CN109467597A - 一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途 - Google Patents

一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术药物技术领域，涉及一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途。所述的新型干扰素具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明的新型干扰素能够在保持良好的安全性与药效的基础上具有明显更高的生物学活性和稳定性。

Description

一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途
技术领域
本发明属于生物技术药物技术领域，涉及一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途。
背景技术
干扰素(interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子蛋白质类药物，包括I型、II型和III型，它们分别具有不同的受体和功能，是机体天然免疫系统的关键组成部分。其中I型IFN于1957年发现，是人和动物受病毒感染后产生的重要抗病毒物质，根据其基因和蛋白结构的不同，又分为IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω等。IFN-α已有3个亚型被批准为药品在临床使用，分别为IFN-α1b、IFN-α2a和IFN-α2b，目前均为基因重组产品。国外使用的IFN-α主要是IFN-α2a和IFN-α2b，其基因来源于西方白种人；国内使用的IFN-α主要是IFN-α1b，其基因由我国侯云德院士于1982年从健康中国人脐血白细胞中获得。中国预防医学科学院病毒学研究所多年的研究表明，中国人白细胞在受到病毒攻击后，产生的多种干扰素中以IFN-α1b型干扰素为主。因此，基因工程IFN-α1b与国内外同类产品相比，具有疗效显著(显效率与国外产品相同)、副作用更低、不易产生中和抗体等优点，更适合中国人使用。
IFN-α1b注射液是我国第一个具有自主知识产权的基因工程I类新药，已经在国内抗病毒领域广泛应用20余年，积累了大量文献报道和临床使用经验。多个多中心临床研究的资料显示，IFN-α1b治疗呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎、毛细支气管炎、手足口病(HFMD)和病毒性肠炎等疗效好，不良反应轻。《中华人民共和国药典2015年版(三部)》收录重组人干扰素α1b注射液，适应症为病毒性疾病和某些恶性肿瘤，主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和毛细胞白血病等。此外，重组人干扰素α1b对尖锐湿疣、慢性宫颈炎、疱疹性角膜炎、带状疱疹、流行性出血热和小儿呼吸道合胞病毒性肺炎等病毒性疾病均有效，对其他病毒性疾病和恶性肿瘤如慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、淋巴瘤等也有良好疗效。
由于IFN-α1b与其它型别干扰素相比，其临床不良反应小，因此其在儿科领域用药取得了良好的效果，是同类产品中可用的少有优选产品。大量儿科临床用药经验和多中心研究资料表明，通过肌肉注射和呼吸道雾化吸入等途径给予IFN-α1b，对儿童病毒感染的治疗有重要作用，尤其是雾化吸入IFN-α1b治疗病毒感染，药物能直接作用于呼吸道黏膜，具有靶向性强、疗效高、安全性好、操作简便、儿童依从性高等优点，并可经支气管、细支气管到达肺部，较多地集中在肺部组织，缓慢入血，较肌肉注射给药作用更持久。因此，雾化吸入IFN-α1b已被国家标准处方集《儿童雾化中心规范化管理指南》推荐使用。
但是，IFN-α1b比活性较低，稳定性欠佳，这都限制了其在临床的进一步推广应用。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种新型干扰素，标记为干扰素α1z(IFN-α1z)，其是在干扰素α1b(IFN-α1b)的基础上经过分子设计和氨基酸序列改造得到，以能够在保持IFN-α1b良好的安全性与药效的基础上较IFN-α1b具有明显更高的生物学活性和稳定性。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种新型干扰素，所述的新型干扰素具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明的新型干扰素(IFN-α1z)与干扰素α1b(IFN-α1b)的氨基酸同源性为93％，与干扰素α2b(IFN-α2b)的氨基酸同源性为85％。
本发明的第二个目的是提供一种编码前述新型干扰素的多核苷酸，以能够更好的编码前述新型干扰素，编码得到的前述新型干扰素能够在保持IFN-α1b良好的安全性与药效的基础上较IFN-α1b具有明显更高的生物学活性和稳定性。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种编码前述新型干扰素的多核苷酸。
本发明的第三个目的是提供一种前述新型干扰素的制备方法，以能够更好的制备前述新型干扰素，制备得到的前述新型干扰素能够在保持IFN-α1b良好的安全性与药效的基础上较IFN-α1b具有明显更高的生物学活性和稳定性。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种前述新型干扰素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)新型干扰素表达工程菌的构建；
(2)新型干扰素表达工程菌的发酵及色谱(层析)分离纯化。
本发明的第四个目的是提供一种前述新型干扰素的药物组合物，以能够在保持IFN-α1b的药物组合物良好的安全性与药效的基础上较IFN-α1b的药物组合物具有明显更高的生物学活性和稳定性。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种前述新型干扰素的药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量且安全量的所述的新型干扰素和适宜量的可药用载体。
本发明的第五个目的是提供一种前述新型干扰素或其药物组合物在制备预防或治疗病毒感染性疾病的药物中的用途。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种前述新型干扰素或其药物组合物在制备预防或治疗病毒感染性疾病的药物中的用途。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种前述新型干扰素或其药物组合物在制备预防或治疗病毒感染性疾病的药物中的用途，其中所述的病毒感染性疾病是乙型脑炎、呼吸道合胞病毒感染或病毒性肝炎。
本发明中使用的术语“治疗有效量且安全量”表示当施用药物活性成分用于治疗或预防疾病时，药物活性成分的量足以实现对疾病的治疗或预防且不引起明显毒副作用。治疗有效量与安全量将依药物活性成分、疾病和它的严重性和所治疗病人的年龄、体重等而异。
本发明的有益效果在于，本发明的新型干扰素能够在保持IFN-α1b良好的安全性与药效的基础上较IFN-α1b具有明显更高的生物学活性和稳定性。
具体实施方式
通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
实施例1：新型干扰素表达工程菌的构建与表达序列确认
根据序列表的SEQ ID No.1合成对应的核酸模板，通过PCR的方法扩增出足够量的核酸。
扩增反应体系引物为：
F：CATATGTGCGACCTGCCTCAAACTCA
R：CTCGAGTTAGCGTTCCTGCAGG
扩增反应体系包含：dNTP 1μl、10X pfu缓冲液5μl、上下游引物各2μl、客户模板1μl、Pfu酶0.4μl(5u/μl)、ddH2O 38.6μl。
扩增反应条件为：95℃，3分钟、95℃，22秒、68℃，20秒、72℃，60秒、72℃，5分钟。共24个循环。反应完成后用琼脂糖凝胶电泳进行分离，用Nde I/Xho I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段。
将pET30a质粒载体用Nde I/Xho I双酶切，经琼脂糖电泳回收并和上述回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为：无缝克隆混合液，8.5μl、酶切载体pET30a，4μl、已纯化好的PCR产物，7.5μl，上述连接混合液放在37℃条件下在PCR仪1h即可。
制备大肠杆菌BLD21感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37℃过夜培养。
挑取单菌落作为模板，用上述设计的引物F、R进行扩增，产物经琼脂糖电泳检测，阳性克隆在486bp左右出现特异条带；取阳性克隆小量培养，提取质粒用Nde I/Xho I双酶切。分别在3kb左右和500bp左右出现特异性的条带，与预计情况相符，初步说明重组质粒构建成功。为进一步确认其序列，以T7通用引物对ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例2：新型干扰素的发酵、纯化与检测
将前述实施例1构建得到的新型干扰素的表达工程菌经涂平板活化后挑选单菌落接种于含有终浓度为30μg/mL的卡那霉素的LB培养基中(每升用蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g配制，调节pH为7.0)，37℃、220转/分摇床摇瓶培养至OD600nm为0.6-0.8。然后以5％的体积接种量接种于50L的LB培养基中在80L发酵罐中进行发酵培养(含30μg/mL的卡那霉素)，培养温度为37℃，培养过程中用氨水调节pH在6.5-7.5之间，用转速控制溶氧值在3-5％之间。在OD600nm达到1.0后按质量体积比1:5000的比例加入IPTG 10g继续诱导培养4小时，诱导培养温度为37℃，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,pH8.0)洗涤离心两次以除去发酵液中的主要杂质。
取上述处理得到的菌体40g以1:15的质量体积比加入600ml TE缓冲液置超声波破碎仪上进行超声破碎，条件为打5秒，歇5秒，共60分钟，所得破碎液室温12000转/分离心20分钟弃上清，沉淀以1:10的质量体积比加入TE缓冲液洗涤离心两次得分离包涵体。
所得10g包涵体以1:10的质量体积比加入包涵体溶解液(8mol/L尿素，50mmol/LTris-HCl，300mmol/L NaCl，pH8.0)溶解后在适度搅拌条件下变性处理2小时，待包涵体完全溶解后室温12000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以稀释复性法进行复性处理，复性液组成为：0.15mol/L硼酸钠缓冲液，3mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，调节pH为9.5。复性过程在2-8℃低温冷库中进行，首先用复性液将上清稀释4倍，放置8小时后再用复性液稀释5倍继续复性6小时。
透析后的复性液经4℃12000转/分离心30分钟后上用25mmol/LTris-HCl pH8.0溶液平衡的DEAE Sepharose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱2-3个柱体积，然后以含有0.3mol/L NaCl的25mmol/LTris-HCl pH8.0溶液进行洗脱收集洗脱峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
DEAE Sepharose FF洗脱峰用50mmol/L醋酸-醋酸钠pH4.5缓冲液以1:10的体积比稀释后上用同样缓冲液平衡的CM Separate FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱2-3个柱体积，然后在用含有0.1-0.15mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠pH4.5缓冲液洗脱除去主要杂质峰后用含有0.5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠pH4.5缓冲液洗脱收集目标峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述CMSepharose FF色谱柱分离得到的新型干扰素的纯度，结果均在97％以上。用《中华人民共和国药典2015年版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”和“蛋白质含量测定法”确定其比活性为3.64×107IU/mg，对照IFN-α1b的比活性为1.32×107IU/mg，前者为后者的2.8倍左右。
实施例3：新型干扰素的稳定性试验
将前述实施例2纯化得到的新型干扰素在室温(25℃)环境下放置3个月，在此过程中定期取样观察外观的变化，并检测纯度、生物学活性(用《中华人民共和国药典2015年版(三部)》规定的“干扰素活性测定法”)等主要质量控制指标的变化，结果如下表1所示。对应的IFN-α1b的25℃稳定性试验结果如表2所示。
表1新型干扰素的25℃稳定性试验结果
表2 IFN-α1b的25℃稳定性试验结果
实施例4：新型干扰素的细胞药效试验
(一)材料
1、细胞
WISH(人传代羊膜)细胞，由纽约大学医学院微生物教研室提供；
Vero(绿猴肾)细胞，由中国疾病预防控制中心病毒病研究所提供。
所有传代细胞均按常规方法传代培养。
2、病毒
滤泡性口膜炎病毒(VSV)Indiana株由病毒基因国家工程实验室提供，美国ATCC引进；
麻疹病毒MA株、单纯疱疹病毒I、II型(HSV-I、HSV-II)、7型腺病毒(Ad7)、CoxΒ1和Sindβis病毒由中国疾病预防控制中心病毒病研究所毒种中心提供；
流行性乙型脑炎病毒-28减毒株(JΒEV-28)，为人肺二倍体细胞适应株，由病毒学研究所脑炎研究室提供；
呼吸道合胞病毒(RSV)均由我国分离。
以上病毒均按常规在各自的敏感细胞上传代。
3、干扰素
自然人白细胞干扰素(nIFN-Le)由人周围血白细胞经NDV诱导产生并分离。
各类干扰素的比活性均＞106IU/mg。
(二)方法：干扰素抗病毒活性的测定
上述细胞形成单层后，加不同浓度的干扰素处理，对照组用营养液代替干扰素。37℃培养24小时后，倾去干扰素液，用l00TCID50的上述病毒攻击，37℃继续培养，待对照组细胞完全病变后，判断结果，从所加干扰素的浓度算出相对抗病毒活性。在同一细胞培养上比较干扰素对不同病毒的敏感性时，以VSV为对照，均采用病变抑制法测定干扰素的抗病毒活性。所得结果如下表3-5所示。
表3新型干扰素与其它干扰素对不同病毒感染的相对抗病毒活性的比较
表4新型干扰素与其它干扰素在人二倍体细胞上对乙型脑炎的抑制作用
表5新型干扰素与其它干扰素在HeLa细胞上对呼吸道合胞病毒的抑制作用
上述结果表明，新型干扰素在不同细胞株上对不同病毒的抗病毒滴度均小于IFN-α1b，说明新型干扰素的抗病毒效果在相同条件下明显优于IFN-α1b。
实施例5：新型干扰素的小鼠急性毒性试验
取体重为20g左右的小鼠30只，均分为2组，每组15只。组1和组2分别皮下单次注射实施例2纯化得到的新型干扰素和IFN-α1b。注射后连续观察14天，结果两组均未见任何异常表现，表明小鼠对新型干扰素的最大耐受量均在6.4mg/Kg以上，相当于人临床用量的3840倍。新型干扰素和IFN-α1b安全性相当。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市利云德生物技术有限公司
<120> 一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途
<130> -
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 162
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln
50 55 60
Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp
85 90 95
Leu Glu Ala Cys Ala Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu
100 105 110
Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile
115 120 125
Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
130 135 140
Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln
145 150 155 160
Glu Arg

Claims (6)

1.一种新型干扰素，其特征在于：所述的新型干扰素具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的新型干扰素的多核苷酸。
3.一种根据权利要求1所述的新型干扰素的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)新型干扰素表达工程菌的构建；
(2)新型干扰素表达工程菌的发酵及色谱分离纯化。
4.一种根据权利要求1所述的新型干扰素的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物含有治疗有效量且安全量的所述的新型干扰素和适宜量的可药用载体。
5.一种根据权利要求1所述的新型干扰素或根据权利要求4所述的药物组合物在制备预防或治疗病毒感染性疾病的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的病毒感染性疾病是乙型脑炎、呼吸道合胞病毒感染或病毒性肝炎。
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WO2020108428A1 (zh) * 2018-11-28 2020-06-04 深圳市利云德生物技术有限公司 重组人抗病毒细胞因子及其制备方法、组合物和用途

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