JPH06316532A

JPH06316532A - ヒト免疫インターフェロン蛋白質含有薬剤

Info

Publication number: JPH06316532A
Application number: JP6086570A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Kikuchi; 正和菊地; Kyozo Tsukamoto; 恭造塚本; Tsutomu Kurokawa; 勉黒川
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-11-22
Filing date: 1994-04-25
Publication date: 1994-11-15
Also published as: FI81832B; IE832216L; EP0110044A1; DK430683D0; NZ205667A; FI833525A; JPS59186995A; JPS59220190A; ES527414A0; AU1934683A; ZA837057B; IE57053B1; FI833525A0; KR920001377B1; AU570219B2; IL69791A; ES8504938A1; JPS63211240A; DK430683A; KR840006676A

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト免疫インターフェロン蛋白質含有医薬組成
物を提供する。【構成】遺伝子組み換え技術により大腸菌形質転換体か
ら得られ、１０⁷Ｕ／mg以上の比活性を有し、H-Lys-Arg
-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-S
er-Gln-OHに対するモノクローナル抗体と結合し、発熱
性物質陰性で、式 H−Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln−OH で表されるアミノ酸配列を有する有効量のヒト免疫イン
ターフェロン蛋白質と生理学的に許容される担体とを含
有する注射剤である抗ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制
または免疫増強剤。【効果】本発明の夾雑蛋白質、発熱性物質が少ないヒト
免疫インターフェロンを含有する注射剤は、抗ウイル
ス、抗腫瘍、細胞増殖抑制または免疫増強剤として安全
に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、ヒト免疫インターフェロン蛋白
質含有薬剤に関する。

【０００２】

【背景技術】インターフェロン(以下ＩＦＮと略称する
ことがある。)は、高等動物の細胞がウイルスや核酸な
どの刺激によって誘発されて産生する蛋白質であり、抗
ウイルス作用、抗腫瘍作用などを有する。ヒトのＩＦＮ
には、現在α型、β型およびγ型の３種の性状の異なる
タイプが存在することが知られており、α型およびβ型
はウイルスや核酸で、γ型はマイトージエンなどで誘発
される。α型ＩＦＮ(以下ＩＦＮ−αと略称する)、β型
ＩＦＮ(以下ＩＦＮ−βと略称する)に関する研究は比較
的すゝんでおり、その産生機構もかなり解明されてきて
いる。さらに遺伝子操作技術の進歩によって、現在はＩ
ＦＮ−αとＩＦＮ−β₁が大腸菌を培養することによ
り、ＩＦＮ−α₁が酵母を培養することにより、それぞ
れ生物学的に活性な蛋白質として、大量に得られるよう
になった〔ゴエデルら、ネイチャー、２８７、４１１
(１９８０)；イエルベルトンら、ヌクレイックアシズ
リサーチ、９、７３１(１９８１)；ゴエデルら、同誌、
８、４０５７(１９８０)；ヒツツエマンら、ネイチャ
ー、２９３、７１７(１９８１)〕。さらに臨床へ応用す
るための大量生産が試みられるようになってきた。γ型
ＩＦＮ(以下ＩＦＮ−γと略称することがある。)はリン
パ球の芽球化やリンホカイン産生が起るような状況下
で、免疫担当細胞から産生されるため、免疫インターフ
ェロン(以下Ｉ−ＩＦＮと略称することがある)とも呼ば
れている。Ｉ−ＩＦＮはＩＦＮ−αやＩＦＮ−βと比較
して、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活性が高いといわれてお
り、臨床的応用面からより期待されている。しかし、そ
の産生に新鮮なリンパ球が必要であることなどの制約が
あるため、これまで効率のよい産生系は確立されていな
い。また、異なる実験系では、異なる細胞種が異なる分
子種のＩ−ＩＦＮを産生する可能性も示唆されており、
その構造や性質に関しても不明な点が多く残されてい
る。

【０００３】一方、ＩＦＮには高い種特異性があるた
め、ヒトへの応用にはヒト由来のＩＦＮが使用されなけ
ればならない。しかしながら、ヒト免疫インターフェロ
ンは量産が困難であるために、現時点では臨床への応用
が不可能であり、純度の高いヒトＩ−ＩＦＮを容易によ
り安価に大量生産できる技術の開発が望まれている。本
発明者らは、遺伝子操作技術を利用してヒトのＩ−ＩＦ
Ｎ遺伝子をクローニングし、得られた組み換えＤＮＡ分
子を宿主に移入してヒトＩ−ＩＦＮ遺伝子を発現させ、
目的とするＩ−ＩＦＮ蛋白質を得ることのできる技術の
開発研究を行い、これに基づいてさらに研究した結果、
本発明を完成するにいたった。

【０００４】

【発明の開示】本発明は、遺伝子組み換え技術により大
腸菌形質転換体から得られ、１０⁷Ｕ／mg以上の比活性
を有し、H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-
Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OHに対するモノクローナル抗
体と結合し、発熱性物質陰性で、式 H−Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln−OH で表されるアミノ酸配列を有する有効量のヒト免疫イン
ターフェロン蛋白質と生理学的に許容される担体とを含
有する注射剤である抗ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制
または免疫増強剤を提供するものである。

【０００５】グレイらは、ヒトＩ−ＩＦＮ遺伝子のひと
つをクローニングしたと考え、それから推定されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を報告した〔ネイチャー、２９
５、５０３(１９８２)〕。その後も、デボスら〔ヌクレ
イックアシズリサーチ、１０、２４８７(１９８
２)〕およびデリンクら〔同誌、１０、３６０５(１９８
２)〕により類似する発表が行われている。しかし、こ
れまでは抗ウイルス作用を有することによりＩＦＮ様物
質の存在が推定されていたのみで、現実に、実質的に純
粋なヒト免疫インターフェロン蛋白質を取得したとの報
告はない。本発明者らは、実質的に純粋な、遺伝子組み
換え技術によって得られるヒト免疫インターフェロン蛋
白質含有薬剤を確立し本発明を完成した。本発明で用い
られるヒトＩ−ＩＦＮをコードするＤＮＡは、例えば一
般式 (５') TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG−X (３') 〔式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを示す〕で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ(I)である。上記Ｄ
ＮＡ(I)は、その５'末端に５' ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC ３' (II) またはＡＴＧ(III)を有していてもよい。

【０００６】ＤＮＡ(I)はプロモーターの下流に連結さ
れていることが好ましく、これらプロモーターとしてト
リプトファン(trp)プロモーター、ラクトース (lac)プ
ロモーター、蛋白質鎖伸長因子Ｔu(tufＢ)プロモーター
が挙げられ、とりわけtrp プロモーターが好適である。
一般式(I)中、Ｘで示されるオリゴヌクレオチドのうち
でもＴＡＡが好ましい。本明細書において、アミノ酸、
ペプチド、保護基、活性基、その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ(Commission on B
iological Nomenclature)による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を〔表
１〕に挙げる。また、アミノ酸などに関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものと
する。

【表１】ＤＮＡ : デオキシリボ核酸Ａ : アデニンＴ : チミンＧ : グアニンＣ : シトシンＲＮＡ : リボ核酸 dＡＴＧ : デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ : デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ : デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ : デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ : アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ: エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ : ドデシル硫酸ナトリウムＧly : グリシンＡla : アラニンＶal : バリンＬeu : ロイシンＩle : イソロイシンＳer : セリンＴhr : スレオニンＣys : システインＭet : メチオニンＧlu : グルタミン酸Ａsp : アスパラギン酸Ｌys : リジンＡrg : アルギニンＨis : ヒスチジンＰhe : フェニールアラニンＴyr : チロシンＴrp : トリプトファンＰro : プロリンＡsn : アスパラギンＧln : グルタミンＺ : カルボベンゾキシＢoc : t−ブトキシカルボニルＭtr : ４−メトキシ−２、３、６−トリメチル
ベンゼンスルホニルＰme : ペンタメチルベンゼンスルホニルＯＢu : t−ブチルエステルＯＮＢ : Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２、３−ジカルボキシイミドエステルＤＣＣ : Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ドＤＣＵ : Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルウレアＨＯＮＢ: Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２、３−ジカルボキシイミドＨＯＢt : Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールＣＨＡ : シクロヘキシルアミンＤＣＨＡ: ジシクロヘキシルアミンＴＥＡ : トリエチルアミンＴＦＡ : トリフルオロ酢酸ＭＳＡ : メタンスルホン酸ＴＨＦ : テトラヒドロフランＤＭＰ : ジメチルホルムアミドＭeＯＨ : メタノールＡcＯＥt: 酢酸エチル

【０００７】本発明においては、例えばヒト末梢血リン
パ球などヒトＩ−ＩＦＮを分泌する細胞を培養し、培養
液からヒトＩ−ＩＦＮをコードする伝令( m )ＲＮＡを
分離し、たとえば逆転写酵素を用いて単鎖の相補( c )
ＤＮＡを合成し、二重鎖ＤＮＡに導き、プラスミドに導
入して、例えば大腸菌を形質転換させ、これよりcＤＮ
Ａ含有プラスミドを単離することによりヒトＩ−ＩＦＮ
をコードする二重鎖ＤＮＡを製造することができる。こ
こで用いられるヒト末梢血リンパ球は非感作細胞、感作
細胞のいずれでもよい。ここでＩ−ＩＦＮ誘起剤は、ヒ
トリンパ球細胞にＩ−ＩＦＮの産生を誘起させるもので
あればいかなるものであってもよい。例えば、フイトヘ
マグルチニン(ＰＨＡ)、コンカナバリンＡ(Con A)、ス
タヒロコッカルエンテロトキシンＡ(ＳＥＡ)、ノイラ
ミニダーゼ−ガラクトース酸化酵素(ＮＡＧＯ)、１２−
Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテイト
(ＴＰＡ)などが挙げられ、これらを単独またはこれらを
組合せて使用することができる。Ｉ−ＩＦＮの誘起は細
胞をＲＰＭＩ−１６４０培地やＭＥＭ培地などそれ自体
公知の培地で培養して行うことができるが牛胎児血清を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地が好ましい。培養は、温度
３５〜３９℃、望ましくは３６〜３８℃で、培養時間は
１２〜７２時間、望ましくは２２〜２６時間行われる。
細胞はそれ自体公知の方法で集め、これにＲＮase阻害
剤としてグアニジンチオシアナイド、ベントナイト、ヘ
バリン、ポリビニル硫酸、オーリントリカルボン酸、バ
ナジウム複合体、ジエチルピロカルボネイト(ＤＰＣ)、
ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)などを加えたのち、Ｎ
−ラウリルザルコシン、ツイーン８０、ノニデットＰ−
４０などを加えて細胞を溶解させてＲＮＡを抽出する。
必要により、このＲＮＡを含む抽出液にフェノール、フ
ェノール−クロロホルムなどを加えて抽出操作をくり返
したのち、エタノール沈殿でＲＮＡを集める。真核細胞
の細胞質に存在するmＲＮＡの多くは、その３'末端にポ
リＡ配列をもつことが知られているので、つぎにオリゴ
(dＴ)セルロース、ポリ(Ｕ)セファロースなどを用いて
ポリ(Ａ)ＲＮＡを集め、これをショ糖密度勾配遠心法で
分画し、この一部をアフリカツメガエル(Xenopas laev
is)の卵母細胞に注入して翻訳させる〔ガードンら、ネ
イチャー、２３３、１７７(１９７１)〕。生じた蛋白質
の抗ウイルス作用を検定し、Ｉ−ＩＦＮのmＲＮＡを含
む１２〜１６Ｓの画分を得ることができる。mＲＮＡは
ホルムアミド−ポリアクリルアミドゲル電気泳動やグリ
オキサールを用いたアガロースゲル電気泳動を用いても
精製することができる。得られたmＲＮＡを鋳型とし
て、たとえば、逆転写酵素を用い自体公知の方法で相補
的ＤＮＡ(cＤＮＡ)鎖を合成し、cＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ
への変換を行う〔マニアチスら、セル、８、１６３ (１
９８６)〕。このＤＮＡを例えばdＧ−dＣあるいはdＡ−
dＴホモポリマー結合法〔ネルソン、メソッズイン
エンヂモロジー、６８、４１(１９７９)アカデミック
プレス社、ニューヨーク〕で、たとえばプラスミド p
ＢＲ３２２のＰstIあるいはＳphI制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位に組み込ませる。これを例えば大腸菌x１７
７６株に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性
あるいはアンピシリン耐性でトランスホーマントを選ぶ
ことができる。別にＩ−ＩＦＮポリペプチドのアミノ酸
配列に対応すると考えられる塩基配列をもったオリゴヌ
レオタイドを化学合成したのち、これを３２pでラベル
してプローブとなし、たとえばそれ自体公知のコロニー
ハイブリダイゼーション法〔グルンステインとホグネ
ス、プロシーデイングオブナショナルアカデミー
サイエンスＵＳＡ、７２、３９６１(１９７５)〕によっ
て、すでに得たテトラサイクリン耐性あるいはアンピシ
リン耐性のトランスホーマントの中から求めるクローン
を二次スクリーニングする。このコロニーハイブリダイ
ゼーションによって陽性を示したクローンの塩基配列
を、たとえばマキサム−ギルバート法〔プロシーデイン
グオブナショナルアカデミ− サイエンスＵＳＡ、
７４、５６０(１９７７)〕あるいはファージＭ１３を用
いたデオキシヌクレオチド合成鎖停止〔メシングら、ヌ
クレイックアシズリサーチ、９、３０９、(１９８
１)〕の方法によって決定し、Ｉ−ＩＦＮ遺伝子の存在
を確認する。次に、得られたクローンからＩ−ＩＦＮ遺
伝子の全部あるいは一部をきり出し、適当なプロモータ
ー、ＳＤ(シャインアンドダルガーノ)配列の下流に
つないで、これを適当な宿主に導入することもできる。
プロモーターとしては、前記のプロモーターが挙げら
れ、宿主としては、大腸菌(エシエリヒアコリ２９
４、Ｗ３１１０、Ｃ６００など)、とりわけ２９４が好
ましい。なお、２９４は公知の菌〔バックマンら、プロ
シーディングオブナショナルアカデミーサイエ
ンスＵＳＡ、７３、４１７４(１９７６)〕で財団法人
「発酵研究所(Institute For Fermentation、Osaka) 」に
ＩＦＯ−１４１７１として寄託もされている。

【０００８】上記ＤＮＡによる宿主の形質転換は、例え
ば公知の方法〔コーエン、Ｓ.Ｎ.ら、プロシーディング
オブナショナルアカデミーサイエンスＵＳ
Ａ、６９、２１１０(１９７２)〕により行う。このよう
にして得られた形質転換体をそれ自体公知の培地で培養
する。培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を
含むＭ９培地〔ミラー、ジャーナルオブエクスペリ
メンツインモレキュラーゼネティクス４３１−
４３３(コールドスプリングハーバー研、ニューヨ
ーク１９７２)〕が挙げられる。ここに、必要により
プロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることがで
きる。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必
要により、通気や撹拌を加えることもできる。培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば、緩衝液に懸
濁させた後、たとえば超音波処理、リゾチームおよび／
または凍結融解によって菌体を破壊し、遠心分離により
上澄みを得る。菌体の破壊に関しては、凍結融解後リゾ
チーム処理を行うことが好ましい。上記上澄み中のヒト
Ｉ−ＩＦＮは、ヒトＩ−ＩＦＮに結合するモノクローナ
ル抗体を用いることにより有利に精製することができ、
モノクローナル抗体として、好ましくは式 (N)H−X₁−Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly−Y₃−OH(C) (IV) 〔式中、Ｘ₁は結合手または(N)Ile Gln Val Met Ala Gl
u Leu Ser Pro Ala AlaLys Thr Gly Lys Arg(C) で示さ
れるペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６
個のアミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残基を
示し、Ｙ₃は (N)Arg Arg Ala Ser Gln(C) で示されるペ
プチド鎖においてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミ
ノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す〕で
表わされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体が
挙げられる。なお、ポリペプチド(IV)は新規化合物であ
る。ポリペプチド(IV)に関し、Ｙ₃としては Arg Arg Ala
Ser Gln が好ましく、Ｘとしては Lys Arg が好まし
い。さらに、ポリペプチド(IV)は、１５〜２５個のアミ
ノ酸残基からなるものが好ましい。該モノクローナル抗
体は、抗体カラムとして有利に使用できる。

【０００９】抗体カラムの作製は、例えばハイブリドー
マを接種した腹水等から純すいに精製した上記モノクロ
ーナル抗体を適切な担体とカプリングさせることによ
り、以下の様な方法でできる。用いる担体は、カプリン
グの後にＩ−ＩＦＮが特異的に効率よく吸着され、その
後適切な溶出が可能なものであればどの様なものでもよ
いが、一例として蛋白の一級アミンが結合し易い様に活
性化されたアガロースゲルビーズ、例えばアフイゲル−
１０(バイオ・ラド社製)などが以下に述べる様な方法で
好都合に用いられる。アフイゲル−１０と抗体との反応
は、０.００１〜１Ｍ、好ましくは０.１Ｍのバイカーボ
ネート等の緩衝液中で反応を行う。反応条件は０〜２０
℃、１０分〜２４時間、種々のpＨが可能であるが、好
ましくは、４℃、４時間、pＨ３〜１０の条件が用いら
れる。混合するアフイゲル−１０と抗体の量比は、アフ
イゲル１mlに対し抗体量が約５０mg位迄は多ければ多い
程多くの抗体がつくので、この範囲内でいくらでもよい
が、実用上および結合効率を考慮して１mg〜３０mgの抗
体が好都合に用いられる。この様にしてできた抗体−担
体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗った後、数日
放置するか、もしくは最終濃度０.０５Ｍのエタノール
アミン・塩酸を加え４℃で１時間反応させる等の方法に
より、残存する未反応の活性基をブロックした後、適切
なカラムにつめることにより、抗体カラムとして使用で
きる。上記した抗体カラムで精製するに際しては、たと
えば、上記の菌体破壊により得られる上澄み等のヒト免
疫インターフェロン蛋白質含有液を中性付近の緩衝液、
たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して
抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗
浄したのち、Ｉ−ＩＦＮを溶出する。溶出液としては、
弱酸性溶液たとえば酢酸溶液、ポリエチレングリコール
を含む溶液、資料にくらべ抗体により結合し易いペプチ
ドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれらの組み合
せた溶液などが用いられ、ヒトＩ−ＩＦＮの分解をあま
り促進しないものが好ましい。カラム溶出液は、常法に
より緩衝液で中和する。必要により再度上記の抗体カラ
ムによる精製操作を行うことができる。ここで得られる
ヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質溶液は透析に付し、必要によりこ
れを凍結乾燥により粉末とすることができる。凍結乾燥
に際しては、ソルビトール、マンニトール、デキストロ
ース、マルトース、グリセロールなどの安定剤を加える
ことができる。

【００１０】本発明に用いられる実質的に純粋な、遺伝
子組み換え技術で得られるヒト免疫インターフェロン蛋
白質はヒト羊膜由来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎
ウイルス(ＶＳＶ)の細胞変性効果阻止試験によるウイル
ス活性測定において１０⁷Ｕ／mg以上の比活性を示すも
のである。なおここでＩ−ＩＦＮの活性としてのＵ／ml
(ユニット／ml)の出し方は以下の様に行った。ユニット
の確定した国際標準ＩＦＮ−αと白血球由来の粗Ｉ−Ｉ
ＦＮをヒト羊膜由来ＦＬ細胞株に対するＶＳＶの細胞変
性効果阻止試験を用いて測定し、その力価の比較から白
血球由来粗Ｉ−ＩＦＮの力価を決定しＩ−ＩＦＮの標準
品とした。目的とする資料中のＩ−ＩＦＮの力価算定の
ためには、常にこの標準Ｉ−ＩＦＮを並べて前述のＷＩ
ＳＨ−ＶＳＶの系でアッセイを行い、その比率から力価
を算出した。本発明の薬剤における１０⁷Ｕ／mg以上の
比活性を有するヒト免疫インターフェロン蛋白質は、式Ｈ−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe−A
rg−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−ＯＨで表わされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体
と結合しうるすなわち当該モノクローナル抗体を用いて
精製されうるものであれば、前記したモノクローナル抗
体を用いる精製法以外の精製法により得られたものでも
よい。

【００１１】本発明に用いられるヒト免疫インターフェ
ロン蛋白質は、好ましくは一般式 (N)H−Y Z₁ Tyr Z₂ Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln−OH(C) (V) 〔式中、ＹはＭet または結合手を示し、Ｚ₁、Ｚ₂はそ
れぞれＣys または 1／2Ｃys を示す〕のアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含有するものである。当該ポリ
ペプチドを乾燥品基準で９０％以上とりわけ９５％以上
含有するものが好ましい。

【００１２】本発明に用いられる実質的に純粋な、遺伝
子組み換え技術によるヒト免疫インターフェロン蛋白質
は好ましくは下記の性状を有する。１) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(１７.５％)電気
泳動による分子量測定で１７０００±１０００を示す。２) アミノ末端アミノ酸としてシステインもしくはハー
フシスチンまたはメチオニンを有する。３) H−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe
−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−OHに対するモ
ノクローナル抗体と結合する。本発明のヒト免疫インターフェロン蛋白質含有薬剤は従
来の方法で得られるＩ−ＩＦＮと同様の目的に同様の用
法により使用できるが、従来品に比し、夾雑蛋白質、発
熱物質が少ないので、注射剤原体等としてより安全に使
用される。本発明のヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質含有薬剤は抗
ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を
示す。本発明のヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質含有薬剤は医薬と
して使用する場合、当該ヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質を滅菌
水、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、生理食塩水その他公
知の生理学的に許容される担体と混合して製剤学的に許
容される組成物として使用することができ、非経口的に
又は局所に投与することができる。例えば、成人１日当
り１０万〜１億ユニット、好ましくは５０００万〜６０
００万ユニットを静注又は筋注などにより投与すること
ができる。本発明のヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質含有薬剤は、
塩、希釈剤、アジュバント、他の担体、バッファー、結
合剤、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される
他の活性成分も含有していてもよい。非経口的投与用薬
剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸
濁液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で用
時希釈して使用しうる滅菌粉末(通常Ｉ−ＩＦＮ溶液を
凍結乾燥して得られる)アンプルとして提供される。さ
らに本発明のヒト免疫インターフェロン蛋白質含有薬剤
は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βまたはインターロイキ
ン２などのリンホカインのような他の活性成分を当該ヒ
トＩ−ＩＦＮ蛋白質に対し１〜９９％含有していてもよ
い。以下参考例、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらに制限されるものでない。
下記参考例に開示しているマウスＢハイブリドーマγ２
−１１.１は、パスツール研究所〔フランス国パリ〕の
ＣＮＣＭに寄託番号Ｎo.Ｉ−２４２として寄託されてい
る。また実施例に開示している形質転換体E. coli ２９
４／pＨＩＴ trp ２１０１は、通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所(ＦＲＩ)に受託番号ＦＥＲＭＰ−７
５５０として寄託されている。

【００１３】

【発明を実施するための最良の形態】

参考例１モノクローナル抗体の製造 (１)免疫原の製造および免疫以下の参考例１(１)Ａにおける薄層クロマトグラフィー
は、メルク社製シリカゲルプレート６０Ｆ₂₅₄又は、フ
ナコシ薬品社製セルロースプレート、アビセルＳＦを用
い、下記の展開溶媒を用いた。Ｒf¹:クロロホルム:メタノール:酢酸＝９:１:０.５Ｒf²:酢酸エチル:ピリジン:酢酸:水＝３０:１０:３:５Ｒf³:クロロホルム:メタノール:水＝７:３:０.５Ｒf⁴:n
−ブタノール:ピリジン:酢酸:水＝３０:２０:６:２４Ｒf⁵:酢酸エチル:n−ブタノール:酢酸:水＝１:１:１:１ (１)Ａ.ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列Ｎo.
１３１−１４６に対応するポリペプチドの製造 (１)Ａ(i)．Z−Ser−Gln−O^tBuの製造 Z−Gln−O^tBu １０.１gをメタノール５００mlに溶解
し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。触媒
をろ去し、溶媒を留去した残留物をZ−Ser−OH７.５g、
ＨＯＮＢ６.８gとともにＤＭＦ２５０mlに溶解し、
氷冷した。氷冷下にＤＣＣ７.１５gを加え、０℃で４
時間室温で１２時間撹拌した。析出したＤＣＵをろ去
し、溶媒を留去ののち残留物をＡcＯＥt ３００mlに抽
出し、４％ＮaＨＣＯ₃、水、０.２Ｎ塩酸、水で洗い、
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、析出し
た結晶をエーテルでろ取し、乾燥ののちＣＨ₃ＣＮより
再結晶した。収量６.５g、収率５１.２％、 mp．９７−
１００℃、〔α〕_D ²⁵−２４.１°(c＝０.４０、メタ
ノール)、Ｒf¹０.６４元素分析Ｃ₂₀Ｈ₂₉Ｏ₇Ｎ₃として計算値: Ｃ 56.72; Ｈ 6.90; Ｎ 9.92 実験値: Ｃ 56.21; Ｈ 6.72; Ｎ 9.76 (１)Ａ(ii)．Z−Ala−Ser−Gln−O^tBu の製造 Z−Ser−Gln−O^tBu ４.２３gをメタノール３００mlに
溶解し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元した。
触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物をZ−Ala−OH ２.
３４g、ＨＯＮＢ２.２７gとともに、ＡcＯＥt２００ml
とジオキサン２００ml、ＤＭＦ1００mlの混合溶媒に溶
解し、氷冷した。冷却下にＤＣＣ２.３８gを加え０℃
で４時間、室温で１２時間撹拌ののち、ＤＣＵをろ去
し、溶媒を留去した。残留物にＣＨ₃ＣＮとエーテルを
加え結晶とし、ろ取、乾燥ののちＣＨ₃ＣＮより再結晶
した。収量３.７２g、収率７５.３％、 mp．１６５−１
７０℃、〔α〕_D ²⁵−４１.２°(c＝０.５０、メタノー
ル)、Ｒf¹０.６０元素分析Ｃ₂₃Ｈ₃₄Ｏ₈Ｎ₄として計算値: Ｃ 55.86; Ｈ 6.93; Ｎ 11.33 実験値: Ｃ 55.58; Ｈ 6.74; Ｎ 11.12 (１)Ａ(iii).Z−Arg(Pme)−Ala−Ser−Gln−O^tBuの製造 Z−Ala−Ser−Gln−O^tBu ３.４６gをメタノール３００m
lに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素気流中で還元し
た。触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物を、Z−Arg(P
me)−OH・CHA ４.５４gから調製したZ−Arg(Pme)−OH、
ＨＯＢt １.９gとともにＤＭＦ１５０mlに溶解し氷冷
した。冷却下にＤＣＣ１.９gを加え、０℃で４時間、
室温で１５時間撹拌した。ＤＣＵをろ去し、溶媒を留去
し残留物にＡcＯＥtを加えゲル状の沈澱を得、ろ取し
た。乾燥後、メタノールとＡcＯＥtより再沈澱した。収
量４.５５g、収率７５.５％、 mp. １３０−１３４℃、
〔α〕_D ²⁵−２４.１°(c＝０.２６、メタノール)、Ｒ
f¹０.５７元素分析Ｃ₄₀Ｈ₆₀Ｏ₁₁Ｎ₈Ｓ・1/2 Ｈ₂Ｏとして計算値: Ｃ 55.22; Ｈ 7.07; Ｎ 12.88; Ｓ 3.69 実験値: Ｃ 55.23; Ｈ 6.93; Ｎ 12.54; Ｓ 3.48 (１)Ａ(iv)．Z−Arg(Pme)−Arg(Pme)−Ala−Ser−Gln−
O^tBu の製造 Z−Arg(Pme)−Ala−Ser−Gln−O^tBu ４.３gをメタノー
ル４００mlに溶解し、パラジウム黒を触媒に水素気流中
で還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物を、
Z−Arg(Pme)−OH・CHA ３.２４gより調製したZ−Arg(Pm
e)−OH、ＨＯＢt１.４２gとともにＤＭＦ２００mlに溶
解し氷冷した。冷却下にＤＣＣ１.４１gを加え０℃で
４時間、室温で２０時間撹拌した。ＤＣＵをろ去し、溶
媒を留去した残留物にＡcＯＥt を加え沈澱を得、ろ取
した。乾燥後、メタノールとＡcＯＥtより、再沈澱し
た。収量４.４g、収率７１.７％、mp．１２５−１３０
℃、〔α〕_D ²⁵ −１８.０°(c＝０.４０、メタノー
ル)、Ｒf¹０.６３元素分析Ｃ₅₇Ｈ₈₆Ｏ₁₄Ｎ₁₂Ｓ₂・Ｈ₂Ｏとして計算値: Ｃ 54.96; Ｈ 7.12; Ｎ 13.50; Ｓ 5.15 実験値: Ｃ 54.66; Ｈ 6.92; Ｎ 13.32; Ｓ 5.34 (１)Ａ(ｖ)．Z−Arg(Pme)−Gly−O^tBu Z−Gly−O^tBu １３.０gをＭeＯＨ５００mlにとかし、
Ｐd 黒を触媒として、水素気流中、接触還元した。触媒
をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、残留物をＤＭＦ２００ml
にとかした。これに、Z−Arg(Pme)−OH・CHA ２０.０g
より調製したZ−Arg(Pme)-OH、ＨＯＢt ５.４gを加え
て氷冷し、ＤＣＣ８．２gを加えて４８時間かき混ぜ
た。析出したＤＣＵをろ別し、濃縮後、ＡcＯＥt ５０
０mlにとかした。ＡcＯＥt 層を４％ＮaＨＣＯ₃水、１
０％クエン酸水で洗浄後、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮
後、石油ベンジンを加えて沈澱としてろ取した。収量１
９.８g(９６.８％)。mp．７１−７３℃、〔α〕_D ²³ ＋
０.２°(c＝０.９、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.６２元素分析Ｃ₃₁Ｈ₄₅Ｏ₇Ｎ₅Ｓとして計算値: Ｃ 58.93; Ｈ 7.18; Ｎ 11.09; Ｓ 5.08 実験値: Ｃ 59.42; Ｈ 7.58; Ｎ 10.95; Ｓ 4.84 (１)Ａ(vi)．Z−Phe−Arg(Pme)−Gly−O^tBu の製造 Z−Arg(Pme)−Gly−O^tBu １０.０gをＭeＯＨ５００ml
中、接触還元したのち、ＤＭＦ３００mlに転溶した。
これにZ−Phe−OH ４.７２g、ＨＯＢt ２.３５gを加え
て氷冷し、ＤＣＣ３.５９gを加えて、１５時間かきま
ぜた。析出したＤＣＵをろ別し、ろ液を濃縮後、残留物
をＡcＯＥt ４００mlにとかした。ＡcＯＥt 層は、４％
ＮaＨＣＯ₃ 水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄
で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて結晶としてろ取
し、ＭeＯＨ−エーテルより再結晶した。収量１０.５g
(８５.３％)。mp．１０１−１０３、℃、〔α〕_D ²⁶−
８.３°(c＝０.９、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.６４元素分析Ｃ₄₀Ｈ₅₄Ｏ₈Ｎ₆Ｓとして計算値: Ｃ 61.67; Ｈ 6.99; Ｎ 10.79; Ｓ 4.12 実験値: Ｃ 61.66; Ｈ 6.56; Ｎ 10.93; Ｓ 4.14 (１)Ａ(vii)．Z−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly−O^tBu の製
造 Z−Phe−Arg(Pme)−Gly-O^tBu ５.５gをＭeＯＨ３００m
l中、接触還元したのち、ＤＭＦ３００mlに転溶した。
これに、Z−Leu−OH DCHA ３.１３gより調製したZ−Leu
−OH、ＨＯＮＢ１.４７gを加えて氷冷し、ＤＣＣ１.
６８gを加えて４８時間かきまぜた。析出したＤＣＵを
ろ別し、濃縮後、ＡcＯＥt ３００mlにとかした。ＡcＯ
Ｅt 層は４％ＮaＨＣＯ₃水、１０％クエン酸水で洗浄
し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮後、エーテルを加えて
粉末としてろ取した。収量６.２g(９８.３％)。mp．１
７１−１７３℃、〔α〕_D ²⁶−１５.５°(c＝０.９、Ｄ
ＭＦ)、Ｒf¹ ０.６４元素分析Ｃ₄₆Ｈ₆₅Ｏ₉Ｎ₇Ｓとして計算値: Ｃ 61.93; Ｈ 7.34; Ｎ 10.99; Ｓ 3.59 実験値: Ｃ 62.02; Ｈ 7.37; Ｎ 11.08; Ｓ 3.59 (１)Ａ(viii)．Boc−Met−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly−O
^tBu の製造 Z−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly−O^tBu ６.０gをＭeＯＨ
２００ml中、接触還元したのち、ＤＭＦ１５０mlに転溶
した。これに、Boc−Met−OH・ＤＣＨＡ３.０gより調
製したBoc−Met−OH、ＨＯＮＢ１.３９gを加えて氷
冷し、ＤＣＣ１.５９gを加えて１５時間かきまぜた。析
出したＤＣＵをろ別し、濃縮後、n−ＢuＯＨ−ＡcＯＥt
にとかし、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥
した。濃縮後、エーテルを加えて結晶としてろ取した。
収量６.２g(９３.１％)。mp．１９２−１９５℃、
〔α〕_D ²⁶−１９.７°(c＝１.０、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.６
４元素分析Ｃ₄₈Ｈ₇₆Ｏ₁₀Ｎ₈Ｓ₂として計算値: Ｃ 58.27; Ｈ 7.74; Ｎ 11.33; Ｓ 6.48 実験値: Ｃ 58.48; Ｈ 7.79; Ｎ 11.34; Ｓ 5.98 (１)Ａ(ix)．Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly
−OH の製造 Boc−Met−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly−O^tBu ５.５gにＴ
ＦＡ５０mlを加え、室温で１０分間振りまぜたのち濃
縮し、エーテルを加えてろ取し乾燥した。これを、ＤＭ
Ｆ５０mlにとかして氷冷し、ＴＦＡ１.８mlを加え
た。これにBoc−Gln−OH １.８５g、ＨＯＮＢ１.４９
g、ＤＣＣ１.９０gより調製したBoc−Gln−ONB を加
え、１５時間かきまぜた。濃縮後、ＡcＯＨを加え、Ａc
ＯＥtを加えて沈澱としてろ取した。収量５.３g(８９.
８％)。mp．１８１−１８３℃(分解)、〔α〕_D ²⁶−１
９.６°(c＝１.０、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.３０元素分析Ｃ₄₉Ｈ₇₆Ｏ₁₂Ｎ₁₀Ｓ₂として計算値: Ｃ 55.45; Ｈ 7.22; Ｎ 13.20; Ｓ 6.04 実験値: Ｃ 55.39; Ｈ 7.17; Ｎ 13.34; Ｓ 6.20 (１)Ａ(x)．Z−Ser−NHNH−Boc の製造 Z−Ser−OH １０.０g、t−ブチルカルバゼート６.２gを
ＤＭＦ１５０mlにとかして氷冷し、ＨＯＮＢ８.０g、
ＤＣＣ９.３gを加えて１５時間かきまぜた。析出した
ＤＣＵをろ別し、濃縮後、ＡcＯＥtに転溶した。ＡcＯ
Ｅt 層は、４％ＮaＨＣＯ₃ 水、１０％クエン酸水で洗
浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮後、エーテルを加え
て結晶としてろ取した。収量７.３g(５０.４％)。mp.９
５−９８℃、〔α〕_D ²⁶−６.２°(c＝０.８、ＤＭ
Ｆ)、Ｒf¹０.６２元素分析Ｃ₁₆Ｈ₂₃Ｏ₆Ｎ₃として計算値: Ｃ 54.38; Ｈ 6.56; Ｎ 11.89 実験値: Ｃ 54.77; Ｈ 6.88; Ｎ 12.29 (１)Ａ(xi). Z−Arg(Pme)−Ser−NHNH−Boc の製造 Z−Ser−NHNH−Boc ３.９gをＭeＯＨ３００ml中接触還
元したのち、ＤＭＦ５０mlに転溶した。これに、Z−Arg
(Pme)−OH・CHA ６.２gより調製したZ−Arg(Pme)−OH、
ＨＯＢt １.５gを加えて氷冷し、ＤＣＣ２.３gを加え
て１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵをろ別し、濃縮
後、ＡcＯＥt にとかした。ＡcＯＥt 層は、４％ＮaＨＣ
Ｏ₃水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥し
た。濃縮後エーテルを加えて、沈澱としてろ取した。収
量７.４５g(９３.７％)。mp.１００−１０１℃、〔α〕
_D ²⁶−０.９°(c＝１.２、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.５１元素分析Ｃ₃₃Ｈ₄₉Ｏ₉Ｎ₇Ｓとして計算値: Ｃ 55.06; Ｈ 6.86; Ｎ 13.62; Ｓ 4.46 実験値: Ｃ 55.49; Ｈ 6.94; Ｎ 13.14; Ｓ 3.86 (１)Ａ(xii)．Z−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Ser−NHNH−Boc
の製造 Z−Arg(Pme)−Ser−NHNH−Boc ３.９gをＭeＯＨ３０
０mlにとかし、接触還元したのち、ＤＭＦ５０mlに転
溶した。これに、Z−Lys(Mtr)−OH・DCHA ３.４gより調
製したZ−Lys(Mtr)−OH、ＨＯＢt ０.８８gを加えて氷
冷し、ＤＣＣ１.３４gを加えて２０時間かきまぜた。
析出したＤＣＵをろ別し、濃縮後、ＡcＯＥt を加えて
粉末としてろ取し、ＭeＯＨ−ＡcＯＥt より再結晶し
た。収量５.１g(９３.４％)。mp.１０３−１０５℃、
〔α〕_D ²⁶−７.２°(c＝０.８、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.５７元素分析Ｃ₄₉Ｈ₇₃Ｏ₁₃Ｎ₉Ｓ₂として計算値: Ｃ 55.50; Ｈ 6.94; Ｎ 11.89; Ｓ 6.05 実験値: Ｃ 55.70; Ｈ 7.15; Ｎ 11.60; Ｓ 5.63 (１)Ａ(xiii)．Z−Arg(Pme)−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Ser
−NHNH−Boc の製造 Z−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Ser−NHNH−Boc ４.８gをＭe
ＯＨ３００mlにとかし、接触還元したのち、ＤＭＦ７
０mlに転溶した。これに、Z− Arg(Pme)−OH・CHA ２.
８gより調製したZ−Arg(Pme)−OH、ＨＯＢt ０.７４gを
加えて氷冷し、ＤＣＣ１.１２gを加えて１５時間かき
まぜた。析出したＤＣＵをろ別し濃縮後、ＡcＯＥt に
とかし、ＡcＯＥt 層を４％ＮaＨＣＯ₃ 水、１０％クエ
ン酸水で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥した。濃縮後、エー
テルを加えて沈澱としてろ取し、ＭeＯＨ−エーテルよ
り再沈澱した。収量５.８g(８９.８％)。mp.１３６−１
３７℃、〔α〕_D ²⁶−６.６°(c＝１.０、ＤＭＦ)、Ｒf
¹０.５８元素分析Ｃ₆₆Ｈ₉₉Ｏ₁₆Ｎ₁₃Ｓ₃として計算値: Ｃ 55.56; Ｈ 6.99; Ｎ 12.76; Ｓ 6.74 実験値: Ｃ 55.34; Ｈ 7.07; Ｎ 12.50; Ｓ 6.59 (１)Ａ(xiv)．Z−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Lys(Mtr)−Arg
(Pme)−Ser−NHNH−Bocの製造 Z−Arg(Pme)−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Ser−NHNH−Boc
３.０gをＭeＯＨ１５０mlにとかし、接触還元したの
ち、ＤＭＦ６０mlに転溶した。これに、Z−Lys(Mtr)−
OH・DCHA １.５４gより調製したZ−Lys(Mtr)−OH、ＨＯ
Ｂt ０.３１gを加えて氷冷し、ＤＣＣ０.５７gを加え
て１５時間かきまぜた。析出したＤＣＵをろ別し、濃縮
後、ＡcＯＥtにとかし、ＡcＯＥt 層を４％ＮaＨＣＯ₃
水、１０％クエン酸水で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥し
た。濃縮後、エーテルを加えて結晶としてろ取し、Ａc
ＯＥt より再結晶した。収量２.７０g、(７２.８％)。m
p.１２３−１２５℃、〔α〕_D ²⁶−５.９°(c＝１.１、
ＤＭＦ)、Ｒf¹ ０.５７元素分析Ｃ₈₂Ｈ₁₂₃Ｏ₂₀Ｎ₁₅Ｓ₄として計算値: Ｃ 55.73; Ｈ 7.02; Ｎ 11.89; Ｓ 7.26 実験値: Ｃ 55.89; Ｈ 7.30; Ｎ 11.72; Ｓ 7.08 (１)Ａ(xv)．Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly
−Arg(Pme)−Arg(Pme)−Ala−Ser−Gln−O^tBu の製造 Z−Arg(Pme)−Arg(Pme)−Ala−Ser−Gln−O^tBu １.０g
をＭeＯＨ１００mlにとかし、接触還元したのちＤＭＦ
２０mlに転溶した。これに、Boc−Gln−Met−Leu−Phe
−Arg(Pme)−Gly−OH ０.８５g、ＨＯＢt １３５mgを加
えて氷冷し、ＤＣＣ２１０mgを加えて２０時間かきま
ぜた。析出したＤＣＵをろ別し、濃縮後、ＭeＯＨを加
えて沈澱としてろ取した。収量１.５０g (８７.４％)。
mp.２１６−２１７℃(分解)、〔α〕_D ²⁶−１１.８°(c
＝１.０、ＤＭＦ)、Ｒf¹０.４３元素分析Ｃ₉₈Ｈ₁₅₄Ｏ₂₃Ｎ₂₂Ｓ₄として計算値: Ｃ 55.09; Ｈ 7.27; Ｎ 14.42; Ｓ 6.00 実験値: Ｃ 54.81; Ｈ 7.33; Ｎ 14.23; Ｓ 5.79 (１)Ａ(xvi)．H−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met
−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln−OH
の製造 Boc−Gln−Met−Leu−Phe−Arg(Pme)−Gly−Arg(Pme)−
Arg(Pme)−Ala−Ser−Gln−O^tBu １.０gにＴＦＡ１０m
lを加え、室温で５０分間振り混ぜたのち、濃縮し、エ
ーテルを加えて沈澱としてろ取し、乾燥した。一方、Z
−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Lys(Mtr)−Arg(Pme)−Ser−NHN
H−Boc ０.８３gにＴＦＡ１０mlを加えて室温で１０分
間振り混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加えて沈澱とし
てろ取し乾燥した。これをＤＭＦ１０mlにとかし、ド
ライアイス−アセトンで冷却後、６.２ＮＨＣl−Ａc
ＯＥt ０.２３ml、亜硝酸イソアミル(０.０７５ml)を
加え、−２５〜−２０℃で２０分間保った(ヒドラジン
テスト:陰性)。これを再びドライアイス−アセトンで冷
却し、ＴＥＡ０.２５mlを加えて中和した。アミン成分
をＤＭＦ４０mlにとかし、氷冷し、ＴＥＡ０.１６mlを
加えたのち、先に調製したアジド溶液を加えて、４℃で
７２時間かきまぜた。反応液を、希酢酸水にそそぎ、析
出したゲルをろ取し、含水ＣＨ₃ＣＮで洗浄した。収量
１.４０g(８１.５％)、Ｒf¹０.０９。このうち４００mg
を０.１５ＭＭＳＡを含むＴＦＡ−チオアニソール−メ
チルスルフイド(８:１:１)６０mlにとかし、室温で２時
間振りまぜたのち、ＡcＯＮＨ₄ ４００mgを加えて濃縮
し、エーテルを加えて沈澱としてろ取し、乾燥した。こ
れを少量の１ＮＡcＯＨにとかしセファデックスＧ−
２５のカラム(２.２×１２０cm)に付した。１ＮＡcＯ
Ｈで溶出し１６０ml−２６０mlの分画を集めて凍結乾燥
し、ついでアンバーライトＩＲＡ−４１０(酢酸型)のカ
ラムを通し、凍結乾燥した。これをさらにＴＳＫ−ＬＳ
−４１０のカラム(２.１４×７.５cm＋２.１４×３０c
m)を用いるＨＰＬＣで精製し、目的物を得た。収量４５
mg、〔α〕_D ²⁴−４５.９°(c＝０.７、０.１ＮＡcＯ
Ｈ)、Ｒf(cellulose) ０.２０アミノ酸分析:Lys 1.71、 Arg 4.71、 Ser 1.69、Glu
2.12、 Gly 1.00、 Ala1.03、 Met 0.32、 Leu 1.30、
Phe 1.08(平均回収率７７％)

【００１４】(１)Ｂ．キャリヤー蛋白とポリペプチド複
合体の合成上記(１)Ａ(xvi)で得たポリペプチドとサイログロブリ
ン(以下ＴＧ)との結合を、グットフレンドらの方法に準
じて行った〔サイエンス、１４４、１３３４頁(１９６
４)〕。即ち、当該ポリペプチド２.５mgをＴＧ３.７５m
gと混合し、２mlの５０mＭのフォスフェートバッファー
を加え、氷水中でよく撹拌した。これにカルボジイミド
塩酸塩３０.４mgを蒸留水２００μlに溶かしたものを
１滴ずつゆっくりと加えた後、３時間氷水中で撹拌しな
がら反応させた。反応後、蒸留水で透析を充分に行い、
凍結乾燥を行なって蛋白複合体４.７mgを得た。

【００１５】(１)Ｃ．抗体検出のためのＥＩＡ用抗原の
調製ＥＩＡ用抗原の調製は北川らの方法〔ジャーナル
オブバイオケミストリー、７９、２３３(１９７
６)〕の方法に準じて行った。 (１)Ｃ(i)．ポリペプチドへのマレイミド基の導入前記(１)Ａ(xvi)で得たポリペプチド(３５０nmoles)を
１mlの１００mＭフォスフェートバッファーpＨ６.８に
溶解し、Ｎ−(４−カルボキシシクロヘキシルメチル)マ
レイミドのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル５８５
μg(１.７５μmoles)と７０μlのＮ、Ｎ−ジメチルホル
マミド溶液に加え混合し、３０℃で３０分撹拌して反応
後、セファデックスＧ−２５カラムで分画を行いマレイ
ミド基の導入されたポリペプチド分画１８５nmolesを得
た。 (１)Ｃ(ii)．マレイミド基導入ポリペプチドとβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼとの結合上記(１)Ｃ(i)で得たマレイミド基導入ポリペプチド１
６.５nmoles とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ３.３nmoles
を混合し、４℃で１８時間反応後、４１２.５nmoles の
β−メルカプトエタノールで反応を停止させた。β−Ｄ
−ガラクトシダーゼと結合したポリペプチドは、セファ
ロース６Ｂカラムで分画を行い、以下の実験に使用し
た。

【００１６】(１)Ｄ．ＥＩＡ法前記(１)Ｂで得た蛋白複合体で免疫したマウス血清ある
いはハイブリドーマ上清中の抗体活性の検出はＥＩＡ法
を用いて行った〔イムノファーマコロジー、１、３(１
９７８)〕。すなわち、血清あるいはハイブリドーマ上
清をバッファーＡ(２０ mＭＮa₂ＨＰＯ₄、１００mＭ
ＮaＣl、０.１％ＮaＮ₃、１mＭＭgＣl₂、 pＨ７.
０)で希釈し、この１００μlをとり、参考例１(１)Ｃで
得たポリペプチド誘導体１００μｌとよく混合し、２４
℃で２４時間反応させた。反応後、ウサギ抗マウスＩg
Ｇを結合した３％セルロース１００μｌを加えて２４
℃、４時間反応させた。反応後、セルロースを０.５％
ツイーン２０を含んだバッファーＡでよく洗浄し、４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド２０μ
g／mlを５００μｌ加え、３７℃で２時間反応後、１０
０mＭカーボネートバッファー(pＨ１０.５)を３ml加え
て反応を停止し、上清中の蛍光強度を蛍光計で測定した
(エキサイテーション３６５nm、エミッション４５０ n
m)。

【００１７】(１)Ｅ．免疫７〜８週令のＢＡＬＢ／c雌マウス６匹各々に抗原とし
て前記(１)Ｂで得た蛋白複合体の、タンパク量として、
４０μgをフロインドコンプリートアジュバントとよ
く混合し、皮下に接種した(初回免疫)。初回免疫の２週
後、同量の抗原をフロインドコンプリートアジュバン
トとよく混合し、皮下に接種した(二次免疫)。さらに、
その２週後、二次免疫と同様の方法で三次免疫を行っ
た。三次免疫の６日後、マウスから血液を部分採取し、
血清中の抗体価を前記(１)Ｄ記載のＥＩＡ法で測定し
た。このうち、高い抗体価を示したγ−２マウスに対し
て１２０μgの抗原を０.５mlの食塩水に溶解させたもの
を静脈内に接種することにより最終免疫を行った。各マ
ウスの抗体価は〔表２〕に示した。

【表２】

【００１８】(２)モノクローナル抗体γ２−１１.１の
製造 (２)Ａ．細胞融合上記(１)Ｅ記載の方法で免疫を行い、最終免疫の３日後
のγ−２マウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュ
で圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャ
ルメディウム(ＭＥＭ)に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得
た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／cマウス
由来ミエローマ細胞Ｐ３−×６３.Ａg８.Ｕ１(Ｐ３Ｕ
１)を用いた〔カレントトピックスインマイクロ
バイオロジーアンドイムノロジー、８１、１(１９７
８)〕。細胞融合は、原法(ネイチャー、２５６巻、４
９５頁、１９７５年)に準じて行った。即ち、脾臓細胞
およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３
度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５:１になる
よう混合して、８００回転で１５分間遠心を行って細胞
を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈澱を軽くほ
ぐし、４５％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)６０００
(コッホライト社製)を０.３ml加え、３７℃温水槽中で７
分間静置して融合を行った。融合後細胞に毎分２mlの割
合でＭＥＭを添加し、合計１２mlのＭＥＭを加えた後６
００回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈
澱物を１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０メ
ディウム(ＲＰＭＩ１６４０−１０ＦＣＳ)にＰ３Ｕ１が
１ml当り２×１０⁵個になるよう浮遊し、２４穴マルチ
デイシュ(リンプロ社製)に１ウエル１mlずつ１４４ウエ
ルに播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスフラン器中培
養した。２４時間後、ＨＡＴ(ヒポキサンチン１×１０⁴
Ｍ、アミノプテリン４×１０⁷ Ｍ、チミジン１.６×１
０⁵ Ｍ)を含んだＰＲＭＩ１６４０−１０ＦＣＳ培地(Ｈ
ＡＴ培地)を１ウエル当り１mlずつ添加することによ
り、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は培養
開始３、５、７日後に旧液を１ml捨てたあと、１mlのＨ
ＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドー
マの増殖は、細胞融合後１０〜１４日で認められ、培養
液が黄変したとき(約１×１０⁶／ml)、上清を採取し、
ＥＩＡ法で、抗体の有無を検索した。このようにして、
ハイブリドーマの増殖が認められた１４１ウエルの上清
を調べたところ、２ウエル(γ２−１１、γ２−１００)
に強い抗体活性、２ウエル(γ２−６２、γ２−７０)に
弱い活性を認めた。

【００１９】(２)Ｂ．クローニング抗体活性が陽性を示した３ウエル(γ２−１１、６２、
１００)の各ハイブリドーマを、限界希釈法によってク
ローニングを行った。即ちハイブリドーマが２個／mlに
なるようＲＰＭＩ１６４０−２０ＦＣＳに浮遊させ、９
６穴マイクロプレート(ヌンク社製)に１ウエル当り０.
１mlずつ分注した。分注する際、フイーダー細胞として
ＢＡＬＢ／cマウスの胸腺細胞をウエル当り５×１０⁵個
になるよう加えた。このようにして、約２週間後には細
胞の増殖が認められるようになり、上清を採取して抗体
の有無を前記(１)Ｄ記載のＥＩＡ法で調べた。その結
果、γ２−１１では１９クローン中８クローン、γ２−
６２では５４クローン中３クローン、γ２−１００では
４７クローン中５クローンに抗体活性を認めた。

【００２０】(２)Ｃ．モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの腹水化ＩＦＮ−γに対して結合能を示す抗体を産生するγ２−
１１、１クローン細胞(マウスＢハイブリドーマ γ２
−１１.１)１×１０⁶個を、あらかじめ０.５mlのミネラ
ルオイルを腹腔内に接種することにより腹水化を行っ
た。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０日後、腹水を
採取して抗体価をＥＩＡ法で測定したところ、１０⁷倍
希釈まで抗体活性を示した。なお、当該クローン細胞の
培養上清中の抗体活性は、１０⁴倍希釈まで認められて
いるが、腹水化することにより約１０００倍程度抗体活
性が上昇した。

【００２１】(２)Ｄ．モノクローナル抗体の精製上記(２)Ｃで得られた腹水４mlを出発材料として、ステ
ーリンら(ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー、２５６巻、９７５０頁、１９８１年)の方法に準じ
てモノクローナル抗体を精製した。まず腹水からフイブ
リン様物質を除去するため１０、０００回転１５分間遠
心した後、リン酸緩衝液−食塩水(ＰＢＳ:８.１mＭＮ
aＨ₂ＰＯ₄、１.５mＭＫＨ₂ＰＯ₄、２.７mＭＫＣl、
１３７mＭＮaＣl、pＨ７.２)で２８０nmの紫外部吸収
(Ａ₂₈₀)が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈
後サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度
になるように加え、４℃で撹拌しながら６０分間塩析を
行い、その後遠心(１０、０００回転、１５分間)を行っ
て沈澱物を得た。沈澱物を５０mＭＮaＣl 含有２０m
Ｍトリス緩衝溶液(pＨ７.９)に溶解し、同溶液２ｌに対
して透析を行った。２時間後、２ｌの新しい同じ透析液
に換え、さらに１５時間透析を行った。透析後、沈澱を
除去するため１０、０００回転１５分間遠心を行い、上
清をＡ₂₈₀の値が２０〜３０の濃度になるように調整し
た。このサンプルを充分量の５０mＭＮaＣl 含有トリ
ス緩衝溶液で順化した８mlのＤＥＡＥセルロースカラム
(ワットマンＤＥ₅₂)にかけ、５０mＭＮaＣl 含有トリ
ス緩衝溶液を用いて１.５ml／分の流出速度で分画を行
った。この条件下では、抗体活性は主として素通り分画
に認められた。

【００２２】参考例２抗体カラムの製造上記参考例１(２)Ｄ記載の方法で精製された素通り分画
のモノクローナル抗体(γ２−１１.１モノクローナル抗
体)２５ml(６５.３mg)を０.１ＭＮaＨＣＯ₃、pＨ８.３
溶液に対して一晩透析を行った。一方、アフイゲル−１
０(バイオ・ラド社)２５mlをグラスフィルターを用いて
充分水洗を行った後、０.１ＭＮaＨＣＯ₃、pＨ８.３溶
液に浮遊させ前記抗体とを混合し、４℃で４時間、ゆつ
くり撹拌しながら反応させた。その後、４℃で一晩放置
した後、グラスフィルターを用いて０.１ＭＮaＨＣ
Ｏ₃、pＨ８.３溶液でよく洗浄した。反応させたゲルに
０.１Ｍエタノールアミン、０.１５ＭＮaＣl を含む
溶液(pＨ８.０)を２５ml加え、４℃、１時間振とうし、
残存するかも知れない未反応の活性基をブロックした。
その後ゲルをＰＢＳでよく洗浄し、０.１％ＮaＮ₃ を含
むＰＢＳ２５mlに懸濁し、４℃で保存した。加えた抗
体量と回収されたろ液中の抗体量から、ゲル１ml当り
２.３５mgの抗体が結合していることが判明した。この
様にして得た反応物をカラムに充め、抗体カラムとして
使用した。

【００２３】実施例１ヒト免疫インターフェロン蛋白
質の製造 (１)形質転換体の製造 (１)Ａ．Ｉ−ＩＦＮ遺伝子含有プラスミドpＨＩＴ３７
０９の製造 (１)Ａ(i)．ヒトＩ−ＩＦＮをコードするmＲＮＡの分離ヒト抹梢血より調製したリンパ球を１２−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート(ＴＰＡ)(１５n
g／ml)とコンカナバリンＡ(４０μg／ml)を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地(１０％の牛胎児血清を含む)で３７℃
培養し、Ｉ−ＩＦＮを誘導させた。２４時間後、この誘
導した１×１０¹⁰個のヒトリンパ球をチオグアニジン変
性溶液(５Ｍグアニジンチオシアネート、５％メルカプ
トエタノール、５０mＭＴris・ＨＣl pＨ７.６、１０
mＭＥＤＴＡ)中でテフロンホモゲナイザーによって破
壊変性した後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム
を４％になるように加え、均質化した混合物を５.７Ｍ
塩化セシウム溶液〔５.７Ｍ塩化セシウム、０.１Ｍエチ
レンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)〕６ml上に重層し、ベッ
クマンＳＷ２７のローターを用いて１５℃で２４０００
rpm ３０時間遠心処理を行い、ＲＮＡ沈澱を得た。この
ＲＮＡ沈澱を０.２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナ
トリウム溶液にとかした後、エタノールで沈澱させ、
８.３mgのＲＮＡを得た。このＲＮＡを高塩溶液〔０.
５ＭＮaＣl、１０mＭＴris・ＨＣl pＨ７.６、１mＭ
ＥＤＴＡ、０.３％ＳＤＳ〕中でオリゴ(dＴ)セルロー
スカラムに吸着させ、ポリ(Ａ)を含むmＲＮＡを低塩溶
液(１０mＭＴris・ＨＣl pＨ７.６、１mＭＥＤＴ
Ａ、０.３％ＳＤＳ)で溶出させることにより、ポリ
(Ａ)を含むmＲＮＡ７００μgを分取した。このmＲＮＡ
を更にエタノールで沈澱させ、０.２mlの溶液(１０mＭ
Ｔris・ＨＣl pＨ７.６、２mＭＥＤＴＡ、０.３％Ｓ
ＤＳ)に溶かし、６５℃で２分間処理して１０〜３５％
庶糖密度勾配遠心処理(ベックマンＳＷ２７のローター
を用いて２０℃、２５０００rpmで２１時間遠心分離)す
ることにより分画化して２２分画を得た。この各分画に
つきＲＮＡの一部ずつを、アフリカツメガエルの卵母細
胞に注入し、合成される蛋白質中のインターフェロン活
性〔ヒト羊膜由来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウ
イルス(ＶＳＶ)の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し
た抗ウイルス活性〔ステワルト、ザインターフェロン
システム、スプリンガー社、ニューヨーク、１９７９
年、１１頁)〕を測定し、分画１２(沈降定数Ｓ値は１２
−１４Ｓを示した)に１９５ユニット／μgＲＮＡの活性
を検出した。このようにして得た分画１２のmＲＮＡは
約２０μgであった。（１)Ａ(ii)．単鎖ＤＮＡの合成上記で得たmＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１００μl
の反応液(５μgのmＲＮＡ、５０μgオリゴ(dＴ)、１０
０ユニットの逆転写酵素、１mＭずつのdＡＴＰ、dＣＴ
Ｐ、dＧＴＰおよびdＴＴＰ、８mＭＭgＣl₂、５０mＭ
ＫＣl、１０mＭジチオスレイトール、５０mＭＴris・
ＨＣl pＨ８.３)中で４２℃、１時間インキュベートし
た後に、フェノールで除蛋白し、０.１ＮのＮaＯＨで７
０℃、２０分処理してＲＮＡを分解除去した。 (１)Ａ(iii)．二重鎖ＤＮＡの合成ここで合成された単鎖の相補ＤＮＡを５０μlの反応液
(mＲＮＡとオリゴdＴを含まない以外は上記と同じ反応
液)中で４２℃２時間反応させることにより二重鎖ＤＮ
Ａを合成した。 (１)Ａ(iv)．dＣテイルの付加この二重鎖ＤＮＡにヌクレアーゼＳ１を５０μlの反応
液(二重鎖ＤＮＡ、０.１Ｍ酢酸ナトリウム pＨ４.５、
０.２５ＭＮaＣl、１.５mＭＺn ＳＯ₄、６０ユニット
のＳ１ヌクレアーゼ)中で室温３０分間作用させ、フェ
ノールで除蛋白し、エタノールでＤＮＡを沈澱させた
後、これにターミナルトランスフェラーゼを５０μlの
反応液(二重鎖ＤＮＡ、０.１４Ｍカコジル酸カリ、０.
３ＭＴris(塩基)pＨ７.６、２mＭジチオスレイトー
ル、１mＭＣ₀Ｃl₂、０.１５mＭ dＣＴＰ、３０ユニッ
トターミナルトランスフェラーゼ)中で３分間３７℃で
作用させ二重鎖ＤＮＡの３両端に約２０個のデオキシシ
チジン鎖を伸長させた。これらの一連の反応で約３００
ngのデオキシシチジン鎖をもった二重鎖ＤＮＡを得た。 (１)Ａ(v)．大腸菌プラスミドの開裂ならびにdＧテイル
の付加一方、１０μgの大腸菌プラスミドpＢＲ３２２ＤＮＡに
制限酵素ＰstIを５０μｌの反応液〔１０μg ＤＮＡ、
５０mＭＮaＣl、６mＭＴris・ＨＣl(pＨ７.４)、６m
ＭＭgＣl₂、６mＭ２−メルカプトエタノール、１００
μg／ml牛血清アルブミン、２０ユニットのＰstI〕中で
３時間３７℃で作用させてpＢＲ３２２ＤＮＡ中に１ケ
所存在するＰstI認識部位を切断し、フェノールで除蛋
白した後、ターミナルトランスフェラーゼを５０μlの
反応液〔ＤＮＡ１０μg、０.１４Ｍカコジル酸カリ、
０.３ＭＴris(塩基)pＨ７.６、２mＭジチオスレイトー
ル、１mＭＣ₀Ｃl₂、０.１５mＭ dＧＴＰ、３０ユニットターミナルトランスフェラー
ゼ〕中で３分間３７℃で作用させ上記プラスミドpＢＲ
３２２ＤＮＡの３'両端に約８個のデオキシグアニン鎖
を延長させた。 (１)Ａ(vi)．cＤＮＡの会合ならびに大腸菌の形質転換このようにして得られた合成二重鎖ＤＮＡ０.１μgと
上記プラスミドpＢＲ３２２０.５μgを０.１ＭＮaＣ
l、５０mＭＴris・ＨＣl pＨ７.６、１mＭＥＤＴＡよ
りなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間加熱しその
後徐冷して会合させエネアらの方法〔ジャーナルオブ
モレキュラーバイオロジー、９６、４９５(１９７
５)〕に従って大腸菌x１７７６を形質転換させた。 (１)Ａ(vii)．cＤＮＡ含有プラスミドの単離こうして約８５００のテトラサイクリン耐性株が単離さ
れ、これら各々のＤＮＡをニトロセルロースフィルター
の上に固定した〔グルンステインとホグネス、プロシー
ディングオブナショナルアカデミーサイエンス
ＵＳＡ、７２、３９６１(１９７５)〕。一方、ゴエデ
ルらの報告〔ネイチャー、２９５、５０３(１９８２)〕
のＩ−ＩＦＮのアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸No.
１−５(Cys・Tyr・Cys・Gln・Asp)及びアミノ酸No.７７
−８２(Lys・Gln・Asp・Met・Asn・Val)より推測できる
塩配列(それぞれ５'TCCTGGCAG/ATAG/AC³' および５'AC
A/GTTCATA/GTCC/TTCC/TT³')をトリエステル法〔クレア
ら、プロシーディングオブナショナルアカデミー
サイエンスＵＳＡ、７５、５７６５(１９７８)〕
を用いて化学合成した。このオリゴヌクレオチドに対し
てＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用いて５０μlの
反応液(オリゴヌクレオチド０.２μg、５０mＭＴris・
ＨＣl pＨ８.０、１０mＭＭgＣl₂、１０mＭメルカプト
エタノール、５０μＣiγ−³²ＰＡＴＰ、３ユニットＴ
４ポリヌクレオチドカイネース)中で１時間３７℃で反
応させ、５'末端を³²Ｐで標識した。この標識されたオ
リゴヌクレオチドをプローブとしてラウンらの方法〔ヌ
クレイックアシズリサーチ、９、６１０３(１９８
１)〕に従って上記のニトロセルロースフィルター上に
固定したＤＮＡに会合させ、オートラジオグラフィーに
よって上記二種類のオリゴヌクレオチドプローブに反応
する菌株を４個単離した。これらの菌株の各々の菌体か
らプラスミドＤＮＡをアルカリ法〔バーンボイムとドリ
ー、ヌクレイックアシズリサーチ、７、１５１３
(１９７９)〕によって単離した。次にプラスミドＤＮＡ
の挿入部を制限酵素ＰstIにより切り出し、分離したプ
ラスミドのうちでその挿入部の長さの最も長い断片を含
むものをえらび、このプラスミドをpＨＩＴ３７０９と
名ずけた。このプラスミドの制限酵素地図を〔図１〕に
示す。次にこのpＨＩＴ３７０９プラスミドに挿入さ
れたcＤＮＡ配列の一次構造(塩基配列)をジヌクレオチ
ド合成鎖停止法とマキサム−ギルバートの方法によって
決定した。その一次構造は〔図２〕の通りであった(特
願昭５８−４９６８１号明細書参照:pＨＩＴ３７０９の
Ｉ−ＩＦＮ暗号領域(コドンNo.Ｓ１〜No.１４６)の塩基
配列はその後公表された文献〔ヌクレイックアシッズ
リサーチ、１０、２４８７(１９８２)中の第３図〕に
記載されたものと同一である。

【００２４】(１)Ｂ．発現プラスミドならびに発現用形
質転換体の製造 (１)Ｂ(i)．ptrp６０１およびptrp７０１の構築発現プラスミドとして大腸菌のトリプトファン合成のプ
ロモーター部分〔プロモーター、オペレーターを含むＤ
ＮＡ断片、２７６塩基対、ペネットら、ジャーナルオ
ブモレキュラーバイオロジー、１２１、１１３(１
９７８)〕を含むプラスミドptrp６０１(ベクターはpＢ
Ｒ３２２)を構築した。一方、プラスミドpＢＲ３２２を
制限酵素ＥcoＲIおよび制限酵素ＡvaIで切断し、得られ
たテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＥcoＲI−ＡvaI断
片ののりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼIラージフラグ
メントでうめた。この断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
てptrp６０１のＰvuIIの切断部位に結合させptrp７０１
を構築した〔図３〕。 (１)Ｂ(ii)．ptrp７７１の構築次にptrp７０１に２ケ所存在する制限酵素ＣlaI切断部
位の一つを消去するため、ptrp７０１をＣlaIで部分分
解して二つのＣlaI切断部位のうち一方のみが切断され
たものを得た。生じたのりしろ部分をＤＮＡポリメラー
ゼIラージフラグメントでうめたのち、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで再度結合させてptrp７７１を得た〔図３〕。 (１)Ｂ(iii)．pＨＩＴtrp １１０１の構築 pＨＩＴ３７０９を制限酵素ＰstIで切断してＩ−ＩＦＮ
の構造遺伝子を含むＰstI断片を得た。この断片を制限
酵素ＢstＮIで部分分解し、Ｉ−ＩＦＮ構造遺伝子内に
あるＢstＮI部位の切断されたＢstＮI−ＰstI断片を得
た。ＢstＮI切断部位ののりしろ部分をＤＮＡポリメラ
ーゼIラージフラグメントでうめたのち、前述したトリ
エステル法によって化学合成した蛋白合成開始コドンＡ
ＴＧを含むオリゴヌクレオチドアダプター CGATAATGTGTTACTGCCTATTACACAATGACGG をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた。一方、上記アダプ
ターを結合させたＩ−ＩＦＮ遺伝子をptrp７７１を制限
酵素ＰstIと制限酵素ＣlaIで切断して得た断片のトリプ
トファンプロモーターの下流に挿入してＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合させ、Ｉ−ＩＦＮ発現プラスミドpＨ
ＩＴ trp １１０１を構築した〔図４〕。 (１)Ｂ(iv)．pＨＩＴtrp ２１０１の構築および発現用
形質転換体の製造 pＨＩＴtrp １１０１をさらに改良して次の通りpＨＩＴ
trp ２１０１を構築した。まずptrp６０１を制限酵素Ｃ
laIおよび制限酵素ＨpaIIで処理してtrp プロモーター
を含むＣlaI−ＨpaII断片０.３３Ｋbを得た。この断片
を、ＣlaIで切断しアルカリホスファターゼ処理したpＨ
ＩＴtrp １１０１にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せtrp プロモーターが二つ直列に入ったpＨＩＴtrp ２
１０１を得た[図５〕。このプラスミドpＨＩＴtrp ２１
０１を用いてコーエンらの方法〔前出〕に従って、大腸
菌２９４を形質転換させ、このプラスミドを含む菌株エ
シェリヒアコリ(Ｅ. coli)２９４／pＨＩＴtrp２１０１
を得た。

【００２５】(２)発現用形質転換体の培養Ｅ. coli ２９４／pＨＩＴtrp ２１０１を８μg／mlの
テトラサイクリン、０.４％カザミノ酸、１％グルコー
スを含むＭ９培地２００mlを分注した１ｌマイヤー中で
３７℃で培養し、生育がＫＵ２２０に達した時に３β−
インドリールアクリル酸(ＩＡＡ)を３０μg／mlになる
ように加えて更に４時間培養した。

【００２６】(３)ヒト免疫インターフェロン蛋白質の精
製 (３)Ａ．ヒトＩ−ＩＦＮ含有上清の製造上記(２)で得られた培養液１.２ｌを遠心分離して菌体
を集め、これを６０mlの１０％シュクロースを含む０.
０５ＭＴris・ＨＣl pＨ７.６に懸濁した。この菌体
懸濁液に０.２Ｍフェニル−メチル−スルフォニルフル
オライド(ＰＭＳＦ) ０.３ml、５ＭＮaＣl ２.４ml、
０.２Ｍエチレンジアミンテトラアセテート(ＥＤＴＡ)
２.４ml、１Ｍスペルミジン２.４ml、５mg／mlリゾチー
ム２.４mlを加え０℃１時間放置したのち、３７℃で５
分処理し、これを更にＡＲＴＥＫ社(米国)製超音波破砕
器で０℃３０秒処理した。この溶菌液を１０５、０００
×gで１時間遠心分離して上清６６mlを集めた。 (３)Ｂ．抗体カラムを用いるヒトＩ−ＩＦＮの精製上記(３)Ａで得た上清６０mlを１mＭＥＤＴＡ、０.１
５ＭＮaＣlを含む２０mＭＴris・ＨＣl、pＨ７.６(Ｔ
ＥＮ)で１５０mlに希釈したのち、参考例２の方法で調
製した抗Ｉ−ＩＦＮ抗体カラム(９ml)にかけた。ＴＥＮ
で十分洗浄したのち、さらに０.０１％ノニデットＰ−
４０(シェル社製)０.５ＭＮaＣl を含むＴＥＮで洗浄
した。次に０.２５ＭＮaＣl を含む０.１Ｍ酢酸でＩ
−ＩＦＮを溶出し、溶出液はただちに１ＭトリスＨＣl
pＨ７.６で中和した。得られた溶液を蒸留水に対し４
℃、１６時間透析し、これをアセトン−ドライアイスで
凍結乾燥に付し粉末とした。結果は以下の通りである。蛋白質(mg) 全活性(U) 比活性(U/mg) 回収率(％) 溶菌液上清 250.8 4×10⁸ 1.6×10⁶ − 抗体カラム処理 2.0 1.5×10 ⁸ 7.5×10 ⁷ 37.5 ここで得られた最終のヒト免疫インターフェロン蛋白質
の比活性(ＷＩＳＨ細胞に対するＶＳＶの細胞変性効果
阻止試験によるウイルス活性測定による(前出))は、７.
５×１０⁷Ｕ／mgであった。この蛋白質を以下の実験に
供した。 (３)Ｃ．ヒト免疫インターフェロン蛋白質の性状上記(３)Ｂで得られたヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質の性状は下
記のとおりであった。 (３)Ｃ(i)．分子量上記(３)Ｂで得られた蛋白質を２−メルカプトエタノー
ルで処理してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(１７.５
％)電気泳動(１５mＡ、６時間)にかけ、クマジーブルー
で染色したところ、蛋白質は単一のバンドとして確認で
きた〔図６〕。なお同時に泳動させた分子量マーカーの
泳動距離と蛋白質の泳動距離との関係から蛋白質の分子
量は１７０００±１０００と推定された〔図７〕。一
方、２−メルカプトエタノールで処理しなかった蛋白質
は分子量３３０００±２０００の位置にもう一本のバン
ドが検出された。この値はＩ−ＩＦＮの分子量１７００
０±１０００の約２倍に相当することから、このバンド
はＩ−ＩＦＮの二量体に由来すると考えられる。 (３)Ｃ(ii)．アミノ酸分析前記(３)Ｂで得られた蛋白質をガラス製加水分解用試験
管にとり、２００倍量(Ｖ／Ｗ)の４％チオグリコール酸
を含む定沸点塩酸を加えて、減圧下に封管したのち、１
１０℃で２４、４８、７２時間加水分解した。加水分解
後、開管し、塩酸を減圧下で除去し、残渣を０.０２Ｎ
塩酸に溶解して日立製８３５型高速アミノ酸分析計によ
りアミノ酸分析を実施した。シスチンおよびシステイン
は、ハースの方法〔メソッズインエンチモロジー、
１１、１９７(１９６７)〕に従い、上記蛋白質を過ギ酸
酸化したのち、上記と同様に２４時間加水分解して、ア
ミノ酸分析計によりシステイン酸として定量した。アミ
ノ酸分析値は、２４、４８および７２時間の加水分解で
得られた値を平均して求めた。但し、セリン、スレオニ
ン、チロシンおよびトリプトファンの値は加水分解時間
を０時間に外挿して求めた。その結果を〔表３〕に示
す。

【表３】 (３)Ｃ(iii)．アミノ末端アミノ酸分析前記(３)Ｂで得られた蛋白質をハースの方法〔メソッズ
インエンチモロジー、１１、１９７(１９６７)〕に
従って過ギ酸酸化したのち、エドマン分解法の岩永らに
よる変法〔ヨーロピアンジャーナルオブバイオケ
ミストリー、８、１８９(１９６９)〕によりそのアミノ
末端アミノ酸分析を実施した。生成したフェニルチオヒ
ダントイン−アミノ酸(ＰＴＨ−アミノ酸)はウルトラフ
ェアーＯＤＳカラム〔アルテックス社製(Ｕ.Ｓ.Ａ.)、
４.６×２５０mm、粒子径５μm〕を用い、アルチャーの
方法〔アルテックスクロマトグラム、３、８(１９８
０)〕により、バリアン製高速液体クロマトグラフ５０
４０型(Ｕ.Ｓ.Ａ.)で同定、定量した。その結果、ＰＴ
Ｈ−メチオニンスルホンおよびＰＴＨ−システイン酸が
検出された。上記から明らかなように本発明によれば、
７.５×１０⁷Ｕ／mg 以上の比活性を有する実質的に純
粋な、遺伝子組み換え技術によるヒト免疫インターフ
ェロン蛋白質を製造することができる。

【００２７】実施例２ヒト免疫インターフェロン蛋白
質の製造および得られた蛋白質のトリプシン消化ペプチ
ドマップ実施例１(１)Ｂ(iv)で得たＥ. coli ２９４／pＨＩＴtr
p２１０１を実施例１(２)と同一の条件で培養し、実施
例１(３)Ａに記載と同一の条件で菌体を破壊し上清６４
mlを集めた。上記上清６０mlを実施例１(３)Ｂに記載の
条件で、参考例２に記載の条件で調製した抗Ｉ−ＩＦＮ
抗体カラムを用いて精製し、凍結乾燥粉末としてヒトＩ
−ＩＦＮ蛋白質(比活性:１.４×１０⁷Ｕ／ mg)１.８mg
を得た。上記蛋白質５０μgを２５mＭ酢酸アンモニウム
−水酸化ナトリウム(pＨ８.０)中でＴＰＣＫ−トリプシ
ン〔ワーシントン社製(米国)〕と３７℃で１８時間反
応させて消化し、２−メルカプトエタノールを添加して
３７℃でさらに２時間保温したのち、１％のトリフルオ
ロ酢酸を加えて反応を停止した。このようにして得られ
た消化物を0.02％トリフルオロ酢酸−５％アセトニトリ
ルで平衡化したウルトラフェアーオクチルカラム〔５μ
m、4.6×２５０mm、アルテックス社製(米国)〕にかけ、
アセトニトリルの直線濃度勾配法(５−７０％)によって
温度３０℃、流速１.０ml／分で溶出した。モニターは
フルオレスカミンを用いる蛍光法によって行った。ここ
で得られたトリプシン消化ペプチドマップの結果は第８
図に示すとおりであった。

【００２８】実施例３注射用製剤本発明のヒトＩ−ＩＦＮ蛋白質(比活性:２×１０⁷Ｕ／m
g)５mgを１００mlの５％ＨＳＡ水溶液１００mlに溶解
し、メンブランフィルター(孔径０.２μm)を用いてろ過
後、無菌条件下１００バイアルに分配する。バイアル中
の溶液を無菌的に凍結乾燥し、用時調製用注射用製剤を
得る。本製剤は用時１mlの蒸留水に溶解する。

【００２９】参考例３ (１)、粗抽出液の製造：前記の実施例１（１)、(２)
および(３)Ａに記載の、大腸菌294/pHIP trp2101の培養
および抽出により、ヒト免疫インターフェロン(IFN-γ)
の粗抽出液(上清)を得た。 (２)、抗体カラムの製造 :前記参考例２に記載の方法に
より、抗体カラム(モノクローナル抗体γ２−１１.１)
を製造した。(３)、抗体カラムを通過させた溶出液の製
造 :抗体カラムを通過させた溶出液は、上記(１)項の粗
抽出液から、本発明方法に従い、次のようにして製造し
た。１１０mlのＩＦＮ−γの粗抽出液を、１mＭＥＤＴ
Ａおよび０.１５ＭＮaＣｌを含む２０mＭＴris−ＨＣ
l(pＨ７.６)(ＴＥＮ)で希釈し２５０mlとなし、希釈液
を上記２項の抗体カラム(１２ml)にかけた。カラムをＴ
ＥＮで、次いで、０.０１％Ｎonidet Ｐ−４０(Ｓheel
社製)および０.５ＭＮaＣｌを含有するＴＥＮで充分に
洗浄した。つぎに、０.２５ＭＮaＣｌ含有０.１Ｍ酢酸
溶液でＩＦＮ−γを溶出した。溶出液をただちに、１Ｍ
Ｔris−ＨＣl(pＨ７.６)で中和し、抗体カラムを通過
させた溶出液４０mlを得た。 (４)、ＣＰＧ(controlled−pore glass)ビーズを用い
て、Leyら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー(Eur. J. Immunol.)、１０、８７７(１９８０)に
記載の方法に従って、次の工程によりＣＰＧ−(１)溶出
液およびＣＰＧ−(２)溶出液を得た。なお、ＣＰＧビー
ズは、ＣＰＧ−１０(１２０−２００メッシュ、７５−
１２５μm、Serva 社、西ドイツ製)を用いた。

【化１】 (５)、上記(１)項で得られた粗抽出液,上記(３)項で得
られた抗体カラムを通過させた溶出液および上記(４)項
で得られたＣＰＧの溶出液の抗ウイルス活性を、前述の
方法により測定した。また、該粗抽出液と該溶出液は、
前記実施例１(３)Ｃ(i)に記載のＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により測定した。結果を次の〔表
４〕に示す。

【表４】

【００３０】実験例１エンドトキシン量の測定 (１)．材料 (イ)ＩＦＮ−γ (粗抽出液。参考例３(１)で得られた
上清。以下の実験例において、「ＩＦＮ−γ(粗抽出液)」
と称する。) (ロ)ＩＦＮ−γ (本発明の抗体カラム精製品。参考例
３(３)で得られた精製標品。以下の実施例において、
「ＩＦＮ−γ(抗体カラム精製品)」と称する。) (ハ)ＩＦＮ−γ (ＣＰＧ−(２)溶出液。参考例３(４)
で得られた溶出液。以下の実験例において、「ＩＦＮ−
γ(ＣＰＧ−(２)溶出液)」と称する。) (２)方法各製剤中のエンドトキシンの定量を、岩永らの方法[ヘ
モスタホシス(Ｈaemostasis), ７,１８３(１９８７)]に
従って行なった。 (３)結果結果を次の〔表５〕に示す。

【表５】なお、用いられた緩衝液中のエンドトキシン量は、１.
０ng／ml以下であった。

【００３１】実験例２発熱性物質試験 (１)．材料 (イ)．ＩＦＮ−γ (粗抽出液) (ロ)．ＩＦＮ−γ (抗体カラム精製品) (ハ). ＩＦＮ−γ (ＣＰＧ−(２)溶出液) (ニ)．ウサギは、市川屋(東京)から購入した。 (２)．発熱性物質試験は、日本抗生物質医薬品基準,厚
生省,１９８２年に従って行なった。 (３)結果結果を次の〔表６〕に示す。

【表６】 (４)結論臨床適用量に相当するＩＦＮ−γをラビットに投与した
ところ、ＩＦＮ−γ(粗抽出液)およびＩＦＮ−γ(ＣＰ
Ｇ−(２)溶出液)は発熱性物質が混在するのに対し、Ｉ
ＦＮ−γ(抗体カラム精製品）は、発熱性物質試験にお
いて発熱性物質陰性である。

【００３２】実験例３細胞増殖抑制試験: (１)．材料 (イ)．ＩＦＮ−γ （粗抽出液） (ロ)．ＩＦＮ−γ （抗体カラム精製品） (ハ). ＩＦＮ−γ (ＣＰＧ−(２)溶出液) (２）試験方法ＩＦＮ−γ製剤のインビトロにおける細胞増殖抑制試験
を、次の方法で行った。腫瘍細胞を細胞培養用フラスコ
に移し、種々の濃度のＩＦＮ−γ含有標品をこれに加え
た。これらの細胞を細胞培養用皿に移し、４〜５時間培
養し、細胞を底につくまで培養した。培地をＩＦＮ−γ
の種々の濃度を含むものに置き換え、３７℃５日間培養
した。増殖抑制活性を、細胞の増殖を減少させるために
必要な濃度を５０％として表わした。 (３)結果結果を次の〔表７〕に示した。

【表７】

【００３３】

【配列番号：１】配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−ＯＨ

【００３４】

【配列番号：２】配列の長さ：１４６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列 Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys 5 10 15 Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe 20 25 30 Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys 50 55 60 Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met 65 70 75 80 Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu 85 90 95 Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala 100 105 110 Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys 115 120 125 Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala 130 135 140 Ser Gln−ＯＨ１４５

【００３５】

【配列番号：３】配列の長さ：４４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：c DNA 配列の特徴特徴を表す記号：mature protein X は TAA, TGA または TAG を示す配列 TGTTACTGCC AGGACCCATA TGTAAAAGAA GCAGAAAACC TTAAGAAATA TTTTAATGCA 60 GGTCATTCAG ATGTAGCGGA TAATGGAACT CTTTTCTTAG GCATTTTGAA GAATTGGAAA 120 GAGGAGAGTG ACAGAAAAAT AATGCAGAGC CAAATTGTCT CCTTTTACTT CAAACTTTTT 180 AAAAACTTTA AAGATGACCA GAGCATCCAA AAGAGTGTGG AGACCATCAA GGAAGACATG 240 AATGTCAAGT TTTTCAATAG CAACAAAAAG AAACGAGATG ACTTCGAAAA GCTGACTAAT 300 TATTCGGTAA CTGACTTGAA TGTCCAACGC AAAGCAATAC ATGAACTCAT CCAAGTGATG 360 GCTGAACTGT CGCCAGCAGC TAAAACAGGG AAGCGAAAAA GGAGTCAGAT GCTGTTTCGA 420 GGTCGAAGAG CATCCCAGX 441

【００３６】

【配列番号：４】配列の長さ：60 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：c DNA 配列ＡＴＧＡＡＡＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴＡＴＡＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧ
ＣＴＣＴＧＣＡＴＣＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＧＣ６０

【００３７】

【配列番号：５】配列の長さ：１０￣３０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴 X₁ は結合手または(N)Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Se
r Pro Ala Ala LysThr Gly Lys Arg(C) で示されるペ
プチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個のア
ミノ酸を有するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す。
Y₃ は (N)Arg Arg Ala Ser Gln(C) で示されるペプチド
鎖においてそのＮ末端から数えて１〜５個のアミノ酸を
有するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す。配列 (N)X₁−Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly−Y₃−OH
(C)

【００３８】

【配列番号：６】配列の長さ：145 ~ 147 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列の特徴 Y は Met または結合手を示す。Z₁、Z₂ はそれぞれ C
ys または 1/2 Cys を示す。配列 Y Z₁ Tyr Z₂ Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys 5 10 15 Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu 20 25 30 Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile 35 40 45 Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp 65 70 75 80 Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe 85 90 95 Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys 100 105 110 Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala 115 120 125 Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg 130 135 140 Ala Ser Gln−OH 145

【００３９】

【配列番号：７】配列の長さ：13 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 TCCTGGCAG/AT AG/AC 13

【００４０】

【配列番号：８】配列の長さ：16 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 ACA/GTTCATA/GT CC/TTCC/TT 16

【００４１】

【配列番号：９】配列の長さ：34 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成 DNA 配列 CGATAATGTG TTACTGCCTA TTACACAATG ACGG 34

【００４２】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１(１)Ａ(vii)で得られたプラスミドpＨ
ＩＴ３７０９の制限酵素地図

【図２】実施例１(１)Ａ(vii)で得られたpＨＩＴ３７０
９プラスミドの一次構造(塩基配列)

【図３】実施例１(１)Ｂ(i)および(ii) の ptrp ７０１
およびptrp７７１の構築図

【図４】実施例１(１)Ｂ(iii)のpＨＩＴtrp１１０１の
構築図

【図５】実施例１(１)Ｂ(iv)のpＨＩＴtrp２１０１の構
築図

【図６】実施例１で得たヒトγＩ−ＩＦＮ蛋白質の電気
泳動の結果

【図７】同蛋白質の分子量測定の結果

【図８】実施例２で得たトリプシン消化ペプチドマップ

【符号の説明】

【化２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 13/00 ＺＮＡ 8318−4Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子組み換え技術により大腸菌形質転換
体から得られ、１０⁷Ｕ／mg以上の比活性を有し、H-Lys
-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-A
la-Ser-Gln-OHに対するモノクローナル抗体と結合し、
発熱性物質陰性で、式 H−Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln−OH で表されるアミノ酸配列を有する有効量のヒト免疫イン
ターフェロン蛋白質と生理学的に許容される担体とを含
有する注射剤である抗ウイルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制
または免疫増強剤。