CN101475636B

CN101475636B - 人干扰素样蛋白及其用途

Info

Publication number: CN101475636B
Application number: CN 200910077177
Authority: CN
Inventors: 刘龙斌; 王海涛; 吕秋军; 王敏荣; 杨子义; 孙俭波
Original assignee: GENOVA BIOTECH COMPANY Ltd
Current assignee: GENOVA BIOTECH COMPANY Ltd
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2029-01-19
Also published as: CN101475636A

Abstract

本发明涉及系列高活性重组人干扰素样蛋白(SEQ ID NO：6-10)及其在抗肿瘤和抗病毒药物的应用。利用人干扰素α的基因，通过基因改组技术获得新型的、但与人天然干扰素α高度同源的核苷酸序列(SEQ ID NO：1-5)，通过大肠杆菌表达并纯化得到的新型蛋白，其抗肿瘤细胞增殖活性和抗病毒活性较普通的重组人干扰素α-2b显著增强。

Description

人干扰素样蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及具有高比活性的人干扰素样蛋白及其在制备抗肿瘤和抗病毒药物中的用途。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质，由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广谱的抑制病毒复制、抑制肿瘤细胞生长及调节免疫功能等多种生物活性。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ，其中IFN-α和IFN-β为I型干扰素，IFN-γ为II型干扰素。同一型内按氨基酸组成差异再分20多个亚型，如α1、α2、α3等。在同一亚型内又因氨基酸的差异而细分，如α2干扰素有三种：α2a、α2b、α2c。按制备方法不同，可将干扰素分为利用基因工程生产的重组干扰素和人自然干扰素两大类。临床上常用的干扰素制剂为基因工程干扰素。

基因重组人干扰素α(rHuIFNα)广泛应用于乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类乳头瘤病毒等病毒感染。我国是乙型肝炎大国，乙肝表面抗原携带率是9.75％。乙型患者使用干扰素停药半年以后15％的患者可以E抗原血清学转换，停药一年达到27％停药一年半达到32％，停药两年可以达到43％。目前为止我国的丙肝感染人群大概占到总体人群的3.2％，感染丙肝二三十年之后20％的人会发生肝硬化，我们国家根据十五期间总结的资料来看，感染丙肝二十年之后，16.7％的人发生肝硬化，干扰素是其主要治疗药物之一。

在肿瘤治疗领域，rHuIFNα已被用于白血病、骨髓瘤、肾细胞癌、黑色素瘤等多种肿瘤的治疗，并证实有助于预防术后复发、控制肿瘤进展。干扰素α的抗肿瘤机制主要包括通过抑制内皮细胞活性来抑制肿瘤血管生成，通过增强T淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)以及巨噬细胞的免疫功能，以及增强肿瘤细胞的免疫源性等方式，增强机体的抗肿瘤免疫反应。此外，干扰素α还可以通过调控细胞周期和诱导凋亡等形式发挥直接的抗肿瘤作用。

为进一步提高干扰素的临床疗效，临床上常将干扰素与其他药物用于治疗病毒性疾病和肿瘤。还有一种策略是在不改变干扰素蛋白序列前提下采用现代分子生物学或蛋白质化学的方法进行修饰，增强代谢稳定性，延长半衰期，从而提高临床疗效，如聚乙二醇(PEG)化干扰素、白蛋白或免疫球蛋白Fc片段与干扰素融合表达的融合蛋白等，其中PEG化干扰素已上市用于抗病毒治疗，一周给药一次，且临床疗效较普通干扰素好。但PEG化干扰素的缺点是PEG修饰会影响干扰素与其受体结合，导致干扰素活性有明显下降，另外副作用也有增加趋势。

改造干扰素的基因以发现高活性的干扰素突变体是另外一种策略。安进公司(Amgen)发明的干复津是通过对13种天然干扰素α序列进行扫描，把最保守的氨基酸转移到各个对应的位置，并对4个氨基酸作了改变以便于分子构造，再利用化学合成方法生成一个非天然的DNA序列，用基因工程的方法生产。干复津与干扰素α-2b的差异在20/166个氨基酸(相当于88％同源性)，但干复津的抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性提高幅度有限，临床上主要用于抗HCV。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是在于提供系列的多核苷酸及其编码的具有人干扰素样生物学活性的蛋白质。本发明经过广泛深入的研究，出人意料地发现其中5个具有人干扰素样活性的蛋白质，这些新蛋白质具有显著的抗肿瘤细胞增殖活性，比干扰素α-2b的活性高10倍以上。进一步利用经典的干扰素体外活性测定法检测，发现其抗病毒活性得到显著提高，比活性达2.0×10⁹IU/mg以上，比干扰素α-2b的活性高10倍以上。

基于本发明的结果，本发明的一方面涉及一种蛋白质，其特征在于其氨基酸序列包含选自SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 10的氨基酸序列，或为在上述包含选自SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 10的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人干扰素样生物学活性的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及一种蛋白质，其中所述的包含选自SEQ IDNO 6至SEQ ID NO 10的氨基酸序列为SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、或SEQ ID NO 10。

优选地，本发明的蛋白质具有比普通人干扰素α-2b(rHuIFNα-2b)更强的抗肿瘤细胞增殖活性和抗病毒活性，更优选地，所述蛋白质体外抗肿瘤细胞增殖活性比普通人干扰素α-2b(rHuIFNα-2b)强10倍以上，最优选10倍以上。

本发明的又一方面涉及一种核苷酸序列，其特征在于其编码具有人干扰素样生物学活性的蛋白。

本发明的又一方面涉及其序列为包含选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5的核苷酸序列。

本发明的又一方面涉及其序列为SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5。

本发明的另一方面涉及与上述核苷酸序列在严格条件下杂交并编码具有人干扰素生物学活性的蛋白。

本发明的再一方面涉及上述蛋白质或上述核苷酸序列在制备下述药物中的用途：抗肿瘤药物、抗病毒药物和抗类风湿关节炎药物，其中，优选地，所述药物为与药学上可接受的载体、辅料或赋形剂组成的组合物。

具体地，所述的肿瘤包括肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、食管癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌；所述的病毒包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、获得性免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒。

本发明的另一方面涉及在于提供一种含本发明所涉及的人干扰素样蛋白的药物组合物。

本发明同时也涉及包含本发明所涉及的核苷酸序列的细胞、微生物或载体，其中所述的微生物例如可以选自大肠杆菌；所述的细胞可为动物细胞(例如昆虫细胞)或植物细胞；所述的载体可为质粒。

具体而言，本发明采用如下技术方案：

采用分子杂交法，克隆12种人干扰素α的cDNA，通过酶切等方法产生断点不同、长短不一的核苷酸小片段，再将这些小片段混合，经多轮PCR扩增，不同分子的同源片段就会互相替换，随机组合，从而得到大量的同源基因分子间相互杂交的新分子。采用细胞筛选技术，对数万个克隆株进行抗肿瘤细胞增殖和抗病毒活性鉴定，成功筛选出了多个高活性、具有干扰素样活性的新型蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO 6-10所示，对应的碱基序列如SEQ ID NO 1-5所示。体外实验表明，这些新型蛋白对淋巴瘤Daudi细胞的生长抑制作用是rHuIFNα-2b的200～400倍；在WISH-VSV系统上，其抗病毒比活性是rHuIFNα-2b的10倍以上。

对13株代表性人肿瘤细胞株，采用SRB法观察本发明的蛋白在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用，结果发现本发明的蛋白对所有肿瘤细胞的抗增殖活性均明显强于rHuIFNα-2b(在10-1200倍之间)，其中对结直肠癌、肺癌等组织类型的肿瘤细胞株效果最显著。

进一步进行抗肿瘤的体内试验，采用肝癌HepG2细胞、结直肠癌LS180细胞、人白血病HL-60(s)细胞和黑色素瘤A375细胞，对裸鼠进行体内抗肿瘤实验，结果显示，本发明的新型蛋白对裸鼠体内肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，呈剂量依赖性关系，且效果明显优于rHuIFNα-2b。

利用分泌HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞观察系列人干扰素样蛋白的抗HBV活性。接种对数生长期的HepG2.2.15细胞于96孔板(2 ×10⁴/孔)，待细胞贴壁后各加入0.1和0.01pmol/L本发明的人干扰素样蛋白，或各加入0.1和0.01pmol/L rHuIFN-2b。之后，于37℃、5％CO₂的条件下培养9天。取细胞培养上清40l/孔，用等量DNA提取液提取上清中的病毒DNA。吸取上清后，在余下每孔细胞中加300l核裂解液。提取HepG2.2.15细胞内基因组DNA，并用实时荧光定量PCR检测HBV DNA。结果显示，本发明的人干扰素样蛋白处理组的细胞培养上清和胞内的HBV DNA拷贝数明显低于培养液对照孔，效果明显优于rHuIFNα-2b。

运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。

本发明化合物或其组合物可用非胃肠道给药方式或口服方法。非胃肠道给药制剂的剂型有注射剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂、贴膜剂、乳膏剂和滴眼剂等；口服给药制剂的剂型可以是肠溶片等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备。进一步地，对于液体剂型，所用的溶剂例如选自水、乙醇、丙二醇、氯化钠；增溶剂例如选自聚山梨酯80和丙二醇；防腐剂例如为苯甲醇；缓冲液例如为乙酸铵等。对于栓剂等非液体制剂，其所用辅料例如选自十二烷基硫酸钠、甘油、三乙醇胺、羟苯乙酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、凡士林、羊毛脂等。含有本发明新型蛋白的制剂中还可含有其它辅料，例如选自赋形剂、表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等的辅料。

在注射剂和栓剂等中含有本发明新型蛋白的剂量是以单元剂型中存在的蛋白质量计算的。在单元剂型中本发明新型蛋白质的一般含量为1-1000μg，优选的单元剂型含有10-100μg。

另外，本发明所述的严格的条件下指的是例如使用ECL directnucleic acid labeling and detection system(Amersham PharmaciaBiotech公司制)，手册给出的条件(wash：42℃、含有0.5xSSC的primary wash buffer)。

为了更好的理解本发明的实质，下面将结合实施例对本发明进一步说明，但并不限制本发明的范围。

本文中使用的主要测定仪器为：PCR仪、ABI自动测序仪、细菌培养箱、细胞培养箱、超净工作台、倒置显微镜、酶标仪等。实验动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。除特殊注明外，采用的细胞培养液购自Gibco公司，Advantage^TM反转录试剂盒和cDNA引物(OligoDT18)(Clontech，USA)，普通Taq酶(New England Biolab，非高保真)，其余分子生物学试剂购自Invitrogen公司。

附图说明

图1本发明的人干扰素样蛋白Novaferonl的人工合成多核苷酸序列(A，SEQ ID NO1)及其编码的氨基酸序列(B，SEQ ID NO6)，与rHuIFNα-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较

图2本发明的人干扰素样蛋白Novaferon2的人工合成多核苷酸序列(A，SEQ ID NO2)及其编码的氨基酸序列(B，SEQ ID NO7)，与rHuIFNα-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较

图3本发明的人干扰素样蛋白Novaferon3的人工合成多核苷酸序列(A，SEQ ID NO3)及其编码的氨基酸序列(B，SEQ ID NO8)，与rHuIFNα-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较

图4本发明的人干扰素样蛋白Novaferon4的人工合成多核苷酸序列(A，SEQ ID NO4)及其编码的氨基酸序列(B，SEQ ID NO9)，与rHuIFNα-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较

图5本发明的人干扰素样蛋白Novaferon5的人工合成多核苷酸序列(A，SEQ ID NO5)及其编码的氨基酸序列(B，SEQ ID NO10)，与rHuIFNα-2b的多核苷酸序列或氨基酸序列的相似性比较

具体实施方式

实施例1干扰素α基因的扩增

总mRNA来源于人外周血白细胞。IFNα的cDNA通过PCR方法扩增，扩增条件如下：2.5μl 10倍扩增缓冲液，0.75μl的10mM dNTPs，0.5μl 25mM硫酸镁，0.25μl多聚合酶，0.75μl mRNA，0.75μl的5′端引物(10μM，IFNα05：5′-tggtgctcagct(a/g)caagtc-3′)(SEQ ID NO 11)，0.75μl的3′引物混合物(1.7μm/each；IFNα03-1：5′-aatcatttccatgttg(a/g)accag-3′(SEQ ID NO 12)；IFNα03-2：5′-aatcatttcccggttgtaccag-3′(SEQ ID NO 13)；IFNα03-3：5′-aatcatttccatgttgaaacag-3′(SEQ ID NO 14)；IFNα03-4：5′-aatcatttcaagatgagcccag-3′(SEQ ID NO 15)；IFNα03-5：5′-aatgattttcatgttgaaccag-3′(SEQ ID NO 16)；IFNα03-6：5′-aatcattt(c/g)(c/g)atgttgaaccag-3′(SEQ ID NO 17)，IFNα03-7：5′-atgcccctgtccttttctttac(SEQ ID NO 18)；IFNα03-8：5′-gagtcgtttctgtgttggatcag-3′)(SEQ ID NO 19)。

扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离，凝胶纯化，并根据制造商的建议方法克隆到pCRII-TOPO或pCR-4-TOPO载体中。利用ABI自动测序仪进行插入片段的DNA序列分析。

克隆的所有12种人干扰素α基因都分别与GeneBank中的序列比较，这些基因的GeneBank登录号分别为NM_024013(IFN-α1)，NM_000605(IFN-α2)，NM_010504(IFN-α4)，NM_010505(IFN-α5)，NM_008335(IFN-α6)，NM_008334(IFN-α7)，NM_008336(IFN-α8)，NM_002171(IFN-α10)，NM_002172(IFN-α14)，NM_002173(IFN-α16)，NM_021268(IFN-α17)，NM_002175(IFN-α21)一致。

实施例2构建人干扰素α基因分子杂交文库

为构建穿梭(shuffling)质粒，根据每个HuIFN-α的核苷酸序列，分别设计了5’和3’端引物，其中5’端引物带BamHI切点，3’ 端引物带EcoRI切点。以上述克隆的带有干扰素α基因的为模板，通过标准的PCR反应扩增出12种HuIFN-α的开放阅读框(Open readingframe，ORF)，BamHI和EcoRI酶切后，与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，最后进行序列分析，验证构建的带人干扰素α基因的质粒。

分别以前述构建的12种带人干扰素α基因的质粒为模板，以BVF4：5′-agggcagcattcaaagcag-3′(SEQ ID NO 20)和BVR3：5′-tcagaccgcttctgcgttctg-3′(SEQ ID NO 21)为引物，进行PCR扩增，并将扩增的产物等量混合。随后按照文献(Stemmer WPC.DNAshuffling by random fragmentation and reassembly：In vitrorecombination for molecular evolution.PNAS vol：91：10747-10751，1994)介绍的方法进行DNase I酶解和PCR组装。

以PCR组装的产物为模板，用引物BVF：5′-gaaggctttggggtgtgtg-3′(SEQ ID NO 22)和BVR：5′-aatcttctctcatccgc-3′(SEQ ID NO 23)，进行二次扩增。二次扩增产物用BamHI和EcoR I与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，即为人干扰素α基因分子的杂交文库。

在以上所有PCR扩增和PCR组装中，都使用普通的DNA聚合酶(NewEngland Biolab，USA)，而不是高保真DNA聚合酶。

实施例3筛选分子杂交文库

新鲜转化的大肠杆菌DH5α直接涂布接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并于37℃下过夜。挑单个菌落接种于96孔板，每孔内有100μl含50μg/ml的氨苄青霉素LB培养基(LBA)，37℃震荡培养过夜。次日，取10μl饱和生长的细菌培养物依次接种于96孔板(复制板)，每孔内有100μl LBA培养基；原细菌培养板，暂时贮存于4℃(储存板)。将复制板置于30℃，震荡培养至OD₆₀₀＝0.4，然后快速升温至42℃。经过4小时的热诱导，细菌培养板直接移入-80 ℃冰箱，并冻融两次。然后，再细菌裂解物液稀释至所需的浓度，吸样加至Daudi细胞培养体系内测试抗肿瘤细胞增殖活性，或加至Wish细胞的培养体系内测试抗病毒活性。

每一轮大约筛选10,000菌落，初步筛选出100个抗肿瘤细胞增殖或抗病毒活性最高的菌落，进入进一步验证性测试：依据上述选定的活性最高的细菌培养物编号，从储存板上将保存的细菌划线接种于LBA平板，37℃下培养过夜，次日挑单菌落接种于1毫升的LBA液体培养基，30℃、250rpm震荡过夜。然后，将40μl经培养的细菌接种在另一组试管之一中，试管中含有1ml加了氨苄青霉素(50μg/ml)的LB。然后，按上文中介绍的初筛步骤，让样品经历以下步骤：42℃诱导表达、收集细菌培养物、冷冻-解冻循环处理，测试每一个细菌裂解物液抗肿瘤细胞增殖活性和抗病毒活性。

每一轮筛选过程中，经过验证性测试后选取约20个抗肿瘤细胞增殖或抗病毒活性最高的菌落，提取质粒，用BVBF：5′-accatgaaggtgacgctc-3′(SEQ ID NO 25)为引物对质粒及其插入片段进行自动DNA序列分析。在序列分析的基础上，剔除个别DNA序列完全相同的克隆，然后用表达载体pBVB的多克隆位点上游和下游的侧翼序列，设计引物BVBF：5′-accatgaaggtgacgctc-3′(SEQ ID NO 25)和BVR：5′-aatcttctctcatccgc-3′(SEQ ID NO 24)进行PCR扩增，产物用于下一轮改组文库的构建，然后重复上述筛选步骤。

从上述五轮筛选中得到的5个抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性最高的大肠杆菌克隆，提取质粒并测序，其所带的、编码新型蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO1-5)分别命名为SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5；依据密码子表，上述多核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO 6-10)相应为SEQID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10。上述含多核苷酸序列(SEQ ID NO 1-5)的质粒用于下一步构建重组表达质粒和工程菌。

实施例4在大肠杆菌中表达并纯化重组干扰素样蛋白

将人工添加起始密码子ATG的SEQ ID NO 1-5的多核苷酸序列分别克隆入温度可诱导的pBVB载体中，位于λPRPL启动子的调控之下，重组表达质粒名称分别为pBVBNF1、pBVBNF2、pBVBNF3、pBVBNF4、pBVBNF5。将重组表达质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中。分别挑取单个菌落，接种于2ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在30℃下振荡培养8小时。然后取2ml培养的细菌，进一步用50ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并在30℃下振荡培养过夜。再将上述细菌按1∶10～1∶20的比例接种于含50μg/ml氨苄青霉素的大体积的LB培养基中，并于30℃下振荡培养。当培养物达到指数生长中期时(A₅₅₀＝0.5～0.6)，将培养温度快速升高至42℃并维持4小时，以便诱导干扰素样蛋白的表达。经过4小时的热诱导后，将细菌离心并用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂PO₄，2mMKHPO₄)洗涤3次，然后保存在-80℃直至进行纯化。

将菌体按1∶10的比例悬浮于20mM PB、0.5M NaCl、pH 7.6的缓冲液中，2～8℃搅拌至全溶，进行超声破碎。在冰浴条件下600W工作5s，间隔9.9s，共12min。镜检破菌率大于85％，将菌体破碎后的悬液10000rpm、25min离心，收获破菌上清液。上清液按1∶25比例用1M NaCl溶液稀释，酸化调pH至3～4。4℃放置2小时后离心。0.45μm过滤，滤出液用碱调pH至7.6～8.0，上色谱柱层析。

将上清液加载至Phenyl Sepharose 6快速流动柱(GEHealthcare，US)上并通过。将含有目的蛋白组份加到POROS 50D柱(Applied Biosystem，US)柱进行纯化。最后，将收集到的干扰素样蛋白分子进一步用HiLoad 26/100 Superdex 75pg(Amersham，Us)进行纯化，得到蛋白纯品干扰素样蛋白。将纯化的干扰素样蛋白分别命名为Novaferon1、Novaferon2、Novaferon3、Novaferon4、Novaferon5，其相应的氨基酸序列为SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10。

纯化的干扰素样蛋白经过15％的SDS-PAGE检测验证，结果显示重组干扰素样蛋白均为一条带，分子量(MW)为19～20KDa。等电点5.6～7.6。高分辨质谱分析表明，纯化的重组干扰素样蛋白分子纯度大于98％，分子量均为19.3KDa。

实施例5重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)的抗病毒活性

按照《中华人民共和国药典》2005年版三部附录XC细胞病变抑制法进行测定。WISH细胞、水疱性口炎病毒(VSV)及rHuIFNα-2b标准品由中国药品生物制品检定所提供。

将生长24～48h的Wish细胞(于含10％小牛血清的MEM培养基)配成细胞浓度约为3×10⁵/ml的悬液，加到96孔细胞培养板上，100μl/孔。同时设立标准品对照孔，体积与样品相同。在含5％CO₂，37℃孵箱中培养4～6h后，每孔加入4倍系列稀释的干扰素样蛋白(Novaferon1-5)样品100μl，样品稀释用含7％小牛血清的MEM培养液，37℃培养18～24h。弃上清后用含3％小牛血清MEM培养基稀释的VSV病毒(100TCID₅₀)攻击，然后于含5％CO₂，37℃孵箱中培养24h左右。弃掉培养板中的上清液，每孔加入40μl的结晶紫液室温染色30min，弃掉染液，用自来水冲洗残余的染液，用滤纸吸干后每孔加入100μl的脱色液脱色，在全自动酶标仪(MK3型)上于570nm波长处测定每孔的吸收值(A)。每个试验重复3次，取平均值。干扰素样蛋白(Novaferon1-5)与rHuIFNα-2b标准品在同一块板中测试。

纯化的干扰素样蛋白(Novaferon 1-5)在经典的WISH-VSV体系中测得的抗病毒活性分别为2.2×10⁹IU/mg、2.5×10⁹IU/mg、3.0×10⁹IU/mg、2.5×10⁹IU/mg、2.7×10⁹IU/mg。而rHuIFNα-2b标准品的抗病毒活性为2.0×10⁹IU/mg。实验结果表明，干扰素样蛋白(Novaferon1-5)的抗病毒活性为rHuIFNα-2b的11～15倍。

实施例6重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)的抗肿瘤细胞增殖活性

人肿瘤细胞株如下：结肠癌细胞株DLD-1、LS180、人前列腺癌细胞株PC-3、DU-145、人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、人胃癌细胞株MKN-1、人黑色素瘤细胞株A375、人肺腺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株MCF-7、人B淋巴瘤细胞株Daudi、人T淋巴瘤细胞株CCRF-CEM、髓性白血病细胞株HL-60(S)(表1)，购自中国医学科学院基础医学研究细胞库。用含10％胎牛血清的1640培养液培养，其中A375用含10％胎牛血清的DMEM培养液(高糖)。

处于指数生长期的细胞经胰酶消化后，计数，稀释成适当浓度的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，接种细胞数见表1，待细胞完全贴壁后，加入重组人干扰素样蛋白(Novaferon 1-5)或rHuIFNα-2b，50μl/孔，Novaferon 1-5的终浓度在100pmol/L～0.0001pmol/L之间，rHuIFNα-2b的终浓度在500pmol/L～0.01pmol/L之间。培养6天后，加预冷的50％TCA液，50μl/孔，使其终浓度为10％三氯醋酸(TCA)。固定，4℃1小时。弃固定液，用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入100μl磺基罗丹明B(SRB)液，室温放置10分钟，未与蛋白结合的SRB用1％醋酸洗5遍，空气干燥，用150μl/孔10mmol/L Tris碱溶液(pH10.5)溶解结合的SRB，用酶标仪在540nm波长测其吸光度(A)。实验设培养液对照孔(用培养液代替重组人干扰素样蛋白或rHuIFNα-2)，所有浓度设三个重复孔。肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(培养液对照孔A值-受试药物A值)/培养液对照孔A×100％，再用Origin2.94软件拟合得出半数生长抑制浓度(IC₅₀)。

结果发现，重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)均具有显著的抗肿瘤细胞增殖活性，其IC₅₀与普通HuIFNα-2b比较，低50倍以上，表明这些蛋白对实体瘤和血液系统肿瘤均具有显著的抑制作用(表2-表6)。

表1实验所用细胞株及接种的细胞数量

表2Novaferon1和HuIFNα-2b抑制肿瘤细胞生长的IC₅₀及两者之比

表3Novaferon2和HuIFNα-2b抑制肿瘤细胞生长的IC₅₀及两者之比

表4Novaferon3和HuIFNα-2b抑制肿瘤细胞生长的IC₅₀及两者之比

表5Novaferon4和HuIFNα-2b抑制肿瘤细胞生长的IC₅₀及两者之比

表6Novaferon5和HuIFNα-2b抑制肿瘤细胞生长的IC₅₀及两者之比

实施例7重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)抑制裸鼠移植人肿瘤生长试验

采用人肝癌HepG2细胞、人结直肠癌LS180细胞、人白血病HL-60 (s)细胞和人黑色素瘤A375细胞，移植在裸鼠皮下，观察重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)的体内抗肿瘤效果。

Balb/c裸鼠，4-6周，体重14～16g，雌性，SPF级，购自中国医学科学院实验动物研究所，饲养于国家北京药物安全评价研究中心(屏障环境)。动物实验室空气定时排风，室温16～25℃，湿度40～70％，光照12小时明暗交替。每笼饲养5只动物，喂食实验动物中心专门为小鼠配制的饲料，每天上、下午定时各饲食和加消毒水1次。试验开始前，观察动物进食、活动和精神等1周。实验动物许可证号SCXK京2005-0013。实验动物使用许可证号SYXK(军)2002-016。rHuIFNα-2b注射液商品名为甘乐能，先灵葆雅(不列纳)有限公司(SP(Brinny)Company)生产。

取裸鼠体内传二代的指数生长期的人肝癌细胞株HepG2、人结直肠癌LS180细胞、人白血病HL-60(s)细胞和人黑色素瘤A375细胞，用PBS洗涤二次，配成如下细胞浓度：HepG2细胞为6×10⁶/0.3ml、LS180细胞为4×10⁶/0.3ml、HL-60(s)细胞为2×10⁷/0.3ml、A375细胞为8×10⁶/0.3ml，接种于右下肢外侧皮下。接种后8天(瘤体积约为150mm³)后，取在接种部位可明显触及肿块的裸鼠，按肿瘤体积大小均衡的原则分组。

上述荷瘤裸鼠分成以下几组：模型对照组、Novaferon1低剂量组和高剂量组、Novaferon2低剂量组和高剂量组、Novaferon3低剂量组和高剂量组、Novaferon4低剂量组和高剂量组、Novaferon5低剂量组和高剂量组和rHuIFNα-2b低剂量和高剂量组。低剂量和高剂量分别为20μg/kg、100μg/kg。每组为8～10只。每周称体重1次，按体重调整给药量。分组后当天开始给药，给药体积为0.3ml，模型对照组注射同样体积的PBS。给药途径为sc，每天给药一次，连续给药时间为21天。实验结束称体重后，采用安死术处置小鼠，小心剥离瘤块，称瘤重。肿瘤生长抑制率(％)＝(模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重)×100。

结果表明，分别接种多株人肿瘤细胞后，给予Novaferon1-5，均能显著裸鼠皮下肿瘤细胞的生长，以对LS180细胞比较敏感，Novaferon5的作用较强，以高剂量的作用较为明显，Novaferon1-5的作用显著强于同剂量的阳性对照药物rHuIFNα-2b(表7)。

表7Novaferon(1-5)或rHuIFNα-2b抑制裸鼠移植人肿瘤细胞生长试验

实施例8重组人干扰素样蛋白(Novaferon1-5)抗HBV试验

利用分泌HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞观察系列人干扰素样蛋白的抗HBV活性。胰蛋白酶消化2.2.15细胞后分散成单个细胞悬液，接种于96孔板，2×10⁴/180l/孔。待细胞贴壁后加不同浓度的Novaferon1-5或rHuIFNα-2b，浓度分别为0.1、0.01pmol/L，20

l/孔。每个浓度2个复孔，设细胞对照孔和培养液对照孔。37℃、5％CO₂孵育9d。培养至3天和6天时分别换含药物的培养液各1次。

取上述细胞培养上清40l/孔，加等量DNA提取液吹匀。沸水浴 10分钟(误差不超过1分钟)，转至4℃静置8～12小时以保证病毒颗粒充分裂解。10,000rpm离心5分钟，取上清保存DNA于4℃备用。

吸取上清后，在余下每孔细胞中加300l核裂解液。吹打均匀至细胞充分裂解，同一浓度的两孔合转移至一个1.5ml EP管中合并。加3lRNA酶，颠倒3-5次，37℃，15-30min，室温冷却5min。加200l蛋白沉淀液，涡旋20秒，水浴5min。离心16000g，4min(可见蛋白沉淀成白色球状)。小心吸上清至另一含600l室温异丙醇的1.5ml EP管中，轻轻颠倒数次至DNA呈线状物质出现。离心16000g，4min(DNA呈白色针点状物质出现)，小心用吸水纸吸去上清。加70％室温乙醇600l，轻轻颠倒洗DNA，离心16000g，1min，室温。小心用吸水纸吸去上清。室温，置于吸水纸上，风干，10～15min，加100ml DNA再水合液。65℃，1h，期间，间隔轻敲EP管底部，离心，6000rpm，数秒。检测DNA浓度后，保存DNA于-20℃。以上基因组DNA在核酸蛋白检测仪上测OD₂₆₀计算相应的DNA浓度。并根据测得的浓度取其10

l将其稀释至同一浓度。

取2lHBV上清DNA(或2l稀释至同一浓度的基因组DNA)，加入HBV DNA PCR荧光检测试剂盒中的PCR反应管中(已加入HBV DNA特异性引物、一条HBV DNA特异性荧光探针、耐热Taq DNA聚合酶、四种核苷酸单体(dNTPs)、PCR反应液)。同时取试剂盒中自带阳性标准品，10倍稀释设5(4)个浓度梯度，分别对应于HBV DNA拷贝数1×10⁸，1×10⁷，1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴。加入PCR反应管中，做标准曲线进行质量控制，最低检测限为1×10³基因拷贝/反应。6,000rpm离心数秒，放入ABI 7000实时定量PCR仪中。反应条件按照试剂盒说明书。

结果显示，Novaferon1-5的高、中浓度都有抑制HepG2.2.15上清和细胞中HBV DNA拷贝数的效果，高浓度效果优于低浓度。rHuIFNα-2b高浓度也有抑制作用，但低浓度作用比较弱(表8)。预试验结果发现，Novaferon和rHuIFNα-2bIFNα-2b对2.2.15细胞株的HBsAg和HBeAg分泌影响不明显，文献报道也如此，故本研究不测细胞培养上清中HBV抗原的水平。此结果表明，Novaferon1-5有显著的抑制HBVDNA复制的活性。

表8Novaferon1-5对HepG2.2.15细胞HBV DNA拷贝数的影响

注：抑制率＝(细胞对照中HBV DNA的拷贝数-样品中HBV DNA的拷贝数)/细胞对照中HBV DNA的拷贝数×100％

序列表

<110>杰华生物技术(北京)有限公司

<120>人干扰素样蛋白及其用途

<130>2008-12-24

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID NO 1

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttga atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg cggactccat cctggctgtg 360

aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgatggaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagtaga aatcatgaga tccctctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaaggg ggaaggat 498

<210>SEQ ID NO 2

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgtaatctgt ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttga atttccccag 120

gaggagtttg atggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg cggactccat cctggctgtg 360

aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgatggaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagtaga aatcatgaga tccctctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaaggg ggaaggat 498

<210>SEQ ID NO 3

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgtaatctgt ctcaaaccca cagcctgggt agcaagagga ccttgatgct cctggcgcag 60

atggggaaaa tctccctttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttga atttccccag 120

gaggaatttg atggcaacca gttccagaaa gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180

atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240

ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctttat ctgatggaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagtaga aatcatgaga tccctctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480

agattaaggg ggaaggat 498

<210>SEQ ID NO 4

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tgtaatctgt ctcaaaccca cagcctgggt agcaagagga ccttgatgct cctggcgcag 60

atggggaaaa tctccctttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttga atttccccag 120

gaggaatttg atggcaacca gttccagaaa gctcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggaatcat ctgctgcttg ggatgagggc 240

ctcctagaca aattccgcac cgaactctac cggcagctaa atgacttgga agcctgtatg 300

atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg 360

aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa 480

agattaaggg ggaaggat 498

<210>SEQ ID NO 5

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tgtaatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaagagga ccttgatgct cctggcgcag 60

atgaggaaaa tctccctttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttga atttccccag 120

gaggaatttg atggcaacca gttccagaaa gctcaaacca tctctgtcct ccatgagctg 180

atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggaatcat ctgctgcttg ggatgagggc 240

ctcctagaca aattccgcac cgaactctac cggcagctaa atgacttgga agcctgtatg 300

atacaggagg ttggggtgac agagactccc ctgatgaagg cggactccat cctggctgtg 360

aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc 420

tgggaggttg tcagagtaga aatcatgaga tccttttctt tttcaacaaa cttgcaagaa 480

agattaaggg ggaaggaa 498

<210>SEQ ID NO 6

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Val Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Gly Lys Asp

165

<210>SEQ ID NO 7

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Lys Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Val Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Gly Lys Asp

165

<210>SEQ ID NO 8

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Lys Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Gly Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Val Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Gly Lys Asp

165

<210>SEQ ID NO 9

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

1 5 10 15

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe

20 25 30

Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Gly Lys Asp Ile Gln

35 40 45

Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Glu Ser Ser Ala Ala Trp Asp

50 55 60

Glu Gly Leu Leu Asp Lys Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Arg Gln Leu Asn

65 70 75 80

Asp Leu Glu Ala Cys Met Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro

85 90 95

Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Cys Asn Leu Ser Gln Thr

100 105 110

His Ser Leu Gly Ser Lys Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Gly

115 120 125

Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe

130 135 140

Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile

145 150 155 160

Ser Val Leu His Glu Leu

165

<210>SEQ ID NO 10

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Cys Asn Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Lys Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Thr Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Glu Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Gly

65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Arg Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Met Ile Gln Glu Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Lys Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145 150 155 160

Arg Leu Arg Gly Lys Glu

165

<210>SEQ ID NO 11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>variation

<222>(13)..(13)

<223>n＝a/g

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>n为a，c，g，or t

<400>11

tggtgctcag ctncaagtc 19

<210>SEQ ID NO 12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>variation

<222>(17)..(17)

<223>n＝a/g

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>n为a，c，g，or t

<400>12

aatcatttcc atgttgnacc ag 22

<210>SEQ ID NO 13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aatcatttcc cggttgtacc ag 22

<210>SEQ ID NO 14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aatcatttcc atgttgaaac ag 22

<210>SEQ ID NO 15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

aatcatttca agatgagccc ag 22

<210>SEQ ID NO 16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

aatgattttc atgttgaacc ag 22

<210>SEQ ID NO 17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>variation

<222>(9)..(9)

<223>n＝c/g

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(10)

<223>n为a，c，g，or t

<220>

<221>variation

<222>(10)..(10)

<223>n＝c/g

<400>SEQ ID NO 17

aatcatttnn atgttgaacc ag 22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

atgcccctgt ccttttcttt ac 22

<210>SEQ ID NO 19

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

gagtcgtttc tgtgttggat cag 23

<210>SEQ ID NO 20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

agggcagcat tcaaagcag 19

<210>SEQ ID NO 21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

tcagaccgct tctgcgttct g 21

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gaaggctttg gggtgtgtg 19

<210>SEQ ID NO 23

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

aatcttctct catccgc 17

<210>SEQ ID NO 24

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

aatcttctct catccgc 17

<210>SEQ ID NO 25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

accatgaagg tgacgctc 18

Claims

1.蛋白质，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、或SEQ ID NO 10。

2.多核苷酸，其特征在于其编码权利要求1所述的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其序列为选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的蛋白质在制备下述药物中的用途：抗肿瘤药物或抗病毒药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述药物为与药学上可接受的载体、辅料或赋形剂组成的组合物。

6.根据权利要求4-5中任一项所述的用途，其中所述的肿瘤包括肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、食管癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌。

7.根据权利要求4-5中任一项所述的用途，其中所述的病毒包括乙型肝炎病毒和水疱性口炎病毒。

8.药物组合物，其包含权利要求1所述的蛋白质以及任选的药学上可接受的载体。

9.一种微生物，其包含权利要求2-3中任一项所述的多核苷酸。