PT85567B - Anticorpos monoclonais e peptidos apropriados para o tratamento e o diagnostico de infeccoes provocadas por hiv - Google Patents

Description

ANTICORPOS MONOCLONAIS E PÉPTIDOS APROPRIADOS PARA O TRATAMENTO Ε O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES PROVOCADAS POR HIV'·

ÂMBITO TÉCNICO

A presente invenção descreve,genericamente, um processo de diagnóstico, tratamento e prevenção de infecções a vírus. Mais particularmente, a invenção proporciona coiaposiçoes e métodos para a preparação de anti-corpos monoclonais e péptidos apropriados para o diagnóstico, neutralização e vacinação contra as infecções provocadas pelo vírus de imunodeficiência humana (HIV).

antecedentes da invenção

O agente infeccioso responsável pelo síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) e pelas suas fases prodrómicas, complexo associado à SIDA (ARG) e sindroma de linfadenopatia (LAS), é um novo retrovírus linfotrópico. 0 vírus tem sido designado diversificadamente por LAV, HTLV-III, ARV, e mais recentemente por HIV.

Uma vez que a propagação do HIV atinge proporções pandémicas, o tratamento de indivíduos infectados e a prevenção da transmissão para indivíduos não afectados em risco de exposição, assume a máxima importância. Há diversas

estratégias terapêuticas que visara estádios diferentes do ciclo de vida do vírus e que foram descritas por Mitsuya e Broder em 1987, Nature; 325; p. 773. Uma abordagem implica a utilização de anti-corpos que se ligara ao vírus e inibem a duplicação vírica quer por interferência com a entrada do vírus nas células do hospedeiro quer por algum outro mecanis. mo. Uma vez identificados o(s) componente(s) víricos susceptíveis de intervenção por anti-corpos, é de esperar que se possam produzir quantidades de anti-corpos suficientes para neutralizar a contagiosidade do vírus por vacinação ou, em alternativa, por administração passiva de imunoglobulinas ou anti-corpos monoclonais com a especificidade desejada.

Admite-se que as glicoproteínas envolventes da maior parte dos retrovírus com as moléculas receptoras sobre a superfície de células susceptíveis, determinando, deste mo do, a contagiosidade do vírus para alguns hospedeiros. Os an ti-corpos que se ligam às glicoproteínas podem bloquear a interacção do vírus com as células receptoras, neutralizando a contagiosidade do vírus. Ver genericamente, The Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J. Tooze, ed., 1973) © RNÃ Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss e outros, eds., 1982) aqui incorporada na sua globalidade como referência. Ver também Gonzalez Scarano e outros, 1982, Virology 120:42 (La Crosse Virus); Matsuno e Inouye, 1983, Infect, Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); e Mathews e outros, 1982, J. Immunol., 129:2763 (Encephalomyelitis Virus).

A estrutura geral do HIV é a de um núcleo de ribonucleoproteína, rodeado por uma envolvente que contem lípi. dos que o vírus adquire durante o decurso do desenvolvimento

a, partir da. membrana da célula do hospedeiro infectado, Embu tidas no interior da envolvente e projectando-se para o exterior estão glicoproteínas víricas codificadas. As glicopro^ teínas envolventes do HIV são sintetizadas inicialmente na célula infectada sob a forma de uma molécula percursora de 150 000-160 000 daltons (gpl50 ou gpl60), a qual sofre depois um processamento na célula proporcionando um fragmento de terminação N de 110 000-120 000 daltons (gpllO ou gpl20), para gerar a glicoproteína externa e um fragmento de terminação C de 41 000-46 000 daltons (gp41), 0 qual representa a glicoproteína envolvente da transmembrana.

Pelas razões anteriormente apresentadas, a glicç; proteína gpllO do HIV tem sido objecto de intensa investigação com um objectivo potencial de interrupção do ciclo de vi da do vírus. Demonstrou-se que 0 soro de indivíduos com HIV neutraliza o HIV in vitro e os anti-corpos que se ligam à gpllO purificada estão presentes no soro. Hobert-Guroff e outros, 1985, Nature 316:72; Weiss e outros, 1935, Nature 316:69; e Mathews e outros, 1986, Proc. Natl, Acad. Sei. U.S.A,, 83:9709. A gpllO recombinante e purificada estimula a produção de anti-corpos do soro neutralizantes quando utilizada para imunizar animais. /ílobey e outros, 1986, Proc. Natl, Acad. Sei. U.S.A., 83:7023; Lasky e outros, 1986, Scienee 233:209; e um ser humano, Zagury e outros, 1986, Nature 326:249/. Também se demonstrou a ligação da molécula gpllO ao receptor CD4 (T4) e demonstrou-se que os anti-corpos monoclonais que reconhecem certos epitopes do receptor CD4 bloqueiam a ligação de HIV, a formação de sincício e a contagiosidade. McDougal e outros; Science¹» 231; 1986, p. 382.

lutney e outros; «Scienoe»; 234; 1986, p. 1392) conseguiram neutralizar anti-corpos do soro em animais, após a imunização com uma proteína de fusão recombinante contendo a metade de terminação carboxilo da molécula gpllO e além disso demons traram que a glicosilação da proteína envolvente não é necessária para que haja uma resposta dos anti-corpos de neutralização.

Deste modo pode ser desejável uma vacina parcial para a SIDA utilizando a molécula gpllO do HIV ou parte dela. As ' vacinas parciais sao uma alternativa às vacinas pre paradas a partir de vírus inactivos ou atenuados. As vacinas inactivas são uma fonte de preocupação devido à possibilidade de fracasso ao pretender-se matar todas as partículas víricas e os vírus atenuados podem possuir a capacidade de mutação e podem retomar a sua aptidão para provocarem a doença. Com as vacinas parciais, apenas se utilizam as porções do vírus que contêm os antigenes ou os epitopes que são susceptíveis de promover respostas imunes, isto é, anti-corpos de neutralização, ADCC, e resposta da célula T citotóxica, no sentido de imunizar o hospedeiro. Uma vantagem, fundamental das vacinas parciais reside no facto de se excluir o material vírico irrelevante.

As sub-unidades víricas para utilização numa vacina podem gerar-se por diversos métodos. A título de exemplo, pode fazer-se a expressão e a purificação da glicoproteína en volvente a partir de um hospedeiro bacteriano, embora esta molécula perca a maior parte das modificações pós-translaCção (tais como a glicosilação) ou outros processamentos. Tal modificação pode obter-se utilizando um sistema de exoressão

eucariótica tal como levedura ou células de mamífero em cultura. Os genes víricos têm sido introduzidos nas células dos mamíferos utilizando o vírus da vacina como vector. Ver por exemplo, Mackett, LI., e outros, 1982, Proc. Nat, Acad. Sei. USA 79;7415; Panicali, D. e Paoletti, E., 1982, Proc. Nat. Acad, Sei. USA 79:4927« 0 vírus de vacina recombinante pode construir-se de acordo com o método de Hu e outros, Nature 320:537 (1986) ou Chakrabarti e outros, Nature 320:535 (1986), apresentando-se ambos aqui como referência. Nestes sistemas as glicoproteínas víricas produzidas pelas células infectadas com vacina recombinante sao glicosiladas adequadamente e podem transportar-se para a superfície das células para extrusão e isolamento final.

Um passo importante na produção de uma vacina parcial é a purificação adequada da glicoproteína desejada a partir da mistura complexa do sistema de expressão. Podem utilizar-se diversos métodos para se conseguir a purificação. Estes englobam, sem contudo ficarem limitados, a electroforese de gel de poliacrilamida preliminar, a cromatografia de impregnação de gel e diversos métodos de cromatografia (isto é, permuta de iões, fase inversa, imuno-afinidade, interaeção hidrofóbica) e outros. A maior parte destes métodos utilizam-se em combinações diversas para se conseguirem preparações essencialmente puras (Kleid, D.G·., e outros, 1981, Science 214:1125; Cabradilla, C.D. e outros, 1986, Biotechnplogy 4 : 128, Dowbenko, D. J,, 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:7748) aqui apresentados como referência.

Para a preparação de vacinas parciais são necessários métodos que possam reduzir o número de passos necessá

rios para se obter uma purificação máxima de um antigene vírica particular, a mártir de uma mistura de expressão comple xa. A separação eficaz dos .-mtigenes em relação aos componen. tes estranhos pode efectuar-se utilizando a cromatografia de imuno-afinidade. Esta técnica, também conhecida co ,o imuno-adsorçao, consiste no princípio da adsorção selectiva de um antigene a um suporte sólido ao qual se ligou covalentemente um anti-corpo específico. Depois faz-se a eluição do antigene adsorvido selectivamente s partir de tal adsorvente com afinidade para o anti-corpo variando, por exemplo, o pH e/ou a potência iónica do tampão.

Os snti-corpos policlonais obtidos partir de animais imunizados con o antigene desej .do ou a partir de indivíduos infectados nstur^lmente (ver por exemplo, Lssky e outros, supra), têm sido utilizados frequentemente como imuno-adsorventes, mas em ger?JL estes reagentes apresentam desvantagens essenciais tais como (i) nem todos os anti-corpos ligados ao suporte insolúvel são específicos para a molécula com interesse, necessitando de purificação adicional; (ii) os rendimentos de produção do antigene desejado são fre quentemente baixos e (iii) as afinidades dos mti-corpos variam com frequência de uma preparação para a outra, exigindo modificações nos procedimentos de eluição. A utilização de .anti-corpos monoclonais específicos parp o antigene vírico desejado que se pretende utilizar na preparação da vacina parcial, em vez dos .uiti-corpos ooliclonais, poderá rodear estas dificuldades.

Descrevem-se já anti-coroos monoclonais murinos

que ligam os antigenes de HIV. Alguns grupos descreveram anti-corpos monoclonais específicos para a proteína p25 do nú cleo (ver por exemplo, di Marzo Veronese, e outros, 1985,

Proc, Nat, Acad. Sei. USA 82*5199 e Chassagne, J., e outros, 1986, J« Immunol, 136:1442). Também se descreveram anti-corpos monoclonais específicos para a membrana da glicoproteína gp41 (ver por exemplo, di Marzo Veronese, e outros, 1985, Science 229:1402).

Nesta especialidade continua a existir a neces sidade de anti-corpos monoclonais específicos para epitopes em regiões bem definidas da glicoproteína envolvente principal, gpllO. Os anticorpos monoclonais que ligam estas regiões e provocam uma, redução ou a eliminação da replicação e da transmissibilidade do HIV possuirão uma utilidade profilá tica e terapêutica importante. Além disso, os anti-corpos mo noclonais também podem ser úteis para purificar a região desejada. da gpllO dos vírus fendidos ou de sistemas de expressão recombinante para utilização em vacinas, por exemplo. Além disso, a região que contém o(s) epitope(s) reconhecido(s) pelos anticorpos monoclonais pode ser sintetizada quimicamente, evitando por isso as dificuldades inerentes è purificação e à administração de fragmentos maiores da molécula de gpllO. A presente invenção satisfaz estes e outros requisitos relacionados.

RESUMO DA INVENÇÃO

Proporcionam-se péptidos susceptíveis de imitar imunologicamente os epitopes de neutralização de proteínas de HIV, sondas de ácido nucleico que codificam tais péptidos

- 8 anti-corpos monoclonais que reagem com tais péptidos, e

bem assim outros péptidos que interferem com a contagiosida de do HIV. Por exemplo, estes materiais novos encontram aplicação nos ensaios de diagnóstico para a detecção de infecções a HIV e em regimes terapêuticos para o tratamento ou vacina ção contra tais infecções.

DESCRIÇÃO DOS ASPECTOS ESPECÍFICOS

A presente invenção proporciona novas composições e métodos para a neutralização de infecções por HIV, isto é, métodos para evitar ou inibir significativamente a formaçao ou a transmissão celular de infecções a HIV num hospedeiro. Mais especificamente, os péptidos que simulam uma região de neutralização de HIV e anti-corpos monoclonais que reagem com tal região, utilizam-se para o diagnóstico, tratamento e vacinação contra as infecções a HIV. Deste modo, o termo região de neutralização” significa as porções de HIV, particularmente as proteínas de HIV, que contêm segmentos de amino ácido que definem um ou vários epitopes que reagem com anti-corpos os quais, quer individualmente quer em combinação com outros anti-corpos da presente invenção, são susceptíveis de neutralizar as infecções a HIV. Os ensaios adequados para a neutralização são bem conhecidos e podem englobar a redução de infecções a HIV em linhas de células T, redução de unidades de formaçao de placas de pseudo-tipos de VSV(HIV) que suportam as glicoproteínas envolventes de HIV, ensaios de inibição de sincício e ensaios de ligação virião-receptor. Conforme desejado, a actividade de neutralização pode comparar-se à reactividade dos anti-corpos nos ensaios imuno-químicos, tais como o ensaio de imuno-fluorescência, imuno-marcação e

radio-imuno-precipitação.

Num dos seus aspectos, os novos péptidos, tipicamente menos do que 50 amino-ácidos aproximadamente, contêm cinco ou mais amino-ácidos contíguos que formam epitopes es sencialmente semelhantes aos epitopes localizados nas regi ões de neutralização da gpllO ou p25 do HIV, codificadas pelas regiões env e gag, respectivamente, do genoma de HIV. São de particular interesse as regiões que se estendem desde próximo do resíduo 301 de amino-ácido até próximo do 336 da gpllO e desde o 278 até ao 319 aproximadamente e desde o 315 até ao 363 do p25 aproximadamente, todos do grupo HIV designa do por LAVg^y. As designações dos resíduos de amino-ácidos são do banco de dados de Los Alamos (banco de dados da sequên cia de vírus da SIDA, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).

Os especialistas na matéria verificarão que se podem identificar regiões análogas adicionais (homólogas”) a partir de outros isolados de HIV com base na sua localização em proteínas associadas de diversos isolados. Na prática, tais homólogos podem identificar-se por referência aos dados da sequência ΒΑνθ^ conforme se seguei (a) As sequências do amino-ácido dos isolados de HIV e de I«4V_BSU podem alinhai—se para se obter uma horaologia máxima entre as duas sequências;

(b) Os péptidos que englobam as sequências de amino-ácido dos isolados de HIV correspondentes à localização dos péptidos de LAV^^ que simulam imunologicamente as oroteínas de BAV^^, podem ser identificados. Os péptidos que

- 10 englobam as sequências do amino-ácido do isolado de HIV identificados deste modo imitarão imunologicamente as proteínas do isolado de HIV corresaondentes.

Este método pode aplicar-se às estirões de HIV que ainda não se descobriram. Por exemplo, à medida que se identificam novas estirpes de HIV, é possível alinhar as sequências do amino-ácido do núcleo e da envolvente, com a de lAVg_Ru P^{ara se} obter homologia máxima. Os métodos segundo os quais se faz o alinhamento das sequências sao conhecidos pelos especialistas na matéria. Ao alinharem-se as sequências é desejável manter a máxima homologia possível entre os resíduos de cisteína. A sequência de amino-ácido das novas espécies ou estirpes de HIV que corresponde, à localização dos péjo tidos aqui especificamente descritos, pode sintetizar-se e utilizar-se, de acordo com a presente invenção.

Scharf e outros, Science¹¹ (1986) 233:1076, descrevem outro método para a determinação das sequências de uma região homóloga em outras estirpes de HIV. Este utiliza dois sistemas iniciadores de oligonucleotido que se ligam a sequências conservadas fora da região de sequência com interesse, e contêm locais de restrição diferentes em cada sistema iniciador. Seguidamente o ADN das estirpes de HIV pode ser amplificado in vitro e os oligonucleotidos resultantes podem ser clonados em vectores para análise sequencial e incorporados numa vacina como uma bolsa representando um epitope particular da estirpe de HIV.

Para a presente invenção nao é necessário que os epitopes contidos em tais sequências efectuem reacções cru zadas com os anti-corpos de todas as estirpes ou espécies de

VΗIV. Os péptidos que englobam epitopes imunológicos que distinguem uma espécie ou serogrupo de outra, encontrarão aplicação na identificação de espécies ou serogrupos particulares e podem efectivamente auxiliar e identificação de indivíduos infectados com uma ou várias espécies ou serogrupos de HIV. Também podem ser úteis em combinação com outros péptidos, quer de uma região homóloga quer de outra região de neutralização, em composições terapêuticas.

Os péptidos com interesse derivarão, preferencial mente, da região gpllO do vírus. Nesta região, são de particular interesse os péptidos codificados no quadro de leitura aberto env que se estende desde o par de base (pb) 6667 até ao 6774 aproximadamente, do isolado de Ι^νθ-^. Deste modo, diversas regiões homólogas de outros isolados de HIV englobam as sequências homólogas obtidas no banco de dados de Los Alamos (excepto o LAV2), conforme apresentado na Tabela I.

tabela 1

hXB2

BH102

BH3

HXB 3

H9M

BRU

MAL

ELI

ARV2

WMJ2 RFEMV

Z6

Z3

NY5

CDC42

LAV2

TGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGA......... CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg......... ------------------------------Ser--------------------------------------Ly_S--------------------------------------Lys--------------------------------------Ser--------------------------------------Ser--------------------Gly-------------ArgGly-----------Ala------TyrGln---------Gin-----------------------------------------Ser--------------------Ty_r------Val---ArgSer---------------------------------------S_ar--------------------TyrLys---------GlnSer---------------------GlySerAspLysLysIle------------------------------------Lys---Gly---------------------------His------------ValThrLeu ------------Gl_y---Lys---Val---Gin---------ATCCGTATG

IleArglle

--------HisPhe -----ThrPro----------_Tyr-------LeuSer----------ThrLys -----ThrPro------GlnSer----------Ala------MetLeu

309

309

309

309

309

314

314

310

312

306

322

311

306

304

320

302

HXB 2 CAGAGA.........GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATG

GlnArg.........GlyProGlyArgAlaPheValThrlleGlyLysIleGlyAsnMet 326

BH102 326

BH3 326

HXB3 326

H9M 326

BRU 331

MAL ------------------------Gin---LeuTyr---Thr---IleVal---Asplle 329

ELI GlyLeu------------... GlnSerLeuTyrThr---Arg---IleValSerArgSer 323

ARV2 ------ His---Thr---Arg---IleGlyAsp327

WMJ2 ------ Arg---ArgGlu...---IleGlylle320

RrENV---------------------------VallleTyrAlaThr---Gin---IleGlyAsp337

Z6 GlyLeu------------...GlnAlaLeuTyrThr Arg---ArgThrLysIlelle 327

Z3 Arglle------------------LysVal TyrAlaLys---Gly 319

NY5 GlyPro------------...------ThrLeuTyrAlaArgGlu---------Asplle 320

CDC42 ............... ValTrpTyr---Thr---Glu---LeuGlyAsn 335

LAV2 MetSer------------------HisVal---HisSerHisTyrGlnProIle---Lys 323

HXB2 ...AGA...CAAGCACATTGT

...Arg...GlnAlaHisCys 331

EH102 331

BH3 331

HXB3 331

H9M 331

BRU 336

MAL ---------Arg---Tyr--- 334 tLl IlelleGly330

ARV2 Ile---Lys...333

WMJ2 Ile326

RFENV Ile---Lys...343

Z6 Gly...334

Z3 IleThrGly326

NY5 325

CDC42 Ile341

LAV2 ArgProArg------Met330

- 13 Os outros péptidos adequados para gerar ou

para efectuar o rastreiro de anti-corpos monoclonais são os codificados no quadro de leitura aberta env desde o pb 7246 até cerca de 7317 do LÀV_BSU·. Tais anti-corpos e péptidos reactivos sao particularmente úteis nos ensaios imunológicos.

Na região gag do elemento isolado as sequências de amino-ácido p25 desde 278 até 319 e desde 315 até 363 são regiões adicionais de neutralização de HIV. Os especialistas na matéria verificarão que as regiões de neutralização adicionais do HIV se podem identificar com ba se nos conhecimentos aqui apresentados; em particular, as combinações de nti-corpos monoclonais que reagem com diversos epitopes diferentes de HIV apresentarão actividade neu tral iz adora.

péptido I, também designado por péptido 29, está codificado no quadro de leitura aberta env desde os resíduos do amino-ácido com os números 308 até cerca de 328 e apresentam a seguinte sequência de amino-ácido, em que os oligopéptidos abrangidos pela sequência seguinte englobam epitopes lineares em tal sequência.:

I (29)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-GlyIro-Gly-Arg-Ala-lhe-Val-Thr-Ile-Gly-IysIle-Y· na qual Y e Y', quando presentes, representam sequências até vinte amino-ácidos aproximadamente. Quando Y e/ou Y’ estão presentes, estes podem englobar, por exemplo, um ou mais amino-ácidos das sequências que orlam os resíduos de amino-áci- 14 dos desde 308 até 328 da sequência envolvente de HIV, ou qual

quer porção destas sequências laterais. A título de exemplo e sem carácter limitativo, Y pode englobar a totalidade ou porções da sequência de amino-ácido envolvente de IDkVggjj desde os números de resíduo 301 até 307 aproximadamente; e Y’ pode englobar a totalidade ou porções da sequência de amino-ácido envolvente de desde os números de resíduo 329 até 336 aproximadamente, conforme se segues

II (29a)

Oys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Iys-S er-IleArg-Il e-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Al a-Ph.e-Val-ThrIle-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

Em alternativa, podem preparar-se sequências truncadas de péptidos da presente invenção. Tomando isto em consideração, as sequências seguintes do péptido 29 Pjo dem ser particularmente úteis:

III (29b)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-GlyY» nas quais Y e/ou Y', quando presentes, representam, cada um, sequências até cerca de 20 resíduos de aminoácido.

IV (29c)

Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-ThrIle-Gly-Lys-Ile-Y’ em que Y e Y’, quando presentes, incluem, cada um, uma se quência com até cerca de 20 resíduos de aminoácidos.

-15Noutro aspecto, as regiões homólogas do elemento isolado ARV-2, de particular interesse, estão codificadas no quadro de leitura aberta env desde os resíduos de aminoácidos com os números 306 até 323 aproximadamente e apre sentam, tipicamente, a seguinte sequência de aminoácidos, em que os oligopéptidos abrangidos pela seguinte sequência de aminoácidos englobam epitopes lineares em tal sequências

V (177)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-rro-Gly-ArgA1a-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y' em que Y e Y’, quando presentes, incluem, cada um, uma sequência com até 20 ou mais resíduos de aminoácidos. Quando Y e/ou Y* estão presentes, podem englobar um ou vários resíduos de aminoácidos das sequências que orlam os resíduos de aminoácidos desde 306 até 323 da sequência envolvente de ARV-2, ou qualquer porção destas sequências laterais. Em par ticular, Y pode englobar a totalidade ou porções da sequência de aminoácido envolvente de HIV desde 0 resíduo com 0 número 299 até ao 3O6 aproximadamente; Y* pode englobar a totalidade ou porções da sequência de aminoácido envolvente de HIV desde 0 resíduo com o número 324 até ao 333 aproximadamente.

Em alternativa, podem preparar-se sequências truncadas do pêptido V. Tomando isto em consideração, as sequências seguintes podem ser particularmente úteis:

- 16 2*

VI (177a)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Iro-Gly-Y'; e

VII

Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-leu-Gly-ProAla-Ala-Thr-L eu-Glu-Glu-Iíorleu-Norleu-Thr-Al aCys-Y’ em que Y e/ou Y’, quando presentes, incluem, cada um, uma sequência com até 20 ou mais resíduos de aminoácidos.

Um exemplo adicional engloba as regiões homó Iogas do elemento isolado de LÀV-2, tal como codificado no quadro de leitura aberto env desde os resíduos de aminoácidos com os números 311 até 330 aproximadamente, e apresenta.rá tipicamente a sequência seguinte:

VIII (110-2-2)

Y-Iiys-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-ValPhe-His-Ser-Hi s-Tyr-Gln-Pro-Y’ em que Y e/ou Y’, quando presentes, incluem, cada um, uma sequência com até 20 ou mais resíduos de aminoácidos, (Ver: «Nature^H: 326; (1987), p. 662, aqui apresentado como referên cia).

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporcionam-se novas linhas de células susceptíveis de produzir anti-corpos monoclonais e composições que englobam tais anti-corpos, podendo os referidos anti-corpos reconhecer selectivamente, para quantidades extremamente el£ vadas (desde 10 até entre 10 e 10 ou mais), regiões de neutralização contidas numa sequência pré-determinada da glj. coproteína envolvente gpllO ou p25, os respectivos percurso res de proteína, proteínas de fusão recombinante de expres- 6 ” sao biológica e péptidos sintéticos que contêm um ou vários epitopes na região de sequência pré-determinada de gpllO ou p25. As células híbridas em questão, possuem um cromossoma identificável, no qual o ADN da linha celular assume um rearranjo para codificar um anti-corpo que possui um local de ligação a um epitope no gpllO ou no p25, comuns a alguns ou a todos os cUnicamente isolados de HIV. Estes anti-corpos monoclonais podem utilizar-se numa ampla diversidade de processos incluindo o diagnóstico e a terapêutica e também servem para identificar outros anti-corpos de reacções cruzadas, tais como os anti-corpos de bloqueio. Os péptidos ou polipéptidos que contenham o(s) epitope(s) com os quais reagem, podem encontrar utilizações separadas como imunogenes para vacinas ou como agentes terapêuticos.

PÉPTIDOS DE BLOQUEIO

Destinando-se fundamentalmente a serem utilizados em conjunto com os péptidos anteriores ou com os anti-coroos monoclonais de neutralização, um outro aspecto da presente invenção consiste na utilização de péptidos adicionais ou anti-corpos que interfiram com a ligação do HIV aos receptores para atenuar ainda mais a contagiosidade do HIV. De preferência, os chamados péptidos de bloqueio susceptíveis de inibirem a proliferação do vírus, assim como os anticorpos monoclonais específicos para os epitopes contidos em tais péptidos de bloqueio, podem utilizar-se para aumentar a eficiência dos tratamentos contra as infecçoes de HIV. Os péo tidos de bloqueio de HIV correspondem, tipicamente, às sequên cias de aminoácidos de HIV, que se pensa serem essenciais pa- / ra a ligação do vírus a uma célula do hospedeiro, tais como os resíduos de aminoácido codificados na região env com os números desde 190 até cerca de

de 185 até cerca de 192 de ASV2 e de HTIiV-III (BH-10). Estes péotidos englobam o péptido octapéptido T (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) e os seus diversos derivados (_Por exemplo, IX seguinte) e análogos (por- exemplo, XI seguinte) descritos por Pert e outros (1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83;

p. 9254-9258, aqui apresentado como referência) localizados na glicoproteína envolvente (gpllO ou 120).

Por exemplo, os péptidos de bloqueio que possuem as sequências seguintes, sao de particular interesse de preferência com acetilação terminal de NEL, e amidação terminal de COOH:

IX (1730)

Y-^Ala-S er-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y';

X(186)

Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y’;

XI(187)

Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y’;

XII(188)

Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y';

XIII(189)

Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y’;

XIV(190)

Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y’;

XV(191)

Y-Ala-Val-Phe-Thr-As p-Asn-Tyr-Thr-Y';

em que cada péptido, Y e Y', quando presentes, inclui uma se-

- 19 quência de aminoácidos com até cerca de 20 aminoácidos. Os determinantes antigénicos ou epitopes no interior destes péptidos definem-se, normalmente por pelo menos cinco aminoácidos contíguos, e utilizam-se, por exemplo, para imitar os locais antigénicos de HIV que ocorrem naturalmente para a produção de anti-corpos que reagem ao HIV e para a produção de vacinas.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCIONAIS

A preparação de anticorpos monoclonais pode efectuar-se perpetuando a expressão das sequências do ácido nucleíco que codificam os anticorpos específicos para o HIV, por introdução de tais sequências, que normalmente codificam o cDNA para o anticorpo, num hospedeiro susceptível de proporcionar uma cultura. A linha de células perpetuada pode ser uma linha de células de um mamífero que tenha sido transformada por oncogénese, por transfecçao, mutação ou por outro processo semelhante. Tais células englobam as linhas de mieloma, linhas de linfoma ou outras linhas de células susceptíveis de suportarem a expressão e a secreção do anticorpo in vitro. 0 anticorpo pode ser uma imunoglobulina de ocorrência natural de um mamífero, produzida por transformação de um linfócito, particularmente um esplenócito, por meio de um vírus ou por fusão do linfócito com uma célula neoplásica, por exemplo, um mieloma, para proporcionar uma linha de células híbridas. Normalmente, o esplenócito será obtido a partir de um animal imunizado contra o vírus de HIV ou a partir de um seu fragmento que contenha um local epitópico.

Os protocolos de imunização sao bem conheci

- 20 dos e podem variar amplamente sem perderem eficácia. Ver

Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 2a. edição (1986), aqui indicada como referência. Os vírus fendidos, os péptidos sintéticos e as proteínas de fusão bacteriana que contenham fragmentos antigé nicos do gpllO ou da molécula p25, podem utilizar-se como imunogenes. De preferência o imunogene do vírus fendido, dos péptidos ou das proteínas recombinantes serão enriquecidos para proteínas ou para os respectivos fragmentos que conte nham os epitopes para os quais se pretendam os esplenócitos ou as células B que produzem anticorpos. Mais particularmente, as soluções que contenham lisatos ou extractos de vírus fendidos ou sobrenadantes de proteínas recombinantes de expressão biológica ou vectores de expressão fendida, podem ser enriquecidos para glicoproteínas, conforme desejado, utilizando métodos de purificação tais como, por exemplo, electroforese de gel de poliacrilamida. A purificação por afinidade da lectina é um método preferencial e conveniente para a purificação de gpllO e de outras glicoproteínas, por exemplo, purificação por afinidade utilizando lectina de lentilhas. 0 grau de purificação das glicoproteínas a partir de soluções para utilização como imunogenes poda variar amplamente, isto é, desde menos do que 50%, normalmente entre 75% e 95%, desejavelmente entre 95% e 99% e ainda mais desejavelmente com uma homogeneidade absoluta.

Assim que as proteínas tiverem sido purificadas até ao grau pretendido, pode fazer-se com elas uma suspensão ou podem diluir-se num veículo fisiológico apropriado para a imunização ou podem ligar-se a um adjuvante. Por exem

pio, uma técnica preferencial implica a adsorção de proteínas e dos respectivos fragmentos em agarose de lectina de lentilhas ou em outros veículos macro moleculares para, injecções. As quantidades imunogénicas de preparações antigénicas enriquecidas em proteínas de HIV, incluindo a glicoproteína gpllO e a proteína do núcleo p25 ou as respectivas porções antigénicas, injectam-se geralmente em concentrações que variam desde 1 pg até 20 mg/kg de hospedeiro. A administração pode ser por injecção, por exemplo, intramuscular, peritoneal, subcutânea, intravenosa, etc. A administração pode ser numa única dose ou em vezes remetidas, normalmente com intervalos entre 1 e 4 semanas. Os animais imunizados sao sujeitos a controlo relativo à produção de anticorpos dos antigenes desejados, depois removem-se os baços, isolam-se os linfócitos B esplénicos e fundem-se com uma linha de células de mieloma ou transformam-se. A transformação ou fusão pode efectuar-se de acordo com diversos processos convencionais, estando a técnica de fusão descrita em diversas patentes, por exemplo, e.g., 4.172.124; 4.350.683; 4.363-799; 4.381.292; e 4.423.147. Ver também, Kennett e outros, Honoclonal Antibodies (1980; apresentados como referência, e Goding, supra.

As linhas de células perpetuadas podem ser clonadas e rastreadas de acordo com técnicas convencionais e podem detectar-se anticorpos nos sobrenadantes de células que sejam susceptíveis de ligação às desejadas proteínas víricas de HIV gpllO ou p25, às proteínas de fusão recombinante ou aos péptidos sintéticos que contenham a região epitópica desejada. As adequadas linhas de células perpetuadas podem desenvolver-se depois in vitro ou podem injectar-se na

ί cavidade peritoneal de um hospedeiro apropriado para a produção de fluido da ascite. Devido ao facto de possuírem alguns anticorpos da presente invenção, que são específicos para os epitopes contidos por exeimlo no interior das regiões codificadas pela região genómica desde bp 6688 até bp675O (pêptido 29 de codificação) ou desde bp7246 até bp7317 (pêptido 36 de codificação) (a numeração de bp estando de acordo com tfain-Hobson e outros, ^HCell; 44» 1985, p. 9, aqui indicada como referência), é possível fazer o rastreio dos sobrenadantes em competição com os anticorpos monoclonais em questão num ensaio concorrente. Deste modo, as linhas de células de hibridoma adicionais perpetuadas com as desejadas características de ligaçao, podem produzir-se facilmente a partir de uma diversidade de fontes baseadas na disponibilidade dos actuais anticorpos específicos para o antigene particular. Em alternativa, estas linhas de células podem ser fundidas com outras células B neoplásicas, sempre que essas células B possam servir como recipiente para o ADN genómico que codifica o anticorpo.

Apesar de serem preferíveis as células B neoplásicas dos roedores, particularmente dos murinos, podem utilizar-se outras espécies de mamíferos tais como os lagomorfos, bovinos, ovinos, equinos, porcinos, aves ou animais semelhantes. A imunização destes animais pode efectuar-se facilmente e os seus linfócitos, particularmente os esplenócitos, podem ser obtidos para as fusões.

Os anticorpos monoclonais segregados pelas linhas de células híbridas ou transformadas podem ser de qual quer das classes ou sub-classes de imunoglobulinas, tais como

- 23 / (

IgM, IgD, Igà, ou IgE. Uma vez que IgG é o isotipo * mais comum utilizado nos ensaios de diagnóstico, é frequentemente preferido. Os anticorpos monoclonais podem utilizar-se intactos, ou como fragmentos tais como Fv, Fab, F(ab')₂» -^Qas normalmente utilizam-se intactos.

Para tornear a possível acção antigénica num hospedeiro humano de um anticorpo monoclonal derivado de outro animal diferente do homem, podem construir-se anticorpos heteroplásticos em que o fragmento de ligação do antigene de | uma molécula de imunoglobulina (região variável) se liga por uma ligação péptido, a parte de outra proteína nao reconhecida como estranha pelo corpo humano, tal como uma porção rejeitada de uma molécula de imunoglobulina humana. Isto pode efectuar-se fazendo a fusão dos exoes da região animal variável com os exões da região constante gama ou capa humans. Os especialistas conhecem diversas técnicas como as descritas em PCT 86/01533, PE171496, e PE173494, aqui apresentadas como referência.

Formulações Farmacêuticas e Sua Utilização

Os anticorpos monoclonais da presente invenção que exibem actividade de neutralização, tais como os que reagem com um local epitópico em gpllO ou em p25 ou que reagem com um péptido de bloqueio, também podem ser incorporados como componentes de composições farmacêuticas para atenuar as infecçoes a HIV, Ã composição deverá conter uma quantidade terapêutica ou profilática de pelo menos um dos anticorpos monoclonais da presente invenção, cora um veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico. Um veículo farmacêu-

tico deverá ser qualquer substância compatível, nao tóxica, adequada para transportar· os anticorpos monoclonais até ao doente. Podem utilizar-se como veículos água esterilizada, álcool, ceras, gorduras e sólidos inertes. Também se podem incorporar adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico (agentes tampão, agentes de dispersão) na composição farmacêutica. Tais composições podem conter um anticorpo monoclonal único que seja, por exemjlo, específico para as estirpes de HIV com glicoproteínas envolventes que contenham um local epitópico numa região codificada por bp6688-bp6750. Em alternativa, uma composição farmacêutica pode conter um ou vários anticorpos monoclonais para formar um •'coktail'·. Por exemnlo, uma mistura que contenha anticorpos monoclonais, contra as diversas estirpes de HIV seria um produto universal com actividade terapêutica ou profilática contra a grande maioria dos elementos isolados clinicamente de HIV. Λ mistura pode conter anticorpos monoclonais que se ligam às proteínas ou glicoproteínas de HIV, diferentes de gpllO ou p25, tais como, por exemplo, a glicoproteína gp41 ou a integrase/ nuclease p34. A proporção molar dos diversos componentes de anticorpos monoclonais não diferirá normalmente de mais do que um factor 10, mais correntemente de um factor inferior a 5 e estará frequentemente numa proporção molar compreendida entre 1:1-2 para cada um dos outros componentes de anticorpo.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem utilizar-se como composições administradas separadamente aplicadas em conjunto com outros agentes anti-retrovíricos, incluindo os péptidos de bloqueio. 0 estado corrent í te do desenvolvimento de agentes anti-retrovíricos, e em particular de agentes anti-HIV, está descrito por Mitsuya e outros; Nature”; 325; 1987, p. 773-778, aqui indicado como referência.

Os anticorpos monoclonais, péptidos e respectivas composições farmacêuticas da presente invenção são particularmente úteis para administraçao oral ou parentérica. De preferência as composições farmacêuticas podem administrar-se parentericamente, isto é, subcutânea, intramuscular ou intravenosamente. Deste modo, a presente invenção proporciona composições para administração parentérica constituídas por uma solução de anticorpo monoclonal, xíotido ou uma mistura dos dois dissolvida num veículo aceitável, de preferência um veículo aquoso. Pode utilizar-se uma diversidade de veículos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e veículos semelhantes. Estas soluções sao esterilizadas e geralmente livres de partículas ínfimas de matéria. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. Estas composições podem conter substâncias auxiliares aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, conforme necessário para adaptar as condições fisiológicas tais como os agentes para ajustar o pH e para tamponar, agentes para ajustar a toxicidade e agentes semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração de anticorpos nestas formulações pode variar amplamente, isto é, normalmente desde cerca de 0,5% ou mais usualmente desde cerca de 1% até 15 ou 20% em peso, fazendo-se a escolha princi-

paimente com viscosidades e volumes dos fluidos, etc, de preferência para o modo particular de administração seleccionado.

Deste modo, pode preparar-se uma composição farmacêutica típica para injecção intramuscular que contenha 1 ml de água tamponada e esterilizada e 50 mg do anticorpo mo noclonal. Pode preparar-se uma composição típica para infusão intravenosa que contenha 250 ml de solução de Ringer esterili zada e 150 mg do anticorpo monoclonal. Os métodos actuais para a preparação de composições administráveis parentericamente serão conhecidos ou evidentes para os especialistas na matéria e vêm descritos com mais pormenor em Hemington¹s Pharmaceutical Science; 15a. edição, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), que aqui se indica como referência.

Os anticorpos monoclonais e péptidos da presente invenção podem ser liofilizados para armazenagem e podem ser reconstituídos num veículo adequado antes da utilização, Demonstra-se que esta técnica é eficaz com imunoglobulinas convencionais e podem utilizar-se técnicas de liofilizaçao e de reconstituição conhecidas na especialidade. Faz-se observar aos especialistas na matéria, que a liofilização e a reconstituição podem originar graus variáveis de perda de actividade do anticorpo (por exemplo, com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a apresentar perda de actividade superior à dos anticorpos IgG) pelo que aqueles níveis de utilização poderão ter que ser ajustados para compensação.

As composições que contêm os anticorpos mo /

- 27/noclonais da presente invenção, péptidos ou as suas misturas, podem administrar-se para o tratamento profilático e/ou terapêutico de infecções de HIV. Nas aplicações terapêuticas admi nistram-se as composições a doentes já infectados com HIV, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente a infecç.ao e as suas complicações. Uma quantidade adequada para conseguir este objectivo define-se como uma dose eficaz sob o ponto de vista farmacêutico. As quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da infecção e do estado geral do sistema imunológico do próprio doente, mas variarão geralmente entre cerca de 1 e cerca de 20 mg de anticorpo por kilograma de peso do corpo, sendo mais frequentemente utilizadas doses compreendidas entre 5 e 25 mg por kilograma. Deve ficar-se bem consciente de que os materiais da presente invenção podem utilizar-se geralmente em esta dos de doença grave, isto é, situações de perigo de vida ou de potencial perigo de vida. Em tais casos, é possível e pode ser desejado pelo médico assistente administrar excessos subs tanciais destes anticorpos.

Nas aplicações profiláticas, as composições que contêm os presentes péptidos, anticorpos ou uma mistura dos dois administram-se em doentes que não tenham ainda sido infectados pelo HIV, mas que talvez tenham sido expostos recentemente ou se admita terem sido expostos ou em risco de vir a ser expostos ao vírus, no sentido de aumentar a resistência dos doentes a uma tal infecção potencial ou para os vacinar contra o vírus. A quantidade aplicada define-se como dose profilaticamente eficaz. Para esta utilização, as quantidades exactas dependem também do estado de saúde dos

- 28// doentes e do nível geral de imunidade, mas variam geralmcnte ¹ entre 0,1 mg e 25 mg por kilograma, especialmente entre 0,5 mg e 2,5 mg por kilograma.

Aá administrações simples ou múltiplas das composições podem efectuar-se com níveis e modelos de dosagem seleccionados pelo médico assistente. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas deverão proporcionar uma quantidade de anticorpos da presente invenção suficiente para tratar efi cazmente os doentes.

Além disso, os anticorpos monoclonais da pre, sente invenção podem utilizar-se como molécula veicular específica para um alvo. Um anticorpo pode ligar-se a uma toxina para formar uma imunotoxina ou um material radioactivo ou um fármaco no sentido de constituir um produto farmacêutico ou radiofarmacêutico. Os métodos para a preparação de imunotoxinas e de produtos radiofarmacêuticos são bem conhecidos (ver por exemplo Câncer Treatment Reports; 68;(1984), p. 317).

Também é possível que os heteroagregados de anticorpos monoclonais da presente invenção e activadores das células T humanas, tais como os anticorpos monoclonais para o antigene CD3 ou para o receptor F -gama nas células T possam permitir que as células T humanas ou as células que suportam F -gama (tais como as células K ou os neutrófilos)

C matem as células infectadas com HIV através de anticorpos dependentes de citólise através das células (ADCC). Tais hetero^ agregados podem construir-se, por exemplo, fazendo covalentemente a ligação reticular dos anticorpos anti-HIV aos anticor pos anti-CD3 utilizando o reagente hetero-bifuncional N-succinimidil-3-(2-piridil-ditiol)-propionato, conforme descrito

- 29 por Karpowsky e outros, J. Exp.Med.; 160; (1984), p. 1686,

aqui indicado como referência.

As próprias composições dos péptidos em ques. tão podem também encontrar utilização terapêutica, quando a administração resulta na redução ou eliminação de HIV num ho_s pedeiro infectado. Estas composições, tais como o péptido 29, os péptidos de bloqueio e o péptido 126, o último dos quais está descrito no pedido de Patente pendente U.S.S.N. 930 785, aqui indicado como referência, podem administrar-se em veículos fisiológicos apropriados por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, etc. As diversas substâncias veiculares englobam a solução salina tamponada com fosfato, solução salina, água, cloreto de potássio, lactato de sódio ou produtos semelhantes. A concentração dos péptidos variará amplamente segundo a sua utilização final, actividade e modo de administração. De preferência, os péptidos terão amidação do terminal COOH, formilação da terminal NHg ou outros deriva dos sob o ponto de vista farmacêutico. A adição de péptidos de bloqueio aos péptidos que imitam uma região de neutralização de HIV e/ou aos anti-corpos reactivos específicos da presente invenção, proporcionará uma eficácia terapêutica significativamente acrescida. Também se podem englobar outros agen tes anti-HIV nas formulações (diferentes dos anti-corpos mono clonais que ligam os péotidos) tais como 3’-azido-3’-desoxiti midina, 2',3'-didesoxicitidina, 2',3’-didesoxi-2*,3’-didesidrocitidina, etc.

UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS EM PURIFICAÇÃO POR

IMUNOAFINIDADE

Os anticorpos monoclonais específicos para os polipéptidos que contêm gpllO ou outros determinantes antigénicos, particularmente os determinantes antigénicos obti dos a partir de proteínas de fusão recombinante de expressão biológica ou lisatos ou extractos de HIV em cultura, são par ticularmente vantajosos para utilização em protocolos de purificação. De um modo geral, os anticorpos terão constantes ~ 8 12 de associaçao de afinidade da ordem de 10 a 10 S. Tais an ticorpos podem utilizar-se para purificar as proteínas de fu são recombinante a partir do meio de cultura do sistema de expressão recombinante se a proteína de expressão fôr segregada ou a partir dos componentes do sistema de expressão bio. lógica fendida se não for segregada. De um modo geral, os an ticorpos monoclonais que são susceptíveis de reagir com gp 110 ou com outros determinantes antigénicos ligam-se ou imobilizam-se sobre um substrato ou suporte. Depois faz-se contactar a solução que contem os determinantes antigénicos de HIV com o anticorpo imobilizado sob condições adequadas para a formação de complexos imunológicos entre o anticorpo e os polipéptidos que contêm os determinantes antigénicos de gpllO. 0 material não ligado separa-se dos complexos imunoló gicos ligados, separando-se depois os complexos ou os fragmentos antigénicos de gpllO do suporte.

Normalmente, os anticorpos monoclonais serão purificados grosseiramente a partir do fluido de ascite ou dos sobrenadantes da cultura de células antes de se ligarem

a um suporte. Tais procedimentos são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e podem englobar o fraccionamento com sais neutros em concentração elevada. Também se podem utilizar outros métodos tais como a cromatografia DEAE, a cromatografia por filtração em gel, a electroforese em gel preliminar ou a cromatografia de afinidade com a proteína A, para purificar o anticorpo monoclonal antes da sua utilização como imuno-ads orvent e.

suporte sobre o qual se imobilizam os anti| corpos monoclonais possuem as características gerais seguintes: (a) interacções fracas com as proteínas em geral, para minimizar a ligação nao específica, (b) boas características de fluidez que permitem o fluxo através dos materiais de elevado peso molecular, (c) devem possuir grupos que possam ser activados ou modificados para permitir a ligação química do anticorpo monoclonal, (d) devem ser física e quimicamente estáveis nas condições utilizadas para ligar o anticorpo monoclonal, e (e) devem ser estáveis sob as condições e constituintes dos tampões necessários para adsorção e eluição do antigene. Alguns dos suportes normalmente utilizados são: agarose, derivados dos poliestirenos, polisacáridos, pequenas esferas de poliacrilamida, celulose activada, vidro e produtos semelhantes. Existem diversos métodos químicos para ligação de anticorpos a um substrato ou suporte. Ver genericamente, Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology; 36; (1972), p. 29. Os anticorpos da presente invenção podem ligar-se directamente a um suporte ou, em alternativa, através de um ligante ou espaçador.

As condições gerais necessárias para a imobi-

lização de anticorpos monoclonais em suportes cromatográfi- <

cos são bem conhecidas na especialidade. Ver, por exemplo, Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, 1985 aqui indicado como referência. Os procedimentos actuais de acoplamento dependerão em parte das características e do tipo do anticorpo que se pretende ligar. Os -anticorpos mono cio. nais possuem características que são normalmente consistentes de porção para porção permitindo desse modo que se faça a optimização de tais condições. A ligação ocorre normalmente através de ligações covalentes.

Depois adiciona-se à matriz de separação uma suspensão de extractos ou lisatos do vírus de HIV, o sobrenadante de um sistema de expressão biológica em cultura ou uma suspensão das células fendidas. Faz-se a incubação da mistura em condiçoes e durante □ tempo suficiente para que ocorra a formação do complexo iraunológico, normalmente pelo menos 30 minutos, mais adequadamente entre 2 e 24 horas. Depois separam-se da mistura os complexos imunológicos que con têm os polipéptidos com porções antigénicas de gpllO.

Normalmente remove-se a mistura, por exemplo, por eluiçao, e os complexos imunológicos de ligação lavam-se intensaraente com um tamoão de adsorção. Depois pode fazer-se a eluiçao dos complexos imunológicos a oartir da matriz de separação utilizando um eluente compatível com o suporte particular que se vai utilizar, sendo os referidos eluentes bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Do mesmo modo também se podem remover selectivamente os polipéptidos que contêm o gpllO ou outras porções antigénicas. For exemplo, os péptidos que contêm um epitope reconhecido pelos anticor-

pos podem utilizar-se para competir pelo local de ligação de anticorpo, o que constitui uma técnica de eluição alternativa que pode ser desenvolvida sob condições de eluição suaves, 0 polipéptido adsorvido selectivamente, que contém o antigene gpllO pode eluir-se a partir de um adsorvente com afinidade para o anticorpo por alteração do pH e/ou da potência iónica do tampao. Os agentes caotrópicos também podem encontrar utilização na remoção do antigene ligado. A selecção de um agente caotrÓpico, a sua concentração e outras condições de eluição estão dependentes das características de interacção anticorpo/antigene, mas uma. vez feita a sua determinação nao haverá normalmente alterações necessárias nos sistemas de separação por afinidade policlonal.

material eluido pode exigir ajustamento para um pH fisiológico se se utilizarem tampões de baixo ou alto pH ou de potência iónica para separar da matriz de separação os antigenes gpllO ligados. A diálise ou a cromatografia por filtração em gel também podem ser necessárias para se remover o excesso de sais utilizados no eluente para permitir a reconstituição de gfLIO ou de polipéptidos que contêm fragmentos antigénicos de gpllO segundo conformações naturais.

Os métodos da presente invenção proporcionam por exemplo gpllO bastante purificado ou polipéptidos que con têm os seus fragmentos antigénicos, quer produzidos naturalmente por culturas de células infectadas, quer por sistemas de expressão recombinante de bactérias, levedura, ou de células de insectos ou de mamíferos em cultura. A gpllO e os frag mentos ou outras proteínas purificadas oossuirão normalmente uma pureza superior a 50%, mais normalmente serão pelo menos

- 34 75% puras e frequentemente de pureza compreendida entre 95%

e 99%. Portanto estas moléculas podem encontrar utilização posterior numa ampla variedade de aplicações.

As proteínas gpllO de HIV, os polipéptidos que contêm os seus fragmentos antigénicos ou outras proteínas essencialmente purificadas, de acordo com os métodos da presente invenção, podem encontrar utilização numa ampla variedade de aplicações, incluindo as formulações para vacinas parciais contra a SIDA, em que o imunogene é constituído por uma dose eficaz de determinantes antigénicos cie, por exemplo, gpllO ou uma sua região de neutralização. Os outros componentes da formulação englobarão as porções antigénicas das glicoproteínas ou proteínas de HIV que estimulam a produção de anticorpo (de oreferência anticorpos de neutralização) num hospedeiro imunizado, sendo os referidos anticorpos susceptíveis de proporcionar protecção contra as infecções posteriores a HIV.

Utilizações em Diagnóstico de Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos monoclonais da presente invenção também sao úteis para efeitos de diagnóstico. Com este objectivo podem ser marcados ou não marcados. Normalmente, os ensaios de diagnóstico requerem a detecção da formação de um complexo através da ligação de um anticorpo monoclonal a um antigene de HIV. Quando não são marcados os anticorpos encontram utilização, por exemplo, nos ensaios de aglutinação. Além disso, os anticorpos não marcados podem utilizar-se em combinação com outros anticorpos marcados (segundos anticornos) que reagem com o anticorpo monoclonal, tal como os

- 35 -y anticorpos específicos para a imunoglobulina. Em alternativa, podem marcar-se directamente os anticorpos monoclonais. Pode utilizar-se uma ampla variedade de marcas, tais como radionuclideos, marcas fluorescentes, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inibidores de enzima, moléculas complexas (particularmente os haptenos), etc. Sao possíveis muitos tipos de ensaios imunológicos e, a título de exemplo, referem-se os descritos nas patentes de invenção americanas n?s. 3.317.327; 3.350.752; 3-901.554; 3.935.974; 3.984.533;

3.996.345; 4.034.074; e 4.O9Ô.376, aqui apresentados como referência.

Normalmente, os anticorpos monoclonais e os péptidos da presente invenção utilizam-se em imunoensaios de enzima, em que, por exemplo os anticorpos em questão ou os segundos anticornos de espécies diferentes se conjugam com um enzima. Quando uma amostra biológica contendo antigenes de HIV, tal como o soro do sangue humano, a saliva, o sémen, as secreções vaginais ou uma suspensão de cultura de células infectadas pelos vírus se combina com os anticorpos em questão, a ligação ocorre entre os anticorpos e as moléculas que apresentam o epitope desejado. Tais proteínas ou partículas víricas podem separar-se depois dos reagentes não ligados e adiciona-se um segundo anticorpo (marcado com um enzima). Seguidamente determina-se a presença do anticorpo/enzima combinado, especificamente ligado ao antigene. Também se podem utilizar outras técnicas convencionais bem conhecidas pelos especialistas na matéria.

Também se podem fornecer conjuntos para utilização com os anticorpos em questão na detecçao de infecções

- 36 a HIV ou para a detecçao da presença do antigene de HIV.

te modo, as referidas composições de anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser fornecidas, normalmente na for ma liofilizada, quer isoladas quer em conjunto com anticorpos adicionais específicos para outros epitopes de HIV. Os anticorpos, que podem estar ou nao combinados com uma marca, embalam-se em estojos com tampões, tais como tris-fosfatos e carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por exemplo albumina do soro de bovino, ou produtos semelhantes. De um modo geral, estes materiais estarão presentes numa quantidade inferior a 5$ em peso, calculado com base na quantidade de anticorpo activo e normalmente estarão presentes numa quantidade total inferior a pelo menos cerca de 0,001$ em peso calculado também com base na concentração de anticorpos. Frequentemente será conveniente incluir un agente de expansão ou excipiente inerte para diluir os ingredientes activos, podendo o excipiente estar presente numa quantidade compreendida entre cerca de 1$ a 99$ em peso relativamente à composição total. Quando se utiliza um segundo anticorpo susceptível de ligação ao anticorpo monoclonal, normalmente encontrar-se-á colocado num frasco separado. 0 segundo anticorpo é usualmente combinado com uma marca e formulado por um processo análogo ao das formulações de anticorpos atrás descritas.

A detecçao de antigenes de gpllO ou p25 ou o vírus global em diversas amostras biológicas pode ser útil para o diagnóstico de uma infecção corrente provocada pelo vírus de HIV. Sem qualquer limitação as amostras biológicas podem englobar soro do sangue, saliva, sémen, amostras de

- 37 biópsias de tecidos (cérebro, pele, nódulos linfáticos, baço,

etc.) sobrenadantes de culturas de células, eucarióticos fendidos, sistemas de expressão bacteriana e produtos semelhantes. A presença de vírus verifica-se por incubação do anticor po monoclonal com a amostra biológica, em condições que condu zem à formação do complexo imunológico, seguindo-se a detecção da formação ão complexo. Num dos seus aspectos, a formação de complexos detecta-se através da utilização de um segun do anticorpo susceptível de se ligar ao anticorpo monoclonal o qual se combina, normalmente com uma marca e se formula por um processo análogo ao das formulações de anticorpos anterior mente descritas. Noutras circunstâncias, o anticorpo monoclo nal liga-se a um suporte de fase sólida o qual se faz contactar depois com uma amostra biológica. Após um passo de incubação adiciona-se o anticorpo monoclonal marcado para detec tar o antigene ligado.

Preparação e Utilização de Péptidos Sintéticos

A nresente invenção proporciona novos péptidos os quais, inter alia, imitam imunologicamente os epitopes de proteína codificados pelo retrovírus de HIV, particularmen te os epitopes codificados nas regiões env ou gag do genoma virai que codifica gpllO ou p25, respectivamente. Para harmonizar as variações de estirpe para estirpe entre diferentes isolados, podem fazer-se ajustamentos para substituições de conservação e selecção entre as alternativas em que estejam implicadas substituições não conservadoras. Estes péptidos podem utilizar-se como imunogenes para inibir ou eliminar a produção do antigene de HIV in vitro ou in vivo, para a de- 38 tecção do vírus ou de anticorpos do vírus numa amostra fisio

lógica. Conforme a natureza do protocolo, pode combinar-se os péptidos com um veículo ou com outros compostos, marcados ou não marcados, ligados a uma superfície sólida, ou semelhante.

Nalguns casos, os péptidos com interesse, derivarão da região gpllO do vírus, Ê de particular interesse a região no interior do quadro de leitura aberto env que se es. tende desde o par de base (pb) 6688 até ao pb675O aproximadamente e desde pb7246 até pb7317.

Os péptidos com interesse, incluindo os péptidos de bloqueio, englobarão pelo menos cinco, por vezes seis, por vezes oito, por vezes doze, por vezes vinte e um, normalmente menos do que cinquenta, mais frequentemente menos do que trinta e cinco, e preferencialmente menos do que vinte e cinco aminoácidos incluídos numa sequência codifica da por um retrovírus de HIV. Desejavelmente, o pêptido será tão pequeno quanto possível devendo contudo manter fundamen talmente toda a imuno-reactividade ou actividade antivírica do pêptido maior. Em alguns casos pode ser desejável unir dois ou vários oligopéptidos que não estejam em sobreposição para formar uma estrutura de pêptido única ou para os utilizar como péptidos individuais ao mesmo tempo, os quais separadamente ou em conjunto proporcionam uma sensibilidade equivalente à original, pêptido pode modificar-se por introdução de substituições de conservação ou de não conservação, permutando-se normalmente menos do que 20%, mais frequentemente menos do que 10% de aminoácidos. Nessas situações, em que se constata que as regiões são polimórficas, pode ser desejável

- 39 variar um ou. vários aminoácidos particulares para imitar mais

eficazmente os diferentes epitopes das diferentes estirpes retrovíricas. Em muitos casos, para proporcionar estabilidade química, pode substituir-se a metionina por norleucina (Nor).

Deve subentender-se que o pêptido utilizado na presente invenção não precisa de ser idêntico a qualquer sequência de polipéptido de HIV particular, desde que o composto em questão seja susceptível de proporcionar competição imunológica. com proteínas de nelo menos uma das estirpes do retrovírus de HIV. Por isso, o pêptido referido pode ser sujeito a diversas alterações, tais como inserções, anulações e substituições, quer de conservação quer de não conservação, sempre que tais alterações possam proporcionar algumas vantagens na sua utilização. Por susbtituiçÕes de conservação pretende-se significar as substituições abrangidas por grupos tais como gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; e nor, met. Normalmente a sequência não diferirá mais do que 20$ da sequência de pelo menos uma estirpe de um retrovírus de HIV, excepto quando se adicionem aminoácidos em ambas as terminações com o objectivo de propor cionar um braço através do qual o pêptido da presente inven ção pode ser convenientemente imobilizado. Os braços terão um comprimento de pelo menos um aminoácido e podem ter cinquenta ou mais aminoácidos, mais frequentemente entre 1 e 10 aminoácidos.

pêptido em que se modifica a sequência de aminoácido por substituição, adição ou anulação de resíduos de aminoácido deverá reter essencialmente toda a imuno-reactividade ou activida.de antivírica dos péj.tidos não modifica40 / dos qual se pode medir apropriadamente por diversas técni-

cas de ensaio aqui descritas. Pode utilizar-se a forma de isó mero-ã de um ou de vários aminoácidos, conforme desejado, para se modificar propriedades biológicas tais como a activi dade, taxa de decomposição química, etc.

Além disso, pode adicionar-se 1,2, ou vários aminoácidos à terminação de um oligopéptido ou péptido para facilitar a ligação dos péptidos uns aos outros, para permitir a acoplação a um suporte ou a um péptido maior, para satisfação das razoes que se apresentam mais adiante, para modificação das propriedades físicas ou químicas do péptido ou do oligopéptido, ou de produtos semelhantes.

Aminoácidos tais como tirosina, cisteina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico ou ácidos semelhantes, podem ser introduzidos na terminação C ou N do péptido ou do oligopéptido, para proporcionar uma funcionalidade útil para ligação. A cisteina é particularmente preferida para facilitar a ligação covalente a outros péptidos ou para formar polímeros por oxidação..

Além disso, as sequências de péptidos ou de oligopéptidos podem diferir da sequência natural por esta ter eido modificada por acilação do NEL·, terminal, por exemplo, acetiLa ção ou amidaçao do ácido tio-glicólico, amidação do terminal carboxi, por exemplo, com amoníaco ou com metilamina, no sentido de proporcionar estabilidade e de aumentar as propriedades hidrofóbicas para ligação ou união a um suporte ou a outra molécula ou para polimerização.

Deste modo, por exemplo, nos péptidos I-VIII e IX-XV atrás descritos, quando Y ou Y’ estão presentes, exis- 41 te uma representação preferencial sempre que Y ou Y' i

englo- * bam ou um vários radicais de cisteína ou uma combinação de um ou vários radicais de cisteína com aminoácidos espaçado res. A glicina é um espaçador particularmente preferido. Os péptidos preferenciais para utilização na polimerização oxidante sao aqueles em que Y ou Y' representam, pelo menos, dois radicais de cisteína. Quando estão presentes dois radicais de cisteína na mesma extremidade do péptido, existem condições preferenciais quando os radicais de cisteína estão separados por um a três radicais de aminoácidos espaçadores, de preferência a glicina. A presença de radicais de cisteína pode permitir a formação de dímeros de um péptido e/ou aumen tar as propriedades hidrofóbicas do péptido resultante, o que facilita a mobilização do péptido em sistemas de ensaio imobilizados ou na fase sólida.

de particular interesse a utilização do grupo mercaptano das cisteínas ou dos ácidos tioglicólicos utiliza dos para fazer a acilação dos grupos amino terminais ou de grupos equivalentes, para ligar dois dos péptidos ou oligopéptidos ou as suas combinações, com uma união de dissulfureto ou com uma união maior para formar polímeros que contenham diversos epitopes. Tais oolímeros têm a vantagem de pos. suir uma maior reacção imunológica. Quando se utilizam péptidos diferentes para preparar o polímero, estes possuem a possibilidade adicional de induzir anticorpos que reagem imunologicamente com diversos determinantes antigénicos de diferentes isolados de HIV.

Para conseguir a formação de polímeros antigénicos (multímeros sintéticos), podem utilizar-se compostos

que possuam grupos, bis-halogenoacetilo, nitroarilhalogenetos, ou grupos semelhantes, em que os reagentes são específicos para os grupos tio. Deste modo, a união entre dois grupos mercapto de péptidos ou oligopéptidos diferentes pode ser uma ligação simples ou um grupo de união de pelo menos dois, normalmente pelo menos quatro, e nao mais do que 16, frequen— temente nao mais do que 14 átomos de carbono.

péptido em questão pode utilizar-se ligado a um veículo macromolecular (por exemplo, não inferior a 5kDal) solúvel. E conveniente que 0 veículo seja um poli-aminoácido, de ocorrência natural ou sintético, para 0 qual seja improvável encontrar anticorpos no sorohumano. São exemnlos de tais veículos: poli-L-lisina, hemocianina de moluscos, tiroglobulina, albuminas, tais como e albulina do soro de bovino, anatóxina do tétano, etc.

A escolha do veículo está fundamentalmente dependente da utilização última pretendida para 0 antigene e da sua conveniência e disponibilidade.

Com tais requisitos, existirá pelo menos uma molécula de pelo menos um dos péptidos referidos por macromolécula e não mais do que um por 0,5 kDal, normalmente não mais do que 1 por 2 kDal da macromolécula. A mesma macromolécula podem estar ligados 1 ou vários péptidos diferentes.

processo de ligação é convencional utilizando-se reagentes tais como ácido p-maleimidobenzóico, ácido p-metilditiobenzóico, anidrido do ácido maleico, anidrido do ácido succínico, glutaraldeído, etc. A ligação pode ocorrer na terminação N, na terminação C ou num local intermédio entre as extremidades da molécula. 0 péptido em questão pode

ser derivado de uma união, pode unir-se apesar de estar ligado a um suporte ou a um grupo semelhante.

Podem utilizar-se diversos protocolos de ensaio familiares aos especialistas da matéria, para detecção da pre sença quer de anticorpos para as proteínas retrovíricas quer das próprias proteínas retrovíricas. S de particular interesse a utilização do pêptido como reagente marcado, quando a marca proporciona um sinal detectável ou como pêptido de ligação, quer directa quer indirecta à superfície, onde o anticorpo do pêptido na amostra ficará ligado ao pêptido na súper fície. Deste modo, pode detectar-se a presença de anticorpos humanos ligados ao pêptido utilizando um anticorpo xenogénico específico para a imunoglobulina humana, normalmente as duas IgM e IgG humanas ou uma proteína marcada, específica para os complexos imunológicos, por exemplo, o factor Sf da proteína A de S. aureus.

Uma técnica de ensaio ilustrativa, consiste na utilização de um recipiente de amostras, por exemplo, reservatórios de placas de micro-orifícios, onde o polipéptido em questão ou as suas misturas sao adsorvidas pelo fundo e/ou pelas paredes do recipiente quer de modo covalente quer não covalente. Adiciona-se a amostra, normalmente sangue humano ou soro diluído num meio adequadamente tamponado, ao recipiente e deixa-se que decorra o tempo suficiente para a formação do complexo entre o(s) polipéptido(s) e quaisquer anticorpos com a mesma origem na amostra. Elimina-se a parte sobrenadante e lava-se o recipiente para eliminar as proteínas ligadas não especificamente. Para a detecção utiliza-se uma proteína de ligação específica marcada, a qual se liga espe

cificamente ao complexo, tal como anti-soro xenogénico para

a. imunoglobulina 'humana.

péptido pode preparar-se segundo uma ampla di versidade de processos. Devido às suas dimensões relativamen te pequenas pode sintetizar-se o péptido numa solução ou num suporte sólido, de acordo com técnicas convencionais. Actual mente existem disponíveis no mercado diversos sintetizadores automáticos os quais se podem utilizar de acordo com protocjo los conhecidos. Ver por exemplo, Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. edição, Pierce Chemical Co, 1984, e Tam e outros, »J« Am. Chem. Soe,»; 105; (1983), p. 6442.

Em alternativa, pode utilizar-se a tecnologia.

do ADN híbrido quando se pode preparar um gene sintético por utilização de cordões simples os quais codificam o polipéptido ou os seus cordões essencialmente complementares, em que os cordões simples se sobrepõem e se podem harmonizar em conjunto num meio de fortalecimento de modo a proporcionar a hibridaçao. Os cordões híbridos podem ligar-se depois para formar o gene completo e, por escolha de terminações apropriadas, pode inserir-se o gene em vectores de expressão os quais se obtêm facilmente nos dias de hoje. Ver, por exem plo, Maniatis e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Ou pode fazer-se a clonagem e a expressão da região do genoma vírico que codifica o péptido, de acordo com técnicas convencionais de ADN recombinante (ver Maniatis supra).

As sequências de codificação de ADN a partir de elementos isolados de ίΑνθ^ e de ARV 2 de HIV que se podem

- 45 *· utilizar para expressão dos péptidos são as seguintes:

iavbiw	TGT	ACA	AGA	CCC	AAC	AAC	AAT	ACA	AGA	AAA	AGT
	ATC	CGT	ATC	CAG	AGG	GGA	CCA	GGG	AGA	GCA	TTT
	GTT	ACA	ATA	GGÂ	AAA	ATA	GGA	AAT	ATG	AGA	CAA
	GCA	CAT	TGT
ARV-2	TGT	ACA	AGA	CCC	AAC	AAC	AAT	ACA	AGA	AAA	AGT
	ATC	TAT	ATA	GGA	CCA	GGG	AGA	GI«A	TTT	CAT	ACA
	ACA	GGA	AGA	ATA	ATA	GGA	GAT	ATA	AGA	AAA	GCA

CAT TGT

Podem utilizar-se fragmentos de uma sequência para expressão de fragemntos de péptido, podem fazer-se alterações de base conservadora, em que os cordões modificados codificam os mesmos aminoácidos ou podem fazer-se alterações não conservadoras na sequência de codificação, em que o aminoácido resultante pode ser uma alteração conservadora ou nao conservadora na sequência de aminoácido, conforme se referiu anteriormente.

A sequência de codificação pode prolongar-se até à terminação 5' ou 3’ ou até ambas as terminações para alongar o péptido ao mesmo tempo que retém o(s) seu(s) locai(s) epitópico(s). A extensão pode proporcionar ura braço para ligação, por exemplo, a uma marca tal como um enzima, para união a dois ou a todos os péptidos juntos na mesma cadeia, para proporcionar actividade antigénica, para facultar locais de restrição convenientes para clonagem ou para, outros efeitos semelhantes.

A própria sequência de ÀDN, os seus fragmentos, ou sequências maiores, normalmente com pelo menos 15 bases,

- 46 -/ preferencialmente com p-elo menos 18 bases, podem ser utilizados como sondas de nucleótido para, a detecção de ARN retrovírica ou para a identificação de regiões homólogas para clonagem ou para sequenciação. Existem numerosas técnicas descritas, tais como a técnica de Grunstein Hogness, a técnica Sul, a técnica ''Norte'·, a técnica ponto-marca e resoectivos melhoramentos, assim como outra, metodologia descrita na patente de invenção americana nâ 4 358 535, aqui apresentada como referência.

Os péptidos da presente invenção, incluindo os péptidos de bloqueio e os seus análogos são úteis por si próprios ou em combinação em vacinas. De modo semelhante, os anticorpos anti-idiotipo, isto é, que reagem com os idiotipos dos anticorpos da presente invenção e por isso contêm epitopes que imitam as regiões de neutralização de HIV, também se podem utilizar em vacinas. Os péptidos ou os anticorpos anti-idiotipo podem formular-se por um processo convenien te, geralmente em concentrações compreendidas entre 1 jag e 20 mg/kg de peso do hospedeiro. Como veículos podem utilizar-se meios fisiologicamente aceitáveis, tais como a água esterilizada, soluções salinas, solução tamponada com fosfato e soluções semelhantes. Podem utilizar-se adjuvantes tais como o gel de hidróxido de alumínio, substâncias tensio-activas tais como lisolecitina, poliois peurónicos, polianiões, péptidos, proteínas (oor exemplo, anatoxina da cólera ou da difteria) e emulsões em óleo. Os péptidos também se podem incorporar em liposomas, ou combinar-se com polis sac áridos, polipéptidos ou polímeros para utilização na formulação de vacinas. A administração pode ser por injecção, por exemplo, intramuscular, peritoneal, subcutânea, intravenosa, etc. A administração de uma dose imunogenicamente eficaz pode realizar-se uma ou diversas vezes, normalmente com intervalos de 1 a 4 semanas. Uma”dose imunogenicamente eficaz é a quantidade de uma vacina susceptível de proporcionar uma resposta imunológica num hospedeiro, quando o hospedeiro apresenta uma grande in fecção.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir das descrições experimentais seguintes, a.s quais apresentam a invenção sob a forma de exemplos. Os exemplos apresentam-se a título ilustrativo e nao têm carácter limitativo.

ΞΙΈΙΣΡΙΟ 1

Preoaracão e caracterização dos anticorpos monoclonais —_ Jlifci· ι·ιι·—mutf ir —rnniTT ! ir 1——-I VMii.iMUMirn—ÍriíMMiiii riim ii ir.iWMin.iJtrtiiWHiici: γτιιγπτ—γτττγτι mimtmrm-nt——^m . exemplo 1 descreve a preparação de linhas de células híbridas que produzem anticorpos monoclonais específicos para as glicoproteínas envolventes do HIV. Este método implica a utilização de extractos purificados de lectina de ^LAVBHU ligados à sgarose de lectina de lentilhas como imunogene. Os anticornos monoclonais gerados posteriormente pelas linhas de células híbridas, caracterizam-se pela sua capacida de para imuno-marcação e precipitação radio-imunológica de gpllO a partir de IAV purificado e como proteína de fusão recombinante de expressão biológica. Os anticorpos monoclonais que se ligam aos epitopes era gpllO também são reactivos em

ELISAs com os vírus globais fendidos, com as proteínas de fusão e com os péntidos sintéticos e reagem com o vírus global

-48-/ / í em ensaios de fluorescência indirecta.

Os protocolos para a preparação de linhas de células híbridas que produzem anticorpos monoclonais e para a caracterização dos anticorpos foram os seguintes.

Os vírus LAV purificados a partir de células CED infectadas (A.T.T.C. N^s. CRL89O4) foram rompidos em 50 mil Tris, oH 7,4; NaCl; 0,15M Aprotinin a 1,0%; Nonidet P-40^ a 2,0% (NJ?-40) (octil-fenoxinolietoxietanol). Purificou-se o extracto duas vezes por centrifugação e ajustou-se para NP-40 s. 0,5% por adição de três volumes de tampao de disrupção de NP-40. Fez-se a pré-lavagem Sefarose (Farmácia, Piscataway, N.J.) de lectina de lentilhas em tampão de disrupção sem NP-40 e depois fez-se o equilíbrio em tampão de adsorçao(Tris 50 mM; pH 7,4; NaCl 0,15 M; Aprotinin a 1,0%; NP-40). 0 extracto vírico purificado foi adsorvido com Sefarose de lectina de lenrs λ* t ilhas durante 24 horas a 4 C. Eliminou-se o material nao adsorvido por lavagem com excesso cio tampão de adsorção. A eluição do material adsorvido efectuou-se com alfa-metil-manosido 0,2 M em um tampão de adsorção. Fez-se a diálise do eluen te contra PBS para se eliminar o açúcar e fez-se nova adsorção do material em Sefarose de lectina de lentilhas.

Utilizou-se o complexo de glicoproteína/Sefarose de lectina de lentilhas para imunizar ratos BALB/C com três injecções intraperitoneais sem adjuvante, administradas com intervalos de 2-3 semanas. Pez-se a remoção dos baços dos ratos imunizados, os quais apresentaram circulação de anticorpos para as glicoproteínas de HIV por imuno-marcação, RIP e/ou ELISA.

De um modo geral os protocolos utilizados pa- 49 / w ra a preparaçao das linhas de células foram os de Kohler e Milstein (Nature^w; 256; (19θ5); P. 495), com as modificações de Goldstein, L-C- e outros, (Infect. Immun.¹¹; 33; (1982) P. 273). Fez-se a fusão dos linfócitos B esplénicos dos ratos imunizados, com células do mieloma NS-1, utilizando polietileno -glicol a 40% (p/v). Após a fusão fez-se nova suspensão da mistura de células em meio de HAT (HHII - meio 1640 comple mentado com soro fetal de vitelga 15%, hipoxantina 1 x 10^, aminopterina 4 x 10^-¾ e timidina 1,6 x 10^--¾) para fazer a selecçao para o crescimento das células híbridas e depois dis tribuiu-se por pratos de microcultura de 96 orifícios numa concentração de 1 a 3 x 10° células por ml e fez-se a incubação a 37°C numa atmosfera húmida contendo 6% de GOg. Fez-se a alimentação das culturas substituindo uma metade da parte sobrenadante do meio de HAT fresco. Fez-se a observação dos reservatórios de cultura utilizando um microscópio invertido p ra verificação dos sinais de proliferação das células e quando estas possuíam uma densidade suficiente fez-se 0 ensaio das partes sobrenadantes para 0 anticorpo anti-LAV.

Os reservatórios contendo as células híbridas que produzem anticorpos para LaV identificaram-se por medição de ELISAs da ligação ao vírus fendido purificado ou às proteínas de fusão por expressão biológica. Os ensaios de ELISA utilizando vírus fendidos efectuaram-se em lâminas LAV EIA (Genetic Systems, Seattle, Washington). Fez-se a incubação das lâminas com fluidos de cultura de células a 37°C durante 45 minutos e depois lavou-se três vezes com Tween 20 a 0,05% em solução salina tamponada com fosfato (PBS-Tween).

Adicionou-se (100 ul por orifício) peroxidase de

- 50 cabra anti-IgG· de rato (diluição 1:2 000 em PBS-Tween; Zymes Laboratories, Inc., South San Francisco, Califórnia) e fez-se a incubação das lâminas durante 45 minutos a 37°C e depois lavou-se conforme atrás referido. Adicionou-se substracto (ácido cítrico 0,025 Mj fosfato de sódio dibásico 0,05 Mj pH 5,0, contendo 14 mg de o_-fenilenodiamina e 10 ^.1 de peróxido de hidrogénio a 30% por 50 ml) e fez-se a incubação das laminas durante 30 minutos ã temperatura ambiente no escuro. Interrompeu-se a reacçao com ácido súlfurico 3N e quantificaram-se as reacções colorimétricas com um leitor de micro-laminas automatizado. Os reservatórios que apresentaram resultados positivos foram subclonados por limitação da diluição e ensaiaram-se novamente para determinar a qualidade e depois expandiu-se.

Depois fez-se a. caracterização da qualidade e da reactividade dos anticorpos monoclonais segregados pelas linhas de células híbridas resultantes, por imuno-marcação, imuno-precipitação e ELISA, utilizando vírus LAV fendidos, proteínas de fusão de LAV recombinante e péptidos de LAV sintéticos. Verificou-se que todos os anticorpos eram do isotipo IgG₁. As linhas de células HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2, e HIV-gpllO-3 foram depositadas nas American Type Culture Collection antes de se fazer este pedido de patente e tomaram a designação A.T.C.C. N2s. HB 9175, BB 9176, e HB 9177, respectivamente.

As proteínas de fusão recombinantes ensaiadas no que respeita à. sua reactividade tinham assumido anteriormente as designações ENV2, ENV3, ENV4 e ENV5. Faz-se a expreis são da proteína ENV2 a partir de pEITV2 (A.T.C.C. N2. 53071),

ί a qual é uma região de 1AV desde o par de base (pb) 6598 até pb 7178 (numeração de acordo com Wain-Hobson e outros, Cell¹¹; 44; 0.985), p. 9);faz-se a expressão de ENV3 a partir de pENV3 (A.T.C.C, N^. 53072), a qual é constituída pela região de LAV desde pb 7178 até pb 7698; faz-se a expressão de ENV4 a partir de pENV4 (A.T.C.C. NS. 53073), desde pb 7698 até pb 8572; e faz-se a expressão de ENV5 a partir de pENV5 (A.T.C.C.

N2. 53074), a qual é constituída pela região de LAV desde pb 5889 até pb 7698. A produção de proteínas de fusão recombinante está descrita com pormenor no pedido de patente pen dente dos Estados Unidos com 0 número de série 721 237, que aqui se indica como referência.

Preparação de péptidos sintéticos

Pez-se a preparação dos péptidos I (29) e VIII (110-2-2) numa resina de benzidrilamina (poliestireno/divinilbenzeno) (Apolied Biosystems, Inc., Póster City, Califórnia), Pez-se a preparação do péptido V (177) numa resina de t-butiloxicarbonil (Boc)-etilbcnzilcisteína-fenilacetamidometilo (PAíi) (poliestireno/divinilbenzeno). As acoplações de anidrido simétricas efectuaram-se num sintetizador Applied Biosystems 4-3O”. Adicionou-se cisteína ao primeiro radical de ambos os péptidos.

Utilizaram-se ligações diciclohexilcarbodiimida na presença de hidroxilbenzotriazol para a asparagina e a glutamina. Utilizou-se a protecção de cadeia lateral baseada em benzilo e a protecção Boc alfa-amina. Outra protecção de cadeia lateral utilizada correntemente foi Boc (formilo) trig tofano, Boc sufóxido de metionina, Boc (tosilo)-arginina, Boc

- 52 -/ (

(metilbenzilo)-cisteína, Boc (tosilo)-histidina, Boc (clorobenziloxicarbonilo)-lisina e Boc (bromobenziloxicarbonil)-tirosina.

Os péptidos foram radio-identifiçados por aceti. laçao da terminação amino com ácido acético ^H e excesso de diciclohexilcarbocLiimida.

A desprotecção e clivagem do pêptido a partir da resina efectu.ou.-se de acordo com o protocolo HF de Tam baixo-alto (Tam e outros, supra). A extracção a partir da resina efectuou-se com ácido acético a 5% e submeteu-se o extracto a cromatografia de filtração em gel com ácido acético a 5%. Os péptidos de HIV sintéticos ensaiados relativamente h sua reactividade com os anticorpos monoclonais foram os péptidos 29, 36 e 39. 0 pêptido 29 está codificado pela região genómica de Ι,Ανθ^ desde aproximadamente pb 6688 até pb 6750; o pêptido 36 está codificado pela região desde pb 7246 até pb 7317; ® o pêptido 39 está codificado pela região desde pb 7516 até pb 7593 aoroximadamente. Os péptidos 36 e 39 estão descritos com pormenor na patente de invenção americana 4 629 7θ3, a qual se indica aqui como referência.

Os péptidos de bloqueio IX-XV preparam-se essen cialmente conforme anteriormente descrito numa resina de metilbenzidrilamina (poliestireno/divinilbenzeno) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Califórnia). As ligações de ani drido simétricas efectuaram-se com um sintetizador Applied Biosystems 430A. Utilizaram-se ligações diciclohexilcarbodiimida na presença de hidroxilbenzotriazol para a asparagina. Utilizou-se para a protecção cadeias laterais baseadas em ben

- 53 -/

R—.— / ·» zilo e protecção Boc alfa-amina ao mesmo tempo que se utilizou Boc (bromo-benzil-oxi-carbonilo) especificamente para as cadeias laterais de tirosina. A acetilaçao, quando presente, efectuou-se utilizando anidrido acético ou ácido acético gla ciai e diciclohexilcarbodiimida. A desprotecção e a clivagem do péptido a partir da resina efectuou-se de acordo com o protocolo normalizado HF ”alto (Stewart e outros, supra). A extracção a partir da resina efectuou-se com ácido acético a 50% e posteriormente submeteu-se o extracto a cromatografia de filtração em gel com ácido acético a 20%. Conforme pretendido, efectuou-se a cromatografia líquida de alto rendimento numa coluna Vydac Cl 8 (Sainin Instrument Co., Emeryville, CA) utilizando ácido trifluoroacético a 0,1% em gradiente de acetonitrilo.

Imuno-marc ação

A caracterização por imuno-marcação efectuou-se em clones sobrenadantes ou em fluído de ascite utilizando o vírus de LÀV purificado e as proteínas de fusão recombinante como antigenes, Primeiro fez-se a separação dos antigenes por electroforese em gel com gradiente de poliacrilamida (7,0 - 15,0%) e fez-se a transferência para uma membrana de nitrocelulose (líNC) por electroforese durante 4 horas a 25 V era fosfato de sódio 25 mui (pH 7,0). Após a transferência, bloqueou-se a uIIC para evitar interacçoes não específicas oor incubação em PBS-Tween ou Blotto (leite em pó não gordo a 5% em PBS), durante 1 hora h temperatura ambiente. Fez-se a incubação da ívTJC cora a parte sobrenadante da cultura de células ou fluido de ascite diluído em PBS-Tween durante 1 ho-

ra à temperatura ambiente e lavou-se três vezes com PBS-Tween. No segundo passo fez-se a incubação da «ÍNC com peroxidase de cabra (rábano) de anti-IgG do rato diluída em PBS-Tween durante 1 hora à temperatura ambiente. A seguir à incubação fez-se a lavagem com PBS-Tween e depois fez-se a imersão em peroxida.se de rábano em solução para revelação de côr (Bio-Rad laboratories, Richmond, Califórnia) durante 20 minutos. Interrompeu-se a reacção por imersão em água desionizada. Comparou-se a reactividade dos anticorpos monoclonais com um soro de controlo positivo que reagiu com vírus fendidos purificados ou com proteínas extraídas oor fusão. Os resultados demonstraram que todos os anticorpos se ligaram à gpllO e è sua molécula percursora gpl50, utilizando preparações de vírus fendidos. Os anticorpos 110-1 e 110-2 também reconheceram a proteína de fusão EW3, tendo em consideração os anti-corpos 110-3, 110-4, 110-5 e 110-6 do imuno-complexo ENV2.

Imuno-precipitação

Prepararam-se os extractos víricos para precipitação radio-imunológica a partir de células CEM infectadas com o elemento isolado LAV^y de HIV adaptado ao crescimento lítico por passagem contínua. Quando os efeitos citopáti cos prematuros se tornaram evidentes, fez-se a transferência das células para o meio de identificação contendo nina (0,05 mCi/ml) ou ^/H^-glucosamina (0,025 mCi/ml), e depois fez-se a incubação durante 24 horas até que a maioria das células ficou ligada, libertando o vírus na parte sobrenadante da cultura. Fez-se uma massa de vírus (1 hora a

100 000 xg) a partir da parte sobrenadante livre de células

- 55 e prepararam-se extractos detergentes em um tampão P-RIPA (solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 1,0$, desoxicolato a 1$, 3D3 a 0,1$ e Aprotinin a 1$), Pez. -se a preparação de extractos idênticos a partir das partes sobrenadantes de células CEM não infectadas.

Os ensaios de imunoprecipitação efectuaram-se com 100 p.1 de extracto de vírus incubado com 100 pl da parte sobrenadante da cultura, a partir de linhas de células híbri. das, durante 1 hora em gelo. A cada amostra adicionou-se 4 pl de anti-Ig de rato em coelho (Zymed Laboratories, So. San Francisco, Califórnia) e fez-se a incubação durante 30 minutos. A cada amostra adicionou-se nuva suspensão de imuno-ore. cipitina (100 ja.1; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, .Jaryland) em tampão de P-RIPA contendo ovalbumina a 1,0$ θ fez-se a incubação durante mais 30 minutos. Fez-se a lavagem dos complexos ligados e separaram-se por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (acrilamida a 15,0%í gel de DATD).

A seguir à electroforese fez-se a fixação dos geles, embebeu-se em Enhance (Ilew England Nuclear, Boston, ΓΑ), secou-se e expôs-se à película Kodak ZR-5. Fez-se reagir um soro positivo de referência que fez a imuno-precipitação de todas as proteínas víricas de HIV, com as partes sobrenadantes das células CEM de infecção simulada e infectadas com vírus, como controlos negativo e positivo.

Os resultados demonstraram que os seis anticorpos monoclonais imuno-precipitaram especificamente a gpllO e a gpl50.

Ensaio imuno-adsorvente associado ao enzima

Para delinear os epitopes gpllO que são reconhecidos pelos anticor*pos monoclonais da presente invenção, ainda se fez a caracterização das partes sobrenadantes da cultura a partir de linhas de células híbridas ou de fluido de ascite por resctividade em ELISAs com proteínas de fusão por expressão biológica sintéticos. Os procedimentos foram idênticos aos anteriormente descritos com a excepção de as proteínas de fusão ou os péptidos sintéticos substituírem os vírus purificados como antigene adsorvido ã superfície do recipiente de microtitulação.

Quando se utilizaram oéptidos como antigenes, o protocolo de preparação foi o seguinte. Dissolveu-se o péotido liofilizado em cloreto de guanidina 6M. Antes fazer a preparação das 96 lâminas do recipiente diluiu-se a solução de guanidina em um tampão de bicarbonato/carbonato 0,05 M (pH 9,6) para proporcionar uma concentração de pêptido final superior a 100 jug/ml. Colocou-se um volume de 50 pl de péptidos diluídos em cada recipiente de microtitulação e fez-se a incubação das lâminas durante a noite a 4°C. igitou-se” o excesso da solução de pêptido, fez-se o bloqueio das lâminas com Blotto¹’ e executou-se o procedimento anteriormente descrito para, a parte restante de ELISA. De modo semelhate, diluiu-se a proteína recombinante para proporcionar uma concentração final aproximada de 2 p-g/ml em um tampão de bicarbonato/carbonato 0,05 M (pH 9,6), antes de se executar o mesmo procedimento.

Os resultados apresentam-se na Tabela II, Os anti- 57 corpos monoclonais produzidos pelas linhas de células HIV gpllO-Ι e HIV gpllO-2 reagiram com ENV3, ENV5, péptido 36 e vírus fendido. Os anticorpos das linhas de células HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpll0-5 e HIV-gpll0-6 reagiram com ENV2 e com 0 péptido 29 e também com 0 vírus fendido.

TABELA II

Demonstração ELISA da Reactividade dos

Anticorpos Honoclonais com

Proteínas Recombinantes e Péptidos Sintéticos

Proteína de Fusão Recombinante Péptido Sintético LAV CEU

	ENV2	ENVJ	ENV4	ENV5 29		39	Oontrcilo Controlo
110-1	0,077	3,000	0,113	3,000 ND	2,421	0,054	0,908	0,125
110-2	-0,003	3,000	0,000	3,000 ND	2,305	-0,005	1,214	0,009
110-3	3,000	0,011	ND	ND 3,000	ND	0,017	0,363	0,046
110-4	3,000	0,020	ND	ND 3,000	ND	0,016	0,333	0,067
110-5	3,000	0,014	ND	ND 3,000	ND	0,016	0,363	0,025
110-6	3,000	0,033	ND	ND 1,937	ND	0,017	0,486	0,032

I

Os resultados da Tabela II demonstram que os anticorpos monoclonais 110-1 e 110-2 reconhecem um determinante antigénico codificado por úma sequência ADN no interior da região pENV3, mais particularmente pela região do genoma HIV definido por uma sequência de aminoácidos no interior do péptido

36. Isto é, os anticorpos monoclonais gpllO-Ι e gpllO-2 ligam-se a uma região do péptido de gpllO codificado desde pb7246 até pb 7317 conforme demonstrado pela formação dos complexos imunológicos com 0 péptido 36 e ENV3. Esta região do genoma de

- 58 / -

HIV foi identificada previamente como inalterável, isto é, pequena variação na sequência de ADN na região codificada pelo pêptido 36 entre os diferentes elementos isolados de vírus a partir de localizações geográficas diversas. Ver Starcich e outros, Cell¹¹; 46; (1986), o. 637, Em contrapartida, os anticorpos monoclonais gpllO-3, -4, -5 e -6 ligam-se aos péptidos de HIV definidos pela região codificada pelo pêptido 29 desde pb 6688 até pb 6750 aproximadamente, A região em gpllO definida pelo pêptido 29 está identificada como contendo diversas substituições de nucleotido entre diversos elementos isolados víricos. Os anticorpos monoclonais que se ligam selectivamente aos polipêptidos gpllO os quais contêm eoitopes inalterados, tais como os anti-corpos 110-1 e 110-2, podem possuir uma maior utilidade numa diversidade de circunstâncias, tal como na cromatografia de afinidade, etc.. Além disso, no ensaio ELISA, 0 pêptido 110-2-2 reagiu com 0 soro do indivíduo a partir do qual se isolou LAV-2.

Ensaio indirecto de imuno-fluorescência

Os ensaios de imuno-fluorescência indirectos utilizando anticorpos monoclonais dirigidos contra 0 antigene gpllO de HIV efectuaram-se em células vivas e células fixadas em acetona. Os diapositivos fixados em acetona preparados a partir de células CELT infectadas com LAV foram incubados com a parte sobrenadante da cultura diluída ou fluido de ascite durante 1 hora a 37°0, ao passo que as células vivas foram incubadas com a parte sobrenadante da cultura ou fluido de ascite durante 1 hora a 4°C, antes de se colocarem as células em diapositivos e de se fixarem coai acetona. Em am- 59 ζ ί * bos os métodos utilizou-se anti-IgG de rato marcada com isotiocianato de fluoresceína, para detectar as células que suportam o antigene de gpllO reactivo. 0 anticorpo monoclonal HIV-gpllO-1 proporcionou resultados positivos utilizando quer as células vivas quer as células infectadas com IAV fixadas em acetona.

EXESPDO II

Neutralização da contagiosidade de HIV pelos anticorpos monoclonais anti-gpllO

Este exemplo descreve e caracteriza a neutralização da contagiosidade de HIV utilizando anticorpos monocl£ nais que se ligam à gpllO e aos péptidos no interior da gpllO. Estes resultados demonstram que os anticorpos mono cio. nais gpllO-3, -4, -5 e -6 possuem actividade neutralizadora e que os gpllO-3 e -4 possuem níveis particularmente elevados de actividade neutralizaâora.

Ensaio de neutralização

Desenvolveu-se um ensaio de neutralização sensitiva para quantificar o efeito dos anticorpos monoclonais na contagiosidade de HIV. Escolheu-se uma linha de células CD4+ altamente susceptível de infecçao por HIV, CEfl, como alvo para comparações de contagiosidade. Durante 30 minutos aqueceu-se a 56°C fluido de ascite inactivado preparado conforme descrito no exemplo I, ou a. sua fracção IgG purificada utilizando a precipitação de sulfato de amónio e depois diluiu-se conforme necessário em meio RPiU contendo soro de vi tela fetal a 10%, Colheu-se uma suspensão de LAV-g^y da estir

pe HIV a partir de culturas de 4 dias de CEM em fase de crescimento logarítmico, filtrou-se através de filtros de 0,2 ou de 0,45 micron, prepararam-se aliquotas e congelou-se a -70°C. Descongelou-se uma aliquota, titulou-se para determinar o valor TCID^q e realizaram-se ensaios posteriores com aliquotas recentemente descongeladas, diluiram-se em meio de cultura na. proporção de 1:500 para proporcionar uma concentração de aproximadamente dez vezes a quantidade necessária para infectar 50% d.-is células CEM na cultura (10 TCID^q). Misturou| -se a suspensão de vírus com igual volume (250 pl) de uma pre.

paração de anticorpos monoclonais de diluições quíntuplas des. de 1:5 até 1:9 765 625. Fes-se a incubação da mistura vírus/ /anticorpo durante 45 minutos a 37°C e depois duplicou-se desde 1:5 até 1:9 765 625. Fez-se a incubação da mistura vírus/anticoroo durante 45 minutos a 37°C e depois duplicou-se as amostras de 200 pl utilizadas para inocular os recipientes que continham 1,0 ml de aproximadamente 2 x 10 células de CEM por recipiente. Fes-se a incubação das culturas a 37°0 numa atmosfera humidificada contendo 5% de C0_P, durante 14

I dias. Colheram-se as células, fez-se uma massa e lisou-se com 1% de Triton Z-100 em PBS durante cerca de 10 minutos. Fez-se a quantificação da quantidade de vírus (ou antigene vírico) presente nag células lisadas utilizando um ensaio imunológico por enzima de ••sanduiche” para captura do antigene sensível ao HIV, conforme se descreve a seguir. A titulação da actividade de neutralização, se existente, determinou-se como sendo o inverso da diluição de anticorpos monoclonais que inibem a produção de antigene em mais do que 50% das culturas de controlo de vírus incubadas sem anticorpo ou

- 61 com um anticorpo monoclonal do mesmo isotipo que tenha demons trado anteriormente falta de actividade de neutralização.

ensaio de captura do antigene de HIV anteriormente referido utilizou como reagentes de captura dois anticorpos monoclonais dirigidos contra os antigenes p25. Estas linhas de células de hibridoma foram geradas pelos métodos atrás descritos com modificações não significativas incluindo a utilização de uma proteína de fusão recombinante gag purificada como imunogene e caracterizando os anticorpos monoclonais resultantes pela sua especificidade e reactividade utilizando proteínas de fusão recombinante anteriormente designadas por GAG-1, GAG-2, e GAG-3, e o péptido 141 sintético. Faz-se a expressão da proteína GAG-1 a partir de pGAG-1 (A.T.C.C. N9. 53379), faz-se a expressão de GAG-2 a partir de pGAG-2 (A.T.C.C, H9. 53111) ® faz-se a expressão de GAG-3 a partir de pGAG-3 (A.T.C.C. N2. 53112). A produção de proteínas de fusão recombinante está descrita com pormenor nos pedidos de patente pendente com os n²s. U.S.S.N. 764 460 e 828 828 os quais se indicam aqui como referência. 0 péptido 141 sintético é codificado pela região genómica de correspondente aos radicais de aminoácidos 198-242. Descobriu-se que os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas de células de hibridoma p25-2 e p25-3 reagem com as proteínas de fusão recombinante G/.G-1, GAG-2, e GAG-3 θ que o elemento monoclonal de p25-3 também reage com o péptido 141 sintético, para se efectuar o ensaio de captura do antigene, os reagentes de captura foram primeiro adsorvidos por um suporte sólido. 0 fluido de ascite derivado das linhas de células de hibridoma p25-2 e p25-3 diluiu-se na proporção de

-62-/ / , 1:5000 em um tampão Tris 25 m'3, pH 8,5 θ colocou-se 200 pl em recipientes de lamelas de micro-orifícios. Vedaram-se os orifícios e fez-se a incubação durante cerca de 16 horas a 4°C. Eliminou-se a solução dos orifícios por aspiração antes de se adicionar uma solução de bloqueio de 0,3% Blotto em PBS. 0 bloqueio efectuou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos, Aspirou-se a solução de bloqueio e adicionou-se a amostra. Adicionou-se a cada orifício 200 pl da suspensão celular lisada e 5,0 pl do combinado de detecção, preparados conforme atrás descrito. As lamelas ou fitas do reservatório foram incubadas durante 2 horas a 37°C, após o que se aspirou a suspensão e se lavaram os orifícios quatro vezes com um tamoao (0,05% de Tween 20 em PBS), 0 combinado de detecção preparou-se do modo seguinte. Combinaram-se os anticorpos monoclonais p25-6 e p25-7 com peroxidase de rábano (HEP) numa proporção molar de 3:1 (AbjHRP) durante 3 horas utilizando um procedimento de oxidação de periodato (Nakane e outros, J. Histochem Cytochem”; 22; (1974) P, 1084). Diluiram-se os combinados na proporção de 1:1500 em leite seco não gordo a 2,5% (p/v), timerosal a 0,01% e anti-es^uma A a 0,005% em citrato de sódio 20 m2I. A parte restante do procedimento ELISA efectuou-se conforme descrito no Exemplo I.

Os resultados do ensaio da actividade de neutralização com os anticorpos g_x;110-3, -4, -5, e -6 sao os seguintes. Verificou-se que as titulações mais elevadas que retinham a actividade de neutralização eram: gpllO-3 s 15*625; gpllO-4 = 9.765.625; g?H0-5 =125; e gpllO-6 = 625.

Devido à variabilidade genética previsível para a região definida, pelo péptido 29, examinou-se a capacidade

- 63 do anticorpo monoclonal gpllO-4 para reconhecer outros isolados de HIV. Os ensaios de imuno-fluorescência efectuaram-se conforme atrás descrito. 0 anticorpo gpllO-4 detectou antigenes em culturas de pelo menos 3 a 16 isolados de HIV ensaiados.

O anticorpo gnll.0-4 foi capaz de neutralizar isolados de vírus ao fim de 15 semanas num chimpazé inoculado com LÃVgpu, como animal de controlo para uma tentativa de vacina contra a SIDA. 0 anticoroo monoclonal foi capaz de neutralizar os isolados ainda que 0 animal possuisse anticorpos de soro que neutralizaram 0 HIV in vitro e tivesse revelado uma resposta imunológica veiculada por células e mensurável, à infecçao de HIV, Isto significa uma falta de tendência antigénica in vivo para 0 epitope reconhecido pelo anticorpo gpllO-4.

EXBIÚPLO III

Neutralização da contagiosidade de HIV com uma Histura de anticorpos monoclonais anti-gpllO e anti-p25

Este exemplo descreve a neutralização da contagiosidade do HIV utilizando anticorpos monoclonais que se ligam ao gpllO e aos péptidos no interior de gpllO em combinação com anticorpos monoclonais que se ligam ao p25 e aos péptidos no interior de p25, os quais isoladamente apresentam fraca actividade ou nenhuma actividade de neutralização. Os resultados indicam que 0 .anticorpo monoclonal gpllO-2 em combinação com p25-6 ou p25-7 possui níveis particularmente elevados de actividade de neutralização.

As linhas de células de hibridoma p25-6 e p25-7

foram geradas pelos métodos atrás descritos com modificações que englobam a utilização de vírus fendidos inactivados ou uma proteína de fusão recombinante gag purificada expressa ^βΛι coli como imunogene e caracterizando os anticorpos monoclonais resultantes pela sua qualidade e reactividade utilizando as proteínas de fusão recombinante anteriormente designadas por GAG-1, GAG-2,

15, 88, 150, 147 © 148, Os cados pela região genómica e GAG-3 e os péptidos sintéticos péptidos sintéticos estão codifi cle BAVpjju correspondente aos radicais de aminoácido seguintes: péptido 15, radicais de amino ácido desde 329 até 350; péptido 88, radicais de aminoácido desde 315 até 350; péptido 150, radicais de aminoácido desde 318 até 363; péptido 147, radicais de aminoácido desde 278 até 319; e péptido 148, radicais de aminoácido desde 290 até 319. Os ^anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas de células de hibridoma p25-6 e p25-7 reagem com a proteína de fusão recombinante GÂG-3, 0 p25-6 reage com os péptidos sintéticos 147 e 148, e 0 p25-7 reage com os péptidos sintéticos 15, 88, e 150.

Os ensaios de neutralização efectuaram-se conforme atrás descrito, com excenção de, na preparação das misturas, se ter feito primeiro a diluição dos anticorpos monoclonais individuais na proporção de 1:5 em um meio de cultura e depois se terem misturado em proporções iguais para originar uma diluição final de 1:10. A parte restante do ensaio efectuou-se conforme anteriormente descrito.

Os anticorpos monoclonais gpllO-2, p25-6 e p25-7 apresentam uma actividade de neutralização inferior a 50% qnan do utilizados isoladamente. Quando utilizados numa mistura que f

- C5 - / _χ / .· englobe anticorpos monoclonais gpllO-2 com p25-6 ou gpllO-2 com p25-7 com uma diluição de 1:10, a neutralização foi total. Uma mistura englobando os anticorpos monoclonais p25-6 em combinação com p2Ç-7 proporcionou uma actividade de neutralização compreendida entre 60-90%.

EXESTO IV

Imuno potência do péptido 29 e dos seus homólogos

A cap·'Cidade do péptido 29 e dos péptidos homólogos, incluindo o péptido 177, para estimular uma resposta imunológica contra o HIV, verificou-se primeiro em duas estirões de ratos. Os procedimentos para a preparação dos imunogenes dos péptidos, para os protocolos de imunização, e para a caracterização da resposta imunológica gerada descrevem-se com pormenor a seguir.

Preparou-se o péptido 29 para imunização, por conjugação com uma tiroglobulina purificada. A tiroglobulin^c preparou-se a partir de N-succinimidil-4-(lí-maleimidometil)-ciclohexano-l-carboxilato (SwICC) por conjugação, de acordo com o procedimento descrito na patente de invenção americana n^. 4 629 783, col. 10, linhas 28-51. Como segundo imunogene, obeteve-se a tiroglobulina a partir de glutaraldeído, conforme se segue, Dissolveu-se 27 mg de tiroglobulina de suíno em 1 ml de bicarbonato de sódio 0,1 1 e adicionou-se-lhe, gota a gota, 8,3 de uma solução de glutaraldeído a 25% a agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente. Adicionou-se à solução 1 ml de um tampao de bicarbonato/carbonato de sódio, pH 9,3, ® fez-se a diálise durante 8 horas na presença de 2 litros do mesmo tampão a 4°C com uma mudança f

, ·- ^z

- fcO - { completa de dialisato decorridas 4 horas. Depois adicionou-se 0 péptido 29 à tiroglobulina obtida com um excesso 100 molar aproximadamente, e agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente. 0 glutaraldeído que nao reagiu bloqueou-se com 200 μΐ de uma solução de Usina 0,2 U, a agitou-se esta mistura durante várias horas (ou durante a noite) à temperatura ambiente. Fez-se então a diálise intensiva do combinado péptido/tiroglobulina na presença de PBS a 4°C.

Inocularam-se duas estirpes de ratos (negro 057 e BALB/c) com péptidos preparados cie acordo com cada um dos métodos de conjugação. Todos os animais tinham 2-4 semanas no momento da inoculação. As vias de inoculação incluíam as plantas das patas, escarificaçao da cauda, inoculação subcutânea, intranasal ou intraperitoneal. A inoculação consistiu em 25 pg de péptido combinado em suspensão em 0,5 ml de adjuvante de Freund completo, sendo as inoculações propulsoras repetidas ao fim de 2, 3 e 5 semanas com o mesmo imunogene em suspensão em um adjuvante de Freund incompleto. Recolheram-se amostras de soro de cada rato antes da imunização, 4 dias após a imunização propulsora das 3 semanas e 4 dias após a imunização final das 5 semanas. Analisaram-se as amostras de soro para detecção dos anticorpos contra os peptidos homólogos ou vírus totais por rastreio segundo ELISA. Fez-se também o rastreio da actividade dos anticorpos demonstrada pelo soro em relação ao LAV em função da actividade da neutralização, seguindo-se a análise dos soros em imuno-marcaçoes em função do antigene LAV fendido e efectuaram-se ensaios de radio-imuno-precipitação com gpllO radio-marcado. Os re sultados das imunizações indicaram que os ratos imunizados /

” /

com o pêptido 29 desenvolveram anticorpos que reagiram ao pêptido 29 e ao vírus LAV-1 fendido em ELISA. A combinação do pêptido 29 por meio cie glutaraldeído faz surgir geralmente uma quantidade mais elevada de anticorpos para o pêptido 29 em ratos Balb/c, embora a combinação por meio de maleimida faça, aparecer com sucesso anticorpos para o pêptido 29 em alguns ratos Balb/c. Os ratos imunizados com o pêptido 177 desenvolveram anticorpos para o pêptido e a combinação do pêptido 177 por meio de glutaraldeído foi melhor para proporcionar uma resposta imunológica. Os ratos C57 reagiram melhor fe estimulação imunológica com o pêptido 177 do que os ratos Balb/c. Os ratos imunizados com o pêptido 110-2-2 de LAV-2 desenvolveram anticorpos ao 110-2-2 e ao vírus LAV-2 conforme indicado por ELISA. 0 pêptido 110-2-2 combinado por meio de glutaraldeído foi imunogénico nos ratos 057 « Balb/c, embora as quantidades para o pêptido 110-2-2 fossem geralmente mais elevadas nos ratos Balb/c do que nos ratos 057, de um modo geral, ao passo que as quantidades para o vírus LAV-2 foram geralmente mais elevadas nos ratos 057 do que nos ratos Balb/c.

Geralmente, as amostras de soro de ratos imunizados que (i) exibem anticorpos contra o vírus total; (ii) são capazes de neutralizar o HIV, tal como sucede nos ensaios descritos no Exemplo II; e (iii) reagem com o pêptido 29 em ELISAs, indicam cumulativamente a eficácia da utilização do pêptido 29 numa formulação de vacina.

-/ _

ΕΣΕΖΡΙΟ V

Separação de gpllO por imuno-afinidade utilizando anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais para o antigene gpllO de HIV podem utilizar-se em procedimentos de separação por imuno-afinidade, para purificar completamente as proteínas de fusão recombinante de expressão bacteriana. Se a proteína de expressão for segregada pela bactéria, pode isolar-se & proteína a partir da parte sobrenadante da cultura; se a proteína não for segregada pode ser necessária a disrupção das células bacterlanas.

A construção do plasmido pENV-5 (A.T.C.C. nS 53074) está descrita no pedido de patente pendente U.S.S.N. 721 237 aqui indicado como referência. 0 plasmido pENV-5 codifica uma porção principal da extremidade carboxilo de gpllO e uma oorção de terminação amino de gp41 de LAV inserido no vector de expressão trp. A E. coli 0600 transformada por este vector exprime mas não segrega a proteína de fusão gpllO.

As E, coli 0600 contendo o plasmido pENV-5 desenvolvem-se em um meio que contém triptofano (20 ^g/ml) e ampicilina (100 çig/ml), durante a noite a 37°C com arejamento. Depois faz-se a inoculação das culturas nocturnas numa proporção de l;100 em um meio mínimo recentemente preparado contendo ampicilina (100 pg/ml), mas sem triptofano. Estas culturas desenvolvem-se com arejamento durante 2-3 horas (até à fase logarítmica prematura) a 37°C. Adiciona-se o indutor, ácido 3-B-indolo-acrílico (Sigma Chemical Oo., St. Louis, ZO), para proporcionar uma concentração final de 20 )ig/ml a partir de reservas recentes de 20 mg/ml em etanol a 95%. As culturas

- 69 induzidas desenvolvem-se depois a 37°C com arejamento durante 4 a 5 horas fazendo-se em seguida uma massa que é opcionalmente congelada. Os rendimentos em proteína a partir de pENV-5 são normalmente inferiores a 1 mg/1.

As células bacterianas desta massa são lisadas utilizando o tampão P-RIPA (PBS contendo 1% de Triton X-100, 1% de desoxicolato, 0,1% de dodecil-sulfato de sódio, e 1% de Aprotinin) o qual lisará as células E. coli. A suspensão pode ser submetida à acção de ultrassons para cortar o ADN e o ARN, seguindo-se a centrifugação para eliminação das par ticulas ínfimas. Seguidamente pode ser necessário um passo de diluição ou de concentração para estabelecer um valor nor malizado para a concentração da. proteína.

anticorpo monoclonal HIV-gpllO-1 precipita-se inicialmente no seio de fluido de ascite ou das partes sobre nadantes da cultura de células, temperatura ambiente ou a frio com soluçoes de (NH^JgSO^ ou de NagSO^ tamponadas pfí 7,3 para proporcionar uma saturação final de 33% ou de

18%, respectivamente. As oroteínas precipitadas eliminam-se por centrifugação e dissolvem-se novamente em PBS e precipitam-se uma segunda vez com (NH^)₂30^ a 33% ou Na^SO^ a 12-15%. Este passo oode repetir-se se necessário. Dissolve-se novamente a massa em PBS e remove-se o sal em excesso por filtração do gel através de uma matriz de dessalinizaçao ou por diálise intensiva na presença de PBS.

anticorpo monoclonal 110-1 purificado pode ligar-se depois à Sefarose activada por brometo de cianogeno.

A quantidade necessária de gel é expandida numa solução de

HC1 IO³ m sobre um filtro de vidro (1 g de material seco

IQ por congelamento proporciona um volume final de gel de aproximadamente 3,5 ml), lava-se durante 15 minutos com a mesma solução e adiciona-se-lhe o anticorpo imediatamente a seguir. Em geral, a reacção de acoplamento decorre mais eficazmente a ura oH compreendido entre 8-10, mas pode utilizar-se um pH inferior se tal fôr necessidade para a estabilidade do anticorpo deve ser dissolvido em PBS ou num tampão de potência iónica elevada de carbonato/bicarbonato ou borato, com NaCl 150 mI.T. Agita-se lentamente a suspensão de anticorpo e de Sefarose activada durante 2-4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C e depois lava-se num filtro de vidro temperado com tampão de acoplamento. Quaisquer grupos activos remanescentes são bloqueados por tratamento com etanolamina 1,0 M a um pH 8 durante 2 horas. 0 produto final anticorpo/ /Sefarose lava-se depois alternadamente com soluções tampão de pH elevado e baixo (tampão de borato, 0,1 m, pH 8,5, NaCl 1 Me tampão acetato, 0,1 M, pH 4,0, NaCl 1 LI, respectivamente) 4 ou 5 vezes. Esta lavagem elimina os traços de materiais adsorvidos nao covalentemente. A matriz final de separação por imuno-afinidade guarda-se a uma temperatura inferior a 8°C na presença de um agente bacteriostático adequa.do, tal como azida a 0,01%.

A adiçao da suspensão de proteína de expressão à matriz de separação por imuno-afiniclade proporciona a eliminação selectiva do antigene gpllO. Deixa-se que se desenvol va a interacção no seio da mistura durante 2-24 horas, de pre ferência durante 12-18 horas, cora agitação lenta. Também se pode utilizar uma coluna na qual se verte a matriz de imuno-afinidade, fazendo-se o equilíbrio e adicionando-se lenta- 71 -

mente a essa coluna a susoensão de proteína de expressão. Após a adição da suspensão de proteína deve interromper-se o fluxo para permitir a. formação da maior quantidade possível de complexo imunológico.

Lava-se o material não ligado ou se^ara-se por lavagem intensa com tampão de adsorçao. Pode utilizar-se um filtro de vidro temperado no vácuo ou um fluxo através de coluna, Depois faz-se a eluição do material ligado utilizando tampões de pH baixo e elevado (tampão de acetato, pH 4,0 ou tampão de borato, pH 3,56) ou um agente caotrópico.

EXEMPLO VI

Purificação por imuno—afinidade de gpllO recombinsnte a partir de um sistema de exoressão de um mamífero

Os anticorpos monoclonais da presente invenção sao úteis na purificação por imuno-afinidade de gpllO de fusão recombinante por expressão de células de mamíferos, Infe£ tim-se as células dos mamíferos com vacina recombinante (Mackett e outros, ^WJ. Virol.¹¹; 49; (1984), p· 857, aqui indicado como referência) que contenha sequências que codifiquem pelo menos na porção de gpllO que é antigénica e que faz surgir os anticorpos de neutralizaçao. A vacina recombinante constrói-se de acordo com o método descrito na U.S.S.N.

842 984, aqui indicada como referência. Resumidamente, faz-se a inserção das sequências que codificam a glicoproteína envol vente de HIV, num vector plasmido (pGS20) a. jusante de um ele mento de controlo transcricional da vacina. Este gene quiméri. co é flanqueado pelas sequências que codificam 0 gene vírico de timidina quinase (TK).

V-,

Os vectores plasmidos quiméricos que contêm o promotor de vírus de vacina ligados ao gene envolvente de LAV utilizam-se para transformar HCIOOO da estirpe E. coli. A inserção das sequências de LAV-env quiméricas no genoma do vírus da vacina, conseguiu-se por recombinação in vivo, o que foi possível pelo facto de os genes quiméricos nos plasmidos pv-env5 serem flanqueados pelas sequências víricas de vacina que codificam o gene TK. Depois introduz-se este plasmido em células previamente infectadas com vírus de vacina do tipo violento e deixa-se que a recombinação ocorra entre as sequências TK do plasmido e as sequências homólogas no genoma vírico da vacina, inserinclo-se deste modo o gene quimérico. Utilizam-se as células de rim de macaco verde africano (estirpe BSC-40, uma linha derivada de células BSC-1. A.T.C.C. n2. CCL26) como hospedeiro no sistema de expressão.

As células BSC-40 confluentes são infectadas com uma multiplicidade de infecções c<- 10 por vírus de vacina recombinante. Deixa-se que a infecção se desenvolva durante 12 horas e, decorrido este tempo, colhem-se as células, lavam-se uma vez com PBS e recolhem-se por centrifugação. Faz-se uma nova suspensão com as massas de células em um tampão de lisina (1,0% cie NP 40, 2,5$ cie desoxicolato de sódio, NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,01 H, pH 7,4, 1 mH de EDTA) e seguidamente purifica-se o lisato por centrifugação. A separação por imuno-afinidade da proteína de fusão recombinante por expressão efectua-se conforme atrás descrito para o sistema de expressão bacteriana, utilizando o anticorpo monoclonal gpllO-1. As proteínas produzidas por este sistema de expressão assemelham-se muito ao gpllO de HIV produzido naturalmen

- 73 te, devido ao processamento e glicosilaçao proporcionados pelas células dos mamíferos.

EXEMPLO VII

Inibição da infecção a HIV com péptidos de bloqueio

Estudou-se a eficácia dos péptidos de bloqueio para inibirem a infecção de células de cultura de tecido pela estirpe de HIV, utilizando uma modificação do protocolo para a avaliação do pêptido T publicada por Pert e outros, supra citado. Os ensaios de inibição de HIV preferidos consistem em combinar iguais volumes de pêptido de bloqueio e células CEM (2,5 x 10^) em um meio RPM (10% de FCS e 2 mg/ml de polibreno), fazendo-se a incubação durante 45 minutos a 37°C. Depois adiciona-se o vírus em doses diversas (10, 50, 500 TCID 50), faz-se a incubação da mistura durante 14 dias a 37°C e depois faz-se o ensaio das partes sobrenadantes para determinar a produção de antigene do vírus (por exemplo, núcleo p25)·

A incubação prévia das células GEÍ.I com os péptidos antes da adição do vírus às culturas facilita o efeito de inibição nos ensaios. Descobriu-se que a inibição depende da dose de vírus, apresentando uma actividade forte para doses baixas e médias, sendo menos eficaz para doses de vírus mais elevadas.

Com o pêptido T apenas se conseguiu uma inibição de 60 a 90% de produção de antigene de vírus nas experiências com doses baixas de vírus. Experiências adicionais com os péptidos X-XV, tipicamente de terminação COOH amidada e de terminação NHg acetilada, proporcionaram resultados semelhanr? _A .

— í 4 tes, ao passo que o pêptido XI foi particularmente eficaz para um amplo intervalo de doseamento. Os anticorpos de neutralização podem adicionar-se quer durante o período de pré-incubação quer no momento em que se adiciona o vírus para proporcionar uma inibição adicional ou sinérgica da produção de anti-gene vírico.

Concluiu-se assim que os anticorpos monoclonais e os péptidos, incluindo os péptidos de bloqueio da presente invenção, proporcionam métodos aperfeiçoados para a neutraliI zação e/ou inibição de infecções a HIV. Isto permite o desenvolvimento mais fácil de composiçoes profiláticas e terapêuticas que sejam eficazes contra as infecções provocadas pela maioria ou mesmo por todas as estirpes de HIV. Além disso, estes novos materiais encontram aplicação nos ensaios de diagnóstico e em outros processos bem conhecidos.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com algum pormenor por via de ilustração e de exemplos com o objectivo de tornar clara a sua compreensão, é evidente que se podem efectuar algumas alterações no âmbito das reivindicações anexas.

DADOS RELATIVOS AQ DEPÓSITO

DOS MICRO-ORGANISMOS

Os micro-organismos seguintes, que fazem parte da presente invenção, foram depositados em American Type Culture Collection, 12J01 Parklawn Drive, Rockville, íãaryland 20852, U.S.A. Os dados relativos ao depósito sao os seguintes:

Descrição Científica	Referência de Dep.	Ref.ATCC	Data do Depósito
Hibridoma
de rato	HlV-gp 110-1	HB 9175	15 de Agosto 1986
(balb c/NS-1)
H	HlV-gp 110-2	HB 9176	15 de Agosto 1986
tl	I-IIV-gp 110-3	HB 9177	15 de Agosto 19'36
H	HlV-gp 110-6	HB 9404	30 de Abril 1987
n	HlV-gP 110-4	HB 9405	30 de Abril 1987
π	HlV-gp 110-5	HB 9406	30 de Abril 1337
n	HIV-p 25-2	HB 9407	30 de Abril 198?
tl	HIV-p 25-3	HB 9408	30 de Abril 193?
n	HIV-p 25-6	HB 9409	30 de Abril 1987
II	HIV-p 25-7	HB 9410	30 de Abril 198-7
	Ensaiaram-se os hibridomas HB	9175, HB 9176 e
HB 9177 ® descobriu-se que eram	viáveis em	26 de Agosto de

1986. Os restantes hibridomas foram ensaiados e decobriu-se que eram viáveis em 4 de Ilaio de 1987.

Claims (40)

1. - Processo para a preparação de uma composição apropriada para utilização no tratamento de infecções provocadas por HIV, caracterizado por se incorporar uma dose terapeuticamente eficaz compreendida entre cerca de 1 e cerca de 200 mg de anticorpo por quilograma de peso do corpo de pelo menos um anticorpo monoclonal, especificamente reactivo com uma ou mais regiões de neutralização de HIV, em um veículo eficaz sob o ponto de vista farmacêutico.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões de neutralização incluírem epitopes codificados nas regiões env ou gag do genoma de HIV.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as regiões de neutralização incluírem epitopes localizados nas gp110 ou p25 das proteínas de HIV.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se adicionar ainda um ou mais péptidos bloqueadores susceptí-

I veis de atenuar a capacidade de infecções de HIV e/ou anticorpos monoclonais reactivos com epitopes dos referidos péptidos.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se incluir ainda uma mistura de anticorpos monoclonais reactivos com diferentes homólogos da referida sequência.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1_f caracterizado por um anticorpo monoclonal ser reactivo com pelo menos um epitope

I da sequência 278 a 319 de aminoácidos de p25 de LAV_a_,_r7 e/ou homólogos correspondentes, e um segundo anticorpo monoclonal ser reactivo com pelo menos um epitope na sequência 315 a 363 de aminoácidos de p25 de LAV_fiRU e/ou homólogos correspondentes.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um anticorpo monoclonal ser reactivo com pelo menos um epitope de p25 de HIV e um segundo anticorpo monoclonal ser reactivo com pelo menos um epitope de gp110 de HIV.

/ -78

8, - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o epitope de p25 estar localizado na sequência 278 a 319 ou 315 a 363 de aminoácidos de LAV_BRU , ou homólogos das referidas sequências.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o epitope gp110 estar localizado na sequência 308 a 328 de aminoácidos de LAV_RR^ ou homólogos correspondentes.

10, - Processo para a preparação de uma composição de anticorpos monoclonais, caracterizado por esta ser especificamente reactiva com uma região de neutralização de HIV.

11, - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a região de neutralização estar localizada no gp110 de HIV.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a referida região incluir uma sequência de 301 a 336 ou 308 a 328 de aminoácidos de gp110 de HIV, ou homólogos das sequências referidas.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se incorporar ainda um anticorpo monoclonal reactivo com um péptido de bloqueio de HIV.

14, - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a região de neutralização estar localizada no p25 de HIV.

15. - Processo para a preparação de um pêptido, caracterizado por se incluir pelo menos cerca de cinco aminoãcidos contíguos da sequência de aminoácidos de gp110 de HIV ou homólogos correspondentes seguintes:

II C29a)

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-IleArg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-ThrIle-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os referidos aminoãcidos contíguos definirem pelo menos um determinante antigênico susceptível de eliciar anticorpos numa imunização em um hospedeiro, em que os referidos anticorpos são protectores contra infecções de HIV.

17, - Processo para a preparação de um pêptido, caracterizado por se incluir uma das sequências de aminoãcidos de gp110 de HIV ou homólogos correspondentes, seguintes:

I (29)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-ProGly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y';

-δον (177)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-ArgAla-Phe-his-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y'; ou

VIII (110-2-2)

Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-ValPhe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y';

nas quais Y e Y', se presentes, consistem, cada um, numa sequência de aminoácidos de até cerca de 20 aminoácidos.

18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por Y e/ou Y' incluírem um resíduo de ligação seleccionado no grupo que consiste essencialmente em glicina, tirosina, cisterna, lisina, ãcido glutãmico ou asparagina.'

19. - Sequências de ãcido nucleico, caracterizadas por codificarem os péptidos das reivindicações 15 ou 18.

20. - Processo para a preparação de uma composição, caracterizado por se incluir um segmento de ãcido nucleico de cerca de 150 nucleotidos ou menos que codificam um péptido de uma região de neutralização de HIV.

21. - Segmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por codificar adicionalmente um péptido de bloqueio de HIV.

22.- Segmento de ácido nucleico de acordo com a reivindi- cação 20, caracterizado por o referido pêptido consistir em pelo menos cerca de cinco aminoácidos da sequência de aminoácidos 301 a 336 de gp110 de LAV_BRU ou das sequências 278 a 319 ou 315 a 363 de aminoácidos de p25 de LAV_RRy e homólogos das sequências.

23.- Painel de sondas/ caracterizado por incluir pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codificam os pêptidos da Tabela i, para utilização em ensaios de diagnóstico de hibridação.

24.- Processo para a preparação de uma vacina contra infecções de HIV, caracterizado por se incorporar uma dose imunologicamente eficaz de um ou mais pêptidos de menos do que cerca de 50 aminoácidos que contêm regiões de neutralização de gp110 e/ou p25, em que os referidos pêptidos são misturados com um veículo fisiologicamente aceitável.

25. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se incorporar ainda pelo menos cerca de cinco aminoácidos de um pêptido de bloqueio.

26. - Processo para a preparação de uma linha de células imortalizada, caracterizado por esta produzir um anticorpo monoclonal susceptível de reagir com um determinante antigénico de glicoproteína gp110 do invólucro, contida na região de neutralif -82 zação ou péptido de bloqueio de HIV.

27. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se obterem as linhas de células HIV-gpllO-1, HIV-gp110-2, HIV-gpl10-3, HIV-gp110-4, HIV-gp110-5, HlV-gp110-6, HIV-p25-6, e HIV-p25-7.

28. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por se obter um anticorpo monoclonal produzido pelas referidas linhas de células.

29. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal susceptível de reagir especificamente com um determinante antigénico de HIV, caracterizado por o anticorpo monoclonal bloquear a ligação de um anticorpo produzido pelas linhas de células da reivindicação 27.

30. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal, caracterizado por este ser susceptível de reagir com um determinante antigénico de glicoproteína gpllO do invólucro de HIV.

31. - Processo para gerar linhas de células que produzem anticorpos reactivos com determinantes antigénicos de gp110 de HIV, caracterizado pelo facto:

de se administrar a um hospedeiro uma quantidade imunogénica de uma preparação antigénica enriquecida por proteínas de HIV;

de se controlar o hospedeiro imunizado para a produção de anticorpos reactivos com determinantes antigénicos de gp110;

de se obter anticorpos que produzem células a partir do hospedeiro e de se imortalizar as referidas células;

de se seleccionar as células imortalizadas que produzem anticorpos a gp110 de HIV; e de se clonar as células imortalizadas para produzir as linhas de células.

32. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por as proteínas de HIV serem proteínas de fusão recombinante expressas por um hospedeiro bacteriano ou eucariota ou as proteínas de HIV serem obtidas a partir de um extracto ou lisado de HIV.

I

33. - Processo para diagnosticar a presença de HIV em uma amostra biológica, caracterizado pelo facto:

de se incubar um anticorpo monoclonal susceptível de reagir com gp110 de HIV na referida amostra biológica; e de se detectar a presença de complexos imunes formados entre o anticorpo monoclonal e o determinante antigénico na amostra biológica, e desta forma, se detectar a presença ou ausência de HIV na amostra.

34,- Processo de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zado por o anticorpo monoclonal ser susceptível de reagir com uma região d^ neutralização ou um peptido de bloqueio de gp110.

35. - Processo para diagnosticar a presença de anticorpos a HIV em uma amostra biológica, caracterizado pelo facto:

de se incubar um pêptido de uma região de neutralização de gp110 de HIV ou p25 com uma amostra biológica; e de se detectar a presença de complexos imunes formados entre o pêptido e anticorpos na amostra reactiva com pêptido , e assim determinar a presença ou ausência de HIV na amostra.

36. - Processo para diagnosticar a presença de HIV numa amostra biológica, caracterizado pelo facto:

de se incubar, sob condições de hibridação, um segmento de ácido nucleico que codifica pelo menos uma porção de uma região de neutralização de HIV com ácido nucleico na amostra biológica; e de se detectar a presença de complexos híbridos formados entre o segmento de ácido nucleico e o ãcido nucleico na amostra, e desta forma determinar a presença ou ausência de HIV na amostra.

37. - Processo para determinar a estirpe de HIV em um hospedeiro infectado, caracterizado pelo facto:

de se incubar uma amostra biológica do referido hospedeiro com um pêptido de uma região de neutralização de HIV; e de se detectar a presença de complexos imunes formados entre o pêptido e anticorpos na amostra, e desta forma determinar a estirpe de HIV que infecta o hospedeiro.

38, - Processo para á preparação de uma composição, caracterizado por se incorporar:

a) pelo menos um anticorpo monoclonal reactivo com uma região de neutralização de HIV e

b) um péptido de bloqueio que inclui pelo menos cerca de cinco aminoácidos contíguos das sequências de aminoácidos de gp110 de HIV ou homólogos correspondentes seguintes:

IX (173) Y-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'; ou

XV (19D Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y';

em que Y e Y', se presentes, incluem, cada um, uma sequência de aminoácidos com até cerca de 20 aminoácidos.

39. - Processo para a preparação de uma composição, caracterizado por se incorporar:

a) um anticorpo monoclonal específico para a região de neutralização de HIV e

b) um péptido que inclui pelo menos uma das sequências de aminoácidos ou homólogos correspondentes, seguintes:

XI(187)

Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y'; ou

XII(188)

Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y'; ou

XIII(189)

Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y'; ou

XIV(190)

Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y';

em que Y e Y*, se presentes, incluem, cada um, uma sequência de aminoacidos com até cerca de 20 aminoacidos.

40,- Processo para a preparação de uma composição de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por o referido péptido de bloqueio definir pelo menos um determinante antigénico susceptível de eliciar anticorpos por imunização de um hospedeiro, »

em que os referidos anticorpos eliciados são protectores contra infecções de HIV,