染等の障害の発生、再発、拡大、発症又は確立の予防を指す。本開示が感染の完全な予防又は感染の確立の予防に限定されることは意図されない。幾つかの実施形態において、発症を遅らせるか、又は続いて発症した（contracted）疾患の重症度若しくは疾患の発症の可能性を低減すること等が予防例を構成する。

「発症した疾患」は、発熱、敗血症又は菌血症の検出等の臨床症状又は不顕性（subclinical）症状が現れた疾患、並びにかかる病理と関連する症状が未だ現れていない場合の細菌病原体の増殖（例えば、培養物中での）によって検出され得る疾患を指す。

ペプチド又はポリペプチド又はその活性フラグメントとの関連での「誘導体」は、例えば、溶菌活性等のポリペプチドの活性に実質的に悪影響を与えない若しくは溶菌活性等のポリペプチドの活性を損なわない、アミノ酸以外の１つ以上の化学的部分を含有するように修飾されたポリペプチドを包含することを意図する。化学的部分は、例えばアミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシ末端のアミノ酸残基又は内部アミノ酸残基を介してペプチドに共有結合的に連結することができる。かかる修飾は、天然であっても又は非天然であってもよい。或る特定の実施形態において、非天然修飾は、反応性部分への保護基若しくはキャップ基（capping group）の付加、抗体及び／又は蛍光標識等の検出可能な標識の付加、グリコシル化の付加若しくは修飾、又はＰＥＧ（ペグ化）等の嵩高基（bulking group）の付加、並びに当業者に既知の他の変化を含み得る。或る特定の実施形態において、非天然修飾は、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化等のキャップ修飾であり得る。溶解素ポリペプチドに付加することができる、例示的な保護基としては、ｔ－Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙ等の一般に使用される蛍光標識タンパク質は、細胞タンパク質の正常機能に干渉することなく、ポリペプチドに共有結合的若しくは非共有結合的に結合するか、又はポリペプチドに融合させることができる小型のタンパク質である。或る特定の実施形態において、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドをポリヌクレオチド配列の上流又は下流に挿入する。これにより、細胞機能又はそれが結合した溶解素ポリペプチドの機能を妨げない融合タンパク質（例えば、溶解素ポリペプチド：：ＧＦＰ）が生じる。タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションが、多くの医薬タンパク質の循環半減期を延長する方法として使用されている。このため、溶解素ポリペプチド誘導体等のポリペプチド誘導体との関連で、「誘導体」という用語は、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合によって化学修飾された溶解素ポリペプチド等のポリペプチドを包含する。ペグ化溶解素等の溶解素ポリペプチドは、生物活性及び治療活性を保持した上で非ペグ化ポリペプチドと比較して延長された循環半減期を示すことが予想される。

「パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列、例えば溶解素ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ等の公開されているソフトウェア、又は例えばDNASTARにより市販されているソフトウェアを用いて達成することができる。２つ以上のポリペプチド配列は、０％～１００％の間のいずれか、又はその間の任意の整数値で同一であり得る。本開示の文脈において、２つのポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも８０％（典型的には、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％であり、典型的には、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも９９％）が同一である場合に「実質的に同一」である。本明細書に記載される「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ペプチドにも当てはまる。このため、「実質的に同一」という用語は、本明細書に記載されるような単離ポリペプチド及びペプチドの突然変異型、切断型、融合型、又は別の形で配列が修飾された変異体、及びその活性フラグメント、並びに参照（野生型又は他の無傷）ポリペプチドと比較して相当の配列同一性（例えば、１つ以上の上記の方法によって測定される、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約８０％（典型的には、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性）が同一であるか、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。本開示のポリペプチドの配列は、ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素ポリペプチドのアミノ酸の１つ以上、又は幾つか、又は最大１０％、又は最大１５％、又は最大２０％が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換され、得られるポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素が、参照ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素の少なくとも１つの活性、抗菌効果、及び／又は細菌特異性を有する場合に実質的に相同である。

本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。

「バイオフィルム」は、表面に付着し、細菌及び／又は宿主に由来する成分で構成され得る水和したポリマーマトリックス中に凝集した細菌を指す。バイオフィルムは、生物表面又は非生物表面上で細胞が互いに接着した微生物の凝集物である。これらの接着細胞は、限定されるものではないが、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）で構成されるマトリックス中に埋め込まれることが多い。バイオフィルムのＥＰＳは、スライム（スライムと記載されたもの全てがバイオフィルムという訳ではない）又はプラークとも称され、一般に細胞外ＤＮＡ、タンパク質及び多糖で構成されるポリマー集塊である。

或る特定の細菌に対する使用に適した抗生物質との関連での「適した、好適な（Suitable）」は、耐性が後に発現する場合であっても、これらの細菌に対して効果的であることが見出された抗生物質を指す。

骨及び関節の感染
本発明者は、驚いたことに、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）及び多剤耐性（ＭＤＲ）スタフィロコッカス・エピデルミディスを含むスタフィロコッカス・エピデルミディス及びスタフィロコッカス・アウレウス等の骨及び関節の感染を引き起こす可能性のあるバイオフィルム形成細菌を死滅させるために或る特定の生物製剤、すなわち溶解素を使用することができることを認識した。溶解素はまた、驚いたことに、滑液又は骨において、例えばスタフィロコッカス・エピデルミディス又はスタフィロコッカス・アウレウスによって形成される成熟したバイオフィルムを破壊することができる。これらの抗微生物剤は、バクテリオファージにコードされた加水分解酵素であり、細胞内部からペプチドグリカンを分解することによって感染細菌から子孫ファージを解放し、宿主細菌の溶菌を引き起こす。溶解素は、細菌細胞の外からペプチドグリカンを攻撃することにより、病原菌に対して作用する。典型的には、溶解素は細菌種に特異性が高く、共生腸内細菌を含む非標的生物を溶菌することはまれであり、消化管の恒常性を維持する上で有益であり得る。

一態様において、本発明の開示は、骨又は関節の感染を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素を、それを必要とする被験体に投与することを含み、骨又は関節の感染がグラム陽性細菌を含む、方法に関する。

幾つかの実施形態において、骨感染は骨髄炎、すなわち、感染生物に対する骨の炎症反応である。幾つかの実施形態において、骨髄炎等の骨感染は、スタフィロコッカス・アウレウス又はＭＲＳＡ等のグラム陽性細菌によるものである。幾つかの実施形態において、グラム陽性細菌は、バイオフィルムを形成し、骨芽細胞内に侵入して生存する能力を有するため、グラム陽性細菌が免疫系及び多くの伝統的な抗生物質を回避することを可能にする。

幾つかの実施形態において、骨髄炎は急性骨髄炎である。他の実施形態において、骨感染は慢性骨髄炎である。骨髄炎は、感染と有効な治療との間の遅延が４週間～６週間を超えると、慢性とみなされる。

幾つかの実施形態において、骨髄炎は、大腿骨、脛骨、上腕骨、及び橈骨等の長骨の感染を含む。他の実施形態において、骨髄炎は、脊柱、特に腰椎、仙骨、及び骨盤の感染を含む。典型的には、小児は長骨に骨髄炎を発症し、成人は脊柱に骨髄炎を発症する。

幾つかの実施形態において、骨髄炎は外因性骨髄炎である。これらの実施形態において、外因性骨髄炎は、骨が皮膚から突き出た時に発生し、膿瘍又は火傷、穿刺創又は開放骨折等の他の外傷から潜在的に感染性の生物が入ることを可能にする。他の実施形態において、外因性骨髄炎は、インプラント関連骨髄炎である。典型的には、インプラントは、例えば、骨折した骨の端部を安定させ、接合するために使用される金属製のプレート、ピン、ロッド、ワイヤ又はねじ等の機械デバイスである。幾つかの実施形態において、インプラント関連骨髄炎は、抗生物質のみが感染を治療するために使用される場合に慢性になる。

幾つかの実施形態において、骨髄炎は血行性骨髄炎である。血行性骨髄炎は、既存の感染、例えば膿痂疹、フルンケル症（持続性のおでき（persistent boils））、水痘の感染病変（水疱瘡）、並びに副鼻腔、耳、歯、軟部組織、呼吸器及び尿生殖器感染からの生物の広がりにより罹り得る。幾つかの実施形態において、尿生殖器感染は、仙骨又は腸骨の骨髄炎につながる可能性がある。

幾つかの実施形態において、慢性骨髄炎は、抗生物質が使われる前の時期（pre-antibiotic era）又は小児期に急性骨髄炎に罹患した患者に生じる。かかる感染は、例えば、死骨に付着したバイオフィルムの無症候性の持続のために、数十年の無症状の期間をおいて再発する可能性がある。

他の実施形態において、本発明の方法の溶解素は、関節の感染を治療するために使用される。感染した関節としては、感染した股関節、膝関節、足首の関節、肩関節、肘関節、又は手首の関節を挙げることができる。典型的には、感染した関節は膝関節又は股関節である。

幾つかの実施形態において、感染した関節は天然関節である。天然関節の感染（本明細書において天然関節の敗血症性関節炎とも称する）は、穿刺傷等の貫通傷が関節の近く又は上方に起こり、細菌が関節に直接侵入できる場合に起こることがある。他の実施形態において、関節感染は、遠隔感染からの細菌が血流を介して天然関節に広がるときに生じる。

他の実施形態において、感染した関節は、人工関節（例えば、人工関節の敗血症性関節炎を含む）である。人工関節としては、臀部、膝、肩、肘、及び足首のプロテーゼを挙げることができる。典型的には、人工関節は人工股関節又は人工膝関節である。

幾つかの実施形態において、本開示の人工関節感染は手術後１年以内に起こる。かかる感染は、手術時の微生物の導入によって開始する場合がある。これは、プロテーゼ又はプロテーゼ周囲組織の直接接触又はエアロゾル汚染のいずれかによって起こり得る。インプラントの表面と接触すると、微生物は表面にコロニーを形成する場合がある。

他の実施形態において、人工関節感染は、隣接する部位からの感染の広がりに起因して生じる。例えば、術後早期に、表層手術部位感染（superficial surgical site infection）がプロテーゼを巻き込むように進行する場合がある。他の実施形態において、人工関節感染は、血流を介して感染の遠隔部位からの生物の拡散に起因して生じる。

幾つかの実施形態において、人工関節感染が再発している。例えば、幾つかの実施形態において、関節感染は、再発性多剤耐性Ｓ．エピデルミディス人工膝関節感染（ＰＫＩ）等の再発性多剤耐性感染である。

典型的には、感染が起こった人工関節（affected prosthetic joint）から得られた少なくとも２つの別々の組織若しくは体液の試料から病原体が培養によって単離された場合、又は以下の６つの基準のうちの４つが存在する場合に、人工関節感染が指摘される：血清赤血球沈降速度（ＥＳＲ）及び血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度の上昇、滑膜白血球数の上昇、滑膜好中球率（ＰＭＮ％）の上昇、感染が起こった関節（affected joint）における化膿の存在、プロテーゼ周囲組織若しくは体液の１つの培養物中の微生物の単離、又は４００倍の倍率でプロテーゼ周囲組織の組織学的分析から観察された５つの強拡大視野における、強拡大視野当たり６個以上の好中球。

典型的には、病原体を評定するために人工関節から得られる体液は、滑液である。本明細書において使用される場合、「滑液」は滑膜関節の空洞に見られる粘性体液である。滑液の主な役割は、運動中の滑膜関節の関節軟骨間の摩擦を低減することである。

幾つかの実施形態において、吸引によって滑液試料を得ることができる。人工関節感染の指標として、総有核細胞数及び好中球パーセンテージについて吸引物（aspirant）を評定してもよい。典型的には、マイクロリットル当たりの総有核細胞量及び／又は好中球の割合は、人工関節感染に罹患していない被験体の滑液と比較して、人工関節感染に罹患している被験体から得られた滑液中の方が大きい。例えば、幾つかの実施形態において、マイクロリットル当たりの総有核細胞１１００個の閾値及び／又は人工関節を有する被験体からの滑液中の好中球の閾値６４％は、人工膝関節感染等の人工関節感染を示す。

幾つかの実施形態において、好中球の量を決定する代わりに、又はそれに加えて、好中球に存在する酵素である白血球エステラーゼのレベルを、例えば、Parvizi et al., "Diagnosis of periprosthetic joint infection: the utility of a simple yet unappreciated enzyme.", J. Bone Joint Surg. Am., 2011, 93:2242-2248（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるように、尿路感染の診断のための膿尿を決定するために広く利用可能な比色ストリップ（colorimetric strips）を用いて評定することができる。

しかしながら、より典型的には、人工関節感染の診断が指摘されかどうかを判断し、感染している病原体（複数の場合もある）を同定するために、滑液試料を培養する。この情報は、治療中に使用される場合、抗生物質の選択の情報も提供することができる。これらの実施形態において、吸引された滑液は、採取時に血液培養瓶に接種するか、又は微生物学の実験室に運ばれて、固体及び／又は液体培地上に接種することができる。例えば、Fehring et al., "Aspiration as a guide to sepsis in revision total hip arthroplasty," 1996, J. Arthroplasty, 11:543-547（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。

原因微生物
幾つかの実施形態において、本発明の骨及び／又は関節の感染は、ストレプトコッカス・ガロリティクス（Streptococcus gallolyticus）及びストレプトコッカス・ニューモニエを含む連鎖球菌種等のグラム陽性細菌によって引き起こされる。しかしながら、より典型的には、骨及び／又は関節の感染は、ブドウ球菌種、例えば、Ｓ．アウレウス又はＳ．エピデルミディスによって引き起こされる。他の実施形態において、ブドウ球菌種は、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・カプラエ、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス又はそれらの組合せ等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種である。典型的には、スタフィロコッカス・エピデルミディスは、骨及び／又は関節感染で同定されたコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種である。

幾つかの実施形態において、本発明の骨及び／又は関節感染は、腸球菌属由来のグラム陽性細菌種によって引き起こされる。

幾つかの実施形態において、本発明の骨及び／又は関節感染は、複数菌感染によって引き起こされる。例えば、腸球菌種とブドウ球菌種の組合せは、骨及び／又は関節感染の原因因子として同定され得る。典型的に特定の感染構造に関連する原因微生物の例を下記表１に示す。

溶解素
被験体において骨及び関節の感染を治療及び／又は予防し、及び／又はバイオフィルム形成を阻害又は破壊する本発明の方法は、本明細書に記載される溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体を、任意に、同じく本明細書に記載される１つ以上の抗生物質と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与することを含む。幾つかの実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、グラム陽性細菌に対する殺菌及び／又は静菌活性を示す。幾つかの実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体はまた、耐性についての低い傾向を示し、抗生物質耐性を抑制し、及び／又は従来の抗生物質との相乗作用を示す。他の実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、細菌凝集、バイオフィルム形成を阻害する、及び／又はバイオフィルム（骨又は関節感染を有する被験体におけるバイオフィルムを含む）を減少させる若しくは根絶する。

本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の殺菌活性は、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて決定することができる。例えば、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体を、例えば、Mueller, et al., 2004, Antimicrob Agents Chemotherapy, 48:369-377（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される、タイムキルアッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評定することができる。

本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の静菌活性も、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて評定することができる。例えば、増殖曲線は、例えば最終濃度５０％までヒト血清に添加したカチオン調整ミューラーヒントンＩＩブロス（ｃａＭＨＢ／５０％ＨｕＳ）において、又は１００％血清において、又は非標準培地（ウマ血清２５％、及びＤＴＴを０．５ｍＭ添加したｃａＭＨＢ（ｃａＭＨＢ－ＨＳＤ））において作成してもよい（performed）。グラム陽性細菌を溶解素と共に懸濁し、培養濁度を、例えば、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（商標）Ｍ３マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、例えば、２４℃で１１時間撹拌しながら１分ごとに読み取って、６００ｎｍの光学密度で測定することができる。倍加時間は、Saito et al, 2014, Antimicrob Agents Chemother 58:5024-5025（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される方法に従い、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体がない状態の培養物の倍加時間と比較して、フラスコ内にて通気させながら増殖させた培養物の対数増殖期において計算することができる。

幾つかの実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、ヒト滑液等の滑液の存在下で溶解素活性を示す。滑液中の溶解素の活性を評定するための好適な方法は、当該技術分野において知られており、実施例に記載されている。簡潔に述べると、滑液中の溶解素及びそのＭＩＣ値について、例えば親溶解素又は溶解素がない場合と比較して、ＭＩＣ値（すなわち、対照と比較して細菌増殖の少なくとも８０％を抑制するのに十分なペプチドの最小濃度）を決定することができる。

より具体的には、溶解素のＭＩＣ値を、例えば、生理的塩濃度を添加したミューラーヒントンブロス（ＭＨＢ）及びヒト滑液等の滑液において、例えば、Ｓ．エピデルミディス又はＳ．アウレウスについて決定することができる。例えば、Ｓ．エピデルミディスに対する溶解素の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、非標準培地（ヒト滑液を５０％まで添加したｃａＭＨＢ（ｃａＭＨＢ－ＨＳＦ））において、Clinical and Laboratory Standards Institute（ＣＬＳＩ）の方法論（Ｍ０７－Ａ１１、２０１８、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に従い、微量液体希釈（ＢＭＤ）を用いて決定することができる。実施例を参照されたい。

幾つかの実施形態において、溶解素、変異体溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む本発明の単離されたポリペプチドは、例えばヒト血清又は滑液の存在下で細菌を阻害するために必要な抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる。このＭＩＣを評定するための任意の既知の方法が使用され得る。幾つかの実施形態において、チェッカーボードアッセイは、抗生物質濃度に対する溶解素の効果を決定するために使用される。チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈によるＭＩＣ決定のためのＣＬＳＩ法の修正に基づく（CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）、及びCeri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37:1771-1776（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。

チェッカーボードは、例えば、最初に、各ウェルが横軸に沿って２倍希釈された同量の抗生物質を有する９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を調製することによって構築される。別々のプレートで、各ウェルが、例えば、縦軸に沿って２倍希釈された同量の溶解素を有する比較可能な行を調製する。次いで、各列が一定量の抗生物質及び溶解素の２倍希釈物を有し、各行が一定量の溶解素及び抗生物質の２倍希釈物を有するように、溶解素及び抗生物質の希釈物を組み合わせる。これにより、各ウェルは、溶解素と抗生物質との独自の組合せを有する。例えば、細菌をｃａＭＨＢ－ＨＳＦ中１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌの濃度で薬物の組合せに添加する。次いで、単独及び組合せでの各薬物のＭＩＣを、例えば周囲空気中にて３７℃で１６時間の後に記録する。部分阻止濃度の総和（ΣＦＩＣ）を各薬物について算出し、最小ΣＦＩＣ値（ΣＦＩＣｍｉｎ）を用いて溶解素／抗生物質の組合せの効果を決定する。

細菌凝集の阻害は、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて評定することができる。例えば、Walker et al.、すなわちWalker et al., 2013, PLoS Pathog, 9:e1003819（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される方法を使用してもよい。

溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオフィルム形成を阻害又は減少させる能力を評定する方法は、当該技術分野でよく知られており、微量液体希釈最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）法を修正した変法が挙げられる（Ceri et al., 1999, J. Clin Microbial. 37:1771-1776（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）、及びSchuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）を評定するこの方法では、例えばＳ．アウレウス株又はＳ．エピデルミディスの新鮮なコロニーを培地、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁し、例えばＴＳＢｇ（０．２％グルコースを添加したトリプシンソイブロス）で１００倍希釈し、例えば０．１５ｍｌアリコートとしてＣａｌｇａｒｙ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｄｅｖｉｃｅ（９６個のポリカーボネートペグを備える蓋を有する９６ウェルプレート；lnnovotech Inc.）に添加し、例えば３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、バイオフィルムを洗浄し、例えばＴＳＢｇ中の例えば２倍希釈系列の溶解素によって、例えば３７℃で２４時間処理する。処理後に、ウェルを洗浄し、例えば３７℃で風乾し、例えば０．０５％クリスタルバイオレットで１０分間染色する。染色後に、バイオフィルムを、例えば３３％酢酸で脱染し、例えば抽出されたクリスタルバイオレットのＯＤ_６００を決定する。各サンプルのＭＢＥＣが、クリスタルバイオレット定量化によって評定される、バイオフィルムのバイオマスの９５％超を除去するのに必要とされる最小溶解素濃度である。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるように、本発明の溶解素、その変異体溶解素及びフラグメントを、骨及び／又は関節感染を有する被験体から得られたグラム陽性細菌溶解物に対して評定する。かかる分離株を得る方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Schmidt-Malan et al., Diag. Microbiol. Infect. Dis. 85:77-79（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。

本発明の方法での使用に適した溶解素としては、国際公開第２０１３／１７００１５号及び国際公開第２０１３／１７００２２号（それぞれ、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているＰｌｙＳｓ２溶解素が挙げられる。本明細書において使用される場合、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素（複数）」、「ＰｌｙＳｓ２」、「エクセバカーゼ」及び「ＣＦ－３０１」という用語は、区別なく使用され、国際公開第２０１３／１７００１５号及び国際公開第２０１３／１７００２２号に記載されるように、本明細書において配列番号１として記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素（開始メチオニン残基の有無にかかわらず）若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体を包含する。ＰｌｙＳｓ２は、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）ゲノムのプロファージ内にコードされる抗ブドウ球菌溶解素として同定され、以下の表２に記載の細菌に対して殺菌及び静菌活性を示す。

幾つかの実施形態において、本発明の方法での使用に適した溶解素は、配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素である。配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素は、ほとんどのバクテリオファージ溶解素に特徴的なドメイン配置を有し、細胞壁結合型Ｃ末端ドメイン（図１）に連結された触媒Ｎ末端ドメイン（図１）によって規定される。Ｎ末端ドメインは、溶解素及び他の細菌細胞壁修飾酵素に共通するシステインヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ファミリーに属する。Ｃ末端ドメインは、多くの場合、溶解素の細胞壁結合要素を形成するＳＨ３ｂファミリーに属する。図１は、配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素を示し、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインを影付きの領域として示す。Ｎ末端ＣＨＡＰドメインは、ＬＮＮで始まる１つ目の影付きアミノ酸配列領域に対応し、Ｃ末端ＳＨ３ｂドメインはＲＳＹで始まる２つ目の影付き領域に対応する。

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される方法による使用に適した溶解素は、以下の溶解素の１つ以上を含む：ｐｐ５５（配列番号３）、ｐｐ６１（配列番号４）、ｐｐ６５（配列番号５）、ｐｐ２９６（配列番号６）、ｐｐ３２４（配列番号７）、ｐｐ３２５（配列番号８）、ｐｐ３３８（配列番号９）、ｐｐ３４１（配列番号１０）、ｐｐ３８８（配列番号１１）、ｐｐ４００（配列番号１２）、ｐｐ６１６（配列番号１３）、ｐｐ６１９（配列番号１４）、ｐｐ６２８（配列番号１５）、ｐｐ６３２（配列番号１６）、及びｐｐ６４２（配列番号１７）。

幾つかの実施形態において、本発明の方法は、変異体溶解素を、それを必要とする被験体に投与することを含む。本発明の方法での使用に適した溶解素変異体としては、参照溶解素の少なくとも１つの生物学的機能を保持する、配列番号１に対して少なくとも１つの置換、挿入及び／又は欠失を有するポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態において、変異体溶解素は、Ｓ．アウレウス及びＳ．エピデルミディスを含む広範囲のグラム陽性細菌に対する溶菌効果及び／又は静菌効果、並びに凝集を阻害する、バイオフィルム形成を阻害する、及び／又はバイオフィルムを減少させる能力を含む抗菌活性を示す。幾つかの実施形態において、本発明の溶解素変異体は、グラム陽性細菌を抗生物質の影響を受けやすいものにする。

幾つかの実施形態において、本発明の方法での使用に適した溶解素変異体は、配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド配列を含み、変異体溶解素は、本明細書に記載される配列番号１のアミノ酸配列を有するＰｌｙＳｓ２溶解素の１つ以上の生物学的活性を保持する。

溶解素変異体を、国際公開第２０１３／１７００１５号（その全体が引用することで本明細書の一部をなす）に記載されるように、当該技術分野で既知の任意の方法により、例えば、配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素を部位特異的突然変異誘発により改変するか、又は配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素を産生する宿主の突然変異を介して形成することでき、これらの溶解素変異体は本明細書に記載される生物学的機能を１つ以上保持する。例えば、当業者は、例えば、配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素のＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメインの置換又は置き換えを合理的に作製し試験することができる。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースとの配列比較を、例えば、置換するアミノ酸を同定するために、ＣＨＡＰ及び／又はＳＨ３ｂドメイン配列のいずれか又は両方、又は配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素の全長アミノ酸配列を用いて行うことができる。例えば、配列番号１のＰｌｙＳｓ２アミノ酸配列中のバリンアミノ酸残基１９でバリンをアラニンに置き換えた突然変異体又は変異体は活性であり、配列番号１のＰｌｙＳｓ２溶解素と同様の方法で、また同じくらい効果的にグラム陽性細菌を死滅させることができる。

さらに、図１に示すように、ＣＨＡＰドメインは、種々のポリペプチドのＣＨＡＰドメインに特徴的で保存されている、保存されたシステイン及びヒスチジンのアミノ酸配列（ＣＨＡＰドメインの最初のシステイン及びヒスチジン）を含む。例えば、保存されたシステイン残基及びヒスチジン残基は、活性又は能力を維持するために、ＰｌｙＳｓ２の突然変異体又は変異体で維持されなくてはならないと予測することは妥当である。したがって、本開示の溶解素変異体で保持するために特に望ましい残基は、配列番号１のＣＨＡＰドメイン内の活性部位残基Ｃｙｓ２６、Ｈｉｓ１０２、Ｇｌｕ１１８、及びＡｓｎ１２０を含む。特に望ましい置換として、正電荷が維持され得るようにＡｒｇからＬｙｓへの置換及びその逆、負電荷が維持され得るようにＡｓｐからＧｌｕへの置換及びその逆、遊離－ＯＨを維持できるようにＴｈｒからＳｅｒへの置換、並びに遊離ＮＨ_２を維持できるようにＡｓｎからＧｌｎへの置換が挙げられる。

好適な変異体溶解素は、ＰＣＴ出願公開番号である国際公開第２０１９／１６５４５４号（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１９６３８号、その全体が引用することで本明細書の一部をなす）に記載されている。特に、好適な変異体溶解素としては、本明細書に配列番号３～配列番号１７として記載されているもの、並びに配列番号３～配列番号１７のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体溶解素が挙げられ、変異体溶解素は、本明細書に記載される配列番号１のアミノ酸配列を有するＰｌｙＳｓ２溶解素の１つ以上の生物学的活性を保持する。

配列番号３～配列番号１７は、抗菌活性及び有効性を維持しながら、対応する野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素（配列番号１）に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する改変溶解素ポリペプチドである。配列番号３～配列番号１７を、下記表Ａに示すように、配列番号１に対するそれらのアミノ酸置換を参照して記載することができる。改変溶解素ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１との相違及びそのアミノ酸残基の位置を参照する）を、以下のように一文字アミノ酸コードを使用してまとめる。

幾つかの実施形態において、本発明の方法は、溶解素の活性フラグメントを、それを必要とする被験体に投与することを含む。好適な活性フラグメントは、本明細書に記載される溶解素実施形態のタンパク質又はペプチドフラグメントの生物学的に活性な部分を保持するものを含む。かかる変異体は、溶解素タンパク質の全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。ＰｌｙＳｓ２溶解素のＮ末端ＣＨＡＰドメインの例示的なドメイン配列を図１に提供する。ＰｌｙＳｓ２溶解素のＣ末端ＳＨ３ｂドメインの例示的なドメイン配列も図１に提供する。本開示のタンパク質又はタンパク質フラグメントの生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００のアミノ酸であるポリペプチドであり得る。タンパク質の他の領域が欠失される他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され、本実施形態のポリペプチドのネイティブ形態の１つ以上の機能的活性について評価することができる。

幾つかの実施形態において、好適な活性フラグメントとしては、本明細書に記載される活性フラグメントと、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する活性フラグメントが挙げられ、その活性フラグメントは、例えば図１に示すようなＣＨＡＰ及び／又はＳＨ３ｂドメインの少なくとも１つの活性を保持する。

本発明の方法で使用される、本明細書に記載の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、特定のバクテリオファージに感染した後に細菌生物によって産生され得るか、又は組換えにより若しくは合成的に製造若しくは調製され得る。溶解素ポリペプチド配列及び溶解素ポリペプチドをコードする核酸が本明細書に記載され、参照される限り、本発明の溶解素は、例えば、国際公開第２０１３／１７００１５号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような当該技術分野の標準的な方法を用いて、ファージゲノムからの溶解素に対する単離された遺伝子を介して、該遺伝子を導入ベクターに入れ、該導入ベクターを発現系にクローニングすることにより産生され得る。本発明の溶解素変異体は、切断型、キメラ型、シャッフル型又は「天然型」であってもよく、例えば、米国特許第５，６０４，１０９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように組合せであってもよい。

特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるか、アミノ酸が別のアミノ酸に置換されるか、又は１つ以上のアミノ酸が欠失されるように、アミノ酸配列において、又は配列番号１に記載される溶解素配列を含む本明細書に記載されるポリペプチド及び溶解素をコードする核酸配列において、又はそれらの活性なフラグメント若しくは切断型において、突然変異を作製することができる。

かかる突然変異は、一般的には可能な限りヌクレオチド変化を少なくすることによって行われる。この種の置換突然変異は、非保存的な方法（例えば、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から別の分類に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）又は保存的な方法（例えば、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から同じ分類に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）で、得られるタンパク質中のアミノ酸を変化させることができる。かかる保存的変化は、概して、得られるタンパク質の構造及び機能の変化を少なくする。非保存的な変化は、得られるタンパク質の構造、活性又は機能を変更する可能性がより高い。本開示は、得られるタンパク質の活性又は結合特性を著しく変化させない保存的変化を含む配列を含むように考慮されるべきである。そのため、当業者は、本明細書に提供されるＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドの配列の再検討、また他の溶解素ポリペプチドに利用可能なそれらの知識及び公開情報に基づいて、溶解素ポリペプチド配列においてアミノ酸の変化又は置換を行うことができる。本明細書に提供される溶解素（複数の場合もある）の配列内の１つ以上、１つ又は数個、１つ又は幾つか、１個～５個、１～１０個又は他のその数のアミノ酸を置き換えて又は置換して、それらの突然変異体又は変異体を生成するため、アミノ酸の変化を行うことができる。それらのかかる突然変異体又は変異体を、機能について予測するか、又は例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、又は腸球菌に対する本明細書に記載される抗菌活性についての機能若しくは能力、及び／又は本明細書に記載され、特に提供されている溶解素（複数の場合もある）に匹敵する活性を有することについて試験してもよい。そのため、溶解素の配列に対して行われる変化、及び本明細書に記載される突然変異体又は変異体を、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されるアッセイ及び方法を用いて試験することができる。当業者は、本明細書の溶解素（複数の場合もある）のドメイン構造に基づいて、合理的で保存的又は非保存的な置換を含む、置換若しくは置換えに適した１つ以上の、１つ若しくは幾つかのアミノ酸、及び／又は置換若しくは置換えに適さない１つ以上のアミノ酸を予測することができる。

抗生物質
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される骨及び関節感染を治療又は予防する方法は、１つ以上の抗生物質とＰｌｙＳｓ２溶解素とを治療有効量で共投与することを含む。幾つかの実施形態において、溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、本明細書に記載される１つ以上の抗生物質との共投与は、Ｓ．アウレウス又はＳ．エピデルミディス等のグラム陽性細菌に対する相乗的な殺菌及び／又は静菌効果をもたらす。典型的には、共投与は、静菌及び／又は殺菌活性に対する相乗効果をもたらす。他の実施形態において、共投与は、バイオフィルム形成及び／又は凝集を含む病原性の表現型を抑制するために使用される。幾つかの実施形態において、共投与は、被験体におけるバイオフィルムの量を減少させるために使用される。

本発明の方法での使用に適した抗生物質としては、種々の種類及び分類の抗生物質、例えばペニシリン（例えば、メチシリン、オキサシリン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン及びセファクロル）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）及びカルバペネム（例えば、イミペネム及びエルタペネム）を含むβ－ラクタム；マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン）、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン）、グリコペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン）、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド及びテジゾリド）、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン）、並びにスルホンアミド（例えば、スルファメトキサゾール）が挙げられる。

幾つかの実施形態において、抗生物質は、リファンピン又はリファブチン等のリファマイシン抗生物質を含む。典型的には、リファマイシン抗生物質が使用される。

幾つかの実施形態において、抗生物質は、典型的には、バンコマイシン又はダプトマイシン等の急性骨髄炎等の骨髄炎を治療するために使用される抗生物質である。幾つかの実施形態において、抗生物質、例えばダプトマイシンは骨組織によく浸透する。

本開示の更なる方法
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるグラム陽性細菌による骨又は関節の感染を予防する方法であって、本明細書に記載されるように、治療有効量のＰｌｙＳｓ２溶解素又はその変異体を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法に関する。任意に、本明細書に記載される抗生物質はＰｌｙＳｓ２溶解素と共投与される。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素又はその変異体は、デブリードマン及びインプラント再置換（ＤＡＩＲ）と併用して投与される。これらの実施形態において、例えば、インプラントの周囲の感染組織及び潜在的に感染した組織のデブリードマンは、典型的には、その後に滅菌生理食塩水等の多量の流体を用いた、関与する組織の関節鏡下洗浄が続く。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素又はその変異体は、関節鏡検査中、関節鏡下洗浄前、その間又はその後に投与される。幾つかの実施形態において、テジゾリド等の本明細書に記載される従来の抗生物質は、その後、例えば６週間～２４週間にわたり被験体に経口投与又は静脈内投与される。

幾つかの実施形態において、本開示の溶解素が投与される被験体は、高齢者であるか、又は骨若しくは関節の高い感染リスクと関連する状態に罹患している。例えば、骨又は関節の感染のリスクがある被験体は、肥満（例えば、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）閾値が３５）に罹患している可能性がある。例えば、高齢者の被験体は、少なくとも６５歳、例えば６５歳～９０歳、７５歳～９０歳、又は７９歳～８９歳である。理論によって制限されるものではないが、肥満を伴う人工骨又は人工関節の感染等の骨又は関節の感染リスク増加の考えられる理由としては、手術期間の延長及び／又は他の併存症の存在が挙げられる。

幾つかの実施形態において、骨又は関節感染、特に人工関節感染のリスクがある被験体は、糖尿病に罹患している。理論によって制限されるものではないが、糖尿病に関連するリスクは、グルコースレベルの上昇、白血球機能の障害、又は糖尿病を有する被験体における微小血管の変化の存在下でのバイオフィルム形成の増加に起因する可能性があり、創傷治癒及び表層手術部位感染の発症に影響を及ぼし得る。

骨及び／又は関節感染の他のリスク因子としては、関節リウマチ、男性の性別、及び喫煙が挙げられる。さらに、インプラント手術の前年の菌血症の診断も、人工関節感染等の骨及び／又は関節感染の危険因子である。

別の態様において、本発明の開示は、グラム陽性細菌バイオフィルムの形成を阻害するか、又は滑液中に形成されたグラム陽性細菌バイオフィルムを破壊する方法であって、本明細書に記載されるグラム陽性細菌を死滅させることができる溶解素を含む組成物を投与することを含み、溶解素は、本明細書にも記載されるようにＰｌｙＳｓ２溶解素であり、バイオフィルムが効果的に阻害又は分散される、方法に関する。本開示のこの態様におけるグラム陽性細菌は、本明細書に記載されるグラム陽性細菌のいずれかを含み得る。しかしながら、典型的には、グラム陽性細菌はスタフィロコッカス・エピデルミディスである。

投与量及び投与
本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の、それを必要とする被験体に投与される投与量は、治療されている感染の活動性、治療対象の被験体の年齢、健康及び総合的な健康状態、特定の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の活性、本開示による溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と対になり、かかる対による併用効果を有する抗生物質が存在する場合には、その抗生物質の性質及び活性を含む多くの要因に依存する。一般に、投与される本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の有効量は、０．００００１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．３ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば１ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇ、例えば４０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲に収まると予想され、最大１４日間、毎日１回～４回投与される。抗生物質は、標準的な投与計画で、又は相乗作用を考慮してより少ない量で投与され得る。しかしながら、（溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体、又はそれに伴って投与される任意の抗生物質に関わらず）かかる投与量及び投与計画はいずれも、最適化の対象となる。最適な投与量は、当業者が備えている技能の範囲内であるが、本開示を考慮に入れて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのパイロット有効性実験を行うことにより決定され得る。

本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は殺菌を提供し、より少量で使用すると静菌作用が得られ、或る範囲の抗生物質耐性菌に対して活性であり、耐性の発現と関連しないことが企図される。本開示に基づいて、臨床現場では、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、或る特定の抗生物質（耐性が生じた抗生物質であっても）と併用して、薬剤耐性細菌及び多剤耐性細菌から生じる骨及び関節の感染を治療するための組成物の強力な代替（又は添加剤若しくは成分）である。グラム陽性細菌に対する既存の耐性機構は、本発明のポリペプチドの溶菌活性に対する感受性に影響を与えないはずである。

本開示の任意のポリペプチドでは、治療有効用量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ、又はブタ）のいずれかで最初に推定され得る。望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するために動物モデルを使用することもできる。次いで、得られた情報を、ヒトにおける有効用量及び投与経路を決定するために使用することができる。しかしながら、典型的には、全身投与、特に静脈内投与が用いられる。十分なレベルの有効成分を提供するか、又は所望の効果を維持するように、投与量及び投与を更に調整することができる。考慮され得る追加の要因としては、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重及び性別；食餌、望ましい治療期間、投与方法、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（複数の場合もある）、反応感受性、並びに治療法に対する忍容性／応答及び治療医の判断が挙げられる。

治療計画は、毎日（例えば、毎日１回、２回、３回等）、隔日（例えば、１日おきに１回、２回、３回等）、半週毎、毎週、２週間に１回、１ヶ月に１回等の投与を必要とし得る。一実施形態において、治療を、持続点滴として与えることができる。単位用量を複数回で投与することができる。また、臨床症状を監視することによって指示されるというように、間隔が不規則であってもよい。代替的には、単位用量を持続放出製剤として投与することができ、その場合、必要な投与頻度はより少なくなる。投与量及び頻度は、患者によって異なる可能性がある。限局性の（localized）投与、例えば、鼻腔内、吸入、直腸等、又は全身投与、例えば経口、直腸（例えば、浣腸による）、ｉ．ｍ．（筋肉内）、ｉ．ｐ．（腹腔内）、ｉ．ｖ．（静脈内）、ｓ．ｃ．（皮下）、経尿道等に対してかかるガイドラインを調整することが当業者に理解される。

幾つかの実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、本明細書に記載の１つ以上の抗生物質、例えば、ダプトマイシンとが同時に投与される。他の実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、本発明の方法の１つ以上の抗生物質、例えば、ダプトマイシンとが任意の順序で連続して、例えば順次投与される。幾つかの実施形態において、溶解素は、標準治療抗生物質処置、例えば、オキサシリン及びゲンタマイシン又はダプトマイシンの２週間のコースの投与中又はその後に投与される。本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、本発明の１つ以上の抗生物質とを、単回用量又は複数回用量で、単独で又は組み合わせて投与することができる。

本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、１つ以上の抗生物質とを、同じ投与様式又は異なる投与様式によって投与してもよく、１回、２回又は複数回で、１つ以上を組み合わせて又は個別に投与してもよい。したがって、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体を、特に応答、例えば、殺菌及び／又は静菌効果及び／又は凝集及び／又はバイオフィルムの形成若しくはその減少に対する効果に応じて、初回用量、その後に続く用量（複数の場合もある）にて投与することができ、抗生物質の用量（複数の場合もある）と組み合わせ又はそれと交互に行ってもよい。典型的には、溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、単回ボーラスで投与され、その後本開示の１つ以上の抗生物質の従来の用量及び投与様式が続く。

より典型的な実施形態において、本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の単回ボーラスを被験体に投与し、その後、従来の投与計画、例えば、標準治療（ＳＯＣ）投与量のダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質が続く。他の典型的な実施形態において、ダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質を被験体に投与し、その後に本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の単回ボーラスが続き、その後に、従来の投与量のダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質の追加の投与量が続く。

幾つかの実施形態において、溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、ＭＩＣレベル未満、例えば、０．９×ＭＩＣ～０．０００１×ＭＩＣの範囲のＭＩＣレベル未満で投与され得る。かかるＭＩＣレベル未満では、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、典型的には、グラム陽性細菌の増殖を阻害し、凝集を減少させ、及び／又はバイオフィルム形成を阻害するか、又はバイオフィルムを減少若しくは根絶するために使用される。

幾つかの実施形態において、溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の単回のＭＩＣ未満の用量を被験体に投与し、続いて本開示の１つ以上の抗生物質を１回以上投与する従来の投与計画が適用される。他の更に典型的な実施形態において、ダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質を従来の投与量で被験体に投与し、その後にＭＩＣ未満の用量の本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の単回ボーラスが続き、その後に、従来の投与量のダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質の追加の投与量が続く。

理論によって制限されるものではないが、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体のＭＩＣ未満の投与量は、溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体のペプチドグリカン加水分解活性によって媒介される細胞エンベロープへの非致死的損傷をもたらす場合がある。幾つかの実施形態において、細胞エンベロープに生じる物理的及び機能的な変化が増殖の遅延の主な原因となる。かかる物理的及び機能的変化としては、例えば、細胞壁の不安定化、膜透過性の増加及び膜電位の消失が挙げられる。本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、典型的には、細菌の細胞膜に直接作用しないが、細胞膜透過性及び静電ポテンシャルに対するいかなる影響も、非常に低い濃度で溶解素のペプチドグリカン加水分解活性（及び細胞エンベロープの不安定化）によって誘発される浸透圧ストレスの結果である可能性が高い。また、局所的な細胞壁加水分解は、内膜の押し出し及び細孔の形成、並びに細胞合成及び加水分解の離脱（uncoupling）、細胞壁の厚さの変化をもたらし、その後の増殖停止をもたらす可能性があると仮定されている。

幾つかの実施形態において、本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体のＭＩＣ未満の濃度は、細菌細胞エンベロープを損傷し、ＭＩＣ未満の用量の本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体がない場合よりも従来の抗生物質の影響を受けやすい細菌をもたらす。

幾つかの実施形態において、ＭＩＣ未満及び／又はＭＩＣレベルの用量での本発明の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体は、バイオフィルム、特にｉｎ ｖｉｖｏバイオフィルムを減少させることができる。当該技術分野で知られているように、ｉｎ ｖｉｖｏバイオフィルムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオフィルムとは構造的に異なる場合がある。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオフィルムとｉｎ ｖｉｖｏバイオフィルム（慢性感染症に関連するもの等）との違いは、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオフィルム系における防御機構曝露の欠如によるものである。ほとんどのｉｎ ｖｉｖｏバイオフィルム生育環境では、膿、並びに他の排泄された液体及びポリマーの存在と共に、食細胞、更にはバクテリオファージが存在する場合がある。かかる変数は、制御又は再現が困難なｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系では一般的に回避され得る。

幾つかの実施形態において、本開示の１つ以上の抗生物質を、１×ＭＩＣ、２×ＭＩＣ、３×ＭＩＣ、及び４×ＭＩＣのように、ＭＩＣレベルで又はＭＩＣレベル超で、それを必要とする被験体に投与する。他の実施形態において、抗生物質はＭＩＣレベル未満で、例えば０．９×ＭＩＣ～０．０００１×ＭＩＣの範囲で投与される。

幾つかの実施形態において、本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の単回のＭＩＣ未満の用量を被験体に投与し、その後、ダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質の１つ以上の用量が続き、ここで、抗生物質の用量（複数の場合もある）はＭＩＣレベル未満でも投与される。

他の実施形態において、ダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質をＭＩＣ未満の投与量で被験体に投与し、その後にＭＩＣ未満の投与量の本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体の単回ボーラスが続き、その後に、ＭＩＣ未満の投与量のダプトマイシン等の本開示の１つ以上の抗生物質の１つ以上の追加の投与量が続く。

製剤
任意に、単独で、又は本明細書に記載される１つ以上の抗生物質と組み合わせて若しくは連続してのいずれかで投与される、本開示の溶解素若しくはそれらの活性フラグメント、又はそれらの変異体若しくは誘導体は、それぞれ単一の医薬製剤に含まれ得るか、又は溶液、懸濁液（a suspension）、エマルション、吸入用粉末、エアロゾル、若しくはスプレー（a spray）、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル剤、粉末、持続放出製剤、坐剤、タンポン用途エマルション、エアロゾル、スプレー（sprays）、懸濁液（suspensions）、ロゼンジ、トローチ、キャンディー、注射剤、チューインガム、軟膏、スメア（smears）、時間放出パッチ、液体を吸収したワイプ、及びそれらの組合せの形態で別々に製剤化され得る。

幾つかの実施形態において、医薬製剤の投与は、全身投与を含み得る。全身投与は、経腸又は経口（すなわち、物質を消化管を介して与える）、非経口（すなわち、物質を注射又は吸入等の消化管以外の経路によって与える）とすることができる。したがって、本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、任意に１つ以上の抗生物質とを、経口的に、非経口的に、吸入により、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、バッカルで若しくは留置されたリザーバーにより、又は任意の他の既知の方法により被験体に投与することができる。本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又は変異体若しくは誘導体、及び／又は１つ以上の抗生物質を、持続放出剤形を用いて投与することもできる。

経口投与の場合、本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体と、任意に１つ以上の抗生物質とを、固体又は液体の調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液及び分散液に製剤化することができる。幾つかの実施形態において、本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体及び／又は１つ以上の抗生物質を、例えば、ラクトース、スクロース、コーンスターチ、ゼラチン、ジャガイモデンプン、アルギン酸及び／又はステアリン酸マグネシウム等の賦形剤と共に製剤化することができる。

錠剤及び丸剤等の固体組成物を調製するため、本開示の溶解素若しくはその活性フラグメント、又はその変異体若しくは誘導体、及び／又は１つ以上の抗生物質を薬学的賦形剤と混合して固体プレ製剤組成物を形成する。望ましい場合、標準的な手法によって錠剤を糖コーティング又は腸溶性コーティングしてもよい。錠剤又は丸剤を、長期作用の利点を与える剤形を提供するためにコーティングしてもよく、又は他の形で配合させてもよい。例えば、錠剤又は丸剤は、内部製剤（inner dosage）及び外部製剤（outer dosage）の成分を含むことができ、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。２つの製剤成分を腸溶層によって分離することができ、胃内での崩壊に抵抗するようにはたらき、内側の成分が十二指腸をそのまま通過するか、又は放出が遅延することを可能にする。かかる腸溶層又はコーティング剤には様々な材料を使用することができ、かかる材料としては、多くのポリマー酸、並びにシェラック、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の材料とのポリマー酸の混合物が挙げられる。

他の実施形態において、本開示の医薬製剤は吸入可能な組成物として製剤化される。幾つかの実施形態において、本発明の医薬製剤は、有利には乾燥した吸入可能な粉末として製剤化される。具体的な実施形態において、本発明の医薬製剤は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いて更に製剤化され得る。好適な噴射剤の例としては、限定されるものではないが、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン及び二酸化炭素が挙げられる。或る特定の実施形態において、製剤は、噴霧化されてもよい。

幾つかの実施形態において、吸入用医薬製剤は、賦形剤を含む。好適な賦形剤の例としては、限定されないが、ラクトース、デンプン、中鎖脂肪酸のプロピレングリコールジエステル；中鎖、短鎖若しくは長鎖、又はそれらの組合せの脂肪酸のトリグリセリドエステル；パーフルオロジメチルシクロブタン；パーフルオロシクロブタン；ポリエチレングリコール；メタノール；ラウログリコール；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；中鎖脂肪酸のポリグリコール化グリセリド；アルコール；ユーカリ油；短鎖脂肪酸；及びそれらの組合せが挙げられる。

医薬品と噴射剤との間の表面張力及び界面張力を低下させるため、界面活性剤を本開示の吸入用医薬製剤に添加することができる。界面活性剤は、本発明のポリペプチドと非反応性である任意の好適な非毒性化合物であり得る。好適な界面活性剤の例としては、限定されないが、オレイン酸；ソルビタントリオレエート；塩化セチルピリジニウム；大豆レシチン；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル；ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンエチレンジアミンブロックコポリマー；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンブロックコポリマー；ひまし油エトキシレート及びそれらの組合せが挙げられる。

幾つかの実施形態において、本開示の医薬製剤は、鼻腔製剤を含む。鼻腔製剤としては、例えば、鼻腔用スプレー、鼻腔用ドロップ、鼻腔用軟膏、鼻腔用洗浄液、鼻腔用注射剤、鼻腔用パッキング、気管支スプレー、及び吸入剤、又は咽喉ロゼンジ剤、洗口液若しくは含嗽剤の間接的な使用によるもの、又は鼻孔若しくは顔へ適用される軟膏の使用によるもの、又はこれらの及び類似の適用方法の任意の組合せが挙げられる。

本開示の医薬製剤は、より典型的には注射によって投与される。例えば、医薬製剤は、グラム陽性細菌よる感染症、典型的には、Ｓ．エピデルミディスにより引き起こされる骨又は関節感染を治療するために、筋肉内、髄腔内、皮膚下（subdermally）、皮下（subcutaneously）又は静脈内に投与することができる。薬学的に許容可能な担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組合せで構成され得る。さらに、非経口注射剤の医薬製剤は、ｐＨ緩衝液、アジュバント（例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤）、リポソーム製剤、ナノ粒子、分散液、懸濁液又はエマルション、及び使用の直前に滅菌注射液又は分散液に再構成するための滅菌粉末を含むことができる。

非経口注射が選択される投与様式である場合、典型的には、等張性製剤が用いられる。一般的には、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンを挙げることができる。血管収縮剤を製剤に添加することができる。この種の用途に応じた医薬調製物は、滅菌されパイロジェンフリーで提供される。

本開示の医薬製剤は、単位剤形で与えられ得て、当該技術分野で既知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療対象の宿主、感染性細菌へのレシピエントの曝露期間、被験体の大きさ及び体重、並びに特定の投与様式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に治療効果を生み出す各化合物のその量である。一般的には、１００％のうち、有効成分の総量は約１％～約９９％、典型的には約５％～約７０％、最も典型的には約１０％～約３０％の範囲である。

実施例１．ヒト滑液（ＨＳＦ）中のＳ．エピデルミディスに対するＣＦ－３０１の抗微生物活性
Ｓ．エピデルミディスに対するＣＦ－３０１溶解素（配列番号１）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、ＣＦ－３０１を用いる抗菌感受性試験に使用することがＣＬＳＩによって承認されている（CLSI, AST Subcommittee Meeting, Jan., 2018）非標準培地（ウマ血清を２５％まで、及びＤＴＴを０．５ｍＭまで添加したｃａＭＨＢ（ｃａＭＨＢ－ＨＳＤ））中で、ＣＬＳＩ方法論（Ｍ０７－Ａ１１、２０１８）に従った微量液体希釈（ＢＭＤ）を用いて決定した。ＨＳＦ（Discovery Life Sciences）におけるＳ．エピデルミディスに対するＣＦ－３０１の活性を、５０％ＨＳＦを含むｃａＭＨＢ（ｃａＭＨＢ－ＨＳＦ）においてＢＭＤを用いて同様に決定した。ｃａＭＨＢ－ＨＳＦは、Ｓ．エピデルミディス及びＳ．アウレウスの増殖及びバイオフィルム形成を支援する。５３個のＳ．エピデルミディス臨床分離株及び２個のＭＲＳＡ株を研究のため選択し、各分離株は、先の研究でバイオフィルムを形成することが以前に実証された（Schuch et al. (2017) AAC, 61:e02666-16）。

以下の表３に示すように、ＣＦ－３０１は、０．０１５／０．１２５μｇ／ｍＬのＭＩＣ_{５０／９０}、及び０．００７８μｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬの範囲で、ヒト滑液中のＳ．エピデルミディスに対する強力な活性を示した。表３にも示されるように、Ｓ．エピデルミディスに対するＣＦ－３０１の活性は、Ｓ．アウレウスに対して観察されたものと同様であった。

実施例２．ＨＳＦにおけるＣＦ－３０１によるＳ．エピデルミディスバイオフィルムの破壊
ヒト滑液中で形成されたバイオフィルムに対するＣＦ－３０１活性の巨視的分析は、Dastgheyb et al. (2015) JID 211:641-50及びDastgheyb et al. (2015) AAC 59:e04579-14に記載される方法で実施した。簡潔に述べると、１０^８ＣＦＵのＳ．エピデルミディス分離株ＮＲＳ６を、ＨＳＦを含む２４ウェルプレートにおいて３７℃で２４時間インキュベートした。バイオフィルム形成後、ウェルを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色し、０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬのＣＦ－３０１で２時間処理した。バイオフィルムは、紫外線蛍光イメージングによって可視化した。未処理の対照も調べた。

図２は、ヒト滑液中でＮＲＳ６によって形成されるバイオフィルム構造の臭化エチジウム染色に対するＣＦ－３０１処理の影響を示す。図２において明らかなように、バイオフィルム構造は２時間以内に排除された。

また、バイオフィルム（及び個々の細菌）中の菌体外多糖を染色するＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ^４８８－ＷＧＡ、及びバイオフィルム全体を染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でバイオフィルムを染色した。次いで、バイオフィルムを蛍光顕微鏡検査で可視化した。図３において明らかなように、ＨＳＦ中で形成された表皮バイオフィルムは、０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬのＣＦ－３０１による処理の２時間後に排除された。

実施例３．ＨＳＦにおけるバイオフィルム破壊のＳＥＭ分析
また、走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）を、ヒト滑液中のＳ．アウレウスによるバイオフィルム形成及び０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬの濃度のＣＦ－３０１による２時間の処理後の排除を証明するために使用した。この実施例において、ＣＦ－３０１処理前にヒト滑液中にＳ．アウレウスのバイオフィルムが形成された。図４に示すように、ＣＦ－３０１はこれらのバイオフィルムを破壊する。

上述の実施例は、ＣＦ－３０１等の溶解素が、Ｓ．エピデルミディスによって引き起こされるものを含む、骨及び関節の感染、特に人工関節感染（これらは、抗生物質が一般的に有効でないバイオフィルムによって複雑になる）の治療薬として使用することができることを裏付ける。

実施例４．ダプトマイシンと組み合わせたエクセバカーゼ（ＣＦ－３０１）は、ラットのメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス骨髄炎において、ダプトマイシン又はＣＦ－３０１単独よりも活性である。
骨中のＣＦ－３０１のレベルは、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与後に血漿レベルの約１０％～１５％であることが判明し、それにより骨及び関節の感染を標的とし、かかる部位で感染を引き起こすＳ．アウレウスを溶解する戦略を提供した。骨感染に対するＣＦ－３０１の有効性を試験するため、急性ＭＲＳＡ骨髄炎の動物モデルを使用した。感染を確立するために使用された株であるＭＲＳＡ ＩＤＲＬ－６１６９は、微量液体希釈によって決定した場合、ＣＦ－３０１及びダプトマイシンの両方について０．５μｇ／ｍｌの最小発育阻止濃度を有した。最小バイオフィルム阻止濃度及び最小バイオフィルム殺菌濃度はそれぞれ、以前に記載される方法を用いて決定した場合にＣＦ－３０１では１μｇ／ｍｌ及び４μｇ／ｍｌ、またダプトマイシンでは１μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌであった。Schmidt-Malan et al., 2016, Diag. Microbiol. Infect. Dis. 85:77-79を参照されたい。Schuch R. 2016, Methods Development and Standardization Working Group, Clinical Laboratory Science Institute, Wayne, PA.に記載されるように、全ての試験ＣＦ－３０１に０．５ｍＭ ＤＬ－ジチオスレイトール及び２５％ウマ血清を添加した。

Ｚａｋの実験的骨髄炎のモデルを改変して用いて、６４匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて急性骨髄炎を確立した（O'Reilly T et al. 1999. "Rat model of bacterial osteomyelitis of the tibia, p 561-575." In Zak O, Sande M (ed), Handbook of animal models of infection. Academic Press, San Diego, CA.）。動物をイソフルランで麻酔し、左膝を剃毛してクロロヘキシジンで消毒した。骨髄炎を誘発するために、膝関節を４５度の角度で曲げて、脛骨突起の頂部を露出させた。１０μｌのアラキドン酸（５０μｇ／ｍｌ）及びトリプシンソイブロス中１０^７ｃｆｕのＭＲＳＡ ＩＤＲＬ－６１６９懸濁液５０μｌを含む２１ゲージの針を備えた１ミリリットルの注射器を脛骨に挿入した。細菌懸濁液をゆっくりと脛骨に注入し、針を抜き取り、膝関節をまっすぐにして、注射部位に１分間圧力をかけた。

感染確定から１週間後（８日目）、ラットを、１）治療なし、２）６０ｍｇ／ｋｇのダプトマイシン（腹腔内にて１２時間ごとに４日間）、３）尾静脈に４０ｍｇ／ｋｇのＣＦ－３０１単回投与、又は４）４０ｍｇ／ｋｇのＣＦ－３０１単回投与＋６０ｍｇ／ｋｇのダプトマイシン（腹腔内にて１２時間ごとに４日間）の４つの治療群のうちの１つに無作為に割り付けた。ＣＦ－３０１注射の１５分前にダプトマイシンを投与した。ＣＦ－３０１を注入まで氷上で維持した。ラットを、治療開始から４日後（１２日目）に屠殺した。各動物から左脛骨を収集し、計量し、定量的細菌培養のため凍結粉砕した。定量的培養の結果を、クラスカル－ウォリス検定を用いて、ＳＡＳソフトウェアバージョン９．４（ノースカロライナ州ケーリーのSAS Inc.）を用いて比較した。平均及び標準偏差を、ｌｏｇ_１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）／骨グラムとして報告した。全ての検定は両側検定であり、０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。

結果
治療を受けなかったラットは、５．１３（±０．３４）ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラムの平均（±ＳＤ）細菌密度を有した。ダプトマイシン、ＣＦ－３０１、及びダプトマイシン＋ＣＦ－３０１の治療群のラットは、それぞれ４．０９（±０．３７）ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラム、４．６５（±０．６５）ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラム、及び３．５７（±０．４８）ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラムの平均（±ＳＤ）を有した（図５）。未治療のラットと比較して、ダプトマイシン、ＣＦ－３０１、及びＣＦ－３０１＋ダプトマイシン療法により、それぞれ、１．０４ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラム、０．６５ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラム及び１．５６ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／骨グラムの減少があった。全ての治療群におけるコロニー数は、未治療ラットと比較して有意に（Ｐ≦０．０００１）減少した。しかしながら、ＣＦ－３０１を伴うダプトマイシンの動物は、ダプトマイシン（Ｐ＝０．００４２）又はエクセバカーゼ（Ｐ＜０．０００１）単独で治療したものよりもコロニー数が低かった。

上記の結果は、ＣＦ－３０１を単独で、又はダプトマイシン等の抗生物質と組み合わせて、骨髄炎の治療に使用することができることを裏付ける。ダプトマイシン又はＣＦ－３０１単独での治療は感染の減少を示したが、ＣＦ－３０１とダプトマイシンとを併用するとより良い効果が示された。

実施例５．人工膝関節感染を有する患者における関節鏡下ＤＡＩＲ中のＣＦ－３０１の有効性
再置換（revision）又は経大腿切断が実現不可能であり、他の経口選択肢が利用できない、再発性多剤耐性（ＭＤＲ）スタフィロコッカス・エピデルミディス人工膝関節感染を有する高齢患者（７９歳～８９歳）を、ＤＡＩＲと組み合わせたＣＦ－３０１による治療のために特定した。各症例を現地の倫理委員会に従ってフランス保健局と協議した。治療前に、各患者は書面による同意書に署名した。関節鏡検査中に関節内にＣＦ－３０１（７５ｍｇ／ｍＬ；３０ｍＬ）を直接投与し、続いて救済療法として抑制性テジゾリドを投与した。

４名の患者を治療した。いずれも、プロテーゼ弛緩はなく、以前に数回の人工膝関節再置換があった（図６Ａ）。３名はオープンＤＡＩＲに続く抑制性抗生物質にもかかわらず、人工膝関節感染を再発した。２名は敗血症性関節炎の臨床的徴候を示し（図６Ｂ）、他の２名には瘻孔があった。関節鏡検査中に有害事象は起こらず、いずれの患者も、ダプトマイシン８ｍｇ／ｋｇ及びリネゾリド（６００ｍｇを１日２回投与；４週間～６週間）を受け、続いて抑制療法としてテジゾリド２００ｍｇ／日を受けた。６ヶ月後、ベースライン時に瘻孔を有する２名の患者において、瘻孔の再発が起こった。１年間のフォローアップ後、敗血症性関節炎の臨床徴候が消失した２名の敗血症性関節炎患者において予後は良好であった（図６Ｃ）。この良好な予後は、抑制性抗生物質の有効性を改善し、かなりの機能喪失を回避するため、ＭＤＲブドウ球菌感が再発した患者において関節鏡下ＤＡＩＲ中にＣＦ－３０１を効果的に使用することができることを裏付ける。

実施例６．ラット骨髄炎モデルにおけるｐｐ２９６の有効性
メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＩＤＲＬ－６１６９；人工股関節感染を有する患者から単離された）の感染を、Karau et al., Exebacase in Addition to Daptomycin Is More Active than Daptomycin or Exebacase Alone in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Osteomyelitis in Rats, Antimicrob. Agents Chemother. 2019 Sept 23; 63(10)に記載されるプロトコルに従ってＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて確立した。具体的には、膝関節を曲げ、脛骨突起に２１Ｇ針を挿入し、１０μｌのアラキドン酸及び約１０^６～１０^８コロニー形成単位（ｃｆｕ）懸濁液のメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスＩＤＲＬ－６１６９ ５０μｌを注入することにより、ラットにおいて骨髄炎を確立した。

以下の６つの治療群を特定した：（１）対照／治療なし（ｎ＝１８）；（２）６０ｍｇ／ｋｇのダプトマイシン（ＤＡＰ）を１日２回４日間皮下投与（ｎ＝１７）；（３）４０ｍｇ／ｋｇのｐｐ２９６を４日間毎日静脈内投与（ｎ＝１７）；（４）４０ｍｇ／ｋｇのｐｐ２９６を４日間毎日静脈内投与＋６０ｍｇ／ｋｇのＤＡＰを１日２回４日間皮下投与（ｎ＝１７）；（５）１００ｍｇ／ｋｇのｐｐ２９６を治療１日目に単回用量として１回静脈内投与（ｎ＝１７）；及び（６）１００ｍｇ／ｋｇのｐｐ２９６を治療１日目に単回用量として１回静脈内投与＋６０ｍｇ／ｋｇのＤＡＰを１日２回４日間皮下投与（ｎ＝１７）。ダプトマイシンをｐｐ２９６と共に投与した場合、ｐｐ２９６の１５分前にダプトマイシンを与え、ｐｐ２９６は氷上に維持しておいた。

最後の治療投与から１２時間後に動物を屠殺し、脛骨を収集し、計量し、定量的細菌培養のために凍結粉砕した。ｌｏｇ_１０ ＣＦＵカウント／脛骨ｇを、偽発見率アプローチで調整されたウィルコクソン順位和検定を用いて決定した。結果を下記表４に示す。

結果は、１００ｍｇ／ｋｇのｐｐ２９６の単回用量がダプトマイシンと相乗作用し、未治療の対照と比較して平均ｌｏｇ_１０ ＣＦＵ／ｇを１．７６ＣＦＵ／ｇ減少させ、ダプトマイシン単独と比較して０．６２ＣＦＵ／ｇ減少させることを示す。この減少は、未治療の対照と比較して有意であり（Ｐ＝０．００３）、また同様にｐｐ２９６単回及び１日用量単独（すなわち、ダプトマイシンなし）と比較しても有意であった（それぞれＰ＝０．０２１０及びＰ＝０．０１７５）。ｐｐ２９６のこれらの結果はＣＦ－３０１で得られた結果に匹敵する。例えば、４０ｍｇ／ｋｇのＣＦ－３０１をダプトマイシンと組み合わせた単回用量は、ダプトマイシン単独と比較してｌｏｇ_１０ ＣＦＵ／ｇの０．５２の減少をもたらした。

さらに、動物の体重を、研究中に全身の健康状態のマーカーとしてモニターした。手術時（１日目）、治療直前（８日目）、及び屠殺時（１２日目）の動物の平均体重を表５に示す。

治療開始前の感染後最初の７日間で動物の体重が著しく減少したことが注目された。全ての治療群で、４日間の治療中に体重減少はほとんど又は全く認められなかった。

病理学的スライドは、細胞過形成の可能性のみを示した１日用量４０ｍｇ／ｋｇのｐｐ２９６（治療群３）を除いて、全ての群において好中球の増加を伴う細胞過形成骨髄を明らかにした。これらの知見は急性骨髄炎と一致しており、群間で顕著な区別は認められなかった。

Claims (31)

1. 骨又は関節の感染を治療又は予防する方法であって、
   配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性細菌に対する殺菌及び／又は静菌活性を備える、その変異体を含むＰｌｙＳｓ２溶解素を治療有効量、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記骨又は関節の感染がグラム陽性細菌を含む、方法。
2. 前記骨又は関節の感染がバイオフィルムを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記骨又は関節の感染が骨髄炎を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記骨髄炎が慢性骨髄炎である、請求項３に記載の方法。
5. 前記骨髄炎が急性骨髄炎である、請求項３に記載の方法。
6. 前記骨又は関節の感染が、人工関節感染又は天然関節の敗血症性関節炎を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記骨又は関節の感染が、人工関節感染を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記人工関節感染が人工股関節感染又は人工膝関節感染を含む、請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記被験体が肥満、糖尿病、関節リウマチに罹患しているか、又は高齢者である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記治療が、デブリードマン及びインプラント再置換（ＤＡＩＲ）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 被験体の滑液中に形成されたバイオフィルムを予防又は破壊する方法であって、
    配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有し、殺菌及び／又は静菌活性を備える、その変異体を含むＰｌｙＳｓ２溶解素を治療有効量、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記バイオフィルムがグラム陽性細菌によって形成される、方法。
12. 前記投与工程が、治療有効量の１つ以上の抗生物質を共投与することを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記１つ以上の抗生物質が、ベータ－ラクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、オキサゾリジノン、リポペプチド及びスルホンアミドからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記１つ以上の抗生物質がリファマイシンを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記１つ以上の抗生物質がバンコマイシン、ダプトマイシン又はテジゾリドを含む、請求項１２に記載の方法。
16. 前記１つ以上の抗生物質がダプトマイシンを含む、請求項１２に記載の方法。
17. 前記グラム陽性細菌が、ブドウ球菌、腸球菌及び／又は連鎖球菌を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ブドウ球菌がスタフィロコッカス・アウレウスを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記グラム陽性細菌が抗生物質耐性グラム陽性細菌である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記グラム陽性細菌がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む、請求項１～１７又は１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記コアグラーゼ陰性ブドウ球菌が、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・カプラエ、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス及び／又はスタフィロコッカス・エピデルミディスの少なくとも１つから選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記グラム陽性細菌がスタフィロコッカス・エピデルミディスを含む、請求項１～１７又は１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素変異体が、配列番号３～１７のアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素変異体が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ＰｌｙＳｓ２溶解素が、配列番号１のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記被験体がヒトである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記グラム陽性細菌がメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含む、請求項１～１９及び２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記破壊が、デブリードマン及びインプラント再置換（ＤＡＩＲ）を含む、請求項１１～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ＰｌｙＳｓ２が関節鏡検査中に投与される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ＰｌｙＳｓ２が関節鏡下洗浄中に投与される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

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