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Aquired Immunodeficiency Syndrom (AIDS) ist das späte Stadium einer persistenten Infektion mit dem Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1). Die gegen das Virus und Virus infizierte Zellen gerichtete Immunantwort reicht in den meisten Fällen nicht aus, um die Progression einer HIV-1 Infektion zum Stadium AIDS zu verhindern. Eine Möglichkeit, das Immunsystem in einen Status zu bringen, welcher das Etablieren einer persistenten Infektion beziehungsweise die Progression zu AIDS verhindern kann, stellen Impfstoffe dar. Herkömmliche Impfstoffstrategien gegen HIV-1 konzentrieren sich auf das Oberflächenprotein GP160 (Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 160 kD), das für die Bindung des Virus an den zellulären Rezeptor CD4 und für die Fusionsaktivität verantwortlich ist.
Das GP160 setzt sich aus den Untereinheiten GP120 und GP41 zusammen. In letzter Zeit wurden Im Zusammenhang mit GP160 mehrere Phänomene beobachtet, welche gegen die Verwendung des gesamten GP160 als Immunogen sprechen. Es wurde in vitro beobachtet, dass GP120 und anti-GP120 Antikörper zusammen die Aktivierung von CD4 + Zellen blockieren können (1). Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass auch in vivo die humorale Immunantwort gegen das GP120 von HIV-1 indirekt die T-Zell Aktivierung supprimiert, was in weiterer Folge zur Immundefizienz führt.
Als Ursache der Blockierung der T-Zell Aktivierung nimmt man eine Vernetzung von CD4+ -Zellen durch anti-GP120 Antikörper über das GP120 an. Eine weitere Hypothese, wonach das GP160 aufgrund von Sequenzhomologien mit den Major Histo-Compatibility Complex (MHC) Molekülen zur Immundefizienz führt, kommt von Kion et al (2). Ausserdem verursachen mehrere antigene Domänen am GP160 die Bildung von Antikörpern, welche eine HIV Infektion verstärken können (3). Solche, durch das GP160 auftretende Effekte könnten mit einem Subunitimpfstoff, der nur ausgewählte immundominante Regionen oder Epitope enthält, vermieden werden.
Immunogene Peptide wurden schon in mehreren Fällen erfolgreich zur Immunisierung eingesetzt (4,5, 6). Der Einsatz von Peptiden als Immunogene bietet eine Reihe von Vorteilen. Die durch solche Peptide induzierten Antikörper zeichnen sich durch eine massgeschneiderte Spezifität aus. Im Falle der Immuniserung gegen Viruserkrankungen können die für eine effektive Immunantwort am besten geeigneten Peptide ausgewählt werden. Bei HIV-1 Viren wurde gezeigt, dass es möglich ist, mit einem synthetischen Peptid, welches ein Teil der V3-Loop Region des Hüllproteins GP120 vom Isolat HTLVIIIB ist, die Bildung von neutralisierenden Antikörpern zu induzieren, wodurch eine Infektion mit demselben Isolat verhindert werden konnte (7,8).
Weiters wurde zum Beispiel im Falle des Hämaggluttinins von Influenza Virus gezeigt, dass durch Immunisierung mit synthetischen Peptiden die Bildung neutralisierender Antikörper induziert werden kann, deren Bindungsspezifitäten bei Immunisierung mit ganzem Influenza Virus nicht beobachtet werden (4). Somit ist es möglich, mittels Peptiden Antikörper zu induzieren, die ein breiteres Wirkungsspektrum haben, als solche, die durch die Verabreichung von ganzen Proteinen gebildet werden. Andererseits wurden Arbeiten publiziert, in denen die Immunisierung verschiedener Versuchstiere mit Peptiden beschneben wird, welche von der Nukleotidsequenz des Maul- und Klauenseuche Virus abgeleitet wurden.
Diese Immuniserung führte im Gegensatz zu der Immunisierung mit dem entsprechenden ganzen Protein des Maul- und Klauenseuche Virus zu der Bildung neutralisierender Antikörper in den Versuchstieren, und damit zu einem kompletten Schutz gegenüber einer nachfolgenden Infektion mit virulentem Maul- und Klauenseuche Virus (5).
Ein Nachteil von Peptidimpfstoffen ist allgemein die geringe Immunogenität von kleinen Molekülen. Eine Lösung dazu ist, das Peptid mit Molekülen von guter Immunogenität, wie zum Beispiel Tetanus Toxoid oder Keyhole Limpet Hämocyanin, chemisch zu koppeln (5). Eine andere Möglichkeit ist die Klonierung von
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kommen attenuierte Viren wie Vaccina, Polio Sabin Typ1 oder Influenza A NA/B-NS als Vektoren für Immunogene in Frage. So wurde das Vaccinia Virus schon vielfach als Vektor für fremde Gene von unterschiedlichen Pathogenen eingesetzt. Unter anderen wurde zum Beispiel das Hepatitis B SurfaceAntigen (HBsAg) exprimiert, und erfolgreich zur Immunisierung von Versuchstieren eingesetzt (11). Am Poliovirus Sabin Typ 1 ist es gelungen, eine antigene Region im Capsid Protein VP 1 gegen ein Epitop von HIV-1 auszutauschen.
Dieses chimäre Virus war In der Lage, in Versuchstieren neutralisierende Antikörper gegen GP160 zu induzieren (12). Seit kurzem ist es auch möglich, Influenzaviren mittels in vitro Mutagenese zu verändern (13). So war es möglich, ein genetisch stabiles attenuiertes Influenza A Virus zu erhalten (14). Weiters konnte ein tntertypisch antigenes chimäres Virus konstruiert werden (15). Ein Vorteil von Influenza Viren in diesem Zusammenhang ist die Verfügbarkeit von vielen unterschiedlichen Serotypen, so dass wiederholte Impfungen möglich sind.
Ausserdem induzieren Influenza Viren eine starke humorale und
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anti-HIV-1 ImpfstoffstrategieTransformation von befallenen Zellen durch Influenza Viren unwahrscheinlich, da es keine DNA-Phase im Replikationszyklus gibt, was eine chromosomal Integration von viralen Influenza Genen ausschliesst.
Die Anwendung anbidiotypischer Antikörper stellt eine weitere Möglichkeit zur Erzielung einer spezifischen Immunreaktion und damit Immunität dar. Antiidiotypische Antikörper sind Antikörper, welche die
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Antigen-Bindungsstelle eines anderen Antikörpers spezifisch erkennen und binden. Da die Bindungsstellen von Antikörpern strukturell als Spiegelbild des gebundenen Epitops angesehen werden können, kann ein antiidiotypischer Antikörper wiederum als Spiegelbild des Spiegelbildes, also als das innere Abbild des Epitops, gesehen werden.
Es ist zwar nicht immer vollkommene Identität zwischen der Struktur bzw. der Aminosäuresequenz des antiidiotypischen Antikörpers mit der Struktur bzw. der Aminosäuresequenz des Epitops zu erwarten, sehr wohl beobachtet man in der Praxis aber Effekte, die auf eine strukturelle, sequenzmässige oder funktionelle Ähnlichkeit schliessen lassen. Die mögliche Anwendung antiidiotypischer Antikörper als Vakzine wurde ursprünglich von Nisonoff und Lamoyi (16) vorgeschlagen.
Am Beispiel der afrikanischen Schlafkrankheit wurde zum erstenmal gezeigt, dass es in BALB/c Mäusen möglich war, eine schützende Immunreaktion gegen den Erreger, Trypanosoma brucei rhodesiense, durch die Verabreichung antiidiotypischer Antikörper zu erzielen (17). Im Zusammenhang mit viralen Antigenen wurde In einer anderen Studie die Bildung antiidiotypischer Antikörper zu dem neutralisierenden Epitop des Hemagglutinin Moleküls von Reovirus Typ 111 untersucht.
Diese antiidiotypischen Antikörper erkannten den zelluläre Rezeptor des Reovirus-Hemagglutinins sowohl auf zytolytischen T-Zellen als auch auf neuronalen Zellen, und induzierten in der Maus sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Imunantwort spezifisch gegen Reovirus-Hemagglutinin (18,19, 20)
Peptide bestehend aus 6 Aminosäuren, welche spezifisch an den anti-HIV-1 monoklonalen Antikörper
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gene zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen HIV-1 verwendet. Zur Identifikation der gegenständlichen Peptide wurden verschiedene überlappende Fragmente vom GP41 vom Isolat BH10 als Glutathion S-Transferase Fusionsproteine kloniert.
Die verschiedenen GP41 Fragmente wurden durch Hybridisieren von entsprechenden Oligonukleotiden erhalten, und In die BamHI-EcoRI Stelle des Plasmids pGEX-2T (Pharmacia) im synchronen Leserahmen kloniert. Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli Stamm DH5 transformiert, und die Expression des Fusionproteins wurde durch Zusatz von Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Der gesamte E. coli Extrakt wurde anschliessend auf SodiumdodecylsulfatPolyacrylamidgelen (SDS-PAGE) aufgetragen, aufgetrennt und die Proteinexpression mittels Silberfärbung analysiert. Fusionspeptide, die am neutralisierenden monoklonalen Antikörper 2F5 binden, wurden über Western-Blots nachgewiesen. Auf diese Art wurden die gegenständlichen Peptide, weiche spezifisch an den Antikörper 2F5 binden, identifiziert.
So zeigt Fig. 1 Western Blots von Fusionspeptiden mit verschieden langen überlappenden Fragmenten vom GP160 vom HIV-1 BH10 Isolat. Während Konstrukte, welche die Aminosäuren 597 bis 677,634 bis 677 und 648 bis 677 (die Nummerierung der Aminosäuren bezieht sich in der ganzen Patentschrift auf GP160 vom HIV-1 Isolat BH10, wie in der Datenbank "SWISSPROT" im Sequenzeintrag "ENV$HIV10" angegeben) umfassen, eine positive Reaktion mit dem monoklonalen Antikörper 2F5 zeigten, ist mit dem Fusionspeptid welches die Aminosäuren 667 bis 677 vom GP160 umfasst, keine Reaktion erfolgt. Dies war der erste Hinweis, dass das gegenständliche Epitop in der Region 648 bis 667 liegt. Es wurden daraufhin von dieser Region überlappende 6er Peptide mit der Glutathion-STransferase fusioniert.
Wie in Fig. 1 b ersichtlich, zeigt das Peptid, weiches die Aminosäuren GLU LEU ASP LYS TRP ALA (Aminosäuren 662-667) enthält eine starke Reaktion und Peptide, welche die Aminosäuren LEU ASP LYS TRP ALA SER (Aminosäuren 663-668) und ASP LYS TRP ALA SER LEU (Aminosäuren 664- 669) umfassen eine deutlich schwächere Färbung. Das Peptid, weiches die Aminosäuren LEU GLU LEU ASP LYS TRP (Aminosäuren 661-666) enthält, zeigt keine Reaktion. Aus diesen Daten geht hervor, dass das
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einigen HIV-Isolaten Abweichungen gegenüber der Sequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA feststellen.
In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen dass auch Peptide mit den entsprechenden Abweichungen von der Sequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA an den Antikörper 2F5 binden (Fig. 1c). Das Epitop des Antikörpers 2F5 ist somit auf den verschiedensten HIV-1 Isolaten vorhanden. Fusionspeptide wurden, wie unter "Gegenstand der Erfindung" beschrieben in E. coli exprimiert, auf 20% Polyacrylamidgele aufgetragen und auf Nitrozellulosemembranen transferiert.
Diese Membranen wurden zunächst mit PBS (pH 7. 2) 0. 1% Tween 20 Puffer (TPBS) der 0. 5% Trockenmilchpulver enthielt blockiert. Danach wurde nacheinander mit 2F5 Antikörper (500 ng/ml TPBS) und Anti-Human IgG-Alkalische- Phosphatase-Konjugat jeweils 30 Minuten inkubiert und diese "Blots" mittels einem Alkalische Phosphatase Substrat entwickelt. In Fig. 1 a in Reihe 1 wurde als negative Kontrolle eine analog den Fusionspeptiden exprimierte Glutathion STransferase (GST) aufgetragen. Reihe 2 entspricht einem Fusionspeptid in welchem an die GST die Aminosäuren (As) 597 bis 677 vom GP41 gekoppelt wurden.
Reihe 3 entspricht der GST mit den Aminosäuren 634 bis 677, Reihe 4 der GST mit den Aminosäuren 648 bis 677, und Reihe 5 der GST mit
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den Aminosäuren 667 bis 677. Reihe 1 in Fig. 1 b zeigt wiederum die negative Kontrolle, Reihe 2 entspricht der GST mit den Aminosäuren GLU LEU ASP LYS TRP ALA (As 662-667), Reihe 3 der GST mit den Aminosäuren LEU ASP LYS TRP ALA SER (As 663-668), Reihe 4 der GST mit den Aminosäuren ASP LYS TRP ALA SER LEU (As 664-669) und Reihe 5 der GST mit den Aminosäuren LEU GLU LEU ASP LYS TRP (As 661-666). Wie in Fig. 1 b zeigen Reihe 1 und Reihe 2 von Fig. 1 c die negative Kontrolle und die GST mit den HIV-1 BH10 Isolat entsprechenden Aminosäuren 662 bis 667 GLU LEU ASP LYS TRP ALA.
In Reihe 3 wurde die vom GP160 HIV-1 BH10 Isolat stammende Peptidsequenz entsprechend den HIV-1 Isolaten Z-84, CDC-451, und CDC-4 zu GLN LEU ASP LYS TRP ALA, in Reihe 4 entsprechend den HIV-1 Isolaten Zaire HZ321, ADA, und U455 zu ALA LEU ASP LYS TRP ALA und in Reihe 4 entsprechend dem HIV-1 Isolat JH3 zu GLY LEU ASP LYS TRP ALA abgwandelt.
Die Vorliegen antigener Stellen In der weiteren Region der gegenständlichen Peptide wurde auch schon von anderen Arbeitsgruppen beschrieben (21,22). Teeuwsen et al. berichten von einem monoklonalen Antikörper, der mit einem Peptid entsprechend dem Abschnitt von Aminosäure 643 bis 692 des GP160 reagiert. Weiters haben Broliden et al. gefunden, dass Vollsera von HIV-positiven Trägern unter anderem an
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Für den von Teeuwsen et al. beschriebenen monoklonalen Antikörper konnte keine neutralisierende Wirkung festgestellt werden.
Auch die von Broliden et al. untersuchten Vollsera, welche an die betreffende Region binden, zeigen nur bedingt neutralisierende Eigenschaften : in verschiedenen Neutralisationsversuchen konnte von dieser Forschergruppe eine neutralisierende Aktivität nur gegen das HIV-1 Isolat HTLVIIIB gezeigt werden, während gegen SF2 und RF keine neutralisierende Wirkung gezeigt werden konnte. Dies steht in krassem Gegensatz zu dem von den Erfindern etablieren und wegen seiner in vitro neutralisierenden Eigenschaften in grossem Detail untersuchten humanen monoklonalen Antikörper 2F5, welcher in der Lage ist, alle bisher getesteten HIV-Hsolate (inclusive SF2 und RF) zu neutralisieren (Tab. 1).
Die Antikörper der Vollsera von Broliden et al., wie auch der monoklonale Antikörper von Teeuwsen et al. haben daher eine andere Spezifität und erkennen somit ein anderes Epitop als der Antikörper 2F5.
Die Verwendung der gegenständlichen Peptide als Immunogene hat mehrere Vorteile. Die Peptide umfassen nur 6 Aminosäuren. Dadurch können Effekte, die von anderen HIV-1 oder GP160 Peptidsequenzen ausgehen, wie zum Beispiel eine Induktion von Antikörpern, die eine HIV Infektion verstärken oder Regionen die einen immunosuppressiven Effekt auslösen, vermieden werden (2,3).
Im Hinblick auf einen HIV-1 Impfstoff ist es wichtig, eine Immunantwort gegen möglichst alle bekannten HIV-1 Isolate zu induzieren. Weiters entstehen während der HIV-1 Virusreplikation Mutanten, die einer Immunantwort entgehen können. Aufgrund des bereits oben erwähnten Sequenzvergleichs In der Region des Epitops vom 2F5 am GP160 (Tab. 2) und der Tatsache dass alle gegenständlichen Peptide mit dem Antikörper 2F5 reagieren (Fig. 1 c) kann davon ausgegangen werden, dass Antikörper die von den gegen- ständlichen Peptiden induziert werden gegen ein breites Spektrum von verschiedenen HIV-Isolaten gerichtet sind.
Weiters wurden für den humanen monoklonalen Antikörper 2F5 in vitro neutralisierende Eigenschaften gegen eine Vielzahl verschiedener HIV-1-lsolate gezeigt, wodurch der Beweis erbracht ist, dass die gegenständliche Peptidsequenz bel unterschiedlichen HIV-1 Isolaten als neutralisierendes Epitop präsentiert wird (Tab. 1).
Der klinische Verlauf einer HIV-1 Infektion variiert zwischen verschiedenen Patienten erheblich. Während einige Patienten Symptome entwickeln, die als AIDS-related complex (ARC) und AIDS bezeichnet werden, bleiben andere asymptomatisch. Es wurde gezeigt, dass Antikörpertiter gegen bestimmte PeptidEpitope in AIDS Patienten im Gegensatz zu asymptomatischen HIV-1-Trägern signifikant niedriger oder überhaupt nicht vorhanden sind (23). Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit Sera von HIV-1-Trägern, die das gegenständliche Peptid binden, gefunden (Fig. 2).
Die in der Fig. 2 gezeigten Patienten Nummer 20, 25,29, 35, 41, 44, 46, welche einen hohen Antikörpertiter gegen das gegenständliche Peptid aufweisen sind, im Gegensatz zu den anderen gezeigten Patienten bereits seit etwa 5 Jahren frei von Symptomen von ARC oder AIDS. Daraus folgt, dass die Stimulierung der Bildung solcher Antikörper, die durch das gegenständliche Peptid induziert werden, die Progression einer HIV-1 Infektion aufhalten kann. Zudem lässt die geringe Häufigkeit von Antikörpern im Vollserum von HIV-1 infizierten Individuen, weiche auch an das gegenständliche Peptid spezifisch binden (vergleiche Fig. 2) den Schluss zu, dass dieses Epitop vom humanen Immunsystem nur unzulänglich erkannt wird und daher nur selten solche neutralisierende Antikörper entstehen. Die Antikörpertiter wurden mittels ELISA bestimmt.
Das Peptid wurde in Form eines Fusionsproteins (gekoppelt an Glutathion-S-Transferase) in Mikrotiterplatten an die Oberfläche gebunden (2, 5 ug/ml). Nach dem Auswaschen des ungebundenen Anteils wurden die Patientensera in einer 2n Verdünnungsreihe aufgetragen und 1 inkubiert. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Anteiles wurde mit Anti h, J1"nan IgG (mit Peroxidase konjugiert) Inkubiert. Nach dem Auswaschen wurde gefärbt und ausgewertet. Als Cutoff wurde der doppelte Reaktionsblindwert definiert.
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Die Spender der Sera mit den Nummern 20, 25, 29, 35, 41,44, 46 sind, wie angeführt, seit etwa 5 Jahren HIV-1 positiv und noch immer symptomfrei. Da es sich bei dem gegenständlichen Epitop um ein generell neutralisierendes Epitop handelt, das hochkonserviert ist, ist es besser geeignet zur immunchemt- schen Bestimmung des Neutralisationstiters von Patientensera als das hochvariable Epitop in der V3-Region am GP-120.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es daher auch, das gegenständliche Peptid in geeigneter Form anzubieten um die Ausbildung neutralisierender Antikörper in der Immunreaktion zu fördern.
Beispiel 1
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Mäusen mit diesem Fusionsprotein. Sämtliche hier und weiter unten beschriebenen Klonierungsvorgänge wurden nach Standardmethoden durchgeführt (24). Die beiden dem gegenständlichen Peptid entsprechenden Oligonukleotide (in ihrer codierenden Sequenz entsprechend dem plus-und dem minus- Strang aus
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wurden miteinander hybridisiert und in die BamH1-EcoR1 Stelle des Plasmids pGEX-2T (Pharmacia) kloniert. Dadurch wurde das NH2-terminale Ende des gegenständlichen Peptids mit dem COOH-terminalen Ende der Glutathiontransferase fusioniert. Am COOH-Terminus des gegenständlichen Peptids wurde ausserdem ein Transkriptions-Stop-codon angefügt. Dieses Konstrukt wurde in den E. coli Stamm DH5 transformiert und die Expression des entsprechenden Fusionsproteins durch Induktion mit IPTG induziert.
Nach 3 Stunden Induktion wurden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet, in Phosphate Buffered Saline (PBS) Puffer (pH 7, 2) mit 1% Triton-X-100 suspendiert und mittels Ultraschall aufgeschlossen. Die Bakterienbruchstücke wurden wiederum abzentrifugiert, und der Überstand auf eine Glutathion-Sepharose 4B Säule (Pharmacia) aufgetragen. Das Fusionsprotein wurde mit 20mM Glutathion in 100mM Tris (pH 8, 0), 120mM NaCI Puffer eluiert. Das auf diese Art gereinigte Fusionsprotein wurde zur Immunisierung von 3 Mäusen gemäss Standardprotokollen eingesetzt. 2 Wochen nach der Grundimmunsierung wurde mit 100up der gleichen Fusionsprotein-Präparation geboostert. Als Kontrolle dienten 3 Mäuse welche mit einer mit der gleichen Methode präparierten Glutathion S-Transferase immunisiert wurden.
Keine dieser Kontrollmäuse hatte HIV-1 spezifische beziehungsweise HIV-1 neutralisierende Antikörper. Vollsera, welche den Mäusen 1 Woche nach der letzten Immunisierung entnommen wurden, zeigten hohe spezifische Neutralisationstiter gegen das gegenständliche Peptid und inhibierten in vitro die Infektion mit HIV-1 Viren (Fig. 3b und c). Fig.
3b betrifft den Antikörpertiter. Dazu wurden je 3 Balb/c Mäuse entweder mit 100 ug Glutathiontransferase
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rekombinanten idiotypischen Antikörpers (rA), bzw. 4, 0 logioTCIDso des chimären Influenza/HIV Virus (V) subcutan geimpft, und 2 Wochen später mit derselben Menge der entsprechenden Präparation geboostert.
Am Tag 30 wurden ELISA Antikörper bestimmt. Resultate sind als reziproke Werte der Serumverdünnung, die noch signifikant positive Messwerte ergaben, angegeben. Fig. 3c zeigt die Neutralisation der HIV-1 Infektion. Die Neutratisationstiter wurden bestimmt, indem 10ul Hitze inaktivierter Antisera mit 3, 0 logo TCIDso bei 37. C inkubiert wurden, und die verbleibende HIV-1 Infektiosität wie in Fig. 3a beschrieben durchgeführt wurde. Abkürzungen : P, Fusionspeptid ; V, chimäres Influenza/HIV Virus ; SM, immunologisches
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;Fällen kleiner als 10.
Beispiel 2
Beispiel 2 beschreibt die Expression des Peptids GLU LEU ASP LYS TRP ALA gemäss SEQ ID NO : 1 als Teil des Hämagglutinins von Influenzavirus. Mittels in vitro Mutagenese wurden jeweils 6 Aminosäuren der antigenen Stellen A, B, C, D, und E (26, 27) vom Hämagglutinin von Influenzavirus A/WSN/33 gegen die Aminosäuresequenz des gegenständlichen Peptids ausgetauscht. Diese chimären DNA-Konstrukte wurden jeweils in das Influenzavirus HK/WSN transfiziert (13). Von den resultierenden chimären InfluenzalHIV-1 Viren wurde über Genreassortment das entsprechende Hämagglutinin in das attenuierte Influenza A NA/BNS Virus gebracht (14). Diese attenuierten chimären InfluenzalHIV-1 Viren hatten die antigenen Eigenschaften des gegenständlichen Peptids.
In Antikörper-Adsorbtionsexperimenten inhibierten diese chimären Viren HIV-1-Neutralisation durch den monoklonalen Antikörper 2F5 (Abb. 3a). Antisera von Mäusen, die durch subcutane Injektion mit chimären InfluenzalHIV-1 Viren induziert wurden, reagierten spezifisch mit dem gegenständlichen Peptid (Abb. 3b). Ausserdem neutralisierten diese Antisera in vitro verschiedene HIV-1 Isolate (Fig. 3c). Fig. 3a zeigt Influenza/HIV Inhibierung von HTLVIIIB Neutralisation. Resultate sind als %
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verbleibende Neutralisation nach Inkubation mit Kulturmedien (Mock), Influenza WSN bzw. Influenza/HIV angegeben. 2F5 ist der monoklonale Antikörper, welcher an das gegenständliche Peptid bindet.
Der monoklonale Antikörper 2G12 erkennt ein vom gegenständlichen Peptid verschiedenes neutralisierendes Epitop am GP120 von HIV-1. Die verbleibende HIV-neutralisierende Aktivität wurde bestimmt, indem
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bei 37. C inkubiert wurden. Aliquote (1001l1) des Kulturmediums mit 104 Zellen wurden zugegeben, und Syncitlenbildung als Indikator für eine HIV Infektion bestimmt.
Beispiel 3
Beispiel 3 beschreibt die Expression des gegenständlichen Peptids als Teil eines sogenannten immunologischen "Supermoleküls", wobei die gegenständliche Peptidsequenz in den Linker, welcher die variable Region der schweren Kette mit der variablen Region der leichten Kette eines single chain Fv (25) verbindet, eingefügt wurde. Die Fusion des Antikörperfragmentes, das je nach Spezifität einerseits an ein beliebiges Epitop des Targetantigens bindet und gleichzeitig auch ein erwünschtes Epitop präsentiert, eröffnet völlig neue Möglichkeiten der Einflussnahme auf die Topographie der Moleküle und damit der Beeinflussung des Immunsystems.
Die hier gezeigte Verabreichung eines immunologischen "Supermole- keuls" stellt eine Möglichkeit dar, gleichzeitig eine passive und aktive Immunisierung zu erzielen. Prinzipiell werden dabei die antigenbindenden Domänen eines neutralisierenden Antikörpers und die Präsentation eines oder mehrerer Epitope miteinander verknüpft. Ein solches Molekül hätte zum Beispiel bei bereits HIVpositiven Personen den Vorteil, das Ausmass der Infektion bereits ab dem Zeitpunkt der ersten Verabreichung einzudämmen. Im speziellen bedeutet das, dass die Zeitspanne bis zum effektiven Einsatz der durch die präsentierten Epitope induzierten Immunantwort ohne besondere Progression der Krankheit überbrückt wird.
Weiters wird das Peptid während der Neutralisation von bereits vorhandenen HIV-1 Viren durch die antigenbindenden Domänen des"Supermoteküts"besonders effizient präsentiert.
Es wurde ein single chain Fv Konstrukt gemäss Standardmethoden (25) ausgehend von einem neutralsierenden anti-HIV-1-GP120 Antikörper hergestellt, wobei in der Region des Linkers, welcher die variable Region der schweren Kette mit der variablen Region der leichten Kette verbindet, eine oder zwei Kopien des Peptids GLU LEU ASP LYS TRP ALA gemäss SEQ 10 NO : 1 eingefügt wurden. Das rekombinante Protein wurde in E. coli zur Expression gebracht und nach Standarmethoden gereinigt. Dieses Konstrukt erfüllte 2 Funktionen.
Einerseits wurden in vitro die antigenbindenden Eigenschaften des ursprünglichen Antikörpers beibehalten, und andererseits induzierte dieses Konstrukt, wenn es in Mäuse geimpft wurde, Antikörper, welche spezifisch mit dem gegenständlichen Peptid reagieren und in vitro unterschiedliche HIV-1 Isolate neutralisieren (Fig. 3b und c).
Beispiel 4
Beispiel 4 beschreibt die Bildung antiidiotypischer Antikörper gegen den Antikörper 2F5, sowie die Herstellung eines antiidiotypischen Antikörpers mittels gentechnischer Methoden. Es wurden Mäuse mit dem Antikörper 2F5 immunisiert, um die Bildung antiidiotypischer Antikörper zu induzieren. Das Impfschema wurde nach Standardmethoden speziell für die Ausbildung antiidiotypischer Antikörper ausgelegt. Die erhaltenen Sera wurden auf Imunreaktivität untersucht, wobei mittels Antigen-Verdrängungs-ELISAfestge- stellt wurde, dass ein Tell der humoralen Immunantwort tatsächlich gegen die Bindungsregion des Antikörpers 2F5 gerichtet war. Somit war bewiesen, dass in den betreffenden Sera antiidiotpische Antikörper vorlagen.
Um das Konzept der Vakzinierung mittels antiidiotypischer Antikörper zu überprüfen, wurden die
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wendet, um wiederum andere Mäuse damit intraperitoneal zu immunisieren. Tatsächlich konnte in diesen Mäusen eine Immunreaktion nachgewiesen werden, die qualitativ vergleichbar mit der oben beschriebenen Immunreaktion gegen den HIV-1 Peptid-Anteil des in Beispiel 1 beschriebenen Glutathion-S-Transferase Fusionsproteins war.
Da bewiesen war, dass das beschriebene Peptid die für ein immunogeen erforderlichen Qualitäten besitzt, und dass ausserdem unter Verwendung antiidiotypischer Antikörper mit innerer-Abbild-Qualität des gegenständlichen Peptids die Induzierung einer HIV-1 neutralisierenden Immureaktion gezeigt worden war, wurde unter Verwendung gentechnischer Methoden ein antndiotypischer Antikörper konstruiert. Dabei wurden eine oder mehrere hypervariabie Regionen (oder Teile davon) eines bestehenden monoklonalen Antikörpers gegen die Peptidsequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA gemäss SEQ 10 NO : 1 ausgetauscht.
Die entsprechenden Konstrukte wurden in Form von single chain Fv Fragmenten in E. coli zur Expression gebracht und die rekombinanten Proteine wurden mittels Standardmethoden gereinigt. Immunisierung von
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Mäusen mit diesen antiidiotypischen rekombinanten Proteinen führte zur Ausbildung einer HIV-1 neutralisierenden Immunantwort (Fig. 3b und 3c).
Tabellen
Tabelle 1
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<tb>
<tb> 1 <SEP> a) <SEP> in <SEP> vitro <SEP> Neutralisationstest <SEP> : <SEP>
<tb> Isolat
<tb> IIIB <SEP> MN <SEP> RF <SEP> SF2 <SEP> A <SEP> C
<tb> Zahl <SEP> der <SEP> positiven <SEP> Tests <SEP> 8/8 <SEP> 2/2 <SEP> 2/2 <SEP> n. <SEP> t. <SEP> 8/8 <SEP> 4/4
<tb> neutralisierende <SEP> Konzentration <SEP> (ug/ml) <SEP> 50 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 10
<tb> 1 <SEP> b) <SEP> Syncytieninhibierungstest <SEP> : <SEP>
<tb> Isolat
<tb> IIIB <SEP> MN <SEP> RF <SEP> SF2 <SEP> A <SEP> C
<tb> Zahl <SEP> der <SEP> positiven <SEP> Tests <SEP> 18/18 <SEP> 11/11 <SEP> 6/10 <SEP> 1/1 <SEP> 1/1 <SEP> 2/3
<tb> ECso <SEP> (ug/ml) <SEP> 12, <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 13, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 27 <SEP> 10
<tb>
Tab. 1 : Neutralisierende Eigenschaften das humanen monoklonalen Antikörpers 2F5. a) in vitro Neutraliationstest.
Verschiedene Konzentrationen vom humanen monoklonalen Antikörper 2F5
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wurden zu 105 H9 Zei ! en/We !) gegeben und anschliessend inkubiert. Nach 20 Tagen wurde von den Kulturüberständen die p24 Antigenkonzentration als Mass für die Virusreplikation nach Standardmethoden bestimmt. b) Syncytieninhibierungstest. Analog zu Tabelle 1a wurden 50 ut Virus/Antikörper-Gemisch zu 105 AA2 Zellen/Well gegeben und nach 5 bis 6 Tagen die Syncitienbildung als Indikator für eine HIV-1 Infektion bestimmt. Die Berechnung der 50% Effektiven Dosis (ECso) wurde nach Reed und Muench bestimmt.
Abkürzungen : A und C sind klinische HIV-1 Isolate aus Wien.
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Tabelle 2
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<tb>
<tb> Sequenzvergleich <SEP> HIV-1 <SEP> Peptid
<tb> HIV-1 <SEP> ISOLAT <SEP> : <SEP> SEQUENZ:
<tb> BH10 <SEP> ELDKWA
<tb> Z-84 <SEP> Q.....
<tb>
Z2/CDC-Z34 <SEP> ......
<tb>
BHB <SEP> ......
<tb>
ARV2/SF2 <SEP> ......
<tb>
BRU-CDC-451 <SEP> Q......
<tb>
JRCSF <SEP> ......
<tb>
ELI <SEP> ......
<tb>
SF33 <SEP> ......
<tb>
SF162 <SEP> ......
<tb>
ZAIRE <SEP> HZ321 <SEP> A----BRAIN
<tb> JH3 <SEP> G----NDK <SEP> ......
<tb>
MN <SEP> ......
<tb>
MAL <SEP> ......
<tb>
OYI <SEP> ......
<tb>
PV22 <SEP> ......
<tb>
RF/HAT <SEP> ......
<tb>
SC <SEP> ......
<tb>
MFA <SEP> ......
<tb>
WMJ2-HXB2 <SEP> ......
<tb>
HXB3 <SEP> ......
<tb>
ZAIRE <SEP> 6 <SEP> ......
<tb>
LA)
<tb> NL43 <SEP> ......
<tb>
BRVA-ALA1 <SEP> ......
<tb>
BAU-NY5CG <SEP> ......
<tb>
SF162 <SEP> ......
<tb>
JFL
<tb> CDC4 <SEP> Q----HAN <SEP> ......
<tb>
ADA <SEP> A......
<tb>
Z2Z6 <SEP> ......
<tb>
JY1
<tb> U455 <SEP> A----- <SEP>
<tb>
Tabelle 2: Sequenzvergieich zwischen verschiedenen HIV-1 Isolaten Die dem Isolat BH10 entsprechende Aminosäuresequenz ELDKWA (662-667) am GP160 wurde mit den entsprechenden GP160 Aminosäurese-
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verglichen. IdentischeLiteratur
1. Mittler, R. S., and K. Hoffmann 1989. Synergism between HIV gp120 and gp 120-specific antibody in blocking human T cell activation, Science 245 : 1380-1382
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Seouenzprotokoll SEQ ID NO : 1 SEQUENZLÄNGE : 6 Aminosäuren ART DER SEQUENZ : Aminosäuresequenz ART DES FRAGMENTS : inneres Fragment Xaa : entweder Glu oder Gln oder Ala oder Gly
EMI9.1
: GPI60EIGENSCHAFTEN : Epitop eines humanen monoklonalen Antikörpers gegen HIV-1 GP160
Xaa Leu Asp Lys Trp Ala 6
EMI9.2
Xaa : entweder Glu oder Gln oder Ala oder Gly
SEQ ID NO : 2
SEQUENZLÄNGE : 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ :
Nukleotidsequenz
STRANGFORM : Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ : linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKüLS: DNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS : inneres Fragment
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT : GP160 von HIV-1 Isolat BH10
POSITION DER SEQUENZ IM HIV-1 GENOM : von 8238 bis 8255
SVATTAGATA AATGGGCA 18
1 11 Patentansprüche
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.