KR910001726B1 - 펩티드의 제조방법 - Google Patents

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펩티드의 제조방법

제1도는 실시예 10의 DEAE 셀롤로오스 컬럼에서의 본 발명의 단클론성 항체의 용출 패턴을, 제2도는 실시예 10에서의 단클론성 항체의 전기 영동의 결과를 보여준다.

제3도는 하기 실시예 13에 언급된 본 발명에 따른 정제 방법에 의해 얻어진 인체 면역 인터페론 단백질의 전기 영동의 결과를 보여주고 제4도는 또한 하기 실시예 13에 언급된 분자량 결정의 결과를 보여준다.

제5도는 참고예 1(vii)에서 얻어진 플라스미드 PHIT 3709의 1차 구조(염기 서열)을 설명하고, 제6도는 참고예 2(i) 및 (ii)에 언급된 ptrp 701 및 ptrp 771의 제작 도표를 보여주고, 제7도는 참고예 2(iii)에 언급된 pHITtrp 1101의 제작 도표를 보여주고, 제8도는 참고예 2(iv)에서 언급된 pHITtrp 2101의 제작 도표를 보여준다.

제9도는 단클론성 항체에 항원이 결합되는데 있어서의, 실시예 19에서의 고체상위에 고정시킨 IFN-γ (b) 및 재조합 IFN-γ 샘플 (a)의 경쟁을 보여주고, 제10 및 제11도는 단클론성 항체에 항원이 결합되는데 있어서의, 실시예 20(i) 및 20(ii)에서의 본 발명의 IFN-γ 샘플(a) 및 효소-라벨된 펩티드(b)의 경쟁을 보여준다.

본 발명은 신규 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 쾨흘러 및 밀리테인[Nature, 256, 495(1975)]에의해 개발된 단클론서 항체에 제조를 위한 융합 세포 기술은 최근에 자주 이용되고 있다. 이러한 기술은 괄목할만한 여러가지 특성을 갖고 있다 ; 예를 들어, 각 항원 결정기(antigenic determinant)에 대한 단일 특이성을 갖는 항체가 제조될 수 있고 거칠게 정제된 시료에 대항하여 얻어진 항체는 흡수 순서가 필요하지 않다. 더욱더, 항체 제조의 견지에서, 본 기술은 많은 점에서 유리하다. 예를 들어 융합 세포가 복수의 형태로써 성장할때, 고-역가 항체 시료를 대량으로, 그리고 일정한 품질 및 우수한 재현성으로 얻을 수 있다. 이러한 견지에서, 융합 세포를 사용하여 단클론성 항체를 얻는 기술의 이용은 증가하고 있다. 단클론성 항체의 이용 형태는 항원 검출에만 제한되지 않는다. 예를 들어, 단클론성 항체들은 항체 컬럼의 제조를 통해 미량 성분의 정제를 위해 사용된다[Nature, 285, 446(1980)]. 더욱더, 진단 시약 또는 치료제로서의 그의 용도가 개발되었다[European Journal or Immunology, 9 94(1979)].

인체 인터페론(IFN)은 적어도 3개의 항원적으로 다른 형태, 즉 알파, 베타 및 감마를 포함함이 알려졌다[Nature, 286, 110(1980)]. 또한 감마-인터페론(IFN-γ)은 유사분열 촉진인자 또는 항원으로부터 자극을 받은 T 림프구에 의해 주로 생산되고 IFN-γ는 또한 면역 인터페론(I-IFN)으로 불리워진다[The Interferon System, Springer Publishing Co., New York, 1979]. IFN-γ는 여러 가지 면역 응답의 결과로써 생체에서 제조되는 것으로 생각되고, IFN-γ가 면역-조절에 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다. IFN-γ는 알파-일터페론(IFN-α) 및 베타-인터페론(IFN-β)과는 항원적 특성 및 유발인자 종에서 다르다. 또한 IFn-γ는 산 및 열에 불안정하다는 것도 공지되어 있다[The Interferon System, Springer Publishing Co., New York, 1979].

IFN들은 일반적으로 생체에서 생산되는 항비루스적으로 활성인 물질로서 정의된다. 이들은 다양한 다른 생물학적 활성을 갖고 있음이 입증되었고 이들의 항종양 활성은 관심의 초점이 되고 있다[Blood, 55, 711,(1980) ; 상등, 56, 875, (1980)]. 중양 성장을 억제하기 위한 두가지 방법이 있다. 하나는 종양 세포 증식의 직접 억제이고 다른 한가지 방법은 숙주의 면역 응답을 통한 종양 성장의 간접적인 억제 방법이다. 후자의 경우는 천연 킬러(NK) 세포 활성화, 마이크로파이지 활성화 및 킬러 T 세포 활성화, 그밖의 다른 것을 포함한다. 사실, IFN들은 상기 언급된 직접 활동에 부가해서 여러 가지 면역-응답을 가능하게 하는 작용을 발휘함이 증명되었다[Biochemica et Biophysica Acta. 516 231(1978)]. IFN-γ는 시험관내에서 항종양 효과의 관련된 여러 가지 활성 및 생체내에서 활성이 IFN-α 및 IFN-β보다 훨씬 높으므로, 그 중요성이 강조되고 있다.[Cellular Immunology, 49, 390, (1980)].

그러나, 시험간내에서 유발될 수 있는 IFN-γ-효능을 일반적으로 낮고, IFN-γ-생산 세포계로서 충분할 만큼 정립된 세포계(cell lines)는 거의 없고, IFN-γ 정제는 그 자체가 열 및 산에 불안정함으로 어렵다.

이런 이유 때문에, IFN-γ의 대량 생산 및 정제는 IFN-β 및 IFN-α와 비교하여 많이 지연되었다.

매우 최근에, 천연 IFN-α를 단일 제조할 수 있다고 보고되었으나[Proceedings of the National Academy of Sciences, 79, 1820, (1982)], 활성의 회복이 매우 낮다. 따라서 더 효과적인 정제 방법이 간절히 열망되고 있다.

한편, 인테 IFN-γ 유전자의 클로닝(cloning)이 보고되었고 최소한 IFN-γ의 종으로써, 146 아미노산으로 구성된 약 17킬로달톤 분자조을 이 콜리(Escherichia Coli)내에서 생산할 수 있게 되었다[Nature, 295, 503, (1982) ; Nucleic Acids Researc, 10, 2487, (1982)]. 그러나, 보고된 것처럼 천연 생성물 IFN-γ는 분자량이 다른 여러 가지 종을 포함하고 있고 분자종들 사이의 대응하는 관계는 알려져 있지 않다.

이러한 견지에서, 여러 가지 IFN-γ에 대한 단클론성 항체를 얻는 것을 분자종 가운데서 대응하는 것을 설립하기 위해 중요할 뿐아니라 천연 IFN-γ 또는 유전공학 기술에 의해 이 콜리에서 제조된 IFN-γ 정제를 위한 매우 강력한 수단을 제공한다. 매우 최근의 보고는 자연 IFN-γ에 대응하는 단클론성 항체의 획득을 기술하였다[Nature, 296, 258(1982)]. IFN-γ가 다수의 분자종을 포함하는 경우에는 유전자 조작 기술에 의해 클로닝된 분자 등에 대한 단클론성 항체를 얻는 것이 매우 중요하다.

인체 IFN-γ의 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 인체 IFN-γ의 보고딘 아미노산 서열에 기초를 두고[Ncleic Acids Rescarch, 10, 2487(1982)], 본 발명자들은 상기 아미노산 서열로부터 주어진 C-말단 폴리펩티드, 즉 하기식의 펩티드를 화학식으로 합성하고 나아가 이와 담체 단백질을 화학적으로 결합시켜 단백질 접합체(conjugate)를 생각하였다.

(N) (C)

H-X-Lys Arg Ser Gln Met Leu Pe Arg Gly-Y-OH (I)

상기식에서, X는 결합 또는 하기식의 펩티드 쇄의 C 말단으로부터 계산하여 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

(N) (C)

Ile Gln Vel Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lus Arg

Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N 말단으로부터 계산하여 1∼5 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

(N) (C)

Arg Arg Ala Ser Gln

이렇게 얻어진 폴리펩티드 및 단백질 접합체는 포유 동물의 면역을 위해 사용하고, 융합 세포는 포유 동물의 같은 또는 다른 종으로부터 얻는 림포이드 세포와 포유 동물로부터 얻어진 비장(spleen) 세포의 세포융합에 의해 만들어지고 클로닝된다.

상기에서 얻어진 융 세포를 포유 동물 체내에 접종하고 성장 및 단클론성 항체를 제조하도록한 후 회수하여 상기 언급된 폴리펩티드에 대응하는 단클론성 항체를 얻는다.

더욱더, 본 발명자들은 얻어진 단클론성 항체를 사용하여 인체 IFN-γ를 포함하는 조생성물로부터 인체 IFN-γ를 정제하는 방법 및 또한 같은 것은 사용하는 효소 면역 분석(EIA) 또는 방사 면역 분석(RIA)에 의해 인체 IFN-γ를 검출하는 방법을 설립하였다. 본 발명은 이러한 방법으로 완성되었다.

즉, 본 발명은 신규 폴리펩티드(I), 그의 단백질 집합체, 신규 클로닝된 융합세포, 신규 단클론성 항체 및 그의 제조방법, 및 더욱더 상기 단클론성 항체의 용도를 제공하는 것이다.

상기 폴리펩티드(I)에 관하여 Y가 Arg Arg Ala Ser Gln이고/이거나 X가 Lys Arg인 것이 바람직하다. 더욱더, 폴리펩티드(I)는 15∼25 아미노산 잔기를 함유하고 있는 것이 바람직하다.

상기 펩티드는 펩티드 합성의 공지 방법에 의해 제조할 수 있다. 고체상 방법과 액체상 방법중의 하나가 사용될 수 있으나 액체상 합성 방법이 많은 경우에 유리하다. 펩티드 합성의 이러한 방법은 예를 들어 참고문헌[Schroder 및 Lubke의 저서 "The Peptides", Vol. 1, Academic Press, New York, U.S.A., 1966, 또는 Izumiya 등의 저서 "Peptide Syntheses", Maruzen, Tokyo, Japan, 1975, 또는 Haruaki Yajima의 저서 "Experiments in Biochemistry, Vol, 1, 페이지 207∼400", Tokyo Kagaku Dojin, 1977] 및 그밖의 다른 방법에 기술되어 있고, 아지드 방법, 클로라이드 방법, 산 무수물 방법, 혼합 산 무순물 방법, DCC 방법, 활성 에스테르 방법, 우드워드 시약 K를 사용하는 방법, 카르보디이미다졸 방법, 산화/환원 방법 및 DCC/부가(즉 HONB, HOBt, HOSu) 방법 등을 포함한다.

상기 펩티드는 폴리펩티드(I)의 부분 성분에 해당하는 출발 물질을 함유하는-반응성 카르복실(a)와 펩티드(I)의 나머지 부분에 해당하는 출발 물질을 함유하는 반응성 아미노(b)의 축합에 의해 제조되고, (a) 및 (b)는 공지의 펩티드 합성 바업중 어느 하나에 의해 임의로 보호되고, 축합 생성물이 보호기를 갖는 경우에, 보호기는 공지의 방법으로 제거될 수 있다.

물질들 사이의 반응에 참여하지 않아야 하는 작용기를 보호하는 방법, 이러한 보호에 사용되는 보호기, 이러한 보호기를 제거하는 방법 및 반응에 참여하도록 작용기를 활성화하는 방법 등은 공지된 방법들중에서 적절히 선택될 수 있다.

즉, 출발 물질의 아미노기의 보호기는 카르보벤즈옥시, t-부틸옥시카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 포밀, 0-니트로페닐카르보닐, 디페닐포스피노티오닐 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐기를 포함한다. 카로복실 보호기는 알킬 에스테르기(즉, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 t-부틸과 같은 에스테르 형성기), 벤질 에스테르기, p-니트로벤질 에스테르기, p-메톡시벤질 에스테르기, p-클로로벤질 에스테르기, 벤즈히드릴 에스테르기, 카르보벤즈옥시 히드라지드기, t-부틸옥시카르보닐 히드라지드기 및 트리틸 히드라지드기 등을 포함한다.

아르기닌의 구아니디노기의 보호기로는 에를 들어 니트로, 토실, p-메톡시벤젠술포닐, 카르보벤즈옥시, 이소보르닐옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 4-메톡시-2,6-디메틸벤젠술포닐 또는 펜타메틸벤젠술포닐이 있다. 구아니디노기는 또한 산(즉, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 염산 또는 황산) 염의 형태로 보호될 수 있다.

트레오닌의 히드록실기는 예를 들어 에스테르화, 또는 에테르화에 의해 보호될 수 있다. 이러한 에스테르화를 위한 적절한 기는, 예를 들어, 아세틸과 같은 저급 알카노일기, 벤조일과 같은 아로일기 및 벤질옥시카르보닐 및 에틸옥시카르보닐과 같은 카르본산-유도된 기가 있다. 에테르화를 위한 적당한 기는, 예를 들어, 벤질, 테트라히드로피라닐 및 t-부틸기가 있다. 그러나, 트레오닌의 히드록실기는 반드시 보호될 필요가 없다. 메티오닌은 술폭사이드의 형태로 보호될 수 있다. 출발 물질에서 카르보닐의 활성화된 형태는 해당하는 산 무수물, 이지드 및 활성 에스테르(펜타클로로페놀, p-니트로페놀, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시벤조트리아졸, N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복스이미드 등과 더불어 에스테르)가 있다. 몇몇 경우에, 펩티드 결합-형성 반응은 탈수제(즉 디시클로헥실 카르보디아미드, 카르보디이미다졸 도는 유사한 카르보디이미드 시약)의 존재하에 수해될 수 있다.

펩티드 축합 반응은 용매 존재하에 수행될 수 있다. 용매는 펩티드 축합 반응에 사용하는 것으로 알려진 용매중에서 적절히 선택될 수 있다. 예로는 무수 또는 수성 디메틸포름이미드, 초산에틸 및 N-메틸피롤리돈 및 이들의 적당한 혼합물이 있다.

반응 온도는 펩티드 결합-형성 반응에 사용하는 것으로 알려진 범위내에서 선택되고, 일반적으로 약 -40℃∼약 60℃의 범위내에서, 바람직하게는 약 -20℃∼약 0℃의 범위내에서 선택된다.

축합 반응의 완결 후, 보호기가 생성물에 존재한다면 공지의 방법, 에를 들어 환원 방법(즉, 팔라듐 블랙과 같은 촉매를 사용하여 수소화, 액체 암모니아중에서 금속 나트륨으로 환원) 또는 산 분해(즉, 티오아니술과 같은 황-함유 화합물 또는 존재하에 트리플루오로 아세트산, 불화수소 도는 메탄술폰산 도는 그의 혼합물과 더불어 산 분해)에 의해 제거될 수 있다.

상기의 방법에 의해 제조된 본 발명의 펩티드는 추출, 분배 및/또는 칼럼 크로마토그래피와 같은 펩티드 분리의 통상 방법에 의해 반응 완결 후 반응 혼합물로부터 회수할 수 있다.

폴리펩티드(I) 및 담체 단백질 사이의 접합체와 관련된, 담체 단백질의 종류 및 담체내 헵텐(본 발명의 경우에 폴리펩티드)의 비율은 항체가 면역화용 담체와 더불어 결합된 헵텐에 대응하여 효과적인 방법으로 제조될 수 있기만 하다면 임의로 제공될 수 있다. 예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 소 틸로글로불린은 헵텐의 1중량부당 0.1∼20중량부, 바람직하게는 1∼5중량부로 커플링을 위해 사용된다.

담체와 헵텐의 커플링을 위해, 여러 종류의 축합체가 사용될 수 있다. 글루타르 알데히드 또는 카르보디이미드의 사용이 바람직하다.

폴리펩티드(Ⅰ) 또는 그의 단백질 접합체에 의한 면역화에 사용되는 포유 동물로는 양, 염소, 집토끼, 모르모트, 쥐 및 새앙쥐와 같은 실험 동물이 있다. 단클론성 항체의 제조를 위해서는, 쥐 및 새앙쥐가 이들가운데 바람직하다. 예를 들어 새앙쥐의 면역화는 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 피내 및 그밖의 경로중 어느 한 경로에 의해 수행되고, 대부분의 경우에 피하, 복강내 또는 정맥내(특히 피하) 주입이 바람직하다. 다른 것중에서, 면역화 간격 및 면역 투여는 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있고, 다양한 변화가 가능하다. 예를 들어, 면역화는 2주 간격으로 2∼6번 반복되고, 마지막 면역화 후 1∼5일, 바람직하게는 2∼4일된 비장세포가 많은 경우에 사용된다. 각 면역화에서, 펩티드의 면역 투여량은 0.1μg 보다 커야하고, 바람직하게는 10∼300μg이 요구된다. 또한 비장 절단전에 부분적으로 혈액을 샘플링하고, 증가된 혈액 항체 기준을 확인한 후 비장 세포를 사용하여 세포 융합 실험을 실행하는 것이 바람직하다. 림포이드 세포와 비장 세포의 상기 언급된 세포 융합에서, 림포이드 세포는 면역된 포유 동물과 같거나 또는 다른 종의 포유 동물(바람직하게는 같은 종)의 것이고, 세포 융합은, 예를 들어, 히포크산린-구아닌-포스포리보실 전이 효소 결실(HGRRT^-) 또는 티미딘키나제 길실(TK^-)과 같은 마커를 갖는 골수종 세포계와 같은 림포이드 세포주 및 절단된 새앙쥐 비장 세포 사이에서 수행된다. 융합을 위해, 센다이(Sendai) 바이러스 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 융합제가 사용된다. 물론 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 융합 촉진제를 가할 수 있다. 예를 들어, PEG의 중합정도는 일반적으로 1000∼6000, 처리 기간은 0.5∼30분, 농도는 10%∼80%이다 바람직한 실시예에서, 융합은 4∼10분 동안 35∼55%에서 PEG 6000으로 처리하여 효과적으로 수행된다. 예를 들어, 융합된 세포는 히포크산린-아미노프테린-터미딘 배지[HAT 배지 ; Nature, 256, 495(1975)]를 사용하여 선택적으로 성장시킬 수 있다.

세포 성장 후 얻어진 배양 상층액은 바람직한 항체의 제조를 위해 스크리닝될 수 있다. 항체 역가를 위한 스크리닝은 하기의 방법으로 만들어질 수 있다. 즉, 첫번째 단계에서, 면역화를 위해 사용된 펩티드에 대응하는 항체의 생산 또는 비생산은 RIA 또는 EIA와 같은 적당한 방법에 의해 체크될 수 있다. 이러한 방법에 여러가지 변형을 가할 수 있다. 바람직한 측정 방법으로써, EIA를 사용하는 방법이 언급되었다. 예를들어, 집토끼 항-새앙쥐 면역 글로불린 항체는 공지의 방법에 의해 구슬 형태의 셀룰로오스와 같은 담체에 결합된다. 시험될 배양 상층액 또는 새앙쥐 혈청을 가하고, 미리 결정된 시간동안 일정한 온도(4∼40℃를 의미한다)에서 반응을 진행시킨다. 반응 생성물은 잘 씻고, 효소-라벨된 펩티드(공지의 방법에 의해 효소 와 펩티드를 커플링시켜 제조한 후 정제함)를 가하고, 미리 정해진 시간동안 일정한 온도에서 반응을 진행 시킨다. 반응 생성물을 잘 씻고, 효소 기질을 가한 다음 미리 정해진 시간동안 일정한 온도에서 반응을 진행시킨다. 이렇게 해서, 수득된 색깔이 있는 생성물은 예를 들어 흡수 또는 형광의 강도를 통해 분석할 수 있다.

선택 배지에서 성장시키고, 면역화를 위해 사용된 펩티트에 대응하는 항체 활성의 검출 후 웰 (well)속의 세포는, 예를 들어, 제한된 희석 방법에 의해 바람직하게 클로닝된다. 클로닝된 세포 배양 상층액은 같은 방법으로 스크린되고, 높은 항체 역가를 갖는 웰속의 세포를 성장시킨다. 이러한 방법으로, 면역화를 위해 사용된 펩티드에 대응하는 단클론성 항체-생산 융합 세포 클론이 얻어질 수 있다.

다음 단계에서, 상기 클론에 의해 제조된 항체는 면역화를 위해 사용된 펩티드 뿐만 아니라 IFN-γ 분자와 반응하는지를 시험할 필요가 있다. 이러한 목적을 위해, 방법으로는 예를 들어, 방사성- 및 또는 효소-라벨된 IFN-γ을사용하여 RIA 또는 EIA에 의해 반등성을 시험하는 방법 및 생물학적 활성(IFN-γ활성)이 항체에 흡수되는지를 시험하는 방법이 이용된다. 후자는 IFN-γ의 정제가 필요하지 않으므로 유리하다. 다른 방법도 가능하지만 예를 들어, 단백질 A를 사용하여 면역 침전물을 제거하는 방법 및 상층액내의 잔존 IFN-γ활성을 측정하는 다른 방법이 하기 실시예에 제시되었다. 이러한 실시예에서, 예를 들어, 집토끼 항-새앙쥐 면역 글로불린 항체는 공지 방법에 의해 구슬 형태의 셀룰로오스와 같은 담체에 결합되고, 분석될 융합 세포 상층액 또는 새앙쥐 혈청을 가하고, 미리 정해진 기간동안 일정한 온도에서 반응을 진행시킨다. 반응 생성물은 잘 씻고, 공지량의 IFN-γ를 가한다. 사용될 IFN-γ로서, 예를 들어, 렉틴 및 포르볼 에스테르와 더불어 인체 말초 혈액 임파구로부터 유도된 IFN-γ를 함유하는 배양 상층액, 이 콜리에 의해 제조된 제조합 IFN-γ를 함유하는 추출액 또는 그밖의 것이 사용될 수 있다. IFN-γ의 부가 후, 미리 정해진 기간동안 일정한 온도에서 반응을 진행시킨 다음 부유물에 잔존하는 IFN-γ활성을 측정한다. 이러한 방법으로, 항체에 의한 IFN-γ활성의 흡수를 결정할 수 있다.

이렇게-클로닝된 융합 세포를 액체 배지 또는 포유 동물의 복막강에서 성장시켜 본 발명의 단클론성 항체를 제조한다.

예를 들어, 융합 세포는 2∼10일 동안, 바람직하게는 3∼5일 동안 가해진 0.1∼40% 소 혈청곽 더붙어 RPMI-1640과 같은 액체 배지에서 배양하고, 상기 단클론성 항체는 배양 브로쓰(broth)로부터 얻을 수 있다. 더욱더, 세포 배양 상층액 보다 휠씬 높은 역가의 항체는 융합 세포를 새앙쥐와 같은 적절한 포유 동물에 복강내 접종시키고, 세포를 성장시킨 다음, 복수 용액을 회수함으로써 효과적인 방법 및 대량으로 얻을수 있다. 이러한 목적을 위해, 미네랄 오일 또는 유사한 것으로 미리 접종된 BALB/C 새앙쥐와 같은 새앙쥐를 1x10⁴∼1x10⁷세포, 바람직하게는 5x10⁵∼2×10⁶세포의 융합 세포로 복강내 접종시키고, 7∼20일후, 바람직하게는 10∼14일 후 복수 용액 등을 회수한다. 복수 용액내에 형성되고 축적된 항체를 예를 들어, 황산암모늄에 의한 분획 및 DEAE-셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피에 의해 쉽게 분리하여 정제된 면역 글로불린 형태의 단클론성 항체를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 단클론성 항체는 하기의 특성을 갖는다 :

(1) 면역화를 위해 사용된 폴리펩티드(Ⅰ)에 결합한다;

(2) IFN-γ 분자에 결합하나 IFN-α 또는 IFN-β에는 결합하지 않는다;

(3) 오크터로니 (Ouchterlo0ny) 방법에 의해 시험하면 항체 서브클래스 IgG₂b 또는 IgG₁에 속한다;

(4) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에서, 표준 면역 글로불린의 H 및 L 쇄에 정확하게 해당하는 단 2밴드가 얻어진다.

단클론성 항체는 안전하게 제조되고, 사용되고, 저장될 수 있다.

본 발명에 따라 수득된 단클론성 항체는 EIA 또는 RIA 받범을 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 미량의 IFN-γ의 잔여량의 검출을 위해 사용할 수 있고, 더욱더 IFN-r의 정제가 매우 어려운 것으로 생각되었음에도 불구하고, 예를 들어, 항체 컬럼을 제조함으로써, 천연 또는 유전자 조작에 의해 만든 IFN-γ를 매우 효과적으로 정제하는데 사용할 수 있다.

예를 들어, IFN-γ의 검출을 위해, IFN-γ-함유 샘플 또는 표준 IPN-r 샘플을 예를 들어, 방산성요오드 또는 효소에 의해 라벨된 상기 단클론성 항체와 반응시킨 다음 예를 들어 단백질 A를 가하여 면역복합체 침전을 일으키고 반응을 충분히 시킨 후, 침전된 면역 복합체에서 방사능 또는 효소 활성을 결정한다, 이러한 방법으로, IFN-γ 분석을 간단하고 쉬운 방법으로 수행될 수 있다.

경쟁적 법에 의한 IFN-γ 분석의 한예는 하기와 같다. IFN-γ는 예를 들어 방사성 요오드 또는 효소로 폴리펩티드(Ⅰ)를 라벨시키고, 본 발명의 라벨되지 않은 소정량의 단클론성 항체와 라벨된 폴리펩터드의 반응계에 분석하고자 하는 IFN-γ를 함유하는 샘플을 공존시키고, 생성된 면역 복합체를 침전시키거나 또는 항-새앙쥐 항체에 결함되게 함으로써 분석할 수 있다. 정제된 IFN-γ는 폴리펩티드(Ⅰ) 대신에 방사성요오드- 또는 효소- 라벨된 물질로서 사용될 수 있다.

경쟁법에 의한 IFN-γ분석의 다른 예는 다음과 같다. 예를 들어 부분적으로 정제된 IFN-γ 또는 폴리펩티드(Ⅰ)를 마이크로트레이 또는 그와 유사한 고체상 의에 고정시킨다. 고정은 예를 들어, 0 1∼100μg/ml의 농도. 바람직하게는 10∼20μg/ml의 농도의 0.1M 중탄산나트륨을 함유하는 인산염 완충 용액에서 IFN-γ 또는 폴리펩티드(Ⅰ)을 현탁시키고, 마이크로트레이 위의 각 웰속에 현탁액의 100μl을 따르고 24시간동안 서서히 흔들어 줌으로써 챙할 수 있다. IFN-γ는 1시간동안 37℃에서 또는 20시간동안 4℃에서 분석하고자 하는 IFN-γ를 함유하는 샘플과 본 발명의 단클론성 항체를 반응시켜 얻어진 생성물을 상기웰에 가하고, 방사성 오포드- 또는 효소-라벨된 집토끼 항-새앙쥐 항체 등을 가하여 분석할 수 있다. 효소∼라벨된 집토끼 항-새앙쥐 항체 등을 이러한 일련의 EIA 방범에서 사용하면 소위 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 방법에서 Multiskan(Flow Lab) 또는 그와 같은 광 메터를 통하며 빠른 분석이 가능하다. 더욱더, 항원 인식부위가 다른 2개의 융합 세포 클론에 의해 제조된 단클론성 항체의 이용은 소위 샌드위치 방법에 의해 더 간단한 IFN-γ 분석을 할 수 있게 한다. 이러한 EIA 또는 RIA 방법을 사용하는 IFN-γ 분석에 적합한 항원이 얻어진다면, 다양한 변화가 물론 가능하고, 따라서 상기 언급된방법은 단지 예시에 불과하다.

IFN-γ의 정제를 위해, 상기 항체를 정세 후, 공지된 방법에 의해 구슬 형태의 활성화 아가로스 겔과같은 적당한 담체와 결합시키고, 컬럼을 담체로 충전하고, 배양 상층액 또는 세포 분해 생성물과 같은 조IFN-γ-함유 물질을 컬럼에 공급하여 IFN-γ는 그에 흡착되도록 한다. 세척 후, 예를 들면 KSCN과 같은 카오트로픽 (chaotropic) 시약을 이용하여 또는 IFN-γ 불활성화를 유포하지 않는 약한 산성 조건하에서 용출시켜 효과적으로 정제된 IFN-γ을 얻는다.

상술한 항체 컬럼은 예를 들어 융합 세포로 접종된 복수 용액 등에서 정제된 상태로 얻어진 본 발명의 단클론성 항체를 적당한 담체와 커플링시켜 제조할 수 있다.

담체는 커플링 후에, IFN-γ가 특이적으로 및 효과적으로 흡수될 수 있고, 그후 충분한 방법에 의해 용리될 수 있는 종류라면 어느 것이어도 무방하다. 그 예로서, 단백질의 일차 아미노기의 결합을 가능하도록 활성화시킨 구슬 형태의 아가로스 겔, 예를 들어 AFFI-GEL 10(Bio-Rad Lad., U.S.A)가 하기와 방법에서 유리하게 사용될 수 있다. 항체와 AFFI-GEL의 반응은 0.001∼1M, 바람직하기는 0.1M의 중탄산염과 같은 완충 용액에서 수행될 수 있고, 유용한 반응 조건은 다양한 pH, 10분∼24시간, 0℃∼20℃이고 바람직한 조건은 pH 3∼10, 4℃ 및 4시간이다. 항체와 AFFI-GEL 10 사이의 정량적인 비는 AFFI -GEL과 결합된 항체의 양이 증가할수록 증가하기 때문에 AFFI-GEL의 ml당 항체의 약 50mg까지의 범위내로 선택될 수 있다. 커플링 효율 견지로부터, 항체는 상기 기준하에 30mg을 초과하지 않는 양으로 사용된다. 이렇게 생성된 항체-담체 커플링 생성물을 반응에서 사용된 것과 같은 완충 동액으로 잘 씻은 다듬 며칠동안 방치하거나 또는 다른 방범에 의해 4℃에서 1시간동안 0.OiM 최종 농도의 에탄올아민 염산염으로 처리하여 남아있는 미반응 활성기를 차단하고, 적당한 컬럼에 충전하여 항체 컬럼을 얻는다.

상기 항체 컬럼으로 정제하기 위해, 예를 들면, 인체 면역 인터페론 단백질-함유 샘플을 인산염 완충 용액 또는 트리스 염산 안충 용액과 같은 거의 중성인 완충 용액에 용해시키고, 항체 컬럼 위에 흡착시킨다. 컬럼을 같은 완충 용액으로 씻고, IFN-γ를 용리시킨다. 유용한 용리제는 예를 들어, 약산성 용액 (즉, 초산 용액), 폴리에틸렌글리콜-함유 용액, 샘플과 비교할때 항체에 비해 더 높은 친화력을 갖는 펩티드 함유용액, 높은 농도 염 용액, 및 이들의 혼합 용액이 사용된다. 상당한 정도로 인체 IFN-γr의 분해를 촉진하지 않는 이러한 용리제가 바람직하다.

컬럼에서 나온 용출액은 공지의 방법으로 완충 용액을 사용하여 중화한다. 필요하다면, 상기 항체 컬럼을 사용하는 정제순서는 반복될 수 있다.

이렇게 얻어진 인체 IFN-γ 단백질 용액을 투석하고, 필요하다면, 동결 건조에 의해 분말로 만들수 있다. 동결 건조시키기 위해, 소르비톨, 만니톨, 덱스츠로스. 말토오스 또는 글리세롤과 같은 안정제를 부가할 수 있다.

이렇게 얻어진 인체 면역 인터페론 단백질은 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 의한 인체 양수-유래된 WISH 세포의 분해를 억제하는 효과를 평가하는 시험에서 항바이러스 활성을 분석할때, 10⁷U/ml 이상의 비활성을 보여준다.

U/ml(units/ml)의 IFN 활성은 하기의 방법으로 결정된다. 단위가 확립된 국제표준 IFN-α 및 백혈구-유래 조 IFN-γ를 VSV에 의한 인체 양수-유래 FL 세포에서 발생한 세포 분해에 대한 억제 효과를 평가하는 시험에서 분석하고, 림파구-유래 IFN-γ의 역가는 발견된 역가와 비교하여 결정하였고, 상기 IFN-γ를 실험실 표준 IFN-γ로서 사용하였다. 물질중의 IFN-γ역가를 계산하는데 있어서는, 본 실험실 표준 IFN-γ를 항상 WISH-VSV계에서 상기-언급된 분석에 병행하여 사용하고, 역가 계산은 역가 비에 기초를 두고 수행한다.

본 발명에 따라 정제된 인체 면역 인터페론 단백질은 예를들어 하기식의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 함유한다.

(N)H-A-Z₁Tyr Z₂Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu

Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His

Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly

Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys

Ile Mrt Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys

Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln

Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val

Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp

Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu

Asn VaL Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu lie Glu

Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly

Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg

Arg Ala Ser Gln-OH(C) (Ⅱ)

상기식에서, A는 Met 또는 결합이고, Z₁및 Z₂는 각각 Cys 또는 1/2 Cys이다. 본 발명에 따른 정제 방법은 건조상태를 기준으로 90% 이상의 순도로, 특히 95% 이상의 순도로 상기 폴리펩티드를 얻을 수 있게 한다.

인체 면역 인터페론 단백질은 본 발명에 따른 정제 방법에 의해 얻을 수 있다.

1) SDS-폴리아크릴아미드 겔(17.5%) 전기 영동에 의하면 분자량 17,000±1,000을 갖고; 2) 아미노 말단 아미노산으로서 시스테인 또는 반 시스틴 또는 메티오닌을 함유하고 ; 3) H-Lys-Arg-Lys-Arg-9er-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH에 대해 단클론성 항체에 결합한다.

본 발명에 따라 정제된 인체 인터페론 단백질은 공지된 방법에 의해 얻어진 I-IFN 종에서와 같은 방법으로 같은 목적을 위해 사용할 수 있다. 오염 단백질 및 피로겐을 소량 함유하기 때문에, 예를들어 주사제 제조를 위한 물질로써 더 안전하게 사용될 수 없다.

본 발병의 방법에 의해 제조된 인체 I-IFN 단백질은 항 바이러스, 항종양, 세포 증식저지 및 면역 강화활성을 갖고 있다. 본 발명의 방법에 와해 제조된 인체 I-IFN 단백질은 멸균수, 인체 혈청 알부민(HSA), 생리 식염수 및 다른 공지의 생리학적으로 수용할 수 있는 담체와 혼합할 수 있고, 경구 또는 국부 투여할 수 있다. 예를들어, 하루에 성인 한사람에 100,000∼100,000,000단위, 바람직하게는 50,000,000∼60,000,000단위 투여량으로 정맥내 또는 근육내 또는 기타 다른 경로로 투여할 수 있다. 본 발명의 인체 I-IFN 단백질을 함유하는 제제물은 염, 희;석제, 보조제, 다른 담체, 완충제, 결합제, 계면 활성제, 방부제와 같은 생리학적으로 수용할 수 있는 다른 불활성 성분을 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해, 제제는 사용전 치석제로 희석하도록 멸균된 수용액 현탁액 또는 생리학적으로 수용할 수 있는 앰푸울속의 용매 또는 멸균 분말의 형태(일반적으로 I-IFN 용액의 동결 건조에 의해 얻을 수 있음)로 제조된다.

더욱 더, 상기 언급된 인체 면역 인터페론 단백질-함유 제제는 본 발명의 물질에 기초를 둔 1∼99%의 양으로 IFN-α 또는 IFN-β 또는 림포킨(즉, 인터류킨 2)과 같은 다른 활성성분을 더 함유할 수 있다.

명세서를 통하여, 아미노산, 펩티드, 보호기, 활성기 등은 약칭될때 IUPAC-IUB(Commission on Biological Nomenclature) 또는 관련 분야의 관행에 따라 약칭되었다 하기는 예이다. 광학 이성체가 포함되는 경우에, 아미노산 등은 특별히 다른 지척이 없다면 L형이다.

DNA :데옥시리보헥산

A :아데닌

T :티민

G :구아닌

C :시토신

RNA :리보헥산

dATP :데옥시아데노신 삼인산염

dTTP :데옥시티미딘 삼인산염

dGTP :데옥시구아노신 삼인산염

dCTP :데옥시시티딘 삼인산염

ATP :아데노신 삼인산염

EDTA :에틸렌디아민 4 아세트산

SDS :도데실 황산나트륨

Gly :글리신

Ala :알라닌

Val :발린

Leu :루이신

Ile :이소루이신

Ser :세린

Thr :트레오닌

Cys :시스테인

Met :메티오닌

Glu :글루탐산

Asp :아스파르산

Lys :리신

Arg :아르기닌

His :히스티닌

Phe :페닐알라닌

Tyr :티로신

Trp :트리프로판

Pro :프롤린

Asn :아스파라긴

Gln :글루타민

Z :카르보벤즈옥시

Boc :t -부톡시카르보닐

Mtr :4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐

Pme :펜타메틸벤젠술포닐

OBu :t-부틸 에스테르

ONB :N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복시이미드 에스테르

DCC :N,N'-디시클로헥실카르보디이미드

DCU :N,N-디시클로헥실우레아

HONB :N-히드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복시이미드

HOBt :N-히드록시벤조트리아졸

CHA :시클로헥실아민

DCHA :디시클로헥실아민

THA :트리에틸아민

TFA :트리플루오로아세트산

MSA :메탄술폰산

THF :테트라히드로푸란

DMF :디메틸포름아미드

MeOH :메탄올

AcOEt :초산에틸

본 발명은 하기의 실시에 및 참고예에서 더 자세히 설명될 것이나, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

하기 실시 예에서, 얇은 막 크로마토그래피는 Merck 60F₂₅₄실리카겔 플레이트 또는 후나꼬시 야꾸힌(Funakoshi Yakuhin)의 AVICEL SF 셀룰로오스 플레이트를 사용하여 하기 언급된 전매용매로 전개되었다.

Rf¹: 클로로포름-메탄올-아세트산=9:1:0.5

Rf²: 초산에틸-피리딘-아세트산-물=30:10:3:5

Rf³: 클로로포름-메탄을-물=7:3:0.5

Rf⁴: n-부탄을-피리딘-아세트산-물=30:20:6:24

Rf⁵: 초산에틸-n-부탄올-아세트산-물=1:1:1:1

하기 실시예에 기재된 세포주, 즉 새앙쥐 B 융합 세포 γ2-11.1 및 새앙쥐 B 융합세포 γ3-11.1은 각각 하기 표에 나타낸 기탁번호로서 미합중국의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) 및 프랑스공화국의 파스퇴르 연구소(CNCM; Institur Pasteur Collection Nationale De Cultures De Microorganismes)에 기탁되어 있다.

[실시예 1]

(i) Z-Ser-Gln-OBu^t의 제조

Z-Gln-OBu^t(10.1g)을 500ml의 메탄올에 용해시키고 촉매로서 팔라듐 블랙을 사용하여 수소 기체 기류 중에서 촉매환원을 행한다. 촉매를 여거하고 용매를 유거한다. 잔류물을 7.59의 Z-Ser-OH 및 6.89의 HONB와 함께 250ml의 DMF에 용해시키고 이 용액을 빙냉한다. DCC(7.15g)를 빙냉하 가하고 혼합물을 0℃에서 4시간동안 그리고 실온에서 12시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여거하고 용매를 유거한다. 잔류물을 300m1의 AcOEt로 추출하고 추출물을 4% NaHC0₃수용액, 0.2N 염산 및 물의 순서로 세척하고 무수황산 나트륨 상에서 건조시킨다. 그런다음 용매를 유거하고 생성된 결정질 침전을 여과에 의해 수집하고 건조시키고 CH₃CN으로 재결정한다.

수율 6.5g(51.2%), mp 97∼100℃

[α]_D ²⁵-24.1°(c=0.40, 메탄올)Rf¹0.64

원소분석: C₂₀H₂₉O₇N₃

계산치: C;56.72, H;6.90, N;9.92

실측치: C;56.21, H;6.72, N;9.76

(ii) Z-Ala-Ser-Gln-OBu^t의 제조

Z-Ser-Gln-OBu^t(4.23g)을 300ml의 메탄올에 용해시키고 촉매로서 팔라듐 블랙을 사용하여 수소 기체기류 중에서 촉매환원을 행한다. 촉매를 여거하고 용매를 유거한다. 잔류물을 2.34g의 Z-Ala-OH 및 227g의 HONB와 함께 200ml의 AcOET, 200ml의 디옥산 및 100ml의 DMF의 혼합 용매에 용해시키고 이 용액을 빙냉한다. DCC(2.38g)을 냉각하면서 가하고 혼합물을 0℃에서 4시간동안 그리고 실온에서 12시간동안 교반시킨다. DCU를 여거하고 장애를 유거한다. CN₃CN 및 에테르를 전류물에 가하고 생성된 결정질침전을 여과에 의해 수집하고 건조시키고 CH₃CN으로 재결정한다.

수율 3.72g(75.3%), mp 165∼170℃,

[α]_D ²⁵-41.2°(c=0.50, 메탄올) Rf¹0.60.

원소분석: C2_3fH₃O₈N₄

계산치: C;55.86, H:6.93, N;11.33

실측치: C;55.58, H:6.74, N;11.12

(iii) Z-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu^t의 제 조

Z-Ala-Ser-Gln-OBu^t(3.46g)을 300ml의 메탄올에 용해시키고 촉매로서 팔라듐 블랙을 사용하여 수소기체기류 중에서 촉매 환원을 행한다. 촉매를 여거하고 용매를 유거한다.

잔류물을 z-Arg(Pme)-OH[4.54g의 Z-Arg(Pme)-OH.CHA로부터 제조됨] 및 1.9g의 HOBt와 함께 150ml의 DMF매 용해시키고, 이 용액을 빙냉한다. DCC(1.9g)을 가하고 혼합물을 0℃에서 4시간동안 그리고 실온에서 15시간동안 교반시킨다. DCU출 여거하고 용매를 유거한다. AcOEt출 잔류물에 가하고 생성된 침전을 여과에 의해 수집하고 건조시키고 메탄올 및 AcOEt로 재결정한다.

수율 4.55g(75.5%), mp 130∼134℃,

[α]_D ²⁵-24.1°(c=0 26, 메탄올) Rf¹0.57,

원소분석:

계산치: C;55.22, H;7.07, N:12.88, 5;3.69

실측치: C;55.23, H;6.93, N;12.54, 5;3.48

(iv) Z-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu^t의 제조

Z-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu^t(4.3g)을 400ml의 메탄올에 용해시키고 촉매로서 팔라듐 블랙을 사용하여 수소기체 기류중에서 촉매 환원을 행한다. 촉매를 여거하고 용매를 유거한다. 잔류물을 Z-Arg(Pme)-OH[3.24g의 Z-Arg(Pme)-OH.CHA로 부터 제조됨] 및 1.42g의 HOBt와 함께 200m1의 DMF에 용해시키고 용액을 빙냉한다. DCC(1.4lg)를 가하고 혼합물을 0℃에서 4시간동안 그리고 실온에서 20시간동안 교반시킨다. DCU를 여거하고 용매를 유거한다. AcOEt를 잔류물에 가하고 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하여, 건조시키고 메탄올 및 AcOEt로 재침전시킨다.

수율 4.4g(71.7%), mp 125∼130℃,

[α]_D ²⁵-18.0°(c=0.40, 메탄올) Rf¹0.63.

원소분석: C₅₇H₈₆O₁₄N₁₂S₂.H₂O

계산치: C;54.96, H;7.12, N;13.50, S;5.15

실측치: C;54.66, H;6.92, N;13.32, S;5.34

(v) Z-Arg(Pme)-Gly-OBu^t의 제조

Z-Gly-OBu^t(13.0g)을 5OOml의 MeOH에 용해시키고 촉매로서 팔라듐 블랙을 사용하는 수소기체 기류중에서 촉매 환원을 행한다. 촉매를 여거하고 여액을 감압하 농축한다. 잔류물을 200ml의 DMF에 용해시키고, Z-Arg(Pme)-OH[20.0g의 Z-Arg(Pme)-OH.CHA로부터 제조됨] 및 5.4g의 HOB^t를 가한후 빙냉한다. DCC(8.2g)을 가하고 혼합물을 48시간동안 교반시킨다. 형성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. 잔류물을 500ml의 AcOEt에 용해시키고 AcOEt 용액을 4% NaHC0₃수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂S0₄로 건조시,1키고 농축한다. 석유 에테르를 가하고 침전을 여과에 의해 수집한다.

수율 19.8g(96.8%), mp 7l∼73℃

[α]_D ²⁵+0.2°(c=0.9 DMF), Rf¹0.62.

원소분석: C₃₁H₄₅O₇N₅S

계산치:C; 58.93, H;7.18, N;11.09, S;5.08

실측치:C; 59.42, H;7.58, N;10.95, S;4.84

(vi) Z-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu^t의 제조

Z-Arg(Pme)-Gly-OBu^t(10.0g)을 500ml의 MeOH에 용해시키고 촉매 환원을 행한다. 그런다음 생성물을 300ml의 DMF에 용해시킨다. Z-Phe-OH(4.72g) 및 2.35g의 HOBt를 가하고 혼합물을 빙냉한다. DCC(3.59g)을 가하고 전 혼합물을 15시간동안 교반한다. 생성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. 잔류물을 400ml의 AcOEt에 용해시키고 이 AcOEt 용액을 4% NaHC03 수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축시킨다. 에테르를 가하고 생성된 결정질 침전을 여과에 의해 수집하고 MeOH-에테르로 재결정한다.

수율 10.5g(85.3%), mp 101∼103℃,

[α]_D ²³-8.3°(c=0.9, DMF), Rf¹0.64.

원소분석: C₄₀H₅₄I₈N₆S

계산치: C;61.67, H;6.99, N;10.79, S;4.12

실측치: C;61.66, H;6.56, N;10.93, S;4.14

(vii) Z-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu^t의 제조

Z-Fhe-Arg(Pme)-Gly-OBu^t(5.5g)을 300ml의 MeOH중에서 촉매적으로 환원시킨 다음 300ml의 DMF에 용해시킨다.

Z-Leu-OH (3.31g의 Z-Leu-OH.DCHAA로부터 제조됨) 및 1.47g의 HONB를 가하고 혼합물을 빙냉한다. DCC(1.68g)을 가하고 전체 혼합물을 48시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. 잔류물을 300ml의 AcOEt에 용해시키고 AcOEt 용액을 4% NaHC0₃수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시켜 농축한다. 에테르를 가하고 침전을 여과로 수집한다.

수율 6.2g(98.3%), mP 171∼173℃,

[α]_D ²⁶-15.5°(c=0.9, DMF), Rf¹0.64.

원소분석: C₄₆H₆₅O₉N₇S

계산치: C;61.93, H;7.34, N;10.99, 5;3.59

실측치: C;62.02, H;7.37, N;11.08, 5;3.59

(xiii) Boc-Met-Leu- Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu^t의 제 조

Z-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu^t(6.0g)을 200ml의 MeOH중에서 촉매적으로 환원시킨 다음 150ml 의 DMF에 용해시킨다. Boc-Met-OH (3,0g의 Boc-Met-OH.DCHA로 부터 제조됨) 및 1.39g의 HONB를 가하고 혼합물을 빙냉한다.

DCC(1.59g)을 가하고 전체 혼합물을 15시간동안 교반시킨다. 형성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. 잔류물을 n-BuOH-AcOEt에 용해시키고 용액을 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시켜 농축한다. 에테르를 가하고 결정을 여과에 의해 수집한다.

수율 6.2g(93.1%), mp 192∼195℃,

[α]_D ²⁶-19.7°(c=1 0, DMF), Rf¹0.64.

원소분석: C₄₈H₇₆O₁₀N₈S₂

계산치: C;58.17, H;7.74, N;11.33, 5;6.48

실측치: C:58.48, H;7.79, N;11.34, 5;5.98

(ix) Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH의 제조

5.5g의 Boc-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu^t에 50ml의 TFA를 가하고 혼합물을 실온에서 10분동안 진탕한 다음 농축시킨다. 에테르를 가하고 침전을 여과에 의해 수집하여 건조시킨다. 이를 50ml의 DMF에 용해시켜 용액을 빙냉하고 1.8ml의 TEA를 가한다. Boc-Gln-ONB (1.85g의 Boc-Gln-Oh, 1.49의 HONB 및 1.90g의 DCC로부터 제조됨)를 가하고 혼합물을 15시간동안 교반시킨 다음 농축시킨다. AcOH 및 AcOEt를 차례로 가하고 생성된 침전을 여과에 의해 수집한다.

수율 5.3g(89.8%), mp 181∼183℃(분해),

[α]_D ²⁽-19.6°(c=1.0, DMF), Rf¹0.30.

원소분석: C₄₉H₇₆O₁₂N₁₀S₂

계산치: C;55.45, H;7.22, N;13.20, 5;6.04

실측치: C:55.39, H;7.17, N;13.34, 5;6.20

(x) Z-Ser-NHNH-Boc의 제조

Z-Ser-OH(10.0g) 및 6.2g의 t-부틸 카르바제이트를 150ml의 DMF에 용해시키고 용액을 빙냉한다. HONB(8.0g) 및 9.3g의 DCC를 가하고 혼합물을 15시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여과하고 여액을 농축한다. 잔류물을 AcOEt에 용출시키고 AcOEt 용액을 4% NaHCO₃수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하여 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축시킨다. 에테르를 가하고 결정을 여과에 의해 수집한다.

수율 7.3g(50.4%), mp 95∼98℃,

[α]_D ²⁽-6.2°(c=0.8,DMF), Rf¹0.62.

원소분석: C₁₆H₂₃O₆N₃

계산치: C;54.38, H;6.56, N;11.89

실측치: C;54.77, H;6.58, N;12.29

(xi) Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc의 제조

Z-Ser-NHNH-Boc(3.9g)를 300ml의 MeOH중에서 촉매적으로 환원시킨 다음 50ml의 DMF에 용해시킨다. Z-Arg(Pme)-OH[6.2g의 Z-Arg(Pme)-OH.CHA로부터 제조됨] 및 1.5g의 HOBt를 가하고 혼합물을 빙냉한다. DCC(2.3g)을 가하고 전체 혼합물을 15시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여과하고 여백을 농축한다. 잔류물을 AcOEt에 용해시키고 AcOEt 용액을 4% NaHC0₃수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축시킨다. 에테르를 가하고 생성된 침전을 여과에 의해 수집한다.

수율 7.45g(93.7%), mp 100∼101℃

[α]_D ²⁶-0.9, (c=1.2, DMF), Rf¹0.51.

원소분석: C₃₃H₄₉O₉N₇S

계산치: C;55.06, H;6.86, N;13.62, S;4.46

실측치: C;55.49, H;6.94. N;13.14, S;3.86

(xii) Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc의 제조

Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (3.9g)을 300ml의 MeOH에 용해시키고 촉매 환원을 행한다. [생성물을 50ml의 DMF에 용해시키고 Z-Lys(Mtr)-OH[3.4g의 Z-Lys(Mtr)-OH.DCHA로 부터 제조됨] 및 0.88g의 HOBt를 가한다. 혼합물을 빙냉하고 1.34g의 DCC를 가한다. 혼합물을 빙냉하고 1.34g의 DCC를 가한다. 전체 혼합물을 20시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. AcOEtfmf 가하고 분말상의 침전을 여과에 의해 수집하고 MeOH-AcOEt로 재결정한다.

수율 5.1g(93.4%), mp 103∼105℃.

[α]_D ²⁶-7.2°(c=0.8 DMF), Rf¹0.57.

원소분석: C₄₉H₇₃O₁₃N₉S₂

계산치: C;55.50, H;6.94, N;11.89, S;6.05

실측치: C;55.70, H;7.15, N;11.60, S;5.63

(xiii) Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)Ser-NHNH-Boc의 제조

Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc(4.8g)을 300ml의 MeOHdp 용해시키고 촉매 환원을 행한다. 생성물을 70ml의 DMF에 용해시키고 Z-Arg(Pme)-OH[2.8g의 Z-Arg(Pme)-OH.CHA로부터 제조됨] 및 0.74g의 HOBt를 가한다. 혼합물을 빙냉하고 1.12g의 DCC를 가한다. 전체 혼합물을 15시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. 잔류물을 AcOEt에 용해시키고 AcOEt 용액을 4% NaHCO₃수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축한다. 에티르를 가하고 생성된 침전을 여과에 의해 수집하고 MeOH-에테르로 재침전시킨다.

수율 5.8g(89.8%), mp 136∼137℃

[α]_D ²⁶-6.6°(c=1.0, DMF), Rf¹0.58.

원소분석: C₆₆H₉₉0₁₆N₁₃S₃

계산치: C;55.56, H;6.99, N;12.76, S;6.74

실측치: C;55.34, H;7.07, N;12.50, S;6.59

(xiv) Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc의 제조

Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (3.0g)을 150ml의 MeOH에 용해시키고 촉매환원을 행한다. 생성물을 60ml의 DMF에 용해시키고 Z-Lys(Mtr)-OH[1.54g의 Z-Lys(Mtr) -OH.DCHA로부턴 제조됨] 및 0.31g의 HOBt를 가한다. 혼합물을 빙냉하고 0.57g의 DCC를 가한다. 전체 혼합물을 15시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. 잔류물을 AcOEt에 용해시키고AcOEt 용액을 4% NaHC0₃수용액 및 10% 시트르산 수용액으로 세척하고 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축시킨다. 에테르를 가하고 결정질 침전을 여과에 의해 수집하고 AcOEt로 재결정한다.

수율 2.70g(72.8%), mp123∼125℃.

[α]_D ²⁶-5.9°(c=1.1, DMF), Rf¹0.57.

원소분석: C;₈₂H₁₂₃O₂₀N₁₅S₄

계산치: C;55.73, H;7.02, N;11.89, S;7.26

실측치: C;55.89, H;7,30. N;11.72, S;7.08

(xv) Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu¹의 제조

Z-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu^t(1.0g)을 100ml의 MeOH에 용해시키고 촉매 환원을 행한다. 그런 다음, 생성물을 20ml의 DMF에 용해시키고 0.85g의 Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH 및 135mg치 HOBt를 가한다.

혼합물을 빙냉하고 210mg의 DCC를 가한다. 전체 혼합들을 20시간동안 교반시킨다. 생성된 DCU를 여거하고 여액을 농축한다. MeOH를 가하고 생성된 침전을 여과에 의해 수집한다.

수율 1.50g(87.4%), mp 216∼217℃(분해),

[α]_D ²⁶-11.8°(c= 1.0,DMF),Rf¹0.43.

원소분석: C₉₈H₁₅₄O₂₃N₂₂S₄

계산치: C;55.09, H;7.29, N;14.42, S;6.00

실측치: C;54.81, H;7.33, N;14.23, S;5.79

(xvi) H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH의 제 조

1.0g의 Boc-Gln-Met-LeU-Phe-Arg(Pme -Gly-Arg(Pme)

Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu_t에 10ml의 TFA를 가하고 혼합물을 실온에서 50분간 진탕한 다음 농축시킨다. 에테르를 가하고 침전을 여과에 의해 수집하여 건조시킨다. 별도로, 10ml의 TFA를 0.839의 Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc에 가하고 혼합물을 실온에서 10분 동안 진탕한 다음 농축시킨다. 에테르를 가하고 침전을 여과에 의해 수집하여 건조시킨다. 이를 10ml의 DMF에 용해시키고 용액을 드라이아이스-아세톤으로 냉각한 다음 0.23ml의 6.2N HCl/AcOEt 및 이소아밀 나이트라이트(0,075ml)를 가한다. 온도를 -25℃∼-20℃로 20분간(히드라진 시험에 음성) 유지하고 반응 혼합물을 드라이아이스-아세톤으로 다시 냉각한 다음 0.25ml의TEA로 중화한다. 아민 성분을 49ml의 DMF에 용해시키고 용액을 빙냉한다. TEA(0.16ml)를 가하고 상기의 아지드 용액을 가한다. 전체 혼합물을 4℃에서 72시간동안 교반시키고 묽은 아세트산에 부어넣는다. 생성된 침전을 여과에 의해 수집하고 CH₃CN 수용액으로 세척한다. 수율 1.40g(81.5%), Rf¹0.09. 이 물질의 일부(400mg)를 0.15M의 MSA를 함유하는 60ml의 TFA-티오아니솔-메틸 설파이드(8:1:1)에 용해시키고 이 용액을 실온에서 2시간동안 진탕시킨다. A_CONH₄(400mg)을 가하고 혼합물을 농축한다. 에테르를 가하고 침전을 여과에 의해 수집하고 건조시킨다. 이를 소량의 1N AcOH에 용해시키고 용액을 용리액으로서 1N AcOH를 사용하는 세파댁스 G-25컬럼(2.2×120cm)에 통과시킨다. 160ml 내지 260ml의 획분을 합하여 동결 건조시킨다. 그런 다음 이 동결 건조물을 암버라이트 IRA-410(아세테이트형)컬럼을 통과시키고 동결 건조시킨다. 이 동결 건조물을 TSK-LS-410컬럼(2.14×7.5cm+2.14×30cm)을 사용하여 HPLC로 정제하여 상술한 화합물을 얻는다.

수율 45mg,

[α]_D ²⁴-45.9°(c=0.7,0.1N AcOH), Rf⁴(셀룰로오즈) 0.20.

아미노산분석: Lys 1.71, Arg 4.71, Ser 1.69, Glu 2.12, Gly 1.00, Ala 1.03, Met 0.32, Leu 1.30, Phe 1.08(평균 회수율 77%).

[실시예 2]

담체 단백질-플리펩티드 복합체의 합성

실시에 1(xvi)에서 얻은 폴리펩티드를 굿프렌드 등([Sceince, 144, 1334(1964)]에 따라 티로글로불린(이하,TG라 함)과 커플링 시킨다. 상기의 플리펩티드 2.5mg을 3.75mg의 TG와 혼합한 다음 2ml의 50mM인산염 완충용액을 가하고, 혼합물을 빙수 중에서 잘 교반시킨다. 여기에 점차로 200ml의 증류수에 30.4mg의 카르보더이미드 히드로즐로라이드를 녹인 용액을 적가한다. 그런 다음, 혼합물을 빙수 중에서 3시간동안 교반시킨다. 반응후, 충분한 정도까지 증류수로 투석한 후 동결 건조시켜 4.7mg의 단백질 복합체를 수득한다.

[실시예 3]

EIA에 의한 항체 검출용 요소-결합 항원의 제조

EIA용 요소-결합 항원을 기따가와 동[Journal of Biochemistry,79,233,(1976)]에 따라 제조한다.

(i)말레이미도기의 폴리펩티드에의 도입

실시예 1(xvi)에서 얻은 폴리펩티드(350nmols)를 1ml의 100mM 인산염 완충용액(pH 6.8)에 용해시키고, 이 용액을 585μg(1.75μ몰)의 N-(4-카르복시시클로헥실메틸)말레이미드 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 70μl의 N,N-디메틸포름아미드에 녹인 용액에 가한다. 혼합물을 30℃에서 30분간 교반시킨다. 반응후, 세파덱스 G-25컬럼을 사용하여 칙분화시켜 그속에 도입된 말레이미도기를 갖는 185nmol의 폴리펩티드 획분을 수득한다.

(ii)β-D-갈락토시다제에 의한 말레이미도-기-함유 폴리펩티드의 커플링

실시예 3(i)에서 얻은 말레이미도-함유 폴리펩티드(16.5nmols)를 3.3nmol의 β-D-갈락토시다제와 혼합한다. 4℃에서 18시간 반응후, 반응을 종료시키기 위하여 412.5nmol의 β-메르캅토에탄올을 가한다. β-D-갈락토시다아제-커플링된 폴리펩티드를 세파로오즈 6B 컬럼상에서 획분화하여 다음의 실험에 사용한다.

[실시예 4]

EIA 방법

실시예 2에서 얻은 단백질 복합체에 의해 면역된 생쥐의 혈청 또는 융합세포 상층액 중의 항체 활성의 검출을 EIA법[Immunology, 1, 3, (1978)]으로 행한다. 이 혈청 또는 융합세포를 완충용액 A(20mM Na₂HPO₄, 100mM NaCl,0,1% NaN₃, 1mM MaCl₂, pH 7.0)로 희석하고, 이 희석액중 100-μl분을 실시예 3에서 얻은 100μl의 폴리펩티드 유도체와 혼합하고 반응을 24℃에서 24시간동안 진행시킨다. 그런 다음, 토끼 항-생쥐 IgG와 결합된 100μl의 3% 셀룰로오즈를 가하고, 반응을 24℃에서 4시간동안 진행시킨다. 반응후, 셀룰로오즈를 0.5%의 트윈 20함유-완충용액 A로 잘 세척한 다음 500μl의 20μg/ml 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시드를 가하고 37℃에서 2시간 반응시킨후, 반응을 종료시키기 위하여 3ml의 100mM탄산염 완충용액(pH 10.5)을 가한다. 형광 강도를 형광계(여기: 365mn; 방사: 450nm)로 측정한다.

[실시예 5]

면역

7∼8주령의 암컷 BALB/C 생쥐 6마리를 프로인트의 완전 보조약(1차 면역)과의 혼합물로 실시예 2에서 얻은(항원으로서) 40μg(단백질 기준으로)의 단백질 복합체로 피하 접종시킨다. 1차 면역 2주일 후에, 프로인트의 불완전 보조약(2차 면역)과의 혼합들로 상술한 바와 동일한 양의 항원을 생쥐에 피하 접종시킨다. 2주일 경과후, 2차 면역과 같은 방법으로 3차 면역을 행한다. 3차 면역후 6일 경과후에 쥐로부터 헐액을 샘플링하여 실시예 4에 기술된 EIA 방법에 의하여 혈청 항체 역가를 측정한다. γ-2 번호의 생쥐가 가장 높은 항체 역가를 가지며 0.5ml의 염화나트륨 수용액에 용해된 120μg의 항원을 정맥에 접종시킴으로써 최종 면역을 행한다. 각 생쥐에 대한 항체 역가 데이타는 표 1과 같다.

[표 1]

면역된 생쥐의 항펩티드 항체 역가

1) 혈청 희석비: 1/1000

2) 혈청 희석비: 1/6300

3) 혈청 희석비: 1/7800

4) -: 검출되지 않음

5) ND: 측정되지 않음

B/T: (결합효소활성/전체 첨가된 효소활성)×100

[실시예 6]

세포 융합

실시예 5에 기술된 방법에 따라 면역을 행한다. 최종 면역후 3일 후에 γ-2 마우스로부터 비장을 절제하고, 가압하 스테인레스 망을 통과하여 여과하고 이글의 최소 필수 배지(MEM)에 현탁하여 비장 세포 현탁액을 얻는다. 내포융합을 위하여, BALB/C-유래 P3-x 63. Ag8. U1(P3Ul) 골수종 세포를 사용한다[Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1.(1978)]. 원래의 방법[Nature, 256, 495(1975)]으로 세포융합을 행한다. 비장 세포 및 P3Ul 세포를 따로 따로 무 혈청 MEM으로 3회 세척하고 5:1(세포의 수로)의 비로 혼합한다. 혼합물을 800rpm에서 15분간 원심분리하여 세포를 가라앉힌다. 상등액을 완전히제거한 후, 침전물이 약간 해체되면 0.3ml의 45% 폴리에틸렌 글리졸(PEG) 6000(Koch-Light)을 가하고, 세포 융합을 실시하기 위하여 혼합물을 37℃로 유지된 온수 탱크에 7분간 방치한다. 그런 다음, 분당 2ml의 비율로 MEM을 가한다. 총 12ml의 MEM을 가한후, 생성된 혼합물을 600rpm에서 15분간 원심분리한후 상층액을 제거한다. 세포 침전물을 10% 소 태아 혈청 (RPMI1640-10FCS)을 2×10⁵P3Ul셀/ml의 농도로 보충한 RPMI-1640 배지에 현탁시키고 이 현탁액 1ml씩을 24-웰 멀티디쉬 상의 144개의 웰 각각에 파종한다. 파종후, 세포를 5% 이산화탄소 기체 배양기중에 37℃에서 배양시킨다. 24시간후, 웰당 1ml의양으로, HAT(1x10^-4M 히포크산틴, 4×10^-7M 아미노프테린, 1.6×10^-5M 티미딘)(HAT배지)가 보충된 PRMI1640-10FCS 배지를 가하여 HAT 선택 배양을 시작한다. 1ml의 구배지를 배양 시작후 3,5 및 7일째 1ml 신선한 HAT 배지로 치환하면서 HAT-선택 배양을 계속한다. 융합 세포의 세포 융합후 10∼14일간 주사한다. 배양 브로쓰가 황색 (약 1x10⁶셀/ml)으로 되었을때 상층액을 수집하여 EIA법에 의하여 항체의 존재를 조사한다. 이 방법으로, 융합 세포의 성장을 주시한 141웰로부터의 상층액을 조사한다. 두개의웰(γ2-11 및 γ 2-100)든 강항 항체 활성을 나타내며 다른 두개의 웰(γ2-62 및 γ2-70)은 약한 항체 활성을 나타낸다.

[실시예 7]

클로닝

항체활성이 양성인 3월(γ2-11,62 및 100)로부터의 융합세포를 제한 희석 방법으로 클로닝한다. 융합세포를 2융합세포/ml의 농도로 RPMI1640-20FCS에 현탁시키고 현탁액을 96-웰 마이크로플레이트(Nunc)상의 웰에 0.1ml씩 분포시킨다. 상기의 분포에서, 웰당 BALB/C 새앙쥐 티모사이트 5×10⁵을 공급 세포로서 가한다. 그 결과, 약 2주내에 세포증식이 관찰된다. 그런다음 상층액을 수집하여 실시에 4에 기술한 EIA 방법에 의하여 항체의 존재를 조사한다. 항체의 활성이 γ2-11에서는 19개의 클론중 8, γ-62에서는 54개의 클론중 3 그리고 γ2-100(표 2)에서는 47개의 클론중 5개에서 나타난다.

[표 2]

[실시예 8]

IFN-γ에 대한 단클론성 항체의 결합능력

IFN-γ에 대한 단클론성 항체의 결합능력을 다음과 같은 방법으로 측정한다. 토끼항-새앙쥐 IgG 항체와 결합된 3% 셀룰로오즈 용액 300μl에 각각 γ2-11, γ2-62 및 γ2-100의 각각으로부터 클로닝된 2 또는 3세포의 배양 상층액 300μl을 가하고, 반응을 실온에서 12 내지 20시간동안 진행시킨다. 그런다음, 셀룰로오즈를 생리 식염류로 철저히 세척하고 하기와 같은 방법에 의하여 수득된 550U/ml의 IFN-γ를 여기에가한다. 3∼4시간 반응시킨 후, 상층액을 수집하여 그속에 IFN-γ 활성을 마이크로플레이트[Applied Microbiology, 16, 1706(1968)]를 사용하는 세포 병리학적 효과(CPE) 해독 방법으로 측정한다. 50μl의 MEM을 96-웰 마이크로플레이트(Nunc)의 각 웰에 놓고 50μl의 IFN 샘플을 첫번째 웰에 가한후 2개로 희석한다. 이와 같이 제조된 각각의 웰에, 20% FCS-함유 MEM중의 WISH 세포 현탁액 (4×10⁵셀/ml) 50μl를 가하고, 37℃의 이산화탄소 배양기중에서 24시간동안 배양을 행한다. 그런 다음, 2000TCID₅₀의 농도(TCID₅₀: 메디안 조직 배양 감염량)로 조정된 50μl의 수포성 구내염 비루스(뉴저어계통)를 각 웰에 가하고 37℃의 이산화탄소 배양기중에서 배양을 행한다. 약 35시간 경과 후, IFN 샘플이 안들어 있는 웰중의 세포가 100% CPE를 나타내는 경우, 각 웰을 CPE를 측정하기 위하여 각 세포를 현미경적으로 관찰하여 50% CPE가 관찰된 웰의 IFN 샘플에 대한 희석 인자의 역수를 IFN 역가라 한다.

사용된 IFN-γ 샘플은 40μg/ml의 큰카나발린 및 15ng/ml의 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트로 인간의 말초 림파를 자극한 후 72시간후에 수집된 상층액이다. 이 배양 상층액의 각 ml는 4400단위의 인간 IFN-γ(열 및 산에 변하기 쉬움)을 함유한다. IFN-γ에 대한 결합 능력을 갖는 항체가 클로닝된 배앙 상층액에 존재하면, 첨가된 IFN-γ는 셀룰로오즈에 대한 합체와 결합하여야하고 상층약의 IFN-γ활성에서의 환원이 일어난다. 결과적으로, 클론 γ2-11를 위하여 IFN-γ에 대한 비교적 강한 결합 활성이 관찰되며 첨가된 IFN-γ(550U/ml)의 50∼75%가 항체(표 3)와 결합된다.

[표 3]

[실시예 9]

단클론성 항체-생성 융합세포에 의한 복수증 생성

복수증 생성은 IFN-γ결합 활성을 갖는 항체를 생성할 수 있는 1x10⁶γ2-11.1 클론 세포와 함께 0.5ml의 광물성 기름으로 복강내로 처리된 BALB/C 생쥐를 복강내 접종시킴으로써 야기된다. 융합세포를 복강내 투여후 10일후에, 복수액을 취하여 10⁷배로 희석하여 항체의 활성을 조사한다. 상응하는 클론 세포 상층액의 항체 활성을 10⁴배 희석하면, 복수증의 등성이 항체 활성을 약 1000배 증가한다.

[실시예 10]

단클론성 항체 정제

출발 물질로서 실시예 9에서 얻은 4ml의 복수액을 사용하여, 스타엘린(Staehelin)등의 방법 [journal of Biological Chemistry, 256, 9750, (1981)]에 의하여 단클론성 항체 정제를 행한다. 이 복수액을 먼저 10000rpm에서 15분간 원심분리하여 이로부터 피브린상의 물질을 제거한 다음 희석에 대한 280nm(A₂₉₀)에서의 자외선 흡수가 12∼14범위인 농도로 인산염 완충용액-염수(PBS : 8.1mM NaH₂PO₄,1.5mM KH₂PO₄,2.7mM KCl, 137mM NaCl; PH 7.2)로 희석한다. 그런다음, 포화 황산 암모늄 수용액을 황산염에 대하여 47%의 농도로 희석한 샘플에 가한다. 혼합물을 염석시키기 위하여 4℃에서 60분간 교반 시킨다음 원심분리(10000rpm, 15분)하여 침전시킨다. 침전을 50mM NaCl을 함유하는 20mM 트리스 완충용액 (pH 7.9)에 용해시키고 동일한 완충용액 2l로 투석한다. 2시간후, 투석용액을 동일한 용액 2l로 대치하고 15시간 더 투석을 계속한다. 그런다음, 10000rpm에서 15분간 침전을 원심분리로 제거하고 A₂₈₀값이 20∼30되는 농도로 상층액을 조절한다. 이 샘플을 50mM NaCl을 함유하는 충분량의 트리스 완충용액으로 평형시킨 DEAE-셀룰로오즈 컬럼 (8ml,화트만 DE₅₂)상에서 분획한다. 동일한 완충용액으로 1.5ml/분의 유속으로 동일한 완충총액으로 광범위하게 세척한후, NaCl의 농도는 50mM 내지 500mM로 직선으로 증가한다. 이들 조건하에서, 항체 활성이 유출분획(제1도)중에서 주로 검출된다. 샘플이 항체인 것의 확인은 라엠리(Laemmli)[Nature,227,680,(1970)]에 의하여 기술된 SES-폴리아크길아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)법에 의하여 한다. 황산 암모늄 염석 및 DEAE-셀룰로오즈 분획화에 의하여 수득된 몇획분을 2-메르캅토에탄올로 그 다음으로 17% SDS 겔 전기영동으로 30볼트에서 24시간동안 환원시킨다. 항체활성 피이크와 일치하여, 약 55킬로달톤(H사슬) 및 약 28킬로달톤(L사슬) (제 2도)의 분자량에 상응하는 위치에 두개의 밴드가 나타난다.

이와 같이 정제된 항체 획분 17에 대하여 실시에 8에 기술된 바의 IFN-γ(2200I/ml)를 가함으로써 IFN-γ-결합 활성을 조사한다. 약 50%의 IFN-γ가 항체와 결합한다는 것을 발견하였다.

[표 4]

[실시예 11]

단클론성 항체가 속하는 서브클래스

실시예 10의 방법에 의하여 정제된 획분 17을 10배 희석하고 γ2-11.1 단클론성 항체가 확인될 수 있는 염소 항-생쥐 IgGl,G2a,G2b 및 G3 항체(Mile)를 사용하여 한천중에서 면역-침전 반응(Ouchterlony test; Immunological Methods, Gel-Diffusion Technique, Blackwell,Oxford,1964)시킨다. 단클론성 항체와 염소 항-생쥐 IgG2b 항체 사이에 하나의 뚜렷한 밴드가 발견되는 반면, 단클론성 항체와 다른 항-항체 사이에는 어떠한 밴드도 형성되지 않는다. 따라서, 상기의 단클론성 항체가 IgG2b(표 5)에 속하는 것으로 발견된다.

[표 5]

[실시예 12]

실시예 10의 방법에서와 같이 정제된 유출 획된으로부터의 단클론성 항체 25ml(65.3mg)를 0.1M NaHC0₃(pH 8.3)에 대하여 철야 투석한다. 이와 별도로, 25ml의 AFFf-GEL 10(Bio-Rad)을 유리 여과기를 사용하여 수세하고, 0.1M NaHC0₃(pH 8.3)에 현탁시켜 상기의 항체와 혼합한다. 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 서서히 교만시켜 반응을 행한 다음 4℃에서 철야 방치한다. 생성된 AFFI-GEL 10을 유리 여과기를 사용하여 0.1M NaHC0₃(PH 8.3)로 잘 세척한다. 이 겔에 0.1M 에탄올 아민 및 0.15M NaCl을 함유하는 용액(pH 8.0) 25ml를 가한다. 잔류하는 미반응의 활성기를 가능한한 차단하기 위하여 혼합물을 4℃에서 1시간동안 진탕한다. 그런 다음, 겔을 PBS로 잘 세척하여 0.1% NaN₃-함유 PBS 25ml에 현탁시킨다. 이 현탁액을 4℃에서 저장한다. 첨가된 항체의 양 및 회수된 여액 중의 항체의 양을 기준으로 하여, 항체가 2.35mg/ml의 비율로 겔과 결합된다는 사실을 발견하였다. 이와 같이 수득한 반응 생성물을 컬럼에 채우고 항체 컬럼으로서 사용한다.

[실시예 13]

참고에 4에 서 얻은 상층액 60ml를 1mM EDTA 및 0.15M NaCl(pH 7.6)을 함유하는 20mM 트리스-HCl로 희석하여 150ml를 만들고 이 희석액을 실시예 12의 방법에 의하여 제조된 항-IFN-γ 항체 컬럼(9ml)에 넣는다. 이 컬럼을 TEN, 및 0.01% 노니데트 P-40(shell) 및 0.5M NaCl을 함유하는 TEN으로 차례로 세척한다. 그런 다음, IFN-γ를 0.25M NaCl을 함유하는 0.1M 아세트산으로 용출한다. 용출액을 즉시 1M 트리스-HCl(pH 7.6)로 중화한다. 생성된 용액을 4℃에서 16시간동안 증류수로 투석한 후 에세톤-드라이아이스로 동결 건조시켜 분말을 얻는다.

수득된 결과는 다음과 같다.

이와 같이 수득된 최종적인 인체 면역 인터페론 단백질 생성물의 비활성[VSV 및 NOSH 셀(전술함)을 사용하는 세포 변성 효과 억제 분석에 의한 바이러스 활성 측정을 기준으로 함]은 7.5×10⁷U/mg이다. 이 단백질의 특성은 다음과 같다.

인간 면역 인터페론 단백질의 특징

(i) 분자량

실시에 13에서 얻은 단백질을 2-데르캅토에탄올로 처리하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔(17.5%) 전기 영동(15mV,6시간)시키고 코오마씨블루로 염색한다. 이 단백질은 단일 밴드(제3도)로 극인될 수 있다. 동시에 전기 영동시킨 분자량 마아커에 대한 이동거리와 단백질에 대한 이동 거리 간의 관계로부터, 단백질의 분자량은 17,000±1,000(제 4도)으로 평가된다. 2-메르캅토 에탄올로 처리되지 않은 단백질에 대하여, 추가의 밴드가 33,000±2,000의 분자량에 상응하는 위치에서 검출된다. 이 같은 IFN-γ의 분자량, 즉 17,000±1,000의 약 2배이며, 이 밴드는 이 합체화전 IFN-γ에 기인하는 것으로 생각된다.

(ii) 아미노산 분석

실시예 13에서 얻은 단백질의 부분 표본을 가수분해용 유리관에 넣고 4% 티오글히콜산을 함유하는 비점이 일정한 염산을 200배(v/w) 가한다. 튜브를 감압하 밀봉하고 가수분해를 110℃에서 24,48 및 72시간동안 행한다. 각각 가수분해를 한후, 튜브를 열고 명산을 감답하 제거하고 잔류물을 0.02N 염산에 용해시키고 히다찌 모델 835 고속 아미노산 분석기를 사용하여 분석한다.

시스틴 및 시스테인의 측정을 위하여, 상기의 단백질을 히스등의 방법[Hirs et al., Methods in Enzymology, 11, 197(1967)]에 따라 과포름산으로 산화시키고 상기와 같은 방법으로 24시간동안 가수분해하여 아미노산 분석기를 사용하여 씨스테인산을 정량적으로 측정한다. 가수분해 24,48 및 72시간 후에 얻은 세가지 값의 평균을 세린, 트레오닌, 티로신 및 트립토판의 경우를 제외하고 각 아미노산에 대한 실측치로서 사용하고, 이 값을 가수분해 기간의 외삽에 의하여 0시간까지 측정한다. 결과는 표 6과 같다.

[표 6]

(iii) 아미노 말단 아미노산 분석

실시에 13에서 얻은 단백질을 히스 등의 방법 [Methods in Enzymology, 11, 197(1967)]에 따라 과포름산으로 산화하고 이와나가 등의 변형 에드만 경사 방법[Eur.J.Biochem., 8, 189, (1969)]에 의하여 아미노 말단 아미노산 분석을 행한다. 생성된 페닐-티오히단토인-아미노산[PTH-아미노산]을 확인하여 아르쳐(Archer)등의 방법에 좌하여 울트라스피어-ODS컬럼(Altex,USA; 4.6×250mm, 분자크기 5μm)을 사용하는 바리안(Varian,U.S.A) 모델 5040 고성능 액체 크로마토그래피 상에서 정량적으로 측정한다. 결과적으로, PTH-메티오닌 술폰 및 PTH-시스테인산이 검출된다.

상술한 예에서 명백한 바와같이, 본 발명에 따른 정제 방법은 7.5×10⁷U/mg 이상의 비활성을 갖는 거의 순수한 인간 면역 인터페론 단백질을 생산할 수 있다.

γ-3 새앙쥐로부터 단클론성 항체에 의하여 수득된 결과는 다음과 같다.

[실시예 14]

면역

4차 면역은 실시예 5에서 1차 및 2차 면역과 같은 방법으로 표 1에 예시된 r-3새앙쥐에서 실행한다. 4차 면역 후 2주 후에, 최종 면역은 염수 0.5ml에 용해된 항원 120μg으로 정맥내 접종시켜 실시예 5와 같은방법으로 수행한다.

[실시예 15]

세포 융합

실시예 14에 제시된 최종 면역화 후 3일에 γ-3새앙쥐로부터 비장을 절제하고, 세포 융합 및 HAT선택 배양은 실시예 6의 순서에 의해 수행한다. 결과로서, 융합 세포 성장은 43웰에서 주목된다. 실시예 4에 제시된 EIA 방법에 의한 항체 분석은 두 웰(γ3-11 및 γ3-19)에서 강한 항체 활섣을 나타난다.

[실시예 16]

클로닝

강한 양성 항체 활성을 보여주는 두 웰(γ3-11 및 γ3-19)속의 융합 세포를 실시예 7의 순서에 따가 클로닝한다. 항체 활성은 γ3-11클론중에서 9클론 및 γ3-11(표 7)의 25클론중에서 15클론에서 나타난다.

[표 7]

[실시예 17]

IFN-γ에 대한 단클론성 항체의 결합 능력

IFN-γ에 대한 단클론성 항체의 결합 능력을 실시에 8에 제시된 방법에 의해 연구하였다. 이 실시예에 사용된 IFN-γ 샘플은 플라tm미드에 삽입된 인체 IFN-γ 유전자(재조합 IFN-γ: 비고. 참고예 4)의이 콜리 발현 생성물이고, 그 농도는 1100U/ml로 조절된다. 강한 IFN-γ-결합 능력은 항체에 결합하도록 가해진 IFN-γ의 약 90%로 클론 γ3-11.1 및 γ3-19.20의 상층액에서 나타난다.

[표 8]

[실시예 18]

단클론성 항체가 곡하는 서브클레스

γ3-11.1 및 γ3-19.20 클로닝된 세포를 실시예 9에 제시된 순서에 의해 복수화하고, 얻어진 복수 용액을 실시예 10의 순서에 의해 정제한다. 얻어진 단클론성 항체를 실시예 11에 제시된 한천 겔 침강소 시험에 의해 세분류한다. γ3-11.1 및 γ3-19.20의 난클론성 항체는 모두 양 항-새앙쥐 IgGl항체에 의해서는 뚜렷한 밴드를 나타내지만 다른 항-항체와는 밴드를 나타내지 않는다. 즉, γ3-11.1 및 γ3-19.20 단클론성 항체는 IgGl에 속하는 것으로 나타났다(표 9)

[표 9]

[실시예 19]

IFN-γ분석을 위한 EIA 방법 I

분석 방법은 용액 속에 IFN-γ샘플(a) 및 고체상위에 운동 억제된 IFN-γ(b) 사이의 단클론성 항체를 위한 경쟁에 기초를 두고 있다.

이 콜리에서 발현되고 실시예 13에서처럼 정제된 IFN-γ를 0.1M 중탄산 나트륨을 함유하는 인산염 완충용액(pH 8.0)속에 현탁시켜 15μg/ml의 농도로 만들고, 현탁액의 100μl-부분은 96-웰 마이크로플래이트의 웰 속에 분포시킨다. 4℃반응의 24시간 후에, 2% 소혈청 알부빈-함유 인산염 완충용액의 100μl-부분을 가하여 웰의 잔류하는 결합 부위를 차단한다. 4℃에서 처리한 24시간 후, 플레이트를 ELISA방법으로 처리한다. 즉, 최대 결합 양의 약 50%의 양으로 항체 (γ3-11.1)를 함유하는 용액 (100μl)을 1시간 동안37℃에서 여러 농도(75, 3×10², 1 25×10³, 5x10³, 2×10⁴, 8x10⁴U/ml)로 조절된 재조합 IFN-γ와 반응시킨다. 반응 혼합물을 상기 플래이트에 가하고 반응은 3시간 동안 실온에서 진행시킨다. 웰을 인산염 완충용액으로 씻고, 양고추냉이 퍼옥시다제-라벨된 양 항-새앙쥐 IgG 항체(100μl)를 가하고 반응을 실온에서 3시간 동안 진행시킨다. 그 후, 웰을 인산염 완충 용액으로 잘 씻고, 0.1M 시트 레이트 완충용액 10ml에오르토-페닐렌-디아민 22mg 및 과산화수소 10μl을 가하여 제조된 기질 용액(100μl)을 가하고, 효소 반응을 실온에서 15분 동안 진행시킨다. 그 후 4N 황산을 반응을 종결시키기 위해 가하고 생성된 색소를 "Titertek Multiskan" 광메터를 사용하여 492nm의 파장에서 분석한다. 그 결과는 제 9도에 나타낸다. ELISA 방법은 3×10²∼5x10³U/ml 범위 농도의 IFN-γ의 분석을 인해 사용될 수 있다.

[실시예 20]

IFN-γ 분석을 위한 EIA 방법 Ⅱ

분석방법은 본 발명의 IFN-Υ 샘플(a) 및 효소-라벨된 펩티드(b)사이의 단클론성 항체에 대한 경쟁에 기초를 두고 있다.

[실시예 20-(i)]

참고예 4에서 얻어진 재조합 IFN∼γ를 여러가지 농도(64, 320, 1.6×10³, 8×10³, 5×10⁴, 2×10⁵U/ml)를 갖는 제재로 만들고 각 제제의 100μl를 실온에서 2시간 동안 γ3- 19.20항체의 알려진 양을 함유하는 용액의 100μl와 반응시킨다. 그후, 실시예 3에서 얻어진 효소-결합 펩티드 유도체의 100μl를 가하고, 반응을 4℃에서 48시간 동안 진행시킨다. 각 반응혼합물을 집토기 항-새앙쥐 IgGg항체-결합 3% 셀룰로오스 용액의 10μl에 가한다. 그 후, 효소 반응은 실시예 4에 제시된 것과 같은 방법으로 수행하고 형광강도를 측정하였다. 단클론성 항체(γ3-11.1, γ3-19.20)에의 효소-결합 폴리펩티드 유도체의 결합은 IFN-γ 320U/ml의 존재하에 약간 억제되고 8×10³U/ml의 존재하에 거의 완전하게 억제된다(제10도). 그러므로, 이러한 방법은 320∼8×10³U/ml의 농도 범위에서 IFN-γ을 분석할 수 있다.

[실시예 20-(ii)]

실시예 20(i)과 같은 원리에 기초를 두고 있으나 멀티스칸(Multiskan)을 사용하여 자동으로 빠르게 많은 수의 샘플을 분석할 수 있는, 하기 변형을 수행한다.

(1) 새앙쥐 IgG-흡착 플래이트의 제조

새앙쥐 AgG 용액 (10μg/ml, 0.01M 보론산염 완충용액, pH 8.0)을 96-웰 마이크로 시험 플래이트(Nunc-면역 플래이트I,Nunc,덴마아크)의 웰 속의 200-μl부분속에 분포시킨다. 4℃에서 일야 방치시킨후, 용액을 제거하고, BSA 1%를 함유하는 0.02M 인산염 완충용액 300μl를 각 웰속에 따르고, 실온에서 3시간 방치한 후, 완충 용액을 제거한다.

(2) 단클론성 항체 γ3∼11.1-흡착 플재이트의 제조

(1)에서 제조된 새앙쥐 IgG-흡착 플래이트의 각 웰속에 1%의 BSA를 함유하는 0.02M인산염 완충용액(pH 7)을 이용하여 제조된 350,000-배 γ3-11.1 희석액의 150μl를 따른다. 4℃에서 일야 방치한 후, 희석액을 제거하고, 웰을 0.01M 인산염 완충용액(pH 7.4)으로 3번 세척하여 항체-흡착 플래이트를 얻는다.

(3) 순서

분석 샘플 및 표준 IFN-γ를 완충용액 A(0.1M NaCl, 1mM MgCl₂, 0.1% BSA 및 0.1% NaN₃을 함유하는 0.02M pH 7인산염 완충용액)으로 적당한 농도로 각각 희석한다. 희석액(각각 75μl)을 (2)에서 준비된 플래이트의 각각의 웰 속에 따르고 실시에 3의 효소-라벨된 생성물의 130-배 희석용액 5μl(희석제: 완충용액 A)를 각 플래이트 위의 각 웰 속에 따른다. 웰은 파라 필름으로 봉하고, 반응을 37℃에서 1시간 동안, 실온에서 ,3시간 동안 진행시킨다. 반응 용액을 제거하고, 웰을 0.01M 인산염 완충용액(pH 7.4)의 75-μl 분액으로 4번 씻는다.

발색을 위해, 완충용액 A에 용해시킨 4-니트고페닐-β-D-칼락토피라노시드(Wako Pure Chemical Industries, Special grade)의 1.5mg/ml 용액 150μl을 플래이트의 각 웰속에 따르고, 반응을 실온에서 일야 진행시킨다. 발색 반응을 각각의 웰 속에 0.4M 탄산염 완충용액(pH 10.5) 100μl을 가하여 종결시키고, 405nm에서 마이크로시험 플래이트용 광메터, 타이터텍 멀티스칸(Titerteck Multiskan, Flow Laboratories,USA)을 이용하여 흡광도를 측정한다. IFN-γ를 위한 표준 커브는 제11도에 제시하였다. 표 10에서, 이 방법에 의해 얻어진 6분석 샘플의 결과를 항 바이러스성 활성(AVA) 방법에 의해 얻어진 결과와 비교한다. 표 11은 이 방법에 대한 날자 변이를 보여준다. 변이 상수는 7.4%이고 결과는 허용할만하다.

[표 10]

[표 11]

실시예 13,19 및 20(i), (ii)에 사용된 조 IFN-γ를 함유하는 부유물은 하기 참고예에 제시된 순서에 의해 얻는다.

[참고예 1]

(i) 인체 I-IFN을 코딩하는 mRNA의 분리

인체 말초 혈액으로부터 제조된 인체 I-IFN림파구를 콘카나발린 A의 40μg/ml 및 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA)의 15ng/ml을 함유하는 RPMI-1640배지 (10% 송아지 태아 혈청)에서 37℃로 배양하여 I-IFN을 유도한다. 24시간 후, 이렇게 유도된 인체 림파구(1×10¹⁰세포)를 티오구아니딘 용액(5M 구아니딘 티오시아네이트. 5% 메르캅토에탄올, 50mM트리스 HCl, pH7.6, 10mM EDTA)내에서 테플론(Teflon) 균질기에서 파괴한다. 그 다음 소듐 N-라우로일 사르코시네이트를 4%의 농도로 가하고 균등질화 후 혼합물을 5.7M 염화세슘[5.7M 염화 세슘, 0.1M에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA)] 6mldnl에서 층을 이루게하고, 베크만(Beckman) SW 27원심 분리기를 사용하여 30시간 동안 2400rpm으로 15℃에서 원심 분리하여 RNA침전물을 얻는다. 이러한 RNA 침전물을 0.25% 소듐 N-라우로일 사르코시네이트에 용해시키고 에탄올로 침전시켜 RNA 8.3mg을 얻는다. 이러한 RNA를 올리고(dT) 셀룰로오스 컬럼 위에 고-농도 염용액(0.5M-NaCl, 10mM-트리스 HCl; pH 7.6mM-EDTA, 0.3% SDS)에서 흡수되도록 방치하고, 폴리(A)를 함유하는 mRNA를 저-농도 염 용액(10mM-트리스 HCl, pH 7.6, 2mM EDTA 0.3% SDS)으로 용출시켜 mRNA 700μg을 얻는다. 이러한 mRNA를 에탄올로 더 침전시키고, 0.2ml의 용액(10mM 트리스 HCl, pH 7.6, 2mM EDTA, 0.3% SDS)에 용해시키고 65℃에서 2분동안 처리하고, 베크만 SW 27원심 분리기를 사용하여 25℃에서 21시간 동안 25000rpm으로 10∼35% 자당 밀도 경사 원심 분리화하여 분획시켜 22분획을 얻는다. 각 분획의 부분은 크세노푸스 레비스 10∼35% 자당 밀도 경사 원심 분리화하여 분획시켜 22분획을 얻는다. 각 분획의 부분은 크세노푸스 레비스(Xenopus laevis) 오오사이트(oocytes)에 주사하고, 합성된 단백질의 인터페론 활성을 분석한다. [인체 양막으로부터 유래된 WISH세포에 대한, 수포성 구내및 바이러스를 사용하는 세포병 효과 억제 분석에 의해 결정된 항바이러스 활성 (Stewart, W. E. The interferon System, Springer New York, 1979, 페이지11)]. 이러한 방법으로, 분획 12는 (침강 상수 12-14 S) RNA 1μg당 195단위의 활성을 가짐을 발견하였다. 이렇게-얻어진 분획 12의 mRNA는 약 20μg무게를 갖는다.

(ii) 단일-쇄 RNA의 합성

상기 mRNA 및 역전사 효소를 사용하여, 100μl의 반응 혼합물(5μg의 mRNA, 올리고(dT) 50μg, 역전사 효소 100단위, dATP,dCTP,dGTP 및 dTTP 각각 1mM, 8mM, MgCl₂, 50mM KCl, 10mM 디티오트레이톨 및 50mM 트리스 HCl; PH8.3)을 42℃에서 1시간 동안 배양하고, 페놀을 가하여 탈 단백질화하고 70℃에서 20분 동안 0.1N NaOHH로 처리하여 분해에 의해 RNA를 제거한다.

(iii) 이중-사슬 DNA의 합성

이렇게 합성된 단일 사슬 상보 DNA를 이중-사슬 DNA를 합성하기 위해 42℃에서 2시간 동안 반응 혼합물(mRNA 및 올리고 dT를 제외하고 상기와 같은 혼합물) 50μl에서 반응시킨다.

(iv) dC 꼬리의 부가

이중-사슬 DNA를 실온에서 30분간 반응 혼합물(이중-사슬 DNA, 0.1M 초산나트륨, pH 4.5, 0.25M NaCl, 1.5mM ZnSO₄, 60단위 SI뉴클레아제) 50μl에서 뉴클레아제 SI로 처리한다. 반응 혼합물에 페놀을 가하여 탈 단백질화시키고 에탄올에 의해 DNA를 침전시킨다. 이렇게 얻어진 DNA를 37℃에서 3분간 반응혼합물(이중-사슬 DNA, 0.14M 포타슘 카코딜레이트, 0.3M 트리스(염기) (pH7.6), 2mM디틴오트레이톨, 1mM CoCl₂, 0.15mM dCTP, 30단위 말단 전이 효소) 50μl에서 말단 전이 효소와 반응시켜 DNA의 각 3'-말단에 약 20데옥시시티딘(약 20) 단위로 이중사슬 DNA를 연장시킨다. 이러한 일련의 반응에 의해 데옥시시티딘-꼬리를 갖는 이중-사슬 DNA 약 300ng을 얻는다.

(v) 이 콜리 플라스미드의 절단 및 dG꼬리의 부가

한편, 이 콜리 플라스미드 pBR322 DNA 10μg을 37℃에서 3시간 동안 반응 혼합물 [10μg DNA, 50mM, NaCl, 6mM 트리스 HCl(pH 7.4), 6mM MgCl₂, 6mM 2-메르캅토에탄올, 100μg/mg 소혈청 알부민, 20단위 PstI] 50μl중에서 제한효소 PstI으로 처리하여 pBR322 DNA내에 존재하는 한 PstI인지 부위를 절단하고, 반응혼합물을 페놀에 의해 탈 단백질차시키고 DNA를 37℃에서 3분동안 반응 혼합물 [10μg DNA, 0.14M 포타슘카모딜레이트, 0.3M 트리스(염기) pH 7.6, 2mM디티오트레이올, 1mM CoCl₂, 0.15mM dGTP, 30단위 말단전의 효소] 50μl중에서 말단 전이 효소로 더 처리하여 그의 각 3'-말단에 약 8데옥시 구아니딘으로 상기 pBR322 플라스미드 DNA를 연장시킨다.

(vi) cDNA 어닐링(annealing) 및 이 콜리의 형질전환 얻어진 합성 이중-사슬 DNA 0.1μg 및 상기 pBR322플라스미드 0.5μg을 65℃에서 2분간, 그리고 45℃에서 2시간 동안 0.1M NaCl, 50mM 트리스 HCl, pH7.6, 1mM EDTA를 함유하는 용액에서 가열한 후, 천천히 냉각시켜 어닐링을 행한다. 이 콜리X1776의 형질전환은 에나(Enea) 등의 방법[J.Mol. Bio1., 96, 495(1975)]에 의해 수행한다.

(vii) cDNA-함유 플라스미드의 분리

이렇게 하여 약 8,500 테트라시클런-저항성 집락들을 분리하고, 각 집락의 DNA를 0니트로셀룰로오스 필터에 고정시킨다. [M.Grunstein 및 D.S.Hogness.Proc.Natl,Acad. Sci.USA,72,3961(1975)]

디.브이.괴델(D.V.Goeddel) 등이 보고[Nature, 295, 503(1982)]한 IFN-γ의 아미노산 서열에 기초를 두고 각각 상기 I-IFN서열의 아미노산 번호, 1∼5(Cys -Try.Cys.Gln.Asp) 및 아미노산 번호. 77∼82(Lys.Gln.AsP.Met.Asn Val)에 해당하는 두 올리고 뉴클레오티 드 [그림] 및 [그림]를 트리에스테르 방법[R.Crea 등., Proc.Natl,Acad.Sci.USA,75,5765(1978)]에 의해 화학적으로 합성한다. 이러한 올리고 뉴클레오니드를 37℃에서 1시간 동안 반응 혼합물(0.2μg 올리고뉴클레오티드, 50Mm트리스 HCl pH 8.0, 10mM MgCl₂10mM 메르캅토에탄올, 50μ Cir-32P ATP, 3단위 T₄폴리뉴클레오터드키나제) 50μl중에서 T₄폴리뉴클레오티드키나제로 처리한다. 즉 5'-말단에 32P로 라벨된 이러한 올리고펩티드론 프로브로사용하고, 로운(Lawn) 등의 방법[Nucleic Acids Res., 9. 6103(1981)]에 의해 상기 언급된 니트로셀룰로오스 필터 상의 DNA와 어닐(anneal)시킨다. 상기 2개의 올리고뉴클레오티드 프로브에 반응하는 4주를 오토라디오그래피에 의해 분리한다.

알칼리 방법[H.C.Birnboim 및 J.Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513(1979)]에 의해 이러한 주의 각각의 박테리아 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 플라스미드 DNA내의 삽입물을 PstI 제한 효소를 이용하여 잘라낸다. 분리된 플라스미드로부터 가장 긴 삽입물을 함유하는 플라스미드를 선택하고 "pHIT3709"라 명명한다.

pHIT3709 플라스미드에 삽입된 cDNA 서열의 구조(염기서열)를 디뉴클레오티드 합성 쇄 종결 방법 및 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법에 의해 결정한다. 상기 1차 구조는 제 5도에 제시되었다.

pHIT3709의 IFN-γ 코오딩영역(코돈 번호 S1∼번호 146)의 염기 서열은 참고문헌[Nucleic Acids Res., 10. 2487 et seq. (1982)]의 제 3도에 제시된 것과 동일하다.

[참고예 2]

(i) 이.콜리 내의 트리프로판 합성을 위한 프로모터 부분을 함유하는 플라스미드 ptrp601(pBR322벡터)[promotor-and operator-containing DNA fragment, 176염기쌍, G.N.bennett 등., J.Mol.Biol., 121, 113(1978)]를 형질발현 플라스미드로서 제작한다.

한편, 플라스미드 pBR322를 제한 효소 EcoRI및 AvaI로 절단한다. 이렇게 얻어진 테트라시클린-저항유전자를 함유한 EcoRI-AvaI 단편의 점착 말단을 DNA 폴리머라제 I큰 단편을 이용하여 채운다. 이러한 단편을 T₄DNA리가제를 이용하여 Ptrp601의 PvuII 절단부위에 접합되도록 한다. 이렇게 해서 Ptrp701이 제작된다(제 6도).

(ii) ptrp701에 존재하는 두 제한 효소 ClaI 절단부위들중의 하나를 제거하기 위해, ptrp701을 ClaIdp 의한 부분 분해 처리시켜 두 ClaI 절단부위중 하나가 절단된 ptrp701들 얻는다. DNA폴리머라제 I큰 단편으로 점착 말단을 채운 후 얻어진 prtp701을 다시 T₄DNA를 사용하여 다시 접합시켜 ptrp711을 얻는다(제 6도).

(iii) PHIT3709를 제한 효소 PstI으로 절단하여 IFN-γ의 구조 유전자를 함유하는 PstI 단편을 얻는다. 단편을 제한효소 BstNIto로 더 부분 소화시켜 IFN-γ구조 유전자에 존재하는 BstNI부위에서 절단된 BstNI-PstI단편을 얻는다. BstNI 절단부위의 점착 말단은 DNA 폴리머라제 I큰 단편으로 채운다. 이렇게 얻어진 단편과 단백질 합성출발 코든 ATG를 함유하고 상기 언급된 트리에스테르방법에 의해 과학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 어댑터

CGATAATGTGTTACTGCC

TATTACACAATCACGG

를 T₄DNA리가제를 사용하여 결합시킨다.

한편, 상기 언급된 어댑터와 연결된 IFN-γ를 T₄DNA리가제를 사용하여 트리프로판 프로모터의 하류에 있는 플라스미드 벡터 ptrp771의 Pst I-Cla I 부위속에 삽입한다. 이렇게 해서 IFN-γ 발현 플라스미드 pHITtrp1101이 제작된다(제 7도).

(iv) pHITtrp2101을 하기와 같이 pHITtrp1101를 더 개량하여 제작한다.

ptrp610을 우선 제한효소 Cla Ⅰ 및 Hpa Ⅱ로 처리하여 trp프로모터를 함유하는 Cla Ⅰ-Hpa Ⅱ 단편의 0.33Kb를 얻는다. 이 단편을 pHITtrp1101과 연결시키고, Cla Ⅰ로 절단하고 T₄DNA리가제를 사용하여 알칼리성 포스파타제로 처리한다. 이렇게 해서 2개의 연속적인 trp프로모터를 함유하는 pHITtrp2101이 얻어진다(제 8도).

이. 콜리 294/pHIT.trp210 주를 코헨 등의 방법 (위에 언급함)의 방법에 의해 플라스미드 pHIT.trp2101로 이.콜리 294(IFO-14171로서 기탁됨)을 형질전환시켜 얻는다.

[참고예 3]

이. 콜리 294/pHITtrp2101을 37℃, 1-l플라스크에서 테트라시클린 8μg/ml, 0.4% 카스아미노산 및 1% 글루코오스를 함유하는 M9 배지의 200ml중에서 배양한다. 박테리아 성장이 KU 220에 달했을때, 3β-인돌일 아크릴산(IAA)를 30μg/ml의 농도로 가하고 혼합물을 4시간 동안 더 배양한다.

[참고예 4]

참고예 3에서 얻어진 배양용액 1.2l을 원심분리한 후, 세포를 회수하고 10% 자당을 함유하는 0.05M 트리스 HCl(pH 7.6) 60ml속에 현탁시킨다. 이 세포 현탁액에 0.2M 페닐메틸-술포닐 플로오라이드(PMSF) 0.3ml, 5M NaCl 용액 24ml, 0.2M 에틸렌디아민 테트라이세테이트(EDTA) 2.4ml, 1M 스페르미딘 2.4ml 및 라이소자임(5mg/ml) 2.4ml을 가한다. 혼합물을 0℃에서 1시간 방치하고, 37℃에서 5시간 동안 배양하고 0℃에서 30초 동안 아르택(ARTEK) 초음파 파괴기(USA)를 사용하여 파괴하였다.

이러한 세포 분해 용액을 1시간 동안 105,000×g에서 원심분리하여 상층액 66ml를 회수한다.

Claims (10)

1. 하기 폴리팹티드(I)의 부분 성분에 해당하는 출발물질을 함유하는 임의로 보호된 반응성 카르복실(a)와 하기 폴리펩티드(I)의 나머지 에 해당하는 출발물질을 함유하는 임의로 보호된 반응성 아미노(b)를 축합하고, 축합 생성물이 보호기를 갖는 경우에 보호기를 제거함을 특징으로 하는 하기식(I)의 폴리팹티드의 제조방법.

   (N) (C)

   H-N-Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (I)

   식중, X는 결합, 또는 하기식의 펩티드 쇄의 C말단으로부터 계산하여 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이고,

   (N)

   (C)

   Ala Lys Thr Gly Lys Arg

   Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala

   Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N말단으로부터 계산하여 1∼5아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

   (N) (C)

   Arg Arg Ala Ser Gln
2. 제1항에 있어서, Y가 Arg Arg Ala Ser Gln임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1 또는 2항에 있어서. X가 Lys Arg임을 특징으로 하는 방법.
4. 하기식의 폴리펩티드(I)(a)와 담체 단백질(b)를 커플링시킴을 특성으로 하는 하기식의 폴리펩티드(I)과 담체 단백질 사이의 접합체의 제조방법.

   (N) (C)

   H-X-Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (I)

   식중, X는 결합, 또는 하기식의 펩티프 쇄의 C말단으로부터 계산하며 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이고,

   (N)

   Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala

   (C)

   Ala Lys 쏙 Gly Lys Arg

   Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N말단으로부터 계산하여 1∼5 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

   (N) (C)

   Arg Arg Ala Ser Gln
5. 비장세포(a)와 림포이드세포(b)를 융합시키고 그를 클로닝함을 특징으로 하는, 하기식(I)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드(I)과 담체 단백질 사이의 점합체에 의해 면역화인 포유동물의 비장세포(a) 및 면역화된 포유동물과 같거나 또는 다른 종의 포유동물의 림포이드세포(b) 사이의 클로닝된 융합세포의 제조방법.

   (N) (C)

   H-X-Lys Arg Ser Gln Met leu Phje Arg Gly-Y-OH (I)

   식중, X는 결합, 또는 하기식의 펩티드 쇄의 C말단으로부터 계산하여 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이고,

   (N)

   Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala

   (C)

   Ala Lys 쏙 Gly Lys Arg

   Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N말단으로부턴 계산하여 1∼5 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

   (N) (N)

   Arg Arg Ala Ser Gln
6. 폴리펩티드(I) 또는 폴리펩티드(I)과 담체 단백질 사이의 접합체에 의해 면역화된 포유동물의 비장 세포(a) 및 면역화된 포유동물과 같거나 또는 다른종의 포유동물의 림포이드세포(b) 사이의 포유동물 융합세포를 액체 배지 또는 복강내에서 성장시켜 단클론성 항체를 생성 및 축적시키고 그를 회수함을 특징으로 하는 하기식의 폴리펩히드(I)에 대응하는 단클론성 항체의 제조방법.

   (N) (C)

   H-X-Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (I)

   식중, X는 결합 또는 하기식의 펩티드 쇄의 C말단으로부터 계산하여 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드와 또는 아미노산 잔기이고,

   (N)

   Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala

   (C)

   Ala Lys 쏙 Gly Lys Arg

   Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N말단으로부터 계산하여 1∼5 아미노산을 갖는 아미노산 잔기 또는 펩티드이다

   (N) (C)

   Arg Arg Ala Ser Gln
7. 제6항에 있어서, 포유동물이 새앙쥐임을 특징으로 하는 방법.
8. 하기식의 폴리펩티드(I)에 대응하는 단클론성 항체를 이용하여 조(crude) 인체 감마-인터페론을함유하는 물질을 처리함을 특징으로 하는 인체-감마-인터페론의 정제방법.

   (N) (C)

   H-X-Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH

   식중, X는 결합, 또는 하기식의 펩티드 쇄의 C말단으로부터 계산하여 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이고,

   (N)

   Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala

   (C)

   Ala Lys 쏙 Gly Lys Arg

   Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N말단으로주터 계산하여 1∼5 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

   (N) (C)

   Arg Arg Ala Ser Gln
9. 제8항에 있어서, 조 인체 감마-인터페론을 함유하는 물질을 담체에 커플링된 단클론성 항체와 함께 친화성 컬럼 크로마토그래피하는 방법.
10. 항체로서, 하기식의 폴리펩티드(I)에 대응하는 단클론성 항체를 사용함을 특징으로 하는 방사성 면역 분석방법 또는 효소 면역 분석방법에 의해 인체-감마-인터페론을 검출하는 방법.

    (N) (C)

    H-X-Lys Arg Ser Gln met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (I)

    식중, X는 결합, 또는 하기식의 펩티드 쇄의 C말단으로부터 계산하여 1∼16 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이고,

    (N)

    Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala

    (C)

    Ala Lys 쏙 gly Lys Arg

    Y는 하기식의 펩티드 쇄의 N말단으로부터 계산하여 1∼5 아미노산을 갖는 펩티드 또는 아미노산 잔기이다.

    (N) (C)

    Arg Arg Ala Ser Gln

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