CN113855665A - 冬凌草甲素和/或其前药在制备抑制SARS-CoV-2的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了冬凌草甲素和/或其前药在制备抑制SARS‑CoV‑2的药物中的应用。所述冬凌草甲素能靶向SARS‑CoV‑2中的Mpro蛋白酶并显著抑制酶活性，有效抑制SARS‑CoV‑2的RNA复制，降低SARS‑CoV‑2的活性，表明冬凌草甲素这一小分子可用于SARS‑CoV‑2感染的新型冠状病毒肺炎的治疗或预防，为新型冠状病毒肺炎的治疗提供了一种高效、安全无毒副作用、新型的天然药物来源。

Description

冬凌草甲素和/或其前药在制备抑制SARS-CoV-2的药物中的 应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物领域。更具体地，涉及冬凌草甲素和/或其前药在制备抑制SARS-CoV-2的药物中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)是指2019新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染导致的肺炎，自从2019年底爆发以来，该疾病已在全球迅速蔓延，造成巨大的经济下滑和医疗负担，因此，抗新型冠状病毒肺炎的药物研发对于遏制病毒发展，控制病毒流行，避免COVID-19的肆虐十分关键。

目前对新冠肺炎治疗的药物主要是抗病毒药物，且目前无特效的抗SARS-CoV-2病毒药物，临床上常用α-干扰素、利巴韦林、洛匹那韦利托那韦、磷酸氯喹、阿比多尔等化学药物进行抗病毒治疗。但化学合成类药物的使用易导致不可预期的副作用，中药因其具有药源丰富、价格便宜、副作用小、多环节整体性治疗等优势，越来越多地被用于防治新型冠状病毒肺炎，如CN112168943A、CN112168932A、CN112168944A等都提供了一种用于预防新冠肺炎的中药组合物。

冬凌草甲素(Oridonin，ORI)是从冬凌草中分离得到的化合物，常用于急慢性咽炎、支气管炎、扁桃体炎和虫咬的治疗，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血压、免疫调节和镇痛等作用。特别是，冬凌草甲素还具有较强的抗肿瘤活性，对20多种人类癌症细胞系的增殖具有显著的抑制作用，如普通食管癌、肺癌和肝癌等，如专利CN201210011120.2公开了冬凌草甲素对肝癌、肺腺癌和胰腺癌的治疗作用，但目前尚未有冬凌草甲素对新型冠状病毒肺炎作用的相关研究。

发明内容

本发明旨在提供一种冬凌草甲素和/或其前药在制备抑制SARS-CoV-2的药物中的应用，以及在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用，为SARS-CoV-2感染导致的新型冠状病毒肺炎提供一种高效、安全无毒副作用的天然活性成分来源。

本发明的首要目的是提供冬凌草甲素和/或其前药在制备SARS-CoV-2抑制剂中的应用。

本发明的另一目的是提供冬凌草甲素和/或其前药在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用。

本发明的又一目的是提供一种抑制SARS-CoV-2的药物。

本发明的再一目的是提供一种预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

所述天然活性小分子冬凌草甲素能靶向SARS-CoV-2中的Mpro蛋白酶并显著抑制酶活性，有效抑制SARS-CoV-2的RNA复制，降低SARS-CoV-2的活性，表明冬凌草甲素对SARS-CoV-2感染和新型冠状病毒肺炎具有良好的治疗和/或预防效果，因此，冬凌草甲素和/或其前药在制备SARS-CoV-2抑制剂中的应用，以及冬凌草甲素和/或其前药在制备或作为预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用都应在本发明的保护范围内。

本发明通过荧光热位移分析法(Fluorescence-based thermal shift assy，TSA)探究冬凌草甲素对SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶的影响，结果显示冬凌草甲素能使Mpro蛋白酶热稳定性下降11.09℃，表明冬凌草甲素能与Mpro蛋白酶结合，并影响Mpro蛋白酶的稳定性；通过荧光共振能量转移法(FRET)探究冬凌草甲素对SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶的抑制情况，结果显示冬凌草甲素能显著抑制Mpro蛋白酶的活性，其半数抑制浓度为2.16μM；此外，本发明还通过在细胞水平探究冬凌草甲素对SARS-CoV-2中RNA复制的影响，发现冬凌草甲素还能通过靶向抑制Mpro蛋白酶的功能而抑制SARS-CoV-2病毒在细胞中的复制。

以上都表明冬凌草甲素和/或其前药具有优异的抗SARS-CoV-2病毒作用，可用于对SARS-CoV-2感染的新型冠状病毒肺炎的治疗或预防，为新型冠状病毒肺炎的治疗提供一种高效、安全无毒副作用、天然新型的药物来源。

冬凌草甲素的化学信息如表1所示。

优选地，所述预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎为抑制SARS-CoV-2的活性，所述抑制SARS-CoV-2的活性包括抑制SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶的活性，以及抑制SARS-CoV-2的RNA复制。

进一步优选地，所述前药为在生物体内能转化成冬凌草甲素的药物。

此外，本发明还请求保护一种抑制SARS-CoV-2的药物和一种预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物，具体是以冬凌草甲素和/或其前药为活性成分的药物，该药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型，如注射剂、口服液、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、粉针剂、水针剂、汤剂、酒剂、缓控释制剂、肠溶剂、气雾剂或混悬剂等。

该药物具有调节机体功能，可适用特定人群日常服用以预防新型冠状病毒肺炎，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害，所述特定人群包括：1)与新型冠状病毒肺炎患者直接暴露接触者，包括在医院接触暴露新型冠状病毒肺炎患者的医生、护士或医院其他工作人员；2)与新型冠状病毒肺炎患者直接有近距离接触者，包括患者家属、社区/集会/饭店/公共交通工具/影剧院/会议等近距离的接触者；3)已经感染SARS-CoV-2，但尚无明显症状的患者等。

本发明具有以下有益效果：

所述天然活性小分子冬凌草甲素能靶向SARS-CoV-2中的Mpro蛋白酶并显著抑制其酶活性，有效抑制SARS-CoV-2的RNA复制，降低SARS-CoV-2的活性，表明冬凌草甲素这一小分子可用于SARS-CoV-2感染的新型冠状病毒肺炎的治疗和/或预防。

本发明提供了冬凌草甲素的新应用，也为新型冠状病毒肺炎的治疗提供了一种新型的天然药物来源，为新型冠状病毒肺炎的新药研发奠定了一定的基础。

附图说明

图1是Mpro蛋白酶目的基因和质粒载体pET 20b基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

图2是Mpro蛋白酶纯化后的电泳泳道，其中，“Marker”泳道是蛋白Marker(Conventional range)的泳道；“流穿”泳道是孵育后的上清液流过Ni-NTA柱的流穿液的泳道；“洗涤液1”泳道是含20mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗涤液2”泳道是含40mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液”泳道是含250mM/L咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“离子交换层析”泳道是Mpro蛋白酶经阴离子交换层析纯化后的泳道；“凝胶过滤层析”泳道是Mpro蛋白酶经凝胶过滤层析纯化后的泳道；圈出部分是目的蛋白Mpro蛋白酶的条带。

图3是Mpro蛋白酶经阴离子交换层析纯化过程中的紫外吸收峰图。

图4是Mpro蛋白酶经凝胶过滤层析纯化过程中的紫外吸收峰图。

图5是标准化荧光发光率曲线。

图6是不同浓度的冬凌草甲素抑制实验结果。

图7是冬凌草甲素对Mpro蛋白酶的抑制率曲线。

图8是冬凌草甲素对Vero E6细胞的细胞毒性曲线。

图9是病毒RNA拷贝数统计结果。

图10是冬凌草甲素对病毒RNA拷贝数的抑制曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

Mpro蛋白酶，又称3C样蛋白酶(3C-Like proteinase，3CLpro)，是SARS-CoV-2复制的关键酶，由多肽编码，参加病毒蛋白的分裂成熟，能够从至少11个保守切割位点水解pp1a、pp1ab原始多聚蛋白，参与其加工、形成复制酶复合体。有研究表明，Mpro蛋白酶在病毒复制、增殖中发挥着重要作用，因此它的缺失会对病毒生命周期造成致命性打击；现有报道的Mpro抑制剂，能够通过阻断Mpro蛋白酶两种单体(A、B)中的结构域Ⅰ与Ⅱ之间的聚合，从而抑制Mpro蛋白酶对原始多聚蛋白pp1a和pp1ab的酶解能力，最终影响病毒RNA的复制；研究表明，在所有Covs中Mpro蛋白酶的底物位点、活性位点具有高度的同源性，SARS-CoV-2与SARS-CoV的Mpro蛋白酶有96.73％的结构相似，并且在人类身上没有同源物。因此，Mpro蛋白酶在抗SARS-CoV-2的研究中，可作为治疗靶标。

实施例1 SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶融合质粒的构建和蛋白表达纯化

一、密码子优化：

选取SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶基因，全长918bp；按照通用遗传密码表和大肠杆菌密码子偏好分析其基因序列，找出其与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点，用大肠杆菌偏好的密码子替代Mpro蛋白酶基因中使用偏好不同的密码子，设计并化学合成密码子优化后的Mpro蛋白酶基因序列，编码序列如SEQ ID NO.1所示。

二、引物设计：

设计引物F1和R1扩增密码子优化后的Mpro蛋白酶基因，设计引物F2和R2扩增pET-20b：引物F1如SEQ ID NO.2所示，引物F2如SEQ ID NO.3所示，R1为F2的反向互补序列，R2为F1的反向互补序列。

引物	序列
		引物F1(SEQ ID NO.2)	5′-GATATACATATGAGCGGTTTTCGT-3′
引物F2(SEQ ID NO.3)	5′-ACCTTTCAGCTCGAGCACCACCAC-3′

三、PCR扩增目的基因和载体：

PCR反应的试剂是KOD-Plus试剂盒(购至TOYOBO公司)；

PCR反应的具体步骤如下：将5μL 10×的KOD-Plus聚合酶缓冲液、5μL2mM的dNTP混合物、3μL 25mM硫酸镁溶液、1.5μL引物、1μL扩增模板、1μLKOD-Plus聚合酶和33μL的121℃、20min灭菌后的MiliQ超纯水混合后，进行PCR扩增(PCR反应条件：在94℃下预变性2min、在94℃下变性15s、在54℃复性下30s、在68℃下延伸3min，循环35次后，在68℃下延伸10min)，最终获得扩增产物。1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的条带大小，琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，表明通过实验得到了Mpro蛋白酶目的基因和质粒载体pET 20b基因，可用于构建表达Mpro蛋白。

四、融合质粒的构建：

将上述扩增得到的25μL目的基因和10μL载体混合后，加入1μLDpn I快切酶，在37℃下水浴30min，再将连接产物全部转入100μL E.coli DH5α感受态细胞中进行转化，冰浴30min，在42℃下热激90s，冰浴5min后，加入600μL LB液体培养基，在37℃下复苏1h，接着将菌液涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的琼脂糖平板上，在37℃下培养过夜后，挑取单克隆菌落于5mL新鲜LB培养基(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)中培养过夜，提取质粒，测序结果显示序列构建成功，获得该融合质粒。

五、Mpro蛋白酶的表达：

将上述获得的融合质粒转入大肠杆菌BL21 DE3感受态细胞进行转化，冰浴30min，在42℃下热激90秒，冰浴5min后，加入600μL LB液体培养基复苏1h，再将菌液涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养；克隆菌株在LB固态培养下，呈2mm左右圆形、边缘光滑清晰、白色或米白色的小菌落；挑取转化有表达载体pET20b的阳性克隆菌株至50mL新鲜LB培养液中(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，在37℃下过夜培养，取7mL培养物加至750mL新鲜LB液体培养液中(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，37℃培养3.5～4h，测OD600＝0.4～0.6；加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达(诱导条件为：IPTG终浓度0.5mM，诱导温度16℃，诱导时间18h)；4200rpm离心35min收集菌体，倒尽培养基残液，裂解液(5mM咪唑，20mM Tris-HCl pH8.0，300mM NaCl)重悬菌体，超声波破碎细胞，功率为400W，工作模式设定为超声2s，间歇8s，每个循环10min，共计三个循环；将破碎后的细胞裂解液在4℃下，以25000g的离心力离心35min，收集上清，弃去沉淀。

六、Mpro蛋白酶的纯化：

(1)镍亲和层析纯化：

将得到的约50mL上清液与预先用裂解液平衡好的Ni-NTA柱的填料在4℃下孵育1h，孵育后的上清液流过Ni-NTA柱，在4℃下用咪唑浓度为20mM、40mM和250mM的缓冲液分别冲洗镍亲和层析柱并收集对应的蛋白洗脱液，分别取40μL蛋白洗脱溶液，加入10μL 5×SDS上样缓冲液后，在100℃下变性10min，用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化结果，结果如图2所示(其中，“Marker”泳道是蛋白Marker(Conventional range)的泳道；“流穿”泳道是孵育后的上清液流过Ni-NTA柱的流穿液的泳道；“洗涤液1”泳道是含20mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗涤液2”泳道是含40mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液”泳道是含250mM/L咪唑的蛋白洗脱液的泳道)。

(2)阴离子交换层析纯化：

使用截留分子量为30k Da的超滤浓缩离心管(购自Millipore公司)对蛋白质进行浓缩，浓缩过程中加入低盐缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，50mM NaCl，1mM DTT)反复稀释，将蛋白的缓冲液换至低盐环境使其最终体积为5mL；将5mL蛋白溶液通过GE healthcare公司的AKTA蛋白纯化系统上样至阴离子交换柱HiTrap Q HP中，再利用40μM至1M的NaCl浓度行连续蛋白质的梯度洗脱；洗脱缓冲溶液分为低盐(20mM Tris-HCl pH8.0，40mM NaCl，1mMDTT)和高盐(20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl，1mM DTT)；根据纯化过程中紫外吸收峰图(图3所示)及SDS-PAGE凝胶电泳(图2中“离子交换层析”泳道所示)鉴定目的蛋白，其中，图2圈出部分即为目的蛋白Mpro蛋白酶的条带。

(3)凝胶过滤层析纯化：

将离子交换层析得到的目的蛋白峰收集起来，通过截留分子量为30kDa的超滤浓缩离心管(购自Millipore公司)将蛋白质浓缩并反复稀释后，换到凝胶层析缓冲液(20mMTris-HCl pH8.0，300mM NaCl，1mM DTT)中，使其最终体积为0.5mL；使用GE healthcare公司的自动蛋白质纯化仪将浓缩好的蛋白上样至Superdex 200层析柱中，以0.5mL/min的流速洗脱目的蛋白；根据纯化过程中紫外吸收峰图(图4所示)及SDS-PAGE凝胶电泳(图2中“凝胶过滤层析”泳道所示)鉴定目的蛋白Mpro。

分析图2可知，这三步纯化得到的目的蛋白纯度较高，纯度达到95％以上，至此便获得纯化的SARS-CoV-2病毒的Mpro蛋白酶。

实施例2冬凌草甲素对SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶荧光热偏移的影响

用反应缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM DTT)将Mpro蛋白酶稀释至终浓度为0.2mg/mL，同时加入100μM的冬凌草甲素和4×SYPRO橙色荧光染料(购自Sigma-Aldrich公司)，反应终体积20μL，混合物在25℃下孵育10min，再以1℃/min的升温速率从25℃加热至95℃；以仅加入0.2mg/mL的Mpro蛋白酶和4×SYPRO橙色荧光染料的混合液为阴性对照组。每次实验设置3个复孔，实验重复3次。用StepOnePlus实时PCR仪(购自LifeTechnologies公司)记录两组的荧光强度，通过荧光热位移分析法(Fluorescence-basedThermal shift assy，TSA)探究冬凌草甲素对SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶荧光热偏移的影响，用GraphPad Prism 7绘制实时温度对应的标准化荧光发光率曲线，结果如图5所示，再通过曲线中一阶导数的最大值计算得到△T_m值为11.09℃，即冬凌草甲素能使Mpro蛋白酶热稳定性下降11.09℃，表明冬凌草甲素能与Mpro蛋白酶结合，并影响Mpro蛋白酶的稳定性。

实施例3冬凌草甲素对SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶的体外抑制情况

(1)Mpro蛋白酶底物设计：

已知Mpro蛋白酶水解底物肽序列SEQ ID NO.4：-KTSAVLQSGFRKME-(-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu-)，在肽链N端加入Edans荧光基团，同时在肽链C端加入Dabcyl荧光淬灭基团，最终合成Edans-KTSAVLQSGFRKME-Dabcyl(由吉尔生化(上海)有限公司合成得到)。

(2)荧光共振能量转移法检测冬凌草甲素对Mpro蛋白酶的抑制作用：

在上述酶活实验中加入梯度浓度的冬凌草甲素(0μM、0.12μM、0.47μM、1.87μM、3.75μM、7.5μM、15μM、60μM)，用反应缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM DTT)将Mpro蛋白酶稀释至终浓度为0.5μM，同时加入50μM上述底物肽，反应终体积为100μL；用Synergy H1多功能微孔板检测仪(购自BioTek公司)在激发波长为340nm，发射波长为490nm处实时检测荧光强度，反应持续25min，每间隔30s进行一次荧光强度读值，每次实验设置3个复孔，实验重复3次，取实验均值做时间-荧光强度曲线，抑制实验结果如图6所示，表明冬凌草甲素对SARS-CoV-2的抑制作用呈浓度依赖。

取抑制实验前15min的荧光强度改变量除以时间作为反应速度；以不加入冬凌草甲素为阴性对照组；反应速度及抑制率的计算公式如下：

反应速度：

抑制率：

其中，V_n为实验组的反应速度，V₀为阴性对照组的反应速度。

用Microsoft Excel 2019计算抑制率，用GraphPad Prism 7拟合log(inhibitor)vs.response(three parameter)模式绘制抑制率曲线，如图7所示，通过抑制率计算可得出冬凌草甲素对SARS-CoV-2Mpro蛋白酶的半数抑制浓度(IC₅₀)为2.16μM，表明冬凌草甲素可以靶向抑制SARS-CoV-2Mpro蛋白酶的活性。

实施例4冬凌草甲素在细胞水平抗SARS-CoV-2实验

(1)细胞活力测定：

将Vero E6细胞(由中国科学院微生物研究所提供)接种于96孔板中，培养过夜，经PBS洗涤细胞后，将12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.58μM、0.79μM、0.40μM和0.19μM共计7个梯度浓度的冬凌草甲素和GC376溶解于DMEM，分别在37℃、5％CO₂的环境下处理Vero E6细胞48h；与此同时，将100μL DMEM作为阴性对照，加入Vero E6细胞并在同等条件下进行处理。将10μL CCK8试剂(TargetMol，C0005)添加到每个孔中，在37℃下孵育3h后，用瑞士TECANInfinite 200Pro酶标仪(购自瑞士TECAN公司)测量OD₄₅₀，实验重复3次，用不同浓度化合物的OD₄₅₀值除以阴性对照的OD₄₅₀值，用Microsoft Excel 2019计算细胞毒性百分比，用GraphPad Prism 7拟合log(inhibitor)vs.response(three parameter)模式绘制细胞毒性曲线见图8，计算出冬凌草甲素细胞半数抑制率(CC₅₀)为24.9μM。

细胞活力：

*A(实验组)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度。

*A(空白组)：具有培养基和CCK-8溶液，没有细胞的孔的吸光度。

*A(对照组)：具有细胞和CCK-8溶液，而没有药物溶液的孔的吸光度。

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。

(2)体外抗病毒试验：

用含1％胎牛血清的DMEM将10mM冬凌草甲素稀释至12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.58μM、0.79μM、0.40μM和0.19μM共计7个浓度梯度；Vero E6细胞在96孔板上培养过夜后，用0.01MOI病毒感染Vero E6细胞2小时，再移除培养基，向细胞中添加含有12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.58μM、0.79μM、0.40μM和0.19μM共计7个浓度梯度抑制剂的新鲜培养基；以含DMEM的培养基为阴性对照。实验设置三个分组(冬凌草甲素为待测组，Mpro蛋白酶抑制剂GC376为阳性对照组，DMEM培养基作为阴性对照)。

48小时后，从100μL感染细胞的上清中提取病毒RNA，采用一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒(购自日本TaKaRa公司)进行SARS-CoV-2病毒的RNA反转录，用LightCycler480实时PCR系统(购自瑞士Roche公司)测定病毒RNA拷贝数；从cDNA中扩增出ORF 1ab，克隆到MS2-nCoV-ORF1ab中，测序证实其同源性后作为质粒标准品。通过测定质粒连续稀释(103～109拷贝)的拷贝数，得到标准曲线。用于定量PCR的引物为：

引物	序列
		ORF1ab-F(SEQ ID NO.5)	5′-AGAAGATTGGTTAGATGATGATAGT-3′
ORF1ab-R(SEQ ID NO.6)	5′-TTCCATCTCTAATTGAGGTTGAACC-3′
		荧光探针(SEQ ID NO.7)	5′-FAM-TCCTCACTGCCGTCTTGTTGACCA-BHQ1-3′

病毒RNA拷贝数：

病毒RNA拷贝数抑制率：

其中，Y_n是待测组的病毒拷贝数，Y₀是阴性对照组的病毒拷贝数。

病毒RNA拷贝数统计结果如图9所示，可见冬凌草甲素对SARS-CoV-2病毒的RNA复制具有显著的抑制作用。此外，用GraphPad Prism 7拟合log(inhibitor)vs.response(three parameter)模式绘制抑制曲线，结果如图10所示，通过GraphPad Prism 7拟合结果可得出冬凌草甲素的半数有效浓度(EC₅₀)为4.95μM。

综上所述，天然活性小分子冬凌草甲素能靶向SARS-CoV-2中的Mpro蛋白酶并显著抑制酶活性，有效抑制SARS-CoV-2的RNA复制，降低SARS-CoV-2的活性，表明冬凌草甲素这一小分子可用于SARS-CoV-2感染的新型冠状病毒肺炎的治疗或预防，为新型冠状病毒肺炎的治疗提供了一种新型的天然药物来源。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学·深圳

中山大学

<120> 冬凌草甲素和/或其前药在制备抑制SARS-CoV-2的药物中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcggttttc gtaaaatggc atttccgagc ggtaaagtgg aaggttgtat ggttcaggtt 60

acgtgtggta caacgacgct gaatggtctg tggctggatg atgttgttta ttgtccgcgc 120

catgttattt gcacgagtga agatatgctg aatccgaatt atgaagatct gctgattcgc 180

aaaagcaatc ataattttct ggttcaggcg ggtaatgttc agctgcgtgt tattggtcat 240

agtatgcaga attgtgttct gaaactgaaa gttgataccg caaatccgaa aaccccgaaa 300

tataaatttg ttcgcattca gccaggtcag accttttcag ttctggcgtg ttataacggt 360

agcccttcag gtgtttatca gtgtgcaatg cgtccgaatt ttaccatcaa aggtagcttt 420

ctgaatggtt cttgcggtag cgttggtttt aatattgatt atgattgcgt gagcttttgt 480

tatatgcatc acatggaact gccgaccggt gttcatgcgg gcaccgatct ggaaggtaat 540

ttttatggtc cgtttgttga tcgtcagacc gcacaggcag caggtaccga tacgaccatt 600

accgtcaatg ttctggcctg gctgtatgca gcagttatta atggtgatcg ttggtttctg 660

aaccgtttta ccaccaccct gaacgatttt aatctggtag caatgaaata taactatgaa 720

ccgctgaccc aggatcatgt tgatattctg ggtccgctga gcgcacagac gggtattgca 780

gtcctggata tgtgtgccag cctgaaagaa ctgctgcaga atggtatgaa cggtcgtacc 840

atcctgggta gcgcactgct ggaagatgaa tttaccccgt ttgatgttgt tcgccagtgt 900

tctggtgtta cctttcag 918

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatatacata tgagcggttt tcgt 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acctttcagc tcgagcacca ccac 24

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Thr Ser Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg Lys Met Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaagattgg ttagatgatg atagt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccatctct aattgaggtt gaacc 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctcactgc cgtcttgttg acca 24

Claims (10)

1.冬凌草甲素和/或其前药在制备SARS-CoV-2抑制剂中的应用。

2.冬凌草甲素和/或其前药在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎为抑制SARS-CoV-2的活性。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抑制SARS-CoV-2的活性包括抑制SARS-CoV-2中Mpro蛋白酶的活性。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抑制SARS-CoV-2的活性包括抑制SARS-CoV-2的RNA复制。

6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述前药为在生物体内能转化成冬凌草甲素的药物。

7.一种抑制SARS-CoV-2的药物，其特征在于，以冬凌草甲素和/或其前药为活性成分。

8.一种预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物，其特征在于，以冬凌草甲素和/或其前药为活性成分。

9.根据权利要求7或8所述药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型。

10.根据权利要求9所述药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、口服液、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、粉针剂、水针剂、汤剂、酒剂、缓控释制剂、肠溶剂、气雾剂或混悬剂。

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