KR20070050941A

KR20070050941A - Ｃａｐ18 유래의 항균 펩티드

Info

Publication number: KR20070050941A
Application number: KR1020077004988A
Authority: KR
Inventors: 요하네스 야코뷔스 흐로테; 얀 바우테르 드레이프하우트; 피테르 시코 힘스트라; 마르티에 요하나 넬; 마르셀 얀 본크; 하위도 빈센트 블룸베르흐
Original assignee: 옥토플러스 테크놀로지스 비.브이.; 아카데미슈 지켄후이스 라이덴
Priority date: 2004-07-28
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2007-05-16
Also published as: RU2392962C2; US20110053835A1; BRPI0513856A; US20080249022A1; EP1621205A1; NZ553175A; US7803756B2; AU2005267651B2; WO2006011792A3; EP1784206A2; RU2007107390A; AU2005267651A1; CA2574959A1; JP2008508265A; CN101018563A; EP2221061A1; WO2006011792A2

Abstract

본 발명은 항균 활성을 가지는 일군의 펩티드 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 또한 독소, 특히 리포폴리사카라이드 또는 리포테이코산과 같은 세균성 독소에 친화적이다. 상기 화합물은 세균 또는 진균의 감염 치료에 유용한 약제 제조에 이용할 수 있다. 상기 약제는 전신 또는 국소 투여될 수 있다.

펩티드 화합물, 항균 활성

Description

ＣＡＰ18 유래의 항균 펩티드{ANTIMICROBIAL PEPTIDES DERIVED FROM CAP18}

본 발명은 그람 음성 세균 및 진균을 포함한 미생물을 저해 및 사멸시키는 항균 화합물에 관한 것이다. 또한, 상기 화합물은 독소, 특히 리포폴리사카라이드(LPS)나 리포테이코산(LTA)과 같은 진균 독소 및 세균 독소에 친화성을 가지며, 이러한 독소를 저해 또는 중화시킬 수 있다. 나아가, 본 발명은 상기 화합물의 치료 및 진단 용도, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 이들의 투여 방법에 관한 것이다.

현대 약물요법은 20세기 중반까지 조기 사망의 주된 원인 중 하나인 세균 감염증과의 전쟁에서 거의 성공을 거두었다. 그러나, 최근들어, 점진적인 세균 내성 증가로 인해, 고효능의 항생제를 광범위로 사용하는 것에 대한 우려가 증폭되고 있다. 실제, 과거 25년간 항생제 내성 - 특히 범위가 넓은 항생제 화합물에 대한 다중 내성 - 이 실질적으로 모든 종의 조사 세균들에서 증가하고 있다. 현재, 통상적인 내성 메카니즘에 의해 작용하지 않는 개량된 타입의 항균제 대부분은 다중약제 내성 돌연변이균에 선택적으로 사용하는 화합물인 것으로 생각된다.

이러한 진전을 토대로, 전문가들은 농업 및 인간 의학 분야 모두에서 과거 보다 훨씬 더 제한적으로 항생제를 사용할 것을 추천하고 있다. 예컨대, 소감염 - 특히, 전형적으로 감기(common cold)와 같이 세균에 의해 유발되지 않는 경우 - 에는 항생제를 처리하지 않아야 하며, 보다 심각한 상태를 대비하여야 한다. 또한, 완전히 다른 약물학적 활성, 바람직하기로는 통상적인 항생제에 대한 세균 내성과는 별개인 일부 활성을 이용하여 세균 감염증을 치료하기 위한 신규 화합물의 개발이 필요하다.

항생제의 광범위 사용이 논쟁적으로 논의되고 있는 증상 중 하나는 급성 또는 만성 중이염이다. 삼출성 중이염(OME), 즉 급성 감염 증상이 없으며 중이에 체액의 존재를 특징으로 하는 타입의 이염 환자의 수가, 최초 급성 중이염(AOM)에 대한 항생제 치료법을 도입한 이래로 현저하게 증가하고 있는 것으로 확인되었으며, 이는 항생제가 OME에 일부 작용함을 시사한다(Lim et al., Laryngoscope 92, 278-286, 1982). 페니실린과 같이 항생제는 중이의 국소 IgM 생산과 같은 국소 면역 반응의 발생을 방해하는 것으로 생각된다(Howie et al., Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 85 Suppl. 25, 18-19, 1976). 기존의 항생제 요법의 다른 문제점은 세균은 죽지만 그것의 독소는 여전히 활성인 상태라는 것이다.

세균 또는 진균 감염에 의해 초래되는 질병이나 그외 증상을 치료하기 위해, 미생물이나 세균(germ)을 죽이진 않지만 오히려 그것의 독소를 중화시켜, 숙주의 고유 방어 메카니즘이 감염 전파를 통제하도록 하는 화합물을 사용하는 것이 이로울 수 있다(Nell, The Role of Endotoxin in the Pathogenesis of Otitis Media With Effusion, PhD Thesis, Leiden, 1999). 동시에, 이러한 방법은 손상된 점막 기능의 신속한 재건을 지원한다.

진균 독소, 특히 세균성 독소와 같은 미생물 독소들이 이염과 같은 다수의 감염성 질환에 관여하는 주된 역할은, 고독성의 지질 모이어티인 리피드 A가 접합된 폴리사카라이드로 구성된, 그람 음성 세균의 세포 벽에서 발견되는 리포폴리사카라이드(LPS) 군인, 내독소에 의해 수행된다. OME를 치료하기 위한 최근 치료방법들중 한 가지는 내독소, 또는 LPS(NELL, ibid)를 중화시키는 화합물을 처방하는 것이다.

내독소나 LPS를 중화시킬 수 있는 다양한 화합물이 현재 알려져 있다. 예로, 수 종의 항-내독소 항체들이 각각 인간 및 뮤랄 단일클론(mural monoclonal) IgM 항체인 HA-1A 및 E5와 같이 개발되어 있다. 이들 항체들은 패혈 쇼크와 같은 일부 심각한 증상의 환자의 생존율을 향상시키는 것으로 확인되었다(Ziegler et al., New Engl. J. Med. 324, 429-436, 1991). 그러나, 이들의 활성 및 특이성은 만족스럽지 못한 것으로 여겨지고 있다.

내독소에 대해 활성을 나타내는 또다른 물질 군은 세균 투과성-증가 단백질(bacterial permeability-increasing protein (BPI))이라고 하는 인간 내인성 단백질로부터 유래된 것으로, 이는 호중구의 하주르진화성 과립(azurophilic granule)에 저장되어 있다(Gazzano-Santoro et al., Infection and Immunity 60:11, 4754-4761, 1992). BPI는 강력한 양이온성 단백질이며, 자유 내독소를 중화시킬 뿐만 아니라, 이들의 외막 투과성을 증가시켜 스스로 세균성 세포를 저해 또는 치사시킨다. BPI는 실로 강력한 천연 항생제로, LPS와 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한 그외 다른 촉발제의 존재시 유도된다. 그러나, 이의 활성 대부분은 이 를 합성하는 면역 세포, 즉 다형핵 대식세포(polymorphonuclear macrophage)와 관련되어 있다.

BPI 유래의 수 종의 재조합 단백질도 역시 개발되었으며, 그 예로는 rBPI₂₃ (Kohn et al., 1993) 및 rBPI₂₃(Horwitz et al., 1996)이 있는데, 이들은 주로 각각 분자량 23 및 21 kDa의 BPI N-말단 부분이다. BPI와 BPI 유래 화합물의 OME 치료에서의 사용은 예컨대 WO-A-00/71149에 개시되어 있다.

항균 활성을 가지는 천연 화합물의 다른 계열로는 호흡 상피 세포, 폐포 대식세포 및 그외 조직에서 생산되는 펩티드 클래스인, 카텔리시딘(cathelicidin)이 있다. 이는 천연 상태에서는, 선형의 α-나선 구조로 시스테인이 없는 펩티드 또는 단백질 형태의 화합물이다. 카텔리시딘은 양이온성이며, 보존성이 높은 신호 서열과 프로-부위, 카텔린(cathelin)으로 구성되어 있다. 그러나, 성숙형 펩티드를 코딩하고 있는 C 말단 도메인은 실질적으로 이질성(heterogeneity)을 보인다. 상기 펩티드는 12 내지 80개의 아미노산을 포함할 수 있다.

가장 현저한 인간 카텔리시딘은 18 kDa의 양이온성 항균 단백질인 CAP18이다. CAP18의 C-말단의 37개의 아미노산, 즉 펩티드 LL-37은 LPS에 대한 고친화성 및 중화 능력을 담당하는 도메인이다(Sawa et al., Antimicr. Agents Chemother. 42:12, 3269-3275, 1998). Sawa(Sawa et al., ibid.), Gutsmann(Gutsmann et al., Biophys. J. 80, 2935-2945, 2001) 및 미국 특허 제 6,040,291호에 개시된 바와 같이, CAP18 또는 LL-37로부터 유래된 수종의 절단된 펩티드도 개발 및 테스트되었 다. 대개, 여러가지 이유로 치료 화합물에 대한 선두 후보물로서, 비교적 작은 펩티드가 CAP18과 같은 단백질 보다 바람직하다. 그 이유로는 첫째로, 이는 원하는 활성 및 특이성을 보존 또는 증대시키기 위해 최적화, 개조 및 변형시키기가 보다 용이할 수 있다. 두번째로, 이는 수득 또는 합성하기 용이하므로, 입수성이 더 좋다. 세째로, 단백질은 종종 불안정적이며 비경구 투여후 생체이용성이 없으므로, 펩티드가 제형화하거나 전달하는데도 용이하다.

본 명세서에 원용에 의해 포함된, 계류중인 국제 특허 출원 PCT/NL2004/00060에는 LPS 및 LTA와 같은 미생물성 및 진균성 독소에 친화성을 가지는 펩티드 화합물이 개시되어 있다. 이들 화합물의 아미노산 서열은 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆(이하, 코어 아미노산 서열이라고도 함)이며, 상기 X₁은 서열의 N-말단부이며, X₂는 K 또는 E이고, X₃은 Q 또는 E이고, X₄는 D 또는 R이고, X₅는 N 또는 E이고, X₆은 C-말단부이며, 상기 코어 서열의 아미노산들 중 하나 이상은 유도체화될 수 있다. 또한, 상기 서열은 N-말단부가 아세틸화되거나/되며 C-말단부는 아미드화되거나/되며 상기 아미노산 서열은 X₁KEFKRIVQRIKDFLRNLVX₆이 아닌 것을 특징으로 한다.

상기 특허 출원은 이러한 화합물의 제조 방법을 또한 개시하고 있다. 상기 방법은 상기 화합물을 조합(assemble)하기 위하여 아미노산 모노머 또는 올리고머의 화학적 및 효소적 삽입(ligation)을 포함한다. 또한, 상기 방법은 핵산 서열을 숙주 세포에 형질감염시키기 위한 벡터를 이용하여 숙주 세포에서 상기 화합물을 코딩하는 상기 핵산 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 아미노산 모노머, 아미노산 올리고머, 아미노산 유사체 또는 모방체의 모노머 또는 올리고머를 화학 또는 효소적 삽입에 의해 조합할 수 있는 전술한 임의의 내용에 따른 화합물의 제조 방법은 액체상 및/또는 관능화된 고체상의 인터페이스에서 수행할 수 있다.

이러한 화합물은 감염증 관련 증상이나 감염증으로 유발되는 질환 관리에 유용한 것으로 확인되고 있다. 이는 중이염과 같은 특정 만성 감염증 치료에 기존의 항생제에 비해 치료학적으로 보다 유용할 수 있음을 시사한다. 그러나, 중증의 급성 감염증의 경우에서는 효과적인 미생물 증식 제어가 여전히 긴요한 것으로 여겨지며, 이는 항생제 투여에 의해 이루어진다.

발명의 목적

종래의 노력에도 불구하고, 전신 또는 국소 세균성 및 진균성 감염증을 포함한 감염성 질환의 예방 치료학적 치료제의 개선이 여전히 요구되고 있다. 본 발명의 목적은 안전하며 효과적이며 감염성 미생물을 효과적으로 제어하는 신규 치료제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 미생물 내성을 쉽게 유도하지 않는 치료제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 미생물이 체내에서 항균 화합물에 의해 사멸되었을때 방출되는 미생물 독소의 독성 효과와 같은, 기존의 항미생물 요법의 부작용을 감소시킬 수 있는 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 상기한 그리고 그외 목적은 하기 설명을 토대로 명확해질 것이다.

발명의 개요

본 발명의 제1 측면은 포유류의 세균 또는 진균 감염을 예방 또는 치료학적으로 처리하기 위한 약제 제조에 있어서의 펩티드 화합물의 용도를 제공하며, 상기 화합물은 아미노산 서열, X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆을 포함하며, 상기 X₁은 서열의 N-말단부이며, X₂는 K 또는 E이고, X₃은 Q 또는 E이고, X₄는 D 또는 R이고, X₅는 N 또는 E이고, X₆은 C-말단부이다. 상기 코어 서열의 아미노산들 중 하나 이상은 선택적으로 유도체화된다. 또한, 상기 N-말단부는 아세틸화되거나/되며, 상기 C-말단부는 아미드화되거나/되며, 상기 아미노산 서열은 X₁KEFKRIVQRIKDFLRNLVX₆이 아니다.

이러한 화합물은 놀랍게도 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 리포테이코산(LTA)에 대한 친화성 뿐만 아니라 항균 또는 살균 활성을 가진다는 것을 발견하였다. 즉, 이들 화합물은 세균과 진균을 죽이는 약제 제조에 사용할 수 있다. 상기 화합물은 살세균 및 살진균 활성을 가진다. 이러한 활성에 의해, 상기 화합물은 미생물 독소만을 중화시킬 수 있는 화합물로 치료할 수 없었던 질병 및 증상에 항생제로서 치료학적으로 사용할 수 있다. 이러한 질병의 예로는 급성 세균 또는 진균 감염증, 예컨대 패혈 쇼크, 눈(들), 간, 신장(들), 폐, 기관지, 비동(nasal sinus), 전두동(frontal sinus), 귀(들), 질, 요도, 피부, 중추신경계, 심근, 비장 및 그외 기관과 조직의 급성 감염증이 있다.

본 발명의 다른 측면은 세균성 또는 진균성 감염증과 유사한 질환 및 증상, 또는 세균성 또는 진균성 감염증과 관련있는 질환 및 증상의 예방 및/또는 치료에 적합한, 약물에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면은 하기 상세한 설명과 첨부된 청구범위에서 설명될 것이다.

본 발명의 상세한 설명

계류중인 국제 특허 출원 PCT/NL2004/00060에 개시된 펩티드 화합물이 리포폴리사카라이드(LPS) 및 리포테이코산(LTA)와 같은 세균 및 진균 독소를 중화시킬 뿐만 아니라 현저한 항균 활성을 가진다는 것을, 놀랍게도 발견하였다. 이러한 화합물은 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆을 포함하며, 상기 X₁은 서열의 N-말단부이며, X₂는 K 또는 E이고, X₃은 Q 또는 E이고, X₄는 D 또는 R이고, X₅는 N 또는 E이고, X₆은 C-말단부이며, 상기 코어 서열의 아미노산들 중 하나 이상은 유도체화될 수 있다. 또한, 상기 N-말단부는 아세틸화되거나/되며, 상기 C-말단부는 아미드화되거나/되며, 상기 아미노산 서열은 X₁KEFKRIVQRIKDFLRNLVX₆이 아니다. 이러한 미생물 독소에 대한 친화성으로 인해, 상기 화합물은 상기 독소의 체내 존재와 관련된 증상을 관리하기 위해 치료학적으로 사용할 수 있다. 또한, 이들의 직접적인 항균 활성에 의해, 항생체로서, 또는 대신 사용할 수 있다. 이러한 이중적인 활성으로, 상기 화합물은 단독으로, 그리고 미생물 내성을 형성하거나 다량의 균이 체내에서 사멸되었을때 체내로 분비되는 미생물 독소의 독성 효과와 같은 부적절한 부작용이 저해 또는 경감될 수 있는 다른 항생제와 병용하여 투여하는 두가지 모든 경우에 매우 유용하다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서, 용어 "상기 N-말단부는 아세틸화되며"는 하기 의미를 가진다. N-말단부는 안정화기나 보호기가 연결된 아미드를 얻기 위해 카르복시산과의 반응에 의해 보호된다. 예로, 포르밀 안정화된 펩티드를 얻기 위해 푸믹산을 펩티드와 반응시킬 수 있으며, 아세틸 보호화된 펩티드를 얻기 위해 아세트산과 반응시킬 수 있다. 또한, 상기 펩티드을 프로피온산, 및 카보하이드레이트 부분의 R에 최대 탄소수 6, 최대 탄소수 10을 가지는 그외 유기산과 반응시킬 수 있다. 이러한 유기산에서, 카보하이드레이트기는 탄소수 최대 10인 R이며, 선형, 분지형 또는 사이클형일 수 있으며/있고 하나 이상의 불포화를 포함할 수 있다. 또한, 알킬쇄는 예컨대, 하이드록실, 할로겐, 아미노, 머캅토 및 설푸록사이드(sulphuroxide) 기로 치환할 수 있다. 따라서, N-말단부에 하기 기가 존재할 수 있다: -C(O)-R'. 대안적으로, 카르복시산과의 반응 대신, 설폰산과 반응시켜, 해당 설폰아미드 연결을 얻을 수 있다. 따라서, N-말단부에 -SO₂-R 기가 존재할 수 있다. 대안적으로, 상기 용어는 또한 N-말단에 각 R이 상기한 의미인 이차 또는 3차 아민기, -N-(R)₁또는 N-(R)₂가 존재할 수 있는 알킬화 및 디알킬화를 포함한다.

또다른 예로, 상기 "아세틸화"는, 유레아나 티오유레아, R-N-C(O)- 또는 R-N-C(S)-가 형성되며 R은 상기한 의미인 경우에서의, 펩티드와 이소시아네이트나 이소티오시아네이트와의 반응을 포함한다.

마지막으로, N-말단은 산 안정적인 차단기에 의해 보호될 수 있으며, 상기 기는 펩티드 합성중에 통상 도입되지만 제거되진 않을 것이다. 잘 알려진 차단 기로는 F_moc와 Z-기가 있다.

"C-말단부가 아미드화되는"의 의미는 하기에 나타낸다. 용어 "아미드화"는 C-말단으로서 천연적으로 존재하는 -OH가 -X기로 치환되는 것을 의미하며, 상기에서 X는 (i) -NY₂ 기, Y는 독립적으로 H 또는 R이고, R은 상기한 바와 동일하거나, 또는 상기 두개의 Y기가 이에 부착된 N 기와 함께 사이클 모이어티를 형성할 수 있으며, 바람직하기로는 하나 이상의 R 기가 존재하거나; (ii) R이 상기한 의미인 -OR 기이거나; 또는 (iii) -R 기이다. 펩티드 아미드가 안정성이 가장 높으므로, 펩티드 아미드가 바람직하다.

본 발명의 펩티드 화합물은 청구항 1항에서 제외된 천연 아미노산 서열에 비해 최적의 안정성을 가지는 것으로 확인되었다.

펩티드 화합물은 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드 유래 물질과 같은 펩티드이다. 또한, 펩티드 화합물은 펩티드 그 자체 이외에도 펩티드 유사체, 펩티드 유도체, 변형된 펩티드 및 펩티드 접합체를 포함한다. 펩티드 화합물은 이들이 아미노산 서열을 포함한다는 공통점을 가진다. 보다 명확하게는, 펩티드는 한 아미노산의 아미노기와 다른 아미노산의 카르복시기의 조합에 의한, 2이상의 아미노산으로부터 유래된 아미드로서 정의된다(Merriam Webster Medical Dictionary 2001). 반대로, 펩티드 화합물 역시 분자내 펩티드 구조를 나타낼 수 있다. 전형적으로, 펩티드는 자연적으로 발생되는 (L-)α-아미노산, 특히 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Gln 또는 Q), 글루탐산(Glu 또는 E), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소루신(lie 또는 I), 루신(Leu 또는 L), 라이신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Trp 또는 W), 타이로신(Tyr 또는 Y) 및 발린(VaI 또는 V)으로 구성된다.

펩티드의 유사체나 기능적인 동등체는, 동일한 활성을 가지며, 특히 미생물, 특히 세균 독소 종에 대해 정량적인 측면에서라기 보다는 정성적 측면에서 동일한 친화성을 가지는 펩티드성 분자이며, 그 예로는 변형 펩티드, 펩티토이드(peptoid), 펩티드 유사체 또는 펩티드모방체(peptidomimetic)가 있을 수 있다.

변형된 펩티드는 일반적으로 자연적으로 형성되는 아미노산에는 없는 치환기나 관능기의 도입에 의해, 펩티드로부터 유래된 분자이다. 또한, 이는 펩티드를 다른 화학적 카테고리의 분자와 반응시켜 수득되는 화합물을 포함하며, 이들 분자는 자연적으로 형성된 것이거나 아닐 수 있다. 예컨대, 인산화된, 설폰화된 및 바이오틴화된 펩티드, 당단백질 및 지단백질은 자연에서 흔히 발견되며, 펩티드의 성질 전체가 아닌 일부를 변형하기 위해 고안된 화학적으로 변형된 펩티드의 예로는 폴리에틸렌 글리콜로 변형시킨 펩티드가 있다.

또한, 펩티드와 유사한 펩토이드 역시 펩티드 화합물이다. 이는 전형적으로 2 이상의 아미노산으로 이루어진 아미드이다. 그러나, 펩토이드는 종종 자연적으로 형성된 아미노산으로부터 직접적으로 유래되지 않으며, 화학적으로 합성된 여러가지 L- 및/또는 D-아미노산 타입이다.

펩티드 모방체는, 광의의 범위에서는 펩티드에 보다 유사하거나 또는 조금 유사한 기능적인 구조를 가지는 화합물이지만, 이들은 벡본에 비펩티드성 결합이나 D-아미노산을 함유할 수 있다. 일반적으로, 펩티드 모방체는 수용체와 효소의 상호작용에서 천연 펩티드에 대한 치환체로서 제공된다(Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 138). 펩티드 모방체 클래스인 슈도펩티드는 아미드 결합 대신 아미드 결합 동위체(isostere)를 포함하고 있는 화합물이다(ibid., pp. 137-140).

본 발명의 실시에 사용되는 화합물은 또한 약학적으로 허용가능한 산- 또는 염기 부가 염, 및 부가물(adduct)과 같은, 펩티드 염이나 기능적 동등체를 포함한다. 또한, 상기 화합물은 펩티드 다량체 또는 기능적 동등체를 포함한다.

나아가, 상기 화합물은 하나 이상의 독소, 특히 세균의 독소에 친화성을 가지고 있다. 다수의 감염성 질환들에서, 그람 음성 세균의 리포폴리사카라이드(LPS) 클래스와, 그람 양성 세균의 리포테이코산과 같은, 세균의 독소는 상기 질환 발생에 관여한다. 이들 독소는 실질적인 염증 반응을 유발할 수 있다. 예로, 상기도 감염증의 경우, 염증은 중이나 동(sinuse)의 상피에 점막 손상을 유도할 수 있으며, 그 결과 상기도의 주된 방어 시스템 중 하나인 점액섬모청소계(mucociliary clearance system (MCS)) 손상이 발생될 수 있다. 진균 또는 세균 독소에 대한 친화성은 모든 중화 능력의 전제 조건이며, 바람직하기로는 본 발명의 화합물은 LPS와 그외 독소 뿐만 아니라 이들 독소를 중화 또는 저해하는 능력 또는 상기 독소의 작용을 감소시킬 수 있는 능력을 가진다.

펩티드 화합물이, 아미노산 서열 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆을 포함하며, 상기 X₁은 서열의 N-말단부이며, X₂는 K 또는 E이고, X₃은 Q 또는 E이고, X₄는 D 또는 R이고, X₅는 N 또는 E이고, X₆은 C-말단부인, 청구항 1의 구성 요건을 충족시키는 경우에, 상기 화합물에서 세균 및 진균과 세균 및 진균의 독소에 대한 적합한 활성 타입이 관찰된다. 이러한 기본적인 모티프는 천연 항균 단백질 CAP18이나 CAP18 유래의 LL-37 펩티드에서 유래된 것이다.

본원에서, N-말단부는 기, 원자 또는 N-말단 모이어티나 화합물의 도메인을 나타내는 서열, 즉 서열에서 아미드 결합에 참여하지 않는 코어 서열의 말단 α-아미노기에 부착된 구조이다. 상기 N-말단부는 간단하게 자유 α-아미노산기의 경우에는 수소 원자일 수 있으며, 또는 아실기와 같은 말단 α-아미노산 질소 원자에 부착된 화합물기로 구성되어 있을 수 있다. 또한, 이는 보다 큰 기, 예컨대 2 이상의 아미노산으로 이루어진 서열, 또는 아미노산으로 구성되어 있지 않거나 아미노산으로만 구성되어 있지 않은 화합물 구조를 의미할 수 있다. 상기 C-말단부는 유사한 형태로 정의된다.

바람직하기로는, 상기 화합물은 코어 모티프를 규정하는 총 18개 보다 많은 수의 아미노산을 포함한다. 일 예로, N-말단부는 2이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 포함한다. 상기 서열의 일원으로 적합한 아미노산은 I 및 G이며, 바람직한 N-말단부는 IG이다.

다른 예로, C-말단부 역시 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 예로, C-말단부는 4개의 아미노산을 포함한다. 상기 4개의 아미노산으로 이루어진 C-말단부의 C-말단끝은 펩티드 LL-37에서의 동일한 위치로서, E일 수 있다. 그러나, 상기 C-말단끝은 또한 R로 정의될 수 있다. C-말단 아미노산 옆에 위치되어 있는 아미노산은 LL-37에서와 같이 T 또는 L일 수 있다. 상기 C-말단부, 4개의 아미노산으로 이루어진 서열에서, 나머지 2곳에 대한 바람직한 2종의 다른 일원으로는 P와 R이 있다. 가장 바람직하기로는, C-말단부는 서열 PRTE 및 RPLR 중에서 선택된다.

추가적인 예로, 상기 N-말단부와 상기 C-말단부는 총 24개의 아미노산을 갖는 펩티드 구조를 나타내도록, 전술한 선택사항으로부터 선택된다. 현재 가장 바람직한 화합물은, 펩티드 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE 및 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR와, 펩티드 그 자체나, 또는 변형 또는 유도체화된 펩티드이다.

바람직한 변형은 아미드화 및/또는 아세틸화된 펩티드이다. 아미드화가 특히 이로운 것으로 보이는 위치중 한 곳은 펩티드의 C-말단이다. 반면에, 아세틸화는 N-말단 아미노산에 이루어지는 것이 바람직하다. 바람직한 일 예로, 펩티드 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE와 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR 모두 N-말단이 아세틸화된 것이며, C-말단은 아미드화된 것이다. 예비 실험 결과, 이러한 변형이 엑소-펩티다제(exo-peptidase)의 존재하에서 안정성을 증가시키는 능력이 있는 것으로 시사되었다.

화합물은 일반적으로 펩티드 및 유사 물질의 제조에 대해 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 단지 수개의 아미노산이나 유사한 유닛, 바람직하기로는 30-50개 이하의 유닛만을 포함하는 유사 화합물은, 반응이 용액이나 현탁액중에 이루어지는 고전적인 방법을 이용하거나, 또는 폴리머성 비드와 같은 고형 표면에 고정된 상태로 펩티드를 조합하는 보다 최신의 고상 방법을 적용함으로써, 화학적 또는 효소학적 삽입 기법으로 제조할 수 있다. 보다 큰 화합물은 자동화된 고상 펩티드 합성기로 전형적으로 합성한다.

대안적으로, 화합물은 공지된 유전공학 기법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 화합물이 펩티드이거나 또는 일부 변형된 펩티드이라면, 특히 유효하다. 예를 들어, 화합물을 코딩하는 DNA 서열은 세포 형질감염할 수 있는 발현 벡터에 조립 또는 조합될 수 있다. 상기 방법의 다른 단계로, 상기 세포를 벡터 또는 벡터성 DNA(vector-associated DNA)와 형질감염이 허용되는 조건하에 접촉시킴으로써, 숙주 세포나 표적 세포에 상기 DNA을 형질감염시킨다. 다음 단계로, 숙주 또는 표적 세포는 상기 화합물이 발현가능한 조건하에서 배양한다. 다음으로, 상기 화합물을 분리할 수 있다. 화합물 자체로는 코딩 또는 발현되지 않지만 코딩 또는 발현될 수 있는 펩티드와 매우 유사하다면, 상기 방법을 적용하여 한 단계 이상의 단계로 화합물과 유사한 펩티드를 제조할 수 있으며, 상기 펩티드를 화학적 또는 효소학적 기법에 의해 변형하여 화합물을 제조한다.

다양한 벡터 타입, 예컨대 바이러스 벡터, 리포플렉스(lipoplexe), 폴리플렉스(polyplexe), 마이크로스피어, 나노스피어, 덴드리머, 네이키드 DNA(naked DNA), 펩티드 전달 시스템, 지질, 특히 양이온성 지질, 또는 그것으로 제조된 리포좀, 폴리머성 벡터, 특히 폴리양이온성 폴리머로 제조된 벡터가 이러한 목적으로 사용된다. 이들중 바람직한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노성 바이러스(adeno-associated viruse), 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 비로좀(virosome)이다. 바람직한 비바이러스성 벡터로는 키토산, SPLP, PLGA를 기본 구성으로하는 폴리머 시스템, 폴리에틸렌 이민, 폴리라이신, 폴리포스포아미데이트, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리포스파젠, DOPE, DOTAP 및 DOTMA를 포함한다.

본 발명에 따른 화합물의 제조에 적용할 수 있는 방법의 일부 보다 포괄적인 요지는 W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89에 개시되어 있다.

펩티드 염 또는 기능적 동등체는 공지 방법에 의해 제조되며, 전형적으로 산 부가 염을 형성하기 위한 약학적으로 허용가능한 산, 또는 염기 부가 염을 형성하기 위한 약학적으로 허용가능한 염기를, 펩티드 또는 펩토이드와 혼합하는 단계를 포함한다. 산 또는 염기가 약학적으로 허용가능한지는 화합물의 특별히 의도한 용도를 고려하여, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험관내 진단 조성물로 허용가능한 모든 산 및 염기는 치료 조성물로 사용될 수 없다. 의도한 용도에 따라, 약학적으로 허용가능한 산은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 글리콜산, 옥살산, 피루브산, 숙신산, 말레산, 말론산, 신남산, 설푸릭산, 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 니트르산, 퍼클로르산, 포스포르산 및 티오시안산과 같은 유기 및 무기 산을 포함하며, 이는 펩티드의 자유 아미노기 및 기능적 등등체와 함께 암모늄 염을 형성한다. 펩티드의 자유 카르복시기 및 기능적 동등체와 카르복실레이트 염을 형성하는, 약학적으로 허용가능한 염기로는, 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 디이소프로필아민 및 그외 모노-, 디- 및 트리알킬아민과, 아릴아민이 있다. 또한, 약학적으로 허용가능한 용매화물, 복합체 또는 부가물, 예컨대 수화물 또는 에트유레이트(ethurate)가 포함된다.

펩티드의 바람직한 일부 변형은 합성 중에 또는 합성 종료시에 용이하게 도입할 수 있다. 예컨대, 펩티드가 고상 기법으로 합성되는 경우, 여전히 수지에 결합되어 있는 아미노산 서열을 다른 아미노산 대신 아세트산과 반응시킴으로써, 반응 끝에 N-말단 아세틸화를 수행할 수 있다.

반면, c-말단 아미드화는 상업적으로 이용가능한 Tentagel S AM(ex Rapp, Tubingen, Germany)와 같은 고상 펩티드 합성시 특별한 종류의 수지를 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 수지는 절단 과정 동안에 아미드화된 펩티드로부터 분리되는 화합물 "핸들(handle)"을 포함한다. 당업자들에게는 이러한 펩티드 변형 방법 및 추가적인 방법이 공지되어 있다.

전술한 바와 같이, 화합물은 미생물 독소, 특히 리포폴리사카라이드(LPS) 및 리포테이코산(LTA)와 같은 세균 독소에 친화성을 가진다. 따라서, 화합물은 이들 독소 존재와 관련있는 증상 및 질환에서 예방적, 치료적 및 진단 목적으로 이롭게 사용할 수 있다. 화합물은 길항제 또는 부분 길항제일 수 있으므로, 결합력은 전형적으로 상기 독소의 중화를 유도시킬 것이다. 나아가, 이는 독소를 중화시킬 수 있으며, 화합물과의 공유 또는 비공유 연결을 통해, 또는 리포좀, 나노입자, 마이크로입자, 나노캡슐, 마이크로캡슐, 지질 복합체 또는 마이셀과 같은 약물 담체 표면과의 공유 또는 비공유 결합을 통해, 이들 독소를 특이적으로 표적화할 수 있는, 다른 화합물에 대한 표적제 또는 리간드로서 사용할 수 있다.

진단에서, 화합물은 혈액, 혈장, 혈청, 호흡기관과 같은 점막 상피의 점액과 같은 생리 체액중의, 또는 삼출성 중이염(OME)의 중이에서 나타나는 체액과 같은, 질환 상태에서 나타나는 체액중의, 세균 독소를 검출 또는 정량하는데 사용할 수 있다. 이러한 용도로, 화합물을 시험관내에서 사용되는 진단 키트에 통합하거나, 또는 환자에게 투여될 수 있는 진단 조성물에 통합할 수 있다. 이러한 용도로, 선택적으로 본 발명의 화합물을 킬레이터와 접합하여, 이후 적정 모니터닝 시스템으로 검출가능한 동위원소 표지물과 복합체를 이루게 된다.

바람직한 용도로, 상기 화합물은 체내 진균 및 세균 감염증, 및 세균 및 진균 독소 존재와 관련된 질환 및 증상을 예방 또는 치료하기 위해, 활성 약물로서 투여한다. 전술한 바와 같이, 급성 또는 만성 감염증 치료에 있어서의 기존의 항생제는 허용성 유발 및 허용되는 세균 변이체 선별, 환자의 천연 방어 시스템 억제, 점막에 자연적으로 증식하고 있는 세균총의 손상, 미생물을 죽이는 다량의 세균 독소 방출과 같은, 문제와 한계점이 있다. 나아가, 독소, 특히 세균 독소의 존재, 및 본질적으로 미생물의 부재가 주된 원인인 OME와 같은 질환 및 증상일 수 있으며, 독소의 중이내 국소 체류는 급성 감염의 증상이 없는 질환을 발생시키는데 상당히 기여할 수 있다.

그러나, 화합물은 또한 현저한 항균 활성을 가지고 있으므로, 중증의 급성 감염증과 같이 체내에 감염된 미생물의 수를 실제로 감소시키는 것이 필수적인 조건에서도 사용할 수 있다. 이런 점에서, 화합물은 단독으로는 미생물 독소를 중화시킬 수 있는 화합물로 치료할 수 없었던 질환 및 증상에서도, 다른 항생체를 대체하거나 보완할 수 있다. 이러한 질병의 예로는 급성 세균성 또는 진균성 감염증, 예컨대, 패혈 쇼크, 눈, 간, 신장, 폐, 기관지, 비동 또는 전두동, 귀(들), 질, 요도, 피부, 중추신경계, 심근, 비장 및 그외 기관과 조직의 급성 감염증이 있다. 특히 감염증과 관련된 중증 증상의 예는 패혈 쇼크이다.

이러한 모든 경우들에서, 항생제로 치료되진 않지만 세균 독소를 중화시킬 수 있는 능력이 있는 물질로 질병을 치료하는데 적합할 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 화합물은 그람 음성 세균의 경우의 리포폴리사카라이드(LPS)와 그람 양성 세균의 경우의 리포테이코산(LTA)와 같은, 가장 실제적인 미생물 독소에 대해 높은 결합력 및 중화 활성을 보이므로, 특히 이롭다. 상기도 감염증에서, 본 발명의 화합물이 특히 바람직한 치료제인 경우, 세균 산물이 중이나 동에 염증 반응을 유발할 수 있으며, 상기도 상피의 점막 상해를 유도할 수 있다. 수행된 독소 중화가 예방, 통제 또는 감소되는 섬모 청소 시스템(MCS)의 손상을 포함한 점막 손상을 입힐 수 있으며, 따라서 천연 방어 시스템을 강하게 할 것이다. 세균 독소가 살아있는 세균 세포의 수가 현저하지 않은 경우에서도 심각한 문제가 될 수 있는 OME를 포함한 경우들에서, 본 발명의 화합물을 예컨대 중이에 직접 투여하는 치료법이 일차적인 치료학적 접근법일 수 있다. 그러나, 그외 기도 감염증, 예컨대 급성 또는 만성 동염, 또는 급성 또는 만성 이염에서도, 상기 화합물은 정상적인 점막 기능과 천연 방어 시스템을 복구하는데 매우 유용할 수 있다.

보다 일반적으로, 본 발명의 화합물은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 모라셀락 카타라리스(Moraxella catarrhalis), 그룹 A β-융혈성 연쇄 구균(group A β-hemolytic streptococci), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 그람 음성 장 간균(gram-negative enteric bacilli), 스트렙토코커스 피로게네스(Streptococcus pyroeenes), 대장균(Escherichia coli), 그람 음성 간균, 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)을 포함한, 감염성 세균으로 이루어진, 및 발생되는 증상의 예방 및 치료법에 유용한 물질이다.

본 발명의 화합물을 이용하여 예방 또는 관리되는 감염증은 본질적으로 부유하는(essence planktonic), 즉 이의 체질은 각 미생물 유기체의 체질임, 미생물에 의해 유발될 수 있다. 예컨대, 부유성 미생물이 혈액과 같은 포유류의 생리 체액에 감염되면, 이는 혈류를 통해 포유류 체내로 전이될 수 있다.

부유성 미생물에 의해 적어도 부분적으로 유래될 수 있는 전신 감염증(systemic infection) 또는 전신 감염증(generalized infection)으로는, 급성 또는 만성 진균 감염증, 예컨대, 방선균증(actinomycosis), 분아균증(blastomycosis), 노카르디아증(nocardiosis), 크립토콕쿠스증(cryptococcosis), 스포로트릭스증(sporotrichosis), 상세불명의 콕시디오이데스 진균증(coccidiomycosis) 및 아스페르길루스증(aspergillosis)과, 급성 또는 만성 세균 감염증, 예컨대 탄저병, 파상풍, 괴저, 보툴리눔독소증(botulism), 리스테리아증, 발진티푸스(typhus), 레지오넬라병, 콜레라, 황열 등이 있다. 중증의 급성 전신 감염증은 다수의 그람 음성 세균과 그의 독소가 혈류에 존재함으로써 일반적으로 유발되는 생명을 위협하는 중증의 패혈증이며, 기관, 조직으로의 혈류를 감소시키는 것을 특징으로하는 패혈 쇼크, 고혈압, 기관 기능부전, 정신 기능 손상, 종종 다중의 기관 부전과 관련있을 수 있으며, 면역약화된 개체에게 종종 작용한다.

그러나, 최근 몇년간, 수많은 감염성 질환 및 증상들이 통상 바이오막이라고 하는 보다 고착된 커뮤니티를 형성하는 미생물에 의해 적어도 부분적으로 초래되는 것으로 확인되고 있다. 이는 다수의 전신, 특히 다수의 보다 국소화된 감염증 모두에 해당된다. 본원에서, 바이오막은 하층(substratum) 또는 인터페이스에, 또는 서로 접착되어 있으며, 이들이 생산한 세포외 폴리머 기질의 매트릭스에 함침되며, 증식율 및 유전자 전사에 대해 변형된 표현형을 나타는 세포를 특징으로 하는 미생물 유래의 고착된 커뮤니티이다. 일반적으로, 세포외 매트릭스는 고도로 수화된 주로 음이온성 매트릭스 폴리머를 포함한다. 바이오막은 표면 및 인터페이스에 접착할 수 있으며, 실제 접착은 세포외 매트릭스의 생산을 조절하는 유전자의 발현과 기존의 부유성 미생물의 고착된 표현형으로 전환을 유발할 수 있다.

고착된 미생물 및 그 바이오막은 다수의 감염성 질환에서 중요한 역할을 하며, 이들중 일부는 많은 증거로 입증된 것으로 여겨진다. 이러한 질병들로는, 예컨대, 치주염, 자연판막 심내막염(native valve endocarditis), 낭성 섬유증, 만성 세균성 전립선염, 기관지염, 폐렴, 동염(sinusitis), 덴탈 케어(dental care), 만성 편도선염, 심내막염, 괴사성 근막염(necrotising fascitis), 근골격계 감염증(musculosceletal infection), 골수염, 담관 감염증, 감염성 신장 결석 및 중이염이 있다. 아마도, 체내 특정 부위나 기관에서의 그외 많은 - 특히 국소- 감염증, 예로 간, 비장, 치주, 눈, 신장, 피부, 질, 요도 또는 심장의 감염증에는 고착된 미생물이 관여한다.

청구항 1항에 따른 펩티드 화합물의 활성 평가에서, 이들 화합물이 고착성의, 바이오막을 형성하는 미생물에 활성인 것으로 확인되었다. 따라서, 이는 이러한 미생물과 관련된, 또는 고착 상태의 미생물이 관여하는 질환의 예방 또는 치료용으로 유용한 화합물이다. 예를 들면, PVC와 같은 임의의 표면에 바이오막을 형성할 수 있는 임의 미생물, 예컨대 슈도모나스 푸티다를 표준 바이오막 분석에서 바이오막을 형성하는 것을 저해 및 방지시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

본 발명의 화합물이 적어도 약 0.001 μM 이상, 더 바람직하기로는 0.01 μM 이상, 보다 더 바람직하기로는 0.1 μM 이상의 농도로 존재할 때, 저해 효과가 달성된다. 다른 바람직한 예로, 화합물의 농도는 약 0.1 내지 약 100 μM 이다. 그러나, 바이오막에 접촉하는 체액의 종류와 양, 관여하는 특정 미생물에 따라, 농도를 맞출 수 있다.

나아가, 본 발명의 화합물은 미생물에 의한 바이오막 형성이나 마이크로필름 형성 능력을 방지할 뿐만 아니라, 이미 형성된 마이크로필름에 대해 활성이라는 것을 발견하였다. 표준 바이오막 분석에서 검출가능한 바와 같이, 그 농도에 따라, 바이오막을 파괴 또는 분해할 수 있다. 또한, 화합물 농도는 바이오막에 접촉하는 체액의 종류와 양, 그리고 관여하는 특정 미생물을 고려하여, 선정하여야 한다. 예컨대, 약 0.001 μM 수준으로 낮은 농도에서 이미 형성된 바이오막에 대해 파괴적인 효과를 가질 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 화합물의 농도는 약 0.001 μM 이상으로 선택하는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 농도는 각각 0.01 μM 이상, 0.1 μM 이상, 1 μM 이상, 10 μM 이상 및 100 μM 이다.

바이오막 감염 위험성은 진단 또는 치료 목적으로 인간이나 그외 포유류의 체내에 의료 기구를 삽입 또는 이식하는 경우에 생긴다. 예를 들면, 바이오막이 관여되는 콘텍트 렌즈, 심장 판막, 정맥 카테터, 요로 카테터, 경질 장치, 봉합사, 혈관이식편(vascular graft), 혈관 단락(vascular shunt), 복막 투석 장치(peritoneal dialysis device), 음경 보형물(penile prosthesis), 및 정형외과적 보형물(orthopaedic prosthesis)의 감염들으로 설명된다. 따라서, 바람직한 예로 본 발명의 화합물을 이용하여 상기 장치로 인한 감염증을 예방 또는 관리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물은 CAP18 및 LL-37과 같이 이들이 유래된 천연 단백질 및 펩티드보다 우수한 장점은 바람직하지 않은 염증 활성이 낮다는 것이다. 이러한 활성은 증식, 분화 및 사이토카인과 같은 전-염증성 매개체를 코딩하는 유전자의 발현을 포함한 여러가지 세포 과정과 관련있다. 사이토카인은 염증의 직접적인 매개체이며, 수많은 면역 반응의 진행 및 방향에 영향을 미친다. 사이토카인 생산의 균형성 동요는 수종의 질환 상태의 중요한 인자로서 널리 인식된다. 삼출성 중이염 또는 동염과 같은 증상에서, 이러한 균형은 이미 파괴되어 있다. 또한, T 세포 증식은 통제를 이미 벗어난 면역 반응을 더욱 자극할 것이므로, 이러한 상황에 이롭지 않다.

따라서, 화합물은 약학 조성물에 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 약학 조성물 뿐만 아니라 화합물 그 자체를 제공한다. 본원에서, 용어 "약학 조성물"은 치료 및 진단 조성물과, 상기 조성물을 포함하는 약제 및 진단제를 의미한다. 치료 조성물 및 약제는 개선이 바람직한 포유류의 질환 또는 그외 증상을 예방하거나 치료하는데 사용된다. 진단제 및 진단 조성물은 상기 질환을 생체내 및 시험관내에서 진단하는데 사용된다.

전형적으로, 이러한 약제 또는 조성물은 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 1종 이상과, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 1종 이상을 포함하다.

일 예로, 상기 약제는 청구항 1항에 개시된 바와 같이 동일한 화합물 군으로부터 선택될 수 있는 다른 활성 성분을 포함한다. 대안적으로, 그외 화합물은 상이한 그룹에 속하는 것이다. 예컨대, 이는 항생제이거나 항진균 활성을 가지지만 다른 작용 메카니즘으로 작용하는 것으로 알려진 화합물일 수 있다. 다른 예로, 상기 다른 화합물은 동일한 약제로 병합되지 않지만 분리된 제형으로서 병용 투여된다.

또한, 상기 조성물은 인간이나 동물에 투여가능한 방식으로 가공 및 형태화된다. 본원에서, 담체 또는 부형제는 실질적인 약리 활성이 없는 약학적으로 허용가능한 임의의 물질 또는 물질 혼합물이며, 이는 비히클 또는 보조 물질로서 사용하여, 투여하기에 안정적이며 적합한 투여 형태로 혼합물을 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 예는 당업자들에게 공지되어 있으며, 주전공 약전에서 확인할 수 있다.

일 예로, 상기 조성물은 비경구 주사, 점적 주사(instillation) 또는 관류(irrigation), 바람직하기로는 정맥내 또는 동맥내와 같은 혈관내 주사와, 또한 근육내, 피하, 병변내, 복막내, 국소부위(locoregional) 또는 그외 비경구 투여 경로용으로 제형화 및 가공된다. 다른 바람직한 예로, 조성물은 중이와 같이 상기도의 병에 걸린 점막에 직접 투여된다. 그외 약물을 이러한 투여 경로로 제형화하는데 적용되는 동일한 원칙은 당업자에게 이러한 조성물을 제조하는 방법을 알려줄 것이다. 예로, 비경구 투여형태의 요건은 무균성이다. 그외 요건은 모든 전공 약전, 예컨대 USP 24, "General Requirements for Tests and Assays. 1. Injections", p. 1775-1777에 개시되어 있다. 비경구 제형의 안정성을 증가시키기 위해, 투여되기 전에 재구성하여야 하는 건조된 투여 형태로 제공할 수 있다. 이러한 투여 형태의 예로는 냉동-건조(freeze-dried) 또는 동결건조(lyophilized) 제형이 있다. 적합하기로는, 본 발명의 조성물은 점액 용해성 용매를 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물을 비경구 조절성 방출 투여 형태로서 투여하여, 치료법의 효능 및 편의성을 개선시키고 잦은 주사를 피하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 디포트(depot) 제형을 제조하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 지연 방출(Prolonged release)은 고형 임플란트, 나노입자, 나노캡슐, 미세입자, 미세캡슐, 에멀젼, 현탁물, 오일성 용액, 리포좀 또는 유사 구조에 의해 제공될 수 있다.

감염된 점막층에 국소 투여하는 조성물의 경우, 투여 부위에 국소 체류 시간을 연장시키는 특성을 가징 제형을 제공하여, 약제의 효과를 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 이를 위하여, 점막부착성 부형제(mucoadhesive excipient)를 상기 제형에 병합할 수 있다. 이러한 기능성 부형제는 당업자에게 알려져 있으며, 이로는 폴리아크릴산 및 그것의 유도체, 폴리메타크릴산 및 그의 유도체와 같은 폴리머, 하이드로시프로필 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 전분, 키토산 등을 포함하는 셀룰로스 에테르가 있다. 적합하게는 또는 대안적으로, 본 발명의 조성물은 또한 점액 용해제를 또한 함유할 수 있다. 특히, 점액 용해성 용매는 사용하여 예컨대 호흡관에서 점액으로의 본 발명의 펩티드 화합물의 투과력에 영향을 준다. 적합한 용매는 공지된 점액조절 또는 점액 용해제, 예컨대 N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸 시스테인, 브롬헥신, 암브록실(ambroxyl), DNAse, 에르도스테인(erdosteine), 염수 및 네소스테인(nesosteine)을 포함할 수 있다. 바람직하기로는, 브롬헥신이 사용된다.

가장 넓은 정의로 비경구 제형의 제조에 특히 유용한 추가적인 부형제로는, 용매, 공용매, 액체 담체 또는 반고형 담체, 예컨대 멸균수, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 부탄디올, 지방 오일, 단쇄 트리글리세라이드, 중쇄 트리글리세라이드, 렉시틴, 폴리옥시에틸렌 캐스터 오일 유도체; 삼투성과 pH를 조절하는 물질, 예컨대, 당, 특히 글루코스, 당 알코올, 특히 만니톨, 소듐 클로라이드, 소듐 카르보네이트, 시트르산, 아세테이트, 포스페이트, 포스포르산, 하이드로클로르산, 소듐 하이드록사이드 등; 안정화제, 항산화제 및 보존제, 예컨대 아스코르브산, 소듐 설파이트 또는 소듐 하이드로겐 설파이트, EDT, 벤질 알코올 등; 그외 부형제 및 동결건조 보조제, 예컨대 알부민, 덱스트란 등이 있다.

유사하게, 본 발명의 화합물은 경점막 투여 형태로 투여하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 투여 경로는 비침습적이며, 환자에게 편리한 방식이며, 동시에 경구 투여에 비해, 특히 소화계의 체액중에 화합물이 불안정하거나, 사이즈가 커서 장에서 효과적으로 흡수되지 못하는 경우에, 본 발명의 화합물의 생체이용성을 일반적으로 개선시킨다. 경점막 투여는 예컨대, 코, 볼, 설하, 잇몸, 또는 질 투여 형태로 가능하다. 이러한 투여 형태는 공지된 기술에 따라 제조할 수 있으며, 이는 점비제, 살비제, 삽입제(insert), 필름, 패치, 젤, 연고 또는 정제로 제형화될 수 있다. 바람직하기로는, 경점막 투여 형태로 사용되는 부형제는 또한 하나 이상의 점액부착성을 제공하는 물질을 함유하여, 투여 형태가 흡수 부위에 접촉되는 시간을 연장시키며, 따라서, 잠재적으로 흡수 정도를 증가시킨다.

대안적으로, 약학 조성물은 경구 투여로 설계되고, 그에 따라 가공될 수 있다. 적정 경구 투여 형태로는 정제, 경질 캡슐, 연질 캡슐, 분제, 과립제, 경구 붕괴성 투여 형태, 시럽, 점적제, 현탁제, 발포성 정제, 츄잉성 정제, 경구 필름, 동결건조된 투여 형태, 서방성 투여 형태, 조절성 방출 투여 형태를 포함한다. 바람직한 일 예로, 경구 투여 형태는 화합물을 위의 산 및 단백질 분해 환경으로부터 보호하기 위해 장 코팅한 고형의 투여 형태이다.

다른 예로, 화합물은 정량 흡입기(metered dose inhaler), 분사기, 에어로졸 스프레이 또는 건조 분말 흡입기를 이용하여, 폐 경로(pulmonary route)를 통해 투여된다. 적합한 제형은 공지 방법 및 기술에 따라 제조할 수 있다. 경피, 직장 또는 안 투여 역시 일부 경우에서 실행할 수 있다.

개선된 약물 전달 또는 표적 방법을 이용하여 본 발명의 화합물을 보다 효율적으로 전달하는 것이 이로울 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여 경로를 선택한다면, 적정 투여 형태는 생체이용성 증강제를 포함할 수 있으며, 이는 화합물의 이용성을 증가시키는 임의의 물질 또는 물질의 혼합물일 수 있다. 이는, 예컨대 효소 저해제나 항산화제에 의한 방법과 같이 화합물을 분해로부터 보호함으로써 달성할 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 증강제는 흡수벽의 투과성을 증가시킴으로써 화합물의 생체이용성을 증가시키며, 상기 흡수벽은 전형적으로 점막이다. 투과 증강제는 다양한 메카니즘을 통해 작용할 수 있으며; 일부는 점막의 유동성(fluidity)을 증가시키며, 그외의 물질은 점막 세포사이의 갭 정션을 개방 또는 넓힌다. 또다른 물질은 점막 세포 층을 덮고 있는 점액의 점도를 감소시킨다. 바람직한 생체이용성 증강제는 콜릭산 유도체(cholic acid derivative), 인지질, 에탄올, 지방산, 올레산, 지방산 유사체, EDTA, 카르보머(carbomer), 폴리마르보필 및 키토산과 같은 친양쪽성(amphiphilic) 물질이다.

상기 화합물의 항균 및 항진균 활성을 이용하여, 보존제를 함유하지 않거나 또는 단지 소량 함유한 약제의 제조에 이용할 수 있다. "소량"은 보존제의 함량이 활성 성분 이외에는 동일한 성분을 함유하고 있는 동일한 플라시보 조성물을 효과적으로 보존하는데 필요한 보존제 함량 보다 적음을 의미한다.

조성물이 효과적으로 보존되는지는 적정 테스트, 예컨대, 5개의 시험 유기체를 제조 카테고리에 따라 정해진 시간 간격으로 5개의 시험 유기체를 테스트하는 보존제 효능 테스트(예, USP<51>)를 이용하여 결정할 수 있다. 전술한 바와 같이 조성물에 대한 약물만 제외한 조성물과 같은 대응하는 조성물에 대한 특정 보존제의 최소 유효 농도를 결정하기 위해, 상기하 테스트를 적정 시리즈로 수행할 수 있다.

예컨대, 소르브산이 함유된 특정 플라시보 조성물을 효과적으로 보존하기 위한 보존제는 약 10%(w/v) 이상의 농도로 존재되어야 함을 확인할 수 있다. 이러한 경우, 청구항 1항에 명시된 화합물을 포함하는 참조 조성물은 소르브산을 실질적으로 낮은 농도로, 예컨대 약 0.05%(w/v) 또는 그 미만으로 함유할 수 있다. 다른 예로, 보존제의 농도는 대응하는 플라시보 조성물을 효과적으로 보존하기 위해 필요한 농도의 1/5 이하, 더 바람직하기로는 1/10 이하의 농도로 선택한다.

도 1은 60.4Ac(막대 1 내지 5), DMSO 및 M63의 여러가지 몰 농도에 따른 OD595 값을 나타낸 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 더 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 본 명세서에 개시된 예로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 화합물의 제조

24개의 아미노산을 각각 포함하며, P60, P60.4, P60.Ac 및 P60.4Ac로 표기한, 하기 펩티드 조성물을, 자동 다중 펩티드 합성기(SyroII, MultiSyntech, Witten, Germany)에서 고상 방법으로 제조하였다. P60와 P60.4는 Tentagel S AC(Rapp, Tubingen, Germany), 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리스티렌의 그래프트 폴리머를 수지로 (loading 0.2 meq, particle size 90μm) 사용하였다. P60.Ac와 P60.4Ac는 Tentagel S AM를 사용하여, C-말단이 아미드화된 펩티드로 제조하였다. 반복적인 커플링은 NMP 중에 적정 Fmoc 아미노산의 0.60 M 용액을 (수지 로딩 기준으로) 6배 몰수로, NMP 중의 0.67 M PyBOP를 0.6배 몰수로, 및 NMP 2/1(v/v) 중의 NMM 12배 몰수로 반응 용액에 첨가하여 수행하였다. 측쇄 보호기는 다음과 같다: D, E, S, T는 tBu; K는 Boc; N, Q는 Trt; 및 R는 Pmc. Fmoc-탈보호는 각 반응 용기에 3배 용량의 피페리딘/NMP 1/4(v/v)를 첨가하여 수행하였다. 보호 반응 시간 및 탈보호 반응 시간은 각각 45분 및 3 x 3 분이다. 커플링 및 Fmoc-탈보호 반응 이후에 세정은 NMP를 이용하여 6번 실시하였다. P60.Ac 및 P60.4Ac에서, N-말단 아세틸화는 펩티드를 수지에 결합시킨 채로 아세트산을 이용하여 수행하였다. 합성한 후, 펩티딜 수지는 NMP, 디클로로메탄, 디클로로메탄/에테르 1/1(v/v) 및 에테르로 각각로 세정하고, 공기중에 건조하였다. 펩티딜 수지를 절단하고, 측쇄는 TFA/물 95/5 (v/v)중에서 2.5시간(펩티드 10 μmol 당 1.5 ml) 동안 탈보호시키고, 여과하여 수지를 제거한 다음, 에테르/펜탄 1/1 (v/v) (펩티드 10 μmol 당 10 ml)을 이용하여 TFA 용액으로부터 펩티드를 침전시켰다. 용액은 -2O ℃에서 1시간 냉각시키고, 침전된 펩티드는 원심분리(-20 ℃, 2,50Og, 10 분)하여 분리하였다. 펠 렛을 10 ml의 에테르/펜탄 1/1 (v/v)로 저작 및 혼합하고, 동일한 방법으로 분리한 다음, 1시간동안 실온에서 펩티드를 공기중 건조시켰다. 펩티드는 10 vol% 아세트산 2 ml 또는 물 2 ml에 용해하고, 이를 약 5분간 액체 질소에서 동결시키고, 원심분리(1,300 rpm, 8-16 시간)하면서 동결건조하였다. 펩티드는 RP-HPLC와 Maldi-Tof 질량 분석기로 분석하였다.

화합물의 아미노산 서열은 다음과 같다:

P60 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE

P60.Ac* IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE

P60.4 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR

P60.4Ac* IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR

*접미사 Ac는 펩티드의 N-말단이 아세틸화되어 있으며, C-말단이 아미드화되어 있음을 의미한다.

실시예 2: 독소 중화

실시예 1에 따라 제조한 화합물을 LAL(limulus amoebocyte lysate) 분석 및 전혈액(WB) 분석으로 세균 독소 LPS 중화력을 테스트하였다. LTA 중화 역시 전혈액 분석으로 측정하였다. 펩티드 LL-37를 양성 대조군으로 사용하였다. LPS 50%가 중화되는 펩티드 농도를 펩티드 활성치로 사용하였다. 상기 농도는 표 1에 나타낸다. 각 분석에서의 화합물간의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다. 종합적으로, 본 발명의 테스트 화합물들은 대략적으로 천연 항균 펩티드 LL-37과 동일한 수준의 항-독소 활성을 나타내었다.

표 1: 50% LPS- 및 LTA-중화하는 화합물의 농도(μg/ml ± SD)

화합물	LPS(LAL)	LPS(WB)	LTA(WB)
P60	1.5 ± 0.5	1.4 ± 0.1	2.1 ± 0.7
P60.Ac	1.8 ± 0.8	2.4 ± 0.5	2.1 ± 0.1
P60.4	1.7 ± 0.6	2.1 ± 0.6	2.0 ± 1.3
P60.4Ac	1.8 ± 0.1	nd	nd
LL-37(대조군)	1.3 ± 0.2	1.2 ± 0.2	1.6 ± 0.5

실시예 3: 화합물에 의한 면역 세포의 활성화

실시예 1에 따라 제조한 화합물을 Elispot, T-세포 증식, ERK-활성화 및 호중구 주화성 분석을 이용하여 이들의 치료학적으로 부적합한 면역형성 활성에 대해 조사하였다. Elispot 분석은 약물 화합물 또는 그외 화합물의 시험관내 사이토카인 분비에 대한 효과를 측정하기 위해 적용할 수 있는 방법으로, 이들의 생체내 면역 기능에 대한 이들의 조절 효과를 추정할 수 있는 데이타를 제공한다. 상기 분석의 결과는 IFN-감마에 대한 양성 반응의 함수로 주어진다. ERK-(세포외 신호 관련 키나제)-l/2은 증식, 분화 및 전-염증 매개체 유사 사이토카인을 코딩하는 유전자의 발현을 포함한, 다양한 세포 과정에 참여하는 것으로 확인된 MAP-키나제 시그널링 경로의 일부이다. 사이토카인은 전-염증의 직접적인 매개체이며, 많은 면역학적 반응의 진행 및 방향에 영향을 미친다. 사이토카인 생산에 있어 균형 동요는 여러가지 질병 상태에서 중요한 인자로 널리 인지된다. 이러한 균형은 삼출성 중이염 및 동염과 같은 증상에서는 교란된 상태이다. 또한 T 세포 증식은 이미 통제를 벗어난 면역 반응을 자극할 것이므로, 이러한 상황에서는 우호적이지 않다. 따라서, 본 발명의 화합물은사이토카인 생산, T 세포 증식, ERK-활성화 및 호중구의 주화성를 자극하지 않는 것이 바람직하다.

T 세포 증식에서, 150,000개의 말초 혈관 단핵구 세포(PBMC)를 5일간 150 ㎕ IMDM 컴플리트가 있는 96웰 둥근 바닥 플레이트(Costar Inc. Cambridge, MA)에서 화합물 부재 또는 화합물이 10 μg/ml로 존재하는 상태에서 배양하였다. 양성 대조군은, PBMC를 재조합 IL-2 25 U/ml 존재하에 배양하였다. 마지막 배양 20시간 동안, PBMC를 [³H]티미딘(0.5 μCi/well)으로 펄스한 다음, 액체 신틸레이션 카운트하여 ³H-병합을 측정하였다. Elispot 분석으로 T 세포 사이토카인인 IFN과 IL-10을 검출하기 위해, 다양한 농도의 합성 펩티드의 존재 또는 부재하에 0.5 ml IMDM 컴플리트에서 1.5 x 10⁶ PBMC를 배양하였다. 양성 대조군으로서, PBMC를 10 μg/ml 포크 위드 미토겐(poke weed mitogen)(PWM)으로 자극하였다. 배양 48시간 후, 따뜻한 IMDM을 이용하여 웰을 조심스럽게 헹구어 비접착 세포를 수득하고, 다량의 IMDM으로 세정하여 PBMC를 회수하였다 이후, PBMC를 항체로 미리 코팅한 ELISA 플레이트에 넣고, 2% 인간 AB 혈청이 보강된 IMDM에서 5시간동안 37℃, 5% CO₂로 배양하였고, 이후 제조사의 프로토콜(U-CyTech, Utrecht, The Netherlands)에 따라 플레이트를 현상하였다. 스팟은 올림푸스 현미경상에서 계수하고 올림푸스 마이크로 이미지 4.0 소프트웨어(Paes Nederland, Zoeterwoude, The Netherlands)로 분석하였다. 최종 결과는 양성 자극 지수의 분수로서 나타내었다(양성: >2).

ERK- 1/2 활성화는, 점막 표피모양의 폐 종양 세포주(muco-epidermoid lung tumor cell line) NCI-H292 (ATCC, Rockville, MD) 유래 세포를 이용하여 테스트하였고, 이는 2 mM L-글루타민(Bio Wittaker, Walkersville, MD), 200 U/ml 페니실린(Bio Wittaker), 200 μg/ml 스트렙토마이신(Bio Wittaker) 및 10%(v/v) 열-불활성화된 소태아 혈청(Gibco)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco, Grand Island, NY)로, 24- 또는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 거의 컨플루언스에 도달한 후, 세포를 혈청 결핍 배지에서 철야 배양하였다. 이후, 세포는 주어진 자극제로 15분간 자극시켰다. 세포용해 완충액(0.5% [v/v] Triton X-100, 0.1M Tris- HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM Na3VO₄, mini complete protease inhibitor cocktail [Boeringer Mannheim, Roche, Basel, Switzerland])을 이용하여 세포 용해물을 제조하였다. 이를 10% 글리신 겔에서 SDS-PAGE하고, 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막에 이동시켰다. 비특이적인 결합부는 PBS/ 0.05% 트윈-20/ 1% 카세인으로 차단시켰다. 블롯은 인산화된 ERK-1/2(New England Biolabs, Beverly, MA)에 대한 토끼 다클론 항체, 및 항 토끼 IgG 항체가 접합된 이차 호르세리디시 페록시다제와 반응시켰다. 강화된 화학발광체(ECL) 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)을 사용하여 면역반응성을 확인하였다. 호중구 주화성는 퍼콜 밀도 원심분리(밀도: 1.082 g/ml)를 이용하여 말초 혈액으로부터 분리한 호중구로 측정하였다. 세포는 무혈청 RPMI가 1:1로 희석된 주화성 배지(20 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES buffer) HEPES, 132 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 5.5 mM glucose, 0.1 mM CaCk and 0.5% (wt/vol) human serum albumin [Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB), Amsterdam, The Netherlands])에서 2.5x10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 화합물의 주화활성(chemotactic activity)은 변형 Boyden Camber 기법으로 분석하였다. 간략하게는, HEPES 완충액에 희석시킨 자극제 26 ㎕을 하단 구획 웰에 넣고, 호중구 현탁액 (2.5xlO⁶ cells/ ml) 50 ㎕을 상단 구획에 넣었다. 이들 구획은 필터 2개로 분리되어 있다: 하단 필터의 기공 크기는 0.45 μm (Millipore Products, Bedford, MA) 및 상단 필터의 기공 크기는 8 μm (Sartorius Filter, San Francisco, CA). 90분간 37℃에 둔 후, 상단 필터를 제거하고, 에탄올-부탄올(80:20, vol/vol) 중에 고정한 다음 Weigert 용액으로 염색하였다. 호중구의 주화활성을 측정하기 위해, 호중구는 6가지 램던 고출력장(six random high-power field)(x400)에서 계수하였고, 양성 대조군(10^-8 M N-포르밀메티오닐-루실-페닐알라닌(FMLP, Sigma))과 비교하여 막상의 호중구 퍼센트를 계산하였다.

그 결과는 표 2에 나타낸다. 총괄적으로, 본 발명의 테스트 화합물, 특히 P60.4는 천연 펩티드 LL-37에 비해 보다 낮은, 매우 낮은 면역 반응을 유도하였다. 이는 낮은 ERK-활성화을 나타내었으며 실제 호중구 주화성은 없었다.

표 2: 화합물의 면역발생성

화합물	γ-IFN ELISPOT	T 세포 증식	ERK-활성화	주화성(%)
P60	1/8	7/8	-	76±39
P60.Ac	3/8	4/8	±	61±36
P60.4	3/8	2/8	±	0±0
P60.4Ac	nd	nd	±	0±0
LL-37(대조군)	4/8	6/8	+	84±17

실시예 4: 생체내 허용성(tolerability)

화합물 P60.4Ac를 실시예 1과 같이 제조하였고, 그것의 생체내 허용성에 대해 조사하였다. 보다 상세하게는 피부 및 눈 자극을 초래할 가능성을 토끼에서 조사하였고, 귀독성은 기니아 피그 모델에서 조사하였다. 또한, 그것의 전신 독성을 정매내 투여후 조사하였다.

눈 및 피부 자극 테스트로, 3마리 토끼를 반 폐쇄성 드레싱(semi-occlusive dressing)으로 4시간동안 크립한 피부에 0.5 ml 포스페이트 완충화된 펩티드 용액(2 mg/ml)를 적용하여 노출시켰다. 노출한 후 1, 24, 48 및 72시간동안 관찰하였다. 샘플 하나, 포스페이트 완충화된(pH7.5) 펩티드 용액(2 mg/ml) 0.1 ml을 3마리 토끼 각각의 한쪽 눈에 주입하여, 급성 눈 자극/부식(corrosion) 실험을 수행하였다. 주입후, 1, 24, 48 및 72시간 관찰하였다.

그 결과, 피부 자극은 관찰되지 않았다. 펩티드 용액을 눈에 주입한 결과 주입 후 24시간이내에 완전히 구분되는 결막의 충혈이 나타났다.

P60.4Ac의 전신 독성은 랫에서의 단회 및 반복 투여 독성 실험으로 평가하였다. 펩티드는 매일 농도를 증가시키면서 정맥내 투여하였다. 이 기간동안 최대 허용 투여량(Maximum Tolerated Dose (MTD))을 확립하였다. 반복 투여 독성은 또한 MTD 기에서 실험하였다. 투여량 증가 기간에서, 9마리의 랫을 3 그룹으로 나누고, 2일간 0.4, 2 또는 8 mg/kg/day을 공급하였다. 임상 신호는 투여한 그날과 투여한 후 1일째에 매일 2번 기록하였고, 첫 투여하기 전과 투여한 후 1일째에 체중을 기록하였다. MTD기에서, 5마리의 암컷 및 5마리의 수컷 랫에게 5일간 8 mg/kg/day을 공급하였다. 임상적인 신호는 투여한 당일에 매일 2번 기록하였고, 1일 및 6일째에 체중을 측정하였다. 임상적인 실험 평가는 부검전에 수행하였다. 육안 검사는 MTD기 종료시에 수행하였다.

그 결과, 전신 투여량 증가 실험에서 사망은 발생되지 않았다. 또한, 임상 신호 및 체중에서 명확한 차이는 없었다. 또한, MTD기 동안 사망은 없었으며, 임상 신호, 체중, 혈액 및 임상적인 생화학적 파라미터 및 육안 검사에서 펩티드와의 관련성은 뚜렷하게 확인되지 않았다.

실시예: 5 귀독성

펩티드 P60.4-Ac의 귀독성을 조사하기 위해, 상기 펩티드를 기니아 피그(HsdPoc:DH; Harlan, Horst, The Netherlands)에 대해 테스트하였다. 7마리의 건강하며, 외이에 병증이 없는 웅성 알비노 기니아 피그(500-1200 g)를 본 실험에 사용하였다. 동물에 케타민(Eurovet Animal Health B. V., Bladel, The Netherlands) 40 mg/kg과 롬푼(Bayer A.G., Leverkusen, Germany) 10 mg/kg을 복막내 주사하여 마취시켰다. 컨트롤 청각 테스트를 실시한 후, 귀 기포(auditory bullae)를 개복하여, 라운드 윈도우 막(round window membrane (RWM))에 작은 스폰 고스탄(spongostan) 조각을 적용하고, 스폰고스탄에 다양한 용액(약 10 ㎕)을 가하였다. 피부를 봉합하고, 청각 테스트를 수행하였다. RWM 적용은 우측 귀에 하였으며, 좌측 귀는 무처리한채 두었다. 동물 한마리에는 제1 플라시보 용액(플라시보 I)을 사용하였고, 다른 동물에는 제2의 플라시보 용액(플라시보 II)를 사용하였으며, 이는 등장성 [NaCl] 및 보존 [0.02% 벤즈알코늄 클로라이드 및 0.1% Na₂EDTA] 20 mM 포스페이트 완충 용액(pH 5.5) 중의 7% Macrogol 10000이다. 기니아 피그 2마리에는 양성 대조군[39]으로서 시스플라틴(0.66 mg/ml in PBS, obtained from Sigma Chemicals, Zwijndrecht, The Netherlands)을 제공하였다. 펩티드 P60.4-Ac(2 mg/ml)는 동물 한마리는 PBS 용액(제형 I)중에서 테스트하였고, 다른 2마리 동물에 대해서는 제2 플라시보에 해당하는 완충액 중에서(제형 II) 테스트하였다. 뇌간유발반응(Auditory brainstem response (ABR))을 약물 투여전에, 그리고 수술 후 바로, 및 3, 7, 12, 22 일 후에, 컴퓨터를 이용한 신호 평균화 시스템(Tucker-Davis Technology, Alucha, FL, USA)을 이용하여 수행하였다. 기니아 피그를 마취하고, 인서터 이어폰을 외이관(external ear canal)에 설치하였다. 피하 전극을 마루점(vertex)(활성) 및 동일한 측의 기포(ipsilateral bulla)(참조)위에 두었다. 기저 전극(Ground electrode)은 목 근육 위에 두었다. 전기적으로 보호된(shielded) 이중 벽의 라디오, 무선 주파수(radio-frequency) 보호된, 사운드 챔버에서, 1 kHz에서 10 ms 톤 버스트에 대한 반응으로, ABR을 기록하였다. 자극 강도를 측정하였고, dB로 나타내었다. ABR 역치는 반복가능한 시각적으로 검출가능 한 반응을 유도할 수 있는 최저 강도이다. 처리 후 ABR 역치를 처리 전 ABR 역치와 비교하였다. 그 결과, 대조군인 PBS의 라운드 윈도우 적용시 수술 후 22일째에 역치 변화는 나타나지 않았다. 제형 완충액들은 22일 후에 2 dB 수준의 역치 변화를 보였다. 반면에, 시스플라틴은 심각한 청력 손실을 의미하는(표 3), 각각 -49 dB 및 -64 dB의 역치 변화를 유도하였다. 이러한 실험은 귀독성 실험에 대한 양성 대조군으로 제공된다. PBS 중의 펩티드 P60.4-Ac(2 mg/ml)은 수술 후 22일째에 -7 dB의 역치 변화를 유도하였다. 제형 II로서 P60.4-Ac를 제공받은 2마리 동물 모두 1 dB의 역치 변화를 나타내었다.

표 3: P60.4Ac의 독성 평가 결과

그룹1	플라시보 I^a	시스플라틴	P60.4-Ac 제형 I^a	플라시보 II^b	P60.4-Ac 제형 II^b
수술 후	1	-2 -1	-2	1	14 20
3일	-3	-32 -38	-2	-8	-1 1
7일	-3	-32 -45	0	-33^c	-18 2
14일	0	-30 -59	-12	-1	0 2
22일	0	-49 -64	-7	2	1 1

수치는 dB에서 Δ 수술전을 나타낸다.

^aPBS

^b등장성 [NaCl] 및 보존 [0.02% 벤즈알코늄 클로라이드 및 0.1% Na₂EDTA] 20 mM 포스페이트 완충 용액(pH 5.5) 중의 7% Macrogol 10000

^c선 불량으로 신뢰할 수 없는 측정치

실시예 6: 항균활성

화합물 P60.4Ac를 실시예 1에 따라 제조하고, 스크류 덮개가 있는 10 mL 유리병으로 멸균 여과하여 멸균화하였다. 보존제는 첨가하지 않았다. 이와는 별도로, 대응하는 플라시보 용액, 즉 화합물 P60.4Ac 이외에는 동일한 구성을 가지는 용액을 준비하였다. 샘플은 두가지 각각의 조제물로 준비하여, 항균 활성 테스트를 실시하였다. 그 결과, 화합물 P60.4Ac을 함유하는 용액이 세균 증식을 억제하거나, 또는 균 수를 줄이는 것으로 확인되었지만, 대응하는 플라시보 용액에서는 항균 활성이 관찰되지 않았다.

실시예 7: 항균 활성

P60.4Ac 및 LL-37의 시험관내 항세균 및 항진균 활성은 R. Hancock의 "Modified MIC method for cationic antimicrobial peptides" [13]의 변형 버전에 따라, 96웰 마이크로타이어 플레이트에서 마이크로희석 감소 테스트에 의해, 최소 저해 농도(MIC)로, 측정하였다. 항세균 활성은 참조 균주 E. coli ATCC 8739, 슈도모나스 에어루지노사 ATCC 9027에 대해 테스트하였다. 항진균 활성은 칸디다 알비칸스 ATCC 10231 및 아스퍼질러스 나이거 ATCC 14406에서 테스트하였다. 항균 활성 분석은 이들의 세균 및 진균 증식에 대한 효과를 비교하기 위해, 여러가지 농도의 P60.4Ac 및 LL-37로 수행하였다. 항세균 활성은 37 ℃, 트립티카제 소이 브로스(Trypticase Soy Broth)에서 대수기로 배양한 세균을 이용하여 실험하였다. 배양물은 10 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 7.4로 희석하여, 약 5.OxIO⁶ CFU/ml로 준비하였다. 희석한 테스트 균주 10 ㎕을 96웰 플레이트로 옮기고, 여러가지 농도 의 펩티드 100 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트는 37 ℃에서 24시간 배양한 다음, 광 박스에서의 육안 검사로 증식을 수치화하였다. 이후 24시간 더 배양한 후, 증식을 다시 평가하였다. 효모 균주, 칸디다 알비칸스는 상기와 같이 준비하였다. 필라멘트형 진균인 아스퍼질러스 나이거는 포자 현탁물로서 사용하였고, 사보우라우드스 덱스트로스 아가 플레이트(Sabourauds Dextrose Agar plate)에서, 20-25 ℃, 6-10 일간 배양하거나, 또는 충분한 포자 형성이 이루어질때까지 배양하였다. 포자는 스크랩핑으로 회수하고, 필요에 따라 최종 농도 5xlO⁶ CFU/ml로 적정하였다.

P60.4Ac의 항미생물 활성은 두종의 그람 음성 균주와 진균 칸디다 알비칸스와 아스퍼질러스 나이거에 대해 평가하였고, LL-37과 비교하였다. 각 펩티드의 MIC 값은 표 4에 나타낸다. P60.4Ac는 LL-37에 비해 그람 음성 균주 E. coli와 슈도모나스 에어루지노사에 대해 우수하거나 또는 유사한 활성을 나타내었다. 또한, 일부 경우에서는, 양 펩티드에 대한 살세균 활성을 측정하였다. P60.4Ac의 칸디다 알비칸스에 대한 MIC는 6 μM이었으며, 살진균 활성은 18 μM이었다. P60.4-Ac는 18 μM에서 24시간 동안 아스퍼질러스 나이거의 발아(germination)를 저해하였지만, LL-37은 상기 균주에 대해 활성을 보이지 않았다.

실시예 8: 바이오막 형성 저해

화합물 P60.4-Ac는 실시예 1에 따라 준비하였고, 슈도모나스 푸티다 PCL1445의 바이오막 형성 저해제로서의 효능을 테스트하였다. 표준 PVC 바이오막 분석 방법을 마이크로타이터 플레이트 웰의 폴리비닐 클로라이드 표면에 형성된 바이오막 에 대해 실시하였다. 웰내 슈도모나스 푸티타 현탁물에 P60.4-Ac 용액(0.9 μM 및 9 μM)을 첨가하여 10시간동안 반응시켰다. 그 결과, 9 μM에서 P60.4-Ac는 펩티드가 첨가되지 않은 완충 용액에 비해 90% 이상의 바이오막 형성 억제율을 보였으며, 0.9 μM에서는 약 50%로 감소하였다.

실시예 9: 형성된 바이오막의 저해

화합물 P60.4-Ac를 실시예 1에 따라 준비하고, 슈도모나스 푸티다 PCL1445의 바이오막 형성 저해제로서의 효능을 테스트하였다. 실시예 7과 같이 표준 PVC 바이오막 분석 방법을 이용하여 바이오막을 형성시켰다. 바이오막이 7시간동안 슈도모나스 푸티다 PCL1445 현탁물로부터 마이크로타이터 플레이트의 웰에 형성되게 하였다. 이후, 여라가지 함량의 P60.4-Ac를 첨가하고, 또한 대조군, 즉 DMSO 및 완충화된 배지 용액, M63을 각각 첨가하였다. 배양 18시간 후에 바이오막은 광학 밀도 595 nm(OD595)에서 분석하였다. 그 결과, DMSO에서만 M63에 비해 OD595가 조금 감소되었고, P60.4-Ac는 농도에 따라 실질적으로 바이오막을 파괴시켰다.

표 4: P60.4-Ac과 LL-37의 항균 활성 비교

유기체(균주)	배양 시간(시간)	펩티드	MIC^a(μM)
E. coli ATCC8739	24 48	LL-37 P60.4-Ac LL-37 P60.4-Ac	3 2 7^b 3^c
슈도모나스 에어루지노사 ATCC9027	24 48	LL-37 P60.4-Ac LL-37 P60.4-Ac	3 3 14^d 6^b
칸디다 알비칸스 ATCC10231	24 48	LL-37 P60.4-Ac LL-37 P60.4-Ac	12 6 >18^e 6^f
아스퍼질러스 나이거 ATCC14406	24 48	LL-37 P60.4-Ac LL-37 P60.4-Ac	>18 18 >18^e >18^e

^aMIC는 37 ℃에서 24 내지 48시간 배양한 후 세균의 가시적인 증식을 저해하는 최소 펩티드 농도이다. 결과는 독립적인 3번의 실험에서의 평균 값이다.

^b 18 μM에서의 살세균

^c 6 μM에서의 살세균

^d 정균 작용(bacteriostatic)

^e 살아있는 미생물의 회복은 실시하지 않았다.

organisms was not performed, as growth in all wells was clearly visible

^f 18 μM에서의 살진균 가능, 6 μM에서 진균억제성(fungistatic)

Claims

포유류의 세균 또는 진균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제 제조에 있어서의 펩티드 화합물의 용도로서,

상기 화합물은 아미노산 서열, X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆을 포함하며,

상기 X₁은 서열의 N-말단부이며,

X₂는 K 또는 E이고,

X₃은 Q 또는 E이고,

X₄는 D 또는 R이고,

X₅는 N 또는 E이고,

X₆은 C-말단부이고,

상기 코어 서열의 아미노산들 중 하나 이상은 선택적으로 유도체화된 것이며,

(a) 상기 N-말단부는 아세틸화 및/또는,

(b) 상기 C-말단부는 아미드화 및/또는,

(c) 상기 아미노산 서열은 X₁KEFKRIVQRIKDFLRNLVX₆이 아닌 것을 특징으로 하는, 펩티드 화합물의 용도.
제 1항에 있어서, 상기 N-말단부인 X₁은 아미노산 I 및/또는 G를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 C-말단부인 X₆은 4개 이상의 아미노산 또는 아미노산 유도체로 구성된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 C-말단부인 X₆은 PRTE 및 RPLR 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열의 하나 이상의 아미노산은 선택적으로 유도체화된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 4항중 어느 한항에 있어서, 상기 화합물은 24개의 아미노산 또는 그의 유도체로 구성된 서열을 가진 펩티드와 유사하며, 상기 서열은 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE 및 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR 중에서 선택되며, 상기 하나 이상의 아미노산은 선택적으로 유도체화된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 5항에 있어서, 상기 N-말단은 아세틸화된 것이고, 상기 C-말단은 아미드화된 것임을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 6항중 어느 한항에 있어서, 상기 세균 또는 진균 감염은 부유성 미생물(planktonic microorganism)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 7항에 있어서, 상기 세균 또는 진균 감염은 급성 또는 만성적인 전신 감염인 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 7항 또는 8항에 있어서, 상기 전신 감염은 패혈 쇼크와 관련있는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 7항 또는 8항에 있어서, 상기 포유류의 면역 시스템은 질병이나 약물 치료를 통해 억제된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 6항중 어느 한항에 있어서, 상기 세균 또는 진균 감염은 고착(sessile) 가능하며 바이오막을 형성할 수 있는 미생물에 의해 초래되는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 11항에 있어서, 상기 세균 또는 진균 감염은 급성 또는 만성적인 국소(local infection) 또는 부위 감염(regional infection)인 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 12항에 있어서, 상기 국소 또는 부위 감염은 중이염, 기관지염, 폐렴 또는 동염(sinusitis)과 같은 하기도, 상기도 또는 호흡계 감염인 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 12항 또는 13항에 있어서, 상기 포유류는 낭성 섬유증을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 12항 내지 14항중 어느 한항에 있어서, 상기 포유류의 면역 시스템은 질환 또는 약물 치료를 통해 억제된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 12항에 있어서, 상기 국소 또는 부위 감염은 간, 비장, 치주, 눈, 신장, 피부, 질, 요도 또는 심장의 감염인 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 16항에 있어서, 상기 국소 또는 부위 감염은 심장 판막, 정맥 카테터, 요로 카테터, 콘택트 렌즈, 스피치 버턴(speech button), 고막절개술관(tympanostomy tube), 자궁내 장치 또는 인공뼈와 같은, 포유류의 의료 기구 이식 또는 삽입과 관련있는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 17항중 어느 한항에 있어서, 상기 포유류는 아미노산 서열 X₁KEFKRIVQRIKDFLRNLVX₆을 포함하는 펩티드 화합물 이외의 추가적인 항균제 또는 항진균제로 동시에 치료되며,

상기 X₁은 서열의 N-말단부이며,

X₂는 K 또는 E이고,

X₃은 Q 또는 E이고,

X₄는 D 또는 R이고,

X₅는 N 또는 E이고,

X₆은 C-말단부이며,

상기 코어 서열의 아미노산들 중 하나 이상은 선택적으로 유도체화된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 18항에 있어서, 상기 추가적인 항균제 또는 항진균제는 하나의 약제중에 펩티드 화합물과 조합된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 17항중 어느 한항에 있어서, 상기 세균 또는 진균 감염은 아미노산 서열 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆을 포함하는 펩티드 화합물이 아닌 활성 성분을 포함하는 약제로는 동시에 치료되지 않으며,

상기 X₁은 서열의 N-말단부이며,

X₂는 K 또는 E이고,

X₃은 Q 또는 E이고,

X₄는 D 또는 R이고,

X₅는 N 또는 E이고,

X₆은 C-말단부이며,

상기 코어 서열의 아미노산들 중 하나 이상은 선택적으로 유도체화된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 20항중 어느 한항에 있어서, 상기 약제는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 21항중 어느 한항에 있어서, 상기 약제는 비경구 투여용으로, 바람직하기로는 정맥내, 근육내, 피하 또는 병변내 주입용으로 제형화, 가공 및 개조된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 21항중 어느 한항에 있어서, 상기 약제는 관류액, 점이제, 점비 제, 에어로졸, 분말 에어로졸, 분무용 액체, 젤, 현탁액 또는 점막부착성 투약 형태(mucoadhesive dosage form)와 같이, 병소 또는 감염된 조직의 점막층에 대한 국소 투여용으로 제형화, 가공 및 개조된 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 23항중 어느 한항에 있어서, 상기 약제는 약물 표적화제, 생체이용성 증강제 및/또는 조절성 전달제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 24항중 어느 한항에 있어서, 상기 약제는 하나 이상의 보존제를 더 포함하며, 상기 보존제의 함량은 대응하는 플리시보 조성물을 효과적으로 보존시키는데 필요한 함량보다 낮은 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.
제 1항 내지 24항중 어느 한항에 있어서, 상기 약제는 실질적으로 보존제가 없는 것을 특징으로 하는 화합물의 용도.