CN114805539B - 一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用，该突变体重组蛋白是将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，第102位由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，并在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”。重组蛋白的制备方法包括：将上述猪干扰素α17突变体两端引入酶切位点后合成；将合成的片段和pVB220质粒进行酶切后纯化并用T4连接酶连接；转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，接种培养；将包涵重组表达质粒菌落进行温度诱导表达；培养结束后将菌液离心，收集菌体；将菌体进行超声破碎后，重悬浮包涵体，并进行分离纯化，即得。该重组蛋白应用于抗VSV或抗PRV药物或疫苗制备。
Description
技术领域
本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用。
背景技术
干扰素(interferon,IFN)是一类具有抑制肿瘤形成、抗病毒、免疫调节和调节细胞生长等生物学功能的细胞因子。根据其生物学活性和抗原活性分为三类：第一类是由病毒诱导白细胞产生的α干扰素(IFN-α)；第二类是由病毒诱导纤维母细胞产生的β干扰素(IFN-β)，与α干扰素(IFN-α)具有共同的表面受体，都属于Ⅰ型干扰素；第三类是由病毒诱导淋巴细胞产生的γ干扰素(IFN-γ)，与α干扰素(IFN-α)、β干扰素(IFN-β)的表面受体不同，属于Ⅱ型干扰素。其中Ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒功能，Ⅱ型干扰素抗病毒功能稍弱，但免疫调节功能较强。
猪的Ⅰ型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β，其中目前发现猪的IFN-α有17个亚型，而IFN-β只有1个亚型。不同的猪IFN-α亚型序列的同源性较高，但由于不同干扰素亚型结构上的差异导致其抗病毒活性和其他生物活性(抗病毒活性、抗炎活性、MHC调节、复制性T细胞的调节)存在差异。尽管目前已开发出部分干扰素产品应用于猪传染性疫病的预防与治疗，但猪干扰素的临床应用仍然存在体内半衰期短、需要大剂量频繁给药、全身毒副作用强等问题，从而使其临床应用具有较多的局限性。因此，进一步开发新一代的高活性、低毒长效的干扰素用于临床疫病防治具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法与应用以解决上述问题。本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白，是将SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，第102位由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，并在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
第二个方面，本发明提供一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述猪干扰素α17突变体蛋白两端引入限制性内切酶BamH I和HindⅢI酶切位点后进行基因合成，得到IFN-α17基因片段；
(2)将所述IFN-α17突变体基因片段和pVB220质粒用限制性内切酶BamHI、HindⅢ酶切后纯化，纯化后的基因片段用T4连接酶连接；
(3)将T4连接酶连接后的基因片段转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，接种含氨苄的LB培养基培养，提取质粒后进行酶切鉴定，并将鉴定的阳性质粒测序，获得重组表达质粒pVB220-poIFN-α17-7m；
(4)将重组表达质粒pVB220-poIFN-α17-7m菌落接种至含氨苄的LB培养基进行温度诱导表达；
(5)培养结束后将菌液离心，收集菌体，弃上清，加入中性PBS多次洗涤菌体，离心后将菌体在缓冲液中悬浮混匀，加入PMSF和溶菌酶，冰上孵育一段时间；
(6)将菌体进行超声破碎后加入裂解液悬浮包涵体，并进行分离纯化，即得。
进一步地，所述步骤(3)中接种含氨苄的LB培养基培养的控制参数为：37℃、200rpm条件下振荡培养16-18h。
进一步地，所述步骤(4)中温度诱导表达的控制过程为：接种至含氨苄的LB培养基后先于37℃、180rpm条件下振荡培养16-18h，然后转接新的氨苄阳性LB培养基，并于30℃、180rpm条件下培养至菌液OD为0.6-0.8，再于42℃、200rpm条件下振荡培养4-8h。
优选地，所述步骤(5)中离心操作的控制参数为：转速6000rpm，离心时间15min。
进一步地，所述步骤(5)中菌体与缓冲液的重量体积比为1:10。
可选地，所述缓冲液按照终浓度的成分组成包括：NaH2PO4 50mM，NaCl 300mM，pH＝8.0。
优选地，所述步骤(5)中PMSF终浓度为1mM，溶菌酶终浓度为0.2-0.4mg/mL。
进一步地，所述步骤(6)中采用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱进行重组蛋白的分离纯化。
第三个方面，本发明提供上述猪干扰素α17突变体重组蛋白在制备抗猪水泡性口炎病毒(VSV)或抗猪伪狂犬病病毒(PRV)药物上的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明通过氨基酸突变的方式获得了新型干扰素突变基因序列，并采用大肠杆菌表达系统表达了猪干扰素α17突变体基因序列，采用亲和层析纯化后，结果证明突变后的猪干扰素α17蛋白在PK-15细胞上能有效的抑制VSV和PRV的复制，较比现有的猪α干扰素抗病毒活性有所提高(如图7、图8、图9所示)。因此，该猪干扰素α17突变体重组蛋白有望制备成抗VSV或抗PRV药物。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1中重组表达质粒pVB220-IFNα17m-7m酶切鉴定结果。
图2为本发明实施例2中纯化后重组poIFN-α17和poIFN-α17-7m蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图3为本发明实施例2中Western-blot实验鉴定重组poIFN-α17和poIFN-α17-7m蛋白结果图。
图4为本发明实施例3中在PK-15细胞上检测重组poIFN-α17和蛋白的细胞毒性。
图5为本发明实施例3中在PK-15细胞上重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白对VSV的抗病毒活性检测。
图6为本发明实施例3中在PK-15细胞上检测重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白对PRV的抗病毒活性，其中图6-1为采用荧光定量PCR检测细胞内PRV的RNA水平，图6-2为检测细胞上清PRV病毒TCID50。
图7为本发明实施例4中在PK-15细胞上检测重组poIFN-α17-7m和其它亚型(poIFN-α2、5、8、14、huIFN-α2)的抗VSV活性对比图。
图8为本发明实施例4中在PK-15细胞上检测重组poIFN-α17-7m和其它亚型(poIFN-α2、5、8、14、huIFN-α2)的抗PRV活性对比图，其中图8-1为细胞上清PRV滴度，图8-2为荧光定量PCR检测细胞内PRV RNA水平。
图9为本发明实施例3以及实施例4中荧光定量PCR试验检测重组poIFN-α17-7m和其它亚型(poIFN-α2、5、8、14、17、huIFN-α2)诱导干扰素下游基因(MX1、OAS1、ISG15)的水平对比图。
图10为本发明实施例5中重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白体内抗病毒活性检测，其中图10-1为攻毒后1-4天肺脏VSV病毒滴度，图10-2为攻毒后1-4天大脑病毒滴度，图10-3为攻毒后1-4天脊髓病毒滴度，图10-4为攻毒后1-7天小鼠体重变化。
具体实施方式
本发明的猪干扰素α17突变体基因经上海生物工程有限公司合成获得。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
猪IFN-α17突变体的获得和猪IFN-α17突变体重组质粒的构建
1.实验方法
1.1目的基因的合成和重组质粒的构建
从Genebank上获得猪干扰素α17基因序列(poIFN-α17(GenBankaccessionNo.GQ415071)，如SEQ ID NO:1所示，该序列编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。用DNAstar软件进行序列比对和分析后，我们将poIFN-α17的氨基酸位点和干扰素序列羧基端序列进行了一系列的突变，以找寻最优的突变方式，具体如下：
1)将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，命名为突变体1(poIFN-α17-1m)；
2)将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第40位亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)，命名为突变体2(poIFN-α17-2m)；
3)将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第88位苯丙氨酸(F)突变为丝氨酸(S)，命名为突变体3(poIFN-α17-3m)；
4)将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第102氨基酸由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，命名为突变4(poIFN-α17-4m)；
5)将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第127位氨基酸缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，命名为突变5(poIFN-α17-5m)；
6)将如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”；命名为突变体6(poIFN-α17-6m)；
7)通过将上述突变的突变体进行大肠杆菌表达与纯化，在细胞上测定突变体1-6表达干扰素体外抗病毒活性后(详见实施例3)，发现将66位、102位和C端氨基酸突变后能显著提高干扰素的体外抗病毒活性，于是将66位、102位和C端氨基酸同时突变，构建突变体，命名为突变体7(poIFN-α17-7m)。
设计获得突变体后，在poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m突变体编码核苷酸上下游分别引入BamH I和HindⅢI酶切位点。将poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m突变体核苷酸序列送上海生物工程有限公司进行基因合成。
1.2poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m表达载体的构建
将合成的poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m突变体基因片段和pVB220质粒分别用BamHI、HindⅢ酶切后，采用凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化后片段用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，加入有氨苄抗性的LB平板过夜培养，挑取单克隆，接种氨苄抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养16-18h后，提取质粒，采用BamH I、HindⅢ限制性内切酶进行酶切鉴定，并将质粒命名为pVB220-poIFNα17和pVB220-poIFN-α17-1-7m。
2.实验结果
2.1poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m核苷酸和氨基酸序列的突变
从Genebank上获得猪干扰素α17基因序列(poIFN-α17(GenBankaccessionNo.GQ415071)，序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列SEQ ID NO.2所示。用DNAstar软件分析比对后，将所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，命名为突变体1(poIFN-α17-1m)，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；第40位亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)，命名为突变体2(poIFN-α17-2m)，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；第88位苯丙氨酸(F)突变丝氨酸(S)，命名为突变体3(poIFN-α17-3m)，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；第102氨基酸由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，命名为突变4(poIFN-α17-4m)，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；第127位氨基酸缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，命名为突变5(poIFN-α17-5m)，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”；命名为突变体6(poIFN-α17-6m)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；将66位、102位和C端氨基酸同时突变，命名为突变体7(poIFN-α17-7m)。其中poIFN-α17-7m抗病毒活性优于其它突变体(详见实施例3)，所述突变体7的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，对应的核苷酸序列为SEQID NO.4所示。将干扰素poIFN-α17和(poIFN-α17-1-7m)核苷酸序列在上下游分别加入BamHI和HindⅢ后，送上海生物工程有限公司进行序列合成。
2.2poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m表达载体的构建
将构建的表达质粒pVB220-poIFN-α17-1-7m用BamH I和HindⅢ进行双酶切,进行琼脂糖凝胶电泳后，在3700bp、543bp、567bp位置出现目的条带，与预期大小一致，如图1所示。将质粒送上海生物工程有限公司测序，结果正确。
实施例2
重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m的鉴定
1.实验方法
1.1重组poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m的表达和纯化
将pVB220-IFNα17、pVB220-IFNα17-1-7m阳性菌株挑取单克隆后，接种氨苄抗性LB液体培养基，先于37℃、180rpm振荡培养16-18h，然后转接新的氨苄阳性LB培养基，并于30℃、180rpm条件下振荡培养至菌液OD值在0.6-0.8之间。将菌液转移至42℃、200rpm条件下振荡培养4-6h；收集菌体，离心6000rpm，15min，弃上清，加入PBS(PH＝7.0)洗涤菌体，6000rpm离心15min，重复清洗一次。按照菌体:溶解buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH＝8.0)1:10(W/V)将菌体悬浮混匀，加入终浓度为1mM PMSF和0.2-0.4mg/mL溶菌酶，冰上孵育20min。将菌体用超声破碎仪进行超声，设置功率为5％，超声5s间歇5s，超声25min至菌液澄清。将破碎液转移至离心管中，15000g，4℃离心20min，弃上清。用菌体裂解液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，6M guanidinehydrochloride，pH＝8.0)将包涵体悬浮。采用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱对重组poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m蛋白进行分离纯化。分段收集流出液，每一个柱体积收集一管，分别对纯化后的蛋白进行检测。
1.2SDS-PAGE对表达和纯化干扰素蛋白进行鉴定
将表达的重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的表达和纯化。
1.3western-blot对表达和纯化的干扰素蛋白进行鉴定
将纯化后的重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白进行SDS-PAGE电泳，将目的蛋白转印NC膜，23V电压转印15min。采用鼠源抗猪干扰素的抗体进行western-blot试验，检测表达蛋白的特异性。
2.实验结果
2.1poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m蛋白的表达与纯化
将表达后蛋白进行SDS-PAGE电泳后，结果证明在预期位置有大小19KD蛋白，与预期结果一致，用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱进行蛋白亲和层析后，结果证明蛋白纯度达到95％以上，结果如图2所示。
2.2western-blot实验鉴定表达poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m
采用鼠抗猪干扰素的抗体进行western-blot实验，结果证明表达重组poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m具有良好的特异性，结果如图3所示。
实施例3
重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m的体外抗病毒活性测定
1.实验方法
1.1重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m细胞毒性测定
用CellTiter96@AQueous one solution cell proliferation assay(Promega生物公司)检测重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m对PK-15的细胞毒性。将重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m加入PK-15细胞单层后24h，加入20μL的CellTiter
Aqueous单溶液试剂直接加入到96细胞板培养孔中，孵育1-4h。然后在96孔板读板仪上记录490nm的吸光度。在490nm测量的吸光度值与培养物中活细胞的数量直接成正比。
1.2重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m抗病毒活性的检测
首先在PK-15细胞上，检测表达重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白抗VSV的活性。将PK-15细胞铺96孔板，每孔1╳104个细胞。当细胞长成单层后，将表达的α17和poIFN-α17-1-7m蛋白2倍比稀释后加入孔内，每个蛋白稀释度4个重复，37℃5％CO2培养24h后，接种VSV病毒(1000PFU)，比较重组poIFN-α17m与poIFN-α17-1-7m蛋白抗病毒活性，并设置未感染和干扰素未处理细胞对照。24h后，将细胞用生理盐水洗涤后，将细胞固定染色液加入细胞孔内，室温处理1h，将染色固定液弃去，并用自来水冲洗3-5遍后，加入200uL 2-甲氧基乙醇溶解染色液。细胞培养板用采用分光光度计在550nm进行检测读数。采用公式计算抗病毒活性百分率,公式如下:抗病毒活性(％)＝(OD550+IFN–OD550-IFN)x 100/(OD550Mock–OD550-IFN).OD550+IFN和andOD550-IFN分别表示经VSV感染及龙胆紫染色后的干扰素处理细胞和干扰素未处理细胞的OD值；OD550Mock表示未经VSV感染细胞的OD值。
同时在PK-15细胞上，检测表达重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m蛋白抗PRV的活性，同时未感染、干扰素未处理细胞对照。采用1ng/mL poIFN-α17m蛋白处理PK15细胞24h，弃去孔内液体后，接种PRV(PFU＝1000)，24h后收集细胞，采用荧光定量PCR方法检测细胞内PRV病毒含量，同时收集上清检测其病毒TCID50。
1.3重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m诱导干扰素下游基因(ISG)表达水平
用1ng/mL纯化后的重组poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m蛋白处理PK-15细胞24h后，收集细胞，同时设置未感染、干扰素未处理细胞对照。采用荧光定量PCR方法检测细胞干扰素下游基因ISG15、Mx1、OSA1的诱导水平。
2.实验结果
2.1重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m对PK-15细胞毒性测定
采用重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m处理PK-15细胞后，加入20μL的Cell Titer
Aqueous单溶液试剂直接加入到96细胞板培养孔中，孵育1-4h。然后在96孔板读板仪上记录490nm的吸光度，结果显示poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m处理细胞和空白对照细胞吸光度无明显差别，证明重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m对PK-15无明显细胞毒性，结果如图4所示。
2.2重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m抗病毒活性的检测采用空斑减少实验在PK-15细胞上检测重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m抗VSV病毒的活性，检测结果证明重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m均能有效的抑制VSV在PK-15细胞上的复制，其中poIFN-α17-7m抗病毒活性较poIFN-α17显著提高，其最小完全抑制病毒复制的干扰素浓度为0.5ng/mL(图5)。采用1ng/mL表达重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m处理PK-15细胞后，接种PRV，收集细胞后，采用荧光定量PCR检测细胞内病毒基因的复制水平。同时，收集细胞上清并测定其TCID50，结果证明和poIFN-α17-1-7m均能有效的抑制PRV在PK-15细胞内的复制(图6)。且poIFN-α17-7m较IFN-α17抗病毒活性显著提升。
2.3重组poIFN-α17和poIFN-α17-1-7m诱导干扰素下游基因(ISG)表达水平
采用荧光定量PCR方法检测重组poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m处理细胞内的Mx1、OAS1、ISG15的表达水平，同时设置干扰素未处理组。如图9所示，结果显示，与对照组相比，poIFN-α17、poIFN-α17-1-7m都能有效的诱导Mx1、OAS1、ISG15表达水平的上调，但其中突变体7抑制效果显著高于其他干扰素处理细胞组。
实施例4
重组poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17和huIFN-α2亚型的体外活性对比
1.实验方法
1.1重组poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17和huIFN-α2亚型体外抗病毒活性对比
首先在PK-15细胞上，检测比较重组poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2蛋白抗VSV的活性。将PK-15细胞铺96孔板，每孔1╳104个细胞。当细胞长成单层后，将重组poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2蛋白2倍比稀释后加入孔内，每个蛋白稀释度4个重复，37℃、5％CO2培养24h后，接种VSV病毒(1000PFU)，并设置未感染和干扰素未处理细胞对照。24h后，将细胞用生理盐水洗涤后，将细胞固定染色液加入细胞孔内，室温处理1h，将染色固定液弃去，并用自来水冲洗3-5遍后，加入200uL 2-甲氧基乙醇溶解染色液。细胞培养板采用分光光度计在550nm进行检测读数。采用公式计算抗病毒活性百分率，计算公式同实施例3的1.2节。
同时在PK-15细胞上，检测重组poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2蛋白抗PRV的活性，同时设置未感染、干扰素未处理细胞对照。采用1ng/mL poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2蛋白处理PK15细胞24h后,弃去孔内液体，接种PRV(PFU＝1000)，24h后收集细胞，采用荧光定量PCR方法检测细胞内PRV病毒含量，同时收集上清检测其病毒TCID50。
1.2干扰素诱导干扰素下游基因(ISG)表达水平
用1ng/mL表达的poIFN-α17-1-7m、poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2蛋白处理PK-15细胞24h后，收集细胞，同时设置未感染、干扰素未处理细胞对照。采用荧光定量PCR方法检测各个重组干扰素对干扰素下游基因ISG15、Mx1、OSA1的诱导水平。
2.实验结果
2.1重组poIFN-α17和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2亚型抗病毒活性的检测，如图9和10所示
采用细胞病毒抑制实验在PK-15细胞上检测poIFN-α17和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2的抗VSV病毒的活性。检测结果证明poIFN-α17和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2均能有效的抑制VSV在PK-15细胞上的复制，其中poIFN-α17-7m抗病毒活性较其它干扰素抗病毒效果显著升高，其最小完全抑制病毒复制的干扰素浓度为0.5ng/mL(如图7所示)。
采用1ng/mL表达的poIFN-α17和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2处理PK-15细胞，采用荧光定量PCR检测细胞内病毒基因的复制水平。同时，细胞上清中TCID50检测结果证明(如图8所示)，结果表明poIFN-α17和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2处理PK-15细胞，均能有效的抑制PRV在PK-15细胞内的复制，且poIFN-α17-7m抗病毒活性显著优于其它干扰素组。
2.2干扰素诱导干扰素下游基因(ISG)表达水平
采用荧光定量PCR方法检测poIFN-α17-7m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2处理细胞内的Mx1、OAS1、ISG15的表达水平，同时设置干扰素未处理组。结果显示，与其它干扰素处理组和未处理相比，poIFN-α17-1-7m诱导Mx1、OAS1、ISG15表达的水平较其它干扰素升高显著，如图9所示。
实施例5
重组poIFN-α17m和poIFN-α2、-α5、-α8、-α14、-α17、huIFN-α2亚型表达蛋白在动物体内安全性和抗病毒活性测定
1.实验方法
1.1体内安全性测定
为了了解poIFN-α17-7m和poIFN-α17亚型表达蛋白在动物体内安全性，本实验购买雌性小鼠20只，给予腹腔注射poIFN-α17-7m、poIFN-α17亚型干扰素。注射结束后，对小鼠进行观察，每天2次-3次。观察小鼠的行为状态和局部全身反应。考察该产品的安全性。
1.2抗病毒活性测定
购买雌性小鼠60只，将小鼠分为4组，a)空白对照：给小鼠腹腔注射200uLPBS缓冲液作为阴性对照；b)病毒对照组：给腹腔注射200uL VSV病毒液；c)给小鼠腹腔注射VSV病毒1天后，给予腹腔注射poIFN-α17-7m亚型干扰素治疗。所有小鼠在感染后-2、0、1、2、3、4、5、6、7天进行称重。给小鼠安乐死后采集小鼠脑、肺和淋巴结，采用RT-PCR检测各个内脏器官病毒载量。
2.实验结果
2.1体内安全性测定
所有小鼠注射干扰素后，精神状态及生长无明显异常表现，未出现局部和全身不良症状，全部健活，无死亡状况发生。结果证明重组poIFN-α17-7m和poIFN-α17对小鼠均安全。
2.2抗病毒活性测定
实验结果显示与空白对照组比较，VSV感染小鼠体重于感染后第2天下降显著，此后，体重逐日上升。采集脏器提取RNA，采用荧光定量PCR方法检测各个脏器VSV病毒载量，结果证明干扰注射后1-3天，poIFN-α17-7m治疗组各个脏器内的VSV病毒载量显著低于poIFN-α17干扰素处理组和病毒对照组。同时，空白对照组未检测到VSV病毒RNA。结果证明重组poIFN-α17-7m蛋白在体内抑制VSV复制的效果显著优于poIFN-α17组(如图10所示)。
综上所述，本发明突变后的猪干扰素α17蛋白在PK-15细胞上能有效的抑制VSV和PRV的复制，并且较比现有的猪α型干扰素抗病毒活性均有所提高。因此，该猪干扰素α17突变体重组蛋白有望制备成抗VSV或抗PRV药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 猪干扰素α17突变体蛋白、重组蛋白的制备方法与应用
<150> 2021113446491
<151> 2021-11-15
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 181
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Claims (10)
1.一种猪干扰素α17突变体重组蛋白，其特征在于：是将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第66位由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，第102位由谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)，并在氨基酸序列C端连接氨基酸序列“QDRLRKKE”，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
2.一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的猪干扰素α17突变体蛋白两端引入限制性内切酶BamH I和HindIII酶切位点后进行基因合成，得到IFN-α17基因片段；
(2)将所述IFN-α17突变体基因片段和pVB220质粒用限制性内切酶BamH I、Hind Ⅲ酶切后纯化，纯化后的基因片段用T4连接酶连接；
(3)将T4连接酶连接后的基因片段转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，接种含氨苄的LB培养基培养，提取质粒后进行酶切鉴定，并将鉴定的阳性质粒测序，获得重组表达质粒pVB220-poIFN-α17-7m；
(4)将重组表达质粒pVB220-poIFN-α17-7m菌落接种至含氨苄的LB培养基进行温度诱导表达；
(5)培养结束后将菌液离心，收集菌体，弃上清，加入中性PBS多次洗涤菌体，离心后将菌体在缓冲液中悬浮混匀，加入PMSF和溶菌酶，冰上孵育一段时间；
(6)将菌体进行超声破碎后加入裂解液悬浮包涵体，并进行分离纯化，即得。
3.根据权利要求2所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中接种含氨苄的LB培养基培养的控制参数为：37℃、200rpm条件下振荡培养16-18h。
4.根据权利要求2所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中温度诱导表达的控制过程为：接种至含氨苄的LB培养基后先于37℃、180rpm条件下振荡培养16-18h，然后转接新的氨苄阳性LB培养基，并于30℃、180rpm条件下培养至菌液OD为0.6-0.8，再于42℃、200rpm条件下振荡培养4-8h。
5.根据权利要求2所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中离心操作的控制参数为：转速6000rpm，离心时间15min。
6.根据权利要求2所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中菌体与缓冲液的重量体积比为1:10。
7.根据权利要求6所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述缓冲液按照终浓度的成分组成包括：NaH2PO4 50mM，NaCl 300mM，pH＝8.0。
8.根据权利要求2所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中PMSF终浓度为1mM，溶菌酶终浓度为0.2-0.4mg/mL。
9.根据权利要求2所述的一种猪干扰素α17突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中采用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱进行重组蛋白的分离纯化。
10.权利要求1所述的猪干扰素α17突变体重组蛋白或者权利要求2～9任意一项所述的制备方法获得的猪干扰素α17突变体重组蛋白在制备抗VSV或抗PRV药物上的应用。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114805539A (zh) | 2022-07-29 |
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