DE68926813T2

DE68926813T2 - Von gemeinsamen sequenzen von antigenen und antiidiotypischen antikörpern oder von antikörpern mit spezifizität für die zellulären rezeptoren der antigene abgeleitete immunogene und biologisch aktive peptide

Info

Publication number: DE68926813T2
Application number: DE68926813T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Cohen; Mark Greene; David Weiner; William Williams
Original assignee: Competitive Technologies Inc
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1988-05-13
Filing date: 1989-04-28
Publication date: 1997-07-17
Anticipated expiration: 2009-04-29
Also published as: EP0370090A4; EP0370090A1; EP0370090B1; DE68926813D1; WO1989010939A1; JPH02504284A; ATE140233T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Wirkstoffe, die bei der Immunisierung von Säugern gegen infektiöse Oganismen, wie beispielsweise Bakterien, Pilze, Parasiten und Viren sowie Neoplasma, welche spezifische Antigene exprimieren, verwendbar sind. Solche Organismen haben normalerweise spezifische Stellen, die sich an den komplementären Teil der sogenannten Rezeptorstelle der Wirtszellen binden. Diese Erfindung betrifft ebenfalls das Gebiet der biologisch aktiven Mittel, wie beispielsweise Pharmazeutika, die auf Säugerzellen wirken, indem sie sich an die Rezeptorstelle (n) dieser Zellen binden, um ihre Funktion oder ihr Verhalten zu ändern oder zu beeinflußen oder indem sie die Wirkung, die ein anderer Wirkstoff, wie beispielsweise ein Antigen oder ein Krankheitserreger sonst auf diese Zellen ausüben würde, verhindern oder ändern.
Einige Strategien wurden bisher eingesetzt, um sichere, wirksaine Impfstoffe gegen virale und bakterielle Krankheitserreger zu entwickeln. Gegenwärtig bestehen die meisten verwendeten Impfstoffe aus attenuierten Krankheitserregern, inaktivierten Krankheitserregern, aus Komponenten eines Krankheitserregers oder modifizierten Toxinen (Toxoiden). Vergleiche Institut of Medicine, "Vaccine Supply and Innovation", Washington, D.C. : National Academy Press (1985). Während diese Präparate bei vielen infektiösen Krankheiten erfolgreich verwendet wurden, existieren viele Krankheitserreger, bei denen diese Vorgehensweisen nicht funktionierten oder nicht anwendbar waren. Bestimmte Krankheitserreger sind potentiell zu gefährlich, um bei der Verwendung von attenuierten oder sogar inaktivierten Präparaten in Frage zu kommen. Das Risiko, das sich Krebs durch Immunisieren mit bestimmten Retroviren ausbildet, oder das sich AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) durch Immunisieren mit HIV (Human Immunodeficiency Virus) bildet, unterstreicht die Nachteile, die mit der Verwendung aller Viruspräparate zur Impfung verbunden sind. Darüberhinaus zeigen viele Krankheitserreger eine erhebliche antigene Heterogenität, die ein wirksames Impfen schwierig macht. Diese Überlegungen führten uns dazu, nach einem alternativen Verfahren zur wirksamen Immunisierung zu suchen.
Die Idiotyp-Netzwerktheorie von N.K.Jerne, "Towards a Network Theory of the Immune System", Ann.Immunol. (Paris) 125: 337-389, (1974) beinhaltet, daß ein anti-idiotypischer Antikörper, der sich gegen einen neutralisierenden Antikörper, der für einen Krankheiterreger spezifisch ist, gebildet hat, diesen Krankheitserreger immunologisch imitieren würde. Die Immunisierung mit dem Anti-Idiotyp sollte in der Ausbildung einer signifikanten anti-pathogenen Reaktion durch Auslösung neutralisierender Antikörper und zellulärer Immunität resultieren. In den vergangenen Jahren gab es einige Beispiele, in denen diese Strategie wirksam war, darunter Reovirus Typ 3, vergleiche Sharp, A.H., Gaulton, G.N., McDade, K.K., Fields, B.N., und Greene, M. I., "Syngeneic Monodonal Antiidiotype Can Induce Cellular Immunity to Reovirustl, J. Exp.Med., 160: 195-205 (1984); Kauffman, R.S., Noseworthy, J.H., Nepoln, J. T., Finberg, R., Fields, B.N., und Greene, MI., "Cell Receptors for Mammalian Reovirus II: Monodonal Anti-Idiotypic Antibody Blocks Viral Binding to Cells", J. Immunol., 131: 2539-2541, (1983); und Gaulton, G.N., Sharpe, AH., Chand, D.W., Fields, B.N. und Greene, M.I. (1986). "Syngeneic monodonal internal image anti-idiotopes as prophylactic vaccines". J. Immunol. 137: 2930-2936. Bezogen auf den Sendai Virus vergleiche Ertl, H.C. und Einberg, R.W., "Sendai Virus Specific T Cell Clones: Induction of Cytolytic T Cells by an Anti- Idiotypic Antibody Directed Against a Helper T Cell done", Proc. Natl. Acad. Sci, USA,81:2850-2854, (1984). Bezüglich einer Veröffentlichung zur Tollwut vergleiche Reagen, K.J., Wanner, W.H., Wiktor, T., und Koprowski, H., "Anti-Idiotypic Antibodies Induce Neutralizing Antibodies to Rabies Virus Glycoproteins", J. virol., 48: 660-666 (1983), Diese Vorgehensweise wurde im Zusammenhang mit dem Polio-Virus bei Uydeltaag, F.G.C.M. und Osterhaus, A.D.M.E., "Induction of Neutralizing Antibody in Mice Against Polio Virus Type II with Monodonal Antiidiotypic Antibody", J. Immunol., 134:1225-1229, (1985) diskutiert. Einer der Schlüsselaspekte dieses Ansatzes ist, daß der Anti-Idiotyp ein neutralisierendes Epitop auf dem Krankheitserreger imitiert und eine neutralisierende Reaktion hervorruft. Infolgedessen scheint ein wirksamer anti-idiotypischer Impfstoff ein ideales Immunogen in den Fällen zu sein, in denen ein intakter Krankheitserreger nicht verwendet werden kann, oder in denen irrelevante nicht-neutralisierende Epitope die Immunreaktion dominieren. Die praktische Anwendung der Anti-Idiotypen als Impfstoff wird jedoch dadurch eingeschränkt, daß es Schwierigkeiten bereitet, humane monoklonale Antikörper herzustellen, und daß die Gefahr besteht, eine Serumkrankheit unter Verwendung von xenogenen Antigenen zu verursachen.
Ein anderes Verfahren, das gegenwärtig intensiv untersucht wird, ist die Verwendung von synthetischen Peptiden, die Segmenten der Proteine aus pathogenen Mikroorganismen entsprechen, gegen die sich eine Immunreaktion richtet. Diese Vorgehensweise war in einigen Fällen erfolgreich, darunter beim Katzen- Leukämie-Virus (Elder, J.H., McGee, J.S., Munson,N.M., Houghten, R.A., Kloetzer, W., Bittle, J.L., und Grant, C.K.," Localization of Neutralizing Regions of the Envelope Gene of Feline Leukemia Virus by Using Anti-Synthetic Peptide Antibodies";, J. Virol., 61: 8-15, (1987), Hepatitis B (Gerin, J.L. Alexander,H., Shih, J.W., Purcell, R.H., Dapolito, G., Engle, R., Green, N., Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., und Lerner, R.A., "Chemically Synthesized Peptides of Hepatitis R Surface Antigen Duplicate the D/Y Specificities and Induce Subtype-Specific Antibodies in Chimpanzees", Proc, Natl. Acad.Sci. USA. 80: 2365-2369, 1983), Plasmodium Falciparum (Cheung,A., Leban, J., Shaw, A.R., Merkli, B., Stocker, J., Chizzolini, C., Sander, C., und Perrin, L.H.,"Immunization With Synthetic Peptides of a Plasmodium Falciparum Surface Antigen Indices Antimerozoite Antibodies", Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83: 8328-8332, 1986), Choleratoxin (Jakob, C.O., Grossfeld, S., Sela, M., und Arnon, R., "Priming Immune Response to Cholera Toxin Induced by Synthetic Peptides", Eur. J. Immunol., 16:1057-1062, 1986) und andere. Wenn diese Peptide in der Lage sind, eine neutralisierende Immunreaktion auszulösen, dann scheinen sie ideale Immunogene zu sein. Sie lösen eine spezifische Reaktion aus und führen normalerweise nicht zu schädlichen Wirkungen auf die Wirtszelle. Es kann jedoch schwierig sein, vorauszusagen, welche Peptidfragmente immunogen sein werden und zur Entwicklung einer neutralisierenden Reaktion führen werden. Es wäre deshalb wünschenswert, Immunogene zu entwickeln, die eine Reaktion auf spezifische neutralisierende Epitope hervorrufen, ohne daß sie Reaktionen auf fremde Epitope hervorrufen, welche die spezifische Reaktion "verdünnen" könnten oder zu einer schädlichen Immunkomplexbildung führen würden.
Technological advances in vaccine development; symposia on molecular biology, Williams W.V. et al. 1988, Bd 84, S. 577-588 offenbart einzelne Peptide VL und VH und zeigt eine Sequenzhomologie mit Reopeptiden. In gleicher Weise wird eine individuelle Sequenzhomologie zwischen relevanten Peptiden und Zielsequenzen in Ann. Inst. Pasteur. Immunol. Bd 136D, 1985, S. 259-269 und in Proc.Natl.Acad.Sci.USA. Bruck C. et al., 1986, Bd. 83, S. 6578-6582 aufgezeigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird infolgedessen ein Verfahren zur Synthese biologisch aktiver Verbindungen zur Verfügung gestellt, welches folgende Schritte umfaßt:
(a) Auswählen eines pathogenen Produkts, von dem bekannt ist, daß es an einen physiologischen Rezeptor einer Säugerzelle (Antigen) bindet;
(b) Bereitstellen eines Antikörpers für einen zellulären Rezeptor des pathogenen Genprodukts: (c) Bestimmen und Vergleichen der Antigensequenzen und der VL und Vh Region der bestimmenden Region des Antikörpers;
(d) Synthese eines Peptids, das ein Epitop umfaßt, dessen Sequenz zu einer in (c) bestimmten homologen Region mit mindestens 60% Sequenzhomologie zwischen der VL- und der VH-Sequenz und der Antigensequenz paßt, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte (e) der Zugabe von Cystein zu einem Ende eines Peptids aus Schritt (d),
(f) Zugabe von Cystein zu einem Ende eines anderen Peptids aus Schritt (d) ; und
(g) Inkontaktbringen der Peptide unter ausgewählten Bedingungen, die die Bindung des Cysteins an jedes Peptid ermöglichen, um ein zusammengesetztes Peptiddimer zu bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt infolgedessen ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der gewünschten Aminosäuresequenzen biologisch aktiver Peptide zur Verfügung, wodurch ein Immunogen, das in der Lage ist, eine Reaktion auf spezifische neutralisierende Epitope hervorzurufen, ohne daß sie eine Reaktion auf fremde Epitope hervorrufen, die die gewünschte Reaktion "verdünnen" könnten oder zu einer schädlichen Immunkomplexbildung führen könnten. Die Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung, daß Antikörper, die für einen Zellrezeptor eines Antigens spezifisch sind, zu der Peptidsequenz, die in der entsprechenden Region des Antigens selbst gefunden wird, eine Peptidsequenzhomologie zeigen. Demgemäß wird es, anstatt den Anti-Rezeptor-Antikörper selbst oder etwas Ähnliches zu verwenden, nur dazu verwendet, die gemeinsamen Peptidsequenzen zwischen korrespondierenden Regionen des Antigens und des Anti- Rezeptor-Antikörpers zu identifizieren. Für die therapeutische Behandlung wird anschließend ein Peptid synthetisiert, das die gemeinsame Sequenz umfaßt.
In der bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen ein Virus, wie beispielsweise ein Reovirus, und das Peptid umfaßt mindestens 60%, vorzugsweise 80- 100% Sequenzhomologie, welche in einer Antigenregion und der korrespondierenden Region des Anti-Rezeptor- Antikörpers gefunden wird.
Die vorliegende Erfindung ist insofern nützlich, als daß sie einen neuartigen Impfstoff für die Immunisierung einer Säugerwirtszelle gegen einen infektiösen Organismus, der eine Stelle aufweist, die sich spezifisch an die Rezeptorstelle einer Wirtszelle bindet, zur Verfügung stellt. Der Impfstoff kann verwendet werden, indem der säuger mit einem synthetischen biologisch aktiven Peptid geimpft wird, welches eine Peptidsequenz aufweist, die einer Peptidsequenz entspricht, welche sowohl in der Stelle des infektiösen Organismus als auch in dem Antikörper, der für einen Rezeptor auf einer Wirtszelle spezifisch ist, gefunden wird. Dabei erfolgt die Impfung in einer Menge, die ausreicht, um die Wahrscheinlichkeit zu reduzieren, daß die Wirtszelle durch den Organismus infiziert werden kann. Dies eingnet sich inbesondere zur Immunisierung einer Säugerwirtszelle gegen Infektionen, die durch einen Virus, wie beispielsweise einen Reovirus verursacht werden. Die Durchführbarkeit und Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Produkte konnte unter Verwendung von Reovirus 3, einem Virus, von dem bekannt ist, daß er sich spezifisch an eine Struktur bindet, die dem β-adrenergen Rezeptor der Säugerzellen physikalisch ähnlich ist, und so den Stoffwechsel dieser Zellen ändert, erfolgreich demonstriert werden.
Das so synthetisierte Peptid umfaßt mindestens und besteht vorzugsweise im wesentlichen aus mindestens 6 Aminosäuren der gemeinsamen Sequenz. Die Genprodukte, die gemäß Schritt (a) ausgewählt werden, umfassen Reovirusgenprodukte, wie beispielsweise die des Reovirus 3; Impfstoffgenprodukte; Epstein-Barr- Virusgenprodukte; und Genprodukte, welche an die β- adrenerge Rezeptorfamilie des Säugers binden.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch neuartige in vitro Verfahren zur Veränderung des Wachstums von Säugerzellen zur Verfügung gestellt. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung eines Peptids an Säugerzellen, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche einem Krankheitserregergenprodukt gleicht, von dem bekannt ist, daß es an den β- adrenergen Rezeptor dieser Zelle bindet, und einem Antikörper gleicht, der für den β-adrenergen Rezeptor spezifisch ist, und diese Sequenz ausgewählt wird, und das Peptid in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um das Wachstum der Zellen zu verändern.
Die bevorzugten Peptide und Krankheitserregergenprodukte, die bei diesem Verfahren verwendet werden, sind die oben beschriebenen.
Demgemäß ist ein Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung neuartiger biologisch aktiver Peptide.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger Verfahren zur Herstellung solcher Peptide, die biologische Aktivität aufweisen.
Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend in der Beschreibung noch genauer beschrieben.

Kurze Zusammenfassung der Figuren

Die Figur 1 veranschaulicht die spezifische Bindung von 9BG5 an Peptide, die durch Radioimmunoassay bestimmt wurde, wie nachstehend in den experimentellen Verfahren beschrieben; CPM von 9BG5, gebunden an leere Vertiefungen, wurde von dem CPM von 9BG5, gebunden an peptidbeschichtete Vertiefungen, subtrahiert; nicht spezifische Bindung an Peptide wurde korrigiert, indem von dem Wert ein vergleichbarer Wert abgezogen wurde, der für einen isotypischen monoklonalen Kontrollantikörper UPC10 bestimmt wurde; spezifische CPM von 9BG5, gebunden an peptidbeschichtete Vertiefungen, werden unter Verwendung der Menge an 9BG5, die zu jeder Vertiefung mit einem Endvolumen von 50 µl zugegeben wurde, gezeigt; der Mittelwert ± SD für jeweils zwei Vertiefungen wird gezeigt.
Die Figuren 2 und 3 veranschaulichen die Bindung von VL-BSA an einen Reovirus-Rezeptor Typ 3, bestimmt durch dessen Fähigkeit, um die Bindung mit Anti- Reovirus Rezeptor Typ3-Antikörper 87.92.6 zu konkurrieren; R1.1 Zellen (10&sup7;/ml) wurden in 1% BSA in Gegenwart oder Abwesenheit von 200 µg/ml VL-BSA oder VH-BSA, wie angegeben, 45 Minuten lang inkubiert; monoklonale Antikörper wurden über 30 Minuten bei den angegebenen Konzentrationen zugegeben,; die Zellen wurden zweimal gewaschen, und eine 1:200 Verdünnung von FITC-Ziege-anti-Maus Fab wurde über 30 Minuten zugegeben; die Zellen wurden zweimal gewaschen und mit einem FACS-Analysiergerät auf ihre Fluoreszenzintensität analysiert; die prozentuale maximale Zellfärbung wurde als das Verhältnis von der Prozentzahl an Zellen, die im FACS-Analysiergerät bei der angegebenen Antikörperkonzentration positiv waren, zu der maximalen Prozentzahl an Zellen, die bei gesättigten Dosen von monoklonalen Antikörpern bei Abwesenheit von Konkurrenten als positiv angesehen wurden, bestimmt; ([% positive Zellen bei der angegebenen Konzentration/ maximal % positive Zellen ] X 100); die maximalen Prozentzahlen an positiven Werten waren wie folgt: 2-15,3%, 3-97%, 3-24%.
Die Figuren 4-7 veranschaulichen die spezifische Bindung eines Immunserums an virusbeschichtete Platten, bestimmt durch Radioimmunoassay, wie in den nachstehend angegebenen experimentellen Verfahren beschrieben; CPM des Immunserums, das an leere Ver tiefungen gebunden war, wurde von CPM, das an virusbeschichtete Vertiefungen gebunden war, subtrahiert; um nicht spezifische Bindung an virusbeschichtete Vertiefungen zu berücksichtigen, wurde ein vergleichbarer Wert für normales Mäuseserum von dem für das Immunserum bestimmten Wert abgezogen; die spezifischen CPM für das gebundene werden gegenüber der Verdünnung mit einem Mäuseserum, das in einem Endvolumen von 50 µl zugegeben wurde, gezeigt; der Mittelwert ± SEM für jeweils zwei Vertiefungen aus der Gruppe von 3 oder 4 Mäusen ist von jeder Verdünnung gezeigt.
Die Figuren 8 und 9 veranschaulichen Immunserumassays für die Virusneutralisierung, wie im folgenden Abschnitt beschrieben; das Serum wurde vor der Immunisierung mit Peptiden gewonnen (Vorimmunisierung oder Tag 0), am Tag 20 nach der ersten Immunisierung und am Tag 60; der Neutralisationstiter wurde zu jedem Zeitpunkt aus der Gruppe von 4 Mäusen bestimmt; das geometrische Mittel, geteilt durch SEM des Kehrwerts des Neutralisationstiters wird zu jedem Zeitpunkt gezeigt.
Die Figuren 10 und 11 veranschaulichen die Plaquemhibition, bestimmt wie in der nachfolgenden Beschreibung angegeben; die Plaqueanzahlen wurden für 4 Mäuse in jeder Gruppe bestimmt, und die Mittelwerte wurden gebildet; die höchste Verdünnung des Serums, die 50% oder eine höhere Plaquemhibition bewirkt, wird für jeden Zeitpunkt, bei dem das Serum erhalten wurde, gezeigt; die Plaquemhibition ist sowohl vom Virus Typ 1 und als auch vom Typ 3 gezeigt.
Figur 12 veranschaulicht die Daten für Mäuse, die mit den angegebenen Reovirustypen durch subkutane Injektion von 10&sup7; PFU oder mit den angegebenen Peptiden bei einer Dosis von 100 µg, aufgeteilt auf zwei subkutane Injektionen, immunisiert worden waren; eine Woche später wurden die Fußsohlen der Mäuse dem Virus oder Peptid ausgesetzt, das Anschwellen der Fußsohlen wurde wie in der nachfolgenden Beschreibung angegeben 48 Stunden nach der Reizung festgestellt; der Mittelwert ± SEM für die Gruppen von Mäusen ist gezeigt.
Die Figuren 13 und 14 zeigen den Typ 4 der Überempfindlichkeitsreaktion(DTH) von Mäusen gegenüber dem intakten Reovirus Typ 3 nach Immunisierung mit Peptiden.
Figur 15 zeigt den Reovirus Typ 3 und die Hemmung der L-Zellvermehrung durch den Antikörper 87.92.6.
Figur 16 zeigt die konkurrierenden Bindungen des 9BG5 Antikörpers und der mit dem Antikörper 87.92.6 beschichteten Vertiefungen in Gegenwart des Peptidinhibitors, einschließlich der VH + VL Peptide.
Figur 17 zeigt ein repräsentatives Diagramm von zwei alternativen Wege für die Herstellung biologisch aktiver Peptide nach den erfindungsgemäßen Verfahren.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in Verbindung mit Versuchen beschrieben, die unter Verwendung der Wechselwirkungen der Reovirustypen 1 und 3 mit Zellrezeptoren durchgeführt wurden, wobei der Anti-Idiotyp-Ansatz verwendet wurde. Diese os Beispiel(e) wurde(n), wenn nicht anders angegeben, unter Verwendung der folgenden experimentellen Verfahren durchgeführt.

Experimentelle Verfahren

Mäuse

Erwachsene weibliche Balb/c Mäuse, 6-8 Wochen alt, wurden von Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. erhalten. Das Vorimmunserum wurde von allen verwendeten Mäusen erhalten und Neutralisierung der Reovirusinfektiösität (siehe unten) untersucht, um sicherzustellen, daß nicht schon vorher mit dem Reovirus Kontakt stattgefunden hat. Die mit Peptid immunisierten Mäuse wurden in einer für Tiere geeigneten Unterbringung gehalten und mit einer Hausdiät ad libitum (Purina, St.Louis, MO) gefüttert. Mit dem Reoviruy Typ 3/Dearing immunisierte Mäuse wurden in einer separaten Einrichtung gehalten.

Viren

Reovirus Typ 1 (Lang) und Reovirus Typ 3 (Dearing) und die Reassortanten 3.HA-1 und 1.HA-3 wurden kürzlich beschrieben (Fields, B.N. und Greene, M.I., "Molecular Mechanism of Viral Pathogenesis: Implications for Prevention and Treatment", Nature, 20:19-23,1982). Die Klone 1.HA-3 und 3.HA-1 sind Einzelsegmentreassortantenklone, die das S1-Gen aufspalten, das Gen, das das virale Befestigungspolypeptid (Hemagglutinin) Sigma 1 kodiert. Zur Mäuseimpfung und Virusneutralisation wurde ein Reovirusstamm, der zweimal die L-Zellen durchlief, gereinigt, indem in Modifizierung der veröffentlichten Verfahren statt einer Zellhomogenisierung eine Ultraschallbehandlung (Branson Ultrasonic 200) durchgeführt wurde ( Joklik, W.K.,"Studies on the Effect of Chymotrypsin on Reovirions", Virology, 49:700-715, 1972). Die Partikelanzahl pro ml wurde mittels der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt (Smith, R.E., Zwernik, H.J., und Joklik, W.K., "Polypeptide Components of Virions, top Coinponent and Core of Reovirus Type 3", Virology, 39: 791-810, 1969).

Monoklonale Antikörper

Der den Reovirus Typ 3 neutralisierende monoklonale Antikörper 9BG5 (Maus-IgGaK) (Burstin, S.J., Spriggs, D.R., und Fields,B.N., "Evidence for Functional Domains on the Reovirus Type 3 Hemagglutinin", Virology, 117:146-155, 1982) wurden aus dem Hybridüberstand gereinigt, wobei die Zellen im DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Media) (NA Bioproducts, Walkersville,MD) und mit zugegebener Penicillin/Streptomycin-Lösung (The Cell Center, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA) und 10%igem fätalem Rinderserum (FBS) gezüchtet wurden. Die Überstände der Kulturen wurden mit 50%igem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gefällt, in destilliertem Wasser gelöst, und dreimal gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert. Anschließend wurde der Antikörper auf einer Sepharose-Protein A-Säule gereinigt und mit 0,1 N Zitronensäure von pH 4,5 eluiert. Das Eluat wurde in 1 M Tris-Puffer von pH 8,5 gesammelt, um überschüssige Säure zu neutralisieren, und dreimal gegen PBS dialysiert. Das Dialysat wurde in einem Amicon-Proteinanreicherungsgerät mit einer Molekulargewichtsbegrenzung von 30 Kilodalton (KD) konzentriert. Der gereinigte Antikörper war gemäß der Natrium-dodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zu mehr als 95 % gereinigt. Irrelevante monoklonale Antikörper UPC-10 und All (beide aus Maus-IgG2AK) wurden in ähnlicher Weise aus geklärten Ascites (Gibko, Grand Island Biological Co.) gereinigt.
Die monoklonalen Antikörper 87.92.6 (Maus-IgM, K) und HO 13,4 (Maus-IgM,K,anti-Thy 1.2) und HO 22.1 (Maus IgM, K, anti-Thy 1.1) wurden aus 50%igen Ammoniumsulfatschnitten des Kulturüberstandes oder Ascitesüberständen, aus Ascites, die in den Hybridzellen der Balb/c-Näuse gebildet wurden, gereinigt. Diese Präparate wurden dreimal gegen PBS dialysiert und auf eine Ziegen/Anti-Maus-IgM Affigel-10 Säule gegeben. Die Antikörper wurden mit 3,5 M MgCl&sub2; eluiert, dreimal gegen PBS dialysiert und wie oben beschrieben konzentriert. Die Reinheit aller verwendeten monoklonalen Antikörper war gemäß SDS-PAGE größer als 95%.

Zellinien

Mäuse-L-Zellen wurden in schnell rotierenden Gefäßen in Joklik's MEM (MA Bioproducts) mit 5% FBS gezüchtet. R 1.1 Zellen (Mäusethymoma, Thy 1.2+) wurden in einer Suspension in RPNI 1640 (NA Bioproducts, Walkersville, MD), das mit L-Glutamin, 10 mM HEPES- Puffer (NA Bioproducts) und Penicillin/Streptomycin mit 10% FBS angereichert war, gezüchtet.

Immunisierung der Mäuse

Zur Untersuchung der DTH-Reaktion wurden die Gruppen von Mäusen entweder mit synthetischen Peptiden oder lebendem Reovirus Typ 3 an zwei Stellen in den Hinterflanken der Tiere (jeweils über den Hinterbeinen) subkutan geimpft; 50 µg eines synthetischen Peptids oder 10&sup7; Viruspartikel/0,2 ml wurden in separaten Injektionen von jeweils 0,1 ml verabreicht. Sechs Tage später wurden die linke Fußsohle der Tiere mit 3x 10&sup7; Viruspartikeln, die in Kochsalzlösung mit 2% Gelatine (30 µl) suspendiert war, in Kontakt gebracht. Das Anschwellen der Fußsohle wurde 24 Stunden später mittels Blindprobe registriert (Greene, M.J. und Weiner, H.L., "Delayed Hypersensitivity in Mice Infected with Reovirus, II. Induction of Tolerance and Suppressor T Cells to Viral Specific Gene Products", J.Immunol.,125: 283-287, 1980). Pro Gruppe wurden 4 Tiere untersucht, und die Stärke der Reaktion wurde durch Vergleichen der gereizten linken Fußsohle mit der unbehandelten rechten Fußsohle bestimmt.
Zur Untersuchung der humoralen Immunreaktion wurden Mäuse entweder mit synthetischem Peptid oder lebendem Reovirus Typ 3 wie oben beschrieben mit der folgenden Modifizierung geimpft. Das Peptid wurde mit CSA (Hühnerserumalbumin) wie nachfolgend beschrieben konjugiert, und 100 µg des Peptidkonjugats wurden auf zwei Dosen verteilt subkutan geimpft. Bei den mit synthetischen Peptiden immunisierten Mäusen geschah die erste Immunisierung mit einem Gemisch aus Peptid und einem gleichen Volumen an komplettem Freund-Adjuvans; wohingegen bei der nachfolgenden Immunisierung das Peptid in einer gelatinehaltigen Salzlösung suspendiert war. Die Mäuse wurden wöchentlich über 5 Wochen immunisiert, und das Serum wurde vor der ersten Impfung und dann in der 2.und 6. Woche erhalten. Bei dem mit dem Reovirus Typ 3 immunisierten Mäusen wurden 10&sup7; plaque-bildende Einheiten (PFU) in der 1. und 3. Woche subkutan geimpft.

Radioimmnunoassay-Verfahren

Die Vertiefungen von Polystyrolpiatten mit 96 V- Bodenvertiefungen (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) wurden mit Peptid beschichtet, indem die Peptide mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 25 µg/ml verdünnt wurden, und jeweils 50 µl in einer Vertiefung eingedampf wurden, indem die Platten über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden. Die Vertiefungen wurden mit dem Reovirus Typ 1 oder Typ 3 beschichtet, indem man die Stammlösungen des Virus in 0,1 M NaHCO&sub3; bei pH 9,5 auf 4,8 x 10¹¹ verdünnte, jeweils 25 µl pro Vertiefung dispensierte und über Nacht bei 4ºC inkubierte (London, S.D., Rubin,D.H., und Cebra, J.J., "Gut Mucosal Immunization with Reovirus Serotype IIL Stimulates Viral Specific Cytotoxic T Cell Precursors as Well as IGA Memory Cells in Peyer's Patches", 1987). Nach der Inkubierung über Nacht wurden die mit Peptiden oder dem Virus beschichteten Vertiefungen dreimal mit PBS gewaschen und und pro Vertiefung mit 200 µl 1%iger Gelatine in PBS mit 0,1% NaN&sub3; durch zweistündiges Inkubieren bei 37ºC blockiert. Von den Vertiefungen wurde abdekantiert, dreimal mit PBS gewaschen und Mäuseserum oder gereinigter monoklonaler Antikörper wurde hinzugefügt, und pro Vertiefung mit 50 µl Mäuseserum oder gereinigtem monoklonalem Antikörper, gelöst in PBS mit 0,5% Gelatine und 0,1% NaN&sub3; versetzt. Nach dreistündiger Inkubation bei 37ºC wurde von den Vertiefungen abdekantiert, dreimal mit PBS gewaschen und radiojodiertes Ziegen-anti-Maus- Kappa in PBS mit 0,1% NaN&sub3; und 1 mg/ml Hühner-Gammaglobulin wurde zugegeben, wobei 100 µl = 48.000 CPM (counts per minute) pro Vertiefung entsprechen. Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert, dekantiert, 10 mal mit Leitungswasser gewaschen und unter einer Wärmelampe getrocknet. Die Vertiefungen wurden dann unter Verwendung eines heißen Drahtes ausgeschnitten und in einem Gammazähler gezählt. In allen Fällen wurden die CPM der leeren Vertiefungen ohne Antigen von den CPM-Werten der antigenbeschichteten Vertiefungen abgezogen.

FACS-Analyse(Fluorescence Activated Cell Sorter Analysis)

R 1.1-Zellen (99% Lebensfähigkeit nach Trypanblau-Farbstoffausschluß) wurden zentrifugiert und zweimal in PBS mit 0,1% NaN&sub3; und 1% Rinderserumalbumin (FACS Medium) gewaschen. Die Zellen wurden in Konzentrationen von 10&sup7;/ml entweder in FACS-Medium allein oder in FACS-Medium mit Peptid-BSA-Konjugaten(200 ug/ml) resuspendiert. Die Zellen wurden zunächst 45 Minuten lang auf Eis inkubiert, und anschließend wurden monoklonale Antikörper aus Stammlösungen mit 0,5 mg/ml zu aliquoten Teilen von 100 µl gegeben, um die angegebene Endkonzentration zu erhalten. Nach einer zusätzlichen 30-minütigen Inkubation wurden 500 µl FACS-Medium zu jeder Probe zugegeben, die Zellen wurden zentrifugiert, einmal mit 500 µl FACS-Medium gewaschen, und mit 10 µl FACS, das fluoresziengefärbtes Ziegen-Anti-Maus-Fab (1:200 Verdünnung) enthielt, gewaschen (Southern Biotechnology Associates), und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. 500 µl FACS-Medium wurde hinzugefügt, die Zellen wurden zentrifugiert und mit 500 µl FACS-Medium gewaschen und mit 200 ul FACS-Medium resuspendiert und an der University of Pennsylvania mit Hilfe eines Sortiergerätes für fluoreszenzaktivierte Zellen analysiert.

Neutralisierung der Virusinfektiösität

Die Titer der neutralisierenden Antikörper in einer Serumprobe wurden auffolgende Weise bestimmt: (i) Microneutralisierung: L-Zellen (5x10&sup4; pro Vertiefung) wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen bei 37ºC über Nacht inkubiert. Reovirus Typ 1/Lang (1/L) und Typ 3/D wurden seriell verdünnt und 1 Stunde mit den L-Zellen bei 37ºC inkubiert. Zusätzliche 75 µl MEM, die mit 5% fetalem Rinderserum und 1% Glutamin angereichert waren, wurden in jede Vertiefung eingebracht. 3 Tage nach dem Inkubieren bei 37ºC wurde das den Virus enthaltende Medium abgetrennt und die Zellen wurden mit Gentianviolett gefärbt (Gentianviolett 3,4 g/l, Ammoniumoxalat 8 g/l) . Der verwendete Virustiter zur Neutralisierung lag im vierfachen Überschuß vor, im Vergleich zu der Virusmenge, die für die Lyse der einschichtigen L-Zellen erforderlich ist. Der Reovirus Typ 1/L oder 3/D wurde bei geeigneter Konzentration mit dem gleichen Volumen Mäuseserum 1 Stunde lang bei 25ºC auf Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Das Virus-Serumgemisch wurde dann wie oben beschrieben auf einlagige Schichten von L-Zellen aufgetragen. Der Antikörpertiter wurde durch visuelle Prüfung als die Menge bestimmt, welche 70% der einlagigen Schicht der L-Zellen unbeschädigt läßt. (ii)Virusplaquereduktion: 100 pfu Reovirus Typ LIL wurden 1 Stunde lang mit L-Zellen (7x10&sup5; Zellen pro Vertiefung) auf Costarplatten mit 12 Vertiefungen inkubiert. Der Virustiter in jeder Vertiefung wurde dann wie voranstehend beschrieben bestimmt (Rubin, D.H., Komstein, M.J., und Anderson, A.D. , "Reovirus Serotype 1 Intestinal Infection:A Novel Replicative Cycle with Ileal Disease", J.Virol., 53: 391-398, 1985).

Peptidsythese:

Die Peptide wurden unter Verwendung eines Peptidsynthesegerätes Modell 430 A von Applied Biosystem (Applied Biosystems, Inc.,Foster City, CA.) synthetisiert. Die Schutzgruppenentfernung und Freisetzung des Peptids aus der Festphasen-Trägermatrix wurde durchgeführt, indem geschütztes Peptid auf dem Harz mit wasserfreiem HF, das 10% Anisol oder 10% Thioanisol enthielt, 1-2 Stunden lang bei 0ºC behandelt wurde. Die Peptide wurden dann entweder mit Ethylacetat oder Diethylether extrahiert und anschließend in 10%iger wäßriger Essigsäure gelöst und filtriert, um das Harz zu entfernen. Nach der Lyophilisierung wurden die Zusammensetzung und die Reinheit der Peptide sowohl durch Aminosäureanalyse als auch Umkehrphasen- HPLC. Dieses Verfahren wurde für die Synthese aller Peptide, einschließlich VL und der Peptidderivate von VL angewendet.

Konjugation von Peptiden mit Hühnerserumalbumin (CSA)

Vor dem Konjugieren der Peptide mit CSA wurde das CSA zunächst Adipinsäuredihydrazid als nukleophilen Spacer derivatisiert, wie beschrieben bei Schneerson, et al., "Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilius Influenzae Type b Polysaccharide Protein Conjugates", J. Exp.Med., 152: 361, (1980). 30 mg des mit Adipinsäuredihydrazid derivatisiertem CSA (CSA-ADH) in 5 ml 0,1 M Natriumbikarbonat wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 7 mg m-Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Pierce) umgesetzt. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden dann 50 mg Peptid zugegeben und die Kopplungsreaktion ließ man bei 25ºC 2 Stunden lang ablaufen. Nach der Dialyse gegen 0,1 M Ammoniumbikarbonat und Lyophilisieren wurde das CSA- ADH-Peptidkonjugat als trockene weiße Pulver erhalten.

Bestimmung der gemeinsamen Peptidsequenz

Frühere Arbeiten haben gezeigt, daß ein monoklonaler Antikörper, bezeichnet mit 87.92.6, der sich gegen monoklonale neutralisierende Anti-Reovirusantikörper 9BG5 bildet, den intakten Virus nachahmt, indem er sich an Zelloberflächenrezeptoren, die für den Reovirustyp 3 spezifisch sind bindet (Noseworthy, J.H., Fields,B.N., Dichter, MA., Sobotka, C., Pizer, E., Perry, L.L., Nepon, J. T., and Greene, M. F., "Cell Receptors for the Mammalian Reovirus.I. Syngeneic Monodonal Anti-Idiotypic Antibody Identifies a Cell Surface Receptor for Reovirus", J. Immunol., 131: 2533-2538, 1983; Kauffman,R.S., et al., 1983 supra; Co, M.S., Gaulton, G.N., Fields, B.N., und Greene, M.I., "Isolation and Biochemical Charakterization of the Mammalian Reovirus Type 3 Cell-Surface Receptor", Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 82:1494-1498, 1985. 87.92.6 konkurriert mit Reovirus Typ 3 um die Bindung an spezifischen Zellrezeptoren, wobei er das virale Befestigungszellprotein Sigma 1 (das Virushemagglutinin) hinsichtlich seiner Bindungsdomäne imitiert. Diese Domäne ist ebenfalls an der neutralisierenden Antikörperreaktion beteiligt (Burstin, S.J., et al, 1982 supra; Spriggs, D.R., Kaye, K., und Fields, B.N., "Topological Analysis of the Reovirus Type 3 Hemagglutinin", Virology, 127: 220-224, 1983). Das bedeutet, das 87.92.6 das Epitop des Hemagglutinins, das mit den Zellrezeptoren für den Reovirus in Wechselwirkung tritt, imitiert. Die Nucleinsäuresequenz der variablen Regionen mit den schweren und leichten Ketten (VH bzw.VL) von 87.92.6 wurden kürzlich bestimmt (Bruck, C., Co, M.S., Slaoui, M., Gaulton, G.N., Smith, T., Fields, B.H., Mullins, J. I., und Greene, MI., "Nucleic Acid Sequence of an Internal Image-Bearing Monodonal Anit-Idiotype and its Comparison to the Sequence of the External Antigen", Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83: 6578-6582, 1986) und die Sequenzen wurden mit der des Proteins Sigma 1 des Reovirus Typ 3 verglichen (Bassel- Duby,R., Jayasuriya,A., Chatterjee, D., Sonenberg, N., Maizel, J.V., Jr., und Fields, B.N., "Sequence of Reovirus Hemagglutinin Predicts a Coiled-Coil Structure", Nature, 315: 421-423, 1985). Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren wurden die gemeinsamen Teilsequenzen des Antigens und des Anti-Idiotyps identifiziert. Insbesondere wurde eine Sequenz von 16 Aminosäuren in dem Protein Sigma 1 des Reovirus Typ 3, welche die Aminosäuren 317 bis 332 umfaßt, identifiziert, und welche die Aminosäuresequenz aufweist, die gleich der kombinierten Sequenz ist, die die sekundäre Komplementaritätsbestimmende Region(CDR lis) von 87.92.6 mit den variablen Regionen (VH bzw. VL) mit den schweren und leichten Ketten umfaßt. Insbesondere weisen die Aminosäuren 43-51 der VH-Region Sequenzähnlichkeit mit den Aminosäuren 317-324 von Sigma 1 auf, und die Aminosäuren 46-55 der VL-Region weisen Homologie mit den Aminosäuren 323-332 von Sigma 1 auf ( Bruck,C., et al, 1986, supra).
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren wurden Peptide, die den Aminosäuren 317-332 des Proteins Sigma 1, den Aminosäuren 43-50 der VH-Sequenz und den Aminosäuren 39-55 der VL-Sequenz entsprechen, synthetisiert. Wie nachstehend gezeigt wird, führt die Immunisierung von Balb/c Mäusen mit diesen Peptiden zur Neutralisierung von Anti-Reovirus Typ 3-Antikörper und zu einer spezifischen zellulären Immunität gegenüber dem Reovirus. Dies beweist, daß die Sequenzhomologie zwischen dem Zellenbefestigungsprotein Sigma 1 und dem Anti-Rezeptor-Antikörper des neutralisierenden Epitops auf dem Reovirushemagglutinin, Sigma 1 vorausbestimmt. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Beschreibung von neutralisierenden Epitopen auf Krankheitserregern, und die Entwicklung von Peptidimpfstoffen, die eine neutralisierende Reaktion auslösen.

Bindung des neutralisierenden monoklonalen Antikörpers 9BG5 an Peptide

Der monoklonale Anti-Rezeptor-Antikörper 87.92.6 bindet sowohl an den Reovirusrezeptor Typ 3 und den neutralisierenden Antikörper 9BG5 ( Kauffman, R.S., et al, 1983, supra) . Anwender sagten voraus, daß die Peptide, die aus den Homologiebereichen von 87.92.6 und dem Protein Sigma 1 des Reovirus Typ 3 ableitbar sind (Bruck, C., et al, 1986 supra) ähnliche Eigenschaften aufweisen würden. Die Peptide, die synthetisiert wurden, um diese Hypothese zu überprüfen, werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Die in dieser Untersuchung verwendeten Peptide wurden nach den oben genannten Festphasenverfahren synthetisiert. Die Sequenzen werden zusammen mit ihrer maximalen Homologie gezeigt. Die mit einem geschlossenen Kreis markierten Aminosäuren sind identisch, und die mit einem offenen Kreis gehören zu der der selben Klasse. Es soli weiterhin erwähnt werden, daß die geprüften Peptide zusätzlich zu der gemeinsamen Peptidsequenz anti-idiotypische Antikörperreste enthalten.
Das Reopeptid entspricht den Aminosäuren 317-332 im VirusHemagglutenin Typ 3. Aus der Computersimulierung geht hervor, daß dieser Bereich vorwiegend in einer β-Faltblattkonfiguration, einschließlich einer β-Schleife, vorliegt. Das VL-Peptid zeigt die Aminosäuren 39-55 der variablen Region der leichten Ketten von 87.92.6 und schließt die sekundäre Komplementaritätsbestimmende Region (CDR II) ein. Die Simuherung sagt voraus, daß dieser Bereich auch vorwiegend in der β-Faltblattkonfiguration vorliegt, und eine β- Schleife einschließt. Das VH-Peptide umfaßt die Aminosäuren 43-56 der variablen Region der schweren Ketten von 87.92.6, einschließlich des CDR II der schweren Ketten. Das Kontroilpeptid, das mit dieem System nicht verwandt ist, wird ebenfalls gezeigt.
Aufgrund dieser Ähnlichkeiten in der Primär- und Sekundärstruktur wurde vorhergesagt, daß die Reopeptide und VL-Peptide durch den das Anti-Reovirus Typ 3 neutralsierenden monoklonalen Antikörper 9BG5 erkannt werden sollten. In Figur 1 zeigen wir die Ergebnisse eines Radioimmunoassays, der die Bindung des gereinigten monoklonalen Antikörpers 9BG5 an die peptidbeschichteten Vertiefungen von Mikrotiterplatten bestimmt. Um nicht spezifische Bindung an die Polystyrolvertiefungen auszuschließen, werden die CPM (counts per minute) der leeren Vertiefungen ohne Peptidbeschichtung von den CPM-Werten der peptidbeschichteten Vertiefungen, subtrahiert. Da darüberhinaus diese Peptide auch ein nicht spezifisches Anhaften von Immunogiobulinmoleküle verursachen können, haben wir die spezifische Bindung des zur gleichen Klasse gehörigen irrelevanten monoklonalen Antikörper UPC-10 an mit Peptid beschichteten Vertiefungen bestimmt, und diesen Wert von denen Werten für 9BG5 subtrahiert. Das in dieser Untersuchung verwendete Kontrollpeptid wies keine signifikante Bindung auf. In ähnlicher Weise lieferte die Bindung des VH- Peptids nur ein Untergrundrauschen, was anzeigte, daß dieses Epitop nicht von 9BG5 erkannt wurde. Eine geringfügige Bindung gab es im Falle des VL-Peptids, welches eine ausgeprägte Homologie in der terminalen Carboxylsequenz im Vergleich mit den Carboxylenden des Reopeptids aufwies. Obwohl die Bindungen nur gering waren, war dieser Befund auch in den nachfolgenden Assays reproduzierbar. Eine starke reproduzierbare Bindung von 9BG5 an das Reopeptid wurde deutlich. Da 9BG5 ein neutralisierender Antikörper ist, beinhaltet dieser Befund, daß das Reopeptid das neutralisierende Epitop enthält, welches von 9BG5 erkannt wird. Die Bindung an das VL-Peptid zeigt an, daß der Bereich der Sequenzhomologie zwischen diesen Peptiden (Aminosäuren 323-332 des Proteins Sigma 1) in dem neutralisierenden Epitop enthalten ist.

Bindung des VL-Peptids an den Reovirus-Rezeptor

Frühere Arbeiten zeigten, daß das von 9BG5 erkannte neutralisierende Epitop an der Bindung an den Reovirus-Rezeptor Typ 3 beteiligt ist (Kauffman, R.S., et al , 1983, supra; Noseworthy, J.H., et al, 1983, supra; Spriggs,D.R., et al, 1983, supra) . Dies führte uns zu der Vermutung, daß das VL-Peptid auch mit dem Virusrezeptor in Wechselwirkung treten kann. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die VH- und VL-Peptide an BSA gekoppelt, indem die Peptide und das BSA in 0,1%igem Glutaraldehyd inkubiert wurden, und anschließend eine Dialyse gegen PBS durchgeführt wurde, und diese Präparate verwendet wurden, um festzustellen, ob wir die Bindung des 87.92.6 an den Reovirusrezeptor Typ 3 auf R1.1-Zellen spezifisch blockieren könnten. Wie in Figur 2 gezeigt, blockiert die Vorinkubation von R1.1-Zellen mit VL-BSA die Bindung des 87.92.6 , was die Wecheiwirkung von VL-BSA mit dem Reovirus-Rezeptor anzeigt. Dieser Blockierungseffekt ist spezifisch, da die Vorinkubation der R1.1-Zellen mit VL-BSA kein Effekt auf die Bindung des HO 13.4 und auf den entsprechenden isotypischen monoklonalen Kontrollantikörper hat, der an Thy 1.2- Moleküle auf der R1.1-Zelloberfläche (Figur 3) bindet. Diese Beobachtungen waren in vielen Experimenten durchgehend reproduzierbar. Eine zusätzliche Kontrolle wird in Figur 3 gezeigt, wo gezeigt wird, daß VH-BSA keinen Inhibitionseffekt auf die Bindung des 87.92.6 hat, wenn dieser in der gleichen Konzentration wie VL-BSA verwendet wird. Diese Daten zeigen eine direkte Wechselwirkung des VL-Peptids mit dem Reovirus-Rezeptor Typ 3 und implizieren, das die Reste 46-55 der VL-Kette des 87.92.6 und 323-332 des Proteins Sigma 1 Typ 3 direkt mit dem Reovirus-Rezeptor Typ 3 in Wechselwirkung treten.

Immunisierung mit Peptiden induzierten Antikör per, die an den Reovirus binden

Die VL-Peptide und Reopeptide enthalten das Epitop, das in die Wechselwirkung zwischen dem Reovirus Typ 3 und seinem spezifischen Zelirezeptor einbezogen ist. Die Immunisierung von Mäusen mit diesen Peptiden wurde ausgeführt, um festzustellen, ob sie Antikörper bilden würden, die in der Lage sind, mit dem Reovirus Typ 3 in Wechselwirkung zu treten und die Infektion zu blockieren. Gruppen aus Balb/C Mäusen wurden mit diesen synthetischen Peptiden, wie im experimentellen Teil angegeben, immunisiert. Gruppen aus 4 Mäusen erhielten jeweils Kontrollpeptid in einem Adjuvans, VL-Peptid, das an Hühnerserumalburnin (VL-CSA) gekoppelt war, in einem Adjuvans, VH und VL-Peptide, die an CSA (VH + VL-CSA) in Adjavans gekoppelt waren, Reopeptide in einem Adjuvans oder Reopeptide ohne ein Adjuvans. Als positive Kontrolle wurde eine zusätzliche Gruppe aus Mäusen mit dem Reovirus Typ 3 injiziert. Wie unten angegeben, zeigte das Vorimmunserum aus diesen Mäusen keine Reovirus neutralisierende Antikörper, was anzeigte, daß sie vorher nicht dem Virus ausgesetzt waren. Der Radioimmunoassay zeigte in allen Fällen (die Daten sind nicht gezeigt) eine starke Reaktion auf das immunisierende Antigen. Die Bindung des Immunserums (60.Tag) an den Reovirus Typ 1 und den Reovirus Typ 3 wird in den Figuren 4-7 gezeigt. Die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der CPM einer leeren Platte von den CPM einer virusbeschichteten Platte, bestimmt. Als zusätliche Kontrolle wurde die Bindung von normalem Mäuseserum an virusbeschichteten Platten subtrahiert. Um die Interpretation zu vereinfachen, wird die spezifische Bindung für 4 Tiergruppen gezeigt: Die Gruppen sind mit dem Kontrollpeptid, VL-CSA, VH+VL-CSA, (jeweils mit einem Adjuvans) und Reopeptid ohne Adjuvans immunisiert. Mit Reopeptid und Adjuvans immunisierte Mäuse zeigten eine Reaktion, die derjenigen mit VL-VSA oder VH+VL-CSA und Adjuvans immunsierten Mäusen vergleichbar war. Mäuse, die mit dem Reovirus Typ 3 immunisiert wurden, zeigten eine starke Reaktion auf den Virus Typ 3 (spezifische CPM bei einer 10&supmin;³ Verdünnung des Serums: 10,428±807) mit signifikanter Kreuzreaktivität mit dem Virus Typ 1 (spezifische CPM bei einer 10&supmin;³ Verdünnung: 6,976±915). Wie in Figuren 4-7 gezeigt, wurde das Serum aus Mäusen, die mit dem Kontrollpeptid immunisiert waren bei allen verwendeten Serumverdünnungen sehr schlecht an Platten, die mit dem Virus Typ 1 oder Typ 3 beschichtet waren, gebunden. Im Gegensatz dazu wird eine signifikante Bindung des Immunserums an Platten, die mit dem Virus Typ 1 und Virus Typ 3 beschichtet waren, von Mäusen, die mit VL-CSA, VH+SA oder Reopeptid immunisiert waren, gezeigt. Wie erwartet, wär die Bindung an den Virus Typ 3 erheblich höher als die Bindung an den Virus Typ 1, obwohl gering Kreuzreaktivität beobachtet wurde. Die Bindung an den Virus Typ 3 war erheblich höher als die Bindung an den Virus Typ 1, obwohl Kreuzreaktivität beobachtet wurde. Die Bindung des Virus Typ 1 ist wahrscheinlich auf einige Bereiche der primären Sequenzhomologie zwischen den hier verwendeten Peptiden und dem Protein Sigma la vom Typ 1 zurückzuführen. Manemitsu, S.M., Atwater, J.A., und Samuel,C.E., "Biosynthesis of Reovirus-Specified Polypeptides. Molecular cDNA Cloning and Nudeotide Sequence of the Reovirus 1 Long Strain Bioistronic SLMRNA Which Encodes the Minor Capsid Polypeptide /a and the Nonstructural Polypeptide 16NS", Biochem. Biophys. Res. Commun., 140:501-510, 1986).
Diese Ergebnisse zeigen an, daß vorzugsweise Mäuse mit Peptiden, die dem vermutlich neutralisierenden Epitop des Reovirus Typ 3 oder dem entsprechenden Epitop aus dem Anti-Rezeptor-monokonaler Antikörper ähneln, Reovirus bildende Antikörper bilden.

Neutralisierung der Virusinfektiösität durch Immunserum aus mit Peptid immunisierten Mäusen

Das Serum aus peptidimmunen Tieren wurden an 3 Zeitpunkten untersucht, um seine Wirkungen auf die Virusinfektiösität von L-Zellen zu bewerten. Zwei Assays wurden durchgeführt, um das Neutralisieren der Infektiösität zu bestimmen. Einer war ein direkter Cytotoxizitätsassay, bei dem mittels Vitalfärbung die Wirkung des Serums auf die Viruslyse von L-Zellen, die an den Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wuchsen gemessen wurde, und der andere wurde durchgeführt, indem die Inhibition der Plaquebildung durch ein Serum, mit Viren und L-Zellen in Softagar gemessen wurde. Die Ergebnisse des direkten Cytotoxizitätsassay sind in den Figuren 8 und 9 gezeigt. Vorimmunseren aus allen verwendeten Tieren wurden untersucht, und kein wirksamer Effekt auf die Viruslyse Typ 1 oder Typ 3 L-Zellen konnte gezeigt werden. Als positive Kontrolle mittels des Serums aus Mäusen, die mit dem Reovirus Typ 3 immunisiert waren, wurde die Neutralisierung der L-Zellyse durch den Reovirus gezeigt. Dieses Serum verursacht sowohl bei dem Virus Typ 3 als auch bei dem Virus Typ 1 eine starke Inhibition der Lyse, obwohl eine bevorzugte Wirkung auf die Viruslyse Typ 3 festgestellt wurde, wobei die mit die Neutrusationstiter für den Virus Typ 3 am 20. Tag und am 60.Tag 1:512 betrugen, und Titer von 1:342 und 1:256 für mit Kontrollpeptid immunisierte Tiere keine Wirkung auf die L-Zeilyse durch den Reovirus Typ 1 oder Typ 3 zeigten. Das Serum aus Mäusen, die mit VL-CSA, VH+VL-CSA oder Reopeptid mit oder ohne einem Adjuvans immunisiert waren, zeigten eine spezifische neutralisierte L-Zellyse durch den Reovirus Typ 3, aber nicht durch Typ 3 (Figur 8 versus 9). Die Ergebnisse waren mit denen des Serums aus Tieren, die mit dem Reopeptid in Gegenwart oder ohne Adjuvans immunisiert wurden, vergleichbar, wobei jedoch nur die Ergebnisse der letzten Gruppe gezeigt sind. Diese Wirkung wurde auch beobachtet, wenn das Serum aus diesen Mäusen auf Inhibition der Plaquebildung untersucht wurde. In den Figuren 10 und 11 wird der Kehrwert de Serumtiters, der 50% mehr Plaquemhibition produziert, für den Virus Typ 1 und den Virus Typ 3 aus den Gruppen, die mit VL-CSA, VH+VL-CSA oder Reo-peptid ohne Adjuvans immunisiert wurden, gezeigt. Wiederum wird die spezifische Inhibition der Plaquebildung für den Virus Typ 3, aber nicht für den Virus Typ 1 beobachtet. Da das Peptidimmunserum spezifisch die Virusinfektiösität Typ 3, aber nicht die des Typ 1 inhibiert, definieren diese Peptide das neutralisierende Epitop, das sich auf dem Reovirus Typ 3 befindet.

Auslösung des Typs 4 der Überempfindlichkeitsreaktion (DTH) auf die Reovirus-Typen durch Immunisie rung mit Peptiden

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Spezifität der DTH-Reaktionen auf die Reovirusinfektion mit dem Polypeptid Sigma 1 zu tun hat (Weiss, H.L., Greene,M.T., und Fields,B.N., " Delayed Type Hypersensitivity to Mice Infected with Reovirus. Identification of Host and Viral Gene Products Responsible for the Immune Response", J. Immunol., 125: 278-282, (1980). Es wurde daher untersucht, ob die Immunisierung von Mäusen mit diesen Peptiden die DTH- Reaktionen auf den intakten Reovirus auslösen würde. Wie in den Figuren 13 und 14 gezeigt, wurden starke DTH-Reaktionen auf den Reovirus Typ 3 durch Immunisierung mit VL-Peptid hervorgerufen. Diese Reaktion ist typspezifisch, da diese Tiere keine starken DTH- Reaktionen auf den Reovirus Typ 1 zeigen. Die Verwendung von Reassortantenviren kartiert die Reaktion auf das Protein Sigma 1. Darüberhinaus resultiert die Versetzung der Tiere mit dem Virus Typ 3 in einer erheblichen DTH-Reaktion auf das VL-Peptid. Wir haben auch kürzlich eine typspezifische Proliferationsreaktion auf den Reovirus Typ 3 in Milzzellen aus Mäusen, die mit dem Reopeptid immunisiert waren, festgestellt. Diese Daten zeigen, daß das VL-Feptid und das Reopeptid ein wichtiges Epitop definieren, das an der T-zellulären Immunität auf Reovirus Typ 3 beteiligt ist.

Die Bindung des Reovirus Typ inhibiert die DNA- Synthese in einer Wirtszelle bei Rezeptorstörungen

Der Reovirus Typ 3 inhibiert die DNA-Synthese in einer Wirtszelle bei Rezeptorstörung. Dieser Effekt ist nicht auf die Infektion der Zellen zurückzuführen, da Reoviruspartikel Typ 3 mit einem Replikationsdefekt diese Eigenschaft beibehalten. L-Zellen wurden mit 5x10&sup4; Zellen pro Vertiefung auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen 24 Stunden lang in jeweils 100 µl Medium gezüchtet.
Reoviruspartikel Typ 3 (A) wurden hinzugefügt und für weitere 24 Stunden lang inkubiert, bevor trituertes Thymidin zugegeben wurde. Gereinigter monoklonaler Antikörper 87.92.6 oder HO 22.1 (B) wurde über 1 Stunde bei 37ºC zugegeben, dann wurde das Kulturmedium entfernt und über 24 Stunden durch 100 µl frisches Medium ersetzt, bevor das trituerte Thymidin zugegeben wurde. Die Zellen wurden für weitere 4-6 Stunden inkubiert, und die inkorporierten CPM (counts per minute) wurden gemessent. Figur 15 zeigt diese Wirkung von Reovirus Typ 3 bei Mäusefibroblasten. Mäusefibroblasten, welche spezifische Rezeptoren für den Reovirus Typ 3 besitzen (L-Zellen), wurden mit dem Reovirus Typ 3 inkubiert oder unbehandelt gelassen (8A) . 24 Stunden später wurde das Ausmaß der DNA- Synthese gemessen. Der Reovirus Typ 3 inhibiert wirksam die DNA-Synthesen in diesen Zellen. 87.92.6 hat eine vergleichbare Wirkung auf diese Zellen, wie in Figur 15 gezeigt wird. In diesem Experiment wurden L- Zellen anhaftend gezüchtet und 1 Stunde lang dem Antikörper ausgesetzt, wonach der Antikörper entfernt wurde, und die Zellen wurden vor der Bestimmung der DNA-Synthese weitere 24 Stunden lang gezüchtet, während ein Kontrollantikörper (HO 22.1) keine Wirkung zeigte. 87.92.6 inhibierte in ähnlicher Weise die DNA-Synthese durch Fibroblasten, neuronale Zellen und Lymphozyten.

Kompetitive Bindung von 9BG5 an 87.92.6 in Gegenwart von Peptiden

Polystyrolvertiefungen wurden mit gereinigtem 87.92.6 oder Kontroll-IgM, K Antikörper HO 22.1 durch Inkubieren von gereinigtem Antikörper (gereinigt an einer Ziegen/Anti-Maus IgM Säule), gelöst in 0,1% NaHCO&sub3; bei pH 9,5 mit 1µg/ml und 50µl/Vertiefungen, über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die Vertiefungen wurden gewaschen, mit 2% BSA in PBS mit 0,1% NAN&sub3; blockiert, nochmals gewaschen, und ein Gemisch aus radioiodiertem 9BG5 und Peptiden (bei den in Figur 26 angegebenen Konzentration) wurde über 1 Stunde bei 37ºC zugegeben. Die Vertiefungen wurden gewaschen und gezählt. In allen Fällen wurden spezifisch gebunden CPM bestimmt, imdem man die CPM von leeren BSA- beschichteten Vertiefungen von den CPM der mit 87.92.6 beschichteten Vertiefungen subtrahierte. Wie in Figur 16 gezeigt, war die Bindung von ¹²&sup5;1-9BG5 an Vertiefungen, die mit irrelevanten Maus IgM, K Antikörper H022.1 beschichtet waren war, vergleichbar mit der Bindung an leeren Vertiefungen.. Die prozentuale Inhibition wurde bestimmt, indem die spezifisch gebundenen CPM in Gegenwart des Inhibitors von den spezifischen CPM in Abwesenheit des Inhibitors subtrahiert und diese durch die gebundenen CPM in Abwesenheit des Inhibitors teilte, und das Ergebnis mit 100 rnultplitierte. Das ± SEM der Experimente aus 2 Versuchen ist in Figur 16 gezeigt.
Der erfindungsgemäße Ansatz stellt auch einen alternativen Weg zur Entwicklung und Herstellung biologisch aktiver Peptide zur Verfügung. Wie in Figur 17 gezeigt, imitieren die Antikörper 15, die für einen Rezeptor 11 des Antigens (oder Liganden) spezifisch sind, auch das Antigen 5 in gleicher Weise wie ein Anti-Idiotyp-Antikörper 9 des Antigens das Antigen 5 irnitiert. Bei dem Verfahrensweg 1 enthält ein Antikörper 7 ein Epitop, das üblicherweise mit 21 gekennzeichnet ist, und komplementär zu dem neutrallisierenden Epitop des Antigens 5 ist, das üblicherweise mit 19 gekennzeichnet wird. Dieser Antikörper 7 wird dann verwendet, um Antikörper oder Anti-Idiotyp- Antikörper 9 herzustellen. Diese Anti-Idiotyp-Antikörper 9 haben eine Region , die üblicherweise mit 23 gekennzeichnet ist, und die das neutralisierende Epitop des Antigens 5 imitiert. Bei dem Verfahrensweg 2 enthält der Rezeptor 11 auf der Zelloberfläche 13 ein Epitop, das üblicherweise mit 25 gekennzeichnet wird und komplementär zu dem neutralisierenden Epitop 19 des Antigens 5 ist; der Antikörper der für den Rezeptor 15 spezifisch ist, wird infolgedessen eine Region enthalten, die üblicherweise mit 27 gekennzeichnet ist, und die das neutralisierende Epitop 19 des Antigens 5 imitiert. Der Anti-Rezeptor-Antikörper 15 ist das Äquivalent des Anti-Idiotype-Antikörpers 9, da beide Regionen enthalten (23 und 27), die das neutralisierende Epitop 19 des Antigens 15 imitieren. Anti- Rezeptor-Antikörper 15 können als Alternative oder zusätzlich zu den Anti-Idiotype-Antikörpern 9 in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um die biologisch aktiven Peptide 17 mit den Eigenschaften des Antigens oder Liganden zu entwickeln und herzustellen. Da Antigene, wie beispielsweise Viren üblicherweise viele Antigenepitope enthalten, ist es erforderlich, die Antikörper, die in der Reaktion auf die Impfung mit dem Liganden, Rezeptor oder Anti- Ligand-Antikörper produziert werden, zu screenen, um Antikörper mit Spezifität für die neutralisierenden Epitope des Antigens auszuwählen. Das Screening kann mittels kompetetiver Assays durchgeführt werden, die die Fähigkeit des Antikörpers bestimmen, die Bindung des Antigens an den Rezeptor der Zelle zu inhibieren, wobei diese Antikörper eine größere Fähigkeit aufweisen, die Bindung des Antigens, das das neutralisierende Epitope enthält oder imitiert, zu inhibieren. Geeignete Screening-Verfahren umfassen die hier beschriebenen, und es wird für den Fachmann offensichtlich sein, die Reagenzien, sofern erforderlich, in den kompetitiven Assays auszutauschen, wenn andere Antigene und Rezeptorpaare verwendet werden.
Wie hier gezeigt wird, wurde ein neutralisierender Antikörper 9BG5 mit einer Spezifität für das Antigen HA3 auf dem Reovirus verwendet, um Anti-Idiotyp-Antikörper mit Anti-Rezeptoraktivität herzustellen. Diese Anti-Idiotyp-Antikörper binden ebenfalls an den Reovirusrezeptor Typ 3. Die Antikörper wurden gescreent, um Antikörper zu identifizieren, die um die Bindung des neutralisierenden Antikörpers mit dem Rezeptor konkurrierten oder diese zu inhibierten, was anzeigen würde, das sie Epitope enthalten, die das HA3, das Antigen, imitieren. Die variable Region eines Antikörpers mit dieser Aktivität wurde mit der Sequenz des Antigens HA3 verglichen, um die Homobgieregionen zu bestimmen, die die Wechselwirkungsstelle des HA3 und des Rezeptors definieren. Anstatt einen Antirezeptor-Antikörper, der als Anti-Idiotyp- Antikörper produziert wurde, zu verwenden, ist der Rezeptor selbst für die Herstellung von Antikörpern geeignet, die Epitope aufzuweisen, die das Antigens imitieren. Um diese Antikörper auf diesem Verfahrensweg herzustellen, wird der Rezeptor, typischerweise ein Protein oder Glykoprotein durch Standardverfahren zur Isolierung von Proteinen, wie beispielsweise aus Zellen, die den Rezeptor aufweisen, isoliert. Der gereinigte Rezeptor wird dann verwendet, um Antikörper, üblicherweise monoklonale Antikörper mittels konventioneller Verfahren herzustellen. Ein Tier, wie beispielsweise eine Maus, wird zuerst mit dem Rezeptor injiziert, dessen Milzzellen werden isoliert und mit Myelomazellen fusioniert, um Hybridzellen zu bilden. Diese werden in einem serumenthaltenden Medium geklont, und die monoklonalen Antikörper werden aus dem Medium abgetrennt. Die Antikörper werden dann, wie oben beschrieben, durch einen Neutralisationsassay gescreent, wie oben beschrieben, um die Antikörper auszuwählen, die spezifisch an die Rezeptorstelle des neutralisierenden Epitops binden.
Die Strategie, eine gemeinsame Primärstruktur und molekulare Mimikry auzunutzen, um die Wechselwirkung von Oligopeptidepitopen zu definieren, sollten einen weiten Anwendungsbereich in den biologischen Wissenschaften haben, um sowohl die Bereiche mit spezifischen Wechselwirkungen zwischen Molekülen zu definieren, und um die Entwicklung von Substanzen mit vorhersagbarer biologischer Aktivität voranzubringen.
Der Fachmann erkennt, das verschiedene Modifizierungen an den Verbindungen (Peptiden) der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können, ohne das vom Umfang der Erfindung abgewichen wird. Beispielsweise können Peptide der gleichen Klasse (d.h. konservative Substitution wie beschrieben von Chu et al, "Conformational Parameters For Anino Acids in Helical, Beta Sheet, und Random Coil Regions Calculated fron Proteins", Biochemistry,13(2) :211 (1974)) (auf die hiermit Bezug genommen wird) in der Sequenz, die dem Antikörper und Antigen gemeinsam ist, substituiert werden, solange die Aktivität der erhaltenen Peptide nicht nachteilig beeiflußt wird. Darüberhinaus können auch andere Antikörper, wie beispielsweise andere Anti-Rezeptor-Antikörper gegenüber dem Reovirusrezeptor Typ 3 oder Anti-Idiotyp-Antikörper gegenüber neutralisierenden Antikörpern unter Verwendung der CDR- Regionen mit dem Rezeptor in Kontakt gebracht werden. Peptide, die sich von diesen Regionen ableiten, und eine biologische Aktivität aufweisen, die vergleichbar ist mit den hier beschriebenen VL-Peptiden, werden auch von dieser Erfindung umfaßt.

Claims

1.Verfahren zur Synthese biologisch aktiver Verbindungen, welches folgende Schritte umfasst:

(a) Auswählen eines pathogenen Produkts (Antigen), von dem bekannt ist, daß es an einen physiologischen Rezeptor einer Säugerzelle bindet;

(b) Bereitstellen eines Antikörpers für einen zellulären Rezeptor des pathogenen Genprodukts;

(c) Bestimmen und Vergleichen der Antigensequenzen und der VL- und VH-Regionen der bestimmenden Region des Antikörpers;

(d) Synthese eines Peptids, das ein Epitop umfasst, dessen Sequenz zu einer in (c) bestimmten homologen Region mit mindestens 60 % Sequenzhomologie zwischen der VL- und der VH- Sequenz und der Antigensequenz paßt, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte (e) der Zugabe von Cystein zu einem Ende eines Peptids aus Schritt (d)&sub1;

(f) Zugabe von Cystein zu einem Ende eines anderen Peptids aus Schritt (d); und

(g) Inkontaktbringen der Peptide unter ausgewählten Bedingungen, die die Bindung des Cysteins an jedes Peptid ermöglichen, um ein zusammengesetztes Peptiddimer zu bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Peptidsequenzen von (e) und (f) unabhängig voneinander (oder jeweils) ausgewählt sind aus:

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin das Antigen aus einem Reovirus-Genprodukt ausgewählt wird.

4. In-Vitro-Verfahren zur Veränderung des Wachstums einer Säugerzelle, das die Verabreichung eines Peptids in diese Zelle umfasst, wobei das Peptid nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt wurde.

5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein synthetisches biologisch aktives Peptid umfasst, das nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt wurde und dafür in einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder Träger bereitgestellt wird.

6. Ein Dimer nach Anspruch 2.