CN105555290A

CN105555290A - 抗微生物肽

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Publication number: CN105555290A
Application number: CN201480039600.7A
Authority: CN
Inventors: P·H·尼博林; P·希姆斯特拉; J·W·德里弗豪特
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-05-09
Also published as: KR20160018549A; MX2015015506A; WO2014182172A1; AU2014263279B2; US20160075749A1; CN105555290B; DK2994154T3; RU2015148642A3; EP2994154A1; AU2014263279A1; RU2695455C2; KR102137941B1; JP6683601B2; CA2911919A1; PT2994154T; LT2994154T; EP2994154B1; RS60248B1; SI2994154T1; MX364942B

Abstract

本发明涉及抗微生物肽，包含该肽的药物组合物及其治疗或预防微生物、细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的用途。

Description

抗微生物肽

本发明涉及生物化学领域。更具体地，本发明涉及抗微生物肽的领域并涉及对抗细菌、病毒、真菌和寄生虫感染。

抗微生物肽(AMP)是整个自然中生物体防御系统的必需组分并且提供抵抗侵入的病原体的保护。AMP并不靶向单一限定的分子结构(表位)，而是作用在细胞膜上因此快速杀死细菌和真菌。因此，与常规抗生素相反，无论细菌的代谢活性如何，它们都是有效的。除了它们的直接杀微生物活性，抗微生物肽是特别有吸引力的，由于某些肽显示出多重活性，如先天和适应性免疫系统的调节、炎症和伤口愈合、以及其它的抗真菌、抗病毒、抗寄生虫和抗癌活性。AMP在序列和二级结构上是特别多种多样的，但是它们有一些共同的性质。它们通常是短的(约15-40个氨基酸)、阳离子型、两亲性并且大部分通过破坏细菌膜的完整性来发挥它们的杀微生物作用。AMP与靶微生物的阴离子膜表面的相互作用导致膜透化、细胞裂解和死亡。公认胞质膜是大多数抗微生物肽的主要靶标，而膜中肽的积累导致增加的透过性和屏障功能的丧失，造成胞质组分泄漏和细胞死亡。已经提出了一些唯象的和其它更为量化的膜透化的各种分子机制以揭示AMP的作用。

主要通过地毯模型或孔模型来使模型系统中的实验观察结果合理化(图1)。在地毯模型中，AMP在平行于膜取向的膜表面上积累导致细胞膜的局部膜变薄和不稳定，造成胞内物质释放。然而，存在有力证据表明许多AMP也以去污剂样的方式通过以非特异性方式破坏脂质的包装和组织(例如，脂质的极性和非极性基团的离析或脂质聚簇)或通过诱导非双层脂质聚集体来发挥作用。此外，一些AMP通过细胞膜并且与胞内靶标相互作用(图1)导致细菌/真菌活力丧失。

明显地，AMP作用的模式与常规抗生素不同，后者通常具有简单靶标，如细胞壁上、或蛋白质中的独特表位和RNA合成过程，这使得病原体细菌更快发展出耐药性。抗微生物肽优于常规抗生素的主要优势在于并不容易发展出针对这些AMP的微生物耐药性，最可能是因为这些肽(与常规抗生素不同)并不靶向单一限定的分子结构(表位)，而是作用在细胞膜上，由此在几分钟内杀死细菌和真菌。因此，由于快速杀伤速率快于细菌的生长速率和靶标的性质(脂质组成显著改变会影响细菌细胞活力)，更不可能发展出耐药性。在肽的亚抑制浓度存在下的重复传代培养(sub-culture)之后监测细菌易感性，已经确定出现对AMP有耐药性的突变株，其显示突变速率低于测试的其它临床抗生素(例如，环丙沙星和红霉素)。虽然这些抗生素的最小抑制浓度(MIC)在全部传代培养中增加(高达64倍)，肽的压迫并没有增加菌株的MIC。因此，与常规抗生素不同，在AMP存在下不太可能发展出耐药性。此外，AMP是快速作用和生物可降解的，这减轻了目前关于环境中残留抗生物的顾虑。

多种微生物感染与生物膜形成相关，其中微生物在自产的聚合物基质中的结构化的群落中聚集并粘附于表面。常规抗生素的另一个缺点在于，由于以下原因，它们不能确保根除生物膜感染：

1)常规抗生素向生物膜中的渗透不足：

包埋细菌的基质保护它们免受外部影响，如抗微生物物质。大多数抗生素能够透过生物膜，但是它们向生物膜中的扩散缓慢，使得它们在能够引发其所需效果之前失活。

2)细菌的低代谢活性：通常用万古霉素(经常与利福平联用)来处理生物膜相关的感染(BAI)。虽然已知万古霉素能够非常良好地透过生物膜-虽然是在明显降低的转运速率下-其使位于生物膜内的细菌的数量减少的能力较差。因此，用这种抗生素处理仍然有较高的失败率，这可由生物膜中细菌的低代谢活性来解释，这使得抗生物无效。

3)抗生素的失活或降解：在BAI中，抗生素大多数是全身性给予的。因此，它们易于经由肾清除从血流中去除并且在血液和周围组织中酶促降解。酶(由细菌产生)可直接破坏或修饰化合物。这些机制有力降低了药物在局部环境中的浓度。在生物膜中，低渗透带来另一个问题。由于高血液浓度抗生素具有毒性，提高全身性给药浓度是不可行的。

4)细菌已经发展出耐药性：除了一般增加的针对抗生素的细菌耐药性，由于在更深层中抗生素浓度降低，细菌从抗生素压迫下逃逸的风险更高，这可能导致对这些抗生素的耐药性增加的突变株的存活。已经报道了抗生素(包括万古霉素)的次优浓度强化了生物膜形成。此外，重复给予效果不足的常规抗生素促进了抗生素耐药性的发展。

5)常规抗生物导致促炎性微生物化合物的释放：已经显示在BAI中，细菌在植入物周围组织中定居。这在很大程度上是由于局部免疫反应的失调。这也是为何在许多病例中，甚至在替换植入物之后，感染持续的原因。生物材料的植入引发称为“外来体反应”的炎性反应，其特征在于嗜中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞的连续流入，之后是巨噬细胞与衬套生物材料的多核外来体巨细胞的融合，新成纤维细胞形成和纤维沉积，导致外来体的纤维化/包封。这一顺序的时间受到分子信号的高度调节，如由涉及的细胞类型产生的细胞因子。在感染的情况中，另外由称为“病原体相关分子模式”(PAMP)的细菌分子触发宿主免疫系统，这些分子由宿主细胞上的特异性受体识别，如Toll-样受体(TLR)。例如，细菌肽聚糖或脂多糖被TLR2和TLR4识别，并且是炎性反应的强效诱导物。同时通过外来体反应和细菌感染激活免疫系统导致宿主免疫系统的“过度(overthetop)”反应，造成发炎和破坏的组织，事实上提供了感染的理想环境。因此，生物材料和PAMP的同时激活可能对免疫功能造成有害的作用并且强烈地增加了感染易感性。

现在，已知超过2000种不同的抗微生物肽序列(参见例如www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/search.htm)，包括天蚕素、防卫素、爪蟾抗菌肽和导管素(cathelicidin)。抗微生物肽和蛋白质，例如，描述于：

US6,503,881，其公开了阳离子肽是待用作抗微生物肽的尹杜抗菌肽类似物。阳离子肽衍生自不同的物种，包括动物和植物。

US5,912,230，其公开了抗真菌和抗细菌的基于组胺素(histatin)的肽和治疗真菌和细菌感染的方法。这些肽基于天然产生的人富组蛋白的氨基酸序列的确定部分。

US5,717,064，其公开了甲基化的富赖氨酸裂解肽。裂解肽耐受胰蛋白酶消化并且是非天然的。裂解肽适用于体内给药。

US5,646,014，其公开了从来自蚕血淋巴的抗微生物部分分离的抗微生物肽。该肽展示出对几种细菌菌株的抗微生物活性，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

WO2004/016653，其公开了基于天青杀素的20-44序列的肽。该肽含有由二硫键桥连连接的环结构。

US6,495,516，其公开了基于杀菌的55kDa蛋白质杀菌/透过性增加蛋白(BPI)的肽。该肽展现出抗微生物效果并具有LPS-中和能力。

WO01/81578，其公开了编码G偶联蛋白质-受体相关的多肽的多个序列，其可用于多种疾病。

WO2004/067563和WO2005/040192，其公开了基于肽LL-37(人导管素的37C-末端氨基酸)的抗微生物肽。

几种AMP、达托霉素和DPK-060现在正处于临床使用和/或研发中，例如，多粘菌素B、尼生素、培西加南、奥米加南、艾塞加南。此外，已经进行了OP-145的2期临床试验，其是衍生自内源性人导管素抗微生物肽LL-37的24个氨基酸的肽。OP-145已经发展为用于局部治疗慢性中耳炎的内毒素中和抗微生物肽。当前已知的AMP仍然存在几个缺陷。虽然蛋白水解降解对于环境是有益的(无残留AMP)，但是其阻止了动态循环。可也由高效的肽清除导致。同时，AMP的精确工作机制仍然在很大程度上未知，因此难以预期它们的真实应用和全部潜能。例如，通常不知道AMP如何与宿主细胞相互作用以诱导其作用。因此，在临床症状中使用AMP已限于局部应用。

多种细菌，如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、粪肠球菌(E.faecalis)、奇异变形菌(Proteusmirabilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)全部分泌降解几种抗微生物肽(如导管素LL-37)的蛋白酶。因此，从治疗的角度来看，耐蛋白酶的抗微生物肽有优势。另外，许多抗微生物肽在通常于问题性发病机理中起关键作用的具有挑战性的微生物如细菌(例如，金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌)中不是非常高效的，并且需要经优化以显示增加的效果。此外，由于AMP针对细菌以及哺乳动物膜的潜在裂解性和其它性质，设计新肽的挑战之一取决于开发与受感染患者的细胞膜相比，具有高的针对微生物如细菌或真菌细胞的特异性的AMP，即高治疗指数(最小溶血浓度/最小抗微生物活性；MHC/MEC)。

因此，即使现在存在较大量的抗微生物肽，对新的改善的抗微生物肽仍然存在增加的需求，其可用于中和微生物，尤其是对抗生物剂和/或其它抗微生物剂有耐药性或耐受性的那些微生物。更重要的是，存在对新抗微生物肽的需求，其在导入哺乳动物如人时是非变应原性的并且具有针对致病性微生物的高特异性。

本发明的一个目的在于提供新型强效抗微生物肽，其克服了常规抗生素的短处并具有优于已知的抗微生物肽改善的性质。另一目的在于提供新型肽，其展示出针对生物膜感染中的致病性微生物的高活性。

发明人发现序列为LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的多肽P10在体外对(耐药性)革兰氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))和革兰氏阴性菌(例如，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))以及真菌，例如白色念珠菌(Candidaalbicans)和黑曲霉(Aspergillusniger)是高度有效的。如图2A和2B所示，P10相比任意其它测试的肽明显更有效。另外，P10能够在塑料以及生物表面(受伤的3-D人皮肤模型)上阻止甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌生物膜形成。此外，P10中和内毒素脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和脂多糖(LPS)，由此降低促炎反应。P10采用α-螺旋产生两亲性结构，其中极性氨基酸位于螺旋的一侧并且亲水性氨基酸位于相反侧。其中引入脯氨酸取代以打破螺旋的肽没有活性，表明多肽的两亲性质对于其生物活性而言是重要的。已经进行的临床试验发现P10甚至比OP-145(P60.4Ac)明显更为强效，如图2-5所示。如图2B所示并在实施例中详述，P10的IC99.9(0.59μM)甚至低于P60.4Ac的IC90(0.75μM)。因此，在0.59μM的浓度下，P10杀死1000个细菌中的999个，而P60.4Ac在相似甚至稍高的浓度下仅杀死1000个细菌中的900个。因此，与相似浓度下的P10处理相比，用P60.4Ac处理之后存活的细菌超过100倍。此外，P10具有宽活性谱，由于其针对广泛的微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫有活性。

本发明的抗微生物肽对生物膜感染的独特效果在以下三点：它们将1)防止生物膜形成并打散已有的生物膜，2)杀死释放位点处及周围的细菌、真菌或其它微生物，和3)通过中和促炎微生物内毒素如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和脂多糖(LPS)并激活巨噬细胞以促进它们的吞噬作用和杀微生物活性来协调免疫反应。这种免疫控制对于防止植入物周围的组织变为病原体的新环境而言是必要的。本发明的多肽针对多种微生物有活性，包括对常规抗生物有耐药性的那些。

还发现：i)P10变体，其中一个或全部氨基酸被其D-氨基酸取代(表2)，ii)P10变体，其中所述肽已经用包括乙酰基、酰胺、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO、己酰基、癸酰基、肉豆蔻酰基、丙酰基、1个或2个氨基酸-己酰基基团的不同基团在N端或C端延长，iii)P10变体，其中一个氨基酸已经被另一种L-氨基酸取代，和iv)较短的P-10变体，其具有与P10相当的抗微生物活性，如实施例中所证明(参见表2、3、5和6)。

因此，本发明的多肽具有针对残留或不残留在生物膜中的微生物的抗微生物高活性，具有由内毒素中和活性表明的最佳的抗炎(微生物化合物-中和)活性，高选择性(即抗微生物高活性)，可接受的低细胞毒性和免疫增强活性。

因此，本发明提供了一种分离或重组多肽，所述重组多肽包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR，或所述氨基酸序列的变体，

所述多肽具有抗微生物、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和/或抗炎活性，

所述变体具有至少16个氨基酸并且：

-具有以下氨基酸取代中的至多5个：

●选自L、I、V或A的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代；

●选自R、K或H的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代；

●由Q取代E

●由F取代Y或W

●选自Q、N、A、S或T的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代

-一个或多个氨基酸由对应的D-氨基酸取代，

-一个或多个氨基酸由对应的非天然氨基酸取代，和/或

-具有来自所述氨基酸序列的至少16个连续氨基酸的逆反序列。

在本文限定的氨基酸序列或其变体中，用单字母符号表示氨基酸。这些单字母符号和三字母符号是本领域技术人员所熟知的，并具有以下含义：A(Ala)是丙氨酸、C(Cys)是半胱氨酸、D(Asp)是天冬氨酸、E(Glu)是谷氨酸、F(Phe)是苯丙氨酸、G(Gly)是甘氨酸、H(His)是组氨酸、I(Ile)是异亮氨酸、K(Lys)是赖氨酸、L(Leu)是亮氨酸、M(Met)是甲硫氨酸、N(Asn)天冬酰胺、P(Pro)是脯氨酸、Q(Gln)是谷氨酰胺、R(Arg)是精氨酸、S(Ser)是丝氨酸、T(Thr)是苏氨酸、V(Val)是缬氨酸、W(Trp)是色氨酸、Y(Tyr)是酪氨酸。

本发明的多肽具有抗微生物活性，优选抗细菌、抗病毒和/或抗真菌活性，更优选抗细菌和/或抗真菌活性。此外，本发明的多肽优选同时具有抗微生物和抗炎活性。本文所述的术语“抗微生物活性”是指抵抗至少一种微生物，例如细菌、病毒和/或真菌的生长或增殖，并包括抑制、降低或防止生长或增殖以及杀死微生物。微生物是微观的生物体，即，通常太小难以被人的肉眼看到。微生物是非常多种多样的，它们包括细菌、病毒、真菌、古细菌、原生动物和细藻。类似地，本文所用术语“抗细菌活性”、“抗病毒活性”、“抗真菌活性”和“抗寄生虫活性”是指分别抵抗一般细菌、病毒、真菌和寄生虫的生长或增殖，并包括抑制、降低或防止生长或增殖以及杀死它们。可通过本领域已知的方法来测量抗微生物、抗细菌、抗病毒、抗真菌和抗寄生虫活性。

这类方法之一详述于本申请的实施例并包括体外杀伤试验。在该方法中，在微生物-多肽混合物在合适的培养基之中或之上孵育之后，用不同浓度的本发明多肽孵育微生物，例如细菌或真菌孵育持续例如约1-2小时，以确立与未用多肽孵育的微生物样品(以相同方式进一步处理)相比的存活和/杀伤的微生物的数量。

可以使用病毒空斑试验来评估本发明的多肽的抗病毒活性。简言之，病毒接种物在任意单层细胞感染之前暴露于多肽。在标准间隔之后，使用这些提取物的多个稀释物通过新鲜的单层细胞并定量它们对单层细胞的作用来确定细胞提取物中的病毒效价。

为了评价抗寄生虫活性，本发明的多肽与寄生虫孵育标准时间间隔。此后，可直接分析寄生虫的代谢活性，例如通过MTT试验，后者可将寄生虫移植到哺乳动物中并在孵育之后通过显微镜来评价这些细胞中的寄生虫繁殖。

本文所用术语多肽的“抗炎活性”是指在已感染微生物，例如细菌、病毒、真菌和/或寄生虫的对象中抑制、减少或防止炎症反应。本发明的多肽的抗炎活性通过抑制、减少或防止促炎微生物化合物，如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)和/或脂多糖(LPS)的释放来实现。可通过本领域已知的方法来测量抗炎活性。这种方法的一个示例是脂多糖中和试验。在该方法中，本发明的多肽与1mg的脂多糖混合并孵育60分钟。此后，将这些混合物加入4倍稀释的新鲜人血中并在18小时后，通过ELISA测量血液样品中细胞因子(1L-8，1L-12p40)的水平。

本文所用的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的变体的长度为至少16个氨基酸并且优选具有以下的氨基酸取代中的至多5个：

-选自L、I、V或A的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代；

-选自R、K或H的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代；

-由Q取代E

-由F取代Y或W

-选自Q、N、A、S或T的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代

-由相应的D-氨基酸取代一个或多个氨基酸

-由相应的非天然氨基酸取代一个或多个氨基酸。所述变体可具有一个L-氨基酸被另一个L-氨基酸取代和/或L-氨基酸被其相应的D-氨基酸取代的所述取代中的1、2、3、4或5个。或者，所述变体的全部至少16个L-氨基酸被其相应的D-氨基酸取代。

优选地，所述变体具有以下氨基酸取代中的至多5个：

-在氨基酸位置1处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置2处用L、V、Q或I取代A

-在氨基酸位置3处用K或H取代R

-在氨基酸位置4处用Q取代E

-在氨基酸位置5处用F或W取代Y

-在氨基酸位置6处用R或H取代K

-在氨基酸位置7处用R或H取代K

-在氨基酸位置8处用L、V或A取代I

-在氨基酸位置9处用L、I或A取代V

-在氨基酸位置10处用Q取代E

-在氨基酸位置11处用R或H取代K

-在氨基酸位置12处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置13处用R或H取代K

-在氨基酸位置14处用K或H取代R

-在氨基酸位置15处用F或Y取代W

-在氨基酸位置17处用H或K取代R

-在氨基酸位置18处用N、A、S或T取代Q

-在氨基酸位置19处用L、I或A取代V

-在氨基酸位置20处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置21处用K或H取代R

-在氨基酸位置22处用Q、N或A取代T

-在氨基酸位置24处用H或K取代R

-由相应的D-氨基酸取代1-5个氨基酸。在此，氨基酸的编号如下：L₁A₂R₃E₄Y₅K₆K₇I₈V₉E₁₀K₁₁L₁₂K₁₃R₁₄W₁₅L₁₆R₁₇Q₁₈V₁₉L₂₀R₂₁T₂₂L₂₃R₂₄。

优选地，本文限定的变体具有至多4个所述氨基酸取代，更优选至多3个所述氨基酸取代，如1、2、3、4或5个所述取代。此外，本文限定的变体优选包含至少氨基酸序列YKKIVEKLKRWLRQVL，其具有至多5个，更优选至多4个，最优选至多3个所述氨基酸取代。

所述变体中由另一个L氨基酸取代L氨基酸的至多5个氨基酸取代优选如下：

-在氨基酸位置1处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置2处用L、V或Q取代A

-在氨基酸位置3处用K或H取代R

-在氨基酸位置4处用Q取代E

-在氨基酸位置5处用F取代Y

-在氨基酸位置6处用R或H取代K

-在氨基酸位置7处用R或H取代K

-在氨基酸位置11处用R或H取代K

-在氨基酸位置12处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置13处用H取代K

-在氨基酸位置14处用K或H取代R

-在氨基酸位置15处用F取代W

-在氨基酸位置17处用H取代R

-在氨基酸位置18处用N、A、S或T取代Q

-在氨基酸位置19处用L取代V

-在氨基酸位置20处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置21处用K或H取代R

-在氨基酸位置22处用Q、N或A取代T

-在氨基酸位置24处用H取代R。

在另一个优选的实施方式中，本发明的多肽包含选自下组的氨基酸序列：

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

IAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

VAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

AAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LLREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LVREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LQREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAKEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAHEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LARQYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREFKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREYRKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREYHKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREYKRIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREYKKIVEKLKKWLRQVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRFLRQVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLHQVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRNVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRAVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRSVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRTVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQLLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVIRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVVRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVARTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLKTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLHTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRQLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRNLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRALR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLH

REYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRT

REYKKIVEKLKRWLRQVLRT

YKKIVEKLKRWLRQVLRTLR

LAREYKKIVEKLKRWLRQVL

EYKKIVEKLKRWLRQVLR

YKKIVEKLKRWLRQVL，

任选地具有N-端和/或C-端修饰，优选包含N-端和/或C-端延伸基团，所述N-端修饰优选选自下组：乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-和丙酰基-，并且所述C-端修饰优选选自下组：酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团。在一个实施方式中，本发明的多肽由所述氨基酸序列之一组成。

替代地，或者除了如上所述由另一个氨基酸取代的至多5个氨基酸以外，本文限定的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的变体可含有一个或多个由其相应的D-氨基酸取代的L-氨基酸。本文中用大写的单字母符号表示氨基酸，如A代表丙氨酸，是天然蛋白质中通常发现的那些L-氨基酸。如实施例所示(表2)，其中L-氨基酸被其相应D-氨基酸取代的多肽保持它们的抗微生物活性。因此，本文限定的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的变体可含有一个或多个由其相应D-氨基酸取代氨基酸。本文所用的“相应D-氨基酸”是L-氨基酸的D-氨基酸相对物。例如，丙氨酸(A)的相应D-氨基酸是D-丙氨酸(a)，精氨酸(R)的相应D-氨基酸是D-精氨酸(r)，天冬酰胺(N)的相应D-氨基酸是D-天冬酰胺(n)等。本文限定的变体的所有L-氨基酸可被它们相应的D-氨基酸取代。本文限定的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的变体可含有至多24个由其相应D-氨基酸取代氨基酸。因此，该变体可完全有D-氨基酸组成，因为包含这种氨基酸变体的多肽中保留抗微生物活性。例如，该变体可含有24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个由其相应的D-氨基酸取代L-氨基酸。在一个实施方式中，本文限定的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的变体含有一个由其相应D-氨基酸取代氨基酸。氨基酸序列中D-氨基酸的位置是无关的。如表2所示，在具有序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR，其中一个氨基酸被D-氨基酸取代的所有多肽中，保留了抗微生物活性。在另一个实施方式中，变体含有的所有L-氨基酸被其相应的D-氨基酸取代。也如实施例中所示(表2)，包含序列lareykkiveklkrwlrqvlrtlr(肽#1313-07)的多肽(其是仅含D-氨基酸的变体)具有抗微生物活性。本文限定的变体还可含有氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的至少16个连续氨基酸的逆反肽。优选地，所述变体是所述氨基酸序列全长的逆反肽。逆反肽是以参比氨基酸序列的反向序列由D-氨基酸组成的肽。因此，本发明的优选变体可具有D-氨基酸序列rltrlvqrlwrklkevikkyeral的至少16个氨基酸。如表2所示，包含序列lareykkiveklkrwlrqvlrtlr(肽#1241-03)的多肽(其是含有氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的逆反序列的变体)具有抗微生物活性。

本文限定的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR的变体可含有至多5个由非天然氨基酸取代氨基酸。本文所用的“非天然氨基酸”是指非遗传编码的氨基酸，不考虑它们是否在自然中出现。可存在于本文所限定的氨基酸序列的变体中的非天然氨基酸包括：β-氨基酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、N-乙酰基赖氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、4-叔丁氢2-叠氮琥珀酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、对氨基苯丙氨酸、2，3-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2，2′-二氨基庚二酸、对氨基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、D-烯丙基甘氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸对-溴苯丙氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、环己基丙氨酸、磺基丙氨酸、D-瓜氨酸、硫代-L-瓜氨酸、锁链素、ε-氨基己酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、高精氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、异-羟基赖氨酸、3-(3-甲基-4-硝基苄基)-L-组氨酸甲酯、异锁链素、异-异亮氨酸、异丙基-L-苯并丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、N-甲基缬氨酸、甲硫氨酸亚砜、2-萘基丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、异丝氨酸、3-苯基丝氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、5，5，5-三氟-DL-亮氨酸、鸟氨酸、3-氯-酪氨酸、N5-氨基甲酰基鸟氨酸、青霉胺、苯基甘氨酸、γ-氨基丁酸、吡啶基丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、γ-羧基-DL-谷氨酸、4-氟-DL-谷氨酸、D-甲状腺素、异-苏氨酸、5-羟基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、5-氟-色氨酸、3-氟-缬氨酸。

在一个实施方式中，所述序列的天然氨基酸由相应的非天然氨基酸取代。本文所用的“相应非天然氨基酸”是指是参比天然氨基酸的衍生物的非天然氨基酸。例如，天然氨基酸被相应的β-氨基酸取代。β-氨基酸的氨基与β碳结合，而不是与天然氨基酸中的α碳结合。例如，α-丙氨酸被β-丙氨酸取代等。天然氨基酸被所述天然氨基酸的衍生物的非天然氨基酸取代的其它示例如下。丙氨酸被例如β-丙氨酸、叔丁基丙氨酸、2-萘基丙氨酸；L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基异丁酸取代。精氨酸被例如高精氨酸、鸟氨酸、N5-氨基甲酰基鸟氨酸、3-氨基-丙酸取代。天冬酰胺被例如N-乙基天冬酰胺取代。天冬氨酸被例如氢2-叠氮琥珀酸4-叔丁基氢2-叠氮琥珀酸。半胱氨酸被例如磺基丙氨酸、高半胱氨酸取代。谷氨酸被例如γ-羧基-DL-谷氨酸、4-氟-DL-谷氨酸取代。谷氨酰胺被例如D-瓜氨酸、硫代-L-瓜氨酸取代。甘氨酸被例如N-甲基甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、D-烯丙基甘氨酸取代。组氨酸被例如3-(3-甲基-4-硝基苄基)-L-组氨酸甲酯取代。异亮氨酸被例如异锁链素、N-甲基异亮氨酸、异-异亮氨酸取代。亮氨酸被例如正亮氨酸、锁链素、5，5，5-三氟-亮氨酸取代。赖氨酸被例如6-N-甲基赖氨酸、2-氨基庚酸、N-乙酰基赖氨酸、羟基赖氨酸、异-羟基赖氨酸取代。甲硫氨酸被例如甲硫氨酸亚砜取代。苯丙氨酸被例如对-氨基-L-苯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸取代。脯氨酸被例如3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、1-乙酰基-4-羟基-L-脯氨酸取代。丝氨酸被例如高丝氨酸、异丝氨酸、3-苯基丝氨酸取代。苏氨酸被例如D-甲状腺素、异-苏氨酸取代。色氨酸被例如5-羟基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、5-氟-色氨酸取代。酪氨酸被例如O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、3-氯-酪氨酸取代。缬氨酸被例如正缬氨酸、N-甲基缬氨酸、3-氟-缬氨酸取代。

特别优选的本发明的多肽包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或其具有至多3.2μM的PBS中致死浓度(LC)99.9的变体，其选自表2、3、5或6。在一个实施方式中，提供了选自表2、3、5或8的具有至多2.4μM的PBS中LC99.9的多肽。

本发明的多肽可由氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或本文限定的该序列的变体组成。本文所用的“多肽”是指包含多个氨基酸的肽、多肽和拟肽。术语“多肽”和“肽”可互换使用。证明具有抗微生物活性的最小的本发明的多肽的长度为16个氨基酸。然而，氨基酸序列或其变体可以是更大的多肽的部分，即N端和/或C端被一个或多个其它氨基酸延伸的多肽的部分。本发明的多肽的氨基酸序列或变体可在N端和/或C端经修饰，优选通过包含N端和/或C端延伸基团。或者，所述氨基酸序列或其变体是N端和/或C端延伸的。本发明的多肽因此包含至少16个氨基酸，并且可包含多达1000个氨基酸。然而，优选较小的多肽以保持尽可能低的生产成本。优选地，本发明的多肽的长度是16-200个氨基酸，更优选16-100个氨基酸，更优选16-50个氨基酸。在一个实施方式中，本发明的多肽包含16-24个氨基酸，即16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。所述多肽优选具有16-24个氨基酸。这类具有16-24个氨基酸的多肽任选地还具有N-端和/或C-端修饰，如选自乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-和丙酰基-的N-端修饰和/或如选自酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团的C-端修饰。实施例中提供了具有不同长度及其抗微生物活性的多肽的示例。在一个实施方式中，本发明的多肽由任选地具有N端和/或C端修饰，优选包含N端和/或C端延伸基团的氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或其如本文限定的变体组成。

本文所用的“拟肽”是指含有非肽结构元件的化合物，该化合物模拟本发明的多肽的抗微生物、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和/或抗炎性质。因此，本发明的多肽可包含非肽结构元件。这类非肽结构元件可存在于氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或其本文限定的变体中，作为所述序列或变体的一个或多个氨基酸的取代或修饰的结果。或者，本发明的多肽可包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或其本文限定的变体外侧，即在任选的N端和/或C端延伸基团中的非肽结构元件。拟肽中的非肽结构元件一般是对一个或多个现有氨基酸的修饰。通过对本发明的多肽进行结构性修饰来得到优选的拟肽，例如，使用非天然氨基酸如本文上述限定的那些、构象约束物、多肽的环化、等排替代或其它修饰。本发明的多肽的氨基酸序列因此任选包含一个或多个修饰。可通过天然方法对该多肽进行修饰，如翻译后加工，或通过化学修饰技术。可在所述多肽的任意位置处插入修饰，包括多肽主链、氨基酸侧链和N端或C端处。单个多肽可含有多种类型的修饰，或单一类型的几个修饰。修饰可包括乙酰化、酰胺化、酰基化、磷酸化、甲基化、去甲基化、ADP-核糖基化、二硫键形成、泛素化、γ羧化、糖基化、羟基化、碘化、氧化、PEG化和硫化。另外，可向本发明的多肽提供标记物，如生物素、荧光素或黄素、脂质或脂质衍生物、糖基团。还可向本发明的多肽提供靶向部分。

在优选的实施方式中，所述氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或其所述本文限定的变体的本发明多肽是N端和/或C端修饰的。本发明的多肽因此优选包含N端和/或C端延伸基团。可用于本发明的多肽的N端和C端延伸基团是本领域熟知的。N端修饰的优选示例是乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-和丙酰基-。C端修饰的优选示例是酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团。然而，其它N端或C端延伸基团也会产生本领域技术人员已知的活性化合物。在一个实施方式中，所述氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或其所述本文限定的变体包含N端乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-或丙酰基-残基，以及C端酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团。如实施例中所示(表3)，具有这类N端或C端修饰的多肽保留高抗微生物活性。在一个实施方式中，提供了本发明的多肽，其中N端是乙酰化的而C端是酰胺化的。

本发明因此提供了包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或所述氨基酸序列的变体的分离或重组多肽，所述多肽具有抗微生物、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和/或抗炎活性，所述变体具有至少16个氨基酸并具有以下氨基酸取代中的至多5个，优选至多3个，更优选至多1个：

-在氨基酸位置1处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置2处用L、V、Q或I取代A

-在氨基酸位置3处用K或H取代R

-在氨基酸位置4处用Q取代E

-在氨基酸位置5处用F或W取代Y

-在氨基酸位置6处用R或H取代K

-在氨基酸位置7处用R或H取代K

-在氨基酸位置8处用L、V或A取代I

-在氨基酸位置9处用L、I或A取代V

-在氨基酸位置10处用Q取代E

-在氨基酸位置11处用R或H取代K

-在氨基酸位置12处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置13处用R或H取代K

-在氨基酸位置14处用K或H取代R

-在氨基酸位置15处用F或Y取代W

-在氨基酸位置17处用H或K取代R

-在氨基酸位置18处用N、A、S或T取代Q

-在氨基酸位置19处用L、I或A取代V

-在氨基酸位置20处用I、V或A取代L

-在氨基酸位置21处用K或H取代R

-在氨基酸位置22处用Q、N或A取代T

-在氨基酸位置24处用H或K取代R

-由相应的D-氨基酸取代1-4个氨基酸，

其中，所述氨基酸序列或其所述变体包含N端和/或C端延伸基团，优选包含N端乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-或丙酰基-残基，以及C端酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团。本领域技术人员会清楚其它N端或C端延伸基团也会产生活性化合物。在此，氨基酸的编号如下：L₁A₂R₃E₄Y_sK₆K₇I₈V₉E₁₀K₁₁L₁₂K₁₃R₁₄W₁₅L₁₆R₁₇Q₁₈V₁₉L₂₀R₂₁T₂₂L₂₃R₂₄。所述多肽优选具有16-24个氨基酸。

在优选的实施方式中，本发明的多肽包含疏水性部分。向阳离子(多)肽加入疏水性基团改善了它们中和微生物内毒素并与微生物膜相互作用的能力，并因此改善了它们消除微生物，例如病原体的能力。

如上文所述，可通过本领域已知的化学修饰技术来修饰本发明的多肽。可在多肽合成期间或结束时导入对本发明的多肽的修饰。例如，当使用固相合成技术合成多肽时，可通过将仍然与树脂结合的氨基酸序列与乙酸反应来进行N端乙酰化。作为另一个示例，在固相肽合成中使用特定类型的树脂来进行C端酰胺化，如市售的TentagelSAM(德国蒂宾根的exRapp(exRapp，Tübingen))。这些树脂包含化学柄(chemicalhandle)，在切割期间从这些化学柄释放酰胺化的(多)肽。修饰多肽的这些和其它方法是本领域任何技术人员已知的。

在一个实施方式中，本发明提供了一种包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR，或所述氨基酸序列的变体的分离或重组多肽，

所述变体具有至少16个氨基酸并且：

-具有以下氨基酸取代中的至多5个：

●由Q取代E

●由F取代Y或W

●选自Q、N、A、S或T的一个或多个氨基酸被选自该组的另一个氨基酸取代，和/或

-一个或多个氨基酸由对应的D-氨基酸取代。

本发明还提供了包含至多6个含有氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或本文限定的其变体的多聚体。所述多聚体可包含至多6个具有相同氨基酸序列的多肽单体，或至多6个多肽单体，其中2个或更多个多肽单体具有不同的氨基酸序列。在优选的实施方式中，本发明的多聚体包含具有相同氨基酸序列的至多6个本发明的多肽。

也提供了本发明的多肽的盐。这类盐包括，但不限于酸加成盐和碱加成盐。本文所用的多肽的“药学上可接受的盐”是指保留多肽的所需抗微生物、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫和/或抗炎活性并适于给予人或动物的盐。制备多肽的盐的方法是本领域已知的，并且一般包括将多肽与药学上可接受的酸或碱混合，例如，通过将产物的游离酸或游离碱形式与一个或多个当量的合适的酸或碱在溶剂或介质(盐在该溶剂或介质中不溶)或溶剂(如水，其然后被真空或冻干去除)中混合，或通过在合适的离子交换树脂上将现有盐的阳离子交换成另一种阳离子。药学上可接受的酸和碱的示例包括有机和无机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、三氟乙酸、肉桂酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫氰酸，其与多肽的游离氨基形成铵盐，和碱，其与多肽的游离羧基形成羧酸盐，如乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、异丙胺、二异丙胺和其它单烷基、二烷基和三烷基胺，乙基芳基胺。

可通过多种方法制备本发明的多肽。例如，可通过本领域熟知的常用的固相合成方法，例如，涉及α氨基的t-BOC或FMOC保护的方法来合成多肽。在此，随后向加长的氨基酸链加入氨基酸。这类方法例如描述于Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156；和Atherton等，″SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成)″伦敦的IRL出版社，(1989)。固相肽合成方法特别适于大规模生产中较短长度的多肽，如长度达到约70个氨基酸的多肽的合成。

或者，可使用本领域熟知的重组技术来制备本发明的多肽，其中在宿主细胞中表达编码多肽的核苷酸序列。本发明因此提供了制备本发明的多肽的方法，包括：

-提供包含编码本发明的多肽的核酸序列的核酸分子；

-用所述核酸分子转化宿主细胞；

-在允许所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；

-从所述细胞收获所述多肽；

-任选地N端或C端修饰所述多肽，例如通过加入N端和/或C端延伸基团。

本发明还提供了包含编码本发明的多肽的核酸序列的核酸分子，其在本文中也称为本发明的核酸分子。本文所用的本发明的核酸分子或核酸序列包含核苷酸，优选DNA和/或RNA链。

还提供了包含本发明的核酸序列分子的载体。本文所用术语“载体”是指能够向宿主细胞导入异源核酸序列的核酸分子，如质粒、噬菌体或动物病毒。本发明的载体允许在宿主细胞中表达或产生由异源核酸序列编码的本发明的多肽。本发明所用的载体例如衍生自动物病毒，其示例包括，但不限于痘苗病毒(包括减毒衍生物，如改良的安卡拉痘苗病毒，MVA)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒或逆转录病毒。本发明的载体优选包含含有启动子的表达盒，该启动子适于在所选的宿主细胞中引发本发明的多肽的转录。真核宿主细胞中表达本发明的多肽的合适启动子的示例包括，但不限于β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、5SRNA启动子或病毒衍生的启动子，如巨细胞病毒(CMV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和猴病毒40(SV40)启动子，用于哺乳动物宿主。

本发明还提供了包含本发明的核酸分子和/或载体的重组宿主细胞。宿主细胞是已经或能够被核酸分子如本发明的载体转化的细胞。“转化”是指外来核酸向受体细胞的导入。宿主细胞的转化可导致重组蛋白质被所述细胞瞬时表达，表示该重组蛋白质仅表达持续限定的时间段。替代地，受体细胞的转化可导致稳定表达，表明核酸导入细胞的基因组中并由此传到下一代细胞中。另外，可以实现重组蛋白质的诱导型表达。诱导型表达系统需要存在或缺少允许编码本发明的多肽的核酸序列的表达的分子。诱导型表达系统的示例包括，但不限于Tet-On和Tet-Off表达系统、激素诱导型基因表达系统(例如蜕皮激素诱导型基因表达系统)、阿拉伯糖诱导型基因表达系统、和使用pMT/BiP载体(英杰公司(Invitrogen))的果蝇诱导型表达系统，该载体包含诱导型金属硫蛋白启动子。在制备本发明的多肽的方法中使用的宿主细胞是例如革兰氏阳性原核生物、革兰氏阴性原核生物或真核生物。优选地，所述宿主细胞是真核细胞，如植物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞，最优选昆虫细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞的示例包括植物细胞，如玉米细胞、水稻细胞、浮萍细胞、烟草细胞(如BY-2或NT-1细胞)和马铃薯细胞。酵母细胞的示例是酿酒酵母和毕赤酵母。昆虫细胞的示例是草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞，如Tn5、SF-9和SF-21细胞，以及果蝇细胞，如果蝇施耐德2(S2)细胞。适于表达本发明的多肽的哺乳动物的示例包括，但不限于，非洲绿猴肾细胞(Vero)、幼仓鼠肾细胞(如BHK-21)、人视网膜细胞(例如PerC6细胞)、人胚胎肾细胞(如HEK293细胞)、马-达二氏犬肾(MDCK)细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肾细胞(CEK细胞)、胚盘衍生的胚胎干细胞(例如EB14)、小鼠胚成纤维细胞(如3T3细胞)、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、和这些细胞类型的衍生物。

本发明的方法优选还包括收获、纯化和/或分离本发明的多肽的步骤。所得的本发明的多肽优选用于人类治疗，任选地在额外纯化、分离或加工步骤之后，例如使用凝胶电泳或色谱方法纯化。

本发明的多肽显示出可优选同时用于治疗或非治疗应用的多种活性。具体地，本发明的多肽可用于对抗多种微生物感染，如细菌感染、真菌感染、病毒感染，以及对抗寄生虫感染。提供了包含本发明的多肽或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。还提供了包含本发明的核酸分子或载体以及至少一种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。

本发明还提供了用作药物的本发明的多肽。还提供用作药物的包含编码本发明的多肽的核酸序列的核酸分子。所述药物可以是治疗剂或预防剂。

在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有细菌、真菌、病毒和/或寄生虫感染的对象的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的本发明的多肽、本发明的药物组合物或本发明的核酸分子。还提供了一种制备用于治疗感染微生物的对象或用于预防微生物感染的药物的方法。在优选的实施方式中，所述微生物是细菌、真菌、病毒或寄生虫。还提供了用于治疗微生物、细菌、真菌、病毒和/或即摄功能常感染或微生物、细菌、真菌、病毒和/或寄生虫感染导致的病症的本发明用途的多肽和/或核酸分子。

本文所用的“对象”是人或动物。对象包括但不限于哺乳动物，如人、猪、雪貂、海豹、兔、猫、狗、牛和马，以及鸟类如鸡、鸭、鹅和火鸡。在本发明的优选实施方式中，对象是哺乳动物。在一个特别优选的实施方式中，对象是人。

本发明还提供了抑制微生物，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫生长的方法，该方法包括将所述微生物或寄生虫与本发明的多肽或药物组合物接触。可在体内或体外进行所述接触。

本发明的多肽和药物组合物有效治疗多种微生物感染，如各种病毒、细菌和真菌感染。例如，多肽和药物组合物有效治疗革兰氏阴性和革兰氏阳性菌。可在人或动物中造成可用本发明的多肽和组合物治疗的感染的致病性细菌的示例包括，但不限于利斯特氏菌属、埃希氏菌属、衣原体属、立克次氏体属、分枝杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肺炎球菌属、脑膜炎球菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属、军团菌属、白喉、沙门氏菌属、杆菌属、霍乱弧菌、破伤风、梭菌属、芽孢杆菌属、耶尔森氏菌属、和钩端螺旋体属。

可在人或动物中造成可用本发明的多肽和组合物治疗的感染的致病性病毒的示例包括，但不限于甲肝、乙肝或丙肝、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II、CMV、EB病毒(EpsteinBarr))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒和人免疫缺陷病毒(HIV病毒；例如，I型和II型)。

可在人或动物中造成可用本发明的多肽和组合物治疗的感染的致病性真菌的示例包括，但不限于念珠菌(例如，白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌)、曲霉(例如，烟曲霉、黑曲霉)、新型隐球菌、夹膜组织胞浆菌、毛霉属、皮炎芽生菌、巴西副球孢子、和粗球孢子菌。

可在人或动物中造成可用本发明的多肽和组合物治疗的感染的致病性寄生虫的示例包括，但不限于痢疾内变形虫、疟原虫(例如，恶性疟原虫、间日疟原虫)、阿米巴虫、鞭毛虫、结肠小袋绦虫、棘阿米巴属、隐孢子虫属、卡氏肺囊虫、果氏巴贝虫、锥虫(例如，布氏锥虫、克氏锥虫)、利什曼原虫(例如，杜氏利什曼原虫)、和弓形虫。

在优选的实施方式中，本发明的多肽和药物组合物有效治疗由甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)和(非耐药性)金黄色葡萄球菌(S.aureus)、革兰氏阴性菌绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和真菌物种白色念珠菌(Candidaalbicans)和黑曲霉(Aspergillusniger)引起的感染。

可给予含多肽的组合物用于预防性和/或治疗性处理。在治疗性应用中，向已患有疾病的对象(优选人)给予足够对抗感染的症状或由感染及其障碍导致的病症的量的多肽或组合物。在预防性应用中，向处于患有微生物或寄生虫感染风险的对象，例如人或动物给予足够防止感染或至少抑制感染发展的量的多肽或组合物。多肽一般以治疗性的量存在于本发明的药物组合物中，该量是足够治疗病症或疾病，尤其是与微生物或寄生虫感染相关的症状的量。给予本发明的多肽或其至少2种的组合的一般剂量是0.01至10mg多肽/kg体重，取决于多肽的大小。

本发明的多肽和药物组合物特别适用于局部应用，例如，治疗或预防皮肤感染、伤口感染和泌尿道感染。如本文之前详述，本发明的多肽能够防止生物膜形成并且打散已有的生物膜，杀死在生物膜形成部位处或其周围的细菌、真菌或其它微生物，并通过中和促炎微生物内毒素来调节免疫反应。细菌生物膜可延迟皮肤伤口愈合并降低常规抗生素在愈合或处理受感染的皮肤伤口、皮肤感染或泌尿道感染中的局部抗细菌功效。本发明的多肽可特别用于例如伤口愈合，如本申请的实施例所示。该实施例显示本发明的多肽在人成纤维细胞的烧伤感染模型中有效杀死位于生物膜内的细菌。在一个实施方式中，本发明因此提供用于治疗或预防皮肤感染、伤口感染和/或泌尿道感染的本发明的多肽、药物组合物和/或核酸分子。

还提供可本发明的多肽、药物组合物和/或核酸分子在伤口愈合中的用途。还提供了本发明的多肽、药物组合物和/或核酸分子在制造用于治疗或预防皮肤感染、伤口感染、泌尿道感染和/或伤口愈合的药物组合物中的用途。本发明还提供了一种治疗患有皮肤感染、伤口感染和/或泌尿道感染的对象的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的本发明的多肽、本发明的药物组合物或本发明的核酸分子。

多肽和药物组合物也可用作抗炎剂，由于它们中和促炎微生物内毒素如脂磷壁酸、肽聚糖和脂多糖，从而抑制、降低或防止嗜中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞的流入以及受感染的对象释放促炎微生物化合物。因此，还提供了一种抑制促炎化合物释放的方法，该方法包括将能够释放促炎化合物的细胞与本发明的多肽接触。可在体内或体外进行所述接触。还提供了用作抗炎剂的本发明的多肽。

本发明的多肽优选整合到控释递送运载体和/或靶向递送运载体中。本文所用的术语“控释”是指以时间依赖性方式释放本发明的多肽。在一个实施方式中，控释是指缓释。本文所用的术语“靶向递送”是指以位点导向的方式释放本发明的多肽。控释载剂的使用具有以下优势，即可避免诸如通过注射本发明的多肽的频繁给药。使用靶向递送载剂具有以下优势，即本发明的多肽有效递送到和/或保留在对象身体的感兴趣部位处，如炎症部位或感染部位。优选地，本发明的多肽靶向受到微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的部位。控释递送运载体和/或靶向递送运载体是本领域所熟知的。控释和/或靶向递送载剂的非限制性示例是纳米颗粒、微粒、纳米胶囊、微胶囊、脂质体、微球、水凝胶、聚合物、脂质复合物、血清白蛋白、抗体、环糊精和葡聚糖。例如，通过将本发明的多肽整合到这种运载体的表面中或表面上来提供控释。运载体由形成捕获本发明的多肽的颗粒并在合适的环境(如水性、酸性或碱性环境或体液)中缓慢降解或溶解，从而释放该多肽的材料组成。例如，通过提供表面上带靶向基团的运载体来实现靶向递送。这类包含靶向基团的运载体的示例是抗体官能化的运载体、具有位点特异性配体的运载体和带正或负表面电荷的运载体。用于控释和/或靶向递送的优选颗粒是纳米颗粒，即，直径范围为约1至500nm，优选至多约200nm的颗粒，和脂质体，任选地提供靶向基团。

因此，本发明还提供了包含本发明的多肽的控释运载体和包含这种控释运载体的药物组合物。还提供了包含本发明的多肽的靶向递送运载体，和包含这种靶向递送运载体的药物组合物。在一个实施方式中，所述运载体选自纳米颗粒、微粒、纳米胶囊、微胶囊、脂质体、微球、水凝胶、聚合物、脂质复合物、血清白蛋白、抗体、环糊精和葡聚糖。

优选的靶向递送和/或控释运载体由生物可降解材料组成。本文所用的“生物可降解”是指在生理条件下降解的分子。这包括可水解降解的分子和需要酶促降解的分子。合适的生物可降解材料包括，但不限于生物可降解的聚合物和天然的生物可降解的材料，如PLA(聚乳酸)，PGA(聚乙醇酸)，聚己酸内酯(PCA)，聚环氧乙烷(PEO)，聚二噁烷酮(PDS)，聚己酸内酯(PCL)，聚富马酸丙二醇酯，衍生自内酯的聚合物，如交酯、乙交酯和己内酯，碳酸酯如碳酸亚丙酯和碳酸亚丁酯，二噁烷酮，乙二醇，聚酯酰胺(PEA)环氧乙烷，酯酰胺，γ-羟基戊酸酯，β-羟基丙酸酯，α-羟基酸，羟基丁酸酯，羟基烷酸酯，聚酰亚胺碳酸酯，聚氨酯，聚酐，及其组合，多糖如透明质酸，壳聚糖和纤维素，以及蛋白质如明胶和胶原。

本发明的多肽还优选用作易受微生物，例如细菌、病毒、真菌、寄生虫感染的物质的防腐剂。这类物质可浸渍、包被或覆盖本发明的多肽。在一个实施方式中，本发明的多肽用作医疗装置的防腐剂。本文所用术语“医疗装置”是指可用于人或动物身体的装置，并且包括但不限于医疗设备，医疗器械，假体如人工关节(包括臀部和膝盖)，和牙科假体，胸植入体，可植入装置如起搏器，心脏瓣膜，支架，导管，耳管，夹板，医疗装置螺杆，和伤口或组织敷料。这类医疗装置特别适于被例如细菌(对单个细菌或生物膜中的细菌)粘附。

因此，还提供了本发明的多肽作为医疗装置防腐剂的用途。还提供了一种涂层，优选用于医疗装置，该涂层包含本发明的多肽。在一个实施方式中，这类涂层提供了本发明的多肽的控释。这类医疗装置的控释涂层优选包含生物可降解材料，使得通过降解涂层材料来实现本发明的多肽的释放。因此，还提供了包含本发明的多肽的控释涂层。还提供了包含这类涂层的医疗装置，该涂层包含本发明的多肽和生物可降解材料。本发明的生物可降解涂层包括上述定义的生物可降解材料。具体地，这类生物可降解涂层包含选自下组的材料：PLA(聚乳酸)，PGA(聚乙醇酸)，聚己酸内酯(PCA)，聚环氧乙烷(PEO)，聚二噁烷酮(PDS)，聚己酸内酯(PCL)，聚富马酸丙二醇酯，衍生自内酯的聚合物，如交酯、乙交酯和己内酯，碳酸酯如碳酸亚丙酯和碳酸亚丁酯，二噁烷酮，乙二醇，聚酯酰胺(PEA)环氧乙烷，酯酰胺，γ-羟基戊酸酯，β-羟基丙酸酯，α-羟基酸，羟基丁酸酯，羟基烷酸酯，聚酰亚胺碳酸酯，聚氨酯，聚酐，及其组合，多糖如透明质酸，壳聚糖和纤维素，以及蛋白质如明胶和胶原。

虽然本发明的多肽是强效抗微生物剂，但是它们可与其它已知的抗微生物剂组合，所述抗微生物剂如常规抗感染药，如抗生素、抗病毒药和抗真菌药或其它抗微生物肽，以及抗体和化学物，例如，敏化剂、纳米颗粒。这种组合可产生增加的抗微生物活性或拓宽活性谱。本发明的多肽例如可与青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、磺酰胺类、四环素类和/或氨基糖苷类组合用于治疗细菌感染。为了治疗病毒感染，多肽可与抗病毒核苷类似物，如阿昔洛韦、更昔洛韦、齐多夫定(AZT)或地达诺新或者神经氨酸酶抑制剂，如奥塞米韦、帕拉米韦或扎那米韦组合。为了治疗真菌感染，本发明的多肽和组合物可与多烯抗真菌剂、咪唑类、三唑类、丙烯胺类、棘球白素类、环吡酮胺、氟胞嘧啶和/或灰黄霉素组合。因此，本发明提供了包含本发明的多肽和另外的抗微生物剂的药物组合物，该抗微生物剂是如抗生素或抗微生物肽，优选选自下组：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、莫匹罗星。

本发明的药物组合物包含至少一种药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。例如，合适载体的例子包括钥孔血蓝素(KLH)、血清白蛋白(如BSA或RSA)和卵清蛋白。在另一个优选的实施方式中，所述合适的运载体是溶液，如盐水。可整合到片剂、胶囊等中的赋形剂的示例如下：粘结剂如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如微晶纤维素；崩解剂如玉米淀粉、预胶化淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂如薄荷，冬青油，或樱桃。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可包含液体运载体(如脂肪油)。可以存在各种各样的其它材料作为包衣或者来改变所述剂型的外形。例如，可用紫胶、糖或两者同时包被片剂。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物，糖如甜味剂，用作防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂如樱桃或橙风味。本发明的药物组合物优选适合人使用。

可以多种不同的方式给予本文所述的药物组合物。示例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮下、皮内、鞘内和颅内方法给予包含本发明的多肽并含有药学上可接受的运载体的药物组合物。对于口服给药，活性成份可以固体剂型给予，如胶囊、片剂和粉末，或以液体剂型，如酏剂、糖浆剂和悬液。

可按照常规药学实践通过在用于注射的载剂，如水或天然产生的植物油，如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等，或合成脂肪载剂如油酸乙酯等中溶解或悬浮本发明的多肽来配制用于注射的无菌组合物。也可纳入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。

在优选的实施方式中，配制本发明的药物组合物用于局部给药。本文所用的“局部给药”是指施用于身体表面，如皮肤或粘膜以局部治疗由微生物或寄生虫感染导致的病症。适用于局部给药的制剂的示例包括，但不限于乳膏、凝胶、软膏、洗液、泡沫、悬液、喷雾剂、气溶胶、粉末气溶胶。局部药物可以是经表皮的，表明它们可直接施涂于皮肤上。局部药物也可以是吸入的，例如，用于施用于呼吸道的粘膜上皮，或施用于除皮肤以外的组织的表面，如施用于结膜表面的滴眼液或置于耳中的滴耳液。所述配制用于局部给药的药物组合物包含至少一种适于局部施用的药物赋形剂，如利泄剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、pH调节剂和/或水。

本发明的多肽也特别适于诊断用途。多肽可用于检测微生物感染，例如，通过检测生理样品如血液、血浆、粘液、伤口渗出物和尿液中的微生物毒素，例如，细菌毒素包括LPS、LTA和PG。此外，多肽可用于测定这类样品中微生物毒素的量。因此，本文提供了用作诊断剂的本发明的多肽核酸分子。还提供了本发明的多肽在检测生理样品如血液、血浆、伤口渗出物和尿液样品中微生物毒素，优选细菌或真菌毒素中的用途。如上所述，本发明的多肽可偶联到合适的部分，如生物素、荧光素标记物、近红外染料或放射性同位素上。这类标记的多肽可用于检测微生物感染如细菌感染的方法中，因为它们会迁移到微生物感染的部位。使用适于所用的与多肽接合的标记物的检测器，可能检测感染部位。因此，本发明提供了用于检测微生物感染，如细菌感染的方法。该方法包括向已感染或怀疑正感染微生物生物体的对象给予标记的多肽。因为标记的多肽能够与感染性生物体相互作用，其在感染部位处积累。为了检测生理样品中的微生物毒素，该方法包括向已感染或怀疑正感染微生物生物体的对象的生理样品给予标记的多肽。可能使用对接合多肽的标记物敏感的各种检测器来检测多肽在感染部位处或样品中的积累。

本发明的多肽的另一个有用的应用在于食品防腐。因此，还提供可本发明的多肽作为食品防腐剂的用途。一般而言，通过将食品经过60至100℃的温度的热处理来破坏致病性或腐坏微生物。这种处理可能对食品有不希望的影响，如不希望的感官作用。本发明的多肽作为食品防腐剂的用途可能导致延长的储存寿命和/或增强的食品安全性。

食品中的致病性微生物可引起对象感染或中毒，并且包括细菌如空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi)和非鼠伤寒沙门氏菌(non-typhiSalmonellaspecies)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、志贺氏菌(Shigella)和肉毒梭菌(ClostridiumBotulinum)，病毒如轮状病毒和诺瓦克病毒，寄生虫如猪肉绦虫(Taeniasolium)、牛肉绦虫(Taeniasaginata)和旋毛虫(Trichinellaspiralis)和霉菌。食品腐坏是指食品的外观、一致程度、风味和/或气味的变化，并且可能是由细菌如乳杆菌、明串珠菌、假单胞菌、微球菌、黄杆菌、沙雷氏菌、肠杆菌和链球菌，真菌如曲霉、镰刀菌和枝孢以及酵母造成的。

下面借助以下非限制性实施例更具体地解释本发明。

附图说明

图1：AMP作用模式中涉及的步骤的简化示意图，其表示膜破坏的2种最主要模型(毛毯和孔形成(carpetandporeformation))和AMP向胞内环境中转移。为了结合主要由阴离子磷脂酰甘油(PG)和中性磷脂酰乙醇胺(PE)组成的胞质细菌膜，AMP必须移位穿过胞外生物膜聚合物基质和其它膜和/或肽聚糖/脂磷壁酸层(出于简化目的未显示)，这大都是静电驱动的。

图2：由肽P60.4Ac(NellMJ等，Peptides(2006)649-660)和肽P2、P3、P4、P5、P6、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17和P19杀死MRSALUH14616，表示为不同浓度的肽(A)的每ml培养基MRSA的CFU(菌落形成单位)和肽(B)的IC90、IC99和IC99.9值(90％、99％和99.9％抑制浓度)。

图3：由不同浓度的P60.4Ac和P10杀死MRSA，由每ml培养基的MRSA的CFU量显示。

图4：LL-37、P60.4Ac、P10和莫匹罗星在热伤模型中对MRSALUH14616的作用，其表示为每个皮肤模型MRSALUH14616的CFU的量(A)和每个皮肤模型中MRSALUH14616的存活(％)。

图5：LL-37、P60.4AC、P10和莫匹罗星在热伤模型中对莫匹罗星耐药性MRSALUH15051的作用，其表示为每个皮肤模型MRSALUH15051的CFU的量(A)和每个皮肤模型中MRSALUH15051的存活(％)。

实施例

材料和方法

抗微生物肽的合成

通过正常Fmoc-化学法来制备合成肽，其使用预加载Tentagel树脂，PyBop/NMM用于原位激活和NMP中20％哌啶用于去除Fmoc(HiemstraHS等，ProcNatlAcadSciUSA，94，10313-10318(1997))。用6倍酰化物质进行偶联，持续60分钟。在最后去除Fmoc之后，当肽序列中存在C(三乙基硅烷)或W(乙硫醇)时，用含清除剂的TFA/H₂O19/1(v/v)来切割肽。通过离心用醚/戊烷1/1(v/v)沉淀和分离产物来分离肽。在约40℃下空气干燥之后，肽溶解在乙酸/水1/10(v/v)中并冻干。使用UPLC-MS(沃特斯公司(Waters)的Acquity)检验肽的纯度并且使用Maldi-Tof质谱(布鲁克公司(Bruker)的Microflex)检验完整性，显示预期的分子质量。

缩写：

Fmoc：9H-芴基甲氧羰基

NMM：N-甲基吗啉

PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-六氟磷酸鏻

TFA：三氟乙酸

细菌菌株

由荷兰马斯特里赫特的马斯特里赫特大学医学中心的S.Croes博士友情提供甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床分离株LUH14616(参见CroesSBMCMicrobiol.2009；9：229.doi：10.1186/1471-2180-9-229)，并且由MEOCHeck博士(荷兰比多芬(Bilthoven)，RIVM，国立公共卫生与环境研究所，感染性疾病和筛选实验室)赠送莫匹罗星耐药性MRSALUH15051。

金黄色葡萄球菌JAR描述于Campoccia等(IntJArtifOrgans.2008年9月；31(9)：841-7)。

细菌在-80℃下储存直至使用。通过将从血液琼脂板分离的MRSA菌落在胰蛋白酶大豆汤(TSB)培养基(法国LePontdeClax的BD公司(BectonDickinson))中孵育2.5小时，然后稀释至所需的浓度来制备对数中期细菌接种物。

表1

体外杀伤试验

为了在对数中期细菌上进行体外杀伤试验，MRSALUH14616和MRSALUH15051在PBS中重悬至1x10⁶细菌/ml的浓度。随后，200μl加入事先冻干的一定浓度范围的肽LL-37、P60.4Ac(OP-145)和P10。随后，细菌-肽混合物在37℃下孵育1小时。为了建立这些肽的杀伤能力，混悬液连续稀释并接种在DST琼脂板上以测量有活力的CFU计数。通过线性回归分析来计算IC90、IC99和IC99.9值。

为了用P10变体进行体外杀伤试验，金黄色葡萄球菌JAR(1mlnCFU/ml)在37℃下与PBS或PBS/人血浆(1/1，v/v)中各种浓度的肽孵育2小时。表2-6显示了导致杀死99.9％的细菌的肽的浓度(残留1000CFU/ml)。LC99.9是2次独立实验的平均值。

人皮肤等效物

如E1Ghalbzouri等(LabInvest.2004年1月；84(1)：102-12)所述制备人皮肤等效物。简言之，将5x10⁵个正常人角质形成细胞接种在充斥成纤维细胞的大鼠尾胶原基质上。事先通过制成接种正常人成纤维细胞(4mg/ml胶原，10xHBSS，1MNaOH，FCS和成纤维细胞)的基底(0.1％乙酸，4mg/ml胶原，汉克斯平衡盐溶液(HBSS，10x)，1MNaOH和FCS)和顶部胶原层来制备胶原基质。使用3μm孔径的Transwell滤器(Corning3414，克斯塔公司(Costar))来培养人皮肤等效物。胶原基质在成纤维细胞介质中培养一周。全厚度的人皮肤等效物首先在37℃和7.3％CO₂下在角质形成细胞介质中浸没培养2或3天，然后如上所述在角质形成细胞介质中培养，但是用1％FCS并补充2ML-丝氨酸、10mML-肉毒碱、1μMDL-α-生育酚-乙酸盐、50μM抗坏血酸、含有1∶1∶1比例的棕榈酸、亚油酸和花生四烯酸的脂质补充物，和2.4x10^-5M牛血清白蛋白。在2或3天后，随后将HSE如上所述在角质形成细胞介质中空气-液体界面处培养14天，但没有血清并补充2ML-丝氨酸、10mML-肉毒碱、1μMDL-α-生育酚-乙酸盐、50μM抗坏血酸、脂质补充物(含有25μM棕榈酸、30μM亚油酸和7μM花生四烯酸(2∶1∶1)以及2.4x10^-5M牛血清白蛋白。每周2次更新培养基。

烧伤感染模型和实验处理

如上所述使用0.4μm孔径的transwell滤器(Corning3460，克斯塔公司)重建全厚度皮肤模型。在空气-液体界面处培养10天后，通过在皮肤等效物上施涂液氮15秒来造成20mm²的烧伤口。在感染之前，热损伤的皮肤等效物在37℃和7.3％CO₂下孵育1小时。通过在皮肤等效物上施加接种物中的1x10⁵MRSA来进行感染。在孵育1小时后，去除未粘附的细菌。处理在感染后1或8小时开始并且给予一个剂量(100ml的PBS中100μg)的LL-37、P60.4Ac或P10。处理在加工之前延长4或24小时。用1ml的PBS洗涤皮肤等效物以去除所有未粘附的细菌。然后，取2个4mm的活检物并在1ml的PBS中匀化。匀化物和洗涤物连续稀释以在诊断灵敏性测试(DST)琼脂板上测量活CFU计数。

结果

P10的鉴定

合成一组15个肽。肽经设计，以在与P60.4Ac相比时，强化或弱化预测的两亲性结构(NellMJ等，Peptides(2006)649-660)，其基于计算机辅助的结构预测。抗生物膜活性在肽(以这种方式生成的较高和较低活性的抗微生物肽)之间的有高度活力的。预期抗微生物肽内的两亲性螺旋结构的修饰和抗生物膜活性之间存在微秒的关系。因此，基于这些观察开发了一系列短合成肽，并且评价其抗微生物活性。这些肽的活性在无抗微生物活性和以摩尔为基准具有超过LL-37的活性的肽之间变化。P60.4Ac和测试的15个肽的序列是：

肽P10非常高效地杀死MRSALYH14616。其具有所有测试的肽中最高的针对MRSALUH14616的活性，并且甚至明显比P60.4Ac(OP-145)更有效，参见图2A和B。例如，P10的IC99.9为0.59μM，表示在该浓度下P10杀死1000个细菌中的999个。P60.4Ac在类似甚至稍高的0.75μM的浓度下仅杀死1000个细菌中的900个(IC90为0.75μM)。因此，与相似浓度下的P10处理相比，用P60.4Ac处理之后存活的细菌超过100倍。因此，P10的活性大约是P60.4Ac的100倍。

P10和变体的活性

肽10在杀死MRSA和莫匹罗星耐药性MRSA中以及从热损伤的人皮肤等效物中消除细菌方面比LL-37和P60.4Ac更有效(图3-5)。

P10对于对数期、稳定器的细菌和生物膜中残留的细菌的MRSA细菌是高度有效的。

另外，P10针对以下高度有效：

1)革兰氏阳性菌，例如，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的各种甲氧西林耐药性以及敏感性菌株(参见图4和5)，

2)革兰氏阴性菌，包括各种(耐药性)绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌株，(耐药性)鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)菌株，

3)分枝杆菌，和

4)真菌病原体(氟康唑耐药性)白色念珠菌(Candidaalbicans)和黑曲霉(Aspergillusniger)。

其中一个或所有氨基酸已被其相应D-氨基酸取代，或一个氨基酸已被另一个L-氨基酸取代的P10变体具有与P10相当的抗微生物活性。同时，具有用不同基团，包括乙酰基、酰胺、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO、己酰基、癸酰基、肉豆蔻酰基、丙酰基、1个或2个氨基-己酰基基团在N端或C端延长的变体和较短的P10变体具有与P10相当的抗微生物活性。这些P10变体的序列和活性示于表2、3、5和6中。其中导入脯氨酸取代以打断螺旋的肽是活性最差的(参见表4)。

表2.其中一个氨基酸被其D-氨基酸(小写字母)取代的P10变体和相对物以及逆反肽的活性。J＝乙酰基，B＝酰胺

表3.其中肽在N端或C端用不同基团延长的P10变体的活性。J＝乙酰基，B＝酰胺，o＝NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO，b＝己酰基，j＝癸酰基，u＝肉豆蔻酰基，U＝丙酰基。Z＝氨基-己酰基

表4.其中已经通过用P(脯氨酸，已经报道是螺旋破坏残基)取代2个特定氨基酸修饰肽的P10变体的活性。J＝乙酰基，B＝酰胺

表5.其中一个氨基酸已被另一个L-氨基酸取代的P10变体的活性。J＝乙酰基，B＝酰胺

表6.较短P10变体的活性。J＝乙酰基，B＝酰胺。

Claims

1.一种包含氨基酸序列LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR或所述氨基酸序列的变体的分离或重组多肽，

所述变体具有至少16个氨基酸，并且：

-具有以下氨基酸取代中的至多5个：

●由Q取代E

●由F取代Y或W

-其中一个或多个氨基酸由对应的D-氨基酸取代，

-其中一个或多个氨基酸由对应的非天然氨基酸取代，和/或

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽任选地在N端和/或C端被修饰，优选包含N端乙酰基-、己酰基-、癸酰基-、肉豆蔻酰基-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-或丙酰基-残基，和/或包含C端酰胺-、NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO-酰胺-和1个或2个氨基-己酰基基团。

3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述变体包含至少氨基酸序列YKKIVEKLKRWLRQVL，所述序列具有权利要求1所述的氨基酸取代中的至多5个。

4.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1-3中任一项所述多肽的核酸序列。

5.一种载体，所述载体包含如权利要求4所述的核酸分子。

6.一种重组宿主细胞，所述细胞包含如权利要求4所述的核酸分子和/或如权利要求5所述的载体。

7.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的多肽或其药学上可接受的盐、权利要求4所述的核酸分子和/或权利要求5所述的载体以及至少一种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物配制用于局部给药，如乳膏、凝胶、油膏、洗液、泡沫、悬液、喷雾、气溶胶、粉末气溶胶。

9.如权利要求7或8所述的药物组合物，所述药物组合物还包含其他抗微生物剂，优选选自下组：青霉素类、头孢菌素类、莫匹罗星、碳青霉烯类。

10.如权利要求7-9中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含控释递送运载体和/或靶向递送运载体，所述运载体包含所述多肽，其中所述运载体优选选自下组：纳米颗粒、微粒、纳米胶囊、微胶囊、脂质体、微球、水凝胶、聚合物、脂质复合物、血清白蛋白、抗体、环糊精和葡聚糖。

11.包含权利要求1-3中任一项所述多肽的医疗装置涂层。

12.用作治疗、预防或诊断剂的权利要求1-3中任一项所述的多肽和/或权利要求4所述的核酸分子。

13.用于治疗微生物、细菌、真菌、病毒和/或寄生虫感染和/或用于治疗由细菌、真菌、病毒和/或寄生虫引起的病症的权利要求10所述的多肽和/或核酸分子。

14.一种治疗被细菌、真菌、病毒和/或寄生虫感染的对象的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的多肽、权利要求4所述的核酸分子或权利要求7-9中任一项所述的药物组合物。

15.一种制备权利要求1-3中任一项所述多肽的方法，所述方法包括：

-提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码权利要求1-3中任一项所述多肽的核酸序列；

-用所述核酸分子转化宿主细胞；

-在允许所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；

-从所述细胞收获所述多肽；

-任选地在N端或C端修饰所述多肽。