DE69333673T2

DE69333673T2 - Epitope von Stress Proteinen

Info

Publication number: DE69333673T2
Application number: DE69333673T
Authority: DE
Inventors: James Peter Burnie; Ruth Christine Matthews
Original assignee: Neutec Pharma Ltd
Current assignee: Neutec Pharma Ltd
Priority date: 1992-08-18
Filing date: 1993-08-17
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2013-08-18
Also published as: EP0861892A1; EP0656945B1; DE69328489D1; GR3033809T3; EP0861892B1; ES2147560T3; AU4727593A; ES2231907T3; GB9217542D0; GB2270076A; EP0656945A1; PT656945E; US5777083A; WO1994004676A1; DE69328489T2; ATE192192T1; DE69333673D1; JP3439213B2; DK0656945T3; ATE280227T1

Description

Die Erfindung betrifft Epitope von Stress-Proteinen, die u. a. für die Verwendung in der Diagnose und Behandlung von Krankheitsbildern, in denen Stress-Proteine produziert werden, vorgesehen sind.
Stress in der Umgebung kann eine Steigerung der Syntheserate des sog. Hitzeschock- oder Stress-Proteins in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen bewirken (siehe z. B. Schlesinger et al (Hrsg.) in: Heat Shock from Bacteria to Man, Cold Spring Harbor, New York, (1972)). Obwohl die Funktion des Stress-Proteins noch endgültig aufgeklärt werden muss, wurde berichtet, dass sie am Aufbau und der strukturellen Stabilisierung von gewissen zellulären und viralen Proteinen beteiligt sind und ihre Anwesenheit bei hohen Konzentrationen einen zusätzlichen stabilisierenden Effekt bei der Einwirkung ungünstiger Bedingungen haben können.
Es wurde gezeigt, dass viele pathogene Organismen Stress-Proteine erzeugen (siehe Young et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4267–4270 (1988)). Es wird davon ausgegangen, dass die Proteine als Reaktion auf den Stress von Infektion gebildet werden, um beim Schutz des eindringenden Erregers zu helfen. So wurde die Fähigkeit zur Herstellung von Stress-Proteinen beim Überleben von bakteriellen Erregern in Makrophagen impliziert (Christmas et al, Cell, 41, 753–762 (1985) und Morgan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8059–8063 (1986)).
Burnie et al (GB 90307236.1, WO 92/01717) haben herausgefunden, dass Stressproteine sowohl von Pilzen als auch von Bakterien, z. B. Candida albicans und Corynebacterium jeikeium, ein immunodominant erhaltenes Antigen enthalten. Das Carboxyl-Ende des Candidal-Stressproteins wurde sequenziert und ein Antikörper, der auf das Epitop LKVIRKNIVKKMIE (SEQ ID NO: 1) anspricht, gefunden, das sowohl die 47 und 92 Kd Candidal-Stressproteine in Seren von Patienten, die unter systemischen Candidal-Infektionen leiden, erkennt. Zusätzlich erkannten die Antikörper auch Stressproteine in Seren von Patienten, die unter anderen Pilzerkrankungen leiden, z. B. die 40 und 88/84 Kd Aspergillus-Stressproteine, genauso wie Stressproteine in Seren von Patienten, die unter bakteriellen Infektionen leiden, z. B. die 52 und 86 Kd Coryneform-Stressproteine. Andere Peptidsequenzen des Candidal-Stressproteins stellten sich als immunogen heraus, z. B. die Epitope LSREM, LKVIRK und STDEPAGESA (SEQ ID NOs: 2, 3 bzw. 4), wenn sie mit Seren von Patienten mit systemischer Candidiasis reagierten.
Das vollständige menschliche 89 kDa Hitzeschock-Protein(HSP90)-Gen ist sequenziert worden (Hickey et al, Mol. Cell. Biol., 9, 2615–2626, 1989) und dessen Aminosäuresequenzen abgeleitet und mit denen anderer Hitzeschock-Proteine anderer Spezies verglichen worden. Obwohl es scheint, dass die Klasse der Hitzeschock-Proteine im hohen Maße unter Spezies erhalten bleibt, wurde bisher von keinem direkten Vergleich und einer Identifizierung von allgemein funktionellen Sequenzen, d. h. Epitopen, des Hitzeschock-Proteins berichtet.
Es wurde nun herausgefunden, dass trotz der Wirksamkeit der zuvor beschriebenen Epitope auch Wege zur Herstellung, die sich von der Carboxy-Sequenz des Candidal HSP90 unterscheiden, gleichwertige oder möglicherweise bessere Ergebnisse liefern können, wenn sie in der Diagnose oder Therapie verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt, das zu einem Epitop mit der Aminosäurensequenz NNLGTI identisch ist. Relevanter Stand der Technik ist die WO 92/01707 (wie oben diskutiert), Immunology 74(1): 20–24; Molecular and Cellular Biology, 9(6): 2615–2626; Journal of Clinical Microbiology, 29(10): 2099–2106; WO 91/00351; Epidemiology and Infection, 107(2): 273–283; und Journal of Immunological Methods, 143: 73–79. Diese offenbare alle unterschiedliche Stressproteine (Hitzeschock-Proteine, ebenso als HSP90 bezeichnet).
Das Peptid kann weiter dadurch beschrieben werden, dass es Kreuzreaktionen mit einem Antikörper eingeht, der auf das HSP90 von Candida albicans, Candida guilliermondii und Malaria anspricht.
Das Pilz-Stressprotein kann ein Candidal 47 KDa-Protein enthalten. Das erfindungsgemäße Peptid hat eine Vielzahl funktioneller Verwendungen. Insbesonde re kann es für die Diagnose und Behandlung einer Anzahl von Krankheiten als eine Alternative und/oder Verbesserung zu konventionellen Diagnose- und Therapieverfahren verwendet werden. Die vorliegende Erfindung kann z. B. bei der Diagnose und Behandlung von Malaria eingesetzt werden. Dies ist von zeitgemäßer Bedeutung, weil bekanntermaßen diese Krankheit schnelle resistent gegenüber gegenwärtigen Arzneimittelbehandlungen wird und als Konsequenz in der Welt immer verbreiteter wird.
Das Peptid kann die Basis (d. h. kann zur Herstellung) diagnostischer Tests für Malaria oder Pilzerkrankungen bilden, wobei ein immunologischer Test, wie z. B. ein ELISA, ein Radioimmunoassay oder ein Latex-Agglutinationsassay, verwendet wird, im wesentlichen um zu bestimmen, ob für das Epitop spezifische Antikörper und damit das spezielle Stressprotein in einem Organismus eines Wirts anwesend sind. Der Test kann im allgemeinen durchgeführt werden, indem die Körperflüssigkeit des Wirts mit einem Epitop in Kontakt gebracht wird und sämtliches komplexiertes Material detektiert wird. Der Test kann für das HSP90 von Candida albicans, Candida guilliermondii und/oder Malaria angewendet werden.
Als weitere Verwendung kann das erfindungsgemäße Peptid unter Verwendung konventioneller Techniken für ein Screening eingesetzt werden, um die Aktivität inhibierender Reagenzien für die Verwendung in der Behandlung von Malaria und Pilzerkrankungen zu erhalten. Als weitere Verwendung kann das erfindungsgemäße Peptid für die Herstellung von Antikörpern, d. h. für die Verwendung als ein Immunogen, durch Standardtechniken, z. B. durch Injektion des Peptids in einem geeigneten Wirt und der Aufnahme des Serums um den ge wünschten polyklonalen Anti-Epitop-Antikörper nach Aufreinigung und/oder Konzentrierung zu erhalten, eingesetzt werden. Vor der Injektion des Wirts kann das Peptid in einem geeigneten Vehikel formuliert werden, um eine Zusammensetzung bereitzustellen, die ein Peptid zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträgern.
Alternativ können die Antikörper im Ursprung monoklonal sein und grundsätzlich zu jeder Immunoglobulin-Klasse, z. B. IgG und/oder IgM und/oder IgA gehören. Der Antikörper kann tierischen Ursprungs sein, z. B. eines Säugetiers, murinen Ursprungs, von einer Ratte oder bevorzugt menschlichen Ursprungs. Ebenso kann es ein humanisierter Antikörper einer Maus oder einer Ratte sein.
Für die Aufreinigung eines jeden Anti-Epitop-Antikörpers kann die Affinitäts-Chromatographie unter Anwendung eines immobilisierten Epitops gemäß der Erfindung als Affinitätsmedium verwendet werden. Solche Anti-Epitop-Antikörper können sowohl für die Diagnose als auch die Behandlung von Pilzerkrankungen und bakteriellen Infektionen und Malaria verwendet werden. Als Inhibitoren der Wirkung eines Stressproteins können die Anti-Epitop-Antikörper entweder alleine oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Wirkstoffen, z. B. anderen antifungalen Mitteln oder Anti-Malaria-Mitteln verwendet werden. Zusätzlich können solche Peptide für die Herstellung anderer Inhibitoren von fungalen oder Malaria-Stressproteinen verwendet werden, z. B. inhibieren Ribozyme und Antisense-RNA die Translation des Stressproteins mRNA.
Eine mögliche Verwendung solcher Anti-Epitop-Antikörper ist die unterstützende Immunotherapie von z. B. HIV-positiven Patienten. Solche Patienten neigen zu opportunistischen Infektionen aufgrund ihres beeinträchtigten Immunsystems. Beispiele solcher opportunistischen Infektionen schließen Candida, Aspergillus und Pneumocystis carnii ein. Tatsächlich wurde gezeigt, dass Seren von HIV-positiven Patienten Antikörper-positiv zu HSP90 von all diesen Organismen sind. Es wird somit vorgeschlagen, solche Patienten mit Antikörpern zu versorgen, die HSP90 von diesen und anderen infektiösen Organismen erkennen, bevor diese Infektionen sich ausbilden und zum Tod solcher Patienten führen.
Mischungen der Antikörper können, wenn gewünscht, für die Diagnose und Behandlung eingesetzt werden, z. B. Mischungen von Antikörpern einer unterschiedlichen Klasse, z. B. Mischungen von IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern, die das Epitop erkennen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.
Beispiel 1
Mögliche immunodominante Epitope des menschlichen HSp90 wurden gegen Seren von Patienten untersucht, die unter verschiedenen Krankheitstypen leiden, bei einem Versuch, neue Hilfsmittel sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung der Krankheit bereitzustellen.
Die untersuchten Seren schlossen solche von Patienten ein, die unter systemischer Candidiasis (47 kDa positiv), invasiver Aspergillosis (88,40 kDa positiv), allergische bronchopulmonare Aspergillosis, Aspergilloma, Malaria, Streptococcus faecalis Endocarditis, Corneybacterium jeikeium Endocarditis und der Autoim munkrankheit systemischer Lupus Erythematosis (SLE) leiden.
Es wurde eine Epitop-Kartierung von menschlichem HSP90 gegen die erhaltene Aminosäurensequenz, die in Hickey et al 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 2615–2626 beschrieben ist, durchgeführt.
Experimentelle Details
Die 716-Aminosäurereste wurden auf Polyethylen-Pins als kompletter Satz von überlappenden Nonapeptiden synthetisiert, in denen Peptid 1 aus den Resten 1 bis 9 bestand, Peptid 2 aus den Resten 2 bis 10 usw. Die Peptidsynthese wurde mit Fmoc-geschützten Aminosäureestern durchgeführt. Die Polyethylen-Pins wurden selbst jeweils mit Fmoc-β-Alanin gekoppelt. Nach der Fmoc-Entschützung wurde die erste Aminosäure zu jedem Pin gekoppelt, wie durch die zu synthetisierende Sequenz vorgegeben. Über Hydrobenzotriazol vermittelte Kopplungsreaktionen wurden über Nacht in einer N,N-Dimethylformamid-Lösung an jeder geschützten Seitenkette, Fmoc-Aminosäure. Die Peptide wurden durch aufeinanderfolgende Zyklen von Fmoc-Entschützungen und Addition einer Aminosäure pro Pin pro Tag synthetisiert. Nach Abschluss der letzten Kopplungsreaktion und Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde die terminale Aminogruppe acetyliert, um die unnatürliche Ladung des N-Endes des Peptids zu entfernen. Die Seitenketten-Schutzgruppen wurden durch eine Mischung aus Trifluoressigsäure : Phenol : Ethandithiol (95 : 2,5 : 2,5, v/w/v) entfernt.
Die noch an die Oberfläche der Pins gekoppelten Peptide wurden gegen Seren durch ein Enzymimmunoassay (EIA) untersucht. Die Pins wurden eine Stunde lang in Mikrotiterplatten enthaltend 1% Ovalbumin, 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-T (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,1% Tween 20) vorbeschichtet. Sie wurden dann bei 4°C in Patientenserum (1/200) inkubiert, viermal mit PBS-T gewaschen und eine Stunde lang mit mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Anti-Immunoglobulin (1/1000; Sigma, Poole) inkubiert. Nach weiterem Waschen wurden die Pins 30 min lang in ABTS (0,5 mg/ml Amino-di-3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonat in Citratpuffer (pH 4,0) mit 0,03% Wasserstoffperoxid) eingetaucht und in einem EIA-Plattenleser wurden A₄₀₅-Messungen durchgeführt. Die Pins wurden durch Ultraschallbehandlung gereinigt.

Eine Reaktion wurde als spezifisch angesehen, wenn über wenigsten drei Wells die optische Dichte wenigstens zweifach über dem Untergrund lag. Die große Anzahl der tatsächlich synthetisierten Peptide fungierte als negative Kontrolle in jedem Test. Die mittlere Absorption dieser Peptide war gering und wurde zur Ermittlung des Hintergrunds verwendet (Geysen et al., 1987). Details der untersuchten Patientenseren I. Disseminierte Candidiasis

Nr.	Anamnese
1.	Leukaemia, Neutropenia, Blutkultur-positive C. albicans
2.	Post-Oesophagectomie, Blutkultur-positive C. albicans
3.	HIV-positiv, Drogenmissbraucher, Candidal Chorioretinitis
4.	Candida Peritonitis, chronische ambulanter peritonealer Dialyse-Patient, Blutkultur-positive C. albicans.

5.	Post-Duodenalresektion, positiv gegenüber C. albicans in zwei Gruppen von Blutkulturen
6.	Pre (Antikörper-negativ), Post Antikörper-positiv. Positiv gegenüber C. albicans in zwei Gruppen von Blutkulturen. Post-Cholecystectomie
7.	Post-Oesophagectomie, Brust-Drainage, Blutkultur-positiv C. albicans
8.	Hepatosplenische Candidiasis, Schaum bei der Biopsie gesehen
9.	Chronische ambulante peritonealer Dialyse-Patient, Peritonitis, abdominaler Abszess, positiv gegenüber C. albicans in zwei Gruppen von Blutkulturen

Antikörper-Profil

C. albicans: HSP 90 besitzt Banden bei 92, 47, 40 KD (wie in GB 2 034 504 offenbart).
A. fumigatus: HSP 90 besitzt Banden bei 88/84, 51 und 40 KD.

HIV-positive Patientenseren sind Antikörper-positiv für Candida HSP90, Pneumocystis carnii HSP90 und Aspergillus. Somit wird vorgeschlagen, den Antikörper bei der Versorgungstherapie solcher Patienten zu verwenden, weil der Verlust des Antikörpers bei diesen Patienten zu opportunistischen Infektionen führen kann, z. B. Pneumocytis carnii und anderen Organismen, die das Antigen, d. h. HSP90, produzieren. II. Invasive Aspergillosis

Fall-Nr.	Anamnese
10.	tödlich, invasive Aspergillosis, akute Leukaemia
11.	tödlich, invasive Aspergillosis, akute Leukaemia
12.	tödlich, invasive Aspergillosis, akute Leukaemia
13.	Überlebender, invasive Aspergillosis, akute Leukaemia
14.	Überlebender, invasive Aspergillosis, akute Leukaemia
15.	Überlebender, invasive Aspergillosis, akute Leukaemia

Antikörper-Profil
III. Allergische bronchopulmonare Aspergillosis
IV. Aspergilloma
V. Streptococcus faecalis endocarditis
Der in GB 2 034 504 beschriebene monoklonale Antikörper führt eine Kreuzreaktion mit einer S. faecalis immunodominanten Bande bei 90 KD aus, wie es das Kaninchenserum, das gegen dieses Peptid (LKVIRKNIVKKMIE-cys-KLH) (SEQ ID NO: 26) gezüchtet wurde, ebenso tut.
Eine vorherige Arbeit (Burnie et al, 1985) identifizierte diese Antigenbande als immunodominant in S. faecalis Endocarditis und schlug vor, dass dies die Basis eines Tests für kulturnegative Endocarditis sein kann.
VI. Malaria
Weitere fünf Fälle von Malaria wurden gegen Candidal- und Aspergillus-Extrakte einem Immunblot unterzogen, um zu zeigen, dass sie Antikörper besitzen, die mit dem fungalen HSP 90 eine Kreuzreaktion durchführen.
VII. Corynebacterium jeikeium endocarditis
VIII. Systemische Lupus-Erythematosis (SLE)
IX. C. guilliermondii Meningitis/Septicaemia
Ergebnisse Epitop-Kartierung von menschlichem HSP 90
Schlussfolgerung: Die Epitope 1, 3, 4, 6, 7, 8, 11 und 12 lieferten eine positive Reaktion mit Seren von SLE-Patienten, d. h. das Epitop erkannte einen Autoimmun-Antikörper und kann als Autoantikörper-Domäne klassifiziert werden.
Die Epitope 2, 5, 9 und 10 scheinen gegenüber Pilzen spezifisch zu sein, mit dem Epitop 2 als potentiellen Candidal-Epitop und dem Epitop 9 als für Aspergillosis spezifischen Epitop. Zusätzlich können die Epitope 2, 5, 9 und 10 Kandidaten für potentielle Malaria-Epitope sein und die Epitope 9 und 10 potentielle S. faecalis-Epitope sein.
Beispiel 2
Das Peptid LKVIRKNIVKKMIE cys wurde zur Züchtung die monoklonaler Seren, die in GB 2 034 504 verwendet werden, eingesetzt. Dennoch ist die genaue Immunogenizität dieses Peptids unbekannt. Es wurde entschieden, dies durch ersetzen jeder der Aminosäuren in dem obigen Peptid zu untersuchen, um den Effekt auf die Immunogenizität, sofern eine vorliegt, zu sehen.
Die notwendigen Peptide wurden zuerst unter Verwendung konventioneller Techniken synthetisiert und die Immunogenizität wurde unter Verwendung menschlicher Seren, die den oben beschriebenen monoklonalen Antikörper enthalten, gemessen. Es wurde entschieden, ebenso ein weiteres Epitop, nämlich NKILKVIRKNIV, zu untersuchen.

Die Protokolle und die Antikörper-Konzentration waren die gleichen wie die zuvor in Beispiel 1 beschriebenen. Ausgewertete Peptide

Peptid 1	LKVIRKNIV (SEQ ID NO: 28) ausgewertet für Wechsel in LKVIRK
Peptid 2	NKILKVIRK (SEQ ID NO: 29) ausgewertet für Wechsel in KILK (SEQ ID NO: 30)
Peptid 3	LKVIRKNIV ausgewertet für Wechsel in KNIV (SEQ ID NO: 31)

So dass in der gesamten Sequenz die
Untersuchte Seren

1. Monoklonal spezifisch gegenüber LKVIRKNIVKKMIE-cys gegen die Peptide 1 und 3.
2. Menschliche Seren

Antikörper-Profile
Ergebnisse
1. Monoklonal spezifisch gegenüber LKVIRKNIVKKMIE-cys
Peptid 1 – LKVIRKNIV

ELISA-Werte gemessen nach 30 Minuten, Antikörper-Verdünnung 1 : 200
Kontrolle LKVIRKNIV Mittel ELISA OD = 0,923 (Kontrollen)

Substituierte Aminosäure
Diese Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Aminosäuren IRK, die mit RK unersetzlich ist, wobei die Bindung des Antikörpers gegenüber der Substitution dieser Aminosäuren vernachlässigbar ist.
Peptid 3 – LKVIRKNIV

ELISA-Werte gemessen nach 30 Minuten, Antikörper-Verdünnung 1 : 200
Kontrolle LKVIRKNIV Mittel ELISA OD = 0,842

Diese Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Aminosäuren KNIV.
Das gesamte Epitop ist I R K N I V (SEQ ID NO: 32) mit den unterstrichenen Aminosäuren, die praktisch unmöglich zu ersetzen sind.
2. Menschliche Seren
Jeder durchgeführte ELISA kombinierte IgM und IgG nach 30 Minuten. Antikörper-Verdünnung 1 : 200. Peptid 1
wo die ELISA-Ablesungen unter 0,4 lagen, wurden diese Ergebnisse als nicht anwendbar angesehen, da sie im Bereich des Untergrunds lagen.
Peptid 2
ELISA-Werte von weniger als 0,4 wurden als Untergrund genommen, und damit als nicht anwendbar betrachtet.
Peptid 3
ELISA-Werte von weniger als 0,4 wurden als Untergrund genommen und damit als nicht anwendbar angesehen.
Beispiel 3
Eine Bibliothek von Immunoglobulinschwer- und -leichtketten-variablen (V) Genen wurde aus den peripheren Blutlymphozyten eines Patienten hergestellt, der sich von systemischer Candidiasis erholt hat. Die Bibliothek wurde angereichert und bezüglich der Wirksamkeit gegenüber LKVIRKNIVKKMIE und NKILKVIRKNIVKK (SEQ ID NO: 33) gescreent und die resultierenden menschlichen rekombinanten Antikörper, die für die therapeutische Wirksamkeit in einem Mäuse-Modell von systemischer Candidiasis untersucht wurden.
Experimentelle Details
Die Bibliothek wurde im wesentlichen wie bei Marks et al (J Mol Biol 1991; 222: 581–597) beschrieben unter Verwendung des pCANTAB5-Vektors, der mittlerweile kommerziell als Teil eines Kits von Pharmacia (Milton Keynes, UK) erhältlich ist, hergestellt. Die Schwer- und Leichtketten-V-Gene, erhalten aus cDNA, hergestellt von der mRNA der peripheren Blutlymphozyten eines Patienten, der sich von systemischer Candidiasis erholt, wurden zufällig kombiniert und in Not I/Sfi I subkloniert, das mit pCANTAB 5 verdaut wurde. Die resultierenden Einzelstrang-Fv-Fragmente (ScFv), ausgedrückt auf der Oberfläche einer Bakteriophage, wurden durch Schwenken gegen spezifische synthetische Peptidepitope einschließlich LKVIRKNIVKKMIE und NKILKVIRKNIVKK, angereichert. Anschließend wurde Immunoblotting (siehe Beispiel 4) zur Identifizierung individueller Klone mit einer Wirksamkeit gegen das 47 kd-Antigen von Candida albicans verwendet. Zwei stark positive rekombinante Antikörper wurden für die weiteren Studien ausgewählt: A2 (durch Panning gewaschen gegen LKVIRKNIVKKMIE) und B3 (gewaschen durch Panning gegen NKILKVIRKNIVKK).
Weiblichen Balb/c-Mäuse wurde intravenös eine letalen Dosis von Candida albicans injiziert. Zwei unterschiedliche Altersgruppen wurden untersucht – erwachsene Mäuse mit einem Gewicht von etwa 20 g (Versuche 1 und 2) und junge Mäuse mit einem Gewicht von etwa 12 g. Zwei unterschiedliche Einsätze von menschlichen rekombinantem B wurden untersucht (Versuch Nr. 1 ge gen Nr. 2 und 3). In Versuch 1 wurde der rekombinante Antikörper mit dem menschlichen rekombinanten Antikörper A und dem Helfer-Phagen M13 K07 verglichen und 200 μl Kochsalzlösung, M13 K07 oder menschlicher rekombinanter Antikörper wurden ungefähr 2 h nach iv. Challenge mit Candida verabreicht. In den Versuchen 2 und 3 wurden 100 μl Kochsalzlösung oder B3 1 h nach iv. Challenge mit Candida verabreicht.
Ergebnisse
Kommentar
Jüngere Mäuse scheinen relativ resistent gegenüber Candida albicans zu sein (eine analoge Situation, die auch beim Menschen auftritt). Der menschliche rekombinante Antikörper B zeigte wiederholt therapeutische Wirksamkeit gegen Candida – anders als der menschliche rekombinante Antikörper A.
Beispiel 4
Menschliche rekombinante Antikörper B3 und A2 wurden hinsichtlich der Kreuz-Reaktivität gegen Streptococcus faecalis und Corynebacterium jeikeium untersucht.
Experimentelle Details
Immunoblots von Candida albicans, Corynebacterium jeikeium und Streptococcus faecalis wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Matthews, Epidemiol. Infect. 1991; 107: 273–283; Burnie et al, J. Clin. Path. 1987; 40: 1149–1158). Vor Inkubierung jedes Blots mit der Phagen-Suspension (B3 oder A2) für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter schonendem Rühren wurden die freien Proteinbindungsstellen mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Sie wurden anschließend fünfmal 30 min. lang in 0,05% Tween 20-Kochsalzlösung gewaschen und 90 min. lang mit Anti-M13-Antikörper (kommerziell erhältlich von 5'–3', Inc. Boulder, USA), 1 : 1000 in 3% BSA verdünnt, inkubiert. Das Waschen wurde wiederholt und anschließend wurden sie mit alkalischer Phosphase konjugiertem Anti-Ziegen-Antikörper (1 : 1000 verdünnt), von Sigma, 1 h lang inkubiert. Das Waschen wurde wiederholt und dann wurden die Blots mit dem Farbsubstrat BCIP NBT wie zuvor beschrieben entwickelt (Matthews 1991).
Ergebnisse
B3 und, in einem geringerem Ausmaß, A2 durchliefen eine Kreuzreaktion mit Streptococcus faecalis und Corynebacterium jeikeium genauso wie Candida albicans. Verschiedene Banden wurden hergestellt. Im Fall von S. faecalis waren diese bei etwa 112 kd, 88 bis 90 kd und 32 kd. Im Fall von C. jeikeium erschienen die Banden bei etwa 160 kd, 52 kd, 47 kd und 40 kd. In dem Fall von C. albicans erschien eine markante Bande bei 47 kd.
Kommentare
Die menschlichen rekombinanten Antikörper B3 und A2 durchliefen eine Kreuzreaktion mit S. faecalis und C. jeikeium und können ein therapeutisches Potential gegen diese und andere Gram-positive Bakterien besitzen.
Beispiel 5
Dot-Immunobinding-Assay
Material und Verfahren
1 μl menschlichen Serums wurde punktförmig auf ein Blatt einer Nitrocellulosemembran (Biorad Laboratories, California) aufgetragen. Dies ließ man 10 min. lang trocknen. Es wurde 1 h lang bei 37°C mit 3% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit pH 7,5 blockiert. Nach fünfmaligem Waschen über 30 min. lang in 0,9% (b/v) Kochsalzlösung – 0,05% Tween 80 wurde 1 h lang bei Raumtemperatur mit dem menschlichen rekombinanten Antikörper B3, 1 : 5 verdünnt, inkubiert. Es wurde dann 30 min. lang wie zuvor beschrieben gewaschen und weiter inkubiert mit dem Anti-M13-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (Pharmacia Ltd.), verdünnt 1 : 5000 in 3% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Nach einem weiteren Waschschritt wurde dies mit dem 3-Amino-9-ethylcarbazol-Substrat (0,67 ml einer Lösung von 0,4 gram 3-amino-9-ethylcarbazol/100 ml Dimethylformamid in 10 ml von 0,1 M Natriumacetat (pH 5,2)) entwickelt. Dies wurde mit 10 μl einer 30%igen H₂O₂-Lösung aktiviert. Der Blot wurde 30 min. lang inkubiert und gewaschen. Die Ergebnisse wurden mit einer positiven Kontrolle von 1 μl von Candidal-Pressat (100 mg/ml) verglichen und als negativ (nil), schwach-positiv (Spur) und positiv (analog zu dem Ergebnis des Candidal-Extrakts) eingestuft.
Dot-Immunobinding-Assay mit rekombinanten Antikörpern Ergebnisse Kontrollseren (Seren von Patienten ohne Hinweis auf disseminierte oder orale Candida, entweder mit Leukaemia oder nach größerer Gastrointestinal-Operation)
Die beiden als Spur positiven Patienten kamen aus einer Gruppe von fünf Patienten mit einer zugrunde liegenden Septicaemia aufgrund eines Corynebacterium jeikeium.
Kolonisierte Patienten (Seren von Patienten mit einer kolonisierten Stelle entweder oral/Wunde/vaginal/intravenöse Linie/Urin)
Systemische Patienten
Definiert entweder als (1) zwei Sätze positiver Blutkulturen, die wenigstens 24 h von zwei verschiedenen intravenösen Stellen genommen wurden, oder (2) kultureller und histopathologischer Hinweis, erhalten nach Absterben.
Jeder Patient wurde als maximaler detektierter Antigentiter berichtet, wenn eine Serie von Proben verfügbar war.
Kommentare
Antigen, detektiert durch Dot-Immunobindung mit dem B3 rekombinanten Antikörper gekennzeichneten Kontrollseren und Seren von kolonisierten Patienten von den Seren von Patienten mit systemischer Candidiasis.
Schlussfolgerung
Betreffend Hitzeschock-Protein-Epitope
Die im folgenden unterstrichenen Aminosäuren sind vital, d. h. unersetzlich, hinsichtlich der Funktion des Epitops als ein Immunogen. Zusätzlich erzeugen die Seren von Patienten mit verschiedenen Krankheiten Antikörper, die Aminosäuren innerhalb desselben Epitops leicht unterschiedlich erkennen.
In Fall 24 fungierte ein SLE-Patient als positive Kontrolle, weil es keinen der drei Peptide des Epitops der vorliegenden Erfindung erkannte, obwohl diese Patientenseren positiv für das Candidal 47 KD-Protein waren.
Der in GB 2 034 504 beschriebenen monoklonale Antikörper reagiert mit einem Epitop, das nur einen Teil des Epitops für die Erregerinfektion (C. albicans/C. tropicalis/C. parapsilosis) darstellt. Infektionen aufgrund von C. tropicalis, A. fumigatus und Malaria sind immunoreaktiver gegenüber dem KILK-Epitop. Infektionen aufgrund von Malaria und A. fumigatus erkennen auch ein Epitop, das NIV enthält.
Somit kann ein wirksamerer Antikörper, der Stressproteine erkennt, die in einem breiteren Bereich von Krankheiten als dem in GB 2 034 504 beschriebenen entstehen, gegen das Epitop NKILKVIRKNIV (d. h. Antikörper B3) hergestellt werden.
Betreffend die Antikörper gegen Hitzeschock-Protein-Epitope
Die Daten zeigen, dass gegen XXXLXVIRKXIV und/oder XXILXVIXXXXX gezüchtete Antikörper, bei denen X eine Aminosäure ist, insbesondere menschliche rekombinante Antikörper einen Schutz in dem Maus-Modell der systemischen Candidiasis zeigen.
Es ist verständlich, dass die Erfindung nicht auf die obigen Beispiele alleine beschränkt ist, sondern viele Variationen, die für den Fachmann greifbar sind, möglich sind, ohne vom Schutzbereich, wie er in den angefügten Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.
Sequenz-Protokoll

Claims

Ein Peptid, das zu einem Epitop identisch ist, welches eine Aminosäurensequenz NNLGTI aufweist.
Peptid nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kreuzreaktion mit einem Antikörper, der gegen das HSP90 von Candida albicans, Candida giulliermondii, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum erzeugt wird, eingeht.
Peptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Candidal HSP90 ein Stress-Protein mit 47 KDa enthält.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in einem diagnostischen Test für parasitäre Infektionen oder Pilzinfektionen.
Peptid nach Anspruch 4 zur Verwendung in einem diagnostischen Test für das HSP90 von Candida albicans, Candida guilliermondii, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines diagnostischen Tests für das HSP90 von Candida albicans, Candida guilliermondii, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum.
Peptid nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der diagnostische Test ein Dot-Immunoblot-Assay, ein Radioimmuno-Assay oder ein Latex-Agglutinations-Assay ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der Behandlung eines krankhaften Zustandes, in dem Stress-Proteine produziert werden.