PT94813B

PT94813B - Processo para a preparacao de peptidos epo de eritropoietina e de anticorpos contra eles

Info

Publication number: PT94813B
Application number: PT94813A
Authority: PT
Inventors: Mathias Dr Fibi; Werner Dr Stueber
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-07-26
Filing date: 1990-07-25
Publication date: 1997-04-30
Also published as: ATE161577T1; DE3924746A1; DK0410246T3; IE902707A1; ES2111524T3; GR3026096T3; CA2021912C; DE59010787D1; EP0410246A1; JPH0381294A; KR0175657B1; CA2021912A1; KR910002897A; PT94813A; AU5977890A; AU648506B2; US5106954A; EP0410246B1; US5712370A; JP3155002B2

Description

: A presente invenção refere-se a péptidos de eritropoietina (EPO) e à sua utilização para a preparação de anticorpos j anti-EPO epito-específicos. A invenção refere-se ainda a anti•i corpos anti-EPO epí topo-específicos em que se pode tratar de l· anticorpos policlonais (anti-soros) ou de anticorpos monoclonais.

ί Além disso, a invenção refere-se à utilização dos anticorpos anti-EPO epítopo-específicos para a purificação de EPO, derivados de EPO e péptidos de EPO. A invenção refere-se

J ainda a anticorpos anti-idiotípicos que imitam uma região recep! tora de EPO. Finalmente, a invenção refere-se à utilização dos , anticorpos anti-EPO epítopo-específicos para a detecção, de preferência, para a detecção epí topo-específica de EPO, medicamen¹ tos que contêm os mencionados péptidos de EPO, anticorpos anti-EPO ou anticorpos anti-idiotípicos de diagnóstico para detecção de EPO ou de anticorpos anti-EPO.

A eritropoietina (EPO) é uma hormona glicoproteínica com 166 aminoácidos, 3 posições de glicosilação nas posições .í, 24, 38 e 83 da cadeia dos aminoácidos e com um peso molecular •Ji igual a cerca de 34 000.

Prepara-se primeiro como uma proteína precursora com : um péptido de sinal de vinte e três aminoàcidos. A EPO estirnuI í la a divisão por mitose e a diferenciação de células precursoras de eritrócitos e garante, por consequência, a formação de eritrócitos. É produzida nos rins se existirem condições hipóxicas. No quadro de uma diferenciação provocada por EPO de células precursoras de eritrócitos, provoca-se a síntese da globina e a síntese do complexo Hem, assim como aumenta o número de receptores de ferritina. Desta forma, a célula pode absorver mais ferro e sintetizar hemoglobina funcional.

i Nos eritrócitos maduros, a hemoglobina liga o oxigé! nio. Por isso, os eritrócitos ou, melhor, a hemoglobina contií

I da nos eritrócitos, desempenham um papel fundamental na alimentação de oxigénio ao organismo. Os processos complexos previstos são desencadeados pela acção de troca de EPO com um correspondente receptor sobre as superfícies das células precursoras de eritrócitos (veja-se Graber e Krantz, Ann. Rev. Med. 29

I (1978), 51-66.

A EPO ou pode ser isolada a partir de fontes naturais í como urina humana (veja-se, por exemplo, Miyake e col., J. Biol.

Chem. 252 (1977), 5558 - 5564) ou pode ser preparada por processos de tecnologia genética (veja-se, por exemplo, a Patente de

Invenção Europeia EP-A-2 148 605).

Os pacientes com insuficiência renal não podem formar EPO e, por consequência, podem sofrer de anemia. Ensaios no sentido de completar esta insuficiência de EPO por administração de EPO recombinante e atenuar os sintomas de anemia são já co1 nhecidos, tendo tido um êxito completo (veja-se The Lancet 4, de Abril de 1987, Erythropoietin, páginas 781 - 782; Eschbach l· e col., The New England Journal of Medicine 316 (1987), 73 - 78).

No entanto, conhece-se muito pouco acerca do mecanismo da acção da troca de EPO com o seu receptor. Por meio da utili! zação de anticorpos específicos contra EPO existe no entanto a , possibilidade de caracterizar a molécula de EPO tanto imunologii camente como também funcionalmente. Além disso, foi possível • ί' .[! tratar perturbações da regulação de EPO com anticorpos neutrali2

zantes ou corn péptidos de EPO que se ligam aos receptores de I

EPO. Neste caso, a utilização de péptidos de EPO é vantajosa !

em relação à utilização de moléculas de EPO completas porque esses péptidos se podem preparar mais facilmente, por exemplo, por síntese.

I

São já conhecidos péptidos de EPO que correspondem às posições 1 a 26, 40 a 59, 80 a 99, 99 a 118, 111 a 129, 131 a 150 e 147 a 166, assim como anticorpos dirigidos contra alguns péptidos de EPO, como descrevem Sytkowski e Donahue, em J. Biol. Chem. 262 (1987), 1161 - 1165. Anticorpos que podem neutralizar a actividade biológica de EPO mas que se podem preparar apenas com péptidos de EPO de Sytkowski e Donahue, que correspondem às posições 99 a 118 e 111 a 129. A este respeito, referem os autores que os (alguns) domínios de ligação de receptores se encontra na região das posições dos aminoácidos 99 a 129 de EPO. Deve observar-se que os péptidos de EPO para imunização foram ligados a um suporte por meio de radicais de dialdeído glutárico.

Na Patente de Invenção Europeia EP-A-2 148 605, descrevem-se, conjuntamente com a preparação por tecnologia genética de EPO e dos seus derivados, também péptidos de EPO que correspondem às posições 1 a 20, 41 a 57, 116 a 128 e 144 a 166. Descrevem-se ainda anticorpos de coelho policlonais contra este péptido de EPO; vide Patente de Invenção Europeia EP-A-2 148 605, página 90. Os anticorpos contra o EPO-péptido 116 a 128 não reagem, contudo, com EPO.

Os anticorpos que neutralizam a EPO ou os anticorpos dirigidos contra as regiões de receptores de EPO, no entanto, não são descritos na Patente de Invenção Europeia EP-A-2 148 605.

A presente invenção tem como objectivo preparar novos péptidos de EPO como problema técnico que permitem a posterior caracterização funcional e imunológica de EPO. Ainda são proporcionados novos péptidos de EPO que se ligam ao receptor de EPO e, por consequência, são apropriados para o tratamento de perturbações provocadas por EPO. Além disso, a invenção resolve o problema técnico que consiste em proporcionar anticorpos contra

os mencionados péptidos de EPO, que são apropriados para a detecção de EPO e para o tratamento de perturbações da função de

EPO.

A solução dos problemas técnicos acima mencionados é conseguida pela preparação das formas de realização caracteriza- j i das nas reivindicações da presente patente. I ί !

ji São portanto, objecto da presente invenção péptidos ^? de EPO que se caracterizam pelo facto de possuírem essencialmen, te as posições de aminoácidos 1 a 35 (P4), 7 a 23 (P4/1), 44 a (P3), 52 a 63 (P3/1), 74 a 109 (Pl), 84 a 95 (Pl/1), 93 a

137 (P5) , 110 a 123 (P5/1), 142 a 166 (P2), ou 152 a 166 (P2/1), correspondendo à numeração das posições dos aminoácidos de EPO i : i natural.

^:l ( Os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção ! Pl, Pl/1, P3 e P3/1 são fortemente imunoqénicos e permitem a j preparação de anticorpos anti-EPO epítopo-específicos com elevados teores dos genes.

Os péptidos EPO P2 e P2/1 permitem, surpreendentemente, a preparação de anticorpos anti-EPO neutralizantes. De acordo com a presente invenção, supõe-se que estes péptidos de EPO j apresentam um outro domínio de receptor até agora ainda não identificado. Por consequência, estes péptidos de EPO de acordo com í a presente invenção são especialmente apropriados para a tera1' ί pia da regulação de EPO.

Os péptidos de EPO P4 e P4/1 são igualmente fortemente i imunogénicos. Por causa da homologia igual a 100% da EPO humana com a EPO de macaco e de rato, neste domínio os anticorpos ji contra estes péptidos de EPO de acordo com a presente invenção

I , (não são apropriados apenas para a detecção de EPO humana.

Os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção P5 e P5/1 são apropriados para a preparação de anticorpos anti|-EPO com os quais se pode detectar a presença de EPO natural e parcialmente desnaturada, por exemplo, nas manchas de Western, ΐ Estes péptidos de EPO estão ligados na região dos receptores já i

’ descritos por Sytkowski e Donahue (loc. cit. ) .

ί Especialmente os péptidos P2, P4 e P5 são muito seme!

'' lhantes aos correspondentes epítopos sobre a molécula de EPO existente na Natureza; são portanto anticorpos que reagem especificamente com estes péptidos de EPO para a detecção de EPO t natural, por exemplo, no ensaio de ELISA ou na mancha de Wes¹ tern.

Os péptidos de acordo com a presente invenção podem preparar-se por separação química ou enzimática da EPO natural ou por tecnologia genética. Além disso, podem preparar-se directamente por tecnologia genética ou sinteticamente. De acordo com a presente invenção, prefere-se a preparação por via sintética .

Nas formas de realização preferidas, os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção Pl, Pl/1, P3, P3/1, P4, P4/1, P5 ou P5/1 têm as seguintes sequências de aminoácidos

Pl VLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLL;

Pl/1 SSQPWEPLQLHV;

P3 NEMITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEA

P3/1 KRmEVGQÇAVEV;

P4 APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSL;

P4/1 CDSRVLERYLLEAKEAE;

P5 LHVDKAVSGLRSLTTLLRALRAQKEAISPPDAASAAPLRTITADT; OU P5/1 RALRAQKEAISPPD.

De acordo com uma forma de realização especialmente preferida da presente invenção, os péptidos de EPO P2 e P2/1 têm as seguintes sequências de aminoácidos

P2 FRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR; ou P2/1 KLKLYTGEACRTGDR.

Os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção podem utilizar-se para a preparação de anticorpos anti-EPO epítopo-específicos. Estes péptidos possuem a vantagem de serem substâncias muito puras, validável como imunogénico, que provocam a formação de anti-soros de elevada concentração definidos reprodutíveis para toda a imunização.

Com os péptidos de EPO de acordo com a presente inven5

_ ção, podem preparar-se tanto anticorpos anti-EPO epítopo-específicos policlonais (anti-soros), como também anticorpos anti-EPO epítopo-específicos monoclonais. A preparação destes anticorpos realiza-se procedendo de acordo com uma maneira de proceder em si conhecida. No entanto, de preferência, os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção são ligados a um material de suporte para a imunização por intermédio dos radicais de cisteína. Sempre que os péptidos de EPO não contenham um radical de cisteína, adiciona-se este radical procedendo de acordo com a maneira de proceder usual.

A invenção refere-se ainda aos anticorpos anti-EPO epítopo-específicos que se podem preparar com os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção. De maneira vantajosa, estes anticorpos anti-EPO dirigem-se contra determinados epítopos de EPO ou de regiões de EPO. Por consequência, podem ser utilizados em sistemas de ensaio para demonstrar a presença do título normal de EPO ou do título de EPO epítopo-específico ' I ^! durante a terapia.

Os anticorpos anti-EPO epítopo-específicos de acordo com a presente invenção são ou anticorpos policlonais (anti-soros) ou anticorpos monoclonais. Por consequência, quando se preparam anticorpos policlonais de acordo com a presente invenção com os péptidos de EPO de acordo com a presente invenção, a sua preparação é reprodutível e eles são definidos e têm um elevado título. Portanto, são especialmente apropriados para emprego em todos os sistemas de detecção de EPO de validação.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a anticorpos anti-idiotípicos que se dirigem contra a região de ligação dos anticorpos anti-EPO anteriormente mencionados e imitam uma zona do receptor de EPO. estes anticorpos anti-idiotípicos ligam-se ao receptor celular de EPO. De preferência, estes anticorpos anti-idiotípicos dirigem-se contra a região de ligação de anticorpos anti-P2 ou anti-P2/l.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, os anticorpos anti-EPO epítopo-específicos . neutralizam a actividade biológica de EPO.

De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção, os anticorpos anti-idiotípicas antes meni cionadas reconhecem células que são postas à disposição através

H de receptores de EPO.

Ainda de acordo com uma outra forma de realização da presente invenção, os anticorpos anti-EPO epítopo-específicos

H de acordo com a presente invenção são utilizados para a purifii cação de EPO, de derivados de EPO ou de péptidos de EPO. No i caso do processo de purificação correspondente, trata-se de processos cromatográficos gerais, por exemplo, de ensaios de , cromatografia de absorção por imunidade ou de cromatografia de afinidade. Para esta finalidade, os anticorpos anti-EPO epítopo-específicos de acordo com a presente invenção são eventualJ mente ligados a materiais de suporte apropriados para cromatolj grafia.

A presente invenção refere-se também à utilização dos anticorpos anti-EPO epítopo-específicos de acordo com a presenj te invenção para a detecção, de preferência, para a detecção epítopo-específica de EPO. Os anticorpos podem detectar-se também diferencialmente muteínas de EPO. Essas muteínas de EPO 'i podem ser modificadas, por exemplo, na estrutura primária, isto ' é, na sua sequência de aminoácidos. Podem preparar-se com essas muteínas de EPO anticorpos que reagem especificamente mediante utilização dos correspondentes péptidos de EPO que se adaptam como se esclareceu anteriormente. Em especial, a invenção refere-se a composições de diagnóstico que contêm péptidos de EPO de acordo com a presente invenção, anticorpos anti-EPO epítopo-específicos e/ou anticorpos anti-idiotípicos.

De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm pelo menos um dos péptidos de EPO de acordo com a presente invenção ou anticorpos anti-EPO epítopo-específicos de acordo com i a presente invenção. De preferência, estas composições farmacêuticas contêm péptidos de EPO que bloqueiam os receptores de EPO das células.

De acordo com uma outra forma de realização preferida,

as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção contêm anticorpos anti-EPO epítopo-específicos de acordo com a presente invenção que neutralizam a actividade biológica de EPO. As composições farmacêuticas contêm eventualmente ainda

S as substâncias auxiliares e os aditivos farmaceuticamente aceitáveis correntemente utilizados.

Com as composições farmacêuticas de acordo com a pre„ sente invenção acima mencionadas, podem tratar-se perturbações , da regulação de EPO.

As Figuras representam:

) Figura 1: Ensaio de ligação directo de eritropoietina. Diluições do soro de anti-soros de coelho específicos contra EPO ou específicos contra P2/1 foram absorvidas em placas η de microtitulação revestidas com EPO (20 microgramas/ml) e detectaram-se os anticorpos ligados com anticorpos anti-coelho marcados com enzimas. Os soros 336, 346, 347 e 348 são preparados contra a molécula completa de EPO; os soros 556, 557 e 558 foram preparados contra o péptido P2; o soro 444 é um soro de pré-imunização de coelhos.

Figura 2: Inibição da actividade biológica de eritropoietina humana recombinante (rhuEPO) por anti-soro específico rhuEPO. Empregaram-se anti-soros que foram obtidos por imuniza• ção de coelhos com rhuEPO ou com as sequências de péptidos P2, r

P4, e P5 que foram obtidas acopladas à hemocianina do limpete chave, conjuntamente com rhuEPO num ensaio de proliferação de precursores eritróides enriquecidos de acordo com Krystal (J. Εχρ. Hematol. 11, 649). Os anticorpos que foram obtidos por imunização com P2-KLH ou EPO-KLH inibem a proliferação dos precursores eritróides provocada por rhuEPO.

Figura 3: Inversão da inibição por soros anti-EPO-P2-KLH. Antes da incubação das células precursoras com rhuEPO e com anti-soro P2-KLH no ensaio de Krystal (acima citado), o soro foi previamente adsorvido com P2-Sepharose até 5 x. Por meio da prévia adsorção em péptido P2, elimina-se completamente a actividade inibitória do soro.

-J Material e Métodos ! Preparação dos Péptidos ií í Os péptidos foram preparados, de preferência, de acordo com o método da fase sólida numa matriz de poliestireno (1% reticulada com divinil-benzeno). A carga da matriz de ; poliestireno em grupos funcionais (-NH^) foi de preferência, igual a 0,4 - 0,6 milimoles/grama de matriz. Como os péptidos foram preparados com utilização do grupo Fmoc lábil em meio alcalino, utilizaram-se como moléculas de ancoragem ésteres de p-alcoxi-benzilo. Em geral, durante a síntese, utilizou-se diclorometano e dimetil-formamida e, em casos excepcionais, N-metil-pirrolidona. As quantidades de líquidos de lavagem ou de reacção foram, de preferência, cerca de 15 ml. Como os grupos alfa-NH^ dos aminoácidos foram protegidos com o grupo Fmoc, foram escolhidos os seguintes de protecção para os grupos lateI rais dos aminoácidos trifuncionais:

i serina, treonina, tirosina éter tércio-butílico ácido glutâmico, ácido aspártico éster tércio-butílico arginina 4-metoxi-2,3,6-trimetil-fenil-sulf onilo cisteína tércio-butil-mercapto lisina tércio-butilóxi-carbonilo.

Os aminoácidos foram acoplados, de preferência, por intermédio de éster activo; de preferência, utilizou-se a activação in situ por HOBt/di-isopropil-carbodiimida.

A eliminação repetitiva dos grupos de protecção de alfa-NH₂ realizou-se com uma base, de preferência, com 20% de piperidina em DMF, à temperatura ambiente.

Depois de cada uma destas fases de reacção, acopla: mento ou desbloqueamento, lavou-se a resina com DMF e álcool isopropílico.

Por acidólise, eliminaram-se simultaneamente os gru. pos de protecção dos grupos laterais e os péptidos da matriz.

De preferência, esta operação realizou-se por meio de uma mistura de ácido triflúor-acético e etanoditiol (9 : 1, volume/ volume). 0 grupo de sulfidrilo da cisteína foi libertado por substâncias que contêm grupos tiol, por exemplo, ditiotreitol ou butil-fosfina.

Os péptidos sintéticos foram ensaiados relativamente à sua composição quírnica e à sua pureza. A composição dos péptidos foi determinada por meio de análise de aminoácidos. Para esta finalidade, hidrolisou-se uma pequena amostra com ácido clorídrico 6 N em presença de fenol, a 110°C, durante vinte e quatro horas ou setenta e duas horas e determinaram-se quantitativamente os aminoácidos individuais.

Os teores de péptidos foram iguais a cerca de 85%. Eventualmente, purificaram-se os péptidos por meio de cromatografia em fase líquida de elevado rendimento em fase inversa (RP-HPLC) de acordo com métodos conhecidos. A pureza dos péptidos foi determinada por HPLC em colunas C18 de fase inversa.

Para esta finalidade, utilizou-se um gradiente de fosfato/acetonitrilo e verificou-se que o grau de pureza era maior do que 85%.

Acoplamento dos péptidos com moléculas de suporte

Os péptidos foram acoplados, de preferência, por intermédio de radicais de cesteína com uma proteína de suporte de elevado peso molecular, por exemplo, com albumina ou ovalbumina, de preferência, em hemocianina de limpete chave (KLH).

O acoplamento realizou-se por intermédio de uma ligação de tioéter ao grupo tiol da cisteína. Este tipo de acoplamento tem a vantagem de se acoplar o péptido à proteína de suporte de maneira bem definida. Sempre que os péptidos não continham nenhum radical de cisteína, ligou-se um radical de cisteína.

Acoplamento dos péptidos com resina de Sepharose acoplamento dos péptidos com Sepharose realizou-se de acordo com um processo usual com o auxílio de Sepharose activada com brometo de ciano.

.;í Preparação dos anti-soros ! I

Imunização de coelhos ' I Ί ' Para produzir anticorpos específicos do péptido de

EPO, emulsionaram-se conjugados de péptido-KLH com substâncias auxiliares e injectaram-se em coelhos de acordo com um esquema de imunização com a duração de cinco semanas. Ao fim deste tempo, os animais tinham formado anticorpos específicos e foram sangrados.

Detecção de anticorpos específicos

Para ensaiar os soros relativamente à especificidade ) dos péptidos ou de EPO, utilizou-se um ensaio do tipo ELISA em fase sólida. Em placas de microtitulação de plástico, que foram recobertas com EPO purificada ou com péptidos de EPO, determinou-se o teor de anticorpos específicos a péptidos e específiI cos a EPO nos anti-soros ou nas fracções de anticorpos purifica'! dos por cromatografia por afinidade com auxílio de um anti-soro - de Ig anti-coelho acoplado com enzimas. Paralelamente a este ensaio, ensaiaram-se os anticorpos de acordo com o ensaio da ί mancha de Western para detecção das bandas específicas de EPO ) de 34 - 38 KDa.

Detecção de anticorpos neutralizantes ί

Para ensaiar os anti-soros específicos de rhuEPO ou de péptido rhuEPO relativamente às suas propriedades de neutralização, procedeu-se ao ensaio de proliferação de acordo com Krystal (1983, Exp. Hematol. 7, 649 - 660). Ratos do sexo feminino da estirpe NMRI foram injectados em dois dias consecutivos com 48 rng/kg de hipoclorito de f enil-hidrazina. Quarenta e oito horas depois da última injecção, retiraram-se os baços dos animais e preparou-se uma suspensão individual. Enriqueceram-se as suspensões em células precursoras eritróides com o auxílio de gradiente de Ficoll (D = 1,077). Para a indução da proliferação, incubaram-se essas células numa placa de microtitulação com noventa e seis reentrâncias, colocando 3 x 10^ células/reentrância com 0,1 picomole/ml de rhuEPO. Para a realização do

II

ensaio de inibição, pré-incubou-se EPO com diluições dos antiί -soros e em seguida empregou-se num ensaio de proliferação.

j A purificação dos anticorpos epítopo-específicos realizou-se de acordo com modos operatórios usuais, em gue os anti corpos de um precipitado com sulfato de amónio dialisado contra PBS foi adsorvido durante a noite em Sepharose, o material não ligado foi lavado com PBS de pH 7,0 e, em seguida, os anticorpos específicos foram eluídos com água acidulada de pH 2,5. Os eluídos foram imediatamente neutralizados com fosfato de sódio sólido até pH 7,0 e dialisados com PBS.

Acoplamento de anticorpos epítopo-específicos com resina de

Sepharose

Os anticorpos de epítopo específico foram acoplados ! num processo normal com Sepharose activada com brometo de ciano

Purificação de eritropoietina por cromatografia de afinidade

A eritropoietina proveniente de sobrenadantes de cultura de células foi adsorvida em colunas com anticorpos epítopo específicos e são eluídos sem perda da actividade biológica de acordo com processos usuais por alteração do valor do pH de pH ! 7 — 8 para pH 2 - 3.

Os seguintes Exemplos esclarecem a presente invenção. Neles, utilizam-se as seguintes abreviaturas:

t-Bu éter tércio-butílico

Mtr 4-metoxi-2,3,6-trimetil-fenil-sulfonilo i

DMF dimetil-formamida

HOBt hidroxi-benzotriazol

Boc tércio-butiloxi-carbonilo

Fmoc fluoreniloxi-carbonilo , GMBS éster de N-hidroxi-succinimida do ácido gama-maleimido-butírico.

EXEMPLOS ; Exemplo 1

I i , Preparação do antigene de imunização l a) Síntese de Péptidos de P2/1 H-Lys-Leu-Lys-Leu-Tyr-Thr-Gly-Glu-Ala-Cys-Arg-Thr-Gly-Asp-Arg

A síntese do péptido realizou-se com utilização de um sintetizador de péptidos completamente automático.

Os grupos de protecção foram eliminados de 1 grama de resina de éster de p-alcoxi-benzilo de Fmoc-Arg(Mtr) com 15 ml de 20% de piridina/DMF (volume/volume) e lavou-se várias vezes com DMF e isopropanol. Adicionou-se 1 milimole de Fmoc-Asp(t-Bu) (excesso triplo) e 203 mg de HOBt em 15 ml de DMF. Depois da adição de 1,1 ml de uma solução 1 molar de di-isopropil-carj! bodiimida (em diclorometano) , realizou-se o acoplamento durante 1,5 horas. Eliminou-se o excesso de reagentes por lavagem com DMF em isopropanol.

^;í

Este esguema de acoplamento foi mantido ate ao amino! ácido da extremidade de N. Como último aminoácido, introduziu-se um aminoácido protegido com Boc. Verificou-se que todas as

I fases de acoplamento estavam completas por meio de um ensaio | com nin-hidrina. Agitaram-se a 35°C durante quatro horas 1,06 gramas de resina com 2,5 ml de tio-anisol, 2,5 ml de etanoditiol e 15 ml de ácido triflúor-acético e filtrou-se. Despejou-se a solução ácida em éter, separou-se por filtração o péptido que :! D h precipitou e cromatografou-se numa coluna de Sephadex G25 com 3 x 100 centímetros com 0,5% de ácido acético. Liofilizaram-se as fracções que continham o péptido. O rendimento foi igual a 230 miligramas.

b) Libertação do grupo sulfidrilo

Dissolveram-se 70 mg de péptido em 7 ml de triflúor-etanol e 350 microlitros de água e regulou-se o valor do pH com N-metil-morfolina de maneira a ser igual a 7,3. Lavou-se o • vaso reaccional com uma corrente de azoto e adicionaram-se 40 microlitros de n-tributil-fosfina. Agitou-se à temperatura ambiente durante uma hora, diluíu-se com 50 ml de água e regulou-se o valor do pH de maneira a ser igual a 4,0. Extraíu-se a fase aquosa por três vezes com 10 ml de éter dietílico, concentrou-se até perfazer um volume de 10 ml e purificou-se em Sephadex G25 (3 x 100 centímetros; 0,5% de ácido acético). Depois de liofilização, obtiveram-se 55 mg de péptido.

c) Preparação do conjugado

Dissolveram-se 30 mg de KLH (hemocianina de limpete chave) em 0,05 milimole de tampão de fosfato de sódio de pH 8,0 e activou-se com 3 mg de GMBS durante uma hora. Cromatografou-se a proteína com uma coluna de Sephadex G50 (2 x 30 centímetros) (0,1 mole de fosfato de sódio; 0,5 milimole de EDTA, pH 6,0). Concentrou-se o eluído que contém proteína até perfazer o volume de 6 ml e incubou-se durante uma hora com 30 mg do péptido que contém grupos sulfidrilo. Depois de diálise e de liofilização, obtiveram-se 38 mg de conjugado de péptido.

Exemplo 2

Imunização de coelhos

Imunizaram-se coelhos com respectivamente 1,7 mg de antigene por animal durante um intervalo de tempo de cinco semanas. Na primeira imunização, os animais receberam respectivamente 0,4 mg de antigene em auxiliar completo de Freund (CFA) subcutaneamente, em oito posições de imunização na proximidade dos nódulos linfáticos. Duas semanas depois, realizou-se a imunização subcutânea com 0,8 mg de antigene em CFA por animal. Depois de mais duas semanas, aos animais administrou-se intravenosamente em cinco dias sucessivos respectivamente 0,1 mg de antigene em Aerosil. Três dias depois, os animais foram sangra dos e obtiveram-se os respectivos anti-soros individuais.

Exemplo 3

Preparação de adsorventes de imunização contendo péptidos

.ij Para purificação por cromatograf ia de afinidade dos ' anti-soros brutos, irnobilizaram-se cerca de 20 mg, por exemplo, ' do 15° péptido (P2/1) j H-Lys-Leu-Lys-Leu-Tyr-Thr-Gly-Glu-Ala-Cys-Arg-Thr-Gly-Asp-Arg! -OH covalentemente numa fase sólida. A reacção de acoplamento realizou-se com Sepharose activada com bromociano, de acordo com ί, o processo acima descrito (Axen e col., Nature 214 (1967), 1302). ί Em seguida, lavou-se o adsorvente com o agente de imunidade res^! pectivamente com solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato (PBS; 0,15 mole/litro, pH 7,2) e ácido acético (0,5 moíj le/litro, pH 2,5). Antes da utilização, o adsorvente foi equiI I

I librado com um volume triplo de PBS.

Rendimento: cerca de 20 ml de péptido - Sepharose.

Procedendo da mesma maneira, utilizaram-se os outros ij péptidos para a preparação de adsorventes de imunização.

'i ; Exemplo 4 ; í i Recuperação de anticorpos λ Colocaram-se 100 ml de anti-soro bruto em péptido: -Sepharose (1,5 x 15 cm) equilibrado com PBS e,em seguida, la! vou-se com PBS até a extinção a 280 nm ser igual a 0,01. Em ₍ seguida, realizou-se a operação de lavagem com solução 1 M de

NaCl, pH 7,0 e com água (pH 7,0), em que se utilizou respectivamente o volume triplo de gel. A eluição dos anticorpos do adsor vente imune efectuou-se com água (pH 2,5), regulou-se a solução de anticorpos com fosfato de sódio sólido (0,001 mole/litro) a pH 7,0, concentrou-se (membrana de Amicon) e guardou-se a -70°C. Rendimento: 35 mg de anticorpos.

I ί ; i

Exemplo 5 í

Ensaio dos anticorpos

!. a) Preparação de placas de microtitulação revestidas com EPO , ou com péptido

-,i Em placas de microtitulação de plástico, acoplaram-se i durante a noite a 4°C em solução tampão de carbonato 20 microgramas/ml de EPO ou de péptidos específicos de EPO. Antes da i: realização do ensaio, lavaram-se as placas por duas vezes com ; PBS e saturaram-se com PBS 0,5% de ESA durante trinta minutos e, em seguida, lavaram-se três vezes com PBS.

j! b) Realização do ensaio de imunidade com Enzimas , Incubaram-se as placas saturadas com ESA durante duas horas com diluições de anti-soros de coelho anti-EPO ou fracções de anticorpos purificados. Depois de decorrido este tempo, la) vou-se com PBS e incubou-se durante duas horas com anti-soro de í Ig anti-coelho, que se acoplou com fosfatase alcalina. Em sej guida, lavou-se duas vezes com PBS, depois por duas vezes com j i ' Tris-HCl 0,2 B, pH 9,5 e, em seguida, durante um curto intervalo de tempo, com Tris-HCl 1 M de pH 9,5. Depois de uma hora, interrompeu-se a reacção com NaOH 1 M e mediu-se a densidade óptica a 405 nm.

I

c) Realização de mancha de Western i

! Separaram-se padrões de EPO por electroforese em gel de poliacrilamida e transferiram-se para nitrocelulose (Towbin í e col., Proc. Natl, Acad Sei. USA 76 (1979), 4350 - 4354),. Sa!

) p turaram-se os filtros com PBS contendo 0,5% de BSA e, em segui!' da, incubaram-se com os anticorpos durante a noite. Seguidamente, lavaram-se os filtros por três vezes com PBS e incubaram'l

-se com fosfatase alcalina conjugada com anti-soro de Ig anti/ -coelho durante duas horas. Depois de se lavar por três vezes i| jí com PBS, se lavar uma vez com Tris-HCl 0,2 molar, pH 9,5 e de H uma curta lavagem com Tris-HCl 1 M de pH 9,5, desenvolveram-se as manchas com azul de cloreto de 4-nitro-tetrazólio hidratado (500 microgramas/mililitro) e sal de p-toluidínio de 5-bromo!í -4-cloro-indoxil-f osf ato (200 microgramas/ml) em Tris-HCl 1M, ! pH 9,5. Ao fim de vinte minutos, interrompeu-se a reacção com ^! água.

-II Exemplo 6 i I i Preparação de adsorventes de imunidade com anticorpos

Acoplaram-se 20 até 50 mg de anticorpos purificados por cromatografia por afinidade de acordo com uma maneira de proceder usual (Axen e col., Nature 214 (1967), 1302) com Sepha : rose activada com bromociano e processou-se como se descreveu

H | no Exemplo 3.

ί!

I i ! I í Exemplo 7 ) Purificação de eritropoietina por cromatografia de afinidade ’ Submeteram-se adsorventes de imunidade que continham anticorpos específicos de EPO como se descreveu anteriormente , a purificação de EPO e muteínas de EPO por cromatografia de afi ' nidade.

!

Exemplo 8

Preparação de anticorpos monoclonais

Para a preparação de anticorpos monoclonais, empregou , -se como antigene EPO obtida recombinantemente, assim como os | péptidos acima descritos. Os péptidos foram previamente acopla ) · dos a KLH (hemocianina de limpete chave).

Imunizaram-se ratos da estirpe Balb/c (do sexo femini i no) intraperitonial ou subcutaneamente com 10 microgramas e relí forçou-se a imunização durante várias semanas. Imediatamente ! antes da fusão propriamente dita, reforçaram-se intravenosamente os animais de ensaio durante quatro dias a seguir uns aos outros por via intravenosa.

No dia da fusão, retiraram-se os baços em condições ,| esterilizadas e suspenderam-se de maneira a obterem-se células I individuais. Por fusão de 10 células de baço com 2 x 10 células de uma linha de células de mieloma (SP 2/0), produziram-se células híbridas que, em seguida, foram utilizadas como • !^! • sementeira num meio de selecção (DMEM = meio essencial mínimo

'i de Dulbecco) + 20% de FKS (soro de feto de vitela); 0,1 mM de 'l ' !; hipoxantina; 0,4 mM de aminopterina; 16 mM de timidina) em plai! cas com vinte e quatro reentrâncias (Costar), com uma concentraí! ção de 10⁶ por reentrância. Duas a três semanas mais tarde, !' isolaram-se as colónias de células individuais das reentrâncias ! e transferiram-se respectivamente para uma nova reentrância de novas placas de cultura (24 reentrâncias, Costar). Depois de ί;

mais dois a três dias, submeteram-se estes sobrenadantes das culturas a um ensaio de imunidade com enzimas relativamente à : existência de anticorpos anti-EPO. Os híbridos que produziram ; anticorpos específicos foram seleccionados e clonados com o ί auxílio de um manipulador de células únicas.

'i'i Exemplo S í!

ij Preparação e detecção de anticorpos anti-idiotípicos i Para a imunização, empregaram-se anticorpos monoclonais ii ! simples com a especificidade pretendida contra EPO/péptido de : EPO. Em vez do anticorpo completo, acoplou-se o fragmento Fab' com 3SA ou com KLH e injectaram-se intraperitonial ou subcutaneamente ratos da estirpe fâalb/c do sexo feminino em CFA (auxii! liar completo de Freund). A preparação posterior dos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos corresponde ao processo que se descreveu no Exemplo 8.

Os sobrenadantes da cultura foram conjugados num ensaio de imunidade com enzimas com utilização do anticorpo de imunização com peroxidase (POD) sobre os anticorpos anti-idiotípicos existentes e estes foram ensaiados num posterior ensaio de imunidade com enzimas relativamente à sua capacidade de inibição do antigene. Os híbridos que produziram anticorpos anti-idiotípicos suseeptíveis de inibirem antigenes foram selaccionados e clonados com o auxílio de um manipulador de célula única.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lê ίί i

' Processo para a preparação de péptidos EPO ‘ de eritropoietina, que possuem essencialmente as posições de : aminoácidos 1 a 35 (P4), 7 a 23 (P4/1), 44 a 78 (P3), 52 a 63 !l (P3/1), 74 a 109 (Pl), 84 a 95 (P/l), 93 a 137 (P5), 110 a 123 (P5/1), 142 a 166 (P2) ou 152 a 166 (P2/1) que correspondem à _Ί numeração das posições de aminoácidos de EPO natural, ! caracterizado por i a) se acoplarem os correspondentes aminoácidos, respectivamente ί protegidos a uma matriz, passo a passo e, depois do último passo da reacção, se eliminarem os grupos de protecção das cadeias laterais e os péptidos da matriz; ou

b) se prepararem os péptidos por tecnologia genética; ou

c) se separar química ou enzimaticamente a EPO obtida naturalmente ou por tecnologia genética.

- 2ã ; Processo de acordo com a reivindicação 1, ; caracterizado pelo facto de os péptidos de EPO obtidos serem de origem sintética.

; Processo de acordo com as reivindicações 1 :'ou 2, caracterizado pelo facto de os péptidos de EPO obtidos ‘ possuírem as seguintes sequências de aminoácidos:

Pl VLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLL;

_;i Pl/1 SSQPWEPLQLHV;

Ί P3 NEMITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEA;

' P3/1 KRMEVGQQAVEV;

P4 APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSL;

.! P4/1 CDSRVLERYLLEAKEAE;

J P5 LHVDKAVSGLRSLTTLLRALRAQKEAISPPDAASAAPLRTITADT; ou P5/1 RALRAQKEAISPPD.

I j ii - 4ê Processo de acordo com as reivindicações 1

I ou 2, caracterizado pelo facto de os péptidos de EPO obtidos possuirem as seguintes sequências de aminoácidos:

P2 FRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR; ou . i ’ ^!i P2/1 KLKLYTGEACRTGDR.

J } í; - 5ã I; i' ' Processo para a preparação de anticorpos !j anti-EPO específicos do epítopo, caracterizado por se acoplarem ; os péptidos de EPO obtidos de acordo com as reivindicações 1 a ' 4 a uma proteína de suporte, se imunizarem mamíferos com o cinjugado obtido e se recuperarem os anticorpos de maneira em si conhecida.

·: - 6â i¹

Processo de acordo com a reivindicação 5, j I· caracterizado por se recuperar anticorpos policlonais a partir i! do soro dos mamíferos imunizados.

- 7ã í Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por, para a preparação de anticorpos monoclonais, se fundirem células de baço dos mamíferos imunizados com células j de mieloma e se recuperarem os anticorpos monoclonais produzidos i pelas células de híbridoma obtidas.

- 8ã Processo de acordo com uma das reivindica20 ções 5 a 7, caracterizado pelo facto de os anticorpos anti-EPO específicos do epítopo obtidos neutralizarem a actividade biológica de EPO.

- 9â Processo para a preparação de anticorpos anti-idiotípicos contra a região de ligação de anticorpos que neutralizam EPO obtidos de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se imunizarem mamíferos com estes anticorpos e se recuperarem os anticorpos anti-idiotípicos a partir do soro.

- 10ã Processo para a purificação de EPO, derivados de EPO ou péptidos de EPO, caracterizado pelo facto de se ligarem os anticorpos anti-EPO específicos do epítopo obtidos de acordo com uma das reivindicações 5 a 8 a materiais de suporte apropriados para a cromatografia, se adsorverem as substâncias a purificar aos suportes e se eluir.