CN115715778B

CN115715778B - 一种木蝴蝶苷a的应用

Info

Publication number: CN115715778B
Application number: CN202210951305.5A
Authority: CN
Inventors: 吴丽莎; 李银塔; 杨青; 王金梅; 位正鹏; 毕迎斌; 沈源庆; 殷诗强
Original assignee: Rongcheng Taixiang Food Products Co ltd
Current assignee: Rongcheng Taixiang Food Products Co ltd
Priority date: 2022-08-09
Filing date: 2022-08-09
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2042-08-09
Also published as: CN115715778A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种木蝴蝶苷A的应用。本发明通过研究首次发现并证实，木蝴蝶苷A能够有效抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶(3C‑like protease，3CLP)的活性，从而抑制病毒复制，进而达到预防和治疗新型冠状病毒感染的作用，因此能够用于制备预防及治疗新型冠状病毒的相关药物，从而具有良好的实际应用之价值。

Description

一种木蝴蝶苷A的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种木蝴蝶苷A的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

病毒是一种具有高度传染性的病原体，严重危害人类健康。据不完全统计，约75％流行性传染病是由病毒感染引起的。近年来，病毒基因组变异以及新病毒毒株的出现，频频引起传染病的大流行：如2003年SARS-CoV、2009年H1N1、2012年MERS-CoV、2013年H7N9、以及2019年底爆发的SARS-CoV-2等。目前抗病毒药物种类有限且有一定毒副作用，随着新型变异毒株及耐药毒株的出现，高效低毒、抗耐性的抗病毒药物的研究迫在眉睫。

中药和天然药物具有多组分、多途径、多靶点作用的特点，在抗病毒方面具有独特优势，不易产生耐药性。黄酮是多种中药和天然药物的活性成分之一，具有抗炎、抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节等多种活性。目前已有大量研究表明，黄酮类化合物具有抗多种病毒的作用，包括流感病毒、乙肝病毒、柯萨奇病毒等，并且效果显著。

木蝴蝶苷A是来源于传统中草药紫薇科木蝴蝶属植物木蝴蝶，临床上可用于急慢性支气管炎、咳嗽、肺结核、扁桃体炎、咽喉肿痛等。己有的研究结果表明，木蝴蝶苷A有效的药理学作用包括了抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒等，同样也可以用于治疗咳嗽、咽炎、百日咳、支气管炎和其他疾病。有研究表明木蝴蝶苷A可以抑制乳腺癌细胞的生长，能够抑制食管鳞癌的增殖和生长，对肺腺癌也有一定的抑制作用，在糖尿病模型研究中也有一定的作用。发明人发现，现有技术中还没有将木蝴蝶苷A用于抗新型冠状病毒的报道。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种木蝴蝶苷A的应用。本发明通过研究首次发现并证实，木蝴蝶苷A能够有效抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶(3C-like protease，3CLP)的活性，能够用于制备预防及治疗新型冠状病毒的相关药物。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供木蝴蝶苷A在制备抗新型冠状病毒产品中的应用。并因此，木蝴蝶苷A在对于预防和/或治疗与新型冠状病毒相关的疾病是有效的。

所述与新型冠状病毒相关的疾病包括新型冠状病毒肺炎。

所述抗新型冠状病毒至少包括：

(a1)抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶的活性；

(a2)抑制新型冠状病毒复制。

所述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用，从而可用于构建相关细胞或动物模型。

本发明中，所述木蝴蝶苷A可通过市售方式购得，也可以采用如下方法进行制备得到：

将黄芩苷悬浮于无水甲醇，加入浓硫酸后加热搅拌反应，自然冷却至室温后，加入硼氢化钠，加毕继续搅拌反应，向反应体系中加入乙酸溶液并采用乙酸乙酯进行萃取，有机相减压浓缩得粗品，将所得粗品悬浮于乙酸乙酯，加热回流后，自然冷却，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥即得。

本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物由木蝴蝶苷A与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

所述其它药物活性成分包括具有抗新冠病毒的物质。

所述非药物活性成分包括药学上可接受的辅料。

本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：

(b1)制备抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶活性的产品；

(b2)制备抑制新型冠状病毒复制的产品；

(b3)制备预防和/或治疗与新型冠状病毒相关的疾病的产品。

与新型冠状病毒相关的疾病包括新型冠状病毒肺炎。

本发明的第四个方面，提供一种用于预防和/或治疗与新冠病毒相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用上述木蝴蝶苷A或上述组合物。

与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：

上述技术方案首次发现化合物木蝴蝶苷A的新用途，木蝴蝶苷A在酶水平能够明显抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶活性，从而抑制病毒复制，进而达到预防和治疗新型冠状病毒感染的作用，因此具有重要的临床意义和社会效益。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1制备的木蝴蝶苷A¹H-NMR谱图；

图2为本发明实施例1制备的木蝴蝶苷A¹³C-NMR谱图；

图3为本发明实施例1制备的木蝴蝶苷A对新型冠状病毒3CLPro的IC₅₀值拟合图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

多聚蛋白(polyproteins，PP)pp1a和pp1b对于维持冠状病毒RNA的合成至关重要，而多聚蛋白的成熟需要经历一系列裂解过程，才能生成多亚基蛋白质复合物(被称为“病毒复制转录酶”)。多亚基蛋白质复合物的主要蛋白酶(main protease，Mpro)为3C样蛋白酶(3C-like protease，3CLP)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(papain-like cysteine protease，PLP)，3CLP和PLP高度协调催化多聚蛋白的裂解，3CLP和PLP活性缺失会导致冠状病毒生命周期停止。

新型冠状病毒进入细胞依靠刺突蛋白spike识别受体ACE2，两种参与新型冠状病毒蛋白酶解过程的关键蛋白酶分别为3C样蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶。因此针对3C样蛋白酶为靶点的小分子抑制剂可应用于制备预防和治疗新型冠状病毒感染的药物。

在本发明中，所述木蝴蝶苷A能够抑制新型冠状病毒的3CLP活性，从而抑制新型冠状病毒的活性和增殖，缓解感染的宿主细胞内免疫失衡。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供木蝴蝶苷A在制备抗新型冠状病毒产品中的应用。并因此，木蝴蝶苷A在对于预防和/或治疗与新型冠状病毒相关的疾病是有效的。

其中，与新型冠状病毒相关的疾病包括新型冠状病毒肺炎。

所述抗新型冠状病毒至少包括：

(a1)抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶的活性；

(a2)抑制新型冠状病毒复制。

所述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用，从而可用于构建相关体外细胞或动物模型。

其中，所述黄芩苷、浓硫酸和硼氢化钠的摩尔体积比为20-30mmol：0.1-0.3mL：220-240mmol，优选为22.4mmol：0.2mL：224mmol。

所述乙酸溶液为5-15％(优选为10％)乙酸溶液；

加热回流提取时间为10-60分钟，优选为30分钟。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物由木蝴蝶苷A与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

本发明的又一具体实施方式中，所述其它药物活性成分包括具有抗新冠病毒的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述非药物活性成分包括药学上可接受的辅料。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：

(b1)制备抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶活性的产品(如新型冠状病毒的3C样蛋白酶抑制剂)；

(b2)制备抑制新型冠状病毒复制的产品；

(b3)制备预防和/或治疗与新型冠状病毒相关的疾病的产品。

与新型冠状病毒相关的疾病包括新型冠状病毒肺炎。

当所述产品为药物时，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

所述辅料包括但不限于：药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质；

药理上无害的盐(优选氯化钠)、调味剂、维生素(优选维生素A或维生素E、生育酚或维生素原)、抗氧化剂(优选抗坏血酸)，以及稳定剂和/或防腐剂。

在本发明的技术方案中，药物组合物的剂型为口服制剂、肺部吸入制剂、黏膜给药制剂或注射剂；优选地，口服制剂选自颗粒剂、粉末剂、丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于预防和/或治疗与新冠病毒相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用上述木蝴蝶苷A或上述组合物。

以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

实施例

1、木蝴蝶苷A的制备

1000mL圆底烧瓶中将黄芩苷(10.0g,22.4mmol)悬浮于无水甲醇(400mL),室温下缓慢滴加浓硫酸(0.2mL)，滴加完毕升温至85℃继续搅拌反应4h。自然冷却至室温后，缓慢加入硼氢化钠(8.5g,224.0mmol)，加毕继续搅拌反应2h。向反应体系中加入200mL 10％乙酸溶液,乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有机相减压浓缩得粗品，将所得粗品悬浮于80mL乙酸乙酯，加热回流30分钟后，自然冷却，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥得淡黄色固体木蝴蝶苷A(8.98g,93％)。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.57(s,1H),8.62(s,1H),8.09(d,J＝7.2Hz,2H),7.60(d,J＝7.7Hz,3H),7.06(s,1H),7.02(s,1H),5.45(s,1H),5.29–5.09(m,2H),5.03(d,J＝7.0Hz,1H),4.70(s,1H),3.77(d,J＝10.9Hz,1H),3.49(d,J＝7.7Hz,2H),3.20(d,J＝18.2Hz,2H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆):δ182.42,163.31,151.46,149.05,146.32,131.91,130.67,130.43,129.01,126.22,105.92,104.55,100.77,94.07,77.16,75.69,73.00,69.50,60.46.

2、新型冠状病毒3CLPro蛋白的表达与纯化

2.1引物设计

根据新型冠状病毒3CLPro的基因(ORF1ab的蛋白残基3264-3569，GenBank检索号：MN908947.3)为模板设计基因特异性引物(3CL-F：

gtgccgcgcggcagccatatgtcggcagtgctgcaaagcggtttccgtaagatg，SEQ ID NO：1；3CL-R：gtggtggtggtggtgctcgaggggcccttgaaaggtcacaccgctgc，SEQ ID NO：2)，其中3CLPro-F引物序列带有NdeI酶切位点，3CLPro-R引物序列带有XhoI酶切位点。在蛋白N端加入SAVLQ 5个氨基酸，构建3CLPro自身酶切位点；在蛋白C端的VTFQ氨基酸后加入GP两个氨基酸，构建Precission蛋白酶酶切位点，促进目的基因与His标签融合表达。

2.2新型冠状病毒3CLPro基因扩增

首先由通用生物合成具有大肠杆菌密码子偏爱性的新型冠状病毒3CLPro基因。以合成的新型冠状病毒3CLPro的基因作为模板，扩增总体系为100μL。PCR反应体系包括：cDNA模板1μL、3CL-R 4μL、3CL-F 4μL、2×Phanta Master Mix 50μL和ddH₂O 41μL。反应程序具体为：94℃3min的预变性，30次扩增反应(94℃15s，65℃30s，72℃30s)及72℃充分延伸5min。PCR产物取9μL，加入1μL 6×Gel Loading Dye Purple混合均匀后上样，其中第一个胶孔中加入2μLDNA Marker，以供样品分离出的条带进行对照(电压150V，40min)。在紫外灯下观察PCR结果，并用切胶刀从凝胶上切下PCR正确片段的条带，放入1.5mL EP管中，称重并记录。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，使用Nano Drop测定回收的目的基因浓度与纯度。

2.3新型冠状病毒3CLPro表达载体的构建

使用NdeI和XhoI限制性内切酶对pET28a(+)进行酶切，然后胶回收目的质粒片段用于重组连接。具体连接体系包括：pET28a(+)质粒片段20μg、3CLPro目的基因40μg、5×CEⅡBuffer 5μL、ExnaseⅡ2μL，并用水补足50μL。

2.4新型冠状病毒3CLPro的诱导表达

将转化成功的大肠杆菌菌种在37℃下按1％(v/v)接种量接种于25mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中预培养过夜，然后将培养物按1％(v/v)接种量接种于1L含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养。当OD600达到0.8时，添加0.5mM异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在25℃下诱导12h，使3CLPro蛋白表达。

2.5新型冠状病毒3CLPro的纯化

1)取1L菌液在5000×g条件下离心10min，弃去上清液。

2)将沉淀重悬于40mL Lysis Buffer中(所有缓冲液的pH在4℃下调节)，然后通过高压均质仪裂解3～5min。

3)使用冷冻低温离心机将裂解液在4℃下超速离心(15000×g)30min，取上清再次超速离心(15000×g)30min。

4)使用Ni-NTA柱进行蛋白纯化前，先用Lysis Buffer平衡Ni-NTA柱。

5)将已离心2～3次的裂解液上清分批次加入至Ni-NTA柱流穿，流穿结束后，为除去非特异性结合蛋白，加入100mL左右的Lysis Buffer洗涤Ni-NTA柱，洗涤结束后使用25mLWash Buffer及35mL Elution Buffer洗脱收集3CLPro。

6)将裂解液、流穿液、洗涤液、Wash Buffer及Elution Buffer各收集20μL。

7)每个样品加入5μL 5×SDS-PAGE Protein Loading Buffer吹打混匀，在95℃条件下加热10min使蛋白样品变性，每管样品取10μL进行SDS-PAGE电泳，其中第一个胶孔中加入2μL Prestained Protein Ladder，以供样品分离出的条带进行对照(电压220V，45min)。

8)根据SDS-PAGE电泳结果浓缩洗脱液至2mL，使用替换液A(20mM HEPES，400mMNaCl，pH 7.5)替换洗脱液3次，最终得到4mL 3CLPro浓缩液，使用Nano Drop测定蛋白浓度。在浓缩液中加入13mg/mL Precission蛋白酶(PPE)100μL酶切过夜。

9)使用GFC Buffer(100mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.5)平衡凝胶过滤分子筛层析柱(HiLoad 16/600Superdex 200pg)。

10)将4mL酶切处理后的3CLPro浓缩液均分至3个1.5mL EP管中，4℃下超速离心12000×g，10min。

11)去除沉淀后，使用螺旋注射器将蛋白样品推入5mL上样环中，通过AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化。

12)浓缩从凝胶过滤分子筛层析柱洗脱下来的含有高纯度3CLPro部分，浓缩液依次使用替换液B(20mM HEPES，200mM NaCl，pH 7.5)和替换液C(20mM HEPES，100mM NaCl，pH7.5)替换3次，使用Nano Drop测定蛋白浓度。将3CLPro蛋白按50μL/管进行分装，液氮速冻后放入-80℃保存。

3、活性测试

1)通过荧光共振能量转移技术(FRET)测定新型冠状病毒3CLPro活性及化合物对新型冠状病毒3CLPro的抑制活性。测定试验中使用带有新型冠状病毒3CLPro切割位点(箭头所示)的荧光底物(Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2)和Tris-HCl缓冲液(50mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 7.3)。

2)化合物由100％DMSO溶解。取上述10μL化合物分别与40μL新型冠状病毒3CLPro(终浓度0.1μM)在Tris-HCl缓冲液中孵育1h，通过添加50μL荧光底物(Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2、终浓度为20μM)引发反应。使用放射共振能量转移荧光分光光度计检测由于3CLPro催化的底物裂解而产生的Dabcyl荧光信号(340nm(激发)/490nm(发射))，通过3min内荧光信号的变化，从而判定化合物是否具有抑制活性。

3)新型冠状病毒3CLPro动力学常数通过将数据拟合到MichaelisMenten方程中得出。

4)使用Tris-HCl缓冲液将化合物稀释至梯度浓度(1.5625-100μM和0.15625-10μM)，并使用上述相同终浓度的新型冠状病毒3CLPro和荧光底物体系进行测定。化合物的IC₅₀值由GraphPad Prism 8.0软件计算。每次实验三个平行，最终结果用平均值±标准差(SD)表示。测定结果为木蝴蝶苷A对新型冠状病毒3CLPro的IC₅₀值为7.087μM，显示出对新型冠状病毒3CLPro的良好抑制活性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.木蝴蝶苷A作为唯一活性成分在制备抗新型冠状病毒产品中的应用，其特征在于，所述木蝴蝶苷A抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶的活性或抑制新型冠状病毒复制；

所述产品为药物或试验试剂。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述木蝴蝶苷A采用如下方法进行制备得到：

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述黄芩苷、浓硫酸和硼氢化钠的摩尔体积比为20-30 mmol：0.1-0.3 mL：220-240 mmol。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述黄芩苷、浓硫酸和硼氢化钠的摩尔体积比为22.4 mmol：0.2 mL：224 mmol。

5.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述乙酸溶液为5-15%乙酸溶液。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述乙酸溶液为10%乙酸溶液。

7.如权利要求2所述应用，其特征在于，加热回流提取时间为10-60分钟。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，加热回流提取时间为30分钟。