DD283936A5 - Verfahren zur herstellung von peptiden, die in der lage sind immunologisch die neutralisierenden bereiche von hiv proteinen nachzuahmen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die in der Lage sind immunologisch die neutralisierenden Bereiche von HIV Proteinen nachzuahmen. Die Herstellung der erfindungsgemaeszen Peptide erfolgt, indem man sie aus einem HIV-Extrakt oder -Lysat oder einem kultivierten biologischen Expressionssystem mit Hilfe eines Immunkomplexes mit den erfindungsgemaeszen monoklonalen Antikoerpern isoliert. Die erfindungsgemaesz erhaeltlichen Produkte sind in der Medizin zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen zur Diagnose von HIV-Infektionen brauchbar.{Verfahren; Herstellung; monoklonale Antikoerper; Peptide; Aminosaeuresequenzen; neutralisierender Bereich; Immunkomplexe; Immunoaffinitaetsreinigung; Medizin; HIV-Bekaempfung; HIV-Nachweis}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Diese lassen sich zu pharmazeutischen Mitteln formulieren, welche bei der Behandlung, Diagnose, Neutralisierung und beim Impfen im Zusammenhang mit der Behandlung von Human-Immunodeficiency Virus (HlV)-lnfektionen brauchbar sind.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das für das Acquired Immunodeficlency-Syndrom (AIDS) und dessen prodromale Phasen, AIDS-related Complex (ARC) und das Lymphadenopathie-Syndrom (LAS) verantwortliche infektiöse Ag en ^ !et oin neuartiges lymphotropes Retrovirus. Dieses Virus wurde auf verschiedene Weise bezeichnet, nämlich als LAV, HTLV-III, ARV und neuerdings als HIV.

Seit der pandemischen Ausbreitung von HIV ist die Behandlung infizierter Personen und die Verhütung der Übertragung auf uninfizierte Risikogruppen von größter Wichtigkeit. Eine Vielzahl von Behandlungsstrategien richtet sich auf unterschiedliche Phasen im LebenscyclusdesViruü. Sie line in Mitsuyaund Broder, 1987, Nature 325:773 beschrieben. Eine Möglichkeit umfaßt die Anwendung von Antikörpern, die an das Virus binden und die Virusroplikation inhibieren, entweder weil sie den Eintritt des Virus in die Wirtsstellen stören oder aufgrund anderer Mechanismen. Sobald die virale Komponente(n) die einem Eingreifen des Antikörpers unterliegt(en), identifiziert ist (sind) hofft man Antikörper-Titer erzeugen zu können, die ausreichen, um die Infektivität des Virus zu neutralisieren und zwar durch Impfung oder in alternativer Weise durch passive Verabreichung von Immunglobulinen oder monoklonalen Antikörpern der gewünschten Spezifität.

Man nimmt an, daß die Hüllglykoproteine der meisten Retroviren mit Rezeptormolekülen an der Oberfläche der für das Virus anfälligen Zellen reagieren und so die Virusinfektivität gegenüber bestimmten Wirten bestimmen. Antikörper, die an die Glykoproteine binden, könnon die Interaktion des Virus mit den Zellrezeptoren blockieren und somit die Infektivität des Virus neutralisieren, siehe Tue Molecular Biology of Tumor Viruses, 534 (J.Tooze, Hrsg., 1973) und RNA Tumor Viruses, 226,236 (R. Weiss et al, Hrsg., 1982) auf beide Publikationen wird hiermit Bezug genommen. Man vergleiche außerdem Gonzalez-Scarano et al., 1982, Virology 120:42 (La Crosse Virus); Matsuno und Inouye, 1983, Infect. Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); und Mathewsetal., 1982, J. Irnmunol., 129:2763(EncephalomyelitisVirus).

Die allgemeine Struktur des HIV besteht in einem Ribonukleoproteinkern, der von einer Lipid-enthaltenden Hülle umgeben ist, 'A/eiche das Virus im Laufe seiner Entwicklung aus der Membran der infizierten Wirtszelle bildet. Die viral kodierten Glykoproteine sind in die Hülle eingebettet und stehen nach außen hervor. Die Hüllglykoproteine von HIV werden ursprünglich in der infizierten Zelle als Prekursormolekül von 150000 bis 160000 Dalton (gp150 oder gp160) synthetisiert und anschließend in der Zelle in ein N-torminales Fragment von 110000 bis 120000 Dalton (gp 110 oder gp 120) um das externe Glykoprotein zu erzeugen und in ein C-terminales Fragment von 41000 bis 46000 Dalton (gp41), das das Transmembran-Hüllglykoprotein darstellt, überführt. Aus den oben angegebenen Gründen war das gp 110 HIV-Glykoprotein Gegenstand zahlreicher Unter; uchungen bezüglich eines potentiellen Targets zur Unterbrechung des Lebenscyclus des Virus. Es wurde gezeigt, daß Sera von MV-infizierten Personen HIV in vitro neutralisieren und daß Antikörper, die an gereinigte gp110 binden, in den Sera vorliegen, Hobert-Guroff et al., 1985, Nature 316:72 Weiss et al., 1985, Nature 316:69 und Mathews et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:9709. Gereinigtes und rekombinantes gp 100 stimulierte dio Produktion neutralisierender Serumantikörper, wenn man sie zur Immunisierung Tieren verabreichte, Robey et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:7 023; Lasky et al., 1986, Science 233:209; und Zagury et al., 1986, Nature 326:249. Weiter konnte gezeigt werden, daß das gp110-Molekül an den CD4 (T4)-Rezeptor bindet und daß monoklonal Antikörper, die bestimmte Epitope des CD4-Rezeptors erkennen, die HIV-Bindung, Syncytiumbildung und Infektivität blockieren, McDougal et al., 1986, Science 231:382. Putney et al. (1986, Science 234:1392) wiesen neutralisierende Serumantikörper in Tieren nach Immunisierung mit einem rekombinanten Fusionsprotein ich, das die carboxyl-terminale Hälfte des gp 110-Moleküls enthielt. Sie konnten weiter zeigen, daß die Glykosylierung des Hüllproteins für ein Ansprechen auf den neutralisierenden Antikörper unnötig ist.

Es wäre deshalb wünschenswert, ein Subunit-Vakzin gegen AIDS unter Anwendung des HIV gp 110-Moleküls oder Teilen davon zur Verfügung zu haben. Subunit-Vakzine sind eine Alternative zu Vakzinen, die aus inaktivierten oder in ihrer Wirkung geschwächten Viren hergestellt werden. Inaktivierte Vakzine sind problematisch, weil möglicherweise nicht alle Viruspartikel abgetötet wurden und die in ihrer Wirkung geschwächten Viren besitzen die Fähigkeit zu mutieren und ihre krankheitsauslösende Wirkung wieder zu gewinnen. Bei Subunit-Vakzinen verwendet man nur diejenigen Teile des Virus zur Immunisierung des Wirts, welche die Antigene oder Epitope enthalten, die in der Lage sind, die Immunantwort auszulösen, d. h. ein Ansprechen auf neutralisierende Antikörper, ADCC und ch-'ytotoxischesT-Zell-Ansprechen. Der Hauptvorteil von Subunit-Vakzinen liegt darin, daß irrelevantes Virusmaterial ausgeschlos-. en ist.

Virale Subunits (Untereinheiten) zur An wem ung in einem Vakzin kann man nach verschiedenen Methoden erzeugen. Beispielsweise kann das Hüllglykoproteir jn einem Baku rienwirt exprimiert und gereinigt werden, obwohl diesem Molekül die meisten post-translationalen Modifikationen (wie die Glykosylierung) oder andere Weiterverarbeitungen fehlen. Eine derartige Modifikation kann man durch Verwendung eines eukaryotischen Expressionssystems, beispielsweise Hefe oder kultivierte Säugetierzelien, erzielen. Virale Gene wurden in Säugetierzellen unter Verwendung von Vaccinia-Viren als Vektor einneführt, siehe beispielsweise Mackett, M. et al, 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:7415; D. Panicali und E. Paoletti, 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:4927.

Rekombinante Vaccinai-Viren kann man gemäß den Methoden von Hu et al., Nature 320:537 (1986) oder Chakrabarti et al., Nature 320:535 (1986), auf die hiermit Bezug genommen wird, konstruieren. In diesen Systemen werden die viralen Glykoproteine, die durch Zellen erzeugt werden, welche mit rekombinanten Vaccinia infiziert sind, in geeigneter Weise glykosyliert. Sie können zu. Extrusion und abschließenden Isolierung an die Zelloberfläche transportiert werden.

Ein wichtiger Schritt in der Produktion eines Subunit-Vakzines ist eine adequate Reinigung des gewünschten Glycoproteins aus der komplexen Mischung des Expressionssystems. Hierfür sind mehrere Methoden geeignet. Dazu zählen, ohne darauf begrenzt zu sein, die präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Golpermeations-Chromatographie, verschiedene Clromatographiemethoden (d.h. Ionenaustausch-, Umkehrphasen-, Immunoaffinitäts- und hydrophobe Int(iraktionschromatographie) und andere. Die m eisten dieser Methoden verwendet man in verschiedenen Kombinationen, um irr. wesentlichen reine Präparate zu erhalten siehe D.G. Kleid et al., 1981, Science 214:1125, C. D. Cabradilla et al., 1986, Biotechnology 4:128, D. J.Dowbenko, 1985, Proc. Nat.Acad. Sei. USA 82:7748, auf die hiermit Bezug genommen wird. Zur Herstellung von Subunit-Vakzinen werden Methoden benötigt, die die Zahl der Stufen reduzieren, die erforderlich sind, um die beste Reinigung eines bestimmter, viralen Antigens aus einer komplexen Expressionsmischung zu erzielen. Eine effiziente Abtrennung der Antigene von Fremakomponenten kann unter Anwendung der Immunoaffinitätschromatographie erfolgen. Diese auch als Immunoadsorption Gekannte Mothode besteht im Prinzip in der selektiven Adsorption eines Antigens an einen festen Träger, an den ein spezifischer Antikörper kovalent geknüpft wurde. Das selektiv absorbierte Antigen eluiert man dann von einem derartigen Adsorbens mit Antikörper-Affinität, indem man beispielsweise den pH-Wert und/oder die lonenstärke des Puffers ändert.

Polygonale Antikörper, die von Tieren, welche mit dem gewünschten Antigen immunisiert wurden oder von natürlich infizierten Personen (siehe beispielsweise Laksy et al., oben) erhalten wurden, wurden häufig als Immunoadsorbentien verwendet. Diese Reagentien besitzen aber im allgemeinen entscheidende Nachteile, beispielsweise daß (i) nicht alle der Antikörper, die an den unlöslichen Träger binden, spezifisch für das interessierende Molekül sind, so daß eine v/eitere Reinigung erforderlich wird; (ii) die Ausbeuten an gewünschtem Antigen häufig niedrig sind; und (iii) die Antikörper-Affinitäten häufig von einem Präparat zum anderen schwanken, so daß Modifizierungen der Elutionsmethode erforderlich sind. Mit der Verwendung monoklonal Antikörper, die spezifisch für das gewünschte virale Antigen sind, in Subunit-Vakzinpräparationen anstelle von polyklonalen Antikörpern könnte man diese Schwierigkeiten umgehen.

Monoklonal Mausantikörper, die HIV-Antigene binden, wurden bereits beschrieben. Mehrere Aroeitsgruppen haben über monoklonal Antikörper berichtet, die spezifisch für das Kernprotein p25 sind (siehe beispielsweise di Marzo Veronese et al., 1985, Proc. Nat.Acad. Sei. USA82:5199und J.Chassagneet al., 1986, J.Immunol.

136:1442). Monoklonal Antikörper, die spezifisch für das Membranglykoprotein gp41 sind, wurden enfalls bereits beschrieben (siehe beispielsweise di Marzo Veronese et al., 1985, Science 229:1402).

Ziel der Erfindung

Es besteht ein Bedürfnis nach Peptiden, die in der Lage sind, die neutralisierenden Bereiche von HIV-Proteinen nachzuahmen. Zu deren Gewinnung benötigt man monoklonal Antikörper, die spezifisch für Epitope in genau definierten Bereichen des Haupthüllglykoproteins gp 110 sind. Diese monoklonalen Antikörper kann man dazu verwenden, den gewünschten Bereich von gp 110 beispielsweise für die Anwendung in Vakzinen aus zerstörten Viren oder rekombinanten Expressionssystemen zu reinigen. Weiter könnte der Bereich chemisch synthetisiert werden, der das (die) Epitop(e) enthält (enthalten), das (die) von den monoklonalen Antikörpern erkannt wird (werden), wodurch die mit der Reinigung und Verabreichung größerer Fragmente des gp HO-Moleküls verbundenen Schwierigkeiten vermieden werden könnten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß werden Peptide, welche in der Lage sind, di i neutralisierenden Epitope von HIV-Proteinen immunologisch nachzuahmen sowie weitere Peptide, welche die HlV-lnfektivit it stören, zur Verfügung gestellt. Diese neuartigen Materialien finden beispielsweise in Diagnose-Assays für den Nachweis von HIV-Infektionen und bei der therapeutischen Behandlung von oder beim Impfen gegen HIV-Infektionen Anwendung.

Die Erfindung betrifft neue Mittel und Methoden zur Neutralisierung von HIV-Infektionen, d. h. zur Verhinderung oder substantiellen Inhibierung der Bildung oder cellulasen Transmission von infektiösem HIV in einem Wirt. Insbesondere werden Peptide, die einen neutralisierenden Bereich des HIV nachahmen, sowie monoklonale Antikörper, die mit einem derartigen Bereich reagieren, für die Diagnose und Behandlung und zur Impfung gegen HIV-Infektionen verwendet. Der Ausdruck „neutralisierender Bereich" bezeichnet in diesem Zusammenhang diejenigen Teile des HIV, insbesondere HIV-Proteine welche Aminosäuresegmente enthalten, die ein oder mehrere Epitope definieren, die mit Antikörpern reagieren, welche entweder alleine oder in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Antikörpern in der Lage sind, HIV-Infektionen zu neutraliseren. Geeignete Assays für die Neutralisierung sind bekannt, dazu zählen beispielsweise die Reduktion von HIV-Infektionen in T-Zellinien, die Reduktion von Plaque-bildenden Einheiten von VSV (HIV) Pseudotypen, welche die Hüllglykoproteine von HIV tragen, Syncytium-Inhibitionstests und Virion-Rezeptor-Bindungstests. Wie erwünscht, ist die neutralisierende Aktivität mit der Antikörperreaktivität in immunorhemischen Tests, wie Immunofluoreszenz-, Immunoblot- und Radioimmunopräzipitations-Assay, vergleichbar.

Die neuen Peptide mit typischerweise weniger als ungefähr 50 Aminosäuren enthalten 5 oder mehr zusammenhängende Aminosäuren, die Epitope bilden, welche im wesentlichen denjenigen Epitopen ähneln, welche sich in neutralisierenden Bereichen von HIV gp 110 oder p.25 befinden, die durch die env- und gag-Bereiche des HIV-Genoms kodiert sind. Von besonderem Interesse sind diejenigen Bereiche, die sich etwa vom Aminosäurerest 301 bis etwa 336 von gp 110 und etwa 278 bis etwa 319 und etwa 315 bis etwa 363 von ρ 25 (alle von dem als LAV_Bru bezeichneten HIV-Stamm) erstrecken. Die Bezeichnung der Aminosäurereste stammt von der Los Alamos Datenbank (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos, NM 87545).

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß weitere analoge Bereiche („Homologe") von anderen HlV-lsolaten identifiziert werden können, basierend auf ihrer Lage in verwandten Proteinen aus unterschiedlichen Isolaten. In der Praxis können derartige Homologe unter Bezug auf LAVeAirSequenzdaten folgendermaßen identifiziert werden:

a) die Aminosäuresequenzen von HIV-lsolaten und LAV_Bnu können so ausgerichtet werden, daß maximale Homologie zwischen den beiden Sequenzen besteht.

b) man kann Peptide identifizieren, die diejenigen Aminosäuresequenzen von HlV-lsolaten umfassen, die der Lokation der LAVoRu-Peptide entsprechen, welche immunologisch die LAV_BRu-Pr°teine nachahmen. Peptide, welche die auf dieso Weise identifizierten Aminosäuresequenzen von HlV-lsolaten umfassen, ahmen typischerweise die entsprechenden Proteine des HlV-lsolats immunologisch nach.

Diese Methode kann auch auf HIV-Stämme angewandt v. ^iden, die erst noch aufzufinden sind. Wenn beispielsweise neue HIV-Stämme identifiziert werden, können deren Hüll- und Kernaminosäuresequenzen mit denjenigen von LAV₆Ru zur Erzielung maximaler Homologie in Übereinstimmung gebracht werden. Die Methoden, mit denen die Sequenzen in Übereinstimmung gebracht werden, sind dem Fachmann bekannt. Wenn die Sequenzen in Übereinstimmung gebracht werden, ist es wünschenswert die Homologie zwischen den Cysteinresten so groß wie möglich zu halten. Die Aminosäuresequenz des neuen HIV-Stamms oder der HIV-Spezies, die der Lokation der hier offenbarten Peptide entspricht, kann synthetisiert und erfindungsgemäß zur Anwendung gebracht werden.

Eine weitere Methode zur Bestimmung von Sequenzen eines homologen Bereichs in anderen HIV-Stämmen wurde von Scharf et al., Science (1986) 233:1076 beschrieben. Dabei verwendet man zwei Oligonukleotid-Primer, die an konservierte Sequenzen außerhalb des hier interessierenden Sequenzbereiches binden, wobei in jedem Primer unterschiedliche restriktive Stellen vorhanden sind. Die DNA von HIV-Stämmen kann dann in vitro vervielfacht werden und die erhaltenen Oligonukleotide können in Vektoren für die Sequenzanalyse kloniert und einem Vakzin als Cassette einverleibt werden, die ein bestimmtes Epitop des HIV-Stamms darstellt.

Es ist bei der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich, daß die Epitope, die innerhalb derartiger Sequenzen vorhanden sind, mit Antikörpern aller HIV-Stämme oder -spezien eine Kreuzreaktion eingehen. Peptide, die immunologische Epitope umfassen, welche eine Spezies oder Serogruppe von einer anderen unterscheiden, finden zur Identifizierung bestimmter Spezien oder Serogruppen Anwendung und können zur Identifizierung von Personen dienen, die mit einer oder mehreren HlV-Spezien oder -Serogruppen infiziert sind. Sie sind auch in therapeutischen Mitteln in Kombination mit anderen Peptiden brauchbar, die entweder von einem homologen Bereich oder einem anderen neutralisierenden Bereich stammen.

Die hier interessierenden Peptide stammen vorzugsweise von der gp 110-Region des Virus ab. Von besonderem Interesse in diesem Bereich sind Peptide, die im offenen env-Leserahmen kodiert sind, der sich etwa von Basenpaar (bp) 6667 bis etwa zum Basenpaar 6774 des LAV_BRU-lsolats erstreckt. Unterschiedliche homologe Bereiche anderer HlV-lsolate umfassen somit, wie in Tabelle I aufgeführt, die homologen Sequenzen, die von der Los Alamos Datenbank (ausgenommen LAV 2) erhalten wurden. Weitere Peptide, die zur Erzeugung von und zum Screening auf monoklonal Antikörper brauchbar sind, sind diejenigen, die im offenen env-Leserahmen etwa vom bp7246 bis etwa 7317 von LAV_Bru kodiert sind. Derartige Antikörper und reaktvie Peptide sind insbesondere im Immunoassay brauchbar.

Im gag-Bereich des LAV_BRU-lsolats stellen die p25 Aminosäuresequenzen von etwa 278 bis 319 und 315 bis 363 weitere neutralisierende Bereiche des HIV dar.

Es ist für den Fachmann ersichtlich, das weitere neutralisierende Bereiche des HIV identifiziert werden können und zwar auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Lehre. Insbesondere zeigen Kombinationen monoklonaler Antikörper, die mit verschiedenen HIV-Epitopen reagieren, eine neutralisierende Aktivität.

TABELLE 1 HXB2 TGTACAACACCCAACAACAATACAAGAAAAACA ATCCGTATC CytThrArgProAenAenAenThrArgLyeArg IleArf XIt 309

BH102 Ser 309

BH8 —————————·.————« ..··—»-——-—·.·»————Lyi~————»—·.——·.»——————-——— 309

HXB3 Lye 309

H9M -Ser 309

BRU ——·.—-*—-.———-.··»-··—»———··»«·——«*———^SCT""*"**"**"" ·»——·.«—·.·. .··«—— jIm MAL GIy ArgCly -KtePhe 314 ELI —Ale TyrGln GIn ThrPro 310 ARV2 — Ser Tyr— 312 WMJ2 Tyr V*l—ArgSer LeuSer 306 RFENV — —Ser ThrLys 322 Z6 TyrLye ClnSer— ThrPro— 311

23 GlySerAspLysLysIle GlnSer— 306

WY5 Lye GIy Ala 304 CDC42 Hie ValThrLeu 320 LAV2 GIy—Lys—-VaI Gin HetLeu 302 HXB 2 CAGAGA CGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGG AAATATG ClnArg ClyProClyArgAlaPheValThrlleClyLyelleGlyAenHet 326

BH102 326

BH8 - - 326

HXB3 326

H9M - —

BRU

HAL Gin—UuTyr Thr lleVal—Asplle ELI GlyLeu .. .GlnSerLeuTyrThr Arg IleValSerArgSer ARV2 His Thr—Arg— lleGlyAsp WMJ2 Arg—Argülu...— IleGlylle RFENV VallleTyrAlaThr GIn IleGlyAep

26 ClyLeu .,.ClnAlaLeuTyrThr Arg—-ArgThrLyellelle

Z3 Arglle LyeVal—TyrAlaLy·—GIy NY5 ClyPro ... ThrLeuTyrAlaArgClu A'plli CDC42 ValTrpTyr—Thr GIu LeuGlyAsn LAV2 MetSer HisVal—HieSerHieTyrClnProIle—Lys

11XB2 ... AGA.. . CAAGCACATTGT

...Arg...GlnAlaHieCyr 331

BH102 331

BH8 331

HXB3 — 331

H9M 331

BRU 336

MAL Arg—Tyr— 334

fcLl IlelleGly— 330

ARV2 lie Lye... 333

WMJ2 Ue 326

RFtNV He Lys... 343

Z6 GIy... 334

Z3 IleThrCly 326

NY5 325

CDC42 lie — 341

LAV2 ArgProArg Met— 330

Peptid I, das auch als Peptid 29 bezeichnet wird, ist im offenen env-Leserahmen etwa von den Aminosäureresten 308 bis kodiert und besitzt die folgende Aminosäuresequenz, bei der die Oligopeptide innerhalb dieser Sequenz lineare Epitope dieser Sequenz umfassen:

1(29) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y',

in der Yund Y', soweit vorhanden, jeweils Sequenzen von biszuotwa 20 Aminosäuren bedeuten. Wenn Y und/oder "vorhanden sind, können diese beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren aus Sequenzen, die die Aminosäurereste 308 bis 328 der HIV-Hüllsequenz flankieren, oder irgendeinen Teil dieser flankierenden Sequenzen umfassen. So kann Y beispielsweise und ohne darauf begrenzt zu sein, die LAVeRu-Hüllaminosäuresequenz etwa von den Resten 301 bis 307 ganz oder teilweise umfassen und Y' kann die LAVeRu-Hüllaminosäuresequenz etwa von den Rosten 329 bis 336 ganz oder teilweise umfassen, wie folgt:

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

In alternativer Weise kann man gekürzte Sequenzen der erfindungsgemäßen Peptide herstellen. In dieser Hinsicht sind die folgenden Sequenzen des Peptids 29 besonders brauchbar:

III (29b) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Y'^

worin Y und/oder Y', soweit vorhanden, jeweils Sequenzen von bis zu etwa 20 Aminosäureresten bedeuten;

IV (29c) Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y^

worin Y und Y', soweit vorhanden, jeweils von Sequenzen bis zu etwa 20 Aminosäureresten bedeuten.

Gemäß ein jr weiteren Ausführungsform sind besonders interessierende homologe Bereiche des ARV-2-lsolats in dem offenen env-Leserahmen von etwa den Aminosäureresten Nr. 306 bis etwa 323 kodiert. Sie haben typischerweise die folgende Aminosäuresequenz, bei der Oligopeptide innerhalb dieser Aminosäuresequenz lineare Epitope innerhalb einer derartigen Sequenz umfassen.

V (177) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y',

worin Y und Y', soweit vorhanden, jeweils 1 bis etwa 20 oder mehr Aminosäurereste umfassen. Wenn Y und/oder Y' vorhanden sind, können sie 1 oder mehrere Aminosäurereste von Sequenzen, welche die Aminosäurereste 306 bis 323 der ARV-2-Hüllsequenz flankieren, oder einen Teil dieser flankierenden Sequenzen umfassen. Insbesondere kann Y die HIV-Hülla inosäuresequenz etwa von den Resten 299 bis 306 ganz oder teilweise umfassen; Y' kann die Hl V-Hüllaminosäuresequenz etwa von den Resten 324 bis 333 ganz oder teilweise umfassen.

In alternativer Weise kann man verkürzte Sequenzen der Peptide V herstellen. In dieser Hinsicht sind die folgenden Sequenzen besonders brauchbar:

VI (177 a) Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y';und

VII Y-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys-Yj

worin Y und/oder Y', soweit vorhanden, jeweils Sequenzen von bis zu 20 oder mehr Aminosäureresten bedeuten.

Ein weiteres Beispiel umfaßt homologe Bereiche des LAV-2-lsolats, wie sie beispielsweise im offenen env-Leseraster etwa von den Aminosäureresten 311 bis 330 kodiert sind. Sie besitzen typischerweise die folgende Stquenz:

VIII (110-2-2) Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y',

worin Y und/oder Y', soweit vorhanden, jeweils Sequenzen von bis zu 20 oder mehr Aminosäurereste bedeuten (siehe Nature 326:662 (1987), worauf hiermit Bezug genommen wird).

Gegenstand der Erfindung sind weiter neue Zellinien, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu produzieren, sowie Mittel, die diese Antikörper enthalten. Die Antikörper sind in der Lage bei extrem hohen Titern (von 10² bis 10⁴ bis etwa 10⁷ oder mehr) neutralisierende Bereiche, die in einer vorbestimmten Sequenz des Hüllglykoproteins gp 110 oder ρ 25 enthalten sind, deren Proteinprekursoren, biologisch exprimierte rekombinante Fusionsproteine und synthetische Peptide, die ein oder mehrere Epitope innerhalb des vorbestimmten Sequenzbereiches von gp 110 oder ρ 25 enthalten, selektiv zu erkennen. Die Hybridzellen besitzen ein identifizierbares Chromosom, bei dem sich die Keimbahn-DNA umgeordnet hat, um für einen Antikörper zu kodieren, der eine Bindungsstelle für ein Epitop an gp 110 oder ρ 25 aufweist, das einige oder alle klinische HlV-lsolate aufweisen. Diese monoklonalen Antikörper kann man auf vielfältige Weise anwenden. Dazu zählen die Anwendungen in der Diagnose und Therapie sowie die Anwendung zur Identifizierung weiterer kreuz-reaktiver Antikörper, wie blockierende Antikörper. Peptide oder Polypeptide, die das (die) Epitop(e) enthalten, mit dem sie reagieren, finden separate Anwendung als Immunugene für Vakzine oder als therapeutische Mittel.

Blockierende Peptide

Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft, hauptsächlich zur Anwendung zusammen mit den obigen Peptiden oder neutralisierenden monoklonalen Antikörpern, weitere Peptide oder Antikörper, die die HIV-Bindung an Rezeptoren stören, um die HlV-Infektivität weiter zuschwächen. Vorzugsweise kann man die sogenannten „blockierenden Peptide", die in der Lage sind, die Virusproliferation zu inhibieren, sowie monoklonale Antikörper, die spezifisch für Epitope sind, die in derartigen blockierenden Peptiden enthalten sind, dazu verwenden, die Wirksamkeit der Behandlung von HIV-Infektionen zu steigern. HlV-blockierende Peptide entsprechen typischerweise derjenigen HIV-Aminosäuresequenz, von der man annimmt, daß sie für die Anlagerung des Virus an eine Wirtszelle wesentlich ist, beispielsweise die env-kodierten Aminosäurereste etwa 190 bis etwa 197 von LAVbru und etwa 185 bis etwa 192 von ARV-2 und HTLV-IIKBH-10). Dazu zählen das Peptid T-Oktapeptid (Ala-Ser-Thr-Thr-THr-Asn-Tyr-Thr) und dessen verschiedene Derivate (z. B. IX unten) und Analoge (z. B. Xl, unten), das von Pert et al (1986, Proc. Natl, Acad. Sei. USA 83:9254-9258, worauf hiermit Bezug genommen wird) beschrieben ist und das sich auf dem Hüllglykoprotein (gp 110 oder 120) befindet.

Von besonderem Interesse sind beispielsweise blockierende Peptide mit den nachfolgenden Sequenzen, wobei vorzugsweise der NH2-Terminus acetyliert und der COOH-Terminus amidiert ist:

IX (173D) Y-oAla-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y';

X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y;

XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y';

XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y';

XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y';

Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y'; XV(191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y';

worin bei jedem Peptid Y und Y', soweit vorhanden, jeweils eine Aminosäuresequenz von bis zu etwa 20 Aminosäuren bedeutet. Epitope oder antigene Determinanten innerhalb dieser Peptide sind typischerv/eise durch wenigstens 5 benachbarte Aminosäuren definiert und finden Anwendung beispielsweise für die Nachahmung natürlich vorkommender HIV-Antigen Stellen bei der Herstellung von HIV-reaktive Antikörpern und Vakzinen.

Gewinnung monoklonaler Antikörper

Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit einem oder mehreren neutralisierenden Bereichen von HIV reagieren, erfolgt dadurch, daß man einem Wirt eine immunogen wirksame Menge eines mit HIV-Proteinen angereicherten Antigenpräparates verabreicht; die Produktion der spezifisch reagierenden Antikörper im immunisierten Wirt überwacht; die Antikörper-produzierenden Zellen aus dem Wirt gewinnt und immortalisiert; die immortalisierten Zellen, die Antikörper gegen HIV produzieren, selektiert; die immortalisierten Zellen für die Produktion von Zellinien kloniort; und die Zellinien, die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die mit einem oder mehreren neutralisierenden HIV-Bereichen reagieren, kultiviert und die Antikörper gewinnt.

Vorzugsweise verwendet man als HIV-Proteine rekombinante Fusionsproteine, die von einem eukaryontischen oder bakterielen Wirt exprimiert werden oder HIV-Proteine aus einem HIV-Extrakt odar -Lysat.

Vorzugsweise verwendet man auch eine immortalisierte Zollinie, die monoklonale Antikörper produziert, welche in der Lage sind, mit einer Hüllglycoprotein-gp 110-Antigen-Determinante zu reagieren, die innerhalb des neutralisierenden Bereiches oder blockierenden Peptids des HIV enthalten ist.

Die Herstellung monoklonaler Antikörper kann also dadurch erfolgen, daß man die Expression von Nukleinsäuresequenzen immortalisiert, die für Antikörper kodieren, die spezifisch für HIV sind, durch Einführung derartiger Sequenzen, typischerweise von für den Antikörper kodierender cDNA, in einen kultivierbaren Wirt. Die immortalisierte Zellinie kann eine solche Säugetierzellinie sein, die durch Onkogenese, Transfektion, Mutation oder dergleichen transformiert wurde. Zu derartigen Zellen zählen Myelomlinien, Lymphomlinien oder andere Zellinien, die in der Lage sind, die Expression und Sekretion des Antikörpers in vitro herbeizuführen. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommendes Immunoglobulin eines Säugetieres sein, das durch Transformation eines Lymphocyten, insbesondere eines Splenocyten, mit Hilfe eines Virus oder mittels Fusion des ' Lymphocyten mit einer neoplastischen Zelle, beispielsweise einem Myelom, unter Bildung einer Hybridzellinie produziert wird. Typischerweise erhält man den Splenocyten von einem Tier, das gegen das HIV-Virus oder ein Fragment mit einer epitopen Stelle davon immunisiert wurde.

Immunisierungsmethoden sind bekannt, sie können beträchtlich variieren und dennoch wirksam bleiben, siehe Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 2 Auf I. (1986), auf das hiermit Bezug genommen wird. Zerstörte Viren, synthetische Peptide und bakterielle Fusionsproteine, die die antigenen Fragmente des gp 110 oder ρ 25-Moleküls enthalten, kann man als Immunogens verwenden. Vorzugsweise wird das Immunogen zerstörter Viren, Peptide oder rekombinanter Proteine durch Proteine oder Fragmente davon angereichert, welche die Epitope enthalten, wofür Antikörper produzierende B-Zellen oder Splenocyten gewünscht sind. Insbesondere kann man Lösungen, die Lysate oder Extrakte zerstörter Viren enthalten, oder Überstände von biologisch exprimierten rekombinanten Proteinen oder zerstörten Expressionsvektoren durch Glykoproteine wie gewünscht anreichern, wobei man Reinigungsmethoden, wie beispielsweise die Polyacrylamid-Gelelektrophorese, verwendet. Die Lektin-Affinitätsreinigung ist eine bevorzugte zweckmäßige Methode zur Reinigung von gp 110 und anderen Glykoproteinen, beispielsweise die Affinitätsreinigung unter Verwendung von lentilem Lektin. Das Ausmaß, in dem die Glykoproteine aus den Lösungen zur Anwendung als Immunogen gereinigt werden, kann stark schwanken, d. h. von weniger als 50% bis zu üblicherweise wenigstens 75 bis 95%, wünschenswerterweise 95 bis 99% und besonders erwünscht bis zur absoluten Homogenität.

Wenn man die Proteine in dem gewünschten Maß gereinigt hat, kann man sie in einem zur Immunisierung geeigneten physiologischen Träger suspendieren oder darin lösen oder man kann sie an ein Adjuvans koppeln. Eine bevorzugte Technik umfaßt beispielsweise die Adsorption der Proteine und der Fragmente davon an lentiler Lektinagarose oder einem anderen makromolekularen Träger für die Injektion. Immunogene Mengen antigener Präparate, die mit HIV-Proteinen, einschließlich dem gp 110-Glykoprotein und dem ρ 25-Kernprotein, oder den antigenen Teilen davon angereichert sind, werden im allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von 1 pg bis 20 rrfg/kg des Wirtes injiziert. Di» Verabreichung kann, beispielsweise durch intramuskuläre, peritoneal, subkutane, intravenöse usw.. Injektion erfolgen. Die Verabreichung kann 1 x oder mehrere Male und üblicherweise in 1 - bis 4wöchigen Intervallen erfolgen. Die immunisierten Tiere kontrolliert man hinsichtlich der Produktion von Antikörpern gegen die gewünschten Antigene, anschließend entfernt man die Milz, isoliert die B-Lymphocyten der Milz und fusioniert sie mit einer Myelomzellinie oder transformiert sie. Die Transformation oder Fusion kann man in üblicher Weise durchführen, die Fusionsmethode ist in zahlreichen Patenten beschrieben, beispielsweise in US-PS'en 4172124,4350683, 4363799,4381292 und 4423147; man vergleiche auch, Kennett et al. Monoclonal Antibodies (1980) und die darin angeführten, sowie Godin wie oben erwähnt; auf alle diese Publikationen wird hiermit Bezug genommen.

Die immortalisierten Zellinien kann man Monieren und gemäß üblichen Verfahren einem Screening unterziehen. In den Zellüberständen kann man die Antikörper, die in der Lage sind, an die gewünschten gp 110 oder ρ 25-HIV-Proteine zu binden, die rekombinanten Fusionsproteine oder die synthetischen Peptide nachweisen, die den gewünschten epitopen Bereich enthalten. Geeignete immortalisierte Zellinien kann man dann in vitro wachsen lasen oder in die Peritonealkavität eines geeigneten Wirts zur Gewinnung von Ascites-Flüssigkelt injizieren. Weil erfindungsgemäße Antikörper vorliegen, die als spezifisch für Epitope bekannt sind, weiche beispielsweise innerhalb der Bereiche vorhanden sind, die durch den LAv°e_RU-Genombereich von etwa bp6688 bis etwa bp6750 (kodierend für Peptid 29) oder von etwa bp7246 bis etwa 7317 (kodierend für Peptid 36) (bp-Numerierung gemäß Wain-Hobson et al., Cell 44:9 1985, auf die hiermit Bezug genommen wird), ködert sind, kann man die Überstände mit den monoklonalen Antikörpern einem kompetitiven Assay unterziehen. Somit können weitere immortalisierte Hybridom-Zellinien mit den gewünschten Bindungseigenschaften leicht aufgrund der Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen, für ein bestimmtes Antigen spezifischen Antikörper aus einer Vielzahl ν on Quellen herstellen. Alternativ kann man diese Zellinien mit anderen neoplastischen B-Zellen fusionieren, wobei diese anderen B-Zellen als Empfänger für die Genom-DNA, die für die Antikörper kodiert, dienen kann.

Neoplastische B-Zellen von Nagetieren, insbesondere Mäusen oder Ratten, sind bevorzugt. Sie können jedoch auch von anderen Säugetierspezien stammen, beispielsweise von Lagomorpha, Rindern, Schafen, Pferden, Schweinen, Vögel (Avian) oder dergleichen. Man kann die Immunisierung dieser Tiere auf einfache Weise durchführen und ihre Lymphocyten, insbesondere die Splenocyten, für Fusionen gewinnen.

Die von den transformierten oder Hybridzellinien sekretierten monoklonalen Antikörper können von einer der Klassen oder Unterklassen der Immunoglobuline sein, wie IgM, IgD, IgA, IgG_1-, oder IgE. IgG ist bevorzugt, weil es sich dabei um den üblichsten Isotyp handelt, der in Diagnose-Assays verwendet wird. Die monoklonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente, wie Fv, Fab, F(ab')2, verwendet werden. Sie werden üblicherweise jedoch intakt verwendet. Um eine mögliche Antigenität eines monoklonalen Antikörpers, der nicht vom Menschen stammt, in einem Humanwirt zu umgehen, kann man chimere Antikörper konstruieren, bei denen das Antigen-Bindungsfragment eines Immunoglobulinmoleküls (variabler Bereich) rr ittels einer Peptidverknüpfung von wenigstens einem Teil eines anderen Proteins gebunden ist, das beim Menschen nicht als fremd erkannt wird, wie beispielsweise die „cast out portion" eines Humanimmunoglobulinmoleküls. Dies kann dadurch erfolgen, daß man die Exone des variablen Bereichs des Tieres mit Human-Kappa- oder -gammaexonen des konstanten Bereichs fusioniert. Hierfür sind dem Fachmann mehrere Methoden bekannt, beispielsweise diejenigen, die in PCT 86/01533, EP-A-171496 und EP-A-173494 beschrieben sind, auf die hiermit Bezug genommen wird.

: harmazeutische Formulierungen und Anwendungen

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit neutralisierender Wirkung, beispielsweise diejenigen, die mit einer Epitopstelle auf gp 110 oder ρ 25 oder mit einem blockierenden Peptid reagieren, können pharmazeutischen Mitteln als eine Komponente einverleibt werden, um HIV-Infektionen zu schwächen. Das Mittel soll eine therapeutische oder prophylaktische Menge von wenigstens einem der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Der pharmazeutische Träger soll eine kompatible, nicht-toxische Substanz sein, die geeignet ist, die monoklonalen Antikörper an den Patienten zu vermitteln. Man kann steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe als Träger verwenden.

Pharmazeutisch verträgliche Adjuvantien (Puffer, Dispergiermittel) können den erfindungsgemäßen Mitteln ebenfalls einverleibt werden. Dies j Mittel können einen einzelnen monoklonalen Antikörper enthalten, um beispielsweise spezifisch für HIV-Stämme mit Hüllglykoproteinen zu sein, die eine Epitopstelle innerhalb eines Bereiches enthalten, der durch bp6688 bis bp 6750 kodiert ist. In alternativer Weise kann ein pharmazeutisches Mittel einen oder mehrere monoklonal Antikörper enthalten und einen „Cocktail" bilden. Beispielsweise ein Cocktail, der monoklonale Antikörper gegen verschiedene HIV-Stämme enthält, stellt ein universell anwendbares Produkt mit therapeutischer oder prophylaktischer Aktivität gege die meisten klinischen HlV-lsolate dar. Der Cocktail kann monoklonale Antikörper enthalten, die an HIV-Proteine oder -glykoproteine binden, die sich von gp 110 oder ρ25 unterscheiden, wie beispielsweise gp41-Glykoprotein oder p34-Nuklease/lntegrase. Das Molverhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörperkomponenten unterscheidet sich im allgemeinen um nicht mehr als den Faktor 10, insbesondere um nicht mehr als den Faktor 5 und liegt im allgemeinen bei etwa 1:1-2 pro jeder anderer Antikörperkomponente.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kann man als separat zu verabreichende Mittel einsetzen, die zusammen mit anderen anti-retroviralen Mitteln, einschließlich blockierenden Peptiden, gegeben werden. Der gegenwärtige Stand der Entwicklung anti-retroviraler Mittel und von Anti-HIV-Mittel ist im einzelnen in Mitsuya et al., Nature 325:773-778,1987 beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, Peptide und pharmazeutischen Mittel sind insbesondere zur oralen und parenteralen Verabreich jng brauchbar. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Mittel parenteral verabreicht, d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb auch Mittel zur parenteralen Verabreichung zur Verfügung, die eine Lösung der monoklonalen Antikörper, Peptide oder eines Cocktails davon in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wäßrigen Träger, umfassen. Man kann eine Vielzahl wäßriger Träger einsetzen, beispielsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei an Teilchen. Die Mittel kann man mit Hilfe herkömmlicher und bekannter Methoden sterilisieren. Die Mittel '(önnen pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich sind, um annähernd physiologische Ecimgungen einzustellen, wie Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffer, Mittel zur Einstellung der Toxizität und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat und dergleichen. Die Menge an

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Antikörper in diesem Formulierungen kann in weitem Umfange variieren, d. h. von weniger als ungefähr 0,5 Gew.-%, üblicherweise etwa oder wenigstens etwa 1C :iw.-% bis zu 15 oder 20Gew.-% Dieso Menge wird hauptsächlich im Hinblick auf die Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten und dergleichen, und vorzugr weise im Hinblick auf die Art der Verabreichung gewählt. Ein typisches pharmazeutisches Mittel zur intramuskulären Injektion kann somit 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50mg monoklonale Antikörper enthalten. Ein typisches Mittel zur intravenösen Infusion kann 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150mg monoklonale Antikörper enthalten. Methoden zur Herstellung parenteral verabreichbarer Mittel sind bei«, nt oder dem Föchman geläufig und sind detailliert beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Science, 15. Aufl., Mack Publishi ig Company, Easton, Pennsylvania (1980) beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptide kann man zur Lagerung lyophilisieren und vor der Anwendung in einem geeigneten Träger rekonstituieren. Dieses Verfahren hat sich bei üblichen Immunoglobulinen als wirksam erwiesen. Dabei kann man bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutlonstechniken anwenden. Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß die Lyophilisierung und Rekonstitution zl einem unterschiedlichen Grad an Antikörperaktivitätsverlust führen kann (bei herkömmlichen Immunoglobulinen neigen 'qM-Antikörper dazu einen größeren Aktivitätsverlust zu erleiden als lgG-Anti!iörper) und daß daher die angewandte Menge angepaßt werden muß, um den Verlust zu kompensieren. Die Mittel, die die erfindungsgemäßon monoklonalen Antikörper, Peptide oder Cocktails davon enthalten, kann man zur prophylaktischen'und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen verabreichen. Bei der therapeutischen Verabreichung werden die Mittel einem Patienten, der bereits mit HIV infiziert ist, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Infektion und die damit verbundenen Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zum Stehen zu bringen. Die Dosis, die man benötigt, um dies zu erreichen, ist als „therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die bei dieser Anwendung wirksamen Menge η richten sich nach der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten, sie liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 200mg Antikörper pro kg Körpergewicht, wobei Dosieiungen von 5 bis 25mg pro kg üblicherweise zur Anwendung kommen. Da die erfindungsgemäßen Produkte im allgemeinen bei schweren Erkrankungen, d. h. in lebensbedrohenden oder potentiell lebensbedrohenden Situationen zur Anwendung kommen, ist es r täglich und kann vom behandelnden Arzt erwünscht sein, eine wesentlich größere Menge dieser Antikörper zu verabreichen. Bei prophylaktischer Anwendung verabreicht man die Mittel, die die erfindungsgemäßen Peptide, Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten, einem Patienten, der noch nicht mit HIV infiziert ist, der ab ' möglicherweise vor kurzem einer derartigen Infektion ausgesetzt war oder angenommen hat, daß er dieser ausgesetzt war oder einem Risiko unterliegt, dem Virus ausgesetzt zu sein. Die prophylaktische Verabreichung dient dazu, die Widerstandskraft des Patienten gegen eine potentielle Infektion zu stärken oder den Patienten gegen das Virus zu impfen. Eine hierfür geeignete Menge wird als „prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Auch bei dieser Anwendung richten sich die genauen zu verabreichenden Mengen nach dem Gesundheitszustand und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten, sie liegen im allgemeinen im Bereich von 0,1 mg bis 25mg pro kg, insbesondere 0,5mg bis 2,5mg pro kg.

Man kann Einzel- oder Mehrfachverabreichungen der Mittel vornehmen, wobei die Dosis und das Verabreichungsschema vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die pharmazeutischen Formulierungen sollten in jedem Fall eine Menge an erfindungsgemäßen Antikörpern zur Verfügung stellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln. Darüber hinaus finden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper als Target-spezifisches Trägermolekül Anwendung. Ein Antikörper kann an ein Toxin zur Bildung eines Immunotoxins oder an eir radioaktives Material oder Arzneiproduktmittel zur Bildung eines Radiopharmakon oder Arzneimittels gebunden sein. Methoden zur Herstellung von Immunotoxinen und Radiopharmaka sind bekannt (siehe beispielsweise Cancer Treatment Reports 68:317 [1984]).

Es ist auch möglich, daß Heteroaggregate aus erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern und Human-T-Zellaktivatoren, wie monoklonale Antikörper gegen dos CD3-Antigen oder gegen den F_c-y-Rezeptor an T-Zellen, Human-T-Zellen oder F_c-yaufweisende Zellen (wie K-Zellen oder Neutrophile) in die Lage versetzen, HlV-infizierte Zellen über eine Antikörper abhängige, zeilvermittelte Cytolyse (ADCC) abzutöten. Derartige Heteroaggregate kann man beispielsweise bilden, indem man die Anti-HIV-Antikörper mit den Anti-CD3-Antikörpern unter Verwendung des heterobifunktjonellen Reagens N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithioDpropionat kovalent vernetzt, wie dies von Karpowsky et al., J. Exp. Med. 160:1686 (1984) beschrieben ist, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die erfindungsgemäßen Mittel auf Basis der Peptide alleine können au^'i therapeutische Anwendung finden, wobei die Verabreichung zu einer Reduktion oder zur Eliminierung von HIV bei eine .»infizierten Wirt führt. Diese Mittel, wie Peptid 29, die blockierenden Peptide und Peptid 126, welches in der USSN 930785 beschrieben ist, auf die hiermit Bezug genommen wird, kann man in geeigneten physiologischen Trägern intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal usw. verabreichen. Verschiedene Träger sind geeignet, dazu zählen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Kochsalzlösung, Wasser, Kaliumchlorid, Natriumlactat oder dergleichen. Die Peptidkoiizentration kann in einem weiten Bereioh in Abhängigkeit von der endgültigen Anwendung, Aktivität und Art der Verabreichung variieren. Vorzugsweise liegt bei den Peptiden eine Amidierung des COOH-Terrninus, eine Formylierung des NHrTerminus oder eine andere pharmazeutisch annehmbare Derivatisierung vor. Die Zugabe blockierender Peptide zu den Peptiden, die einen neutralisierenden HIV-Bereich nachahmen, und/oder die spezifisch reagierenden erfindungsgemäßen Antikörper führen zu einer signifikant erhöhten therapeutischen Wirksamkeit. Die Formulierungen können auch andere Anti-HIV-Mittel enthalten (die von den die Peptide bindenden monoklonalen Antikörper verschieden sind), wie beispielsweise 3'-Azido-3'-deoxythymidin, 2',3'-Dideoxycytidin, 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrocytidin usw.

Anwendung der monoklonalen Antikörper bei der Immunoafflnltätsreinigung

Die monoklonalen Antikörper, die spezifisch für Polypeptide sind, welche gp 110 oder andere Antigen-Determinanten enthalten, insbesondere diejenigen Antigen-Determinanten, die von biologisch exprimierten rekombinanten Fusionsproteinen oder Lysaten oder Extrakten von kultivierten HIV erhalten wurden, lassen sich besonders vorteilhaft bei Reinigungsverfahren anwenden. Im allgemeinen haben die Antikörper Affinitätskonstanten (affinity association constants) im Bereich von 10⁸ bis

10'²M. Derartige Antikörper kann man verwenden zur Reinigung von rekombinanten Fusionsproteinen von dem Kulturmedium des rekombinanten Exrepssionssystems, wenn das exprimierte Protein sekretiert wird, oder von den Komponenten des zerstörten, biologischen Expressionssystems, wenn das Protein nicht sekretiert wird. Die monoklonalen Antikörper, die in der Lage sind, mit gp 110 oder anderen Antlgen-Determinanten zu reagieren, werden im allgemeinen an ein Substrat oder einen Träger gebunden oc laran immobilisiert. Die Lösung, die die HIV-Antigendeterminanten enthält, wird dann mit dem immobilisierten Ant per unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die zur Bildung von Immunkomplexen zwischen dem Antikörper und den die gp 100-Antigen-Determinanten enthaltenden Polypeptiden geeignet sind. Ungebundenes Material wird von den gebundenen Immunkomplexen abgetrennt, diese Komplexe oder die gp 110-Antigenfragme;ite werden dann vom Träger abgetrennt.

Die monoklonalen Antikörper werden typischerweise bevor sie an den T'äger gebunden werden, von Ascitesflüssigkeh oder Zellkulturüberständen grob gereinigt. Derartige Deinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt, dazu zählt die Fraktionierung mit Neutralsalzen bei hoher Konzentration.

Weitere Methoden, wie DEAE-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, präparative Gelelektrophorese oder Protein-A-Aff initäts-Chromatographie, kann man ebenfalls verwenden, um die monoklonalen Antikörper zu reinigen bevor sie als Immunoadsorbens Anwendung finden

Der Träger, an dem die monoklonalen Antikörper immobilisiert werden, sollte die folgenden allgemeinen Eigenschaften besitzen:

(a) im allgemeinen schwache Wechselwirkungen mit Proteinen, um eine nicht-spezifische Bindungen zu minimieren,

(b) gute Fließeigenschaft6n, die einen Durchfluß von Materialien mit hohem Molekulargewicht erlauben,

(c) Vorhandensein chemischer Gruppen, die aktiviert oder modifiziert werden können, um eine chemische Bindung des monoklonalen Antikörpers zu b, möglichen,

(d) physikalische und chemische Stabilität unter den Bedingungen, die für die Bindung des monoklonalen Antikörpers Anwendung finden und

(e) Stabilität gegenüber den Bedingungen und Konstituenten der Puffer, die für die Absorption und Elution des Antigens erforderlich sind. Einige üblicherweise verwendete Träger sind Agarose, derivatisierte Polystyrole, Polysaccharide, Polyacrylamidperlen, aktivierte Cellulose, Glas und dergleichen. Es gibt verschiedene chemische Methoden, um die Antikörper an die Substratträger anzuknüpfen, siehe allgemein Cuatrecasas P., Advances in Enzymology 36:29 (1972). Die erfindungsgemäßen Antikörper kann man direkt oder in alternativer Weise über ein Bindeglied oder Zwischenstück (linker, spacer) an dem Träger anknüpfen.

Die für die Immobilisierung monoklonaler Antikörper an chromatographischen Trägern erforderlichen allgemeinen Bedingungen sind bekannt, siehe beispielsweise P.Tijissen, 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, worauf hiermit Bezug genommen wird. Das tatsächlich verwendete Koppelungsverfahren ist in geringem Maße abhängig von der Eigenschaft und der Art des anzukoppelnden Antikörpers. Monoklonal Antikörper besitzen Eigenschaften, die üblicherweise von Charge zu Charge konsistent sind, so daß die erwähnten Bedingungen optimiert werden können. Die Verknüpfung erfolgt typischerweise über kovalente Bindungen.

Zu der Separationsmatrix gibt man dann eine Suspension von Extrakten oder Lysaten von HIV-Viren, den Überstand von einem kultivierten biologischen Expressionssystem oder eine Suspension der zerstörten Zellen. Man inkubiert die Mischung unter Bedingungen und während einer Zoitdauer, die zur Bildung des Immunkomplexes ausreichend ist, üblicherweise wenigstens 30Min., zweckmäßiger 2 bis 24h. Die Immunkomplexe, die Polypeptide mit antigenen Teilen von gp110 enthalten, trennt man aus d(.f Reaktionsmischung ab. Man entfernt die Mischung beispielsweise durch Elution und wäscht die gebundenen ImmünKomplexe extensiv mit Adsorptionspuffer. Die Immunkomplexe kann man dann von der Separationsmatrix eluieren, wobei man ein Eluierungsmittel verwendet, das mit dem zur Anwendung kommenden Träger verträglich ist. Derartige Eluierungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Auch die Polypeptide, die gp 110 oder andere antigene Teile enthalten, kann man selektiv entfernen. Beispielsweise kann man Peptide, die ein Epitop enthalten, 'das durch die Antikörper erkannt wird, dazu verwenden, um mit den Antikörperbindungsstellen zu konkurrieren. Dies «uellt ein alternatives Elutionsverfahren dar, das unter milden Elutionsbedingungen durchgeführt werden kann. Das selektiv adsorbierte Polypeptid, das das gp 110-Antigen enthält, kann man von einem Antikörper-Affinitätsadsorbens eluieren, indem man den pH und/oder die lonenstärke des Puffers ändert. C'iaotrope Mittel finden ebenfalls Anwendung zur Entfernung des gebundenen Antigens. Die Wahl eines chaotropen Mittels, desstn Konzentration und der Eluierungsbedingungen hängen von den Charakteristika der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung ab, aber sobald sie festgelegt sind, sollten sie keinen Änderungen unterworfen werden, die üblicherweise bei polyklonalen Affinitäts-Separations-Systemen erforderlich sind.

Es kann erforderlich sein, den pH-Wert des eiuierten Materials an den physiologischen pH-Wert anzupassen, wenn ein hoher oder niedriger pH-Wert oder lonenstärkepuffer verwendet wurden, um die gebundenen gp 110-Antigene von der Separationsmatrix abzutrennen. Auch eine Dialyse oder eine Geifiltrations-Chromatographie kann zur Entfernung überschüssiger, im Eluierungsmittel verwendeter Salze erforderlich werden, um die Rekonstitution von gp 110 oder ν jn Polypeptiden, die Antigenfragmente von gp 110 enthalten, r.a nativen Konformationen zu ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben beispielsweise im wesentlichen reines gp 110 oder im wesentlichen reine Polypeptide, die Antigenfragmente davon enthalten, hergestellt entweder auf natürliche Weise durch infizierte Zellkulturen oder rekombinate Expressionssysteme von Bakterien, Hefen oder in Kultur gehaltenen Insekten oder Säugetierzellen, gp 110, die Fragmente davon oder andere gereinigte Proteine besitzen typischerweise eine Reinheit von mehr als 50%, üblicherweise von wenigstens 75% und häufig von mehr als 95 bis 99%. Diese Produkte finden vielfältige Anwendung.

Die HIV-gp 110-Proteine, die Polypeptide, die Antigenfragmente davon enthalten oder andere Proteine, die im wesentlichen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wurden, haben viele Anwendungsmöglichkeittn. Dazu zählen AIDS-Subunit-Vakzinformulierungen, bei denen das Immunogen eine wirksame Dosis an Antigen-Determinanten von beispielsweise gp 110 oder einem neutralisierenden Bereich davon umfaßt. Zu weiteren Komponenten der Formulierung können diejenic en antigenen Teile von HIV-Proteinen oder -Glykoproteinen zählen, die die Produktion von Antikörp-rn (vorzugsweise neutralisierenden Antikörpern) in einem immunisierten Wirt stimulieren, wobei diese Antikörper in der Lage sind, eine Schutzwirkung gegen eine nachfolgende HIV-Infektion ? szuüben.

-11- 283 936 Anwendung dar monoklonalen Antikörper in der Diagnose

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind auch für Diagnosezwecke brauchbar. Sie könr.jn hierfür mark'ert oder unmarkiert zur Anwendung kommen. Typischerweise umfaßt ein Diagnose-Assay den Nachweis einer Komplexbildung durch die Bindung eines monoklonalen Antikörpers an ein HIV-Antigen. Unmarkierte Antikörper finden haispNsweise in Agglutinations-Assays Anwendung. Darüber hinaus können unmarkierte Antikörper in Kombination η tit anderen markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern), die mit den monoklonalen Antikörpern reaktiv sind, wie beispielsweise Antikörper, die spezifisch für Immunoglobulin sind, eingesetzt werden. In alternativer Weise können die monoklonalen Antikörper direkt markiert werden.

Man kann eine Vielzahl von Markierungsmitteln einsatzen, beispielsweise Radionuklide, fluoreszierende Substanzen, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymkofaktoren, Enzyinhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) usw. Zahlreiche Arten von Immunoassays stehen zur Verfugung, dazu zählen beispielsweise diejenigen, die in den US-PSen 3817827,3850752,3901654, 3935074,3984533,3996345,403407A und 4098876 beschrieben sind, auf die hiermit Bezug genommen wird. Üblicherweise verwendet man die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptida in Enzym-Immunoassays, wobei beispielsweise die erfindungsgemäßen Antikörper ortar die zweiten Antikörper einer anderen Spezies an ein Enzym kunjugiert werden. Wenn man eine biologische Probe mit HIV-Antigenen, wie Humanblutserum, Speichel, Samen, Vaginalsekretionen oder eine Virus-infizierte Zellkultursuspension, mit den Antikörpern kombiniert, en'olgt eine Binc ung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen, die das gewünschte Epitop aufweisen. Man kann dann derartige Proteine oder Virusteilchen von den ungebundenen Reagentien abtrennen und einen zweiten Antikörper (mit einem Enzym markiert! zugeben. Anschließend wird die Anwesenheit des Antikörper-Enzykonjugats, das spezifisch an das Antigen gebunden ist, bt.Jtimmt. Man kann auch weitere herkömmliche, dem Fachmann bekannte Verfahren verwenden.

Zum Nachweis einer HIV-Infektion oder der Anwesenheit von HIV-Antigenen kann man auch Kits unter Anwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Verfügung stellen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperzusammensetzungen kann man, üblicherweir.e in lyophiüsierter Form entweder allein oder zusammen mit weiteren Antikörpern, die spezifisch für andere HIV-Epitopi sinn, zur Verfügung stellen. Die Antikörper, die an ein Markierungsmittel konjugic.t sein oder unkonjugiert vorliegen können, sind in den Kits zusammen mit Puffern, wie Tris-, Phosphat-, Carbonatpuffer usw.. Stabilisierungsmitteln, Bioziden, inerten Proteinen, wie Rinderserumalbumin oder dergleichen enthalten. Im allgemeinen liegen diese Materialien in einer Menge von weniger als etwa 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge an aktivem Antikörper und üblicherweise in einer Gesamtmenge von wenigstens etw.i 0,001 Gew.-%, bezogen auf die AntikörperkonzenUation, vor. Es ist häufig wünschenswert, einen inerten Extender oder Excipienten zur Verdünnung der aktiven Bestandteile zuzugeben, wobei der Excipient in einer Menge von etwa 1 bis 99Gew.-% der Gesamtzusammensetzung vorliegen kann. Wenn ein zur Bindung an die monoklonalen Antikörper fähige' zweiter Antikörper eingesetzt wird, liegt dieser üblicherweise in einem separaten Vial vor. Der zweite Antikörper ist typischerweise an ein Label konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert.

Der Nachweis von gp 110- oder p25-Antigenen oder des Ganzvirus in biologischen Proben findet bei der Diagnose einer HIV-Virusinfektion Anwendung. Zu biologischen Proben zählen, ohne darauf begrenzt zu sein, Blutserum, Speichel, Samen, Gewebebiopsieproben (Gehirn, Haut, Lymphknoten, Milz usw.), Zellkulturüberstände, zerstörte eukaryontische und bakterielle Expressionssysteme und dergleichen. Auf die Anwesenheit des Virus testet man, indem man die monoklonalen Antikörper mit der biologischen Probe unter Bedingungen inkubiert, die zu einer Immunkomplexbildung führen und man anschließend die Komplexbiidung nachweist. Gemäß einer Ausführungsform weist man die Komplexbildung durch die Anwendung eines zweiten Antikörpers >>ach, der in der Lage ist, an einen monoklonalen Antikörper zu binden, welcher typischerweise an ein Magerungsmittel konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert ist. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der monoklonal Antikörper an einen Festphasenträger gebunden, der dann mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Nach der Inkubierung wird der markierte monoklonal Antikörper zugegeben, um das gebundene Antigen nachzuweisen.

Herstellung und Anwendung synthetischer Peptide

Die Erfindung stellt auch neue Peptide zur Verfügung, die unter anderem immunologisch die Proteinepitope nachahmen, die durch das HIV-Ketrovirus kodiert sind, insbesondere die Epitope, die innerhalb der env- oder gag-Beieiche des Virusgenoms kodiert sind, welche für die gp 110 oder ρ 25 kodieren. Zur Anpassung an die unterschiedlichen Verhältnisse von Stamm zu Stamm bei den jeweiligen Isolaten kann man eine Anpassung bezüglich konservativer Substitutionen und eine Auswahl unter Alternativen mit nicht-konservativen Substitutionen vornehmen. Diese Peptide kann man, um die HIV-Antigenproduktion in vitro oder in vivo zu inhibieren oder eliminieren, als Immunogene für den Nachweis des Virus oder von Antikörpern gegen das Virus in einer physiologischen Probe einsetzen. In Abhängigkeit von der Art des Schemas kann man die Peptide an einen Träger oder an andere Verbindungen konjugieren, die markiert oder unmarkiert, an eine feste Oberfläche gebunden usw. vorliegen. Gemäß einer Ausführungsform stammen die erfindungsgemäßen Peptide von dem gp '· 10-Bereich dr,y Virus. Von besonderem Interesse ist der Bereich innerhalb des offenen env-Leserahmens, der sich etwa vom Basenpaar (bpj6688 bis etwa bp6750 und etwa vom bp7246 bis etwa 7317 erstreckt. Die hier interessierenden Peptide, einschließlich blockie>ender Peptide, umfassen wenigstens 5, manchmal 6, manchmal 8, manchmal 12, manchmal 21, häufig weniger als etwa 50, insbesondere weniger als etwa 35 und vorzugsweise weniger als etwa 25 Aminosäuren in einer Sequenz, die durch ein HIV-Retrovirus kodiert ist. Wünschenswerterweise sind die Peptide so klei.i wie möglich, enthalten aber dennoch im wesentlichen die gesamte Immunoreaktivität oder antivirale Aktivität eines größeren Peptids. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehrere nicht-überlappende Oligopeptide zu verbinden, um eine einzige Peptidstruktur zu bi'den, oder sie als einzelne Peptide gleichzeitig zu verwenden, woLei diese Peptide separat oder zusammen eine äquivalente Sensibilität des Ausgangsmaterials besitzen.

Die Peptide kann man durch Einführen konservativer oder nicht-konservativer Substitutionen modifizieren, wobei im allgemeiner· wenigei ..Is 2Ü-%-Punkte, insbesondere weniger als 10-%-Punkte der Aminosäuren ausgetauscht werden. Wenn polymorphe Bereiche vorliegen, kann ee wünschenswert sein, eine oder mehrere bestimmte Aminosäuren zu ändern, um die unterschiedlichen Epitope der verschiedene Retrovirusstämme wirksamer nachahmen zu können. Häufig wird man Methionin durch Norleucin (Nor) ersetzen, um eine chemische Stabilität zu erzielen.

Es ist darauf hinzuweisen, daß das erfindungsgemäß zur Anwendung kommende Peptid nicht mit einer bestimmten HIV-Polypeptidsequenz identisch sein muß, solange die in Rede stehende Verbindung in der Lage ist, eine immunologische Kompetition mit den Proteinen von wenigstens einem Stamm des HIV-Retrovirus herbeizuführen. Die in Rede stehenden Peptide können deshalb auf vielfältige Weise geändert werden, beispielsweise durch Insertionen, Deletionen und Substitutionen in konservativer oder nicht-konservativer Weise, wenn derartige Änderungen Anwendungsvorteile nach sich ziehen. Mit einer konservativen Substitution sind Substitutionen gemeint, innerhalb der Gruppen, wie gly, ala; val, ile leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; und nor, met.

Üblicherweise unterscheidet sich die Sequenz um nicht mehr als 20% von der Sequenz wenigstens eines Stammes eines HIV-Retrovirus, außer wenn weitere Aminosäuren an den bei.ien Termini hinzugefügt werden können, um einen „Arm" :.ur Verfügung zu stellen, mit Hilfe dessen das erfin^ungsgemäße Peptid in einfacher Weise' ^mobilisiert werden kann. Die Arrre sind üblicherweise wenigstens eine Aminosäur ~< lang und können 50 oder mehr Amino, ,uren, häufiger 1 bis 10 Aminosäuren, lang sein.

Das Peptid, dessen Aminosäuresequenz durch Substitution, Addition oder Deletion von Aminosäureresten modifiziert ist, sollte im wesentlichen die gesamte Immunoreaktivität oder antivirale Aktivität der unmodifizierten Peptide beibehalten. Dies kann auf einfache Weise anhand verschiedener, hier beschriebener Assays bestimmt werden. Gewünschtenfalls kann man das d-lsomer eineroder mehrerer Aminosäuren verwenden, um die biologischen Eigenschaften, wie die Aktivität, Abbaurate und dergleichen, zu modifzieren.

Darüber hinaus kann man eine, zwei oder mehrere Aminosäuren zur leichteren Verbindung der Peptide aneinander an die Termini eines Oligopeptids oder Peptids anfügen und zwar zur Kopplung an einen Träger oder ein größeres Peptid, aus den nachfolgend erläuterten Gründen, zur Modifizierung der physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids oder dergleichen.

Aminosäuren, wie Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder dergleichen, kann man an C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligopeptids einführen, um eine geeignete Funktionalität zur Verknüpfung zu schaffen.

Cystein ist besonders bevorzugt zur Erleichterung einer kovak.,iten Bindung an andere Peptide.oder zur Bildung von Polymeren durch Oxidation.

Darüber hinaus können sich die Peptid- oder Oligopeptidsequenzen von der natürlichen Sequenz durch eine Sequenz unterscheiden, die durch terminale NH₂-Acylierung, beispielsweise Acetylierung oder Amidierung mit Thioglykolsäure, terminale Carboxyamidierung, beispielsweise mit Ammoniak oder Methylamin, modifiziert sind, um eine bessere Stabilität, erhöhte Hydrophobizität für eine Verbindung mit oder Bindung an einem Träger oder ein anderes Molekül oder für eine Polymerisation zu erzielen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der oben beschriebenen Peptide I bis VIII und IX bis XV, wenn Y oder Y' vorhanden sind, liegt beispielsweise dann vor, wenn Y oder Y' einen oder mehrere Cysteinreste oder eine Kombination von einem oder mehreren Cysteinresten mit Spacer-Aminosäuren umfassen. Glycin ist ein besonders bevorzugter Spacer. Bevorzugte Peptide zur Anwendung bei der oxidativen Polymerisation sind diejenigen, bei denen Y oder Y' wenigstens zwei Cysteinreste bedeuten.

Wenn rwei Cysteinrest9 am gleichen Ende des Peptids vorhanden sind, liegt eine bevorzugte Ausführungsform dann vor, wenn die Cysteinreste durch 1 bis 3 Spacer-Aminosäurereste, vorzugsweise Glycin, getrennt sind. Die Anwesenheit von Cysteinresten kann die Bildung von Peptiddimeren ermöglichen und/oder die Hydrophobizität des erhaltenen Peptids erhöhen, was die Immobilisierung des Peptids an Festphasen- oder immobilisieiten Ass iysystemen erleichtert.

Von besonderem Interesse ist der Gebrauch der Mercaptangruppen der zur Acylierung der terminalen Aminogruppen verwendeten Cysteine oder Thioglykolsäuren oder dergleichen zur Verknüpfung von zwei Peptiden oder Oligopeptiden oder Kombinate .en davon über eine Disulfidbrücke oder eine längere Brücke, um Polymere zu bilden, die eine Reihe von Epitopen enthalten. Derartige Polymere besitzen den Vorteil einer verstärkten immunologischen Reaktion. Wenn unterschiedliche Peptide zur Herstellung des Polymers verwendet werden, besitzen sie zusätzlich die Fähigkeit, Antikörper zu induzieren, die mit einigen Antigen-Determinanten verschiedener HlV-lsolate immuno-reagieren.

Für die Bildung antigener Polymere (synthetische Multimere) kann man Verbindungen mit bis-Haloacetylgruppen, Nitroarylhaloganide oder dergleichen einsetzen, wobei die Reagentien spezifisch für Thiogruppen sind. Die Verknüpfung zwischen zwei Mercaptogruppen von verschiedenen Peptiden oder Oligopeptiden kann somit eine Einfachbindung oder ein Bindeglied von wenigstens 2, üblicherweise wenigstens 4 und nicht mehr als etwa 16, üblicherweise nicht mehr als etwa 14 Kohlenstoffatome sein.

Die hier i ι Rede stehenden Peptide kann mar. gebunden an einen löslichen makromolekularen Träger (beispielsweise nicht weniger als 5kDal) einsetzen. Zweckmäßigerweise ist der Träger eine natürlich vorkommende oder synthetische Poly(aminosäure) gegen die Antikörper im Humanserum unwahrscheinlich sind. Beispiele derartiger Träger sind Poly-L-Lysin, Keyhole-Limpet-Hemocyanin, Thyroglobulin, Albumine, wie Rindersorumalbumin, Tetanustoxoid usw. Die Wahl des Trägers ist zur Hauptsache abhängig vom beabsichtigten Anwendungszweckfür das Antigen und richtet sich nach der Zweckmäßigkeit und Verfügbarkeit ces Trägers. Bei derartigen Konjugaten liegt v/enigstens 1 Molekül wenigstens eines Peptids pro Makromolekül und nicht mehr als 1 proO,5kDal, üblicherweise nicht mehr als etwa 1 pro2kDal des Makromoleküls, vor. Man kann 1 oder mehrere unterschiedliche Peptide an das gleiche Makromolekül binden.

Die Verbindung erfolgt in Üblicher Weise unter Verwendung von Reagentien, wie p-Maleimidobenzoesäure, p-Methyldithiobenzoesäure, Maleinsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Glutaraldehyd usw. Die Bindung kann am N-Terminus, C-Terminus oder zwischen den Enden des Moleküls erfolgen.

Das Peptid kann man durch Verknüpfung oerivatisieren, kann während es an einem Träger gebunden ist, verknüpft werden oder dergleichen.

Um die Anwesenheit von Antikörpern gegen retrovirale Proteine oder von retroviralen Proteinen selbst nachzuweisen, kann man nach verschiedenen, dem Fachmann geläufigen Assay-Verfahren vorgehen. Von besonderem Interesse ist es, das Peptid als markiertes Reagens zu verwenden, wobei das Markierungsmittel ein nachweisbares Signal liefert, oder das Peptid direkt oder indirekt an eine Oberfläche zu binden, wobei der Antikörper gegen das Peptid in der Probe an das Peptid an der Oberfläche gebunden wird. Die Anwesenheit eines Human-Antikörpers, der an das Peptid gebunden ist, kann dann unter Verwendung eines xenogenen Antikörpers, der spezifisch für Humanimmunoglobulin, normalerweise sowohl Human-lgM als auch IgG, ist oder eines markierten Proteins erfolgen, das spezifisch für Immunkomplexe ist, beispielsweise der Rf-Faktor von S. aureus-Protein-A.

Ein Beispiel für ein Assay-Verfahren ist die Verwendung eines Probonbehälters, beispielsweise did Vertiefungen von Mikrowellplatten, wobei das Polypeptid oder die Konjugate davon am Boden und/oder an den Wänden des Behälters kovalent oder nicht-kovalent adsorbiert sind. Die Probe, normalerweise Humanblut oder -serum, verdünnt mit einem geeigneten Puffermedium, gibt man in den Behälter und läßt ausreichend Zeit vergehen bis die Komplexbildung zwischen dem (den) Polypep'.id(en) und einem entsprecherden Antikörper in der Probe erfolgt ist. Man entfernt den Überstand und wäscht den Behälter zur Entfernung von nicht-spezifisch gebundenen Proteinen. Zum Nachweis verwendet man ein markiertes spezifisch bindendes Protein, das spezifisch an den Komplex bindet, wie beispielsweise xenogenes Antiserum gegen Humanimmunoglobulin.

Das Peptid kann auf vielfältige Weise hergestellt werden. Das Peptid kann aufgrund seiner relativ geringen Länge in Lösung oder an einem festen Träger gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisiergeräte sind im Handel erhältlich und können in bekannter Weise angewendet werden, siehe beispielsweise Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2.Aufl., Pierce Chemical Co., 1984; und Tarn et al., J.Am.Chem.Soc. (1983) 10ί·6442. In alternativer Weise kann man von der Hybrid-DNA-Technologie Gebrauch machen, bei der man ein synthetisches Gen unter Anwendung von Einzelsträngen, welche für das Polypeptid kodieren, oder von im wesentlichen Komplementärsträngen davon herstellt, wobei die Einzelstränge überlappen und in einem annealing-Medium zusammengebracht werden können, um zu hybridiseren. Die hybridisierten Stränge kann man dann zu einem vollständigen Gen ligieren und das Gen durch Wahl geeigneter Termini in heut.» leicht erhältlichen Expressionsvektoren insertieren, siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Oder man kann den Bereich des viralen Genoms, der für das Peptid kodiert durch herkömmliche rekombinante DNA-Techniken klonieren und expKmieren (siehe oben Maniatis et al.). DNA-Codesequenzen von' AV_Bnu und ARV 2-lsolaten von HIV, die zur Expression der Peptide verwendet werden können, umfassen die folgenden:

LAV_BRU TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGT

ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ATA AGA AAA GCA CAT TGT

Zur Expression von Peptidfragmenten kann man Fragmente einer Sequenz verwenden. Man kann konservative Basenänderungen, wobei der (die) modifizierte Kodon(s) für die gleiche Aminosäure(n) kodiert (kodieren), oder nicht konservative Basenänderungen in der Kodierungssequenz durchführen, wobei die erhaltene Aminosäure eine konservative oder nicht-konservative Änderung in der Aminosäuresequenz sein kann, was oben beschrieben wurde. Die Codesequenz kann am 5'- oder 3'-Terminus oder an beiden verlängert werden, um das Peptid zu verlängern, jedoch unter Beibehaltung der epitopen Stelle(n). Die Verlängerung kann dazu dienen, einen Arm zur Anknüpfung beispielsweise an ein Markierungsprodukt, wie ein Enzym, zu schaffen, zwei oder alle Peptide zusammen in der gleichen Kette zu verbinden, Antigen-Aktivität und geeignete Restriktionsstellen zum Klonen zur Verfügung zu stellen oder dergleichen.

Die DNA-Sequenz selbst, die Fragmente davon oder größeie Sequenzen, üblicherweise wenigstens 15 Basen, vorzugsweise weniustens 18 Basen, kann man als Nukleotidsondenzum Nachweis von rotroviraler RNA oder proviraler DNA oder zur Identifizierung homologer Regionen für das Klonieren oder Sequenzieren verwenden. Es sind zahlreiche Methoden beschrieben, wie die Grundstein-Hogness-Methode, Southern-Methode, Northem-Methode, Dot-blot, Verbesserungen davon sowie andere Methoden, wie diejenigen, die in der US-PS 4358535, worauf hiermit Bezug genommen wird, beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen Peptide, einschließlich der blockierenden Peptide und ihre Analoga finden allein oder in Kombination in Vakzinen Anwendung. In ähnlicher Weise kann man in Vakzinen auch anti-idiotype Antikörper verwenden, d. h. Antikörper, die mit dem Idiotypen der erfindungsgemäßen Antikörper reagieren und dabei Epitope enthalten, die die neutralisierenden HIV-Bereiche nachahmen. Die Peptide oder anti-idiotypen Antikörper kann man in herkömmlicher Weise formuÜDren, im allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von 1 pg bis 20 mg/kg des Wirts.

Physiologisch annehmbare Medien kann man als Träger verwenden, beispielsweise steriles Wasser, Kochsalzlösung, Phosphatgepufferte Kochsalzlösung und dergleichen. Man kann Adjuvantien einsetzen, wie Aluminiumhydroxidgel, grenzflächennktive Substanzen, wie Lysolecilhin, Pluroicpolyole, Polyanionen, Peptide, Proteine (z. B. Diphtherie und Choleratoxin) und Ölemulsionen. Die Peptide kann man zur Anwendung in Vakzinformulierungen auch Liposomen einverleiben oder an Polysaccharide, Polypeptide oder Polymere konjugieren. Die Verabreichung kann durch Injektion erfolgen, beispielsweise

intramuskulär, peritoneal, subkutan, intravenös usw. Die Verabreichung einer immunogen wirksamen Dosis kann einmal oder mehrfach erfolgen, üblicherweise in Zeitabständen von 1 bis 4 Wochen. Eine „immunogen wirksame Dosis" ist diejenige Menge eines Vakzins, die geeignet ist, eine Immunantwort in einem Wirt auszulösen, wobei der Wirt eine gesoigerte Infektion zeigt. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen.

Beispiel I Erzeugung und Charakterisierung der monoklonalen Antikörper

Beispiel I beschreibt die Erzeugung von Hybridzellinien, die monoklonal Antikörper produzieren, welche spezifisch für HIV-Hüllglykoproteine sind. Dieses Verfahren umfaßt die Anwendung von Lektin-gereinigten Extrakten von LAV_Bru, das an lentile Lektinagarose als Immunogen gebunden ist. Die anschließend durch die Hybridzellinien erzeugten monoklonalen Antikörper sind charakterisiert durch ihre Fähigkeit gp 110 aus gereinigtem LAV zu immunoblotten und in einem Radioimmun-Assay zu präzipitieren sowie als biologisch exprimiertes rekombinantes Fusionsprotein. Dio monoklonalen Antikörper, die an die Epitope an gp 110 binden, reagieren auch in ELISAs mit zerstörten ganzen Viren, Fusionsproteinen und synthetischen Peptiden und reagieren mit'ganzen Viren in indirekten Fluoreszenz-Assays.

Die Erzeugung der monoklonale Antikörper produzierenden Hybridzellinien und die Charakterisierung der Antikörper erfolgen folgendermaßen:

LAV-Viren, die von infizierten CEM-Zellen (ATCC Nr.CRL8904) gereingt waren, wurden in 5OmM Tris, pH 7,4,0,15 M NaCI, 1,0% Aprotinin, 2,0% Nonidet P-40® (NP-40) (Octylphenoxypolyethoxyethanol) zerstört. Der Extrakt wurde 2x durch Zentrifugieren geklärt und auf 0,5% NP-40 durch Zugabe von 3 Volumina Disruptionspuffer ohne NP-40 eingestellt. Lentile Lektinsepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) wurde in Disruptionspuffer ohne NP-40 vorgewasch« η und anschließend in Adsorptionspuffer (5OmM Tris, pH7,4,0,15M NaCI, 1,0% Aprotinin, 0,5% NP-40) äquilibriert. Der geklärt Virusextrakt wurde mit lentiler Lektinsepharose 42 h bei 4°C adsorbiert. Unadsorbiertes Material wurde durch Was ~!ien mit überschüssigem Adsorptionspuffer entfernt. Die Eluierung des adsorbierten Materials erfolgte mit 0,2 M a-Methylmannosid in Adsorptionspuffer. Das Eluat wurde gegen PBS zur Entfernung des Zuckers dialysiert und das Material wurde erneut an lentiler Lektinsepharose adsorbiert. Dei Glykoprotein-Ientile Lektinsepharose-Komplex wurde dazu verwendet, BALB/c-Mäuse mittels drei intraperitonealen Injektionen ohne Adjuvans, die >' ί Abständen von 2 bis 3 Wochen gegeben wurden, zu immunisieren. Die Milz der immunisierten Mäuse wurde entfernt. Es zeigen sich mittels Immunoblot-RIP und/oder ELISA zirkulierende Antikörper gegen Glykoproteine. Zur Erzeugung von Zellinien arbeitete man im allgemeinen nach den Vorschriften von Köhler und Milstein (Nature 256:495 [1985]) mit den Modifizierungen von L.C.Goldstein et al., (Infect.Immun.38:273 [1982]). Die B-Lymphocyten der Milz aus den immunisierten Mäusen wurden mit NS-l-Myelomzollen un'er Verwendung von 40% (W/V) Polyethylenglykol fusioniert. Im Anschluß an die Fusionierung wurde die Zellmischung erneut in HAT-Medium (RPMI-1640 ergänzt mit 15% fötalem Kälberserum, 1 x 10"⁴M Hypoxanthin, 4 x 10~⁷MAminopterinund 1,6 x 10"⁵M Thymidin) suspendiert, um für das Wachstum der Hybridzellen zu selektieren und anschließend auf 96-Well-Mikrokulturplatten bei einer Konzentration von 1 bis 3 χ 10~⁶ Zellen/ml gegebon und bei 37⁰C in einer feuchten Atmosphäre, die 6% CO₂ enthält, inkubiert. Die Kulturen wurden ernährt, indem die Hälfte des Überstandes durch frisches HAT-Medium ersetzt wurde. Die Vertiefungen (wells) wurden unter Verwendung eines Planktonmikroskops auf Anzeichen von Zeilproliferation beobachtet und sobald die Zellen eine ausreichende Dichte besaßen, wurden die Überstände auf Anti-LAV-Antikörper getestet.

Diejenigen Wells, die Antikörper gegen LAV produzierende Hybridzellen enthalten, wurden durch ELISAs identifiziert, wobei die Bindung an gereinigte, zerstörte Ganzviren, oder biologisch exprimierte Fusionsproteine bestimmt wurde. Die ELISA-Assays unter Anwendung zerstörter Viren wurden an LAV EIA-Platten (Genetic Systems, Seattle, Washington) durchgeführt. Die Platten wurden mit Zellkulturflüssigkeit bei 37⁰C 45 Min. inkubiert und anschließtnd 3x mit 0,05% Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS-Tween) gewaschen.

Peroxidase-Zie'je-Anti-Maus-lgG (1:2000 Verdünnung in PBS-Tween; Zymetf l oboratories, Inc., South San Francisco, California) wurde zugegeben (100μ1 pro Well) und die Platten wurden 45 Min. bei 37⁰C inkubiert und wie oben gewaschen. Es wurde Substrat zugegeben (0,025M Zitronensäure, 0,05 M dibasisches Natriumphosphat, pH 5, enthaltend 14mg o-Phenylendiamin und 10μΙ 30%iges Wasserstoffperoxid pro 50ml) und die Matten wurden 30Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 3N Schwefelsäure gestoppt und die kolorimetrischen Reaktionen wurden mit einem automatischen Mikroplattenlesegerät quantitativ bestimmt. Diejenigen Vertiefungen, die positive Ergebnisse erbrachten, wurden durch Grenzverdünnung subkloniert, erneut auf Spezifität getestet und anschließend expandiert.

Die von den daraus resultierenden Hybridzellinien sekretierten monoklonalen Antikörper wurden weiterhin hinsichtlich Spezifität und Reaktivität mittels Immunoblotting, Immunopräzipitation und ELISA unter Anwendung zerstörter LAV-Viren, rekombinanter LAV-Fusionsproteine und synthetischer LAV-Peptide charakterisiert. Es zeigte sich, daß andere Antikörper vom IgGi-lsotyp waren. Die Zellinien HIV-gp110-1,HIV-gp 110-2 und HIV-gp 110-3 wurden bei der Amercian Type Culture Collection zur Einreichen dieser Anmeldung hinterlegt und haben die Hinterlegungs-Nrn. ATCC HB9175, HB9176 und HB9177 erhalten. Die auf ihre Reaktivität getesteten rekombinanten Fusionsproteine wurden als ENV 2, ENV3, ENV4 und ENV5 bezeichnet. Das Protein ENV2 wird aus pENV2 (ATCC Nr.53071) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich vom Basenpaar (bp) 6598 bis bp 7178 (Numerierung gemäß Wain-Hobson et al., Cell 44:9 [1985]. ENV3 wird aus pENV3 (ATCC Nr. 53072) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich von bp7178 bis bp7698. ENV4 wird aus pENV4 (ATCC Nr.53073) exprimiert und umfaßt bp7698 bis bp8572. ENV5 wird aus pENV5 (ATCC Nr. 53074) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich von bp5889 bis bp7698. Die Produktion der rekombinanten Fusionsproteine ist detailliert in der USSN721237 beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Assembly synthetischer Peptide

Die Peptide I (29) und VIII (110-2-2) wurden an einem Benzhydrylaminharz (Polystyrol/Divinylbenzol (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) zusammengebaut. Peptid V (177) wurde an einem t-ButyloxycarbonyKBocJ-ethylbenzylcysteinphenylacetamidomethyl-(PAM)-polystyrol/divinylbenzolharz zusammengebaut. Kopplungen mit symmetrischem Anhydrid wurden in einem Applied Biosystems 430A-Synethisiergerät durchgeführt. Cystein wurde als erster Rest den beiden Peptiden zugegeben.

Kopplungen mit Dicyclohaxylcarbodiimid in Anwesenheit von Hydroxylbenzotriazol wurden für Asparagin und Glutamin verwendet. Als Schutzgruppen kamen Seitenketten auf Benzylgruppenbasis und Boc-a-Amingrupper. :ur Anwendung. Weitere routinemäßig eingesetzte Seitenkettenschutzgruppen waren Boc(Formyl)-tryptophan, Boc-Methionins jlfoxid, Boc(tosyl)· arginin, Boc(methylbenzyl)cystein, Boc(tosyl)-histidin, BodchlorbenzyloxycarbonyOlysin und BocfbrombenzyloxycarbonyOtyrosin.

Die Radiomarkierung der Peptide erfolgte durch Acetylierung des Aminoterminus mit ³H-Essigsäure und einom Überschuß an Dicyclohexylcarbodiimid.

Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte gemäß dem Tarn „low-high" HF-Verfahren (Tarn et al., siehe obnn). Die Extraktion vom Harz wurde mit 5%iger Essigsäure durchgeführt und der Extrakt wurde einer Gelfiltrations-Chromatographie in 5%iger Essigsäure unterzogen.

Zu den synthetischen HlV-Peptiden, die auf Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern getestet wurden, zählten die Peptide 29,36 und 39. Das Peptid 29 ist durch den LAVenu-Genombereich von etwa bp6688 bis bp 6750 kodiert; das Peptid 36 ist durch den Bereich von etwa bp7246 bis bp7317 kodiert; und das Peptid 39 ist durch den Bereich von etwa bp7516 bis bp7593 kodiert. Die Peptide 36 und 39 sind detailliert in der US-PS4629783 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Die blockierenden Peptide IX-XV wurden im wesentlichen wie oben beschrieben an einem Methyl-benzhydrylaminharz (Polystyrol/Divinylbenzol) (Applied Biosystems, Inc. Foster City, California) zusammengebaut. Kopplungen mit symmetrischem Anhydrid wurden an einem Applied Biosystems 430A-Synthetisiergerät durchgeführt. Für Asparagin wurden Kopplungen mit Dicylcohexylcarbodiimid in Anwesenheit von Hydroxybenzotriazol verwendet. Als Schutzgruppen wurden Seitenketten auf Benzylgruppenbasis und boc-a-Amin-Schutzgruppen verwendet, wohingegen Boc(brombenzyloxycaibonyl) spezifisch für Tyrosin-Seitenketten verwendet wurde. Eine Acetylierung erfolgte, soweit vorhanden, unter Anwendung von Acetanhydrid oder Eisessig und Dicyclohexylcarbodiimid. Die Entfernung der Schutzgruppen und die Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte gemäß dem „high" HF-Standardverfahren (Stewart et al., siehe oben). Die Extraktion vom Harz erfolgte mit 50%iger Essigsäure und der Extrakt wurde anschließend einer Gelfiltrations-Chromatographie in 20%iger Essigsäure unterzogen. Gewünschtenfalls wurde eine Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie an einer Vydac-C18-Säule (Rainin Instrument Co., Emeryville, CA) unter Anwendung eines 0,1 %Trifluoressigsäure-Acetonitril-Gradienten durchgeführt.

Immunoblottind

Die Charakterisierung mittels Immunoblotting erfolgte an Clonüberständen oder Ascitesflüssigkeit unter Anwendung gereinigter LAV-Viren und rekombinanter Fusionsproteine als Antigene. Die Antigene wurden zunächsdt mittels Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese (7,0-15,0%) getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (NCM) mittels 4stündiger Elektrophorese bei 25 V in 25 mM Natriumphosphat (pH 7,0) transferiert. Nach der Übertragung wurde die NCM durch 1 stündige Inkubation bei Raumtemperatur in PBS-Tween oder Blotto (5% fettarme Trockenmilch in PBS) blockiert, um nicht-spezifische Interaktionen zu verhindern. Die NCM wurde mit Zellkulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit, verdünnt in PBS-Tween, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und 3x mit PBS-Tween gespült. In der zweiten Stufe wurde die NCM mit Ziege-anti-Maus-lgG-Meerrettichperoxidase, verdünnt in PBS-Tween, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde mit' PBS-Tween gewaschen, gefolgt von 20minütigem Eintauchen in Meerrettichperoxidase-Farbentwicklungslösung (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California). Die Reaktion wurde durch Eintauchen in entsalztes Wasser gestoppt. Die monoklonal Antikörper-Aktivität v/urde mit einem positiven Kontrollserum, das mit gereinigten zerstörten Viren oder exprimierten Fusionsproteinen reagiert, verglichen. Es zeigte sich, daß unter Anwendung zerstörter Viruspräparate alle Antikörper an gp 110 oder dessen Prekursormolekül gp 150 banden. Die Antikörper 110-1 und 110-2 erkannten auch das Fusionsprotein ENV3, wohingegen die Antikörper 110-3,110-4,110-5 und 110-6ENV2 in einen Immunokomplex überführen.

Immunpräzipltatlon

Virusextrakte für die Radioimmun-Präzipitation wurden aus CEM-Zeilen hergestellt, die mit LdAVeRu-HIV-lsolat infiziert waren, das durch kontinuierliche Passage dem lytischen Wachstum angepaßt wurde. Sobald sich frühe cytopathische Effekte zeigten, wurden die Zellen auf markierende Medien übertragen, die ³⁵S-Methionin (0,05mCi/ml) oder ³[H]-Glucosamin (0,025 mCi/ml) enthielten, anschließend 24h inkubiert, bis die meisten Zellen lysiert hatten und das Virus in den Kulturüberstand freisetzen. Die Viren wurden aus dem zellfreien Überstand pelletiert (1 h bei lOOOOOxg) und Detergenzextrakte wurden in P-RIPA-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 1,0% Triton X-100,1,0% Deoxycholat, 0,1 % SDS und 1 % Aprotinin enthält) hergestellt. Ähnliche Extrakte wurden von den Überständen von uninfizierten CEM-Zellen hergestellt.

Immunopräzipitations-Assays wurden mit 100μΙ Virusextrakt durchgeführt, der 1 h auf Eis mit 100μΙ Kulturüberstand von den Hybridzellinien inkubiert wurde. 4μΙ Kaninchen-Anti-Maus-Ig (Zymed Laboratories, So. San Fransisco, California) wurden zu jeder Probe gegeben und 30 Min. inkubiert. Zu jeder Probe wurde Immuno-Präzipitin (100 μΙ; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, Maryland), das in P-RIPA-Puffer resuspendiert wurde, welcher 1 % Ovalbumin enthält, gegeben und weitere 30 Min. inkubiert. Die gebundenen Komplexe wurden gewaschen und mittels SDS-Polyacrylamid-Geleleklrophorese (15,0% Acrylamid: DATD-GeI) aufgetrennt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele fixiert, in Enhance (New England Nuclear; Boston, MA) eingeweicht, getrocknet und mit einem Kodak XR-5-Film in Kontakt gebrecht. Ein positives Referenzserum, das mit allen HlV-Virusproteinen ein Immunopräzipitat ergibt, wurde als positive und negative Kontrolle mit Virus-infizierten und scheininfizierten CEM-Zellüberständen zur Reaktion gebracht

Die Ergebnisse zeigen, daß alle sechs monoklonalen Antikörper spezifisch gp 110 und gp 150 immunopräzipitierten.

Enyzm-Llnked-Immunoadäorbant-Assay

Um die von den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern erkannten gp110-Epitope zu kartieren, wurden die Kulturüberstände aus Hybridzellinien oder Ascitesflüssigkeit weiter durch die Reaktivität in ELISA-Assays mit biologisch exprimierten Fusionsproteinen und synthetischen Peptiden charakterisiert. Die Verfahren waren diegleichen wie die oben beschriebenen, mit der Ausnahme, daß die Fusionsproteine oder synthetischen Peptide die gereinigten Viren 3ls Antigene ersetzten, welche an die Oberfläche der Mikrotiterwells adsorbiert sind.

Bei der Verwendung von Peptiden als Antigen arbeitete man nach folgendem Verfahren. Die lyophilisierten Peptide wurden in

6M Guanidin-HCI gelöst. Unmittelbar vor Plattieren in die 96-Well-Platten wurde die Guanidinlösung in 0,05 M Carbonat/ Gicarbonat-Puffer (pH 9,6) auf eine Peptidendkonzentration von bis zu 100 Mg/ml verdünnt. 50 μΙ des verdünnten Peptids wurden in jede Mikrotiter-Vertiefung gegeben. Die Platten wurden anschließend über Nficht bei 4°C inkubiert. Überschüssige Peptidlösung wurde „ausgeschüttelt", die Platten wurden mit Blotto blockiert und der weitere ELISA-Assay erfolgte gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. In ähnlicher Weise wurde rekombinantes Protein auf eine Endkonzentration von etwa 2 Mg/ml in 0,05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) verdünnt und das gleiche Verfahren wiederholt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle Il gezeigt. Die von den Zellinien HIV-gp 110-1 und HIV-gp 110-2 produzierten monoklonalen Antikörper reagierten mit ENV3, ENV5, Peptid 36 und zerstörten Viren. Die Antikörper von den Zellinien HIV-gp 110-3, HIV-gp 110-4, HIV-gp 110-5 und HIV-gp 110-6 reagierten mit ENV2 und Peptid 29 sowie mit zerstörten Viren.

TABELLE Il

ELISA-Assays, die die Reaktivität der monoklonalen Antikörper mit rekombinanten Proteinen und synthetischen Peptiden zeigen

Rekombinantes Fusionsprotein	ENV2	ENV3	ENV4	ENV5	Synthetische Peptide	36	39	LAV	CEM
	0.077"	3.000	0.113	3.000	29	2.421	0.054	Kontrolle	Kontrolle
110-1	-0.003	3.000	0.000	3.000	ND	2.305	-0.005	0.908	0.125
110-2	3.000	0.011	ND	ND	ND	ND	0.017	1.214	0.009
110-3	3.000	0.020	ND	ND	3.000	ND	0.016	0.363	0.046
110-4	3.000	0.014	ND	ND	3.000	ND	0.016	0.383	0.067
110-5	3.000	0.033	ND	ND	3.000	ND	0.017	0.368	0.025
110-6			1.937		0.486	0.032

Die in Tabelle Il zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß die monokonalen Antikörper 110-1 und 110-2 eine Antigen-Determinante erkennen, die durch die DNA-Sequem im pENV3-Bereich kodiert ist, insbesondere durch den Bereich des HIV-Genoms, der durch eine Sequenz von Aminosäuren im Peptid 36 definiert ist. Das heißt, daß die monoklonalen Antikörper gp110-1 und 110-2 an einen Peptidbereich von gp 110 binden, der in bp7246 bis 7317 kodiert ist, wie durch die Bildung von Immunkomplexen mit Peptid 36 und ENV3 gezeigt wird. Dieser Bereich des HIV-Genoms wurde als konserviert identifiziert, d. h. mit nur geringen Veränderungen in der DNA-Sequenz in dem Bereich, der durch Peptid 36 bei verschiedenen Virusisolaten unterschiedlicher geographischer Herkunft kodiert ist, siehe Starcich et al., Cell 46:637 (1986). Im Gegensatz dazu binden die monoklonalen Antikörper gp 110-3, -4, -5 und -6 an HlV-Peptide, die durch den Bereich definiert "sind, der durch Peptid 29 von bp6688 bis etwa bp6750 kodiert ist. Der Bereich in gp110, der durch Peptid 29 definiert ist, wurde als Bereich identifiziert, der mehrere Nukleotidsubstitutionen bei verschiedenen Virusisolaten enthält. Die monoklonalen Antikörper, die selektiv gp 110-Polypeptide binden, welche konservierte Epitope enthalten, wie die Antikörper 110-1 und 110-2, können häufig besonders brauchbar sein, beispielsweise bei der Affinitäts-Chromatographie usw. Auch bei einem ELISA-Assay reagiert das Peptid 110-2-2 mit Sera von der Person, von der LAV-2 isoliert wurde.

Indirekter Immunofluoreszenz-Assay

Indirekte Immunofluoreszenz-Assays unter Anwendung monoklonaler Antikörper gegen das gp 110-Antigen von HIV wurden an Aceton-fixierten und lebenden Zellen durchgeführt. Aceton-fixierte Objektträger, die aus LAV-infizierten CEM-Zellen bereitet wurden, wurden mit verdünntem Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit 1 h bei 37⁰C inkubiert, wohingegen lebende Zellen mit Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit 1 h bei 4°C inkubiert wurden, ehe die Zellen auf die Objektträger gegeben und mit Aceton fixiert wurden. Bei beiden Methoden wurde Fluorescein-lsothiocyanat-markiertes-Anti-Maus-IgG verwendet, um diejenigen Zellen nachzuweisen, die das reaktive gp110-Antigen aufweisen. Die monoklonalen Antikörper HIV-gp110-1 ergaben positive Ergebnisse sowohl bei Anwendung lebender oder aceton-fixierter LAV-infizierter Zellen.

Beispiel Il

Neutralisierung der HlV-Infektivität durch Anti-gp 110-monoklonale Antikörper Dieses Beispiel beschreibt und charakterisiert die Neutralisierung von HlV-Infektivität unter Anwendung monoklonaler Antikörper, die an gp 110 und Peptide innerhalb von gp 110 binden. Die Ergebnisse zeigen, daß die Antikörper gp 110-3, -4, -5 und -6 neutralisierende Aktivität besitzen und daß gp 110-3 und -4 besonders hohe neutralisierende Aktivität besitzen.

Neutralisations-Assay

Ein sensitiver Neutralisations-Assay wurde entwickelt, um den Effekt der monoklonalen Antikörper auf die HlV-Infektivität quantitativ zu erfassen. Eine CD4+-Zellinie, CEM, die besonders empfindlich gegen HIV-Infektionen ist, wurde als Target-Zelle für Infektivitätsvergleiche gewählt. Ascitesflüssigkeit, hergestellt wie im Beispiel I beschrieben, oder die IgG-Fraktion davon, die unter Anwendung einer Ammoniumsulfatfällung gereinigt wurde, wurde 30 Min. bei 56°C inaktiviert, anschließend in dem erforderlichen Maße in RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, verdünnt. Eine Suspension des HIV-Stammes LAVbhu wurde von etwa 4 Tage alten CEM-Kulturen in der log-Wachstumsphase geerntet, durch einen 0,2 oder 0,45 Mikronfilter filtriert, in aliquote Teile aufgeteilt und bei -70⁰C eingefroren. Ein aliquoter Teil wurde aufgetaut, zur Bestimmung von TCIDg₀ titriert und anschließend wurden Assays mit frisch aufgetauten aliquoten Teilen durchgeführt, die im Verhältnis von 1:500 in Kulturmedium auf etwa die 10fache Konzentration verdünnt wurc^n, die erforderlich ist, um 50% der CEM-Zellen in der Kultur (10 TCID₆₀) zu infizieren. Die Virussuspension wurde mit dem gleichen Volumen (250 μΙ) eines monoklonalen Antikörperpräparates in 5fach Verdünnungen von 1:5 bis 1:9 765625 vermischt. Die Virus/Antikörpermischung wurde 45 Min. bei 37⁰C inkubiert und anschließend voin 1:5 bis 1:9 765625 dupliziert. Die Virus/Antikörpermischung wurde dann 45 Min. bei 37⁰C inkubiert. Anschließend wurden duplizierte Proben von 200μΙ dazu verwendet, Wells zu inokulieren, die 1 ml mit etwa 2 χ 10⁵-CEM-Zellen pro Well enthielten. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂14 Tage inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, pelletisiert und mit 1 %Triton-X-100 in PBS etwa 10 Min. lysiert. Die Menge an Viren (oder Virusantigen), die in den lysierten Zellen vorhanden war, wurde unter Anwendung eines sensitiven HIV-Antigen-Capture-

„Sandwich"- Enzymimmunoassays wie unten beschrieben quantitativ bestimmt. Der Titer an neutralisierender Aktivität, soweit vorhanden, wurde als reziproker Wort derjenigen Verdünnung der monoklonalen Antikörper bestimmt, welche um mehr als 50% die Antigenproduktion der Viruskontrollkulturen inhibiert, welche ohne Antikörper oder mit einem monoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps inkubiert wurden, von dem vorher gezeigt wurde, daß er keine neutralisierende Aktivität besitzt. Bei dem oben erwähnten HIV-Antigen-Capture-Assay wurden als Capture-Reagens zwei monoklonale Antikörper gegen p25-Antigene verwendet. Diese Hybridomzellinien wui Jen anhand der oben beschriebenen Methoden mit geringfügigen Modifikationen erzeugt, einschließlich der Anwendung eines gereinigten gag-rekombinanten Fusionsproteins als Immunogen und der Charakterisierung der erhaltenen monoklonalen Antikörper hinsichtlich Spezifität und Reaktivität unter Anwendung der als GAG-1, GAG-2 und GAG-3 bezeichneten rekombinanten Fusionsproteine und des synthetischen Peptids 141. Das Protein GAG-1 wird aus PGAG-1 (ATCC Nr. 53379) exprimiert, GAG-2 wird aus pGAG-2 (ATCC Nr. 53111) exprimiert und GAG-3 wird aus pGAG-3 (ATCC Nr. 53112) exprimiert. Die Produktion der rekombinanten Fusionsproteine ist detailliert in den USSN 764460 und 828828 beschrieben, auf die hierm.i Bezug genommen wird. Das synthetische Peptid 141 wird durch den LAV_BRU-Genombereich kodiert, der den Aminosäureresten 198 bis 242 entspricht. Die monoklonalen Antikörper, die durch die Hybridomzellinien ρ 25-2 und ρ 25-3 produziert werden, reagieren mit den rekombinanten Fusionsproteinen GAG-1, GAG-2 und GAG-3. Auch die aus ρ 25-3 gewonnenen monoklonalen Antikörper reagieren mit dem synthetischen Peptid 141.

Um den Antigen-Capture-Assay durchzuführen, wurden die Capture-Reagentien zuerst an einem festen Träger adsorbiert. Ascitesflüssigkeit, die von den Hybridomzellinien ρ25-2 und ρ25-3 stammte, wurde 1:5000 in 25mM Tris-Puffer von pH8,5 verdünnt. 200μΙ wurden in die Vertiefungen von Mikrowellplatten gegeben. Die Vertiefungen wurden versiegelt und etwa 16h bei ·! ⁰C inkubiert. Die Lösung wurde von den Platten abgesaugt, ehe eine blockierende Lösung von 0,3% Blotto in PBS zugegeben wurde. Das Blockieren erfolgte 15 Min. bei Raumtemperatur. Die blockierende Lösung wurde abgesaugt und die Probe wurde zugegeben. 200μΙ der lysierten Zellsuspension und 5μΙ Detektionskonjugat, hergestellt wie unten beschrieben, wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Wellstreifen oder-platten wurden 2 h bei 37⁰C inkubiert, anschließend wurde die Suspension abgesaugt und die Wells wurden 4x mit Puffer gewaschen (0,05% Tween 20 in PBS). Das Detektionskonjugat wurde folgendermaßen hergestellt. Die monoklonalen Antikörper p25-6 und p26-7 wurden an Meerrettichperoxidase (HRP) in einem Molverhältnis von 3:1 (Ab:HRP) 3h unter Anwe idung des Periodatoxidationsverfahren (Nakane et al., J.Histüchem.Cytochem. 22:1084 (1984)) konjugiert. Die Konjugate wu. den 1:1500 in 2,5% (G/V) fettarmer Trockenmilch, 0,01 Thimerosal und 0,005% Antifoam A in 2OmM Natriumzitrat verdünn:. Der verbleibende Teil des ELISA-Assays wurde wie im Beispiel I beschrieben, durchgeführt. Die Bestimmung der neutrall· i'arenden Aktivität mit den Antikörpern gp 110-3, -4, -5 und -6 erbrachte folgende Ergebnisse. Die höchsten Titer mit beibehaltr ier neutralisierender Aktivität waren: gp 110-3 = 15625; gp 110-4'= 9765625; gp 110-5 = 125 und gp110-6 = 625.

Aufgrund der vorausgesagten genetischen Variabilität des durch das Peptid 29 definierten Bereichs wurde die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers gp 110-4, andere HlV-lsolate zu erkennen, untersucht. Die Immunof luoreszenz-Assays wurdet ι wie oben beschrieben durchgeführt. Der Antikörper gp 110-4 konnte Antigen in Kulturen von wenigstens drei von 16 HlV-lsolaten detektieren.

Der Antikörper gp 110-4 war In der Lage, Viren zu neutralisieren, die über einen Zeitraum von 15 Wochen von einem Schimpansen isoliert wurden, der bei einem AIDS-Impfversuch als Kontrolltier mit LAV_Bru inokuliert wurde. Der monoklonale Antikörper war in der Lage, die Isolate zu neutralisieren, obwohl das Tier Serumantikörper aufwies, die HIV in vitro neutralisierten und obwohl das Tier eine meßbare, zeilvermittelte Immunantwort gegen HIV-Infektion ausgebildet hatte. Dies zeigt das Fehlen eines Antigen-Drifts in vivo für das Epitop, das durch den gp 110-4 Antikörper erkannt wird.

Beispiel III

Neutralisierung der HlV-lnfektivität durch einen Cocktail von Anti-gp110 und Antl-p25 monoklonalen Antikörpern Dieses Beispiel beschreibt die Neutralisierung der HlV-lnfektivität unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern, die an gp 110 und Peptide innerhalb von gp 110 binden, in Kombination mit monoklonalen Antikörpern, welche an ρ25 und an Peptide innerhalb von p25 binden und welche alleine eine nur geringe oder keine neutralisierende Aktivität aufweisen. Die Ergebnisse zeigen, daß der monoklonale Antikörper gp 110-2 in Kombination mit ρ 25-6 oder ρ 25-7 eine besonders große neutralisierende Aktivität aufweist.

Die Hybridomzellinien p25-6 und p25-7 wurden nach den oben beschriebenen Methoden unter Anwendung der Modifikationen erzeugt, zu denen die Verwendung inaktivierter zerstörter Viren oder gereinigter gag rekombinanter Fusionsproteine, die in E.CoIi als Immunogen exprimiert wurden, und die Charakterisierung der monoklonajen Antikörper bezüglich der Spezifität und der Reaktivität zählen, wobei die als GAG-1, GAG-2 und GAG-3 bezeichneten rekombinanten Fusionsproteine und die synthetischen Peptide 15,88,150,147 und 148 zur Anwendung kamen. Die synthetischen Peptide sind vom LAV_8RU-Genombereich kodiert, der den folgenden Aminosäureresten entspricht: Peptid 15, Aminosäurereste 329 bis 350; Peptid 88, Aminosäurereste 315 bis 350; Peptid 150, Aminosäuroreste 318 bis 363; Peptid 147, Aminosäurereste 278 bis 319; und Peptid 148, Aminosäurereste 290 bis 319. Die von den Hybridomzellinien p25-6 und ρ 25-7 produzierten monoklonalen Antikörper reagieren mit dem rekombinanten Fusionsprotein GAG-3; ρ25-6 reagiert mit den synthetischen Peptiden 147 und 148; und ρ25-7 mit den synthetischen Peptiden 15,88 und 150.

Die Neutralisations-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß bei Anwendung von Cocktails die einzelnen monoklonalen Antikörper zuerst 1:5 in Kulturmedium verdünnt und anschließend in gleichen Verhältnissen vermischt wurden, um eine Endverdünnung von 1:10 zu ergeben. Der verbleibende Teil des Assays wurde wie oben durchgeführt.

Die monoklonalen Antikörper gp 110-2, ρ 25-6 und ρ 26-7 zeigen weniger als 50% neutralisierende Aktivität, wenn sie alleine verwendet werden. Bei Verwendung eines Cocktails, der die monoklonalen Antikörper gp 110-2 zusammen mit ρ 25-6 oder gp 110-2 mit p25-7 in einer Verdünnung von 1:10 umfaßt, erfolgt vollständige Neutralisierung. Ein Cocktail, der die monoklonalen Antikörper ρ 25-6 in Kombination mit ρ 25-7 enthält, ergab eine neutralisierende Aktivität im Bereich von 60 bis 90%.

Immunwirksamkeit des Peptide 29 und der Homologen davon

Die Fähigkeit des Peptids 29 und der homologen Peptide, einschließlich dem Peptid 177, eine Immunantwort geg. η HIV zu stimulieren, wurde an zwei Mäusestämmen untersucht. Die Herstellung der Peptidimmunogene, die Immunisierungsverfahren und die Charakterisierung der ausgelösten Immunantworten werden nachfolgend beschrieben.

Das Peptid 29 wird zur Immunisierung durch Konjugation an ein gereinigtes Thyroglobulin hergestellt. Thyroglobulin kann zur Konjugation mit N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) gemäß den in der US-PS4629783, Spalte 10, Zeilen 28-51 beschriebenen Verfahren derivatisiert werden. Als zweites Immunogen wird Thyroglobulin mit Glutaraldehyd folgendermaßen derivatisiert. 27mg Schweinethyroglobulin werden in 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonat gelöst. Dazu trocknet man 8,3 μΙ einer 25%igen Glutaraldehydlösung und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man gibt

1 ml Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer von pH9,3 zu der Lösung und dialysiert anschließend 8h gegen 2I des gleichen Puffers bei 4⁰C, wobei ein vollständiger Austausch des Dialysats nach 4 h erfolgt. Das Peptid 29 gibt man dann zu dem derivat'-sierien Thyroglobulin in etwa lOOfachem molaren Überschuß und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. M'.ii blockiert unumgesetzen G lataraldehyd mit 200μΙ einer 0,2 M Lysinlösung und rührt die Mischung mehrere Stunden (oder über Nacht) bei Raumtemperatu \ Das Peptid-Thyroglobulin-Konjugat wird dann extensiv gegen PBS bei 4°C dialysiert.

Zwei Mäusestänme (C57 schwarz und BALB/c) inokuliert man mit den Peptiden, die durch das jeweilige Konjugationsverfahren herstellt wurden. Alle Tiere waren im Zeitpunkt der Inokulation etwa 2 bis 4 Wochen alt. Die Inokulation kann in den Fußballen, durch Schwanzkarifikation, subkutan, intranasal oder intraperitoneal erfolgen. Das Inokulum besteht aus 25 μς des konjugierten Peptids, suspendiert in 0,5ml kompletten Freunds-Adjuvans, wobei nach der 2., 3. und 5.Woche Booster-Inokulationen mit dem gleichen Immunogen, suspendiert in inkomplettem Freunds-Adjuvans, gegeben werden. Man sammelt Serumproben von den einzelnen Mäusen vor der Immunisierung, 4 Tage nach der Booster-Immunisierung nach der 3. Woche und 4 Tage nach der letzten Booster-Immunisierung nach 5 Wochen. Die Serumproben wurden auf Antikörper gegen homologe Peptide oder Ganzviren durch eine Screening in einem ELISA-Assay analysiert. Diejenigen Sera, die Antikörperaktivität gegen LAV zeigen, werden einem weiteren Screening auf neutralisierende Aktivität unterzogen. Im Anschluß daran erfolgt eine Analyse der Sera in Immunoblot-Assays gegen zerstörtes LAV-Antigen und in Radicimmunopräzipitations-Assays mit radio-markiertem gp 110. Die Ergebnisse der Immunisierungen zeigen, daß die mit Peptid 29 immunisierten Mäuse Antikörper entwickelt, die mit Peptid 29 und zerstörten LAV-1-Viren in ELISA-Assays reagieren. Eine Konjugation des Peptid 29 durch Maleimid führt zur Bildung von Anti-Peptid-29-Antikörpern in einigen balb/c-Mäusen. Die Konjugation des Peptids 29 durch Glutaraldehyd ergibt im allgemeinen höhere Titer an Antikörpern gegen das Peptid 29 in balb/c-Mäusen. Mit Peptid 177 immunisierte Mäuse entwickeln Antikörpergegen das Peptid. Eine Konjugation des Peptids 177 durch Glutaraldehyd war bei der Auslösung einer Immunantwort besser. C57-Mäuse sprechen stärker auf die Immunstimulicrung mit dem Peptid 177 an als balb/c-Mäuse. Mit dem LAV-2-Peptid 110-2-2 immunisierte Mäuse entwickeln Antikörper gegen 110-2-2 und LAV-2-Viren, wie mittels ELISA-Assays gezeigt werden konnte. Das durch Glutaraldehyd konjugierte Peptid 110-2-2 wirkt sowohl bei C57- als auch bei balb/c-Mäusen immunogen, wobei die Titer gegen das 110-2-2-Peptid bei balb/c-Mäusen im allgemeinen höher als bei C57-Mäusen sind, während die Titer gegen das LAV-2-Virus im allgemeinen bei C57-Mäusen höher sind als bei balb/c-Mäusen.

Diejenigen Serumproben von immunisierten Mäusen, die (i) Antikörper gegen Ganzviren zeigen; (ii) in der Lage sind, HIV zu neutralisieren, wie beispielsweise in den in Beispiel Il beschriebenen Assays und (iii) mit Peptid 29 in ELISA-Assays reagieren, zeigen kumulativ die Wirksamkeit der Anwendung des Peptids 29 in einer Vakzinformulierung.

Beispiel V Immunoarflnititstrennung von gp 110 unter Anwendung monoklonaler Antikörper

Monoklonal Antikörper gegen das gp 110-HIV-Antigen kann man bei Immunoäffinitätstrennverfahren verwenden, um die bakteriell exprimierten rekombinanten Fusionsproteine zu reinigen. Wenn das exprimierte Protein von den Bakterien sekretiert wird, kann das Protein aus dem Kulturüberstand isoliert werden. Wenn das Protein nicht sekretiert wird, kann eine Zerstörung der Bakterienzellen erforderlich werden.

Die Konstruktion des Plasmids pENV-5 (ATCC Nr. 53074) ist in der USSN721237 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Das Plasmid pENV-5 kodiert .'ür den Hauptteil des Carboxylendes von gp 110 und einen Teil des Aminoterminus von gp41 von LAV, das in den trp Expressionsvektor insertiert ist. Durch diesen Vektor transformierte E.CoIi C600 exprimieren das gp 110 Fusionsprotein, sekretieren es aber nicht.

E.CoIi C600, die das Plasmid pENV-5 enthalten, läßt man über Nacht bei 37⁰C unter Belüftung in einem Medium wachsen, das Tryptophan l2Q\ig/m\) und Ampicillin (lOOpg/ml) enthält. Die Übernachtkulturen inokuliert man dann zu 1:100 in frisches Minimalmedium, das Ampicillin (100pg/ml), nicht aber Tryptophan enthält. Diese Kulturen läßt man unter Belüftung bei 37⁰C

2 bis 3h wachsen (bis zur frühen log-Phase). Der Induktor, 3-B-lndol-acrylsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wird aus einor frisch bereiteten Vorratslösung von 20mg/ml in 95%igem Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 20 Mg/ml zugegeben. Die induzierten Kulturen läßt man bei 37⁰C unter Belüftung 4 bis 5h wachsen, pelletisiert anschließend und friert gegebenenfalls ein. Die Proteinausbeuten von pENV-5 betragen typischerweise weniger als 1 mg/l.

Die pelletisierten Bakterienzellen werden unter Verwendung von P-RIPA-Puffer (PBS, enthaltend 1 % Triton X-100,1 % Deoxycholat, 0,1 % Natriumdodocylsulfat und 1 % Aprotinin) lysiert, der E. Coli-Zellen lysiert. Die Suspension wird zum Shearing von DNA und RNA einer Ultraschallbehandlung unterzogen und anschließend zur Entfernung von Teilchen zentrifugiert. Eine Verdünnung oder Konzentrierung kann zur Standardisierung der Proteinkonzentration erforderlich sein.

Der monoklonale Antikörper HIV-gp 110-1 wird ursprünglich ausgefällt aus Ascitesflüssigkeit oder Zellkulturüberständen bei Raumtemperatur oder in der Kälte mit (NH₄I₂SO₄ oder Na₂SO₄-Lösungen, die bei pH 7,3 auf eine Endsättigung von 33 oder 18% gepuffert sind. Die ausgefällten Proteine werden durch Zentrifugieren entfernt und erneut in PBS gelöst und ein zweites Mal mit 33% (NH₄I₂SO₄ oder 12 bis 15% Na₂SO₄ gefällt. Falls erforderlich, kann diese Stufe wiederholt werden. Das Pellet wird erneut in PBS gelöst und die überschüssigen Satze werden durch Gelfiltration über eine entsalzende Matrix oder durch erschöpfende Dialyse gegen PBS entfernt.

Der gereinigte monoklonale Antikörper 110-1 kann dann an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose gekoppelt werden. Die

erforderliche Menge an Gel läßt man in 1O^-3M HCI-Lösung auf einem Glasfilter quellen (1 g gefriergetrocknetes Material ergibt ein Gelendvolumen von etwa 3,5ml), wäscht 15 Min. mit der gleichen Lösung und gibt den Antikörper unmittelbar danach zu. Im allgemeinen erfolgt die Kopplungsreaktion am wirksamsten in einem pH-Bereich von 8 bis 10, man kann jedoch auch bei einem niedrigeren pH-Wert arbeiten, wenn dies aus Gründen der Antikörperstabilität erforderlich ist. Der Antikörper soll in PBS oder in einem Carbonat/Bicarbonat- oder Boratpuffer von hoher lonenstärke mit 15OmM NaCI gelöst sein. Die aktivierte Sepharose und die Antikörpersuspension werden bei Raumtemperatur 2 bis 4h oder über Nacht bei 4°C leicht gerührt und anschließend auf einer groben Glasfilterfritte mit Kopplungspuffer gewaschen. Soweit aktive Gruppen verblieben sind, werden diese durch 2stündige Behandlung mit 1,0M Ethanolamin bei pH 8 blockiert. Das Antikörper-Sepharose-Endprodukt wird anschließend abwechselnd 4 oder 5x mit Pufferlösungen mit hohem oder niedrigem pH-Wert gewaschen (Boratpuffer, 0,1 M, pH 8,5,1 M NaCI und Acetatpuffer, 0,1 M, pH 4,0,1 MNaCI). Durch das Waschen entfernt man Spuren von nichtkovalent absorbierten Materialien. Die fertige Immunoaffinitäts-Separatlonsmatrix lagert man unterhalb von 8°C in Anwesenheit eines geeigneten bakteriostatischen Mittels, wie 0,01%igesAzid.

Die Zugabe der exprimierten Proteinsuspension zu der Immunoaffinitäts-Separationsmatrix führt zu der selektiven Entfernung des gp110-Antigens. Die Mischung läßt man 2 bis 24 h, vorzugsweise 12 bis 18h, unter leichtem Rühren oder Schütteln einwirken. Man kann auch so vorgehen, daß man die Immunoaffinitätsmatrix in eine Säule gibt, äquilibriort und die exprimierte Proteinsuspension langsam auf die Säule gibt. Nach Zugabe der Proteinsuspension sollte der Flow gestoppt werden, um die Bildung des Immunkomplexes auf beste Weise zu bewerkstelligen.

Ungebundenes Material wird durch extensives Waschen mi". Adsorptionspuffer ausgewaschen oder abgetrennt. Dazu kann man eine grobe Glasfilterfritte unter Anlegen eines Vakuums verwenden oder die Säule im Durchfluß behandeln. Das ungebundene Material wird dann unter Anwendung von Puffern mit niedrigem oder hohem pH-Wert (Acetatpuffer, pH 4,0 oder Boratpuffer, pH 8,56) oder eines chaotropen Agens eluiert.

Beispiel Vl

Immunoaffinitetsrelnigung von rekomblnantem gp110 aus einem Säugeiler-Expresslonssystem Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper finden bei der Immunoaffinitätsreinigung von rekombinantem, durch Säugetierzellen experimierten Fusions-gp 110 Anwendung. Die Säugetierzellen infiziert man mit rekombinierten Vaccinia (Mackett et al., J. Virol. 49:857 [1984], woraus hiermit Bezug genommen wird), die Sequenzen enthalten, welche für wenigstens den Teil von gp 110 kodieren, der antigen ist und die Bildung von neutralisierenden Antikörpern auflöst. Die rekombinenten Vaccinia werden gemäß dem Verfahren konstruiert, das in der USSN 842 984 beschrieben ist, auf die hiermit Bezug genommen wird. Die Sequenzen, die für das Hüllglykoprotein von HIV kodieren, werden in einem Plasmidvektor (pGS20) abwärts von einem Vaccinia-Transkriptions-Kontrollelement insertiert. Diese Chimäre Gen wird flankiert von Sequenzen, die für das virale Thymidinkinase (TK)-Gen kodieren.

Die Chimären Plasmidvektoren, die Vaccinia-Virus-Promotoren enthalten, welche an das LAV-Hüllgen ligiert sind, verwendet man zur Transformation des E.-Coli-Stamms MC 1000. Insertion der Chimären LAV-env-Sequenz in das Vaccinia-Virus-Genom erfolgte durch In-vivo-Rekombination, was dadurch möglich wurde, daß die Chimären Gene in den Plasmiden pv-env 5 von Vaccinia-Virus-Sequenzen flankiert sind, die für das TK-Gen kodieren. Dieses Plasmid wird dann in die Zellen eingeführt, die vorher mit Vaccinia-Viren vom Wildtyp infiziert wordon waren. Man ermöglicht dann eine Rekombination zwischen den TK-Sequenzen am Plasmid und den homologen Sequenzen in dem Vaccinia-Virus-Genom unter Insertion des Chimären Gens. Afrikanische Green-Monkey-Nierenzellen (Stamm BSC-40, eine von BS-1-Zellen abstammende Zellinie, ATCC Nr.CCL26) verwendet man als Wirt im Expressionssystem.

Konfluente BSC-40-Zellen infiziert man in einer Infektionsmultiplizität von 10 durch rekombinante Vaccinia-Viren. Die Infektion läßt man 12h ablaufen, danach werden die Zellen geerntet, einmal mit PBS gawaschen und abzentrifugiert. Die Zellpellets suspendiert man in Lysepuffer (1,0% NP-40,2,4% Natriumdeoxycholat, 0,1 M NaCI, 0,01 M M Tris-HCI, pH 7,4,1 mM EDTA) und klärt das Lysat durch zentrifugieren. Die Immunoaffinitätstrennung des exprimierten rekombinanten Fusionsproteins führt man, wie oben für das bakterielle Expressionssystem beschrieben, unter Anwendung des monoklonalen Antikörpers gp 110-1 durch. Die durch dieses Expressionssystem produzierten Proteine ähneln aufgrund der durch die Säugetierzellen erfolgten Behandlung und Glykosylierung stärker natürlich produziertem HIV-gp110.

Beispiel VII

Inhibierung einer HIV-Infektion mit blockierenden Peptiden

Die Wirksamkeit von blockierenden Peptiden bei der Inhibierung der Infektion von Gewebekulturzellen durch den LAV_Bru-HIV-Stamm wurde unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens für die Bewertung von Peptid T, das von Pert et al., siehe oben, publiziert wurde, untersucht. Die bevorzugten HIV-lnhibitions-Assays erfolgen, indem man gleiche Volumina blockierender Peptide und CEM-Zellen (2,5 χ 10⁶) in Medium (RPMI, 10% FCS und 2 mg/ml Polybren) kombiniert und 45 Min. bei 37⁰C inkubiert. Das Virus wird dann in unterschiedlichen Dosierungen (10,50,500 TCID50) zugegeben und die Mischung wird 14 Tage bei 37°C inkubiert. Der Überstand wird anschließend einem Assay auf die Produktion von Virusantigen (z. B. ρ 25-Kernantigen) unterzogen.

Eine Preinkubation der CEM-Zellen mit den Peptiden vor der Viruszugabe zu den Kulturen verstärkt den inhibierenden Effekt in den Assays. Es hat sich gezeigt, daß die Inhibierung von der Virusdosierung abhängig ist, wobei eine große Aktivität bei niedrigen und mittleren Dosierungen, ein geringerer Effekt dagegen bei höchsten Virusdosierungen zu beobachten war.

Mit Peptid T war bei Experimenten mit niedrigen Virusdosierungen eine Inhibierung der Virusantigenproduktion von etwa 60% bis 90% zu erzielen. Weitere Experimente mit den Peptiden X bis XV, die typischerweise am COOH-Terminus amidiert und am NH2-Terminus acetyliert waren, ergaben ähnliche Ergebnisse, wobei das Peptid Xl über einen breiten Dosisbereich besonders wirksam war. Es ist ersichtlich, daß auf Basis der erfindungsgemäßen monokl· malen Antikörper und Peptide, einschließlich der blockierenden Peptide, eine bessere Methode zur Neutralisierung und/oder Inhibierung von HIV-Infektionen zur Verfugung steht. Dies ermöglicht die Schaffung prophylaktischer und therapeutischer Mittel, die gegen Infektionen durch die meisten, wenn nicht alle, HIV-Stämme wirksam sind. Darüber hinaus finden die neuen Materialien in Diagnose-Assays und anderen bekannten Verfahren Anwendung.

Hlnterlogungsnummern der Mikroorganismen

Die nachfolgenden Mikroorganismen, die Teil der vorliegenden Erfindung sind, v.urden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parkiawn Drive, Rockville, Maryland 20852, US \, hinterlegt. Die Hinterlegungsdaten sind wie folgt:

ATCC-Nr. Hinterlegungs

daten

HB9175 August 15,1986

HB9176 August15,1986

HB 9177 August 15,1986

HB 9404 April 30,1987

HB 9405 April 30,1987

HB 9406 April 30,1987

HB 9407 " April 30,1987

HB 9408 April 30,1987

HB 9409 April 30,19E7

HB 9410 April 30,1087

Die Hybridome HB9175, HB9176 und HB9177 wurden getestet und waren am 26. August 1986 lebensfähig. Cie übrigen Hybridome wurden ebenfalls getestet und waren am 4. Mai 1987 lebensfähig.

Wissenschaftl.	Bezeichnung
Bezeichnung	des
	Hinterlegers
Mouse hybridoma	HIV-gpHO-1
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-gp 110-2
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-gp110-3
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-gp 110-6
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-gp 110-4
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-gp 110-5
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-p 25-2
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-p 25-3
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-p 25-6
(balbc/NS-1)
Mouse hybridoma	HIV-p 25-7

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die in der Lage sind, immunologisch die neutralisierenden Bereiche von HIV-Proteinen nachzuahmen, dadurch gekennzeichnet, daß man monoklonale
Antikörper, die spezifisch mit einem oder mehreren neutralisierenden Bereichen von HIV reagieren, an ein Substrat odor einen Träger bindet oder daran immobilisiert; die rekombinanten
Fusionsproteine, die von einem eukaryontischen oder bakteriellen Wirt exprimiert werden, oder die HIV-Proteine aus einem HIV-Extrakt oder -Lysat mit den immobilisierten Antikörpern unter Bildung eines Immunkomplexes in Kontakt bringt; die Immunkomplexe in Kontakt bringt; die
Immunkomplexe oder Antigenfragmente vom Träger abtrennt; und die Peptide gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper verwendet, die
spezifisch mit einem neutralisierenden Bereich reagieren, der Epitope umfaßt, die in den env- oder gag-3ereichen des HIV-Genoms kodiert sind.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man
monoklonale Antikörper verwendet, die spezifisch mit einem neutralisierenden Bereich reagieren, der Epitope umfaßt, die auf den LAV_BRU-HIV-Proteinen gp 110 oder p25 lokalisiert sind.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man
monoklonale Antikörper verwendet, die spezifisch mit einem neutralisierenden Bereich reagieren, der die HIV-gp 110-Aminosäuresequenz von etwa 301 bis 336 oder 308 bis 328 oder Homologe
dieser Sequenzen umfaßt.

5. Verfahren nach einam der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man monoklonale
AntikO 'per verwendet, die spezifisch für einen neutralisierenden Bereich sind, der die HIV-p25-Aminosäuresequenz von etwa 278 bis 319 oder etwa 315 bis 363 oder Homologe dieser Sequenzen umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Peptide erhält, die wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren der folgenden HIV-gp 110-Aminosäuresequenz
oder der Homologen davon umfassen:

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Me-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zusammenhängenden Aminosäuren wenigstens eine Amigen-Determinante definieren, die in der Lage ist, nach Immunisierung eines
Wirts die Bildung von Antikörpern auszulösen, die eine Schutzwirkun j gegen HIV-Infektionen
besitzen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Peptide erhält, die eine der
folgenden HIV-gp 110-Aminosäuresequenzen oder der Homologen davon umfassen;

I (29)
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y'

VI117)
YThr-Arg-Lys-Ser-lle-Tyr-lle-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-lle-Y'

VIII (110-2-2)
Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Noi-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y'

worin Y und Y', soweit vorhanden, jeweils eine Aminosäuresequenz von bis zu etwa 20
Aminosäuren bedeuten.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Peptide der Sequenz I, V oder VIII erhält, in denen Y und/oder Y' einen bindenden Rest umfassen, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die im wesentlichen besteht aus Glycin, Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure oder Asparagin.