CN1472336A - Sars冠状病毒3cl蛋白酶三维结构模型与抗sars药物 - Google Patents

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Abstract

通过分子模拟获得SARS－CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构；以此为药物靶标，筛选了现有药物数据库CMC(Comprehensive Medicinal Chemistry，MDL Information System，Inc.)，发现一系列具有SARS－CoV病毒3CL蛋白酶抑制活性的化合物；对其中的肉桂硫胺进行分子和病毒水平测试，发现其具有较好的抑制SARS－CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS－CoV病毒活性；合成了肉桂硫胺类似物，进行了分子和病毒水平测试，发现这类化合物均有抑制SARS－CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS－CoV病毒活性，可用于治疗和/或预防SARS－CoV病毒的感染。

Description

SARS冠状病毒3CL蛋白酶三维结构模型与抗SARS药物
技术领域
本发明涉及用模建药物作用靶标筛选药物，具体涉及用非典型肺炎冠状病毒(SARS-CoV)3CL蛋白酶(3CLPro)三维结构模型作为药物设计靶标，以及在分子和细胞水平筛选药物的方法，还涉及肉桂硫胺衍生物作为SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂和抗SARS-CoV病毒药物用于治疗和/或预防SARS病毒感染。
背景技术
传染性非典型肺炎称为严重急性呼吸综合征(Severe Acute RespiratorySydrome，SARS)。从去年年底今年年初开始，非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome，SARS)病例在我国广东首次发现，随后在香港、越南、加拿大等地爆发，目前已蔓延到33个国家和地区；最近SARS又在内地的北京、山西、内蒙等27省市自治区爆发。SASR病毒是一种传染性强、生存强、致死率高的新型病毒，截至到年5月31日，全球共有8360人感染，死亡人数达764人。非典型肺炎严重影响了人们的日常生活、国家的经济建设。
研究发现，一种新型的冠状病毒极可能是SARS的病因，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸体中都分离出了这种病毒，在一些SARS病人的血清中也发现了抗hMPV的抗体。2003年4月16日，世界卫生组织(WHO)正式确认SARS病毒是传染性非典型肺炎的病因。传染性非典型肺炎病人中90％以上感染SARS病毒的人能够自愈，致死率约为10％左右。SARS病人的呼吸道切片和细胞培养物的电子显微镜照片显示，存在冠状病毒颗粒。这是一种新型的冠状病毒，与冠状病毒属中其他已知的成员不同，该病毒可引起绿猴肾细胞(VERO-E6)发生病变效应。病毒复制能够被SARS感染康复人的血清所抑制，可以利用感染的细胞和康复病人的血清进行免疫荧光检测法(Immunofluorescence assays，IFA)检测培养细胞中细胞感染有SARS病毒的情况，该方法表现出特异性的反应。美国、加拿大和香港的研究表明，非SARS病人的血清不能和新冠状病毒发生反应；传染性肠胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine HepatitisVirus，MHV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)、229E人冠状病毒的超抗血清可以抑制培养的病毒生长。几个实验室对病毒的测序表明，新病毒和冠状病毒属相关，但不同于同属的其它冠状病毒个群，是冠状病毒的一个新的变种。SARS冠状病毒在种属分类上属于正链RNA病毒(ssRNA positivestrand viruses)家系的巢状病毒(Nidovirales)族中的冠状病毒(Coronaviridae)系。它是冠状病毒家族中新出现的一个子类。2003年3月，科学家们发现了导致SARS的元凶SARS冠状病毒(SARS Coronaviruses，SARS-CoV)，并且成功地完成了SARS-CoV基因组的完整测序。SARS-CoV基因组由29727个核苷酸、11个开放阅读框(Opening Reading Frames)组成。它的基因组结构和其他的冠状病毒非常相似。但通过比较遗传史和序列比对表明SARS-CoV的特征和以前发现的冠状病毒的特征并不完全相似，它不仅表现有其他冠状病毒共有的特征，还有SARS-CoV本身特有的特征(Paul A.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe，W.Allan Nix，Ray Campagnoli，et al.Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratorysyndrome.Science(Sciencexpress)1 May，2003；Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell，Robert A.Holt，Angela Brooks-Wilson，et al.Thegenome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science 2003，300：1394-1398)。科学家同时进行了SARS相关的冠状病毒加拿大多伦多(Tor2)分离株29751个碱基的基因组测序。基因组序列揭示这个冠状病毒与已知的冠状病毒(包括人类冠状病毒HcoVOC43，HCoV-229E)无密切相关。预测病毒蛋白的种系分析表明，该冠状病毒与已知的三族冠状病毒均非密切相似。基因组序列将有助于人类了解SARS病毒感染的机制、潜在动物宿主的诊断检测(使用PCR和免疫测试法)，同时也有助于发展抗病毒制剂(包括中和抗体)和找出疫苗抗原决定簇(Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell，Robert A.Holt，Angela Brooks-Wilson，et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science，2003，300：1399-1403)。
基因组测序和生物信息学分析表明，SARS-CoV病毒主要含有以下功能蛋白：聚合酶、穿刺(Spike，S)糖蛋白、小信封(E)蛋白、基质(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白以及类3C(3CL)蛋白酶。理论上这些蛋白质均可以作为抗SARS-CoV病毒药物设计和筛选靶标，但3CL蛋白酶作为靶标进行药物设计和筛选尤其独特的优势：(1)根据其他冠状病毒3CL蛋白酶功能推测，SARS-CoV病毒的3CL蛋白酶在病毒的复制过程中起重要作用；(2)许多现有的针对其他病毒的3CL蛋白酶抑制剂可以直接尝试抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的活性和抗SARS-CoV病毒的测试；(3)3CL蛋白酶非常容易表达，可以在短期内获得蛋白质进行药物筛选，本发明分子水平的筛选模型就是用本发明者表达的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶建立的，蛋白表达方法已另案申请专利；(4)SARS-CoV病毒3CL蛋白酶与人冠状病毒和遗传性肠胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase，Mpro)有较高的序列同源性，可以这两个蛋白酶的晶体结构为模板，建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构，进行抑制剂的设计和虚拟筛选。
因此，本发明的第一个目的是提供SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三维结构模型作为筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的药物作用靶标。
本发明的第二个目的是提供用这种药物作用靶标筛选治疗和/或预防SARS病毒感染药物的方法。
本发明的第三个目的是提供用这种药物作用靶标筛选出的治疗和/或预防SARS病毒感染的药物。
发明概述
本发明建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三维结构作为筛选抗SARS-CoV病毒药物的作用靶标，用计算机虚拟筛选方法从现有药物数据库中发现具有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶活性并具有抗SARS-CoV病毒的药物(化合物)，进行蛋白酶分子的测试和SARS-CoV感染Vero-E6细胞水平的测试，提供治疗和/或预防传染性非典型肺炎药物和药物组合物。
本发明提供的抗SARS-CoV病毒药物作用靶标为SARS冠状病毒3CL蛋白酶，其序列特征为：1        SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR61       KSNHSFIVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG121      SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK181      FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE241      PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC301      SGVTFQ
本发明提供的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂和/或治疗、预防SARS病毒感染药物的筛选方法，包括以下步骤：
1)SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构模建；
2)用分子对接虚拟筛选搜寻现有药物数据库，获得与3CL蛋白酶有较强亲和力的获选化合物；
3)用表面等离子共振(SPR)技术得到3CL蛋白酶与上述获选化合物相互作用的动力学参数；
4)测试获选化合物对SARS-CoV病毒感染细胞的保护作用。
本发明还提供SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为与所述三维结构模型相结合的有机分子化合物或多肽化合物。
本发明提供的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂可用于制备治疗和/或预防SARS病毒感染的药物。
本发明进一步提供通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或其水合物：
Figure A0312907100071
式中
R1为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
R2为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
R3为
Figure A0312907100081
其中n＝1-4，R3和R4为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
X为O、N和S；
Y为O、N、S、亚砜、磺酰基。
通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或水合物可用于制备治疗和/或预防SARS病毒感染的药物。
本发明更进一步提供治疗和/或预防SARS病毒感染的药物组合物，其中包括治疗和/或预防SARS病毒感染有效量的通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或水合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
附图说明
图1(A)显示SARS-CoV 3CL蛋白酶三维结构模型(黄色)与TGEV Mpro蛋白晶体结构(红色)的叠合，图中仅显示了Cα原子，整个结构叠合的RMSD为0.34。图1(B)显示SARS-CoV 3CL蛋白酶蛋白三维结构模型。底物结合在结构域(Domain)I和II间的沟槽内，活性位点位于沟槽的中部，催化残基H41和C145用球棍模型表示。
图2为3CL蛋白酶蛋白底物结合口袋表面图，表面图的颜色是静电势分布，颜色越深，静电势越负。肉桂硫胺(CPK模型表示)契合在结合口袋中。
图3为SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白与肉桂硫胺相互作用动力学测试结果。所用仪器为BIACORE3000，分析软件为Application wizard中KineticAnalysis。测定时3CL蛋白酶蛋白固定在CM5芯片上，肉桂硫胺为流动相，浓度依次为：0 62.5nM、125nM、250nM、500nM、100nM和2000nM。
发明详述
本发明通过分子模拟获得了SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构；根据3CL蛋白酶的三维结构用虚拟筛选方法筛选了现有药物数据库CMC(Comprehensive Medicinal Chemistry，MDL Information System，Inc.)，发现了10个具有SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制活性的化合物；对其中的肉桂硫胺(Cinanserin，2′-(3-dime-thylaminopropylthio)cinnamanilide，2’-(3-二甲基氨基丙基硫代)肉桂酰苯胺)进行了分子和病毒水平测试，发现其有较好的抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性；合成了肉桂硫胺及其类似物，进行了分子和病毒水平测试，发现这类化合物均有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性。
一.用分子模拟和蛋白质同源模建方法建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构模型
序列分析表明，SARS-CoV病毒3CL蛋白酶与遗传性肠胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase，Mpro)有较高的序列同源性，全序列比较，两者序列相似性为大于60％、相同性大于43％、序列间隙小于1％。以Mpro蛋白晶体结构(Anand K，Palm GJ，Mesters JR，Siddell SG，Ziebuhr J，et al.EMBO J 2002，21：3213，PDB号为1LVO)为模板，用同源蛋白模建方法建立了三维结构模型，结构模型及与Mpro蛋白晶体结构比较见图1。在SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三维结构模型中确立了活性中心和活性口袋。
二、虚拟筛选
选择3CL蛋白酶蛋白催化活性残基H41和C145周围6范围内的残基组成底物结合口袋作为虚拟筛选的模型，结合口袋的表面图见图2。用分子对接(Molecular Docking)虚拟筛选(Virtual Screening)方法，搜寻了MDL公司的药物数据库CMC，获得了一批与3CL蛋白酶具有较强亲和力的获选化合物，包括肉桂硫胺(Cinanserin，2′-(3-dimethylaminopropylthio)cinnamanilide，2’-(3-二甲基氨基丙基硫代)肉桂酰苯胺)。肉桂硫胺与3CL蛋白酶蛋白结合方式见图2。
三、分子水平筛选
将构建好的pQE30/SARS 3CL蛋白酶质粒转化于大肠杆菌M15中，以IPTG(浓度0.8mM)诱导，在氨苄西林为抗生素，温度为30℃，表达时间为10小时条件下，表达SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白。以NTA-His柱层析法初步纯化SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白，再利用FPLC-凝胶过滤进一步纯化SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白。
使用表面等离子共振(SPR)技术得到SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白与上述虚拟筛选获得候选物相互作用的动力学参数。肉桂硫胺与3CL蛋白酶蛋白结合的动力学参数为：ka＝3.86×104Ms-1，kd＝9.93×10-3s-1，KD＝2.57×10-6M，表明SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白与肉桂硫胺有较强的结合。测定结果见图3。
四、病毒细胞水平筛选
为了确证肉桂硫胺能否抑制SARS-CoV病毒感染正常细胞，本发明测试了肉桂硫胺抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6细胞的活性。
测试原理：以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及观察感染细胞保护率。
测试方法：把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO2孵箱培养，加入不同稀释浓度的SARS-CoV病毒和肉桂硫胺，观察CPE，并用中性红染色测定OD值，计算样品抗SARS-CoV病毒活性作用。
测试结果：在病毒-细胞水平模型的抗SARS病毒活性实验中，用不同有效浓度的SARS病毒感染Vero-E6细胞，结果列于表1，表明肉桂硫胺时有较明显的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6细胞的保护活性。
表1.不同浓度肉桂硫胺对防止Vero-E6细胞感染SARS-CoV病毒的保护率
       浓度(ug/ml)             CPE                 感染细胞保护率(倍数)
          100                  ——                                             ——*
          20                   +                          3.85
          4                    +                          3.69
细胞病变法(CPE)：以加号表示细胞病变程度，＜25％+，25％～50％++，50％～75+++，＞75％++++。
感染细胞保护率：通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的OD值，计算样品对病毒感染细胞的保护活性，保护率＞1.5倍率，初步被认为样品对病毒感染细胞具有一定的保护活性。
*样品细胞毒性：如果样品的细胞毒性与细胞对照比＞50％时，不做CPE评价和保护率计算。
五、肉桂硫胺及其类似物抗SARS-CoV病毒的新用途
肉桂硫胺是二十世纪六十年代初开发的一个老药，最初发现其为5-羟色胺受体的拮抗剂，用于催眠和延长睡眠时间，并具有镇痛作用(Furgiuele A R，High J P，Horovitz Z P.Arch.Int.Pharmacodyn.Ther，1965，155：225-235；Krapcho J，Rubin B，et al.J.Med.Chem.1963，6：219；Rubin B，Piala JJ，et al.Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.1964，152：132)；后发现肉桂硫胺及其类似物具有免疫抑制作用(Krapcho J，Millonig RC，et al.J.Med.Chem.969，12：164)；后又发现这类化合物具有抗炎作用(Millonig RC，Amrein BJ，et al.J.Med.Chem.1974，17：772)；肉桂硫胺也曾作用抗慢性精神分裂症药物用于临床研究(Holden JMC，Itil T.et al.J.Clin.Pharmacol.New Drugs 1971，11：220；Itil TM，Polvan N，Holden JM.Dis.Nerv.Syst.197 132：193；Gallant DM，Bishop MP.Curr.Ther.Res.Clin.Exp.1968 10：461)，90年代肉桂硫胺又被开发成为治疗心肌缺血症(myocardial ischemia)药物(EP0596449)。然而，肉桂硫胺及其类似物抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶及抗SARS-CoV病毒的活性却未见报道。
本发明涉及肉桂硫胺抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白酶催化活性，并具有抗SARS-CoV病毒活性的新用途。根据SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白三维结构模型，用虚拟筛选筛选方法筛选出能抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白催化活性的化合物肉桂硫胺，并合成了具有通式I的肉桂硫胺及其类似物，经SPR分子水平的活性测试和抑制Vero-E6细胞感染病毒活性测试，发现通式I所示肉桂硫胺及其类似物可以特异性地与3CL蛋白酶蛋白结合，并具有较明显的抑制SARS病毒感染Vero-E6细胞的保护活性，具有用于治疗和/或预防SARS-CoV病毒感染的新用途。
通式I所示肉桂硫胺衍生物或其药学上可接受的盐或水合物中各取代基的定义如下：
Figure A0312907100121
式中
R1为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
R2为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
R3为
Figure A0312907100122
其中n＝1-4，R3和R4为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
X为O、N和S；
Y为O、N、S、亚砜、磺酰基。
本说明书中所述的“可药用盐”具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。
本发明通式I化合物或其药用盐或水合物中优选的化合物为：肉桂硫胺(化学名为2’-(3-二甲基氨基丙基硫代)肉桂酰苯胺)，英文名为Cinanserin(2′-(3-dimethylaminopropylthio)cinnamanilide)。
本发明另一方面还涉及治疗和/或预防SARS病毒感染的药物组合物，其中包括治疗和/或预防SARS病毒感染有效量的通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或水合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
这里的药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。
本发明还涉及通式I所示化合物或包括通式I所示化合物或者其药用盐或其水合物的药物组合物在制备预防和/或治疗传染性非典型性肺炎(SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS)药物上的新用途。
所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。所述这些剂型可以下面方式之一施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中预防SARS病毒感染时优选口服或肌肉注射，治疗SARS病毒感染时优选腹膜内或静脉内给药方式。
另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的判断。
本发明涉及的阻断SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白的抑制剂阻断SARS病毒的复制、转录、翻译和组装，阻断病毒的成熟化和病毒颗粒的形成，3CL蛋白酶蛋白抑制剂阻断SARS-CoV病毒感染不会对感染SARS病毒的人或动物正常的生理过程产生不良影响，可以用于治疗和/或预防SARS病毒感染的医药用途。
优选实施方案
下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
实施例1：SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三维结构模建
对比的序列源自美国国家生物信息中心NCBI，它们分别来自不同地区的SARS病例标本，包括NCBI登录号为gi|30275668(BJ01)、gi|30027618(Vietnam)、gi|29836495(Tor2)、gi|30023962(CUHKW1)、gi|29837498(GZ01)、gi|30275667(BJ02)、gi|30023953(HKu-39849)、gi|30124074(Canada)、gi|30173234(BJ03)。采用ClustalX(1.8版)的方法进行多重序列对比，结果表明所有已测序的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白序列相同。
和遗传性肠胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase，Mpro)有较高的序列同源性，全序列比较，两者序列相似性为大于60％、相同性大于43％、序列间隙小于1％。以Mpro蛋白晶体结构(Anand K，Palm GJ，Mesters JR，Siddell SG，Ziebuhr J，et al.EMBO J 2002，21：3213，PDB号为1LVO)为模板，用同源蛋白模建方法建立了三维结构模型。三维结构模建采用InsightII的MODELLER软件，并用3D-Profile和Prostat软件评价结构模型的质量。获得复合物的初始结构，再用分子力学进行优化，采用的力场参数到Amber力场和Kollman-all-atom电荷。，结构模型及与Mpro蛋白晶体结构比较见图1。
实施例2：SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂虚拟筛选
用分子对接方法DOCK程序对MDL公司的现有药物数据库CMC，共含有8474个已知药物的信息。分子对接时考虑了小分子化合物的柔性，根据打分的高低从上述数据库中先挑选10个候选物，用AutoDock的打分函数和Cscore打分函数对候选物进行进一步的评价，最后挑选了肉桂硫胺进行分子水平的筛选。
实施例3：肉桂硫胺结合SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白动力学测试
通过虚拟筛选和分子水平测试，潜在的3CL蛋白酶蛋白酶抑制剂肉桂硫胺，本实施例肉桂硫胺来说明抑制剂与3CL蛋白酶蛋白酶结合动力学测试过程。将3CL蛋白酶蛋白固定在CM5芯片上，肉桂硫胺为流动相。用BIACORE3000测定肉桂硫胺蛋白与3CL蛋白酶蛋白的动力学行为，3CL蛋白酶蛋白的浓度依次为：62.5nM、125nM、250nM、500nM、100nM、和2000nM。用ApplicationWizard/Kinetic Analysis软件分析数据(图2)，获得上述两蛋白见的结合动力学参数为：ka＝3.86×104Ms-1，kd＝9.93×10-3s-1，KD＝2.57×10-7M。
实施例4：肉桂硫胺保护Veto-E6感染SARS-CoV病毒测试
以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，测试样品对病毒感染细胞的保护作用，检测指标为细胞变性反应(CPE)以及感染细胞保护率。
把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置37℃，5％CO2孵箱培养，分别加入SARS病毒和不同稀释浓度的肉桂硫胺，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录CPE，并用中性红染色测定OD值，参照对照进行样品抗SARS病毒活性作用的计算和评价。测试结果见表1。
实施例5：2-(3-二甲基胺基丙基硫代)苯胺的合成
将溶于500毫升异丙醇中的54.0克(1.0摩尔)甲醇钠，加入溶于1000毫升异丙醇的62.5克(0.5摩尔)的2-氨基硫苯酚的混合液中。室温搅拌30分钟，然后加入79.0克(0.5摩尔)的3-二甲基胺基丙基氯盐酸盐的300毫升甲苯溶液，混合液回流6小时。真空泵蒸去溶剂，加入60毫升水，用乙醚(150ml×2)萃取两次。合并有机相，无水硫酸镁干燥。旋转蒸发蒸去溶剂。用硅胶板快速分离，展开剂为乙酸乙脂(1)：石油醚(4)/二氯甲烷(10)：甲醇(1)得油状物80.0g(76％)。
实施例6：2-(3-二甲基胺基丙基硫代)肉桂酰苯胺的合成
将溶于10毫升氯仿的5.2克(0.025摩尔)的2-(3-二甲基胺基丙基硫代)苯胺，在15-20℃，约20分钟，搅拌滴加到的4.1克(0.025摩尔)的肉桂酰氯的30毫升氯仿溶液中。混合物回流1小时，减压移去溶剂得粘稠物，用丙酮热溶，置冷，抽滤得无色固体7.5克(88％)，m.p.109-111℃。用异丙醇再次重结晶，产物熔点为142-144℃。

Claims (9)

1、抗SARS-CoV病毒药物作用靶标，所述药物作用靶标为SARS冠状病毒3CL蛋白酶，其序列特征为：1      SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR61     KSNHSFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG121    SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK181    FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE241    PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC301    SGVTFQ
2、SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂和/或治疗、预防SARS病毒感染药物的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
1)建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三维结构模型；
2)用分子对接虚拟筛选搜寻现有药物数据库，获得与3CL蛋白酶有较强亲和力的获选化合物；
3)用表面等离子共振(SPR)技术得到3CL蛋白酶与上述获选化合物相互作用的动力学参数；
4)测试获选化合物对SARS-CoV病毒感染细胞的保护作用。
3、SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为与权利要求2中所述三维结构模型相结合的有机分子化合物或多肽化合物。
4、权利要求3所述SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制剂在制备治疗和/或预防SARS病毒感染药物上的用途。
5、通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或其水合物
Figure A0312907100021
式中
R1为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
R2为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
R3为
其中n＝1-4，R3和R4为H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羟基、卤素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基；
X为O、N和S；
Y为O、N、S、亚砜、磺酰基。
6、如权利要求5所述的肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或水合物，其为肉桂硫胺。
7、通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或其水合物在制备治疗和/或预防SARS病毒感染药物上的用途。
8、治疗和/或预防SARS病毒感染的药物组合物，其中包括治疗和/或预防SARS病毒感染有效量的通式I所示肉桂硫胺及其类似物或其可用药盐或水合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
9、权利要求8所述药物组合物制备治疗和/或预防SARS病毒感染药物上的用途。
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