DD284089A5 - Verfahren zur bestimmung der anwesenheit von hiv in einer biologischen probe - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von HIV in einer biologischen Probe mit Hilfe von monoklonalen Antikoerpern, die spezifisch mit einem oder mehreren neutralisierenden HIV-Bereichen reagieren, Peptiden, die immunologisch die neutralisierenden HIV-Bereiche nachahmen und Nukleinsaeuresequenzen, die zumindest einem Teil des neutralisierenden Bereichs entsprechen.{Verfahren; Diagnose; Herstellung; monoklonale Antikoerper; Peptide; Aminosaeuresequenzen; neutralisierender Bereich; Immunkomplexe; Immunoaffinitaetsreinigung; Medizin; HIV-Bekaempfung; HIV-Nachweis}

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER ANWESENHEIT VON HIV IN EINER BIOLOGISCHEN PROBE

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit des Human-Immunodeficiency Virus (HIV) in einer biologischen Probe.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

_1B Das für das Acquired Immunodeficiency-Syndrom (AIDS) und , dessen prodromale Phasen« AIDS-related Complex (ARC) und das j Lymphadenopathie-Syndrom (LAS) verantwortliche infektiöse ; Agens ist ein neuartiges lymphotropes Retrovirus. Dieses Virus wurde auf verschiedene Weise bezeichnet, nämlich als

LAV, HTLV-III, ARV und neuerdings als HIV.

Seit der pandemischen Ausbreitung von HIV ist die Behandlung infizierter Personen und die Verhütung der übertragung auf uninfizierte Risikogruppen von größter Wichtigkeit. Eine Vielzahl von Behandlungsstrategien richtet sich auf unterschiedliche Phasen im Lebenscyclus des Virus. Sie sind in Mitsuya und Broder, 1987, Nature 325:773 beschrieben. Eine Möglichkeit umfaßt die Anwendung von Antikörpern, die an das Virus binden und die Virusreplikation inhibieren, entweder weil sie den Eintritt des Virus in die Wirtsstellen stören oder aufgrund anderer Mechanismen. Sobald die virale Komponente(n), die einem Eingreifen des Antikörpers unterliegt (en), identifiziert ist (sind), hofft man Antikörper-

Titer erzeugen zu können/ die ausreichen* um die Infektivität des Virus zu neutralisieren und zwar durch Impfung oder in alternativer Weise durch passive Verabreichung von Immunglobulinen oder monoklonalen Antikörpern der gewünschten

Spezifität.

Man nimmt an« daß die Hüllglykoproteine der meisten Retroviren mit Rezeptormolekülen an der Oberfläche der für das Virus anfälligen Zellen reagieren und so die Virusinfektivität gegenüber bestimmten Wirten bestimmen. Antikörper« die an die Glykoproteine binden« können die Interaktion des Virus mit den Zellrezeptoren blockieren und somit die Infektivität des Virus neutralisieren« siehe The Molecular Biology of Tumor Viruses« 534 (J. Tooze« Hrsg.«

1973) und RNA Tumor Viruses« 226« 236 (R. Weiss et al« Hrsg.« 1982) auf beide Publikationen wird hiermit Bezug genommen. Man vergleiche außerdem

Gonzalez-Scarano et al.« 1982« Virology 120:42 (La Crosse Virus); Matsuno und Inouye« 1983« Infect. Immun. 39:155 (Neonatal Calf Diarrhea Virus); und Mathews et al.« 1982« J. Immunol.« 129:2763 (Encephalomyelitis Virus).

Die allgemeine Struktur des HIV besteht in einem Ribonukleoproteinkern« der von einer Lipid-enthaltenden Hülle umgeben ist« welche das Virus im Laufe seiner Entwicklung aus der Membran der infizierten Wirtszelle bildet. Die viral kodierten Glykoproteine sind in die Hülle eingebettet und stehen nach außen hervor. Die Hüllglykoproteine von HIV werden ursprünglich in der infizierten Zelle als Prekursor-

3Q molekül von 150.000 bis 160.000 Dalton (gpl50 oder gpl60) synthetisiert und anschließend in der Zelle in ein N-terminales Fragment von 110.000 bis 120.000 Dalton (gp 110 oder gp 120) um das externe Glykoprotein zu erzeugen und in ein C-terminales Fragment von 41.000 bis 46.000 Dalton (gp41)« das das Transmembran-Hüllglykoprotein darstellt« überführt.

Aus den oben angegebenen Gründen war das gpllO HIV-Glykoprotein Gegenstand zahlreicher Untersuchungen bezüglich eines potentiellen Targets zur Unterbrechung des Lebenscyclus des Virus. Es wurde gezeigt/ daß Sera von HIV-infizierten Personen HIV in vitro neutralisieren und daß Antikörper/die an gereinigtes gpllO binden» in den Sera vorliegen/ Robert-Guroff et al./ 1985/ Nature 316:72/ Weiss et al./ 1985/ Nature 316:69 und Mathews et al./ 1986/ Proc. Natl. Acad. Sei. USA/ 83:9709. Gereinigtes und rekombinantes gplOO stimulierte die Produktion neutraliserender Serumantikörper/ wenn man sie zur Immunisierung Tieren verabreichte/ Robey et al./ 1986/ Proc. Natl. Acad. Sei. USA/ 83:7023; Lasky et al./ 1986/ Science 233:209; und Zagury et al./ 1986/ Nature 326:249. Weiter konnte gezeigt werden/ daß das gpllO-Molekül an den CD4 (T4)-Rozeptor bindet und daß monoklonale Antikörper/ die bestimmte Epitope des CD4-Rezeptors erkennen/ die HIV-Bindung/ Syncytiumbildung und Infektivität blockieren/ HcDougal et al./ 1986/ Science 231:382. Putney et al. (1986/ Science 234:1392) wiesen neutralisierende Serumantikörper in Tieren nach Immunisierung mit einem rekombinanten Fusionsprotein nach/ das die carboxyl-terminale Hälfte des gpllO-Moleküls enthielt. Sie konnten weiter zeigen/ daß die Glykosylierung des Hüllproteins für ein Ansprechen auf den neutralisierenden Antikörper unnötig ist.

Es wäre deshalb wünschenswert/ ein Subunit-Vakzin gegen AIDS unter Anwendung des HIV gpllO-Moleküls oder Teilen davon zur Verfügung zu haben. Subunit-Vakzine sind eine

Alternative zu Vakzinen/ die aus inaktivierten oder in

ihrer Wirkung geschwächten Viren hergestellt werden. Inaktivierte Vakzine sind problematisch/ weil möglicherweise nicht alle Viruspartikel abgetötet wurden und die in ihrer Wirkung geschwächten Viren besitzen die Fähigkeit zu mutieren und ihre krankheitsauslösende Wirkung wieder zu gewinnen. Bei Subunit-Vakzinen verwendet man nur diejenigen

Teile des Virus zur Immunisierung des Wirts« welche die Antigene oder Epitope enthalten, die in der Lage sind/ die Immunantwort auszulösen« d.h. ein Ansprechen auf neutralisierende Antikörper, ADCC und ein cytotoxisches T-Zell-Ansprechen. Der Hauptvorteil von Subunit-Vakzinen liegt darin, daß irrelevantes Virusmaterial ausgeschlossen ist.

Virale Subunits (Untereinheiten) zur Anwendung in einem Vakzin kann man nach verschiedenen Methoden erzeugen. Beispielsweise kann das Hüllglykbprotein von einem Bakterienwirt exprimiert und gereinigt werden, obwohl diesem Molekül die meisten post-translationalen Modifikationen (wie die Glykosylierung) oder andere Weiterverarbeitungen fehlen. Eine derartige Modifikation kann man durch Verwendung eines eukaryotischen Expressionssystems/ beispielsweise Hefe oder kultivierte Säugetierzellen, erzielen. Virale Gene wurden in Säugetierzellen unter Verwendung von Vaccinia-Viren als Vektor eingeführt, cifshe beispielsweise Mackett, M. et al, 1982, Proc. Nat. Acad.. Sei. USA 79:7415; D. Panicali und

E. Paoletti, 1982, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:4927.

Rekombinante Vaccinia-Viren kann man gemäß den Methoden von Hu et al., Nature 320:537 (1986) oder Chakrabarti et al., Nature 320:535 (1986), auf die hiermit Bezug genommen wird, konstruieren. In diesen Systemen werden die viralen Glykoproteine, die durch Seilen erzeugt werden, welche mit rekombinanten Vaccinia infiziert sind, in geeigneter Weise glykosyliert. Sie können zur Extrusion und abschließenden Isolierung an die Zelloberfläche transportiert werden.

Ein wichtiger Schritt in der Produktion eines Subunit-Vakzines ist eine adequate Reinigung des gewünschten Glykoproteins aus der komplexen Mischung des Expressionssystems. Hierfür sind mehrere Methoden geeignet. Dazu zählen, ohne darauf begrenzt zu sein, die präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Gelpermeations-Chromatographie, ver-

schiedene Chromatographiemethoden (d.h. Ionenaustausch-« Umkehrphasen-, Immunoaffinitä'ts- und hydrophobe Intecaktionschromatographie) und andere. Die meisten dieser Methoden verwendet man in verschiedenen Kombinationen,um im wesentlichen reine Präparate zu erhalten» siehe D.G. Kleid et al., 1981, Science 214:1125, CD. Cabradilla et al., 1986, Biotechnology 4:128, D.J. Dowbenko, 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:7748, auf die hiermit Bezug genommen wird.

Zur Herstellung von Subunit-Vakzinen werden Methoden benötigt, die die Zahl der Stufen reduzieren, die erforderlich sind, um die beste Reinigung eines bestimmten viralen Antigens aus einer komplexen Expressionsmischung zu er-

,_c zielen. Eine effiziente Abtrennung der Antigene von Fremd-

komponenten kann unter Anwendung der Immunoaffinitätschromatographie erfolgen. Diese auch als Immunoadsorption bekannte Methode besteht im Prinzip in der selektiven Adsorption eines Antigens an einen festen Träger, an den . ein spezifischer Antikörper kovalent geknüpft wur^e. Das selektiv adsorbierte Antigen eluiert man dann von einem derartigen Adsorbens mit Antikörper-Affinität, indem man beispielsweise den pH-Wert und/oder die Ionenstärke des Puffers ändert.

Polyklonale Antikörper, die von Tieren, welche mit dem gewünschten Antigen immunisiert wurden oder von natürlich infizierten Personen (siehebeispielsweise Laksy et al., oben) erhalten wurden, wurden häufig als Immunoadsorbentien verwendet. Diese Reagentien besitzen aber im allgemeinen ent-

scheidende Nachteile, beispielsweise daß (i) nicht alle der

Antikörper, die an den unlöslichen Träger binden, spezifisch für das interessierende Molekül sind, so daß eine weitere Reinigung erforderlich wird; (ii) die Ausbeuten an gewünschtem Antigen häufig niedrig sind; und (iii) die 35

Antikörper-Affinitäten ha'ufig von einem Präparat zum anderen schwanken, so daß Modifizierungen der Elutionsmethode erforderlich sind. Mit der Vervendung monoklonaler Antikörper* δ die spezifisch für das gewünschte virale Antigen sind, in Subunit-Vakzinpräparationen anstelle von polyklonalen Antikörpern könnte man diese Schwierigkeiten umgehen.

Monoklonale Mausantikörper die HIV-Antigene binden/ wurden bereits beschrieben. Mehre e Arbeitsgruppen haben über monoklonale Antikörper berichtet/ die spezifisch für das Kernprotein p25 sind (siehe beispielsweise di Marzo Veronese et al./ 1985, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:5199 und J. Chassagne et al./ 1986/ J. Immunol. 136:1442). Monoklonale Antikörper/ die spezifisch für das Membranglykoprotein gp41 sind/ wurden ebenfalls bereits beschrieben (siehe beispielsweise di Marzo Veronese et al./ 1985/ Science 229: 1402).

₇Μρ1 der Erfindung ist es, eine bessere Diagnose einer HIV-Infektion zu ermöglichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

25

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren

zur Bestimmung der Anwesenheit von HIV in biologischen Proben bereitzustellen. Hierzu werden Peptide, welche in der Lage sind, die neutralisierenden Epitope von HIV-Proteinen immunologisch nachzuahmen/ Nukleinsäuresonden, 30

welche für derartige Peptide kodieren und monoklonale Antikörper, die mit derartigen Peptiden reagieren, verwendet.

Daher besteht ein Bedürfnis nach monoklonalen

OO

Antikörpern, die spezifisch für Epitope in genau definierten Bereichen des Haupthüllglykoproteins gpllO sind. Monoklonale Antikörper, welche an diese Bereiche

binden und eine Reduktion oder Eliminierung der Replikation und der Ubertragbarkeit von HIV verursachen, wären von großem therapeutischen und prophylaktischen Nutzen. Darüber hinaus könnte man die monoklonalen Antikörper auch dazu verwenden, den gewünschten Bereich von gpllO beispielsweise für die Anwendung in Vakzinen aus zerstörten Viren oder rekombinanten Expressionssystemen zu reinigen. Weiter könnte der Bereich chemisch synthetisiert werden, der das (die) Epitop(e) enthält (enthalten), das (die) von den monoklonalen Antikörpern erkannt wird (werden), wodurch die mit der Reinigung und Verabreichung größerer Fragmente des gpllO-Moleküls verbundenen Schwierigkeiten vermieden werden könnten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.

Die Erfindung betrifft neue Mittel und Methoden zur Neutralisierung von HIV-Infektionen/ d.h. zur Verhinderung oder substantiellen Inhibierung der Bildung oder cellulären Transmission von infektiösem HIV in einem Wirt. Insbesondere werden Peptide/ die einen neutralisierenden Bereich des HIV nachahmen« sowie monoklonale Antikörper« die mit einem derartigen Bereich reagieren« für die Diagnose und Behandlung und zur Impfung gegen HIV-Infektionen verwendet. Der Ausdruck "neutralisierender Bereich" bezeichnet in diesem Zusammenhang diejenigen Teile des HIV, insbesondere HIV-Proteine, welche Aminosäuresegmente enthalten« die ein oder mehrere Epitope definieren, die mit Antikörpern reagieren« welche entweder alieine oder in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Antikörpern in der Lage sind« HIV-Infektionen zu neutralisieren. Geeignete Assays für die Neutralisierung sind bekannt« dazu zählen beispielsweise die Reduktion von HIV-Infektionen in T-Zellinien« die Reduktion von Piaquerbildenden Einheiten von VSV (bIV) Pseudotpyen, weiche die

Hüllglykoproteine von HIV tragen« Syncytium-Inhibitionstests

β 2 64 08 9

und Virion-Rezeptor-Bindungstests. Wie erwünscht/ ist die neutralisierende Aktivität mit der Antikörperreaktivität in immunochemischen Tests/ wie .Immunofluoreszenz-, Immunoblot- und Radioimmunopräzipii.alions-Assay,vergleichbar. 6

Die neuen Peptide mit typischerweise weniqei* eis ungefähr 50 Aminosäuren enthalten 5 oder meIr zusammenhängende Aminosäuren, die Epitope bilden, welche im wesentlichen denjenigen Epitopen ähneln, welche sich in neutralisierenden Bereichen von HIV gpllO oder p25 befinden,die durch die env-und gag-Bereiche des HIV-Genoms kodiert sind.Von besonderem Interesse sind diejenigen Bereiche, die sich etwa vom Aminosäurerest 301 bis etwa 336 von gpllO und etwa 278 bis etwa 319 und etwa 315 bis etwa 363 von p25 (alle von dem als LAV_00n bezeichneten HIV-Stamm) erstrecken. Die Bezeichnung der Aminosäurereste stammt von der Los Alamos Datenbank (AIDS virus sequence database, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Division, Los Alamos« NM 87545).

Für den Fachmann ist ersichtlich/ daß weitere analoge Bereiche ("Homologe") von anderen HIV-Isolaten idenif iz.iert werden können, basierend auf ihrer Lage in verwandten Proteinen aus unterschiedlichen Isolaten. In der Praxis können derartige Homologe unter Bezug auf LAV_n „-Sequenzdaten folgendermaßen identifiziert werden:

a) die Aminosäuresequenzen von HIV-Isolaten und LAV₀₀₁₁ können so ausgerichtet werden, daß maximale Homologie zwischen den beiden Sequenzen besteht.

b) man kann Peptide identifizieren, die diejenigen Aminosäuresequenzen von HIV-Isolaten umfassen, die der Lokation der LAV_nnM-Peptide entsprechen, welche immunologisch die LAV_nnI1-Proteine nachahmen. Peptide, welche

DnU

die auf diese Weise identifizierten Aminosäuresequenzen von HIV-Isolaten umfassen, ahmen typischerweise die ent-

sprechenden Proteine des HIV-Isolats immunologisch nach.

Diese Methode kann auch auf HIV-Stämme angewundt werden» die erst noch aufzufinden sind. Wenn beispielsweise neue HIV-Stämme identifiziert werden* können deren Hüll- und Kernaminosäuresequenzen mit denjenigen von LAV__RU zur Erzielung maximaler Homologie in Übereinstimmung gebracht werden, nie Methoden/ mit denen die Sequenzen in Übereinstimmung gebracht werden/ sind dem Fachmann bekannt. Wenn die Sequenzen in Übereinstimmung gebracht werden/ ist es wünschenswert die Homologie zwischen den Cysteinresten so groß wie möglich zu halten. Die Aminosäuresequenz des neuen HIV-Stamms oder der HIV-Spezies/ die der Lokation der hier offenbarten Peptide entspricht/ kann synthetisiert und erfindungsgemäß zur Anwendung gebracht werden.

Eine weitere Methode zur Bestimmung von Sequenzen eines homologen Bereichs in anderen HIV-Stämmen wurde von Scharf et al./ Science (1986) 233:1076 beschrieben. Dabei veiwendet man zwei Oligonukleotid-Primer> die an konservierte Sequenzen außerhalb des hier interessierenden Sequenzbereiches binden/ wobei in jedem Primer unterschiedliche restriktive Stellen vorhanden sind. Die DNA von HTV-Stämmen kann dann in vitro vervielfacht werden und die erhaltenen Oligonukleotide können in Vektoren für die Sequenzanalyse kloniert und einem Vakzin als Cassette einverleibt werden/ die ein bestimmtes Epitop des HIV-Stamms darstellt.

&s ist bei der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich/ daß die Epitope/ die innerhalb derartiger Sequenzen vorhanden sind/ mit Antikörpern aller HIV-Stämme oder -spezien eine Kreuzreaktion eingehen. Peptide/ die immunologische Epitope umfassen/ welche eine Spezies oder Serogruppe von einer anderen unterscheiden/ finden zur Identifizierung be-

stimmter Spezlen oder Serogruppen Anwendung und können zur Identifizierung von Personen dienen/ die mit einer oder mehreren HIV-Spezien oder -Serogruppen infiziert sind. Sie sind auch in therapeutischen Mitteln in Kombination mit anderen Peptiden brauchbar/ die entweder von einem homologen Bereich oder einem anderen neutralisierenden Bereich stammen.

Die hier interessierenden Peptide stammen vorzugsweise von der gpllO-Region des Virus ab. Von besonderem InteresjQ se in diesem Bereich sind Pepti'de, die im offenen env-Leserahmen kodiert sind, der sich etwa von Basenpaar (bp) 6667 bis etwa zum Basenpaar 6774 des LAV_BRÜ-Isolats erstreckt. Unterschiedliche homologe Bereiche anderer HIV-Isolate umfassen somit, wie in Tabelle I aufgeführt,

die homologen Sequenzen, die von der Los Alamos Daten-ίο '

bank (ausgenommen LAV2) erhalten wurden.

Weitere Peptide, die zur Erzeugung von und zum Screening auf monoklonale Antikörper brauchbar sind, sind diejenigen, die im offenen env-Leserahmen etwa vom bp 7246 bis etwa

7317 von LAV_BRU kodiert sind. Derartige Antikörper und reaktive Peptide sind insbesondere im Immunoassay brauchbar.

Im gag-Bereich des LAV__DM-Isolats stellen die p25 Aminosäuresequenzen von etwa 278 bis 319 und 315 bis 363 weitere neutralisierende Bereiche des HIV

Es ist für den Fachmann ersichtlich« das weitere neutralisierende Bereiche des HIV identiizieit werden können und zwar auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Lehre. insbesondere zeigen Kombinationen monoklonaler Antikörper, die mit

verschiedenen HIV-Epitopen reagieren«·

eine neutralisierende Aktivität.

TABELLE 1 HXB2 TCTACAAGACCCAACAACAATACAACAAAAAGA ATCCCTATC CyaThrArgProAanAenAenThrArgLyeArg IlcArgllt 309

BH102 Str 309

AUft w.»ww_wwww~ww..w..wwwwww-.w_w«.ww_V — -

ΟΠΟ WWWWW WWW — — ·. WWW«-»WWWWWWW.WW^y0W

ΠλΟ«Ι W ··«·· § ·«·»·»»·· W W WWWWW»W«W»OTW WM^V ^W

Il QM η Γ-τι «τη τ ι τι- --» -»-»»

Π7Π ww w-www— — — w wwwwwww

BRU Str 314

MAl. CIy ArgCly HlePh« 31« ELi —AIa TyrCln Gin— ThrPro— 310 ARV2 Ser Tyr— 312 WMJ2 ——— -Tyr—-—'VaI-^-Ar gSer——————-LeuSer— 306 RFENV Str ThrLye 322 Ib TyrLya ClnStr — —ThrPro— 311

23 .- .... -ClySerAspLyaLyelle—-—————GlnSer— 306

NY5 Lye—GIy Ala— 304 CDC4 2 Ria ValThrLeu 320 LAV2 GIy—Lye—VaI Gin MetLeu 302

. . HXB 2 CAGAGA GGACCA6GGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATG

° ClnArg GlyProGlyArgAlaPhcValThrllcClyLyellcGlyAanMet 326

BH102 · 326

BH8 326

HXB3 326

HyH w^www ww WMWWW ^WWWWM-*. wta w WW-WWWW.WWW ww wv-wwwwwwwwwwwww ww w www·· w ww ww J2w

BRU 331

MAL GIn—L«uTyr-—Thr—IleVal—Aeplle 329 ELI CIyLeu .. .GlnSerLeuTyrThr—Arg—IleValSerArgSer 323 ARV2 HIs—Thr—Arg—lleGlyAsp 327 WMJ2 Arg—Argtflu...—IleClylle 320 RFENV VallleTyrAlaThr—CIn—lleClyAep 337

26 ClyLeu— «...GInAlaLeuTyrThr-—Arg—-ArgThrLyallelle 327

Z3 Arglle LyaVal—TyrAlaLya—CIy , 319 NY5 GlyPro ... ThrLeuTyrAlaArgGlu Aeplle 320

. . CDCA2 , ValTrpTyr—Thr—GIu—UuClyAen 335

" UV2 MetSer HisVal—HlaSerHleTyrClnProIl«—Lye 323

11XB2 ... AGA... CAAGCACATTGT

...Arg...ClnAl«Hi«Cyi 331

BH102 331

BH8 331

H9M 331

BRU 336

MAL Arg—Tyr— 334

fcLl UeIIeGIy 330

ARV2 lie Lye... 333

WMJ2 lie 326

RFK.MV lie—Lye... 343

,e Z6 GIy.., 334

^J3 23 IleThrGly 326

NY5 J25

CDC42 Ue 341

LAV2 ArgProArg Met— 330

12.

Peptid I, das auch als Peptid 29 bezeichnet wird, ist im offenen env-Leserahmen etwa von den Aminosäureresten 308 bis 328 kodiert und besitzt die folgende Aminosäuresequenz, bei der die Oligopeptide innerhalb dieser Sequenz lineare Epitope dieser Sequenz umfassen:

I (29)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ue-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe^uVal-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Y·

in der Y und Y¹, soweit vorhanden« jeweils Sequenzen von bis zu etwa 20 Aminosäuren bedeuten. Wenn Y und/oder Y¹ vorhanden sind, können diese beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren aus Sequenzen, die die Aminosäurereste 308 bis 328 der HIV-Hüllsequenz flankieren, oder irgendeinen Teil dieser flankierenden Sequenzen umfassen. So kann Y beispielsweise und ohne darauf begrenzt zu sein, die LAV_nDM-

Hüllaminosäuresequenz etwa von den Resten 301 bis 307 ganz oder teilweise umfassen und Y' kann die LAV_DDI1-Hüll-

DKU

aminosäuresequenz etwa von den Resten 329 bis 336 ganz oder teilweise umfassen, wie folgt:

II (29a)

Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-I le-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-His-Cy s.

30

In alternativer Weise kann man gekürzte Sequenzen der erfindungsgemäßen Peptide herstellen. In dieser Hinsicht sind die folgenden Sequenzen des Peptide 29 besonders brauchbar:

III (29b)

35

Y-Thr-Arg-Lyi-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-

Y»

worin Y und/oder Y'/ soweit vorhanden» jeweils Sequenzen von bis zu etwa 20 Aminosäureresten bedeuten^

XV (29c)

Y-IJe-Cln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-

Xle-Gly-Lys-Ile-Y· ...

worin Y und Y¹/ soweit vorhanden« jeweils von Sequenzen bis zu etwa 20 Aminosäureresten bedeuten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind besonders interessierende homologe Bereiche des ARV-2-Isolats in dem offenen env-Leserahmen von etwa den Aminosäureresten Nr. 306 bis etwa 323 kodiert. Sie haben typischerweise die folgende Aminosäuresequenz, bei der Oligopeptide ι innerhalb dieser Aminosäuresequenz lineare Epitope : innerhalb einer derartigen Sequenz umfassen.

V (177)

Y-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Tyr-lle-Gly-Pro-Gly-Arg-" Ala-Phe-His-Thr-Thr-Gly-Arg-Ile-Y·

worin Y und Y% soweit vorhanden« jeweils 1 bis etwa 20 oder mehr Aminosäurereste umfassen. Wenn Y und/oder Y¹ vorhanden sind« können sie 1 oder mehrere Aminosäurereste von Sequenzen« welche die Aminosäurereste 306 bis 323 der ARV-2-Hüllsequenz flankieren« oder einen Teil dieser flankierenden Sequenzen umfassen. Insbesondere kann Y die HIV-Hüllaminosäuresequenz etwa von den Resten 299 bis ganz oder teilweise umfassen; Y¹ kann die HIV-Hüllami -:- säuresequenz etwa von den Resten 324 bis 333 ganz odvc teilweise umfassen.

Zn alternativer Weise kann man verkürzte Sequenzen der 3g Peptide V herstellen. In dieser Hinsicht sind die folgenden

Sequenzen besonders brauchbar:

VI (177a)

Y-Thr-Arg-Lye-Ser-Ile-Tyr-Ile-Gly-Pro-Gly-Y¹; und VII

Y-Asp-Cye-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-

Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys-Y·

worin Y und/oder Y¹, soweit vorhanden, jeweils Sequenzen von bis zu 20 oder mehr Aminosäureresten bedeuten.

Ein weiteres Beispiel umfaßt homologe Bereiche des LAV-2-Isolats, wie sie beispielsweise im offenen env-Leseraster ._ etwa von den Aminosäureresten 311 bis 330 kodiert sind.

Sie besitzen typischerweise die folgende Sequenz:

VIII (110-2-2)

Y-Lys-Thr-Val-Lys-Ile-Nor-Leu-Nor-Ser-Gly-His-Val-Phe-His-Ser-His-Tyr-Gln-Pro-Y'

worin Y und/oder Y¹» soweit vorhanden» jeweils Sequenzen von bis zu 20 oder mehr Aminosäurereste bedeuten (siehe Nature 326:662 (1987), worauf hiermit Bezug genommen wird).

Gegenstand der Erfindung sind weiter neue Zellinien, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu produzieren, sowie Mittel, die diese Antikörper enthalten. Die Antikörper sind

2 4 in der Lage bei extrem hohen Titern (von 10 bis 10 bis

etwa 10⁷ oder mehr) neutralisierende Bereiche, die in einer vorbestimmten Sequenz des Hüllglykoproteins gp110 oder p25 enthalten sind, deren Proteinprekursoren, biologisch exprimierte rekombinante Fusionsproteine und syn-

thetische Peptide, die ein oder mehrere Epitope innerhalb des vorbestimmten Sequenzbereiches von gp110 oder p25 enthalten, selektiv zu erkennen. Die Hybridzellen besitzen ein identifizierbares Chromosom, bei dem sich die Keimbahn-DNA umgeordnet hat, um für einen Antikörper zu kodieren, der eine Bindungsstelle für ein Epitop an gp110 oder p25 aufweist, das einige oder alle klinische HIV-Isolate aufweisen. Diese monoklonalen Antikörper kann man auf vielfältige Weise anwenden. Dazu zählen die Anwendungen in der Diagnose und Therapie sowie die Anwendung zur Identifizierung weiterer kreuz-reaktiver Antikörper, wie blockierende Antikörper. Peptide oder Polypeptide, die das (die) Epitop(e) enthalten, mit dem sie reagieren, finden separate Anwendung als Immunogene für Vakzine oder als therapeutische Mittel.

15

Blockierende Peptide

Eine andere AusfUhrungsform der Erfindung betrifft, hauptsächlich zur Anwendung zusammen mit den obigen Peptiden oder neutralisierenden monoklonalen Antikörpern/ weitere Peptide oder Antikörper, die die HIV-Bindung an Rezeptoren stören, um die HlV-Infektivität weiter zuschvächen. Vorzugsweise kann man die sogenannten "blockierenden Peptide"/ die in der Lage sind, die Virusproliferation zu inhibieren, sowie monoklonale Antikörper/ die spezifisch für Epitope sind, die in derartigen blockierenden Peptiden enthalten sind, dazu verwenden/ die Wirksamkeit der Behandlung von HIV-Infektionen zu steigern. HIV-blockierende Peptide entsprechen typischerweise derjenigen HIV-Aminosäuresequenz/ von der man annimmt/ daß sie für die Anlagerung des Virus an eine Wirtszelle wesentlich ist/ beispielsweise die env-kodierten Aminosa'urereste etwa 190 bis etwa 197 vonLAV_ßRU und etwa 185 bis etwa 192 von ARV-2 und HTLV-III(BH-IO). Dazu zählen das Peptid T-Oktapeptid (Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr) und dessen verschiedene Derivate (z.B. IX unten) und Analoge (z.B. XI, unten), das von Pert et al (1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9254-9258, worauf hiermit Bezug genommen wird) be-

16

schrieben ist und das sich auf dem Hullglykoprotein (gpllO oder 120) befindet.

Von besonderem Interessse sind beispielsweise blockierende Peptide mit den nachfolgenden Sequenzen« wobei vorzugsweise der NH^-Terminus acetyliert und der COO.H-Terminus amidiert ist:

IX (173D) Y-.Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Y¹ ι

X (186) Y-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr -Y';

XI (187) Y-Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr-Y·t

XII (188) Y-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y¹ t

XIII (189) Y-Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly-Y·;

XIV (190) Y-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Y¹ ;

²⁰ XV (191)

Y-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Y'}

worin bei jedem Peptid Y und Y'# soweit vorhanden« jeweils 25

eine Aminosäuresequenz von bis zu etwa 20 Aminosäuren bedeutet. Epitope oder antigene Determinanten innerhalb dieser Peptide sind typischerweise durch wenigstens 5 benachbarte Aminosäuren definiert und finden Anwendung beispielsweise für die Nachahmung natürlich vorkommender HIV-Antigen Stellen bei der Herstellung von HIV-reaktive Antikörpern und Vakzinen.

Gewinnung monoklonaler Antikörper

Die Herstellung monoklonaler Antikörper kann erfolgen« indem man die Expression von Nukleinsäuresequenzen immortalisiert/ die für

Antikörper kodieren, die spezifisch für HIV sind, durch Einführung derartiger Sequenzen, typischerweise von für den Antikörper kodierender cDNA, in einen kultivierbaren Wirt. Die inunortalisierte Zellinie kann eine solche Säuge-

tierzellinie sein, die durch Onkogenese,

Transfektion/ Mutation oder dergleichen transformiert wurde. Zu derartigen Zellen zählen Myelomlinien» Lymphomlinien oder andere Zellinien, die in der Lage sind,die Expression und Sektretion des Antikörpers in vitro herbeizuführen. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommendes Immunoglobulin eines Säugetieres sein«das durch Transformation eines Lymphocyten, insbesondere eines Splenocyten/ mit Hilfe eines Virus oder mittels Fusion des Lymphocyten mit einer neoplastischen Zelle/ beispielsweise einem Myelom, unter Bildung einer Hybridzellinie produziert wird. Typischerweise erhält man den Splenocyten von einem Tier/ das gegen das HIV-Virus oder ein Fragment mit einer epitopen Stelle davon immunisiert wurde.

Immunisierungsmethoden sind bekannt/ sie können beträchtlich

variieren und dennoch wirksam bleiben/ siehe Goding/ Monoclonal Antibodies: Principles and Practice/ Academic Press/ 2. Aufl. (1986)/ auf das hiermit Bezug genommen wird. Zerstörte Viren/ synthetische Peptide und bakterielle Fusionsproteine/ die die antigenen Fragmente des gpllO oder p25-Moleküls enthalten/ kann man als Immunogene verwenden. Vorzugsweise wird das Immunogen zerstörter Viren/ Peptide oder rekombinanter Proteine durch Proteine oder Fragmente davon angereichert/ welche die Epitope enthalten/ wofür Antikörper produzierende B-Zellen oder Splenocyten gewünscht sind. Insbesondere kann man Lösungen/ die Lysate oder Extrakte zerstörter Viren enthalten« oder überstände von biologisch exprimierten rekombinanten Proteinen öder zerstörten Expressionsvektoren durch Glykoproteine wie gewünscht anreichern/ wobei man Reinigungsmethoden/ wie beispielsweise die Polyacrylamid-Gelelektrophorese/ verwendet.

Die Lektin-Affinitä'tsreinigung ist eine bevorzugte zweckmäßige Methode zur Reinigung von gpllO und anderen Glykoproteinen/ beispielsweise die Affinitätsreinigung unter Verwendung von lentilem Lektin. Das Ausmaß/ in dem die Glykoproteine aus den Lösungen zur Anwendung als Immunogen gereinigt werden/ kann stark schwanken/ d.h. von weniger als 50 % bis zu Üblicherweise wenigstens 75 bis 95 %/ wünschenswerterweise 95 bis 99 % und besonders erwünscht bis zur absoluten Homogenität.

Wenn man die Proteine in dem gewünschten Maß gereinigt hat/ kann man sie in einem zur Immunisierung geeigneten physiologischen Träger suspendieren oder darin lösen oder man kann sie an ein Adjuvans koppeln. Eine bevorzugte Technik umfaßt beispielsweise die Adsorption der Proteine und der Fragmente davon an lentiler Lektinagarose oder einem anderen makromolekularen Träger für die Injektion. Immunogene Mengen antigener Präparate/ die mit HIV-Proteinen/ einschließlich dem gpllO-Glykoprotein und dem p25-Kernprotein/ oder den antigenen Teilen davon angereichert sind/ werden im allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von 1 \iq bis 20 mg/kg des Wirtes injiziert. Die Verabreichung kann_;beispielsweise durch intramuskuläre/ peritoneale/ subkutane/ intravenöse etc., Injektion erfolgen. Die Verabreichung kann 1 χ oder mehrere Male und üblicherweise in 1- bis 4-wöchigen Intervallen erfolgen. Die immunisierten Tiere kontrolliert man hinsichtlich der Produktion von Antikörpern gegen die gewünschten Antigene/ anschließend entfernt man die Milz/ isoliert die B-Lymphocyten der Milz und fusioniert sie mit einer Myelomzellinie oder transformiert sie. Die Transformation oder Fusion kann man in üblicher Weise durchführen/ die Fusionsmethode ist in zahlreichen Patenten beschrieben/ beispielsweise in US-PS'en 4 172 124/ 4 350 683/ 4 363 799/ 4 381 292 und 4 423 147; man vergleiche auch/ Kennett et al/ Monoclonal Antibodies (1980) und die darin angeführten/ sowie Godin wie oben erwähnt; auf alle diese Publikationen wird hiermit Bezug genommen.

Die immortalisierten Zellinien kam man klonieren und gemäß üblichen Verfahren einem Screening unterziehen. In den ZeIlüberständen kann man die Antikörper» die in der Lage sind/ an die gewünschten gpllO oder p25-HIV-Proteine zu binden/ die rekombinanten Fusionsproteine oder die synthetischen Peptide nachweisen/ die den gewünschten epitopen Bereich enthalten. Geeignete immortalisierte Zellinien kann man dann in vitro wachsen la>sen oder in die Peritonealkavität eines geeigneten Wirts zur Gewinnung von Mscites-Flüssigkeit injizieren. Weil erf indungsgeniäße Antikörper vorliegen/ die als spezifisch für Epitope bekannt sind/ welche beispielsweise innerhalb der Bereiche vorhanden sind/ die durch den LAV__OII-Genombereich von etwa bp6688 bis etwa bp 6750 (kodierend für Peptid 29) oder von etwa bp7246 bis etwa 7317 (kodierend für Peptid 30) (bp-Numerierung gemäß Wain-Hobson et al., Cell 44:9 1985/ auf die hiermit Bezug genommen wird)/ kodiert sind/ kann man die Überstände mit den monoklonalen Antikörpern einem kompetitiven Assay unterziehen. Somit können weitere immortalisierte Hybridom-Zellinien mit den gewünschten Bindungseigenschaften leicht aufgrund der Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen/ für ein bestimmtes Antigen spezifischen Antikörper aus einer Vielzahl von Quellen herstellen. Alternativ kann man diese Zellinien mit anderen neoplastischen B-Zellen fusionieren/ wobei diese anderen B-Zellen als Empfänger für die Genom-DNA/ die für die Antikörper kodiert/ dienen kann.

Neoplastische B-Zellen von Nagetieren/ insbesondere Mäusen oder Ratten,sind bevorzugt. Sie können jedoch auch von anderen Säugetierspezien stammen/ beispielsweise von Lagomorpha/ Rindern/ Schafen/ Pferden/ Schweinen/ Vögel (Avian) oder dergleichen. Man kann die Immunisierung dieser Tiere auf einfache Weise durchführen und ihre Lymphocyten, insbesondere die Splenocyten, für Fusionen gewinnen.

Die von den transformierten oder Hybridzellinien sekretierten monoklonalen Antikörper können von einer der Klassen oder Unterklassen der Immunoglobuline sein/ wie IgN_f IgD, IgA/ IgG, ₄ oder IgE. IgG ist bevorzugt/ weil es sich dabei um

δ den üblichsten Isotyp handelt; der in Diagnose-Assays verwendet wird. Die monoklonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente/ wie Fv/ Fab/ F(ab')₂' verwendet werden. Sie werden üblicherweise jedoch intakt verwendet.

Um eine mögliche Antigenität eines monoklonalen Antikörpers/ der nicht vom Menschen stammt/ in einem Humanwirt zu um· gehen/ kann man chimere Antikörper konstruieren/ bei denen das Antigen-Bindungsfragment eines Immunoglobulinmoleküls (variabler Bereich) mittels einer Peptidverknüpfung von wenigstens einem Teil eines anderen Proteins gebunden ist/ das beim Menschen nicht als fremd erkannt wird/ wie beispielsweise die "cast out portion" eines Humanimmunogiobulinmoleküls. Dies kann dadurch erfolgen/ daß man die Exone des variablen Bereichs des Tieres mit Human-Kappa- oder -gammaexonen des konstanten Bereichs fusioniert. Hierfür sind dem Fachmann mehrere Methoden bekannt/ beispielsweise diejenigen/ die in PCT 86/01533/ EP-A-171496 und EP-A-173494 beschrieben sind/ auf die hiermit Bezug genommen wird.

25

Pharmazeutische Formulierungen und Anwendungen

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit neutralisierender Wirkung/ beispielsweise diejenigen/ die mit einer Epitopstelle auf gpllO oder p25 oder mit einem blockierenden Peptid reagieren/ können pharmazeutischen Mitteln als eine Komponente einverleibt werden/ um HIV-Infektionen zu schwächen. Das Mittel soll eine therapeutische oder prophylaktische Menge von wenigstens einem der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Der pharmazeutische

₂₁ 2 84 Ü8

Träger soll eine kompatible« nicht-toxische Substanz

sein/ die geeignet ist/ die monoklonalen Antikörper an den Patienten zu vermitteln. Man kann steriles Wasser* Alkohol» Fette/ Wachse und inerte Peststoffe als Träger verwenden. Pharmazeutisch . verträgliche Adjuvantien (Puffer, Dispergiermittel) können den ?rfindungsgemäßen Mitteln ebenfalls einverleibt werden. Diese Mittel können einen einzelnen monoklonalen Antikörper enthalten/ um beispielsweise spezifisch für HIV-Stämme mit Hüllglykoproteinen zu sein/ die eine Epitopstelle innerhalb eines Bereiches enthalten/ der durch bp6688 bis bp6750 kodiert ist. In alternativer Weise kann ein pharmazeutisches Mittel einen oder mehrere monoklonale Antikörper enthalten und einen "Cocktail" bilden. Beispielsweise ein Cocktail/ der monoklonale Antikörper gegen verschiedene HIV-Stämme enthält/ stellt ein universell anwendbares Produkt mit therapeutischer oder prophylaktischer Aktivität gegen die meisten klinischen HIV-Isolate dar. Der Cocktail kann monoklonale Antikörper enthalten/ die an HIV-Proteine oder -glykoproteine binden/ die sich von gpllO oder p25 unterscheiden/ wie beispielsweise gp41-Glykoprotein oder p34-Nuklease/Integrase. Das Molverhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörperkomponenten unterscheidet sich im allgemeinen um nicht mehr als den Faktor 10/ insbesondere um nicht mehr als den Faktor 5 und liegt im allgemeinen bei etwa 1:1-2 pro jeder anderer Antikörperkomponente.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kann man als separat zu verabreichende Mittel einsetzen/ die zusammen mit anderen anti-retroviralen Mitteln/ einschließlich blockierenden Peptiden, gegeben -erden. Der gegenwärtige Stand der Entwicklung anti-retroviraler Mittel und von Anti-HIV-Mittel ist im einzelnen in Mitiuya et al./ Nature 325:773-778/ 1987 beschrieben/ worauf hiermit Bezug genommen wird,

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, Peptide und pharmazeutischen Mittel sind insbesondere zur oralen und parenteralen Verabreichung brauchbar. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Mittel parenteral verabreicht, d.h. δ subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb auch Mittel zur parenteralen Verabreichung zur Verfugung, die eine Lösung uer monoklonalen Antikörper, Peptide oder eines Coc».tails davon in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wäßrigen Träger, umfassen. Man kann eine Vielzahl wäßriger Träger einsetzen, beispielsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%-ige Kochsalzlösung, 0,3%-iges Glycin und dergleichen, Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei an Teilchen. Die Mittel kann man mit Hilfe herkömmlicher und bekannter Methoden sterilisieren. Die Mittel können pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich sind, um annähernd physiologische Bedingungen einzustellen, wie Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffer, Mittel zur Einstellung der Toxizität und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat und dergleichen. Die Menge an Antikörper in diesem Formulierungen kann in weitem Umfange variieren, d.h. von weniger als ungefähr 0,5 Gew.-%, üblicherweise etwa oder wenigstens etwa 1 Gew.-% bis zu 15 oder 20 Gew.-%. Diese Menge wird hauptsächlich im Hinblick auf die Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten und dergleichen, und vorzugsweise im Hinblick auf die Art der Verabreic'iung gewählt.

Ein typisches pharmazeutisches Mittel zur intramuskulären Injektion kann somit 1 ml steriles gepuffertes Wasser unO 50 mg monoklonale Antikörper enthalten. Ein typisches Mittel zur intravenösen Infusion kann 250 ml sterile Ringer-Lösang und 150 mg monoklonale Antikörper enthalten. Methoden zur Herstellung parenteral verabreichbarer Mittel sind bekannt oder dem Fachmann geläufig und sind detailliert beispiels-

weise in Remington's Pharmaceutical Science/ 15. Aufl./ Mack Publishing Company/ Easton/ Pennsylvania (1980) beschrieben/ worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper unü Peptide kann man zur Lagerung lyophilisieren und vor der Anwendung in einem geeigneten Träger rekonstituierer. Di&ses Verfahren hat sich bei üblichen Immunoglobulinen als wirksam erwiesen. Dabei kann man bekannte Lyophilisiorungs- und Rekonstitutionstechniken anwenden. Es ist für den Fachmann ersichtlich/ daß iie Lyophilisierung und ^konstitution zu einem unterschiedlichen Grad an Antikörperaktivitätsverlust führen kann (bei herkömmlichen Immunoglobulinen neigen IgM-Antikörper dazu einen größeren Aktivitätsverlust zu erleiden als IgG-Antikörper) und daß daher die angewandte Menge angepaßt werden muß/ um den Verlust zu kompensieren.

Die Mittel/ die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper/ Peptide oder Cocktails davon enthalten/ kann man zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen verabreichen. Bei der therapeutischen Verabreichung werden die Mittel einem Patienten/ der bereits mi¹ HIV infiziert ist/ in einer Menge verabreicht/ die ausreicht/ um die Infektion und die damit verbundenen Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zum Stehen zu bringen. Die Dosis/ die man benöuigt/ um dies zu erreichen/ ist als "therapeutisch wirksame .""osis" definiert. Die bei dieser Anwendung wirksamen Mengen richten sich nach der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Im.tiun-

oQ systems des Patienten/ sie liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 200 mg Antikörper pro kg Körpergewicht/ wobei Dosierungen von 5 bis 25 rag pro kg üblicherweise zur Anwandung kommen. Da die erfindungsgemäßen Produkte im allgemeinen böi schweren Erkrankungen/ d.h. in lebensbedrohenden

_g5 oder potentiell lebensbedrohenden Situationen zur Anwendung kommen/ ist es möglich und kann vom behandelnden Arzt er-

wünscht sein,· eine wesentlich größere Menge dieser Antikörper zu verabreichen.

Bei prophylaktischer Anwendung verabreicht man die Mittel ι c die die erfindungsgemäßen Peptide/ Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten» einem Patienten» der noch nicht mit HIV infiziert ist« der aber möglicherweise vor kurzem einer derartigen Infektion ausgesetzt war oder angenommen hat» daß er dieser ausgesetzt war oder einem Risiko unterliegt« dem Virus ausgesetzt zu sein.' Die prophylaktische Verabreichung dient dazu« die Widerstandskraft des Patienten gegen eine potentielle Infektion zu stärken oder den Patienten gegen das Virus zu impfen. Eine hierfür geeignete Menge wird als "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert.

,_ Auch bei dieser Anwendung richten sich die genauen zu ver-Io

abreichenden Mengen nach dem Gesundheitszustand und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten» sie liegen im allgemeinen im Bereich von 0»l mg bis 25 mg pro kg» insbesondere 0/5 mg bis 2»5 mg pro kg.

Man kann Einzel- oder Mehrfachverabreichungen der Mittel

vornehmen« wobei die Dosis und das Verabreichungsschema vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die pharmazeutischen Formulierungen sollten in jedem Fall eine Menge an erfindungsgemäßen Antikörpern zur Verfugung stellen» die

ausreicht» um den Patienten wirksam zu behandeln.

Darüber hinaus finden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper als Target-spezifisches Trägermolekül Anwendung.

Ein Antikörper kann an ein Toxin zur Bildung eines Immuno-30

toxins oder an ein radioaktives Material oder Arzneiproduktmittel zur Bildung :ines Radiopharmakon oder Arzneimittels gebunden sein. Methoden zur Herstellung von Immunotoxinen und Radiopharmaka sind bekannt (siehe beispielsweise Cancer Treatment

Reports 68:317 (1984))

35

Es ist auch möglich, daß Heteroaggregate aus erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern und Human-T-Zellaktivatoren, wie monoklonale Antikörper gegen das CD3-Antigen oder gegen den F -J^-Rezeptor an T-Zellen, Human-T-Zellen oder F- Jf*-aufweisende Zellen (wie K-Zellen oder Neutrophile) in die Lage versetzen/ HIV-infizierte Zellen über eine Antikörper abhängige, zellvermittelte Cytolyse (ADCC) abzutöten. Derartige Heteroaggregate kann man beispielsweise bilden, indem man die Anti-HIV-Antikörper mit den Anti-CD3-Antikörpern> unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagens N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol* propionat kovalent vernetzt, wie dies von Karpowsky et al., J. Exp. Med. 160:1686 (1984) beschrieben ist, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die erfindungsgemäßen Mittel auf Basis der Peptide alleine können auch therapeutische Anwendung finden, wobei die Verabreichung zu einer Reduktion oder zur Eliminierung von HIV bei einem infizierten Wirt führt. Diese Mittel, wie

Peptid 29, die blockierenden Peptide und Peptid 126,

welches in der USSN 930785 beschrieben ist, auf die hiermit Bezug genommen wird, kann man in geeigneten physiologischen Trägern intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal usw. verabreichen. Verschiedene Träger sind geeignet, dazu zählen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Kochsalzlösung, Wasser, Kaliumchlorid, Natriumlactat oder dergleichen. Die Peptidkonzentration kann in einem weiten Bereich in Abhängigkeit von der endgültigen Anwendung, Aktivität und Art der Verabreichung variieren. Vorzugsweise liegt bei den Peptiden eine Amidierung des COOH-Terminus, eine Forrayliorung des NH^-Terminus oder eine andere pharmazeutisch annehmbare Derivatisierung vor. Die Zugabe blockierender Peptide zu den Peptiden, die einen neutralisierenden HIV-Bereich nachahmen, und/oder die spezifisch reagierenden erfindungsgemäßen

Antikörper führen zu einer signifikant erhöhten therapeutischen Wirksamkeit. Die Formulierungen können auch andere Anti-HIV-Mittel enthalten (die von den die Peptide bindenden monoklonalen Antikörper verschieden sind),wie beispielsweise 3'-Azido-3'-deoxythymidin, 2'/3'-Dideoxycytidin, 2'/3'-Dideoxy-2·#3'-didehydrocytidin etc.

Anwendung der monoklonalen Antikörper bei der Immuno-

aff initätsreinigung _,

Die monoklonalen Antikörper» die spezifisch für Polypeptide sind/ welche gpllO oder andere Antigen-Determinanten enthalten/ insbesondere diejenigen Antigen-Determinanten/ die von biologisch exprimierten rekombinanten Fusionsproteinen oder Lysaten oder Extrakten von kultivierten HIV erhalten wurden* lassen sich besonders vorteilhaft bei Reinigungsverfahren anwenden. Im allgemeinen haben die

Antikörper Affinitätskonstanten (affinity association

8 12 constants) im Bereich von 10 bis 10 M. Derartige Antikörper kann man verwenden zur Reinigung von rekombinanten Fusionsproteinen von dem Kulturmedium des rekombinanten Exrepssionssystems/ wenn das exprimierte Protein sekretiert wird/ oder von den Komponenten des zerstörten« biologischen Expressionssystems/ wenn das Protein nicht sekretiert wird. Die monoklonalen Antikörper/ die in der Lage sind/ mit gpllO oder anderen Antigen-Determinanten zu reagieren/ werden im allgemeinen an ein Substrat oder einen Träger gebunden oder daran immobilisiert. Die Lösung/ die die HIV-Antigendeterminanten enthält/ wird dann mit dem immobilisierten Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht/ die zur Bildung von Immunkomplexen zwischen dem Antikörper und den die gpllO-Antigen-Determinanten enthaltenden Polypeptiden geeignet sind. Ungebundenes Material wird von den gebundenen Immunkomplexen abgetrennt/ diese

Komplexe oder die gpllO-Antigenfragmente werden dann vom Träger abgetrennt.

Die monoklonalen Antikörper werden typischerweise bevor sie an den Träger gebunden werden/ von AscitesflUssigkeit oder Zellkulturüberstanden grob gereinigt. Derartige Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt/ dazu zählt die Fraktionierung mit Neutralsalzen bei hoher Konzentration. Weitere Methoden» wie DEAE-Chromatographie/ GeIfiltrations-Chromatographie, präparative Gelelektrophorese oder Protein-A-Affinitäts-Chromatographie/ kann man ebenfalls verwenden/ um die monoklonalen Antikörper zu reinigen bevor sie als Immunoadsorbens Anwendung finden.

Der Träger/ an dem die monoklonalen Antikörper immobilisiert werden/ sollte die folgenden allgemeinen Eigenschaften besitzen :

(a) im allgemeinen schwache Wechselwirkungen mit

Proteinen/ um eine nicht-spezifische Bindungen zu minimieren/

(b) gute Fließeigenschaften/ die einen Durchfluß von Materialien mit hohem Molekulargewicht erlauben/

^b (_c) Vorhandensein chemischer Gruppen/ die aktiviert oder modifiziert werden können/ um eine chemische Bindung des monoklonalen Antikörpers zu ermöglichen/

(d) physikalische und chemische Stabilität unter den Bedingungen/ die für die Bindung des monoklonalen Antikörpers Anwendung finden und

(e) Stabilität gegenüber den Bedingungen und Konstituenten der Puffer/ die für die Adsorption und Elution des

Antigens erforderlich sind. Einige üblicherweise ver-35

wendete Träger sind Agarose, derivatisierte Polystyrole/ Polysaccharide« Polyacrylamidperlen/ aktivierte Cellulose/ Glas und dergleichen. Es gibt verschiedene chemische Nethoden/ um die Antikörper an die Substratträger anzuknüpfen/ siehe allgemein Cuatrecasas P./ Advances in Enzymology 36:29 (1972). Die erfindungsgemäßen Antikörper kann man direkt oder in alternativer Weise über ein Bindeglied oder Zwischenstück (linker/ spacer) an dem Träger anknüpfen.

Die für die Immobilisierung monoklonaler Antikörper an chromatographischen Trägern erforderlichen allgemeinen Bedingungen sind bekannt» siehe beispielsweise P. Tijissen/ 19851 Practice and Theory of Enzyme Immunoassay/ worauf hiermit Bezug genommen wird. Das tatsächlich verwendete Koppelungsverfahren ist in geringem Maße abhängig von der Eigenschaft und der Art des anzukoppelnden Antikörpers. Monoklonale Antikörper besitzen Eigenschaften/ die üblicherweise von Charge zu Charge konsistent sind/ so daß die erwähnten Bedingungen optimiert werden können. Die Verknüpfung erfolgt typischerweise über kovalente Bindungen.

Zu der Separationsmatrix gibt man dann eine Suspension von Extrakten oder Lysaten von HIV-Viren/ den Überstand von einem kultivierten biologischen Expressionssystem oder eine Suspension der zerstörten Zellen. Man inkubiert die Mischung unter Bedingungen und während einer Zeitdauer/ die zur Bildung des Immunkomplexes ausreichend ist/ üblicherweise wenigstens 30 Min./ zweckmäßiger 2 bis 24 h. Die Immunkomplexe/ die Polypeptide mit antigenen Teilen von gpllO enthalten/ trennt man aus der Reaktionsmischung ab. Man entfernt die Mischung beispielsweise durch Elution und wäscht die gebundenen Immunkomplexe extensiv mit Adsorptionspuffer. Die Immunkomplexe kann man dann von der

Separationsmatrix eluieren, wobei man ein Eluierungsmittel verwendet/ das mit dem zur Anwendung kommenden Träger verträglich ist. Derartige Eluierungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Auch die Polypeptide/ die gpllO oder andere antigene Teile enthalten/ kann man selektiv entfernen. Beispielsweise kann man Peptide/ die ein Epitop enthalten/ das durch die Antikörper erkannt wird/ dazu verwenden/ um um die Antikörperbindungsstellen zu konkurrieren. Dies stellt ein alternatives Elutionsverfahren dar/ das unter milden Elutionsbedingungen durchgeführt werden kann. Das selektiv adsorbierte Polypeptid/ das das gpllO-Antigen enthält/ kann man von einem Antikörper-Affinitätsadsorbens eluieren/ indem man den pH und/oder die Ionenstärke des Puffers ändert. Chaotrope Mittel finden ebenfalls Anwendung zur Entfernung des gebundenen Antigens. Die Wahl eines chaotropen Mittels/ dessen Konzentration und der Eluierungsbedingungen hängen von den Charakteristika der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung ab, aber sobald sie festgelegt sind/ sollten sie keinen Änderungen unterworfen werden/ die üblicherweise bei polyklonalen Affinitäts-Separations-Systemen erforderlich sind.

Es kann erforderlich sein/ den pH-Wert des eluierten Materials an den physiologischen pH-Wert anzupassen/ wenn ein hoher oder niedriger pH-Wert oder Ionenstärkepuffer verwendet wurden/ um die gebundenen gpllO-Antigene von der Separationsmatrix abzutrennen. Auch eine Dialyse oder eine GeIfiltrations-Chromatographie kann zur Entfernung überschüssiger/ im Eluierungsmittel verwendeter Salze erforderlich werden/ um die Rekonstitution von gpllO oder von Polypeptiden/ die Antigenfragmente von gpllO enthalten/ zu nativen Konformationen zu ermöglichen.

Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben beispielsweise im wesentlichen reines gpllO oder im wesentlichen reine PoIypeptide/ die Antigenfragmente davon enthalten/ hergestellt

entweder auf natürliche Weise durch .infizierte Zellkulturen oder rekombinante Expressionssysteme von Bakterien/ Hefen oder in Kultur gehaltenen Insekten oder Säugetierzellen. gpllO/ die Fragmente davon oder andere gereinigte Proteine besitzen typischerweise eine Reinheit von mehr als 50 %/ üblicherweise von wenigstens 75 % und häufig von mehr als 95 bis 99 %. Diese Produkte finden vielfältige Anwendung.

Die HlV-gpllO-Proteine, die Polypeptide/ die Antigenfragmente davon enthalten oder andere Proteine/ die im wesentlichen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wurden/ haben viele Anwendungsmöglichkeiten. Dazu zählen AIDS-Subunit-Vakzinformulierungen/ bei denen das Immunogen eine wirksame Dosis an Antigen-Determinanten von beispielsweise gpllO oder einem neutralisierenden Bereich davon umfaßt. Zu weiteren Komponenten der Formulierung können diejenigen antigenen Teile von HIV-Proteinen oder -Glykoproteinen zählen/ die die Produktion von Antikörpern(vorzugsweise neutralisierenden Antikörpern) in einem immunisierten Wirt stimulieren/ wobei diese Antikörper in der Lage sind/ eine Schutzwirkung gegen eine nachfolgende HIV-Infektion auszuüben.

Anwendung der monoklonalen Antikörper in der Diagnose

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind auch für Diagnosezwecke brauchbar. Sie können hierfür markiert oder unmarkiert zur Anwendung kommen. Typischerweife umfaßt ein Diagnose-Assay den Nachweis einer Komplexbildung durch die Bindung eines monoklonalen Antikörpers an ein HIV-Antigen.

Unmarkierte Antikörper finden beispielsweise in Agglutinations-Assays Anwendung. Darüber hinaus können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern ( Bweiten Antikörpern)/die mit den monoklonalen Antikörpern reaktiv sind/ wie beispielsweise Antikörper/ die spezifisch

QQ für Immunoglobulin sind/ eingesetzt werden. In alternativer Weise können die monoklonalen Antikörper direkt markiert

werden. Man kann eine Vielzahl von Markierungsmitteln einsetzen« beispielsweise Radionukltde« > fluoreszierjnde Substanzen« Enzyme, Enzymsubstrate« Enzymkofaktoren« Enzyinhibitoren« Liganden (insbesondere Haptene) etc. Zahlreiche Arten von Immunoassays stehen zur Verfügung« dazu zählen beispielsweise diejenigen« die in den US-PSen 3 817 827«

3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345,

4 034 074 und 4 098 876 beschrieben sind« auf die hiermit Bezug genommen wird.

10

üblicherweise verwendet man die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptide in Enzym-Immunaassays,- wobei beispielsweise die erfindungsgemäßen Antikörper oder die zweiten Antikörper einer anderen Spezies an ein Enzym konjugiert werden· Wenn man eine biologische Probe mit HIV-Antigenen« wie Humanblutserum, Speichel« Samen« Vaginalsekretionen oder eine Virus-infizierte Zellkultursuspension« mit den Antikörpern kombiniert, erfolgt eine Bindung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen« die das gewünschte

Epitop aufweisen. Man kann dann derartige Proteine oder

Virusteilchen von den ungebundenen Reagentien abtrennen und einen zweiten Antikörper (mit einem Enzym markiert) zugeben. Anschließend wird die Anwesenheit des Antikörper-Enzykonjugats« das spezifisch an das Antigen gebunden ist, bestimmt. Man kann auch weitere herkömmliche, dem Fachmann bekannte Verfahren verwenden.

Zum Nachweis einer HIV-Infektion oder der Anwesenheit von HIV-Antigenen kann man auch Kits unter Anwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Verfügung stellen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperzusammensetzungen kann man, üblicherweise in lyophilisierter Form entweder allein oder zusammen mit weiteren Antikörpern, die spezifisch für andere HIV-Epitope sind« zur Verfügung stellen. Die Antikörper« die an ein Markierungsmittel konjugiert sein oder unkonjur/iert vorliegen können« sind in den Kits zusammen mit Puffern, wie

Tris-# Phosphat-/ Carbonatpuffer etc.# Staoilisierungsmitteln, Bioziden/ inerten Proteinen« wie Rinderserumalbumin oder dergleichen enthalten. Im allgemeinen liegen diese Materialien in einer Menge von weniger als etwa 5 Gev.-%/ bezogen auf die Menge an aktivem Antikörper und Üblicherweise in einer Gesamtmenge von wenigstens etwa 0/001 Gew.-%/ bezogen auf die Antikörperkonzentration/ vor. Es ist häufig wünschenswert/ einen inerten Extender oder Excipienten zur Verdünnung der aktiven Bestandteile zuzugebori/ wobei der Excipient in einer Menge von etwa 1 bis 99 Gev.-% der Gesamtzusammensetzung vorliegen kann. Wenn ein zur Bindung an die monoklonalen Antikörper fähiger zweiter Antikörper eingesetzt wird/ liegt dieser üblicherweise in einem separaten Vial vor. Der zweite Antikörper ist typischerweise an ein Label konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert.

Der Nachweis von gpllO- oder p25-Antigenen oder des

Ganzvirus in biologischen Proben findet bei der Diagnose einer HIV-Virusinfektion Anwendung. Zu biologischen Proben zählen/ ohne darauf begrenzt zu sein/ Blutserum/ Speichel/ Samen/ Gewebebiopsieproben (Gehirn/ Haut/ Lymphknoten« Milz etc.)/ Zellkulturüberstände/ zerstörte eukaryontische und bakterielle Expressionssysteme und dergleichen. Auf die Anwesenheit des Virus testet man/ indem man die monoklonalen Antikörper mit der biologischen Probe unter Bedingungen inkubiert/ die zu einer Immunkomplexbildung führen und man anschließend die Komplexbildung nachweist. Gemäß einer Ausführungsform weist man die Komplexbildung durch die Anwendung eines zweiten Antikörpers nach/ der in der Lage ist/ an einen monoklonalen Antikörper zu binden/ welcher typischerweise an ein Markierungsmittel konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert ist. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der monoklonale Antikörper an einen Fest-

phasepträger gebunden« der dann mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Nach der Inkubierung wird der markierte monoklonale Antikörper zugegeben/ um das gebundene Antigen nachzuweisen.

Herstellung und Anwendung synthetischer Peptide Die Erfindung stellt auch neue Peptid*? zur Verfügung/ die

unter anderem immunologisch die Proteinepitope nachahmen/ die durch das HIV-Retrovirus kodiert sind/ insbesondere die Epitope/ die innerhalb der env- oder gag-Bereiche des Virusgenoms kodiert sind/ welche für die gpllO oder p25 kodieren. Zur Anpassung an die unterschiedlichen Verhältnisse von Stamm zu Stamm bei den jeweiligen Isolaten kann man eine Anpassung bezüglich konservativer Substitutionen und eine Auswahl unter Alternativen mit nicht-konservativen Substitutionen vornehmen. Diese Peptide kann man/ um die HIV-Antigenproduktion in vitro oder in vivo zu inhibieren oder eliminieren, als Immunogene für den Nachweis des Virus oder von. Antikörpern gecen das Virus in einer physiologischen Probe einsetzen. In Abhängigkeit von der Art des Schemas kann man die Peptide an einen Träger oder an andere Verbindungen konjugieren/ die markiert oder unmarkiert/ an eine feste

Oberfläche gebunden etc. vorliegen.

Gemäß einer Ausführungsform stammen die erfindungsgemaßen Peptide von dem gpllO-Bereich des Virus. .Von besonderem Interesse ist der Bereich innerhalb des offenen env-Leserahmens, der sich etwa vom Basenpaar (bp) 6698 bis etwa bp6750 und etwa vom bp7246 bis etwa 7317 erstreckt. Die hier interessierenden Peptide, einschließlich blockierender Peptide, umfassen wenigstens 5, manchmal 6, manchmal 8, manchmals 12, manchmal 21, häufig weniger ; als etwa 50, insbesondere weniger als etwa 35 und Vorzugs- · weise weniger als etwa 25 Aminosäuren in einer Sequenz, die durch ein HIV-Retrovirus kodiert ist.

Wünschenswerterweise sind die Peptide so klein wie möglich/ enthalten aber dennoch im wesentlichen die gesamte Immunoreaktivität oder artivirale Aktivität eines größeren Peptids. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein» zwei oder mehrere nicht-überlappende Oligopeptide zu verbinden/ um eine einzige l^eptidstruktur zu bilden« oder sie als einzelne Peptide gleichzeitig zu verwenden/ wobei diese Peptide separat oder zusammen eine äquivalente Sensibilität des Ausgangsmaterials besitzen.

Die Peptide kann man durch Einführen konservativer oder nicht-konservativer Substitutionen modifizieren/ wobei im allgemeinen weniger als 20 %-Punkte, insbesondere weniger als 10 %-Punkte der Aminosäuren ausgetauscht werden. Wenn polymorphe Bereiche vorliegen/ kann es wünschenswert sein/ eine oder mehrere bestimmte Aminosäuren zu ändern/ um die unterschiedlichen Epitope der verschiedene Retrovirusstämme wirksamer nachahmen zu können. Häufig wird man Methionin durch Norleucin (Nor) ersetzen/ um eine chemische Stabilität zu erzielen.

Es i&t ciarauf hinzuweisen/ daß das erfindungsgemäß zur Anwen <fj;tg kommende Peptid nicht mit einer bestimmten HIV-PoIypeptidsequenz identisch sein muß/ solange die in Rede stehende Verbindung in der Lage ist/ eine immunologische Korrpetition mit den Proteinen von wenigstens einem Stamm des HIV-Retrovirus herbeizuführen. Die in Rede stehenden Peptide können deshalb auf vielfältige Weise geändert werden/ beispielsweise durch Insertionen/ Deletionen und Substitutionen in konservatives: oder nicht-konservativer Weise/ wenn derartige Änderungen Anwendungsvorteäle nach sich ziehen. Mit einer konservativen Substitution sind Substitutionen gemeint/ innerhalb der Gruppen/ wie gly/ ala; val/ ile leu; asp/ glu; asn/ gin; sor/ thr; lys/ arg; phe/ tyr; und nor/ met. Üblicherweise unterscheidet sich die Sequenz um nicht mehr als 20 % von der Sequenz wenigstens eines Stammes eines HIV-Retrovirus/ außer wenn weitere Aminosäuren an den beiden

Termini hinzugefügt werden können/ um einen "Arm" zur Verfügung zu stellen/ mit Hilfe dessen das erfindungsgemäße Peptid in einfacher Weise immobilisiert werden kann. Die Arme sind üblicherweise wenigstens eine Aminosäure lang und können 50 oder mehr Aminosäuren/ häufiger 1 bis 10 Aminosäuren/ lang sein.

Das Peptid/ dessen Aminosäuresequenz durch Substitution/ Addition oder Deletion von Aminosäureresten modifiziert ist/ sollte im wesentlichen die gesamte Immunoreaktivität oder antivirale Aktivität der unmodifizierten Peptide beibehalten. Dies kann auf einfache Weise anhand verschiedener/ hier beschriebener Assays bestimmt werden. Gewünschtenfalls kann man das d-Isomer einer oder mehrerer Aminosäuren verwenden/ um die biologischen Eigenschaften/ wie die Aktivität/ Abbaurate und dergleichen/ zu modifizieren.

Darüber hinaus kann man eine/ zwei oder mehrere Aminosäuren zur leichteren Verbindung der Peptide aneinander an die Termini eines Oligopeptids oder Peptids anfügen und zwar zur Kopplung an einen Träger oder ein größeres Peptid/ aus den nachfolgend erläuterten Gründen/ zur Modifizierung der physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopept.^ds oder dergleichen.

Aminosäuren/ wie Tyrosin/ Cystein/ Lysin/ Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder dergleichen/ kann man an C- oder N-Terminus des Peptids oder oligopeptids einführen/ um eine geeignete Funktionalität zur Verknüpfung zu schaffen, Cystein ist besonders bevorzugt zur Erleichterung einer kovalenten Bindung an andere Peptide oder zur Bildung von Polymeren durch Oxidation.

Darüber hinaus können sich die Peptid- oder Oligopeptid-3g Sequenzen von der natürlichen Sequenz durch eine Sequenz

unterscheiden« die durch terminale NH₂-Acylierung, beispielsweise Acetylierung oder Amidierung mit Thioglykolsäure, terminale Carbo>.yamidierung, beispielsweise mit Ammoniak oder Methylamin« modifiziert sind« um eine bessere Stabilität, erhöhte Hydrophobizität für eine Verbindung mit oder Bindung an einen Träger oder ein anderes Molekül oder für eine Polymerisation zu erzielen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der oben beschriebenen

Peptide I bis VIII und IX bis XV, wenn Y oder Y¹ vorhanden sind, liegt beispielsweise dann vor« wenn Y oder Y¹ einen oder mehrere Cysteinreste oder eine Kombination von einem oder mehreren Cysteinresten mit Spacer-Aminosäuren umfassen. Glycin ist ein besonders bevorzugter Spacer. Bevorzugte Peptide zur Anwendung bei der oxidativen Polymerisation sind diejenigen« bei denen Y oder Y¹ wenigstens zwei Cysteinreste bedeuten. Wenn zwei Cysteinreste am gleichen Ende des Peptids vorhanden sind« liegt eine bevorzugte Ausführungsform dann vor« wenn die Cysteinreste durch 1 bis 3 Spacer-Aminosäurereste« vorzugsweise Glycin,getrennt sind. Die Anwesenheit von Cysteinresten kann die Bildung von Peptiddimeren ermöglichen und/oder die Hydrophobizität des erhaltenen Peptids erhöhen« was die Immobilisierung des Peptids an Festphasen- oder immobilisierten Assaysystemen erleichtert.

Von besonderem Interesse ist der Gebrauch 0er Mercaptangruppen der zur Acylierung der terminalen Aminogruppen verwendeten Cysteine oder Thioglykolsäuren oder dergleichen zur Verknüpfung von zwei Peptiden oder Oligopeptiden oder Kombinationen davon über eine Disulfidbrücke oder eine längere Brücke« um Polymere zu bilden« die eine Reihe von Epitopen enthalten. Derartige Polymere besitzen den Vorteil einer verstärkten immunologischen Reaktion. Wenn unterschiedliche Peptide zur Herstellung des Polymers verwendet werden« besitzen sie zusätzlich die Fähigkeit, Antikörper

zu induzieren« die mit einigen Antigen-Determinanten verschiedener HIV-Isolate immuno-reagieren.

PUr die Bildung antigener Polymere (synthetische Multimere) kann man Verbindungen mit bis-Haloacetylgruppen* Nitroarylhalogenide oder dergleichen einsetzen/ wobei die Reagentien spezifisch für Thiogruppen sind. Die Verknüpfung zwischen zwei Mercaptogruppen von verschiedenen Peptiden oder Oligopeptiden kann somit eine Einfachbindung oder ein Bindeglied von wenigstens 2 , üblicherweise wenigstens 4" und nicht mehr als etwa 16« üblicherweise nicht mehr als etwa 14 Kohlenstoffatome sein.

Die hier in Rede stehenden Peptide kann man gebunden an einen löslichen makromolekularen Tra'ger (beispielsweise nicht weniger als 5 kDal) einsetzen. Zweckmäßigerweise ist der Träger eine natürlich vorkommende oder synthetische Poly(aminoaäure) gegen die Antikörper im Humanserum unwahrscheinlich sind. Beispiele derartiger Träger sind Poly-L-Lysin/ Keyhole-Limpet-Hemocyanin/Thyroglobulin/ Albumine/ wie Rinderserumalbumin/ Tetanustoxoid etc.. Die Wahl des Trägers ist zur Hauptsache abhängig vom beabsichtigten Anwendungszweck für das Antigen und richte sich nach der Zweckmäßigkeit und Verfügbarkeit des Trägers. Bei derartigen Konjugaten liegt wenigstens 1 Molekül wenigstens eines Peptids pro Makromolekül und nicht mehr als 1 pro 0/5 kDal/ üblicherweise nicht mehr als etwa 1 pro 2 kDal des Makromoleküls/ vor. Man kann 1 oder mehrere unterschiedliche Peptide an das gleiche Makromolekül binden.

Die Verbindung erfolgt in üblicher Weise unter Verwendung

von Reagentien/ wie p-Maleimidobenzoesäure, p-Methyldithiobenzoesäure/ Maleinsäureanhydrid/ Bernsteinsäureanhydrid/ Glutaraldehyd etc. Die Bindung kann am N-Terminus/ C-Terminus oder zwischen den Enden des Moleküls erfolgen.

Das Peptid kann man durch Verknüpfung derivatisieren/

kann während es an einem Träger gebunden ist/ verknüpft werden oder dergleichen.

Um die Anwesenheit von Antikörpern gegen retrovirale Proteine

oder von retroviralen Proteinen selbst nachzuweisen /kann man nach verschiedenen/ dem Fachmann geläufigen Assay-Verfahren vorgehen. Von besonderem Interesse ist es, das Peptid als markiertes Reagens zu verwenden/ wobei das Markierungsmittel ein nachweisbares Signal liefert/ oder das Peptid direkt oder indirekt an eine Oberfläche zu binden/ wobei der Antikörper gegen das Peptid in der Probe an das Peptid an der Oberfläche gebunden wird. Die Anwesenheit eines Human-Antikörpers/ der an das Peptid gebunden ist/ kann dann unter Verwendung eines xenogenen Antikörpers/ der spezifisch für Humanimmunoglobulin/ normalerweise sowohl Human-IgM als auch IgG/ ist oder eines markierten Proteins erfolgen/ das spezifisch für Immunkomplexe ist/ beispielsweise der Rf-Paktor von S. Aureus-Protein-A.

Ein Beispiel für ein Assay-Verfahren ist die Verwendung eines Probenbehälters/ beispielsweise die Vertiefungen von Mikrowellplatten/ wobei das Polypeptid oder die Konjugate davon am Boden und/oder an den Wänden des Behälters kovalent oder nicht-kovalent adsorbiert sind. Die Probe/ normalerweise Humanblut oder -serum/ verdünnt mit einem geeigneten Puffermedium/ gibt man in den Behälter und läßt ausreichend Zeit vergehen bis die Komplexbildung zwischen dem (den) Polypeptid(en) und einem entsprechenden Antikörper in der

Probe erfolgt ist. Man entfernt den überstand und wäscht

den Behälter zur Entfernung von nicht-spezifisch gebundenen Proteinen. Zum Nachweis verwendet man ein markiertes spezifisch bindendes Protein* das spezifisch an den Komplex bindet/ wie beispielsweise xenogenes Antiserum gegen Humanimmunoglobulin.

Das Peptid kann auf vielfältige Weise hergestellt werden. Das Peptid kann aufgrund seiner relativ geringen Länge in Lösung oder an einen festen Träger gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisiergeräte sind im Handel erhältlich und können in bekannter Weise angewendet werden/ siehe beispielsweise Stewart und Young/ Solid Phase Peptide Synthesis/ 2. Aufl./ Pierce Chemical Co./ 1984; und Tarn et al./ J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:6442.

In alternativer Weise kann man von der Hybrid-DNA-Technologie Gebrauch machen/ bei der man ein synthetisches Gen unter Anwendung von Einzelsträngen/ welche für das Polypeptid kodieren/oder von im wesentlichen Komplementärsträngen davon herstellt/ wobei die Einzelstränge überlappen und in einem annealing - Medium zusammengebracht werden können/ um zu hybridisieren. Die hybridisierten Stränge kann man dann zu einem vollständigen Gen ligieren und das Gen durch Wahl geeigneter Termini in heute leicht erhältlichen Expressionsvektoren insertieren/ siehe beispielsweise Maniatis et al./ Molecular Cloning/ A Laboratory Manual/ CSH/ Cold Spring Harbor Laboratory/ 1982. Oder man kann den Bereich des viralen Genoms/ der für das Peptid kodiert durch herkömmliche rekombinante DNA-Techniken klonieren und exprimieren (siehe oben Maniatis et al.).

DNA-Codesequenzen von LAV_DDM und ARV 2-Isolaten von HIV/

BKU

die zur Expression der Peptide verwendet werden können/ umfassen die folgenden: 30

40 2 B 4089

LAV_pRU TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGT

ARV-2 TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT ACA AGA AAA AGT ATC TAT ATA GGA CCA GGG AGA GLA TTT CAT ACA ACA GGA AGA ATA ATA GGA GAT ΑΤΑ AGA AAA GCA CAT TGT

Zur Expression von Peptidfragmenten kann man Fragmente einer Sequenz verwenden. Man kann konservative Basenänderungen/ wobei der (die) modifizierte Kodon(s) für die gleiche Aminosäure(n) kodiert (kodieren); oder nicht konservative Basenänderungen in der Kodierungssequenz durchführen/ wobei die erhaltene Aminosäure eine konservative oder nicht-konservative Änderung in der Aminosäuresequenz sein kann/ was oben beschrieben wurde.

*® Die Codesequenz kann am 5·- oder 3'-Terminus oder an beiden verlängert werden/ um das Peptid zu verlängern/ jedoch unter Beibehaltung der epitopen Stelle(n). Die Verlängerung kann dazu dienen/ einen Arm zur Anknüpfung beispielsweise an ein Markierungsprodukt/ wie ein Enzym/ zu schaffen/ zwei oder

*** alle Peptide zusammen in der gleichen Kette zu verbinden/ Antigen-Aktivität und geeignete Restriktionsstellen zum Klonen zur Verfugung zu stellen oder dergleichen.

Die DNA-Sequenz selbst/ die Fragmente davon oder qrößere Sequenzen/ üblicherweise wenigstens 15 Basen/ vorzugsweise wenigstens 18 Basen,kann man als Nukleotidsonden zum Nachweis von retroviraler RNA oder proviraler DNA oder zur Identifzierung homologer Regionen für das Klonieren oder Sequenzieren verwenden.Es sind zahlreiche Methoden beschrieben/ _wie die Grunstein-Hogness-Methode/ Southern-Methode/

Northern-Methode, Dot-blot, Verbesserungen davon sowie

andere Methoden, wie diejenigen, die in der US-PS 4 358 535, worauf hiermit Bezug genommen wird, beschrieben sind.

Die erfindungsgemäßen Peptide, einschließlich der

blockierenden Peptide und ihre Analoga finden allein oder in Kombination in Vakzinen Anwendung. In ähnlicher Weise kann man in Vakzinen auch anti-idiotype Antikörper verwenden, d.h. Antikörper, die mit dem Idiotypen der erfindungsgemaßen Antikörper reagieren und dabei Epitope enthalten, die die neutralisierenden HIV-Bereiche nachahmen. Die Peptide oder anti-idiotypen Antikörper kann man in herkömmlicher Weise formulieren, im allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von 1 pg bis 20 mg/kg des Wirts.

Physiologisch annehmbare Medien kann man als Träger verwenden, beispielsweise steriles Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und dergleichen. Man kann Adjuvantien einsetzen, wie Aluminiumhydroxidgel, grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronicpolyole, Polyanionen, Peptide, Proteine (z.B. Diphtherie und Choleratoxin) und Ölemulsionen. Die Peptide kann man zur Anwendung in Vakzinformulierungen auch Liposomen einverleiben oder an Polysaccharide, Polypeptide oder Polymere konjugieren. Die Verabreichung kann durch Injektion erfolgen, beispielsweise intramuskulär, peritoneal, subkutan, intravenös etc. Die Verabreichung einer immunogen wirksamen Dosis kann einmal oder mehrfach erfolgen, üblicherweise in Zeitabständen von 1 bis 4 Wochen. Eine "immunogen wirksame Dosis" ist diejenige Menge eines Vakzins, die geeignet ist, eine Immunantwort in einem Wirt auszulösen, wobei der Wirt eine gesteigerte Infektion zeigt.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen.

42 2 64 08

Beispiel I

Erzeugung und Charakterisierung der monoklonalen Antikörper 5

Beispiel I beschreibt die Erzeugung von Hybridzellinien/ die monoklonale Antikörper produzieren/ welche spezifisch für HIV-HUllglykoproteine sind. Dieses Verfahren umfaßt die

Anwendung von Lektin-gereinigten Extrakten von LAV_n-,./

'

das an lentile Lektinagarose als Immunogen gebunden ist.

Die anschließend durch die Hybridzellinien erzeugten monoklonalen Antikörper sind charakterisiert durch ihre Fähigkeit gpllO aus gereinigtem LAV zu immunoblotten und in einem Radioimmun-Assay zu präzipitieren sowie als biologisch exprimiertes rekombinantes Fusionsprotein. Die monoklonalen Antikörper/ die an die Epitope an gpllO binden/ reagieren auch in ELISA's mit zerstörten ganzen Viren/ Fusionsproteinen und synthetischen Peptiden und reagieren

mit ganzen Viren in indirekten Fluoreszenz-Assays. 20

Die Erzeugung der monoklonale Antikörper produzierenden Hybridzellinien und die Charakterisierung der Antikörper erfolgen folgendermaßen:

LAV-Viren/ die von infizierten CEM-Zellen (ATCC Nr. CRL 8904)

gereinigt waren/ wurden in 50 mM Tris/ pH 7/4/ 0/15 M NaCl/ IfJO % Aprotinin/ 2/0 % Nonidet P-40^v ' (NP-40) (Octylphehoxypolyethoxyethanol) zerstört. Der Extrakt wurde 2 χ durch Zentrifugieren geklärt und auf 0/5 % NP-40 durch

QQ Zugabe von 3 Volumina Disruptionspuffer ohne NP-40 eingestellt. Lentile Lektinsepharose (Pharmacia/ Piscataway/ N.J.) wurde in Disruptionspuffer ohne NP-40 vorgewaschen und anschließend in Adsorptionspuffer (50 mM TtLs₁ pH 7/4/ 0,15 M NaCl., 1,0 % Aprotinin, 0,5 % NP-40) ä'quilibriert.

o_er geklärte Virusextrakt wurde mit lentiler Lektin-

sepharose 42 h bei 4⁰C adsorbiert. Unadsorbiertes Material wurde durch Waschen mit Überschüssigem Adsorptionspuffer entfernt. Dia Eluierung des adsorbierten Materials erfolgte mit Ο»2 M 6^-Methylmannosid in Adsorptionspuffer. Das Eluat wurde gegen PBS zur Entfernung des Zuckers dialysiert und das Material wurde erneut an lentiler Lektinsepharose adsorbiert.

Der Glykoprotein-lentile Lektinsepharose-Komplex wurde dazu verwendet« BALB/c-Mäuse mittels drei intraperitonealen Injektionen ohne Adjuvans« die in Abständen von 2 bis 3 Wochen gegeben wurden/ zu immunisieren. Die Milz der immunisierten Mäuse wurde entfernt. Es zeigen sich mittels Immunoblot-RIP und/oder ELISA zirkulierende Antikörper gegen Glykoproteine.

Zur Erzeugung von Zellinien arbeitete man im allgemeinen nach den Vorschriften von Kohler und Milstein (Nature 256:495 (1985)) mit den Modifizierungen von L.C. GoIdstein et al./ (Infect. Immun. 38:273 (1982)). Die B-Lymphocyten der Milz aus den immunisierten Mäusen wurden mit NS-1-Myelomzellen unter Verwendung von 40 % (W/V) Polyethylenglykol fusioniert. Im Anschluß an die Fusionierung wurde die Zellmischung erneut in HAT-Medium (RPMI-1640 ergänzt mit 15 % fötalem Kälberserum/ 1 χ 10~ M Hypoxanthin/ 4 χ 10 M Aminopterin und 1/6 χ 10 M Thymidin) suspendiert/ um für das Wachstum der Hybridzellen zu selektieren und anschließend auf 96-Well-Mikrokulturplatten bei einer Konzentration von 1 bis 3 χ ΙΟ"* Zellen/ml gegeben und bei 37⁰C in einer feuchten Atmosphäre/ die 6 % CO₂ enthält/ inkubiert. Die Kulturen wurden ernährt/ indem die Hälfte des Überstandes durch frisches HAT-Medium ersetzt wurde. Die Vertiefingen (wells) wurden unter Verwendung eines Planktonmikroskops auf Anzeichen von ZeIl-

3g proliferation beobachtet und sobald die Zellen eine aus-

reichende Dichte besaßen/ wurden die überstände auf Anti-LAV-Antikörper getestet.

Diejenigen Wells« die Antikörper gegen LAV produzierende Hybridzellen enthalten« wurden durch ELISA¹S identifiziert« wobei die Bindung an gereinigte« zerstörte Ganzviren« oder biologisch exprimierte Fusionsproteine bestimmt wurde. Die ELISA-Assays unter Anwendung zerstörter Viren wurden an LAV EIA-Platten (Genetic Systems« Seattle« Washington) durchgeführt. Die Platten wurden mit Zellkulturflüssigkeit bei 37⁰C 45 Min. inkubiert und anschließend 3 χ mit 0/05 % Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS-Tween) gewaschen.

Ϊ6 Peroxidase-Ziege-Anti-Maus-IgG (1:2.000 Verdünnung in PBS-Tween; Zymed Laboratories« Inc.« South San Francisco« California) wurde zugegeben (100 μΐ pro Well) und die Platten wurden 45 Min. bei 37⁰C inkubiert und wie oben gewaschen. Es wurde Substrat zugegeben (0/025 M Zitronensäure« 0/05 M dibasisches Natriumphosphat« pH 5« enthaltend 14 mg o-Phenylendiamin und 10 μΐ 30%-iges Wasserstoffperoxid pro 50 ml) und die Platten wurden 30 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 3 N Schwefelsäure gestoppt und die kolorimetrischen Reaktionen wurden mit einem automatischen Mikroplattenlesegerät quantitativ bestimmt. Diejenigen Vertiefungen« die positive Ergebnisse erbrachten« wurden durch Grenzverdünnung subkloniert« erneut auf Spezifität getestet und anschließend expandiert.

Die von den daraus resultierenden Hybridzellinien sekretierten monoklonalen Antikörper wurden weiterhin hinsichtlich Spezifität und Reaktivität mittels Immunoblotting« Immunopräzipitation und ELISA unter Anwendung zerstörter LAV-Viren« rekombinanter LAV-Fusionsproteine und synthetischer LAV-

3g Peptide charakterisiert. Es zeigte sich« daß andere Antikörper vom IgG.-Isotyp waren. Die Zellinien HIV-gpllO-1«

ΓΛ5 Si__

HIV-gpllO-2 und HIV-gpllO-3 wurden bei der Amercian Type

Culture Collection vor Einreichen dieser Anmeldung hinterlegt und haben die Hinterlegungs-Nrn. ATCC HB 9175/ HB9176 und HB9177 erhalten

5

Die auf ihre Reaktivität getesteten rekombinanten Fusionsproteine wurden als ENV2, ENV3, ENV4 und ENV5 bezeichnet. Das Protein ENV2 wird aus pENV2 (ATCC Nr. 53071) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich vom Basenpaar (bp) 6598 bis bp 7178 (Numerierung gemäß Wain-Hobson et al./ Cell 44:9 (1985). EI/V3 wird aus pENV3 (ATCC Nr. 53072) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich von bp 7178 bis bp 7698. ENV4 wird aus pENV4 (ATCC Nr. 53073) exprimiert und umfaßt bp7698 bis bp 8572. ENV5 wird aus pENV5 (ATCC Nr. 53074) exprimiert und umfaßt den LAV-Bereich von bp 5889 bis bp 7698. Die Produktion der rekombinanten Fusionsproteine ist detailliert in der UPSN 721 237 beschrieben/ worauf hiermit Bezug genommen wird.

Assembly synthetischer Peptide

Die Peptide I (29) und VIII (110-2-2) wurden an einem Benzhydrylaminharz (Polystyrol/Divinylbenzol (Applied Biosystems/ Inc./ Foster City/ California) zusammengebaut.

Peptid V (177) wurde an einem t-Butyloxycarbonyl(Boc)-

ethylbenzylcystein-phenylacetarnidomethv]-/pam)-polystyrol/ divinylbenzolharz zusammengebaut. Kopplungen mit symmetrischem Anhydrid wurden in einem Applied Biosystems 430A-Synethisiergerät durchgeführt. Cystein wurde als erster

Rest den beiden Peptiden zugegeben.

Kopplungen mit Dicyclohexylcarbodiimid in Anwesenheit von Hydroxylbenr.otriazol wurden für Asparagin und Glutamin verwendet. Als Schutzgruppen kamen Seitenketten auf Benzylgg gruppenbasis und Boc-oO-Amingruppsn zur Anwendung. Weitere

routinemäßig eingesetzte Seitenkettenschutzgruppen waren Boc(Formyl)-tryptophan/ Boc-Methioninsulfoxid/ Boc(tosyl)-arginin, Boc(methylbenzyl)cystein, Boc(tosyl)-histidin/ Bocfchlorbenzyloxycarbonyl)lysin und Boc(brombenzyloxycarbonyl)tyrosin.

Die Radiomarkierung der Peptide erfolgte durch Acetylierung des Aminoterminus mit Η-Essigsäure und einem Überschuß an Dicyclohexylcarbodiimid.

Entfernung.der Schutzgruppen und Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte gemäß dem Tarn "low-high" HF-Verfahren (Tarn et al/ siehe oben). Die Extraktion vom Harz wurde mit 5%-iger Essigsäure durchgeführt und der Extrakt wurde einer GeIfiltrations-Chromatographie in 5%-iger Essigsäure unterzogen.

Zu den synthetischen HIV-Peptiden/ die auf Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern getestet wurden/ zählten die Peptide 29/ 36 und 39. Das Peptid 29 ist durch den LA\ _..-Genombereich von etwa bp 66Θ8 bis bp 6750 kodiert; das Peptid 36 ist durch den Bereich von etwa bp 7246 bis bp 7317 kodiert; und das Peptid 39 ist durch den Bereich von etwa bp 7516 bis bp7593 kodiert. Die Peptid^ 36 und 39 sind detailliert in der US-PS 4 629 783 beschrieben/ auf die hiermit Bezug genommen wird.

Die blockierenden Peptide IX-XV wurden im wesentlichen wie oben beschrieben an einem Methyl-benzhydrylaminharz (Polystyrol/Divinylbenzol) (Applied Biosystems/ Inc. Foster City/ California) zusammengebaut. Kopplungen mit symmetrischem Anhydrid wurden an einem Applied Biosystems 430A-Synthetisiergerät durchgeführt. Für Asparagin wurden Kopplungen mit Dicylcohexylcarbodiimid in Anwesenheit von

Hydroxybenzotriazol verwendet. Als Schutzgruppen wurden Seiten-

ketten auf Benzylgruppenbasis und boc-i^-Amin-Schutzgruppen verwendet/ wohingegen Boc(brombenzyloxycarbonyl) spezifisch für Tyrosin-Seitenketten verwendet wurde. Eine Acetylierung erfolgte/ soweit vorhanden/ unter Anwendung von Acetanhydrid oder Eisessig und Dicyclohexylcarbodiimid. Die Entfernung der Schutzgruppen und die Abspaltung des Peptide vom Harz erfolgte gemäß dem "high" HF-Standardverfahren (Stewart et al./ siehe oben). Die Extraktion vom Harz erfolgte mit 50%-iger Essigsäure und der Extrakt wurde anschließend einer GeIfiltrations-Chromatographie in 20%-iger Essigsäure unterzogen. Gewünschtenfalls wurde eine Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie an einer Vydac-Cl8-Säule (Rainin Instrument Co./ Emeryville/ CA) unter Anwendung eines 0/1% Trifluoressigsäure-Acetonitril-Gradienten durchgeführt.

Immunoblotting

Die Charakterisierung mittels Immunoblotting erfolgte an Clonüberständen oder Ascitesflüssigkeit unter Anwendung gereinigter LAV-Viren und rekombinanter Fusionsproteine als Antigene. Die Antigene wurden zunächst mittels Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese (7/0 - 15/0 %) getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (NCM) mittels 4-stündiqer Elektrophorese bei 25 V in 25 mM Natriumphosphat (pH 7/0) transferiert. Nach der übertragung wurde die NCM durch 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur in PBS-Tween oder Blotto (5% fettarme Trockenmilch in PBS) blockiert/ um nicht-spezifische Interaktionen zu verhindern. Die NCM wurde mit Zellkulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit/ verdünnt in PBS-Tween/ 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und 3 χ mit PBS-Tween gespült. In der zweiten Stufe wurde die NCM mit Ziege-anti-Maus-IgG-Meerettichperoxidase/verdünnt in PBS-Tween/ 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wiu-de mit PBS-Tween gewaschen/ gefolgt von 20-minütigem Eintauchen in Meerettichperoxidase-Farbentwicklungslösung (Bio-Rad Laboratories/ Richmond/ California).

Die Reaktion wurde durch Eintauchen in entsalztes Wasser geätoppt. Die monoklonale Antikörper-Aktivität wurde mit einem positiven Kontrollserum« das mit gereinigten zerstörten Viren oder exprimierten Pusionsproteinen reagiert/ verglichen. Es zeigte sich« daß unter Anwendung zerstörter Viruspräparate alle Antikörper an gpllO oder dessen PrekursormolekUl gpl5O banden. Die Antikörper 110-1 und 110-2 erkannten auch das Fusionsprotein ENV3/ wohingegen die Antikörper 110-3# 110-4, 110-5 und 110-6 ENV2 in einen Immunokomplex überführen.

Immunpräzipitation

Virusextrakte für die Radioimmun-Präzipitation wurden aus CEM-Zellen hergestellt/ die mit LAV___M-HIV-Isolat in-

oKU

fiziert waren« das durch kontinuierliche Passage dem lytischen Wachstum angepaßt wurde. Sobald sich frühe cytopathische Effekte zeigten/ wurden die Zellen auf markierende Medien übertragen/ die S -Methionin

(0/05 mCL/ml) oder [h] -Glucosamin (0/025 mCi/ml) enthielten/ anschließend 24 h inkubiert/ bis die meisten Zellen lysiert hatten und das Virus in den Kulturüberstand freisetzten. Die Viren wurden aus dem zellfreien überstand pelletiert (1 h bei 100.000 xg) und Detergenzextrakte wurden in P-RIPA-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die I/O % Triton X-100, l«0 % Deoxycholat« 0/1 % SDS und 1 % Aprotinin enthält) hergestellt. Ähnliche Extrakte wurden von den überständen von uninfizierten CEM-Zellen hergestellt.

Immunopräzipitations-Assays wurden mit 100 μΐ Virusextrakt durchgeführt« der 1 h auf Eis mit 100 μΐ Kulturüberstand von den Hybridzellinien inkubiert wurde. 4 μΐ Kaninchen-Anti-Maus-Ig (Zymed Laboratories« So. San Pransisco/ California) wurden zu jeder Probe gegeben und 30 Min. inkubiert. Zu jeder Probe wurde Immuno-Präzipitin (100 μΐ;

Bethesda Research Laboratory« Bethesda, Maryland), das in P-RIPA-Puffer resuspendiert wurde/ welcher 1 % Ovalbumin enthält/ gegeben und weitere 30 Min. inkubiert. Die gebundenen Komplexe wurden gewaschen und mittels SDS-PoIyacrylamid-Gelelektrophorese (15/0 % Acrylamid: DATD-GeI) aufgetrennt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele fixiert/ in Enhance (New England Nuclear; Boston/ MA) eingeweicht« getrocknet und mit einem Kodak XR-5-Film in Kontakt gebracht. Ein positives Referenzserum/ das mit allen HIV-Virusproteinen ein Xmmunopräzipitat ergibt/ wurde als positive und negative Kontrolle mit Virus-infizierten und schein-infizierten CEM-Zellüberständen zur Reaktion gebracht.

Die Ergebnisse zeigen, daß alle sechs monoklonalen Antikörper spezifisch gpllO und gpl50 immunopräzipitierten.

Enyzm-Linked-Immunoadsorbant-Assay

Um die von den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern erkannten gpllO-Epitope zu kartieren/ wurden die Kulturüberstände aus Hybridzellinien oder Ascitesflüssigkeit weiter durch die Reaktivität in ELISA-Assays mit biologisch exprimierten Pusionsproteinen und synthetischen Peptiden charakterisiert. Die Verfahren waten diegleichen wie die oben beschriebenen/ mit der Ausnahme/ daß die Fusionsproteine oder synthetischen Peptide die gereinigten Viren als Antigene ersetzten/ welche an die Oberfläche der Mikrotiterwells adsorbiert sind.

Bei der Verwendung von Peptiden als Antigen arbeitete man

nach folgendem Verfahren. Die lyophilisierten Peptide wurden in 6 M Guanidin-HCl gelöst. Unmittelbar vor Plattieren in die 96-Well-Platten wurde die Guanidinlösung in 0/05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9/6) auf eine Peptid-

endkonzentration von bis zu 100 μς/ιηΐ verdünnt. 50 μΐ des verdünnten Peptide wurden in jede Mikrotiter-Vertiefung gegeben. Die Platten wurden anschließend über Nacht bei 4^eC inkubiert, überschüssige Peptidlösung wurde "ausgeschüttelt"/ die Platten wurden mit Blotto blockiert und der weitere ELISA-Assay erfolgte gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. In ähnlicher Weise wurde rekombinantes Protein auf eine Endkonzentration von etwa 2 pg/ml in 0,05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) verdünnt und das gleiche Verfahren wiederholt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Die von den Zellinien HIV-gpllO-1 und HIV-gpllO-2 produzierten monoklonalen Antikörper reagierten mit ENV3, ENV5, Peptid 36 und zerstörten Viren. Die Antikörper von den Zellinien HIV-gpllO-3, HIV-gpllO-4, HIV-gpllO-5 und HIV-gpllO-6 reagierten mit ENV2 und Peptid 29 sowie mit zerstörten Viren.

TABELLE II

ELISA-Assays, die die Reaktivität der monoklonalen Antikörper mit rekombinanten Proteinen und synthetischen Peptiden zeigen

Rekombinantes Fusionsprotein Synthetische Peptide LAV CEM EHV2 ENV3 ENV4 ENV5 29 36 39 Kontrolle Kontrolle

110-1 0.077 3.000 0.113 3.000

110-2 -0.003 3.000 0.000 3.000

110-3 3.000 0.011 ND ND

110-4 3.000 0.020 ND ND

110-5 3.000. 0.014 ND ND

110-6 3.000 0.033 ND ND

ND	2	.421	0.054	0.908	0.125
ND	2	.305	-0.005	1.214	0.009
3.000		ND	0.017	0.363	0.046
3.000		ND	0.016	0.383	0.067
3.000		ND	0.016	0.368	0.025
1.937		ND	0.017	0.486	0.032

Die in Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse zeigen/

daß die monokonalen Antikörper 110-1 und 110-2 eine Antigen-Determinante erkennen/ die durch die DNA-Sequenz im pENV3-Bereich kodiert ist/ insbesondere durch den Bereich des HIV-Genoms/ der durch eine Sequenz von Aminosäuren im Peptid 36 definiert ist. D.h./ daß die monoklonalen Antikörper gpllO-1 und 110-2 an einen Peptidbereich von gpllO binden/ der in bp 7246 bis 7317 kodiert ist/ wie durch die Bildung von Immunkomplexen mit Peptid 36 und ENV3 gezeigt wird. Dieser Bereich des HIV-Genoms wurde als konserviert identifiziert/d.h. mit nur geringen Veränderungen in der DNA-Sequenz in dem Bereich/ der durch Peptid 36 bei verschiedenen Virusisolaten unterschiedlicher geographischer Herkunft kodiert ist/siehe Starcich et al.« Cell 46:637 (1986). Im

Gegensatz dazu binden die monoklonalen Antikörper

gpllO-3/ -4/ -5 und -6 an HIV-Peptide/ die durch den Bereich definiert sind/ der durch Peptid 29 von bp6688 bis etwa bp 6750 kodiert ist. Der Bereich in gpllO/ der durch Peptid 29 definiert ist/ wurde als Bereich identifiziert/ der mehrere Nukleotidsubstitutionen bei verschiedenen Virusisolaten enthält. Die monoklonalen Antikörper/ die selektiv gpllO-Polypeptide binden/ welche konservierte Epitope enthalten/ wie die Antikörper 110-1 und 110-2/ können häufig besonders brauchbar sein/ beispielsweise bei der Affinitäts-

Chromatographie etc. Auch bei einem ELISA-Assay reagiert

das Peptid HO-- 2-2 mit Sera von der Person/ von der LAV-2 isoliert wurde.

Indirekter Immunofluoreszenz-Assay

Indirekte Immunofluoreszenz-Assays unter Anwendung monoklonaler Antikörper gegen das gpllO-Antigen von HIV wurden an Aceton-fixierten und lebenden Zellen durchgeführt. Aceton-fixierte Objektträger/ die au3 LAV-infizierten CEM-

Zellen bereitet wurden* wurden mit verdünntem Kulturüber-

stand oder Ascitesflüssigkeit 1 h bei 37°C inkubiert/ wohingegen lebende Zellen mit Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit 1 h bei 4⁰C inkubiert wurden« ehe die Zellen auf die Objektträger gegeben und mit Aceton fixiert wurden.

δ Bei beiden Methoden wurde Fluorescein-Isothiocyanatmarkiertes-Anti-Maus-IgG verwendet/ um diejenigen Zellen nachzuweisen« die das reaktive gpllO-Antigen aufweisen. Die monoklonalen Antikörper HIV-gpllO-1 ergaben positive Ergebnisse sowohl bei Anwendung lebender oder aceton-fixierter LAV-infizierter Zellen.

Beispiel II

Neutralisierung der HlV-Infektivität durch Anti-gpllO-monoklonale Antikörper

Dieses Beispiel beschreibt und charakterisiert die Neutralisierung von HlV-Infektivität unter Anwendung monoklonaler Antikörper« die an gpllO und Peptide innerhalb von gpllO binden. Die Ergebnisse zeigen« daß die Antikörper gpllO-3« -4« «5 und -6 neutralisierende Aktivität besitzen und daß gpllO-3 und -4 besonders hohe neutralisiernde Aktivität besitzen.

Neutralisations-Assay

Ein sensitiver Neutralisations-Assay wurde entwickelt« um den Effekt der monoklonalen Antikörper auf die HIV-

Infektivität quantitativ zu erfassen. Eine CD4+-Zell-

linie« CEM« die besonders empfindlich gegen HIV-Infektionen ist/ wurde als Target-Zelle für Infektivitätsvergleiche gewählt. Ascitesflüssigkeit« hergestellt wie im Beispiel I beschrieben« oder die IgG-Fraktion davon« die unter Anwendung einer Ammoniumsulfatfällung gereinigt wurde« wurde

30 Min. bei 56⁰C inaktiviert/ anschließend in dem erforderlichen Maße in RPMI-Medium/ das 10 % fötales Kälberserum enthält/ verdünnt. Eine Suspension des HIV-Stammes LAV_ßRU wurde von etwa 4 Tage alten CEM-Kulturen in der log-Wachstumsphase geerntet/ durch einen 0/2 oder 0/45 Mikronfilter filtriert/ in aliquote Teile aufgeteilt und bei -70⁰C eingefroren. Ein aliquoter Teil wurde aufgetaut, zur Bestimmung von TCIDe₀ titriert und anschließend wurden Assays mit frisch aufgetauten aliquoten Teilen durchgeführt/ die im Verhältnis von 1:500 in Kulturmedium auf etwa die 10-fache Konzentration verdünnt wurden/ die erforderlich ist/ um 50 % der CEM-Zellen in der Kultur (10 TCID₅₀) zu infizieren. Die Virussuspension wurde mit dem gleichen Volumen (250 μΐ) eines monoklonalen Antikörperpräparates in 5-fach Verdünnungen von 1:5 bis 1:9 765 625 vermischt. Die Virus/Antikörpermischung wurde 45 Min. bei 37⁰C inkubiert und anschließend von 1:5 bis 1:9 765 625 dupliziert. Die Virus/Antikörpermischung wurde dann 45 Min. bei 37⁰C inkubiert. Anschließend wurden duplizierte Proben von 200 μΐ dazu verwendet/ Wells zu inokulieren/ die 1 ml mit etwa 2 χ 10 -CEM-Zellen pro Well enthielten. Die Kulturen wurden bei 37⁰C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO« 14 Tage inkubiert. Die Zellen wurden geerntet/ pelletisiert und mit 1 % Triton-X-100 in PBS etwa 10 Min.

lysiert. Die Menge an Viren (oder Virusantigen)/ die in den lysierten Zellen vorhanden war/ wurde unter Anwendung eines sensitiven HIV-Antigen-Capture-"Sandwich"-Enzymimmunoassays wie unten beschrieben quantitativ bestimmt. Der Titer an neutralisierender Aktivität/ soweit vorhanden/ wurde als reziproker Wert derjenigen Verdünnung der monoklonalen Antikörper bestimmt/ welche um mehr als 50% die Antigenproduktion der Viruskontrollkulturen inhibiert/ welche ohne Antikörper oder mit einem monoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps inkubiert wurden/ von dem vorher gezeigt wurde/ daß er keine neutralisierende Aktivität besitzt.

Bei dem oben erwähnten HIV-Antigen-Capture-Assay wurden als Capture-Reagens zwei monoklonale Antikörper gegen p25-Antigene verwendet. Diese Hybridomzellinien wurden anhand der oben beschriebenen Methoden mit geringfügigen Modifikationen erzeugt/ einschließlich der Anwendung eines gereinigten gag-rekombinanten Fusionsprotein als Immunogen und der Charakterisierung der erhaltenen monoklonalen Antikörper hinsichtlich Spezifität und Reaktivität unter Anwendung der als GAG-I/ GAG-2 und GAG-3 bezeichneten rekombinanten Fusionsproteine und des synthetischen Peptids 141. Des Protein GAG-I wird aus PGAG-I (ATCC Nr. 53379) exprimiert, GAG-2 wird aus pGAG-2 (ATCC Nr. 53111) exprimiert und GAG-3 wird aus pGAG-3 (ATCC Nr. 53112) exprimiert. Die Produktion der rekombinanten Fusionsproteine ist detailliert in den USSN 764 460 und Θ2Θ 828 beschrieben/ auf die hiermit Bezug genommen wird» Das synthetische Peptid 141 wird durch den LAV___M-Genombereich kodiert/ der den Aminosäureresten 198 bis 242 entspricht. Die monoklonalen Antikörper/ die durch die Hybridomzelllinien p25-2 und p25-3 produziert werden/ reagieren mit den rekombinanten Fusionsproteinen GAG-I/ GAG-2 und GAG-3. Auch die aus p25-3 gewonnenen monoklonalen Antikörper reagieren mit dem synthetischen Peptid 141.

Um den Antigen-Capture-Assay durchzuführen/ wurden die

Capture-Reagentien zuerst an einem festen Träger adsorbiert. Ascitesflüssigkeit/ die von den Hybridomzellinien p25-2 und p25-3 stammte/ wurde 1:5000 in 25 mM Tris-Puffer von pH 8/5 verdünnt. 200 μΐ wurden in die Vertiefungen von Mikrowellplatten gegeben. Die Vertiefungen wurden versiegelt und etwa 16 h bei 4⁰C inkubiert. Die Lösung wurde von den Platten abgesaugt/ ehe eine blockierende Lösung von 0/3 % Blotto in PBS zugegeben wurde. Das Blockieren erfolgte 15 Min. bei Raumtemperatur. Die blockierende Lösung wurde ab-

3g gesaugt und die Probe wurde zugegeben. 200 μΐ der lysierten

Zellsuspension und 5 μΐ Detektionskonjugat/ hergestellt wie unten beschrieben, wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Wellstreifen odei: -platten wurden 2 h bei 37^eC inkubiert, anschließend wurde die Suspension abgesaugt und die Wells wuden 4 χ mit Puffer gewaschen.(0,05 % Tween 20 in PBS).

Das Detektionskonjugat wurde folgendermaßen hergestellt. Die monoklonalen Antikörper p25-6 und p26-7 wurden an Meerettichperoxidase (HRP) in einem Molverhältnis von 3:1 (AbtHRP) 3h unter Anwendung des Periodatoxidationsverfahrens (Nakane et al., J. Histochem. Cytochem*. 22:1084 (1974)) konjugiert. Die Konjugate wurden 1:1500 in 2,5 % (G/V) fettarmer Trockenmilch, 0,01 Thimerosal und 0,005 % Antifoam A in 20 mM Natriumzitrat verdünnt. Der verbleibende Teil des ELISA-Assays wurde wie im Beispiel I beschrieben, durchgeführt.

Die Bestimmung der neutralisierenden Aktivität mit den Antikörpern gpllO-3, -4, -5 und -6 erbrachte folgende Ergebnisse. Die höchsten Titer mit beibehaltener neutralisierender Aktivität waren: gpllO-3 = 15 625: gpllO-4 = 9 765 625: gpllO-5 = 125; und gpllO-6 = 625.

Aufgrund der vorausgesagten genetischen Variabilität des durch das Peptid 29 definierten Bereichs wurde die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers gpllO-4, ander» HIV-Isolate zu erkennen, untersucht. Die Immunofluoreszenz-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Der Antikörper gpllO-4 konnte Antigen in Kulturen von wenigstens drei von 16 HIV-Isolaten detektieren.

Der Antikörper gpllO-4 war in der Lage, Viren zu neutralisieren,

die über einen Zeitraum von 15 Wochen von einem Schimpansen isoliert wurden, der bei einem AIDS-Impfversuch als Kontrolltier mit LAV_DDfl inokuliert wurde. Der monoklon^le Antikörper

BKU

war in der Lage, die Isolate zu neutralisieren, obwohl das

Tier Serumantikörper aufwies« die HIV in vitro neutralisierten und obwohl das Tier eine messbare« zellvermittelte Immunantwort gegen HIV-Infektion ausgebildet hatte. Dies zeigt das Fehlen eines Antigen-Drifts in vivo für das Epitop; das durch den gpllO-4 Antikörper erkannt wird.

Beispiel III

Neutralisierunq der HlV-Infektivität durch einen Cocktail von Anti-gpllO und Anti-p25 monoklonalen Antikörpern

Dieses Beispiels beschreibt die Neutralisierung der HIV-Ig, Infektivität unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern« die an gpllO und Peptide innerhalb von gpllO binden« in Kombination mit monoklonalen Antikörpern« welche an p25 und an Peptide innerhalb von p25 binden und welche alleine eine nur geringe oder keine neutralisierende Aktivität aufweisen. Die Ergebnisse zeigen« daß der monoklonale Antikörper gpllO-2 in Kombination mit p25-6 oder p25-7 eine besonders große neutralisierende Aktivität aufweist.

Die Hybridomzellinien p25-6 und p25-7 wurden nach den oben beschriebenen Methoden unter Anwendung der Modifikationen erzeugt« zu denen die Verwendung inaktivierter zerstörter Viren oder gereinigter gag rekombinanter Fusionsproteine« die in E. CoIi als Immunogen exprimiert wurden« und die Charakterisierung der monoklonalen Antikörper bezüglich der Spezifität und der Reaktivität zählen« wobei die als GAG-1« GAG-2 und GAG-3 bezeichneten rekombinanten Fusionsproteine und die synthetischen Peptide 15/ 88« 150« 147 und 148 zur Anwendung kamen. Die synthetischen Peptide sind vom LAV_B__M-Genombe-

BRU

reich kodiert« der den folgenden Aminosäureresten entspricht: gg Peptid 15« Aminosäurereste 329 bis 350; Peptid 88« Aminosäurereste 315 bis 350; Peptid 150, Aminosäurereste318 bis

?63; Peptid 147« Aminosäurereste 278 bis 319; und Peptid 148, Aminosäurereste 290 bis 319. Die von den Hybridomzellinien p25-6 und p25-7 produzierten monoklonalen Antikörper reagieren mit dem rekombinanten Fusionsprotein GAG-3; p25-6 reagiert mit den synthetischen Peptiden 147 und 148/und p25-7 mit den synthetischen Peptiden 15, 88 und 150.

Die Neutralisations-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt/ außer daß bei Anwendung von Cocktails die einzelnen monoklonalen Antikörper zuerst 1:5 in Kulturmedium verdünnt und anschließend in gleichen Verhältnissen vermischt wurden« um eine Endverdünnung von 1:10 zu ergeben. Der verbleibende Teil des Assays wurde wie oben durchgeführt.

Die monoklonalen Antikörper gpllO-2, p25-6 und p26-7 zeigen

weniger als 50 % neutralisierende Aktivität« wenn sie alleine verwendet werden. Bei Verwendung eines Cocktails, der die monoklonalen Antikörper gpllO-2 zusammen mit p25-6 oder gpllO-2 mit p25-7 in einer Verdünnung von 1:10 umfaßt, erfolgt vollständige Neutralisierung. Ein Cocktail« der die monoklonalen Antikörper p25--6 in Kombination mit p25-7 enthält« ergab eine neutralisierende Aktivität im Bereich von 60 bis 90 %.

Beispiel IV Immunwirksamkeit des Peptids 29 und der Homologen davon

Die Fähigkeit des Peptids 29 und der homologen Peptide, ein-30

schließlich dem Peptid 177, eine Immunantwort gegen HIV zu

stimulieren, wurde an zwei Mäusestämmen untersucht. Die Herstellung der Peptidimmunogene, die Immunisierungsverfahren und die Charakterisierung der ausgelösten Immunantworten werden nachfolgend beschrieben. 35

Das Peptid 29 wird zur Immunisierung durch Konjugation an ein gereinigtes Thyroglobulin hergestellt. Thyroglobulin kann zur Konjugation mit N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) gemäß den in der US-PS 4 629 783/ Spalte 10» Zeilen 28-51 beschriebenen Verfahren derivatisiert werden. Als zweites I mmunogen wird Thyroglobulin mit Glutaraldehyd folgendermaßen derivatisiert. 27 mg Schweinethyroglobulin werden in 1 ml 0/1 M Natriumbicarbonat gelöst. Dazu trocknet man 8/3 μΐ einer 25%-igen Glutaraldehydlösung und rührt äie Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man gibt 1 ml Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer von pH 9/3 zu der Lösung und dialysiert anschließend 8 h gegen 2 1 des gleichen Puffers bei 4⁰C/ wobei ein vollständiger Austausch des Dialysats nach 4 h erfolgt. Das Peptid 29 gibt man dann zu dem derivatisierten Thyroglobulin in etwa 100-fachem molaren Überschuß und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man blockiert unumgesetzen Glutaraldehyd mit 200 μΐ einer 0/2 M Lysinlösung und rührt die Mischung mehrere Stunden (oder über Nacht) bei Raumtemperatur. Das Peptid-Thyroglobulin-Konjugat wird dann extensiv gegen PBS bei 4⁰C dialysiert.

Zwei Mäusestämme (C57 schwarz und BALB/c) inokuliert man mit den Peptider»; die durch das jeweilige Konjugationsverfahren herstellt wurden. Alle Tiere waren im Zeitpunkt der Inokulation etwa 2 bis 4 Wochen alt. Die Inokulation kann in den Fußballen/ durch Schwanzskarifikation, subkutan/ intranasal oder intraperitoneal erfolgen. Das Inokulum besteht aus 25 pg des konjugierten Peptids/ suspendiert in 0/5 ml kompletten Freund ¹S-Adjuvans/ wobei nach der 2., 3. und

5. Woche Booster-Inokulationen mit dem gleichen Immunogen/ suspendiert in inkomplettem Freund ¹S-Adjuvans/ gegeben werden. Man sammelt Serumproben von den einzelnen Mäusen vor der Immunisierung/ 4 Tage nach der Booster-Immunisierung nach der 3. Woche und 4 Tage nach der letzten Booster-Immunisierung nach 5 Wochen. Die Serumproben wurden auf Antikörper gegen

homologe Peptide oder Ganzviren durch ein Screening in einem ELISA-Aasay analysiert. Diejenigen Sera/ die Antikörperaktivität gegen LAV zeigen/ werden einem weiteren Screening auf neutralisierende Aktivität unterzogen. Im Anschluß daran erfolgt eine Analyse der Sera in Immunoblot-Assays gegen zerstörtes LAV-Antigen und in Radioimmunopräzipitations-Assays mit radio-markiertem gpllO.

Die Ergebnisse der Immunisierungen zeigen/ daß die mit Peptid 29 immunisierten Mäuse Antikörper entwickeln/ die mit Peptid 29 und zerstörten LAV-1-Viren in ELISA-Assays reagieren. Eine Konjugation des Peptid 29 durch Maleimid führt zur Bildung von Anti-Peptid-29-Antikörpern in einigen balb/c-Häusen. Die Konjugation des Peptids 29 durch Glutaraldehyd ergibt im allgemeinen höhere Titer an Antikörpern gegen das Peptid 29 in balb/c-Mäusen. Mit Peptid 177 immunisierte Mäuse entwickeln Antikörper gegen das Peptid. Eine Konjugation des Peptids 177 durch Glutaraldehyd war bei der Auslösung einer Immunantwort besser.

20

C57-Mäuse sprechen stärker auf die Immunstimulierung mit

dem Peptid 177 an als balb/c-Mäuse. Mit dem LAV-2-Peptid 110-2-2 immunisierte Mäuse entwickeln Antikörper gegen 110-2-2 und LAV-2-Viren/ wie mittels ELISA-Assays gezeigt werden konnte. Das durch Glutaraldehyd konjugierte Peptid 110-2-2 wirkt sowohl bei C57- als auch bei balb/c-Mäusen immunogen/ wobei die Titer gegen das 110-2-2-Peptid bei balb/c-Mäusen im allgemeinen höher als bei C57-Mäusen sind/ während die Titer gegen das LAV-2-Virus im allgemeinen bei

C57-Mäusen höher sind als bei balb/c-Mäusen. 30

35

Diejenigen Serumproben von immunisierten Mäusen/ die

(i) Antikörper gegen Ganzviren zeigen; (ii) in der Lage sind/ HIV zu neutralisieren/ wie beispielsweise in den in Beispiel II beschriebenen Assays und (iii) mit Peptid 29 in ELISA-Assays reagieren/ zeigen kumulativ die Wirksamkeit der Anwendung des Peptiäs 29 in einer Vakzinformulierung.

Beispiel V

t - Immunoaffinitä'tstrennung von qpllO unter Anwendung mono-

klonaler Antikörper

Monoklonale Antikörper gegen das gpllO-HIV-Antigen kann man

bei Immunoaffinitätstrennverfahren verwenden/ um die 15

bakteriell exprimierten rekombinanten Fusionsproteine zu reinigen. Wenn das exprimierte Protein von den Bakterien sekretiert wird/ kann das Protein aus dem Kulturüberstand isoliert werden. Wenn das Protein nicht sekretiert wird/

kann eine Zerstörung der Bakterienzellen erforderlich werden. 20

Die Konstruktion des Plasmids pENV-5 (ATCC Nr. 53074) ist in der USSN 721 237 beschrieben/ auf die hiermit Bezug genommen wird. Das Plasmid pENV-5 kodiert für den Hauptteil

dos Carboxylendes von gpllO und einen Teil des Amino-25

törminus von gp41 von LAV/ das in den trp Expressionsvektor insertiert ist. Durch diesen Vektor transformierte E. CoIi C600 exprimieren das gpllO Fusionsprotein/ sekretieren es aber nicht.

E. CoIi C600/ die das Plasmid pENV-5 enthalten/ läßt man

über Nacht bei 37⁰C unter Belüftung in einem Medium wachsen/ das Tryptophan (20 pg/ml) und Ampicillin (3.00 pg/ml) enthält. Die Übernachtkulturen inokuliert man dann zu 1:100

in frisches Minimalmedium/ das Ampicillin (100 pg/ml)* nicht 35

aber Tryptophan enthält. Diese Kulturen läßt man unter Be-

lüftung bei 37⁴C 2 bis 3 h wachsen (bis zur frühen log-Phase). Der Induktor» 3-B-Indol-acrylsäure (Sigma Chemical Co./ St. Louis/ MO) wird aus einer frisch bereiteten Vorratslösung von 20 mg/ml in 95%-igem Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 20 Mg/ml zugegeben. Die induzierten Kulturen läßt man bei 37⁰C unter Belüftung 4 bis 5 h wachsen/ pelletisiert anschließend und friert gegebenenfalls ein. Die Proteinausbeuten von pENV-5 betragen typischerweise weniger als 1 mg/1.

Die pelletisieren Bakterienzellen werden unter Verwendung von P-RIPA-Puffer (PBS, enthaltend 1 % Triton X-100, 1 % Deoxycholat/ 0,1 % Natriumdodecylsulfat und 1 % Aprotinin) lysiert, der E. Coli-Zellen lysiert. Die Suspension wird zum Shearing von DNA und RNA einer Ultraschallbehandlung unterzogen und anschließend zur Entfernung von Teilchen zentrifugiert. Eine Verdünnung oder Konzentrierung kann zur Standardisierung der Proteinkonzentration erforderlich sein.

Der monoklonale Antikörper HIV-gpllO-1 wird ursprünglich ausgefällt aus Ascitesflüssigkeit oder Zellkulturüberständen bei Raumtemperatur oder in der Kälte mit(NH₄J₂SO₄ oder Na₂SO.-Lösungen, die bei pH 7,3 auf eine Endsättigung von 33 oder 18 % gepuffert sind. Die ausgefällten Proteine werden durch Zentrifugieren entfernt und erneut in PBS gelöst und ein zweites Mal mit 33 % (NH₄J₂SO₄ oder 12 bis 15 % Na₃SO₄ gefällt. Falls erforderlich/ kann diese Stufe wiederholt werden. Das Pellet wird erneut in PBS gelöst und die überschüssigen Salze werden durch Gelfiltration über eine entsalzende Matrix oder durch erschöpfende Dialyse gegen PBS entfernt.

Der gereinigte monoklonale Antikörper 110-1 kann dann an 3g Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose gekoppelt werden. Die

erforderliche Menge an Gel läßt man in 10 M HCl-Lösung auf einem.Glasfilter quellen (1 g gefriergetrocknetes Material ergibt ein Gelendvolumen von etwa 3/5 ml), wäscht 15 Min. mit der gleichen Lösung und gibt den Antikörpör unmittelbar danach zu. Im allgemeinen erfolgt die Kopplungsreaktion am wirksamsten in einem pH-Bereich von 8 bis 10/ man kann jedoch auch bei einem niedrigeren pH-Wert arbeiten/ wenn dies aus Gründen der Antikörperstabilität erforderlich ist. Der Antikörper soll in PBS oder in einem Carbonat/Bicarbonat-oder Boratpuffer von hoher Ionenstärke mit 150 mM NaCl gelöst sein. Die aktivierte Sepharose und die Antikörpersuspension werden bei Raumtemperatur 2 bis 4 h oder über Nacht bei 4⁰C leicht gerührt und anschließend auf einer groben Glasfilterfritte mit Kopplungspuffer gewaschen. Soweit aktive Gruppen verblieben sind/ werden diese durch 2-stündige Behandlung mit 1/0 M Ethanolamin bei pH 8 blockiert. Das Antikörper-Sepharose-Endprodukt wird anschließend abwechselnd 4 oder 5 χ mit Pufferlösungen mit hohem oder niedrigem pH-Wert gewaschen (Boratpuffer/ 0/1 M/ pH 8/5/ IM NaCl und Acetatpuffer/ 0/1 M/ pH 4/0/ 1 M NaCl). Durch das Waschen entfernt man Spuren von nicht-kovalent adsorbierten Materialien. Die fertige Immunoaffinitäts-Separationsmatrix lagert man unterhalb von 8⁰C in Anwesenheit eines geeigneten bakteriostatischen Mittels/ wie 0/01 %-iges Azid.

Die Zugabe der exprimierten Proteinsuspension zu der Immunoaf finitäts-Separationsmatrix führt zu der selektiven Entfernung des gpllO-Antigens. Die Mischung läßt man 2 bis 24 h, vorzugsweise 12 bis 18 h, unter leichtem Rühren oder Schütteln einwirken. Man kann auch so vorgehen/ daß man die Immunoaffinitätsmatrix in eine Säule gibt/ äquilibriert und die exprimierte Proteinsuspension langsam auf die Säule gibt. Nach Zugabe der Proteinsuspension sollte der Flow gestoppt werden/ um die Bildung des Immunkomplexes auf beste Weise zu bewerkstelligen.

Ungebundenes Material wird durch extensives Waschen mit

Adsorptionspuffer ausgewaschen oder abgetrennt. Dazu kann man eine grobe Glasfilterfritte unter Anlegen eines Vakuums verwenden oder die Säule im Durchfluß behandeln. Das ungebundene Material wird dann unter Anwendung von Puffern mit niedrigem oder hohem pH-Wert (Acetatpuffer« pH 4/0 oder Boratpuffer/ pH 8/56) oder eines chaotropen Agens eluiert.

Beispiel VI Immunoaffinitätsreinigung von rekombinantem gpllO aus einem Säugetier-Expressionssystem

Die erfindungsgemäßen monokionalen Antikörper finden bei der Immunoaffinitätsreinigung von rekombinantem,durch Säugetierzellen exprimierten Fusions-gpllO Anwendung. Die Säugetierzellen infiziert man mit rekombinanten Vaccinia (Mackett et al., J. Virol. 49:857 (1984), worauf hiermit Bezug genommen wird), die Sequenzen enthalten, welche für wenigstens den Teil von gpllO kodieren, der antigen ist und die Bildung von neutralisierenden Antikörpern auslöst.

Die rekombinanten Vaccinia werden gemäß dem Verfahren konstruiert, das in der USSN 842 984 beschrieben ist, auf die hiermit Bezug genommen wird. Die Sequenzen, die für das Hüllglykoprotein von HIV kodieren, werden in einem Plasmidvektor (pGS20) abwärts von einem Vaccinia-Transkriptions-Kontrollelement insertiert. Diese Chimäre Gen wird flankiert von Sequenzen, die für das virale Thymidinkinase (TK)-Gen kodieren.

Die Chimären Plasmidvektoren, die Vaccinia-Virus-Promotoren enthalten, welche an das LAV-Hüllgen ligiert sind, verwendet gg man zur Transformation des E. Coli-Stamms MClOOO. Insertion

der Chimären LAV-env-Sequenzen in das Vaccinia-Virus-Genom erfolgte durch in vivo-Rekombination, was dadurch möglich wurde/ daß die Chimären Gene in den Plasmiden pv-env5 von Vaccinia-Virus-Sequenzen flankiert sind» die für das TK-Gen kodieren. Dieses Plasmid wird dann in die Zellen eingeführt« die vorher mit Vaccinia-Viren vom Wildtyp infiziert worden waren. Man ermöglicht dann eine Rekombination zwischen den TK-Sequenzen am Plasmid und den homologen Sequenzen in dem Vaccinia-Virus-Genom unter Insertion des Chimären Gens. Afrikanische Green-Monkey-Nier> nzellen (Stamm BSC-40/ eine von BS-1-Zellen abstammende Zellinie« ATCC Nr. CCL26) verwendet man als Wirt im Expressionssystem.

Konfluente BSC-40-Zellen infiziert man in einer Infektionsmultiplizität von 10 durch rekombinante Vaccinia-Viren. Die Infektion läßt man 12 h ablaufen/ danach werden die Zellen geerntet« einmal mit PBS gewaschen und abzentrifugiert. Die Zellpellets suspendiert man in Lyf,epuffer (l«0 % NP-40« 2«4 % Natriumdeoxycholat« 0,1 M NaCl, 0«01 M M Tris-HCl, pH 7/4/ 1 mM EDTA) und klärt das Lysat durch zentrifugieren. Die Immunoaffinitätstrennung des exprimierten rekombinanten Fusionsproteinsführt man,wie oben für das bakterielle Expressionssystem beschrieben,unter Anwendung des monoklonalen Antikörpers gpllO-1 durch. Die durch dieses Expressionssystem produzierten Proteine ähneln aufgrund der durch die Säugetierzellen erfolgten Behandlung und Glykosylierung stärker natürlich produziertem HIV-gpllO.

Beispiel VII Inhibierung einer HIV-Infektion mit blockierenden Peptiden

Die Wirksamkeit von blockierenden Peptiden bei der Inhibierung der Infektion von Gewebekulturzellen durch den LAV__RU-HIV-

Stamm wurde unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens

für die Bewertung von Peptid T, das von Pert et al, siehe

DD

. oben» publiziert wurde« untersucht. Die bevorzugten HIV-Inhibitions-Assays erfolgen/ indem man gleiche Volumina blockierender Peptide und CEN-Zellen (2,5 χ ΙΟ⁵) in Medium (RPMI/ 10 % PCS und 2 mg/ml Polybren) kombiniert und

t 45 Min. bei 37⁰C inkubiert. Das Virus wird dann in unterschiedlichen Dosierungen (10/ 50/ 500 TCID 50) zugegeben und die Mischung wird 14 Tage bei 37⁰C inkubiert. Der überstand wird anschließend einem Assay auf die Produktion von Virusantigen (z.D. p25-Kernantigen) unterzogen.

Eine Preinkubation der CEM-Zellen mit den Peptiden vor der

Viruszugabe zu den Kulturen verstärkt den inhibierenden Effekt in den Assays. Es hat sich gezeigt/ daß die Inhibierung von der Virusdosierung abhängig ist/ wobei eine

große Aktivität bei niedrigen und mittleren Dosierungen/ 15

ein geringerer Effekt dagegen bei höchsten Virusdosierungen zu beobachten war.

Mit Peptid T wer bei Experimenten mit niedrigen Virusdosierungen eine Inhibierung der Virusantigenproduktion 20

von etwa 60 % bis 90 % zu erzielen. Weitere Experimente mit den Peptiden X bis XV/ die typischerweise am COOH-Terminus amidiert und am NHj-Terminus acetyliert waren/ ergaben ähnliche Ergebnisse/ wobei das Peptid XI über einen

breiten Dosisbereich besonders wirksam war. Es ist ersicht-25

lieh/ daß auf Basis der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und Peptide/ einschließlicn der blockierenden Peptide/ eine bessere Methode zur Neutralisierung und/oder Inhibierung von HIV-Infektionen zur Verfügung steht. Dies ermöglicht

die Schaffung prophylaktischer und therapeutischer Mittel/ 30

die gegen Infektionen durch die meistert/ wenn nicht alle/ HIV-Stämme wirksam sind. Darüber hinaus finden die neuen Materialien in Diagnose-Assays und anderen bekannten Verfahren Anwendung.

66

Hinterlegungsnummern der Mikroorganismen

Die nachfolgenden Mikroorganismen; die Teil der vorliegenden Erfindung sind/ wurden bei der American Type Culture Collection; 12301 Parklawn Drive; Rockville; Maryland 20852; USA; hinterlegt. Die Hintenlegungsdaten sind wie folgt:

Wissenschafti. Bezeichnung	Bezeichnung des Hinterlegers	ATCC-Nr.	9175	Hinterlegungs daten
Mouse hybridoma (ba:ib c/NS-1)	HIV-gp 110-1	HB	9176	August 15, 1986
N	HIV-gp 110-2	HB	9177	August 15, 1986
H	HIV-gp 110-3	HB	9404	August 15, 1986
H	HIV-gp 110-6	HB	9405	April .10, 1987
n	HIV-gp 110-4	HB	9406	April 30, 1987
M	HIV-gp 110-5	HB	9407	April 30, 1987
N	HIV-p 25-2	HB	9408	April 30, 1987
N	KIV-p 25-3 ι	HB	9409	April 30, 1987
H	HIV-p 25-6	HB	9410	April 30, 1987
N	HIV-p 25-7	HB	9177	April 30, 1987
5 Die Hybridome HB9175, HB 9176	und HB	Die	wurden getestet und
waren am 26.	August 1986 lebensfähig.	waren am 4.	übrigen Hybridome
wurden ebenfalls getestet und	Mai 1987 lebens-

fähig.

Claims (2)

1. _c PATENTANSPRÜCHE

   ο

   1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von HIV in einer biologischen Probe,

   dadurch gekennzeichnet , daß
   man

   a) einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, mit HIV-gpllO der biologischen Probe zu

   *" reagieren, inkubiert; und

   die Anwesenheit von Immunkomplexen aus dem monoklonalen Antikörper und der Antigen-Determinante in der biologischen Probe nachweist und daraus die

   Anwesenheit oder das Fehlen von HIV in der Probe 20

   bestimmt; oder

   b) ein Peptid aus einem neutralisierenden Bereich ; von HIV-gpllO oder p25 mit der biologischen Probe

   inkubierfc; und die Anwesenheit von Immunkomplexen aus

   dem Peptid und den Antikörpern in der Probe, die mit 25

   dem Peptid reagieren, nachweist und daraus die . Anwesenheit oder das Fehlen von HIV in der Probe bestimmt^ oder

   c) ein Nukleinsäuresegment, das für wenigstens einen 30

   Teil eines neutralisierenden Bereichs von HIV kodiert,

   mit einer Nukleinsäure in der biologischen Probe unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert; und

   die Anwesenheit von Hybridkomplexen aus dem Nukleinsäuresegment und der Nukleinsäure in der Probe nachweist und daraus die Anwesenheit oder das Fehlen von HIV in der Probe bestimmt; oder

   (J U lt.)

   d) eine biologische Probe des Wirts mit einem Peptid eines neutralisierenden Bereichs von HIV inkubiert; und

   die Anwesenheit von Immunkomplexen aus dem Peptid und den Antikörpern in der Probe nachweist und daraus den HIV-Stamm bestimmt, mit dem der Wirt infiziert ist.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper gemäß Absatz a) in der Lage ist, mit einem neutralisierenden Bereich oder einem blockierenden Peptid von gpllO zu

   reagieren.
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