JP2783385B2 - ヒト血管浸透性因子のｃＤＮＡ - Google Patents
ヒト血管浸透性因子のｃＤＮＡInfo
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- JP2783385B2 JP2783385B2 JP8046220A JP4622096A JP2783385B2 JP 2783385 B2 JP2783385 B2 JP 2783385B2 JP 8046220 A JP8046220 A JP 8046220A JP 4622096 A JP4622096 A JP 4622096A JP 2783385 B2 JP2783385 B2 JP 2783385B2
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- JP
- Japan
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- hvpf
- cells
- cdna
- vpf
- vascular permeability
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規ヒト血管浸透
性因子および完全な大きさのヒト血管浸透性因子を与え
るｃＤＮＡクローンに関するものである。
性因子および完全な大きさのヒト血管浸透性因子を与え
るｃＤＮＡクローンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】血管浸透性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐ
ｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒｓ（ＶＰＦ
ｓ））は、種々の腫瘍から最初に得られた蛋白質であ
り、温血動物の皮下にナノグラム量を注射した場合に、
血管の浸透性の急速かつ可逆的な増大を引き起こす。Ｖ
ＰＦ活性は、モルモット、ハムスターおよびマウスの腫
瘍腹水液中に見出され、これらの腫瘍および種々の腫瘍
細胞株によりＳｅｎｇｅｒらのＳｃｉｅｎｃｅ ２１
９、９８３−９８５（１９８３）に従ってインビトロで
分泌される。米国特許第４，４５６，５５０号には、下
記の性質を有する精製ＶＰＦが記載されている： （ａ） ＮａＣｌ濃度が線形的に変化する水溶液（０．
０１Ｍ Ｎａ3 ＰＯ 4、ｐＨ７）において、ＶＰＦは、
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィカラムから
０．４ＮａＣｌを中心とするピーク中に溶出され； （ｂ） 濃度が変化するＮａ3 ＰＯ 4の水溶液、ｐＨ
７．０において、ＶＰＦは、ヒドロキシアパタイトカラ
ムから０．２５Ｍ Ｎａ3 ＰＯ 4を中心とするピーク中
に溶出され；および （ｃ） ポリアクリルアミドスラブゲル（０．３７５Ｍ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳ）にお
けるＳＤＳゲル電気泳動に３５ミリアンペアおよび４℃
にてかけられた場合に、ＶＰＦは、３４，０００と４
５，０００ドルトンとの間の分子量に対応する領域に位
置する。
ｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒｓ（ＶＰＦ
ｓ））は、種々の腫瘍から最初に得られた蛋白質であ
り、温血動物の皮下にナノグラム量を注射した場合に、
血管の浸透性の急速かつ可逆的な増大を引き起こす。Ｖ
ＰＦ活性は、モルモット、ハムスターおよびマウスの腫
瘍腹水液中に見出され、これらの腫瘍および種々の腫瘍
細胞株によりＳｅｎｇｅｒらのＳｃｉｅｎｃｅ ２１
９、９８３−９８５（１９８３）に従ってインビトロで
分泌される。米国特許第４，４５６，５５０号には、下
記の性質を有する精製ＶＰＦが記載されている： （ａ） ＮａＣｌ濃度が線形的に変化する水溶液（０．
０１Ｍ Ｎａ3 ＰＯ 4、ｐＨ７）において、ＶＰＦは、
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィカラムから
０．４ＮａＣｌを中心とするピーク中に溶出され； （ｂ） 濃度が変化するＮａ3 ＰＯ 4の水溶液、ｐＨ
７．０において、ＶＰＦは、ヒドロキシアパタイトカラ
ムから０．２５Ｍ Ｎａ3 ＰＯ 4を中心とするピーク中
に溶出され；および （ｃ） ポリアクリルアミドスラブゲル（０．３７５Ｍ
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳ）にお
けるＳＤＳゲル電気泳動に３５ミリアンペアおよび４℃
にてかけられた場合に、ＶＰＦは、３４，０００と４
５，０００ドルトンとの間の分子量に対応する領域に位
置する。
【０００３】従って、前述の性質を有するＶＰＦは、モ
ルモット腫瘍細胞培養物の無血清調節培地から約１，８
００倍に、または腹水から１０，０００倍に、次の一連
の工程： （ａ） ヘパリン−セファロースカラムによるアフィニ
ティクロマトグラフィ； （ｂ） ヒドロキシアパタイトカラムによるクロマトグ
ラフィ；および （ｃ） 硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気
泳動 により精製される。この特許によると、わずか２００ｎ
ｇ（５×１０-12 モル）の同精製ＶＰＦは、１．２５μ
ｇ（４×１０-9モル）のヒスタミンに相当するまで血管
浸透性が増大している。ヒスタミンは、Ｍｉｌｅｓおよ
びＭｉｌｅｓのＪ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１８、２２８−
２５６（１９５２）に記載された標準的浸透性媒体であ
る。該ＶＰＦは、傷の回復等における血液栄養物の要求
の増大に伴って、栄養物を組織に到達させ得る点におい
て、臨床的価値を有するといわれている。
ルモット腫瘍細胞培養物の無血清調節培地から約１，８
００倍に、または腹水から１０，０００倍に、次の一連
の工程： （ａ） ヘパリン−セファロースカラムによるアフィニ
ティクロマトグラフィ； （ｂ） ヒドロキシアパタイトカラムによるクロマトグ
ラフィ；および （ｃ） 硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気
泳動 により精製される。この特許によると、わずか２００ｎ
ｇ（５×１０-12 モル）の同精製ＶＰＦは、１．２５μ
ｇ（４×１０-9モル）のヒスタミンに相当するまで血管
浸透性が増大している。ヒスタミンは、Ｍｉｌｅｓおよ
びＭｉｌｅｓのＪ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１８、２２８−
２５６（１９５２）に記載された標準的浸透性媒体であ
る。該ＶＰＦは、傷の回復等における血液栄養物の要求
の増大に伴って、栄養物を組織に到達させ得る点におい
て、臨床的価値を有するといわれている。
【０００４】ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ
のＳｃｉｅｎｃｅ ２３５、４４２−４４７（１９８
７）によると、ＶＰＦは、フィブリノーゲンを含む蛋白
質類の血管からの漏出を招き、これにより脈管形成にお
いて役割を演ずるフィブリンゲルの形成を開始させる。
ＤｖｏｒａｋらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２（１）、
１６６−１７４（１９７９）；ＤｖｏｒａｋのＮ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５、１６５０−１６５９（１９
８６）；ＫａｄｉｓｈらのＴｉｓｓｕｅ＆Ｃｅｌｌ １
１、９９（１９７９）；およびＤｖｏｒａｋらのＪ．Ｎ
ａｔｌ．Ｃｅｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．６２、１４５９−１
４７２（１９７９）も参照。
のＳｃｉｅｎｃｅ ２３５、４４２−４４７（１９８
７）によると、ＶＰＦは、フィブリノーゲンを含む蛋白
質類の血管からの漏出を招き、これにより脈管形成にお
いて役割を演ずるフィブリンゲルの形成を開始させる。
ＤｖｏｒａｋらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２（１）、
１６６−１７４（１９７９）；ＤｖｏｒａｋのＮ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５、１６５０−１６５９（１９
８６）；ＫａｄｉｓｈらのＴｉｓｓｕｅ＆Ｃｅｌｌ １
１、９９（１９７９）；およびＤｖｏｒａｋらのＪ．Ｎ
ａｔｌ．Ｃｅｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．６２、１４５９−１
４７２（１９７９）も参照。
【０００５】共通の譲受人に譲渡された出願において、
内皮細胞を成長刺激量の高度精製されたＶＰＦに接触さ
せることからなる内皮細胞の成長刺激方法が与えられて
いる。モルモット腫瘍細胞から誘導された該高度精製Ｖ
ＰＦは、以下の特徴を有する： （ａ） 硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）による測定において約３４，０
００−４０，０００のＭｒを有し； （ｂ） ジスルフィド結合蛋白質２量体であり； （ｃ） 次のＮ−末端アミノ酸配列：
内皮細胞を成長刺激量の高度精製されたＶＰＦに接触さ
せることからなる内皮細胞の成長刺激方法が与えられて
いる。モルモット腫瘍細胞から誘導された該高度精製Ｖ
ＰＦは、以下の特徴を有する： （ａ） 硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）による測定において約３４，０
００−４０，０００のＭｒを有し； （ｂ） ジスルフィド結合蛋白質２量体であり； （ｃ） 次のＮ−末端アミノ酸配列：
【化３】 を有し；および （ｄ） 培養において内皮細胞に対して実質的に分裂促
進剤活性を示す。
進剤活性を示す。
【０００６】前述した高度精製モルモットＶＰＦは、ｇ
ＶＰＦとも称され、モルモット腫瘍細胞の無血清調節培
養培地から次の一連の工程において単離された： （ａ） ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムによ
る前記調節培養培地のアフィニティクロマトグラフィ； （ｂ） 前記アフィニティクロマトグラフィからのＶＰ
Ｆ活性分画のＴＳＫ−５−ＰＷカラムによる陽イオン交
換クロマトグラフィ； （ｃ） 前記陽イオン交換クロマトグラフィからのＶＰ
Ｆ活性分画のＶｙｄａｃ Ｃ4 逆相ＨＰＬＣカラムによ
る高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）；および （ｄ） 前記Ｃ4 ＨＰＬＣからのＶＰＦ活性分画のＶｙ
ｄａｃ Ｃ18逆相ＨＰＬＣカラムによるＨＰＬＣ。
ＶＰＦとも称され、モルモット腫瘍細胞の無血清調節培
養培地から次の一連の工程において単離された： （ａ） ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムによ
る前記調節培養培地のアフィニティクロマトグラフィ； （ｂ） 前記アフィニティクロマトグラフィからのＶＰ
Ｆ活性分画のＴＳＫ−５−ＰＷカラムによる陽イオン交
換クロマトグラフィ； （ｃ） 前記陽イオン交換クロマトグラフィからのＶＰ
Ｆ活性分画のＶｙｄａｃ Ｃ4 逆相ＨＰＬＣカラムによ
る高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）；および （ｄ） 前記Ｃ4 ＨＰＬＣからのＶＰＦ活性分画のＶｙ
ｄａｃ Ｃ18逆相ＨＰＬＣカラムによるＨＰＬＣ。
【０００７】共通の譲受人に譲渡された出願において、
ｇＶＰＦの特定のペプチド断片を免疫原として用いる、
ｇＶＰＦに対する抗体の製造方法が与えられている。Ｌ
ｏｂｂらのＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３６、４７３−
４７８（１９８５）は、ヒト分泌腺悪性腫瘍細胞株ＨＴ
−２９由来の分子量４５，０００を有する部分精製ＶＰ
Ｆを記述している。しかしながら、このＶＰＦは、Ｓｅ
ｎｇｅｒおよびＤｖｏｒａｋによりモルモット腫瘍細胞
材料から誘導されたＶＰＦのようには、固定されたヘパ
リンに対して結合しない。ＳｅｎｇｅｒらのＣａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．４６、５６２９−５６３２（１９８６）
は、種々のヒト腫瘍細胞株、すなわちヒト骨肉腫、小疱
肉腫、頸部肉腫および繊維肉腫細胞からのＶＰＦの製造
を記述している。しかしながら、これらのヒト細胞株の
いずれもがＶＰＦ産生についてモルモット細胞株１０ほ
どに活性ではないことが分かった。
ｇＶＰＦの特定のペプチド断片を免疫原として用いる、
ｇＶＰＦに対する抗体の製造方法が与えられている。Ｌ
ｏｂｂらのＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３６、４７３−
４７８（１９８５）は、ヒト分泌腺悪性腫瘍細胞株ＨＴ
−２９由来の分子量４５，０００を有する部分精製ＶＰ
Ｆを記述している。しかしながら、このＶＰＦは、Ｓｅ
ｎｇｅｒおよびＤｖｏｒａｋによりモルモット腫瘍細胞
材料から誘導されたＶＰＦのようには、固定されたヘパ
リンに対して結合しない。ＳｅｎｇｅｒらのＣａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．４６、５６２９−５６３２（１９８６）
は、種々のヒト腫瘍細胞株、すなわちヒト骨肉腫、小疱
肉腫、頸部肉腫および繊維肉腫細胞からのＶＰＦの製造
を記述している。しかしながら、これらのヒト細胞株の
いずれもがＶＰＦ産生についてモルモット細胞株１０ほ
どに活性ではないことが分かった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の概略説明 本発明によって、完全な大きさのヒト血管浸透性因子
（ｈＶＰＦ）を表わすｃＤＮＡクローンが明らかにされ
た。このクローンＶＰＦ−４は、約１３００塩基体（ｂ
ｐ）の見かけの５′−非コード領域、６４５ｂｐの開か
れた読み枠、停止コドンおよび約１６００ｂｐの３′−
非コード領域を有する約３５５０ｂｐを含有する。
（ｈＶＰＦ）を表わすｃＤＮＡクローンが明らかにされ
た。このクローンＶＰＦ−４は、約１３００塩基体（ｂ
ｐ）の見かけの５′−非コード領域、６４５ｂｐの開か
れた読み枠、停止コドンおよび約１６００ｂｐの３′−
非コード領域を有する約３５５０ｂｐを含有する。
【０００９】
【問題を解決するための手段】該ｃＤＮＡ配列は、２１
５個のアミノ酸を有するｈＶＰＦ蛋白質をコードしてい
る。この蛋白質配列は、１８９個のアミノ酸の成熟蛋白
質に続く、Ｎ−末端から２６個のアミノ酸分上流側に位
置するメチオニン残基から始まる２６個のアミノ酸の推
定上のシグナルペプチドを含んでいる。該ｈＶＰＦは、
可能なＮ−グリコシル化部位を、Ａｓｎ７５および１６
個のシステイン残基に含んでいる。亜鉛指（ｚｉｎｃ−
ｆｉｎｇｅｒ）様領域は、５７−９０位のアミノ酸にお
いて示される。
５個のアミノ酸を有するｈＶＰＦ蛋白質をコードしてい
る。この蛋白質配列は、１８９個のアミノ酸の成熟蛋白
質に続く、Ｎ−末端から２６個のアミノ酸分上流側に位
置するメチオニン残基から始まる２６個のアミノ酸の推
定上のシグナルペプチドを含んでいる。該ｈＶＰＦは、
可能なＮ−グリコシル化部位を、Ａｓｎ７５および１６
個のシステイン残基に含んでいる。亜鉛指（ｚｉｎｃ−
ｆｉｎｇｅｒ）様領域は、５７−９０位のアミノ酸にお
いて示される。
【００１０】該ｈＶＰＦ配列内において、４個のアミノ
酸断片は、１９８８年１１月２１日出願の同時に係属中
の出願番号第０７／２７４，０６１号に記載されている
Ｕ−９３７分泌蛋白質から先に配列決定された断片に対
応している。これらは、ＮＨ 2 −末端のはじめの１０個
のアミノ酸、すなわち、
酸断片は、１９８８年１１月２１日出願の同時に係属中
の出願番号第０７／２７４，０６１号に記載されている
Ｕ−９３７分泌蛋白質から先に配列決定された断片に対
応している。これらは、ＮＨ 2 −末端のはじめの１０個
のアミノ酸、すなわち、
【化４】 ならびにアミノ酸残基：
【化５】 に対応する３個の内部ペプチド断片を含む。
【００１１】該ｃＤＮＡ配列および対応する推定された
該ｈＶＰＦのアミノ酸配列は、５′−および３′−非コ
ード領域の部分を含む下記の１１９５ｂｐ配列において
示されている。ヌクレオチドは、左欄に第１番から始ま
る番号が付されている。アミノ酸は、上側に番号が付さ
れている。アミノ酸の１−１８、１７−２３、３３−４
５および４６−５６位に対するｃＤＮＡクローンから推
定されたアミノ酸配列は、Ｎ−末端および３個の異なる
トリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列決定により得ら
れたアミノ酸配列と正確に一致した。これらの配列には
下線を付した。Ａｓｎ−７５の単一のＮ−グリコシル化
部位は、四角で囲んである。停止コドンは、３個のアス
テリクスにより示してある。
該ｈＶＰＦのアミノ酸配列は、５′−および３′−非コ
ード領域の部分を含む下記の１１９５ｂｐ配列において
示されている。ヌクレオチドは、左欄に第１番から始ま
る番号が付されている。アミノ酸は、上側に番号が付さ
れている。アミノ酸の１−１８、１７−２３、３３−４
５および４６−５６位に対するｃＤＮＡクローンから推
定されたアミノ酸配列は、Ｎ−末端および３個の異なる
トリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列決定により得ら
れたアミノ酸配列と正確に一致した。これらの配列には
下線を付した。Ａｓｎ−７５の単一のＮ−グリコシル化
部位は、四角で囲んである。停止コドンは、３個のアス
テリクスにより示してある。
【００１２】
【化６】
【化７】（化６のつづき）
【００１３】本発明のｈＶＰＦをコードする遺伝子は、
原核性および真核性宿主においてクローン化し、かつ発
現することができる。例えば、活性なｈＶＰＦ蛋白質
は、該ｈＶＰＦコード配列を複製可能なベクターまたは
プラスミドに操作的に挿入することにより、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ等の原核性宿主およびＣ−１２７マウス細胞またはチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の真核性宿
主中で発現され得る。例えば、それはＥ．ｃｏｌｉ中で
の産生のためのｐＭＬ、ならびにマウス細胞中での産生
のためのウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ならびに原核性
および真核性細胞の両者において複製可能なシャトルベ
クター等の適切なプラスミド中に挿入され得る。好適な
実施態様においては、ｈＶＰＦをコードする該遺伝子
は、Ｃ−１２７マウス細胞中にクローン化され、発現さ
れる。分泌された蛋白質は、ＭｉｌｅｓおよびＭｉｌｅ
ｓの前出文献のアッセイ法（以下、マイルズアッセイと
も称する）により測定される。
原核性および真核性宿主においてクローン化し、かつ発
現することができる。例えば、活性なｈＶＰＦ蛋白質
は、該ｈＶＰＦコード配列を複製可能なベクターまたは
プラスミドに操作的に挿入することにより、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ等の原核性宿主およびＣ−１２７マウス細胞またはチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の真核性宿
主中で発現され得る。例えば、それはＥ．ｃｏｌｉ中で
の産生のためのｐＭＬ、ならびにマウス細胞中での産生
のためのウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ならびに原核性
および真核性細胞の両者において複製可能なシャトルベ
クター等の適切なプラスミド中に挿入され得る。好適な
実施態様においては、ｈＶＰＦをコードする該遺伝子
は、Ｃ−１２７マウス細胞中にクローン化され、発現さ
れる。分泌された蛋白質は、ＭｉｌｅｓおよびＭｉｌｅ
ｓの前出文献のアッセイ法（以下、マイルズアッセイと
も称する）により測定される。
【００１４】ｈＶＰＦ産生のための供給材料は、ヒト組
織球様リンパ腫細胞株Ｕ−９３７である。この細胞株
は、ＳｕｎｄｓｔｒｏｍおよびＮｉｌｓｓｏｎのＩｎ
ｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ １７、５６５−５７７（１９７
６）に報告されているように、散在性組織球様リンパ腫
患者の胸膜滲出液からの細胞から最初に確立された。こ
れらの細胞は、発行物から証明されるように広く配布さ
れており、またＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ）の非制限培養寄託物において、寄託
番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３のもとに一般に容易に
入手することもできる。これらの細胞についての他の背
景は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３、１５２８−１５２
３（１９７６）：Ｎａｔｕｒｅ ２７９、３２８−３３
１（１９７９）；およびＪ．Ｉｍｍｕｎａｌ．１２５、
４６３−４６５（１９８０）を参照することによって得
られる。
織球様リンパ腫細胞株Ｕ−９３７である。この細胞株
は、ＳｕｎｄｓｔｒｏｍおよびＮｉｌｓｓｏｎのＩｎ
ｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ １７、５６５−５７７（１９７
６）に報告されているように、散在性組織球様リンパ腫
患者の胸膜滲出液からの細胞から最初に確立された。こ
れらの細胞は、発行物から証明されるように広く配布さ
れており、またＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ）の非制限培養寄託物において、寄託
番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３のもとに一般に容易に
入手することもできる。これらの細胞についての他の背
景は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３、１５２８−１５２
３（１９７６）：Ｎａｔｕｒｅ ２７９、３２８−３３
１（１９７９）；およびＪ．Ｉｍｍｕｎａｌ．１２５、
４６３−４６５（１９８０）を参照することによって得
られる。
【００１５】ＶＰＦ様活性の産生のためのＵ−９３７細
胞の使用に関する最近の報告は、ＢｅｃｋおよびＨａｂ
ｉｃｈｔのＪ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．４２、
５６８、抄録、１９８７年１２月によりなされている。
しかしながら、該活性は純粋にされず、かつ化学的特徴
付けまたは同定は開示されていない。
胞の使用に関する最近の報告は、ＢｅｃｋおよびＨａｂ
ｉｃｈｔのＪ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．４２、
５６８、抄録、１９８７年１２月によりなされている。
しかしながら、該活性は純粋にされず、かつ化学的特徴
付けまたは同定は開示されていない。
【００１６】Ｕ−９３７細胞により産生されたヒトＶＰ
Ｆは、モルモットＶＰＦに対するウサギポリクローナル
抗体による阻害および結合によって最初に同定された。
モルモットＶＰＦに対するウサギポリクローナル抗血清
は、マイルズアッセイにより測定されるように、Ｕ−９
３７細胞により産生される浸透性活性を阻害した。この
Ｕ−９３７産生ＶＰＦ活性は、モルモットＶＰＦに対す
るウサギポリクローナル抗血清と反応させられた蛋白質
Ａ−セファロースTMにより調整された免疫吸養剤に結合
することによって約７０％ないし８０％が除去される。
Ｆは、モルモットＶＰＦに対するウサギポリクローナル
抗体による阻害および結合によって最初に同定された。
モルモットＶＰＦに対するウサギポリクローナル抗血清
は、マイルズアッセイにより測定されるように、Ｕ−９
３７細胞により産生される浸透性活性を阻害した。この
Ｕ−９３７産生ＶＰＦ活性は、モルモットＶＰＦに対す
るウサギポリクローナル抗血清と反応させられた蛋白質
Ａ−セファロースTMにより調整された免疫吸養剤に結合
することによって約７０％ないし８０％が除去される。
【００１７】ヒトＶＰＦ適切な製造方法は、ヒト組織球
体リンパ腫細胞株Ｕ−９３７から誘導された細胞を、無
血清栄養培養培地中で３５°ないし３８℃にてＶＰＦを
産生するために充分な時間育生し、生じたＶＰＦを使用
細胞または細胞培養調節培地から単離することを含んで
なる。
体リンパ腫細胞株Ｕ−９３７から誘導された細胞を、無
血清栄養培養培地中で３５°ないし３８℃にてＶＰＦを
産生するために充分な時間育生し、生じたＶＰＦを使用
細胞または細胞培養調節培地から単離することを含んで
なる。
【００１８】前述した同時に係属中の出願に記載した該
Ｕ−９３７細胞の細胞培養調節培地からの好ましいヒト
ＶＰＦの単離方法は、次の工程： （ａ）例えば、ＣＭ−セルロース、ＣＭ−セファデック
スTM、アンバーライトTMＩＲ−１２０ＨまたはＳ−セフ
ァロース・ファスト・フロウ（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）陽イオン交換体カラムを用いた
前記調節細胞培養培地の陽イオン交換クロマトグラフ
ィ； （ｂ）例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+またはＮｉ2+／イミノジ
酢酸（ＩＤＡ）／セファロースカラムを用いた、前記陽
イオン交換クロマトグラフィからのＶＰＦ活性分画の金
属アフィニティクロマトグラフィ；および （ｃ）例えば、Ｃ4 またはＣ18逆相ＨＰＬＣカラムを用
いた、前記金属アファニティクロマトグラフィからのＶ
ＰＦ活性分画の逆相ＨＰＬＣを含んでなる。
Ｕ−９３７細胞の細胞培養調節培地からの好ましいヒト
ＶＰＦの単離方法は、次の工程： （ａ）例えば、ＣＭ−セルロース、ＣＭ−セファデック
スTM、アンバーライトTMＩＲ−１２０ＨまたはＳ−セフ
ァロース・ファスト・フロウ（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）陽イオン交換体カラムを用いた
前記調節細胞培養培地の陽イオン交換クロマトグラフ
ィ； （ｂ）例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+またはＮｉ2+／イミノジ
酢酸（ＩＤＡ）／セファロースカラムを用いた、前記陽
イオン交換クロマトグラフィからのＶＰＦ活性分画の金
属アフィニティクロマトグラフィ；および （ｃ）例えば、Ｃ4 またはＣ18逆相ＨＰＬＣカラムを用
いた、前記金属アファニティクロマトグラフィからのＶ
ＰＦ活性分画の逆相ＨＰＬＣを含んでなる。
【００１９】かくして精製されたヒトＶＰＦは、Ｍｒが
３４，０００−４２，０００の蛋白質であることが見出
された。Ｎ−末端アミノ酸配列分析に供することによ
り、これは最初の１０個のアミノ酸位置のうち４個がｇ
ＶＰＦとは異なり、別個の新規な構造を有することが見
出された。
３４，０００−４２，０００の蛋白質であることが見出
された。Ｎ−末端アミノ酸配列分析に供することによ
り、これは最初の１０個のアミノ酸位置のうち４個がｇ
ＶＰＦとは異なり、別個の新規な構造を有することが見
出された。
【００２０】該精製ｈＶＰＦは、モルモットへの皮内注
射による２２ｎｇ（５．５×１０-1 3 モル）の投与量に
て血管浸出促進において活性であった。従って、この高
度に精製されたｈＶＰＦは、米国特許第４，４５６，５
５０号に記載されたｇＶＰＦよりも９倍有能である。本
発明のｈＶＰＦの他の優位点は、そのヒト起源である点
にあり、これは、より低純度の、または免疫反応を生じ
るであろうモルモットもしくは他の動物から誘導された
他の薬剤に比べて、ヒトの臨床について使用可能性が示
唆される。
射による２２ｎｇ（５．５×１０-1 3 モル）の投与量に
て血管浸出促進において活性であった。従って、この高
度に精製されたｈＶＰＦは、米国特許第４，４５６，５
５０号に記載されたｇＶＰＦよりも９倍有能である。本
発明のｈＶＰＦの他の優位点は、そのヒト起源である点
にあり、これは、より低純度の、または免疫反応を生じ
るであろうモルモットもしくは他の動物から誘導された
他の薬剤に比べて、ヒトの臨床について使用可能性が示
唆される。
【００２１】本発明の詳細な記述 該明細書は、本発明を構成するべき主題事項を特に指摘
し、明確に請求することにより特許請求の範囲により結
論を与えられるものではあるが、本発明は、添付図面と
関連させて以下の発明の好適な実施態様の詳細な記述か
らより良く理解されるものと信ずる。図１は、本発明の
一実施態様において、Ｕ−９３７細胞の調節細胞培養培
地からのヒトＶＰＦ（ｈＶＰＦ）の段階的精製を示す模
式的表示である。図２は、図１の実施態様の下記の４種
類のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおけるｈＶＰＦの段階
的精製の溶出パターンを示す図式表示である。
し、明確に請求することにより特許請求の範囲により結
論を与えられるものではあるが、本発明は、添付図面と
関連させて以下の発明の好適な実施態様の詳細な記述か
らより良く理解されるものと信ずる。図１は、本発明の
一実施態様において、Ｕ−９３７細胞の調節細胞培養培
地からのヒトＶＰＦ（ｈＶＰＦ）の段階的精製を示す模
式的表示である。図２は、図１の実施態様の下記の４種
類のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおけるｈＶＰＦの段階
的精製の溶出パターンを示す図式表示である。
【００２２】Ａ．）ｈＶＰＦの陽イオン交換クロマトグ
ラフィ Ｕ−９３７細胞からの無血清調節培地（６倍濃度で６
Ｌ）をｐＨ７．０に調整し、０．０１Ｍリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０にて平衡化したＳ−セファロースカラム
（５×４５ｃｍ）に流速６０ｍｌ／時でかけた。ｈＶＰ
Ｆを溶出するために、同じ緩衝溶液中の０．２Ｍから
０．８Ｍ ＮａＣｌまでの線形勾配を使用した。Ｂ．）ｈＶＰＦの金属アフィニティクロマトグラフィ 該陽イオン交換カラムからの活性溶出液を、限外濾過に
より２０ｍｌに濃縮し、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０、２Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾー
ル中で平衡化したセファロース／ＩＤＡ／Ｃｕ2+カラム
にかけた。ｈＶＰＦは、示されているようにイミダゾー
ルの線形勾配により溶出した。
ラフィ Ｕ−９３７細胞からの無血清調節培地（６倍濃度で６
Ｌ）をｐＨ７．０に調整し、０．０１Ｍリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０にて平衡化したＳ−セファロースカラム
（５×４５ｃｍ）に流速６０ｍｌ／時でかけた。ｈＶＰ
Ｆを溶出するために、同じ緩衝溶液中の０．２Ｍから
０．８Ｍ ＮａＣｌまでの線形勾配を使用した。Ｂ．）ｈＶＰＦの金属アフィニティクロマトグラフィ 該陽イオン交換カラムからの活性溶出液を、限外濾過に
より２０ｍｌに濃縮し、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０、２Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾー
ル中で平衡化したセファロース／ＩＤＡ／Ｃｕ2+カラム
にかけた。ｈＶＰＦは、示されているようにイミダゾー
ルの線形勾配により溶出した。
【００２３】Ｃ．）ｈＶＰＦのＲＰ−ＨＰＬＣ 該金属アフィニティカラムからの活性溶出液を、水中の
０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により平衡化し
たＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラムにかけ、１ｍｌ／分にて示
されたようにアセトニトリルの勾配により溶出した。Ｄ．）ＲＰ−ＨＰＬＣ分画のドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 活性ピーク周辺の分画の分別量を取り、還元剤を用いな
いで電気泳動により分析した。標準は、最初にβ−メル
カプトエタノールにより還元した。
０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により平衡化し
たＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラムにかけ、１ｍｌ／分にて示
されたようにアセトニトリルの勾配により溶出した。Ｄ．）ＲＰ−ＨＰＬＣ分画のドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 活性ピーク周辺の分画の分別量を取り、還元剤を用いな
いで電気泳動により分析した。標準は、最初にβ−メル
カプトエタノールにより還元した。
【００２４】図３は、ｈＶＰＦおよびｇＶＰＦのＥＬＩ
ＳＡを示している。微量滴定プレートのポリスチレンウ
エルを被覆するためにウサギ抗−ｇＶＰＦ ＩｇＧを使
用した。種々の量のｈＶＰＦ（下方のパネル）またはｇ
ＶＰＥ（上方のパネル）のいずれかを一夜結合せしめ、
結合した抗原の量を、ビオチン−抗−ｇＶＰＥ Ｉｇ
Ｇ、次いでＨＲＰ−アビジンを用いて検出した。ウエル
をＨＲＰ基質を用いて展開し、吸光度を４９０ｎｍにて
読取った。目盛を越える読取り値を有したウエルは希釈
し、Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレート読取り装置の線形
範囲において再度読取り、得られた吸光度を希釈度につ
いて補正した。ｈＶＰＦおよびｇＶＰＦについて異なる
ｘ軸目盛を使用した。初期および後期採血は、それぞれ
４番目の採血（３回の免疫後）および１１番目の採血
（５回の免疫後）において採取された血清から調整され
た第１および第２のビオチン結合ＩｇＧ類を示す。
ＳＡを示している。微量滴定プレートのポリスチレンウ
エルを被覆するためにウサギ抗−ｇＶＰＦ ＩｇＧを使
用した。種々の量のｈＶＰＦ（下方のパネル）またはｇ
ＶＰＥ（上方のパネル）のいずれかを一夜結合せしめ、
結合した抗原の量を、ビオチン−抗−ｇＶＰＥ Ｉｇ
Ｇ、次いでＨＲＰ−アビジンを用いて検出した。ウエル
をＨＲＰ基質を用いて展開し、吸光度を４９０ｎｍにて
読取った。目盛を越える読取り値を有したウエルは希釈
し、Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレート読取り装置の線形
範囲において再度読取り、得られた吸光度を希釈度につ
いて補正した。ｈＶＰＦおよびｇＶＰＦについて異なる
ｘ軸目盛を使用した。初期および後期採血は、それぞれ
４番目の採血（３回の免疫後）および１１番目の採血
（５回の免疫後）において採取された血清から調整され
た第１および第２のビオチン結合ＩｇＧ類を示す。
【００２５】図４は、約６２００ｂｐのプラスミドｈＶ
ＰＦ／ｐＵＣ９の構造を示す。このプラスミドは、ｐＭ
ＯＮ３０４４とも命名され、ｈＶＰＦｃＤＮＡを含有す
る。太い矢印は、３．５ｋｂ ｃＤＮＡ内のｈＶＰＦコ
ード領域の位置を表している。プラスミドｐＵＣ９は、
商業的に入手可能な用途の広いベクターであり、多数の
クローニング部位と、アンピシリン（ＡＭＰ）耐性を与
える遺伝子とを有する。該プラスミドは、β−ガラクト
シダーゼのα−ペプチドを生成し、これはＤＨ５ａ、Ｊ
Ｍ８３およびＴＢ１等のＥ．ｃｏｌｉ株におけるｌａｃ
欠除変異を補足する。
ＰＦ／ｐＵＣ９の構造を示す。このプラスミドは、ｐＭ
ＯＮ３０４４とも命名され、ｈＶＰＦｃＤＮＡを含有す
る。太い矢印は、３．５ｋｂ ｃＤＮＡ内のｈＶＰＦコ
ード領域の位置を表している。プラスミドｐＵＣ９は、
商業的に入手可能な用途の広いベクターであり、多数の
クローニング部位と、アンピシリン（ＡＭＰ）耐性を与
える遺伝子とを有する。該プラスミドは、β−ガラクト
シダーゼのα−ペプチドを生成し、これはＤＨ５ａ、Ｊ
Ｍ８３およびＴＢ１等のＥ．ｃｏｌｉ株におけるｌａｃ
欠除変異を補足する。
【００２６】ここにおいては、標準的な生化学的述語が
使用され、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのヌクレオ
チド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン（Ｔ）；グアニン
（Ｇ）；およびシトシン（Ｃ）と命名される。Ｎは、こ
れらのヌクレオチド類のいずれかを意味する。ＤＮＡヌ
クレオチド配列の構造表示において、便宜上慣用されて
いるように、一方の鎖のみが通常示され、ここで一方の
鎖のＡは、相補鎖上のＴを意味し、ＧはＣを意味する。
すべての配列は、５′から３′に記述される。アミノ酸
類は、次に示すように、３文字または１文字省略形のい
ずれかにより示される。
使用され、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのヌクレオ
チド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン（Ｔ）；グアニン
（Ｇ）；およびシトシン（Ｃ）と命名される。Ｎは、こ
れらのヌクレオチド類のいずれかを意味する。ＤＮＡヌ
クレオチド配列の構造表示において、便宜上慣用されて
いるように、一方の鎖のみが通常示され、ここで一方の
鎖のＡは、相補鎖上のＴを意味し、ＧはＣを意味する。
すべての配列は、５′から３′に記述される。アミノ酸
類は、次に示すように、３文字または１文字省略形のい
ずれかにより示される。
【００２７】
【表１】 ─────────────────────────── 省略記号 アミノ酸 ─────────────────────────── Ａ Ａｌａ アラニン Ｃ Ｃｙｓ システィン Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｇ Ｇｌｙ グリシン Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン Ｋ Ｌｙｓ リジン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン Ｒ Ａｒｇ アルギニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａｌ バリン Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン Ｙ Ｔｙｒ チロシン ───────────────────────────
【００２８】例４および図４に示された一般に入手可能
な制限エンドヌクレアーゼは、以下の制限配列および
（矢印で示された）切断パターンを有している。
な制限エンドヌクレアーゼは、以下の制限配列および
（矢印で示された）切断パターンを有している。
【化８】
【００２９】該Ｕ−９３７細胞は、周知の細胞培養培
地、例えば、Ｅａｇｌｅの基底培地（ＢＭＥ）、Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、培地１
９９、ＲＰＭＩ １６４０培地、およびＨ．Ｊ．Ｍｏｒ
ｔｏｎのＩｎ Ｖｉｔｒｏ ６、８９−１０８（１９７
０）により詳細に記載されているような同様な細胞培養
培地において培養され得る。これらの通常の培養培地
は、公知のアミノ酸類、無機塩類、ビタミン類、ホルモ
ン類および炭水化物類を含有している。これらは、しば
しばウシ胎児性血清（ＦＢＳ）等の哺乳類血清により増
強される。該培地において使用され得る他の成分は、ウ
シ血清アルブミン、トランスフェリンおよびインシュリ
ン等の成長因子、ラクトアルブミン加水分解物、トリプ
トン、トリプトースおよびペプトン等の蛋白質加水分解
物、ならびに、脂質類、界面活性剤等の材料である。該
Ｕ−９３７細胞は、ｈＶＰＦ産生のためには、好ましく
は無血清培地中で培養される。
地、例えば、Ｅａｇｌｅの基底培地（ＢＭＥ）、Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、培地１
９９、ＲＰＭＩ １６４０培地、およびＨ．Ｊ．Ｍｏｒ
ｔｏｎのＩｎ Ｖｉｔｒｏ ６、８９−１０８（１９７
０）により詳細に記載されているような同様な細胞培養
培地において培養され得る。これらの通常の培養培地
は、公知のアミノ酸類、無機塩類、ビタミン類、ホルモ
ン類および炭水化物類を含有している。これらは、しば
しばウシ胎児性血清（ＦＢＳ）等の哺乳類血清により増
強される。該培地において使用され得る他の成分は、ウ
シ血清アルブミン、トランスフェリンおよびインシュリ
ン等の成長因子、ラクトアルブミン加水分解物、トリプ
トン、トリプトースおよびペプトン等の蛋白質加水分解
物、ならびに、脂質類、界面活性剤等の材料である。該
Ｕ−９３７細胞は、ｈＶＰＦ産生のためには、好ましく
は無血清培地中で培養される。
【００３０】哺乳類細胞の大規模育成方法は、周知であ
り、これらの方法は、ここに定義されたＵ−９３７細胞
の培養に使用し得る。このような方法は、例えばＴｏｌ
ｂｅｒｔらのＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．ＸＸＩ
Ｖ、１６７１−１６７９（１９８２）；Ｔｏｌｂｅｒｔ
およびＦｅｄｅｒのＡｎｎ．Ｒｅｐｔ．Ｆｅｒｍ．Ｐｒ
ｏｃ．Ｖｏｌ．６、ｃｈ．３、３５−７４頁（１９８
４）；およびこれらの刊行物中に引用された文献に記載
されている。米国特許第４，１６６，７６８；第４，２
８９，８５４；および第４，５３７，８６０号は、蛋白
質性物質の産生のための細胞の大規模培養および維持に
特に有用な方法および装置を開示している。前記特許中
の開示を、ここに参考として含める。それに開示された
方法および装置は、ここに定義されたＵ−９３７細胞の
培養のために使用しうる。
り、これらの方法は、ここに定義されたＵ−９３７細胞
の培養に使用し得る。このような方法は、例えばＴｏｌ
ｂｅｒｔらのＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．ＸＸＩ
Ｖ、１６７１−１６７９（１９８２）；Ｔｏｌｂｅｒｔ
およびＦｅｄｅｒのＡｎｎ．Ｒｅｐｔ．Ｆｅｒｍ．Ｐｒ
ｏｃ．Ｖｏｌ．６、ｃｈ．３、３５−７４頁（１９８
４）；およびこれらの刊行物中に引用された文献に記載
されている。米国特許第４，１６６，７６８；第４，２
８９，８５４；および第４，５３７，８６０号は、蛋白
質性物質の産生のための細胞の大規模培養および維持に
特に有用な方法および装置を開示している。前記特許中
の開示を、ここに参考として含める。それに開示された
方法および装置は、ここに定義されたＵ−９３７細胞の
培養のために使用しうる。
【００３１】該細胞は、また、大規模に栄養培地中で３
７℃にて米国特許第４，２８９，８５４に記載されてい
るように撹拌懸濁培養において培養され、適当な成育期
間後に、米国特許第４，５３７，８６０に記載された静
的維持反応器中で０．５％のラクトアルブミンが補充さ
れた培地中で維持され得る。使用された培養培地からの
ｈＶＰＦの精製には、蛋白質類の分離のための公知の種
々の方法、例えば、塩および溶媒分画、コロイド状材料
への吸着、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ア
フィニティクロマトグラフィ、免疫アフィニティクロマ
トグラフィ、電気泳動ならびに高速液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）等が使用され得るが、前述した３段階の
クロマトグラフィ的方法が好ましい。適切な金属アフィ
ニティクロマトグラフィ方法は、Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉの
Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、１−７（１９８
５）に例示されている。
７℃にて米国特許第４，２８９，８５４に記載されてい
るように撹拌懸濁培養において培養され、適当な成育期
間後に、米国特許第４，５３７，８６０に記載された静
的維持反応器中で０．５％のラクトアルブミンが補充さ
れた培地中で維持され得る。使用された培養培地からの
ｈＶＰＦの精製には、蛋白質類の分離のための公知の種
々の方法、例えば、塩および溶媒分画、コロイド状材料
への吸着、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ア
フィニティクロマトグラフィ、免疫アフィニティクロマ
トグラフィ、電気泳動ならびに高速液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）等が使用され得るが、前述した３段階の
クロマトグラフィ的方法が好ましい。適切な金属アフィ
ニティクロマトグラフィ方法は、Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉの
Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、１−７（１９８
５）に例示されている。
【００３２】好ましい工程において、該Ｕ−９３７細胞
類は、ｈＶＰＥの収量を改善するために、ヌードマウス
を介してサブクローン化または継代培養される。該細胞
のこのような処理は、調節培地に２００ないし８００ｎ
ｇ／ｍｌまでの量のｈＶＰＦの産生をもたらした。これ
は、モルモット細胞株１０について報告されているｇＶ
ＰＦの水準と同等か、あるいはそれ以上である。該Ｕ−
９３７細胞は、１×１０7 個の細胞をマウス腹膜内に注
射することにより、ヌードマウスを介して継代された。
ヌードマウスは、免疫血管種であって、ヒト細胞を生育
でき、拒絶されない。約３ないし４週間後に、該マウス
は切開され、それらの腹部から軟腫瘍が取出された。該
腫瘍は、機械的に細胞に分離され、そしてこれらのＵ−
９３７細胞は、再度培養に付せられた。
類は、ｈＶＰＥの収量を改善するために、ヌードマウス
を介してサブクローン化または継代培養される。該細胞
のこのような処理は、調節培地に２００ないし８００ｎ
ｇ／ｍｌまでの量のｈＶＰＦの産生をもたらした。これ
は、モルモット細胞株１０について報告されているｇＶ
ＰＦの水準と同等か、あるいはそれ以上である。該Ｕ−
９３７細胞は、１×１０7 個の細胞をマウス腹膜内に注
射することにより、ヌードマウスを介して継代された。
ヌードマウスは、免疫血管種であって、ヒト細胞を生育
でき、拒絶されない。約３ないし４週間後に、該マウス
は切開され、それらの腹部から軟腫瘍が取出された。該
腫瘍は、機械的に細胞に分離され、そしてこれらのＵ−
９３７細胞は、再度培養に付せられた。
【００３３】
【実施例】以下の例は、本発明を更に例示するものであ
って、本発明はこれらの特定の例またはそこに記載され
た詳細に限定されるものではないと理解される。
って、本発明はこれらの特定の例またはそこに記載され
た詳細に限定されるものではないと理解される。
【００３４】例１ 材料および方法 Ｕ−９３７細胞の成育 Ｕ−９３７細胞は、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）から最初に入手し、軟カンテン中でサ
ブクローン化し、成育の速いものを選択した。これらの
クローンの一つを、規模拡大のために選択したが、他の
クローンおよび非クローン化ＡＴＣＣ細胞さえもｈＶＰ
Ｆを産生した。使用した無血清培地は、以下の組成を含
有していた： １：１：１の割合においてＲＰＭＩ １
６４０、ＤＭＥ（高グルコース）、ＨａｍのＦ１２；Ｈ
ＥＰＳ（２５ｍＭ、ｐＨ７．１０−７．１５）；グルタ
チオン（１ｍＭ）；エタノールアミン（２０μＭ）；セ
レン（３０ｎＭ）；ＮａＨＣＯ3 （２ｍＭ）；ＣｕＳＯ
4 （５ｎＭ）；ＮＨ4 ＶＯ3 （５ｎＭ）；ＺｎＳＯ
4 （０．５μＭ）；ＭｎＳＯ4 （０．５ｎＭ）；ＦｅＳ
Ｏ4 （４μＭ）；ウシ血清アルブミン、Ｍｉｌｅｓ "Ｐ
ｅｎｔｅｘ" （１００μｇ／ｍｌ）；鉄富有トランスフ
ェリン、Ｍｉｌｅｓ（５μｇ／ｍｌ）；ウシインシュリ
ン（１０μｇ／ｍｌ）；ＥｘＣｙｔｅ，Ｍｉｌｅｓ−脂
質分画（０．１％ ｖ／ｖ）；Ｆ−６８Ｐｌｕｒａｃａ
ｌTM（０．０５％ ｗ／ｖ）。体積を、２８０ｍＯｓｍ
の重量オスモル濃度となるように調節した。この培地に
おける２倍化時間は、約５０−６０時間であったが、一
方２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地においては、
わずかに３５−４０時間であった。
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）から最初に入手し、軟カンテン中でサ
ブクローン化し、成育の速いものを選択した。これらの
クローンの一つを、規模拡大のために選択したが、他の
クローンおよび非クローン化ＡＴＣＣ細胞さえもｈＶＰ
Ｆを産生した。使用した無血清培地は、以下の組成を含
有していた： １：１：１の割合においてＲＰＭＩ １
６４０、ＤＭＥ（高グルコース）、ＨａｍのＦ１２；Ｈ
ＥＰＳ（２５ｍＭ、ｐＨ７．１０−７．１５）；グルタ
チオン（１ｍＭ）；エタノールアミン（２０μＭ）；セ
レン（３０ｎＭ）；ＮａＨＣＯ3 （２ｍＭ）；ＣｕＳＯ
4 （５ｎＭ）；ＮＨ4 ＶＯ3 （５ｎＭ）；ＺｎＳＯ
4 （０．５μＭ）；ＭｎＳＯ4 （０．５ｎＭ）；ＦｅＳ
Ｏ4 （４μＭ）；ウシ血清アルブミン、Ｍｉｌｅｓ "Ｐ
ｅｎｔｅｘ" （１００μｇ／ｍｌ）；鉄富有トランスフ
ェリン、Ｍｉｌｅｓ（５μｇ／ｍｌ）；ウシインシュリ
ン（１０μｇ／ｍｌ）；ＥｘＣｙｔｅ，Ｍｉｌｅｓ−脂
質分画（０．１％ ｖ／ｖ）；Ｆ−６８Ｐｌｕｒａｃａ
ｌTM（０．０５％ ｗ／ｖ）。体積を、２８０ｍＯｓｍ
の重量オスモル濃度となるように調節した。この培地に
おける２倍化時間は、約５０−６０時間であったが、一
方２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地においては、
わずかに３５−４０時間であった。
【００３５】細胞を、該無血清培地中で、Ｔ−フラスコ
から振盪ビンに、次いで小型スピナーへと規模を拡大し
た。次いで、１２Ｌのスピナーを、１４Ｌの潅流ケモス
タットの接種の為に用い、これは、全充填細胞の約３ｍ
ｌ培地／時／ｍｌの速度で潅流した。引続いて、培養物
を１００Ｌの灌流ケモスタットに移し、これは限定され
た栄養物条件下で潅流した（１．５−２．０ｍｌ培地／
時／ｍｌ充填細胞、または０．１−０．１５ｍｌ／日／
１００万細胞）。細胞はＡＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの
中空ファイバーカートリッジ（型式ＣＦＰ−４−Ｅ−
６、０．４ミクロン）を用いて反応容器に再循環させ
た。細胞密度は、１．０×１０6 ないし４．６×１０6
生細胞数／ｍｌ、３．０ないし２３ｍｌ／Ｌ充填細胞の
範囲であり、生存率は６４％ないし８４％の範囲であっ
た。該１００Ｌ反応器中での製造は、２４日間継続し、
この間に全量で１０００Ｌの無血清調節培地が製造され
た。
から振盪ビンに、次いで小型スピナーへと規模を拡大し
た。次いで、１２Ｌのスピナーを、１４Ｌの潅流ケモス
タットの接種の為に用い、これは、全充填細胞の約３ｍ
ｌ培地／時／ｍｌの速度で潅流した。引続いて、培養物
を１００Ｌの灌流ケモスタットに移し、これは限定され
た栄養物条件下で潅流した（１．５−２．０ｍｌ培地／
時／ｍｌ充填細胞、または０．１−０．１５ｍｌ／日／
１００万細胞）。細胞はＡＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの
中空ファイバーカートリッジ（型式ＣＦＰ−４−Ｅ−
６、０．４ミクロン）を用いて反応容器に再循環させ
た。細胞密度は、１．０×１０6 ないし４．６×１０6
生細胞数／ｍｌ、３．０ないし２３ｍｌ／Ｌ充填細胞の
範囲であり、生存率は６４％ないし８４％の範囲であっ
た。該１００Ｌ反応器中での製造は、２４日間継続し、
この間に全量で１０００Ｌの無血清調節培地が製造され
た。
【００３６】該潅流反応器からの浸透物を採集し、４℃
にて保存した。濃縮は、並行して運転された３個の低蛋
白質結合１０ｋＤａ遮断スパイラルカートリッジ（Ａｍ
ｉｃｏｎＳ１０Ｙ１０）を用いたＡｍｉｃｏｎ ＤＣ−
３０限外濾過装置において、２００−３００Ｌのロット
にて行なった。該濃縮物と共に集められたカートリッジ
および装置の洗浄用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含め
て、６倍の濃縮が達成された。該濃縮物は、−２０℃に
て保存した。
にて保存した。濃縮は、並行して運転された３個の低蛋
白質結合１０ｋＤａ遮断スパイラルカートリッジ（Ａｍ
ｉｃｏｎＳ１０Ｙ１０）を用いたＡｍｉｃｏｎ ＤＣ−
３０限外濾過装置において、２００−３００Ｌのロット
にて行なった。該濃縮物と共に集められたカートリッジ
および装置の洗浄用リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含め
て、６倍の濃縮が達成された。該濃縮物は、−２０℃に
て保存した。
【００３７】血管浸透性アッセイ Ｍｉｌｅｓ−型の浸
透性アッセイ（ＭｉｌｅｓおよびＭｉｌｅｓの前出文
献）を、ｈＶＰＦの検出に用いた。無毛モルモット（Ｉ
ＡＦ／ＨＡ−ＨＯ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉ
ｌｍｉｇｔｏｎ ＭＡ）に、メトキシフルラン（Ｍｅｔ
ｏｆａｎｅTM、Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．）
の吸入により麻酔をかけた。注射用殺菌食塩水（Ａｂｂ
ｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて調整した０．
５％（ｗ／ｖ）のＥｖａｎのブルー染料（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を１ｍｌ溶、循環系に心臓
内的に注射した。ｈＶＰＦ測定用試料は、食塩水または
リン酸緩衝食塩水中で適当に希釈して調製し、２００μ
ｌ容をモルモットの背の部位に皮下的に注射した。ｈＶ
ＰＦの存在は、注射部位における染料（血清蛋白質に結
合している）の循環系から組織への浸透による明確な青
色スポットにより示された。
透性アッセイ（ＭｉｌｅｓおよびＭｉｌｅｓの前出文
献）を、ｈＶＰＦの検出に用いた。無毛モルモット（Ｉ
ＡＦ／ＨＡ−ＨＯ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉ
ｌｍｉｇｔｏｎ ＭＡ）に、メトキシフルラン（Ｍｅｔ
ｏｆａｎｅTM、Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．）
の吸入により麻酔をかけた。注射用殺菌食塩水（Ａｂｂ
ｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて調整した０．
５％（ｗ／ｖ）のＥｖａｎのブルー染料（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を１ｍｌ溶、循環系に心臓
内的に注射した。ｈＶＰＦ測定用試料は、食塩水または
リン酸緩衝食塩水中で適当に希釈して調製し、２００μ
ｌ容をモルモットの背の部位に皮下的に注射した。ｈＶ
ＰＦの存在は、注射部位における染料（血清蛋白質に結
合している）の循環系から組織への浸透による明確な青
色スポットにより示された。
【００３８】陽イオン交換クロマトグラフィ ６リット
ルの６倍濃縮調節培地を酢酸によりｐＨ７．０に調整
し、０．０１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０により平衡
化したセファロース（ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM）高速流
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陽イオン交換ゲルカラム（５ｃ
ｍ×４４ｃｍ）に通した。４℃においては、浸透性増強
活性のかなりの部分はカラムを通過したが、周囲温度
（２５℃）においては５０ないし７０％の活性がカラム
に結合した。従って、この工程は、室温にて行なわれ
た。ナトリウムアジド（０．０１％ ｗ／ｖ）をすべて
の緩衝液に添加した。負荷および溶出のための流速は、
毎分１０ｍｌであった。負荷後、該カラムを９００ｍｌ
の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０により洗浄
し、次いで同じ緩衝液において０．２Ｍから０．８Ｍま
での塩化ナトリウムを含む２．３Ｌの線形勾配を用いて
溶出した。操作間において、該カラムを、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０にて再度平衡化する前に、
０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて洗浄した。
ルの６倍濃縮調節培地を酢酸によりｐＨ７．０に調整
し、０．０１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０により平衡
化したセファロース（ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM）高速流
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陽イオン交換ゲルカラム（５ｃ
ｍ×４４ｃｍ）に通した。４℃においては、浸透性増強
活性のかなりの部分はカラムを通過したが、周囲温度
（２５℃）においては５０ないし７０％の活性がカラム
に結合した。従って、この工程は、室温にて行なわれ
た。ナトリウムアジド（０．０１％ ｗ／ｖ）をすべて
の緩衝液に添加した。負荷および溶出のための流速は、
毎分１０ｍｌであった。負荷後、該カラムを９００ｍｌ
の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０により洗浄
し、次いで同じ緩衝液において０．２Ｍから０．８Ｍま
での塩化ナトリウムを含む２．３Ｌの線形勾配を用いて
溶出した。操作間において、該カラムを、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０にて再度平衡化する前に、
０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて洗浄した。
【００３９】金属アフィニティクロマトグラフィ 金属
アフィニティクロマトグラフィは、スペーサ腕を介して
アガロースに共有結合された銅−イミノジ酢酸複合体を
用いて行なった。該ゲルは、第１にはスペーサ腕を含む
エポキシドのアガロースへの添加、次いで、該活性化ゲ
ルとイミノジ酢酸との反応による２つの工程にて合成し
た。高度に交差結合したアガロース（セファロース高速
流、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を繰返し蒸留水で洗浄して、
全ての緩衝液および防腐剤を除去し、吸引により乾燥さ
せた。この湿潤ゲル約１００ｇ（１００ｍｌ）を６０ｍ
ｌの蒸留水に懸濁し、次いで新たに調製した４０ｍｌの
２．５Ｍ ＮａＯＨを、緩和に撹拌されているアガロー
ス懸濁液に添加した。次いで、Ｇｕらの、Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ、６４９−６５１（１９８３）に記載されている
ように調製した１００ｍｌのジエチレングリコールジク
リシジルエーテルを加え、そして該混合物を３０℃にて
１６時間緩かに撹拌した。該活性化ゲルを蒸留水により
繰返し洗浄して過剰のエポキシドおよび塩基を除去し
た。この洗浄され、吸引乾燥されたゲルは、ｍＬゲルあ
たり７０マイクロモルの活性エポキシドを含んでいた。
該活性化ゲルは、蒸留水中に４℃にて貯蔵し、一般的に
は調製後２４時間以内に使用した。
アフィニティクロマトグラフィは、スペーサ腕を介して
アガロースに共有結合された銅−イミノジ酢酸複合体を
用いて行なった。該ゲルは、第１にはスペーサ腕を含む
エポキシドのアガロースへの添加、次いで、該活性化ゲ
ルとイミノジ酢酸との反応による２つの工程にて合成し
た。高度に交差結合したアガロース（セファロース高速
流、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を繰返し蒸留水で洗浄して、
全ての緩衝液および防腐剤を除去し、吸引により乾燥さ
せた。この湿潤ゲル約１００ｇ（１００ｍｌ）を６０ｍ
ｌの蒸留水に懸濁し、次いで新たに調製した４０ｍｌの
２．５Ｍ ＮａＯＨを、緩和に撹拌されているアガロー
ス懸濁液に添加した。次いで、Ｇｕらの、Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ、６４９−６５１（１９８３）に記載されている
ように調製した１００ｍｌのジエチレングリコールジク
リシジルエーテルを加え、そして該混合物を３０℃にて
１６時間緩かに撹拌した。該活性化ゲルを蒸留水により
繰返し洗浄して過剰のエポキシドおよび塩基を除去し
た。この洗浄され、吸引乾燥されたゲルは、ｍＬゲルあ
たり７０マイクロモルの活性エポキシドを含んでいた。
該活性化ゲルは、蒸留水中に４℃にて貯蔵し、一般的に
は調製後２４時間以内に使用した。
【００４０】約１００ｍｌ（１００ｇ）の活性化セファ
ロース・ファスト・フローを蒸留水にて洗浄し、吸引に
より乾燥させ、ｐＨ＝１１．０に調製された１００ｍｌ
の１．０Ｍ Ｎａ2 ＮＨ（ＣＨ2 ＣＯ2 ）−Ｈ2 Ｏ溶液
中に懸濁した。この混合物を６５℃にて２４時間緩かに
撹拌し、次いで過剰なリガンドを除去するために繰返し
蒸留水で洗浄した。該官能化されたゲルを、エタノール
／水（２５／７５ｖ／ｖ）中に４℃にてすぐ使用できる
ように保存した。チオサルフェイトを用いた滴定は、エ
ポキシド基が存在しないことを示し、従ってエタノール
アミンによるキャッピングは不必要とみなされた。該ゲ
ルの金属結合能力を測定するために、１０ｍｌの吸引乾
燥ゲルを過剰の５０ｍＭ Ｃｕ（ＣｌＯ4 ）2 で飽和
し、次いで蒸留水により慎重に洗浄した。最後に、結合
した銅を過剰量の５０ｍＭ Ｎａ2Ｈ2 ＥＤＴＡによ
り除去した。標準化した銅−ＥＤＴＡ溶液を比較用に用
いて、銅含有量が、１ミリリットルの湿潤吸引乾燥ゲル
あたり４３ピコモルであることが光測定により測定され
た。
ロース・ファスト・フローを蒸留水にて洗浄し、吸引に
より乾燥させ、ｐＨ＝１１．０に調製された１００ｍｌ
の１．０Ｍ Ｎａ2 ＮＨ（ＣＨ2 ＣＯ2 ）−Ｈ2 Ｏ溶液
中に懸濁した。この混合物を６５℃にて２４時間緩かに
撹拌し、次いで過剰なリガンドを除去するために繰返し
蒸留水で洗浄した。該官能化されたゲルを、エタノール
／水（２５／７５ｖ／ｖ）中に４℃にてすぐ使用できる
ように保存した。チオサルフェイトを用いた滴定は、エ
ポキシド基が存在しないことを示し、従ってエタノール
アミンによるキャッピングは不必要とみなされた。該ゲ
ルの金属結合能力を測定するために、１０ｍｌの吸引乾
燥ゲルを過剰の５０ｍＭ Ｃｕ（ＣｌＯ4 ）2 で飽和
し、次いで蒸留水により慎重に洗浄した。最後に、結合
した銅を過剰量の５０ｍＭ Ｎａ2Ｈ2 ＥＤＴＡによ
り除去した。標準化した銅−ＥＤＴＡ溶液を比較用に用
いて、銅含有量が、１ミリリットルの湿潤吸引乾燥ゲル
あたり４３ピコモルであることが光測定により測定され
た。
【００４１】クロマトグラフィは、１０ｍｌのゲルを含
むガラスカラム（１．０×１３ｃｍ）中で行なった。該
ゲルにＣｕ（ＣｌＯ4 ）2 の５０ｍＭ溶液、ｐＨ＝４．
５を負荷し、次いで緩衝化イミダゾール溶液（２０ｍＭ
イミダゾール＋２Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ ＮａＨ2 Ｐ
Ｏ4 、ｐＨ７．０）で満たした。１．０Ｍ ＮａＣｌに
より充分に洗浄した後、次いで該カラムを出発緩衝液
（５０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 、ｐＨ７．０、２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．５Ｍイミダゾール）により平衡化した。該陽
イオン交換工程からの浸透性増強活性を含む分画を集
め、ＡｍｉｃｏｎＹＭ５膜を用いて約７００ｍｌから２
０ｍｌに濃縮した。濃縮において、通常形成される蛋白
質沈殿は、濾過により除去され得る。該試料を、周囲温
度（２５℃）にてカラムにかけ、流速０．５ｍｌ／分に
て、５０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 、ｐＨ７．０、２Ｍ Ｎ
ａＣｌ中のイミダゾール線形勾配（０．５ｍＭから６０
ｍＭ）を用いて５００分間で溶出した。
むガラスカラム（１．０×１３ｃｍ）中で行なった。該
ゲルにＣｕ（ＣｌＯ4 ）2 の５０ｍＭ溶液、ｐＨ＝４．
５を負荷し、次いで緩衝化イミダゾール溶液（２０ｍＭ
イミダゾール＋２Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ ＮａＨ2 Ｐ
Ｏ4 、ｐＨ７．０）で満たした。１．０Ｍ ＮａＣｌに
より充分に洗浄した後、次いで該カラムを出発緩衝液
（５０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 、ｐＨ７．０、２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．５Ｍイミダゾール）により平衡化した。該陽
イオン交換工程からの浸透性増強活性を含む分画を集
め、ＡｍｉｃｏｎＹＭ５膜を用いて約７００ｍｌから２
０ｍｌに濃縮した。濃縮において、通常形成される蛋白
質沈殿は、濾過により除去され得る。該試料を、周囲温
度（２５℃）にてカラムにかけ、流速０．５ｍｌ／分に
て、５０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 、ｐＨ７．０、２Ｍ Ｎ
ａＣｌ中のイミダゾール線形勾配（０．５ｍＭから６０
ｍＭ）を用いて５００分間で溶出した。
【００４２】逆相ＨＰＬＣ 逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰ
ＬＣ）は、３３０オングストロームの孔径の５μＭ充填
剤を含む４．６ｍｍ×２５ｃｍ Ｖｙｄａｃカラム（Ｓ
ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて行なっ
た。移動相は： "Ａ" 、水中の０．０５％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）および "Ｂ" 、アセトニトリル中の０．
０５％ＴＦＡであった。試料を負荷した後、カラムを "
Ａ" を用いて吸光度が再びベースラインに達するまで洗
浄し、次いで以下の線形勾配を用いて溶出した：０％な
いし２０％の "Ｂ" を２０分間、２０％ないし４０％の
"Ｂ" を続く８０分間、次いで４０％ないし１００％の
"Ｂ" を続く２０分間。流速はすべて１ｍｌ／分とし
た。分画はシリコン化ガラス試験管に集めた。
ＬＣ）は、３３０オングストロームの孔径の５μＭ充填
剤を含む４．６ｍｍ×２５ｃｍ Ｖｙｄａｃカラム（Ｓ
ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて行なっ
た。移動相は： "Ａ" 、水中の０．０５％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）および "Ｂ" 、アセトニトリル中の０．
０５％ＴＦＡであった。試料を負荷した後、カラムを "
Ａ" を用いて吸光度が再びベースラインに達するまで洗
浄し、次いで以下の線形勾配を用いて溶出した：０％な
いし２０％の "Ｂ" を２０分間、２０％ないし４０％の
"Ｂ" を続く８０分間、次いで４０％ないし１００％の
"Ｂ" を続く２０分間。流速はすべて１ｍｌ／分とし
た。分画はシリコン化ガラス試験管に集めた。
【００４３】Ｎ−末端アミノ酸配列分析 自動化エドマ
ン分解化学をＮ−末端アミノ酸配列の決定に使用した。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４７
０Ａ気相シーケンサー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃ
Ａ）を分解のために使用した〔Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ
らのＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１、３９９−
４１３（１９８３）〕。各々のＰＴＨ−アミノ酸誘導体
は、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．ＰＴＨ−Ｃ
18カラムに適合したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社のモデル１２０Ａ ＰＴＨ分析装置を用いたオン
ラインによるＲＰ−ＨＰＬＣにて同定した。ＰＴＨアミ
ノ酸の収量は、部外標準混合物との比較により測定し
た。繰返し収量の平均は、サイクル数プロットに対する
ｌｏｇピコモル収量の線形回帰分析により計算した。
ン分解化学をＮ−末端アミノ酸配列の決定に使用した。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル４７
０Ａ気相シーケンサー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃ
Ａ）を分解のために使用した〔Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ
らのＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１、３９９−
４１３（１９８３）〕。各々のＰＴＨ−アミノ酸誘導体
は、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．ＰＴＨ−Ｃ
18カラムに適合したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社のモデル１２０Ａ ＰＴＨ分析装置を用いたオン
ラインによるＲＰ−ＨＰＬＣにて同定した。ＰＴＨアミ
ノ酸の収量は、部外標準混合物との比較により測定し
た。繰返し収量の平均は、サイクル数プロットに対する
ｌｏｇピコモル収量の線形回帰分析により計算した。
【００４４】得られた配列と公知の配列との間の類似性
は、コンピュータプログラムＦＡＳＴ Ａ〔Ｐｅａｒｓ
ｏｎおよびＬｉｐｍａｎのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、２４４４−２４４８（１９
８８）〕を使用して評価した。類似性の検索は、Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒａｒｃ
ｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ）の蛋白質配列デ
ータベース〔Ｓｉｄｎｅｙらの、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１６ １８６９−１８７１（１９８
８）、リリース１７、１９８８年６月〕および翻訳ＧＥ
ＮＢＡＮＫ ＤＮＡベース〔ＢｉｌｏｆｓｋｙおよびＢ
ｕｒｋｓの、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
６、１８６１−１８６４（１９８８）、リリース５６、
１９８８年６月〕に対しても行なった。
は、コンピュータプログラムＦＡＳＴ Ａ〔Ｐｅａｒｓ
ｏｎおよびＬｉｐｍａｎのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、２４４４−２４４８（１９
８８）〕を使用して評価した。類似性の検索は、Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒａｒｃ
ｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ）の蛋白質配列デ
ータベース〔Ｓｉｄｎｅｙらの、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１６ １８６９−１８７１（１９８
８）、リリース１７、１９８８年６月〕および翻訳ＧＥ
ＮＢＡＮＫ ＤＮＡベース〔ＢｉｌｏｆｓｋｙおよびＢ
ｕｒｋｓの、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
６、１８６１−１８６４（１９８８）、リリース５６、
１９８８年６月〕に対しても行なった。
【００４５】トリプシンペプチドを、還元およびアルキ
ル化ｈＶＰＦから調製した。ｈＶＰＦ（１ｎ ｍｏｌ
ｅ）を、１００μｌの０．５Ｍトリス ＨＣｌ、ｐＨ
８．５、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
および５ｍＭジチオスレイトールに溶解させた。該溶液
を、３７℃にて３０分間熟成した後に、ヨウ化酢酸ナト
リウム（最終濃度５ｍＭ）を添加し、４℃で一夜熟成し
た。２Ｍ グアニジンＨＣｌ、０．０１Ｍ トリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．５に対して透析した後、次いで０．１Ｍ
炭酸水素アンモニウム、１μｇのＴＰＣＫ処理トリプシ
ン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｏ）を加え、該溶液を３７℃にて一夜熟成した。
ペプチド類は、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ18、５ミクロ
ン、１００Å、４．６×２５０ｍｍカラム（Ｍａｃｈｅ
ｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより
分離した。流速は、室温で１ｍｌ／分であった。０．１
％トリフルオロ酢酸中の０ないし９０％アセトニトリル
の線形勾配を２７０分間の操作にて溶出のために使用し
た。
ル化ｈＶＰＦから調製した。ｈＶＰＦ（１ｎ ｍｏｌ
ｅ）を、１００μｌの０．５Ｍトリス ＨＣｌ、ｐＨ
８．５、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
および５ｍＭジチオスレイトールに溶解させた。該溶液
を、３７℃にて３０分間熟成した後に、ヨウ化酢酸ナト
リウム（最終濃度５ｍＭ）を添加し、４℃で一夜熟成し
た。２Ｍ グアニジンＨＣｌ、０．０１Ｍ トリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．５に対して透析した後、次いで０．１Ｍ
炭酸水素アンモニウム、１μｇのＴＰＣＫ処理トリプシ
ン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｏ）を加え、該溶液を３７℃にて一夜熟成した。
ペプチド類は、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ18、５ミクロ
ン、１００Å、４．６×２５０ｍｍカラム（Ｍａｃｈｅ
ｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより
分離した。流速は、室温で１ｍｌ／分であった。０．１
％トリフルオロ酢酸中の０ないし９０％アセトニトリル
の線形勾配を２７０分間の操作にて溶出のために使用し
た。
【００４６】電気泳動 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＰ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いて
１０−１５％勾配ポリアクリルアミドゲル上で行なっ
た。緩衝液系および銀染色プロトコールは、製造者が勧
めるものであった。
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＰ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いて
１０−１５％勾配ポリアクリルアミドゲル上で行なっ
た。緩衝液系および銀染色プロトコールは、製造者が勧
めるものであった。
【００４７】抗体およびイムノアッセイ ｇＶＰＦに対
するウサギポリクローナル抗血清（Ｆ００１と命名）を
ニュジーランド白（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔ
ｅ）（ＮＺＷ）ウサギにｇＶＰＦを反復して注射し、免
疫することによって調製した。最初の注射は、完全フロ
イントアジュバントをもって行なわれ、引続き、不完全
フロイントアジュバントでの促進が行なわれた。ｇＶＰ
Ｆは、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔ＳｅｎｇｅｒらのＳｃ
ｉｅｎｃｅ ２１９、９８３−９８５（１９８３）〕、
続いてＳｅｎｇｅｒらのＦｅｄ．Ｐｒｏｃ．４６、２１
０２（１９８７）の精製方法により精製した。
するウサギポリクローナル抗血清（Ｆ００１と命名）を
ニュジーランド白（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔ
ｅ）（ＮＺＷ）ウサギにｇＶＰＦを反復して注射し、免
疫することによって調製した。最初の注射は、完全フロ
イントアジュバントをもって行なわれ、引続き、不完全
フロイントアジュバントでの促進が行なわれた。ｇＶＰ
Ｆは、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔ＳｅｎｇｅｒらのＳｃ
ｉｅｎｃｅ ２１９、９８３−９８５（１９８３）〕、
続いてＳｅｎｇｅｒらのＦｅｄ．Ｐｒｏｃ．４６、２１
０２（１９８７）の精製方法により精製した。
【００４８】サンドイッチ酵素結合免疫吸着剤アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）をヒトおよびモルモットＶＰＦに対して
下記のように行なった。Ｆ００１抗血清のＩｇＧ分画
を、蛋白質Ａ−セファロースへの吸着を用いて精製し
た。１１番目の採血血清から得られたＩｇＧの５００ｎ
ｇ／ウエルを、ポリスチレン微量滴定プレート上に３時
間で被覆した。次いで、種々の既知濃度のヒトおよびモ
ルモットＶＰＦを一夜結合に供した。濃度は、マイルズ
浸透性アッセイにおいて検出可能な応答を生じる最大希
釈度から評価した。この濃度は、ＶＰＦの５０ｎｇ／ｍ
ｌであった。結合した抗原の量は、５００ｎｇ／ウエル
のビオチン−ａ−ｇＶＰＦ ＩｇＧ（１１番目の採血Ｆ
００１抗血清）を２時間、次いで１／２０００希釈ワサ
ビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）−アビジン（Ｃａｐｐｅ
ｌ Ｌａｂｓ）を９０分間用いて検出した。ウエルをＨ
ＲＰ気質であるｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌとＨ
2 Ｏ2とを用いて展開し、吸光度をＢｉｏＴｅｋ読取り
装置により４９０ｎｍにて測定した。
（ＥＬＩＳＡ）をヒトおよびモルモットＶＰＦに対して
下記のように行なった。Ｆ００１抗血清のＩｇＧ分画
を、蛋白質Ａ−セファロースへの吸着を用いて精製し
た。１１番目の採血血清から得られたＩｇＧの５００ｎ
ｇ／ウエルを、ポリスチレン微量滴定プレート上に３時
間で被覆した。次いで、種々の既知濃度のヒトおよびモ
ルモットＶＰＦを一夜結合に供した。濃度は、マイルズ
浸透性アッセイにおいて検出可能な応答を生じる最大希
釈度から評価した。この濃度は、ＶＰＦの５０ｎｇ／ｍ
ｌであった。結合した抗原の量は、５００ｎｇ／ウエル
のビオチン−ａ−ｇＶＰＦ ＩｇＧ（１１番目の採血Ｆ
００１抗血清）を２時間、次いで１／２０００希釈ワサ
ビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）−アビジン（Ｃａｐｐｅ
ｌ Ｌａｂｓ）を９０分間用いて検出した。ウエルをＨ
ＲＰ気質であるｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌとＨ
2 Ｏ2とを用いて展開し、吸光度をＢｉｏＴｅｋ読取り
装置により４９０ｎｍにて測定した。
【００４９】ウサギＦ００１の初期採血は、後期採血に
比べて、ｈＶＰＦとの交差反応性抗体のより高濃度およ
び／またはより高い親和性を含むことが観察された。従
って、ｈＶＰＦについてのＥＬＩＳＡを、初期採血（４
番目の採血）抗血清を用いて行なった。１５００ｎｇ／
ウエルのビオチン−Ｆ００１ ＩｇＧ（４番目の採血）
を結合抗原の量を検出するために用いたことを除き、上
述したのと同じ条件下で行なった。
比べて、ｈＶＰＦとの交差反応性抗体のより高濃度およ
び／またはより高い親和性を含むことが観察された。従
って、ｈＶＰＦについてのＥＬＩＳＡを、初期採血（４
番目の採血）抗血清を用いて行なった。１５００ｎｇ／
ウエルのビオチン−Ｆ００１ ＩｇＧ（４番目の採血）
を結合抗原の量を検出するために用いたことを除き、上
述したのと同じ条件下で行なった。
【００５０】結果 Ｕ−９３７浸透性増強活性 培養におけるＵ−９３７細
胞由来の無血清調節培地は、マイルズ浸透性アッセイに
ついての試験で正の応答を生じた。下記の例２から分か
るように、多くの細胞はＶＰＥ様活性を生じなかったこ
とから、これらの結果は予期し得なかった。マイルズア
ッセイは、試験試料の皮内注射後における循環系からの
Ｅｖａｎの青色染料−血清アルブミン複合体の滲出を測
定する。しかしながら、このアッセイは非特異的であ
り、例えばヒスタミンを含む種々の物質により正の応答
が測定される。従って、Ｕ−９３７細胞により生成され
る浸透性増強活性が、モルモット腫瘍ＶＰＦに関連する
ものであるかどうかについては、最初には分からなかっ
た。このことを試験するために、該培地を蛋白質Ａ−セ
ファロースTMおよびｇＶＰＦに対するポリクローナル抗
血清から入手したＩｇＧからなる免疫吸着と混合した。
該Ｕ−９３７培地中の浸透性増強活性は、すべてではな
いにせよ、ほとんどがこの処理で吸着されるが、これに
代えてｇＶＰＦで免疫していないウサギから得た対照Ｉ
ｇＧの場合には吸着しなかった。従って、Ｕ−９３７細
胞の培地中に分泌された浸透性増強活性のほとんどは、
モルモット腫瘍誘導ＶＰＦに関連するものと思われる。
しかしながら、下記に議論するように、ｈＶＰＦがある
種の免疫交差反応性をｇＶＰＦと共有するとしても、そ
れは免疫学的にはｇＶＰＦとは区別される。
胞由来の無血清調節培地は、マイルズ浸透性アッセイに
ついての試験で正の応答を生じた。下記の例２から分か
るように、多くの細胞はＶＰＥ様活性を生じなかったこ
とから、これらの結果は予期し得なかった。マイルズア
ッセイは、試験試料の皮内注射後における循環系からの
Ｅｖａｎの青色染料−血清アルブミン複合体の滲出を測
定する。しかしながら、このアッセイは非特異的であ
り、例えばヒスタミンを含む種々の物質により正の応答
が測定される。従って、Ｕ−９３７細胞により生成され
る浸透性増強活性が、モルモット腫瘍ＶＰＦに関連する
ものであるかどうかについては、最初には分からなかっ
た。このことを試験するために、該培地を蛋白質Ａ−セ
ファロースTMおよびｇＶＰＦに対するポリクローナル抗
血清から入手したＩｇＧからなる免疫吸着と混合した。
該Ｕ−９３７培地中の浸透性増強活性は、すべてではな
いにせよ、ほとんどがこの処理で吸着されるが、これに
代えてｇＶＰＦで免疫していないウサギから得た対照Ｉ
ｇＧの場合には吸着しなかった。従って、Ｕ−９３７細
胞の培地中に分泌された浸透性増強活性のほとんどは、
モルモット腫瘍誘導ＶＰＦに関連するものと思われる。
しかしながら、下記に議論するように、ｈＶＰＦがある
種の免疫交差反応性をｇＶＰＦと共有するとしても、そ
れは免疫学的にはｇＶＰＦとは区別される。
【００５１】ｈＶＰＦ精製 Ｕ−９３７細胞誘導浸透性
増強活性の精製における最初の試みは、Ｓｅｎｇｅｒら
のＦｅｄ．Ｐｒｏｃ．４６、２１０２（１９８７）に記
載されているｇＶＰＦのために先に使用された精製方法
の採用であった。この方法の適用、またはその僅かな修
飾は、該浸透性増強活性のクロマトグラフィ的挙動がｇ
ＶＰＦに類似していたにもかかわらず、Ｕ−９３７細胞
調節培地から、均質蛋白質を精製しなかった。従って、
陽イオン交換クロマトグラフィ、金属アフィニティクロ
マトグラフィ、およびＲＰ−ＨＰＬＣを組合せた新規な
精製方法が開発された（図１）。第１の工程において
は、濃縮調節培地、Ｓセファロース陽イオン交換カラム
に通した（図２Ａ）。ｐＨ７．０において、約５０−７
０％の浸透性増強活性がカラムに結合した。結合しない
活性は、特徴付けしなかった。結合した活性は、塩化ナ
トリウムの勾配により溶出し、そして限外濾過による濃
縮後、金属アフィニティカラムに負荷した（図２Ｂ）。
すべての検出可能な活性は、銅／ＩＤＡ／セファロース
カラムに強く結合し、ほとんどの別の蛋白質の後にイミ
ダゾール勾配中に溶出した。最終工程は、ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃを使用し（図２Ｃ）、浸透性増強活性のピークに伴わ
れた分画中のＭｒ〜４０ｋＤａの蛋白質類の群の溶出を
生じた（図２Ｄ）。この方法は、多数回反復され、銀染
色またはＮ−末端分析によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析さ
れた約９０％以上の純度のＭｒ〜４０ｋＤａの蛋白質を
再現性をもって生成した。約１−２μｇの純粋な蛋白質
が、Ｕ−９３７細胞調節培地１リットルあたりから得ら
れる。
増強活性の精製における最初の試みは、Ｓｅｎｇｅｒら
のＦｅｄ．Ｐｒｏｃ．４６、２１０２（１９８７）に記
載されているｇＶＰＦのために先に使用された精製方法
の採用であった。この方法の適用、またはその僅かな修
飾は、該浸透性増強活性のクロマトグラフィ的挙動がｇ
ＶＰＦに類似していたにもかかわらず、Ｕ−９３７細胞
調節培地から、均質蛋白質を精製しなかった。従って、
陽イオン交換クロマトグラフィ、金属アフィニティクロ
マトグラフィ、およびＲＰ−ＨＰＬＣを組合せた新規な
精製方法が開発された（図１）。第１の工程において
は、濃縮調節培地、Ｓセファロース陽イオン交換カラム
に通した（図２Ａ）。ｐＨ７．０において、約５０−７
０％の浸透性増強活性がカラムに結合した。結合しない
活性は、特徴付けしなかった。結合した活性は、塩化ナ
トリウムの勾配により溶出し、そして限外濾過による濃
縮後、金属アフィニティカラムに負荷した（図２Ｂ）。
すべての検出可能な活性は、銅／ＩＤＡ／セファロース
カラムに強く結合し、ほとんどの別の蛋白質の後にイミ
ダゾール勾配中に溶出した。最終工程は、ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃを使用し（図２Ｃ）、浸透性増強活性のピークに伴わ
れた分画中のＭｒ〜４０ｋＤａの蛋白質類の群の溶出を
生じた（図２Ｄ）。この方法は、多数回反復され、銀染
色またはＮ−末端分析によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析さ
れた約９０％以上の純度のＭｒ〜４０ｋＤａの蛋白質を
再現性をもって生成した。約１−２μｇの純粋な蛋白質
が、Ｕ−９３７細胞調節培地１リットルあたりから得ら
れる。
【００５２】ｈＶＰＦ誘導浸透性増強の投与応答 異な
る量のｈＶＰＦをマイルズ浸透性アッセイにて試験し
た。正の応答を生じる最低の希釈は、約２．７５ｎＭの
ｈＶＰＦ濃度であった。これは、２２ｎｇの注射投与
量、またはＭｒ ４０ｋＤａのｈＶＰＦの０．５５ピコ
モルに対応する。これは、米国特許第４，４５６，５５
０号に記載されたｇＶＰＦによる同様な応答の為に必要
な２００ｎｇのわずか９分の１と同等である。
る量のｈＶＰＦをマイルズ浸透性アッセイにて試験し
た。正の応答を生じる最低の希釈は、約２．７５ｎＭの
ｈＶＰＦ濃度であった。これは、２２ｎｇの注射投与
量、またはＭｒ ４０ｋＤａのｈＶＰＦの０．５５ピコ
モルに対応する。これは、米国特許第４，４５６，５５
０号に記載されたｇＶＰＦによる同様な応答の為に必要
な２００ｎｇのわずか９分の１と同等である。
【００５３】ｈＶＰＦのアミノ酸配列 ｈＶＰＦをＮ−
末端アミノ酸配列分析に供した（第１表）。最初の６個
のアミノ酸については、ｈＶＰＦとモルモット腫瘍誘導
ｇＶＰＦとの間に完全な同等性が観察されたが、続く４
個のアミノ酸配列については、相違していた。従って、
このＮ−末端については、同等性は６０％にすぎない。
末端アミノ酸配列分析に供した（第１表）。最初の６個
のアミノ酸については、ｈＶＰＦとモルモット腫瘍誘導
ｇＶＰＦとの間に完全な同等性が観察されたが、続く４
個のアミノ酸配列については、相違していた。従って、
このＮ−末端については、同等性は６０％にすぎない。
【００５４】
【表２】
【００５５】約１ｎモル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染
色により約４０μｇと評価された）のｈＶＰＥを配列決
定した。各サイクルにおいて検出され、生成されたアミ
ノ酸を示してある（括弧内）。平均反復収率は７３％で
あった。これらのデータは、同様なｈＶＰＦ調製物につ
いての他の数回の操作の代表例である。内部配列情報を
得るために、ｈＶＰＦを還元し、ヨウ化酢酸でカルボキ
シメチル化し、トリプシンにより処理した。次いで、得
られたペプチド類をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離した。
単離されたペプチドの数個を、第２表に示すように配列
決定した。これらの配列およびＮ−末端配列のいずれも
が、発表されたデータベース中に存在する蛋白質に対し
て明らかな相同性を示さなかった。本発明の該新規なｈ
ＶＰＦは、従って以前に記述された蛋白質類およびｇＶ
ＰＦとは実質的に異なる。
色により約４０μｇと評価された）のｈＶＰＥを配列決
定した。各サイクルにおいて検出され、生成されたアミ
ノ酸を示してある（括弧内）。平均反復収率は７３％で
あった。これらのデータは、同様なｈＶＰＦ調製物につ
いての他の数回の操作の代表例である。内部配列情報を
得るために、ｈＶＰＦを還元し、ヨウ化酢酸でカルボキ
シメチル化し、トリプシンにより処理した。次いで、得
られたペプチド類をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離した。
単離されたペプチドの数個を、第２表に示すように配列
決定した。これらの配列およびＮ−末端配列のいずれも
が、発表されたデータベース中に存在する蛋白質に対し
て明らかな相同性を示さなかった。本発明の該新規なｈ
ＶＰＦは、従って以前に記述された蛋白質類およびｇＶ
ＰＦとは実質的に異なる。
【００５６】
【表３】
【００５７】還元されカルボキシメチル化されたｈＶＰ
Ｆをトリプシンにより処理し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分
離した。良好に単離されたペプチドを配列決定した。番
号表示は、該ペプチドが現れた分画番号に対応してい
る。
Ｆをトリプシンにより処理し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分
離した。良好に単離されたペプチドを配列決定した。番
号表示は、該ペプチドが現れた分画番号に対応してい
る。
【００５８】ｈＶＰＦの抗−ｇＶＰＦ抗体との反応性 ｇＶＰＦに対するポリクローナルウサギ抗体を、サンド
イッチＥＬＩＳＡを用いてｈＶＰＦとの交差反応性につ
いて試験した。図３は、ｈＶＰＦが抗−ｇＶＰＦ Ｉｇ
Ｇにより認識されたことを示しているが、検出に要する
ｈＶＰＦの濃度は、ｇＶＰＦに対しての場合より１０倍
高い。更には、ｈＶＰＦについて得られた最大吸収は有
意であるが（１．５吸光度単位背景より高い）、ｇＶＰ
Ｆを抗原として得られたものより３倍低い。これらの結
果は、これら２種の蛋白質は関連があるが、ｈＶＰＦは
ｇＶＰＦとは免疫学的に異なることを示唆している。
イッチＥＬＩＳＡを用いてｈＶＰＦとの交差反応性につ
いて試験した。図３は、ｈＶＰＦが抗−ｇＶＰＦ Ｉｇ
Ｇにより認識されたことを示しているが、検出に要する
ｈＶＰＦの濃度は、ｇＶＰＦに対しての場合より１０倍
高い。更には、ｈＶＰＦについて得られた最大吸収は有
意であるが（１．５吸光度単位背景より高い）、ｇＶＰ
Ｆを抗原として得られたものより３倍低い。これらの結
果は、これら２種の蛋白質は関連があるが、ｈＶＰＦは
ｇＶＰＦとは免疫学的に異なることを示唆している。
【００５９】例２ Ｕ−９３７細胞から誘導されたｈＶＰＦを、数種の他の
細胞株由来のＶＰＦとマイルズアッセイにより比較し、
次の結果を得た。Ｍｎｎｇ ＨＯＳヒト骨原性肉腫細胞
株を、ＳｅｎｇｅｒらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６、
５６２９−５６３２（１９８６）に記載されているＶＰ
Ｆ産生のための先行技術のヒト細胞株の代表として使用
した。該細胞を、ＲＰＭＩ １６４０またはＤＭＥのい
ずれかの無血清基底培地中で、１．５ないし２．０×１
０6 細胞／ｍｌの密度において４８時間抽出した。該抽
出物を集め、遠心分離して細胞および破片を除き、次い
で、必要に応じてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０メンブレン
（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて濃縮した。該抽
出部を、次いでマイルズアッセイにより試験した。第３
表に示す結果は、Ｕ−９３７細胞がｈＶＰＦの産生株と
して他の細胞株より顕著に有効であることを示してい
る。
細胞株由来のＶＰＦとマイルズアッセイにより比較し、
次の結果を得た。Ｍｎｎｇ ＨＯＳヒト骨原性肉腫細胞
株を、ＳｅｎｇｅｒらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６、
５６２９−５６３２（１９８６）に記載されているＶＰ
Ｆ産生のための先行技術のヒト細胞株の代表として使用
した。該細胞を、ＲＰＭＩ １６４０またはＤＭＥのい
ずれかの無血清基底培地中で、１．５ないし２．０×１
０6 細胞／ｍｌの密度において４８時間抽出した。該抽
出物を集め、遠心分離して細胞および破片を除き、次い
で、必要に応じてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０メンブレン
（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて濃縮した。該抽
出部を、次いでマイルズアッセイにより試験した。第３
表に示す結果は、Ｕ−９３７細胞がｈＶＰＦの産生株と
して他の細胞株より顕著に有効であることを示してい
る。
【００６０】
【表４】
【００６１】（ａ）調節培地は、マイルズアッセイによ
る試験に先立ってＸ倍に濃縮した。 （ｂ）試料の活性＝青色スポットが検出可能な試料の最
大希釈度。 １単位（ｕ）＝ＶＰＥを含まない対照注射から識別可能
な最小の検出可能な青色スポットを生じる試料中のＶＰ
Ｆの量。 （ｃ）米国特許第４，４５６，５５０号のモルモット細
胞株１０ＶＰＦで確立された関係、１単位活性＝５０ｎ
ｇ／ｍｌに基づく、ｎｇ／ｍｌにおける非濃縮使用培地
中のＶＰＥ濃度の評価。 （ｄ）限界希釈クローニング法により得られた産生活性
１００−８００ｎｇ／ｍｌの範囲の数種のクローン。 （ｅ）試料の希釈はこのアッセイでは行なわなかったた
め、Ｍｎｎｇ ＨＯＳ細胞の先に決定された活性に基く
評価である。
る試験に先立ってＸ倍に濃縮した。 （ｂ）試料の活性＝青色スポットが検出可能な試料の最
大希釈度。 １単位（ｕ）＝ＶＰＥを含まない対照注射から識別可能
な最小の検出可能な青色スポットを生じる試料中のＶＰ
Ｆの量。 （ｃ）米国特許第４，４５６，５５０号のモルモット細
胞株１０ＶＰＦで確立された関係、１単位活性＝５０ｎ
ｇ／ｍｌに基づく、ｎｇ／ｍｌにおける非濃縮使用培地
中のＶＰＥ濃度の評価。 （ｄ）限界希釈クローニング法により得られた産生活性
１００−８００ｎｇ／ｍｌの範囲の数種のクローン。 （ｅ）試料の希釈はこのアッセイでは行なわなかったた
め、Ｍｎｎｇ ＨＯＳ細胞の先に決定された活性に基く
評価である。
【００６２】例３ 材料 すべての試薬および略記号は、特記しない限りＭａｎｉ
ａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９８２に記載されているものと同じである。λｇ
ｔ１０ライブラリーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．Ｃａ
ｌｉｆ（カタログ番号ＨＬ１０３６ａ）から入手し、こ
れはフォルボルミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ）により処理
されたＵ−９３７細胞から調製された。
ａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９８２に記載されているものと同じである。λｇ
ｔ１０ライブラリーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．Ｃａ
ｌｉｆ（カタログ番号ＨＬ１０３６ａ）から入手し、こ
れはフォルボルミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ）により処理
されたＵ−９３７細胞から調製された。
【００６３】方法 λｇｔ１０Ｃｌｏｎｔｅｃｈライブラリーのオリゴヌク
レオチドスクリーニング方法 フォルボル−エステル刺
激Ｕ−９３７細胞から構築されたλｇｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．
ＣＡ）由来の約５×１０5 クローンを、２個の最良の推
定オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニング
した。Ｎ−末端アミノ酸配列決定に基づく（ｈＶＰＦの
アミノ酸１−１０）第１のプローブ、
レオチドスクリーニング方法 フォルボル−エステル刺
激Ｕ−９３７細胞から構築されたλｇｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．
ＣＡ）由来の約５×１０5 クローンを、２個の最良の推
定オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニング
した。Ｎ−末端アミノ酸配列決定に基づく（ｈＶＰＦの
アミノ酸１−１０）第１のプローブ、
【化９】 は、単一のｇｔ１０クローンとハイブリッド化した。ｈ
ＶＰＦのアミノ酸３３−４５に対応するトリプシンペプ
チドからの配列情報に基く第２のプローブ、
ＶＰＦのアミノ酸３３−４５に対応するトリプシンペプ
チドからの配列情報に基く第２のプローブ、
【化１０】 は、０．８ないし３．５ｋｂの大きさの範囲の挿入物を
含有する７個のクローンとハイブリッド化した。
含有する７個のクローンとハイブリッド化した。
【００６４】スクリーニングする方法は、Ｕｌｌｒｉｃ
ｈらの、ＥＭＢＯ Ｊ．３、３６１−３６４（１９８
４）によるもので、次の修飾を含む：サケ精子に代えて
精製酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ３００
１）を用い、ハイブリダイゼーション溶液からピロリン
酸ナトリウムとＡＴＰとを除いた。３．５ｋｂの大きさ
を有する前記クローン中の最大のもの、すなわちクロー
ン４をｐＵＣ９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）にサブクローン化し、これによりプラスミドベクタ
ーｐＭＯＮ３０４４（図４参照）を生成し、Ｕｎｉｔｅ
ｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手し
た試薬を用いてＳａｎｇｅｒらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７
（１９７７）の一般的ジデオキシー末端化法により１１
９５ｂｐの配列を得た。ヌクレオチド２８８から１１１
０までに対応する配列は、ＤＮＡの両方の鎖の配列決定
により得られた。ヌクレオチド１４７−２８８は、一方
の鎖のみから決定したが、２種類の異なった配列決定プ
ライマーを用いて２回配列決定を行なっている。ｐＭＯ
Ｎ３０４４構築物の多重制限エンドヌクレアーゼ消化パ
ターンの結果としてのアガロースゲルにおけるＤＮＡバ
ンド回帰パターンは、図４に示すようなクローンの配向
を示した。
ｈらの、ＥＭＢＯ Ｊ．３、３６１−３６４（１９８
４）によるもので、次の修飾を含む：サケ精子に代えて
精製酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ３００
１）を用い、ハイブリダイゼーション溶液からピロリン
酸ナトリウムとＡＴＰとを除いた。３．５ｋｂの大きさ
を有する前記クローン中の最大のもの、すなわちクロー
ン４をｐＵＣ９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）にサブクローン化し、これによりプラスミドベクタ
ーｐＭＯＮ３０４４（図４参照）を生成し、Ｕｎｉｔｅ
ｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手し
た試薬を用いてＳａｎｇｅｒらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７
（１９７７）の一般的ジデオキシー末端化法により１１
９５ｂｐの配列を得た。ヌクレオチド２８８から１１１
０までに対応する配列は、ＤＮＡの両方の鎖の配列決定
により得られた。ヌクレオチド１４７−２８８は、一方
の鎖のみから決定したが、２種類の異なった配列決定プ
ライマーを用いて２回配列決定を行なっている。ｐＭＯ
Ｎ３０４４構築物の多重制限エンドヌクレアーゼ消化パ
ターンの結果としてのアガロースゲルにおけるＤＮＡバ
ンド回帰パターンは、図４に示すようなクローンの配向
を示した。
【００６５】結果 フォルボル−エステル刺激Ｕ−９３７細胞から単離され
たｍＲＮＡを用いて調製されたλｇｔ１０ライブラリー
から、３．５ｋｂｃＤＮＡクローン（ＶＰＦ−４と命
名）を単離した。このクローンをプラスミドベクターｐ
ＵＣ９に移動させて、これにより構築物ｐＭＯＮ３０４
４を形成した。次いでｈＶＰＦ ｃＤＮＡに対する１１
９５ｂｐの配列を作成した。該プラスミドベクター中の
ｈＶＰＦのｃＤＮＡの配向を決定するために、種々の制
限エンドヌクレアーゼを用いた。該ｃＤＮＡの選択され
たエンドヌクレアーゼ処理は、該ｈＶＰＦ ｃＤＮＡ中
に、アミノおよびカルボキシ末端に対するそれぞれ約１
３００および１６００ｂｐの非翻訳ヌクレオチド配列が
存在することを示した。該ｈＶＰＦ／ｐＵＣ９構築物
（図４参照）の大きさは、約６２００ｂｐである。これ
は、ｈＶＰＦ ｃＤＮＡ由来の約３５００ｂｐと、プラ
スミドｐＵＣ９由来の約２７００ｂｐとの和である。
たｍＲＮＡを用いて調製されたλｇｔ１０ライブラリー
から、３．５ｋｂｃＤＮＡクローン（ＶＰＦ−４と命
名）を単離した。このクローンをプラスミドベクターｐ
ＵＣ９に移動させて、これにより構築物ｐＭＯＮ３０４
４を形成した。次いでｈＶＰＦ ｃＤＮＡに対する１１
９５ｂｐの配列を作成した。該プラスミドベクター中の
ｈＶＰＦのｃＤＮＡの配向を決定するために、種々の制
限エンドヌクレアーゼを用いた。該ｃＤＮＡの選択され
たエンドヌクレアーゼ処理は、該ｈＶＰＦ ｃＤＮＡ中
に、アミノおよびカルボキシ末端に対するそれぞれ約１
３００および１６００ｂｐの非翻訳ヌクレオチド配列が
存在することを示した。該ｈＶＰＦ／ｐＵＣ９構築物
（図４参照）の大きさは、約６２００ｂｐである。これ
は、ｈＶＰＦ ｃＤＮＡ由来の約３５００ｂｐと、プラ
スミドｐＵＣ９由来の約２７００ｂｐとの和である。
【００６６】ｃＤＮＡ配列の予測は、直接的アミノ酸配
列決定を用いて先に決定されたＮ−末端および数個のト
リプシンペプチドと１００％の相同性を示した。これら
の配列は、アミノ酸１−１８、１７−２３、３３−４５
および４６−５５に各々対応する。シグナル配列（アミ
ノ酸−２６から−１）および単一のＡｓｎ７５における
Ｎ−結合グリコシル化部位もまた見出された。これらの
結果は、ｈＶＰＦが、分泌され、またグリコシル化され
た蛋白質であることを支持している。上記のＵ−９３７
細胞−誘導ｈＶＰＦのＮ−末端配列と、モルモット株１
０腫瘍細胞由来の精製ｇＶＰＦのアミノ酸配列決定によ
り決定されたｇＶＰＦの配列とを比較することにより、
ｈＶＰＦとｇＶＰＦとのアミノ酸配列の比較を以下のよ
うに更に行なった：
列決定を用いて先に決定されたＮ−末端および数個のト
リプシンペプチドと１００％の相同性を示した。これら
の配列は、アミノ酸１−１８、１７−２３、３３−４５
および４６−５５に各々対応する。シグナル配列（アミ
ノ酸−２６から−１）および単一のＡｓｎ７５における
Ｎ−結合グリコシル化部位もまた見出された。これらの
結果は、ｈＶＰＦが、分泌され、またグリコシル化され
た蛋白質であることを支持している。上記のＵ−９３７
細胞−誘導ｈＶＰＦのＮ−末端配列と、モルモット株１
０腫瘍細胞由来の精製ｇＶＰＦのアミノ酸配列決定によ
り決定されたｇＶＰＦの配列とを比較することにより、
ｈＶＰＦとｇＶＰＦとのアミノ酸配列の比較を以下のよ
うに更に行なった：
【化１１】
【００６７】モルモットおよびヒト腫瘍細胞株由来のＶ
ＰＦのアミノ末端の比較は、明確な差異を示している。
ｇＶＰＦ配列中のアミノ酸位置７および８の間のギャッ
プは、２つの蛋白質の間に重複を生じるためには挿入さ
れなければならない。更に、ｈＶＰＦからの番号付けを
用いて、非同等残基のいくつかの領域、すなわちアミノ
酸７，８，１０，１１，１２，２２，２７および３１に
おけるものが示された。
ＰＦのアミノ末端の比較は、明確な差異を示している。
ｇＶＰＦ配列中のアミノ酸位置７および８の間のギャッ
プは、２つの蛋白質の間に重複を生じるためには挿入さ
れなければならない。更に、ｈＶＰＦからの番号付けを
用いて、非同等残基のいくつかの領域、すなわちアミノ
酸７，８，１０，１１，１２，２２，２７および３１に
おけるものが示された。
【００６８】例４ｈＶＰＦ遺伝子をトランスフェクトされたＣ−１２７細
胞による浸透性−増強活性の発現 無血清調節培地を、ｈＶＰＦ ｃＤＮＡ配列を含むＢＰ
Ｖ発現ベクターによりトランスフェクトされた３種類の
選択されたｈＶＰＥ細胞株（ＶＰＦ−２５Ｂ、−２９
Ｂ、および−３０Ｂ）から、またはＢＰＶベクターのみ
によりトランスフェクトされた対照株（ＢＰＶ−１１２
３）から採集した。このＢＰＶベクターは、周知のｐＢ
Ｒ３２２誘導体ｐＭＬ２に連結された完全なウシパピロ
ーマウイルスゲノムを含んでいる。培地は、マイルズの
浸透性アッセイを行なう前に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１
０限外濾過装置を用いて５倍に濃縮した。正の応答は、
Ｅｖａｎの青色染料の循環系からの滲出を示す、試料の
モルモットへの皮内注射部位における青色スポットの出
現により示される。
胞による浸透性−増強活性の発現 無血清調節培地を、ｈＶＰＦ ｃＤＮＡ配列を含むＢＰ
Ｖ発現ベクターによりトランスフェクトされた３種類の
選択されたｈＶＰＥ細胞株（ＶＰＦ−２５Ｂ、−２９
Ｂ、および−３０Ｂ）から、またはＢＰＶベクターのみ
によりトランスフェクトされた対照株（ＢＰＶ−１１２
３）から採集した。このＢＰＶベクターは、周知のｐＢ
Ｒ３２２誘導体ｐＭＬ２に連結された完全なウシパピロ
ーマウイルスゲノムを含んでいる。培地は、マイルズの
浸透性アッセイを行なう前に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１
０限外濾過装置を用いて５倍に濃縮した。正の応答は、
Ｅｖａｎの青色染料の循環系からの滲出を示す、試料の
モルモットへの皮内注射部位における青色スポットの出
現により示される。
【００６９】該ｈＶＰＦ ｃＤＮＡは、こうしてウシパ
ピローマウィルス（ＢＰＶ）ベクターを用いて哺乳類細
胞中で発現された。このベクターは、１００％のウィル
ス性ゲノムに基き、外来遺伝子の発現を制御するために
マウスメタロチオニンＩプロモータおよびＳＶ４０後期
ポリＡ付加部位を利用している。該ベクターは、プロモ
ータとポリＡ付加部位との間の特異的ＢａｍＨＩ部位に
おいて線形化された。該ベクター断片の５′突出末端を
クレナウ酵素とｄＮＴＰ類とを用いて充填した。同様
に、ｈＶＰＦ ｃＤＮＡを含むプラスミドをＸｍａＩに
より消化し、１０２１ｂｐＶＰＦ断片をゲル電気泳動に
より単離した。この平滑末端断片を、次いで、該ベクタ
ーに連結により挿入した。マウスＣ−１２７細胞は、Ｈ
ｏｗｌｅｙらのＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１、３
８７−４０３（１９８３）に記載されているリン酸カル
シウム沈殿法により、該ｈＶＰＦ発現ベクターおよびｐ
ＳＶ２ｎｅｏでコトランスフェクトされた。Ｇ４１８
（ゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ））耐性のトランスフ
ェクタントを選択した。コロニーを摘取り、マイルズア
ッセイによるアッセイのために安定な株へと展開させ
た。当業者には、この開示の読後においては、本発明の
精神および範囲を離れることなく種々の他の例が明らか
となるであろう。そのような全ての例は、本願特許請求
の範囲に包含されることを意図している。
ピローマウィルス（ＢＰＶ）ベクターを用いて哺乳類細
胞中で発現された。このベクターは、１００％のウィル
ス性ゲノムに基き、外来遺伝子の発現を制御するために
マウスメタロチオニンＩプロモータおよびＳＶ４０後期
ポリＡ付加部位を利用している。該ベクターは、プロモ
ータとポリＡ付加部位との間の特異的ＢａｍＨＩ部位に
おいて線形化された。該ベクター断片の５′突出末端を
クレナウ酵素とｄＮＴＰ類とを用いて充填した。同様
に、ｈＶＰＦ ｃＤＮＡを含むプラスミドをＸｍａＩに
より消化し、１０２１ｂｐＶＰＦ断片をゲル電気泳動に
より単離した。この平滑末端断片を、次いで、該ベクタ
ーに連結により挿入した。マウスＣ−１２７細胞は、Ｈ
ｏｗｌｅｙらのＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１、３
８７−４０３（１９８３）に記載されているリン酸カル
シウム沈殿法により、該ｈＶＰＦ発現ベクターおよびｐ
ＳＶ２ｎｅｏでコトランスフェクトされた。Ｇ４１８
（ゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ））耐性のトランスフ
ェクタントを選択した。コロニーを摘取り、マイルズア
ッセイによるアッセイのために安定な株へと展開させ
た。当業者には、この開示の読後においては、本発明の
精神および範囲を離れることなく種々の他の例が明らか
となるであろう。そのような全ての例は、本願特許請求
の範囲に包含されることを意図している。
【図１】ヒトＶＰＦの精製工程を示す模式図。
【図２Ａ】精製工程における溶出パターンを示す図。
【図２Ｂ】精製工程における溶出パターンを示す図。
【図２Ｃ】精製工程における溶出パターンを示す図。
【図２Ｄ】精製工程における溶出パターンを示す図。
【図３】ｈＶＰＦとｇＶＰＦとのＥＬＩＳＡの結果を示
す図。
す図。
【図４】プラスミドｈＶＰＦ／ｐＵＣ９の構造を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョセフ フィーダー アメリカ合衆国ミズリー州ユニバーシイ ティ シイティ，マルベリイ レーン 935 (72)発明者 ジットカ ベラ オランダー アメリカ合衆国ミズリー州ユニバーシイ ティ シイティ，キングスベリィ ブー ルバード 7114 (56)参考文献 特開 平４−505705（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】 下記のヌクレオチド配列を含むヒト血管
浸透性因子のｃＤＮＡ： 【化１２】 【化１３】 - 【請求項２】 請求項１に記載のヒト血管浸透性因子の
ｃＤＮＡを含むプラスミドｈＶＰＦ／ｐＵＣ９． - 【請求項３】 請求項１に記載のｃＤＮＡを含有する約
３．５ｋｂのヒト血管浸透性因子のｃＤＮＡクローンＶ
ＰＦ−４。 - 【請求項４】 請求項１に記載のヒト血管浸透性因子の
ｃＤＮＡを含むベクターによりトランスフェクトされた
哺乳類細胞。 - 【請求項５】 請求項１に記載のヒト血管浸透性因子の
ｃＤＮＡを含むベクターによりトランスフェクトされた
Ｃ−１２７マウス細胞。 - 【請求項６】 下記のヌクレオチド配列を含むヒト血管
浸透性因子をコードする単離されたＤＮＡ。 【化１４】
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|---|---|---|---|
| JP1301810A Expired - Lifetime JP2567114B2 (ja) | 1988-11-21 | 1989-11-20 | ヒト血管浸透性因子 |
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