CN101018563A - 衍生自cap18的抗菌肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类具有抗菌活性的肽化合物。该化合物对于毒素并且尤其是对于细菌毒素如脂多糖和脂磷壁酸质具有亲和力。该化合物可以用来制备对于治疗细菌或真菌感染很有用的药物。该药物可以系统或局部地进行给予。

Description

衍生自CAP18的抗菌肽
技术领域
本发明涉及抗菌化合物，其抑制或杀灭包括格兰氏阴性细菌和真菌的微生物。另外，该化合物对于毒素并且尤其对于真菌和细菌毒素如脂多糖(LPS)或脂磷壁酸质(LTA)具有亲和力，以及该化合物可抑制或使这样的毒素无效。此外，本发明涉及该化合物的治疗和诊断应用，以及涉及包括该化合物的药物组合物及其给药方法。
背景技术
现代的药物疗法在抗击细菌感染方面已经非常成功，直至上世纪中叶，细菌感染通常是引起过早死亡的主要原因之一。然而，最近，由于持续增加的细菌抗药性，已经出现对广泛使用高度有效抗生素的日益增加的关注。事实上，在过去的25年中，对大范围的抗生素化合物的抗生素抗药性-尤其是多种抗药性实质上在所研究的每种细菌中都已增大。目前认为，不受一般抗药性机制影响的最先进剂型的抗菌剂是利用似乎选择用于多药抗性突变体的化合物。
基于这种开发，在农业和人类医药两方面，专家推荐使用抗生素要比过去要远远严格得多。例如，小部分感染-尤其是即使通常不是由细菌引起的感染如感冒，就不应该用抗生素进行治疗，而是应当将其保留用于更严重的症状。此外，有必要开发用于治疗细菌感染的具有完全不同类型的药物活性的新化合物，优选具有部分不依赖于对普通抗生素的细菌抗药性的活性。
在其中广泛使用抗生素引起争论性讨论的症状之一是极性形式或慢性形式的中耳炎。已证实，患有渗出性中耳炎(OME)(即，一类特征在于在没有极性感染症状的情况下中耳中存在液体的耳炎)的患者数量对于早期急性中耳炎(AOM)在引入抗生素疗法后显著增加，表明抗生素本身参与了OME。(Lim et al.，Laryngoscope  92，278-286，1982)。认为诸如青霉素的抗生素干扰局部免疫应答的形成，如利用在中耳中的局部IgM的生成(Howie et al.，Ann.Otol.Rhinol.Laryngol. 85 Suppl.25，18-19，1976)。传统抗生素疗法的另一缺点在于杀灭了细菌，但其毒素仍然是活性的。
已表明，对于治疗这些和其它由细菌或真菌感染导致的症状，可以有利地使用这样的化合物，该化合物不是杀灭微生物或细菌本身而是使其毒素无效并且允许天然宿主防御机制控制感染的传播(Nell，The Role of Endotoxinin the Pathogenesis of Otitis Media With Effusion，PhD Thesis，Leiden，1999)。同时，这种方案有利于受损粘膜功能的快速恢复。
在大量感染的症状如中耳炎中涉及的细菌毒素如真菌毒素并且尤其是细菌毒素之中的主要作用是通过内毒素来实施的，内毒素是在格兰氏阴性菌的细胞壁中发现的一类脂多糖(LPS)，由结合有高毒性脂质部分(脂质A)的多糖组成。用于治疗OME的最新治疗方法之一是给予使内毒素或LPS无效的化合物(Nell，ibid.)。
能够使内毒素或LPS无效的各种化合物目前是已知的。例如，已开发了多种抗内毒素抗体，如HA-1A和E5(分别为人类和胞壁单克隆IgM抗体)。已证实这些抗体提高患有某些重症如败血病性休克的患者的存活率(Ziegler etal.，New Engl.J.Med. 324，429-436，1991)。然而，其活性和特异性被认为是不满意的。
另一类对内毒素是活性的物质衍生自人内源性蛋白，称为细菌可渗透性增加的蛋白(BPI)，其被储存在中性白细胞的嗜天青颗粒(Gazzano-Santoro et al.，Infection and Immunity  60：11，4754-4761，1992)为强阳离子蛋白的BPI不仅使游离内毒素无效，而且本质上通过增大其外膜的渗透性来抑制或杀灭细菌细胞。BPI是真正有效的天然抗生素，由LPS和一些包括肿瘤坏死因子(TNF)的其它引发物的存在所引入的。然而，其大部分活性与合成它的免疫细胞，即多形核白细胞巨噬细胞有关。
也已开发了若干种衍生自BPI的重组蛋白，如rBPI23(Kohn etal.，1993)和rBPI21(Horwitz et al.，1996)，其较大程度地代表了分别具有分子量为23kDa和21kDa的BPI的N-末端部。例如，在WO-A-00/71149中已描述了BPI和BPI衍生化合物在治疗OME中的应用。
具有抗菌活性的天然化合物的另一家族是cathelicidin，一类由呼吸上皮细胞(肺泡巨噬细胞)和其它组织所产生的肽。以其天然形式，这些化合物是线性、α-螺旋、无半胱氨酸的肽或蛋白。Cathelicidin是阳离子性的并且包括高度保守的信号序列和正面区域(cathelin区域)。然而，其编码成熟肽的C-末端结构域表现出基本上的异质性(heterogeneity)。该肽具有12至80个氨基酸。
最著名的人cathelicidin是18kDa阳离子抗菌蛋白CAP18。CAP18的37C-末端氨基酸，即肽LL-37表示负责高亲和力的结构域并使对于LPS的形成能力无效(Sawa et al.，Antimicr.Agents Chemother. 42：12，3269-3275，1998)。已开发和测试了衍生自CAP18或LL-37的若干截短肽，如由Sawa(Sawaet al.，ibid.)、Gutsmann(Gutsmann et al.，Biophys.J. 80，2935-2945，2001)以及在美国专利第6,040,291号中所披露的那些截短肽。通常，相对较小的肽优选诸如CAP18的蛋白作为用于治疗用化合物的首选，这有几个原因，首先，它们可以更易于被优化、调整和修饰以保留或增加其希望的活性和特异性；其次，它们易于获得或合成，因而更易于得到；再次，它们易于配制和递送，由于蛋白质在非肠胃外给药后经常是不稳定的和非生物可利用的。
临时国际专利申请PCT/NL2004/00060(将其内容结合于此作为参考)披露了肽化合物，其对细菌和真菌毒素如LPS和LTA具有亲和力。该化合物包括氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6(在下文中，也称为核心氨基酸序列)，其中X1表示序列的N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，以及X6表示C-末端部；并且其中，该核心序列的一个或多个氨基酸可以被衍生化。该序列的进一步特征在于N-末端部被乙酰化，和/或C-末端部被酰胺化，和/或该氨基酸序列不同于X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。
所述专利申请进一步描述了用于制备这样的化合物的方法。该方法包括氨基酸单体或寡聚物的化学和酶促连接以装配该化合物。它们还包括在宿主细胞中编码该化合物的核酸序列的表达，其中利用用于通过该核酸序列来转染宿主细胞的载体。一种根据前述权利要求任一项所述的用于制备化合物的方法，其中氨基酸单体、氨基酸寡聚物、或氨基酸类似物或模拟物的单体或寡聚物通过化学或酶促连接进行装配，这在液相中和/或功能化固相的界面处进行。
已发现这些化合物在处理与感染相关或由感染所导致的症状中很有用。已表明它们在治疗上比在治疗某些慢性感染如中耳炎中的传统抗生素更有用。然而，在严重急性感染的情况下，仍然认为有效控制细菌生长是必不可少的，而这是通过给予抗生素来实现的。
发明内容
尽管有现有技术中的工作，但是对于在感染疾病(包括系统或局部细菌和真菌感染)的预防性或治疗性治疗中仍然需要加以改进。本发明的一个目的是提供新的疗法，该疗法是安全、有效的，并且其导致有效控制感染性微生物。本发明的另一个目的是提供不容易导致微生物抗药性的疗法。此外，本发明的目的是提供同样减少传统抗菌疗法不希望的作用，如在体内通过抗菌化合物杀灭微生物时所释放的细菌毒素的毒性作用的疗法。
基于以下描述，本发明的这些和其它目的将变得更清楚。
在第一方面，本发明提供了肽化合物在制备用于预防或治疗性治疗哺乳动物的细菌或真菌感染的药物中的应用，其中该化合物包括氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中X1表示N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，以及X6表示C-末端部。该核心序列的一个或多个氨基酸被可选地衍生化。此外，N-末端部被乙酰化，和/或C-末端部被酰胺化，和/或该氨基酸序列不同于天然氨基酸序列X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。
惊人地发现，这样的化合物不仅具有对于脂多糖(LPS)或脂磷壁酸质(LTA)的亲和力，而且具有直接抗菌或杀菌活性。也就是说，这些化合物可用于制备杀灭细菌和真菌的药物。该化合物具有杀菌和杀真菌活性。借助这种活性，该化合物可治疗性地用作抗生素，即使在不能用仅能够使细菌毒素无效的化合物来治疗的疾病和病症中。这样的疾病的实例是急性细菌或真菌感染，如败血病性休克，眼、肝、肾、肺、支气管、鼻或额窦、耳、阴道、尿道、皮肤、中枢神经系统、心肌、脾、以及其它器官和组织的急性感染。
在进一步方面，本发明涉及适用于预防和/或治疗类似细菌或真菌感染、或与细菌或真菌感染有关的疾病和病症的药物。
在下面的详细叙述中以及所附权利要求书中将陈述本发明的其它方面。
具体实施方式
惊人地发现，在临时国际专利申请PCT/NL2004/00060中披露的肽化合物不仅使细菌毒素和真菌毒素如脂多糖(LPS)和脂磷壁酸质(LTA)无效，而且具有显著抗菌活性。这些化合物包括核心氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中X1表示该序列的N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，X6表示C-末端部；并且其中该核心序列的一个或多个氨基酸被衍生化。此外，或者该序列的N-末端部被乙酰化，和/或C-末端部被酰胺化，和/或该氨基酸序列不同于X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。通过对细菌毒素的亲和力，该化合物可被治疗地用来处理与体内存在这样的毒素有关的病症。然而，通过它们的直接抗菌活性，它们也可被用作或代替抗生素。该双重活性使得这些化合物在单独给药和结合其它抗生素给药时都非常有用，其中抗生素的不希望的副作用如耐药性微生物的产生或在大量微生物在体内被杀灭时释放入体内的细菌毒素的毒性作用可以被抑制或减轻。
在本说明书和所附权利要求书中，术语“其中N-末端部被乙酰化”具有下面的意思。N-末端部通过与羧酸反应以获得连接有稳定或保护基团的酰胺而被保护。例如，有可能将肽与甲酸反应而获得甲酰基稳定的肽；与乙酸反应而获得乙酰基保护的肽。该肽可进一步与丙酸和其它在碳水化合物部分R中具有多达6个碳原子以及甚至多达10个碳原子的有机酸进行反应。在这些有机酸中，碳水化合物基团是具有多达10个碳原子的R，可以是直链或支链，或环状的和/或可以包含一个或多个不饱和部分。此外，烷基链可以被例如羟基、卤素、氨基、巯基以及硫氧化物基团所取代。因此，在N-末端部，可以存在下列基团：-C(O)-R’。可替换地，不是与羧酸反应，而是可以用磺酸来进行反应以获得相应的磺酰胺键。因此，在N-末端部，可以存在基团-SO2-R。可替换地，所述术语也涵盖烷基化和二烷基化作用，以便在N-末端部可以存在仲或叔胺基团-N-(R)1或N-(R)2，其中每个R具有上述的意思。
在更进一步的具体实施方式中，“乙酰化”涵盖肽与异氰酸酯或异硫氰酸酯(盐)进行反应，在这种情况下，分别形成了脲或硫脲：R-N-C(O)-或R-N-C(S)-，其中R如上文所定义。
最后，N-末端可由酸稳定的封端基团进行保护，该基团传统地在肽合成过程中被引入，但现在将不会去除。熟知的封端基团是Fmoc和Z-基团。
至于术语“其中C-末端部被酰胺化”的意思将在下面进行解释。术语“酰胺化”意思是当C-末端被基团-X代替后自然存在的-OH，其中X是(i)-NY2基团，Y独立地为H、或R，其中R如上文所定义，或者两个Y-基团一起可以是与其连接的N-基团一起的环状部分，优选存在至少一个R基团；(ii)-OR基团，其中R如上文所定义，或(iii)-R基团。优选酰胺化肽，因为它们具有最高的稳定性。
已发现，相比于从权利要求1排除的天然氨基酸序列，本发明的肽化合物(肽类化合物)具有最优化的稳定性。
肽化合物是肽如寡肽或多肽，蛋白质或衍生自肽的物质。超出肽本身，肽化合物还涵盖肽类似物、肽衍生物、经修饰的肽、以及肽轭合物。肽化合物具有共性，即它们包含氨基酸序列。更准确地，肽被定义为通过将一个酸的氨基与另一个的羧基进行结合而衍生自两个或更多个氨基酸的酰胺(Merriam Webster Medical Dictionary 2001)。相反，肽化合物还可以指分子内的肽结构。通常，肽由天然存在的(L-)α-氨基酸，尤其是丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、以及缬氨酸(Val或V)所构成。
肽的类似物或功能等同物是肽类分子，包含相同的活性，并且尤其是对微生物特别是对种类上而不必是数量上的细菌毒素的相同亲和力，并且可以是例如经修饰的肽、类肽(peptoids)、肽类似物和肽模拟物。
经修饰的肽是通过引入通常在天然存在的氨基酸中不存在的取代基或功能基团的衍生自肽的分子。该术语也包括通过肽与来自其它化学种类的分子(不管这些分子是否是天然存在或不是天然存在)进行反应而获得的化合物。例如，经常在自然界中发现磷酸化、磺化以及生物素化的肽、糖蛋白、以及脂蛋白，而用聚乙二醇修饰的肽是化学修饰的肽的实例，其被设计以改变部分但不是所有的肽的性能。
类肽(和肽一样)也是肽化合物，它们也通常是两种或更多种氨基酸的酰胺。然而，它们经常不是直接衍生自天然存在的氨基酸，而是衍生自各种类型的化学合成的L-和/或D-氨基酸。
肽模拟物(以其最广的意思)是在其功能结构上或多或少类似于肽的化合物，但其在主链中还可以包含非肽键、或D-氨基酸。通常，肽模拟物在受体与酶的相互作用中用作天然肽的替代物(Pharmaceutical Biotechnology，Ed.D.J.A.Crommelin and R.D.Sindelar.Harwood Academic Publishers，1997，p.138)。假肽(pseudopeptide)(一类肽模拟物)是包含酰胺键异酯(isoester)而不是酰胺键的化合物(ibid.，PP.137-140)。
用于实施本发明的化合物还包括肽或功能等同物的盐，如药学上可接受的酸或碱加成盐、以及加合物。它们还包括肽或功能等同物的多聚体。
此外，该化合物对至少一种毒素，并且尤其是细菌毒素具有亲和力。在大量感染性疾病中，在疾病的表现中涉及细菌毒素，如在格兰氏阴性细菌情况下的脂多糖(LPS)类和在格兰氏阳性细菌情况下的脂磷壁酸质类。这些毒素可诱导实质上的发炎反应。例如，在上气道感染中，发炎可以导致中耳或鼻窦上皮的粘膜损伤，致使粘膜纤毛清洁系统(MCS)(其为上气道的主要防御系统之一)的损伤。对真菌或细菌毒素的亲和力是任何无效作用能力的前提，并且优选地，本发明的化合物不仅结合至LPS和其它毒素，而且具有使这些毒素无效或抑制这些毒素的能力或者另外减少所述毒素的作用的能力。
在肽化合物满足根据权利要求1所述的结构要求时观察到希望的对细菌和真菌以及对细菌和真菌毒素的活性类型，根据权利要求1，该化合物包括氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，
其中X1表示该序列的N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，以及X6表示C-末端部。这些碱性基序衍生自天然抗菌蛋白CAP18、或其本身衍生自CAP18的肽LL-37。
如本文所使用的，N-末端部是表示化合物N-末端部分或结构域的基团、原子、或序列，即连接至核心序列的末端α-氨基基团的结构，在该序列中不包含酰胺键。在游离α-氨基基团的情况下，N-末端部可以简单地是氢原子；或者其可以由连接至末端α-氨基氮原子的化学基团如酰基基团构成。其也可以表示较大基团如两个或更多个氨基酸的序列，或者不是由或不是单独由氨基酸构成的化学结构。以类似形式定义C-末端部。
优选地，该化合物包括一共超过18个确定核心基序的氨基酸。在一个具体实施方式中，N-末端部包括两个或更多个氨基酸的序列。在这些氨基酸中，为这个序列的合适成员的是I和G，并且优选N-末端部是IG。
在另一具体实施方式中，C-末端部也包含氨基酸序列。该序列可以包含1、2、3、4或多于4个氨基酸。在一个具体实施方式中，C-末端部包含4个氨基酸。所述4个氨基酸的C-末端部的C-末端可以是E，如在肽LL-37中的等同位置。然而，这个C-末端也可以通过R来定义。位于紧邻C-末端氨基酸的氨基酸可以是T，如在LL-37中，或者其可以是L。P和R是C-末端部的4个氨基酸序列的两个其它优选成员(在两个剩余位置的任何位置)。最优选地，C-末端部选自序列PRTE和RPLR。
在进一步的具体实施方式中，N-末端部和C-末端部选自上述的优选方案以生成具有总数为24个氨基酸的肽结构。在这些当中，当前最优选的化合物是肽IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE和IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR，其或者作为肽本身，或者作为修饰或衍生的肽。
这些当中，优选的修饰体是酰胺化和/或乙酰化的肽。其中酰胺化似乎特别有利的位置之一是肽的C-末端。另一方面，乙酰化优选地在N-末端氨基酸处进行。在目前优选的具体实施方式中，肽IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE和IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR都被N-末端乙酰化和C-末端酰胺化。初步检测表明这些修饰体在存在外肽酶下具有增大的稳定性。
该化合物通常可通过已知的用于制备肽和类似物质的方法加以制备。仅包含少数氨基酸或类似单元(优选不多于30～50个单元)的较小化合物可通过化学或酶促结合技术，或者利用其中反应发生在溶液或悬浮液中的典型方法或者采用更现代的固相方法(其中肽在被固定至固体表面如聚合物珠的同时被装配)来制备。较大的化合物通常通过自动化固相肽合成器来合成。
可替换地，该化合物可通过已知的遗传工程技术来制备。如果该化合物真正是肽或稍微修饰的肽，则这种方法尤其有效。例如，编码该化合物的DNA序列可以与能够转染细胞的表达载体进行连接或组合。在该方法的另一步骤中，宿主细胞或靶细胞在可以进行转染的条件下，通过接触具有载体和载体相关DNA的细胞，利用所述DNA加以转染。在进一步的步骤中，宿主或靶细胞在允许表达该化合物的条件下进行培养。随后，可分离该化合物。如果该化合物本身不能被编码或被表达，但非常类似于可被编码或表达的肽，则该方法可被用来制备该化合物类似的肽，接着通过一个或多个步骤，其中肽通过化学或酶促技术进行修饰以制备该化合物。
为此可使用各种类型的载体，如病毒载体、lipoplex、polyplex、微球体、纳米球体、树形化合物、裸DNA、肽递送体系、脂质、尤其是阳离子脂质、或其形成的脂质体、聚合物载体、尤其是由多阳离子聚合物制成的聚合物载体。在这些当中，优选的病毒载体是逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、以及病毒颗粒。优选的非病毒载体包括壳聚糖、SPLP、基于PLGA的聚合物体系、聚乙烯亚胺、多熔素、聚氨基磷酸酯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚磷腈、DOPE、DOTAP、以及DOTMA。
可用于制备本发明化合物的方法的更全面概括描述于：W.F.Anderson，Nature  392 Supp.，30 April 1998，p.25-30；PharmaceuticalBiotechnology，Ed.D.J.A.Crommelin and R.D.Sindelar，Harwood AcademicPublishers，1997，p.53-70，167-180，123-152，8-20；Protein Synthesis：Methodsand Protocols，Ed.R.Martin，Humana Press，1998，p.1-442；Solid-PhasePeptide Synthesis，Ed.G.B.Fields，Academic Press，1997，p.1-780；AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxford University Press，1997，p.1-89。
肽或功能性等同物的盐通过已知方法进行制备，其通常涉及将肽或类肽或者与药学上可接受的酸进行混合以形成酸加成盐，或者与药学上可接受的碱进行混合以形成碱加成盐。酸或碱是否是药学上可接受，对于本领域技术人员来说，在考虑到该化合物的具体打算用途后可以很容易地加以确定。例如，不是所有的对于体外诊断组分可接受的酸和碱可用作治疗组合物。取决于预计的用途，药学上可接受的酸包括有机和无机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、肉桂酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸、以及硫氰酸，其与肽和功能性等同物的游离氨基形成铵盐。药学上可接受的碱(其与肽和功能性等同物的游离羧基形成羧酸盐)包括乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、异丙胺、二异丙胺、以及其它单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，以及芳胺。此外，也包括药学上可接受的溶剂化物、复合物或加合物，如水合物或ethurate。
肽的部分优选修饰可以在合成过程中或合成结束时容易地被引入。例如，当利用固相技术合成肽时，N-末端乙酰化可在氨基酸序列(其仍然结合至树脂)的端部与乙酸反应而不是另一个氨基酸来完成。
另一方面，C-末端酰胺化可通过在固相肽合成中利用特定种类的树脂，如可商购获得的Tengagel SAM(ex Rapp，Tübingen，Germany)来完成。这些树脂包括化学“柄”，酰胺化的肽在切割过程中从其释放。这些和进一步的修饰肽的方法对于本领域的任何技术人员来说都是已知的。
如前所述，本发明的化合物对于微生物毒素尤其对于细菌毒素如脂多糖(LPS)和脂磷壁酸质(LTA)具有亲和力。因此，该化合物可有利地用于其中涉及这些毒素存在的症状和疾病的预防、治疗以及诊断用途。结合能力通常导致毒素的无效，化合物通过其可被认为是拮抗剂和部分拮抗剂。而且，它们可以被用作对于其它能够使毒素无效的化合物的靶向试剂或配体，并且通过共价或非共价配体结合于该化合物，或通过共价或非共价键接于药物载体如脂质体、纳米颗粒或微粒、纳米胶囊或微胶囊、脂质复合物、或胶束的表面，其可以特异性地靶向于这些毒素。
在诊断中，化合物可以用于检测或量化存在于生理液体(如血液、血浆、血清、连着诸如呼吸道的粘膜上皮的粘液)、或在其存在引起病症的液体(如在渗出性中耳炎(OME)的中耳中发现的液体)中的细菌毒素的量。对于这种应用，化合物可以被组合到体外使用的诊断试剂盒中，或组合到可以给予至患者的诊断组合物中。对于这种应用，一种选择是将本发明的化合物与螯合剂加以轭合，其随后与可通过合适监测系统检测的同位素标记物进行复合。
在优选的应用中，将化合物作为活性药物给予以预防或治疗与真菌和细菌感染相关以及与体内存在真菌和细菌毒素有关的疾病和病症。如前面提到的，传统抗生素在治疗急性或慢性感染中存在某些缺陷和局限，其中的感染如诱导耐药性和选择耐药性细菌变体、由于微生物被杀灭而抑制患者的天然防御系统、损伤天然生长在粘膜的菌落、释放大量的细菌毒素等。而且，可能存在其中存在毒素尤其是细菌毒素而本身不存在微生物是主要原因的病症和疾病，如在OME中，其中毒素在中耳中的局部保留可显著有利于疾病的表现，即使缺少急性感染的症状。
然而，由于该化合物也具有显著的抗菌活性，所以它们可以即使在其中必需实际上减少感染主体的微生物数量的那些症状，如严重急性感染中被利用。在这方面，它们可以代替或补足其他抗生素，即使在不能利用仅能够使微生物毒素无效的化合物来治疗的疾病和病症中。这样的疾病的实例是急性细菌或真菌感染，如败血病性休克，眼、肝、肾、肺、支气管、鼻或额窦、耳、阴道、尿道、皮肤、中枢神经系统、心肌、脾、或其它组织和器官的急性感染。特别与感染相关的严重病症的实例是败血病性休克。
在所有这些情况下，不用抗生素药物而是用能够使细菌毒素无效的物质来治疗疾病是可行的。为此，本发明的化合物是尤其有利的，因为它们表现出对最相关的微生物毒素如在格兰氏阴性细菌情形下的脂多糖(LPS)和在格兰氏阳性细菌情形下的脂磷壁酸质(LTA)的较高结合和无效活性。在上气道的感染中，对于治疗这种感染，本发明的化合物是特别优选的，这些细菌产物可诱发在中耳或鼻窦中的炎性反应，并且可诱发上气道上皮的粘膜损伤。涉及的使毒素无效可以允许粘膜损伤(包括粘膜纤毛清洁系统(MCS)的损伤)被防止、控制、或减少，从而将强化天然防御系统。在包括OME的那些情形中，其中细菌毒素可以代表即使在缺少多数活的细菌细胞中的主要问题，依赖于给予本发明化合物(例如直接给予至中耳)的疗法可以代表主要的治疗方法。但同样在其它气道感染如急性或慢性鼻窦炎、或急性或慢性耳炎中，该化合物对于恢复正常粘膜功能及其天然防御系统可以是高度有用的。
更通常地讲，本发明的化合物在预防和治疗由感染性细菌构成和来自感染性细菌的症状中是很有用的药剂，其中感染性细菌包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、A群β-溶血链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、格兰氏阴性肠杆菌、化脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、格兰氏阴性杆菌、海绵假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
用本发明化合物预防或处理的感染可以是由实质上是浮游生物的微生物引起的，即，其习性是单个微生物。例如，如果浮游微生物已经感染了哺乳动物的生理液体如血液，则它们可以利用血流被输送到哺乳动物的全身。
其可以至少部分是由浮游微生物引起的系统或通常化感染包括急性或慢性真菌感染如放线菌病、芽生菌病、诺卡菌病、隐球菌病、孢子丝菌病、孢子丝菌病、球胞子菌病、和曲霉病，以及急性或慢性细菌感染如炭疽热、破伤风、坏疽、肉毒中毒、李斯特菌病、斑疹伤寒、军团病、霍乱、黄热病等。急性严重系统感染可能与败血病性休克相关，其是败血症的威胁生命的严重形式，其通常由于在血流中存在大量格兰氏阴性细菌及其毒素所导致的，并且其进一步特征在于减少血液流至器官和组织、低血压、器官功能障碍、损伤的精神状态、以及经常性多器官功能衰竭，并且其经常影响免疫缺失个体。
然而，在最近几年，已发现许多感染性疾病和症状也是(至少部分)由形成更多无柄群落的微生物(通常称为生物膜)所引起的。这对于许多系统感染并且尤其是对于大量更多局部感染来说是真实的。如本文所使用的，生物膜是微生物衍生的无柄群落，其特征在于附着至基质或界面或相互附着的细胞被嵌入胞外聚合物(它们产生的)的基质中，并且相对于生长速率和基因转录表现出变化的显型。通常，胞外基质包括高度水合的显性阴离子基质聚合物。生物膜可以粘附至表面和界面；事实上，粘附可以引发控制胞外基质的产生和前述浮游微生物转化为其无柄显型的基因的表达。
认为无柄微生物及其生物膜在大量感染疾病中起主要作用，并且对于它们中的部分，这已由大量证据所支持。在这些疾病之中，例如是牙周炎、天生瓣膜心内膜炎、囊性纤维化病、慢性细菌性前列腺炎、支气管炎、肺炎、鼻窦炎、蛀牙(老年龋)、慢性扁桃体炎、心内膜炎、坏死性筋膜炎、肌与骨骼的感染、骨髓炎、胆管感染、感染性肾结石、以及中耳炎。最可能地，许多其他(尤其是局部)的涉及身体的具体区域或器官的感染(还涉及无柄微生物)，如肝、脾、牙周组织、眼、肾、皮肤、阴道、尿道、或心脏的感染。
在研究如权利要求1中所定义的肽化合物的活性中，现在已发现，这些化合物对于无柄的形成生物膜的微生物也是活性的。因此，它们代表对于预防或治疗涉及这样的微生物或涉及微生物的无柄状态的疾病的有用化合物。例如，已发现在标准生物膜试验中，能够在某些表面如PVC上形成生物膜的某些微生物例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)可被抑制和阻止形成生物膜。
当本发明的化合物以至少约0.001μM，并且更优选地以至少约0.01μM，以及还更优选地以至少约0.1μM的浓度存在时可获得抑制效应。在进一步优选的具体实施方式中，该化合物的浓度为约0.1至约100μM。然而，取决于接触生物膜的液体的种类和数量，以及涉及的特定微生物，这些浓度可以被调整。
此外，已发现本发明的化合物不仅通过另外能够形成微膜的微生物阻止生物膜的形成，而且对于已形成的微膜也是活性的。取决于其浓度，它们能够破坏或降解生物膜，例如在标准生物试验中可检测的生物膜。同样，化合物的浓度应通过考虑接触该生物膜和涉及的特定微生物的液体的种类和数量加以选择。例如，已发现低至约0.001μM的浓度对于预先形成的生物膜已经可以具有破坏性作用。因此，优选选择化合物的浓度为至少约0.001μM。其它优选的浓度分别为至少约0.01μM、0.1μM、1μM、10μM以及100μM。
由生物膜感染的特别危险起因于不管是用于诊断或治疗用途的在人或其它哺乳动物的体内插入或植入医疗装置。例如，已证实生物膜的涉及来自隐形眼镜、心脏瓣膜、静脉导管、导尿管、宫内避孕器、缝合、人造血管、分流管、腹膜透析装置、阴茎修补物、以及矫形修补物的感染。因此，另一优选具体实施方式是利用本发明的化合物来预防或处理由这样的装置导致的感染。
本发明的化合物相对其衍生自的天然蛋白质和肽如CAP18和LL-37的特别优点是其较低程度的不希望的发炎活性。这种活性与各种细胞过程，包括编码在前发炎介质如细胞因子的基因的增生、分化和表达相关。细胞因子是炎症的直接介质并且影响许多免疫反应的进展和趋向。细胞因子生产中平衡的扰动被广泛识别为若干疾病状态的关键因素。在诸如渗出性中耳炎或鼻窦炎的症状中，这种平衡已被破坏。T细胞增生在这种情况下也不是有利的，因为这将进一步刺激已失去控制的免疫应答。
因此，该化合物可有利地用于药物组合物中。根据本发明，提供了这样的药物组合物以及化合物本身。如本文所使用的，术语“药物组合物”指的是治疗和诊断组合物，以及包含这样的组合物的药物和诊断处方。治疗用组合物和药物用于预防或治疗哺乳动物的疾病和其它症状(希望进行改善)。诊断处方和诊断组合物用于这样的疾病的体内和体外的诊断。
通常，这样的药物或组合物包括至少一种作为活性成分的本发明化合物以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个具体实施方式中，所述药物包括另一活性成分，其可以选自如权利要求1所述的化合物的相同组。可替换地，另一化合物属于不同的组。例如，可以为这样的化合物，其也已知具有抗生素或抗真菌活性但具有不同的作用机制。在进一步的具体实施方式中，另一化合物没有被组合到同一药物中，而是作为单独制剂同时给予。
此外，将组合物以这样的方式进行加工和成型，使得其可以被给予至人或动物。如本文所使用的，载体或赋形剂是任何药学上可接受的物质或基本上不具有药理活性的物质的混合物，其可作为赋形剂或作为辅助物质使用以将化合物制成剂型，该剂型稳定并适合给药。药学上可接受的赋形剂的实例对技术人员来说是已知的并且可在专业药典的专著中找到。
在一个具体实施方式中，配制和加工该组合物以用于非肠道注射、滴注或灌注，优选用于血管内注射，如静脉内或动脉内注射，但也用于肌内、皮下、伤口内、腹膜内、局部区域或其它非肠道给药途径。在另一优选具体实施方式中，将组合物直接给予至感染的上气道的粘膜，如中耳。管理用于这些给药途径的其它药物制剂的相同原则也将教导本领域技术人员如何制备这样的组合物。例如，非肠道剂型的要求之一是其无菌性。其它要求描述于所有专业药典，如在USP 24、专著“General Requirements for Tests and Assays.1.Injections”，p.1775-1777。为了增加非肠道制剂的稳定性，可能有必要提供干的剂型，其必须在可被给药之前重组。这样的剂型的实例是冷冻干燥或冻干的制剂。合适地，本发明的组合物也可包含粘液溶解的溶剂。
将本发明化合物作为非肠道受控释放剂型给予可能是理想的，以避免频繁注射并且增进治疗的有效性和便利性。各种制备这样的贮存制剂的方法是已知的。缓释可以由固态植入物、纳米颗粒、微粒、微胶囊、乳剂、悬液、油溶液剂、脂质体、或类似结构来提供。
在用于局部给予至受感染粘膜的组合物的情况下，提供具有在给药部位处的局部保持延长时间的性质的制剂可能是很有用的，以增加药物的有效性。为了实现这个目标，粘膜粘附(mucoadhesive)赋形剂可以组合到制剂中。这样的功能性赋形剂对本领域技术人员来说是已知的；它们包括聚合物如聚丙烯酸及其衍生物、聚甲基丙烯酸及其衍生物、包括羟丙基甲基纤维素的纤维素醚、羧甲基纤维素、淀粉、壳聚糖等。适合或可替换地，本发明的组合物也可以包含粘液溶解的溶剂。尤其是，粘液溶解的溶剂可以用来影响本发明的肽化合物进入粘液(例如在呼吸道中)的渗透性。合适的溶剂可以包括已知的粘液调节剂或粘液溶解剂如N-乙酰基半胱氨酸、S-羧甲基半胱氨酸、溴己新(bromhexine)、ambroxyl、脱氧核糖核酸酶、厄多司坦(erdosteine)、盐水溶液以及奈索司坦(nesosteine)。优选地，使用溴己新。
以其最宽定义，对于制备非肠道制剂特别有用的其它赋形剂是溶剂、助溶剂以及液态或半固态载体，如无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、丁二醇、脂油、短链和中链甘油三酸酯、卵磷脂、聚氧化乙烯蓖麻油衍生物；用于调节摩尔渗透压浓度和pH的物质，如糖类尤其是葡萄糖、糖醇尤其是甘露醇、氯化钠、碳酸钠、柠檬酸、醋酸盐(酯)、磷酸盐(酯)、磷酸、盐酸、氢氧化钠等；稳定剂、抗氧化剂、以及防腐剂，如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠、EDTA、苄醇等；其它赋形剂和冻干助剂如白蛋白、葡聚糖等。
类似地，可以有利地以跨粘膜剂型给予本发明的化合物。这种给药途径是非攻击性和患者友好的；同时，当与口服给药相比时，其通常导致本发明化合物改进的生物可利用性，尤其是在该化合物在消化系统的液体中不稳定的情形，或其太大而不能从内脏有效被吸收的情形下。跨粘膜给药例如借助于鼻、口腔、舌下、齿龈、或阴道剂型是可能的。这些剂型可通过已知技术来制备；可将它们配制成滴鼻剂或喷雾剂、插入剂、膜剂、药膏、凝较剂、油膏、或片剂。优选地，用于跨粘膜剂型的赋形剂还包括一种或多种提供粘膜附着力的物质，因此，延长剂型与吸收部位的接触时间，从而有效地增大吸收程度。
可替换地，药物组合物可以被设计用于口服给药并相应地进行加工。合适的口服剂型包括片剂、硬胶囊、软胶囊、粉末、颗粒、口服分解剂型、糖浆、滴剂、悬浮液、泡腾片剂、可咀嚼片剂、口含软片(oral film)、冻干剂型、缓释剂型、控释剂型。在优选的具体实施方式之一中，口服剂型是肠道涂覆的固态剂型以在胃的酸性和蛋白水解的环境中为化合物提供保护。
在进一步的具体实施方式中，借助于肺部途径给予该化合物，利用计量吸入器、喷雾器、气溶胶喷射、或干粉吸入器。合适的制剂可通过已知方法和技术来制备。经皮的、直肠或眼给药在一些情形下也是可行的。
可以有利地利用先进的药物递送或靶向方法来更有效地递送本发明的化合物。例如，如果选择非注射给药途径，则合适的剂型可以包含生物可利用性增强剂，其可以是任何增加该化合物的可利用性的物质或物质的混合物。这可以通过例如防止化合物降解来实现，如通过酶抑制剂或抗氧化剂。更优选地，该增强剂通过增大吸收壁(其通常是粘膜)的可渗透性来增加化合物的生物可利用性。渗透增强剂可通过各种机制起作用；一部分增大粘膜的流动性，而其它的则打开或加宽在粘膜细胞之间的间隙连接。还是其它的降低覆盖在粘膜细胞层上的粘液的粘度。在这些之中，优选的可生物利用性增强剂是两性物质如胆酸衍生物、磷脂、乙醇、脂肪酸、油酸、脂肪酸衍生物、EDTA、卡波姆(carbomer)、聚卡波非(polycarbophil)、以及壳聚糖。
利用化合物的抗菌活性和抗真菌活性，可选地将它们用于制备或者不包含防腐剂或者仅包含减少含量的防腐剂的药物。“减少含量”意思是指防腐剂的含量低于需要用来有效防腐(保存)相应的安慰剂组合物的防腐剂含量，其中的安慰剂组合物是含有除了活性成分外的相同组分的组合物。
组合物是否有效地防腐可利用适当的试验如用于防腐效力的试验(例如USP<51>)来确定，其中取决于产物类别，以确定的时间间隔检测了五种置疑的微生物。以适当系列进行检测，还可实施这样的检测以确定对于所给组合物如对应于上述组合物的无药物的组合物的特异性防腐剂的最小有效浓度。
例如，可以发现，为了利用山梨酸来有效地防腐特定的安慰剂组合物，防腐剂必须以至少约0.1％(w/v)的浓度存在。在这种情况下，包含权利要求1所述化合物的参照组合物可含有以基本上较低浓度如约0.05％(w/v)或更低的山梨酸。在另一具体实施方式中，选择防腐剂的浓度不高于约1/5，并且更优选不高于约1/10的需要用来有效地防腐相应的安慰剂组合物的浓度。
以下实施例旨在进一步阐述本发明，而不是用来将其范围限制于本文提供的具体实施方式。
实施例1：化合物的制备
在自动化多重肽合成器(SyroII，MultiSyntech，Witten，Germany)上通过固相方案制备了下列肽化合物，其每一个都包含24个氨基酸，将本文的化合物编码为P60、P60.4、P60.Ac、以及P60.4Ac。对于P60和P60.4，将Tentagel S AC(Rapp，Tübingen，Germany)(聚乙二醇和聚苯乙烯的接枝聚合物)用作树脂(加载0.2meq，粒径90μm)。对于P60.Ac和P60.4Ac，使用Tentagel S AM，其生成C-末端酰胺化肽。通过向反应容器中加入6倍摩尔过量(基于加载的树脂)的在NMP中的适当Fmoc氨基酸的0.60M溶液、6倍摩尔过量的在NMP中的0.67M PyBOP以及12倍摩尔过量的在NMP中2/1(v/v)的NMM来实施重复连接。侧链保护如下：tBu用于D、E、S、T；Boc用于K；Trt用于N、Q以及Pmc用于R。通过向每个反应器中加入3倍的哌啶/NMP 1/4(v/v)进行Fmoc去保护。连接时间和去保护时间分别为45分钟和3次3分钟。在连接和Fmoc去保护之后用NMP进行洗涤6次。对于P60.Ac和P60.4Ac，在肽仍然结合于树脂的同时利用醋酸实施N-末端乙酰化。在合成之后，将肽基树脂分别用NMP、二氯甲烷、二氯甲烷/乙醚1/1(v/v)和乙醚充分洗涤，并空气干燥。然后将肽基树脂切割并将侧链在TFA/水95/5(v/v)(每10μmol肽1.5ml)中去保护2.5h，通过过滤去除树脂并利用乙醚/戊烷1/1(v/v)(每10μmol肽10ml)将肽从TFA溶液中沉淀出来。将该溶液在-20℃下冷却1h并通过离心(-20℃，2500g，10min)分离出沉淀的肽。在用10ml乙醚/戊烷1/1(v/v)的小球捣碎和涡旋以及通过相同工序的分离之后，将肽在室温下空气干燥1小时。将肽溶解在2ml水或2ml 10vol％的乙酸中，将该溶液在液氮中冷冻约5min，接着冷冻干燥同时离心(1,300rpm，8～16h)。利用RP-HPLC和Maldi-tof质谱仪对肽进行分析。
该化合物的氨基酸序列是：
P60       IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE
P60.Ac*   IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE
P60.4     IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR
P60.4Ac*  IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR
*后缀Ac意思是指肽被N-末端乙酰化并且C-末端酰胺化。
实施例2：毒素的无效
根据实施例1制备的化合物，利用鲎变形细胞溶解物(LAL)试验以及利用全血(WB)试验对它们使细菌毒素LPS无效的能力进行检测。LTA无效也利用全血试验进行检测。将肽LL-37用作阳性对照。将使50％LPS无效的肽浓度用作肽活性的测量值。这些浓度值列于表1中。在每个试验中的化合物之间的差异统计上不是显著性的。总的来说，所测试的本发明化合物同天然抗菌肽LL-37一样表现出大约相同程度的抗毒素活性。
表1：对于使50％LPS和LTA无效的化合物浓度(μg/ml±SD)
 化合物     LPS(LAL)     LPS(WB)     LTA(WB)
 P60     1.5±0.5     1.4±0.1     2.1±0.7
 P60.Ac     1.8±0.8     2.4±0.5     2.1±0.1
 P60.4     1.7±0.6     2.1±0.6     2.0±1.3
 P60.4Ac     1.8±0.1     nd     Nd
 LL-37(对照)     1.3±0.2     1.2±0.2     1.6±0.5
实施例3：通过化合物的免疫细胞活化
根据实施例1制备的化合物，通过利用Elispot、T-细胞增生、ERK-活化、以及嗜中性白细胞趋化性试验对其治疗上不希望的免疫原活性进行测试。Elispot试验用来确定药物、化学品或其它化合物对体外细胞因子分泌的作用，从而提供关于其对体内免疫功能的推定调节作用。试验的结果以对IFN-γ的阳性(正)响应的分数给出。ERK(胞外信号相关激酶)-1/2是部分MAP激酶信号途径，其已被证实涉及各种细胞过程，包括编码前发炎介质如细胞因子的基因的增生、分化和表达。细胞因子是炎症的直接介质并且影响许多免疫反应的进展和趋向。细胞因子生产中的平衡的扰动被广泛识别为若干疾病状态的关键因素。在诸如渗出性中耳炎或鼻窦炎的症状中，这种平衡已被破坏。T细胞增生在这种情况下也不是有利的，因为这还将刺激已失去控制的免疫应答。因此，希望本发明的化合物并不刺激嗜中性白细胞的细胞因子生产、T细胞增生、ERK活化或趋化性。
对于T细胞增生，在没有或存在10μg/ml化合物下，在96孔圆底平板(Costar Inc.Cambridge，MA)中，以最终全部体积为150μlIMDM，将150,000个周围血单核细胞(PBMC)培养5天。作为阳性对照，将PBMC在存在25U/ml重组IL-2下进行培养。在培养的最后20小时期间，用[3H]胸腺嘧啶(0.5微Ci/孔)脉动PBMC，之后通过液体闪烁计数检测3H-并入。对于通过Elispot分析的T细胞细胞因子IFN和IL-10的检测，在没有或存在各种浓度的合成肽下，在全部0.5ml IMDM中培养1.5×106个PBMC。作为阳性对照，通过10μg/ml商陆促分裂原(PWM)来刺激PBMC。在培养48h后，通过用温和IMDM轻轻漂洗孔以收集非附着性细胞(其被洗涤到较大体积的IMDM中)而获得PBMC。接下来将PBMC置于预涂覆了抗体的ELISA平板上并在37℃、5％CO2下、在补加了2％混合人AB血清的IMDM中培养5h，之后根据制造商协议(U-CyTech，Utrecht，The Netherlands)将平板展开。在Olympus显微镜上计数斑点并用Olympus Micro Image 4.0软件(Paes Nederland，Zoeterwoude，The Netherlands)进行分析。将最终的结果表示为阳性刺激指数的分数(阳性：＞2)。
利用来自粘液表皮样肺肿瘤细胞系NCI-H292(ATCC，Rochville，MD)的细胞测试ERK-1/2活化，将该细胞在补加了2mM L-谷氨酰胺(Bio Wittaker，Walkersville，MD)、200U/ml青霉素(Bio Wittaker)、200μg/ml链霉素(Bio Wittaker)以及10％(v/v)热失活胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养基(Gibco，Grand Island，NY)中、在24孔或6孔组织培养皿中进行培养。在达到接近汇合之后，将细胞在无血清培养基中培养整夜。接着用指定刺激物刺激细胞15分钟。细胞溶解产物利用溶胞缓冲液(0.5％[v/v]Triton X-100，0.1MTris-HCl pH7.4，100mM NaCl，1mM MgCl2，1mM Na3VO4，小型完整蛋白酶抑制剂混合物[Boeringer Mannheim，Roche，Basel，Switzerland])加以制备。在10％甘氨酸基的凝较上将样品进行SDS-PAGE，并将溶解的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。非特异性结合部位通过PBS/0.05％吐温-20/1％酪蛋白被阻断。利用对磷酸化ERK-1/2(New England Biolabs，Beverly，MA)的兔多克隆抗体和结合有抗兔IgG抗体的次级辣根过氧物酶孵育印迹。利用增强的化学发光(ECL)蛋白质印迹检测系统(Amersham PharmaciaBiotech，Upsala，Sweden)来显示免疫反应性。
利用Percoll密度离心(密度：1.082g/ml)，用分离自周边血的嗜中性白细胞来测量嗜中性白细胞趋向性。在趋向性介质(20mMN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES缓冲液)HEPES，132mMNaCl，6mM KCl，1.2mM KH2PO4，1mM MgSO4，5.5mM葡萄糖，0.1mM CaCl2和用无血清的RPMI 1∶1稀释的0.5％(wt/vol)人血清白蛋白[Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood TransfusionService(CLB)，Amsterdam，The Netherlands])中，将细胞以2.5×106细胞/ml的浓度进行再悬浮。利用改进的Boyden Camber技术来评估化合物的趋化活性。简而言之，将稀释在HEPES缓冲液的26μl刺激物加到下部区室的孔中，并将50μl的嗜中性白细胞悬浮液(2.5×106个细胞/ml)加到上部区室中。区室由两个过滤器分隔开：下面的过滤器的孔径为0.45μm(Millipore Products，Bedford，MA)并且上面的过滤器的孔径为8μm(Sartorius Filter，San Francisco，CA)。在37℃下孵育90min后，取下上面的过滤器，固定在乙醇-丁醇(80∶20，v/v)中，并用Weigert溶液染色。为了确定嗜中性白细胞趋向活性，在6个自由度的较高功率场(x400)中计数嗜中性白细胞，并计算相比于阳性对照(10-8M N-甲酰甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP，Sigma)，在膜上的嗜中性白细胞百分数。
在表2中给出了结果。概括地讲，所测试的本发明化合物，尤其是P60.4，诱发了非常低的免疫应答，低于天然肽LL-37。它们表现出了较低的ERK活化并且基本上没有嗜中性白细胞趋向性。
表2：化合物的免疫原性
 化合物   y-IFN Elispot   T细胞增生   ERK-活化   趋向性(％)
 P60   1/8   7/8     -   76±39
 P60.Ac   3/8   4/8     ±   61±36
 P60.4   3/8   2/8     ±   0±0
 P60.4Ac   nd   nd     ±   0±0
 LL-37(对照)   4/8   6/8     +   84±17
实施例4：体内耐受度
根据实施例1制备化合物P60.4Ac并测试其体内耐受性。更具体地，在兔子中对其引起皮肤和眼刺激的效力进行评价，而在豚鼠模型中对其耳毒性进行研究。此外，在静脉内给药后对其系统毒性进行评估。
对于皮肤和眼刺激试验，将3只兔暴露于0.5ml磷酸缓冲的肽溶液(2mg/ml)，用半塞音敷料施用到夹紧的皮肤上4h。在暴露后1、24、48和72小时进行观察。将0.1ml磷酸缓冲(pH7.5)的肽溶液(2mg/ml)的单个样品慢慢灌注到3只兔各自的一个眼中，以进行急性眼刺激/腐蚀研究。在灌注后1、24、48以及72小时进行观察。
结果，没有检测到皮肤刺激。肽溶液的眼部灌注导致节间膜(其在灌注后在24小时内完全溶解)发红。
P60.4Ac的系统毒性在大鼠中以单一和重复剂量毒性研究进行评估。以增加的剂量每天静脉内给予肽。在这个阶段，建立了最大耐受剂量(MTD)。重复剂量毒性也在MTD阶段进行研究。在剂量增加阶段，将9只兔分成3组并接受0.4、2或8mg/kg/天达两天。在给予剂量当天每天记录两次临床信号而在给予剂量之后每天记录一次，在给予第一次剂量之前记录体重而在给予剂量之后每天记录一次体重。在MTD阶段，5只雌大鼠和5只雄大鼠接受8mg/kg/天达连续的5天。在给予剂量当天每天记录两次临床信号，在第1天和第6天记录体重。在尸体剖检前进行临床试验室观察。在MTD阶段结束时进行肉眼检查。
结果，在系统剂量增加研究中没有出现死亡。此外，在临床信号和体重方面没有表现出明显的反常。在MTD阶段期间，也没有出现死亡并且在临床信号、体重、血液学以及临床生物化学参数方面和肉眼检查中没有明显的肽相关发现。
实施例5：耳毒性
为了评价肽P60.4Ac的耳毒性，将这种肽在豚鼠中进行测试(HsdPoc：DH；Harlan，Horst，The Netherlands)。在这个研究中使用7只健康的雄白化体豚鼠(500～1200g)(无外部耳病状)。通过腹膜内注射40mg/kg克他命(Eurovet Animal Health B.V.，Bladel，TheNetherlands)和10mg/kg若朋(rompun)(Bayer A.G.，Leverkusen，Germany)来麻醉动物。在实施对照听觉试验后，将听觉大疱手术地打开以将小片海绵体施加于圆窗膜(RWM)，并将各种溶液(约10μl)加到海绵体上。将皮肤缝合并接着进行听觉测试。在RWM上的施加在右耳中实施，左耳保持未处理。一只动物接受作为第一个安慰剂溶液的PBS(安慰剂I)，而另一只动物接受第二个安慰剂溶液(安慰剂II)，其为在等渗[NaCl]中的7％聚乙二醇(Macrogol)10 000并保存在[0.02％氯化苄烷铵和0.1％Na2EDTA]20mM磷酸盐缓冲溶液(pH5.5)。两只豚鼠接受顺铂(在PBS中的0.66mg/ml，获自Sigma Chemicals，Zwijndrecht，The Netherlands)，其用作试验[39]的阳性对照。在一只动物中肽P60.4-Ac(2mg/ml)在PBS溶液(制剂I)中进行测试，而在其它两只动物中，在对应于第二个安慰剂的缓冲液(制剂II)中进行测试。
在药物给予之前并在手术后和3、7、14以及22天之后，利用基于计算机的信号平均化系统(Tucker-Davis Technology，Alucha，FL，USA)直接进行听性脑干反应(ABR)。将豚鼠加以麻醉并且将插入式听筒置入外耳道。将皮下电极置于头顶(活性的)上和置于身体同侧的大疱(参照)上。将接地电极置于颈部肌肉上。记录响应于在电屏蔽的、双壁的、辐射频率屏蔽的声室中的1kHz的10m猝发音的ABR。测量刺激强度并表达为dB。将ABR阈值定义为能够引起可重复的、视觉上可察觉的响应的最低强度。将处理后的ABR阈值与处理前的ABR阈值进行比较。
结果，PBS(用作对照)的圆窗应用在手术后22天没有导致阈值发生变化。制剂缓冲液在22天后导致2dB的阈值变化。另一方面，顺铂分别引起-49dB和-64dB的阈值变化，其表明严重的听力丧失(表3)。这部分的实验用作耳毒性研究的阳性对照。在PBS中的肽P60.4-Ac(2mg/ml)在手术后22天引起-7dB的阈值变化。接受作为制剂II的P60.4-Ac的动物都产生1dB的阈值变化。
表3：P60.4Ac的耳毒性评价结果
第1组 安慰剂Ia        顺铂   P60.4-Ac制剂Ia     安慰剂IIb     P60.4-Ac制剂IIb
手术后     1   -2   -1     -2     1     14     20
第3天     -3   -32   -38     -2     -8     -1     1
第7天     -3   -32   -45     0     -33c     -18     2
第14天     0   -30   -59     -12     -1     0     2
第22天     0   -49   -64     -7     2     1     1
数值以dB为单位，表示Δ手术前。
a为PBS
b为在等渗[NaCl]中的7％聚乙二醇10,000并保存在[0.02％氯化苄烷铵和0.1％Na2EDTA]20mM磷酸盐缓冲溶液(pH5.5)
c为由于劣质电线的不可靠测量
实施例6：抗菌活性
根据实施例1制备化合物P60.4Ac并通过无菌过滤到10mL带有螺旋盖子的玻璃瓶中进行消毒杀菌。不加入防腐剂。单独地，制备相应的安慰剂溶液，即具有除了化合物P60.4Ac外的相同组分的溶液。将从两种制剂各自取出的样品用于实施抗菌活性的试验。结果，发现含有化合物P60.4Ac的溶液以抑制细菌生长或甚至减少微生物的数量，而相应的安慰剂溶液表现出没有抗菌活性。
实施例7：抗菌活性
根据R.Hancock′s″Modified MIC method for cationicantimicrobial peptides″[13]的修订版，在96孔微量滴定板上，通过微量稀释易感性试验将P60.4Ac和LL-37的体外抗细菌和抗真菌活性确定为最低抑制浓度(MIC)。在参照菌株大肠杆菌ATCC 8739、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027上测试抗细菌活性。在白念珠菌(candida albican)ATCC 10231和黑曲霉(aspergillusniger)ATCC14406上评价抗真菌活性。利用不同浓度的P60.4Ac和LL-37来实施抗菌活性试验，以比较它们对细菌或真菌生长的作用。利用在37℃下、在胰胨豆胨培养液中的对数期培养的细菌来研究抗菌活性。将培养物利用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)加以稀释以得到大约5.0×106 CFU/ml。将10μl的稀释试验菌株转移至96孔平板并将100μl的不同肽浓度加到每个孔中。将该平板在37℃下孵育24小时，然后在光盒(light box)上通过视觉检查评价生长。然后将它们返回进一步孵育24小时，在此之后，再次评价它们的生长。如上所述制备酵母菌株白念珠菌。将丝状真菌黑曲霉用作孢子悬液，在20～25℃下在杀氏葡萄糖琼脂平板上培养6～10天或直至出现足量孢子形成。通过刮下来收获孢子，并且如果必要，将浓度调节至5×106 CFU/ml的最终浓度。
因此，对两种格兰氏阴性菌株和真菌白念珠菌和黑曲霉来评价P60.4Ac的抗菌活性，并与LL-37进行比较。在表4中给出了每种肽的MIC值。相比于LL-37，P60.4Ac表现出较高或相等的抗格兰氏阴性菌株大肠杆菌和绿脓杆菌活性。在一些情况下，对于两种肽还确定了杀菌活性。P60.4Ac表现出对白念珠菌的MIC为6μM并且在18μM的MIC是良好杀真菌的。在18μM的P60.4Ac抑制黑曲霉孢子的发芽达24小时，而LL-37对黑曲霉没有表现出活性。
实施例8：生物膜形成的抑制
根据实施例1制备化合物P60.4Ac并对其作为恶臭假单胞菌PCL1445生物膜形成的抑制剂的有效性进行测试。利用标准PVC生物膜试验，其中生物膜形成在微量滴定平板的孔的聚氯乙烯表面上。向孔中的恶臭假单胞菌悬液中加入P60.4Ac溶液(0.9μM和9μM)并孵育10小时。结果发现，相比于没有肽的缓冲溶液，在9μM的P60.4Ac抑制超过90％的生物膜形成，而0.9μM的P60.4Ac导致大约50％的降低。
实施例9：形成的生物膜的抑制
根据实施例1制备化合物P60.4Ac并对其在破坏恶臭假单胞菌生物膜的有效性进行测试。如实施例7，利用标准PVC生物膜试验来形成生物膜。允许生物膜由恶臭假单胞菌PCL1445悬液在微量滴定平板的孔中形成超过7小时。在此之后，加入不同量的P60.4Ac以及对照物，即分别为DMSO和缓冲介质溶液M63。在孵育18小时后，通过其在595nm处的光学密度(OD595)来评估生物膜。结果，相比于M63，DMSO仅导致较少的OD595的减少，而P60.4Ac取决于其浓度，基本上破坏了生物膜。
图1示出了对于各种摩尔浓度的P60.4Ac(条1至5)、DMSO和M63的OD595值。
表4：P60.4Ac相比于LL-37的抗菌活性
微生物(菌株)   孵育时间(h)     肽     MICa(μM)
大肠杆菌ATCC8739     24     LL-37     3
    P60.4-Ac     2
    48     LL-37     7b
    P60.4-Ac     3c
绿脓杆菌ATCC9027     24     LL-37     3
    P60.4-Ac     3
    48     LL-37     14d
    P60.4-Ac     6b
白念珠菌ATCC10231     24     LL-37     12
    P60.4-Ac     6
    48     LL-37     ＞18a
    P60.4-Ac     6f
黑曲霉ATCC14406     24     LL-37     ＞18
    P60.4-Ac     18
    48     LL-37     ＞18a
    P60.4-Ac     ＞18a
a将MIC定义为抑制在37℃下培养24或48小时后的细菌可见生长的肽的最低浓度。给出的结果是三个独立确定值的平均值。
b在18μM处的杀菌性
c在6μM处的杀菌性
d细菌抑制
e当在所有孔中的生长可见时，没有进行可存活微生物的恢复
f在18μM处可能的杀灭真菌性、在6μM处可能的抑制真菌性。

Claims (26)

1.肽化合物在制备用于预防或治疗哺乳动物的细菌或真菌感染的药物中的应用，其中所述化合物包含氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中
X1表示N-末端部；
X2是K或E；
X3是Q或E；
X4是D或R；
X5是N或E；
X6表示C-末端部；
其中，所述核心序列的氨基酸中的一个或多个可选地被衍生化，并且其中
(a)所述N-末端部被乙酰化，和/或
(b)所述C-末端部被酰胺化，和/或
(c)所述氨基酸序列不同于X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述N-末端部X1包含氨基酸I和/或G。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述C-末端部X6包含至少4个氨基酸或氨基酸衍生物的序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述C-末端部X6包含选自PRTE和RPLR的氨基酸序列，其中所述序列的氨基酸中的一个或多个可选地被衍生化。
5.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述化合物类似具有24个氨基酸或其衍生物的序列的肽，所述序列选自IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE和IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR，并且其中所述氨基酸中的一个或多个可选地被衍生化。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述N-末端被乙酰化并且所述C-末端被酰胺化。
7.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述细菌或真菌感染是由浮游微生物引起的。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述细菌或真菌感染是急性或慢性系统感染。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中，所述系统感染与败血病性休克有关。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其中，所述哺乳动物的免疫系统通过疾病或药物来抑制。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的应用，其中，所述细菌或真菌感染是由能够为无柄的并形成生物膜的微生物所引起的。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述细菌或真菌感染是急性或慢性局部或区域感染。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述局部或区域感染是下气道或上气道或呼吸系统的感染，如中耳炎、支气管炎、肺炎、或鼻窦炎。
14.根据权利要求12或13所述的应用，其中，所述哺乳动物遭受囊肿性纤维化。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的应用，其中，所述哺乳动物的免疫系统通过疾病或药物被抑制。
16.根据权利要求12所述的应用，其中，所述局部或区域感染是肝、脾、牙周组织、眼、肾、皮肤、阴道、尿道、或心脏的感染。
17.根据权利要求16所述的应用，其中，所述局部或区域感染与医疗装置如心脏瓣膜、静脉导管、导尿管、隐形眼镜、语音按钮、鼓膜造孔管、宫内避孕器、或人造骨植入或插入所述哺乳动物内有关。
18.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述哺乳动物同时用不同于以下肽化合物的其它抗菌剂或抗真菌剂加以治疗，所述肽化合物包含氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中
X1表示所述N-末端部；
X2是K或E；
X3是Q或E；
X4是D或R；
X5是N或E；
X6表示所述C-末端部；
其中，所述核心序列的氨基酸中的一个或多个可选地被衍生化。
19.根据权利要求18所述的应用，其中，所述其它抗菌剂或抗真菌剂与肽化合物组合在单一药物中。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的应用，其中，所述细菌或真菌感染不是同时用包含活性成分的药物加以治疗的，其中所述活性成分不是包含氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6的肽化合物，其中
X1表示所述N-末端部；
X2是K或E；
X3是Q或E；
X4是D或R；
X5是N或E；
X6表示所述C-末端部；
其中，所述核心序列的氨基酸中的一个或多个可选地被衍生化。
21.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述药物进一步包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
22.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述药物被配制、加工，并适用于非肠道给药，优选适用于血管内、肌内、皮下、或伤口内注射。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的应用，其中，所述药物被配制、加工，并且适用于局部给予至受感染区域或组织的粘膜，如以灌注液形式、滴耳剂、滴鼻剂、气溶胶、粉末气溶胶、用于喷雾的液体、凝胶、悬液、或粘膜粘附性剂型。
24.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述药物进一步包含药物靶向剂、生物可利用性增强剂、和/或受控递送剂。
25.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述药物进一步包含至少一种防腐剂，并且其中所述防腐剂的含量低于需要用来有效地防腐所述相应的安慰剂组合物的含量。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的应用，其中，所述药物基本上没有防腐剂。
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