CN114848793B - 多肽在抗冠状病毒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽在抗冠状病毒中的用途。本发明要解决的技术问题是提供一种具有广谱抗冠状病毒潜能的药物。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种多肽，或该多肽的衍生物，或该多肽的化学修饰产物在抗冠状病毒中的用途。本发明使用的多肽具有抑制冠状病毒3CLpro蛋白酶活性和抑制冠状病毒S蛋白和细胞受体ACE2的结合的能力，能从阻止病毒入侵细胞以及抑制病毒蛋白酶的活性两个方面发挥抗冠状病毒感染的效果，故在抗冠状病毒感染方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽在抗冠状病毒中的用途。
背景技术
冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales，又称网巢病毒目)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，在自然界广泛存在。冠状病毒直径约80～120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒，主要感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。冠状病毒感染可能引发以下症状(1)呼吸系统感染、(2)肠道感染、(3)神经系统症状，其中呼吸系统感染是主要的致病方式。如禽类冠状病毒如鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)是最主要的是禽传染性支气管炎病毒，对家禽养殖业有较大危害。犬冠状病毒可使犬发生程度不同的胃肠炎症状，特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状，是养犬业的一大传染病病源。
目前发现能够感染人的2019新型冠状病毒(2019-nCoV，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19，Corona Virus Disease 2019，后被命名为SARS-CoV-2)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征，SARS)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征，MERS)。其中，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已在世界范围内爆发，其危害程度也被定义为“大流行”，SARS-CoV-2的防治迫在眉睫。
目前，本领域研究的针对冠状病毒的靶点主要分为两类：一类是和病毒包装和复制有关的靶点。主要是病毒蛋白酶(包括主要蛋白酶蛋白(Mpro,又称为3CLpro))和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro))，它们用于将病毒翻译得到的多蛋白体切割成有活性的单一蛋白，在病毒细胞内复制和包装中发挥重要作用，如之前用于抗HIV的洛匹那韦和利托那韦就以病毒蛋白酶为靶点。而RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)在病毒的遗传物质—RNA的合成过程中起着至关重要的作用，是重要的抗病毒药靶之一，如瑞德西韦(remdesivir)就主要针对RdRp。并且3CLPro在冠状病毒中保守性高,筛选出的3CLPro抑制剂具有广谱抗冠状病毒能力。另一类是抗冠状病毒与宿主细胞结合的靶点，一方面是病毒上的与宿主细胞结合的相关蛋白，如冠状病毒刺突糖蛋白(S蛋白，Spike Protein)；另一方面是由宿主细胞表达的冠状病毒受体，主要是冠状病毒S蛋白相关受体，如血管紧张素转换酶2(ACE2)、跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)。病毒S蛋白与宿主ACE2的相互作用使细胞通过内吞作用将病毒吞入细胞内，而TMPRSS2主要是水解修饰S蛋白以启动其与ACE2结合从而使病毒进入细胞。阿比多尔是一种广谱抗病毒药物，可防止病毒进入宿主细胞，已经显示出治疗流感的功效，目前也成为COVID-19的候选药物；而已知的TMPRSS2抑制剂卡莫他米松也被发现在体外试验中能够阻止SARS-CoV-2进入人体细胞。
目前，无论是在技术上还是市场上，最重要的需求都是开发和生产高特异性、高治愈率的抗冠状病毒药物，尤其是广谱抗冠状病毒药物，并应用于临床治疗。但是，目前尚无明确有效的药物治疗冠状病毒感染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有广谱抗冠状病毒潜能的药物。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种多肽，或该多肽的衍生物，或该多肽的化学修饰产物在抗冠状病毒中的用途。
具体而言，该技术方案为：
多肽，或多肽的衍生物，或多肽的化学修饰产物在如下任一中的应用：
a、制备抗冠状病毒的产品，或抗冠状病毒；
b、制备治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品，或治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；
c、制备能改善由于冠状病毒感染所致症状的产品，或改善由于冠状病毒感染所致症状；
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.4)，或为在其序列基础上进行1、2或3个插入、缺失或者替换突变的多肽。
此外，还提供了多肽、或多肽的衍生物、或多肽的化学修饰产物在如下任一中的应用：
a、制备能抑制冠状病毒的病毒蛋白酶活性的产品，或抑制冠状病毒的病毒蛋白酶活性；
b、制备能抑制冠状病毒的状病毒刺突糖蛋白与宿主细胞表达的冠状病毒受体结合的产品，或抑制冠状病毒的状病毒刺突糖蛋白与宿主细胞表达的冠状病毒受体结合；
c、制备能在细胞水平抗冠状病毒的产品，或在细胞水平抗冠状病毒；
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK，或为在其序列基础上进行1、2或3个插入、缺失或者替换突变的多肽。
进一步的，所述的多肽的氨基酸序列为下表中的任意一条所示：
其中，上述应用中所述多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
进一步的，上述应用中所述多肽VQWRIRVAVIRK在碳端进行酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
其中，上述应用中多肽VQWRIRVAVIRK-NH2的结构为：
其中，上述应用中所述的冠状病毒为能够感染人的冠状病毒。
其中，上述应用中所述的冠状病毒的病毒蛋白酶为主要蛋白酶3CLpro；或者，所述冠状病毒的的宿主细胞表达的冠状病毒受体为血管紧张素转换酶2(ACE2)。
其中，上述应用中所述的冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或MERS-CoV中的至少一种。
其中，上述应用中所述的冠状病毒感染所致疾病为COVID-19、SARS或者MERS中的至少一种。
其中，上述应用中所述的由于冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、胸闷、气促和/或呼吸困难。
其中，上述应用中所述多肽在抗冠状病毒的状病毒刺突糖蛋白与宿主细胞表达的冠状病毒受体结合的浓度为0.2μg/ml-1000μg/ml。
优选的，所述阳离子多肽在抗冠状病毒S-RBD和细胞受体ACE2结合抑制病毒入侵细胞所用浓度可选择为30μg/ml-200μg/ml。
其中，上述应用中所述多肽在抗冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的活性时所用浓度为0.1μg/ml-1000μg/ml。
优选的，所述阳离子多肽在抗冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的活性所用浓度可选择为10μg/ml-200μg/ml。
进一步的，上述应用中所述的产品为药品或消毒用品。进一步的所述的药品的剂型为吸入制剂或注射剂。更进一步的，所述的药品为冠状病毒抑制剂或者为冠状病毒蛋白酶抑制剂。
进一步的上述的产品的剂型为注射剂或吸入制剂。
其中，上述的吸入制剂为气雾剂、喷雾剂、粉雾剂或雾化器用制剂。
进一步的，上述的气雾剂为溶液型气雾剂、乳剂型气雾剂或混悬型气雾剂；
进一步的，上述的喷雾剂为溶液型喷雾剂、乳剂型喷雾剂或混悬型喷雾剂；
进一步的，上述的所述雾化器用制剂为吸入用溶液剂或吸入用混悬剂。
本发明还提供了抗冠状病毒的吸入制剂。该吸入制剂是以多肽，或多肽的衍生物，或多肽的化学修饰产物为主要活性成分制成的吸入制剂；所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK，或为在其序列基础上进行1、2、3或4个插入、缺失或者替换突变的多肽。
进一步的，上述抗冠状病毒的吸入制剂中所述的多肽的氨基酸序列为下表中的任意一条所示：
| 氨基酸序列 | 序列编号 |
| VQWRIRVCVIRA | SEQ ID No.1 |
| VQWRIRIAVIRA | SEQ ID No.2 |
| VQLRIRVCVIRR | SEQ ID No.3 |
| VQWRIRVAVIRK | SEQ ID No.4 |
| VQLRIRVCVIRK | SEQ ID No.5 |
| VQWRIRIAVIRK | SEQ ID No.6 |
| VQWRIRVCVIRR | SEQ ID No.7 |
| VQWRIRICVIRA | SEQ ID No.8 |
| VQWRIRVAVIRA | SEQ ID No.9 |
| VQWRIRIAVIRR | SEQ ID No.10 |
| VQWRIRICVIRR | SEQ ID No.11 |
| VQWRIRVAVIRR | SEQ ID No.12 |
| VQWRIRICVIRK | SEQ ID No.13 |
| VQWRIRVCVIRK | SEQ ID No.14 |
| VQLRIRVAVIRR | SEQ ID No.15 |
| VQLRIRVAVIRK | SEQ ID No.16 |
。
进一步的，上述抗冠状病毒的吸入制剂中所述多肽VQWRIRVAVIRK在碳端进行酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
其中，上述应用中多肽VQWRIRVAVIRK-NH2的结构为：
其中，上述的吸入制剂为气雾剂、喷雾剂、粉雾剂或雾化器用制剂。
进一步的，上述的气雾剂为溶液型气雾剂、乳剂型气雾剂或混悬型气雾剂；
进一步的，上述的喷雾剂为溶液型喷雾剂、乳剂型喷雾剂或混悬型喷雾剂；
进一步的，上述的所述雾化器用制剂为吸入用溶液剂或吸入用混悬剂。
进一步的，上述多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
其中，上述冠状病毒为能够感染人的冠状病毒。
进一步的，上述冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或MERS-CoV中的至少一种。
同时，本发明也提供了上述的抗冠状病毒的吸入制剂在以下至少一方面的应用：
a、制备抗冠状病毒的产品，或抗冠状病毒；
b、制备治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品；或治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病；
c、制备能改善由于冠状病毒感染所致症状的产品；或改善由于冠状病毒感染所致症状；
其中，上述由冠状病毒感染所致疾病为COVID-19、SARS或者MERS中的至少一种。
其中，上述由冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、胸闷、气促或呼吸困难中的至少一种。
本发明的有益效果在于：本发明使用的VQWRIRVAVIRK多肽具有同时抑制冠状病毒3CLpro蛋白酶活性和抑制冠状病毒S蛋白和细胞受体ACE2的结合的能力，能同时从阻止病毒入侵细胞以及抑制病毒蛋白酶的活性两个方面发挥抗冠状病毒感染的效果。此外VQWRIRVAVIRK多肽是已被证实的广谱抗菌肽，能够抵抗临床耐药菌，而一些感染冠状病毒的患者可能并发细菌感染，需要抗病毒药物与抗生素联合治疗，故在抗冠状病毒感染方面还具有特殊的优势。本发明VQWRIRVAVIRK多肽及其衍生物在发挥抗病毒感染的功效时，能制成吸入制剂，制得的吸入制剂能直接达到作用部位，作用快，可减少用药剂量；也可提高患者依从性，可减轻或避免部分药物不良反应，具有很好的应用前景
附图说明
图1.DP7对假病毒感染细胞的抑制作用。(A)DP7对SARS-CoV S假病毒感染细胞的抑制作用；(B)DP7对SARS-CoV-2S假病毒感染细胞的抑制作用。
图2.DP7对冠状病毒S蛋白介导的细胞融合的抑制作用。(A)DP7对SARS-CoV S蛋白介导的细胞融合的抑制作用；(B)DP7对SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞融合的抑制作用。
图3.DP7与蛋白结合动力学的表面等离子体共振传感图。(A)ACE2和DP7结合动力学的表面等离子体共振传感图；(B)SARS-CoV-2S-RBD-Fc和DP7结合动力学的表面等离子体共振传感图。
图4.DP7对SARS-CoV-2 3CLpro的抑制作用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的介绍对本发明进行具体的说明。
计算机辅助药物设计(CADD)作为一种加速药物发现的有效策略，在这一流行病中得到了广泛的关注。可以主要采用“新用途常规药物”方法和生物信息学研究技术，从数据库中筛选出对冠状病毒感染可能有效的药物，然后进行体外实验或临床前实验。
本发明在前期通过计算机模拟筛选验证了具有广谱抗菌活性的多肽VQWRIRVAVIRK(命名为DP7)及其系列多肽，该系列多肽中抗菌效果较优的参见表1。
表1.DP7系列多肽
| 氨基酸序列 | 序列编号 |
| VQWRIRVCVIRA | SEQ ID No.1 |
| VQWRIRIAVIRA | SEQ ID No.2 |
| VQLRIRVCVIRR | SEQ ID No.3 |
| VQWRIRVAVIRK | SEQ ID No.4 |
| VQLRIRVCVIRK | SEQ ID No.5 |
| VQWRIRIAVIRK | SEQ ID No.6 |
| VQWRIRVCVIRR | SEQ ID No.7 |
| VQWRIRICVIRA | SEQ ID No.8 |
| VQWRIRVAVIRA | SEQ ID No.9 |
| VQWRIRIAVIRR | SEQ ID No.10 |
| VQWRIRICVIRR | SEQ ID No.11 |
| VQWRIRVAVIRR | SEQ ID No.12 |
| VQWRIRICVIRK | SEQ ID No.13 |
| VQWRIRVCVIRK | SEQ ID No.14 |
| VQLRIRVAVIRR | SEQ ID No.15 |
| VQLRIRVAVIRK | SEQ ID No.16 |
本发明从直接抗冠状病毒活性和防止冠状病毒与细胞受体结合两个方面进行探索，为该多肽抗冠状病毒感染提供实验依据。首先，通过分子对接和分子动力学模拟实验，评价DP7是否能抑制SARS-CoV-2-3CLpro的活性以及抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2的结合。
一方面的结果表明DP7和ACE2作用残基中的D30和K353也是SARS-CoV-2-S-RBD和ACE2结合的残基。DP7和SARS-CoV-S-RBD作用残基Y436也是SARS-CoV-S-RBD和ACE2作用残基。ACE2和DP7的结合自由能(-115.07±1.68kcal/mol)与ACE2和S蛋白的结合自由能(-119.89±2.28kcal/mol)差异不显著，说明DP7有可能抑制SARS-CoV-S-RBD和SARS-CoV-2-S-RBD与ACE2的结合，具有抗冠状病毒感染的潜力
通过实验进一步验证了DP7与SARS-CoV-2S-RBD、DP7和ACE2的亲和力，并验证DP7是否能抑制SARS-CoV S蛋白、SARS-CoV-2S蛋白和ACE2的结合，以及DP7是否能抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒感染细胞。结果表明，DP7与SARS-CoV-2S-RBD和ACE2的亲和力均达到nM水平；DP7可降低SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒感染细胞的效率，并且能够抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞融合。这些结果表明DP7可用于预防冠状病毒感染。
另一方面计算机模拟验证表明DP7和SARS-COV-2-3CLpro的结合自由能为-100.35±1.57kCal/mol，远低于蛋白酶抑制剂茚地那韦和SARS-CoV-2-3CLpro(-18.03kCal/mol)的结合自由能以及达芦那韦和SARS-COV-2-3CLpro(-22.83kCal/mol)的结合自由能。表明DP7可作为SARS-CoV-2-3CLpro的潜在抑制剂。
在此基础上，本发明进一步的通过实验检测了DP7对SARS-CoV-2-3CLpro的抑制作用，发现了DP7对SARS-CoV-2-3CLpro的酶活有一定的抑制作用。由于3CLpro在冠状病毒中的保守性高，因此筛选出的3CLPro抑制剂具有广谱抗冠状病毒能力，甚至可能用于猪冠状病毒等其他动物的疾病治疗中。并且本发明通过计算机模拟发现DP7可同时抑制SARS-CoV的S蛋白、SARS-CoV-2的S蛋白和ACE2的结合。因此，本领域技术人员有理由相信DP7具有广谱抗冠状病毒的能力。由此可见，本发明出人意料地发现DP7多肽是一种能利用双靶点进行抗病毒的多肽，这在临床应用中可能具有更好前景。
本领域技术人员可以理解的是，DP7系列多肽进行抗冠状病毒及上述相关用途时时，都可能还同时使用药学上可接受的辅助性成分，或者可能于一种或多种其他的抗冠状病毒活性成分配合使用。
这些药学上可接受的辅助性成分可为保护剂、赋型剂、免疫佐剂、分散剂、表面活性剂或细胞培养基中的至少一种。
本领域技术人员可以理解的是，使用DP7系列多肽发挥抗冠状病毒及及上述相关作用时，可以制备成药品使用。从作用靶点上来说，DP7系列多肽可以制备为冠状病毒抑制剂或者为冠状病毒蛋白酶抑制剂。所述药品的剂型可根据具体情况选取，一般为注射剂和吸入制剂。
本领域一般认为，吸入制剂系指通过特定的装置将药物以雾状形式传输至呼吸道和/或肺部以发挥局部或全身作用的制剂。与普通口服制剂相比，吸入制剂的药物可直接达到吸收或作用部位，吸收或作用快，可避免肝脏首过效应、减少用药剂量；而与注射制剂相比，可提高患者依从性，同时可减轻或避免部分药物不良反应。因而近年来越来越为药物研发者所关注。
吸入剂可为经口腔吸入制剂，也可为经鼻吸入的制剂。
由于冠状病毒引起的症状，早期多集中在肺部和呼吸道，因此DP7系列多肽发挥本发明抗冠状病毒及上述相关作用时，可制备为吸入制剂，更有利于发挥其相应的药效。
进一步的，根据处方、制剂工艺和施用方式的不同，可以制备为气雾剂、喷雾剂、粉雾剂或雾化器用制剂。
其中的气雾剂是指将含药溶液、乳状液或混悬液与适宜的抛射剂共同分装于具有特制阀门系统的耐压容器中，使用时借助抛射剂的压力将内容物成雾状喷出，吸入后发挥局部或全身治疗作用。气雾剂一般由药物、辅料、耐压容器、定量阀门系统和喷射装置组成。本发明DP7系列多肽可以制备为溶液型气雾剂、乳剂型气雾剂或混悬型气雾剂。根据处方中辅料的不同，气雾剂的处方大致可分为四种类型：1)药物、抛射剂系统；2)药物、助溶剂、抛射剂系统；3)药物、表面活性剂、抛射剂系统；4)药物、表面活性剂、助溶剂、抛射剂系统。
其中的喷雾剂是指含药溶液、乳状液或混悬液置于特制的装置，使用时借助适当的雾化系统将内容物呈雾状释出，用于患者吸入的制剂。喷雾剂一般由药物、辅料、容器、雾化装置等组成。本发明DP7系列多肽可以制备为溶液型喷雾剂、乳剂型喷雾剂或混悬型喷雾剂。喷雾剂的处方组成与气雾剂比较，除没有抛射剂外，其它组成基本一致。喷雾剂一般由药物、溶剂、助溶剂、表面活性剂组成，有时根据药物理化性质的不同加入稳定剂。如使用防腐剂，应关注其对安全性的影响。
其中的粉雾剂系指将微粉化的药物或/和载体以单剂量或多剂量储库形式，采用特制的干粉吸入装置，由患者主动吸入雾化药物至呼吸道或肺部的制剂，单剂量的粉雾剂多制备为胶囊型和泡囊型。而根据药物与辅料的组成，粉雾剂的处方一般可分为：1)仅含微粉化药物的粉雾剂；2)药物加适量的辅料，如润滑剂和助流剂，以改善粉末之间的流动性；3)一定比例的药物和载体均匀的混合体；4)药物、适当的润滑剂、助流剂以及抗静电剂和载体的均匀混合体。
对于供雾化器用的吸入制剂是指可供连续或定量雾化器产生供吸入用气溶胶的溶液、混悬液和乳液制剂制备为吸入溶液剂或吸入混悬剂，一般为液体制剂，或者在施用前需配制成液体制剂。
本领域技术人员能够在需要抗冠状病毒或发挥上述相关作用时，以DP7系列多肽作为原料药，制备成各种合适的制剂类型。
以下通过实施例对本发明进行更进一步的详细描述。
实施例中主要使用的实验材料和设备如下：
(1)稳定表达重组人ACE2的HEK 239T细胞(ACE2-293T)，购自金唯智生物科技有限公司。使用Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基+10％FBS+1％PS培养。
(2)DMEM培养基、胎牛血清、链霉素和青霉素(PS)均购自Thermo FisherScientific。
(3)DP7多肽(VQWRIRVAVIRK-NH2)由上海吉尔生化合成，纯度大于99％。
(4)BiacoreTM 8K和CM5芯片(GE，USA)。
(5)3CLPro酶活检测试剂盒(novoprotein，china)。
(6)GENios微孔板阅读器(Tecan，Mannedorf，Switzerland)。
(7)96孔黑色微孔板(BMG LABTECH，Ofenburg，Germany)。
实施例1分子对接和分子动力学模拟
实验方法：
将MOE-Dock用于肽DP7与3种蛋白的蛋白肽对接，以及SARS-CoV-2-S蛋白与ACE2的蛋白-蛋白对接，分别预测初始结合位置，为进一步的分子动力学模拟奠定基础。
在蛋白质肽对接中，通过蛋白质构建模块和能量最小化，在MOE中构建了DP7的三维结构。从RCSB蛋白数据库(PDB-ID:6LU7)下载SARS-CoV-2蛋白酶的X射线结构，并利用SARS-CoV-S受体结合区(RBD)和SARS-CoV-2-S-RBD的X射线结构(PDB-ID:2AJF和6LZG)。然后用LigX优化了靶蛋白的质子化状态和水凝胶的取向，在PH值为7、温度为300k的条件下，确定了SARS-CoV-2-蛋白酶的结合位点在配体在原X射线结构中的位置。SARS-CoV-S-RBD和SARS-CoV-2-S-RBD的结合位点是围绕着参与蛋白质相互作用结合的残基位置确定的。对接前，选择AMBER10:EHT的力场和反应场的隐式溶剂化模型(R场)。对接工作流程遵循“诱导配合”方案，在该方案中，受体口袋的侧链可以根据配体构象移动，并对其位置进行限制。用于将侧链原子系在其原始位置的重量为10。配体的结合模式首先通过London dG打分函数进行排序，前30个构象通过进一步优化和GBVI/WSA dG方法对结合自由能再次评价。选择打分最佳(结合自由能最低)的结合模式，进行分子动力学模拟。蛋白质对接以ACE2为靶点，SARS-CoV-S-RBD和SARS-CoV-2-S-RBD为配体。根据ACE2与SARS-CoV-S-RBD(PDB编码：2AJF)和SARS-CoV-2-S-RBD(PDB编码：6LZG)结合的X射线结构选择结合位点和最终结合姿势，获得初始结合构象后进行动力学模拟。
对上述蛋白-多肽，蛋白-蛋白复合物进行动力学模拟。通过添加钠/氯反离子中和每个配合物，并将其溶解在TIP3P水分子的长方体盒中，在盒边缘和溶质表面之间有溶剂层10。所有MD模拟均使用AMBER162进行。采用AMBER-FF14SB力场和SHAKE算法对所有含氢原子的共价键进行时间步长为2fs的限制。采用粒子网格法(PME)处理长程静电相互作用。对于每个溶剂化系统，在加热步骤之前执行两个最小化步骤。在前4000个最小化循环中，所有重原子都受到的限制，而溶剂分子和氢原子可以自由移动。然后进行非约束极小化，包括2000个最速下降极小化周期和2000个共轭梯度极小化周期。之后，利用Langevin dynamics在恒定体积下首先将整个系统在50ps中从0k加热到300k，然后在1atm的恒定压力下平衡400ps。在加热过程中，用/>的弱约束来抑制所有重原子。在1atm和300k的恒压下，采用NPT(恒压、恒压、恒温)系综对整个系统进行了周期性边界动力学模拟。在生产阶段，进行了100ns的模拟。用MM-PBSA法计算了配合物的结合自由能。
实验结果：
(1)ACE2与SARS-CoV-2-S-RBD的相互作用列表如表2所示。分子动力学模拟研究表明，ACE2中的残基D30、Y41、Q42和K553通过盐桥和氢键与SARS-CoV-2-S-RBD中的残基K417、G446、Y449、T500和G502相互作用。
表2.ACE2和SARS-CoV-2-S-RBD的相互作用列表
(2)ACE2和SARS-CoV-S-RBD之间的相互作用位点列于表3。分子对接结果显示，ACE2上的残基D38、Q42、Q325和E329通过盐桥和氢键与SARS-CoV-S-RBD中的残基R426和Y436相互作用。
表3.ACE2与SARS-CoV-S-RBD的作用方式
(3)ACE2与DP7之间的相互作用列表如表4所示。分子动力学模拟研究表明，ACE2中的残基E23、K26、D30、D38、N330、K353、D355和A387通过盐桥和氢键与DP7中的残基W3、R6、A8、R11和K12相互作用。
表4.ACE2和DP7的相互作用列表
(4)SARS-CoV-2-S-RBD与DP7的相互作用列表见表5。分子动力学模拟研究表明，SARS-CoV-2-S-RBD中的残基D405、E406、T415、Q493、S494和Y495通过盐桥和氢键与DP7中的残基W3、R4、I5、R11和K12结合相互作用。
表5.SARS-CoV-2-S-RBD和DP7的相互作用列表
(5)DP7和SARS-CoV-S-RBD的分子对接的相互作用位点如表6所示。预测结果表明，DP7中的残基V1、Q2、R4和K12通过盐桥和氢键与SARS-CoV-S-RBD中的残基Y436、D463、N479、D480和Y481相互作用。
表6.DP7与SARS-CoV-S-RBD的作用方式
(6)SARS-CoV-2-蛋白酶与DP7的相互作用列表见表7。分子动力学模拟研究表明，SARS-CoV-2蛋白酶残基T24、T26、S144和E166通过盐桥和氢键与DP7中的Q2、W3、R6、V9和R11结合。
表7.SARS-CoV-2-蛋白酶与DP7的相互作用列表
从表2-7的结果我们可以得出结论：
Y436是DP7和SARS-CoV-S-RBD作用的残基，也是SARS-CoV-S-RBD和ACE2作用的残基。说明DP7可竞争性与SARS-CoV-S-RBD的Y436残基结合，具有抑制SARS-CoV-S-RBD与ACE2结合的潜在作用。
D30和K353是DP7和ACE2的作用残基，同时也是SARS-CoV-2-S-RBD和ACE2的作用残基。说明DP7可竞争性与ACE2的D30和K353残基结合，具有抑制SARS-CoV-S-RBD与ACE2结合的潜在作用。
(7)经计算，ACE2与DP7的对接得分为-11.62kcal/mol。DP7与SARS-CoV-S-RBD和SARS-CoV-2-S-RBD的对接得分分别为-10.29kcal/mol和-10.43kcal/mol。DP7与蛋白酶的对接得分为-11.96kcal/mol(表8)。
表8.DP7和蛋白质的对接打分
结果表明DP7和ACE2、冠状病毒S蛋白以及冠状病毒主要蛋白酶的结合能力均较强。
(8)用MM-PBSA法计算的四种配合物的结合能(ΔGtotal)如表9所示。VdW和静电相互作用对结合自由能的贡献(ΔGtotal)用ΔEvdw和ΔEelec表示。极性溶剂化能和非极性溶剂化能对ΔGtotal的贡献分别用ΔGpolar和∏Gnonpolar表示。配合物的结合在很大程度上受静电相互作用的控制，其中ΔEelec是最有利的贡献者。ΔGpolar对结合不利，而ΔGnonpolar对结合有利，这导致了整体上有利的结合能。在水环境中，这些配合物(ACE2-DP7、SARS-CoV-2-Protease-DP7、SARS-CoV-2-S-RBD-DP7和SARS-CoV-2-S-RBD-ACE2)的结合自由能分别为-115.07±1.68kcal/mol、-100.35±1.57kcal/mol、-82.27±1.91kcal/mol和-119.89±2.28kcal/mol。
表9.通过MM-PBSA计算得到的配合物的平均结合能及其组分
结果表明：DP7和ACE2结合自由能与SARS-CoV-2-S-RBD和ACE2的结合自由能并无显著差异，说明二者可竞争性结合ACE2。从而说明DP7具有潜在抑制SARS-CoV-2-S-RBD和ACE2结合的能力，可能会有助于抑制病毒感染细胞。
实施例2 DP7抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒入侵细胞实验
在本实施例中考察检测DP7能否降低假病毒入侵细胞的效率。具体步骤如下：
(1)将消化好的ACE2-293T(5×104)细胞铺于96孔板中，37℃培养过夜。
(2)用不同浓度的DP7(0、5、10、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、170、200、400、800μg/ml)和2μl假病毒(MOI＝1)孵育30min，然后加入细胞中，继续培养72h。
(3)倒掉培养液上清，每孔加入30μl PBS，再加入30μl荧光素酶报告基因检测试剂，充分混匀后，吸出50μl加入黑色96孔板中，使用酶标仪检测生物发光。
结果显示：DP7预处理细胞能有效阻断SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒入侵细胞的效率，并且具有浓度依赖性，其IC50分别为104μg/ml和73.625μg/ml(图1A-1B)。
实施例3 DP7抑制冠状病毒S蛋白介导的细胞融合实验
在本实施例中考察检测DP7能否抑制冠状病毒S蛋白介导的细胞融合。具体步骤如下：
(1)将消化好的ACE2-293T(1×105)和293T(1×105)细胞铺于48孔板中，37℃培养过夜。
(2)使用Lipo3000转染试剂按照说明书向ACE2-293T中转染0.5μg/孔的pcDNA3.1-eGFP质粒。使用Lipo3000转染试剂按照说明书向293T中转染0.5μg/孔的pcDNA3.1-SARS-CoV S质粒和pcDNA3.1-SARS-CoV-2S质粒。
(3)24h后，向293T中加入不同浓度的DP7(0、20、50、80、100、120、150、200μg/ml)在37℃预处理细胞30min。
(4)将293T(1×105)消化后加入ACE2-293T-eGFP(1×105)中，继续培养24h。
(5)用荧光显微镜取3个视野对融合的细胞进行计数，然后计算DP7对冠状病毒S蛋白介导的细胞融合的抑制作用。
结果显示：DP7能抑制冠状病毒S蛋白介导的细胞融合，并且具有浓度依赖性。DP7抑制SARA-CoV-S蛋白介导的细胞融合的IC50为68.38μg/ml，DP7抑制SARA-CoV-2-S蛋白介导的细胞融合的IC50为57.6μg/ml，(图2A-2B)。
实施例4基于表面等离子体共振技术的结合分析及动力学研究
实验方法：
为了检测DP7与ACE2和SARS-CoV-2-S RBD的结合，采用了基于SPR技术的BiacoreTM 8K(GE，USA)。在25℃下进行SPR分析，将ACE2-his、SARS-CoV-2-S RBD-Fc和SARS-CoV-2-3CLpro稀释至最终浓度20μg/ml，置于10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中，用标准伯胺偶合法固定在CM5传感器芯片(GE，USA)上。以PBS-P(0.02M磷酸盐，0.137mnacl，27mmkcl，pH 7.4，0.05％P20)为流动缓冲液。用流动缓冲液将DP7稀释至31.25、62.5、125、250、500nm。将不同浓度的DP7通过CM5，流速设定为30μL/min，流速设定为120s，解离时间设定为180s，再经过10mM盐酸甘氨酸，pH1.7，流速设定为30μL/min，流速设定为30s，得到响应值，并利用Bia评价分析软件的1:1结合模型计算动态参数，比较DP7的亲和力。
实验结果
结果显示DP7与SARS-CoV-2S-RBD的亲和力为51.9nM；DP7与ACE2的亲和力为227nM(图3A-3B)。说明DP7和ACE2以及DP7和S蛋白的亲和力很强，能与二者结合。
实施例5 DP7抑制SARS-CoV-2-3CLpro活性实验
本实验考察DP7是否能抑制蛋白酶蛋白SARS-CoV-2-3CLpro的活性。
采用含氟底物Dabcyl-KNSTLQSGLRKE-Edans对SARS-CoV-2-3CLpro的酶活性进行了测定。具体步骤如下：
(1)在室温下用不同浓度的DP7对SARS-CoV-2-3CLpro酶(0.4μM)预培养10min来检测其对SARS-CoV-2-3CLpro活性的抑制作用。
(2)加入10μM的荧光底物(Dabcyl KNSTLQSGLRKE-Edans)来启动反应。
(3)在GENios微孔板阅读器(Tecan，Mannedorf，Switzerland)上连续监测96孔黑色微孔板(BMG LABTECH，Ofenburg，Germany)荧光强度的变化，使用340nm和490nm的波长分别作为激发波长和发射波长。
(4)最后，绘制DP7抑制SARS-CoV-2-3CLpro酶活的曲线。
结果显示：DP7具有一定的抑制SARS-CoV-2-3CLpro酶活的能力(图4)。说明其能够通过抑制SARS-CoV-2-3CLpro的酶活，从而阻断病毒的复制和包装。
实施例6雾化吸入用DP7浓溶液的制备
(1)处方表(1支)
| 成分 | 处方作用 | 用量 |
| DP7 | 活性成分 | 100mg |
| 注射用水 | 溶剂 | 1ml |
(2)工艺
a.将注射用水加至适当容器中，加入DP7，搅拌直至溶解；
b.使用0.45和0.22μm滤膜过滤后保存
(3)使用方法：
DP7吸入制剂可使用喷射雾化器和超声雾化器以及Aeroneb Pro(Aerogen Inc)，eFlow Rapid(PARI GmbH)，I-neb(Philips Respironics)等振动筛雾化器。使用时应使用注射用水稀释至合适浓度，雾化器使用方式具体可参考设备说明书。
在本发明中，通过实验表明了DP7能抑制SARS-CoV-2-3CLpro的活性，也能抑制SARS-CoV-S蛋白和SARS-CoV-2-S蛋白与ACE2的结合，具有利用双靶点抗病毒的能力。而由于DP7本身具有广谱抗菌活性，在一些感染冠状病毒的患者可能并发细菌感染，需要抗病毒药物与抗生素联合治疗时，具有特别的优势。
序列表
<110> 四川大学
<120> 多肽在抗冠状病毒中的用途
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Cys Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Lys
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10
Claims (12)
1.多肽在如下任一项中的应用：
a、制备抗冠状病毒的产品；
b、制备治疗或预防由于冠状病毒感染所致疾病的产品；
c、制备能改善由于冠状病毒感染所致症状的产品；
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK；
所述冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或MERS-CoV中的至少一种。
2.多肽在如下任一项中的应用：
a、制备能抑制冠状病毒的病毒蛋白酶活性的产品；所述冠状病毒的病毒蛋白酶为主要蛋白酶3CLpro；所述冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或MERS-CoV中的至少一种；
b、制备能抑制冠状病毒的冠状病毒刺突糖蛋白与宿主细胞表达的冠状病毒受体结合的产品，所述冠状病毒受体为血管紧张素转换酶2；所述冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或MERS-CoV中的至少一种；
c、制备能在细胞水平抗冠状病毒的产品；所述冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或MERS-CoV中的至少一种；
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的应用，其特征在于：所述多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
4.根据权利要求1～2中任一所述的应用，其特征在于：由于所述冠状病毒感染所致疾病为COVID-19、SARS或者MERS中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述由冠状病毒感染所致症状为发热、咳嗽、胸闷、气促或呼吸困难中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述多肽在抗冠状病毒的冠状病毒刺突糖蛋白与宿主细胞表达的冠状病毒受体结合的浓度为0.2μg/ml-1000μg/ml。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述多肽在抗冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的活性时所用浓度为0.1μg/ml-1000μg/ml。
8.根据权利要求1～2中任一项所述的应用，其特征在于：所述产品为药品或消毒用品。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产品的剂型为注射剂或吸入制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述吸入制剂为气雾剂、喷雾剂、粉雾剂或雾化器用制剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述气雾剂为溶液型、乳剂型或混悬型；或者，所述喷雾剂为溶液型、乳剂型或混悬型。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述雾化器用制剂为吸入用溶液剂或吸入用混悬剂。
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