LU86972A1

LU86972A1 - Anticorps monoclonaux,peptides et compositions les contenant,destinees au diagnostic et au traitement des infections par le virus hiv

Info

Publication number: LU86972A1
Application number: LU86972A
Authority: LU
Original assignee: Genetic Systems Corp
Priority date: 1986-08-20
Filing date: 1987-08-19
Publication date: 1988-03-02
Also published as: BE1000811A4; NO873495D0; FR2603107A1; IL83580A0; PL267401A1; ZW15487A1; PT85567B; PL155084B1; AU616156B2; NO300462B1; GR871298B; NO934897L; OA08652A; KR890002547A; SE8703225D0; PT85567A; FI873553A0; SE8703225L; ATA208987A; FI873553L

Description

* * % 52.682

A "ΓΙΟ GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

Monsieur le Ministre · du 19 août 1.9 8.7 3rip£. de l’Économie et des Classes Moyennes _ ,... „ 1¾¾¾ Service de la Propriété Intellectuelle

LUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention T &·^:_____________________________:_ (o I. Requête

La société dite: GENETIC SYSTEMS CORPORATION, 3005 First (2j

Avenue. SEATTLE. Washington 98121, Etats-Unis d'Amérique,__ -représentée-par ..Monsieur Jacques.....de Muyser, agissant en_ ....q.uali.té„de.„maMa.tair&__:____________( 3) dépose(nt) ce ____dix-neuf août 1900 quatre-vingt sept_ ( 4) à —1.5--------heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: "Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contena^, .„destinées......au......diagnostic et au traitement des, infections par le _ ...virus.......HIV. "......................................................................

2. la description en langue f r ançai s e_____de l’invention en trois exemplaires; 3............................................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 19 août 1987 .

5. la délégation de pouvoir, datée de ...._______________.___ le ....._ __; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont): ( 6) voir désignation séparée : pas .¾ mentionner f_______ revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (7) „_______________brevets.___________________________________________________1_____________déposée(s)J8i:(8) aux Etats-Unis d'Amérique le(9) ...2..Q.......août 1986. le 1er mai 1987 et le 29 juin 1987_ sous le N° (10) ...8..98 .273.,.......No.........045.026.......et No. 067.996_________ au nom de (11) s.......inventeurs_________( J&ife jfa, £ 3. -lÂaZjteJi_ élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg____/__ _____________35 , boulevard Royal________________________________________________________ (12) sollicitent) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à___6__________________________mois. (13)

Lgjdép5sanli^andataire>y..A.._A_A_i.____-____________________________________________________ (14) / \ Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes,

Service delsPropriété toteJleCE^qTfTsuxembourg, en date du: 19 août 1987 / .ta- ' ί· Pr. le Ministre de l’Éconj) nie et des Classes Moyennes, à____1.5.______heures J s / rl jj fà.

Ä Ça \ -J* J Le chef du servic^de^ rproptiété intellectuelle,

Coi K A680oz__/]/_ EXPLICATIONS RELATIVES AU FORMULAIRE DEDÉPÔT · f/ Γ' . λ (1) s’il y a lieu "Demande de certificat d’addition au brevet principal, à la demande de brevet principal No............du............"-(2) inscrire les nom, prénom, profession.

( . 7 0 H adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale - (3) inscrire t. / / / lunnm nr<nnm ailrece· Hn manHirain aan(2 mncAÏl »n nmnn^l j initnctnAllA iminî it'nn nnminir en^net c'il v ü IÎpii* "rmritpnfi mr ülncoilî M mialilérfp manriatair^" 52.682

REVENDICATION DE LA PRIORITE

de la demande de brevet / etixxnadèteKdlMtaiiâ; XSK Aux Etats-Unis d'Amérique Du 20 août 1986 (No. 898.273), ; du 1er mai 1987 (No. 045.026) et du 29 juin 1987 (No. 067.996).

Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg au nom de : genetic Systems corporation SEATTLE, Washington 98121 (Etats-Unis d'Amérique) pour : "Anticorps monoclonaux, -peptides et compositions les contenant, destinées au diagnostic et au traitement des infections par le virus HIV." * *

Anticorps monoclonaux, peptides et compositions les contenant destinées au diagnostic et au traitement des infections par le

virus HIV

La présente invention se rapporte d'une manière générale au diagnostic, au traitement et à la prévention des infections virales.

Elle concerne plus particulièrement des compositions 5 et des procédés pour la production d'anticorps monoclonaux ainsi que des peptides utiles dans le diagnostic, la neutralisation et la vaccination contre les infections par virus d'immunodéficience humaine HIV (Human Immunodeficiency Virus).

L'agent d'infection responsable du syndrome d'immuno-10 déficience acquis (SIDA) et ses phases prodromiques, le complexe correspondant au SIDA ARC ("AIDS-related complex"), et le syndrome de lymphadénopathie (LAS), est un nouveau rétro-virus lymphotrophique. Le virus a été diversement appelé LAV, HTLV-III, ARV, et plus récemment HIV.

15 Etant donné que le virus HIV atteint des proportions pandémiques, le traitement des individus infectés et la prévention de la transmission à des individus exposés et non infectés est d'un intérêt fondamental. Diverses stratégies thérapeutiques ont visé différentes étapes dans le cycle de vie du virus et 20 sont soulignées par Mitsuya et Broder, 1987, Nature 325:773.

Une approche consiste à utiliser des anticorps qui se lient au virus et inhibent la réplication virale, soit en interférant avec l'entrée du virus dans des cellules hôtes, soit par d'autres mécanismes. Une fois que le ou les constituants du 25 virus susceptibles ou sensibles à l'intervention de l'anticorps sont identifiés, on peut espérer que des titres d'anticorps suffisants pour neutraliser le pouvoir infectieux du virus puissent être engendrés par vaccination ou, alternativement, J * 2 par l'administration passive d'immunoglobulines ou d'anticorps monoclonaux de spécificité désirée.

On pense que les glycoprotéines formant l'enveloppe de la plupart des rétrovirus réagissent avec des molécules récep-5 trices sur la surface des cellules susceptibles, ce qui permet la détermination du pouvoir infectieux du virus pour certains hôtes. Des anticorps qui se lient aux glycoprotéines peuvent bloquer l'interaction du virus avec les récepteurs cellulaires, en neutralisant le pouvoir d'infection du virus. Voir d'une 10 manière générale, The Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J. Tooze, éd., 1973) et RNA Tumor Viruses, 226, 236 (R. Weiss et autres, eds., 1982) ces deux documents étant cités ici dans leur totalité à titre de référence. Voir également, Gonzalez-Scarano et autres, 1982, Virology 120:42 (La Crosse 15 Virus); Matsuno et Inouye, 1983, Infect. Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); et Mathews et autres, 1982, J. Immunol. , 129:2763 (Encephalomyelitis Virus).

La structure générale d'un virus HIV est celle d'un noyau de ribonucléoprotéine entouré par une enveloppe conte-20 nant des lipides que le virus acquiert au cours d'un bourgeonnement à partir de la membrane de la cellule hôte infectée. Logées à l'intérieur de l'enveloppe et faisant saillie de celle-ci, on trouve les glycoprotéines codées du virus.

Les glycoprotéines de l'enveloppe du HIV sont initialement 25 synthétisées dans la cellule infectée sous la forme d'une molécule précurseur de 150.000-160.000 daltons (gpl50 ou gpl60) , qui est ensuite traitée dans la cellule pour former un fragment N-terminal de 110.000-120.000 daltons (gpllO ou gpl20) afin d'engendrer la glycoprotéine externe, et un 30 fragment C-terminal de 41.000-46.000 daltons (gp 41), qui représente la glycoprotéine d'enveloppe transmembranaire.

Pour les raisons données ci-dessus, la glycoprotéine gpllO du virus HIV a été l'objet de recherche importantes en tant que cible potentielle pour interrompre le cycle de vie 35 du virus. On a montré que des sérums d'individus infectés 3 * 3 par HIV neutralisaient HIV _in vitro , et que des anticorps qui se lient à gpllO purifié sont présents dans les sérums.

Voir Robert-Guroff et autres, 1985, Nature 316:72; Weiss et autres, 1985, Nature 316:69; et Mathews et autres, 1986, 5 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 83:9709. La molécule gpllO recombinante et purifiée peut stimuler la production des anticorps de sérum neutralisant lorsqu'on l'utilise pour immuniser des animaux, voir Robey et autres, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A., 83:7023; Lasky et autres, 1986, Science 10 233:209; et pour immuniser un être humain, voir Zagury et autres, 1986, Nature 326:249. La liaison de la molécule gpllO au récepteur (T4) CD4 a également été décrite , et des anticorps monoclonaux qui reconnaissent certains épitopes du récepteur CD4 ont été décrits comme bloquant la liaison HIV, 15 la formation syncytiale et le pouvoir infectieux. Voir McDougal et autres, 1986, Science 231:382. Putney et autres (1986, Science 234:1392) ont découvert des anticorps de sérums neutralisants chez des animaux après immunisation avec une protéine de fusion recombinante contenant la moitié du 20 carboxyle-terminal de la molécule gpllO et ont en outre démontré que la glycosylation de la protéine d'enveloppe n'est pas nécessaire pour une réponse d'anticorps neutralisante.

Un vaccin en sous-unité pour le SIDA utilisant la molécule gpllO de HIV ou des parties de celle-ci peut ainsi 25 être désirable. Des vaccins formant sous-unités constituent une alternative à des vaccins préparés à partir de virus atténués ou inactivés. Les vaccins inactivés sont préoccupants étant donné le défaut possible qu'ils présentent pour tuer toutes les particules virales, et les vaccins atténués peuvent 30 posséder un pouvoir de mutation et retrouver leur capacité à provoquer la maladie. Avec des vaccins de sous-unités, seulement les parties du virus qui contiennent les antigènes ou les épitopes qui sont capables de faire apparaître des réponses immunitaires, c'est-à-dire des anticorps neutralisants, 35 ADCC, et une réponse de cellule T cytoxique, sont utilisées * Jr 4 pour immuniser l'hôte. Un avantage majeur des vaccins de sous-unités est que le matériau viral non intéressant est exclus.

Des sous-unités virales utilisables dans un vaccin 5 peuvent être produites par plusieurs procédés. A titre d'exemple, la glycoprotéine d'enveloppe peut être exprimée et purifiée à partir d'un hôte bactérien, bien que cette molécule puisse être déficiente au niveau de la plupart des modifications post-translationnelles (telle que la glycosylation), ou iO à partir d'autres procédés. Une telle modification peut être obtenue en utilisant un système d'expression eucaryotique, tel que la levure ou des cellules de mammifère cultivées.

Des gènes de virus ont été introduits dans des cellules de mammifère en utilisant le virus des vaccins comme vecteur.

15 Voir par exemple Mackett M. et autres, 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:741b; Panicali, D. et Paoletti, E., 1982, Proc, Nat. Acad. Sei USA 79:4927. Un virus de vaccin recombinant peut être construit suivant la méthode de Hu et autres,

Nature 320:537 (1986) ou Chakrabarti et autres, Nature 320:535 20 (1986), ces deux documents étant donnés ici à titre de réfé rence. Dans ces systèmes, les glycoprotéines virales produites par des cellules infectées avec des vaccins recombinants sont glycosylées d'une manière appropriée et peuvent être transportées jusqu'à la surface de la cellule pour extrusion et 25 isolation ultime.

Une importante phase dans la production d'un vaccin de sous-unité est la purification adéquate de la glycoprotéine désirée à partir du mélange complexe du système d'expression. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour accomplir la 30 purification. Celles-ci comprennent , mais ne sont pas limitées à, l'électrophorèse sur gel polyacrylamide préparative, la chromatographie de perméation sur gel et diverses méthodes de chromatographie (c'est-à-dire échange d'ions, phase inverse, immunoaffinité, interaction hydrophobe), ainsi que d'autres 35 méthodes. La plupart de ces méthodes sont utilisées suivant -î -t 5 diverses combinaisons pour réaliser des préparations sensiblement pures (Kleid , D.G., et autres, 1981, Science 214:1125; Cabradilla, C.D. et autres, 1986, Biotechnology 4:128, Dowbenko, D.J., 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:7748), 5 ces articles étant donnés ici à titre de référence.

Des méthodes qui réduisent le nombre de phases requises pour réaliser la purification maximum d'un antigène viral particulier à partir d'un mélange d'expression complexe, sont nécessaires pour fabriquer des vaccins de sous-unités. La 10 séparation efficace des antigènes des composants étrangers pourrait être réalisée en utilisant une chromatographie d'immunoaffinité. Cette technique, également connue sous l'appellation immuno-adsorption, consiste dans son principe à adsorber sélectivement un antigène sur un support solide 15 sur lequel un anticorps spécifique a été fixé de façon covalente. L'antigène adsorbé sélectivement est ensuite élué à partir, d'un tel adsorbant à affinité d'anticorps, en changeant par exemple le pH et/ou la force ionique du tampon.

Des anticorps polyclonaux, obtenus à partir d'animaux 20 immunisés avec l'antigène désiré ou à partir d'individus naturellement infectés ou contaminés (voir par exemple Lasky et autres, supra), ont été utilisés fréquemment comme immuno-adsorbants, mais, en général, ces réactifs présentent des inconvénients substantiels , tels que (i) les anticorps liés 25 au support insoluble ne sont pas tous spécifiques pour la molécule d'intérêt, ce qui nécessite une purification supplémentaire; (ii) les rendements de l'antigène désiré sont fréquemment faibles ; et (iii) les affinités pour l'anticorps varient souvent d'une préparation à l'autre, ce qui exige 30 des modifications dans les processus d'élution. L'utilisation des anticorps monoclonaux spécifiques pour l'antigène viral désiré et destinés à être utilisés dans la préparation de vaccin de sous-unités, plutôt que d'anticorps polyclonaux, devrait contourner ces difficultés.

35 Des anticorps monoclonaux murins qui se lient aux i .t 6 antigènes HIV ont été décrits. Plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des anticorps monoclonaux spécifiques pour la protéine de noyau p25 (voir par exemple di Marzo Veronese et autres, 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:5199 et 5 Chassagne, J., et autres, 1986, J. Immunol. 136:1442). Des anticorps monoclonaux spécifiques pour la glycoprotéine de membrane gp41 ont également été décrits (voir par exemple di Marzo Veronese et autres, 1985, Science 229:1402).

Il demeure qu'il y a une nécessité dans la technique 10 concernée pour des anticorps monoclonaux spécifiques pour des épitopes dans des régions bien définies de la glycoprotéine d'enveloppe importante, gpllO. Des anticorps monoclonaux qui se lient à ces régions et provoquent une réduction ou une élimination de la réplication et de la trans-15 missibilité du virus HIV présenteraient une utilité prophylactique et thérapeutique substantielle. Par ailleurs, les anticorps monoclonaux pourraient également être utilisés pour purifier la région désirée de gpllO à partir de virus rompus ou brisés, ou de systèmes d'expression recombinants 20 pour une utilisation dans les vaccins, par exemple. En outre, la région contenant l'épitope ou les épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux pourrait être chimiquement synthétisée, ce qui permet d'éviter les difficultés inhérentes à la purification et l'administration des fragments plus gros 25 de la molécule gpllO. La présente invention répond aux besoins ci-dessus ainsi qu'à d'autres.

La présente invention propose des peptides capables d'imiter ou de mimer immunologiquement des épitopes neutralisants de protéines HIV, des sondes d'acide nucléique codant 30 de tels peptides et des anticorps monoclonaux réagissant avec de tels peptides, aussi bien que d'autres peptides interférant avec le pouvoir infectieux de HIV. Ces nouveaux matériaux trouvent une utilité par exemple dans les essais de diagnostic pour la détection des infections par HIV et dans les actions 35 thérapeutiques pour le traitement de ou la vaccination contre * « 7 de telles infections.

La présente invention a pour objet des nouvelles compositions et des nouveaux procédés pour neutraliser les infections par HIV, c'est-à-dire pour la prévention ou 5 l'inhibition substantielle de la formation ou de la transmission cellulaire des infections HIV chez un hôte. Plus particulièrement, des peptides imitant une région neutralisante du HIV et des anticorps monoclonaux réagissant avec une telle région sont utilisés pour diagnostiquer, traiter et 10 vacciner contre les infections HIV. A cet égard, l'expression "région neutralisante" indique les parties de HIV, particulièrement les protéines HIV, contenant des segments d'acides aminés définissant un ou plusieurs épitopes réagissant avec des anticorps qui, soit individuellement ou en combinaison 15 avec d'autres anticorps de la présente invention, sont capables de neutraliser les infections par HIV. Des tests convenables pour la neutralisation sont bien connus et peuvent comprendre la réduction des infections par HIV dans les lignées de cellules T, la réduction d'unités formant des plaques de 20 pseudotypes VSV (HIV) portant les glycoprotéines d'enveloppe de HIV, les essais d'inhibition syncytiale, et les essais de liaison récepteur virion. Si on le désire, l'activité neutralisante peut être comparée à la réactivité d'anticorps dans les tests immunochimiques tels que l'essai d'immuno-25 fluorescence, d'immunoblot et de radioimmunoprécipitation.

Suivant un aspect de l'invention, les nouveaux peptides, qui d'une manière typique possèdent moins d'environ 50 acides aminés, contiennent cinq ou plus d'acides aminés contigus formant des épitopes sensiblement similaires aux épitopes situés sur les 30 régions neutralisantes de gpllO ou p25 de HIV, codées par les régions env et gag respectivement, du génome HIV. Les régions qui sont d'un intérêt particulier sont celles qui s'étendent depuis environ 301 résidus d'acides aminés jusqu'à environ 336 de gpllO , et depuis environ 278 jusqu'à environ 35 319 et depuis environ 315 jusqu'à environ 363 de p25, tous « Γ 8 provenant de la souche HIV désignée LAVBRy. Les désignations de résidus d'acides aminés proviennent de la Banque de Données de Los Alamos (Base de données de séquence virus SIDA, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, 5 Los Alamos, NM 87545).

Les familiers de la technique apprécieront que des régions analogues supplémentaires ("homologues") à partir d'autres isolats HIV peuvent être identifiées sur la base de leur situation à l'intérieur des protéines correspondantes 10 à partir d'isolats divers. En pratique, de tels homologues peuvent être identifiés par référence aux données de séquence LAVßRu > comme suit : (a) Les séquences d'acides aminés d'isolats HIV et de LAVbru peuvent être alignées pour obtenir une homologie 15 maximum entre les deux séquences; (b) Des peptides comprenant des séquences d'acides aminés d'isolats HIV correspondant au site des peptides de LAVgpu Qui imitent immunologiquement les protéines LAVBRU peuvent être identifiés. Les peptides comprenant des séquen- 20 cas d'acides aminés d'isolats HIV ainsi identifiés imitent ou miment immunologiquement , et ce d'une manière typique, les protéines correspondantes d'isolat HIV.

Cette méthode peut être appliquée aux souches HIV qui sont encore à découvrir. Par exemple, lorsque des nou-25 velles souches de HIV sont identifiées, leurs séquences d'acides aminés de noyau et d'enveloppe peuvent être alignées avec celle de LAVRR^ pour obtenir une homologie maximum. Les méthodes grâce auxquelles les séquences sont alignées, sont connues de ceux qui sont familiers de la technique. En 30 alignant les séquences, il est désirable de maintenir autant d'homologie que possible entre les résidus de cystéine. La séquence d'acides aminés de la nouvelle espèce ou souche HIV, qui correspond à la situation ou au site des peptides spécifiquement décrits présentement, peut être synthétisée et 35 utilisée suivant la présente invention.

Λ t 9

Une autre méthode pour déterminer les séquences d'une région homologue dans d'autres souches HIV est décrite par Scharf et autres, Science (1986) 233:1076. Elle utilise deux amorces d'oligonucléotides qui se lient à des séquences 5 conservées à l'extérieur de la région de séquence d'intérêt, et contiennent différents sites restrictifs dans chaque amorce. De l'ADN à partir de souches HIV peut alors être amplifié in vitro par la suite, et les oligonucléotides résultants peuvent être clonés en vecteurs pour une analyse 10 de séquence , et incorporés dans un vaccin sous la forme d'une cassette représentant un épitope particulier de la souche HIV.

Il n'est pas nécessaire pour la présente invention que les épitopes contenus à l'intérieur de telles séquences soient réactifs par réaction croisée avec des anticorps pour toutes les souches ou espèces de HIV. Les peptides englobant des épitopes immunologiques qui distinguent une espèce ou un sérogroupe d'un autre, trouvent une utilité dans l'identification des espèces ou sérogroupes particuliers, 20 et peuvent en fait aider à l'identification des individus infectés par une ou plusieurs espèces ou sérogroupes de HIV. Ils peuvent également être utiles en combinaison avec d'autres peptides à partir de soit une région homologue ou une autre région neutralisante, dans des compositions 25 thérapeutiques.

Les peptides d'intérêt proviennent très préférablement de la région gllO du virus. Les peptides présentant un intérêt particulier dans cette région sont les peptides codés dans le cadre de lecture ouvert env s'étendant depuis 20 environ la paire de base (bp) 6667 jusqu'à environ 6774 de l'isolat LAVbru . Ainsi, diverses régions homologues d'autres isolats HIV comprennent les séquences homologues obtenues à partir de la Banque de Données de Los Alamos (sauf LAV2) , comme énoncé dans le Tableau I.

X I

10 TABLEAU 1.

tiXB2 TGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGA...............ATCCGTATD

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArg...............IleArglle 309 BH102-----------------------------Ser----------------------- 309 - BH8 ------------------------------Lys---------------------- 309 HXB3 -----------------------------Lys----------------------- 309 H9M ------------------------------Ser---------------------- 309 BRU ----------------------------Ser-------------------- 314 MAL --------Gly------------ArgGly----------------HisPhe 314 ELI ---Ala-----TyrGln--------Gin-------------ThrPro-- 310 ARV2 Ser-----------------Tyr--- 312 WM J 2 ---------Tyr------Val---ArgSer--------------LeuSer 306 10 RFENV--------------------------Ser-----------------ThrLys 322 26 ---------TyrLys-------GlnSer--------ThrPro--- 311 Z3 ------------GlySerAspLysLyslle---------------—-GlnSer 306 NY5 ---------------------Lys---Gly---------------Ala-- 304 CDC42---------------His------------ValThrLeu............... 320 LAV2 ------------Gly---Lys---Val---Gin----——-------—MeCLeu 302

HXB2 CAGAGA.........GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGQAAATATG

1 GlnArg.........GlyProGlyArgAlaPheValThrlleGlyLysIleGlyAsnMet 326 BH102 ------------------------------------------------------------ 326 BH8 ------------------------------------------------------------326 HXB3 ----------------------------------------------------------326 H9M ---------------------------------------------------326 BRU -----------------------------------------------------331 MAL ......—----------—-Gin---LeuTyr---Thr--IlaVal---Asp Ile 329 20 ELI GlyLeu------------...GlnSerLeuTyrThr---Arg---IleValSerArgSer 323 ARV2 -------------------------------His---Thr---Arg—-IleGlyAsp 327 WMJ2 ......—----------------------Arg--ArgGlu...---IleGlylle 320 RFENV--------------------------ValIleTyrAlalhr--Gin---IleGlyAsp 337 Z6 GlyLeu—---------... GlnAlaLeuTyrThr--Arg—ArgThrLysIlelle 327 Z3 Argile-------------LysVal--TyrAlaLys---Gly............ 319 NY5 GlyPro------------...------ThrLeuTyrAlaArgGlu----------Asplle 320 CDC42 .........................—ValTrpTyr---Thr---Glu---LeuGlyAsn 335 25 LAV2 MetSer-----------------HisVal--HisSerHisTyrGlnProIle---Lys 323

11XB2 ... AGA... CAAGCACATTGT

...Arg...GlnAlaHisCys 331 BH102 --------------------- 331 BH8 ---------------------331 HXB3 --------------------331 30 H9M ---------------------331 BRU ---------------------336 MAL ---------Arg---Tyr---334 fcLl IlelleGly------------330 ARV2 Ile---Lys...---------333 WM J 2 Ile------------------326 RFENV Ile--Lys...---------343 ,- Z6 Gly...---------------334 Z3 IleThrGly------------326 NY5 ---------------------J25 CDC42 Ile------------------341 LAV2 ArgProArg------Mec---330 I Λ 11 D'autres peptides convenables pour engendrer ou obtenir par "screening" des anticorps monoclonaux, comprennent ceux codés dans le cadre de lecture ouvert env depuis environ bp 7246 jusqu'à environ 7317 de LAVggy. De tels anticorps 5 et peptides réactifs sont particulièrement utiles dans les tests d'immunisation.

Dans la région gag de l'isolat LAVggy, les séquences d'acides aminés p25 depuis environ 278 jusqu'à 319 et depuis 315 jusqu'à 363 sont des régions neutralisantes supplémen-10 taires de HIV. Ceux qui sont familiers de cette technique pourront comprendre que des régions de neutralisation supplémentaires de HIV peuvent être identifiées en se basant sur les enseignements donnés ici; en particulier, des combinaisons d'anticorps monoclonaux réagissant avec divers 15 épitopes HIV différents présentent une activité de neutralisation.

Le peptide I, également appelé peptide 29 est codé dans le cadre de lecture ouvert env depuis un nombre de résidus d'acides aminés d'environ 308 jusqu'à environ 328, 20 et présentera la séquence suivante d'acides aminés, où les oligopeptides inclus dans la séquence suivante comprendront des épitopes linéaires à l'intérieur d'une telle séquence : I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-25 Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-

Ile-Y' dans laquelle Y et Y' , s'ils sont présents, représentent chacun des séquences jusqu'à environ vingt acides aminés. Lorsqu'Y et/ou Y' sont présents, ils peuvent comprendre, par 30 exemple, un ou plusieurs acides aminés à partir de séquences qui sont disposées à côté des résidus d'acides aminés 308 à 328 de la séquence d'enveloppe HIV ou de n'importe quelle partie de ces séquences latérales ou disposées à côté. A titre d'exemple non limitatif, Y peut comprendre toute ou des 35 parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe l-AV ^ « * 12 depuis environ un nombre de résidus 301 à 307; et Y' peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe depuis un nombre de résidus d'environ 329 à 336 comme suit : 5 II (29a)

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-

Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-

Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

Alternativement, des séquences tronquées de pe.ptides 10 selon la présente invention peuvent être préparées. A cet égard, les séquences suivantes du peptide 29 peuvent être particulièrement utiles : III (29b) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-15 Y' dans laquelle Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à environ vingt .résidus d'acides aminés.

IV (29c) 20 Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-

Ile-Gly-Lys-Ile-Y' dans laquelle Y et Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à environ vingt résidus d'acides aminés.

25 Suivant un autre mode de réalisation, des régions homologues de l'isolat ARV-2, d'un intérêt particulier,· sont codées dans le cadre de lecture ouvert env depuis des nombres de résidus d'acides aminés d'environ 306 à environ 323 et présentent d'une manière typique, les séquences d'acides 30 aminés suivantes, où les oligopeptides inclus dans la séquence d'acides aminés suivante comprennent des épitopes linéaires à l'intérieur d'une telle séquence : V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-35 Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y' «r * 13 dans laquelle Y et Y', s'ils sont présents, représentent chacun de un jusqu'à environ vingt ou plus de résidus d'acides aminés. Si Y et/ou Y' sont présents, ils peuvent comprendre un ou plusieurs résidus d'acides aminés de sé-5 quences qui sont disposées à côté de résidus d'acides aminés 306 à 323 de la séquence d'enveloppe ARV-2 ou de n'importe quelle partie de ces séquences latérales ou disposées à côté.

En particulier, Y peut comprendre toute ou des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe HIV depuis environ des 10 nombres de résidus 299 à 306; Y' peut comprendre toute ou1 des parties de la séquence d'acides aminés d'enveloppe HIV depuis des nombres de résidus 324 à 333.

Alternativement, des séquences tronquées de peptide V peuvent être préparées . A cet égard, les séquences suivantes 15 peuvent être particulièrement utiles : VI (177a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y'; et

VII

Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-20 Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-

Cys-Y' dans lesquelles Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à vingt ou plus de résidus d'acides aminés.

25 Un autre exemple comprend des régions homologues de l'isolat LAV-2, telles que codées dans le cadre de lecture ouvert env depuis environ un nombre de résidus d'acides aminés 311 à 330, et présentent d'une manière typique la séquence suivante : 30 VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y' dans laquelle Y et/ou Y', s'ils sont présents, représentent chacun des séquences de jusqu'à vingt ou plus de résidus 35 d'acides aminés. (Voir article dans Nature 326:662 (1987), 14 qui est donné ici à titre de référence).

Suivant un autre aspect de la présente invention, des nouvelles lignées cellulaires capables de produire des anticorps monoclonaux et des compositions comprenant de tels 5 anticorps sont proposées , lesquels anticorps sont capables de reconnaître sélectivement à des titres extrêmement élevés 2 4 7 (de 10 , à 10 jusqu'à environ 10 ou plus) des régions neutralisantes contenues dans une séquence prédéterminée de glycoprotéines d'enveloppe gpllO ou p25, leurs précurseurs 10 (je protéine , les protéines de fusion recombinantes biologiquement exprimées , et les peptides de synthèse qui contiennent un ou plusieurs épitopes dans la région de séquence prédéterminée de gpllO ou p25. Les cellules hybrides objet de l'invention présentent un chromosome identifiable 15 dans lequel l'ADN de lignée germinale s'est réarrangé pour coder un anticorps possédant un site de liaison pour un épitope sur gpllO ou p25 commun à quelques ou tous les isolats cliniques HIV. Ces anticorps monoclonaux peuvent être utilisés suivant une grande variété de manières incluant les 20 diagnostics et la thérapie, aussi bien que pour identifier d'autres anticorps réagissant de façon croisée, tels que les anticorps de blocage. Les peptides ou polypeptides contenant l'épitope ou les épitopes avec lesquels ils réagissent peuvent trouver des utilisations séparées comme immunogènes 25 pour les vaccins, ou comme agents thérapeutiques.

Peptides de blocage

Suivant un autre mode de réalisation de la présente invention, on utilise, pour une utilisation conjointe avec les anticorps monoclonaux de neutralisation ou les peptides 30 précédents, des peptides supplémentaires ou anticorps qui interfèrent avec la liaison HIV aux récepteurs pour en outre modérer le pouvoir infectieux de HIV. De préférence, des peptides appelés "peptides bloquants" capables d'inhiber la profilération du virus, aussi bien que des anticorps mono-35 clonaux spécifiques pour les épitopes contenus dans de tels 15 peptides bloquants, peuvent être utilisés pour augmenter l'efficacité des traitements contre les infections par HIV.

Les peptides de blocage HIV correspondent d'une manière typique aux séquences d'acides aminés de HIV que l'on estime 5 être essentielles pour la fixation du virus sur une cellule hôte, tel que les résidus d'acides aminés codés env d'environ 190 à environ 197 de LAV^^ et d'environ 185 à environ 192 de ARV-2 et HTLV-III(BH-IO). Ces peptides comprennent 1'octapeptide T (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) et ses 10 divers dérivés (voir IX ci-dessous) et les analogues (par exemple XI ci-dessous) décrits par Pert et autres (1986,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9254-9258, laquelle publication est donnée ici à titre de référence) situés sur la glycoprotéine d'enveloppe (gpllO ou 120).

15 Par exemple, les peptides de blocage possédant les séquences suivantes sont d'un intérêt particulier, de préférence avec une acétylation du NH2-terminal et une amidation du COOH-terminal: IX (173D) 20 Y-^Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y'; X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y ’ ; XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y ' ; 25 XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y ' ; XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y ' ; XIV (190) 30 Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y ' ; XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y'; dans lesquelles, pour chaque peptide, Y et Y', s'ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés de 35 jusqu'à environ 20 acides aminés. Les épitopes ou déterminants 16 antigéniques dans ces peptides sont d'une manière typique définis par au moins environ cinq acides aminés contigus, et trouvent une utilisation dans par exemple l'imitation des sites antigènes HIV se produisant naturellement pour produire 5 des anticorps réactifs HIV et des vaccins.

Production des anticorps monoclonaux

La préparation des anticorps monoclonaux peut être réalisée en immortalisant l'expression des séquences d'acides nucléiques qui codent des anticorps spécifiques pour HIV, en 10 introduisant de telles séquences, typiquement ADNc codant pour l'anticorps, dans un hôte capable d'être cultivé dans une culture. La lignée cellulaire immortalisée peut être une lignée cellulaire de mammifère qui a été transformée par oncogenèse, par transfection, mutation ou analogues. De 15 telles cellules comprennent les lignées de myélomes, les lignées de lymphomes ou d'autres lignées cellulaires capables de supporter l'expression et la sécrétion de l'anticorps in vitro. L'anticorps peut être une immunoglobuline se produisant naturellement d'un mammifère, produite par trans-20 formation d'un lymphocyte, particulièrement d'un splénocyte, au moyen d'un virus ou par fusion du lymphocyte avec une cellule néoplasique, par exemple un myélome, pour produire une lignée cellulaire hybride. D'une manière typique, le splénocyte sera obtenu à partir d'un animal immunisé contre 25 le virus HIV ou un fragment de celui-ci contenant un site épitopique.

Les protocoles d’immunisation sont bien connus et peuvent varier considérablement pour demeurer cependant efficaces. Voir Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and 30 Practice, Academie Presse, 2è édition (1986), qui est donné ici à titre de référence. Un virus rompu ou brisé , des peptides de synthèse, et des protéines de fusion bactérienne qui contiennent des fragments antigéniques de la molécule gpllü ou p25, peuvent être utilisés comme immunogènes. De 35 préférence, l'immunogène du virus brisé, des peptides ou des

* A

17 protéines recombinantes sera enrichi en protéines ou en ses fragments contenant les épitopes pour lesquels les cellules B produisant l'anticorps ou les splénocytes sont désirés.

Plus particulièrement, des solutions contenant des extraits 5 ou lysats de virus brisé ou rompu, ou des surnageants de protéines recombinantes biologiquement exprimées ou des vecteurs d'expression rompus ou séparés, peuvent être enrichis en glycoprotéines, si on le désire, en utilisant des méthodes de purification, telles que par exemple, l'électrophorèse 10 sur gel polyacrylamide. La purification d’affinité par lectine est une méthode pratique et préférée pour purifier gpllO et d'autres glycoprotéines, par exemple la purification d’affinité utilisant la lectine de lentille. L'étendue jusqu'à laquelle les glycoprotéines sont purifiées à partir 15 des solutions pour une utilisation comme immunogènes, peut varier d’une manière importante, c'est-à-dire de moins de 50%, habituellement ou au moins de 75% à 95% , d'une manière désirable de 95% à 99% et, plus désirablement , jusqu'à l'homogénéité absolue.

20 Une fois que les protéines ont été purifiées jusqu'au degré désiré, elles peuvent être mises en suspension ou diluées dans un support physiologique approprié pour immunisation, ou bien peuvent être couplées à un adjuvant. Une technique préférée, par exemple, consiste en l'adsorption des 25 protéines et de leurs fragments sur de l'agarose de lectine de lentille ou sur un autre support macromoléculaire pour l'injection. Des quantités immunogènes de préparations antigéniques enrichies en protéines HIV, comprenant la glycoprotéine gpllO et la protéine de noyau p25 ou des 30 fractions antigèniques de celles-ci, sont injectées , généralement à des- concentrations comprises dans l'intervalle 1 pg à 20 mg/kg d'hôte. L'administration peut se faire par injection, par exemple intramusculaire, péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse etc. L'administration peut se faire en une 35 ou plusieurs fois, habituellement suivant des intervalles de A t 18 une à quatre semaines. Les animaux immunisés sont contrôlés pour la production de l'anticorps en les antigènes désirés, puis les rates sont enlevées et les lymphocytes B spléniques isolés et combinés avec une lignée cellulaire de myélomes 5 ou transformés. La transformation ou la fusion peut être réalisée suivant des manières classiques, la technique de fusion ou combinaison étant décrite dans un grand nombre de brevets, par exemple les brevets américains N° 4 172 124; N° 4 350 683; N° 4 363 799; N° 4 381 292; et N° 4 423 147.

10 Voir encore , Kennett et autres, Monoclonal Antibodies (1980), et les références citées dans cet article qui sont citées à titre de référence, et voir encore Goding, supra.

Les lignées cellulaires immortalisées peuvent être clonées et triées , suivant les techniques classiques , et 15 on détecte les anticorps dans les produits surnageants qui sont capables de se lier aux protéines virales HIV désirées de gpllO ou p25 , les protéines de fusion recombinantes ou les peptides de synthèse qui contiennent la région épitopique désirée. Les lignées de cellules immortalisées appropriées 20 peuvent ensuite être soumises à une croissance i£ vitro ou injectées dans la cavité péritonéale d'un hôte approprié pour production d'un fluide ascite. En vertu du fait que l'on dispose de certains anticorps de la présente invention qui sont connus comme étant spécifiques pour des épitopes contenus 25 par exemple dans les régions codées par la région génomique LAVgpnj d'environ 6688 bp à environ 6750 bp (peptide codant 29), ou d'environ 7246 bp à environ 7317 (peptide codant 36) (numérotage bp selon Wain-Hobson et autres, Cell 44:9 1985, qui est donné ici à titre de référence), les surnageants 30 peuvent être sélectionnés en compétition avec les anticorps monoclonaux objet de l'invention dans un test de compétition. Ainsi, des lignées cellulaires d'hybridomes immortalisées supplémentaires avec les caractérisques de liaison désirées peuvent être produites facilement à partir d'une variété de 35 sources en fonction de la disponibilité des anticorps * * 19 présents spécifiques pour l'antigène particulier. Alternativement, ces lignées cellulaires peuvent être combinées avec d'autres cellules B néoplasiques, où de telles autres cellules B peuvent servir comme récipients pour l'ADN du 5 génome codant pour l'anticorps.

Bien que des cellules B néoplasiques de rongeur, particulièrement murin soient préférées, d'autres espèces de mammifères peuvent être utilisées telles que lagomorphe, bovin, ovin, équin, porcin, avien ou analogues. L'immunisa-10 tion de ces animaux peut être facilement réalisée et leurs lymphocytes, particulièrement les splénocytes, peuvent être obtenus pour des fusions.

L'anticorps monoclonal sécrété par les lignées cellulaires hybrides ou transformées peut être l'un quelconque 15 des classes ou sous-classes d ' immunoglobulines, telles que IgM, IgD, IgA, IgG^ ou IgE. Etant donné que IgG est l'isotype le plus commun utilisé dans les tests de diagnostic, il est souvent préféré. Les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés intacts, ou sous la forme de fragments, tels 20 que Fv, Fab, F ( a b ' )21 mais habituellement intacts.

Pour atténuer l'antigénicité possible dans un hôte humain d'un anticorps monoclonal, dérivé d'un animal autre qu'un être humain, des anticorps chimériques peuvent être construits, dans lesquels le fragment de liaison à l'antigène 25 d'une molécule d'immunoglobuline (région variable), est relié par une liaison peptidique à au moins une partie d'une autre protéine non reconnue comme étrangère par les humains, telle que la partie évacuée d'une molécule d'immunoglobuline humaine. Ceci peut être réalisé en fusionnant ou combinant 30 des exons de régions variables d'animal avec des exons de régions constantes gamma ou kapa d'un être humain. Diverses techniques sont connues par ceux familiers de la technique, telles que celles décrites dans la demande de brevet international N° 86/01533, et dans les demandes de brevets 35 européens 171496 et 173494, qui sont données ici à titre J* ·> 20 de référence.

Utilisation et formulations pharmaceutiques

Les anticorps monoclonaux de cette invention qui présentent une activité de neutralisation, tels que ceux qui 5 réagissent avec un site épitopique sur gpllO ou p25 ou qui réagissent avec un peptide de blocage, peuvent également être incorporés comme constituants d'une composition pharmaceutique pour atténuer les infections par HIV. La composition doit contenir une quantité prophylactique ou thérapeutique 10 d'au moins l'un des anticorps monoclonaux de cette invention avec un support pharmaceutiquement efficace. Le support pharmaceutique..doit être constitué par n'importe quel substance compatible, non toxique et convenable pour permettre l'administration des anticorps monoclonaux au malade. De 15 l'eau stérile, de l'alcool, des produits gras, des cires et des produits solides inertes peuvent être utilisés comme support. Des adjuvants pharmaceutiquement acceptables (agents tampon, agents de dispersion) peuvent également être incorporés dans la composition pharmaceutique. De telles 20 compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique de façon à être par exemple spécifiques pour des souches de HIV avec des glycoprotéines d'enveloppe contenant un site épitopique dans une région codée par 6688 bp-6750 bp. Alternativement, la composition pharmaceutique peut contenir 25 un ou plusieurs anticorps monoclonaux pour former un "cocktail". Par exemple, un cocktail contenant des anticorps monoclonaux contre les diverses souches de HIV constituerait un produit universel avec une activité prophylactique ou thérapeutique contre la grande majorité des isolats cliniques 30 de HIV. Le cocktail peut contenir des anticorps monoclonaux qui se lient à des protéines ou des glycoprotéines de HIV autres que gpllO ou p25, telles que, par exemple, à la glycoprotéine gp41 ou à 1'intégrase/p34 nucléase. Le rapport molaire des divers constituants d'anticorps monoclonaux ne 35 différera habituellement pas de plus d'un facteur 10, plus *' * 21 habituellement de pas plus d'un facteur 5, et sera habituellement compris entre environ 1:1-2 pour chacun des autres constituants d'anticorps.

Les anticorps monoclonaux de la présente invention 5 peuvent être utilisés sous la forme de compositions administrées séparément et données en conjonction avec d'autres agents anti-rétroviraux, comprenant des peptides de blocage. L'état actuel du développement des agents anti-rétroviraux, et des agents anti-HIV en particulier, est décrit dans la 10 publication de Mitsuya et autres, Nature 32b:773-778, 1987, qui est donnée ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux, les peptides et les compositions pharmaceutiques de ceux-ci selon la présente invention sont particulièrement utiles pour une administrais tion par voie orale ou parentérale.

De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie parentérale, c'est-à-dire par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Ainsi, cette invention propose des compositions pour une 20 administration parentérale , qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal, d'un peptide ou d'un cocktail de ceux-ci, dissous dans un support acceptable, de préférence un support aqueux. Une grande variété de supports aqueux peut être utilisée, par exemple l'eau, l'eau tamponnée, une 25 solution saline 0,4%, de glycine 0,3% ou analogues. Ces solutions sont stériles et généralement dépourvues de particules. Ces compositions peuvent être stérilisées par des techniques classiques et bien connues de stérilisation. Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires 30 pharmaceutiquement acceptables comme exigé pour satisfaire approximativement aux conditions physiologiques, tels que les agents tampon et d'ajustage du pH, les agents d'ajustage de la toxicité ou analogues, par exemple l'acétate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure 35 de calcium, le lactate de sodium etc. La concentration de *' Λ 22 l'anticorps dans ces formulations peut varier d'une manière importante, c'est-à-dire de moins environ 0,5%, habituellement à ou au moins environ 1% jusqu'à autant que 15 ou 20% en poids, et la concentration sera choisie essentiellement 5 en fonction des volumes de fluide, des viscosités, etc., de préférence en fonction du mode particulier d'administration choisi.

Ainsi, une composition pharmaceutique typique pour injection intramusculaire pourra être confectionnée de façon 10 à contenir 1 ml d'eau tamponnée stérile, et 50 mg d'anticorps monoclonal. Une composition typique pour injection intraveineuse pourrait être confectionnée de façon à contenir 250 ml de solution de Ringer stérile , et 150 mg d'anticorps monoclonal. Des méthodes pour préparer des compositions 15 administrables par voie parentérale sont bien connues de ceux qui sont familiers de la technique et sont décrites en plus de détail dans par exemple la publication Remington's Pharma-ceutical Science, 15è Ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvanie (1980), qui est indiquée ici à titre de 20 référence.

Les anticorps monoclonaux et les peptides de cette invention peuvent être lyophilisés pour le stockage et reconstitués dans un support ou véhicule convenable avant usage. Cette technique s'est montrée comme efficace avec des 25 globulines immunes classiques et des techniques de reconstitution et de lyophilisation connues dans la technique peuvent être utilisées. Il sera apprécié par ceux familiers de la technique que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire à divers degrés de perte d'activité de l'anticorps 30 (par exemple avec des immunoglobulines classiques, des anticorps IgM tendent à avoir une plus grande perte d'activité que les anticorps IgG) et que des niveaux ou proportions d'utilisation peuvent nécessiter un ajustement pour compensation.

35 Les compositions contenant les anticorps monoclonaux ϊ * 23 de la présente invention, les peptides ou leurs cocktails peuvent être administrés pour le traitement thérapeutique et/ou prophylactique des infections par HIV. Dans les applications thérapeutiques, les compositions sont administrées à un 5 malade déjà infecté avec le HIV, suivant une quantité suffisante pour guérir ou au moins partiellement arrêter l'infection et ses complications. Une proportion adéquate pour accomplir ceci est définie comme étant une "dose thérapeutiquement efficace". Des quantités efficaces pour cette utilisation 10 dépendent de la sévérité de l'infection et de l'état général du système immunitaire propre du malade, mais sont généralement comprises entre environ 1 et environ 200 mg d'anticorps par kilogramme de poids du corps, des doses comprises entre 5 et 25 mg par kilogramme étant plus communément utilisées. On 15 doit garder à l'esprit que les matériaux de cette invention peuvent être généralement utilisés dans des états de maladie sérieux , c'est-à-dire dans des situations où la vie est menacée ou potentiellement menacée. Dans de tels cas, il est possible et peut être estimé désirable par le médecin trai-20 tant d'administrer ces anticorps suivant des excès sensibles.

Dans les applications prophylactiques, les compositions contenant les présents peptides, anticorps ou leurs cocktails sont administrées à un malade qui n'est pas déjà infecté par le virus HIV, mais qui a peut-être été récemment exposé ou 25 qui est estimé avoir été exposé à un risque d'infection par le virus ou au virus lui-même, de façon à renforcer la résistance du malade à une telle infection potentielle ou de façon à le vacciner contre le virus. On définit la quantité administrée par une "dose prophylactiquemênt efficace".

30 Dans cette utilisation, les quantités précises dépendent de nouveau de l'état de santé du malade et de son état général immunitaire, mais sont généralement comprises entre 0,1 mg et 25 mg par kilogramme , tout particulièrement entre 0,5 mg et 2,5 mg par kilogramme.

35 Des administrations uniques ou multiples des « » 24 compositions peuvent être réalisées avec des doses et un protocole choisis par le médecin traitant. Dans tous les cas, les formulations pharmaceutiques doivent fournir une quantité de l'anticorps ou des anticorps de cette invention qui sont 5 suffisantes pour traiter efficacement le malade.

En outre, les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent trouver une utilisation en tant que molécule support ou véhicule spécifique pour une cible. Un anticorps peut être lié à une toxine pour former une immunotoxine 10 ou un matériau radioactif ou un médicament pour former un produit pharmaceutique ou radiopharmaceutique . Des procédés pour produire des immunotoxines et des produits radiopharmaceutiques sont bien connus (voir par exemple, Cancer Treatment Reports 68:317 (1984)).

15 II est également possible que des hétéroagrégats d'anticorps monoclonaux de la présente invention et d'activateurs de cellules T humaines, tels que des anticorps monoclonaux pour l'antigène CD3 ou le récepteur gamma F sur des cellules T, puissent permettre à des cellules T humaines ou 20 à des cellules portant Fc-gamma (telles que des cellules K ou neutrophiles) de tuer des cellules infectées par HIV via une cytolyse par l'intermédiaire de cellules dépendant d'anticorps ("antibody dépendent cell-mediated cytolysis" * "ADCC"). De tels hétéroagrégats peuvent être assemblés, par 25 exemple, par liaison covalente des anticorps anti-HIV aux anticorps anti-CD3 en utilisant le réactif hétéro-bifonctionnel N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate, comme décrit par Karpowsky et autres, J. Exp. Med. 160:1686 (1984), cette publication étant donnée ici à titre de référence.

30 Les compositions peptidiques elles-mêmes objet de cette invention peuvent également trouver une utilisation thérapeutique, lorsque l'administration produit la réduction ou l'élimination du virus HIV dans un hôte infecté. Ces compositions , telles que le peptide 29, les peptides de blocage et 35 le peptide 126 peuvent être administrées dans des supports 25 ou véhicules physiologiques appropriés, par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale etc. Divers véhicules comprennent une solution saline tamponnée au phosphate, une solution saline, de l'eau, du 5 chlorure de potassium., du lactate de sodium ou analogues.

La concentration des peptides varie largement en fonction de son usage ultime, de l'activité et du mode d'administration.

De préférence, les peptides comportent une amidation du C00H-terminal, une formylation du Nl^-terminal ou d'autres dérivés 10 pharmaceutiquement acceptables. L'addition de peptides bloquants aux peptides imitant une région du HIV neutralisante et/ou les anticorps spécifiquement réactifs de la présente invention procurera une efficacité thérapeutique accrue de manière significative. D'autres agents anti-HIV peuvent égale-15 ment être inclus dans les formulations (autres que les anticorps monoclonaux qui lient les peptides) tels que la 3'-azido-3'-déoxythymidine, la 2',3'-didéoxycytidine, la 2',3'-didéoxy-2',3'-didéhydrocytidine , etc.

Utilisation des anticorps monoclonaux dans la purification 20 d'immunoaffinité

Des anticorps monoclonaux spécifiques pour les polypeptides contenant gpllO ou d'autres déterminants antigéniques, particulièrement les déterminants antigéniques obtenus à partir des protéines de fusion recombinantes biologiquement 25 exprimées ou des lysats ou extraits d'HIV cultivé, sont particulièrement avantageux pour une utilisation dans les protocoles de purification. Généralement les anticorps possèdent des constantes d'association par affinité de l'ordre 8 12 de 10 à 10 M. De tels anticorps peuvent être utilisés pour 30 purifier les protéines recombinantes à partir du milieu de culture du système d'expression recombinant si la protéine exprimée est sécrétée ou à partir des constituants du système d'expression biologique rompu si elle n'est sécrétée. Généralement, les anticorps monoclonaux qui sont capables de réagir 35 avec gpllO ou d'autres déterminants antigéniques sont attachés * * 26 ou immobilisés sur un substrat ou support. La solution contenant les déterminants antigéniques HIV est ensuite mise en contact avec l'anticorps immobilisé dans des conditions convenables pour la formation de complexes immuns entre 5 l'anticorps et les polypeptides contenant les déterminants antigéniques gpllO. Le matériau non lié est séparé des complexes immuns liés, lesquels complexes ou fragments antigèniques de gpllO sont ensuite séparés du support.

D'une manière typique, les anticorps monoclonaux sont 10 purifiés bruts à partir d'un fluide ascite ou de surnageants, de culture de cellules avant fixation sur un support. De tels processus sont bien connus de ceux familiers de la technique, et peuvent inclure un fractionnement avec des sels neutres à concentration élevée. D'autres méthodes, telles que la 15 chromatographie DEAE , la chromatographie de filtration sur gel, l'électrophorèse sur gel préparative, ou la chromatographie d'affinité protéine A, peuvent également être utilisées pour purifier l'anticorps monoclonal avant son utilisation comme un immunoadsorbant.

20 Le support sur lequel les anticorps monoclonaux sont immobilisés doit avoir les caractéristiques générales suivantes : (a) interactions faibles avec les protéines en général pour minimiser les liaisons non spécifiques, (b) bonnes caractéristiques d'écoulement qui permettent l'écoule-25 ment au travers de matériaux de poids moléculaire élevé, (c) possession de groupes chimiques qui peuvent être activés ou modifiés pour permettre la liaison chimique de l'anticorps monoclonal, (d) stabilité physique et chimique dans les conditions utilisées pour lier l'anticorps monoclonal et (e) 30 stabilité aux conditions et constituants des tampons exigés pour l'adsorption et l'élution de l'antigène. Certains supports communément utilisés sont l'agarose, les polystyrènes dérivés, les polysaccharides, les grains de polyacrylamide, la cellulose activée, le verre et analogues. Diverses méthodes 35 chimiques existent pour la fixation des anticorps sur les ·* * 27 supports formant substrats. Voir généralement Cuatrecasas, P., Advances in Enzymology 36:29 (1972). Les anticorps de la présente invention peuvent être fixés directement sur le support ou, alternativement, par l'intermédiaire d'un bras 5 de liaison ou d'entretoise.

Les conditions générales requises pour l'immobilisation des anticorps monoclonaux sur les supports chromatographiques sont bien connues dans la technique. Voir par exemple Tijssen, P. 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, 10 cette publication étant donnée ici à titre de référence. Les processus actuels de couplage dépendent légèrement des caractéristiques et du type de l'anticorps à coupler. Les anticorps monoclonaux possèdent des caractéristiques qui sont habituellement constantes d'un mélange à l'autre, ce qui 15 permet à de telles conditions ou caractéristiques d'être y optimisées. La fixation se produit typiquement par l'intermédiaire de liaisons covalentes.

Une suspension d'extraits ou lysats de virus HIV, le surnageant d'un système d'expression biologique cultivé, ou 20 une suspension des cellules rompues ou brisées est ensuite ajoutée à la matrice de séparation. Le mélange est incubé sous des conditions et pendant un temps suffisant pour que se produise la formation du complexe immun , habituellement pendant au moins 30 minutes, plus habituellement pendant un 25 temps de 2 à 24 heures. Les complexes immuns contenant des polypeptides avec des parties antigéniques de gpllO sont ensuite séparés du mélange. D'une manière typique, le mélange est enlevé, par exemple par élution, et les complexes immuns liés sont lavés d'une manière exhaustive avec du tampon 30 d'adsorption. Les complexes immuns peuvent être ensuite élues à partir de la matrice de séparation en utilisant un éluant compatible avec le support particulier qui est utilisé, lesquels éluants sont bien connus par ceux qui sont familiers de la technique. Egalement, les polypeptides contenant le 35 gpllO ou d'autres fractions antigèniques peuvent être éliminés -* ·» 28 sélectivement. Par exemple, les peptides qui contiennent un épitope reconnu par les anticorps peuvent être utilisés pour entrer en compétition avec le site de liaison de l'anticorps, ce qui constitue une technique d'élution alternative qui peut 5 être réalisée dans des conditions d'élution douces. Le polypeptide sélectivement adsorbé contenant l'antigène gpllO peut être élue à partir d'un adsorbant d'affinité d’anticorps en altérant le pH et/ou la force ionique du tampon. Des agents chaotropiques peuvent également trouver une utilisation 10 dans l'élimination de l'antigène lié. La sélection de l'agent chaotropique, sa concentration et d'autres conditions d'élution dépendent des caractéristiques de l'interaction anticorps-antigène, mais une fois qu'elles sont déterminées, elles ne doivent pas être soumises à des changements habituellement 15 nécessaires dans les systèmes de séparation par affinité polyclonale.

Le matériau élué peut exiger un ajustage à un pH physiologique si des tampons de force ionique ou pH faibles ou élevés sont utilisés pour séparer les antigènes gpllO liés 20 de la matrice de séparation. Une dialyse ou une chromatographie de filtration sur gel peuvent également être exigées pour éliminer les sels en excès utilisés dans l'éluant de façon à permettre la reconstitution de gpllO ou des polypeptides contenant des fractions antigéniques de gpllO sur 25 des conformations naissantes.

Les procédés de cette invention procurent, par exemple, du gpllO sensiblement purifié ou des polypeptides contenant des fragments antigéniques de celui-ci, soit produits naturellement par des cultures de cellules infectées ou par des 30 systèmes d'expression recombinants de bactéries, levures, ou des cellules de mammifère ou d'insectes cultivées. Le gpllO et les fragments ou d'autres protéines purifiées seront d'une manière typique d'une pureté supérieure à 50%, plus usuellement d'au moins 75% et fréquemment plus grande que 35 95 à 99%. Ces molécules peuvent ensuite trouver un usage «* « 29 ultérieur dans uns grande variété d'applications.

Les protéines de gpllO HIV, les polypeptides contenant des fragments antigéniques de celles-ci, ou d'autres protéines sensiblement purifiées selon les procédés de la présente 5 invention, peuvent trouver une utilisation dans une grande variété d'applications, comprenant les formulations de sous-unités de vaccin SIDA, dans lesquelles l'immunogène comprend une dose efficace de déterminants antigéniques de, par exemple, gpllO ou d'une région neutralisante de gpllO, D'au-10 très constituants de la formulation peuvent inclure les fractions antigéniques des protéines HIV ou des glycoprotéines qui stimulent la production d'anticorps (de préférence anticorps neutralisants) dans un hôte immunisé, lesquels anticorps sont capables de constituer une protection contre une 15 infection subséquente par HIV.

Utilisations pour diagnostic des anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux de la présente invention sont également utiles dans des buts de diagnostic. Ils peuvent être soit marqués ou non marqués dans ce but. Typiquement, 20 des tests de diagnostic permettent la détection de la formation dçun complexe par l'intermédiaire de la liaison de l'anticorps monoclonal sur un antigène HIV. S'ils sont non marqués, les anticorps trouvent l'utilisation par exemple dans les tests d'agglutination. En outre, des anticorps non marqués 25 peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres anticorps marqués (seconds anticorps) qui réagissent avec l'anticorps monoclonal, tels que des anticorps spécifiques pour l'immunoglobuline. Alternativement, les anticorps monoclonaux peuvent être marqués directement. Une grande variété de marqueurs 30 peut être utilisée, tels que des radionucléides, des agents fluorescents, des enzymes, des substrats d'enzyme, des co-facteurs d’enzyme, des inhibiteurs d'enzyme , des ligands (particulièrement haptens) , etc. Divers types d ' immuno-essais sont disponibles, et, à titre d'exemple, ceux décrits dans 35 les brevets américains N°s 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; * * 30 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; et 4 098 876 qui sont donnés ici à titre de référence.

De manière habituelle, les anticorps monoclonaux et les peptides de la présente invention sont utilisés dans des 5 immuno-essais d'enzyme où, par exemple, les anticorps objet de l'invention, ou les seconds anticorps d'une espèce différente, sont conjugués à un enzyme. Lorsqu'un échantillon biologique contenant des antigènes HIV, tels que le sérum sanguin humain, la salive, le sperme, les sécrétions vaginales 10 ou une suspension de culture de cellules infectéespar virus, est combiné avec les anticorps, une liaison se produit entre les anticorps et les molécules présentant l'épitope désiré.

De telles protéines ou particules virales peuvent ensuite être séparées des réactifs non liés, et un second anticorps 15 (marqué avec un enzyme) ajouté. Par la suite, la présence du conjugat anticorps-enzyme spécifiquement lié à l'antigène est déterminée. D'autres techniques classiques bien connues des familiers de la technique peuvent également être utilisées.

Des kits peuvent également être réalisés pour être 20 utilisés avec les anticorps dans la détection de l'infection HIV ou pour la présence de l'antigène HIV. Ainsi, les compositions d'anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent être proposées, habituellement sous forme lyophilisée, soit seules ou conjointement avec des anticorps 25 supplémentaires spécifiques pour d'autres épitopes de HIV.

Les anticorps, qui peuvent être conjugués à un marqueur ou non conjugués, sont inclus dans les kits avec des tampons, tels que Tris, phosphate, carbonate etc..., des stabiliseurs, des biocides, des protéines inertes, par exemple de l'albumine de 30 sérum bovin, ou analogues. D'une manière générale, ces matériaux seront présents suivant une proportion de moins d'environ 5¾ en poids basée sur la quantité d'anticorps actifs, et seront habituellement présents suivant une quantité totale d'au moins environ 0,001% en poids basée sur la 35 concentration d'anticorps. Fréquemment, il est désirable 31 * 9 d'inclure un agent de dilution inerte ou un excipient pour diluer les ingrédients actifs, où l'excipient peut être présent suivant une quantité d'environ 1% à 99% en poids de la composition totale. Si un second anticorps capable de se 5 lier à l'anticorps monoclonal est utilisé, celui-ci sera habituellement présent dans un récipient séparé. Le second anticorps est d'une manière typique conjugué à un marqueur et formulé d'une manière analogue aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus.

10 La détection des antigènes p25 ou de gpllO , ou du virus entier, dans des échantillons biologiques variés peut trouver une utilisation dans le diagnostic d'une infection courante par le virus HIV. Les échantillons biologiques peuvent comprendre, mais ne sont pas limités à, le sérum 15 sanguin, la salive, le sperme, les échantillons de tissus obtenus par biopsie (cerveau, peau, nodosités lymphatiques, rate, etc..), des surnageants de culture de cellules, des systèmes d'expression bactériens et eucaryotiques rompus ou brisés, et analogues. La présence du virus est testée par 20 incubation de l'anticorps monoclonal avec l'échantillon biologique dans des conditions contribuant à la formation d'un complexe immun, ce après quoi on détecte la formation du complexe. Suivant une réalisation, la formation de complexe est détectée par l'utilisation d'un second anticorps capable 25 de se lier à l'anticorps monoclonal qui est typiquement conjugué à un marqueur et formulé d'une manière analogue aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus. Dans une autre réalisation, l'anticorps monoclonal est fixé sur un support à phase solide qui est ensuite mis en contact avec un échan-30 tillon biologique. Après une phase d'incubation, l'anticorps monoclonal marqué est ajouté pour détecter l'antigène lié. Préparation et utilisation des peptides de synthèse

La présente invention a pour objet des nouveaux peptides qui, entre autres, imitent immunologiquement des 35 épitopes de protéine codés par le rétrovirus HIV, 32 particulièrement des épitopes codés dans les régions gag ou env du génome viral codant respectivement gpllO ou p25.

Pour satisfaire les variations de souche à souche, parmi les différents isolats, des ajustements pour les substitutions 5 conservatives, et une sélection parmi les alternatives si des substitutions non-conservatives sont nécessaires, peuvent être réalisés. Ces peptides peuvent être utilisés comme des immunogènes, pour inhiber ou éliminer la production d'antigène HIV in_ vitro ou i£ vivo, pour la détection du virus ou 10 des anticorps sur le virus dans un échantillon physiologique.

En fonction de la nature du protocole, les peptides peuvent être conjugués à un support ou d'autres composés, marqués ou non marqués, liés à une surface solide, ou analogue.

Suivant un mode de réalisation, des peptides d'intérêt 15 peuvent dériver de la région gpllO du virus. La région qui présente un intérêt particulier est celle qui se trouve dans le cadre de lecture ouvert env s'étendant depuis environ la paire de bases 6688 bp jusqu'à environ 6750 bp et depuis environ 7246 bp jusqu'à environ 7317, 20 Les peptides d'intérêt, comprenant les peptides blo quants, comprennent au moins cinq, parfois six, quelquefois huit, parfois douze, parfois 21, habituellement un peu moins que 50, plus habituellement un peu moins qu'environ 35 et de préférence moins d'environ 25 acides aminés compris dans une 25 séquence codée par un rétrovirus HIV. D'une manière désirable, le peptdde sera aussi petit que possible tout en maintenant encore sensiblement toute l'activité antivirale ou d'immunoréactivité du peptide plus important. Dans quelques cas, il peut être désirable de réunir deux ou plus d'oligopeptides 30 qui ne se chevauchent pas pour former une structure de peptide unique ou pour les utiliser comme des peptides individuels en même temps, lesquels procurent ensemble ou séparément une sensibilité équivalente au peptide père.

Le peptide peut être modifié en introduisant des 35 substitutions conservatives ou non-conservatives dans le '* > 33 peptide, habituellement moins de 20%, plus habituellement moins de 10% des acides aminés étant échangés. Dans les situations où des régions sont trouvées comme étant polymorphiques, il peut être désirable de faire varier un ou 5 plusieurs acides aminés particuliers pour imiter plus efficacement les différents épitopes des différentes souches rétrovirales. Dans beaucoup de cas pour obtenir une stabilité chimique, la méthionine peut être remplacée par la norleucine (Nor).

10 II convient de comprendre que le peptide utilisé dans la présente invention n'a pas besoin d'être identique à une séquence de polypeptides d'HIV particulière, pour autant que le composé soit capable de procurer une compétition immunologique avec des protéines d'au moins l'une des souches du 15 rétrovirus HIV. Par conséquent, le peptide de l'invention peut être sujet à divers changements, tels que des insertions, des suppressions et des substitutions, soit conservatifs ou non-conservatifs, si de tels changements peuvent procurer certains avantages lors de l'utilisation. Par substitutions 20 conservatives, on entend des substitutions dans des groupes tels que gly, ala; val, île, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; et nor, met. Habituellement, la séquence ne diffère de pas plus de 20% par rapport à la séquence d'au moins une souche d'un rétrovirus HIV sauf où 25 des acides aminés supplémentaires peuvent être ajoutés sur l'un ou l'autre terminal de façon à procurer un "bras" par lequel le peptide de cette invention peut être convenablement immobilisé. Les bras peuvent avoir une longueur qui est habituellement d'au moins 1 acide aminé et peut être de 50 30 ou plus d'acides aminés, plus souvent de 1 à 10 acides aminés.

Le peptide dans lequel la séquence d'acides aminés est modifiée par la substitution, l'addition ou la suppression des résidus d'acides aminés, doit retenir sensiblement toute l'activité antivirale ou d'immunoréactivité des peptides non 35 modifiés, ce qui peut être commodément mesuré par diverses

* J

34 techniques de test présentement décrites. La forme isomère d d'un ou plusieurs acides aminés peut être utilisée, si on le désire, pour modifier les propriétés biologiques, telles que l'activité , le taux de rupture etc..

5 En outre, un, deux ou plusieurs acides aminés peuvent être ajoutés sur les parties terminales d'un oligopeptide ou d'un peptide pour faciliter la liaison des peptides l'un à l'autre, pour le couplage à un support ou un peptide plus grand, pour des raisons qui seront discutées plus loin, pour 10 modifier les propriétés physiques ou chimiques du peptide ou de l'oligopeptide, ou analogues.

Des acides aminés tels que la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide aspartique ou glutamique, ou analogues, peuvent être introduits sur le C ou N terminal du peptide 15 ou de l'oligopeptide pour procurer une fonctionnalité utile dans la liaison. La cystéine est particulièrement préférée pour faciliter le couplage covalent à d'autres peptides ou pour former des polymères par oxydation.

En outre, les séquences de peptide ou d'oligopeptide 20 peuvent différer de la séquence naturelle par le fait que la séquence est modifiée par acylation du Nh^-terminal, par exemple acétylation ou amidation par acide thioglycolique, amidation du carboxy-terminal , par exemple , avec de l'ammoniac ou de la méthylamine, pour procurer une stabi-25 lité, un pouvoir hydrophobe accru pour la liaison à un support ou une autre molécule, ou pour la polymérisation.

Ainsi, par exemple, dans les peptides I-VIII et IX-XV décrits ci-dessus, lorsque Y ou Y' sont présents, un mode de réalisation préféré existe si Y ou Y' comprend un ou plusieurs 30 résidus de cystéine ou une combinaison d'un ou plusieurs résidus de cystéine avec des acides aminés d'espacement. La glycine constitue un moyen d'espacement ou une entretoise particulièrement préféré. Des peptides préférés pour utilisation dans une polymérisation oxydante sont ceux dans lesquels 35 Y ou Y' représente au moins deux résidus de cystéine. Si deux *· y 35 résidus de cystéine sont présents à la même extrémité du peptide, une réalisation préférée existe lorsque les résidus de cystéine sont séparés au moyen d'un à trois résidus d'acides aminés d'espacement, de préférence la glycine. La 5 présence de résidus de cystéine peut permettre la formation de dimères du peptide et/ou augmenter le caractère hydrophobe du peptide résultant ce qui facilite l'immobilisation du peptide dans des systèmes immobilisés de test ou des systèmes de phase solide.

10 Un usage d'un intérêt particulier est celui du groupe mercaptan des cystéines ou des acides thioglycoliques utilisés pour les groupes amino terminaux d'acylation ou analogues pour lier deux des peptides ou oligopeptides ou leurs combinaisons par une liaison disulfure ou une liaison plus grande 15 pour former des polymères qui contiennent un certain nombre d'épitopes. De tels polymères présentent l'avantage d'une réaction immunologique accrue. Si différents peptides sont utilisés pour fabriquer le polymère, ils possèdent la possibilité supplémentaire d'induire des anticorps qui immuno-20 réagissent avec plusieurs déterminants antigéniques de différents isolats HIV.

Pour obtenir la formation de polymères antigéniques (multimères synthétiques), on peut utiliser des composés possédant des groupes bis-haloacétyles, des nitroarylhalogénures, 25 ou analogues, lorsque les réactifs sont spécifiques pour les groupes thio. Ainsi, la liaison entre les deux groupes mercapto des différents peptides ou oligopeptides peut être une liaison simple ou un groupe liant d'au moins 2, habituellement d'au moins 4, et pas plus d'environ 16, habituellement 30 pas plus d'environ 14 atomes de carbone.

Le peptide objet de l'invention peut être utilisé en étant lié à un support macromoléculaire soluble (par exemple pas moins de 5 kDal). D'une manière commode, le support peut être un poly(acide aminé), soit naturel ou synthétique, vis-35 è-vis duquel des anticorps ont peu de chance d'être rencontrés 36 «r i dans le sérum humain. Des exemples de tels supports sont la poly-L-lysine, 1'hémocyanine limpet keyhole, la thyroglobuline, les albumines, telles que l'albumine de sérum bovin , le toxoïde du tétanos etc.. Le choix du support est essentiel-5 lement dépendant de l'utilisation ultime de l'antigène, et dépend des commodités et des disponibilités.

Avec de tels produits conjugués, il y aura au moins une molécule d'au moins un peptide de l'invention par macromolécule, et pas plus qu'environ 1 par 0,5kDal, habituellement 10 pas plus d'environ 1 par 2kDal de la macromolécule. Un ou plusieurs peptides différents peuvent être liés à la même macromolécule.

La façon de réaliser la liaison est classique, et utilise des réactifs tels que l'acide p-maléïmidobenzoïque, 15 l'acide p-méthyldithiobenzoïque, l'anhydride d'acide maléique, l'anhydride d'acide succinique, le glutaraldéhyde etc. La liaison peut se produire sur le N-terminal, le C-terminal ou sur un site intermédiaire entre les extrémités de la molécule. Le peptide objet de l'invention peut être dérivé par liaison, 20 peut être lié tout en étant relié à un support, ou analogues.

Divers protocoles d'essai connus de ceux qui sont familiers de la technique peuvent être utilisés pour détecter la présence de soit les anticorps sur les protéines rétro-virales soit les protéines rétrovirales elles-mêmes. Il y a 25 un intérêt particulier à utiliser le peptide sous la forme du réactif marqué, si le marqueur permet un signal détectable, ou à lier le peptide, soit directement ou indirectement sur une surface, si l'anticorps sur le peptide dans l'échantillon devient lié au peptide sur la surface. La présence d'un 30 anticorps humain lié au peptide peut alors être détectée en utilisant un anticorps xénogène spécifique pour l'immunoglobuline humaine, normalement à la fois IgM et IgG humaines, ou une protéine marquée spécifique pour des complexes immuns, par exemple le facteur Rf de la protéine A S. aureus.

35 A titre d'illustration d'une technique d'essai, on « & 37 citera l'utilisation d'un conteneur d'échantillons, par exemple les puits de plaques comportant des micropuits, où le polypeptide objet de l'invention ou les produits conjugués de celui-ci sont adsorbés sur le fond du récipient 5 et/ou les parois soit de façon covalente ou non covalente. L'échantillon, qui est normalement du sang humain ou du sérum dilué dans un milieu tamponné de manière appropriée, est mis dans le récipient et un temps suffisant est laissé pour la formation du complexe entre le ou les polypeptides 10 et tous les anticorps parents dans l'échantillon. Le surnageant est éliminé et le récipient lavé pour enlever les protéines non spécifiquement liées. Une protéine de liaison spécifique marquée qui se lie spécifiquement au complexe, tel que l'antisérum xénogénique pour l'immunoglobuline 15 humaine, est utilisée pour la détection.

Le peptide peut être préparé suivant une grande variété de façons. Le peptide, en raison de ses dimensions relativement courtes, peut être synthétisé en solution ou sur un support solide suivant les techniques classiques. Divers 20 appareils automatiques de synthèse sont disponibles dans le commerce aujourd'hui et peuvent être utilisés avec des protocoles connus. Voir par exemple Stewart et Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 2è ed., Pierce Chemical Co., 1984; et Tarn et autres, J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6442.

25 Alternativement, la technologie ADN hybride peut être utilisée si un gène synthétique peut être préparé en utilisant des brins uniques qui codent pour le polypeptide ou des brins sensiblement complémentaires de celui-ci,si les brins uniques se chevauchent et peuvent être mis ensemble dans un 30 milieu de recuisson de façon à permettre l'hybridation. Les brins ou filaments hybridés peuvent être ensuite ligaturés pour former le gène complet, et, par le choix de terminaisons appropriées, le gène peut être inséré dans des vecteurs d'expression, qui sont facilement disponibles aujourd'hui.

35 Voir par exemple Maniatis et autres, Molecular Cloning, * » 38 A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Ou bien la région du génome viral codant pour le peptide peut être clonée par des techniques ADN recombinant classiques et exprimée (voir Maniatis, supra).

5 Des séquences codantes ADN des isolats LAVgpy et ARV-2 de HIV qui peuvent être utilisées pour exprimer les peptides, sont les suivantes :

LAVBRU TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT

10 GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA

GCA CAT TGT

ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA 15 CAT TGT

Des fragments d'une séquence peuvent être utilisés pour l'expression de fragments de peptide, des changements de base conservatifs peuvent être faits, si le ou les codons codent pour le ou les mêmes acides aminés, ou bien des chan-20 gements non-conservatifs dans la séquence codante peuvent être faits, si l’acide aminé résultant peut être un changement conservatif ou non-conservatif dans la séquence d'acides ' aminés, comme cela a été discuté précédemment.

La séquence codante peut être étendue soit au 25 5' ou 3' terminal ou aux deux terminaux pour allonger le peptide, tout en retenant son ou ses sites épitopiques. L'allongement peut procurer un bras pour la liaison, par exemple à un marqueur, tel qu'un enzyme, pour réunir deux ou tous les peptides ensemble dans la même chaîne, de façon 30 à procurer une activité antigénique, des sites de restriction convenables pour le clonage , ou analogues.

La séquence ADN par elle-même, ses fragments, ou des séquences plus grandes, habituellement d'au moins 15 bases, de préférence d'au moins 18 bases, peuvent être utilisés 35 comme sondes nucléotidiques pour la détection d'ARN rétroviral « » 39 ou d'ADN proviral, ou pour identifier les régions homologues pour le clonage ou la formation de séquence. De nombreuses techniques sont décrites, telles par exemple la technique Grunstein-Hogness, la technique Southern, la technique 5 Northern, dot-blot, leurs perfectionnements, aussi bien que d'autres méthodologies, telles que celles décrites dans le brevet américain N° 4 358 535 qui est donné ici à titre de référence.

Les peptides objet de l'invention, comprenant des 10 peptides de blocage, et leurs analogues trouvent une utilisation en eux-mêmes ou en combinaison dans des vaccins. De manière similaire, des anticorps anti-idiotypes c'est-à-dire réagissant avec les idiotypes des anticorps de la présente invention et contenant par conséquent des épitopes imitant les 15 régions neutralisantes de HIV, peuvent également être utilisés dans des vaccins. Les peptides ou anticorps anti-idiotypes peuvent être formulés d'une manière convenable, généralement à des concentrations dans l'intervalle de 1 »jjg à 20 mg/kg d'hôte. Des milieux physiologiquement acceptables peuvent 20 être utilisés comme supports, tels que l'eau stérile, une solution saline, une solution saline tamponnée au phosphate ou analogues. Des adjuvants peuvent être utilisés tels que le gel d'hydroxyde d'aluminium, les substances actives en surface telles que la lysolécithine, les polyols pluroniques, 25 les polyanions, les peptides, les protéines (par exemple toxine du choléra ou diphtérie) et les émulsions d'huile.

Les peptides peuvent également être incorporés dans des liposomes, ou conjugués à des polysaccharides, des polypeptides ou des polymères pour une utilisation dans une 30 formule de vaccin. L'administration peut se faire par injection, par exemple par voie intramusculaire, péritonéale, sous-cutanée, intraveineuse etc. L'administration d'une dose immunogéniquement efficace peut être faite en une ou plusieurs fois, habituellement dans un intervalle de une à quatre 35 semaines. Une "dose immunogéniquement efficace" correspond à 40

κ V

une quantité de vaccin convenable pour obtenir une réponse immunitaire chez un hôte, ce qui démontre chez l'hôte une infection accrue.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente 5 invention apparaîtront mieux dans les expériences qui suivent, et qui décrivent l'invention à titre d’exemple.

Ces exemples ne doivent pas être considérés comme limitant la présente invention.

EXEMPLE I

10 Production et caractérisation des anticrops monoclonaux L'exemple I décrit la production de lignées cellulaires hybrides qui produisent des anticorps monoclonaux spécifiques pour les glycoprotéines d'enveloppe de HIV. Cette 15 méthode implique l'utilisation d'extraits purifiés de lectine de bAVgpy fixés à l'agarose de lectine de lentille comme l'immunogène. Les anticorps monoclonaux produits par la suite par les lignées cellulaires hybrides sont caractérisés par leur pouvoir à précipiter radioimmunitairement et 20 en "immunoblot" gpllO à partir de LAV purifié et comme protéine de fusion recombinante biologiquement exprimée. Les anticorps monoclonaux qui se lient aux épitopes sur gpllO sont également réactifs dans le test ELISA avec le virus entier rompu, des protéines de fusion et des peptides synthé-25 tiques, et réagissent avec le virus entier dans des tests de fluorescence indirecte.

Les protocoles pour la production de lignées de cellules hybrides produisant un anticorps monoclonal et la caractérisation des anticorps sont les suivants.

30 Du virus LAV purifié à partir de cellules CEM infec tées (A.T.T.C. N° CRL8904) , fut rompu ou brisé dans du Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, aprotinine 1%, Nonidet P-40^ (NP-40) (octylphénoxypolyéthoxyéthanol) 2%. L'extrait fut 35 clarifié deux fois par centrifugation et ajusté à 0,5% NP-40 avec l'addition de trois volumes de tampon de dislocation * Λ 41 100 NP-40. De la Sepharose de lectine de lentille (Pharmacia, Piscataway, N.J.) fut prélavée dans le tampon de dislocation 100 NP-40 et ensuite équilibrée dans le tampon d'adsorption (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, aprotinine 1%, NP-40 0,5%).

5 L'extrait viral clarifié fut adsorbé avec de la Sepharose lectine de lentille pendant 42 heures à 4°C. Le matériau non adsorbé fut éliminé par lavage avec du tampon d'adsorption en excès. L'élution du matériau adsorbé fut réalisée avec de l'alpha méthyl mannoside 0,2 M dans du tampon d'adsorption. 10 L'éluant fut dialysé contre PBS pour éliminer le sucre et le matériau fut réadsorbé sur la Sepharose de lectine de lentille,

Le complexe de Sepharose de lectine de lentille-glycoprotéine fut utilisé pour immuniser des souris BALB/c 15 par trois injections intrapéritonéales sans adjuvant et données séparément sur une période de 2-3 semaines. Des rates furent éliminées des souris immunisées, qui démontraient la présence d'un anticorps circulant sur les glycoprotéines de HIV par immunoblot, RIP et/ ou ELISA.

20 Les protocoles utilisés pour la production de lignées cellulaires étaient généralement ceux de Köhler et Milstein (Nature 256:495 (1985)) avec les modifications de Goldstein L.C. et autres (Infect. Immun. 38:273 (1982)). Les lymphocy tes B spléniques des souris immunisées furent fusionnés avec 25 des cellules de myélome NS-1 utilisant 40% (poids/volume) de polyéthylène glycol. Après la fusion, le mélange de cellules fut remis en suspension dans un milieu HAT (milieu RPMI - 1640 supplémenté avec 15% de sérum de veau foetal, de -4 -7 l'hypoxanthine 1 x 10 M, de l'aminoptérine 4 x 10 M et de _5 30 la thymidine 1,6 x 10 M) pour choisir la croissance des cellules hybrides , et ensuite le mélange fut délivré dans des plateaux de microculture à 96 puits à une concentration g de 1 à 3 x 10 cellules/ml et incubé à 37°C dans une atmosphère humide contenant 6% de COg. Les cultures furent alimen-35 tées par remplacement d'une moitié du surnageant avec du * k 42 milieu HAT frais. Les puits furent observés en utilisant un microscope inversé pour les indications de prolifération de cellules et lorsque les cellules étaient d'une densité suffisante les surnageants furent testés pour l'anticorps 5 anti-LAV.

Les puits contenant des cellules hybrides produisant un anticorps vis-à-vis de LAV furent identifiés par test ELISA en mesurant la liaison à soit le virus rompu entier purifié soit les protéines de fusion biologiquement exprimées. 10 Des tests ELISA utilisant du virus rompu furent réalisés sur des plaques LAV EIA (Genetic Systems, Seattle, Washington).

Les plaques furent incubées avec des fluides de culture de cellule à 37°C pendant 45 minutes et ensuite lavées trois fois avec 0,5% de Tween 20 dans une solution saline tamponnée 15 au phosphate (PBS-Tween).

De l'IgG anti-souris chèvre-peroxydase (dilution 1:2.000 dans PBS-Tween; Zymed Laboratories, Inc., San Francisco Sud, Californie) fut ajouté (100 μΐ par puits), et les plaques furent incubées pendant 45 minutes à 37°C et 20 lavées comme ci-dessus. Un substrat (acide citrique 0,025 M, phosphate de sodium dibasique 0,05 M, pH 5 contenant 14 mg de o-phénylènediamine et 10 μΐ de peroxyde d'hydrogène 30% par 50 ml) fut ajouté et les plaques furent incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans le noir. La réaction 25 fut arrêtée avec de l'acide sulfurique 3N, et des réactions colorimétriques furent quantifiées avec un lecteur automatique de microplaques. Les puits qui donnaient des résultats positifs furent sous-clonés par dilution limitée, retestés pour la spécificité, puis étendus.

30 Les anticorps monoclonaux sécrétés par les lignées de cellules hybrides résultantes furent ensuite caractérisés en ce qui concerne la spécificité et la réactivité par immunoblot, immunoprécipitation et test ELISA en utilisant du virus LAV rompu, des protéines de fusion LAV recombinantes et des 35 peptides LAV de synthèse. Tous les anticorps furent déterminés 43 comme étant de l'isotype IgG^ . Des lignées cellulaires HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2 et HIV-gpllO-3 ont été déposées auprès de (l'American Type Culture Collection) avant le dépôt de cette demande et sont référencées sous les N°s ATCC 5 HB 9175 , HB 9176 et HB 9177 respectivement.

Les protéines de fusion recombinantes testées pour la réactivité ont précédemment été appelées ENV2, ENV3, ENV4 et ENV5. La protéine ENV2 est exprimée à partir de pENV2 (ATCC N° 53071), qui est une région de LAV de la paire de bases 10 bp 6598 à bp 7178 (numérotation selon Wain-Hobson et autres Cell 44:9 (1985)), ENV3 est exprimée à partir de pENV3 (ATCC N° 53072) qui comprend la région LAV de bp 7178 à bp 7698; ENV4 est exprimée à partir de pENV4 (ATCC N° 53073)» et comprend bp 7698 à bp 8572; et ENV5 est exprimée à 15 partir de pENV5 (ATCC N° 53074) qui comprend la région LAV bp 5889 à bp 7698.

Assemblage de peptides de synthèse

Les peptides I (29) et VIII (110-2-2) furent assemblés sur une résine de benzhydrylamine (polystyrène/divinylbenzène) 20 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Le peptide V (177) fut assemblé sur une résine p-butyloxy-carbonyl(Boc)-éthylbenzylcystéïne-phénylacétamidométhyl (PAM) polystyrène/divinylbenzène. Des couplages d'anhydride symétriques furent réalisés dans un synthétiseur 430A 25 (Applied Biosystems). De la cystéine fut ajoutée comme un premier résidu dans les deux peptides.

Des couplages de dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxylbenzotriazole furent utilisés pour l'asparagine et la glutamine. Une protection de chaîne latérale ou ramifiée 30 à base de benzyle et une protection d'alpha-amine Boc furent utilisées. D'autres protections de chaîne latérale utilisées de manière habituelle étaient constituées par tryptophane (formyl) Boc, sulfoxyde de méthionine Boc, arginine (tosyl) Boc, cystéine (méthylbenzyl) Boc» histidine (tosyl) Boc, 35 lysine (chlorobenzyloxycarbonyl) Boc et tyrosine (bromobenzyl- " t 3 44 oxycarbonyl) Boc.

Lorsque les peptides furent radiomarqués, ce le fut par acétylation du terminal amino avec de l'acide acétique- H et un excès de dicyclohexylecarbodiimide.

5 La déprotection et le clivage du peptide à partir de la résine furent effectués par le protocole HF "bas-élevé" Tarn (Tarn et autres, supra). L'extraction de la résine fut faite avec de l'acide acétique 5% et l'extrait fut soumis à une chromatographie de filtration par gel dans de l'acide 10 acétique 5%.

Les peptides de synthèse HIV testés pour la réactivité avec les anticorps monoclonaux comprenaient les peptides 29, 36 et 39. Le peptide 29 est codé par la région de génome LAVgru 3 partir de 6688 bp jusqu'à 6750 bp; le peptide 36 15 est codé par la région depuis environ 7246 bp jusqu'à 7317 bp; et le peptide 39 est codé par la région depuis environ 7516 bp jusqu'à 7593 bp. Les peptides 36 et 39 sont décrits en détail dans le brevet américain N° 4 629 783 qui est donné ici à titre de référence.

20 Les peptides de blocage, IX-XV furent assemblés essentiellement comme décrit ci-dessus sur une résine de méthyl-benzhydrylamine (polystyrène/divinylbenzène) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Les couplages d'anhydride symétriques furent réalisés sur un appareil de 25 synthèse 430A (Applied Biosystems). Les couplages de dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxylbenzotriazole furent utilisés pour l'asparagine. Pour la protection, une protection par Boc alpha-amine et par chaîne latérale à base de benzyle fut utilisée, tandis que Boc (bromobenzyloxy-30 carbonyl ) fut utilisé spécifiquement pour les chaînes ramifiées de tyrosine. L'acétylation, si elle est présente, fut réalisée en utilisant de l'anhydride acétique ou de l'acide acétique glacé et du dicyclohexylcarbodiimide. La déprotection et le clivage du peptide de la résine furent accomplis par le 35 protocole HF "haut" standard (Stewart et autres, voir supra).

» « 45 L'extraction de la résine fut réalisée avec 50% d'acide acétique, et l'extrait fut ensuite soumis à une chromatographie de filtration sur gel dans 20% d'acide acétique. Comme désiré, une chromatographie liquide à haute performance fut 5 réalisée sur une colonne Vydac C18 (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) en utilisant un acide trifluoacétique 0,1%, gradient d'acétonitrile.

Immunoblot

La caractérisation par immunoblot fut réalisée sur 10 des surnageants de clone ou un fluide ascite en utilisant du virus LAV purifié et des protéines de fusion recombinantes comme antigènes. Les antigènes furent d'abord séparés par électrophorèse sur gel à gradient polyacrylamide (7-15%) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (NCM) par 15 électrophorèse pendant 4 heures à 25 V dans du phosphate de sodium 25 mM (pH 7). Après transfert, le NCM fut bloqué pour empêcher les interactions non spécifiques par incubation dans PBS-Tween ou Blotto (5% lait sec non gras dans PBS) pendant une heure à la température ambiante. Le NCM fut incubé 20 avec du surnageant de culture de cellules ou un fluide ascite dilué dans PBS-Tween pendant une heure à la température ambiante et fut rincé avec trois changements de PBS-Tween.

Dans la seconde phase, le NCM fut incubé avec une peroxydase de radis noir IgG anti-souris chèvre, diluée dans PBS-Tween 25 pendant une heure à la température ambiante. Cette incubation fut suivie par un lavage avec PBS-Tween et ensuite une immersion dans une solution de développement en couleur de peroxydase de radis noir (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie) pendant 20 minutes. La réaction fut arrêtée par 30 immersion dans de l'eau déionisée. La réactivité de l'anticorps monoclonal fut comparée à un sérum témoin positif réagissant avec le virus rompu purifié ou une protéine de fusion exprimée. Les résultats montraient que tous les anticorps se liaient à gpllO et sa molécule précurseur, gpl50, en utilisant des 35 préparations de virus rompus ou séparés. Les anticorps 110-1 46 et 110-2 reconnaissaient également la protéine de fusion ENV3, tandis que les anticorps 110-3, 110-4, 110-5 et 110-6 formaient un immunocomplexe ENV2.

Immunoprécipitation 5 Des extraits de virus pour précipitation radioimmune furent préparés à partir de cellules CEM infectées avec l'isolat LAVgpy de HIV apte à une croissance lytique par passage continu. Lorsque les effets cytopathes précoces étaient évidents, les cellules furent transférées dans un 10 milieu marquant contenant de la méthionine ^ ^ _l (0,05 mCi/ml) ou de la glucosamine ^ Γη ] (0,025 mCi/ml) , puis incubées pendant 24 heures jusqu'à ce que la plupart des cellules aient été lysées, ce qui relâche le virus dans le surnageant de la culture. Le virus fut transformé en pilules 15 ou comprimés (une heure à 100.000 xg) à partir du surnageant dépourvu de cellules, et des extraits de détergent furent préparés dans un tampon P-RIPA (solution saline tamponnée au phosphate contenant 1% de Triton X-100, 1% de déoxycholate, 0,1% de SDS et 1% d'aprotinine). Des extraits similaires 20 furent préparés à partir des surnageants de cellules CEM non infectées.

Les tests d'immunoprécipitation furent réalisés avec 100 pl d'extrait de virus incubé avec 100 μ1 de surnageant de culture à partir de lignées cellulaires hybrides pendant 25 une heure sur de la glace. Quatre microlitres d'Ig anti-souris lapin (Zymed Laboratories, So. San Francisco, Californie) furent ajoutés à chaque échantillon et incubés pendant 30 minutes. De 1 ' immunoprécipitine (100 jjI; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland) remise en suspension dans un 30 tampon P-RIPA contenant 1% d'ovalbumine fut ajoutée à chaque échantillon et incubée pendant 30 minutes supplémentaires.

Les complexes liés furent lavés et séparés par électrophorèse sur gel polyacrylamide-SDS (15% acrylamide; gel DATD). A la suite de l'électrophorèse, les gels furent fixés, trempés 35 dans le produit "Enhance" (New England Nuclear, Boston, MA), * « 47 séchés et exposés à un film Kodak XR-5. Un sérum positif de référence qui immunoprécipitait toutes les protéines virales HIV fut mis en réaction avec des surnageants de cellules CEM faussement infectées et infectées par virus 5 comme témoins négatifs et positifs.

Les résultats ont montré que tous les six anticorps monoclonaux immunoprécipitaient spécifiquement gpllO et gpl50.

Test d'immunoadsorbant lié par enzyme 10 Pour établir que les épitopes gpllO étaient reconnus par les anticorps monoclonaux de la présente invention, des surnageants de culture à partir de lignées cellulaires hybrides ou fluides ascites furent en outre caractérisés par réactivité dans le test ELISA avec des protéines de 15 fusion biologiquement exprimées et des peptides de synthèse.

Les processus étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus à l'exception que les protéines de fusion ou les peptides de synthèse remplaçaient le virus purifié comme l'antigène ’ adsorbé sur la surface des puits de microtitrage.

20 Lorsque des peptides furent utilisés comme antigène, le protocole de mise sur plaque était le suivant. Le peptide lyophilisé fut dissous dans de la guanidine 6M HCl. Juste avant la mise sur plaque dans des plaques de 96 puits, la solution de guanidine fut diluée dans un tampon de bicarbonate/ 25 carbonate 0,05 M (pH 9,6) jusqu'à une concentration finale de peptide allant jusqu'à 100 jug/ml. Un volume de 50 ul du peptide dilué fut placé dans chaque puits de microtitrage et les plaques furent ensuite incubées toute la nuit à 4°C.

La solution de peptide en excès fut "secouée", les plaques 30 fermées ou bloquées Blotto , et le processus décrit ci-dessus fut suivi pour le reste du test ELISA. De manière similaire, une protéine recombinante fut diluée jusqu'à une concentration finale d'environ 2 pg/ml dans un tampon bicarbonate/carbonate 0,05 M (pH 9,6) avant que le même processus soit suivi.

35 Les résultats sont donnés dans le Tableau II. Les 48 anticorps monoclonaux produits par les lignées de cellules HIV-gpllO-1 et HIV-gpllQ-2 réagissaient avec ENV3, ENV5, le peptide 36 et le virus disloqué. Les anticorps provenant des lignées de cellules HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5 5 et HIV-gpllO-6 réagissaient avec ENV2 et le peptide 29 aussi bien que le virus disloqué ou rompu.

TABLEAU II

Test ELISA montrant la réactivité des anticorps monoclonaux avec des protéines recombinantes et 10 des peptides de synthèse

Protéine de fusion recombinante Peptide de synthèse LAV CEM

té- té- ENV2 ENV3 ENV4 ENV5 29 36 39 moin moin 110-1 0,077 3,000 0,113 3,000 ND 2,421 0,054 0,908 0,125 110-2 -0,003 3,000 0,000 3,000 ND 2,305 -0,005 1,214 0,009 15 110-3 3,000 0,011 ND ND 3,000 ND 0,017 0,363 0,046 110-4 3,000 0,020 ND ND 3,000 ND 0,016 0,383 0,067 110-5 3,000 0,014 ND ND 3,000 ND 0,016 0,368 0,025 110-6 3,000 0,033 ND ND 1,937 ND 0,017 0,486 0,032

Les résultats dans le Tableau II montrent que les p n anticorps monoclonaux 110-1 et 110-2 reconnaissaient un déterminant antigénique codé par une séquence ADN dans la région pENV3 , plus particulièrement par la région du génome de HIV définie par une séquence d'acides aminés dans le peptide 36. Autrement dit, les anticorps monoclonaux gpllO-l et 110-2 se 25 lient à une région de peptide de gpllO codée dans 7246 bp à 7317, comme cela est mis en évidence par la formation de complexes immuns avec le peptide 36 et ENV3. Cette région du génome de HIV a précédemment été identifiée comme conservée, c'est-à-dire peu de changement dans la séquence d' ADN dans la 30 région codée par le peptide 36 parmi différents isolats viraux à partir de divers lieux géographiques. Voir Starcich et autres , Cell 46:637 (1986). Par contraste, les anticorps monoclonaux gpllO-3, -4, -5 et -6 se lient à des peptides de * * 49 HIV définis par la région codée par le peptide 39 de 6688 pb à environ 6750 bp. La région dans gpllO définie par le peptide 29 a été identifiée comme contenant plusieurs substitutions de nucléotide parmi différents isolats de virus. Les 5 anticorps monoclonaux qui se lient sélectivement aux polypeptides gpllO qui contiennent des épitopes conservés, tels que les anticorps 110-1 et 110-2 peuvent posséder une utilité renforcée dans différentes circonstances, telles que dans la chromatographie d'affinité etc. Egalement , dans un test 10 ELISA, le peptide 110-2-2 réagissait avec des sérums de l'individu à partir duquel LAV-2 fut isolé.

Test immunofluorescent indirect

Des tests immunofluorescents indirects utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène gpllO de HIV 15 furent réalisés sur des cellules vivantes et fixées par l'acétone. Des cadres ou châssis fixés par acétone, préparés à partir de cellules OEM infectées par LAV furent incubés avec un surnageant de culture dilué ou un fluide ascite pendant une heure à 37°C, tandis que des cellules vivantes 20 furent incubées avec un surnageant de culture ou un fluide ascite pendant une heure à 4°C avant que les cellules soient placées sur des cadres ou analogues et fixées par l'acétone. Les deux méthodes utilisaient de l'IgG anti-souris marquée à 1'isothiocyanate de fluorescéine pour détecter les cellules 25 portant l'antigène gpllO réactif. L'anticorps monoclonal HIV-gpllO-1 a donné des résultats positifs en utilisant soit des cellules vivantes soit des cellules infectées par LAV fixées par l'acétone.

EXEMPLE II

30 Neutralisation du pouvoir infectieux de HIV par des anticorps monoclonaux anti-gpllO Cet exemple décrit et caractérise la neutralisation du pouvoir infectieux de HIV en utilisant des anticorps mono-clonaux qui se lient à gpllO et des peptides dans gpllO. Les 35 résultats indiquent que les anticorps monoclonaux GpllO-3, • b 50 -4, -5 et -6 possèdent une activité neutralisante, et que gpll0-3 et -4 possèdent des niveaux particulièrement élevés d'activité neutralisante.

Test de neutralisation 5 Un test de neutralisation sensible fut développé pour quantifier l'effet des anticorps monoclonaux sur le pouvoir infectieux de HIV. Une lignée cellulaire CD4+ hautement susceptible ou sensible à l'infection HIV, CEM fut choisie comme cible pour des comparaisons du pouvoir infectieux. Un 10 fluide ascite préparé comme décrit dans l'Exemple I, ou sa fraction IgG purifiée en utilisant une précipitation de sulfate d'ammonium, fut désactivé à la chaleur à 56°C pendant 30 minutes, puis dilué comme requis dans un milieu RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal . Une suspension de 15 LAVgpu souche HIV fut moissonnée depuis des cultures d'environ 4 jours de CEM dans une phase de croissance logarithmique, filtrée au travers de filtres de 0,2 ou 0,45 micron, mise sous forme d'aliquotes et congelées à -70°C. Un aliquote fut décongelé, titré pour déterminer le TCID^g, et des tests 20 subséquents ont été réalisés avec des aliquotes fraîchement décongelés, dilué à 1:500 dans un milieu de culture jusqu'à une concentration d'approximativement dix fois la quantité requise pour infecter 50% de cellules CEM dans la culture (10 TCIDj-g). La suspension de virus fut mélangée avec un 25 volume égal (250 pl) d'une préparation d'anticorps monoclonal selon cinq dilutions depuis 1:5 à 1:9,765,625. Le mélange virus/anticorps fut incubé pendant 45 minutes à 37°C et ensuite dupliqué de 1:5 à 1:9,765,625. Le mélange virus/ anticorps fut incubé pendant 45 minutes à 37°C et ensuite des 30 échantillons dupliqués de 200 jul furent utilisés pour inoculer des puits contenant 1 ml d ' approximativement 2 x 10^ cellules CEM par puits. Les cultures furent incubées à 37°C dans une atmosphère de 5% de COg humidifiée pendant 14 jours. Les cellules furent récoltées, mises en comprimés, et lysées avec 35 1% de Triton X-100 dans PBS pendant environ 10 minutes. La f > 51 quantité de virus (ou d'antigène viral) présente dans les cellules lysées fut quantifiée en utilisant un immunotest enzyme "sandwich" à capture d'antigène HIV sensible. Le titrage de l'activité neutralisante, s'il y en a, fut déter-5 miné comme la réciproque de la dilution d'anticorps monoclonal qui inhibait la production d'antigène sur plus de 50% de cultures témoin de virus incubées sans anticorps, ou avec un anticorps monoclonal du même isotype qui avait précédemment été montré comme manquant d'activité neutralisante.

10 Le test de capture antigénique HIV décrit ci-dessus utilisait deux anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes p25 comme réactifs de capture. Ces lignées de cellules hybridomes furent produites par les méthodes décrites ci-dessus avec des modifications mineures, y compris en 15 utilisant une protéine de fusion recombinante de gag purifiée comme l'immunogène et caractérisant les anticorps monoclonaux résultants en ce qui concerne la spécificité et la réactivité utilisant les protéines de fusion recombinantes précédemment appelées GAG-1 , GAG-2 et GAG-3 , et le peptide synthèse 141.

20 La protéine GAG-1 est exprimée à partir de pGAG-1 (ATCC

N° 53379), GAG-2 est exprimée à partir de pGAG-2 (ATCC N° 53111) et GAG-3 est exprimée à partir de pGAG-3 (ATCC N° 53112).

Le peptide de synthèse 141 est codé par la région de génome LAVgRu correspondant aux résidus d'acides aminés 198-242.

25 Des anticorps monoclonaux produits par des lignées de cellules hybridomes p25-2 et p25-3 ont été trouvés comme réagissant avec des protéines de fusion recombinantes GAG-1, GAG-2 et GAG-3 et le monoclonal de p25-3 est également réactif avec le peptide de synthèse 141.

30 Pour réaliser le test de capture d'antigène, les réactifs de capture furent d'abord adsorbés sur un support solide. Un fluide ascite dérivant des lignées de cellules hybridomes p25-2 et p25-3 fut dilué 1:5.000 dans un tampon Tris 25 mM, pH 8,5 et 200 pi furent placés dans des puits de 35 plaques à micropuits. Les puits furent fermés de manière * * 52 étanche et incubés pendant environ 16 heures à 4°C. La solution fut éliminée des puits par aspiration avant d'ajouter une solution de blocage de 0,3% Blotto dans BBS. Le blocage fut réalisé pendant 15 minutes à la température ambiante.

5 La solution de blocage fut aspirée et l'échantillon fut ajouté. Deux cents microlitres de la suspension cellulaire lysée et 5 ju 1 de conjugat de détection, préparé comme décrit ci-dessous, furent ajoutés à chaque puits. Les plaques ou bandes de puits furent incubées pendant 2 heures à 37°C, 10 après quoi la suspension fut aspirée et les puits lavés quatre fois avec du tampon (0,05% Tween 20 dans PBS). Le produit conjugué de détection fut préparé comme suit. Les anticorps monoclonaux p25-6 et p25-7 furent conjugués avec la peroxydase de radis noir (HRP) suivant un rapport molaire 15 3:1 (Ab:HRP) pendant trois heures en utilisant une méthode d'oxydation au périodate (Nakane et autres, J. Histochem. Cytochem. 22:1084 (1974). Les produits conjugués furent dilués 1:1500 dans 2,5% (poids/volume) de lait sec non gras, 0,01% de thimérosal et 0,05% d'anti-mousse A dans du citrate 20 de sodium 20 mM. Le restant du test ELISA fut réalisé comme décrit dans l'Exemple I.

Les résultats de l'essai de l'activité neutralisante avec les anticorps gpllO-3, -4, -5 et -6 sont les suivants. Les titres les plus élevés qui retenaient l'activité neutra-25 lisante furent déterminés comme étant : gpllÛ-3 = 15,625; gpllQ-4 = 9,765,625; gpllO-5 = 125; et gpllO-6 = 625.

Etant donné la variabilité génétique prédite de la région définie par le peptide 29, le pouvoir de l'anticorps monoclonal gpll0-4 à reconnaître d'autres isolats de HIV fut 30 examiné. Les tests d'immunofluorescence furent réalisés comme décrit ci-dessus. L'anticorps gpll0-4 détectait un antigène dans des cultures d'au moins 3 à 16 isolats HIV testés.

L'anticorps gpllO-4 était capable de neutraliser des 35 virus isolés sur quinze semaines à partir d'un chimpanzé 53 inoculé avec du LAVRRy comme animal témoin dans un essai de vaccin SIDA. L'anticorps monoclonal était capable de neutraliser les isolats même si l'animal avait des anticorps de sérum qui neutralisaient HIV ijn vitro, et avait développé 5 une réponse mesurable immunitaire engendrée par les cellules, à l'infection HIV. Ceci indique un défaut de mouvement antigénique in vivo pour l'épitope reconnu par l'anticorps gpllQ-4.

EXEMPLE III

10 Neutralisation du pouvoir infectieux de HIV par un cocktail d'anticorps monoclonaux anti-gpllO et anti-p25

Cet exemple décrit la neutralisation du pouvoir infectieux HIV en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient 15 à gpllO et aux peptides dans gpllO en combinaison avec des anticorps monoclonaux qui se lient à p25 et des peptides dans p25 , lesquels seuls montrent peu ou pas d'activité neutralisante. Les résultats indiquent que l'anticorps monoclonal gpllO-2 en combinaison avec soit p25-6 ou p25-7 possède des 20 niveaux particulièrement élevés d'activité neutralisante.

Des lignées de cellules hybridomes p25-6 et p25-7 ont été produites par les méthodes décrites ci-dessus avec des modifications qui comprennent l'utilisation du virus disloqué ou rompu inactivé ou ou une protéine de fusion ’re-25 combinante de gag purifiée exprimée dans E^ Coli, comme immunogène, et caractérisant les anticorps monoclonaux résultants en ce qui concerne la spécificité et la réactivité, utilisant les protéines de fusion recombinantes précédemment appelées GAG-1, GAG-2 et GAG-3 et les peptides de synthèse 15, 88, 30 150, 147 et 148. Les peptides de synthèse sont codés par la région de génome LAVßRU correspondant aux résidus d'acides aminés comme suit : peptide 15, résidus d'acides aminés 329 à 350; peptide 88, résidus d'acides aminés 315 à 350; peptide 150, résidus d'acides aminés 318 à 363; peptide 147, 35 résidus d'acides aminés 278 à 319; et peptide 148, résidus

* A

54 d'acides aminés 290 à 319. Les anticorps monoclonaux produits par les lignées de cellules hybridomes p25-6 et p25-7 réagissent avec la protéine recombinante GAG-3 , p25-6 réagit avec les peptides de synthèse 147 et 148, et p25-7 réagit avec 5 les peptides de synthèse 15, 88, et 150.

Des essais de neutralisation furent réalisés comme décrit ci-dessus, sauf lorsque des cocktails ont été utilisés; des anticorps monoclonaux d'individus furent d'abord dilués 1:5 dans un milieu de culture et ensuite mélangés suivant 10 des rapports égaux pour donner une dilution finale de 1:10.

Le restant de l'essai fut réalisé comme décrit ci-dessus.

Les anticorps monoclonaux gpllO-2, p25-6 et p25-7 montrent moins de 50% d'activité neutralisante lorsqu'ils sont utilisés seuls. Lorsqu'ils sont utilisés dans un cocktail 15 qui comprend les anticorps monoclonaux gpll0-2 avec p25-6 ou gpll0-2 avec p25-7 suivant une dilution 1:10, il se produit une neutralisation totale. Un cocktail comprenant les anticorps monoclonaux p25-6 en combinaison avec p25-7 a donné un taux d'activité neutralisante de 60-90%.

20 EXEMPLE IV

Immunopotentialité du peptide 29 et ses homologues Le pouvoir du peptide 29 et des peptides homologues, y compris le peptide 177, à stimuler une réponse immunitaire contre HIV fut d'abord examiné dans deux souches de souris.

25 Les processus pour la préparation des immunogènes de peptide, les protocoles d'immunisation, et pour la caractérisation de la réponse immunitaire engendrée sont donnés en détail ci-dessous .

Le peptide 29 fut préparé pour immunisation par conju-30 gaison avec une thyroglobuline purifiée. La thyroglobuline peut être dérivée avec du N-succinimidyl-4-(N-maléïmido-méthyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC) pour conjugaison selon le processus souligné dans le brevet américain N° 4 629 783, colonne 10, lignes 28 à 51. Comme second immunogène, la thyro-35 globuline fut dérivée avec du glutaraldéhyde comme suit.

* * 55

De la thyroglobuline porcine, 27 mg, fut dissoute dans 1 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M, auquel 8,3 jul d'une solution de glutaraldéhyde 25% furent ajoutés goutte à goutte, et le mélange fut agité toute la nuit à la température ambiante.

5 1 ml de tampon de bicarbonate/carbonate de sodium , pH 9,3, fut ajouté à la solution et ensuite dialysé pendant 8 heures sur 2 litres du même tampon à 4°C, avec un changement complet du dialysat après 4 heures. Le peptide 29 fut ensuite ajouté à la thyroglobuline dérivée suivant approximativement un 10 excès molaire de 100, et le mélange fut agité toute la nuit à la température ambiante. Le glutaraldéhyde qui n'avait pas réagi fut bloqué avec 200 pl d'une solution de lysine 0,2 M, lequel mélange fut agité pendant plusieurs heures (ou pendant toute la nuit) à la température ambiante. Le conjugat de 15 thyroglobuline-peptide fut ensuite dialysé d'une manière extensive sur du PBS à 4°C.

Deux souches de souris (noire C57 et BALB/c) furent inoculées avec des peptides préparés par chaque méthode de conjugaison. Tous les animaux avaient un âge d'environ 20 2-4 semaines au moment de l'inoculation. Les voies d'inoculation comprennent le bout de la patte, une scarification de la queue, une administration sous-cutanée, intranasale, ou intrapéritonéale. L'inoculum consistait de 25 pg de peptide conjugué en suspension dans 0,5 ml d'adjuvant de Freund 25 complet, avec des inoculations renforcées et répétées aux semaines 2, 3 et 5, avec le même immunogène en suspension dans un adjuvant de Freund incomplet. Des échantillons de sérum de souris individuelles furent recueillis avant immunisation, 4 jours après l'immunisation renforcée à 3 semaines, et 30 4 jours après l'inoculation renforcée à 5 semaines. Les échantillons de sérum furent analysés pour les anticorps contre les peptides homologues ou le virus entier par "screening" dans le test ELISA. Les sérums présentant une activité d'anticorps pour LAV sont en outre triés pour 35 l'activité de neutralisation, ce après quoi on analyse les « * 56 sérums dans des immunoblots pour l'antigène LAV rompu et des tests de radioimmunoprécipitation avec gpllO radiomarqué.

Les résultats des immunisations indiquaient que les souris immunisées avec le peptide 29 développaient des 5 anticorps réactifs avec le peptide 29 et le virus LAV-1 rompu ou brisé dans les tests ELISA. La conjugaison du peptide 29 à travers du glutaraldéhyde révélait généralement un titre plus élevé d'anticorps pour le peptide 29 dans des souris Balb/c, bien que la conjugaison 10 à travers de la maléimide faisait mettre au jour avec succès des anticorps anti-peptide 29 dans quelques souris Balb/c.

Des souris immunisées avec le peptide 177 développaient des anticorps pour le peptide, et une conjugaison du peptide 177 à travers du glutaraldéhyde était meilleure pour mettre au 15 jour une réponse immunologique. Des souris C57 étaient plus sensibles à une stimulation immune avec le peptide 177 que les souris Balb/c. Des souris immunisées avec le peptide 110-2-2 de LAV-2 développaient des anticorps contre 110-2-2 et le virus LAV-2 comme montré par les tests ELISA. Un 20 peptide 110-2-2 conjugué à travers du glutaraldéhyde était immunogénique à la fois dans des souris Balb/c et C57, bien que les titres pour le peptide 110-2-2 soient généralement plus élevés dans les souris Balb/c que C57, tandis que les titres au virus LAV-2 étaient généralement plus élevés 25 dans les souris C57 que dans les souris Balb/c.

Généralement, les échantillons de sérum à partir de souris immunisées qui (i) présentent des anticorps vis-à-vis du virus entier; (ii) sont capables de neutraliser HIV, tel que dans les tests décrits dans l'Exemple II; et (iii) 30 réagissent avec le peptide 29 dans le test ELISA, indiquent de manière cumulative l'efficacité de l'utilisation du peptide 29 dans une formulation de vaccin.

I * 57

EXEMPLE V

Séparation d'immunoaffinité d'un anticorps monoclonal utilisant gpllQ

Les anticorps monoclonaux vis-à-vis de l'antigène 5 gpllO de HIV peuvent être utilisés dans des processus de séparation d'immunoaffinité pour purifier sensiblement les protéines recombinantes d'expression bactérienne. Si la protéine exprimée est sécrétée par les bactéries, la protéine peut être isolée du surnageant de la culture; si la protéine 10 n'est pas sécrétée, la rupture des cellules bactériennes peut être nécessaire.

Le plasmide pENV-5 (ATCC N° 53074) code une fraction majeure de l'extrémité carboxyle de gpllO et une fraction du terminal amino de gp41 de LAV inséré dans le vecteur 15 d'expression trp . _E. Coli C600 transformé par ce vecteur exprime mais ne sécrète pas la protéine gpllO.

Des _E. Coli C 600 contenant le plasmide pENV-5 sont soumises à la croissance dans un milieu contenant du tryptophane (20 pg/ml) et de l'ampicilline (100 pg/ml) pen-20 dant toute une nuit à 37°C avec aération. Les cultures de la nuit sont alors inoculées suivant 1:100 dans un milieu minimal frais contenant de l'ampicilline (100 pg/ml) mais pas de tryptophane. Ces cultures croissent avec aération pendant 2-3 heures (jusqu'à la phase logarithmique précoce) 25 à 37°C. L'inducteur, l'acide 3-B-indole-acrylique (Sigma

Chemical Co., Saint-Louis, MO) est ajouté à une concentration finale de 20 pg/ml à partir de stocks fraîchement obtenus de 20 mg/ml dans 95% d'éthanol. Les cultures induites sont ensuite soumises à la croissance à 37°C avec une aération 30 pendant 4 à 5 heures puis mises en comprimés et, facultativement, congelées. Les rendements de protéines provenant de pENV-5 sont typiquement moindres que 1 mg/litre.

Les cellules bactériennes en grains ou pilules sont lysées en utilisant du tampon P-RIPA (PBS contenant 1% de 35 Triton X-100, 1% de désoxycholate, 0,1% de sulfate de sodium * t.

58 dodécyle, et 1% d'aprotinine) qui provoquera la lyse des cellules £. Coli . La suspension peut être soumise à des ondes sonores pour cisailler l'ADN et l'ARN, ce après quoi on effectue une centrifugation pour éliminer les particules.

5 Une phase de dilution ou de concentration peut être nécessaire pour standardiser la concentration de protéine.

L'anticorps monoclonal HIV-gpllO-1 est précipité initialement à partir de fluides ascites ou de surnageants de culture de cellules à la température ambiante ou dans le 10 froid avec des solutions de (NH^gSO^ ou NagSO^ tamponnées à pH 7,3 jusqu'à saturation finale de 33 ou 18% respectivement. Les protéines précipitées sont éliminées par centrifugation et redissoutes dans PBS et précipitées une seconde fois avec 33% de (NH^^SO^ ou 12-15% de NagSO^. Cette phase 15 peut être répétée si nécessaire. Le comprimé est de nouveau dissous dans PBS et les sels en excès sont enlevés par filtration sur gel à travers une matrice de dessalage ou par dialyse-exhaustive sur PBS.

L'anticorps monoclonal purifié 110-1 peut ensuite 20 être couplé à de la Sepharose activée par bromure de cyanogène. La quantité nécessaire de gel est gonflée dans f -3 une solution de HCl 10 M sur un filtre de verre (1 g de matériau séché par congélation donne un volume final de gel d'approximativement 3,5 ml) et lavée pendant 15 minutes avec 25 la même solution, et l'anticorps est ajouté immédiatement après. En général, la réaction de couplage a lieu plus efficacement dans un intervalle de pH 8-10, mais un pH plus faible peut être utilisé si nécessaire pour la stabilité de l'anticorps. L'anticorps doit être dissous dans PBS ou un 30 tampon de borate ou bicarbonate/carbonate de force ionique élevée avec du NaCl 150 mM. La suspension d'anticorps et de Sepharose activée est agitée doucement pendant 2-4 heures à la température ambiante, ou toute la nuit à 4°C, et ensuite lavée sur un filtre de verre fritté avec tampon de couplage.

35 Tous les groupes actifs restants sont bloqués par traitement » λ 59 avec de 1'éthanolamine 1 M à pH 8 pendant 2 heures. Le produit final Sepharose-anticorps est ensuite lavé alternativement avec des solutions tamponsà pH élevé et faible (tampon borate, 0,1M, pH 8,5, tampon acétate et NaCl IM, 0,IM, pH 4, 5 NaCl 1 M, respectivement) quatre ou cinq fois. Ce lavage élimine les traces de matériaux adsorbés de façon non covalente. La matrice de séparation d'immunoaffinité finie est stockée en dessous de 8°C en présence d'un agent bactériostatique convenable, tel que azide 0,01%.

10 L'addition de la suspension de protéine exprimée à la matrice de séparation d'immunoaffinité provoque l'élimination sélective de l'antigène gpllO. On laisse le mélange interagir pendant 2 à 24 heures, de préférence 12-18 heures, avec oscillation ou agitation lente. Un système à colonne peut 15 également être utilisé dans lequel la matrice d'immunoaffinité est versée sur une colonne, équilibrée et la suspension de protéine exprimée ajoutée lentement à la colonne. Après que la suspension de protéine a été ajoutée, l'écoulement peut être arrêté pour permettre une formation de complexe immuni-20 taire maximum.

Le matériau non lié est lavé ou enlevé par séparation par un lavage extensif avec un tampon d'adsorption. Un filtre de verre fritté avec du vide peut être utilisé ou bien on utilise un écoulement au travers de la colonne. Le matériau 25 lié est ensuite élué en utilisant des tampons de pH faible ou élevé (tampon d'acétate, pH 4 ou tampon de borate, pH 8,6) ou bien un agent chaotropique.

EXEMPLE VI

Purification d1immunoaffinité de gpllO recombinant 30 à partir d'un système d'expression de mammifère

Les anticorps monoclonaux de la présente invention trouvent une utilisation dans la purification d'immunoaffinité de gpllO recombinant exprimé par des cellules de mammifère.

Les cellules de mammifère sont infectées avec des vaccins 35 recombinants (Mackett et autres, ^J. Virol. 49:857 (1984) qui r i 60 contiennent des séquences codant au moins la partie de gpllû qui est antigène et met à jour les anticorps de neutralisation .

Les vaccins recombinants sont construits selon la 5 méthode décrite dans la demande de brevet américain N° 842 984 qui est donnée ici à titre de référence. Brièvement parlant, des séquences codant pour la glycoprotéine d'enveloppe de HIV sont insérées dans un vecteur plasmide (pGS20) en aval d'un élément témoin de transcription de vaccin. Ce gène 10 chimérique est flanqué de séquences codant le gène (TK) de la thymidine kinase virale.

Des vecteurs de plasmide chimériques contenant un promoteur de virus de vaccin ligaturé au gène d'enveloppe LAV sont utilisés pour transformer la souche Coli MC1000.

15 L'insertion des séquences LAV-env chimériques dans le génome de virus des vaccins fut réalisée par recombinaison i£ vivo , ce qui est rendu possible par le fait que les gènes chimériques dans les plasmides pv-env5 sont flanqués ou disposés à côté de séquences de virus de vaccin codant pour le gène TK. 20 Ce plasmide est ensuite introduit dans des cellules précédemment infectées par un virus de vaccin du type sauvage et on laisse se produire la recombinaison entre les séquences TK sur le plasmide et les séquences homologues dans le génome viral de vaccin, ce qui assure l'insertion du gène chimérique. 25 Des cellules de rein du Singe Vert d'Afrique (souche BSC-40, lignée dérivée de cellules BSC-1, ATCC N° CCL26) sont utilisées comme cellule hôte dans le système d'expression.

Les cellules BSC-40 confluentes sont infectées suivant un multiple d'infection de 10 par virus de vaccin re-30 combinant. On laisse s'effectuer l'infection pendant 12 heures, auquel moment, les cellules sont récoltées, lavées une fois avec PBS, et recueillies par centrifugation. Les grains cellulaires sont remis en suspension dans un tampon de lyse (1% NP 40, 2,5% désoxycholate de sodium, NaCl 0,1 Μ, M Tris-HCl 35 0,01 M, pH 7,4, EDTA 1 mM), et le lysat est ensuite clarifié * * 61 .par centrifugation. Une séparation d1immunoaffinité de la protéine recombinante exprimée est réalisée comme décrit ci-dessus pour le système d'expression bactérien, en utilisant l'anticorps monoclonal gpllO-1. Les protéines produites 5 par ce système d'expression ressemblent plus étroitement au gpllO HIV produit naturellement en raison du traitement et de la glycosylation fournis par les cellules de mammifère.

EXEMPLE VII

Inhibition de l'infection par HIV avec des 10 pepti*des bloquants L'efficacité des peptides bloquants dans l'inhibition de l'infection des cellules de tissus par la souche LAV^y de HIV fut étudiée en utilisant une modification du protocole pour l'évaluation du peptide T, comme publié par Pert et 15 autres, voir supra. Les tests d'inhibition préférés de HIV consistent à combiner des volumes égaux de peptide bloquant et de cellules CEM (2,5 x 10^) dans un milieu (RPMI, 10% FCS et 2 mg/ml polybrène), et à incuber pendant 45 minutes à 37°C. Du virus est ensuite ajouté à des doses différentes (10, 50, 20 500 TCID 50) le mélange est incubé pendant 14 jours à 37°C et ensuite le supernageant testé pour la production d'antigène du virus (par exemple noyau p25).

Une préincubation des cellules CEM avec les peptides avant l'addition de virus dans les cultures renforce l'effet 25 d'inhibition dans les tests. L'inhibition fut trouvée comme étant dépendante de la dose de virus, et présente une forte activité à des doses moyennes et faibles, mais moins d'effet pour des doses de virus très élevées.

Environ 60% à 90% d'inhibition de la production 30 d'antigène dans les expériences avec doses de virus faibles, furent obtenus avec du peptide T. Des expériences supplémentaires avec des peptides X-XV, typiquement à COOH-terminal amidé et NHg-terminal acétylé, ont donné des résultats similaires, tandis que le peptide XI était particulièrement 35 efficace sur un large intervalle de dose. Les anticorps 62 * 1 neutralisants peuvent être ajoutés soit pendant la période de préincubation ou au moment où le virus est ajouté pour produire une inhibition synergique ou additive de la production d'antigène viral.

5 On comprend de ce qui précède que les anticorps monoclonaux et peptides , comprenant les peptides bloquants, de la présente invention, constituent des méthodes perfectionnées pour neutraliser et/ou inhiber les infections par HIV. Ceci permet à des compositions thérapeutiques et 10 prophylactiques d'être plus facilement développées et qui peuvent être efficaces contre des infections dues pour la plupart, sinon toutes, aux souches HIV. En outre, les nouveaux matériaux de l'invention trouvent des utilisations dans les tests de diagnostic et d'autres processus bien 15 connus.

On donnera ci-après un tableau comportant les références d'un certain nombre de microorganismes qui constituent une partie de la présente invention et qui ont été déposés auprès de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn 20 Drive, Rockville, Maryland 20852, USA .

Description scientifique Ref. Déposants Ref. ATCC Date dépêt

Hybridome souris 25 (balb c/NS-1) HIV-gp 110-1 HB 9175 15 Août 1986 " HIV-gp 110-2 HB 9176 15 Août 1986 " HIV-gp 110-3 HB 9177 15 Août 1986 ‘ " HIV-gp 110-6 HB 9404 30 Avril 1987 " HIV-gp 110-4 HB 9405 30 Avril 1987 30 " HIV-gp 110-5 HB 9406 30 Avril 1987 " HIV-p 25-2 HB 9407 30 Avril 1987 " HIV-p 25-3 HB 9408 30 Avril 1987 " HIV-p 25-6 HB 9409 30 Avril 1987 " HIV-p 25-7 HB 9410 30 Avril 1987 ' '* 63

On notera que les hybridomes HB 9175, HB 9176 et HB 9177 ont été testés et trouvés viables le 26 Août 1986. Les hybridomes restants ont été testés et trouvés viables le 4 Mai 1987.

5 Bien entendu, la présente invention n’est nullement limitée aux exemples donnés qui doivent être considérés comme clarifiant l’invention mais ne la limitant pas.

C’est dire que l’invention comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs 10 combinaisons si celles-ci sont effectuées suivant son esprit.

Claims

1. Composition à utiliser pour le traitement d'infections par HIV, caractérisée en ce qu'elle 5 comprend une dose thérapeutiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec une ou plusieurs régions neutralisantes de HIV, et un excipient pharmaceutiquement efficace.

2. Composition suivant la revendication 1, 0 caractérisée en ce que les régions neutralisantes contiennent des épitopes codés par les régions env ou gag du génome de HIV.

3. Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les ^5 épitopes sont situés sur les protéines gpllO ou p25 de HIV.

4. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend aussi un ou plusieurs peptides bloquants 2q capables d'atténuer le pouvoir infectieux de HIV et/ou anticorps monoclonaux réactifs avec des épitopes de ces peptides.

5. Composition suivant la revendication 4, caractérisée en ce que les peptides bloquants compren- 25 nent au moins environ 5 acides aminés contigus provenant d'une protéine gpllO de HIV.

6. Composition suivant la revendication 5, caractérisée en ce que les peptides bloquants comprennent des peptides provenant de la séquence d'acides 2q aminés 190 à 197 de LAVbru» ou des homologues de cette séquence.

7. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’un anticorps monoclonal est réactif avec au moins un 3!- épitope de la séquence d'acides aminés 278 à 319 de p25 k 65 de LAVßgjj et/ou ses homologues, et un second anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de la séquence d'acides aminés 315 à 363 de p25 de iAVßjyj et/ou ses homologues.

8. Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'un anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de p25 de HIV et un second anticorps monoclonal est réactif avec au moins un épitope de gpllO de HIV.

9. Composition suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'épitope de p25 est situé dans la séquence d’acides aminés 278 à 319 ou 315 à 363 de LAVß£u» ou dans les homologues de ces séquences.

10. Composition suivant l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que l'épitope de gpllO est situé dans les séquences d'acides aminés de l'enveloppe 190 à 197, 301 à 336 ou 308 à 328 de LAVBru» ou dans des homologues de ces séquences.

11. Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle 20 comprend, en outre, un cocktail d'anticorps monoclonaux réactifs avec ces séquences ou différents homologues de ces séquences.

12. Composition d'anticorps monoclonaux, ^ caractérisée en ce qu'elle est spécifiquement réactive avec une région neutralisante de HIV.

13. Composition suivant la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, un anticorps monoclonal réactif avec un peptide bloquant de HIV. 30

14. Composition suivant l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la région neutralisante est située sur gpllO de HIV.

15. Composition suivant la revendication 14, 2^ caractérisée en ce que la région comprend la séquence 66 « » d'acides aminés d'environ 301 à 336 ou 308 à 328 de gpllO de HIV ou des homologues de ces séquences.

16. Composition suivant la revendication 14, caractérisée en ce que la région neutralisante et le 5 peptide bloquant sont situés sur gpllO de HIV.

17. Composition suivant la revendication 16, caractérisée en ce que le peptide bloquant comprend la séquence d'acides aminés d'environ 190 à 197 de gpllO de HIV, ou des homologues de cette séquence. ^0 18.- Composition suivant l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisée en ce que la région neutralisante est située sur p25 de HIV.

19. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) au moins un anticorps monoclonal réactif avec une région neutralisante de HIV et, (b) un peptide bloquant contenant au moins environ 5 acides aminés contigus provenant des séquences d'acides aminés de gpllO de HIV ci-après, ou de leurs homologues :

20 IX (173) Y-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y', ou XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y' 2^ où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides aminés.

20. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un anticorps monoclonal spécifique pour 2Q une région neutralisante de HIV, et (b) un peptide bloquant contenant au moins 1'une des séquences d'acides aminés ci-après ou de leurs homologues : 35 » * 67 XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y', ou XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y', ou 5 XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y', ou XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y' où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides aminés.

21. Composition suivant l'une quelconque des revendications 19 et 20, caractérisée en ce que le 15 peptide bloquant définit au moins un déterminant antigénique capable de faire apparaître des anticorps par immunisation d'un hôte, les anticorps ainsi apparus étant protecteurs contre des infections par HIV.

22. Composition suivant l'une quelconque des 20 revendications 19 à 21, caractérisée en ce que Y et/ou Y' comprennent un résidu de liaison choisi dans la classe formée essentiellement par la glycine, la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide glutamique et l'asparagine. 25 23.- Composition suivant l'une quelconque (»es revendications 19 à 22, caractérisée en ce que le peptide comprend un terminal amino acétylé et/ou un terminal carboxy amidé et/ou un acide aminé d.

24.- Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend 30 au moins environ 5 acides aminés contigus provenant de la séquence d'acides aminés de gpllO de HIV ci-après, ou de ses homologues : 35 68 * 3 XI (29a) Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile- Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr- Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys. 5

25. Peptide suivant la revendication 24, caractérisé en ce que les acides aminés contigus définissent au moins un déterminant antigénique capable de faire apparaître des anticorps par immunisation d'un ^ hôte, ces anticorps étant protecteurs contre des infections par HIV.

26. Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences d'acides aminés de gpllO de HIV ci- après ou de leurs homologues : 15 I (29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y', V (177)

20 Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg- Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Gly-Y', ou VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y', 25 où Y et Y', au cas où ils sont présents, comprennent chacun une séquence d'acides aminés comptant jusqu'à environ 20 acides aminés.

27. Peptide suivant la revendication 26, 30 caractérisé en ce que Y et/ou Y* comprennent un résidu de liaison choisi dans la classe formée essentiellement par la glycine, la tyrosine, la cystéine, la lysine, l'acide glutamique et l'asparagine.

28. Séquences d'acides nucléiques, caracté-35 risées en ce qu'elles codent pour les peptides suivant » J 69 l'une quelconque des revendications 24 à 27.

29. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend un segment d'acides nucléiques d'environ 150 nucléotides ou moins codant pour un segment de 5 peptide bloquant de HIV. 30, - Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que le segment d'acides nucléiques code, en outre, pour un peptide d'une région neutralisante de HIV. 10 31.- Segment d'acides nucléiques d'environ 150 nucléotides ou moins, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide d'une région neutralisante de HIV.

32. Segment d'acides nucléiques suivant la revendication 31, caractérisé en ce qu'il code aussi 15 pour un peptide bloquant de HIV.

33. Segment d'acides nucléiques suivant l'une quelconque des revendications 31 et 32, caractérisé en ce que le peptide d'une région neutralisante comprend au moins environ 5 acides aminés provenant des acides 20 aminés 310 à 336 de gpllO de LAVgj^j, ou des séquences d'acides aminés 278 à 319 ou 315 à 363 de p25 de LAVbru» et des homologues de ces séquences.

34. Jeu de sondes, à utiliser pour des tests de diagnostic par hybridation, caractérisé en ce qu'il 25 comprend au moins deux séquences d'acides nucléiques codant pour les peptides mentionnés au tableau I.

35. Vaccin contre une infection par HIV, caractérisé en ce qu'il comprend une dose immunologi-quement efficace d'un ou plusieurs peptides de moins 30 d'environ 50 acides aminés contenant des régions neutralisantes de gpllO et/ou de p25, ces peptides étant mélangés avec un excipient physiologiquement acceptable.

36. Vaccin suivant la revendication 35, 35 caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, au moins * 4 70 environ 5 acides aminés d'un peptide bloquant.

37. Vaccin suivant l'une quelconque des revendications 35 et 36, caractérisé en ce que les peptides sont conjugués avec un support immunogénique. 5

38. Lignée cellulaire immortalisée, caractérisée en ce qu'elle produit un anticorps monoclonal capable de réagir avec un déterminant antigénique de la glycoprotéine gpllO de l'enveloppe contenu dans une région neutralisante ou un peptide bloquant de HIV.

39. Les lignées cellulaires HIV-gpllO-1, HIV-gpllO-2, HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5, HIV-gpllO-6, HIV-p25-6 et HIV-p25-7.

40. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée cellulaire suivant l'une quelconque des revendications 38 et 39.

41. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il est capable de réagir avec un déterminant antigènique de la glycoprotéine gpllO de l'enveloppe de HIV. 20 42.- Anticorps monoclonal, capable de réagir spécifiquement avec un déterminant antigénique de HIV, caractérisé en ce qu'il bloque la liaison d'un anticorps produit par les lignées cellulaires suivant l'une quelconque des revendications 38 et 39. 25 43.- Procédé pour engendrer des lignées cellulaires qui produisent des anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques de gpllO de HIV, caractérisé en ce qu'il comprend : l'administration à un hôte d'une quantité 20 immunogénique d'une préparation antigénique enrichie en protéines de HIV, l'observation, chez l'hôte, immunisé de la production d'anticorps réactifs avec des déterminants antigéniques de gpllO, 35 l'obtention, à partir de l'hôte, de cellules » » 71 productrices d'anticorps et l'immortalisation de ces cellules, la sélection des cellules immortalisées qui produisent des anticorps à l'égard de gpllO de HIV, et ^ le clonage des cellules immortalisées pour produire les lignées cellulaires,

44. Procédé suivant la revendication 43, caractérisé en ce que les protéines de HIV sont des protéines de fusion recombinantes exprimées par un hôte eucaryote ou bactérien, ou bien les protéines de HIV sont obtenues à partir d'un extrait ou lysat de HIV.

45. Procédé pour diagnostiquer la présence de HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un anticorps monoclonal capable de réagir avec gpllO de HIV contenu dans le dit échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre 1'anticorps monoclonal et le 20 déterminant antigénique dans l'échantillon biologique, et partant la détermination de la présence ou de l'absence de HIV dans l'échantillon.

46. Procédé suivant la revendication 45, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est 25 capable de réagir avec une région neutralisante ou un peptide bloquant de gpllO.

47. Procédé pour diagnostiquer la présence d'anticorps contre HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : 50 l'incubation d'un peptide provenant d'une région neutralisante de gpllO ou p25 de HIV avec le dit échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre le peptide et les anticorps de 55 l'échantillon réactifs avec le peptide, et partant la * > 72 détermination de la présence ou de l'absence de HIV dans l'échantillon.

48. Procédé pour diagnostiquer la présence de HIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce g qu'il comprend : l'incubation, dans des conditions d'hybridation, d'un segment d'acide nucléique codant au moins pour une partie d'une région neutralisante de HIV avec l'acide nucléique que contient l'échantillon biologique, et la détection de la présence de complexes hybrides formés entre le segment d'acide nucléique et l'acide nucléique de l'échantillon, et partant la détermination de la présence ou de 1 ' absence de HIV dans l'échantillon. 15 , ,

49. Procédé pour déterminer une souche de HIV chez un hôte infecté, caractérisé en ce qu'il comprend : l'incubation d'un échantillon biologique prélevé chez l'hôte avec un peptide provenant d'une 20 région neutralisante de HIV, et la détection de la présence de complexes immuns formés entre le peptide et des anticorps de l'échantillon, et partant la détermination de la souche de HIV infectant l'hôte. 25

50. Composition a utiliser pour le traitement d'un patient suspecté d'avoir été exposé à HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeu tiquement ou immunologiquement efficace d'au moins un anticorps monoclonal réactif avec une région neutra-30 lisante de HIV.

51. Trousse à utiliser pour le traitement d'un patient suspecté d'avoir été exposé à HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose thérapeu tiquement ou prophylactiquement efficace d'un ou 35 * ' * 73 plusieurs anticorps monoclonaux réactifs avec une région neutralisante de HIV, des peptides bloquants capables d'atténuer le pouvoir infectieux de HIV et/ou des anticorps monoclonaux réactifs avec les peptides 5 bloquants.

52. Trousse suivant la revendication 51, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal réactif avec la région neutralisante de HIV est produit par une lignée cellulaire portant la désignation ATCC HB 9405 10 et un peptide bloquant est le peptide T ou un dérivé, ou analogue de celui-ci.

53. Composition à utiliser pour le traitement d'un patient infecté par HIV après détermination de la souche de HIV par le procédé suivant la revendi- ^5 cation 49, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal spécifiquement réactif avec une région neutralisante de la souche de HIV.

54. Composition à utiliser pour vacciner un patient contre des infections par HIV, caractérisée en 2Q ce qu'elle comprend une dose immunologiquement efficace d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique, l'anticorps étant spécifiquement réactif avec un idiotype d'un second anticorps monoclonal capable de se fixer sur une région neutralisante de HIV. 25 30 35