DD280118A5 - Verfahren zur herstellung von monoklonaren antikoerpern und peptiden, welche zur behandlung und diagnose von hiv-infektionen brauchbar sind - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper, die spezifisch mit einem oder mehreren neutralisierenden HIV-Bereichen reagieren. Die Herstellung der monoklonalen Antikoerper erfolgt durch Immortalisierung von Antikoerper-produzierenden Zellinien und Kultivierung dieser Zellinien. Die erfindungsgemaess erhaeltlichen Produkte sind in der Medizin zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen zur Diagnose von HIV-Infektionen brauchbar.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper . Diese lassen sich zu pharmazeutischen Mitteln formulieren/ welche bei der Behandlung» Diagnose/ Neutralisierung und beim Impfen im Zusammenhang mit der Behandlung von Human-Immunodeficiency Virus (HlV)-Infektionen brauchbar sind.
Das für das Acquired Immunodeficiency-Syndrom (AIDS) und dessen prodromale Phasen/ AIDS-related Complex (ARC) und das Lymphadenopathie-Syndrom (LAS) verantwortliche infektiöse Agens ist ein neuartiges lymphotropes Retrovirus. Dieses Virus wurde auf verschiedene Weise bezeichnet/ nämlich als LAV, HTLV-III, ARV und neuerdings als HIV.
Seit der pandemischen Ausbreitung von HIV ist die Behandlung infizierter Personen und die Verhütung der Übertragung auf uninfizi^rte Risikogruppen von größter Wichtigkeit. Eine Vielzahl von Behandlungsstrategien richtet sich auf unterschiedliche Phasen im Lebenscyclus des Virus. Sie sind in Mitsuya und Broder/ 1987, Nature 325:773 beschrieben. Eine Möglichkeit umfaßt die Anwendung von Antikörpern/ die an das Virus binden und die Virusreplikation inhibieren/ entweder weil sie den Eintritt des Virus in die Wirtsstellen stören oder aufgrund anderer Mechanismen. Sobald die virale Komponente(η )/ die einem Eingreifen des Antikörpers unterliegt (en), identifiziert ist (sind), hofft man Antikörper-
Titer erzeugen zu können/ die ausreichen; um die Infektivität des Virjs zu neutralisieren und zwar durch Impfung oder in alternativer Weise durch passive Verabrei :hung von Immunglobulinen oder monoklonalen Antikörpern der gewünschten Spezifität.
Man nimmt an/ daß die Hüllgiykoproteine der meisten Retroviren mit Rezeptormolekülen an der Oberfläche der für das Virus anfälligen Zellen reagieren und so die Virusinfektivität gegenüber bestimmten Wirten bestimmen. Antikörper/ die an die Glykoproteine binden/ können die Interaktion des Virus mit den Zellrezeptoren blockieren und somit die Infektivität des Virus neutralisieren/ siehe The Molecular Biology of Tumor Viruses/ 534 (J. Tooze, Hrsg./
1973) und RNA Tumor Viruses/ 226, 236 (R. Weiss et al, Hrsg./ 1982) auf beide Publikationen wird hiermit Bezug genommen. Man vergleiche außerdem
Gonzalez-Scarano et al., 1982, Virology 120:42 (La Crosse Virus); Matsuno und Inouye, 1983, Infect. Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); und Mathews et al., 1982, J. Immunol., 129:2763 (Encephalomyelitis Virus).
Die allgemeine Struktur des HIV besteht in einem Ribonukleoproteinkern/ der von einer Lipid-enthaltenden Hülle umgeben ist, welche das Virus im Laufe seiner Entwicklung aus der Membran der infizierten Wirtszelle bildet. Die viralen kodierten Glykoproteine sind in die Hülle eingebettet und stehen nach außen hervor. Die Hüllgiykoproteine von HIV werden ursprünglich in der infizierten Zelle als Prekursor-
3q molekül von 150.000 bis 160.000 Daltons (gpl50 oder gpl60) synthetisiert und anschließend in der Zelle in ein N-terminales Fragment von 110.000 bis 120.000 Daltons (gp 110 oder gp 120) um das externe Glykoprotein zu erzeugen und in ein C-terminales Fragment von 41.000 bis 46.000 Daltons (gp41), das das Transmembran-Hüllglykoprotein darstellt, überführt.
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Aus den oben angegebenen Gründen war das gpllO HIV-Glykoprotein Gegenstand zahlreicher Untersuchungen bezüglich eines potentiellen Targets zur Unterbrechung des Lebenscyclus des Virus. Es wurde gezeigt; daß Sera von HIV-infizierten Personen HIV in vitro neutralisieren und daß Antikörper/die an gereinigtes gpllO binden, in den Sera vorliegen/ Robert-Guroff et al., 1985/ Nature 316:72, Weiss et al., 1985, Nature 316:69 und Mathews et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 33:9709. Gereinigtes und rekombinantes gplOO stimulierte die Produktion neutraliserender Serumantikörper, wenn man sie zur Immunisierung Tieren verabreichte, Robey et al., 1986, Froc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:7023; Lasky et al., 1986, Science 233:209; und Zagury et al., 1986, Nature 326:249. Weiter konnte gezeigt werden, daß das gpllO-Molekül an den CD4 (T4)-Rezeptor bindet und daß monoklonale Antikörper, die bestimmte Epitope des CD4-Rezeptors erkennen, die HIV-Bindung, Syncytiumbildung und Infektivität blockieren, McDougal et al., 1986, Science 231:382. Putney et al. (1986, Science 234:1292) wiesen neutralisierende Serumantikörper in Tieren nach Immunisierung mit einem rekombinanten Fusionsprotein nach, das die carboxyl-terniinale Hälfte des gpllO-Moleküls enthielt. Sis konnten weiter zeigen, daß die Glykosylierung des Küllproteins für ein Ansprechen auf den neutralisierenden Antikörper unnötig ist.
Es wäre deshalb wünschenswert/ ein Subunit-Vakzin gegen AIDS unter Anwendung des HIV gpllO-Moleküls oder Teilen davon zur Verfugung zu haben. Subunit-Vakzine sind eine Alternative zu Vakzinen, die aus inaktivierten oder in ihrer Wirkung geschwächten Viren hergestellt werden. Inaktivierte Vakzine sind problematisch, weil möglicherweise nicht alle Viruspartikel abgetötet wurden und die in ihrer Wirkung geschwächten Viren besitzen die Fähigkeit zu mutieren und ihre krankheitsauslösende Wirkung wieder zu gewinnen. Bei Subunit-Vakzinen verwendet man nur diejenigen
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Teile des Virus zur Immunisierung des Wirts/ welche die Antigene oder Epitope enthalten/ die in der Lage sind/ die Immunantwort auszulösen/ d.h. ein Ansprechen auf neutralisierende Antikörper/ ADCC und ein cytotoxisches T-Zell-Ansprechen. Der Hauptvorteil von Subunit-Vakzinen liegt darin/ daß irrelevantes Virusmaterial ausgeschlossen ist.
Virale Subunits (Untereinheiten) zur Anwendung in ei".·· Vakzin kann man nach verschiedenen Methoden erzeugen. Beispielsweise kann das Hüllglykoprotein von einem Bakterienwirt exprimiert und gereinigt werden/ obwohl diesem Molekül die meisten post-translationalen Modifikationen (wie die Glykosylierung) oder andere Weiterverarbeitungen fehlen. Eine derartige Modifikation kann man durch Verwendung eines eukaryotischen Expressionssystems/ beispielsweise Hefe oder kultivierte Säugetierzellen/ erzielen. Virale Gene wurden in Säugetierzellen unter Verwendung von Vaccinia-Viren als Vektor eingeführt/ siehe beispielsweise Mackett/ M. et al/ 1982/ Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:7415; D. Panicali und
E. Paoletti, 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:4927.
Rekombinante Vaccinia-Viren kann man gemäß den Methoden von Hu et al./ Nature 320:537 (1986) oder Chakrabarti et al., Nature 320:535 (1986)/ auf die hiermit Bezug genommen wird/ konstruieren. In diesen Systemen werden die viralen Glykoproteine/ die durch Zellen erzeugt werden, welche mit rekombinanten Vaccinia infiziert sind, in geeigneter Weise glykosyliert. Sie können zur Extrusion und abschließenden Isolierung an die Zelloberfläche transportiert werden.
Ein wichtiger Schritt in der Produktion eines Subunit-Vakzines ist eine adequate Reinigung des gewünschten Glykoproteins aus der komplexen Mischung des Expressionssystems. Hierfür sind mehrere Methoden geeignet. Dazu zählen/ ohne darauf begrenzt zu sein/ die präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese/ Gelpermeations-Chromatographie, ver-
η Kh
schiedene Chromatographiemethoden (d.h. Ionenaustausch-/ Umkehrphasen-/ Immunoaffinitäts- und hydrophobe Interaktionschromatographie) und andere. Die meisten dieser Methoden verwendet man in verschiedenen Kombinationen,um im wesentlichen reine Präparate zu erhalten/ siehe D.G. Kleid et al., 1981, Science 214:1125, CD. Cabradilla et al. ι 1986, Biotechnology 4:128, D.J. Dowbenko, 1985,-Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:7748, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Zur Herstellung von Subunit-Vakzinen werden Methoden benötigt, die die Zahl der Stufen reduzieren, die erforderlich sind, um die beste Reinigung eines bestimmten viralen Antigens aus einer komplexen Expressionsmischung zu er-
](. zielen. Eine effiziente Abtrennung der Antigene von Fremdkomponenten kann unter Anwendung der Immunoaffinitätschromatographie erfolgen. Diese auch als Iminunoadsorption bekannte Methode besteht im Prinzip in der selektiven Adsorption eines Antigens an einen festen Träger, an den
on ein spezifischer Antikörper kovalent geknüpft wurde. Das selektiv adsorbierte Antigen eluiert man dann von einem derartigen Adsorbens oit Antikörper-Affinität, indem man beispielsweise den pH-Wert und/oder die Ionenstärke des Puffers ändert.
Polyklonale Antikörper, die von Tieren, welche mit dem gewünschten Antigen immunisiert wurden oder von natürlich infizierten Personen (siehebeispielsweise Laksy et al., oben) erhalten wurden, wurden häufig als Immunoadsorbentien verwendet. Diese Reagentien besitzen aber im allgemeinen entscheidende Nachteile, beispielsweise daß (i) nicht alle der Antikörper, die an den unlöslichen Träger binden, spezifisch für das interessierende Molekül sind, so daß eine weitere Reinigung erforderlich wird; (ii) die Ausbeuten an gewünschtem Antigen häufig niedrig sind; und (iii) die
η ni-
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28 O i ί
Antikörper-Affinitäten häufig von einem Präparat zum anderen schwanken/ so daß Modifizierungen der Elutionsmethode erforderlich sind. Mit der Verwendung monoklonaler Antikörper/ die spezifisch für das gewünschte virale Antigen sind/ in Subunit-Vakzinpräparationen anstelle von polyklonalen Antikörpern könnte man diese Schwierigkeiten umgehen.
Monoklonale Murinantikörper/ die HIV-Antigene binden/ wurden bereits beschrieben. Mehrere Arbeitsgruppen haben über monoklonale Antikörper berichtet/ die spezifisch für das Kernprotein p25 sind (siehe beispielsweise di Marzo Veronese et al., 1985/ Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:5199 und J. Chassagne et al./ 1986/ J. Immunol. 136:1442). Monoklonale Antikörper/ die spezifisch für das Membranglykoprotein gp41 sind/ wurden ebenfalls bereits beschrieben (siehe beispielsweise di Marzo Veronese et al.; 1985/ Science 229: 1402).
Es besteht ein Bedürfnis nach monoklonalen Antikörpern/ die spezifisch für Epitope in genau definierten Bereichen des Haupthüllglykoproteins gpllO sind. Monoklonale Antikörper/ welche an diese Bereiche binden und eine Reduktion oder Eliminierr.ng der Replikation und der übertragbarkeit von HIV verursachen/ wären von großem therapeutischen und prophylaktischen Nutzen. Darüber hinaus könnte man die monoklonalen Antikörper auch dazu verwenden/ Cen gewünschten Bereich von gpllO beispielsweise für die Anwendung in Vakzinen aus zerstörten Viren oder rekombinanten Expressionssystemen zu reinigen. Weiter könnte der Bereich chemisch synthetisiert werden/ der das (die) Epitop(e) enthält (enthalten)/ das (die) von den monoklonalen Antikörpern erkannt wird (werden)/ wodurch die mit der Reinigung und Verabreichung größerer Fragmente des gpllO-Moleküls verbundenen
') I) H H 7
2 8 O M
Schwierigkeiten vermiedon werden könnten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.
Erfindungsgemäß werden monoklonale Antikörper zur Verfügung gestellt, welche in der Lage sind, die neutralisierenden Epitope von HIV-Proteinen immunologisch nachzuahmen. Dies" neuartigen Materialien finden beispielsweise in Diagnose-Assays für den Nachweis von HIV-Infektionen und bei der therapeutischen Behandlung von oder beim Impfen gegen HIV-Infektionen Anwendung.
Die Erfindung betrifft neue Mittel und Methoden zur NeutraliVierung von HIV-Infekt ionen, d.h. zur Verhinderung oder substantiellen Inhibierung der Bildung oder cellulären Transmission von infektiösem HIV in einem Wirt. Insbesondere werden Peptide, die einen neutralisierenden Bereich des HIV nachahmen, sowie monoklonale Antikörper, die mit einem derartigen Bereich reagieren/ für die Diagnose und Behandlung und zur Impfung gegen HIV-Infektionen verwendet. Der Ausdruck "neutralisierender Bereich" bezeichnet in diesem Zusammenhang diejenigen Teile des HIV, insbesondere HIV-Proteine/ welche Aminosäuresegmente enthalten, die ein oder mehrere Epitope definieren, die mit Antikörpern reagieren/ welche entweder alleineoder in Kombination mit anderen er-"findungsgemäßen Antikörpern in der Lage sind, HIV-Infektionen zu neutralisieren. Geeignete Assays für die Neutralisierung sind bekannt/ dazu zählen beispielsweise die Reduktion von HIV-Infektionen in T-Zellinien/ die Reduktion von Plaque-bildenden Einheiten von VSV (HIV), Pseudotpyen/ welche die
3(3 nüllglykoproteine von HIV tragen/ Syncytium-Inhibitionstests
und Virion-Rezeptor-Bindungstests. Wie erwünscht; ist die neutralisierende Aktivität mit der Antikörperreaktivität in immunochemischen Tests/ wie Immuncflr.ceszenz-, Immunoblot- und Radioimmunopräzipitations-Assay/vergleichbar .
Die neuen Peptide mit typischerweise veniqer als ungefähr 50 Aminosäuren enthalten 5 oder mehr zusanmenhangende Aminosäuren, die Epitope bilden/ welche im wesentlichen denjenigen Epitopen ähneln/ welche sich an dem neutralisierenden Bereichen IU von HIV gpllO oder p25 befinden/die durch die env-und gag-Bereiche des HIV-Genoms kodiert sind .Von besonderem Interesse sind diejenigen Bereiche/ die sich etwa vom Aminosiurerest 301 bis etwa 336 von gpllO und etwa 278 bis etwa 319 und etwa 315 bis etwa 363 von p25 (alle von dem als LAV be-
BKU
zeichneten HIV-Stamm) erstrecken. Die Bezeichnung der Aminosäurereste stammt von der Los Alamos Datenbank (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory/ Theoretical Division/ Los Alamos/ NM 87545).
Für den Fachmann ist ersichtlich/ daß weitere analoge Bereiche ("Homologe") von anderen HIV-Isolaten idenifiziert werden können/ basierend auf ihrer Lage in verwandten Proteinen aus unterschiedlichen Isolaten. In der Praxis
können derartige Homologe unter Bezug auf LAVDn -Sequenz-DK U
daten folgendermaßen identifiziert werden:
a) die Aminosäuresequenzen von HIV-Isolaten und LAV' ir.
BKU
können so ausgerichtet werden, daß maximale Homologie zwischen den beiden Sequenzen-besteht.
30
b) man kann Peptide identifizieran/ die diejenigen Aminosäuresequenzen von HIV-Isolaten umfassen/ die der Lokation der LAV -Peptide entsprechen/ welche immuno-
BKU
logisch die LAV^^-Proteine nachahmen. Peptide/ welche
dKU
die auf dies« Weise identifizierten Aminosäureseruenzen von HIV-Isolaten umfassen/ ohmen typj i.cherweise die ent-
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2 Π Ο Μ
sprechenden Proteine des HlV-Isolats immunologisch nach,
Diese Methode kann auch auf HIV-Stämme angewandt werden; die ersi.·. noch aufz finden sind. Wenn beispielsweise neue HIV-Stämme identifiziert werden/ können deren Hüll- und Kernaminosäuresequenzen mit denjenigen von LAVor>r, zur Erzielung maximaler Homologie in Übereinstimmung gebracht werden. Die Methoden/ mit denen die Sequenzen in Übereinstimmung gebracht werden; sind dem Fachmann bekannt. Wenn die Sequenzen in Übereinstimmung gebracht werden/ ist es wünschenswert die Homologie zwischen den Cysteinresten so groß wie möglich zu halten. Die Aminosäuresequenz des neuen HIV-Stamms oder der HIV-Spezies/ die der Lokation der hier offenbarten Peptide entspricht/ kann synthetisiert und erfindungsgemäß zur Anwendung gebracht werden.
Eine weiUeire Methode zur Bestimmung von Sequenzen eines homologen Bereichs in anderen HIV-Stämmen wurde von Scharf et al., Science (1986) 233:1076 beschrieben. Dabei verwendet man zwei Oligonukleotid-Primer/ die an konservierte Sequenzen außerhalb des hier interessierenden Sequenzbereiches binden/ wobei in jedem Primer unterschiedliche restriktive Stellen vorhanden sind. Die DNA von HIV-Stämmen kann dann in vitro vervielfacht werden und die erhaltenen Oligonukleotide können in Vektoren für die Sequenzanalyse kloniert und einem Vakzin als Cassette einverleibt werden/ die ein bestimmtes Epitop des HIV-Stamms darstellt.
Es ist bei der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich/ daß die Epitope, die innerhalb derartiger Sequenzen vorhanden sind/ mit Antikörpern aller HIV-Stämme oder -spezien eine Kreuzreaktion eingehen. Peptide, die immunologische Epitope umfassen/ welche eine Spezies oder Serogruppe von einer anderen unterscheiden, finden zur Identifizierung be-
2 8 O M ίο
stimmter Spezien oder Serogruppen Anwendung und können zur Identifizierung von Personen dienen/ die mit einer oder mehreren HIV-Spezien oder -Serogruppen infiziert sind. Sie sind auch in therapeutischen Mitteln in Kombination mit anderen Peptiden brauchbar/ die entweder von einem homologen Bereich oder einem anderen neutralisierenden Bereich stammen.
Die hier interessierenden Peptide stammen vorzugsweise von gpllO-Region des Virus ab. Von besonderem Interesse in diesem Bereich sind Peptide/ die im offenen env-Leseraster kodiert sind/ der sich etwa von Basenpaar (bp) 6667 bis etwa zum Basenpaar 6774 des LAVD_ -Isolats erstreckt. Unterschiedliche
tSKU
homologe Bereiche anderer HIV-Isolate umfassen somit/ wie in Tabelle I aufgeführt/ die homologen Sequenzen/ die von der Los Alamos Datenbank (ausgenommen LAV2) erhalten wurden.
Weitere Peptide( die zur Erzeugung von und zjm Screening auf monoklonale Antikörper brauchbar sind/ sind diejenigen/ die im : rZenen env-Leseraster etwa vom bp 7246 bis etwa 7317 von LAV_._M kodiert sind. Derartige Antikörper und reaktive Peptide sind insbesondere im Immunoassay brauchbar.
Im gag-Bereich des LAV -Isolats stellen die p25 Amino-
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säuresequenzen von etwa 278 bis 3L9 und 315 bis 363 weitere neutralisierende Bereiche des HIV dar.
Es ist für den Fachmann ersichtlich/ das weitere neutralisierende Bereiche des HIV identifziert werden können und zwar auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Lehre. Insbesondere zeigen Kombinationen, monoklonaler Antikörper/ die mit verschiedenen HIV-Epitopen reagieren/ eine neutralisierende Aktivität.
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'Mi H Hi < -^- ·
2 8 O i
11
BHiO2 Ser 309
BH8 Lye— 309
HXB3 Lye Z09
H9M Ser 309
BRU -Ser 314
26 TyrLys GlnSer ThrPro 311
,,. HXB 2 CACAGA GGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATG
BH102 326
BH8 326
HXB3 326
H9M 326
BRU 331
ΝΎ5 GlyPro ... ThrLeuTyrAlaArgGlu '-Asplle 320
?. CDC42 ValTrpTyr Thr GIu LeuGlyAsn 335
...Arg...GlnAlaHisCys 331
BH102 331
BH8 331
HXB3 331
H9M 331
BRU 336
tLl IlelleGly— 330
ARV2 lie Lys... 333
WMJ2 lie — 326
^, Z6 GIy... 334
NY5 J25
CDC42 He 341
V!!
Peptid I; das auch als Peptid 29 bezeichnet wird/ ist im offenen env-Leseraster etwa von den Aminosäureresten 308 bis 328 kodiert und besitzt die folgende Aminosäuresequenz/ bei der die Oligopeptide innerhalb dieser Sequenz lineare Epitope diener Sequenz umfassen:
I (29)
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y·
in der Y und Y1/ soweit vorhanden/ jeweils Sequenzen von bis zu etwa 20 Aminosäuren bedeuten. Wenn Y und/oder Y' vorhanden sind/ können diese beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren aus Sequenzen/ die die Aminosäurereste 308 bis 328 der HIV-Hüllsequenz flankieren/ oder irgendeinen Teil dieser flankierenden Sequenzen umfassen. So kann Y beispielsweise und ohne darauf begrenzt zu sein/ die LAVnri -
BKU Hüllaminosäuresequenz '»twa von den Resten 301 bis 307 ganz oder teilweise umfassen und Y1 kann die LAV .-Hüll-
BKU
aminosäuresequenz etwa von den Resten 329 bis 336 ganz oder teilweise umfassen/ wie folgt
17. (29a)
Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-
Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cys.
Tn alternativer Weise kann man qekürzte Seq-iomzen der erfindungsgemäßen Peptide herstellen. In dieser Hinsicht sind die folgenden Sequenzen des Peptids 29 besonders brauchbar:
III (29b)
Y'
i Γ f. ° '"
2 8 O ί ί 8
worin Y und/oder Y1/ soweit vorhanden/ jeweils Sequenzen von bis zu etwa 20 Aminosäureresten bedeuten.
IV (29c)
Y-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-
Ile-Gly-Lys-Ile-Y1. .
worin Y und Y1, soweit vorhanden/ jeweils von Sequenzen bis zu etwa 20 Aminosäureresten bedeuten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind besonders interessierende homologe Bereiche des ARV-2-Isolats in dem env~open-Leseraster von etwa den Aminosäureresten Nr. 306 bis etwa 323 kodiert. Sie haben typischerweise die folgende Aminosäuresequenz/ bei der Oligopeptide innerhalb dieser Aminosäuresequenz lineare Epitope innerhalb einer derartigen Sequenz umfassen.
V (177)
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-IIe-Tyr-1Ie-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y1
worin Y und Y1/ soweit vorhanden/ jeweils 1 bis etwa 20 oder mehr Aminosäurereste umfassen. Wenn Y und/oder Y1 vorhanden sind/ können sie 1 oder mehrere Aminosäurereste von Sequenzen/ welche die Aminosäure aste 306 bis 323 der ARV-2-HÜllsequenz flankieren/ oder einen Teil dieser flankierenden Sequenzen umfassen. Insbesondere kann Y die HIV-Hüllaminosäuresequenz etwa von den Resten 299 bis 306 ganz oder teilweise umfassen; Y1 kann die HIV-Hüllaminosäuresequenz etwa von den Resten 324 bis 333 ganz oder teilweise umfassen.
In alternativer W;iise kann man verkürzte Sequenzen der Peptide V herstellen. In dieser Hinsicht sind die folgenden
2 8 O 1 ί
14 Sequenzen besonders brauchbar:
VI (177a)
Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y'; und VII
Ma-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys-Y·
worin Y und/oder Y1/ soweit vorhanden; jeweils Sequenzen von bis zu 20 oder mehr Aminosäureresten bedeuten.
Ein weiteres Beispiel umfaßt homologe Bereiche des LAV-2-Isolats, wie sie beispielsweise im offenen env-Leseraster
.c etwa von den Aminosäureresten 311 bis 330 kodiert sind, ο
Sie besitzen typischerweise die folgende Sequenz:
VIII (110-2-2)
Y-Lys-Thr-Va1-Lys-IIe-Nor-Leu-Nor-Ser-GIy-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y1
worin Y und/oder Y1/ soweit vorhanden/ jeweils Sequenzen von bis zu 20 oder mehr Aminosäurereste bedeuten (siehe Nature 326:662 (1987)/ worauf hiermit Bezug genommen wird).
Gegenstand der Erfindung sind weiter neue Zellinien, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu produzieren, sowie Mittel, die diese Antikörper enthalten. Die Antikörper sind
2 4 in der Lage bei extrem hohen Titern (von 10 bis 10 bis etwa 10 oder mehr) neutralisierende Bereiche, die in einer vorbestimmten Sequenz des Hüllglykoproteins gp110 oder p25 enthalten sind, deren Proteinprekursoren, biologisch exprimierte rekcmbinante Fusionsproteine und syn-
Vt! vi H7
2 8 O ί ί
thetische Peptide, die ein oder mehrere Epitome innerhalb des vorbestimmten Sequenzbereiches von gp110 oder p25 enthalten, selektiv zu erkennen. Die Hybridzellen besitzen ein identifizierbares Chromosom, bei dem sich die Keimbahn-DNA umgeordnet hat, um für einen Antikörper zu kodieren, der eine Bindungsstelle für ein Epitop an gp110 oder p25 aufweist, das einige oder alle klinische HIV-Isolate aufweisen. Diese monoklonalen Antikörper kann man auf vielfältige Weise anwenden. Dazu zählen die Anwendungen in der Diagnose und Therapie sowie die Anwendung zur Identifizierung weiterer kreuz-reaktiver Antikörper, wie blockierende Antikörper. Peptide oder Polypeptide, die das (die) Epitop(e) enthalten, mit dem sie reagieren, finden separate Anwendung als Immunogene für Vakzine oder als therapeutische Mittel.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft/ hauptsächlich zur Anwendung zusammen mit den obigen Peptiden oder neutralisierenden monoklonalen Antikörpern/ weitere Peptide oder Antikörper, die die HIV-Bindung an Rezeptoren stören/ um die HIV-Infektivität weiter zuschwächen. Vorzugsweise kann man die sogenannten "blockierenden Peptide", die in der Lage sind/ die Virusproliferation zu inhibieren/ sowie monoklonale Antikörper/ die spezifisch für Epitope sind/ die in derartigen blockierenden Peptiden enthalten sind/ dazu verwenden/ die Wirksamkeit der Behandlung von HIV-Infektionen zu steigern. HIV-blockierende Peptide entsprechen typischerweise derjenigen HIV-Aminosäuresequenz/ von der man annimmt/ daß sie für die Anlagerung des Virus an eine Wirtszelle wesentlich ist/ beispielsweise die env-kodierten Aminosäurereste etwa 190 bis etwa 197 vonLAVnnM und etwa 185 bis etwa
BKU
192 von ARV-2 und HTLV-IIl(BH-IO). Dazu zählen das Peptid
T-Oktapeptid (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) und dessen verschiedene Derivate (z.B. IX unten) und Analoge (z.B. XI, unten), das von Pert et al (1986, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83:9254-9258/ worauf hiermit Bezug genommen wird) be-
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schrieben ist und das sich auf dem Hüllglykoprotein (gpllO oder 120) befindet.
Von besonderem Interessse sind beispielsweise blockierende Peptide mit den nachfolgenden Sequenzen; wobei vorzugsweise der NH_-Terminus acetyliert und der COOH-Terminus amidiert ist:
IX (173D) Y-.Ala-Ser-ihr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y1;
X (.86) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y';
XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y1 ;
XII (188)
XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y1;
XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y' ;
XV (191) Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y';
worin bei jedem Peptid Y und Y1/ soweit vorhanden, jeweils 25
eine Aminosäuresequenz von bis zu etwa 20 Aminosäuren bedeutet. Epitope oder antigene Determinanten innerhalb dieser Peptide sind typischerwoise durch wenigstens 5 benachbarte Aminosäuren definiert und finden Anwendung beispielsweise für die Nachahmung natürlich vorkommender HIV-Antigen Stellen bei der Herstellung von iJIV-reaktive Antikörpern und Vakzinen.
Die Herstellung monoklonaler Antikörper kann erfolgen, indem man die Expression von Nukleinsäuresequenzen inmrarcalisiert, die für
2 8OiIS
Antikörper kodieren; die spezifisch für HIV sind/ durch Einführung derartiger Sequenzen; typischerweise von für den Antikörper kodierender cDNA/ in einen zur Kultivierung fähigen Wirt. Die immortalisierte Zellinie kann eine solche Säugetierzellinie sein/ die durch Onkogenese,
Transfektion/ Mutation oder dergleichen transformiert wurde. Zu derartigen Zellen zählen Myelomlinien/ Lymphomlinien oder andere Zellinien; die in der Lage sind;die Expression und Sekretion des Antikörpers in vitro herbeizuführen. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommendes Immunoglobulin eines Säugetieres sein/das durch Transformation eines Lymphocyten/ insbesondere eines Splenocyten/ mit Hilfe einas Virus oder mittels Fusion des Lymphocyten mit einer neoplastischen Zelle; beispielsweise einem Myelom; unter Bildung einer Hybridzellinie produziert wird. Typischerweise erhält man den Splenocyten von einem Tier; das gegen das HIV-Virus oder ein Fragment mit einer epitopen Stelle davon immunisiert wurde.
Immunisierungsmethoden sind bekannt; sie können beträchtlich variieren und dennoch wirksam bleiben; siehe Goding; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice; Academic Press; 2. Aufl. (1986); auf das hiermit Bezug genommen wird. Zerstörte Viren; synthetische Peptide und bakterielle Fusionsproteine; die die antigenen Fragmente des gpllO oder p25-Moleküls enthalten/ kann man als Immunogene verwenden. Vorzugsweise wird das Immunogen zerstörter Viren/ Peptide oder rekombinanter Proteine durch Proteine oder Fragmente davon angereichert; welche die Epitope enthalten; wofür Antikörper produzierende B-Zellen oder Splenocyten gewünscht sind. Insbesondere kann man Lösungen; die Lysate oder Extrakte zerstörter Viren enthalten; oder Überstände von biologisch exprimierten rekombinanten Proteinen oder zerstörten Expressionsvektoren durch Glykoproteine wie gewünscht anreichern; wobei man Reinigungsmethoden; wie beispielsweise die Polyacrylamid-Gelelektrophorese; verwendet.
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Die Lektin-Affinitätsreinigung ist eine bevorzugte zweckmäßige Methode zur Reinigung von gpllO und anderen Glykoproteinen; beispielsweise die Affinitätsreinigung unter Verwendung von lentiiem Lektin. Das Ausmaß/ in dem die Glykoproteine aus den Lösungen zur Anwendung als Immunogen gereinigt werden; kann stark schwanken, d.h. von weniger als 50 % bis zu üblicherweise wenigstens 75 bis 95 %, wünschenswerterweise 95 bis 99 % und besonders erwünscht bis zur absoluten Homogenität.
Wenn man die Proteine in dem gewünschten Maß gereinigt hat/ kann man sie in einem zur Immunisierung geeigneten physiologischen Träger suspendieren oder darin lösen oder man kann sie an ein Adjuvans koppeln. Eine bevorzugte Technik umfaßt beispielsweise die Adsorption der Proteine und der Fragmente davon an lentiler Lektinagarose oder einem anderen makromolekularen Träger für die Injektion. Immunogene Mengen antigener Präparate/ die mit HIV-Proteinen/ einschließlich dem gpllO-Glykoprotein und dem p25-Kernprotein/ oder den antigenen Teilen davon angereichert sind/ werden im allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von 1 μg bis 20 mg/kg des Wirtes injiziert. Die Verabreichung kann;beispielsweise durch intramuskuläre/ peritoneale/ subkutane/ intravenöse etc., Injektion erfolgen. Die Verabreichung kann 1 χ oder mehrere Male und üblicherweise in 1- bis 4-wöchigen Intervallen erfolgen. Die immunisierten Tiere kontrolliert man hinsichtlich der Produktion von Antikörpern gegen die gewünschten Antigene/ anschließend entfernt man die Milz/ isoliert die B-Lymphocyten der Milz und fusioniert sie . mit einer Myelomzellinie oder transformiert sie. Die Transformation oder Fusion kann man in üblicher Weise durchführen/ die Fusionsmethode ist in zahlreichen Patenten beschrieben/ beispielsweise in US-PS'en 4 172 124/ 4 350 683, 4 363 799, 4 381 292 und 4 423 147; man vergleiche auch, Kennett et al, Monoclonal Antibodies (1980) und die darin angeführten, sowie Godin wie oben erwähnt; auf alle diese Publikationen wird hiermit Bezug genommen.
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Die immortalisierten Zellinien kann man klonieren und gemäß üblichen Verfahren einem Screening unterziehen. In den Zeilüberständen kann man die Antikörper/ die in der Lage sind; an die gewünschten gpllO oder p25-HIV-Proteine zu binden/ die rekombinanten Fusionsproteine oder die synthetischen Peptide nachweisen/ die den gewünschten epitopen Bereich enthalten. Geeignete immortalisierte Zellinien kann man dann in vitro wachsen lassen oder in die Peritonealkavität eines geeigneten Wirts zur Gewinnung von Ascites-Flüssigkeit injizieren. Weil erfindungsgemäße Antikörper vorliegen/ die als spezifisch für Epitope bekannt sind/ welche beispielsweise innerhalb der Bereiche vorhanden sind/ die durch den LAV -Genombereich von etwa bp6688 bis etwa bp 6750
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(kodierend für Peptid 29) oder von etwa bp7246 bis etwa 7317 (kodierend für Peptid 36) (bp-Numerierung gemäß Wain-Hobson et al./ Cell 44:9 1985/ auf die hiermit Bezug genommen wird)/ kodiert sind/ kann man die Überstände mit den monoklonalen Antikörpern einem kompetitivet. Assay unterziehen. Somit können weitere immortalisierte Hybridom-Zellinien mit den gewünschten Bindungseigenschaften leicht aufgrund der Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen, für ein bestimmtes Antigen spezifischen Antikörper aus einer Vielzahl von Quellen herstellen. Alternativ kann man diese Zellinien mit anderen neoplastischen B-Zellen fusionieren/ wobei diese anderen B-Zellen als Empfänger für die Genom-DNA/ die für die Antikörper kodiert/ dienen kann.
Neoplastische B-Zellen von Nagetieren/ insbesondere Mäusen oder Ratten,sind bevorzugt. Sie könner. jedoch auch von anderen Säugetierspezien stammen/ beispielsweise von Lagomorpha/ Rindern/ Schafen/ Pferden/ Schweinen/ Vögel (Avian) oder dergleichen. Man kann die Immunisierung dieser Tiere auf einfache Weise durchfüiren und ihre Lymphocyt -·η; insbesondere die Splenocyten/ für Fusionen gewinnen.
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Die von den transformierten oder Hybridzellinien sekretiarten monoklonalen Antikörper können von einer der Klassen oder Unterklassen der Immunoglobuline sein; wie IgM/ IgD, IgA, IgG,_4 oder IgE. IgG ist bevorzugt/ weil es sich dabei um den üblichsten Isotyp handelt/ der in Diagnose-Assays verwendet wird. Die monoklonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente/ wie Fv.· Fab/ F(ab')5/ verwendet werden. Sie werden üblicherweise jedoch intakt verwendet.
Um eine mögliche Antigenität eines monoklonalen Antikörpers/ der nicht vom tierischen stammt/ in einem Humanwirt zu umgehen/ kann man chimere Antikörper konstruieren, bei denen das Ant igen-Bindungsf ragrnent eines Immunoglobul inmolekuls (variabler Bereich) mittels einer Pcptidverknupfung von wenigstens einem Teil eines anderen Proteins gebunden ist/ das beim Menschen ni it als fremd erkannt wird/ wie beispielsweise die "cast out portion" eines Humanimmunoglobulinmolekuls. Dies kann dadurch erfolgen/ döfi man die Exone des variablen Bereichs des Tieres mit Human-Kappa- oder -gammaexonen des konstanten Bereichs fusioniert. Hierfür sind dem Fachmann mehrere Methoden bekannt, beispielsweise diejenigen, die in PCT 86/01533, FP-A-171496 und EP-A-173494 beschrieben sind/ auf die hiermit Bezug genommen wird.
Pharmazeutische Formulierungen und Anwendungen
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit neutralisierender Wirkung, beispielsweise diejenigen, die mit einer Epitopstelle auf gpllO oder p25 oder mit einem blockierenden Peptid reagieren, können pharmazeutischen Mitteln als eine Kompc inte einverleibt werden, um HIV-Infektionen zu schwächen. Das Mittel soll eine therapeutische oder prophylaktische Menge von wenigstens einem der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Der pharmazeutische
Träger soll eine kompatible/ nicht-toxische Substanz sein/ die geeignet ist/ die monoklonalen Antikörper an den Patienten zu vermitteln. Man kann steriles Wasser, Alkohol/ Fette/ Wo"hse und inerte Feststoffe als Träger verwenden. Pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien (Puffer/ Dispergiermittel) können den erfindungsgemäßen Mitteln ebenfalls einverleibt werden. Diese Kittel können einen einzelnen monoklonalen Antikörper enthalten/ um beispielsweise spezifisch für HIV-Stämme mit Hüllglykoproteinen zu sein/ die eine Epitopstelle innerhalb eines Bereiches enthalten/ der durch bp6688 bis bp6750 kodiert ist. In alternativer Weise kann ein pharmazeutisches Mittel einen oder mehrere monoklonale Antikörper enthalten und einen "Cocktail" bilden. Beispielsweise ein Cocktail/ der monoklonale Antikörper gegen verschiedene HIV-Stämme enthält/ stellt, ein universell anwendbares Produkt mit therapeutischer oder prophylaktischer Aktivität gegen die meisten klinischen HIV-Isolate dar. Der Cocktail kann monoklonale Antikörper enthalten/ die an HIV-Proteine oder -glykoproteine binden/ die sich von gpllO oder p25 unterscheiden/ wie beispielsweise gp41-Glyhoprotein oder p34-Nuklease/Integrase. Das Molverhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörperkomponenten unterscheidet sich im allgemeinen um nicht mehr als den Faktor 10/ insbesondere um nicht mehr als den Faktor 5 und liegt im allgemeinen bei etwa 1:1-2 pro jeder anderer Antikörperkomponente.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kann man als separat zu verabreichende Mittel einsetzen/ die zusammen mit anderen anti-retroviralen Mitteln/ einschließlich blockierenden Peptiden/ gegeben werden. Der gegenwärtige Stand der Entwicklung anti-retroviraJer Mittel und von Anti-HIV-Mittel ist im einzelnen in Mitsuya et al./ Nature 325:773-778/ 1987 beschrieben/ worauf hiermit Bezug genommen wird.
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Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper/ Peptide und pharmazeutischen Mittel sind insbesondere zur oralen und parenteralen Verabreichung brauchbar. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Mittel parenteral verabreicht/ d.h. subkutan/ intramuskulär oder intravenös. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb auch Mittel zur parenteralen Verabreichung zur Verfügung/ die eine Lösung der monoklonalen Antikörper/ Peptide oder eines Cocktails davon in einem annehmbaren Träger/ vorzugsweise einem wäßrigen Träger/ umfassen. Man kann eine Vielzahl wäßriger Träger einsetzen/ beispielsweise Wasser/ gepuffertes Wasser/ 0/4%-ige Kochsalzlösung,· 0/3%-iges Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei an Teilchen. Die Mittel kann nan mit Hilfe herkömmlicher und bekannter Methoden sterilisieren. Die Mittel können pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten/ wie sie erforderlich sind/ um annähernd physiologische Bedingungen einzustellen/ wie Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffer/ Mittel zur Einstellung der Toxizität und dergleichen/ beispielsweise Natriumacetat/ Natriumchlorid/ Kaliumchlorid/ Calciumchlorid/ Natriumlactat und dergleichen. Die Menge an Antikörper in diesem Formulierungen kann in weitem Umfange variieren/ d.h. von weniger als ungefähr 0/5 Gew.-%; üblicherweise etwa oder wenigstens etwa 1 Gew.-% bis zu 15 oder 20 Gew.-%. Diese Menge wird hauptsächlich im Hinblick auf die Flüssigkeitsvolumina/ Viskositäten und dergleichen/ und vorzugsweise im Hinblick auf die Art der Verabreichung gewählt.
. Ein typisches pharmazeutisches Mittel zur intramuskulären Injektion kann somit 1 ml steriles gepuffertes Wasser ui.d 50 mg monoklonale Antikörper enthalten. Ein typisches Mittel zur intravenösen Infusion kann 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg monoklonale Antikörper enthalten. Methoden zur Herstellung parenteral verabreichbarer Mittel sind bekannt oder dem Fachmann geläufig und sind detailliert beispiels-
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weise in Remington's Pharmaceutical Science/ 15. Aufl.; Mack Publishing Company; Easton7 Pennsylvania (1980) beschrieben; worauf hiermit Bezug genommen wird.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptide kann man zur Lagerung lyophilisieren und vor der Anwendung in einem geeigneten Träger rekonstituieren. Dieses Verfahren hat sich bei üblichen Immunoglobulinen als wirksam erwiesen. Dabei kann man bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutionstechiiiken anwenden. Es ist für den Fachmann ersichtlich; daß die Lyophilisierung und Rekonstitution zu einem unterschiedlichen Grad an Antikörperaktivitätsverlust führen kann (bei herkömmlichen Immunoglobulinen neigen IgM-Antikörper dazu einen größeren Aktivitätsverlust zu erleiden als IgG-Antikörper) und daß daher die angewandte Menge angepaßt werden muß; um den Verlust zu kompensieren.
Die Mittel; die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper; Peptide oder Cocktails davon enthalten; kann man zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen verabreichen. Bei der therapeutischen Verabreichung werden die Mittel einem Patienten; der bereits mit HIV infiziert ist/ in einer Menge verabreicht; die ausreicht/ um die Infektion und die damit verbundenen Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zum Stehen zu bringen. Die Dosis; die man benötigt/ um dies zu erreichen; ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die bei dieser Anwendung wirksamen Mengen richten sich nach der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Immun-
OQ systems des Patienten/ sie liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 200 mg Antikörper pro kg Körpergewicht; wobei Dosierungen von 5 bis 25 mg pro kg üblicherweise zur Anwendung kommen. Da die erfindungsgemäßen Produkte im allgemeinen bei schweren Erkrankungen; d.h. in lebensbedrohenden
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ι wünscht sein/ eine wesentlich größere Menge dieser Antikörper zu verabreichen.
Bei prophylaktischer Anwendung verabreicht man die Mittel/ ι- die die erfindungsgemäßen Peptide/ Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten/ einem Patienten/ der noch nicht mit HIV infiziert ist/ der aber möglicherweise vor kurzem einer derartigen Infektion ausgesetzt war oder angenommen hat/ daß er dieser ausgesetzt war oder einem Risiko unterliegt/ .Φ dem Virus ausgesetzt zu sein. Die prophylaktische Verabreichung dient dazu/ die Widerstandskraft des Patienten gegen eine potentielle Infektion zu stärken oder den Patienten gegen das Virus zu impfen. Eine hierfür geeignete Menge wird als "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Auch bei dieser Anwendung richten sich die genauen zu ver-ο
abreichenden Mengen nach dem Gesundheitszustand und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten/ sie liegen im allgemeinen im Bereich von 0/1 mg bis 25 mg pro kg/ insbesondere 0/5 mg bis 2/5 mg pro kg.
Man kann Einzel- oder Mehrfachverabreichungen der Mittel vornehmen/ wobei die Dosis und das Verabreichungsschema vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die pharmazeutischen Formulierungen sollten in jedem Fall eine Menge an erfindungsgemäßen Antikörpern zur Verfügung stellen/ die
ausreicht/ um den Patienten wirksam zu behandeln.
Darüber hinaus finden die erfindungsgernäßen monoklonalen Antikörper als Target-spezifisches Trägermolekül Anwendung. Ein Antikörper kann an ein Toxin zur Bildung eines Immunotoxins oder an ein radioaktives Material oder Arzneiproduktmittel zur Bildung eines Radiopharmakon oder Arzneimittels gebunden sein. Methoden zur Herstellung von Immunotoxinen und Radiopharmaka sind bekannt (siehe beispielsweise Cancer Treatment
Reports 68:317 (1984))
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Es ist auch möglich/ daß Heteroaggregate aus erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern und Human-T-Zellaktivatoren/ wie monoklonale Antikörper gegen das CD3-Antigen oder gegen den F -I^-Rezeptor an T-Zellen/ Human-T-Zellen oder F - Jf* -aufweisende Zellen (wie K-Zellen oder Neutrophile) in die Lage versetzen; HIV-infizierte Zellen über eine Antikörper abhängige/ zeilvermittelte Cytolyse (ADCC) abzutöten. Derartige Heteroaggregate kann man beispielsweise bilden/ indem man die Anti-HIV-Antikörper mit den Anti-CD3-Antikörpern unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagens N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionat kovalent vernetzt/ wie dies von Karpowsky et al./ J. Exp. Med. 160:1686 (1984) beschrieben ist/ worauf hiermit Bezug genommen wird.
Die erfindungsgemäßen Mittel auf Basis der Peptide alleine können auch therapeutische Anwendung finden/ wobei die Verabreichung zu einer Reduktion oder zur Eliminierung von HIV bei einem infizierten Wirt führt. Diese Mittel/ wie Peptid 29/ die blockierenden Peptide und Peptid 126/ welches in der USSN 930785 beschrieben ist/ auf die hiermit Bezug genommen wird/ kann man in geeigneten physiologischen Trägern intravenös/ subkutan/ intramuskulär/ intraperitoneal usw. verabreichen. Verschiedene Träger sind geeignet/ dazu zählen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung/ Kochsalzlösung/ Wasser/ Kaliumchlorid/ Natriumlactat oder dergleichen. Die Peptidkonzentration kann in einem weiten Bereich in Abhängigkeit von der endgültigen Anwendung/ Aktivität und Art der Verabreichung variieren. Vorzugsweise liegt bei den Peptiden eine Amidierung des COOH-Terminus/ eine Formylierung des NH_-Terminus oder eine andere pharmazeutisch annehmbare Derivatisierung vor. Die Zugabe blockierender Peptide zu den Peptiden/ die einen neutralisierenden HIV-Bereich nachahmen/ und/oder die spezifisch reagierenden erfindungsgemäßen
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Antikörper führen zu einer signifikant erhöhten therapeutischen Wirksamkeit. Die Formulierungen können auch andere Anti-HIV~Mittel enthalten (die von den die Peptide bindenden monoklonalen Antikörper verschieden sind),wie beispielsweise 3'-Azido-3'-deoxythymidin/ 2'/3'-Dideoxycytidin/ 2'/3'-Dideoxy-2'/3'-didehydrocytidin etc.
Anwendung der monoklonalen Antikörper bei der Immuno-
affinitätsreinigung
Die monoklonalen Antikörper/ die spezifisch für Polypeptide sind/ welche gpllO oder andere Antigen-Determinanten enthalten/ insbesondere diejenigen Antigen-Determinanten/ die von biologisch exprimierten rekombinanten Fusionsproteinen oder Lysaten oder Extrakten von kultivierten HIV erhalten wurden/ lassen sich besonders vorteilhaft bei Reinigungsverfahren anwenden. Im allgemeinen haben die Antikörper Affinitätskonstanten (affinity association ο ίο constants) im Bereich von 10 bis 10 M. Derartige Antikörper kann man verwenden zur Reinigung von rekombinanten Fusionsproteinen von dem Kulturmedium des rekombinanten Exrepssionssystems/ wenn das exprimierte Protein sekretiert wird/ oder von den Komponenten des zerstörten/ biologischen Expressionssystems/ wenn das Protein nicht sekretiert wird. Die monoklonalen Antikörper/ die in der Lage sind/ mit gpllO oder anderen Antigen-Determinanten zu reagieren/ werden im allgemeinen an ein Substrat oder einen Träger gebunden oder daran immobilisiert. Die Lösung/ die die HIV-Antigendeterminanten enthält/ wird dann mit dem immobilisierten Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht/ die zur Bildung von Immunkomplexen zwischen dem Antikörper und den die gpllO-Antigen-Determinanten enthaltenden Polypeptiden geeignet sind. Ungebundenes Material wird von den gebundenen Immunkomplexen abgetrennt/ diese
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Komplexe oder die gpllO-Antigenfragmente werden dann vom Träger abgetrennt.
Die monoklonalen Antikörper werden typischerweise bevor sie an den Träger gebunden werden/ von Ascitesflüssigkeit oder Zellkulturüberständen grob gereinigt. Derartige Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt/ dazu zählt die Fraktionierung mit Neutralsalzen bei hoher Konzentration. Weitere Methoden/ wie DEAE-Chromatographie/ GeIfiltrations-Chromatographie/ präparative Gelelektrophorese oder Protein-A-Affinitäts-Chromatographie/ kann man ebenfalls verwenden; um die monoklonalen Antikörper zu reinigen bevor sie als Immunoadsorbens Anwendung finden.
Der Träger/ an den die monoklonalen Antikörper immobilisiert werden/ sollte die folgenden allgemeinen Eigenschaften besitzen :
(a) im allgemeinen schwache Wechselwirkungen mit
Proteinen/ um eine nicht-spezifische Bindungen zu minimieren/
(b) gute Fließeigenschaften; die einen Durchfluß von Materialien mit hohem Molekulargewicht erlauben/
(c) Vorhandensein chemischer Gruppen/ die aktiviert oder modifiziert werden können/ um eine chemische Bindung des monoklonalen Antikörpers zu ermöglichen/
(d) physikalische und chemische Stabilität unter den Bedingungen/ die für die Bindung des monoklonalen Antikörpers Anwendung finden und
(e) Stabilität gegenüber den Bedingungen und Konstituenten der Puffer/ die für die Adsorption und Elution des Antigens erforderlich sind. Einiqe üblicherweise ver-
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wendete Träger sind Agarose# derivatisierte Polystyrole; Polysaccharide/ Polyacrylamidperlen/ aktivierte Cellulose/ Glas und dergleichen. Es gibt verschiedene chemische Methoden/ um die Antikörper an die Substratträger anzuknüpfen/ siehe allgemein Cuatrecasas P./ Advances in Enzymology 36:29 (1972). Die erfindungsgemäßen Antikörper kann man direkt oder in alternativer Weise über ein Bindeglied oder Zwischenstück (linker/ spacer) an dem Träger anknüpfen.
Die für die Immobilisierung monoklonaler Antikörper an chromatographischen Trägern erforderlichen allgemeinen Bedingungen sind bekannt/ siehe beispielsweise P. Tijissen/ 1985/ Practice and Theory of Enzyme Immunoassay/ worauf hiermit Bezug genommen wird. Das tatsächlich verwendete Koppelungsverfahren ist in geringem Maße abhängig von der Eigenschaft und der Art des anzukoppelnden Antikörpers« Monoklonale Antikörper besitzen Eigenschaften/ die üblicherweise von Charge zu Charge konsistent sind/ so daß die erwähnten Bedingungen optimiert werden können. Die Verknüpfung erfolgt typischerweise über kovalente Bindungen.
Zu der Separationsmatrix gibt man dann eine Suspension von Extrakten oder Lysaten von HIV-Viren/ den Überstand von einem kultivierten biologischen Expressionssystem oder eine Suspension der zerstörten Zellen. Man inkubiert die Mischung unter Bedingungen und während einer Zeitdauer/ die zur Bildung des Immunkomplexes ausreichend ist/ üblicherweise wenigstens 30 Min.; zweckmäßiger 2 bis 24 h. Die Immunkomplexe/ die Polypeptide mit antigenen Teilen von gpllO enthalten/ trennt man aus der Reaktionsmischung ab. Man entfernt die Mischung beispielsweise durch Elution und wäscht die gebundenen Immunkomplexe extensiv mit Adsorptionspuffer. Die Immunkomplexe kann man dann von der
Separationsmatrix eluiereri; wobei man ein Eluierungsmittel verwendet/ das mit dem zur Anwendung kommenden Träger verträglich ist. Derartige Eluierungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Auch die Polypeptide; die gpllO oder andere antigene Teile enthalten/ kann man selektiv entfernen. Beispielsweise kann man Peptide/ die ein Epitop enthalten/ das durch die Antikörper erkannt wird/ dazu verwenden/ um um die Antikörperbindungsstellen zu konkurrieren. Dies stellt ein alternatives Elutionsverfahren dar/ das unter milden Elutionsbedingungen durchgeführt werden kann. Das selektiv adsorbierte Polypeptid/ das das ςρΙΙΟ-Antigen enthält/ kann man von einem Antikörper-Affinitätsadsorbens eluieren/ indem man den pH und/oder die Ionenstärke des Puffers ändert. Chaotrope Mittel finden ebenfalls Anwendung zur Entfernung des gebundenen Antigens. Die Wahl eines chaotropen Mittels/ dessen Konzentration und der Eluierungsbedingungon hängen von den Charakteristika der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung ab/ aber sobald sie festgelegt sind/ sollten sie keinen Änderungen unterworfen werden/ die üblicherweise bei polyklonalen Affinitäts-Separations-Systemen erforderlich sind.
Es kann erforderlich sein/ den pH-Wert des eluierten Materials an den physiologischen pH-Wert anzupassen/ wenn ein hoher oder niedriger pH-Wert oder Ionenstärkepuffer verwendet wurden/ um die gebundenen gpllO-Antigene von der Separationsmatrix abzutrennen. Auch eine Dialyse oder eine Gelfiltrations-Chromatographie kann zur Entfernung überschüssiger/ im Eluierungsmittel verwendeter Salze erforderlich werden/ um die Rekonstitution von gpllO oder von Polypeptiden/ die Antigenfragmente von gpllO enthalten/ zu nativen Konformationen zu ermöglichen.
Die erfindungsgemäfien Verfahren ergeben beispielsweise im wesentlichen reines gpllO oder im wesentlichen reine PoIypeptide/ die Antigenfragmente davon enthalten/ hergestellt
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entweder auf natürliche Weise durch infizierte Zellkulturen oder rekombinante Expressionssysteme von Bakterien/ Hefen oder in Kultur gehaltenen Insekten oder Säugetierzellen. gpllO; die Fragmente davon oder andere gereinigte Proteine besitzen typischerweise eine Reinheit von mehr als 50 %; üblicherweise von wenigstens 75 % und häufig von mehr als 95 bis 99 %. Diese Produkte finden vielfältige Anwendung.
Die HlV-gpllO-Proteine, die Polypeptide/ die Antigenfragmente davon enthalten oder andere Proteine/ die im wesentlichen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wurden/ haben viele Anwendungsmöglichkeiten. Dazu zählen AIDS-Subunit-Vakzinformulierungen/ bei denen das Immunogen eine wirksame Dosis an Antigen-Determinanten von beispielsweise gpllO oder einem neutralisierenden Bereich davon umfaßt. Zu weiteren Komponenten der Formulierung können diejenigen antigenen Teile von HIV-Proteinen oder -Glykoproteinen zählen/ die die Produktion von Antikörpern(vorzugsweise neutralisierenden Antikörpern) in einem immunisierten Wirt stimulieren/ wobei diese Antikörper in der Lage sind/ eine Schutzwirkung gegen eine nachfolgende HIV-Infektion auszuüben.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind auch für Diagnosezwecke brauchbar. Sie können hierfür markiert oder unmarkiert zur Anwendung kommen. Typischerweise umfaßt ein Diagnose-Assay den Nachweis einer Komplexbildung durch die Bindung eines monoklonalen Antikörpers an ein HIV-Antigen.
Unmarkierte Antikörper finden beispielsweise in Agglutinations-Assays Anwendung. Darüber hinaus können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (aweiten Antikörpern)/die mit den monoklonalen Antikörpern reaktiv sind/ wie beispielsweise Antikörper/ die spezifisch
gg für Immunoglobu.lin sind/ eingesetzt werden. In alternativer Weise können die monoklonalen Antikörper direkt markiert
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werden. Man kann eine Vielzahl von Markierungsmitteln einsetzen/ beispielsweise Radionukleide/ fluoreszierende Substanzen/ Enzyme/ Enzymsubstrate/ Enzymkofaktoren; Enzyinnibitoren/ Liganden (insbesondere Haptene) etc. Zahlreiche Arten von Immunoassays stehen zur Verfügung/ dazu zählen beispielsweise diejenigen/ die in den US-PSen 3 817 ö27,
3 850 752, 3 901 654, 3 935 074/ 3 984 533, 3 996 345;
4 034 074 und 4 098 876 beschrieben sind, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Üblicherweise verwendet man die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptide in En ym-Immunoassays, wobei beispielsweise die erfindungsger.iäßen Antikörper oder die zweiten Antikörper einer anderen Spezies an ein Enzym konjugiert werden. Wenn man eine biologische Probe mit HIV-Antigenen, wie Humanblutserum, Speichel, Samen, Vaginaloekretionen oder eine Virus-infizierte Zellkultursuspension, mit den Antikörpern kombiniert, erfolgt eine Bindung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen/ die das gewünschte Epitop aufweisen. Man kann dann derartige Proteine oder
Virustei1jhen von den ungebundenen Reagentien abtrennen und einen zweiten Antikörper (mit einem Enzym markiert) zuqeben. Anschließend wivd die Anwesenheit des Antikörper-Enzykonjugats/ das spezifisch an das Antigen gebunden ist/ bestimmt. Man kann auch weitere herkömmliche/ dem Fachmann bekannte Verfahren verwenden.
Zum Nachweis einer HIV-Infektion oder der Anwesenheit von HIV-Antigenen kann man auch Kits unter Anwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Verfügung stellen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperzusammensetzungen kann man/ üblicherweise in lyophilisierter Form entweder allein oder zusammon mit weiteren Antikörpern/ die spezifisch für andere HIV-Epitope sind, zur Verfügung stellen. Die Antikörper, die an ein Markierungsmittel konjugiert sein oder unkonjugiert vorliegen können, sind in den Kits zusammen mit Puffern, wie
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Tris-/ Phosphat-; Carbonatpuffer etc./ Stabilisierungsmitteln/ Bioziden; inerten Proteinen/ wie Rinderserumalbumin oder dergleichen enthalten. Im allgemeinen liegen diese Materialien in einer Menge von weniger als etwa 5 Gew.-%/ bezogen auf die Menge an aktivem Antikörper und üblicherweise in einer Gesamtmenge von wenigstens etwa 0/001 Gew.-%/ bezogen auf die Antikörperkonzentration/ vor. Es ist häufig wünschenswert/ einen inerten Extender oder Excipienten zur Verdünnung der aktiven Bestandteile zuzugeben/ wobei der Excipient in einer Menge von etwa 1 bis 99 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung vorliegen kann. Wenn ein zur Bindung an die monoklonalen Antikörper fähiger zweiter Antikörper eingesetzt wird/ liegt dieser üblicnerweise in einem separaten Vial vor. Der zweite Antikörper ist typischerweise an ein Label konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebener. Ant ikörpei;formul ierungen formuliert.
Der Nachweis von gpllO- oder p25-Antigenen oder des Ganzvirus in biologischen Proben findet bei der Diagnose einer HIV-Virusinfektion Anwendung. Zu biologischen Proben zählen/ ohne darauf begrenzt zu sein/ Blutserum/ Speichel/ Samen/ Gewebebiopsieproben (Gehirn/ Haut/ Lymphknoten/ Milz etc.)/ Zellkulturüberstände; zerstörte eukaryontische und bakterielle Exp "essionssysteme und dergleichen. Auf die Anwesenheit des Virus testet man/ indem man die monoklonalen Antikörper mit der bioloyischen Probe unter Bedingungen inkubierli/ die zu einer Immunkomplexbildung führen und man anschließend die Komplexbildung nachweist. Gemäß einer Ausführungsform weist man die Komplexbildung durch die Anwendung eines zweiten Antikörpers nach/ der in der Lage ist/ an einen monoklonalen Antikörper zu binder;/ welcher typischerweise an ein Markierungsmittel konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert ist. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der monoklonale Antikörper an einen Fest-
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phasenträger gebunden/ der dann mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Nach der Inkubierung wird der markierte monoklonale Antikörper zugegeben/ um das gebundene Antigen nachzuweisen.
HErstellung und Anwendung synthetischer Peptide
Die Erfindung stellt; auch neae Peptide zur Verfügung/ die unter anderem immunologisch die Prcteinepitope nachahmen/ die durch das HIV-Retrovirus kodiert sind/ insbesondere die Epitope/ die innerhalb der env- oder gag-Bereiche des Virusgenoms kodiert sind/ welche für die gpllO oder p25 kodieren. Zur Anpassung an die unterschiedlichen Verhältnisse von Stamm zu Stamm bei den jeweiligen Isolaten ka .i man eine Anpassung bezüglich konservativer Substitutionen und eine Auswahl unte' Alternativen mit nicht-konservativen Substitutionen vornehmen. Diese Peptide kann man/ um die HIV-Antigenproduktion in vitro oder in vivo zu inhibieren oder el iminieren, als Immunccjene für den Nachweis des Virus oder von Antikörperr. gegen das Virus in einer physiologischen Probe einsetzen. In Abhängigkeit von der Art des Schemas kann man die Peptide an einen Träger oder an andere Verbindungen konjugieren/ die markiert oder unmarkiert/ an eine feste Cberfläche gebunden etc. vorliegen.
Gemäß einer Ausführungsform stammen die erfindungsgemäßen Peptide von dem gp]10-Bereich des Virus. Von besonderem Interesse ist der Bereich innerhalb des env-open-Leserasters der sich etwe vom Basenpaar (bp) 6688 bis etwa bp6750 und etwa vom hp724t> bis etwa 7317 erstreckt. Die hier interessierenden Peptide/ einschließlich blockierender Peptide, umfassen wenigsten:- 5/ manchmal 6, manchmal 8/ manchmal 12, manchmal 21, häufig weniger als etwa 50, insbesondere weniger ils etwa !5 und vorzugsweise weniger als etwa 25 Aminosäuren in einer Sequenz, die durch ein HI V-Retrov.vrus kodiert ist.
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Wünschenswerterweise sind die Peptide so klein wie möglich/ enthalten aber dennoch im wesentlichen die gesamte Immunoreaktivität oder antivirale Aktivität eines größeren Peptids. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein/ zwei oder mehrere nicht-überlappende Oligopeptide zu verbinden/ um eine einzige Peptidstruktur zu bilden/ oder sie als einzelne Peptide gleichzeitig zu verwenden/ wobei diese Peptide separat oder zusammen eine äquivalente Sensibilität des Ausgangsmaterials besitzen.
Die Peptide kann man durch Einführen konservativer oder nicht-konservativer Substitutionen modifizieren/ wobei im allgemeinen weniger als 20 %-Punkte, insbesondere weniger als 10 %-Punkte der Aminosäuren ausgetauscht werden. Wenn polymorphe Bereiche vorliegen/ kann es wünschenswert sein/ eine oder mehrere bestimmte Aminosäuren zu ändern/ um die unterschiedlichen Epitope der verschiedene Retrovirusstamme wirksamer nachahmen zu können. Häufig wird man Methionin durch Norleucin (Nor) ersetzen/ um eine chemische Stabilität zu erzielen.
Es ist darauf hinzuweisen/ daß das erfindungsgemäß zur Anwendung kommende Peptid nicht mit einer bestimmten HIV-PoIypeptidsequenz identisch sein muß/ solange die in Rede stehende Verbindung in der Lage ist/ eine immunologische Kompetition mit den Proteinen von wenigstens einem Stamm des HIV-Retrovirus herbeizuführen. Die in Rede stehenden Peptide können deshalb auf vielfältige Weise geändert werden/ beispielsweise durch Insertionen/ Deletionen und Substitutionen in konservativer oder nicht-konservativer Weise/ wenn derartige Änderungen Anwendungsvorteile nach sich ziehen. Mit einer konservativen Substitution sind Substitutionen gemeint/ innerhalb der Gruppen/ wie gly/ ala; val/ ile leu; asp/ glu; asn, gin; ser> thr; lys/ arg; phe/ tyr; und nor, met. Üblicherweise unterscheidet sich die Sequenz um nicht mehr als 20 % von der Sequenz wenigstens eines Stammes eines HIV-Retrovirus/ außer wenn weitere Aminosäuren an den beiden
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Termini hinzugefügt werden können/ um einen "Arm" zur Verfügung zu stellen/ mit Hilfe dessen das erfindungsgemäße Peptid in einfacher Weise immobilisiert werden kann. Die Arme sind üblicherweise wenigstens eine Aminosäure lang und können 50 oder mehr Aminosäuren/ häufiger 1 bis 10 Aminosäuren/ lang sein.
Das Peptid/ dessen Aminosäuresequenz durch Substitution/ Addition oder Deletion von Aminosäureresten modifiziert ist/ sollte im wesentlichen die gesamte Immunoreaktivität oder antivirale Aktivität der unmodifizierten Peptide beibehalten. Dies kann auf einfache Weise anhand verschiedener/ hier beschriebener Assays bestimmt werden. Gewünschtenfalls kann man das d-Isomer einer oder mehrerer Aminosäuren verwenden/ um die biologischen Eigenschaften/ wie die Aktivität/ Abbaurate und dergleichen/ zu modifizieren.
Darüber hinaus kann man eine/ zwei oder mehrere Aminosäuren zur leichteren Verbindung der Peptide aneinander an die Termini eines Oligopeptids oder Peptids anfügen und zwar zur Kopplung an einen Träger oder ein größeres Peptid/ aus den nachfolgend erläuterten Gründen/ zur Modifizierung der physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids oder dergleichen.
Aminosäuren/ wie Tyrosin/ Cystein/ Lysin/ Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder dergleichen/ kann man an C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligopeptids einführen/ um eine geeignete Funktionalität zur Verknüpfung zu schaffen.
Cystein ist besonders bevorzugt zur Erleichterung einer kovalenten Bindung an andere Peptide oder zur Bildung von Polymeren durch Oxidation.
Darüber hinaus können sich die Peptid- oder Oligopeptidgg Sequenzen von der natürlichen Sequenz durch eine Sequenz
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2 8 O Ι ί
unterscheiden; die durch terminale NH^-Acylierung/ beispielsweise Acetylierung oder Amidierung mit Thioglykolsäure/ terminale Carboxyamidierung; beispielsweise mit Ammoniak oder Methylamin, modifiziert sind/ um eine bessere Stabilität/ erhöhte Hydrophobizität für eine Verbindung mit oder Bindung an einen Träger oder ein anderes Molekül oder für eine Polymerisation zu erzielen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der oben beschriebenen Peptide I bis VIII und IX bis XV/ wenn Y oder Y1 vorhanden sind/ liegt beispielsweise dann vor/ wenn Y oder Y1 einen oder mehrere Cysteinreste oder eine Kombination von einem oder mehreren Cysteinresten mit Spacer-Aminosäuren umfassen. Glycin ist ein besonders bevorzugter Spacer. Bevorzugte Peptide zur Anwendung bei der oxidativen Polymerisation sind diejenigen.· bei denen Y oder Y1 wenigstens zwei Cysteinreste bedeuten. Wenn zwei Cysteinreste am gleichen Ende des Peptids vorhanden sind/ liegt eine bevorzugte Ausführungsform dann vor/ wenn die Cysteinreste durch 1 bis 3 Spacer-Aminosäurereste/ vorzugsweise Glycin, getrennt sind. Die Anwesenheit von Cysteinresten kann die Bildung von Peptiddimeren ermöglichen und/oder die Hydrophobizität des erhaltenen Peptids erhöhen/ was die Immobilisierung des Peptids an Festphasen- oder immobilisierten Assaysystemen erleichtert.
Von besonderem Interesse ist der Gebrauch der Mercaptangruppen der zur Acylierung der terminalen Aminogruppen verwendeten Cysteine oder Thioglykolsäuren oder dergleichen zur Verknüpfung von zwei Peptiden oder Oligopeptiden oder Kombinationen davon über eine Uisulfidbrücke oder eine längere Brücke/ um Polymere zu bilden/ die eine Reihe von Epitopen enthalten. Derartige Polymere besitzen den Vorteil einer verstärkten immunologischen Reaktion. Wenn unterschiedliche Peptide zur Herstellung des Polymers verwendet werden/ besitzen sie zusätzlich die Fähigkeit/ Antikörper
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2 8 O ! !
zu induzieren/ die mit einigen Antigen-Determinanten verschiedener HIV-Isolate immuno-reagieren.
Für die Bildung antigener Polymere (synthetische Multimere) kann man Verbindungen mit bis-Haloacetylgruppen/ Nitroarylhalcgenide oder dergleichen einsetzen; wobei die Reagentien spezifisch für Thiogruppen sind. Die Verknüpfung zwischen zwei Mercaptogruppen von verschiedenen Peptiden oder Oligopeptiden kann somit eine Einfachbindung oder ein Bindeglied von wenigstens 2 / üblicherweise wenigstens 4 und nicht mehr als etwa 16/ üblicherweise nicht mehr als etwa 14 Kohlenstoffatome sein.
Die hier in Rede stehenden Peptide kann man gebunden an einen löslichen makromolekularen Träger (beispielsweise nicht weniger als 5 kDal) einsetzen. Zweckmäßigerweise ist der Träger eine natürlich vorkommende oder synthetische Poly(aminosäure) gegen die Antikörper im Humanserum unwahrscheinlich sind. Beispiele derartiger Träger sind Poly-L-Lysin/ Keyhole-Limpet-Hemocyanin/Thyroglobulin/ Albumine/ wie Rinderserumalbumin/ Tetanustoxoid etc.. Die Wahl des Trägers ist zur Hauptsache abhängig vom beabsichtigten Anwendungszweck für das Antigen und richtet sich nach der Zweckmäßigkeit und Verfügbarkeit des Trägars. Bei derartigen Konjugaten liegt wenigstens 1 Molekül wenigstens eines Peptids pro Makromolekül und nicht mehr als 1 pro 0/5 kDal/ üblicherweise nicht mehr als etwa 1 pro 2 kDal des Makromoleküls/ vor. Man kann 1 oder mehrere unterschiedliche Peptide an das gleiche Makromolekül binden.
Die Verbindung erfolgt in üblicher Weise unter Verwendung von Reagentien/ wie p-Maleimidobenzoesäure/ p-Methyldithiobenzoesäure/ Maleinsäureanhydrid/ Bernsteinsäureanhydrid/ Glutaraldehyd etc. Die Bindung kann am N-Terminus/ C-Terminus oder zwischen den Enden des Moleküls erfolgen.
2 3 0
Das Peptid kann man durch Verknüpfung derivatisieren/ kann während es an einem Träger gebunden ist, verknüpft werden oder dergleichen.
Um die Anwesenheit von Antikörpern gegen retrovirale Proteine oder von retroviralen Proteinen selbst nachzuweisen,kann man nach verschiedenen, dem Fachmann geläufigen Assay-Verfahren vorgehen. Von besonderem Interesse ist es, das Peptid als markiertes Reagens zu verwenden, wobei das Markierungsmittel ein nachweisbares Signal liefert, oder das Peptid direkt oder indirekt an eine Oberfläche zu binden, wobei der Antikörper gegen das Peptid in der Probe an das Peptid an der Oberfläche gebunden wird. Die Anwesenheit eines Human-Antikörpers, der an das Peptid gebunden ist, kann dann unter Verwendung eines xenogenen Antikörpers, der spezifisch für Humanimmunoglobulin, normalerweise sowohl Human-IgM als auch IgG, ist oder eines markierten Proteins erfolgen, das spezifisch für Immunkomplexe ist, beispielsweise der Rf-Faktor von S. Aureus-Protein-A.
Ein Beispiel für ein Assay-Verfahren ist die Verwendung eines Probenbehälters, beispielsweise die Vertiefungen von Mikrowellplatten, wobei das Polypeptid oder die Konjugate davon am Boden und/oder an den Wänden des Behälters kovalent oder nicht-kovalent adsorbiert sind. Die Probe, normalerweise Humanblut oder -serum, verdünnt mit einem geeigneten Puffermedium, gibt man in den Behälter und läßt ausreichend Zeit vergehen bis die Komplexbildung zwischen dem (den) Polypeptid(en) und einem entsprechenden Antikörper in der Probe erfolgt ist. Man entfernt den überstand und wäscht den Behälter zur Entfernung von nicht-spezifisch gebundenen Proteinen. Zum Nachweis verwendet man ein markiertes spezifisch bindendes Protein, das spezifisch an den Komplex bindet, wie beispielsweise xenogenes Antiserum gegen Humanimmunoglobulin.
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Das Peptid kann auf vielfältige Weise hergestellt werden. Das Peptid kann aufgrund seiner relativ geringen Länge in Lösung oder an einem festen Träger gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisiergeräte sind im Handel erhältlich und können in bekannter Weise angewendet werden/ siehe beispielsweise Stewart und Young/ Solid Phase Peptide Synthesis/ 2. Aufl./ Pierce Chemical Co./ 1984; und Tarn et al./ J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6442.
In alternativer Weise kann man von der Hybrid-DNA-Technologie Gebrauch machen/ bei der man ein synthetisches Gen unter Anwendung von Einzelsträngen, welche für das Polypeptid kodieren,oder von im wesentlichen Komplementärsträngen davon herstellt, wobei die Einzelstränge überlappen und in einem annealing - Medium zusammengebracht werden können, um zu hybridisieren. Die hybridisierten Stränge kann man dann zu einem vollständigen Gen ligieren und das Gen durch Wahl geeigneter Termini in heute leicht erhältlichen Expressionsvektoren insertieren, siehe beispielsweise Maniatis et al./ Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH/ Cold Spring Harbor Laboratory/ 1982. Oder man kann den Bereich des viralen Genoms/ der für das Peptid kodiert durch herkömmliche rekombinante DNA-Techniken klonieren und exprimieren (siehe oben Maniatis et al.).
DNA-Codesequenzen von LAV und ARV 2-Isolaten von HIV/
BKU
die zur Expression der Peptide verwendet werden können/ umfassen die folgenden: 30
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LAV TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGT
ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ΑΤΑ AGA AAA GCA CAT TGT
Zur Expression von Peptidfragmenten kann man Fragmente einer Sequenz verwenden. Man kann konservative Basenänderungen/ wobei der (die) modifizierte Kodon(s) für die gleiche Aminosäure(n) kodiert (kodieren)/ oder nicht
konservative Basenänderungen in der Kodierungssequenz durchführen; wobei die erhaltene Aminosäure eine konservative oder nicht-konservative Änderung in der Aminosäuresequenz sein kann/ was oben beschrieben wurde.
Die Codesequenz kann am 5'- oder 3'-Terminus oder an beiden verlängert werden/ um das Peptid zu verlängern/ jedoch unter Beibehaltung der epitopen Stelle(n). Die Verlängerung kann dazu dienen/ einen Arm zur Anknüpfung beispielsweise an ein Markierungsprodukt/ wie ein Enzym/ zu schaffen/ zwei oder ^° alle Peptide zusammen in der gleichen Kette zu verbinden/ Antigen-Aktivität und geeignete Restriktionsstellen zum Klonen zur Verfugung zu stellen oder dergleichen.
Die DNA-Sequenz selbst/ die Fragmente davon oder größere Sequenzen/ üblicherweise wenigstens 15 Basen/ vorzugsweise wenigstens 18 Basen(kann man als Nukleotidsonden zum Nachweis von retroviraler RNA oder proviraler DNA oder zur Identifzierung homologer Regionen für das Klonieren oder Sequenzieren verwenden.Es sind zahlreiche Methoden beschrieben/ wie die Grunstein-Hogness-Methode/ Southern-Methode/
Northern-Methode-, Dot-blot/ Verbesserungen davon sowie andere Methoden/ wie diejenigen; die in der US-PS 4 358 535, worauf hiermit Bezug genommen wird, beschrieben sind.
Die erfindungsgemäßen Peptide, einschließlich der blockierenden Peptide und ihre Analoga finden allein oder in Kombination in Vakzinen Anwendung. In ähnlicher Weise kann man in Vakzinen auch anti-idiotype Antikörper verwenden, d.h. Antikörper, die mit dem Idiotypen der erfindungsgemäßen Antikörper reagieren und dabei Epitope enthalten, die die neutralisierenden HIV-Bereiche nachahmen. Die Peptide oder anti-idiotypen Antikörper kann man in herkömmlicher Weise formulieren, im allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von 1 pg bis 20 mg/kg des Wirts.
Physiologisch annehmbare Medien kann man als Träger verwenden, beispielsweise steriles Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und dergleichen. Man kann Adjuvantien einsetzen, wie Aluminiumhydroxidgel, grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronicpolyole, Polyanionen, Peptide, Proteine (z.B. Diphtherie und Choleratoxin) und Ölemulsionen. Die Peptide kann man zur Anwendung in Vakzinformulierungen auch Liposomen einverleiben oder an Polysaccharide, Polypeptide oder Polymere konjugieren. Die Verabreichung kann durch Injektion erfolgen, beispielsweise intramuskulär, peritoneal, subkutan, intravenös etc. Die Verabreichung einer immunogen wirksamen Dosis kann einmal oder mehrfach erfolgen, üblicherweise in Zeitabständen von 1 bis 4 Wochen. Eine "immunogen wirksame Dosis" ist diejenige Menge eines Vakzins, die geeignet ist, eine Immunantwort in einem Wirt auszulösen, wobei der Wirt eine gesteigerte Infektion zeigt.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen
35
2 3
Erzeugung und Charakterisierung der monoklonalen Antikörper 5
Beispiel I beschreibt die Erzeugung von Hybridzeilinien/ die monoklonale Antikörper produzieren/ welche spezifisch für HIV-Hüllglykoproteine sind. Dieses Verfahren umfaßt die Anwendung von Lektin-gereinigten Extrakten von LAV ,
das an lentile Lektinagarose als Immunogen gebunden ist.
Die anschließend durch die Hybridzeilinien erzeugten monoklonalen Antikörper sind charakterisiert durch ihre Fähigkeit gpllO aus gereinigtem LAV zu immunoblotten und in einem Radioimmun-Assay zu präzipitieren sowie als biologisch exprimiertes rekombinantes Fusionsprotein. Die monoklonalen Antikörper/ die an die Epitope an gpllO binden/ reagieren auch in ELISA's mit zerstörten ganzen Viren/ Fusionsproteinen und synthetischen Peptiden und reagieren
mit ganzen Viren in indirekten Fluoreszenz-Assays. 20
Die Erzeugung der monoklonale Antikörper produzierenden Hybridzeilinien und die Charakterisierung der Antikörper erfolgen folgendermaßen:
LAV-Viren, die von infizierten CEM-Zellen (ATCC Nr. CRL 8904) gereinigt waren/ wurden in 50 rnM Tris/ pH 7;4/ 0/15 M NaCl/ 1,0 % Aprotinin, 2,0 % Nonidet P-40^ (NP-40) (Octylphenoxypolyethoxyethanol) zerstört. Der Extrakt wurde 2 χ durch Zentrifugieren geklärt und auf 0;5 % NP--40 durch
SQ Zugabe von 3 Volumina Disruptionspuffer ohne NP-40 eingestellt. Lentile Lektinsepharose (Pharmacia/ Piscataway/ N.J.) wurde in Disruptionspuffer ohne NP-'O vorgewaschen und anschließend in Adsorptionspuffer (50 mM Tris/ pH 7/4/ 0,15 M NaCl., 1,0 % Aprotinin, 0,5 % NP-40) äquilibriert.
Der geklärte Virusextrakt wurde mit lentiler Lektin-
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sepharose 42 h bei 4CC adsorbiert. Unadsorbiertes Material wurde durch Waschen mit überschüssigem Adsorptionspuffer entfernt. Die Eluierung des adsorbierten Materials erfolgte mit 0/2 M öc^-Methylmannosid in Adsorptionspuffer. Das Eluat wurde gegen PBS zur Entfernung des Zuckers dialysiert und das Material wurde erneut an lenliler Lektirsepharose adsorbiert.
Der Glykoprotein-lentile Lektinsepharose-Komplex wurde dazu verwendet; BALB/c-Mäuse mittels drei intraperitonealen Injektionen ohne Adjuvans; die in Abständen von 2 bis 3 Wochen gegeben wurden, zu immunisieren» Die Milz der immunisierte! Mäuse wurde entfernt. Es zeigen sich mittels Immunoblot-RIP und/oder ELISA zirkulierende Antikörper gegen Glykoproteine.
Zur Erzeugung von Zellinien arbeitete man im allgemeinen nach den Vorschriften von Kohler und Milstein (Nature 256:495 (1985)) mit den Modifizierungen von L.C. GoIdstein et al., (Infect. Immun. 38:273 (1982);. Die B-Lymphocyten der Milz aus den immunisierten Mäusen wurden mit NS-I-Myelomzellen unter Verwendung von 40 % (W/V) Polyethylenglykol fusioniert. Im Anschluß an die Fusionierung wurde die Zellmischung erneut in HAT-Medium (RPMI-1640
-4 ergänzt mit 15 % fötalem Kälberserum, 1 χ 10 M Hypoxanthin, 4 χ 10" M Amin^pterin und 1,6 χ 10~ M Thymidin) suspendiert, um für das Wachstum der Hybridzellen zu selektieren und anschließend auf 96-Well-Mikrokulturplatten bei einer Konzentration von 1 bis 3 χ 10 Zellen/ml gegeben und bei 370C in einer feuchten Atmosphäre, die 6 % C0_ enthält, inkubiert. Die Kulturen wurden ernährt, indem die Hälfte des Ub:?rstandes durch frisches HAT-Medium ersetzt wurde. Die Vertiefungen (wells) wurden unter Verwendung eines Planktonmikroskops auf Anzeichen von ZeIlproliferation beobachtet und sobald die Zellen eine aus-
2 8 ο : ι a
reichende Dichte besaßen, wurden die Überstände auf Anti-LAV-Antikörper getestet.
Diejenigen Wells, die Antikörper gegen LAV produzierende Hybridzellen enthalten, wurden durch ELISA's identifiziert, wobei die Bindung an gereinigte, zerstörte Ganzviren, odeu biologisch exprimierte Fusionsproteine bestimmt wurde. Die ELISA-Assays unter Anwendung zerstörter Viren wurden an LAV EIA-Platten (Genetic Systems, Seattle, Washington) durchgeführt. Die Platten wurden mit Zellkulturflüssigkeit bei 37°C 45 Min. inkubiert und anschließend 3 χ mit 0,05 % Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS-Tween) gewaschen.
Peroxidase-Ziege-Anti-Maus-IgG (1:2.000 Verdünnung in PBS-Tween; Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, California) wurde zugegeben (100 μι pro Well) und die Platten wurden 45 Min. bei 37°C inkubiert und wie oben gewaschen. Es wurde Substrat zugegeben (0,025 M Zitronensäure, 0,05 M dibasisches Natriumphosphat, pH 5, enthaltend 14 mg o-Phenylendiamin und 10 \i\ 30%-iges Wisserstoffperoxid pro 50 ml) und die Platten wurden 30 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 3 N Schwefelsäure gestoppt und die kolorimetrischen Reaktionen wurden mit einem automatischen Mikroplattenlesegerät quantitativ bestimmt. Diejenigen Vertiefungen, die positive Ergebnisse erbrachten, wurden durci. Grenzveraünnung subkloniert, erneut auf Spezifität getestet und anschließend expandiert.
Die von den daraus resultierenden Hybridzellinien sekretierten monoklonalen Antikörper wurden weiterhin hinsichtlich Spezifität und Reaktivität mittels Irnmunoblotting, Immunopräzipitat ion und ELISA unter Anwendung zerstörter LAV-Viren, rekombinanter LAV-Fusionsproteine und synthetischer LAV-
3g Peptide charakterisiert. Es zeigte sich, daß andere Antikörper vom IgG,-Isotyp waron. Die Zellinien HIV-gpllO-1,
2 3 0
HIV-gpllO-2 und HIV-gpllO-3 wurden bei der Amercian Type
Culture Collection vor Einreichen dieser Anmeldung hinterlegt und haben die Hinterlegungs-Nrn. ATCC HB 9175/ HB9176 und HB9177 erhalten
5
Die auf ihre Reaktivität getesteten rekombinanten Fusionsproteine wurden als ENV2, ENV3/ ENV4 und ENV5 bezeichnet. Das Protein ENV2 wird aus pENV2 (ATCC Nr. 53071) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich vom Basenpaar (bp) 6598 bis bp /178 (Numerierung gemäß Wain-Hobson et al., Cell 44:9 (1985). ENV3 wird aus pENV3 (ATCC Nr. 53072) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich von bp 7178 bis bp 7698. ENV4 wird aus pENV4 (ATCC Nr. 53073) exprimiert und umfaßt bp7698 bis bp 8572. ENV5 wird aus pENV5 (ATCC Nr. 53074) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich von bp 5889 bis bp 7698. Die Produktion der rekombinanten Fusionsproteine ist detailliert in der USSN 721 237 beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird.
Assembly synthetischer Peptide
Die Peptide I (29) und VIII (110-2-2) wurden an einem Benzhydrylaminharz (Polystyrol/Divinylbenzol (Applied Biosystems; Inc., Foster City, California) zusammengebaut.
Peptid V (177) wurde an einem t-Butyloxycarbonyl(Boc)-ethylbenzylcystein-phenylacetamidomethyl-(PAM)-polystyrol/ divinylbenzolharz zusammengebaut. Kopplungen mit symmetrischem Anhydrid wurden in einem Applied Biosystems 430A-Synethisiergerät durchgeführt. Cystein wurde als erster Rest den beiden Peptiden zugegeben.
Kopplungen mit Dicyclohexylcarbodiimid in Anwesenheit von Hydroxylbenzotriazol wurden für Asparagin und Glutamin verwendet. Als Schutzgruppen kamen Seitenketten auf Benzylgg gruppenbasis und Boc- <Xy- Am ing r upper» zur Anwendung. Weitere
fi i; :
i; rt f. I
2 3 O M
routinemäßig eingesetzte Seitenkettenschutzgruppen waren Boc(Formyl)-tryptophan/ Boc-Methioninsulfoxid/ Boc(tosyl)-arginin/ Boc(methylbenzyl)cystein/ Boc(tosyl)-histidin/ Boc(chlorbenzyloxycarbonyl)lysin und Boc(brombenzyloxycarbonyl)tyrosin.
Die Radiomarkierung der Peptide erfolgte durch Acetylierung des Aminoterminus mit Η-Essigsäure und einem Überschuß an Dicyclohexylcarbodiimid.
Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte gemäß dem Tarn "low-high" HF-Verfahren (Tarn et al/ siehe oben). Die Extraktion vom Harz wurde mit 5%-iger Essigsäure durchgeführt und der Extrakt wurde einer GeIfiltrations-Chromatographie in 5%-iger Essigsäure unterzogen.
Zu den synthetischen HIV-Peptiden/ die auf Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern getestet wurden, zählten die Peptide 29, 36 und 39. Das Peptid 29 ist durch den LAV0n,,-Genombereich von etwa bp 6688 bis bp 6750 kodiert; das Peptid 36 ist durch den Bereich von etwa bp 7246 bis bp 7317 kodiert; und das Peptid 39 ist durch den Bereich von etwa bp 7516 bis bp7593 kodiert. Die Peptide 3d und 39 sind detailliert in der US-PS 4 629 783 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Die blockierenden Peptide IX-XV wurden im wesentlichen wie oben beschrieben an einem Methyl.-benzhydrylaminharz (Polystyrol/Divinylbenzol) (Applied Biosystems, Inc. Foster City, California) zusammengebaut. Kopplungen mit symmetrischem Anhydrid wurden an einem Applied Biosysteins 43OA-Synthetisiergerät durchgeführt. Für Asparagin wurden Kopplungen mii. Dicylcohexylcarbodiimid in Anwesenheit von Hydroxybenzotriazol verwendet. Als Schutzgruppen wurden Seiten-
' ΐ. r: Π
ketten auf Benzylgruppenbasis und boc- c/, -Amin-Schutzgruppen verwendet/ wohingegen Boc(brombenzyloxycarbonyl) spezifisch für Tyrosin-Seitenketten verwendet wurde. Eine Acetylierung erfolgte/ soweit vorhanden/ unter Anwendung von Acetanhydrid oder Eisessig und Dicyclohexylcarbodiimid. Die Entfernung der Schutzgruppen und die Abspaltung des Peptide vom Harz erfolgte gemäß dem "high" HF-Standardverfahren (Stewart et al./ siehe oben). Die Extraktion vom Harz erfolgte mit 50%-iger Essigsäure und der Extrakt wurde anschließend einer GeIfiltrations-Chromatographie in 20%-iger Essigsäure unterzogen. Gewünschtenfalls wurde eine Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie an einer Vydac-C18-Säule (Rainin Instrument Co./ Emeryville/ CA) unter Anwendung eines 0/1% Trifluorescigsäure-Acetonitril-Gradienten durchgeführt.
Die Charakterisierung mittels Immunoblotting erfolgte an Clonüberständen oder Ascitesflüssigkeit unter Anwendung gereinigter LAV-Viren und rekombinanter Fusionsproteine als Antigene. Die Antigene wurden zunächst mittels Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese (7/0 - 15;0 %) getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (NCM) mittels 4-stündiger Elektrophorese bei 25 V in 25 mM Natriumphosphat (pH 7/0) transferiert. Nach der Übertragung wurde die NCM durch 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur in PBS-Tween oder Blotto (5% fettarme Trockenmilch in PBS) blockiert/ um nicht-spezifische Interaktionen zu verhindern. Die NCM wurde mit Zellkulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit/ verdünnt in PBS-Tween/ 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und 3 χ mit PBS-Tween gespült. In der zweiten Stufe wurde die NCM mit Ziege-anti-Maus-IgG-Meerettichperoxidase/verdünnt in PBS-Tween/ 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde mit PBS-Tween gewaschen/ gefolgt von 20-minütigem Eintauchen in Meerettichperoxidase-Farbentwicklungslösung (Bio-Rad Laboratories/ Richmond, California).
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2 8 O 1 ί
Die Reaktion wurde durch Eintauchen in entsalztes Wasser gestoppt. Die monoklonale Antikörper-Aktivität wurde mit einem positiven Kontrollserum; das mit gereinigten zerstörten Viren oder exprimierten Fusionsproteinen reagiert/ verglichen. Es zeigte sich/ daß unter Anwendung zerstörter Viruspräparate alle Antikörper an gpllO oder dessen Prekursormolekül gpl50 banden. Die Antikörper 110-1 und 110-2 erkannten auch das Fusionsprotein ENV3/ wohingegen die Antikörper 110-3, 110-4, 110-5 und 110-6 ENV2 in einen Immunokomplex überführen.
Virusextrakte für die Radioimmun-Präzipitation wurden aus CEM-Zellen hergestellt, die mit LAVonrl-HIV-Isolat in-
BKU
fiziert waren, das durch kontinuierliche Passage dem lytischen Wachstum angepaßt wurde. Sobald sich frühe cytopathische Effekte zeigten, wurden die Zellen auf markierende Medien übertragen, die S -Methionin (0,05 mCi/ml) oder [h] -Glucosamin (0,025 mCi/ml) enthielten, anschließend 24 h inkubiert, bis die meisten Zellen lysiert hatten und das Virus in den Kulturüberstand freisetzten. Die Viren wurden aus dem zellfreien Überstand pelletiert (1 h bei 100.000 xg) und Detergenzextrakte wurden in P-RIPA-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 1,0 % Triton X-100, 1,0 % Deoxycholat, 0,1 % SDS und 1 % Aprotinin enthält) hergestellt. Ähnliche Extrakte wurden von den Überständen von uninfizierten CEM-Zellen hergestellt.
Immunopräzipitations-Assays wurden mit 100 μΐ Virusextrakt durchgeführt, der 1 h auf Eis mit 100 μΐ Kulturüberstand von den Hybridzellinien inkubiert wurde. 4 μΐ Kaninchen-Anti-Maus-Ig (Zymed Laboratories, So. San Fransisco, California) wurden zu jeder Probe gegeben und 30 Min. inkubiert. Zu jeder Probe wurde Immuno-Präzipitin (100 μ 1ϊ
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2 8 O M
Bethesda Research Laboratory/ Bethesda; Maryland)/ das in P-RIPA-Puffer resuspendiert wurde/ welcher 1 % Ovalbumin enthält/ gegeben und weitere 30 Min. inkubiert. Die gebundenen Komplexe wurden gewaschen und mittels SDS-PoIyacrylamid-Gelelektrophorese (15/0 % Acrylamid: DATD-GeI) aufgetrennt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele fixiert/ in Enhance (New England Nuclear; Boston/ MA) eingeweicht/ getrocknet und mit einem Kodak XR-5-Film in Kontakt gebracht. Ein positives Referenzserum, das mit allen HIV-Virusproteinen ein Immunopräzipitat ergib:/ wurde als positive und negative Kontrolle mit Virus-infizierten und schein-infizierten CEM-Zellüberständen zur Reaktion gebracht.
Die Ergebnisse zeigen, daß alle sechs monoklonalen Antikörper spezifisch gpllO und gpl50 immunopräzipicierten.
Uni die von den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern erkannten gpllO-Epitope zu kartieren/ wurden die Kulturüberstände aus Kybridzellinien oder Ascitesflüssigkeit weiter durch die Reaktivität in ELISA-Assays mit biologisch exprimierten Fusionsproteinen und synthetischen Peptiden charakterisiert. Die Verfahren waren diegleichen wie die oben beschriebenen/ mit der Ausnahme/ daß die Fusionsproteine oder synthetischen Peptide die gereinigten Viren als Antigene ersetzten/ welche an die Oberfläche der Mikrotiterwells adsorbiert sind.
. Bei der Verwendung von Peptiden als Antigen arbeitete man nach folgendem Verfahren. Die lyophilisierten Peptide wurden in 6 M Guanidin-HCl gelöst. Unmittelbar vor Plattieren in die 96-Well-Platten wurde die Guanidinlösung in 0/05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9/6) auf eine Peptid-
71! K !-7
κ >· Γ,
3 0
endkonzentration von bis zu 100 μ9/Ίη1 verdünnt. 50 μΐ des verdünnten Peptids wurden in jede Mikrotiter-Vertiefung gegeben. Die Platten wurden anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert. Überschüssige Peptidlösung wurde "ausgeschüttelt"; die Platten wurden mit Blotto blockiert und der weitere ELISA-Assay erfolgte gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. In ähnlicher Weise wurde rekombinantes Protein auf eine Endkonzentration von etwa 2 pg/ml in 0,05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) verdünnt und das gleiche Verfahren wiederholt.
Die Ergebnisse; sind in Tabelle II gezeigt. Die von den Zellinien HIV-gpllO-1 und HIV-gpllO-2 produzierten monoklonalen Antikörper reagierten mit ENV3, ENV5, Peptid 36 und zerstörten Viren. Die Antikörper von den Zellinien HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5 und HIV-gpllO-6 reagierten mit ENV2 und Peptid 29 sowie mit zerstörten Viren.
ELISA-Assays, die die Reaktivität der monoklonalen Antikörper mit rekombinanten Proteinen und synthetischen Peptiden zeigen
Rekombinantes Fusionsprotein Synthetische Peptide LAV CEM
EN V 2 ENV 3 ENV4 ENV 5 29 36 39 Kontrolle Kontrolle
30 110-1 0.077 3.ΟΟΟΟ.113 3.ΟΟΟ
110-2 -0.003 3.000 0.000 3.000
110-3 3.000 0.011 ND ND
110-4 3.000 0.020 ND ND
110-5 3.000 0.014 ND ND
35 110-6 3.000 0.033 ND ND
| ND | 2 | .421 | 0.054 | 0.908 | 0.125 |
| ND | 2 | .305 | -0.005 | 1.214 | 0.009 |
| 3.000 | ND | 0.017 | 0.363 | 0.046 | |
| 3.000 | ND | 0.016 | 0.383 | 0.067 | |
| 3.000 | ND | 0.016 | 0.368 | 0.025 | |
| 1.937 | ND | 0.017 | 0.486 | 0.032 |
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' i.v-
Die ir Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse zeigen/ daß die monokonalen Antikörper 110-1 und 110-2 eine Antigen-Determinante erkennen/ die durch die DNA-Sequenz im pENV3-Bereich kodiert ist/ insbesondere durch den Pereich des HIV-Genoms/ der durch eine Sequenz von Aminosäuren im Peptid 36 definiert ist. D.h./ daß die monoklonalen Antikörper gpllO-1 und 110-2 an einen Peptidbereich von gpllO binden/ der in bp 7246 bis 7317 kodiert ist/ wie durch die Bildung von Immunkomplexen mit Peptid 36 und ENV3 gezeigt wird. Dieser Bereich des HIV-Genoms wurde als konserviert identifiziert/ d.h. mit nur geringen Veränderungen in der DNA-Sequenz in dem Bereich/ der durch Peptid 36 bei verschiedenen Virusisolaten unterschiedlicher geographischer Herkunft kodiert ist/siehe Starcich et al., Cell 46:637 (1986). Im Gegensatz dazu binden die monoklonalen Antikörper gpllO-3/ -4/ -5 und -6 an HlV-Peptide/ die durch den Bereich definiert sind, der durch Peptid 29 von bp6688 bis etwa bp 6750 kodiert isL. Der Bereich in gpllO, der durch Peptid 29 definiert ist, wurde als Bereich identifiziert, der mehrere Nukleotidsubstitutionen bei verschiedenen Virusisolaten enthält. Die monoklonalen Antikörper, die selektiv gpllO-Polypeptide binden/welche konservierte Epitope enthalten/ wie die Antikörper 110-1 und 110-2, können häufig besonders brauchbar sein, beispielsweise bei der Affinitats-Chromatographie etc. Auch bei einem ELISA-Assay reagiert das Peptid 110*- 2-2 mit Sera von der Person/ von der LAV-2 isoliert wurde.
Indirekte Immunofluoreszenz-Assays unter Anwendung monoklonaler Antikörper gegen das gpllO-Antigen von HIV wurden an Aceton-fixierten und lebenden Zellen durchgeführt. Aceton-fixierte Objektträger/ die aus LAV-infizierten CEM-Zellen bereitet wurden/ wurden mit V3rdünntem Kulturüber-
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* stand oder Ascitesflüssigkeit 1 h bei 370C inkubiert/ wohingegen lebende Zellen mit Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit 1 h bei 4°C inkubiert wurden/ ehe die Zellen auf die Objektträger gegeben und mit Aceton fixiert wurden. Bei beiden Methoden wurde Fluorescein-Isothiocyanatmarkiertes-Anti-Maus-IgG verwendet; um diejenigen Zellen nachzuweisen; die das reaktive gpllO-Antigen aufweisen. Die monoklonalen Antikörper HIV-gpllO-1 ergaben positive Ergebnisse sowohl bei Anwendung lebender oder aceton-fixierter LAV-infizierter Zellen.
Neutralisierung der HlV-Infektivität durch Anti-gpllO-monoklonale Antikörper
Dieses Beispiel beschreibt und charakterisiert die Neutralisierung von HIV-Infektivität unter Anwendung monoklonaler Antikörper/ die an gpllO und Peptide innerhalb von gpllO binden. Die Ergebnisse zeigen/ daß die Antikörper gpllO-3/ -4/ -5 und -6 neutralisierende Aktivität besitzen und daß gpHO-3 und -4 besonders hohe neutralisiernde Aktivität besitzen.
Ein sensitiver Neutralisations-Assay wurde entwickelt/ um den Effekt der monoklonalen Antikörper auf die HIV-Infektivität quantitativ zu erfassen. Eine CD4+-Zelllinie/ CEM/ die besonders empfindlich gegen HIV-Infektionen ist/ wurde als Target-Zelle für Infektivitätsvergleiche gewählt. Ascitesflüssigkeit; hergestellt wie im Beispiel I beschrieben; oder die IgG-Fraktion davon; die unter Anwendung einer Ammoniumsulfatfällung gereinigt wurde/ wurde
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30 Min. bei 560C inaktiviert; anschließend in dem erforderlichen Maße in RPMI-Medium/ das 10 % fötales Kälberserum enthält/ verdünnt. Eine Suspension des HIV-Stammes LAV wurde von etwa 4 Tage alten CEM-Kulturen in der log-Wachstumsphase geerntet/ durch einen 0/2 oder 0/45 Mikronfilter filtriert/ in aliquote Teile aufgeteilt und bei -700C eingefroren. Ein aliquoter Teil wurde aufgetaut/ zur Bestimmung von TCID50 titriert und anschließend wurden Assays mit frisch aufgetauten aliquoten Teilen durchgeführt/ die im Verhältnis von 1:500 in Kulturmedium auf etwa die 10-fache Konzentration verdünnt wurden/ die erforderlich ist/ um 50 % der CEM-Zellen in der Kultur (10 TCID50) zu infizieren. Die Virussuspension wurde mit dem gleichen Volumen (250 μΐ) eines monoklonalen Antikörperpräparates in 5-fach Verdünnungen von 1:5 bis 1:9 765 625 vermischt. Die Virus/Antikörpermischung wurde 45 Min. bei 370C inkubiert und anschließend von 1:5 bis 1:9 765 625 dupliziert. Die Virus/Antikörpermischung wurde dann 45 Min. bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden duplizierte Proben von 200 μΐ dazu verwendet/ Wells zu inokulieren/ die 1 ml mit etwa 2 χ 10 -CEM-Zellen pro Well enthielten. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO_ 14 Tage inkubiert. Die Zellen wurden geerntet/ pelletisiert und mit 1 % Triton-X-100 in PBC etwa 10 Min.
lysiert. Die Menge an Viren (oder Virusantigen)/ die in den lysierten Zellen vorhanden war/ wurde unter Anwendung eines sensitiven HIV-Antigen-Capture-"Sandwich"-Enzymimmunoassays wie unten beschrieben quantitativ bestimmt. Der Titer an neutralisierender Aktivität, soweit vorhanden/ wurde als reziproker Wert derjenigen Verdünnung der monoklonalen Antikörper bestimmt/ welche um mehr als 5C% die Antigenproduktion der Viruskontrollkulturen inhibiert/ welche ohne Antikörper oder mit eine"1 .nonoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps inkubiert wurden/ von dem vorher gezeigt wurde/ daß er keine neutralisierende Aktivität besitzt.
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Bei dem oben erwähnten HIV-Antigen-Capture-Assay wurden als Capture-Reagens zwei monoklonale Antikörper gegen p25-Antigene verwendet. Diese Hybridomzellinien wurden anhand der oben beschriebenen Methoden mit geringfügigen Modifikationen erzeugt/ einschließlich der Anwendung eines gereinigten gag-rekombinanten Fusionsprotein als Immunoqen und der Charakterisierung der erhaltenen monoklonalen Antikörper hinsichtlich Spezifität und Reaktivität unter Anwendung der als GAG-I/ GAG-2 und GAG-3 bezeichneten rekombinanten Fusionsproteine und des synthetischen Peptids 141. Das Protein GAG-I wird aus PGAG-I (ATCC Nr. 53379) exprimiert, GAG-2 wird aus pGAG-2 (ATCC Nr. 53111) exprimiert und GAG-3 wird aus pGAG-3 (ATCC Nr. 53112) exprimiert. Die Produktion der rekombinanten Fusionsproteine ist detailliert in den USSN 764 460 und 828 beschrieben/ auf die hiermit Bezug genommen wird. Das synthetische Peptid 141 wird durch den LAV__r-Genombereich
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kodiert/ der den Aminosäureresten 198 bis 242 entspricht. Die monoklonalen Antikörper/ die durch die Hybridonizel 1-linien p25-2 und p25-3 produziert werden/ reagieren mit den rekombinanten Fusionsproteinen GAG-I/ GAG-2 und GAG-3. Auch die aus p25-3 gewonnenen monoklonalen Antikörper reagieren mit dem synthetischen Peptid 141.
Um den Antigen-Capture-Assay durchzuführen/ wurden die Capture-Reagentien zuerst an einem festen Träger adsorbiert. Ascitesflüssigkeit/ die von den Hybridomzellinien p25-2 und p25-3 stammte, wurde 1:5000 in 25 mM Tris-Puffer von pH 8,5 verdünnt. 200 μΐ wurden in die Vertiefungen von Mikrowell-
3Q platten gegeben. Die Vertiefungen wurden versiegelt und etwa 16 h bei 40C inkubiert. Die Lösung wurde von den Platten abgesaugt, ehe eine blockierende Lösung von 0,3 % Blotto in PBS zugegeben wurde. Das Blockieren erfolgte 15 Hin. bei Raumtemperatur. Die blockierende Lösung wurde abgesaugt und die Probe wurde zugegeben. 200 μΐ der lysierten
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Zellsuspension und 5 μΐ Detektionskonjugat/ hergestellt wie unten beschrieben/ wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Wellstreifen oder -platten wurden 2 h bei 370C inkubiert; anschließend wurde die Suspension abgesaugt und die Wells wuden 4 χ mit Puffer gewaschen (0/05 % Tween 20 in PBS).
Das Detektionskonjugat wurde folgendermaßen hergestellt. Die monoklonalen Antikörper p25-6 und p26-7 wurden an Meerettichperoxidase (HRP) in einem Molverhältnis von 3:1 (Ab:HRP) 3 h unter Anwendung des Periodatoxidationsvei.f ahrens (Nakane et al./ J. Histochem. Cytochem. 22:1084 (1974)) konjugiert. Die Konjugate wurden 1:1500 in 2/5 % (G/V) fettarmer Trockenmilch/ 0/01 Thimerosal und 0/005 % Antifoam A in 20 mM Natriumzitrat verdünnt. Der verbleibende Teil des ELISA-Assays wurde wie im Beispiel I beschrieben/ durchgeführt.
Die Bestimmung der neutralisierenden Aktivität mit den Antikörpern gpllO-3/ -4/ -5 und -6 erbrachte folgende Ergebnisse. Die höchsten Titer mit beibehaltener neutralisierender Aktivität waren: gp.UO-3 = 15 625; gpllO-4 = 9 765 625; gpllO-5 = 125; und gpllO-6 = 625.
Aufgrund der vorausgesagten genetischen Variabilität des durch das Peptid 29 definierten Bereichs wurde die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers gpllO-4/ andere HIV-Isolate zu erkennen/ untersucht. Die Immunofluoreszenz-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Der Antikörper gpllO-4 konnte Antigen in Kulturen von wenigstens drei von 16 HIV-Isolaten detektieren.
Der Antikörper apllO-4 war in der Lage/ Viren zu neutralisieren/ die über einen Zeitraum von 15 Wochen von einem Schimpansen isoliert wurden/ der bei einem AIDS-Impfversuch als Kontrolltier mit LAV inokuliert wurde. Der monoklonale Antikörper war in der Lage/ die Isolate zi1 neutralisieren/ obwohl das
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Tier Serumantikörper aufwies; die HIV in vitro neutralisierten und obwohl das Tier eine messbare/ zellvermittelte Immunantwort gegen HIV-Infektion ausqebildet hatte. Dies zeigt das Fehlen eines Antigen-Drifts in vivo für das Epitop/ das durch den gpllO-4 Antikörper erkannt wird.
Neutralisierung der HIV-Infektivität durch einen Cocktail von Anti-gpllO und Anti-p25 monoklonalen Antikörpern
Dieses Beispiels beschreibt die Neutralisierung der HIV-Infektivität unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern; die an gpllO und Peptide innerhalb von gpllO binden; in Kombination mit monoklonalen Antikörpern, welche an p25 und an Peptide innerhalb von p25 binden und welche aileine eine nur geringe oder keine neutralisierende Aktivität aufweisen. Di^ Ergebnisse zeigen; daß der monoklonale Antikörper gpllO-2 in Kombination mit p25-6 oder p25-7 eine besonders große neutralisierende Aktivität aufweist.
Die Hybridomze11inien p25-6 und p25-7 wurden nach den oben beschriebenen Methoden unter Anwendung der Modifikationen erzeugt; zu denen die Verwendung inaktivierter zerstörter Viren oder gereinigter gag rekombinanter Fusionsproteine; die in E. CoIi als Immunogen exprimiert wurden; und die Charakterisierung der monoklonalen Antikörper bezüglich der Spezifität und der Reaktivität zählen; wobei die als GAG-I; GAG-2 und GAG-3 bezeichneten rekombinant-.en Fusionsproteine und die synthetischen Peptide 15; 88, 150/ 147 und 148 zur Anwendung kamen. Die synthetischen Peptide sind vom LAV__,_ -Genombe-
BKU
r<?ich kodiert, der den folgenden Aminosäureresten entspricht: gg Peptid 15, Aminosäurereste 329 bis 350; Peptid 88, Aminosäurereste 315 bis 350; Peptid 150, Aminosäurereste 318 bis
nui
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363; Peptid 147/ Aminosäurereste 278 bis 319; und Peptid 148/ Aminosäurereste 290 bis 319. Die von den Hybridomzelliriien p25-6 und p25-7 produzierten monoklonalen Antikörper reagieren mit dem rekombinanten Fusionsprotein GAG-3; p25-6 reagiert mit den synthetischen Peptiden 147 und 148/und p25-7 mit den synthetischen Peptiden 15/ 88 und 150.
Die Neutralisations-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt/ außer daß bei Anwendung von Cocktails die einzelnen monoklonalen Antikörper zuerst 1:5 in Kulturmedium verdünnt und anschließend in gleichen Verhältnissen vermischt wurden/ um eine Endverdünnung von 1:10 zu ergeben. Der verbleibende Teil des Assays wurde wie oben durchgeführt.
Die monoklonalen Antikörper gpllO-2/ p25-6 und p26-7 zeigen weniger als 50 % neutralisierende Aktivität/ wenn sie alleine verwendet werden. Bei Verwendung eines Cocktails/ der die monoklonalen Antikörper gpl3O-2 zusammen mit p25-6 oder gpllO-2 mit p25-7 in einer Verdünnung von 1:10 umfaßt/ erfolge vollständige Neutralisierung. Ein Cocktail/ der die monoklonalen Antikörper p25-6 in Kombination mit p25-7 enthält/ ergab eine neutralisierende Aktivität im Bereich von 60 bis 90 %.
Die Fähigkeit des Peptids 29 und der homologen Peptide/ ein-30
schließlich dem Peotid 177, eine Immunantwort gegen HIV zu
stimulieren/ wurde an zwei Mäusestämmen untersucht. Die Herstellung der Peptidimmunogene/ die Immunisierungsverfahren und die Charakterisierung der ausgelösten Immunantworten werden nachfolgend beschrieben. 35
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Das Peptid 29 wird zur Immunisierung durch Konjugation an ein gereinigtes Thyroglobulin hergestellt. Thyroglobulin kann zur Konjugation mit N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-l-carboxylat (SMCC) gemäß den in der US-PS 4 629 783/ Spalte 10/ Zeilen 28-51 beschriebenen Verfahren derivatisiert werden. Als zweites Immunogen wird Thyroglobulin mit Glutaraldehyd folgendermaßen derivatisiert. 27 mg Schweinethyroglobulin werden in 1 ml Oil M Natriumbicarbonat gelöst. Dazu trocknet man 8/3 μΐ einer 25%-igen Glutaraldehydlösung und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man gibt 1 ml Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer von pH 9/3 zu der Lösung und dialysiert anschließend 8 h gegen 2 1 des gleichen Puffers bei 4°C/ wobei ein vollständiger Austausch des Dialysats nach 4 h erfolgt. Das Peptid 29 gibt man dann zu dem derivatisierten Thyroglobulin in etwa 100-fachem molaren Überschrß und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man blockiert unumgesetzen Glutaraldehyd mit 200 μΐ einer 0/2 M Lysinlösung und rührt die Mischung mehrere Stunden (oder über Nacht) bei Raumtemperatur. Das Peptid-Thyroglobulin-Konjugat wird dann extensiv gegen PBS bei 4"C dia3ysiert.
Zwei Mäusestämme (C57 schwarz und BALB/c) inokuliert man mit den Peptiden/ die durch das jeweilige Konjugationsverfahren herstellt wurden. Alle Tiere waren im Zeitpunkt der Inokulation etwa 2 bis 4 Wochen alt. Die Inokulation kann in den Fußballen/ durch Schwanzskarifikation/ subkutan/ intranasal oder intraperitoneal erfolgen. Das Inokulum besteht aus 25 μg des konjugierten Peptids/ suspendiert in 0/5 ml kompletten Freund's-Adjuvans/ wobei nach dar 2./ 3. und
5. Woche Booster-Inokulationen mit dem gleichen Immunogen/ suspendiert in inkomplettem Freund' s-Adjuvans/ gegeben werden. Man sammelt Serumproben von den einzelnen Mäusen vor der Immunisierung/ 4 Tage nach der Booster-Immunisierung nach der 3. Woche und 4 Tage nach der letzten Booster-Immunisierung nach 5 Wochen. Die Serumproben wurden auf Antikörper gegen
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homologe Peptide oder Ganzviren durch ein Screening in einem ELISA-Assay analysiert. Diejenigen Sera; die Antikörperaktivität gegen LAV zeigen; werden einem weiteren Screening auf neutralisierende Aktivität unterzogen. Im Anschluß daran erfolgt eine Analyse der Sera in Immunoblot-Assays gegen zerstörtes TjAV-Antigen und in Radioimmunopräzipitations-Assays mit radio-markiertem gpllO.
Die Ergebnisse der Immunisierungen zeigen; daß die mit
Peptid 29 immunisierten Mäuse Antikörper entwickeln; die mit Peptid 29 und zerstörten LAV-1-Viren in ELTSA-Assays reagieren. Eine Konjugation des Peptid 29 durch Maleimid führt zur Bildung von Anti-Peptid-29-Antikörpern in einigen balb/c-Mäusen. Die Konjugation des Peptids 29 durch
Glutaraldehyd ergibt im allgemeinen höhere Tjter an Antikörpern gegen das Peptid 29 in balb/c-Mäusen. Mit Peptid 177 immunisierte Mäuse entwickeln Antikörper gegen das Peptid. Eine Konjugation des Peptids 177 durch Glutaraldehyd war bei der Auslösung einer Immunantworc besser.
C57-Mäuse sprechen stärker auf die Immunstimulierung mit dem Peptid 177 an als balb/c-Mäuse. Mit dem LAV-2-Peptid 110-2-2 immunisierte Mäuse entwickeln Antikörper gegen 110-2-2 und LAV-2-Viren; wie mittels ELISA-Assays gezeigt werden konnte. Das durch Glutaraldehyd konjugierte Peptid
110-2-2 wirkt sowohl bei C57- als auch bei balb/c-Mäusen immunogen; wobei die Titer gegen das 110-2-2-Peptid bei balb/c-Mäusen im allgemeinen höher als bei C57-Mäusen sind; während die Titer gegen das LAV-2-Virus im allgemeinen bei
C57-Mäusen höher sind als bei balb/c-Mäusen. 30
Diejenigen Serumproben von immunisierten Mäusen/ die (i) Antikörper gegen Ganzviren zeigen; (ii) in der Lage sind, HIV zu neutralisieren, wie beispielsweise in den in Beispiel II beschriebenen Assays und (iii) mit Peptid 29 in ELISA-Assays reagieren, zeigen kumulativ die Wirksamkeit der Anwendung des Peptids 29 in einer Vakzinformulierung
Immunoaffinitätstrennung von gpllO unter Anwendung monoklonaler Antikörper
Monoklonale Antikörper gegen das gpllO-HIV-Antigen kann man
bei Immunoaffinitätstrennverfahren verwenden, um die 15
bakteriell exprimierten rekombinanten Fusionsproteine zu reinigen. Wenn das exprimierte Protein von den Bakterien sekretiert wird, kann das Protein aus dem Kulturüberstand isoliert werden. Wenn das Protein nicht sekretiert wird, kann eine Zerstörung der Bakterienzellen erforderlich werden.
Die Konstruktion des Plasmids pENV-5 (ATCC Nr. 53074) ist in der USSN 721 237 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Das Plasmid pENV-5 kodiert für den Hauptteil
des Carboxylendes von gpllO und einen Teil des Amino- A ο
terminus von gp41 von LAV, das in den trp Expressionsvektor insertiert ist. Durch diesen Vektor transformierte E. CoIi C600 exprimieren das gpllO Fusionsprotein, sekretieren es aber nicht.
E. CoIi C600, die das Plasmid pENV-5 enthalten, läßt man über Nacht bei 37°C unter Belüftung in einem Medium wachsen, das Tryptophan (20 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthält. Die Ubernachtkulturen inokuliert man dann zu 1:100
in frisches Minimalmedium, das Ampicillin (100 μg/ml), nicht 35
aber Tryptophan enthält. Diese Kulturen läßt man unter Be-
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lüftung bei 370C 2 bis 3 h wachsen (bis zur frühen log-Phase). Der Induktor/ 3-B-Indol-acrylsäure (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) wird aus einer frisch bereiteten Vorratslösung von 20 mg/ml in 95%-igem Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 20 Mg/ml zugegeben. Die induzierten Kulturen läßt man bei 370C unter Belüftung 4 bis 5 h wachsen/ pelletisiert anschließend und friert gegebenenfalls ein. Die Proteinausbeuten von pENV-5 betragen typischerweise weniger als 1 mg/1.
Die pelletisieren Bakterienzellen werden unter Verwendung von P-RIPA-Puffer (PBS, enthaltend 1 % Triton X-100, 1 % Deoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat und 1 % Aprotinin) lysiert, der E. Coli-Zellen lysiert. Die Suspension wird zum Jhearing von DNA und RNA einer Ultraschallbehandlung unterzogen und anschließend zur Entfernung von Teilchen zentrifugiert. Eine Verdünnung oder Konzentrierung kann zur Standardisierung der Proteinkonzentration erforderlich sein ·
Der monoklonale Antikörper HIV-gpllO-1 wird ursprünglich ausgefällt aus Ascitesflüssigkeit oder Zellkulturüberständen bei Raumtemperatur oder in der Kälte mit (NH . )„SO, oder Na^SO.-Lösungen, die bei pH 7,3 auf eine Endsättigung von 33 oder 18 % gepuffert sind. Die ausgefällten Proteine werden durch Zentrifugieren entfernt und erneut in PBS gelöst und ein zweites Mal mit 33 % (NH4KSO4 oder 12 bis 15 % Na3SO4 gefällt. Falls erforderlich, kann diese Stufe wiederholt werden. Das Pellet wird erneut in PBS gelöst und die überschüssigen Salze werden durch Gelfiltration über eine entsalzende Matrix oder durch erschöpfende Dialyse gegen PBS entfernt.
Der gereinigte monoklonale Antikörper 110-1 kann dann an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose gekoppelt werden. Die
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erforderliche Menge an Gel läßt man in 10~ M HCl-Lösung auf einem Glasfilter quellen (1 g gefriergetrocknetes Material ergibt ein Gelendvolumen von etwa 3/5 ml)* wäscht 15 Min. mit der gleichen Lösung und gibt den Antikörper unmittelbar danach zu. Im allgemeinen erfolgt die Kopplungsreaktion am wirksamsten in einem pH-Bereich von 8 bis 10; man kann jedoch auch bei einem niedrigeren pH-Wert arbeiten; wenn dies aus Gründen der Antikörperstabilität erfc '"lieh ist. Der Antikörper soll in PBS oder in einem Carbonat/Bicarbonat-oder Boratpuffer von hoher Ionenstärke mit 150 mM NaCl gelöst sein. Die aktivierte Sepharose und die Antikörpersuspension werden bei Raumtemperatur 2 bis 4 h oder über Nacht bei 40C leicht gerührt und anschließend auf einer groben Glasfilterfritte mit Kopplungspuffer gewaschen. Soweit aktive Gruppen verblieben sind; werden diese durch 2-stündige Behandlung mit 1/0 M Ethanolamin bei pH 8 blockiert. Das Antikcrper-Sepharose-Endprodukt wird anschließend abwechselnd 4 oder 5 χ mit Pufferlösungen mit hohem oder niedrigem pH-Wert gewaschen (Boratpuffer/ 0/1 M; pH 8;5; IM NaCl und Acetatpuffer, 0,1 M, pH 4,0, 1 M NaCl). Durch das Waschen entfernt man Spuren von nicht-kovalent adsorbierten Materialien. Die fertige Immunoaffinitäts-Separationsmatrix lagert man unterhalb von 8°C in Anwesenheit eines geeigneten bakteriostatischen Mittels, wie 0,01 %-iges Azid.
Die Zugabe der exprimierten Proteinsuspension zu der Immunoaf finitäts-Separationsmatrix führt zu der selektiven Entfernung des gpllO-Antigens. Die Mischung läßt man 2 bis 24 h,
3P vorzugsweise 12 bis 18 h, unter leichtem Rühren oder Schütteln einwirken. Man kann auch so vorgehen, daß man die Immunoaffinitätsmatrix in eine Säule gibt, äquilibriert und dis exprimierte Proteinsuspension langsam auf die Säule gibt. Nach Zugabe der Proteinsuspension sollte der Flow gestoppt werden, um die Bildung des Immunkomplexes auf beste Weise zu bewerkstelligen.
Ungebundenes Material wird durch extensives Waschen mit Adsorptionspuffer ausgewaschen oder abgetrennt. Dazu kann man eine grobe Glasfilterfritte unter Anlegen eines Vakuums verwenden oder die Säule im Durchfluß behandeln. Das ungebundene Material wird dann unter Anwendung von Puffern mit niedrigem oder hohem pH-Wert (Acetatpuffer; pH 4/0 oder Boratpuffer; pH 8;56) oder eines chaotropen Agens eluiert.
Immunoaffinitätsreinigung von rekombinantem gpllO aus einem Säugetier-Expressionssystem
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper finden bei der Immunoaffinitätsreinigung von rekombinantem;durch Säugetierzellen exprimierten Fusions-gpl]0 Anwendung. Die Säugetierzellen infiziert man mit rekombinanten Vaccinia (Mackett et al.; J. Virol. 49:85? (19£.<4), worauf hiermit Bezug genormen vird), die Sequenzen enthalten; welche für wenigstens den Teil von gpllO kodieren/ der antigen ist und die Bildung von neutralisierenden Antikörpern auslöst.
Die rekombinanten Vaccinia werden gemäß dem Verfahren konstruiert; das in der USSN 842 984 beschrieben ist; auf
die hiermit Bezug genommen wird. Die Sequenzen; die für das Hüllglykoprotein von HIV kodieren; werden in einem Plasmidvektor (pGS20) abwärts von einem Vaccinia-Transkriptions-Kontrollelement insertiert. Diese chimäre Gen wird gO flankiert von Sequenzen/ die für das virale Thymidinkinase (TK)-Gen kodieren.
Die chimären Plasmidvektoren; die Vaccinia-Virus-Promotoren enthalten; welche an das LAV-Hüllqen ligiert sind; verwendet gg man zur Transformation des E. Coli-Stamms MClOOO. Insertion
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der Chimären LAV-env-Sequenzen in das Vaccinia-Virus-Genom erfolgte durch in vivo-Rekombination/ was dadurch möglich wurde/ daß die Chimären Gene in den Plasmiden pv-env5 von Vaccinia-Virus-Sequenzen flankiert sind, die für das TK-Gen kodieren. Dieses Plasmid wird dann in die Zellen eingeführt/ die vorher mit Vaccinia-Viren vom Wildtyp infiziert worden waren. Man ermöglicht dann eine Rekombination zwischen den TK-Sequenzen am Plasmid und den homologen Sequenzen in dem Vaccinia-Virus-Genom unter Insertion des Chimären Gens. Afrikanische Green-Monkey-Nierenzellen (Stamm BSC-40, eine von BS-1-Zellen abstammende Zellinie/ ATCC Nr. CCL26) verwendet man als Wirt im Expressionssystem.
Konfluente BSC-40-ZeIlen infiziert man in einer Infektionsmultiplizität von 10 durch rekombinante Vaccinia-Viren. Die Infektion läßt man 12 h ablaufen/ danach werden die Zellen geerntet/ einmal mit PBS gewaschen und abzentrifugiert. Die Zellpeliets suspendiert man in Lysepuffer (1,0 % NP-40, 2,4 % Natriumdeoxycholat, 0/1 M NaCl, 0,01 M M Tris-HCl, pH 7/4/ 1 mM EDTA) und klärt das Lysat durch zentrifugieren. Die Immunoaffinitätstrennung des exprimierten rekombinanten Fusionsproteinsführt man,wie oben für das bakterielle Expressionssystem beschrieben,unter Anwendung des monoklonalen Antikörpers gpllO-1 durch. Die durch dieses Expressionssystem produzierten Proteine ähneln aufgrund der durch die Säug^tierzellen erfolgten Behandlung und Glykosylierung stärker natürlich produziertem HIV-gpllO.
Inhibierung einer HIV-Infektion mit blockierenden Peptideη
Die Wirksamkeit von blockierenden Peptiden bei der Inhibierung der Infektion von Gewebekulturzellen iurch den LAV-HIV-
BKU
Stamm wurde unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens
für die Bewertung von Peptid T/ das von Pert et al/ siehe
, oben/ publiziert wurrde/ untersucht. Die bevorzugten HIV-Inhibitions-Assays erljlgen/ indem man gleiche Volumina blockierender Peptide und CEM-Zellen (2;5 χ 10 ) in Medium (RPMI, 10 % FCS und 2 mg/ml Polybren) kombiniert und
c 45 Min. bei 37°C inkubiert. Das Virus wird dann in unterb
schiedlichen Dosierungen (10/ 50/ 500 TCID 50) zugegRben und die Mischung wird 14 Tage bei 37°C inkubiert. Der Überstand wird anschließend einem Assay auf die Produktion von Virusantigen (z.B. p25-Kernantigen) unterzogen.
Eine Preinkubation der CEM-Zellen mit den Peptiden vor der Viruszugabe zu den Kulturen verstärkt den inhibierenden Effekt in den Assays. Es hat sich gezeigt/ daß die Inhibierung von der Virusdosierung abhängig ist/ wobei eine große Aktivität bei niedrigen und mittleren Dosierungen/ ο
ein geringerer Effekt dagegen bei höchsten Virusdosierungen zu beobachten war.
Mit Peptid T war bei Experimenten mit niedrigen Virusdosierungen eine Inhibierung der Virusantigenproduktion von etwa 60 % bis 90 % zu erzielen. Weitere Experimente mit den Peptiden X bis XV7 die typischerweise am COOH-Terminus amidiert und am NH~-Terminus acetyliert waren/ ergaben ähnliche Ergebnisse, wobei das Peptid XI über einen
breiten Dosisbereich besonders wirksam war. Es ist ersicht-25
lieh/ daß auf Basis der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptide, einschließlich der blockierenden Peptide/ eine bessere Methode zur Neutralisierung und/oder Inhibi<irung von HIV-Infektionen zur Verfügung steht. Dies ermögliche die Schaffung prophylaktischer und therapeutischer Mittel/ die gegen Infektionen durch die meisten/ wenn nicht alle/ HIV-Stämme wirksam sind. Darüber hinaus finden die neuen Materialien in Diagnose-Assays und anderen bekannten Verfahren Anwendung.
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Hinterlegungt.nummern der Mikroorganismen
Die nachfolgenden Mikroorganismen, die Teil der vorliegenden Erfindung sind/ wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 2085"^, USA, hinterlegt. Dia Hinterlegungsdaten sind wie folgt :
| Wissenschafti. Bezeichnung | Bezeichnung des Hinterlegers | ATCC-Nr. | August 1986 lebensfähig. | 9175 | Hinterlegungs- daten | , 2986 |
| Mouse hybridoma (balb c/NS-1) | HIV-gp 110-1 | HB | 9176 | August 15, | , 1986 | |
| Il | HIV-tjp 110-2 | HB | 9177 | August Ib, | , 1986 | |
| H | HIV-gp 110-3 | HB | 9404 | August 15, | 1987 | |
| H | HIV-gp 110-6 | HB | 9405 | April 30, | 1987 | |
| Il | HIV-gp 110-4 | HB | S406 | April 30, | 1987 | |
| Il | HIV-gp 110-5 | HB | 9407 | April 30, | 1987 | |
| M | HIV-p 25-2 | HB | 9408 | April 30, | 1987 | |
| Il | HIV-p 25-3 | HB | 9409 | April 30, | 1987 | |
| η | HIV-p 25-6 | HB | 9410 | April 30, | 1987 | |
| N | HIV-p 25-7 | HB | 91-/7 | April 30, | und | |
| 5 Die Hybridome HB9175, HB 9176 und HB | Die | wurden getestet | übrigen Hybridome | |||
| waren am 26. | wurden ebenfalls getestet und waren am ',. | Mai 1987 lebens- | ||||
fähig.
7!i ft}:/
1: 6
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit einem oder mehreren neutralisierenden Bereichen von HIV reagieren,
dadurch gekennzeichnet, daß man
einem Wirt eine immunogen wirksame Menge eines mit HIV-Proteinen angereicherten Antigenpräparates verabreicht ;
die Produktion der spezifisch reagierenden Antikörper im immunisierten Wirt überwacht;
die Antikörper-produzierenden Zellen aus dem Wirt gewinnt und immortalisiert;
die immortalisierten Zellen, die Antikörper gegen HIV produzieren, selektiert;
die immortalisierten Zellen für die Produktion von Zellinien kloniert; und
die Zellinien, die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die mit einem oder mehreren neutralisierenden HIV-Bereichen reagieren, kultiviert und die Antikörper gewinnt.
2 8 0 ί ί β 69
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als HIV-Proteine rekombinante Fusionsproteine verwendet, die von einem eukaryontischen oder bakteriellen Wirt exprimiert werden, oder daß die HIV-Proteine aus einem HIV-Extrakt oder -Lysat erhältlich sind.
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3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine immortalisierte Zellinie verwendet. die monoklonale Antikörper produziert, welche in der Lage sind, mit einer HüllglycoproteingpllO-Antigen-Determinante zu reagieren, die innerhalb
J5 des neutralisierenden Bereicnes oder blockierenden Peptids des HIV enthalten ist.
2 8 0MS
2 8 O f I S
PATENTANSPRÜCHE
5
5
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper erhält,
2Q die spezifisch mit einem neutralisierenden Bereich reagieren, der Epitope umfaßt, die in den env- oder gag-Bereichen des HIV-Genoms kodiert sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ,r dadurch gekennzeichnet, daß man monoklonale Antikörper erhält, die spezifisch mit einem neutralisierenden Bereich reagieren, der Epitope umfaßt, die auf den LAV-DnrI HIV-Proteinen gpllO oder ρ 25 lokalisiert sind.
„Q
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man monoklonale Antikörper erhält, die spezifisch mit einem neutralisierenden Bereich reagieren, der die HIV-gpl10-Aminosäuresequenz von etwa 301 bis 336 oder 308 bis 328 oder Homologe
_r dieser Sequenzen umfaßt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man monoklonale Antikörper erhält, die spezifisch für einen neutralisierenden Bereich sind, der die HIV-p25-Aminosäuresequenz von etwa 278 bis 319 oder etwa 315 bis 363 oder Homologe dieser Sequenzen umfaßt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89827386A | 1986-08-20 | 1986-08-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD280118A5 true DD280118A5 (de) | 1990-06-27 |
Family
ID=25409193
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD33023187A DD283936A5 (de) | 1986-08-20 | 1987-08-20 | Verfahren zur herstellung von peptiden, die in der lage sind immunologisch die neutralisierenden bereiche von hiv proteinen nachzuahmen |
| DD33023087A DD284089A5 (de) | 1986-08-20 | 1987-08-20 | Verfahren zur bestimmung der anwesenheit von hiv in einer biologischen probe |
| DD87306218A DD280118A5 (de) | 1986-08-20 | 1987-08-20 | Verfahren zur herstellung von monoklonaren antikoerpern und peptiden, welche zur behandlung und diagnose von hiv-infektionen brauchbar sind |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD33023187A DD283936A5 (de) | 1986-08-20 | 1987-08-20 | Verfahren zur herstellung von peptiden, die in der lage sind immunologisch die neutralisierenden bereiche von hiv proteinen nachzuahmen |
| DD33023087A DD284089A5 (de) | 1986-08-20 | 1987-08-20 | Verfahren zur bestimmung der anwesenheit von hiv in einer biologischen probe |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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-
1987
- 1987-08-20 DD DD33023187A patent/DD283936A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-20 DD DD33023087A patent/DD284089A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-20 DD DD87306218A patent/DD280118A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD283936A5 (de) | 1990-10-31 |
| DD284089A5 (de) | 1990-10-31 |
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