JPH0646959B2 - 新規ポリペプチドおよびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関す
る。

ケーラーとミルスタインにより開発され（ネイチャー，
第２５６巻，４９５頁，１９７５年）、近年盛んになっ
て来たハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製
造法は、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗
体が得られることや、粗精製標品に対して得られた抗体
について吸収操作を必要としないことなどのすぐれた特
徴をもっている。またこの他に、抗体取得という面から
も、ハイブリドーマの腹水化により、高力価の抗体が、
自由に、多量に、しかも常に均質な標品を再現性よく得
られるなど多くの利点がある。この様な意味からハイブ
リドーマによるモノクローナル抗体取得の手法は、多方
面にわたってその有用性が高く評価されている。また、
その使い方も単に抗原検出にとどまらず、抗体カラム作
製を通じて、微量成分の精製に用いたり〔ネイチャー，
２８５，４４６−４５０，（１９８０年）〕、更には、
診断薬，治療薬への応用〔ヨーロピアン ジヤーナル
オブ イムノロジー，９，９４−９６，（１９７９）〕
も展開されている。

ヒトのインターフェロン（ＩＦＮ）には、抗体的に異な
るα，β，γ型の少くとも３種のタイプが存在すること
が知られている〔ネーチャー，２８６，１１０，（１９
８０）〕。γ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）につい
ては、マイトージエンや抗原刺激によって、主としてＴ
リンパ球から産生されることが判っており、別名免疫イ
ンターフェロン（Ｉ−ＩＦＮ）とも呼ばれている〔ザ
インターフェロン システム，スプリンガー社，ニュー
ヨーク，１１頁−２６頁，１９７９年〕。ＩＦＮ−γは
生体内で、種々の免疫反応にともなって産生されること
が予想され、免疫調節に重要な役割を果たしていると考
えられている。また、ＩＦＮ−γの性質としては、α型
インターフェロン（ＩＦＮ−α）やβ型インターフェロ
ン（ＩＦＮ−β）と抗原性が異なることや、誘起剤の種
類が異なることの他に、酸や熱に対する安定性が悪いこ
となども判っている〔ザ インターフェロン システ
ム，スプリンガー社，ニューヨーク，１１頁−２６頁，
（１９７９）〕。

一般的にＩＦＮは、生体の産生する抗ウイルス作用をも
つものとして定義されているが、この他に多くの生物活
性をもつことが証明されており、特に抗腫瘍効果を有す
る点で注目されている〔ブラッド，５５，７１１−７２
１，（１９８０）；同誌，５５，８７５−８８４，（１
９８０）〕。

腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細胞の増殖を直
接抑制する方法と、宿主の免疫反応を介して、間接的に
腫瘍を抑制する方法が考えられ、後者の場合、例えばナ
チュラルキラー細胞（ＮＫ）や、マクロファージの活性
化、或いはキラーＴ細胞の活性化などが考えられる。実
際、ＩＦＮには直接作用の他に、この様な種々の免疫増
強活性があることが証明されている〔バイオケミカ エ
ト バイオフイジカ アクタ，５１６，２３１−２４
７，（１９７８）〕。ＩＦＮ−γはインビトロでのこれ
ら抗腫瘍につながる各種の活性、およびインビボに於け
る抗腫瘍活性が、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βに比べ遥かに
高いことから、その重要性が強く指摘されている〔セル
ラーイムノロジー，４９，３９０−３９４，（１９８
０）〕。

然しながら、インビトロで誘導されるＩＦＮ−γの力価
は一般に低いことや適切なＩＦＮ−γ産生株細胞がほと
んどないこと、さらに熱や酸に対する安定性が悪いため
精製がむつかしいことなどのためにＩＦＮ−γの大量生
産および精製はＩＦＮ−αやＩＦＮ−βに比べ大幅に遅
れている。

最近、天然のＩＦＮ−γが単一に出来たという報告があ
るが（プロシジング オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス，７９，１８２０−１８２４，（１９
８２）〕、活性の回収が大変悪く、より効果的な精製法
が待望されている。

一方最近に至り、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子のクローニング
が報告され、少くともＩＦＮ−γの一種として、１４６
個のアミノ酸から成る約１７キロダルトンの分子種が、
大腸菌で作られる様になった〔ネーチャー，２９５，５
０３−５０８，（１９８２）；ヌクレイック アシッズ
リサーチ，１０，２４８７−２５０１，１９８２）〕
ので、遺伝子組み換え法を用いたＩＦＮ−γの大量生産
が期待出来る様になったが、抗体を用いない通常の精製
法で単一化することは大変な困難が予想される。

この様な視点から、各種のＩＦＮ−γに対するモノクロ
ーナル抗体を得ることは、分子種間の対応をつけるのに
重要なだけでなく、天然の、或いは遺伝子組み換え法に
よる大腸菌などで作らせたＩＦＮ−γを精製する上に極
めて強力な武器となる。最近に至り、天然のＩＦＮ−γ
に対するモノクローナル抗体の取得が報告され〔ネーチ
ャー，２９６，２５８−２５９，(１９８２)；ザ エン
ボジャーナル，２，１５２７−１５３０,(1983)〕。後
者の報告では該抗体が天然のＩＦＮ−γの精製や定量に
用いられることが報告されたが、遺伝子組み換え法によ
り得られたＩＦＮ−γに対するモノクローナル抗体を取
得することは、遺伝子組み換え法により作られたＩＦＮ
−γをより効率よく精製したり、より感度よく検出した
りする上に極めて重要である。また、モノクローナル抗
体を用いてＩＦＮ−γを精製したり検出する上におい
て、その抗体がペプチドのどの部分を認識しているかを
認め、認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を取
得し、それらを目的に応じて使い分けることができれ
ば、その応用価値は急増する。上述した報告において
は、得られたモノクローナル抗体がＩＦＮ−γのどの部
分を認識しているかは全く不明である。ごく最近に至
り、ＩＦＮ−γのＮ末端１番目から２０番目迄のアミノ
酸配列に相当する合成ペプチドに対する抗体の取得が報
告〔ジャーナル オブ イムノロジー，１２９，２３５
７−２３５９（１９８２）〕されたが、報告による抗体
は兎で作製されたポリクローナル抗体である。ポリクロ
ーナル抗体に比べ、モノクローナル抗体は供給面（抗原
認識部位，抗体価，親和性等に関して、常に一定のもの
を随時、多量に供給し得る）ですぐれているのみなら
ず、ＩＦＮ−γの精製、検出等の応用面でも結果の再現
性が遥かに高く有効である。

本発明者らは、製造遺伝子のヌクレオチド配列から推定
されたヒトＩＦＮ−γのアミノ酸配列に関する報告〔ヌ
クレイック アシッズ リサーチ１０，２４８７−２５
０１（１９８２）〕をもとに、そのアミノ酸配列のＮ末
端側の部分構造を有する式 （式中、ＺはPyro GluまたはGlnを示す。）で表わされ
るポリペプチド（以下、「ポリペプチド（Ｉ）と称する
こともある。）を化学的に合成し、さらにキャリヤー蛋
白と化学結合させ蛋白複合体とした。

ここで得られたポリペプチドまたは蛋白複合体で哺乳動
物を免疫し、取り出したリンパ球と同種または異種のリ
ンパ球様細胞株とを細胞融合によりハイブリドーマと
し、これをクローン化した。

ここで得られたハイブリドーマを哺乳動物に接種し、モ
ノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取して前
記のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を製造し
た。

さらに、ここで得られるモノクローナル抗体を利用し、
粗ヒトＩＦＮ−γ含有物からヒトＩＦＮ−γを精製する
方法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法ならびに
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法によりヒトＩＦ
Ｎ−γを検出する方法を確立し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、(1)ポリペプチド（Ｉ）に対する
モノクローナル抗体，(2)ポリペプチド（Ｉ）に対する
モノクローナル抗体を用いて精製することを特徴とする
ヒトγ型インターフェロンまたは（および）そのＣ末端
部分を欠くフラグメントの精製法，および(3)ポリペプ
チド（Ｉ）に対するモノクローナル抗体を用いることを
特徴とするラジオイムノアッセイ法またはエンザイムイ
ムノアッセイ法によるヒトγ型インターフェロンまたは
（および）そのＣ末端部分を欠くフラグメントの検出法
である。

当該ポリペプチドは、ペプチド合成の常套手段で製造し
うる。固相合成法，液相合成法のいずれによってもよい
が、液相合成法が有利な場合が多い。このようなペプチ
ドの合成の手段は、たとえば、“The Peptides”第１巻
（１９６６），Schroder and Lubke著，Academic Pres
s,New York,U.S.A.あるいは“ペプチド合成”，泉屋ら
著，丸善株式会社（１９７５），あるいは“生化学実験
講座，第１巻，２０７頁−４００頁”矢島治明著，東京
化学同人株式会社（１９７７年）に記載されており、た
とえば、アジド法，クロライド法，酸無水物法，混合酸
無水物法，ＤＣＣ法，活性エステル法，ウッドワード試
薬Ｋを用いる方法，カルボジイミダゾール法，酸化還元
法，ＤＣＣ／アデイテイブ（例、HONB，HOB_t，HOS_u）法
などがあげられる。

ポリペプチド（Ｉ）は、いずれも保護されていてもよ
い。(a)ポリペプチドの一部に相当する反応性カルボキ
シル基を有する原料と、(b)ポリペプチド（Ｉ）の残部
に相当する反応性アミノ基を有する原料をペプチド合成
の常套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有す
る場合、その保護基を常套手段で脱離させることにより
製造しうる。

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護
基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基
の活性化などもまた公知のものあるいは手段から適宜選
択しうる。

原料のアミノ基の保護基としては、たとえばカルボベン
ゾキシ，ｔ−ブチルオキシカルボニル，ｔ−アミルオキ
シカルボニル，イソボルニルオキシカルボニル，ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル，２−クロル−ベンジ
ルオキシカルボニル，アダマンチルオキシカルボニル，
トリフルオロアセチル，フタリル，ホルミル，Ｏ−ニト
ロフェニルスルフェニル，ジフェニルホスフイノチオイ
ル，４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンス
ルホニルなどがあげられる。カルボキシル基の保護基と
しては、たとえばアルキルエステル（例、メチル，エチ
ル，プロピル，ブチル，ｔ−ブチルなどのエステル
基），ベンジルエステル基，ｐ−ニトロベンジルエステ
ル基，ｐ−メトキシベンジルエステル基，ｐ−クロルペ
ンジルエステル基，ベンズヒドリルエステル基，カルボ
ベンゾキシヒドラジド基，ｔ−ブチルオキシカルボニル
ヒドラジド基，トリチルヒドラジド基などがあげられ
る。

原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、た
とえば対応する酸無水物，アジド，活性エステル（ペン
タクロロフェノール，ｐ−ニトロフェノール，Ｎ−ハイ
ドロキシサクシンイミド，Ｎ−ハイドロキシベンズトリ
アゾール，Ｎ−ハイドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミドなどとのエステル）などがあげ
られる。ペプチド結合形成反応は脱水剤（例、ジシクロ
ヘキシカルボジイミド，カルボジイミダゾール等のカル
ボジイミド試薬）の存在下に実施しうる場合がある。

本ペプチド縮合反応は溶媒の存在下に行うことができ
る。溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうること
が知られているものから適宜選択されうる。たとえば無
水または含水のジメチルホルムアミド，ジメチルスルホ
キサイド，ピリジン，クロロホルム，ジオキサン，ジク
ロルメタン，テトラハイドロフラン，酢酸エチル，Ｎ−
メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物などが
あげられる。

反応温度はペプチド結合形成反応に使用されうることが
知られている範囲から適宜選択され、通常約−４０℃−
約６０℃、好ましくは約−２０℃−約０℃の範囲から適
宜選択される。

本縮合反応終了後、生成物が保護基を有している場合、
それは常法により離脱できる。かかる常法としては、た
とえば還元的方法（例、パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加，液体アンモニア中金属ナトリウムによる還
元），アシドリシス（例、トリフルオロ酢酸，フッ化水
素，メタンスルホン酸あるいは、チオアニソール等の含
硫化合物の存在下、上記の酸あるいは、その混合物によ
るアシドリシス）などがあげられる。

上記のようにして製造された本発明のペプチドは、反応
終了後混合物から、通常のペプチドの分離手段，抽出，
分配，カラムクロマトクラフィーなどにより採取でき
る。

ポリペプチドの蛋白複合体に関し、キヤリヤー蛋白の種
類およびキヤリヤーとハプテン（この場合ペプチド）と
の混合比は、キヤリヤーにカプリングさせて免疫したハ
プテンに対して抗体が効率よく出来れば、どの様なもの
をどの様な比率でカプリングさせてもよいが、例えばヒ
ト又は牛血清アルブミンや牛サイログロブリンあるいは
ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し０．１〜２
０、好ましくは１〜５の割合でカプルさせる方法が用い
られる。

また、ハプテンとキヤリヤーのカプリングには、種々の
縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒドや
カルボジイミド等が好都合に用いられる。

ポリペプチド（Ｉ）または蛋白複合体を用いて免疫する
に際し、免疫する哺乳動物は羊，山羊，兎，モルモッ
ト，ラット，マウス等の実験動物が使われるが、モノク
ローナル抗体を得るためには、ラット，マウスが好まし
い。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下，
腹腔内，静脈内，筋肉内，皮内等のいずれのルートから
でも可能であるが、主として皮下，腹腔内，静脈内に
（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。また、接種間
隔，接種量等も可変度は高く、種々の方法が可能である
が、例えば２週間隔で２〜８回接種し、最終免疫後、１
〜５日、好ましくは２〜４日後の脾細胞を用いる方法が
よく用いられる。接種量は１回にペプチド量として、マ
ウス当り０．１μｇ以上、好ましくは１０μｇ〜３００
μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する場合は
その前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認
した上で、リンパ球源として脾臓細胞を用いる融合実験
を行うことが望ましい。

又、免疫の方法として、ポリペプチド（Ｉ）または蛋白
複合体で哺乳動物を免疫する方法について述べたが、例
えばＩＦＮ−γ、好ましくは遺伝子組み換え法により大
腸菌を用いて作製したＩＦＮ−γ（以後ｒＩＦＮ−γと
記す）を精製し、精製ｒＩＦＮ−γをまず接種した後、
上記ポリペプチド（Ｉ）または蛋白複合体で哺乳動物を
免疫するか、又はその逆にポリペプチド（Ｉ）又は蛋白
複合体で免疫した後、精製ｒＩＦＮ−γを哺乳動物に追
加接種することもできる。該免疫方法の中、ｒＩＦＮ−
γを接種した後、ポリペプチド（Ｉ）又は蛋白複合体で
免疫する当発明による免疫方法は、前者単独で免疫する
方法に比べ、特定のポリペプチド部分を認識する抗体を
取得する上でとりわけ効率がよい。この方法は単にＩＦ
Ｎ−γとその特定のペプチド部分との関係だけでなく、
他の分子についてもその特定部位を認識する抗体を取得
したい場合の有効な免疫方法として応用可能である。

上記リンパ球とリンパ球様細胞株との細胞融合は、例え
ば免疫したマウスのリンパ球（とりわけ脾臓細胞由来の
もの）をヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ欠損（HGRRT^-）や、チミジンキナーゼ
欠損（ＴＫ⁻）の様なマーカーを持った適切な同種また
は異種（好ましくは同種）のミエローマ等の、リンパ球
様細胞株との間で融合させる。融合には、センダイウイ
ルス，ポリエチングリコール（ＰＥＧ）等の融合剤が用
いられる。もちろんジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
その他の融合促進剤を加えることも可能である。ＰＥＧ
の重合度は、ふつう１０００〜６０００，時間は０．５
〜３０分，濃度は１０％〜８０％等が用いられるが、好
ましい条件の一例として、ＰＥＧ６０００を３５〜５５
％で４〜１０分処理することにより、効率よく融合させ
ることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地；ネイチャー，２
５６，４９５−４９７，(1975)〕等を用いて、選択的に
増殖させることが出来る。

マウスの血清や増殖して来た細胞の培養上清は、目的と
する抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行
うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に
行うことが出来る。即ち、ＲＩＡ法またはＥＩＡ法等の
方法で調べることが出来るが、これらの方法についても
種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる方法について述べる。固相にｒＩＦ
Ｎ−γ又はポリペプチド（Ｉ）を常法に従って固定（例
えば９６穴のマイクロタイタープレートを固相として用
いるとマルチスキャン等を用いた迅速な測定が可能とな
り有利である）させておき、これに測定したい培養上清
や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（以下４〜４
０℃を示す）で反応させる。この後、反応物をよく洗っ
た後、酵素で標識した抗マウス抗体（山羊，兎などのポ
リクローナル抗体に例えばホースラディッシュペルオキ
シダーゼ等の酵素を結合したものを市販品として入手出
来る）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応物を
よく洗った後、酵素基質を加え、一定時間，定温で反応
させ、その後、生成発色物を吸光度または螢光度等で測
定することが出来る。

選択培地で増殖を示し、かつｒＩＦＮ−γへの結合能や
免疫に用いたペプチドに対する抗体活性のみられたウエ
ルの細胞は、限界稀釈法等によりクローニングを行うこ
とが望ましい。クローン化された細胞の上清について同
様のスクリーニングを行い抗体価の高いウエルの細胞を
増やすことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られ
る。

これらクローンの産生する抗体が天然のＩＦＮ−γ（例
えばヒト末梢血リンパ球からレクチンとホルボールエス
テル等で誘導したもの；以後ｎＩＦＮ−γと記す）およ
びｒＩＦＮ−γを吸収する能力について生物活性を用い
て調べることができる。その方法として有利に用いられ
る一例を次に述べるが、もちろん種々の変法も可能であ
る。例えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体をセル
ロースビーズ等の抗体に常法に従いカプリングさせてお
き、これに測定したいハイブリドーマ上清またはマウス
の血清を加え、一定時間、定温で反応させる。この後反
応物をよく洗い一定量のＩＦＮ−γを加える。ＩＦＮ−
γとして、例えばｎＩＦＮ−γやｒＩＦＮ−γを加えた
後、一定時間，定温で反応させ、反応上清中に含まれる
ＩＦＮ−γの活性を測定する。この様にして目的とする
抗体のＩＦＮ−γ活性の吸収能を測定することが出来
る。

次に、これらクローンの産生する抗体が、ｒＩＦＮ−γ
やｎＩＦＮ−γのもつ抗ウイルス作用（以後ＡＶＡと略
す）を中和する能力があるか否かを調べることもでき
る。中和活性のある抗体の取得は、該抗体が直接生物活
性に関連した部位を認識していることになるので、ＩＦ
Ｎ−γを含むサンプルから、ＩＦＮ−γを精製したり、
ＥＩＡ法やＲＩＡ法を用いて定量したりする上に於て、
極めて重要である。抗体の中和活性は例えば次の様にし
て測ることができる。即ち、一定量のＩＦＮ−γに対し
て大過剰量の抗体を加え、一定時間、一定温度で反応さ
せた後、反応物を後述するＡＶＡにて測定することがで
きる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。例え
ば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０に０．１〜４
０％の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、好ましく
は３〜５日間培養することにより、培養液から該モノク
ローナル抗体を得ることができるが、この他にマウス等
の適切な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、
腹水を採取することにより、細胞培養上清よりも遥かに
高力価の抗体を、多量に効率よく取得することが出来
る。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイ
ル等を前もって接種したＢＡＬＢ／Ｃ等のマウスに１×
１０^４〜１×１０^７個、好ましくは５×１０^５〜２×１
０^６個のハイブリドーマを腹腔内等に接種し、７〜２０
日後、好ましくは１０〜１４日後に腹水液等を採取す
る。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムクロマト等により、容易にモノ
クローナル抗体を純粋な免疫クロブリンとして単離する
ことが出来る。

本発明のモノクローナル抗体は、下記の性状をする。

(1) ポリペプチド（Ｉ）と結合する。

(2) ＩＦＮ−γ分子およびそのＣ末端部分を欠くフラ
グメントと結合し、ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βとは結合し
ない。

(3) ＩＦＮ−γの生物学的活性を中和する。

(4) オクタロニー法による検定によりＩｇＧ１のサブ
クラスの抗体に属する。

(5) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、標準免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖に完全に一致
する２本のバンドのみを示す。

なお本モノクローナル抗体は安全に製造，使用保管する
ことができる。

本発明により得られるモノクローナル抗体は、ＥＩＡ法
〔イムノケミストリー，１５，４２９−４３６（１９７
６）〕或いはＲＩＡ法〔サイエンス，１５８，１５７０
−１５７２（１９６７）〕を活用することにより、生体
中の、或いは試験管内での微量のＩＦＮ−γの検出に用
いることが出来ることの他に、たとえば抗体カラムを作
製することにより、今迄大変困難とされていた天然の、
或いは遺伝子組みかえにより作られるＩＦＮ−γを、非
常に効率良く精製するのに使用することができる。

当発明において得られたモノクローナル抗体をＩＦＮ−
γの定量に用いる場合、例えば当抗体とＩＦＮ−γを含
む資料とを一定時間，定温で反応させた後，予め固相に
固定したＩＦＮ−γに上記反応物を加え一定時間，定温
で反応させ洗った後、酵素標識した抗マウス抗体を加え
反応させ、更に酵素基質を加え一定時間反応させマルチ
スキャンを用いた色素量の定量を行うことにより関接的
にＩＦＮ−γ量を測定するいわゆるＥＬＩＳＡ（エンザ
イム リンクド イムノソルベントアッセイ）法等によ
る測定が可能である。

又、これらのモノクローナル抗体はＩＦＮ−γのＮ末端
部分を認識する抗体であるので、例えばこれらの抗体と
別個に、ＩＦＮ−γのＣ末端部分を認識する抗体を用い
て、これら各々の抗体を第１抗体，第２抗体として用
い、第１抗体を固相に固定し、これに測定したいＩＦＮ
−γを含む試料を加え、一定時間，定温で反応させよく
洗った後、例えば酵素標識した第２抗体を加え、一定時
間，定温で反応させ、さらに酵素基質を加えて一定時間
反応させた後、マルチスキャン等を用い比色法により定
量する、いわゆるサンドウィッチ法による定量が可能と
なり、この場合、Ｎ末，Ｃ末の両末端部分を含む完全分
子のみを測定することができる。この方法によれば、例
えば大腸菌等で作らせたＩＦＮ−γ等がプロテアーゼ等
による分解を部分的に受けていた場合にも完全分子のみ
を測定することができるので大変有利に用いることがで
きる。例えば、合成Ｃ末端ペプチドで免疫したマウス脾
臓細胞とリンパ球様細胞株との細胞融合によりＣ末端ペ
プチドを認識する抗体を取得し〔特願昭５８−１７６０
９１号（出願日，昭和５８年９月２２日）明細書（特開
昭５９−８０６４６）号公報参照〕、当発明の抗体と組
み合わせて有利に用いることができる。もちろん第２抗
体として、Ｃ末端部分以外の認識部位を有する別なモノ
クローナル抗体や、ポリクローナル抗体なども目的に応
じて有利に使い分けることができる。

これらの反応において、酵素標識抗体の代りに¹²⁵Ｉな
どのラジオアイトープ標識抗体を用いたＲＩＡによる定
量法も可能であるし、また個々の反応ステップについて
は種々の変法はもちろん可能であり、当発明に記載した
方法に限定されるものではない。

また本発明において得られるモノクローナル抗体を用い
てＩＦＮ−γを効率よく精製することができる。該モノ
クローナル抗体はしかるべき担体に化学的に結合させ、
カラムに充填し抗体カラムとして有利に使用できる。

抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを接種した
腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体
を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の様
な方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後にＩＦＮ−γが特異的に
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、一例として蛋白の一級ア
ミンが結合し易い様に活性化されたアガロースゲルビー
ズ、例えばアフイゲル−１０（バイオラド社製）などが
以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。アフイゲ
ル−１０と抗体との反応は、０．００１〜１Ｍ、好まし
くは０．１Ｍのバイカーボネート等の緩衝液中で反応を
行なう。反応条件は０゜〜２０℃，１０分〜２４時間、
種々のｐＨが可能であるが、好ましくは４℃、４時間，
ｐＨ３〜１０の条件が用いられる。混合するアフイゲル
−１０の抗体の量比は、アフイゲル１mlに対し抗体量が
約５０mg位迄は多ければ多い程多くの抗体がつくので、
この範囲内でいくらでもよいが、結合効率およびアフイ
ニテイカラムクロマトグラフィーにおける精製効率を考
慮して１０〜３０mgの抗体が好都合に用いられる。この
様にしてできた抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝
液でよく洗った後、数日放置するか、もしくは最終濃度
０．０５Ｍのエタノールアミン・塩酸を加え４℃で１時
間反応させる等の方法により、残存する未反応の活性基
をブロックした後、適切なカラムにつめることにより、
抗体カラムとして使用できる。

上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばヒ
ト免疫インターフェロン蛋白質含有資料を中性附近の緩
衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶
解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝
液で洗浄したのち、ＩＦＮ−γを溶出する。溶出液とし
ては、例えばグアニジン塩（塩酸塩，硫酸塩など）や尿
素等のたん白変性剤を含む溶液，チオシアン化カリなど
カオトロピックイオンを含む溶液，弱酸性溶液たとえば
酢酸溶液，ポリエチレングリコールを含む溶液，資料に
くらべ抗体に、より結合し易いペプチドを含む溶液，高
濃度塩溶液などおよびこれらの組み合せた溶液などが用
いられ、ヒトＩＦＮ−γの分解をあまり促進しないもの
が好ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。必要に
より再度上記の抗体カラムによる精製操作を行なうこと
ができる。

ここで得られるヒトＩＦＮ−γ蛋白質溶液は透析に付
し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることが
できる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニト
ール，デキストロース，マルトース，グリセロースなど
の安定剤を加えることができる。

該抗体カラムを用いれば、ＩＦＮ−γをコードする塩基
配列を含有する形質転換体等を用いるＩＦＮ−γを製
造，精製する際に生成するＣ末端部分を欠いた１５Ｋ，
１６Ｋ，１７Ｋスピーシーズなど各種ＩＦＮ−γフラグ
メントやこれらフラグメントを複数含有する組成物〔カ
ポン，D.J.ら，第３回 アニュアル インターナショナ
ル コングレス フォア インターフェロン リサーチ
（１９８２），マイアミ，フロリダ；米国特許出願第
５３４，０３８号（出願日，１９８３年９月２０日）明
細書（米国特許第４，６０４，２８４号公報）および米
国特許出願第５３３，８７６号（出願日，１９８３年９
月２０日）明細書参照〕の精製も有利に実施することが
できる。

本発明のポリペプチド（Ｉ）は、ヒトＩＦＮ−γアミノ
酸配列のＮ末端側に存在するシステインを含有しないも
のである。したがって、当該ペプチドを用いた免疫処理
により製造されるモノクローナル抗体は、システインに
対する認識能を有しないことを特徴とするものである。

そもそもＩＦＮ−γは通常の存在状態では、１位のシス
テインおよび３位のシステインによりＳ−Ｓ結合で多量
化しているので、システインに対する認識能を有するモ
ノクローナル抗体のこの能力はかかるＩＦＮ−γの精
製，検出には寄与し得ない。

本発明のモノクローナル抗体は、かかる不要な結合能を
有しないものであり、この特性のために、有利にＩＦＮ
−γ単量体，多量体およびＩＦＮ−γのＣ末端部を欠く
各種フラグメントの精製，検出に用いることができる。
すなわち同時に混存する他のシステイン含有蛋白質や蛋
白分解物と結合しないため、上記の精製，検出におい
て、正確、有利に使用することができる。

本願明細書中記載したウイルス活性測定は、ヒト羊膜由
来ＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウイルス（ＶＳ
Ｖ）の細胞変性効果防止試験によった。

なおここでＩＦＮの活性としてのＵ／ml（ユニット／m
l）の出し方は以下の様に行った。ユニットの確定した
国際標準ＩＦＮ−αと白血球由来の粗ＩＦＮ−γをヒト
羊膜由来ＦＬ細胞株に対するＶＳＶの細胞変性効果防止
試験を用いて測定し、その力価の比較から白血球由来粗
ＩＦＮ−γの力価を決定しＩＦＮ−γの標準品とした。
目的とする資料中のＩＦＮ−γの力価算定のためには、
常にこの標準ＩＦＮ−γを並べて前述のＷＩＳＨ−ＶＳ
Ｖの系でアッセイを行い、その比率から力価を算出し
た。

また本願明細書中ＩＦＮ−γのＣ末端部分を欠くフラグ
メントとは、例えば成熟型ＩＦＮ−γ分子のＮ末端アミ
ノ酸から１３１番目までのアミノ酸残基を含み１３２番
目以降のいずれかの部分で切断された前記の１５Ｋ，１
６Ｋおよび１７Ｋスピシーズやその他各種のポリペプチ
ドを意味する。

本願明細書において、アミノ酸，ペプチド，保護基，活
性基，その他に関し略号で表示する場合、それらはＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢ（Commission on Biological Nomenclat
ureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸
などに関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しな
ければＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：デオキシアデニル酸 Ｔ：チミジル酸 Ｇ：デオキシグアニル酸 Ｃ：デオキシシチジル酸 ＲＮＡ：リボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：チミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム Lys：リジン Asp：アスパラギン酸 Asn：アスパラギン Glu：グルタミン酸 PyroGlu：ピログルタミン酸 Gln：グルタミン Pro：プロリン His：ヒスチジン Gly：グリシン Ala：アラニン Val：バリン Leu：ロイシン Ser：セリン Tyr：チロシン Phe：フェニルアラニン Ｚ：カルボベンゾキシ Boc：ｔ−ブトキシカルボニル OBu^t：ｔ−ブチルエステル OBzl：ベンジルエステル ＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−
ジカルボキシイミドエステル ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド WSCD・HCl：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド・塩酸塩 ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３
−ジカルボキシイミド ＨＯＢ_ｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＣＨＡ：ジシクロヘキシルアミン ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド 以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。

なお実施例において開示するマウス Ｂ ハイブリドー
マＷＮ_γ２−７６．５３は、パスツール研究所〔フラン
ス国パリ〕のC.N.C.M.に寄託番号No.Ｉ−２５７として
寄託されている。

以下の実施例において、薄層クロマトグラフィーは、メ
ルク社製シリカゲルプレート６０Ｆ₂₅₄を用い、下記の
展開溶媒を用いた。

Rf¹：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：１：０．
５ Rf²：クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５ Rf³：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝３０：２
０：６：２４ Rf⁴：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝１：
１：１：１ 実施例１ (i)Ｚ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕ^ｔ の製造 Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＢｕ^ｔ ８ｇをメタノール５００mlに
溶解し、パラジウム黒を触媒として還元した（以下の接
触還元もすべてパラジウム黒を触媒とした）。触媒をろ
去し、溶媒を留去した残留物を、Z-Ala-OH ６．７ｇ，
ＨＯＮＢ ６．５ｇとともに酢酸エチルとジオキサン
（１：１）の混合溶媒３００mlに溶解し、氷冷下にＤＣ
Ｃ６．８ｇを加え、４時間撹拌し、さらに室温で１２時
間撹拌した。析出物をろ去し、溶媒を留去した残留物を
酢酸エチル３００mlに溶解し、５％ＮａＨＣＯ_３水，
０．２ＮＨＣｌ，水で洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥し
たのち、溶媒を留去した。残留物をメタノール４００ml
に溶解し、先と同様に還元し、Z-Asn-OH ８．０ｇ，Ｈ
ＯＮＢ ８．１ｇと共にＤＭＦ２００mlに溶解した。氷
冷下にＤＣＣ６．８ｇを加え、０℃、４時間、室温１６
時間撹拌した。析出物をろ去し、溶媒を留去し、残留物
をＤＭＦとアセトニトリルより結晶としてろ取し、アセ
トニトリルで洗った。

収量８．１ｇ（６６．３％） Rf¹０．５２ 融点 １８９−１９０℃ ▲〔α〕²⁵ _D▼−２９．８゜（ｃ＝０．３２，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₂₁Ｈ₃₀Ｏ_７Ｎ_４として 計算値：Ｃ，５５．９９；Ｈ，６．７１；１２．４４ 分析値：Ｃ，５５．９５；Ｈ，６．７８；Ｎ，１２．４
３ （ii）Z-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^t の製造 Z-Asn-Ala-Gly-OBu^t ４．１ｇをＤＭＦ２００mlに溶解
し、接触還元した。触媒をろ去した溶液にZ-Phe-OH
３．３ｇ，ＨＯＮＢ ２．４ｇを加え、さらに冷却下に
ＤＣＣ ２．５ｇを加え０℃で４時間、室温で１２時間
かきまぜた。析出物をろ去し、溶媒を留去した残留物を
アセトニトリルとメタノールから結晶化し、さらにメタ
ノールで再結晶した。

収量３．８２ｇ（６８．５％） Rf¹ ０．５６ 融点 ２１０−２１２℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−２８．９゜（ｃ＝０．３７，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₃₀Ｈ₃₉Ｏ_８Ｎ_５として 計算値：Ｃ，６０．２９；Ｈ，６．５８；Ｎ，１１．７
２ 分析値：Ｃ，５９．９８；Ｈ，６．３９；Ｎ，１１．７
３ （iii）Z-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^tの製造 Z-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^t ３．６１ｇをＤＭＦ２００ml
に溶解し接触還元した。触媒をろ去した溶液に、Z-Tyr-
OH(Z-Tyr-OH・DCHA ３．７ｇより調製），ＨＯＮＢ
１．５２ｇを加え、冷却下にＤＣＣ １．７ｇを加え０
℃で４時間、室温で１２時間反応した。不溶物をろ去し
溶媒を留去した残留物をアセトニトリルを加え結晶化
し、メタノールより再結晶した。

収量３．７２ｇ（７３．８％） Rf¹０．３８ 融点 ２４２−２４３℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−３４．７゜（ｃ＝０．２８，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₃₉Ｈ₄₈Ｏ₁₀Ｎ_６として 計算値：Ｃ，６１．５６；Ｈ，６．３６；Ｎ，１１．０
５ 分析値：Ｃ，６１．２９；Ｈ，６．１９；Ｎ，１０．８
６ （iv）Z-Lys(Boc)-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^tの製造 Z-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^t １．９ｇをＤＭＦ１００
mlに溶解し接触還元した。触媒をろ去した溶液にZ-Lys
(Boc)-OH １．０５ｇ，ＨＯＮＢ６４４mgを加え、冷却
下にＤＣＣ ６５２mgを加え、０℃で４時間、室温で１
２時間撹拌した。不溶物をろ去し、溶媒を留去した残留
物をアセトニトリルを加え結晶化し、メタノールより再
結晶した。

収量１．９ｇ（７６．９％） Rf¹０．３９ 融点 ２１３℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−３４．２゜（ｃ＝０．４０，メタノー
ル） 元素分析 として 計算値：Ｃ，６０．１６；Ｈ，６．９７；Ｎ，１１．２
３ 分析値：Ｃ，６０．２６；Ｈ，６．８３；Ｎ，１０．７
９ （Ｖ）Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^t
の製造 Z-Lys(Boc)-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^t１．８ｇをＤＭ
Ｆ １００mlに溶解し接触還元した。触媒をろ去した溶
液にＺ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ７６２mgとＨＯＮＢ
４３３mgを加え、冷却下にＤＣＣ ４５４mgを加え、０
℃、４時間、室温で１２時間撹拌した。不溶物をろ去し
溶媒を留去した残留物にアセトニトリルを加え粉末とし
てろ取し、メタノールで洗った。

収量１．８２ｇ（８２．２％） Rf¹０．４１ 融点 ＞２５０℃ ▲〔α〕²⁵ _D▼−２６．０゜（ｃ＝０．３０，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₆₁Ｈ₈₈Ｏ₁₆Ｎ₁₀として 計算値：Ｃ，６０．１８；Ｈ，７．２９；Ｎ，１１．５
１ 分析値：Ｃ，５９．９５；Ｈ，７．２８；Ｎ，１１．１
９ （vi）Boc-Asn-Leu-OBzl の製造 H-Leu-OBzl・pTSOH ７．８７ｇ，Boc-Asn-OH４．６４
ｇ，ＨＯＮＢ５．４ｇ，トリエチルアミン３mlをＤＭＦ
３００mlに溶解し冷却下にＤＣＣ ４．５４ｇを加え、
０℃で４時間、室温で８時間かきまぜた。析出物をろ去
し溶媒を留去して得られた残留物を酢酸エチル５００ml
に溶解し、５％−NaHCO₃水，０．２Ｎ ＨＣｌ，水で洗
い無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し結晶を
得、アセトニトリルより再結晶した。

収量７．１ｇ（８１．５％） Rf¹０．７６ 融点 １４０−１４１℃ ▲〔α〕²⁵ _D▼−４２．９゜（ｃ＝０．２３，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₂₂Ｈ₃₃Ｏ_６Ｎ_３として 計算値：Ｃ，６０．６７；Ｈ，７．６４；Ｎ，９．６５ 分析値：Ｃ，６０．５７；Ｈ，７．３３；Ｎ，９．２９ （vii）Z-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OBzlの製造 Boc-Asn-Leu-OBzl ４．３６ｇをトリフルオロ酢酸３０
０mlに溶解し、１０分後に溶媒を留去して得られた残留
物にエーテルを加えろ取した。乾燥ののち酢酸エチルと
ジオキサン（１：１）の混合溶媒２００mlに溶解し、ト
リエチルアミン１．５mlで中和した。この溶液にZ-Glu
(OBu^t)-ONB(Z-Glu(OBu^t)-OH・ＤＣＨＡ５．２ｇより調製
したZ-Glu(OBu^t)-OH，ＨＯＮＢ２．１６ｇ，ＤＣＣ２．
２７ｇより合成）を加え２０時間撹拌した。溶媒を留去
したのち酢酸エチル３００mlに抽出し５％ NaHCO₃水，
０．２Ｎ ＨＣｌ，水で洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥
した。溶媒を留去し残留物にアセトニトリルを加えろ取
した。

収量５．１ｇ（７８．０％） Rf¹０．７７ 融点 １７６−１７８℃ ▲〔α〕²⁵ _D▼−３２．６゜（ｃ＝０．３１，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₃₄Ｈ₄₆Ｏ_９Ｎ_４として 計算値：Ｃ，６２．３７；Ｈ，７．０８；Ｎ，８．５６ 分析値：Ｃ，６１．６８；Ｈ，７．３５；Ｎ，８．３９ （viii）Z-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OHの製造 Z-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OBzl４．６ｇをメタノール２００
mlと酢酸１００mlの混合溶媒に溶解し接触還元した。触
媒をろ去し溶媒を留去した残留物をトリエチルアミン
１．１mlと共に５０％含水ＤＭＦ ９００mlに溶解し、
Z-Ala-ONB(Z-Ala-OH １．８８ｇ，ＨＯＮＢ １．８２
ｇ，ＤＣＣ １．９１ｇより合成）を加え撹拌した。１
６時間後溶媒を留去し残留物に酢酸エチルとアセトニト
リル各１００mlを加えて粉末としてろ取し、アセトニト
リルで洗った。

収量３．７８ｇ（８４．６％） Rf¹０．１８ 融点 ２１３−２１４℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−３９．１゜（ｃ＝０．４６，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₃₀Ｈ₄₅Ｏ₁₀Ｎ_５として 計算値：Ｃ，５６．６８；Ｈ，７．１４；Ｎ，１１．０
２ 分析値：Ｃ，５６．７５；Ｈ，７．１８；Ｎ，１１．３
１ （ix）Z-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OH の製造 Z-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OH ３．５ｇをメタノール３
００mlに溶解し、接触還元した。触媒をろ去し溶媒を留
去したのち、トリエチルアミン０．８２５mlと共に５０
％含水−ＤＭＦ ５００mlに溶解し、この溶液にZ-Glu
(OBu^t)-ＯＮＢ（Z-Glu(OBu^t)-OH・ＤＣＨＡ３．４２ｇよ
り調製したZ-Glu(OBu^t)-OH，ＨＯＮＢ １．４３ｇ，Ｄ
ＣＣ １．５ｇより合成）を加え１６時間撹拌した。溶
媒を留去し、酢酸１mlと共にＤＭＦ １００mlに溶解し
たのち1/3に濃縮しアセトニトリルを加え結晶化し、ア
セトニトリルより再結晶した。

収量３．８ｇ（８４．２％） Rf¹０．１６ 融点 ２０９−２１０℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−３２．１゜（ｃ＝０．２２，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₃₉Ｈ₆₀Ｏ₁₃Ｎ_６として 計算値：Ｃ，５６．０６；Ｈ，７．３７；Ｎ，１０．２
４ 分析値：Ｃ，５６．３６；Ｈ，７．５６；Ｎ，９．９４ （Ｘ）Z-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-O
Hの製造 Z-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OH２．４６ｇをＤ
ＭＦと酢酸（１：１）の混合溶媒３００mlに溶媒し接触
還元した。触媒をろ去し溶媒を留去した残留物を、トリ
エチルアミン１．０mlとともに５０％含水ＤＭＦ ５０
０mlに溶解し、Z-Lys(Boc)-ONB(Z-Lys(Boc)-OH１．３７
ｇ，ＨＯＮＢ ７７８mg，ＤＣＣ ８１７mgより合成）
を加え１６時間反応した。溶媒を留去したのち１０％酢
酸含有ＤＭＦ２００mlに溶解し不溶物をろ去したのち溶
媒を再び留去した。残留物にアセトニトリルを加えろ過
し、メタノールと水から再結晶した。収量２．０ｇ（６
３．５％） Rf¹０．１６融点 ２２７℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−３２．５゜（ｃ＝０．３１，メタノー
ル） 元素分析 として 計算値：Ｃ，５６．７５；Ｈ，７．７２；Ｎ，１０．５
９ 分析値：Ｃ，５６．８３；Ｈ，７．５６；Ｎ，１０．５
６ （xi）Ｚ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕ
^t）−Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OHの製造 Z-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OH１．
９５ｇをＤＭＦと酢酸（１：１）の混合溶媒３００mlに
溶媒し接触還元した。触媒をろ去し溶媒を留去した残留
物をトリエチルアミン０．６mlと共に１０％−含水ＤＭ
Ｆ ３００mlに溶解し、Z-Val-ONB(Z-Val-OH５６０mg，
ＨＯＮＢ４８２mg，ＤＣＣ５０６mgより合成）を加え１
６時間撹拌した。溶媒を留去し残留物を１０％酢酸含有
ＤＭＦ ２００mlに溶解し不溶物をろ去したのち溶媒を
留去した。残留物にアセトニトリルを加えろ取し、メタ
ノールと水から再沈殿した。

収量１．５５ｇ（７２．８％） Rf¹０．１６ 融点 ２３７−２３９℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−３４．１゜（ｃ＝０．４５，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₅₅Ｈ₈₉Ｏ₁₇Ｎ_９として 計算値：Ｃ，５７．５２；Ｈ，７．８１；Ｎ，１０．９
８ 分析値：Ｃ，５７．３４；Ｈ，７．８７；Ｎ，１０．８
７ （xii）Z-Tyr-Val-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-
Asn-Leu-OHの製造 Z-Val-Lys(Boc)-Glu（ＯＢｕ^t）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｏ
Ｂｕ^ｔ）−Asn-Leu-OH１．３６ｇを酢酸１００mlに溶解
し接触還元した。触媒をろ去し溶媒を留去した残留物を
トリエチルアミン０．３６mlとともにＤＭＦ３５０mlに
溶解し、この溶液にZ-Tyr-ONB(Z-Tyr-OH・ＤＣＨＡ７７
５mgより調製したZ-Tyr-OH,ＨＯＮＢ３３７mg，ＤＣＣ
３５４mgより合成）を加え１６時間撹拌した。溶媒を留
去し、１０％酢酸含有ＤＭＦ２００mlに溶解し不溶物を
ろ去したのち再び溶媒を留去した。残留物にアセトニト
リルを加えろ取し、メタノールと水から再沈殿した。

収量１．２１ｇ（７６．９％） Rf¹０．１１ 融点 ２３５−２３７℃（分解） ▲〔α〕²⁵ _D▼−２６．２゜（ｃ＝０．３４，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₆₄Ｈ₉₈Ｏ₁₉Ｎ₁₀として 計算値：Ｃ，５８．６１；Ｈ，７．５３；Ｎ，１０．６
８ 分析値：Ｃ，５８．４５；Ｈ，７．８５；Ｎ，１０．９
０ （xiii）Z-Tyr-Val-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)
-Asn-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu
^tの製造 実施例１（Ｖ）で得たZ-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr-Phe-As
n-Ala-Glu-OBu^t６０９mgをＤＭＦ ５０mlに溶解し接触
還元した。触媒をろ去したにZ-Tyr-Val-Lys(Boc)-Glu(O
Bu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu-OH ６５６mg，ＨＯＢｔ
２９７mgを加え溶解し、氷−食塩浴中で冷却した。冷
却下ＷＳＣＤ・ＨＣｌ ２１１mg，トリエチルアミン
０．１６mgを加え４℃の低温室で４８時間撹拌した。溶
媒を留去し、析出物にアセトニトリルと酢酸エチルとエ
ーテル（１：１：１）の混合溶媒を加えろ取した。

収量０．８ｇ（６７．３％） Rf²０．６８ 融点 ＞２５０℃ ▲〔α〕²⁵ _D▼＋１．９゜（ｃ＝０．１１，ＤＭＦ） 元素分析 Ｃ₁₁₇Ｈ₁₇₈Ｏ₃₂Ｎ₂₀として 計算値：Ｃ，５９．１２；Ｈ，７．５５；Ｎ，１１．７
９ 分析値：Ｃ，５９．０８；Ｈ，７．４０；Ｎ，１１．５
０ （xiv）Boc-Glu-Asp(OBzl)-Pro-OHの製造 Boc-Asp(OBzl)-Pro-OH・ＤＣＨＡ３．０１ｇより調製し
たBoc-Asp(OBzl)Pro-OHをトリフルオロ酢酸３０mlに溶
解し１０分後に溶媒を留去する。６Ｎ塩酸−ジオキサン
１mlを加えよくかきまぜたのちエーテルを加え沈殿を
得、ろ取した。乾燥したのち、トリエチルアミン１．５
mlと共にＤＭＦ１００mlに溶解し、この溶液にBoc-Glu-
ONB（Boc-Gln-OH１．５ｇ，ＨＯＮＢ１．３ｇ，ＤＣＣ
１．３６ｇより合成）を加え２０時間撹拌した。溶媒を
留去し残留物にエーテルと５％NaHCO₃水各１００mlを加
え溶解し、水層を冷却下１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２とし酢酸
エチル２００mlで抽出し、水洗いしたのち乾燥した。溶
媒を留去し残留物をアセトニトリルより結晶化し、同じ
溶媒で再結晶した。

収量１．２９ｇ（４６．９％） Rf²０．２３ 融点 １２９−１３０℃ ▲〔α〕²⁵ _D▼−５７．５゜（ｃ＝０．４２，メタノー
ル） 元素分析 Ｃ₂₆Ｈ₃₆Ｏ_９Ｎ_４として 計算値：Ｃ，５９．９２；Ｈ，６．６１；Ｎ，１０．２
１ 分析値：Ｃ，５６．８０；Ｈ，６．４５；Ｎ，１０．０
１ （xv）PyroGlu-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-
Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OHの製造 Z-Tyr-Val-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ala-Glu(OBu^t)-Asn-Leu
-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OBu^t１７８m
gを１０％含水ＤＭＦ３００mlに溶解し接触還元した。
触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物をBoc-Gln-Asp(OB
u^t)-Pro-OH ６２mg，ＨＯＢ_ｔ ４９mgと共にＮ−メチ
ルピロリドン１０mlに溶解し、冷却下にＷＳＣＤ・ＨＣ
ｌ３４ml，トリメチルアミン０．０３mlを加え２０時間
反応した。溶媒を留去し残留物に水を加え沈殿を得、ろ
取乾燥した。収量１４５mg（６９．０％） これを５％
−含水トリフルオロ酢酸１５mlに溶解し室温で６０分置
いたのち溶媒を留去し２０％含水酢酸５０mlに溶解し接
触還元した。触媒をろ去し溶媒を留去した残留物を水２
００mlに溶解し、２８％アンモニア水１０mlを加え３０
分静置し、触媒を留去し酢酸酸性にし凍結乾燥した。こ
れを５Ｎ酢酸１mlに溶解し、同じ溶媒で充填したセファ
デックスＬＨ−２０（２×８５cm）のカラムに付し展開
した。６７〜９６．４mlの区分を集め凍結乾燥した。こ
れをさらにＴＳＫ−ＬＳ−４１０のカラム（２．１４×
７．５cm＋２．１４×３０cm）を用いるＨＰＬＣで精製
し目的物を得た。収量３６mg（３５．３％） Rf³０．２７， Rf⁴０．１８ ▲〔α〕²⁶ _D▼−５９．８゜（ｃ＝０．１７，０．１Ｎ
−酢酸） アミノ酸分析：Ｌｙｓ ２．９４（３），Ａｓｐ ３．
０５（３），Ｇｌｕ ３．１１（３），Ｐｒｏ ０．９
５（１），Ｇｌｙ １．０（１），Ａｌａ １．９７
（２），Ｖａｌ ０．８８（１），Ｌｅｕ ０．９９
（１），Ｔｙｒ １．６２（２），Ｐｈｅ ０．９８
（１） （平均回収率６８．１％） 実施例２ 免疫原の調製 実施例１で得られたＩＦＮ−γＮ末（４−２１）ペプチ
ド（以下ＩＦＮ−γＮＰ）とウシサイログロブリン（以
下ＴＧ）の結合は、ガロインドらの方法に準じて行なっ
た〔ホルモンメタボリックリサーチ，８，２４１（１９
７６）〕。即ちＩＦＮ−γＮＰ２．５３mgをＴＧ３．８
１mgと混合し、２mlの２００ｍＭのフォスフェートバッ
ファーを加え、氷水中でよく撹拌した。これに蒸溜水で
２．５％濃度になるよう希釈したグルタールアルデハイ
ド２００μｌを、１滴ずつゆっくりと加えた後、３時間
氷水中で撹拌しながら反応させた。反応後、蒸留水で透
析を充分に行ない、凍結乾燥を行なって免疫原とした。

なお、精製されたｒＩＦＮ−γは特願昭５８−１７６０
９１号明細書（特開昭５９−８０６４６）号公報記載の
方法に準じて作製した。

実施例３ 免疫 実施例２で得たｒＩＦＮ−γを、タンパク量として３０
μｇ，フロインドコンプリートアジュバント（ＦＣＡ）
とよく混合し、７〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスの皮
下に接種した（初回接種）。初回接種の２週後、同量の
ｒＩＦＮ−γをフロインドインコンプリートアジュバン
ド（ＦＩＡ）とよく混合し、皮下に接種した（二次接
種）。三次・四次接種は２週間隔で二次接種と同じ方法
で行なった。五次，六次接種は、実施例２で得たＩＦＮ
−γＮＰ−ＴＧ結合物をタンパク量として３０μｇ，Ｆ
ＩＡとよく混合し、皮下に２週間隔で接種した。六次接
種の二週後，ｒＩＦＮ−γ２５μｇ，ＩＦＮ−γＮＰ−
ＴＧ結合物２０μｇを０．５mlの生理食塩水に浮遊さ
せ、静脈内に最終免疫を行なった。

実施例４ ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体アッセイ法 実施例３の方法で免疫したマウス血清あるいは実施例５
で得られるハイブリドーマ培養上清中の抗体活性はエン
ザイム リンクド イムノソーベント アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）法を用いて検索した。即ち、実施例２で記載の
ｒＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−γＮＰを１５μｇ／mlにな
るよう０．１Ｍ重炭酸ナトリウムを含有したリン酸緩衝
液(pH8.0)に浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートの
各ウエルに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間反応
させた。反応後、ウエルの余剰の結合部位をふさぐため
２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を１
００μｌずつ分注し、４℃で２４時間処理し、ＥＬＩＳ
Ａに使用するプレートを作製した。

以上のように調製したプレートに血清あるいはハイブリ
ドーマ培養上清１００μｌを加え、24℃で３時間反応さ
せた。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、ホースラディ
シュベルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を各ウエルに１００μｌ加え、室温で３
時間反応させた。反応終了後、各ウエルをリン酸緩衝液
でよく洗浄し、１０mlの０．１Ｍクエン酸緩衝液に２２
mgのオルソフェニレンジアミン，１０μｌのＨ_２Ｏ_２を
加えた酵素基質溶液１００μｌを各ウエルに加えて、酵
素反応を室温で１５分行ない、４規定硫酸で反応を停止
させた。反応停止後、タイターテックマルチスキャン
（フロー社製）を用いて波長４９２ｎｍで発色色素量を
測定し、抗体の活性を判定した。

実施例５ 細胞融合および抗体のアッセイ 実施例３の最終免疫の３日後マウスの脾臓を摘出し、ス
テンレスメッシュで圧迫，過し、イーグルズ・ミニマ
ム・エッセンシャルメディウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、
脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、
ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−×６３，
Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント トピッ
クス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロ
ジー，８１，１−７，（１９７８）〕。細胞融合は、原
法〔ネイチャー，２５６，４９５−４９７，（１９７
５）〕に準じて行なった。即ち、リンパ球含有脾臓細胞
およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３
度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を５：１になるよう
混合して、８００回転で１５分間遠心を行なって細胞を
沈殿させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐ
し、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）6000
^-（コッホライト社製）を０．３ml加え、３７℃温水槽
中で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分
２mlの割合でＭＥＭを添加し、合計１２mlのＭＥＭを加
いた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した。こ
の細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ１
６４０メディウム（ＲＰＭＩ１６４０−１０ＦＣＳ）に
Ｐ３Ｕ１が１ml当り２×１０^５個になるよう浮遊し、２
４穴マルチデイシュ（リンブロ社製）に１ウエル１mlず
つ１２０ウエルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５
％炭酸ガスフラン器中培養した。２４時間後、ＨＡＴ
（ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ，アミノプリテン４×１
０^-7Ｍ，チミジン１．６×１０^-5Ｍ）を含んだＰＲＭＩ
１６４０−１０ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウエル当
り１mlずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始
した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３，５，７日後に旧
液を１ml捨てたあと、１mlのＨＡＴ培地を添加すること
により継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後
１０〜１４日で播種した全ウエルに認められ、培養液が
黄変したとき（約１×１０^６／ml）、上清を採取し、ｒ
ＩＦＮ−γをコートしたマイクロプレートを用いたＥＬ
ＩＳＡ法（実施例４記載）で、抗体の有無を検討した。
抗体活性は、１２０ウエル中１５ウエルに認められた
（第１図）。

次に、得られたこれら１５ウエルからの抗体のうち、Ｉ
ＦＮ−γのＮ末部を認識する抗体を選択するため、各々
の上清５０μｌと、ＩＦＮ−γＮＰまたはＩＦＮ−γＣ
末（１３１−１４６）ペプチド（以下ＩＦＮ−γＣＰ）
〔特願昭58-176091号（出願日，昭和５８年９月２２
日）明細書（特開昭59-80646）号公報参照〕をそれぞれ
２０μｇ／mlに調製したもの５０μｌとを混合し、３７
℃で１時間反応させた後、この混合液中の抗体価を、上
記のＥＬＩＳＡ法で検討した。なお対照はＩＦＮ−γＮ
ＰまたはＩＦＮ−γＣＰ溶液の代りにＨＡＴ培地を用い
た。この実験でもし、抗体がＩＦＮ−γＮ末部を認識す
るものならば、ＩＦＮ−γＮＰにより抗体の活性基がマ
スクされ、マイクロプレート上のｒＩＦＮ−γに結合し
ない筈である。結果は、１５ウエル中いくつかのウエル
の抗体のｒＩＦＮ−γへの結合がＩＦＮ−γＮＰによっ
て阻害されることが分り、このうちＷＮ_γ２−７６では
著明に抑制された。また対照として用いたＩＦＮ−γＣ
末部を認識するγ３−１１．１モノクローナル抗体〔特
願昭５８−１７６０９１号（出願日，昭和５８年９月22
日）明細書参照〕は、ＩＦＮ−γＣＰにより著明に抑制
された（第１表）。

なお、ｒＩＦＮ−γ単独で過免疫したマウスの脾臓細胞
を用いた融合実験からは、ＩＦＮ−γＮＰに結合し、か
つｒＩＦＮ−γに結合する抗体を産生するハイブリドー
マを得ることができなかった。

実施例６ クローニング 実施例５で得られたＷＮ_γ２−７６ハイブリドーマを、
限界希釈法によりクローニングを行なった。即ち、ハイ
ブリドーマが２個／mlになるようＲＰＭＩ−２０ＦＣＳ
に浮遊させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に
１ウエル当り、０．１mlずつ分注した。分注する際、フ
ィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウ
エル当り５×１０^５個になるように加えた。このように
して、約２週間後には細胞の増殖が認められるようにな
り、上清を採取して、抗体の有無を実施例４記載のＥＬ
ＩＳＡ法で調べた。その結果、得られた７１クローン中
１０クローンに抗体活性を認め、これらの抗体全てが、
ｒＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γＮＰを認識することが分
った（第２図）。

実施例７ 抗体産生ハイブリドーマの腹水化および腹水
からの抗体精製 クローニングによって得られたマウス Ｂ ハイブリド
ーマＷＮ_γ２−７６．５３細胞１×１０^６個を、あらか
じめ０．５mlのミネラルオイルを腹腔内に投与しておい
たＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に接種することにより腹
水化を行なった。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０
日後、腹水を採取した。得られた腹水７mlから、ステー
リンら〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー，２５６，９７５０−９７５４，（１９８１）〕の方
法に準じてモノクローナル抗体を精製した。まず腹水か
らフイブリン様物質を除去するため１０，０００回転１
５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（ＰＢＳ：
８．１ｍＭ-NaH₂PO₄，１．５ｍＭ KH₂PO₄，２．７ｍＭ
ＫＣｌ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で２８
０ｎｍの紫外部吸収（Ａ₂₈₀ ）が１２〜１４の値を示す
濃度に希釈した。希釈後サンプルに飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を４７％の濃度になるように加え、４℃で撹拌し
ながら６０分間塩析を行ない、その後遠心（１０，００
０回転，１５分間）を行なって沈澱物を得た。沈澱物を
５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ
７．９）に溶遊し、同溶液２に対して透析を行なっ
た。２時間後、２の新しい同じ透析液に換え、さらに
１５時間透析を行なった。透析後、沈澱を除去するため
１０，０００回転１５分間遠心を行ない、上清をＡ₂₈₀
の値が２０〜３０の濃度になるように調整した。このサ
ンプルを充分量の５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有トリス緩衝溶
液で順化した１３mlのＤＥＡＥセルロースカラム（ワッ
トマンＤＥ₅₂）にかけ、５０ｍＭ ＮａＣｌ 含有トリ
ス緩衝溶液でよく洗った後、５０ｍＭ−５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液を用いて１．５
ml／分の流出速度で分画を行なって素通り分画を濃縮
し、モノクローナル抗体ＷＮ_γ２−７６．５３を得た。
抗体の純度の確認にはラエムリらの方法〔ネイチャー，
２２７，６８０−６８５,(1970）〕に準じてＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。すなわち硫安
塩析し、ＤＥＡＥセルロースカラムで素通りした分画
を、２−メルカプトエタノールで還元を行ない１０％Ｓ
ＤＳゲル，１８０ボルト，２．５時間泳動を行なった。
その結果、分子量約５２キロダルトン前後にＨ鎖，約２
８キロダルトン前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた
（第３図）。

実施例８ モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する結
合能および中和能 実施例７で精製されたモノクローナル抗体ＷＮ_γ２−７
６．５３が、ＩＦＮ−γに結合し、かつ中和する能力が
あるかどうかを次の方法で検討した。

結合能：ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を結合させた３％セ
ルロース溶液５００μｌに精製した抗体を５００μｌ
（約２５μｇの抗体含有）加え、４℃で２４時間反応さ
せた。反応後セルロースを生理食塩水でよく洗浄し、１
１００Ｕ／mlのＩＦＮ−γを加え、４℃で２４時間反応
させ、上清中のＩＦＮ活性を測定した。ＩＦＮ−γサン
プルとして、実施例２記載のｒＩＦＮ−γおよびヒト末
梢血リンパ球をコンカナバリンＡ４０μｇ／mlと１２−
０−テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート
１５ｎｇ／mlで刺激して７２時間後採取した上清（ｎＩ
ＦＮ−γ）を用いた。また対照として５００μｌのＩＦ
Ｎ−α（ナマルバ細胞をセンダイウイルス１０ＨＡユニ
ットで刺激して４８時間後の培養上清で５５０Ｕ／mlの
ＩＦＮ−αを含む），５００μｌのＩＦＮ−β（リー・
バイオモレギュラー・リサーチラボラトリーズ社から購
入したもの１１００Ｕ／mlのＩＦＮ−βを含む）を用い
た。ＩＦＮ活性の測定は、マイクロプレートを用いた細
胞変性効果（ＣＰＥ）リーディング法で測定した〔アプ
ライド マイクロバイオロジー，１６，１７０６−１７
０７，（１９６８）〕。すなわち、９６穴マイクロプレ
ート（ヌンク社製）全てのウエルに５０μｌのＭＥＭを
入れ、最初のウエルにＩＦＮサンプルを５０μｌ加え
て、連続的に２倍希釈を行なった。このようにした各ウ
エルに、ＷＩＳＨ細胞を２０％ＦＣＳ含有ＭＥＭに１ml
当り４×１０^５個になるよう調整した細胞浮遊液５０μ
ｌを加え、２４時間，３７℃，炭酸ガスフラン器で培養
した。培養後、水泡性口内炎ウイルス（ニュージャーシ
ー株）を２０００ＴＣＩＤ₅₀（テイツシューカルチュア
インフェクテイングドーズ５０）になるようＭＥＭで調
整し、その５０μｌを各々のウエルに加え、３７℃，炭
酸ガスフラン器内で培養した。約３５時間後、ＩＦＮサ
ンプルを加えていないウエルの細胞が１００％ＣＰＥを
起こした時点で、各ウエルのＣＰＥを顕微鏡で観察し、
５０％のＣＰＥを起こしているウエルのＩＦＮ−サンプ
ルの希釈数の逆数をもってＩＦＮの力価とした。

中和能：上記の２種のＩＦＮ−γ（ｎＩＦＮ−γ，ｒＩ
ＦＮ−γ），ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β（力価は何れ
も上記と同じ）それぞれ５００μｌに、精製した抗体５
００μｌ（約２５μｇの抗体含有）を加え、４℃で２４
時間反応させた。反応後反応液中のＩＦＮ活性をＣＰＥ
リーディング法で測定した。

以上の試験から、ＷＮ_γ２−７６．５３モノクローナル
抗体は、ｒＩＦＮ−γの約９０％，ｎＩＦＮ−γの約６
０％を結合させた（第２表）。また当抗体は、ｒＩＦＮ
−γの約９０％，ｎＩＦＮ−γの約６０％を中和した
（第３表）。一方ＩＦＮ−α，βに対しては、結合能も
中和能も示さなかった（第２，３表）。

実施例９ モノクローナル抗体のサブクラス ＷＮ_γ２−７６．５３モノクローナル抗体のサブクラス
は、実施例７の方法で精製した抗体とウサギ抗マウスＩ
ｇＧ１，Ｇ２ａ，Ｇ２ｂ，Ｇ３抗体（マイルス社）との
寒天内沈降反応（イムノロジカルメソット ゲル ディ
フュージョンテクニック ブラックウエルオックスフォ
ード １９６４年）で検討した。結果は、モノクローナ
ル抗体とウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体との間に著名な１
つのバンドが認められ、他の抗マウスＩｇＧ抗体との間
には、バンドの形成はみられなかった（第４表）。従っ
て当モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１サブクラスに属す
るものであることが判明した。

実施例10 本発明のモノクローナル抗体を用いたＩＦＮ
−γの定量 （ｉ）競合法 ＷＮ_γ２−７６．５３モノクローナル抗体に対する資料
中のＩＦＮ−γと固相に固定されたｒＩＦＮ−γとの競
合による定量法 実施例４に記載の方法でｒＩＦＮ−γを結合させたプレ
ートに、最大量結合する抗体の約５０％量の抗体を含む
１００μｌの抗体（ＷＮ_γ２−７６．５３）溶液と種々
の濃度（７，２８，１１１，４４５，１．８×１０^３，
７×１０^３，２．９×１０^４，１×１０^５，４．５×１
０^４Ｕ／ml）に調製したｒＩＦＮ−γを３７℃で１時間
反応させた混合液を加え、室温で３時間反応させた。反
応後、生理食塩水でよく洗浄し、ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でラベルした抗マウスＩｇＧ
抗体を１００μｌ加え室温で反応させた。反応終了後、
ウエルを生理食塩水でよく洗い、実施例４記載の方法で
酵素反応を行ない色素量をタイターテックマルチスキャ
ンで定量した。第４図は、その結果を示したもので本法
を用いることにより、約１０〜５×１０^３Ｕ／ml濃度の
ＩＦＮ−γが定量可能であった。

（ii）サンドウィッチ法 得られたＩＦＮ−γＮ末端部を認識するモノクローナル
抗体ＷＮ_γ２−７６．５３と実施例５記載のＩＦＮ−γ
Ｃ末端部を認識するモノクローナル抗体γ３−１１．１
を用いたサンドイッチ法によるＩＦＮ−γの定量を試み
た。即ち、ＷＮ_γ２−７６．５３抗体を１５μｇ／mlに
なるよう０．１Ｍ重炭酸ナトリウムを含有したリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、この１００μｌを９６
ウエルマイクロプレートの各ウエルに分注し、４℃で２
４時間反応させた。反応後、ウエルの余剰の結合部位を
ふさぐため２％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液を１００μｌず
つ分注し、４℃で２４時間処理した。以上のように処理
したプレートに、種々の濃度（７．２×１０^３，１．８
×１０^３，４．５×１０^２，１．１×１０^２，２８，７
Ｕ／ml）に調整したｒＩＦＮ−γを加え、室温で３時間
反応させた。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、ナカネ
らの方法〔ザ ジャーナル オブ ヒストケミストリー
アンド サイトケミストリー，２２，１０８４−１０
９１，（１９７４）〕を用いてＨＲＰでラベルしたγ３
−１１．１抗体を１００μｌ加え、室温で３時間反応さ
せた。反応終了後、ウエルを生理食塩水でよく洗った
後、以下実施例４記載と同様の方法で酵素反応を行な
い、色素量をマルチスキャンで定量した。第５図は、そ
の標準曲線を示したもので、この様にしてＩＦＮ−γの
定量が可能であることが判明した。

実施例11 抗体カラムの調製 実施例７の要領で精製された素通り分画のモノクローナ
ル抗体３７ml（６６mg）を４℃で０．１Ｍ NaHCO₃−
０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．９）に対して一晩透析
を行った。一方、アフイゲル−１０（バイオ・ラド社）
１２mlをグラスフイルターを用いて充分水洗を行った
後、０．１Ｍ NaHCO₃（ｐＨ ８．３）に浮遊させ前記
抗体とを混合し、４℃で５時間、ゆっくり撹拌しながら
反応させた。その後、グラスフイルターを用いて０．１
Ｍ NaHCO₃−０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）でよ
く洗浄した。反応させたゲルに０．１Ｍエタノールアミ
ン-0.15Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を２５ml加え、４
℃，１時間撹拌し、残存するかも知れない未反応の活性
基をブロックした。その後ゲルをＰＢＳでよく洗浄し、
０．１％NaH₃を含むＰＢＳ２５mlに懸濁し、４℃で保存
した。加えた抗体量と回収された液中の抗体量から、
ゲル１ml当り５．０mgの抗体が結合していることが判明
した。この様にして得た反応物をカラムに充め、抗体カ
ラムとして使用した。

実施例12 本発明のモノクローナル抗体を用いたｒＩＦ
Ｎ−γの精製 E.ｃｏｌｉ ＲＲ１／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ，ｐＲＣ２
３１／ＩＦＮ−γ〔特願昭５８−４９６８１号（出願
日，昭和５８年３月２３日）明細書（特開昭５８−１８
９１９７号公報）参照〕の凍結保存菌体１ｇを７Ｍ塩酸
グアニジンを含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７．
２）３mlに懸濁し、４℃で１時間撹拌した。得られた懸
濁液を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清３
mlを得た。得られた上清３mlに０．１４Ｍ ＮａＣｌお
よび０．００３Ｍ ＫＣｌ を含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）２０７mlを加えて上清を希釈した。
この希釈液を１０，０００×ｇ，１０分間遠心分離して
不溶物を除いたのち、実施例１１で得た抗体カラム（Ｗ
Ｎ_γ２−７６．５３，カラム容積８ml）にかけた。０．
５Ｍ塩酸グアニジンを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）２４mlでカラムを洗浄した。ついで、２．０
Ｍ塩酸グアニジンを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）２０mlでカラムからｒＩＦＮ−γを溶出し、ｒ
ＩＦＮ−γを含む溶出液１０mlを得た（蛋白量５．３m
g，比活性３．２×１０^６Ｕ／mg）。この溶出液をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果、標
品として用いた成熟型ｒＩＦＮ−γ〔１８Ｋ ｒＩＦＮ
−γ；米国特許出願第５３４０４０号（出願日，１９８
３年９月２０日）明細書（米国特許第４，６８１，９３
０号公報）参照〕と同じ移動度を示す位置に蛋白のバン
ドが検出された。なお、他に蛋白のバンドはほとんど認
められなかった。

実施例13 モノクローナル抗体を用いた１５ＫｒＩＦＮ
−γの精製 E.ｃｏｌｉ ＲＲ１／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ，ｐＲＣ２
３１／ＩＦＮ−γ〔特願昭５８−４９６８１号（出願
日，昭和５８年３月２３日）明細書（特開昭５８−１８
９１９７号公報）参照〕の凍結保存菌体２５ｇを１０％
シュクロース，０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，１０ｍＭスペルミジンおよび２ｍＭフェニルメチル
スルフォニルフルオライドを含む０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２５０mlに懸濁し、均一な懸濁
液となった時点でリゾチーム５０mgを添加して４℃で１
時間撹拌した後、３７℃で５分間保温し、これを更に０
℃で４０秒間超音波破砕器で処理した。この溶菌液を２
８，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清２５０mlを
得た。この上清に１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む。０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）（ＴＥＮ）５００mlを加えて上清を希釈したの
ち、この希釈液を実施例１１で得た抗体カラム４０mlに
かけた。ＴＥＮ１２０mlでカラムを洗浄したのち、さら
に１．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％Tween２０を含む
０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１２０ml
で洗浄した。ついで、２Ｍ塩酸グアニジンを含む０．０
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１２０mlで抗ウイルス活性を有
するポリペプチド画分６０mlを溶出した。（蛋白量１
３．３mg，比活性２．７×１０⁶Ｕ／mg）該画分を還元
条件 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分析した結果、分子量約１６，０００および約１５，０
００付近に２本の主要蛋白バンドが、分子量約１８，０
００および約１７，０００付近にうすい蛋白のバンドが
それぞれ検出された。該画分に５倍量（ｖ／ｖ）のエタ
ノールを添加し４℃で１６時間放置後、析出した蛋白を
遠心分離により集め、少量の２％ＳＤＳ，１０％グリセ
ロールおよび２％ジチオスレイトールを含む０．０６２
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）に溶解した。こ
の溶解度を常法に従って調製用ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（１２．５％ゲル，厚さ３mm）にかけ
た。一枚のスラブゲル当り約０．４mgの蛋白量をかけて
電気泳動した。電気泳動後、ゲルを０．１％クマシーブ
リリアントブル−Ｒ−２５０により染色し分子量約１
５，０００付近に泳動した蛋白のバンドをカミソリで切
り出したのち、細かくくだいて０．０５％ＳＤＳ溶液
（ｐＨ７．４）に懸濁させた。この懸濁液を４℃で４８
時間撹拌したのち、紙過により得られた液に９倍
量（ｖ／ｖ）のエタノールを添加した。生じた沈澱を遠
心分離により集めて、少量の０．１％ＳＤＳ溶液に溶解
した（蛋白量１．３mg，比活性１．０×１０^６Ｕ／m
g）。該溶液を還元条件下のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析したところ、標品として用い
た１５ＫｒＩＦＮ−γフラグメント〔米国特許出願第５
３４０３８号（出願日，１９８３年９月２０日）明細書
（米国特許第４，６０４，２８４号公報）参照〕と同じ
移動度を示す位置（分子量約１５，０００に相当する位
置）に１本の蛋白のバンドが検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例５に記載したハイブリドーマ上清のｒＩ
ＦＮ−γとの結合能測定の結果を、第２図は実施例６に
記載したＩＦＮ−γＮＰに対する抗体産生ハイブリドー
マ各クローンの産生する抗体の活性比較の結果を、第３
図は実施例７で得られた精製モノクローナル抗体ＷＮ_γ
２−７６．５３のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を、第４図は実施例１０（ｉ）の本発明モノ
クローナル抗体を用いる競合法によるＩＦＮ−γの定量
の結果を、第５図は実施例１０（ii）の２種のモノクロ
ーナル抗体を用いるサンドウィッチ法によるＩＦＮ−γ
定量の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，10（８），2487−2501（1982) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，129（６），2357−2359（1982) Ｎａｔｕｒｅ，256，495−497（1975)

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 （式中、ＺはPyro Glu またはGlnを示す。）で表わされ
   るポリペプチドに対するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】ヒトγ型インターフェロンおよびそのＣ末
   端部分を欠くフラグメントと結合する特許請求の範囲第
   １項記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】粗製のヒトγ型インターフェロンまたは
   （および）そのＣ末端部分を欠くフラグメントを、式 （式中、ＺはPyro Glu または Gln を示す。）で表わさ
   れるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて
   精製することを特徴とするヒトγ型インターフェロンま
   たは（および）そのＣ末端部分を欠くフラグメントの精
   製法。
4. 【請求項４】抗体として式 （式中、ＺはPyro Glu または Gln を示す。）で表わさ
   れるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いる
   ことを特徴とするラジオイムノアッセイ法またはエンザ
   イムイミイムノアッセイ法によるヒトγ型インターフェ
   ロンまたは（および）そのＣ末端部分を欠くフラグメン
   トの検出法。