CN113350330B - 杨梅素类化合物在制备防治新冠肺炎药物中的应用 - Google Patents

杨梅素类化合物在制备防治新冠肺炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及杨梅素类化合物在制备防治新冠肺炎药物中的应用。具体而言，本发明涉及杨梅素类化合物及其药物组合物作为2019新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)3CL蛋白酶抑制剂在制备治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒感染引起的呼吸道感染、肺炎等相关疾病的药物中的用途。

Description

杨梅素类化合物在制备防治新冠肺炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地涉及杨梅素类化合物在制备防治新冠肺炎药物 中的应用。
背景技术
在急性传染病中，绝大部分都是病毒性传染病，病毒性传染病的发病率高，死 亡率也很高。由于检测和诊断手段有限，导致新病毒引发的新疫情爆发往往具有突 发性、随机性和不可预测性等特点，一旦爆发，如无有效的防治手段，极易造成大 规模流行，严重威胁人民健康生命安全。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可引起严重肺炎。SARS-CoV-2病毒传播途径 未完全掌握，已知能通过飞沫和接触传播，且存在人传人、医务人员感染，一定社 区传播风险，且病毒存在变异的可能。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异的 预防和治疗方法。
SARS-CoV-2冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为具有包膜的单链正义RNA 病毒。和其他已知冠状病毒类似，SARS-CoV-2冠状病毒也经过吸附、穿入、脱壳、 生物合成、子代病毒的组装与释放等几个过程完成子代病毒的增殖。SARS-CoV-2 冠状病毒感染宿主细胞起始于病毒包膜表面的刺突糖蛋白与宿主细胞表面的受体 结合，随后发生膜融合，病毒进入宿主细胞，在细胞溶酶体等细胞器作用下，释放 出病毒的遗传物质单链正义RNA，在宿主细胞的线粒体、核糖体等蛋白质合成元件 以及必须的原料等作用下，翻译产生多聚蛋白，之后，SARS-CoV-2冠状病毒的两 大必需半胱氨酸蛋白酶：木瓜样蛋白酶(papain-likeprotease,PLpro)和3C样蛋白 酶(3C-like protease,3CLpro)在特定位点切割加工多聚蛋白前体，产生多个对病毒 生命周期非常重要的非结构蛋白。在这些非结构蛋白的作用下，病毒RNA复制出子 代病毒核酸物质，并大量翻译出所需的结构蛋白，完成子代病毒的组装和释放。 SARS-CoV-2冠状病毒感染细胞的生命周期的任何环节或关键酶均可以作为抗病毒药物的研究靶点，如水解切割多聚蛋白前体的半胱氨酸蛋白酶PLpro和3CLpro，负责 完成子代病毒遗传物质复制的RNA聚合酶等。
3CL蛋白酶(3chymotrypsin-like protease,3CLpro)，又称主蛋白酶(Mpro)，是 冠状病毒RNA翻译出多聚蛋白pp1a和pp1ab后水解产生多个非结构蛋白过程中的 关键蛋白酶，对病毒的复制和感染至关重要，抑制3CL蛋白酶的催化功能可有效抑 制病毒多聚蛋白前体的切割，阻断病毒复制，抑制子代病毒生成。3CLpro属于半胱 氨酸蛋白酶，是催化单正链RNA病毒前体蛋白水解的关键蛋白酶，对SARS-CoV-2 等冠状病毒的复制活性具有重要的作用。因此，3CLpro是目前公认的研发抗冠状病 毒药物的理想靶点。
目前，针对SARS-CoV-2冠状病毒导致的严重肺炎疾病尚无特效的疫苗和抗病 毒药物。这些感染性疾病严重影响了人们的生命健康，研发效果好的抗病毒药物迫 在眉睫。针对SARS-CoV-2冠状病毒3CLpro开发出低毒高效的抗病毒药物，以满足 国内外SARS-CoV-2冠状病毒感染患者的临床需求，具有重大的社会意义。
综上所述，本领域迫切需要开发针对SARS-CoV-2冠状病毒3CL蛋白酶的抑制 剂用于治疗新型冠状病毒感染引起的肺炎。
发明内容
本发明的目的是提供一种可有效抑制冠状病毒3CL蛋白酶的活性成分及其在 抑制冠状病毒方面的新用途。
具体地，本发明提供了式I所示的杨梅素类化合物及其组合物在抗冠状病毒 尤其是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中的用途。
在本发明第一方面，提供了一种活性成分或含所述活性成分的制剂的用途(或 制药用途)，所述的活性成分为式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002403222580000021
式中，
每个R各自独立地为H、C1-C3烷基、或乙酰基；
Figure BDA0002403222580000022
为双键或单键；
并且，所述的活性成分或含所述活性成分的制剂被用于制备(a)抑制2019新型 冠状病毒(SARS-CoV-2)3CL蛋白酶的抑制剂；和/或(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述由2019新型冠状病毒感染引起的相关疾病选自下组： 呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
在另一优选例中，所述的活性成分选自下组：
(Z1)杨梅素、或其药学上可接受的盐
(Z2)二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐
(Z3)3-O-乙酰二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z4)上述Z1～Z3的任意组合。
在另一优选例中，所述的活性成分选自下组：杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰 二氢杨梅素。
在另一优选例中，所述的药物还包括选自下组的额外组分：抗逆传录病毒 的药物或增强免疫力的药物。
在另一优选例中，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。
在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊 剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(a1)第一活性成分，所述的第一活性成分为式I所示的杨梅素类化合物或其药 学上可接受的盐：
Figure BDA0002403222580000031
式中，
每个R各自独立地为H、C1-C3烷基、或乙酰基；
Figure BDA0002403222580000032
为双键或单键；
(a2)任选的第二活性成分，所述的第二活性成分选自下组：(Y1)RNA复制酶 抑制剂(如Remdesivir(瑞德西韦或GS-5734))；(Y2)洛匹那韦(Lopinavir)；(Y3) 利托那韦(Ritonavir)；(Y4)法匹拉韦；(Y5)氯喹(Chloroquine,Sigma-C6628)、 羟氯喹、或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)、(Y6)上述Y1～Y5的任意组合；
以及(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，每个R各自独立地为H、或乙酰基；
在另一优选例中，R为H。
在另一优选例中，所述的第一活性成分选自下组：
(Z1)杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z2)二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z3)3-O-乙酰二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z4)上述Z1～Z3的任意组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物为用于抑制2019新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)3CL蛋白酶的药物组合物。
在本发明的第三方面，提供了本发明第二方面中所述的药物组合物的用途，它 被用于制备(a)抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CL蛋白酶的抑制剂；和/ 或(b)治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的相关疾 病的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CL 蛋白酶的方法，包括步骤：将第一活性成分或含所述第一活性成分的制剂与2019 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的3CL蛋白酶接触，从而抑制所述3CL蛋白酶的活性；
其中，所述的第一活性成分为式I化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002403222580000041
式中，
每个R各自独立地为H、C1-C3烷基、或乙酰基；
Figure BDA0002403222580000042
为双键或单键；
在另一优选例中，所述的第一活性成分为选自下组的杨梅素类化合物：
(Z1)杨梅素、或其药学上可接受的盐
(Z2)二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐
(Z3)3-O-乙酰二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z4)上述Z1～Z3的任意组合。
在另一优选例中，所述的方法中与2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的3CL蛋 白酶接触的式I化合物或其药学上可接受的盐的浓度为0.5-20μM，较佳地为1-10 μM。
在另一优选例中，所述方法是体外方法。
在另一优选例中，所述方法是非治疗性和非诊断性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了杨梅素对SARS-CoV-2蛋白酶的抑制曲线。
图2显示了二氢杨梅素对SARS-CoV-2蛋白酶的抑制曲线。
图3显示了3-O-乙酰二氢杨梅素对SARS-CoV-2蛋白酶的抑制曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一类可 有效抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等冠状病毒的3CL蛋白酶的活性成分。 实验表明，本发明的活性成分(以杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素为代 表的式I化合物或其药学上可接受的盐)可高效地抑制2019新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)等冠状病毒的3CL蛋白酶的活性，从而抑制SARS-CoV-2冠状病毒的 复制和活力。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明揭示了杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素及其组合 物在抗冠状病毒的用途，尤其是在抗SARS-CoV-2病毒治疗中的用途。杨梅素、二 氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素及其组合物对冠状病毒复制必不可少且高度保守的 3CL水解酶具有优良的抑制作用，具有良好的临床应用前景。
术语
如本文所用，“本发明的活性化合物”、“本发明的活性成分”、“本发明 的抑制3CL蛋白酶的活性化合物”可互换使用，指具有优异的3CL蛋白酶抑制活性 的杨梅素类化合物，包括式I所示的化合物，例如杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰 二氢杨梅素或其药学上可接受的盐、或其组合。
如本文所用，“本发明的制剂”指含有本发明活性化合物的制剂。
如本文所用，术语“包括”或其变换形式如“包含”或“包括有”等等，被 理解为包括所述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
如本文所用，术语“新型冠状病毒”、“2019-nCov”或“SARS-CoV-2”可 互换使用，该2019新型冠状病毒是已知感染人的第7种冠状病毒，并且造成 新冠肺炎(COVID-19)，是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。
冠状病毒和3CL蛋白酶
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四 属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状 病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属 冠状病毒。SARS-CoV-2也被称为2019-nCov。
2003年和2012年分别爆发的高致病性冠状病毒“非典”SARS-CoV和“中 东呼吸综合征”MERS-CoV均属于β属冠状病毒。2019年年底爆发的新型冠状 病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性， 也属于β属冠状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一， 编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制 的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白 (Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和 解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
3CL蛋白酶(3Chymotrypsin-like protease,3CLpro)是冠状病毒中负责 切割前体蛋白的主蛋白酶(所以又称为Mpro)，对病毒的复制不可或缺。
3CLpro属于半胱氨酸水解酶，在各类冠状病毒中高度保守，与小RNA病毒 中的3C蛋白酶也比较相似，而人体中却没有与其相似的蛋白酶，因而是研发 广谱抗单正链RNA病毒药物的理想靶点。
本发明的活性化合物和活性成分
在本发明中，提供了一种可有效抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等冠状 病毒复制的活性成分。该活性成分选自下组：杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢 杨梅素、或其药学上可接受的盐、或其组合、或其晶体、或其溶剂化物。
杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素的结构式如下：
Figure BDA0002403222580000071
试验表明，本发明的活性成分可有效地抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 的3CL蛋白酶，从而抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的复制，进而预防、治 疗和/或缓解SARS-CoV-2相关疾病。
如本文所用，“本发明的活性化合物”、“本发明的抑制3CL蛋白酶的活性 化合物”可互换使用，指具有优异的3CL蛋白酶抑制活性的化合物，包括杨梅素、 二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐、或其晶体、或其溶剂 化物。
应理解，本发明的活性成分包括本发明的抑制3CL蛋白酶的活性化合物、或 其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体、或其前药。应理解， 本发明的活性成分还包括本发明的活性化合物的晶型、无定形化合物、以及氘代化 合物等形式。
所述“药学上可接受的盐”为本发明的活性化合物与无机酸或有机酸反应形 成常规的无毒盐。例如，常规的无毒盐可通过本发明的活性化合物与无机酸或有机 酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，所 述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺 酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙 酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、 谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者本发明 的活性化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、 酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者本发明的活性化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐 酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、 苦味酸、甲磺酸或乙磺酸形成的对应的有机酸盐。
此外，本发明的活性成分还特别适合与其他抗病毒的药物联用。代表性的 其他的抗病毒药物包括(但并不限于)：逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、辅助 受体拮抗剂、逆转录病毒整合酶抑制剂、病毒吸附抑制剂、特异性病毒转录抑 制剂、抗体、或其组合。
本发明的活性成分可抑制SARS-CoV-2等新型冠状病毒的感染活性。因此， 当在治疗上施用或给予本发明的的活性成分时，可抑制3CL蛋白酶活性，从而 抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的感染，进而达到抗病毒作用。
药物组合物和应用
本发明还提供了以本发明的抑制3CL蛋白酶的活性化合物、或其药学上可接 受的盐、或其前药、或其提取物、或其药材中的一种或多种的混合物为有效成分在 制备治疗和/或预防、缓解由2019新型冠状病毒感染引起的呼吸道感染、肺炎等相 关疾病的药物中的用途。
本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.001-99wt％的活性成份，优选的比例是本发明的活性化合物作为活性成分占总重量的0.1wt％～90wt％或1wt％～50wt％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、 糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释 液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制 剂配方的单位计量中通常包含0.05-400mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配 方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以 通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为 0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何 种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始， 逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、 滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、 静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明活性化合物可高效地抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶，IC50值小于2μM， 最优的杨梅素的IC50值为约0.64μM
(b)本发明活性化合物的毒副作用低，成药性好。这提示着本发明的杨梅素类 化合物在抗新冠肺炎领域有很好的药用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份 数按重量计算。
实施例1：杨梅素类化合物针对SARS-CoV-2Mpro蛋白酶的实验测试
1.1.方法
在本实施例中，测定不同的化合物对SARS-CoV-2Mpro蛋白酶(SARS-CoV-2 3CLpro)的抑制活性，方法为：利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transferFRET)技术测定针对3CL蛋白酶的抑制剂的酶水 平抑制活性。整个酶促反应体系的体积为120μL，蛋白酶的终浓度为30nM， 底物终浓度为20μM。反应体系的缓冲液包括50mM TrispH7.3、1mM EDTA。 在96孔板中加入2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的3CL蛋白酶和不同浓度的 测试化合物，30℃孵育10min，加入底物并迅速放入酶标仪中读数。激发光和 发射光分别为320nm和405nm。测试时间为10min，每隔30s读一次荧光 值，拟合出反应速率，并与对照组(DMSO)比较，计算抑制率和IC50值。
1.2结果
如图1、图2、图3以及表1所示，杨梅素抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 的3CL蛋白酶活活性的IC50值为0.64μM，二氢杨梅素抑制新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的3CL蛋白酶活活性的IC50值为1μM，3-O-乙酰二氢杨梅素抑 制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的3CL蛋白酶活活性的IC50值为1.72μM。
由此可见以杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素为代表的杨梅素类 化合能有效抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的3CL蛋白酶活性，从而有效帮助 预防和/或治疗新型冠状病毒引起的疾病。
表1.杨梅素类化合物对SARS-CoV-2蛋白酶的抑制活性
Figure BDA0002403222580000101
讨论
在本发明之前，杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素或其药学上可 接受的盐对2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CL水解酶的抑制作用尚未见报 道。
在本发明中，本发明人首次公开了杨梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨 梅素或其药学上可接受的盐对SARS-CoV-2的3CLpro具有显著的抑制作用， IC50达到个位数微摩尔级别，尤其是杨梅素的IC50仅为0.640μM。因此，杨 梅素、二氢杨梅素、3-O-乙酰二氢杨梅素或其药学上可接受的盐具有优异的抗 2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)活性，具有良好的临床应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权 利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种药物组合物用于制备抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 3CL蛋白酶抑制剂的用途，其特征在于，所述药物组合物选自下组：
(Z1) 杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z2) 二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z3) 3-O-乙酰二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z4) 上述Z1～Z3的任意组合。
2.一种体外非治疗性和非诊断性抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CL蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将活性成分与2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的3CL蛋白酶接触，从而抑制所述3CL蛋白酶的活性；
其中，所述的活性成分选自下组：
(Z1) 杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z2) 二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z3) 3-O-乙酰二氢杨梅素、或其药学上可接受的盐；
(Z4) 上述Z1～Z3的任意组合。
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