JP3155002B2 - エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体 - Google Patents
エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体Info
- Publication number
- JP3155002B2 JP3155002B2 JP19896990A JP19896990A JP3155002B2 JP 3155002 B2 JP3155002 B2 JP 3155002B2 JP 19896990 A JP19896990 A JP 19896990A JP 19896990 A JP19896990 A JP 19896990A JP 3155002 B2 JP3155002 B2 JP 3155002B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- epo
- antibodies
- erythropoietin
- peptide
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、エリスロポイエチン（EPO）ペプチドおよ
びエピトープ特異性抗EPO抗体の調製のためのそれらの
使用に関する。本発明は、さらにポリクローナル抗体
（抗血清）またはモノクローナル抗体であってもよいエ
ピトープ特異性抗EPO抗体に関する。さらに、本発明
は、EPO、EPO誘導体またはEPOペプチドの精製のための
エピトープ特異性抗EPO抗体の使用に関する。さらに、
本発明は、EPOリセプター領域を模した抗イディオタイ
プ抗体に関する。最後に、本発明は、EPOの検出、好ま
しくはエピトープ特異性の検出、上記EPOペプチド、抗E
PO抗体または抗イディオタイプ抗体を含む医薬物および
EPOまたは抗EPO抗体の検出のための診断的補助物のため
のエピトープ特異性抗EPO抗体の使用に関する。
びエピトープ特異性抗EPO抗体の調製のためのそれらの
使用に関する。本発明は、さらにポリクローナル抗体
（抗血清）またはモノクローナル抗体であってもよいエ
ピトープ特異性抗EPO抗体に関する。さらに、本発明
は、EPO、EPO誘導体またはEPOペプチドの精製のための
エピトープ特異性抗EPO抗体の使用に関する。さらに、
本発明は、EPOリセプター領域を模した抗イディオタイ
プ抗体に関する。最後に、本発明は、EPOの検出、好ま
しくはエピトープ特異性の検出、上記EPOペプチド、抗E
PO抗体または抗イディオタイプ抗体を含む医薬物および
EPOまたは抗EPO抗体の検出のための診断的補助物のため
のエピトープ特異性抗EPO抗体の使用に関する。
＜従来の技術＞ エリスロポイエチン（EPO）は、166個のアミノ酸を有
し、アミノ酸の位置24、38、83および126のグリコシル
化（glycosylation）部位を有する、分子量約34,000で
ある糖タンパク質ホルモンである。これは、最初は23個
のアミノ酸のシグナルペプチドを有する前駆体タンパク
質として産生される。EPOは、赤血球前駆細胞の有糸分
裂および分化を刺激して、その結果、赤血球の産生を確
実にする。これは、低酸素状態が優勢になると腎臓で産
生される。赤血球前駆細胞のEPO誘導性分化の間、グロ
ビン合成の誘導およびヘム複合体の合成およびフェリチ
ンリセプターの数の増加がある。これによって、細胞は
より多くの鉄を取り込んで機能性ヘモグロビンを合成す
ることが可能になる。成熟赤血球中のヘモグロビンは酸
素を結合する。このように、赤血球およびそれらに含ま
れるヘモグロビンは、生体への酸素供給において重要な
役割を果たす。記述されてきた複雑な工程は、EPOと適
当なリセプターとの赤血球前駆細胞の細胞表面上におけ
る相互作用によって始まる（GraberおよびKrantz:Ann.R
ev.Med.29、51−66、1978を参照されたい）。EPOは、ヒ
ト尿（例えば、Miyakeら:J.Biol.Chem.252、5558−556
4、1977を参照されたい）などの天然源から単離できる
し、遺伝子工学的方法（例えば、EP−A2 148 605を参照
されたい）によって調製することもできる。
し、アミノ酸の位置24、38、83および126のグリコシル
化（glycosylation）部位を有する、分子量約34,000で
ある糖タンパク質ホルモンである。これは、最初は23個
のアミノ酸のシグナルペプチドを有する前駆体タンパク
質として産生される。EPOは、赤血球前駆細胞の有糸分
裂および分化を刺激して、その結果、赤血球の産生を確
実にする。これは、低酸素状態が優勢になると腎臓で産
生される。赤血球前駆細胞のEPO誘導性分化の間、グロ
ビン合成の誘導およびヘム複合体の合成およびフェリチ
ンリセプターの数の増加がある。これによって、細胞は
より多くの鉄を取り込んで機能性ヘモグロビンを合成す
ることが可能になる。成熟赤血球中のヘモグロビンは酸
素を結合する。このように、赤血球およびそれらに含ま
れるヘモグロビンは、生体への酸素供給において重要な
役割を果たす。記述されてきた複雑な工程は、EPOと適
当なリセプターとの赤血球前駆細胞の細胞表面上におけ
る相互作用によって始まる（GraberおよびKrantz:Ann.R
ev.Med.29、51−66、1978を参照されたい）。EPOは、ヒ
ト尿（例えば、Miyakeら:J.Biol.Chem.252、5558−556
4、1977を参照されたい）などの天然源から単離できる
し、遺伝子工学的方法（例えば、EP−A2 148 605を参照
されたい）によって調製することもできる。
腎不全症の患者はEPOを産生することができず、した
がって、貧血症になる。組換えEPOを投与することによ
って、このEPOの不十分な供給を補填するおよび貧血症
状を軽減させる試みが既に成功している（The Lancet、
April 4、1987「エリスロポイエチン」、781−782、Esc
hbachら:The New England Journal of Medicine 316、7
3−78、1987を参照されたい）。これにもかかわらず、E
POとそのリセプターとの相互作用の機構に関してはまだ
ほとんど知られていない。しかし、EPOに対する特異性
抗体の使用は、EPO分子の免疫学的および機能的特徴の
双方を確立するよい機会を提供するであろう。さらに、
EPO調節の障害は、中和抗体またはEPOリセプターに結合
しているEPOペプチドを用いて治療されるかもしれな
い。これに関連して、ペプチドは、例えば合成などによ
って、より容易に調製することができることから、完全
なEPO分子を用いるよりはむしろEPOペプチドを用いるこ
とが有利である。
がって、貧血症になる。組換えEPOを投与することによ
って、このEPOの不十分な供給を補填するおよび貧血症
状を軽減させる試みが既に成功している（The Lancet、
April 4、1987「エリスロポイエチン」、781−782、Esc
hbachら:The New England Journal of Medicine 316、7
3−78、1987を参照されたい）。これにもかかわらず、E
POとそのリセプターとの相互作用の機構に関してはまだ
ほとんど知られていない。しかし、EPOに対する特異性
抗体の使用は、EPO分子の免疫学的および機能的特徴の
双方を確立するよい機会を提供するであろう。さらに、
EPO調節の障害は、中和抗体またはEPOリセプターに結合
しているEPOペプチドを用いて治療されるかもしれな
い。これに関連して、ペプチドは、例えば合成などによ
って、より容易に調製することができることから、完全
なEPO分子を用いるよりはむしろEPOペプチドを用いるこ
とが有利である。
位置１〜26、40〜59、80〜99、99〜118、11〜129、13
1〜150および147〜166に対応するEPOペプチドおよびこ
れらEPOペプチドのいくつかに対する抗体は、既にSytko
wskiおよびDonahue（J.Biol.Chem.262、1161−1165、19
87）によって開示されている。EPOの生物学的活性を中
和することができた抗体は、SytkowskiおよびDonahueに
よって、位置99〜118および111〜129に対応するEPOペプ
チドについてのみ調製されている。彼らは、このことか
ら、（単一の）リセプター結合領域がEPOのアミノ酸位
置99〜129に位置していると結論づけている。これに関
連して、EPOペプチドが免疫化のためのキャリアにグル
タールアルデヒド残基を介して結合されていることを想
起せねばならない。EP−A2 148 605には、遺伝子工学に
よるEPOおよびその誘導体の調製の他に、位置１〜20、4
1〜57、116〜128および144〜166を含むEPOペプチドが記
述されている。これらEPOペプチドに対するポリクロー
ナルウサギ抗体もまた記述されている（EP−A2 148,60
5、90頁を参照されたい）。しかし、EPOペプチド116〜1
28に対する抗体は、EPOと反応しない。いかなる中和抗
体またはEPOのリセプター領域に対する抗体も、EP−A2
148,605には記載されていない。
1〜150および147〜166に対応するEPOペプチドおよびこ
れらEPOペプチドのいくつかに対する抗体は、既にSytko
wskiおよびDonahue（J.Biol.Chem.262、1161−1165、19
87）によって開示されている。EPOの生物学的活性を中
和することができた抗体は、SytkowskiおよびDonahueに
よって、位置99〜118および111〜129に対応するEPOペプ
チドについてのみ調製されている。彼らは、このことか
ら、（単一の）リセプター結合領域がEPOのアミノ酸位
置99〜129に位置していると結論づけている。これに関
連して、EPOペプチドが免疫化のためのキャリアにグル
タールアルデヒド残基を介して結合されていることを想
起せねばならない。EP−A2 148 605には、遺伝子工学に
よるEPOおよびその誘導体の調製の他に、位置１〜20、4
1〜57、116〜128および144〜166を含むEPOペプチドが記
述されている。これらEPOペプチドに対するポリクロー
ナルウサギ抗体もまた記述されている（EP−A2 148,60
5、90頁を参照されたい）。しかし、EPOペプチド116〜1
28に対する抗体は、EPOと反応しない。いかなる中和抗
体またはEPOのリセプター領域に対する抗体も、EP−A2
148,605には記載されていない。
＜発明が解決しようとする課題＞ このように、本発明が基づく技術的課題は、EPOのさ
らなる機能的および免疫学的特徴の決定を可能にする新
規のEPOペプチドを提供することである。さらに、本発
明の目的は、EPOリセプターに結合して、したがって、E
PO調節の障害を治療するために適している新規のEPOペ
プチドを提供することにある。本発明が基づくさらなる
技術的課題は、EPOの検出およびEPO機能の障害の治療に
適している該EPOペプチドに対する抗体を提供すること
である。
らなる機能的および免疫学的特徴の決定を可能にする新
規のEPOペプチドを提供することである。さらに、本発
明の目的は、EPOリセプターに結合して、したがって、E
PO調節の障害を治療するために適している新規のEPOペ
プチドを提供することにある。本発明が基づくさらなる
技術的課題は、EPOの検出およびEPO機能の障害の治療に
適している該EPOペプチドに対する抗体を提供すること
である。
上記の技術的課題は特許請求の範囲に記述される態様
を提供することによって解決される。
を提供することによって解決される。
＜発明の具体的説明＞ したがって、本発明は、天然EPOのアミノ酸位置番号
に対応するアミノ酸位置１〜35（P4）、７〜23（P4/
1）、44〜78（P3）、52〜63（P3/1）、74〜109（P1）、
84〜95（P1/1）、93〜137（P5）、110〜123（P5/1）、1
42〜166（P2）または152〜166（P2/1）を本質的に含むE
POペプチドに関する。本発明によるEPOペプチドP1、P1/
1、P3およびP3/1は、免疫原性が高く、高力価（タイタ
ー）のエピトープ特異性抗EPO抗体の調製を可能にす
る。EPOペプチドP2およびP2/1は、驚異的に中和抗EPO抗
体の調製を可能にする。本発明によれば、これらEPOペ
プチドは、以前には同定されなかった他のリセプター領
域を表すと考えられる。したがって、本発明によるこれ
らEPOペプチドは、EPO調節の障害の治療にとくに適して
いる。EPOペプチドP4およびP4/1も同様に高い免疫原性
を示す。この領域におけるヒトEPOとサルおよびネズミE
POとの100％の相似性から、本発明によるこれらEPOペプ
チドに対する抗体は、単なるヒトEPOの検出以外にも適
している。本発明によるEPOペプチドP5およびP5/1は、
例えばウエスタンプロットにおける天然および部分的に
変性したEPOの検出に用いることができる抗EPO抗体の調
製に適している。これらEPOPペプチドは、Sytkowskiお
よびDonahue（前出）によって既に記述されているリセ
プター領域にある。ペプチドP2、P4およびP5は、とく
に、天然に生じるEPO分子上の対応するエピトープとよ
く似ている。なぜならば、これらEPOペプチドと反応す
る特異性抗体は、例えば、ELISAまたはウエスタンブロ
ットなどにおける天然のEPOの検出に適しているからで
ある。
に対応するアミノ酸位置１〜35（P4）、７〜23（P4/
1）、44〜78（P3）、52〜63（P3/1）、74〜109（P1）、
84〜95（P1/1）、93〜137（P5）、110〜123（P5/1）、1
42〜166（P2）または152〜166（P2/1）を本質的に含むE
POペプチドに関する。本発明によるEPOペプチドP1、P1/
1、P3およびP3/1は、免疫原性が高く、高力価（タイタ
ー）のエピトープ特異性抗EPO抗体の調製を可能にす
る。EPOペプチドP2およびP2/1は、驚異的に中和抗EPO抗
体の調製を可能にする。本発明によれば、これらEPOペ
プチドは、以前には同定されなかった他のリセプター領
域を表すと考えられる。したがって、本発明によるこれ
らEPOペプチドは、EPO調節の障害の治療にとくに適して
いる。EPOペプチドP4およびP4/1も同様に高い免疫原性
を示す。この領域におけるヒトEPOとサルおよびネズミE
POとの100％の相似性から、本発明によるこれらEPOペプ
チドに対する抗体は、単なるヒトEPOの検出以外にも適
している。本発明によるEPOペプチドP5およびP5/1は、
例えばウエスタンプロットにおける天然および部分的に
変性したEPOの検出に用いることができる抗EPO抗体の調
製に適している。これらEPOPペプチドは、Sytkowskiお
よびDonahue（前出）によって既に記述されているリセ
プター領域にある。ペプチドP2、P4およびP5は、とく
に、天然に生じるEPO分子上の対応するエピトープとよ
く似ている。なぜならば、これらEPOペプチドと反応す
る特異性抗体は、例えば、ELISAまたはウエスタンブロ
ットなどにおける天然のEPOの検出に適しているからで
ある。
本発明によるペプチドは、天然のEPOまたは遺伝子工
学的によるEPOの化学的または酵素的切断によって調製
することができる。これらは、さらに、遺伝子工学的に
または合成によって直接に調製することもできる。本発
明によれば、合成的調製が好ましい。
学的によるEPOの化学的または酵素的切断によって調製
することができる。これらは、さらに、遺伝子工学的に
または合成によって直接に調製することもできる。本発
明によれば、合成的調製が好ましい。
好ましい態様において、本発明によるEPOペプチドP
1、P1/1、P3、P3/1、P4、P4/1、P5またはP5/1は、次の
ようなアミノ酸配列を有する。
1、P1/1、P3、P3/1、P4、P4/1、P5またはP5/1は、次の
ようなアミノ酸配列を有する。
または とくに好ましい態様において、EPOペプチドP2およびP
2/1は、次のようなアミノ酸配列を有する。
2/1は、次のようなアミノ酸配列を有する。
本発明によるEPOペプチドは、エピトープ特異性抗EPO
抗体の調製に用いることができる。これらペプチドは、
高度精製物の利点を提供し、これは、各免疫化において
再現的に定義された（reproducibly defined）高い力価
の抗血清を誘導する免疫原として、有効とされる。
抗体の調製に用いることができる。これらペプチドは、
高度精製物の利点を提供し、これは、各免疫化において
再現的に定義された（reproducibly defined）高い力価
の抗血清を誘導する免疫原として、有効とされる。
本発明によるEPOペプチドは、ポリクローナルエピト
ープ特異性抗EPO抗体（抗血清）およびモノクローナル
エピトープ特異性抗EPO抗体の双方の調製に用いること
ができる。これら抗体は既知の方法で調製される。しか
し、本発明によれば、EPOペプチドは、好ましくは、シ
ステイン残基を介して免疫化のためのキャリア材料と結
合する。EPOペプチドがシステイン残基を含まない場合
には、通常の方法で付ける。
ープ特異性抗EPO抗体（抗血清）およびモノクローナル
エピトープ特異性抗EPO抗体の双方の調製に用いること
ができる。これら抗体は既知の方法で調製される。しか
し、本発明によれば、EPOペプチドは、好ましくは、シ
ステイン残基を介して免疫化のためのキャリア材料と結
合する。EPOペプチドがシステイン残基を含まない場合
には、通常の方法で付ける。
本発明は、さらに、本発明によるEPOペプチドを用い
て調製することができるエピトープ特異性抗EPO抗体に
関する。これら抗EPO抗体は、特定のEPOエピトープまた
はEPO領域に対して有利に向けられている。これによっ
て、これらを、正常EPO力価または治療中のEPO力価のエ
ピトープ特異性検出を行うために分析系において採用す
ることが可能になる。
て調製することができるエピトープ特異性抗EPO抗体に
関する。これら抗EPO抗体は、特定のEPOエピトープまた
はEPO領域に対して有利に向けられている。これによっ
て、これらを、正常EPO力価または治療中のEPO力価のエ
ピトープ特異性検出を行うために分析系において採用す
ることが可能になる。
本発明によるエピトープ特異性抗EPO抗体は、ポリク
ローナル抗体（抗血清）またはモノクローナル抗体であ
る。本発明によるポリクローナル抗体は本発明によるEP
Oペプチドを用いて調製されることから、これらの調製
は再現性があり、明確に決められて高力価である。した
がって、これらは有効とされる全てのEPO検出系におけ
る使用にきわめてとくに適している。
ローナル抗体（抗血清）またはモノクローナル抗体であ
る。本発明によるポリクローナル抗体は本発明によるEP
Oペプチドを用いて調製されることから、これらの調製
は再現性があり、明確に決められて高力価である。した
がって、これらは有効とされる全てのEPO検出系におけ
る使用にきわめてとくに適している。
他の態様において、本発明は、上記の抗EPO抗体の結
合部位に対するおよびEPOリセプター領域を模した抗イ
ディオタイプ抗体に関する。これら抗イディオタイプ抗
体は、細胞性EPOリセプターに結合する。これら抗イデ
ィオタイプ抗体は、好ましくは、抗P2または抗P2/1抗体
の結合領域に対して向けられる。
合部位に対するおよびEPOリセプター領域を模した抗イ
ディオタイプ抗体に関する。これら抗イディオタイプ抗
体は、細胞性EPOリセプターに結合する。これら抗イデ
ィオタイプ抗体は、好ましくは、抗P2または抗P2/1抗体
の結合領域に対して向けられる。
本発明による好ましい態様において、エピトープ特異
性抗EPO抗体は、EPOの生物学的な活性を中和する。
性抗EPO抗体は、EPOの生物学的な活性を中和する。
本発明の他の好ましい態様において、上記の抗イディ
オタイプ抗体は、EPOリセプターを有する細胞を認識し
て、影響する。
オタイプ抗体は、EPOリセプターを有する細胞を認識し
て、影響する。
本発明による他の態様において、本発明によるエピト
ープ特異性抗EPO抗体は、EPO、EPO誘導体またはEPOペプ
チドの精製に用いられる。関連する精製工程は、例え
ば、免疫吸着クロマトグラフィーやアフィニティークロ
マトグラフィーなどの、通常のクロマトグラフィーの形
態をとる。本発明によるエピトープ特異性抗EPO抗体
は、適宜、この目的のためのクロマトグラフィーに適し
たキャリアー素材と結合する。
ープ特異性抗EPO抗体は、EPO、EPO誘導体またはEPOペプ
チドの精製に用いられる。関連する精製工程は、例え
ば、免疫吸着クロマトグラフィーやアフィニティークロ
マトグラフィーなどの、通常のクロマトグラフィーの形
態をとる。本発明によるエピトープ特異性抗EPO抗体
は、適宜、この目的のためのクロマトグラフィーに適し
たキャリアー素材と結合する。
本発明は、また、EPOの検出、好ましくはEPOのエピト
ープ特異性の検出、のための本発明によるエピトープ特
異性抗EPO抗体の使用に関する。抗体は、また、EPO変異
体（muteins）の識別検出のために用いることができ
る。そのようなEPO変異体は、例えば、一次構造、すな
わち、それらのアミノ酸配列において修飾することがで
きる。特異的にそのようなEPO変異体と反応する抗EPO抗
体を、適当に適応させたEPOペプチドを用いて、前に示
したようにして調製することができる。本発明は、とく
に、本発明によるEPOペプチド、エピトープ特異性抗EPO
抗体および／または抗イディオタイプ抗体を含む診断補
助物に関する。
ープ特異性の検出、のための本発明によるエピトープ特
異性抗EPO抗体の使用に関する。抗体は、また、EPO変異
体（muteins）の識別検出のために用いることができ
る。そのようなEPO変異体は、例えば、一次構造、すな
わち、それらのアミノ酸配列において修飾することがで
きる。特異的にそのようなEPO変異体と反応する抗EPO抗
体を、適当に適応させたEPOペプチドを用いて、前に示
したようにして調製することができる。本発明は、とく
に、本発明によるEPOペプチド、エピトープ特異性抗EPO
抗体および／または抗イディオタイプ抗体を含む診断補
助物に関する。
他の態様において、本発明は、少なくとも一つの本発
明によるEPOペプチドを含むまたは本発明のエピトープ
特異性抗EPO抗体を含む、医薬物に関する。これら医薬
物は、好ましくは、細胞性EPOリセプターをブロックす
るEPOペプチドを含む。他の好ましい態様において、本
発明による医薬物はEPOの生物学的な活性を中和する本
発明によるエピトープ特異性抗EPO抗体を含む。また、
医薬物は、適宜、薬剤学的に許容される補助物および添
加物を含む。
明によるEPOペプチドを含むまたは本発明のエピトープ
特異性抗EPO抗体を含む、医薬物に関する。これら医薬
物は、好ましくは、細胞性EPOリセプターをブロックす
るEPOペプチドを含む。他の好ましい態様において、本
発明による医薬物はEPOの生物学的な活性を中和する本
発明によるエピトープ特異性抗EPO抗体を含む。また、
医薬物は、適宜、薬剤学的に許容される補助物および添
加物を含む。
EPO調節の障害は、本発明の該医薬物によって治療す
ることができる。
ることができる。
材料および方法 ペプチドの調製 ペプチドを、好ましくは、ポリスチレンマトリックス
（ジビニルベンゼンと１％交差結合したもの）上での固
相法によって調製した。機能基（−NH2）のポリスチレ
ンマトリックスの負荷は、好ましくは、0.4〜0.6mmol/g
マトリックスであった。ペプチドは塩基不安定性Fmoc基
を用いて調製したので、アンカー分子としてはｐ−アル
コキシベンジルエステルを用いた。一般に、ジクロロメ
タンおよびジメチルホルムアミドを、例外的にはＮ−メ
チルピロリドンを、合成中に用いた。洗浄液および反応
液の量は、約15mlが好ましい。アミノ酸のα−NH2基をF
moc基によって保護したことから、次の保護基を三官能
性アミノ酸の側鎖として選択した。
（ジビニルベンゼンと１％交差結合したもの）上での固
相法によって調製した。機能基（−NH2）のポリスチレ
ンマトリックスの負荷は、好ましくは、0.4〜0.6mmol/g
マトリックスであった。ペプチドは塩基不安定性Fmoc基
を用いて調製したので、アンカー分子としてはｐ−アル
コキシベンジルエステルを用いた。一般に、ジクロロメ
タンおよびジメチルホルムアミドを、例外的にはＮ−メ
チルピロリドンを、合成中に用いた。洗浄液および反応
液の量は、約15mlが好ましい。アミノ酸のα−NH2基をF
moc基によって保護したことから、次の保護基を三官能
性アミノ酸の側鎖として選択した。
セリン、スレオニン、チロシン tert.−ブチルエステル グルタミン酸、アスパラギン酸 tert.−ブチルエステル アルギニン ４−メトキシ−２、３、６−トリメチルフ
ェニル−スルフォニル システイン tert.−ブチルメルカプト リジン tert.−ブチルオキシカルボニル アミノ酸を、好ましくは、活性エステルを介して、結
合させて、HOBt/ジイソプロピルカルボジイミドによっ
てそこで活性化することは、とくに好ましい。
ェニル−スルフォニル システイン tert.−ブチルメルカプト リジン tert.−ブチルオキシカルボニル アミノ酸を、好ましくは、活性エステルを介して、結
合させて、HOBt/ジイソプロピルカルボジイミドによっ
てそこで活性化することは、とくに好ましい。
反復性のα−NH2保護基除去を、塩基、好ましくはDMF
中の20％ピペリジンを用いて、室温で行った。
中の20％ピペリジンを用いて、室温で行った。
樹脂を、これら各反応段階、結合または脱ブロッキン
グ、の後にDMFおよびイソプロピルアルコールで洗浄し
た。酸分解（acidolysis）の結果、側鎖基から保護基が
またマトリックスからペプチドが、同時に除去された。
これは、好ましくは、トリフルオロ酢酸およびエタンジ
チオールの混合物（9:1、v/v）を用いて行われた。シス
テインのスルフヒドリル基を、メルカプト基を有する物
質、例えば、ジチオスレイトールまたはブチルフォスフ
ィン、によって遊離させた。
グ、の後にDMFおよびイソプロピルアルコールで洗浄し
た。酸分解（acidolysis）の結果、側鎖基から保護基が
またマトリックスからペプチドが、同時に除去された。
これは、好ましくは、トリフルオロ酢酸およびエタンジ
チオールの混合物（9:1、v/v）を用いて行われた。シス
テインのスルフヒドリル基を、メルカプト基を有する物
質、例えば、ジチオスレイトールまたはブチルフォスフ
ィン、によって遊離させた。
合成ペプチドをその化学組成および純度について調べ
た。ペプチドの組成をアミノ酸分析によって決定した。
この目的のために、少量のサンプルを6N塩酸を用いてフ
ェノールの存在下で110℃で24または72時間加水分解し
て、個々のアミノ酸を定量的に決定した。ペプチド含有
量は約85％であった。ペプチドを、適宜、RP−HPLC（逆
相高速液体クロマトグラフィー）を用いて既知の方法で
精製した。ペプチドの純度を、C18逆相カラム上でのHPL
Cによって決定した。この目的のために、燐酸塩／アセ
トニトリル勾配を用いて、85％以上の純度を見出した。
た。ペプチドの組成をアミノ酸分析によって決定した。
この目的のために、少量のサンプルを6N塩酸を用いてフ
ェノールの存在下で110℃で24または72時間加水分解し
て、個々のアミノ酸を定量的に決定した。ペプチド含有
量は約85％であった。ペプチドを、適宜、RP−HPLC（逆
相高速液体クロマトグラフィー）を用いて既知の方法で
精製した。ペプチドの純度を、C18逆相カラム上でのHPL
Cによって決定した。この目的のために、燐酸塩／アセ
トニトリル勾配を用いて、85％以上の純度を見出した。
ペプチドのキャリア分子への結合 ペプチドを、好ましくは、システイン残基を介して高
分子量キャリアタンパク質、例えばアルブミンまたは卵
アルブミン、好ましくは鍵穴アオガイ（keyhole limpe
t）ヘモシアニン（KLH）に結合させた。結合は、システ
インのメルカプト基とのチオエーテル結合を介して行わ
れた。この型の結合は、ペプチドが定義されたやり方で
キャリアタンパク質に結合されるという利点を有する。
ペプチドがシステイン残基を含まない場合には、システ
イン残基を付けた。
分子量キャリアタンパク質、例えばアルブミンまたは卵
アルブミン、好ましくは鍵穴アオガイ（keyhole limpe
t）ヘモシアニン（KLH）に結合させた。結合は、システ
インのメルカプト基とのチオエーテル結合を介して行わ
れた。この型の結合は、ペプチドが定義されたやり方で
キャリアタンパク質に結合されるという利点を有する。
ペプチドがシステイン残基を含まない場合には、システ
イン残基を付けた。
セファロース樹脂へのペプチドの結合 ペプチドを、臭化シアンで活性化したセファロースを
用いる標準工程によってセファロースに結合させた。
用いる標準工程によってセファロースに結合させた。
抗血清の調製 ウサギの免疫化 EPOペプチドに特異的な抗体を産生するために、ペプ
チド−KLH抱合体をアジュバントと乳化して、５週間免
疫化法に従ってウサギに注射した。この期間の後、動物
は特異性抗体を生産しており、放血させた。
チド−KLH抱合体をアジュバントと乳化して、５週間免
疫化法に従ってウサギに注射した。この期間の後、動物
は特異性抗体を生産しており、放血させた。
特異的抗体の検出 固相ELISAを、血清のペプチドまたはEPO特異性につい
ての分析に用いた。抗血清中またはアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製しておいた抗体画分中のペ
プチド特異性およびEPO特異性抗体の含有量を、精製EPO
またはEPOペプチドで被覆されたプラスチック製マイク
ロタイタープレート中で、酵素結合抗ウサギ−Ig抗血清
を用いて、決定した。これと平行して、抗体をウエスタ
ンブロット中で調べて、34〜38kDaの特異性EPOバンドを
検出した。
ての分析に用いた。抗血清中またはアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製しておいた抗体画分中のペ
プチド特異性およびEPO特異性抗体の含有量を、精製EPO
またはEPOペプチドで被覆されたプラスチック製マイク
ロタイタープレート中で、酵素結合抗ウサギ−Ig抗血清
を用いて、決定した。これと平行して、抗体をウエスタ
ンブロット中で調べて、34〜38kDaの特異性EPOバンドを
検出した。
中和抗体の決定 クリスタル（Krystal）増殖試験（Exp.Hematol.7、64
9−660、1983）を用いて、rhuEPO−特異性またはrhuEPO
ペプチド−特異性抗血清について中和する性質を調べ
た。雌NMRIマウスに48mg/kgのフェニルヒドラジン次亜
塩素酸塩（phenyl−hydrozine hypochloride）を二日続
けて注射した。最後の注射の48時間後に、動物の脾臓を
除去して、単一細胞懸濁液を調製した。赤血球前駆体細
胞を、フィコール勾配（Ｄ＝1.077）によって濃厚富化
した。細胞の増殖を誘導するために、３×105細胞／ウ
ェルを96ウェルマイクロタイタープレート中で0.1pmol/
mlのrhuEPOとインキュベートした。阻害試験を行うため
に、EPOを抗血清の希釈物と前培養してから増殖試験に
用いた。
9−660、1983）を用いて、rhuEPO−特異性またはrhuEPO
ペプチド−特異性抗血清について中和する性質を調べ
た。雌NMRIマウスに48mg/kgのフェニルヒドラジン次亜
塩素酸塩（phenyl−hydrozine hypochloride）を二日続
けて注射した。最後の注射の48時間後に、動物の脾臓を
除去して、単一細胞懸濁液を調製した。赤血球前駆体細
胞を、フィコール勾配（Ｄ＝1.077）によって濃厚富化
した。細胞の増殖を誘導するために、３×105細胞／ウ
ェルを96ウェルマイクロタイタープレート中で0.1pmol/
mlのrhuEPOとインキュベートした。阻害試験を行うため
に、EPOを抗血清の希釈物と前培養してから増殖試験に
用いた。
エピトープ特異性抗体を、標準法によって精製した。
すなわち、PBSに対して透析しておいた硫安沈澱から抗
体をセファロースに一晩吸着させて、非結合物をpH7.0
のPBSで洗い出してから次いで、特異性抗体をpH2.5の水
性酸（aqueous acid）で溶出した。溶出液を固体燐酸ナ
トリウムで直ちにpH7.0に中和して、PBSに対して透析し
た。
すなわち、PBSに対して透析しておいた硫安沈澱から抗
体をセファロースに一晩吸着させて、非結合物をpH7.0
のPBSで洗い出してから次いで、特異性抗体をpH2.5の水
性酸（aqueous acid）で溶出した。溶出液を固体燐酸ナ
トリウムで直ちにpH7.0に中和して、PBSに対して透析し
た。
セファロース樹脂へのエピトープ特異性抗体の結合 エピトープ特異性抗体を、臭化シアンで活性化したセ
ファロースへ標準方法で結合させた。
ファロースへ標準方法で結合させた。
アフィニクロマトグラフィーによるエリスロポイエチン
の精製 細胞培養上清からのエリスロポイエチンを、エピトー
プ特異性抗体カラムに吸着させて、生物学的活性の損失
なしで、通常の工程でpHをpH7〜８からpH2〜３に変化さ
せることによって溶出することができた。
の精製 細胞培養上清からのエリスロポイエチンを、エピトー
プ特異性抗体カラムに吸着させて、生物学的活性の損失
なしで、通常の工程でpHをpH7〜８からpH2〜３に変化さ
せることによって溶出することができた。
以下の諸例は本発明を説明するものである。次の略号
がここで用いられる。
がここで用いられる。
ｔ−Bu tert.−ブチルエーテル Mtr ４−メトキシ−２、３、６−トリメチルフェニ
ルスルフォニル DMF ジメチルホルムアミド HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾル Boc tert.−ブチルオキシカルボニル Fmoc フルオレニルメトキシカルボニル GMBS γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミ
ドエステル 例１ 免疫化抗原の調製 ａ）ペプチド（P2/1）の合成 ペプチドを完全自動ペプチド合成機を用いて合成し
た。保護基を、1gのFmoc−Arg（Mtr）−ｐ−アルコキシ
ベンジル−エステル−樹脂から15mlの20％ピペリジン/D
MF（v/v）で除去して、次いで、DMFおよびイソプロパノ
ールで数回洗浄した。1mmolのFmoc−Asp（ｔ−Bu）（３
倍過剰量）および15mlのDMFに溶解した203mgのHOBtを加
えた。1.1mlの1Mジイソプロピルカルボジイミド溶液
（ジクロロメタン）を加えた後、1.5時間結合を行っ
た。過剰の試薬をDMFのイソプロパーノール溶液で洗浄
して除いた。この結合のやり方をＮ末端アミノ酸まで維
持した。Boc−保護アミノ酸を最終アミノ酸として採用
した。各結合段階が完了したかどうかをニンヒドリン試
験によって調べた。1.06gの樹脂を2.5mlのチオアニソー
ル、2.5mlのエタンジチオールおよび15mlのトリフルオ
ロ酢酸とともに35℃で４時間攪拌して、濾過した。酸溶
液をエーテル中に注いで、沈澱したペプチドを濾過し
て、セファデックスG25カラム（３×100cm、0.5％酢
酸）上のクロマトグラフィーに供した。ペプチドプール
を凍結乾燥した。収量は230mgであった。
ルスルフォニル DMF ジメチルホルムアミド HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾル Boc tert.−ブチルオキシカルボニル Fmoc フルオレニルメトキシカルボニル GMBS γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミ
ドエステル 例１ 免疫化抗原の調製 ａ）ペプチド（P2/1）の合成 ペプチドを完全自動ペプチド合成機を用いて合成し
た。保護基を、1gのFmoc−Arg（Mtr）−ｐ−アルコキシ
ベンジル−エステル−樹脂から15mlの20％ピペリジン/D
MF（v/v）で除去して、次いで、DMFおよびイソプロパノ
ールで数回洗浄した。1mmolのFmoc−Asp（ｔ−Bu）（３
倍過剰量）および15mlのDMFに溶解した203mgのHOBtを加
えた。1.1mlの1Mジイソプロピルカルボジイミド溶液
（ジクロロメタン）を加えた後、1.5時間結合を行っ
た。過剰の試薬をDMFのイソプロパーノール溶液で洗浄
して除いた。この結合のやり方をＮ末端アミノ酸まで維
持した。Boc−保護アミノ酸を最終アミノ酸として採用
した。各結合段階が完了したかどうかをニンヒドリン試
験によって調べた。1.06gの樹脂を2.5mlのチオアニソー
ル、2.5mlのエタンジチオールおよび15mlのトリフルオ
ロ酢酸とともに35℃で４時間攪拌して、濾過した。酸溶
液をエーテル中に注いで、沈澱したペプチドを濾過し
て、セファデックスG25カラム（３×100cm、0.5％酢
酸）上のクロマトグラフィーに供した。ペプチドプール
を凍結乾燥した。収量は230mgであった。
ｂ）スルフヒドリル基の遊離 70mgのペプチドを、7mlのトリフルオロエタノールお
よび350μｌの水に溶解して、Ｎ−メチルモルフォリン
でpHを7.3に調整した。反応器を窒素で充満させて、40
μｌのトリ−ｎ−ブチルホスフィンを加えた。混合物を
室温で１時間攪拌して、50mlの水で希釈して、pHを4.0
に調整した。水相を10mlのジメチルエーテルで３回抽出
して、10mlに濃縮してから、セファデックスG25（３×1
00cm、0.5％酢酸）上で精製した。凍結乾燥後、55mgの
ペプチドが得られた。
よび350μｌの水に溶解して、Ｎ−メチルモルフォリン
でpHを7.3に調整した。反応器を窒素で充満させて、40
μｌのトリ−ｎ−ブチルホスフィンを加えた。混合物を
室温で１時間攪拌して、50mlの水で希釈して、pHを4.0
に調整した。水相を10mlのジメチルエーテルで３回抽出
して、10mlに濃縮してから、セファデックスG25（３×1
00cm、0.5％酢酸）上で精製した。凍結乾燥後、55mgの
ペプチドが得られた。
ｃ）抱合体調製 30mgのKLH（Keyhole limpet hemocyanin）を、0.05mm
ol/の燐酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に溶解して、3m
gのGBMSで１時間活性化した。タンパク質をセファデッ
クスG50カラム（２×30cm）（0.1mol/燐酸ナトリウ
ム、0.5mmol/EDTA、pH6.0）上でのクロマトグラフィ
ーに供した。タンパク質プールを6mlまでに濃縮して、
スルフヒドリル基を含むペプチド30mgとともに１時間イ
ンキュベートした。透析および凍結乾燥の結果、38mgの
ペプチド抱合体が得られた。
ol/の燐酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に溶解して、3m
gのGBMSで１時間活性化した。タンパク質をセファデッ
クスG50カラム（２×30cm）（0.1mol/燐酸ナトリウ
ム、0.5mmol/EDTA、pH6.0）上でのクロマトグラフィ
ーに供した。タンパク質プールを6mlまでに濃縮して、
スルフヒドリル基を含むペプチド30mgとともに１時間イ
ンキュベートした。透析および凍結乾燥の結果、38mgの
ペプチド抱合体が得られた。
例２ ウサギの免疫化 ウサギを、動物当り1.7mgの抗原で各々５週間の期間
免疫化した。最初の免疫化時に、各動物のリンパ節近傍
の８箇所の免疫化部位に、完全フロインドアジュバント
（CFA）中の0.4mgの抗原を皮下接種した。続いて２週間
後に、CFAに溶かした抗体0.8mg/動物で皮下免疫化し
た。さらに２週間後、各動物に0.1mgのAerosil中の抗原
を各々５日間連続して静脈注射した。３日後に、放血さ
せて、各抗血清が得られた。
免疫化した。最初の免疫化時に、各動物のリンパ節近傍
の８箇所の免疫化部位に、完全フロインドアジュバント
（CFA）中の0.4mgの抗原を皮下接種した。続いて２週間
後に、CFAに溶かした抗体0.8mg/動物で皮下免疫化し
た。さらに２週間後、各動物に0.1mgのAerosil中の抗原
を各々５日間連続して静脈注射した。３日後に、放血さ
せて、各抗血清が得られた。
例３ ペプチドを有する免疫吸着体（immunoadsorbants）の調
製 アフィニティクロマトグラフィーによる粗抗血清の精
製のために、20mgの、例えば、ペンタデカペプチド（p2
/1）： を共有結合で固相に固定化した。結合反応は、記述され
た方法（Axenら:Nature 214、1302、1967）によって、
臭化シアンで活性化されたセファロースを用いて行っ
た。次いで免疫吸着体を各々燐酸緩衝生理食塩水（PB
S、0.15mol/、pH7.2）および酢酸（0.5mol/、pH2.
5）で洗浄した。使用の前に、吸着物を３倍量のPBSで平
衡化した。
製 アフィニティクロマトグラフィーによる粗抗血清の精
製のために、20mgの、例えば、ペンタデカペプチド（p2
/1）： を共有結合で固相に固定化した。結合反応は、記述され
た方法（Axenら:Nature 214、1302、1967）によって、
臭化シアンで活性化されたセファロースを用いて行っ
た。次いで免疫吸着体を各々燐酸緩衝生理食塩水（PB
S、0.15mol/、pH7.2）および酢酸（0.5mol/、pH2.
5）で洗浄した。使用の前に、吸着物を３倍量のPBSで平
衡化した。
収率：約20mlのペプチド−セファロース。
他のペプチドも同様にして免疫吸着体の調製に用い
た。
た。
例４ 抗体の調製 100mlの粗抗血清を、PBS−平衡ペプチド−セファロー
ス（1.5×15cm）に供して、次いで、280nmでの吸光度が
0.01になるまでPBSで洗浄した。続いて、1M NaCl（pH7.
0）および水（pH7.0）で各回ゲル容量の３倍量を用いて
洗浄した。抗体を、免疫吸着体から水（pH2.5）で溶出
して、抗体溶液をpH7.0に固体燐酸ナトリウム（0.001mo
l/）で調整して、濃縮して（アミコン膜）、−70℃で
保存した。
ス（1.5×15cm）に供して、次いで、280nmでの吸光度が
0.01になるまでPBSで洗浄した。続いて、1M NaCl（pH7.
0）および水（pH7.0）で各回ゲル容量の３倍量を用いて
洗浄した。抗体を、免疫吸着体から水（pH2.5）で溶出
して、抗体溶液をpH7.0に固体燐酸ナトリウム（0.001mo
l/）で調整して、濃縮して（アミコン膜）、−70℃で
保存した。
収率:35mgの抗体。
例５ 抗体の試験 ａ）EPO−またはペプチド−被覆マイクロタイタープレ
ートの調製 20μg/mlのEPO−またはEPO−特異性ペプチドを炭酸緩
衝液中でプラスチックマイクロタイタープレート中で４
℃で一晩で結合させた。分析を行う前に、プレートをPB
Sで２回洗浄して、PBS/0.5％BSAで30分間飽和させてか
ら、PBSで３回洗浄した。
ートの調製 20μg/mlのEPO−またはEPO−特異性ペプチドを炭酸緩
衝液中でプラスチックマイクロタイタープレート中で４
℃で一晩で結合させた。分析を行う前に、プレートをPB
Sで２回洗浄して、PBS/0.5％BSAで30分間飽和させてか
ら、PBSで３回洗浄した。
ｂ）酵素イムノアッセイ工程 BSAで飽和させたプレートを、抗EPOウサギ抗血清また
は精製抗体画分の希釈物とともに２時間インキュベート
した。その後、これらをPBSで洗浄して、アルカリホス
ファターゼに結合させた抗ウサギIg抗血清とともに２時
間インキュベートした。次いで、PBSで２回、次に0.2M
トリス−HCl（pH9.5）で２回、次いで1Mトリス−HCl（p
H9.5）で簡単に、各々洗浄した。１時間後に、反応を1M
NaOHで停止させて、405mmでの吸光度を測定した。
は精製抗体画分の希釈物とともに２時間インキュベート
した。その後、これらをPBSで洗浄して、アルカリホス
ファターゼに結合させた抗ウサギIg抗血清とともに２時
間インキュベートした。次いで、PBSで２回、次に0.2M
トリス−HCl（pH9.5）で２回、次いで1Mトリス−HCl（p
H9.5）で簡単に、各々洗浄した。１時間後に、反応を1M
NaOHで停止させて、405mmでの吸光度を測定した。
ｃ）ウエスタンブロット工程 EPO標準物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画
して、ニトロセルロースに移した（Towbinら:Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、76、4350−4354、1979）。フィルター
をPBS/0.5％BSA中で飽和させて、次いで抗体とともに一
晩インキュベートした。次いでフィルターを３回PBSで
洗浄して、アルカリホスファターゼに抱合させた抗ウサ
ギIg抗血清とともに２時間インキュベートした。PBSで
３回、0.2Mトリス−HCl（pH9.5）で１回、1Mトリス−HC
l（pH9.5）で簡単に、各々洗浄した後に、1Mトリス−HC
l（pH9.5）中の４−ニトロテトラゾリウムクロリドブル
ーハイドレート（500μg/ml）および５−ブロモ−４−
クロロ−インドキシルホスフェートｐ−トルイジニウム
塩（200μg/ml）を用いてブロットの展開を行った。20
分後に反応を水で終結させた。
して、ニトロセルロースに移した（Towbinら:Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、76、4350−4354、1979）。フィルター
をPBS/0.5％BSA中で飽和させて、次いで抗体とともに一
晩インキュベートした。次いでフィルターを３回PBSで
洗浄して、アルカリホスファターゼに抱合させた抗ウサ
ギIg抗血清とともに２時間インキュベートした。PBSで
３回、0.2Mトリス−HCl（pH9.5）で１回、1Mトリス−HC
l（pH9.5）で簡単に、各々洗浄した後に、1Mトリス−HC
l（pH9.5）中の４−ニトロテトラゾリウムクロリドブル
ーハイドレート（500μg/ml）および５−ブロモ−４−
クロロ−インドキシルホスフェートｐ−トルイジニウム
塩（200μg/ml）を用いてブロットの展開を行った。20
分後に反応を水で終結させた。
例６ 抗体を有する免疫吸着体の調製 アフィニティークロマトグラフィーによって精製した
20〜50mgの抗体を、臭化シアンで活性化したセファーロ
ースに標準工程（Axenら:Nature 214、1302、1967）を
用いて結合させて、さらに例３に記載のように処理し
た。
20〜50mgの抗体を、臭化シアンで活性化したセファーロ
ースに標準工程（Axenら:Nature 214、1302、1967）を
用いて結合させて、さらに例３に記載のように処理し
た。
例７ アフィニティークロマトグラフィーによるエリスロポイ
エチンの精製 EPO特異性抗体を含む免疫吸着体を、上記のようにア
フィニティークロマトグラフィーによるEPOおよびEPO変
異体の精製に採用した。
エチンの精製 EPO特異性抗体を含む免疫吸着体を、上記のようにア
フィニティークロマトグラフィーによるEPOおよびEPO変
異体の精製に採用した。
例８ モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体の調製のために、組換えDNA技術
によって得られたEPOおよびさらに上記のペプチドを抗
原として用いた。ペプチドは予めKLH（鍵穴アオガイヘ
モシアニン）と結合させておいた。
によって得られたEPOおよびさらに上記のペプチドを抗
原として用いた。ペプチドは予めKLH（鍵穴アオガイヘ
モシアニン）と結合させておいた。
Balb/cマウス（雌）に、腹腔内または皮下に10μｇを
免疫化し、数週間ブースター投与（booste）した。実際
の融合の直前に、４日間続けて実験動物に静脈内に追加
的にブースター投与した。
免疫化し、数週間ブースター投与（booste）した。実際
の融合の直前に、４日間続けて実験動物に静脈内に追加
的にブースター投与した。
融合当日、脾臓を無菌的に除去して、単一（single）
細胞を得るために懸濁させた。108個の脾臓細胞と２×1
07個のミエローマ細胞系（SP2/0）の細胞との融合によ
って、ハイブリド細胞を作出して、これを次いで、24穴
プレート（コスター社製）上の選択培地（DMEM（ダルベ
ッコのミニマル必須培地）＋20％FCS（胎児ウシ血
清）、0.1mMヒボキサンチン、0.4mMアミノプテリン、16
mMチミジン）中に106細胞／ウェルの濃度で分注した。
２〜３週間後、単一細胞コロニーをウェルから単離し
て、新しい培養プレート（24穴、コスター社製）の他の
ウェルに各々移した。さらに２〜３日後、これら培養上
清を、酵素イムノアッセイで抗EPO抗体の存在について
スクリーニングした。特異性抗体を産生するハイブリド
を選択して、単一細胞マニピュレーターを用いてクロー
ニングした。
細胞を得るために懸濁させた。108個の脾臓細胞と２×1
07個のミエローマ細胞系（SP2/0）の細胞との融合によ
って、ハイブリド細胞を作出して、これを次いで、24穴
プレート（コスター社製）上の選択培地（DMEM（ダルベ
ッコのミニマル必須培地）＋20％FCS（胎児ウシ血
清）、0.1mMヒボキサンチン、0.4mMアミノプテリン、16
mMチミジン）中に106細胞／ウェルの濃度で分注した。
２〜３週間後、単一細胞コロニーをウェルから単離し
て、新しい培養プレート（24穴、コスター社製）の他の
ウェルに各々移した。さらに２〜３日後、これら培養上
清を、酵素イムノアッセイで抗EPO抗体の存在について
スクリーニングした。特異性抗体を産生するハイブリド
を選択して、単一細胞マニピュレーターを用いてクロー
ニングした。
例９ 抗イディオタイプ抗体の調製および決定 EPO/EPOペプチドに対する所望の特異性を有する同系
（syngenic）モノクローナル抗体を免疫化に用いた。全
抗体の代わりに、Fab′断片をBSAまたはKLHに結合させ
て、CFA（完全フロインドアジュバント）に溶かして雌B
alb/cマウスの腹腔内または皮下に注射した。モノクロ
ーナル抗イディオタイプ抗体のさらなる調製は、例８の
工程と同様である。
（syngenic）モノクローナル抗体を免疫化に用いた。全
抗体の代わりに、Fab′断片をBSAまたはKLHに結合させ
て、CFA（完全フロインドアジュバント）に溶かして雌B
alb/cマウスの腹腔内または皮下に注射した。モノクロ
ーナル抗イディオタイプ抗体のさらなる調製は、例８の
工程と同様である。
免疫化に採用した抗体をペルオキシダーゼ（POD）に
抱合させて用いる酵素イムノアッセイにおいて、培養上
清を抗イディオタイプ抗体の存在について試験して、さ
らに別の酵素イムノアッセイにおいてこれら抗イディオ
タイプ抗体が抗原によって阻害され得るかどうかを試験
した。抗原によって阻害される得る抗イディオタイプ抗
体を産生するハイブリドを選択して、単一細胞マニピュ
レーターを用いてクローニングした。
抱合させて用いる酵素イムノアッセイにおいて、培養上
清を抗イディオタイプ抗体の存在について試験して、さ
らに別の酵素イムノアッセイにおいてこれら抗イディオ
タイプ抗体が抗原によって阻害され得るかどうかを試験
した。抗原によって阻害される得る抗イディオタイプ抗
体を産生するハイブリドを選択して、単一細胞マニピュ
レーターを用いてクローニングした。
第１図は、直接エリスロポイエチン結合分析の結果を示
すグラフ図である。エピトープ特異性またはP2/1特異性
ウサギ抗血清の血清希釈物をEPO（20μg/ml）被覆マイ
クロタイタープレート上に吸着させて、結合抗体を酵素
標識抗ウサギ抗体で検出した。図中、血清336、346、34
7および348を全EPO分子に対して調製し、血清556、557
および558をペプチドP2に対して調製し、血清444はウサ
ギ免疫前血清である。 第２図は、組換えヒトエリスロポイエチン（rhuEPO）の
生物学的活性のrhuEPO−特異性抗血清による阻害を示す
グラフ図である。ウサギをrhuEPOまたはペプチド配列物
P2、P4およびP5で免疫化して得てから鍵穴アオガイヘモ
シアニンに結合させておいた抗血清を、rhoEPOととも
に、濃厚富化した赤血球前駆細胞のKrystal法（Exp.Hem
atol.7、649−660）による増殖試験に採用した。P2−KL
HまたはEPO−KLHで免疫化して得られた抗体は、rhuEPO
によって誘導される赤血球前駆細胞の増殖を阻害する。 第３図は、抗EPO−P2−KLH血清による阻害の復帰を示
す、グラフ図である。血清は、Krystal分析（上記を参
照されたい）において前駆細胞をrhuEPOおよび抗P2−KL
H抗血清とともにインキュベートする前に５回までP2−
セファロースに予め吸着させておいた。血清の阻害活性
は、ペプチドP2への予備吸着によって完全に除去するこ
とができる。
すグラフ図である。エピトープ特異性またはP2/1特異性
ウサギ抗血清の血清希釈物をEPO（20μg/ml）被覆マイ
クロタイタープレート上に吸着させて、結合抗体を酵素
標識抗ウサギ抗体で検出した。図中、血清336、346、34
7および348を全EPO分子に対して調製し、血清556、557
および558をペプチドP2に対して調製し、血清444はウサ
ギ免疫前血清である。 第２図は、組換えヒトエリスロポイエチン（rhuEPO）の
生物学的活性のrhuEPO−特異性抗血清による阻害を示す
グラフ図である。ウサギをrhuEPOまたはペプチド配列物
P2、P4およびP5で免疫化して得てから鍵穴アオガイヘモ
シアニンに結合させておいた抗血清を、rhoEPOととも
に、濃厚富化した赤血球前駆細胞のKrystal法（Exp.Hem
atol.7、649−660）による増殖試験に採用した。P2−KL
HまたはEPO−KLHで免疫化して得られた抗体は、rhuEPO
によって誘導される赤血球前駆細胞の増殖を阻害する。 第３図は、抗EPO−P2−KLH血清による阻害の復帰を示
す、グラフ図である。血清は、Krystal分析（上記を参
照されたい）において前駆細胞をrhuEPOおよび抗P2−KL
H抗血清とともにインキュベートする前に５回までP2−
セファロースに予め吸着させておいた。血清の阻害活性
は、ペプチドP2への予備吸着によって完全に除去するこ
とができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 7/06 Ｃ０７Ｋ 14/505 Ｃ０７Ｋ 14/505 16/22 16/22 16/42 16/42 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (56)参考文献 特開 昭63−185396（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500558（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 7/08 C07K 14/505 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列の一つからなるエリスロ
ポイエチンペプチド。 - 【請求項２】特異性抗エリスロポイエチン抗体の調製の
ための、請求項１に記載のペプチドの使用方法。 - 【請求項３】請求項１に記載のペプチドに対する、特異
性抗エリスロポイエチン抗体。 - 【請求項４】モノクローナル抗体である、請求項３に記
載の特異性抗エリスロポイエチン抗体。 - 【請求項５】エリスロポイエチンの生物学的活性を中和
する、請求項３に記載の特異性抗エリスロポイエチン抗
体。 - 【請求項６】請求項３に記載の特異的抗エリスロポイエ
チン抗体の結合領域に対する抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項７】エリスロポイエチン、エリスロポイエチン
誘導体またはエリスロポイエチンペプチドの精製のため
の、請求項３に記載の特異性抗エリスロポイエチン抗体
の使用方法。 - 【請求項８】エリスロポイエチン、エリスロポイエチン
誘導体またはエリスロポイエチンペプチドの検出のため
の診断補助物における請求項３に記載の特異性抗エリス
ロポイエチン抗体の使用方法。 - 【請求項９】請求項１に記載の少なくとも一つのエリス
ロポイエチンペプチドおよび、適宜、薬剤学的に許容さ
れる補助剤および添加剤を含む、造血調節の障害を有す
る患者に使用してエリスロポイエチン調節の障害を治療
するための医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3924746A DE3924746A1 (de) | 1989-07-26 | 1989-07-26 | Erythropoietin (epo)-peptide und dagegen gerichtete antikoerper |
| DE3924746.5 | 1989-07-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0381294A JPH0381294A (ja) | 1991-04-05 |
| JP3155002B2 true JP3155002B2 (ja) | 2001-04-09 |
Family
ID=6385895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19896990A Expired - Lifetime JP3155002B2 (ja) | 1989-07-26 | 1990-07-26 | エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5106954A (ja) |
| EP (1) | EP0410246B1 (ja) |
| JP (1) | JP3155002B2 (ja) |
| KR (1) | KR0175657B1 (ja) |
| AT (1) | ATE161577T1 (ja) |
| AU (1) | AU648506B2 (ja) |
| CA (1) | CA2021912C (ja) |
| DE (2) | DE3924746A1 (ja) |
| DK (1) | DK0410246T3 (ja) |
| ES (1) | ES2111524T3 (ja) |
| GR (1) | GR3026096T3 (ja) |
| IE (1) | IE902707A1 (ja) |
| PT (1) | PT94813B (ja) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6932968B1 (en) * | 1989-07-26 | 2005-08-23 | Dade Behring Marburg Gmbh | Erythropoietin (EPO) peptides and antibodies directed against these |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| GB2270695B (en) * | 1992-09-18 | 1996-06-05 | Oxford Res Support Co Ltd | Antibodies that activate plasminogen in the manner of streptokinase |
| US5830851A (en) * | 1993-11-19 | 1998-11-03 | Affymax Technologies N.V. | Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5773569A (en) * | 1993-11-19 | 1998-06-30 | Affymax Technologies N.V. | Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| PL185040B1 (pl) * | 1995-06-07 | 2003-02-28 | Affymax Tech Nv | Peptyd wiążący się z receptorami erytropoetyny, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd i jego zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego |
| KR100400637B1 (ko) * | 1996-02-06 | 2004-03-10 | 씨제이 주식회사 | 생물학적으로유용한펩타이드 |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| ES2523599T3 (es) * | 1997-12-03 | 2014-11-27 | Roche Diagnostics Gmbh | Eritropoyetina de gran actividad específica |
| MXPA01011264A (es) * | 1999-05-07 | 2002-07-02 | Genentech Inc | Nuevos polipeptidos de eritropoyetina de chimpance (chepo) y aciodos nucleicos que codifican los mismos. |
| KR100524041B1 (ko) * | 1999-05-07 | 2005-10-27 | 제넨테크, 인크. | 신규 침팬지 에리쓰로포이에틴 (chepo) 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산 |
| US6831060B2 (en) | 1999-05-07 | 2004-12-14 | Genentech, Inc. | Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| US6703480B1 (en) | 1999-11-24 | 2004-03-09 | Palani Balu | Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use |
| CA2405029A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-18 | Jong Y. Lee | Detection of erythropoietin and erythtropoietin receptor |
| US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2405709A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| PL362396A1 (en) * | 2001-02-06 | 2004-11-02 | Merck Patent Gmbh | Modified erythropoietin (epo) with reduced immunogenicity |
| WO2002070009A1 (fr) * | 2001-02-27 | 2002-09-12 | Yasuda, Yoshiko | Medicaments preventifs/curatifs pour cicatrices hypertrophiques, cheloides et maladies arthritiques chroniques |
| US20030143191A1 (en) * | 2001-05-25 | 2003-07-31 | Adam Bell | Chemokine beta-1 fusion proteins |
| JP4991088B2 (ja) * | 2001-07-26 | 2012-08-01 | タグラ バイオテクノロジーズ リミテッド | アスコルビン酸−３リン酸の安定化誘導体 |
| US6930086B2 (en) * | 2001-09-25 | 2005-08-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Diglycosylated erythropoietin |
| CA2471363C (en) * | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU2002364587A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1527094B1 (en) * | 2002-08-09 | 2008-07-16 | MERCK PATENT GmbH | T-cell epitopes in erythropoietin |
| CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1608672A4 (en) * | 2003-04-02 | 2007-11-21 | Epimmune Inc | PEPTIDES, POLYPEPTIDES AND PROTEINS OF REDUCED IMMUNOGENICITY AND METHODS OF PRODUCTION THEREOF |
| PL1615945T3 (pl) | 2003-04-09 | 2012-03-30 | Ratiopharm Gmbh | Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami |
| US20040266993A1 (en) * | 2003-06-30 | 2004-12-30 | Evans Glen A. | Non-immunoglobulin binding polypeptides |
| US7588745B2 (en) * | 2004-04-13 | 2009-09-15 | Si Options, Llc | Silicon-containing products |
| US20050255112A1 (en) * | 2004-05-17 | 2005-11-17 | Lee Jong Y | Compositions and methods for preventing erythropoietin-associated hypertension |
| CA2586915A1 (en) * | 2004-11-10 | 2006-05-18 | Aplagen Gmbh | Molecules which promote hematopoiesis |
| US7589063B2 (en) * | 2004-12-14 | 2009-09-15 | Aplagen Gmbh | Molecules which promote hematopoiesis |
| EA200701031A1 (ru) * | 2004-11-10 | 2007-10-26 | Аплаген Гмбх | Молекулы, способствующие гематопоэзу |
| EP1848461A2 (en) * | 2005-02-16 | 2007-10-31 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an epo moiety and a polymer |
| EP2385061A3 (en) | 2005-05-10 | 2012-02-22 | Neoloch Aps | Neuritogenic peptides |
| EP1736481A1 (en) * | 2005-05-13 | 2006-12-27 | Charite Universitätsmedizin-Berlin | Erythropoietin variants |
| EA200800109A1 (ru) * | 2005-06-23 | 2008-06-30 | Аплаген Гмбх | Суправалентные соединения |
| ES2550055T3 (es) | 2005-08-05 | 2015-11-04 | Araim Pharmaceuticals, Inc. | Péptidos protectores de tejido y usos de los mismos |
| BRPI0709014A2 (pt) * | 2006-03-09 | 2011-06-21 | Aplagen Gmbh | moléculas modifcadas que promovem hematopoise |
| EP2134862A4 (en) * | 2007-03-12 | 2011-04-20 | Univ Utah Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF DIABETIC MICROVASCULAR COMPLICATIONS |
| US8853358B2 (en) | 2008-01-22 | 2014-10-07 | Araim Pharmaceuticals, Inc. | Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage |
| JP5702150B2 (ja) | 2008-02-08 | 2015-04-15 | アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. | 修飾されているレプチンポリペプチドおよびそれらの使用 |
| PL2342223T3 (pl) | 2008-09-26 | 2017-09-29 | Ambrx, Inc. | Zmodyfikowane polipeptydy zwierzęcej erytropoetyny i ich zastosowania |
| PL2928921T3 (pl) * | 2012-12-05 | 2021-06-28 | Novartis Ag | Kompozycje i sposoby dla przeciwciał celujących w epo |
| EP3334842B1 (en) | 2015-08-12 | 2022-03-02 | Novartis AG | Methods of treating ophthalmic disorders |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56145222A (en) * | 1980-04-28 | 1981-11-11 | Toshiyuki Hamaoka | Improved antibody and its preparation |
| US4474893A (en) * | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4748018A (en) * | 1984-02-07 | 1988-05-31 | Stolle Research & Development Corp. | Method of passive immunization of mammals using avian antibody |
| US4558005A (en) * | 1982-09-13 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Monoclonal anti-erythropoietin |
| US4558006A (en) * | 1983-02-04 | 1985-12-10 | Kirin-Amgen, Inc. | A.T.C.C. HB8209 and its monoclonal antibody to erythropoietin |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| US4677195A (en) * | 1985-01-11 | 1987-06-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions |
-
1989
- 1989-07-26 DE DE3924746A patent/DE3924746A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-07-14 DE DE59010787T patent/DE59010787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-14 EP EP90113527A patent/EP0410246B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-14 AT AT90113527T patent/ATE161577T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-07-14 DK DK90113527T patent/DK0410246T3/da active
- 1990-07-14 ES ES90113527T patent/ES2111524T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-24 US US07/556,423 patent/US5106954A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-25 CA CA002021912A patent/CA2021912C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-25 AU AU59778/90A patent/AU648506B2/en not_active Expired
- 1990-07-25 IE IE270790A patent/IE902707A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-07-25 PT PT94813A patent/PT94813B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-07-25 KR KR1019900011291A patent/KR0175657B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-07-26 JP JP19896990A patent/JP3155002B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-29 US US08/267,539 patent/US5712370A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-11 GR GR980400264T patent/GR3026096T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT94813A (pt) | 1991-03-20 |
| DE59010787D1 (de) | 1998-02-05 |
| KR910002897A (ko) | 1991-02-26 |
| PT94813B (pt) | 1997-04-30 |
| JPH0381294A (ja) | 1991-04-05 |
| KR0175657B1 (ko) | 1999-04-01 |
| DK0410246T3 (da) | 1998-08-31 |
| IE902707A1 (en) | 1991-02-27 |
| CA2021912A1 (en) | 1991-01-27 |
| US5712370A (en) | 1998-01-27 |
| ATE161577T1 (de) | 1998-01-15 |
| US5106954A (en) | 1992-04-21 |
| EP0410246B1 (de) | 1997-12-29 |
| AU648506B2 (en) | 1994-04-28 |
| DE3924746A1 (de) | 1991-01-31 |
| AU5977890A (en) | 1991-01-31 |
| EP0410246A1 (de) | 1991-01-30 |
| CA2021912C (en) | 2001-11-27 |
| ES2111524T3 (es) | 1998-03-16 |
| GR3026096T3 (en) | 1998-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3155002B2 (ja) | エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体 | |
| JP2783385B2 (ja) | ヒト血管浸透性因子のｃＤＮＡ | |
| Klagsbrun et al. | Human tumor cells synthesize an endothelial cell growth factor that is structurally related to basic fibroblast growth factor. | |
| US4816561A (en) | Biologically active polypeptides | |
| US5240912A (en) | Transforming growth factor (TGF) peptides | |
| US5656435A (en) | Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof | |
| US4864019A (en) | Antibodies to inhibin and conjugates produced therefrom | |
| US4863899A (en) | Biologically active polypeptides | |
| Zarnegar et al. | NH2-terminal amino acid sequence of rabbit hepatopoietin A, a heparin-binding polypeptide growth factor for hepatocytes | |
| US6328974B1 (en) | Immunogenic compositions that potentiate growth hormone activity | |
| EP0246753A2 (en) | Fibroblast growth factor antagonists | |
| JPH06507398A (ja) | Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体 | |
| US4652629A (en) | Synthetic peptide-based anti-rabies compositions and methods | |
| JPH04503812A (ja) | メラニン濃縮ホルモンおよびそれを用いた処置法 | |
| EP0418590B1 (en) | Antibodies, production thereof and use | |
| NZ227073A (en) | Peptide structures and synthetic immunogens and their use in fertility control | |
| NO169348B (no) | Analogifremgangsmaate for fremstilling av en polypeptid-transformerende vekstfaktor | |
| US6932968B1 (en) | Erythropoietin (EPO) peptides and antibodies directed against these | |
| EP0364481A1 (en) | Growth factors | |
| CA2028517A1 (en) | Enhancement of porcine somatotropin activity | |
| JP3232415B2 (ja) | モノクローナル抗体，その製造法および用途 | |
| JP2803184B2 (ja) | 酸性線維芽細胞成長因子の抗体，その用途およびペプチド | |
| JP3024987B2 (ja) | 抗体、その製造法および用途 | |
| US4707356A (en) | Synthetic peptide-based anti-rabies compositions and methods | |
| Léonetti et al. | Immunogenicity of T epitope-containing cyclic peptides. Increasing neutralizing antibody responses by introducing fine chemical changes. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090202 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 9 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 9 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 9 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 9 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 9 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110202 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110202 Year of fee payment: 10 |