JP2001509168A

JP2001509168A - 血管新生を誘導するためのアデノウイルスベクターの多部位送達

Info

Publication number: JP2001509168A
Application number: JP53224998A
Authority: JP
Inventors: ケイ．ローゼンガート、トッド; ジー．クリスタル、ロナルド
Original assignee: コーネルリサーチファウンデーション、インコーポレイティッド
Priority date: 1997-01-29
Filing date: 1998-01-29
Publication date: 2001-07-10
Also published as: IL131021A0; NO993669L; NO993669D0; US20010041679A1; CA2278621A1; US6518255B2; KR20000070572A; HUP0001964A3; DE69827021D1; PL334902A1; EP1012291B1; AU745409B2; US20030103943A1; EP1012291A1; BR9806819A; HUP0001964A2; WO1998032859A1; ATE279518T1; AU6253098A; MXPA99006993A

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的組織への血液の灌流のレベルを増進させる方法、虚血性損傷を病んでいるか、あるいは病む危険性のある標的組織の処置方法、標的組織における血管新生の誘導方法、および／または血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある標的組織における側副血管形成の誘導方法を提供する。本発明の方法は、(a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織へ投与し、該標的組織への血液の灌流のレベルを増進させ、該用量により該標的組織において治療または予防効果をもたらし、該標的組織において血管新生を誘導し、および／または該アデノウイルスベクターを側副血管形成のための起点、終点およびそれらの間の領域を含む領域に接触させて側副血管形成を誘導する。

Description

【発明の詳細な説明】血管新生を誘導するためのアデノウイルスベクターの多部位送達発明の技術分野本発明は標的組織への血液の灌流のレベルを増進させる方法、虚血性損傷を病むか、あるいは病む危険性のある標的組織の処置方法、並びに標識組織内での血管新生の誘導方法に関する。発明の背景新しい血管の成長である血管新生は、血管基底膜の破壊、内皮細胞の移動および増殖、並びにその後の血管の形成および成熟を含む複雑な過程である。いくつかのメディエーターが血管新生応答を誘導することが知られており、これらのメディエーターの投与により虚血組織の血管再形成が促進される。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ蛋白）は、その受容体が内皮細胞上にほとんど独占的に局在するために、公知の血管新生のメディエーターの中で最も特異的なものの１つである。ＶＥＧＦに対する受容体は虚血条件下で上向きに調節され、組換えＶＥＧＦを投与すると、側副血管の発生が生じ、末梢および心筋の虚血組織における機能が向上する。しかしながら、ＶＥＧＦ蛋白の送達は非常に困難である。ＶＥＧＦ蛋白の半減期は非常に短く、高用量のＶＥＧＦ蛋白の投与は低血圧を伴い、また、ＶＥＧＦ蛋白の全身投与はターゲッティングすべき組織以外の組織における無差別な血管新生の誘導を引き起こし得る。無差別な血管新生の誘導は、失明を引き起こし、腫瘍細胞の侵襲性を増大させ、多くの他のネガティブな副作用を引き起こし得る。さらに、送達されるＶＥＧＦ蛋白の量が重要である。もしＶＥＧＦ蛋白があまりにも少ししか送達されなければ、血管新生は誘導されず、顕著な治療的利益は達成されないだろう。もしＶＥＧＦ蛋白があまりにも多く送達されれば、結果として無秩序な血管系の下地の形成、冒された組織における機能の喪失および無差別な血管新生が起こり得る。さらに、血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含有するリポソームおよび／または「裸の」ＤＮＡの投与を介した血管新生の誘導もまた、多くの短所を抱えている。特に、リポソームと「裸の」ＤＮＡの送達形式は、どちらも細胞への遺伝子導入においてウイルスよりも効率が低く、宿主ゲノムへの組込みにおいて非効率的であり、また、特定の組織にターゲッティングすることが困難である。前記の点を考慮して、標的組織における血管新生を誘導する有効な方法が要望されている。本発明はそのような方法を提供する。これらの、および他の本発明の利点、並びに本発明のさらなる特徴は、本明細書に示される発明の説明から明らかとなるだろう。発明の簡単な要約本発明は、(a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、標的組織への複数回適用を介して投与し、該標的組織への血液の灌流のレベルを増進させることを含む、該標的組織への血液の灌流のレベルを増進させる方法を提供する。また、(a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、標的組織への複数回適用を介して投与し、該用量により該標的組織において治療または予防効果をもたらすことを含む、虚血性損傷を病んでいるか、あるいは病む危険性のある該標的組織の処置方法を提供する。さらに、(a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、標的組織への複数回適用を介して投与し、該標的組織において血管新生を誘導することを含む、該標的組織における血管新生の誘導方法を提供する。加えて、(a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を標的組織に投与し、該アデノウイルスベクターを側副血管形成の起点、終点およびそれらの間の部分を含む領域に接触させて側副血管形成を誘導することを含む、血管閉塞に冒された、あるいは冒される危険性のある該標的組織における側副血管形成の誘導方法を提供する。好適な態様の説明本発明は、以下の好適な態様の詳細な説明に関して最もよく理解されるだろう。本発明は、標的組織への血液の灌流のレベルを増進させる方法、虚血性損傷を病んでいる、あるいは病む危険性のある標的組織の処置方法、標的組織において血管新生を誘導する方法および／または血管閉塞に冒された、あるいは冒される危険性のある標的組織における側副血管形成を誘導する方法を提供する。これらの方法の各々は、(a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、標的組織への複数回適用を介して投与し、該標的組織への血液の灌流のレベルを増進させ、該用量により該標的組織において治療または予防効果をもたらし、該標的組織において血管新生を誘導し、および／または該アデノウイルスベクターを側副血管形成の起点、終点およびそれらの間の部分を含む領域に接触させて側副血管形成を誘導することを含む。血管新生の誘導「血管新生を誘導する」という語は、血管新生が開始されるか、あるいは増進するかのいずれかを意味する。それ故、例えば、標的組織にまだ血管新生が起こっていない場合は、本方法は該標的組織における血管新生の開始を提供する。しかしながら、標的組織にすでに血管新生が起こっている場合は、本方法は血管新生のレベルを増進させるか向上させる手段を提供する。標的組織いかなる適切な組織も、本発明における投与対象となり得る。好ましくは、標的組織はＤＮＡによりコードされる血管形成誘導ペプチドと結合し得る受容体を含み、より好ましくは、標的組織はＶＥＧＦ受容体を含む。最も好ましくは、標的組織は内皮細胞を含む。一般に、標的組織は、心臓のような別個の器官の一部であったり、あるいは別個の器官を形成するだろう（例えば、筋肉）。通常、標的組織は、該組織が酸素付加された血液の十分な供給を阻まれた際に結果として起こる虚血性損傷を病んでいるか、あるいは病む危険性があるだろう。酸素付加された血液供給の遮断はしばしば血管閉塞によって引き起こされる。このような血管閉塞は、動脈性硬化症、外傷、外科的処置、疾患および／または他の徴候によって引き起こされ得る。組織が望ましくない血管閉塞から虚血性損傷を病む危険性があるかどうかを決定する多くの手法がある。このような方法はそのような病態を治療する医師にはよく知られている。例えば、心筋の疾患においては、これらの方法として種々の造影技術（例えば、^99mTc-ｓｅｓｔａｍｉｂｉスキャニング、Ｘ線およびＭＲＩスキャニング等の放射性トレーサ一方法論）および生理学的検査が挙げられる。それ故、血管閉塞に冒された、あるいは冒される危険性のある組織において血管新生を誘導することは、そのような組織における虚血を予防するおよび／または軽減する有効な手段である。したがって、いかなる適切な組織も血管新生を誘導する標的となり得るが、標的組織は血管閉塞に冒されたものか、あるいは冒される危険性のあるものであることが好ましい。例えば、脳、心臓、膵臓、四肢全体、もしくは足などのより大きな身体の部分のような、別個の器官への血液の供給は、疾患、外傷、手術もしくは他の出来事により減じ得る。このような減衰した血液供給の緩和は、その原因に関係なく本発明が目的とするものである。したがって、心筋の虚血および発作などの徴候に由来する損傷を予防または緩和することは十分に意図されている。さらに、外科的処置の計画は、患者の血管系の特定の部分を通る血液供給の遮断を予見することができる。本方法にしたがって前処置することにより、これらの手術の所望の結果を実質的に改善させることができる。その場合、好ましくは、処置は該手術の約１日ないし約６週間前になされ、より好ましくは、手術の約２ないし１４日前になされる。血管形成誘導ベクターの投与前述のように、ＶＥＧＦ蛋白などの血管形成誘導ペプチドの全身投与を介して血管新生を誘導すると、例えば、失明を引き起こし、腫瘍細胞の侵襲性を増大させ得る無差別な血管新生の誘導が起こり得る。それ故、そのようなネガティブな副作用を軽減もしくは予防するために、それを必要とする組織（すなわち、標的組織）のみに血管新生を誘導することが望ましい。本発明は、血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターを、標的組織に、局在化する様式で投与することを含む。本発明においては、いかなる適切な血管形成誘導ベクターの標的組織への投与手段も使用することができるが、好ましくは、標的組織へのそのような局在投与は、該標的組織に血管形成誘導ベクターを直接注入するか、あるいは該標的組織に血管形成誘導ベクターを局所的に塗布することにより達成される。「注入する」という語は、血管形成誘導ベクターを標的組織内に強制的に導入することを意味する。本発明においては、いかなる適切な注入装置も使用することができる。そのような注入装置としては、同時複数注入の送達が可能な遺伝子導入送達装置に関する米国特許出願第08/801,352号に記載されるものが挙げられるが、それに限定されない。本発明において使用することができる別の注入装置の例として、侵襲性が最小の注入装置が挙げられる。このような装置は、例えば、５インチ未満の小さな切り込みを通して心臓に到達することができ、上記の複数注入装置とは対照的に、単一の内腔を通じて注入するように設計されている。特異な幾何学図形をなす複数注入の必要性のために、以前の注入部位がよく描写されるようにマーキングシステムを使用することができる。侵襲性が最小の注入装置は、フレキシブルで操縦可能で、心臓の湾曲した外表面につけた小さな切り込みを介して心臓に到達可能なインジェクターチップを含むことができ、例えば、該表面は、侵襲が最小限な手術に必要とされる制限された開口部に対してさまざまな角度をなして存在する。さらに、血管形成誘導ベクターは、標的組織のいかなる適切な表面に投与してもよく、内表面もしくは外表面のいずれに投与してもよい。例えば、心組織に血管形成誘導ベクターを直接注入するに関しては、そのような注入は心臓のいかなる適切な表面からも（すなわち、心内膜および／または心外膜に）投与することができることを意図している。しかしながら、どのような血管形成誘導ベクターの投与手段を選択しようとも、非標的組織における血管新生の誘導は最小限にすることが望ましい。一用量の血管形成誘導ベクターの投与は、標的組織への一回の適用（例えば、一回の注入または一回の局所塗布）によって達成することができるが、好ましくは、該用量を血管形成誘導ベクターの複数回適用によって投与する。複数回適用は２，３，４，５回または６回以上の適用であってよく、好ましくは５回以上の適用、より好ましくは８回以上の適用、最も好ましくは少なくとも１０回（例えば、１０，１５または２０回）の適用である。複数回適用は、各適用がなされる標的組織上の位置によって決まる特異な幾何学図形のようなパラメータにより操作することができるという点で、一回適用よりも利点を提供する。複数回適用により一用量の血管形成誘導ベクターの投与をよりよく制御することができ、いかなる所定の用量を投与しても有効性を最大限にすることができる。このようにして、大用量を一点適用するのに付随する望ましくない効果もまた、最小限にすることができる。複数回適用の特異な幾何学図形は、二次元または三次元空間において、血管形成誘導ベクターの各適用がなされる標的組織上の位置によって決まる。複数回適用は、好ましくは適用点が約４ｃｍまで（例えば、約０．５〜４ｃｍ）、より好ましくは約３ｃｍまで（例えば、約１〜３ｃｍ）、最も好ましくは約２ｃｍまで（例えば、約１〜２ｃｍ）の間隔で隔てられる。二次元空間における複数回適用の特異な幾何学図形に関しては、特異な幾何学図形は複数回適用が位置する平面（すなわち、標的組織の横断切片）によって決まる。複数回適用によって決まる平面は、標的組織の表面から一定の距離（すなわち、標的組織の表面と実質的に平行）のところにあってもよく（該平面の深さ）、あるいは該平面は標的組織の表面に対してある角度で位置してもよい。好ましくは、一回の適用は該平面の約０．５〜１５ｃｍ²おきに、より好ましくは該平面の約１〜１２ｃｍ²おきに、最も好ましくは該平面の約１．５〜７ｃｍ²おきになされるだろう。該平面の深さは、好ましくは約１〜１０ｍｍ、より好ましくは約２〜７ｍｍ、最も好ましくは約３〜５ｍｍである。三次元空間においては、一回の適用は、好ましくは標的組織の約５０ｃｍ³まで（例えば、約０．５〜５０ｃｍ³）、より好ましくは標的組織の約３５ｃｍ³まで（例えば、約１〜３５ｃｍ³）、最も好ましくは標的組織の約１５ｃｍ³まで（約３〜１５ｃｍ³）に対してなされる。さらに、複数回適用は、いかなる適切なパターンまたは特異な幾何学図形をも描くことができる。したがって、例えば、二次元空間においては複数回適用は正方形を描くことができるのに対し、三次元空間においては複数回適用は立方体を描くことができる。操作可能な複数回適用の別のパラメータは、各適用間の時間差である。好ましくは、複数回適用の各々はお互いの約１０分以内（例えば、約０．５〜１０分）に、より好ましくはお互いの約８分以内（例えば、約０．５〜８分）に、いっそう好ましくはお互いの約６分以内（例えば、約１〜６分）に投与される。最も好ましくは、一回用量の複数回適用のすべてが前記時間枠内に投与される。最適には、複数回投与の各々は実質的に同時に投与される。特異な幾何学的配列と複数回適用の時間差の両方を操作することにより、非標的組織における血管新生の誘導を最小限にすることができる。血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある標的組織に血管形成誘導ベクターを投与する場合、投与は、該血管形成誘導ベクターが、血管閉塞に対してバイパスとして機能するであろう側副血管形成の起点、終点およびその間の領域と程良く隣接する領域と接触することができるようになされることが望ましい。血管形成誘導ベクターを、側副血管形成の起点および終点の正確な部位に実際に接触させる必要はないと信じられている。しかしながら、血管形成誘導ベクターの複数回適用においては、複数回適用の特異な幾何学図形は、該血管形成誘導ベクターを、側副血管形成の起点、終点およびその間の領域を含む領域に接触させるか、もしくは到達させるように、好ましくは、その間の領域とともに側副血管形成の起点および終点の正確な部位に実際に接触させるように描くのが望ましい。さらに、血管形成誘導ベクターの標的組織への投与は、インビボ（in vivo）またはイクスビボ（ex vivo）のいずれかで達成することができる。したがって、例えば、標的組織を本発明の方法のレシピエントから除去し、血管形成誘導物質で処理した後、レシピエントに再移植することができる。血管形成誘導物質の標識組織へのイクスビボ投与はまた、望ましくない非標的組織における血管新生の誘導を最小限にするのにも役立つ。血管形成誘導ベクター前述のように、血管形成誘導物質としてのＶＥＧＦ蛋白の組織への送達は、大部分はその非常に短い半減期のせいで非常に難しい。しかしながら、血管形成誘導物質として血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを利用することにより、宿主細胞を感染させ、それによって約１週間血管形成誘導ペプチドの持続的で予測できる有効な産生を誘導することが可能である。約１週間後、アデノウイルスベクターは血管形成誘導ペプチドを産生するのを止め、その程度までで、本発明は血管新生誘導の自己終結方法を提供する。アデノウイルスベクターは、プラスミドや他のウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルス）とは異なり、分裂細胞と非分裂細胞の両方に遺伝子導入を達成し、心筋、血管内皮および骨格筋などの心血管関連部位において高レベルで蛋白を発現するので、好適である。さらに、アデノウイルスベクターによって導入された遺伝子は、染色体外の位置で機能し、宿主ゲノムの重大な部位に導入された遺伝子を不適当に挿入する危険性がほとんどない。アデノウイルスベクターはまた、ウイルス複製に必要な少なくとも１つの遺伝子機能を欠損していることが好ましい。好ましくは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能、特にＥ１ａ領域を欠損し、より好ましくは、該ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能およびＥ３領域の一部を欠損（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）するか、あるいはＥ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能およびＥ４領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損する。しかしながら、Ｅ２ａ領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損したアデノウイルスベクターおよびＥ３領域のすべてを欠損したアデノウイルスベクターもまた意図されており、且つ当該技術分野においてよく知られている。Ｅ４領域全体を欠失したアデノウイルスベクターは、より低い宿主免疫応答を引き出すことができる。適切な複製欠損アデノウイルスベクターがＰＣＴ国際公開WO 95/34671号およびWO 97/21826号に開示されている。例えば、適切な複製欠損アデノウイルスベクターとして、Ｅ１ａ領域の部分欠失、Ｅ１ｂ領域の部分欠失、Ｅ２ａ領域の部分欠失およびＥ３領域の部分欠失を有するものが挙げられる。あるいは、複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の欠失、Ｅ３領域の部分欠失およびＥ４領域の部分欠失を有していてもよい。さらに、ＰＣＴ国際公開WO 96/2628号に記載されるように、ウイルスベクターのコート蛋白を、特異的な蛋白質結合配列を組み込むように改変することができ、あるいは、米国特許出願08/816,346号に記載されるように、野生型コート蛋白に対して指向性の中和抗体により認識されるウイルスベクターの能力もしくは認識されない無能力を減少させるように、該ウイルスベクターのコート蛋白を改変することができる。本発明においては、血管形成誘導ペプチドをコードし、且つ適切な発現シグナルに機能的に連結したいかなるＤＮＡも使用することができる。該ＤＮＡはいかなる適切な発現シグナルのセットとも機能的に連結することができるが、好ましくは、該ＤＮＡの発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターの制御下にある。さらに、該ＤＮＡはいかなる適切な血管形成誘導ペプチドをコードしてもよい。好ましくは、血管形成誘導ペプチドはＶＥＧＦ蛋白であり、より好ましくは、血管形成誘導ペプチドはＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₄₅、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉ または哺乳動物の対応物であり、それらは米国特許第5,332,671号(Ferraraら)、第5,240,848号（Keckら）および第5,219,739号（Tischerら）に種々記載されている。最も好ましくは、その高い生物活性のために、血管形成誘導ペプチドはＶＥＧＦ₁₂₁またはＶＥＧＦ₁₆₅、特にＶＥＧＦ₁₂₁である。ＶＥＧＦ₁₂₁とＶＥＧＦ₁₆₅ の間の顕著な相違は、ＶＥＧＦ₁₂₁はＶＥＧＦ₁₆₅がそうであるほどには高度なアフィニティーでヘパリンと結合しないことである。一般に、ＶＥＧＦ蛋白は新たな血管系の産生に関与しない組織の増殖を誘導しないので、ＶＥＧＦ部分は他の血管形成誘導ペプチドよりも有利である。他の血管形成誘導ペプチドとしては、ＶＥＧＦII、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＦＧＦ−４、アンギオゲニン、アンギオゲニン −２およびＰ１ＧＦが挙げられ、それらは米国特許第5,338,840号(Bayneら)、第 5,532,343号(Bayneら)、国際特許出願WO 95/24473号(Huら)、欧州特許公報第476 983号(Bayneら)、第506 477号（Bayneら）および第550 296号(Sudoら)、並びに日本国特許公報第1038100号、第2117698号、第2279698号および第3178996号に種々記載されている。アデノウイルスベクターはまた、血管形成誘導ペプチド受容体をコードするＤＮＡを含むことができる。適切な血管形成誘導ペプチド受容体としては、例えば、ＦＬＴ−１、ＦＬＫ−１およびＦＬＴ−４が挙げられる。実際、ある実施態様においては、アデノウイルスベクターは、血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡに加えてではなく、それに代えて、血管形成誘導ペプチド受容体をコードするＤＮＡを利用することができる。発現シグナルに機能的に連結し、血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡは、発現カセットとしてアデノウイルスベクターのいかなる適切な領域にも挿入することができる。その点において、当業者は、アデノウイルスゲノムのある不可欠な遺伝子領域を欠損したアデノウイルスベクターを使用することは、そのような欠損がベクターに導入遺伝子のための余地を提供し、且つウイルスが複製するのを妨げるであろうから、ある特定の利点があると容易に理解するだろう。好ましくは、該ＤＮＡセグメントは、アデノウイルスベクターのＥ１領域に挿入される。該ＤＮＡセグメントは、アデノウイルスベクターのいかなる適切な領域に、いかなる適切な方向でも発現カセットとして挿入することができるが、好ましくは、該ＤＮＡセグメントの方向は右から左である。右から左の方向をもつ発現カセットとは、該発現カセットの転写の方向が、該発現カセットが挿入されるアデノウイルスベクターの領域の転写の方向と逆であることを意味する。本発明のベクターの実例となるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ領域、Ｅ１ｂ領域の一部およびＥ３領域の一部を欠損し、アデノウイルスゲノムのＥ１領域にＣＭＶ前初期プロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦ₁₂₁またはヒトＶＥＧＦ₁₆₅をコードするＤＮＡを含む。そのようなベクターは、投与１日後に最大となり、投与後ほぼ１週間ぐらいにはベースラインレベル以上では検出されないインビボでのＶＥＧＦ発現を支える。これは、遠位の部位での意に添わない血管新生を最小限に抑えながら新たな血管系の実質的な増殖を提供するのに十分なので、理想的である。その点に関して、このベクターを標的組織に局所投与した場合、標準的なＥＬＩＳＡモニタリングアッセイを用いて血清中に検出可能なＶＥＧＦ発現を認めることはできない。有利なことに、アデノウイルスゲノムのＥ１領域にヒトＶＥＧＦ₁₂₁またはＶＥＧＦ₁₆₅をコードするアデノウイルスベクターを標的組織に局所投与することにより、哺乳動物の四肢（例えば、Sprague-Dawleyラットの後肢）において、腸骨および大腿骨部の動脈の連結を伴って、血流を少なくとも３倍に増大させることができる。医薬組成物血管形成誘導ベクターは、望ましくは、医薬上許容される担体および該血管形成誘導ベクターを含む医薬組成物として標的組織に投与される。本発明においては、医薬上許容されるいかなる適切な担体も使用することができ、そのような担体は当該技術分野で周知である。担体の選択は、幾分は該組成物が投与される特定の部位と、該組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決まるだろう。注射に適切な製剤としては、水性および非水性溶液剤、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含むことができる等張な滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液剤が挙げられる。製剤はアンプルやバイアルなどの、一回用量もしくは複数回用量の密閉容器として提供でき、また、滅菌した液体担体、例えば水を使用直前に添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）した状態で保存することもできる。即席の注射液剤および懸濁液剤は、滅菌した、前記した類の散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。好ましくは、医薬上許容される担体は、緩衝化された食塩溶液である。本発明においては、いかなる適切な容量の担体も使用することができるが、好ましくは、血管新生が行われるべき組織（すなわち、標的組織）には該血管形成誘導ベクターが灌流するが、該血管形成誘導ベクターが血液、リンパ排液もしくは物理的メカニズム（例えば、重力による流れもしくは浸透圧による流れ）によってターゲッティングされていない組織に運ばれないように、血管形成誘導ベクターは、少量の担体中で投与される。たいていの適用、特に、ヒト心筋注入に関するようなはっきり区別される器官への適用の場合、投与する容量は各投与あたり２０ｍｌ未満（例えば、約０．１〜２０ｍｌ）であることが好ましく、各投与あたり約２．５ｍｌ未満（例えば、約０．５〜２．５ｍｌ）であることがより好ましい。投与量当業者は、容易に血管形成誘導ベクターの妥当な投与量の決定を行うことができる。しかしながら、一般に、投与される投与量にある特定の要因が影響を与えるだろう。妥当な投与量は標的組織において血管新生が誘導されるような量であるが、好ましくは、投与量は、組織の虚血性損傷を引き起こすかもしれない血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある標的組織に対して治療および／または予防効果を有するのに十分な量である。さらに、投与量は非標的組織における血管新生の誘導が最小限となるような量であるべきである。投与量はまた、投与すべき血管形成誘導物質によっても変動するだろう。特に、投与量は、使用される特定のベクターおよびベクター中の血管形成誘導ペプチドをコードし、その発現を制御するＤＮＡによって変動するだろう。通常、一用量は標的組織、例えば、ヒト心臓のようなはっきりと区別される器官に対し、少なくとも約１×１０⁶ｐｆｕ（例えば、１×１０⁶〜１×１０¹³ｐｆｕ）であろう。好ましくは、投与量は、少なくとも約１×１０⁷ｐｆｕ（例えば、約１×１０⁷ 〜１×１０¹³ｐｆｕ）、より好ましくは少なくとも約１×１０⁸ｐｆｕ（例えば、約１×１０⁸〜１×１０¹¹ｐｆｕ）、最も好ましくは少なくとも約１×１０⁹（例えば、約１×１０⁹〜１×１０²⁰ｐｆｕ）である。該用量は、典型的には約１００ｃｍ³、より典型的には約１５０ｃｍ³の容積の標的組織に対するものである。該用量は複数回適用によって投与され、そうして複数回適用で分割される。したがって、もし該用量を１０回投与により投与するならば、各投与は約１×１０⁵〜１×１０¹ ² ｐｆｕを含む。好ましくは、各適用は約１×１０⁶〜１×１０¹²ｐｆｕ、より好ましくは１×１０⁷〜１×１０¹⁰ｐｆｕ、最も好ましくは約１×１０⁸〜１×１０⁹ ｐｆｕを含む。また、用量を粒子単位（ｐｕ）の観点から考慮するために、ウイルス粒子でいうと、１００粒子／ｐｆｕあると仮定できる（例えば、１×１０¹² ｐｆｕは１×１０¹⁴ｐｕと等価である）。例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１ａ領域、Ｅ１ｂ領域の一部およびＥ３領域の一部を欠失し、且つ標準的なＣＭＶ前初期プロモーターの制御下にあるヒトＶＥＧＦ₁₂₁またはＶＥＧＦ₁₆₅を担持するアデノウイルスベクターを用いた１ラウンドのベクター投与においては、約１０⁷〜１０¹³ｐｆｕ、好ましくは約１０⁹〜１０¹¹ｐｆｕが、約１５０ｃｍ³と見積もられる容積を有する標的組織に（例えば、標的組織を含むはっきりと区別される器官に）投与される。これらの条件下では、遠位の組織において検出可能なレベルのＶＥＧＦ産生を生み出すことなく、標的組織における実質的なレベルのＶＥＧＦ生産が達成される。さらに、血管形成誘導ベクターの複数回適用に関して、各適用は、複数回適用が描く領域を横切って投与量勾配をなすように投与されるようにしてもよい。あるいは、複数回適用の各々は、複数回適用が描く領域を横切って実質的に均一な用量が投与されるようにしてもよい。実施例以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものと解すべきではない。実施例１本実施例では、本発明が、複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄベクター）の投与によりインビボで血管新生を誘導し得ることを実証する。血管形成誘導（特に、ＶＥＧＦ）ペプチドをコードするＤＮＡを含む。実例となる血管形成誘導（特にＶＥＧＦペプチド）ＶＥＧＦ₁₆₅のＤＮＡを含む複製欠損組換えＡｄベクターを、Gastroenterology，106，1638-1644(1994)に記載される技法にしたがって工作した。分泌のためのシグナル配列を含むＶＥＧＦ₁₆₅のＤＮＡを発現プラスミド中に挿入し、構成的なＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサーの制御下においた。該発現プラスミドはまた、ヌクレオチド３３８４からヌクレオチド５７７８まで（９．２４〜１６．０５地図単位）のＡｄ５配列を含み、それは相同組換え配列として役立った。ＶＥＧＦ₁₆₅のＤＮＡを担持するプラスミドをプラスミドｐＪＭ１７（マクマスター大学（カナダ、オンタリオ州、ハミルトン）のF．Grahamより）とともに２９３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ＣＲＬ１５７３）に共トランスフェクションした。プラスミドｐＪＭ１７は全長Ａｄ５ＤＮＡ（３６ｋｂ）およびＥ１領域に置かれた４．２ｋｂのインサートｐＢＲＸを含み、したがって、ＡｄキャプシドへのＤＮＡの最大パッケージング限界を約２ｋｂ超えている。２９３細胞内での発現プラスミドとｐＪＭ１７の間の相同組換えにより、Ｅ１領域およびｐＢＲＸインサートが発現プラスミド由来の発現カセットで置換された。Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの増殖は相補的な細胞に制限され、Ａｄ５で形質転換されてＥ１領域をトランスに発現するヒト胚腎細胞株である２９３細胞内で行われた。２９３細胞用の培養培地は最少必須培地を１０％熱非働化胎仔ウシ血清、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてBiofluidsより）で改良した。共トランスフェクション後、個々のウイルスプラークを単離して２９３細胞内で増幅させた。コントロールベクターはＡｄＣＭＶ．βｇａｌで、これは大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のＤＮＡを担持しており、酵素β−ガラクトシダーゼをコードしている。ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅ とＡｄＣＭＶ．βｇａｌを２９３細胞内で繁殖させ、ＣｓＣｌ勾配精製により精製した。次いで、調製物を透析し、透析バッファー（１０ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌおよび１ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ₂、ｐＨ＝７．４）中、１０％グリセロールとともに−７０℃で保存した。各ウイルスストックの力価を２９３細胞でのプラークアッセイにより測定したところ、力価は一貫して５×１０⁹と２×１０¹¹ｆｕ／ｍｌの間の範囲内であった。Ａｄを介したインビボ遺伝子導入の効果を調べるために、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅またはＡｄＣＭＶ．βｇａｌ（２×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ）をマトリゲル０．５ｍｌ中に再懸濁した。次いで、Ｃ５７ＢＬマウス（Jacobson Laboratories ，Bar Harbor，ME）にＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅またはＡｄＣＭＶ．βｇａｌを含むマトリゲル０．５ｍｌ全部を、腹中線付近に皮下注入した。追加の動物にベクターを含まないマトリゲルを注入した。マウスを４つの異なるプロトコールに従って研究した。プロトコール１：マトリゲルに再懸濁したＡｄベクターが周辺の組織に感染するかどうかを確かめるために、ＡｄＣＭＶ．βｇａｌを含むマトリゲル（ｎ＝５）またはマトリゲルのみ（ｎ＝３）をマウスに注入した。注入後６日目に動物を殺し、マトリゲルプラグを除去して固定した。次いで、マトリゲルプラグを切片化し、Ｘ−ｇａｌで染色して青色染色のしるしを調べた。プロトコール２：インビボでの導入遺伝子発現の持続を確かめるために、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅を含むマトリゲル（ｎ＝９）またはマトリゲルのみ（ｎ＝９）をマウスに注入した。注入後３、７、２１日目に動物を殺し、マトリゲルプラグを除去した。組織ブロックをＯＣＴ化合物（Miles，Inc）中に浸漬し、液体窒素中で急速冷凍した。組織ブロックを１ヶ月未満−７０℃で保存した。免疫組織化学的評価のために、１０μｍの凍結切片（Microm cryotome）をシラン化スライド（Digene Diagnostics）上にマウントした。切片を１５分間風乾し、−７０℃で４８時間まで保存するか、あるいはすぐに０．１％トライトンＸ−１００（Shigma Chemical Co.）を含む１×ヒストチョイス（Amresco）中で１２分間固定した。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で洗浄した後、スライドをメタノール中の０．５％過酸化水素中でインキュベートして内在のペルオキシダーゼ活性を阻害した。ウサギ抗ＶＥＧＦ−次抗体を、ビオチン化したヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体とアビジン −ビオチン複合体を用いて検出し、ジアミノベンジダインにより可視化した(すべての検出試薬はVector Laboratoriesより入手した)。手順は、切片を一次抗体の添加前に少なくとも４５分間ブロッキング溶液中におくこと、および抗ＶＥＧＦまたはコントロール血清（１：６０００希釈）とのインキュベーションを４℃ で一夜行う以外は、同梱の手引きに従って実施した。切片をヘマトキシリンでカウンター染色した。ペプチドを０．２％グルタルアルデヒドでキャリア蛋白ＫＬＨに結合する以外は、抗ＶＥＧＦ抗体はウサギ体内で製造した。ＫＬＨのみに対する抗体も生じさせ、ネガティブコントロールとして用いた。抗体特異性はウェスタンブロット上でのヒトＶＥＧＦの認識によって測定し、また、抗ＫＬＨおよび放血前の血清をネガティブコントロールとして用いてバックグラウンド染色を測定した。プロトコール３：Lab Invest.，67，519-528(1992)に記載されるようにして、マトリゲルの注入後１４日目に殺したマウス（各Ａｄベクターについてｎ＝８マウス；２回の別個の実験の各々で４匹のマウスを使用した）に新たに形成した血管の存在を評価した。解剖によりゲルを回収し、固定した。組織学的切片をMass onの三色染料で染色し、血管新生の存在を評価した。各プラグから得た２つの異なる組織学的切片におけるマトリゲル表面と腹筋の間の距離を測定することにより、マトリゲルの周囲の間質の厚さを調べた。各組織学的切片につき５０〜１００μｍ間隔で１０回の測定を行い、２つの切片から得られる２０回の測定を平均して個々のプラグについての間質の厚さを表現した。プロトコール４：マトリゲルプラグ（各Ａｄベクターにつきｎ＝１０マウス；３回の別個の実験の各々につき３もしくは４匹のマウスを使用した）のヘモグロビン含量により血管新生応答を定量化した。マトリゲル中に再懸濁したＡｄベクターがゲルから拡散して周辺組織に感染するかどうかを確かめるために行った実験について、ＡｄＣＭＶ．βｇａｌを含むマトリゲルまたはマトリゲルのみを注入して６日後にマウスを殺し、マトリゲルプラグをＸ−ｇａｌで染色した。Ｘ−ｇａｌ陽性細胞は、マトリゲルの周囲の間質中に見出された。対照的に、非感染ゲルプラグの周囲の組織中には青色細胞は見られなかった。他の実験において、インビボでのＡｄを介したＶＥＧＦ₁₆₅遺伝子発現の持続を確かめた。免疫組織化学的染色により、マトリゲルとＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅の同時注入後３日目に回収したプラグは、マトリゲル周辺の組織中にＶＥＧＦ陽性細胞を示した。染色は７日目に最も強く、注入後２１日目にはほんのわずかの細胞しか免疫活性がなかった。一次抗体の非存在下にインキュベートしても免疫染色は見られなかった。キャリア蛋白に対する抗体とインキュベートすると、腹筋層において陽性を示したが、マトリゲルプラグの周囲の組織中には陽性は見出されなかった。注入後１４日目にマトリゲルプラグを組織学的に調べたところ、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅に応答してマトリゲルの周囲の組織中で血管新生が観察された。この効果は、血管分布の増大およびマトリゲルの周囲の間質マトリックスの肥厚を伴った。対照的に、ＡｄＣＭＶ．βｇａｌは結果としてマトリゲルの周囲の間質マトリックスの肥厚をいくらか生じたが、血管新生の増大は確認されず、また、マトリゲルのみでは、間質の肥厚の増大も血管新生の増大も伴わなかった。さらに、血管新生の定量評価により、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ₁₆₅を有するマトリゲルプラグのヘモグロビン含量は、ＡｄＣＭＶ．βｇａｌを有するゲル移植片の場合より４倍高かった。ヘモグロビン含量における有意な増加は、非感染のコントロールプラグに対するＡｄＣＭＶ．βｇａｌ感染プラグでも観察された。総合すると、これらの結果は、血管形成誘導（特にＶＥＧＦ）ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターはインビボで血管新生を誘導することを示している。実施例２本実施例では、本発明が、複製欠損アデノウイルスベクターを用いてインビボで心筋に直接遺伝子導入し得ることを実証する。複製欠損ベクターＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅のＤＮＡを駆動するサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ）を含む発現カセットをＥ１位に含む、Ｅ１ａ^-、部分的Ｅ１ｂ^-、部分的Ｅ３^-アデノウイルスベクターであった。ＡｄＣＭＶ．Ｎｕｌｌ（ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦと類似するが、発現カセット内に遺伝子を持たない）を、インビトロ実験のコントロールベクターとして使用した。ＡｄＣＭＶ．ＣＡＴ（ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦと類似するが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする）を用いてマーカー遺伝子を導入、発現させた。すべてのアデノウイルスベクターを２９３細胞内で繁殖、ＣｓＣｌ密度精製により精製、透析して、プラークアッセイにて力価を測定した。ベクターは５０μｌのアリコート中、−７０℃で保存した。雄性の雑種犬（２５〜３０ｋｇ）をすべての研究に使用した。静脈内メトヘキシタール（ブレビタール；Eli Lilly，Indianapolis，Indiana；１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔を誘発し、挿管後、イソフルラン（２〜３ＬＯ₂中１〜２％）吸入を用いて麻酔を維持した。直接心筋注入のため、無菌条件下に左側方開胸術を行った。心膜を横膜神経の前で分割し、３つの別個のマーク縫合線（５−０単糸）を左心室自由壁に沿って３．５ｃｍ間隔で配置した。アデノウイルスベクターを、３０ゲージ針を有する０．５ｍｌシリンジを用いてマークした位置に１００μｌの容量で投与した。針先を心膜表面から３〜５ｍｍの深さに位置させ、十分な送達を目視で確認した。標準的なやり方で心膜と胸を閉じ、動物を回復させた。心筋における局所レベルの治療的血管形成誘導蛋白の持続を達成する可能性を評価するために、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ（１０⁹ｐｆｕ）を直接心筋注入（動物あたり２回注入；１２動物個体）により投与した。ベクター投与部位由来の組織試料（１ｃｍ³）を集め、ベクター投与直後、並びに２、５、７および１４日後にＶＥＧＦ発現について評価した。ＡｄＣＭＶ．ＣＡＴベクターを注入した組織をネガティブコントロールとして用いた。心筋におけるＶＥＧＦ発現の定量は、Ouantikine human VEGF immunoassay（R &D Systems，Inc.，Minneapolis，MN）を用いて行った。ベクター投与部位由来の組織試料（０．５ｇ）を蛋白質溶解バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス− ＨＣｌ、ｐＨ＝８、０．１４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．０２５％ＮａＮ₃、２％トライトンＸ−１００および１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルホニルフルオリド；２ｍｌ／ｇ組織）を用いてホモジナイズし、蛋白質測定を行い、蛋白溶解物アリコート（１００μｇ）を３連で分析し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＶＥＧＦの濃度はｍｇ蛋白に標準化した。ＶＥＧＦ発現の空間的限界を、７日目に殺した動物由来の組織試料の評価により測定した。組織を中枢、末梢、心膜および心内膜部分に分け、各試料のＶＥＧＦ発現を個別に評価した。ＶＥＧＦの局在化した発現が結果として血清中に検出可能なレベルのＶＥＧＦを生じるかどうかを確かめるために、ベクター投与前、並びにベクター投与後２、５、７および１４日目に殺した時に、動物から血液試料を採取した。ＶＥＧＦの定量は、血清試料５０μｌについての酵素結合免疫吸着測定法により行った。心筋におけるアデノウイルスベクターの直接心筋注入の全身性効果を評価するために、血清の生化学および全血球計算値の指数を経時的にモニタリングした。白血球数、ヘマトクリット、血小板数、アルカリホスファターゼ、血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ビリルビンおよびクレアチニンのための血液試料を、ベクター投与前、並びにベクター投与後２、７および１４日目に動物から採取した。各回の数値を平均した。血清化学測定はDu Pont Analyst Benc htop Chemistry System(Du Pont Co.，Wilmington，DE)を用いて計算し、全血球計算値測定はSystem 900 Hematology Analyzer(Serono Diagnostics， Allentown，PA)を用いて行った。心筋への直接遺伝子導入の心機能に及ぼす効果を調べるために、Hewlett-Pack ard 2500心エコー計（Hewlett-Packard Co.，Andover，MA）および３．５ＭＨｚ変換器を用いて、胸部横断二次元ドップラーおよび心エコー図を行った。以下の像：傍胸骨長軸像、乳頭筋先端における傍胸骨短軸像および心尖五腔像を、操作前、および操作後５〜７日または操作後１４日のいずれかに得た。また、大動脈輪のレベルでのパルス波ドップラー心エコー造影を心尖五腔像から行った。心弛緩期と心収縮期の両方における左心室の心内膜および心外膜表面の輪郭をたどることにより、局所的な壁肥厚のオフライン分析を行った。心室を、下心室中隔のセグメント１に始まり、時計回りに次のセグメントを連続的に番号付けして下壁のセグメント６で終わる、放射状セグメントに６等分した。したがって、セグメント３および４は、左心室の前側自由壁を表す。各セグメントの平均壁厚を測定した。各セグメントの心収縮期の壁肥厚を、（心収縮期の平均壁厚）−（心弛緩期の平均壁厚）と定義した。包括的な左心室機能の評価として、標準的なドップラーから導出される一回拍出量（大動脈輪の面積×大動脈輪を横切る流速プロファイルの速度・時間積分）と記録された心拍数を用いて心拍出量を計算した。ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦを直接心筋投与した後のインビボでのＶＥＧＦ蛋白発現の確認は、酵素結合免疫吸着測定法により行った。経時的な心筋層でのＶＥＧＦ発現の定量により、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ投与の結果、ベクター投与後２日でベースラインの１８倍を上回るＶＥＧＦ発現の増加が起こり、ベクター投与後７日でベースラインの１５倍を上回る増加があることが実証された。１４日目までにＶＥＧＦレベルはベースラインに戻っていた。対照的に、コントロールベクターＡｄＣＭＶ．ＣＡＴの投与は、結果として、調べたいずれの回においてもベースラインを上回るＶＥＧＦ発現レベルの有意な増加を生じなかった。ベクター投与直後に得られた０日目におけるＶＥＧＦレベルは未投与の組織におけるレベルと同様であり、ウイルス製剤にＶＥＧＦ蛋白が夾雑していないことが確認された。さらに、アデノウイルスベクター送達が局在化された遺伝子導入戦略を提供するという概念を裏付けるように、調べたいずれの回においても、処理された動物の血清中にＶＥＧＦは検出できなかった。マーカー遺伝子導入で得られたデータと一致して、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦの投与はまた、遺伝子発現の広い空間的限界によっても特徴付けられた。しかしながら、ＡｄＣＭＶ．ＣＡＴについて得られた結果とは対照的に、ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ投与７日後には、ＶＥＧＦの発現レベルは、ベクター投与部位から１５ｍｍまでの４つの空間的領域（中枢および末梢心外膜、並びに中枢および末梢心内膜）すべてにおいて同等に増加し、すべての組織試料を通して均一に蛋白が分布することが示唆された。アデノウイルスベクターを受容したすべての動物は予め決められた屠殺時期まで生存した。成長できなかったり、頻脈を示したり、発熱したりする動物はなく、創感染も発症しなかった。ベクター投与後２、７および１４日目に調べた動物において、白血球数、ヘマトクリット、血小板数、アルカリホスファターゼ、血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ビリルビン、およびクレアチニンにおけるベースラインを上回る顕著な変化はなかった。ベクター投与前および投与後５〜７日もしくは１４日目の動物について実施した心エコー図から、全体的にも局所的にも心室機能に顕著な変化はないことがわかった。局所壁運動を調べたところ、６つの放射状セグメントのいずれの心収縮期壁肥厚についても、操作前の研究と操作後の研究との間で顕著な変化がないことがわかった。心拍出量もまた、操作前の研究と操作後の研究との間で顕著な変化はなかった。要約すると、アデノウイルスを介した心筋への直接遺伝子導入の後、広い空間的限界を特徴とする遺伝子発現が起こることがわかり、また、当該送達システムが安全で受容性がよいことがわかった。さらに、ヒトの生理学と同様の生理学を有する大動物モデルを用いて、治療的血管形成誘導蛋白（特にＶＥＧＦ）をコードするアデノウイルスベクターのインビボ投与の結果、遺伝子導入後何日にもわたって持続的且つ局在化された蛋白質の発現が起こることが示された。実施例３本実施例では、本発明が、血管形成誘導ペプチド（特にＶＥＧＦ）のアデノウイルスを介した遺伝子導入によって救済的な血管新生を誘導することにより、虚血性血管閉塞の危険性を防御し得ることを実証する。先に存在する虚血に急性血管閉塞を併発したモデルを、体重２５０〜３００ｇの雄性Sprague-Dawleyラットを用いて作出した。動物を筋肉内ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、無菌条件下に正中線開腹術を行い、左総腸骨動脈を結紮して分離した。次いで、アデノウイルスベクターを左腸骨大腿骨脂肪組織および筋肉に投与し、非吸収性縫合糸を用いて腹を二層に閉じた。腸骨動脈の結紮時に、ＡｄＶＥＧＦ（総用量＝４×１０⁹ｐｆｕ）、コントロールベクターであるＡｄＮｕｌｌ（総用量＝４×１０⁹ｐｆｕ）またはＰＢＳ（総用量＝４×１００μｌ）を、３０−ゲージ針を有する０．５ｍｌシリンジを用いて４つの部位に各１００μｌの容量で投与した。側副血管形成にターゲッティングされた領域において、後腹膜および鼠径部の脂肪組織、腰筋、並びに四頭筋を含む、各動物の左腸骨大腿骨領域内の同一の場所で、４回の個別のベクター投与を行った。付加的なコントロール動物群には片側の総腸骨結紮だけを行い、処理はしなかった。左総腸骨結紮およびベクター投与から３週間後、動物を上述のように麻酔し、左総大腿骨大動脈を鼠径靱帯面で結紮して分離した。その後直ちに、以下の順序で、(1)^99mＴｃ標識ｓｅｓｔａｍｉｂｉ；(2)カラーマイクロスフェア；(3)血管造影および(4)血管数の組織学的定量を用いて、後肢の相対的な血流および血管分布の分析を行った。複製欠損ベクターＡｄＶＥＧＦは、１６５残基型のヒトＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ¹⁶ ⁵ ）のＤＮＡを駆動するサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ）を含む発現カセットをＥ１位に含む、Ｅ１ａ^-、部分的Ｅ１ｂ^-、部分的Ｅ３^-のアデノウイルスベクターであった。ＡｄＮｕｌｌ（ＡｄＶＥＧＦと類似するが、発現カセット中に遺伝子を持たない）をコントロールベクターとして使用した。アデノウイルスベクターはすべて２９３細胞内で繁殖させ、ＣｓＣｌ密度精製により精製し、透析して、−７０℃で保存した。各ウイルスストックの力価を２９３細胞内でのプラークアッセイにより測定した。すべてのウイルスストックが複製能力のある野生型アデノウイルスを含まないことを実証した。ＡｄＶＥＧＦベクターが脂肪組織および骨格筋へのＶＥＧＦＤＮＡの導入および発現を仲介できることを確かめるために、総腸骨結紮およびベクター投与後０、１、３、５および７日の動物（１０⁹ｐｆｕ／部位；各時点につきｎ＝３）から回収した組織におけるＶＥＧＦレベルを、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量した。ベクターで処理した動物の後腹膜脂肪組織および四頭筋を集め、リン酸緩衝食塩水，ｐＨ＝７．４（ＰＢＳ）でリンスして蛋白質溶解バッファー［１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ＝８．０，０．１４ＭＮａＣｌ，０．０２５％ＮａＮ₃，２％トライトンＸ−１００および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（２ｍｌ／ｇ組織）］とともにホモジナイズした。産生されたＶＥＧＦが局在化したままであることを確かめるために、上記時点に各動物から血清を採取した。ブラッドフォード法を用いて蛋白質測定を行い、５０ μｇの組織を用いてＶＥＧＦについてのＥＬＩＳＡを行った［Quantikine human VEGF Immunoassay，R&D Systems，Minneapolis，MN］（各アッセイは、各動物について２回行った）。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＶＥＧＦ濃度をｍｇ蛋白に標準化した。後肢への血流の測定として、^99mＴｃ標識ｓｅｓｔａｍｉｂｉスキャニングを使用した。これを達成するために、右頸静脈を限定的な右頸部切開を通じて同定し、０．５ｍｌ容量のＰＢＳ中の２〜３ｍＣｉ ^99mＴｃ標識ｓｅｓｔａｍｉｂｉ（Cardiolite，Dupont Pharma，North Billerica，MD）（０．９％）を静脈内に注射した。注射から約１５分後、動物をADAC Vertexデュアルヘッドガンマカメラシステム（ADAC Laboratories，Milpitas，CA）の下方検出器上に仰向けにおき、低エネルギー高分解能平行孔コリメータと１４０ｋｅＶ±１０％の光ピークエネルギー窓を用いて腹面および背面の全身ガンマカメラ像を得た。動物あたり少なくとも２×１０⁵カウントを、背面（下方検出器）および腹面（上方検出器）像から同時に得た。Pegasys^TMコンピューターおよび画像処理ソフトウェア（A DAC Laboratories）を用い、処理群について知らない個人が左右の後肢のふくらはぎの中心上の同じ方形の関心領域（ＲＯＩ）を手動で描き、これらの領域の画素あたりの平均カウントを測定した。相対血流は、腹面および背面像の幾何学的平均について、対側性の（右）コントロール後肢における画素あたりのＲＯＩ平均カウントに対する結紮（左）後肢における画素あたりのＲＯＩ平均カウントの比として記録した。正常（右）後肢に対する虚血性（左）後肢への血流はまた、肢への機能的な血管の評価として１５μｍのカラーマイクロスフェアを動脈内投与することによっても評価した。腹部大動脈を正中線開腹術を通じて同定し、４−０絹縫合糸で緩く巻いた。縫合線のすぐ遠位で、２４−ゲージ、３／４インチ（１．９ｃｍ）の Angiocath（Becton Dickinson Vascular Access，Sandy，UT）を腎臓下大動脈に挿入し、ニトログリセリン溶液［Abbott Laboratories，North Chicago，IL（５００μｇ／ｍｌ）］０．５ｍｌと１５μｍのカラーマイクロスフェア［E-Z Trac ，Los Angeles，CA（２００μｌ中に２×１０⁶マイクロスフェア）］２×１０⁶ 個とを、マイクロスフェアが十分混合するのを確実にするため、ボルテックスして該カテーテルを通じ２０秒間かけて注入した。屠殺の際、すべての下部後肢ふくらはぎ筋組織を皮膚および骨から切り離し、秤量し、Tissue Digest Reagents １および２（E-Z Trac）を用いて製造者の手引きにしたがって消化して、Micro sphere Counting Reagent（E-Z Trac）５０μｌ中に再懸濁した。処理群について知らない個人が、マイクロスフェアを手動血球計を用いて計数した。試料あたり最低４００スフェアが計数された。組織１ｇあたりのマイクロスフェア数を測定し、相対血流を対側性のコントロール後肢におけるマイクロスフェア／ｇｍ湿組織に対する結紮後肢におけるマイクロスフェア／ｇｍ（湿重量）組織として記録した。巨視的な血管分布の評価として血管造影を使用した。これを行うために、動物をMobile Surgical X-ray System BV25（Philips，Holland）のコリメータから２０ｃｍの距離に仰向けにおいた。腎臓下大動脈に据えつけた２４ゲージ、３／４インチ（１．９ｃｍ）の脈管カテーテル（Becton Dickinson，Sandy，UT）を用いて、ニトログリセリン（５００μｇ／ｍｌ；Abbott Laboratories）０．５ｍｌを２０秒かけて注入した。その直後にRenograffin-76（Squibb Diagnostics ，NewBrunswick，NJ）３ｍｌを該カテーテルを通じて遠位の大動脈に注入し、２秒間隔で蛍光透視鏡画像を得た。最大の動脈不透明化を示す典型的な画像を現像し、先入観の入らない様式で３人の観察者が血管分布を評価した。血管スコアは大腿骨長軸の中点に垂直な線を引くことによって各動物について測定した：この線を横切る血管数を各観察者が計数し、平均して、「血管スコア」として記録した。組織学的評価を用いて血管分布をアデノウイルスベクターの受容部位における小血管レベルで定量した。処理した脂肪組織部位について、ベクター投与部位から脂肪組織１ｃｍ³を回収し、ＰＢＳ中でリンスして４％ホルマリン中４℃で保存した。試料をパラフィン包埋し、組織表面に平行な平面内で連続的な５μｍ横断切片を５０μｍ間隔で得、内皮細胞特異的抗原であるα−アクチンに対する免疫組織化学的染色を行った。パラフィン切片を１．５％ウマ血清で２０分間ブロッキングして非特異的結合を防ぎ、次いで一次抗体（モノクローナル抗ヒトα− アクチン；Sigma，St．Louis，MO）に１／５００希釈で６０分間曝露した。スライドをビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ、ＡＢＣ試薬（Vector Laboratories,Bu rlingame,CO)、アルカリホスファターゼに対する新フクシン基質（Dako Corp.,C arpenteria,CA）に順次（各３０分）曝露し、次いでヘマトキシリンでカウンター染色した。３人の観察者が先入観の入らない様式で、１００倍の倍率で切片を調べた。スライドあたり８０μｍ未満の血管の無作為に選んだ５視野を計数し、試料あたり６スライドを評価した。カウントを平均してｍｍ²あたりの血管数として記録した。骨格筋の処理領域における血管分布を定量するために、ベクター投与部位から四頭筋の１ｃｍ³切片を回収し、ＰＢＳ中でリンスして、濃度が増加するスクロースーリン酸溶液中で固定した(２５℃、１時間)。次いで、骨格筋標本を２：１２０％スクロース／ＯＣＴ（Tissue Tek，Sakura Finetek，Torrance，CA）化合物混合物中、−７０℃で凍結させた。次に、凍結標本を５μｍ切片に切りスライド上−７０℃で凍結させた。凍結スライドを室温まで温め、不溶性アルカリホスファターゼ基質−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT錠剤，Sigma，St．Louis，MO）を用いてアルカリホスファターゼを染色し（２５℃、１時間）、エオシンでカウンター染色した。３人の観察者が先入観の入らない様式で、４００倍の倍率で切片を調べた。１視野あたり６つの無作為に選んだ筋繊維、スライドあたり５つの無作為に選んだ視野、動物あたり５スライドを計数することにより、筋繊維あたりの毛細管を定量した。カウントを平均して筋繊維あたりの毛細管数として記録した。ＥＬＩＳＡによって、脂肪組織および骨格筋においてＡｄＶＥＧＦを介した遺伝子導入および発現が首尾よくなされることが確認された。０日目の（ベクター投与直後に採取した）いずれの組織にも、未投与の脂肪組織や骨格筋と同様、ＶＥＧＦは検出できず、ベクター製剤にＶＥＧＦ蛋白が夾雑していないことが確認された。両方の組織について、ＶＥＧＦ発現を定量することにより、ＡｄＶＥＧＦの投与の結果、ベクター投与１日後をピークにしてベクター投与後１週間までに数日間かけてベースラインまで減少するＶＥＧＦ発現が起こることが実証された。対照的に、コントロールベクターＡｄＮｕｌｌの投与の結果、どちらの組織もいずれの時点でも検出可能なＶＥＧＦ発現を生じなかった。重要なことに、アデノウイルスベクター送達が局在化された遺伝子導入および発現の戦略を提供するという概念と一致して、ベクター送達後のいかなる時点においても、ＡｄＶＥＧＦで処理した動物の血清中にＶＥＧＦは検出できず、また、ＡｄＮｕｌｌを投与しても、ベースラインを超えるＶＥＧＦの血清レベルの増加を生じなかった。これらの実験に使用したＥＬＩＳＡはヒトＶＥＧＦのみを検出し、ラットＶＥＧＦを検出しないので、内在性ＶＥＧＦは血清中にも組織中にも検出されなかった。 ^99mＴｃ標識ｓｅｓｔａｍｉｂｉ撮像により、ＡｄＶＥＧＦで処理した動物における顕著に多い虚血性後肢への相対血流が実証された。ＡｄＮｕｌｌで処理したコントロール動物のスキャンされた放射活性画像は、結紮された後肢のふくらはぎ領域において低レベルの放射活性を示した。未処理およびＰＢＳで処理したコントロール動物は、未処理およびＡｄＮｕｌｌコントロールと同じく、この領域で同様に低レベルの放射活性を有していた。ＡｄＮｕｌｌおよびＰＢＳコントロールはどちらもふくらはぎ領域の放射活性が低レベルであったが、ＡｄＮｕｌｌ群はＰＢＳ群よりわずかに高かった。カラーマイクロスフェア分析により、ＡｄＶＥＧＦで処理した動物における大腿骨動脈結紮後の相対血流は、いずれのコントロール動物［ＡｄＮｕｌｌ処理、ＰＢＳ処理または未処理の動物］で観察されるものよりほぼ３倍多いことが実証された。未処理およびＰＢＳ処理したコントロールにおける相対血流は、ＡｄＮｕｌｌで処理した動物と同様であった。コントロールに比べてＡｄＶＥＧＦで処理した動物において、対側性のコントロール後肢におけるマイクロスフェア／ｇｍ組織に対する結紮された後肢におけるマイクロスフェア／ｇｍ組織の比として計算される相対血流が増加するのは、結紮された後肢におけるマイクロスフェア数が増加することによるものであって、対側性のコントロール後肢におけるスフェア数の減少によるものではなかった。注入の間、カラーマイクロスフェアが十分混合されていることを確かめるために、腸骨および大腿骨のいずれの結紮も受けていない別個の動物群（ｎ＝６）において、各後肢への相対血流を定量した。これらの動物における相対血流（左対右）は、９９％±７％であった。血管造影により、ＡｄＶＥＧＦで処理した動物において、遠位の後肢の血管系を部分的に再構成する側副形成を伴った、コントロールよりも顕著に大きい結紮後肢での血管分布が実証された。ＡｄＶＥＧＦ処理した動物の結紮後肢における血管造影の血管スコアは、未処理、ＰＢＳ処理およびＡｄＮｕｌｌ処理したコントロールのそれよりも顕著に大きかった。血管造影で可視化される、未処理およびＰＢＳ処理した動物における側副血管数は、ＰＢＳおよびＡｄＮｕｌｌ処理した動物における血管数と同じく類似していた。未処理コントロールにおける血管数はＡｄＮｕｌｌ群のそれよりも多かったが、どちらもＡｄＶＥＧＦ群よりは少なかった。脂肪組織および骨格筋における血管分布の組織学的評価は、相対血流および血管造影による血管分布増進の証拠の観察と一致した。未処理、ＰＢＳ処理およびＡｄＮｕｌｌ処理コントロールと比較して、顕著に多数の小血管がベクター投与２１日後にＡｄＶＥＧＦを注入した脂肪組織で観察された。ＡｄＶＥＧＦ処理した脂肪組織の組織学的試料の定量評価の結果、未処理、ＰＢＳ処理およびＡｄＮｕｌｌ処理コントロールと比較すると、小血管数において５２％±６％の増加を生じた。同様に、ＡｄＶＥＧＦ処理した四頭骨格筋の組織学的評価は、ベクター投与２１日後の筋繊維あたりの毛細管数が、未処理、ＰＢＳ処理およびＡｄＮｕ１１処理コントロールと比較して顕著に多いことを実証した。ＡｄＶＥＧＦ処理した骨格筋の定量評価は、筋繊維あたりの平均毛細管数が、未処理、ＰＢＳ処理およびＡｄＮｕｌｌ処理コントロールと比較して顕著に増加することを実証した。これらの結果は、血管閉塞部位の周囲且つ遠位の脂肪組織および骨格筋への、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅のＤＮＡのアデノウイルスを介したインビボ導入が、続いて起こる急性血管閉塞によって引き起こされる虚血を軽減するのに十分な血管新生応答を誘導することを示している。また、これらの結果は、血管形成誘導メディエーターは急性虚血現象の後に血管新生応答を増進させるのに用いることができるだけでなく、急性血管閉塞が続いて起こる危険性のある虚血組織を「救済する」のにも使用し得ることを示している。発現した血管形成誘導蛋白がもはや検出できなくなって何週間も後に、虚血組織を保護する血流増進が実証されるということは、血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクター投与が生理学的に意義ある血管新生応答を提供するのに十分であることを示している。実施例４本実施例では、本発明が、血管形成誘導ペプチド（特にＶＥＧＦ₁₂₁）をコードするＤＮＡのアデノウイルスを介した遺伝子導入により、心筋の灌流および虚血心臓における機能を改善し得ることを実証する。体重２８〜３０ｋｇのヨークシャーブタに慢性心筋虚血を作出した。動物の筋肉内にチレタミンおよびゾラゼパム（テラゾール、３．３ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（０．１０ｍｇ／ｋｇ）の鎮静剤を投与してから挿管し、０．５％〜２．０％イソフルランで鎮静作用を維持した。第５肋間空間を通じて制限された左開胸術を無菌的に行い、心膜を小さく切開した。内径２．５ｍｍのアメロイド圧迫器（Research Instruments & MFG，Corvallis，Ore.）を回旋動脈の周りにできるだけ近位に据え付けた。局所リドカイン１％溶液をアメロイド圧迫器部位において回旋動脈に適用し、冠動脈発作を防いだ。心膜および胸部を閉じ動物を回復させた。複製欠損ベクターＡｄＶＥＧＦ₁₂₁は、Ｅ１領域（右から左）にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー、人工のスプライス配列、ヒトＶＥＧＦ₁₂₁ＤＮＡおよびＳＶ４０ポリＡ／終結シグナルを含む発現カセットを含有する、Ｅ１ａ^-、部分的Ｅ１ｂ^-、部分的Ｅ３^-のアデノウイルスベクターである。コントロールベクターとしてＡｄＮｕｌｌ（ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁と類似するが、発現カセット中に遺伝子を有しない）を使用した。すべてのアデノウイルスベクターを２９３細胞内で繁殖・力価測定し、塩化セシウム密度精製により精製、透析して、−７０℃で保存した。ウイルスストックは複製能力のある野生型アデノウイルスを含まないことが実証された。［³Ｈ］チミジンの取り込みを用いてヒト臍静脈内皮細胞の増殖を実証することにより、ＶＥＧＦ₁₂₁導入遺伝子産物の生物活性を確認し、また、導入遺伝子の発現のインビボ確認は、ベクター投与３日後にＡｄＶＥＧＦ₁₂₁注入部位から採取した心筋生検試料の酵素結合免疫吸着測定法分析により測定した。アメロイド圧迫器設置３週間後に、左開胸術を再開し、治療的ベクターＡｄＶＥＧＦ₁₂₁またはコントロールベクターＡｄＮｕｌｌを、直接心筋注入により投与した。各ベクターを、回旋分布で１０部位に、それぞれリン酸緩衝食塩水（ｐＨ＝７．４）１００μｌでもって注入した（１０⁸ｐｆｕ／注入）。ペーシングワイヤーを左心耳内に据え付け、その後のシングル・フォトン・エミッション・コンピューター連動断層撮影（ＳＰＥＣＴ）による心筋の局所的灌流の負荷^99m Ｔｃ標識ｓｅｓｔａｍｉｂｉ評価および局所的壁肥厚の心エコー図法による評価のために、皮下に潜り込ませた。アメロイド圧迫器の設置３週間後および７週間後に、安静時および負荷時の心筋の局所的灌流を^99mＴｃ−ｓｅｓｔａｍｉｂｉＳＰＥＣＴにより評価した。２００拍／分での急速心房ペーシングの間に、動物に５ｍＣｉの^99mＴｃ−ｓｅｓｔａｍｉｂｉの濃縮塊を静脈内注入し、およそ３分間ペーシングを続けた。次いで、動物をADAC Vertex ２検出器γカメラシステム（ADAC Laboratories，Mi lpitas，CA）内に俯せにおいた。次いで、非ゲート制御ＳＰＥＣＴ研究を、身体の輪郭に沿った１８０度の軌道上を「わずかに進んでは撮影する（step-and-sho ot）」方式で取得した。ベースラインの心拍数に戻した後、類似の様式で得られる静止ＳＰＥＣＴを得る前に、動物に２５ｍＣｉの^99mＴｃ−ｓｅｓｔａｍｉｂｉの濃縮塊を注入した。安静および負荷ＳＰＥＣＴ研究を、集積ADAC Pegasysコンピューターを使用して、先入観の入らない様式で処理した。心室中部短軸像を心室腔を中心として６０角セグメントに分割し、セグメントあたりのカウント数を測定し、各セグメントにおけるカウント数を最大カウント数（レファレンス値１００が与えられる）を有するセグメントに対して標準化し、標準化されたセグメントあたりのカウントをセグメントの角位置に対してプロットすることにより、心室中部レベルにおける負荷および安静円周カウントプロファイル（極プロット）を構築した。プログラムSIGMAPLOT（Jandel Scientific，Corte Madera，CA）を用いてさらに解析を行うために、極プロットをＡＳＣＩＩファイルに移した。各動物について、心筋虚血の範囲（「領域」）を安静および負荷極プロット間の差異から決定した。回旋分布において虚血が最も激しいところ（「虚血最大」）を、安静および負荷プロット間の差異が最大となる点を突き止め、その点でのプロットの差を測定することによって決定した。各動物について、心筋の灌流における改善パーセントを、これら２つのパラメータに関して、（３週間時点での「パラメータ」−７週間時点での「パラメータ」×１００）／（３週間時点での「パラメータ」）として計算した。安静時およびベクター投与時の負荷期間の心エコー図によって、ベースラインの心筋の局所的機能を評価した。動物に鎮静剤を投与して、左側臥位におき、ＨＰ２５００心エコー計および３．０／３．５ＭＨｚ二元頻度経胸腔トランスデューサー（Hewlett-Packard，Andover，Mass.）を用いて、標準的な二次元およびＭ−モード経胸腔像を得た。右傍胸骨アプローチから、３分間静止時の短軸像、中心室像を得た。次いで、動物に目的の心拍数である２００拍／分まで段階的な様式で急速左心房ペーシングを行い、その時に画像をさらに３分間記録した。１人の経験豊富な研究者が先入観の入らない様式で、Digisonics CardioRevue System（Digisonics Inc，Houston，Tex.）を用いて心弛緩期と心収縮期の両方における左心室の心内膜および心外膜表面の輪郭を描き、局所的な壁肥厚を測定した。６つの等しい放射状６０度セグメントのそれぞれにおける心収縮期の壁肥厚を、心収縮期の平均壁厚−心弛緩期の平均壁厚と定義した。壁肥厚率を、心収縮期の平均壁肥厚を心弛緩期の平均壁厚で割って計算した。各動物について、３週間（ベースライン虚血）における急速心房ペーシング像から、虚血および非虚血ゾーンを、それぞれ最低および最高の壁肥厚率を有する２つの隣接するセグメントとして定義した。これは、すべての場合において、回旋領域および中隔にそれぞれ対応した。各動物について、７週間における急速心房ペーシングで同じゾーンを分析した。各動物を死に至らしめる際（ベクター投与４週間後）、心臓を４０ｍＥｑのＫＣｌで停止させ、次いで、McDowell-Trump固定液（４％ホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒド、１％ＮａＨ₂ＰＯ₄および０．３％ＮａＯＨ、ｐＨ＝７．２に調整）１Ｌを用いて、１００ｍｍＨｇで灌流固定した。左主要冠状動脈に据え付けた５Ｆ末端孔楔入バルーンカテーテル（Arrow Inc.，Reading，Pa. ）を用いて、同じ血管造影者が、先入観の入らない様式で、生体外（ex vivo）冠血管造影を行った。連続的な画像取得を伴う標準的な第一斜位における透視シネ検査法により、造影剤（Hypaque-76，Nycomed Inc.，New York，N.Y.）５ｍｌを、左前下行冠状動脈全体とその枝が完全に不透明化するまで連続的な速度で注入した。回旋冠状動脈または回旋冠状動脈の鈍縁枝を再構成する左前下行冠状動脈からの側副血管を、３人の先入観のない観察者が、J ．Am．Coll．Cardiol.，5 ，587-592(1985)に記載されるように、Rentropとその共同研究者の以下のような格付け法を用いて定量した：０＝側副血管の補足なし；１＝心外膜セグメントは可視化されずに回旋の側副枝または鈍縁枝が補足される；２および３＝側副血管を介して回旋動脈の心外膜セグメントまたは鈍縁動脈が、それぞれ部分的または完全に補足される。血管造影の後、各心臓の左心室を短軸で３つの環に切片化した。各心臓由来の４０個の５μｍ組織学的切片を、心基部環および心室中部環の周囲で等間隔に取り、パラフィンで処理してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各組織切片について、処理に対して先入観のない病理学者が、梗塞および炎症の組織学的証拠を以下のように０〜４の尺度で格付けした：０＝なし；１＝１〜３の小領域を含む；２＝切片表面の１０％未満；３＝切片表面の１０％以上且つ５０％まで；４＝切片表面の５０％より上。研究した１９匹の動物（ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁、ｎ＝９；ＡｄＮｕｌｌ、ｎ＝１０）のすべてが、アメロイド圧迫器設置７週間後に屠殺するまで毒性の臨床的証拠なしに生存した。３週間（すなわち、治療前）では、(1)^99mＴｃ−ｓｅｓｔａｍｉｂｉＳＰＥＣＴ像の回旋ゾーンにおける固定した欠損（安静時および負荷時の間で差がない）および(2)安静時の心エコー図法の間の短軸像における左心室の薄くなった無収縮の後側壁領域により示されるように、１９匹のブタのうち４匹（ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁、ｎ＝２；ＡｄＮｕｌｌ、ｎ＝２）に回旋領域における心筋梗塞の証拠があった。アメロイド圧迫器設置３週間後の心筋梗塞を示唆する⁹⁹ ^m Ｔｃ−ｓｅｓｔａｍｉｂｉＳＰＥＣＴおよび心エコー図法と一致して、４週間後の病理学的総評は、心筋に傷が残り、総心室量の少なくとも２５％が薄くなっていることを示した。この亜群の４匹のブタはすべて、大きな壁内梗塞の組織学的証拠も有していた。これらのデータに基づいて、これら４匹の動物はさらなる分析から除外した。したがって、治療の有効性について評価した動物群は、７匹のＡｄＶＥＧＦ₁₂₁処理動物および８匹のＡｄＮｕｌｌ（コントロール）動物であった。１０⁸ｐｆｕのＡｄＶＥＧＦ₁₂₁（ｎ＝３）を心筋に注入した後の心筋での局所的なＶＥＧＦ発現を実証することにより、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁ベクターのインビボでの発現を確認した。ベクター投与３日後、心筋でのレベルは０．７５±０．２５ｎｇ／ｍｇ蛋白であった。心室中部レベルからの^99mＴｃ−ｓｅｓｔａｍｉｂｉＳＰＥＣＴデータの円周カウントプロファイル（極プロット）を用いて、（１）虚血の範囲と重篤度（「領域」）および（２）最も激しい虚血（「虚血最大」）を定量した。３週間時点で得られる安静時の画像の円周プロットは、負荷（ペーシング）時の画像のプロットと比較して最小の灌流不足を典型的に示し、閉塞した回旋冠状動脈分布に対応する後側部分における灌流の減少を明らかにした。ベクター投与４週間後に評価したＡｄＮｕｌｌ動物においては、虚血領域と虚血最大はベースラインから変化がないことが特徴であった。対照的に、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物は、虚血領域と虚血最大がベースラインと比較して減少することにより実証されるように、ベクター投与４週間後の心筋の灌流において改善を示した。対応する変化は、心尖、心室中部および心基部レベルで表れた。虚血領域は、ベクター投与時にはＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物とＡｄＮｕｌｌコントロール動物のどちらでも同様であった。対照的に、７週間時点では、虚血領域はＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物ではＡｄＮｕｌｌ動物と比較して顕著に減少した。ベクター投与４週間後の各動物の虚血領域におけるベースラインと比較した「改善パーセント」は、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物ではＡｄＮｕｌｌ動物におけるよりもおよそ２．４倍大きかった（それぞれ７５％±６％対３２％±１１％）。回旋分布における虚血最大もまた、３週間後では、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物とＡｄＮｕｌｌコントロール動物で同じであった。対照的に、ベクター投与４週間後には、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物における虚血最大はＡｄＮｕｌｌコントロール動物におけるよりも顕著に減少した。同様に、虚血最大における「改善パーセント」は、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物ではＡｄＮｕｌｌコントロール動物よりも２．５倍大きかった（５６％±８％対２２％±６％）。アメロイド圧迫器設置３週間後では、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁群における、非虚血性中隔と比較した虚血性回旋領域の心筋機能は、急速心房ペーシングの間の壁肥厚率によって評価されるように、ＡｄＮｕｌｌコントロールと比較して同様であった。対照的に、ベクター投与４週間後には、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁処理した動物は、急速心房ペーシングの間の壁肥厚率において、ＡｄＮｕｌｌコントロール動物よりも顕著に大きな改善を示した。印象的なことに、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁群の回旋セグメントにおける収縮機能は、この分析での虚血ゾーンから非虚血ゾーンを引いた差が「ゼロ」であることに反映されるように、中隔（コントロール）セグメントのそれに近づいた。ベクター投与４週間後に行った生体外血管造影により、すべての動物においてアメロイド圧迫器により近位の回旋冠状動脈が完全に閉塞されることが確認された。ＡｄＮｕｌｌで処理した動物は、鈍縁および回旋冠状動脈の部分的にすぎない補充を特徴として示した。対照的に、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁を受容した動物は、鈍縁および回旋冠状動脈のどちらの循環においてもほぼ完全な再構成を典型的に示した。鈍縁および回旋冠状動脈に対する側副グレードは、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物においてＡｄＮｕｌｌ動物よりも顕著に高かった。最後に、血管造影により可視化される、回旋および鈍縁動脈を補う側副血管の総数は、ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁動物においてＡｄＮｕｌｌ動物よりも顕著に多かった。本研究における１５匹の動物のうち１３匹の心筋が、炎症の評価に利用可能であった（ＡｄＶＥＧＦ₁₂₁、ｎ＝５；ＡｄＮｕｌｌ、ｎ＝８）。最小の炎症が、治療４週間後に評価したこれらの動物の心筋において検出され、ＡｄＶＥＧＦ₁₂ ₁ 群とＡｄＮｕｌｌ群との間で炎症の程度に差はなかった（全体の強度スコア０．３±０．０６対０．４±０．０８）。本結果は、ヨークシャーブタで実証されたように、ヒトＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦ₁₂₁のＤＮＡを、閉塞した回旋冠状動脈を有する哺乳動物の心筋層にアデノウイルスを介して直接導入することにより、負荷により誘導される心筋の虚血の間に、心筋の局所的灌流および収縮機能において顕著で且つ生理学的に適切な改善を生じることを示している。重要なことに、この改善は、心筋の側副血管の発達を伴い、実験的に閉塞させた冠状動脈セグメントを「生物学的にバイパスする」のである。実施例５本実施例では、本発明が、ヒトの心組織にＡｄＶＥＧＦ_121.10を投与し得ることを実証する。複製欠損ベクターＡｄＶＥＧＦ_121.10は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー、人工のスプライス配列、ヒトＶＥＧＦ₁₂₁ＤＮＡおよびＳＶ４０ポリＡ／終結シグナルを含む発現カセットをＥ１位に含有する、Ｅ１ａ^-、部分的Ｅ１ｂ^-、Ｅ３^-のアデノウイルスベクターである。ＡｄＶＥＧＦ_121.10ベクターは、２つのヒト臨床試験（すなわち、合衆国ＦＤＡ臨床試験ＢＢ−ＩＮＤ５７０２およびＢＢ−ＩＮＤ６４４２）のためのＡｄ_GVＣＦＴＲ．１０およびＡｄ_GVＣＤ．１０を構築・製造するのに用いた手順に従って製造した。ＡｄＶＥＧＦ_121.10を製造した後、該ベクターを精製し、２×１０⁹〜２×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ（すなわち、１００粒子単位／ｐｆｕと仮定すると２× １０¹¹〜２×１０¹²ｐｕ／ｍｌ）の力価で、炭水化物塩溶液中−７０℃で保存した。慣用の心肺バイパスを用いた開胸心臓バイパス外科手術を、該バイパス処置完了後のＡｄＶＥＧＦ_121.10ベクターの投与とともに行った。ＡｄＶＥＧＦ_121.10 ベクターを、開胸心臓手術の間に、２８ゲージ針を有するインスリンシリンジを用いて心筋層に直接投与した。慣用の冠バイパス手術の候補者であり、少なくとも１つの他の冠状動脈分布に広汎性もしくはバイパス不可能な疾患を有する２人のヒト患者にＡｄＶＥＧＦ_121.10投与を行った。２人の患者のそれぞれについて、ベクターの全用量（１×１０⁷ｐｆｕ、１×１０⁹ｐｕ）を１０のアリコート（１００μｌ／アリコート）に分け、各アリコートを５ｍｍ以下の深さで１．５〜２．０ｃｍ離れた部位に投与した。その後の外科手術は、該外科手術に先立ち真夜中以降は患者が絶食および絶水するようにして行った。心臓麻酔医は、各個体を準備するのに、また、手術の間中標準的な手順を使用した。標準的なモニター類（３リード−修正心電図、パルス酸素濃度計）を利用できる手術室に個体を搬送し、必要に応じて前投薬を行った。連続的な血圧モニタリングと血液サンプリングのために、橈骨動脈ラインを麻酔下に挿入した。ミダゾラム、フェンタニルおよび／またはチオペンタールで麻酔状態を誘導した。追加麻酔にはミダゾラム、フェンタニルおよび／またはチオペンタール、並びにイソフルランが含まれた。パンクロニウムにより筋肉を弛緩させた。気管内挿管（その場合さらに静脈内通路が挿入される）を容易にするために、必要に応じてスクシニルコリンを投与した。中枢ライン（内頸静脈または鎖骨下静脈）を挿入した。その中枢ラインを通じて肺カテーテルを挿入し、心機能（中心静脈圧、肺動脈圧、肺動脈楔入圧およびコンピューター処理され、熱希釈計算された心拍出量）をモニタリングできるようにした。経食道心エコー法プローブを挿入して心臓内構造を同定し、弁膜および心室の機能を評価した。膀胱カテーテルを据え付けて尿産出量を測定した。処置終了後４〜６時間以内に、抜管を可能にする用量の麻酔を投与した。次いで、患者の胸部をベタジン／アルコールを用いて標準的な滅菌の仕方で準備し、布で覆った。小さな（半径およそ０．６ｍｍ、細切採取法による皮膚生検と同じ）皮膚生検を皮膚切開部位で採取した。該生検を、アデノウイルスベクター指向性の細胞傷害性Ｔリンパ球を評価するための自家線維芽細胞を増殖させるのに用いた。胸骨正中切開術を行い、伏在静脈または別の関連する導管を集めた。胸骨正中切開術に続いて、大動脈および右心房カニューレ挿入をヘパリン（３ｍｇ／ｋｇ）投与後に行った。左内胸動脈を同定して胸壁から切り離した。標準的なプラクティスにより患者を心肺バイパスにつないだ。心肺バイパス回路は、Cobe Excel 膜型人工肺（Cobe Laboratories Inc.，Lakewood，Colorado）と、CobeローラーポンプもしくはBiomedicus遠心型ポンプ（Biomedicus，Eden Prairie，MN）のいずれかを含んでいた。回路に、約２２００ｍｌのクリスタロイド溶液（２５％アルブミン２００ｍｌ、０．５ｍｇ／ｋｇマンニトール、Ringerの乳酸塩１８００ｍｌ）を注入した。バイパスすべき冠状動脈を同定して印を付けた。大動脈を留め具で横断固定した後、穏やかな全身冷却（２８〜３２℃）による断続的な前行性および／または逆行性の冷血心停止法を使用した。心筋温度プローブを据え付けて、心臓麻痺的な停止の間、連続的に心筋の温度をモニタリングし、膀胱温度プローブを用いて全身の温度をモニタリングした。ランニング７−０プロレン縫合糸を使用し、逆の伏在静脈セグメントを用いて冠状動脈に遠位吻合を行った。同様のやり方で内胸動脈を左前下行動脈に吻合した。大動脈の横断クランプを除去し、心肺バイパス回路の熱交換器を利用して患者を全身的に３６℃に温め直した。再加温開始後、部分的に大動脈を閉塞させるクランプを大動脈に据え付けた。伏在静脈移植片の近位吻合部位を大動脈上にマーキングし、４．８ｍｍの綿撒糸を大動脈の付け根から切り出した。各伏在静脈移植片の近位部分を、６−０プロレン縫合糸を用いて大動脈に吻合した。近位吻合の完了後、バイパスの影響をうけにくい遮断された冠状動脈領域内に、ＡｄＶＥＧＦ_121.10を１０回注入（１００μｌ／注入）で投与した。１人の患者には右冠状動脈区域にベクターを投与し、第二の患者には左心室にベクターを投与した。患者を心肺バイパスから切り離した。プロタミンを投与してヘパリンにより誘導される抗凝固傾向を逆転させた。大動脈および心房のカニューレを除去し、すべてのカニューレ挿入部位を縫合した。一時的な心室ペーシングワイヤーを据え付けた。標準的なプロトコールにより３６フレンチ胸部造瘻管を左胸膜空間および縦隔に据え付け、術後ドレナージを行った。＃２０ワイヤーを用いて胸骨を再隣接させ閉じた。ランニング０ビクリル縫合糸を用いて筋膜を二層で閉じた。皮膚を皮膚クリップで再隣接させた。伏在静脈採取部位における脚についても同様の閉じ方を用いた。ここで述べられた特許、特許出願および刊行物を含めたすべての引用文献は、引用によりその全体がここに組み込まれるものである。本発明は好適な態様を強調して記載したものであるが、様々な好適な態様が使用され得ること、および本発明がここで詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図していることは、当業者には自明であろう。したがって、本発明は添付の請求の範囲によって定義される発明の精神および範囲内に包含されるすべての改変を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月５日（１９９９．３．５）【補正内容】的処置の計画は、患者の血管系の特定の部分を通る血液供給の遮断を予見することができる。本方法にしたがって前処置することにより、これらの手術の所望の結果を実質的に改善させることができる。その場合、好ましくは、処置は該手術の約１日ないし約６週間前になされ、より好ましくは、手術の約２ないし１４日前になされる。血管形成誘導ベクターの投与前述のように、ＶＥＧＦ蛋白などの血管形成誘導ペプチドの全身投与を介して血管新生を誘導すると、例えば、失明を引き起こし、腫瘍細胞の侵襲性を増大させ得る無差別な血管新生の誘導が起こり得る。それ故、そのようなネガティブな副作用を軽減もしくは予防するために、それを必要とする組織（すなわち、標的組織）のみに血管新生を誘導することが望ましい。本発明は、血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターを、標的組織に、局在化する様式で投与することを含む。本発明においては、いかなる適切な血管形成誘導ベクターの標的組織への投与手段も使用することができるが、好ましくは、標的組織へのそのような局在投与は、該標的組織に血管形成誘導ベクターを直接注入するか、あるいは該標的組織に血管形成誘導ベクターを局所的に塗布することにより達成される。「注入する」という語は、血管形成誘導ベクターを標的組織内に強制的に導入することを意味する。本発明においては、いかなる適切な注入装置も使用することができる。そのような注入装置としては、同時複数注入の送達が可能な遺伝子導入送達装置に関する米国特許第５,８４６,２２５号に記載されるものが挙げられるが、それに限定されない。本発明において使用することができる別の注入装置の例として、侵襲性が最小の注入装置が挙げられる。このような装置は、例えば、５インチ未満の小さな切り込みを通して心臓に到達することができ、上記の複数注入装置とは対照的に、単一の内腔を通じて注入するように設計されている。特異な幾何学図形をなす複数アデノウイルスベクターは、プラスミドや他のウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルス）とは異なり、分裂細胞と非分裂細胞の両方に遺伝子導入を達成し、心筋、血管内皮および骨格筋などの心血管関連部位において高レベルで蛋白を発現するので、好適である。さらに、アデノウイルスベクターによって導入された遺伝子は、染色体外の位置で機能し、宿主ゲノムの重大な部位に導入された遺伝子を不適当に挿入する危険性がほとんどない。アデノウイルスベクターはまた、ウイルス複製に必要な少なくとも１つの遺伝子機能を欠損していることが好ましい。好ましくは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能、特にＥ１ａ領域を欠損し、より好ましくは、該ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能およびＥ３領域の一部を欠損（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）するか、あるいはＥ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能およびＥ４領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損する。しかしながら、Ｅ２ａ領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損したアデノウイルスベクターおよびＥ３領域のすべてを欠損したアデノウイルスベクターもまた意図されており、且つ当該技術分野においてよく知られている。Ｅ４領域全体を欠失したアデノウイルスベクターは、より低い宿主免疫応答を引き出すことができる。適切な複製欠損アデノウイルスベクターが米国特許第5,851,806号およびＰＣＴ国際公開WO 95/34671号に開示されている。例えば、適切な複製欠損アデノウイルスベクターとして、Ｅ１ａ領域の部分欠失、Ｅ１ｂ領域の部分欠失、Ｅ２ａ領域の部分欠失およびＥ３領域の部分欠失を有するものが挙げられる。あるいは、複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の欠失、Ｅ３領域の部分欠失およびＥ４領域の部分欠失を有していてもよい。さらに、米国特許第5,432,075号に記載されるように、ウイルスベクターのコート蛋白を、特異的な蛋白質結合配列を組み込むように改変することができ、あるいは、ＰＣＴ国際公開WO98/40509号に記載されるように、野生型コート蛋白に請求の範囲１．標的組織への血液の灌流のレベルを増進させる方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該組織への該血液の灌流のレベルを増進させる方法。２．虚血性損傷を病んでいるか、あるいは病む危険性のある標的組織の処置方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該用量により該組織において治療または予防効果をもたらす方法。３．標的組織における血管新生を誘導する方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該組織において血管新生を誘導する方法。４．血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある標的組織における側副血管形成を誘導する方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該アデノウイルスベクターを該側副血管形成のための起点、終点およびそれらの間の領域を含む領域に接触させる方法。５．該標的組織がはっきりと区別される器官の中にある請求の範囲１〜４のいずれかの方法。６．該はっきりと区別される器官が心臓である請求の範囲５の方法。７．該心臓がヒト心臓である請求の範囲６の方法。８．該複数回適用が、該標的組織の異なる点に投与される請求の範囲１〜７のいずれかの方法。９．該複数回適用が該標的組織の約０．５〜１５ｃｍ³に投与される請求の範囲１〜８のいずれかの方法。１０．該複数回適用の少なくとも２回が約１０分以内に投与される請求の範囲１〜９のいずれかの方法。１１．該複数回適用のすべてが約１０分以内に投与される請求の範囲１〜１０のいずれかの方法。１２．該複数回適用が実質的に同時である請求の範囲１〜１１のいずれかの方法。１３．該血管形成誘導ペプチドが、ＶＥＧＦ121、ＶＥＧＦ145、ＶＥＧＦ165およびＶＥＧＦ189からなる群より選択される請求の範囲１〜１２のいずれかの方法。１４．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損する請求の範囲１〜１３のいずれかの方法。１５．該ベクターがＥ３領域の一部を欠損する請求の範囲１〜１４のいずれかの方法。１６．該ベクターが、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ１ｂ領域の少なくとも一部の欠失およびＥ３領域の少なくとも一部の欠失を有する請求の範囲１〜１５のいずれかの方法。１７．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損する請求の範囲１〜１６のいずれかの方法。１８．該ベクターが、Ｅ１領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ３領域の少なくとも一部の欠失およびＥ４領域の少なくとも一部の欠失を有する請求の範囲１〜１７のいずれかの方法。１９．該ＤＮＡが、該アデノウイルスベクターの該アデノウイルスゲノムにおいて右から左の方向である請求の範囲１〜１８のいずれかの方法。２０．該ＤＮＡがアデノウイルスゲノムのＥ１領域内に位置する請求の範囲１９の方法。２１．該組織が血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある請求の範囲１〜２０のいずれかの方法。２２．該用量が該標的組織に生体外で投与される請求の範囲１〜２１のいずれかの方法。２３．該用量が該標的組織にインビボで投与される請求の範囲１〜２２のいずれかの方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ０７Ｋ 14/515 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号６０／０７１，１５６ (32)優先日平成10年１月13日(1998．1．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クリスタル、ロナルドジー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20852、ポトマック、キャナルヴィスタコート 13712

Claims

【特許請求の範囲】１．標的組織への血液の灌流のレベルを増進させる方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該組織への該血液の灌流のレベルを増進させる方法。２．虚血性損傷を病んでいるか、あるいは病む危険性のある標的組織の処置方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該用量により該組織において治療または予防効果をもたらす方法。３．標的組織における血管新生を誘導する方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織への複数回適用を介して投与し、該組織において血管新生を誘導する方法。４．血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある標的組織における側副血管形成を誘導する方法であって、 (a)医薬上許容される担体および(b)血管形成誘導ペプチドをコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含有する医薬組成物の一用量を、該組織へ投与し、該アデノウイルスベクターを該側副血管形成のための起点、終点およびそれらの間の領域を含む領域に接触させる方法。５．該標的組織がはっきりと区別される器官の中にある請求の範囲１〜４のいずれかの方法。６．該はっきりと区別される器官が心臓である請求の範囲５の方法。７．該心臓がヒト心臓である請求の範囲６の方法。８．該複数回適用の各々が該標的組織の約０．５〜１５ｃｍ³に投与される請求の範囲１〜７のいずれかの方法。９．該複数回適用のすべてが約１０分以内に投与される請求の範囲１〜８のいずれかの方法。１０．該複数回適用が実質的に同時である請求の範囲１〜９のいずれかの方法。１１．該血管形成誘導ペプチドが、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₄₅、ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₈₉からなる群より選択される請求の範囲１〜１０のいずれかの方法。１２．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損する請求の範囲１〜１１のいずれかの方法。１３．該ベクターがＥ３領域の一部を欠損する請求の範囲１〜１２のいずれかの方法。１４．該ベクターが、Ｅ１ａ領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ１ｂ領域の少なくとも一部の欠失およびＥ３領域の少なくとも一部の欠失を有する請求の範囲１〜１３のいずれかの方法。１５．該ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくとも１つの不可欠な遺伝子機能を欠損する請求の範囲１〜１４のいずれかの方法。１６．該ベクターが、Ｅ１領域の少なくとも一部の欠失、Ｅ３領域の少なくとも一部の欠失およびＥ４領域の少なくとも一部の欠失を有する請求の範囲１〜１５のいずれかの方法。１７．該ＤＮＡが、該アデノウイルスベクターの該アデノウイルスゲノムにおいて右から左の方向である請求の範囲１〜１６のいずれかの方法。１８．該ＤＮＡがアデノウイルスゲノムのＥ１領域内に位置する請求の範囲１７の方法。１９．該組織が血管閉塞に冒されているか、あるいは冒される危険性のある請求の範囲１〜１８のいずれかの方法。２０．該用量が該標的組織に生体外で投与される請求の範囲１〜１９のいずれかの方法。２１．該用量が該標的組織にインビボで投与される請求の範囲１〜１９のいずれかの方法。