PT656945E - Epitopos de proteinas do stress - Google Patents

Description

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Descrição “Epítopos de proteínas do stress” A presente invenção refere-se aos epítopos das proteínas do stress destinados, inter alia, a serem utilizados em diagnóstico e no tratamento de doenças em que sejam produzidas proteínas do stress, O stress ambiental pode induzir um aumento da velocidade de síntese de proteínas do chamado choque térmico, ou stress, tanto nas células procarióticas como nas células eucarióticas (ver, por exemplo, Schlesinger et al., (eds), em ‘Heat Shock from Bactéria to Man’, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, (1972)). Embora a função das proteínas do stress ainda não esteja totalmente esclarecida, sabe-se já que algumas participam na constituição e na estabilização estrutural de determinadas proteínas celulares e virais e a sua presença em grandes concentrações pode ter um efeito estabilizador complementar durante a exposição a condições adversas.

Comprovou-se já que há muitos organismos patogénicos que produzem proteínas do stress (ver Young et al, Proc. Nad. Acad. Sei. USA, 85, 54267-4270 (1988). Admite-se que tais proteínas sejam produzidas em resposta ao stress de infecções para ajudar a proteger contra o agente patogénico invasor. Assim, por exemplo, sabe-se que a capacidade de produção de proteínas do stress está associada à sobrevivência de agentes patogénicos bacterianos dentro de macrófagos (Christmas et al., Cell, 41, 753-762 81985) e Morgan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, 8059-8063 (1986)).

Bumie et al, (GB 90307236.1, WO 92/01717) descobriram que as proteínas do stress, tanto de fungos como de bactérias, por exemplo, de Candida albicans e de Corynebacterhim jeikeium, compreendem um antigénio conservado imunodominante. Determinou-se a sequência do terminal carboxi da proteína do stress das Cartdidas e criou-se um anticorpo contra o epítopo LKVTRKNIVKKMIE para o qual se comprovou que reconhecia tanto as proteínas do stress das Condidas de 47 Kd como de 92 Kd em soros retirados de pacientes que padeciam de uma infecção sistémica com Cartdidas. Além disso, os anticorpos reconheceram também as proteínas do stress em soros retirados de pacientes que padeciam de outras infecções fúngicas, por exemplo, as proteínas do stress de Aspergillns de 40 Kd e de 88/84 Kd, e reconheceram também as proteínas do stress retiradas de pacientes que padeciam de uma infecção bacteriana, por exemplo, as proteínas do stress de microrganismos corineformes de 52 Kd e de 86 Kd. Comprovou-se que havia outras sequências peptídicas de proteínas do stress das Cartdidas que eram imunogénicas, por exemplo, os epítopos LSREM, LKVIRK e STDEPAGESA reagiram com soros de pacientes com candidíase sistémica.

Determinou-se a sequência completa do gene humano da proteína do choque térmico de 89 Kd (PCT90, o mesmo que HSP90) (Hicley et ai, Mol. Cell. Biol., 9, 2615-2626, 1989), deduziu-se a sua sequência de aminoácidos e comparou-se com as proteínas do choque térmico de outras espécies. Embora se admita que a classe das proteínas do choque térmico seja fortemente conservada entre espécies, nunca antes foi efectuada uma comparação directa e uma identificação das sequências funcionais comuns, (isto é, epítopos) das proteínas do choque térmico.

Descobriu-se agora, independentemente da eficácia dos epítopos já anteriormente descritos, que as vias para a produção, diferentes das que partem da sequência do terminal carboxi da PCT90 das Cartdidas, podem proporcionar resultados iguais ou potencialmente superiores quando utilizadas em diagnóstico ou terapia.

J

De acordo com a presente invenção, esta proporciona um péptido idêntico a um epítopo que possui a sequência de aminoácidos NKILKV1RKNIV. A técnica anterior relevante vem descrita nas publicações WO 92/01707 (adiante analisada), ‘Immunology 74’ (1): 20-24; ‘Molecular and Cellular Biology’, 9(6): 2615-2626; ‘Journal of Clinicai Microbiology’, 29810): 2099-2106; WO 91/00351; ‘Epidemiology and Infection’, 107(2): 273-283; e ’Journal of Inununological Methods’, 143: 73-79. Todas estas publicações descrevem diversas proteínas do stress (proteínas do choque térmico, também designadas por PCT90 (o mesmo que HSP90)) e epítopos particulares das proteínas do stress semelhantes aos da presente invenção. No entanto, em nenhuma dessas publicações vem sugerida ou descrita a adição dos três resíduos do terminal N, de acordo com a presente invenção, o que faz com que o epítopo tenha uma maior especificidade entre espécies (ver o capítulo “Conclusões” infra). O péptido ainda pode ser caracterizado pelo facto de interreagir com um anticorpo criado contra uma proteína do stress malárico ou contra uma proteína do stress fúngico.

Uma proteína do stress fúngico pode ser uma proteína de Condidas de 97 Kd e/ou 47 Kd ou pode ser um a proteína de Aspergillus de 40 Kd, 51 Kd e/ou 88/84 Kd. O péptido de acordo com a invenção possui um conjunto de utilizações funcionais. Em particular, pode ser utilizado no diagnóstico e no tratamento de diversas doenças em alternativa e/ou complementaimente aos métodos convencionais de diagnóstico e terapêuticos. Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada no diagnóstico e no tratamento de malária. Isto é de grande importância uma vez que esta doença, como se sabe, está a tomar-se rapidamente resistente aos tratamentos com os fármacos convencionais e em consequência está a tomar-se mais predominante em todo o mundo.

0 péptido pode constituir a base de um teste de diagnóstico da malária ou de uma infecção fúngica, por exemplo, um teste imunológico, tal como um ensaio de imunossorção associado a uma enzima, um radioimunoensaio ou um ensaio de aglutinação de látex, essencialmente para se determinar se eventualmente estão presentes anticorpos específicos para o epítopo e consequentemente para a proteína do stress particular, num organismo hospedeiro. O teste pode ser realizado, geralmente, fazendo contactar um fluido corporal retirado do hospedeiro com um péptido e detectando a formação de qualquer material complexo resultante.

Segundo uma outra utilização, o péptido de acordo com a invenção pode ser utilizado, recorrendo a técnicas convencionais, para pesquisar agentes inibidores de actividade destinados ao tratamento da malária e de infecções fúngicas. O péptido de acordo com a invenção pode ser utilizado para gerar anticorpos, isto é, pode ser utilizado como imunogénio, por meio de técnicas convencionais, por exemplo, injectando o péptido em qualquer hospedeiro adequado e recolhendo-lhe uma amostra de soro para se obter o desejado anticorpo policlonal anti-epítopo após a purificação e/ou a concentração. Antes de o hospedeiro ser injectado, o péptido pode ser formulado num veículo adequado para se obter uma composição que contenha o péptido conjuntamente com um ou vários excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Em alternativa, os anticorpos podem ter uma origem monoclonal e podem pertencer, em geral, a qualquer classe de imunoglobulinas, por exemplo, IgG e/ou IgM e/ou IgA. O anticorpo pode ser, por exemplo, de origem animal, tal como um mamífero seleccionado entre murinos, ratos ou preferencialmente seres humanos, ou pode ser um anticorpo humanizado de murino ou de rato. 5

Para a purificação de qualquer anticorpo anti-epítopo é possível recorrer à cromatografia por afinidade , utilizando um epítopo imobilizado, de acordo com a invenção, como meio de afinidade. Tais anticorpos anti-epítopos podem ser utilizados tanto em diagnóstico como no tratamento de infecções fúngicas e bacterianas e também da malária. Enquanto inibidores da acção de uma proteína do stress, os anticorpos anti-epítopos podem ser utilizados por si sós ou em combinação com outros agentes farmacêuticos, por exemplo, outros agentes antifungicos ou agentes antimaláricos. Além disso, tais péptidos podem ser utilizados para a produção de outros inibidores de proteínas do stress, fúngicas ou maláricas, por exemplo, as ribozimas e o ARN anti-sentido inibem a tradução do ARNm das proteínas do stress.

Uma utilização possível para tais anticorpos anti-epítopos é na imunoterapia de reforço, por exemplo, de pacientes positivos aos VIH. Tais pacientes são propensos a infecções oportunistas devido ao facto de o seu sistema imunitário estar comprometido. Como exemplos de tais infecções oportunistas refere-se as provocadas por Candidas, Aspergillus e Pneimocystis camii. Com efeito, comprovou-se que os soros de pacientes positivos aos VIH eram positivos aos anticorpos contra a PCT90 de todos estes organismos. Assim, foi proposto criar em tais pacientes os anticorpos com capacidade para reconhecerem as PCT90 de tais microrganismos e de outros organismos infecciosos antes de tais infecções se desenvolverem e contribuírem para a morte desses pacientes.

Se desejado, é possível utilizar misturas de anticorpos para diagnóstico ou tratamento, por exemplo, misturas de anticorpos de uma classe diferente, por exemplo, misturas de anticorpos de IgG, IgM e IgA que reconheçam o epítopo.

Os exemplos a seguir descritos ilustram a invenção. O Exemplo 1 tem uma finalidade apenas ilustrativa.

EXEMPLO 1

Realizou-se um estudo sobre possíveis epítopos imunodominantes da PCT90 humana em soros de pacientes que padeciam de vários tipos de doenças, numa tentativa para se obter novas ferramentas, tanto para diagnóstico como para o tratamento das doenças.

Entre os soros examinados estavam os de pacientes que padeciam de candidíase sistémica (positivos à proteína de 47 Kd), aspergilose invasiva (positivos às proteínas de 88 e 40 Kd), aspergilose broncopulmonar alérgica, aspergiloma, malária, endocardite provocada por Streptococcus faecalis e endocardite provocada por Corynebacterium jeikeium e a doença autoimunitária designada por lúpus eritematoso sistémico (LES).

Realizou-se a cartografia do epítopo da PCT90 humana por contraposição com a sequência derivada de aminoácidos descrita por Hickey et al.,. 1989, ‘Mol. Cell. Biol.’, 9, 2615-2626.

Pormenores Experimentais

Efectuou-se a síntese de 716 resíduos aminoácidos em pinos de polietileno, formando um conjunto completo de nonapeptidos sobrepostos, em que o péptido 1 é constituído pelos resíduos 1 a 9, o péptido 2 é constituído pelos resíduos 2 a 10, etc.. Realizou-se a síntese dos péptidos com esteres de aminoácidos protegidos com o radical Fmoc. Cada um dos pinos de polietileno foi acoplado a Fmoc-P-alanina. A seguir à desprotecção por remoção do radical Fmoc, acoplou-se o primeiro aminoácido a cada pino, conforme imposto pela sequência que se pretendia sintetizar. Foram realizadas reacções de acoplamento em que interveio o hidrobenzotriazol, de um dia para o outro, numa solução de cada aminoácido de cadeia lateral protegida com Fmoc em Ν,Ν-dimetilformamida. Os péptidos foram sintetizados por ciclos

sucessivos de desprotecção por remoção do radical Fmoc e adição de um aminoácido por pino e por dia. Depois de completada a reacção de acoplamento final e após a remoção do grupo de protecção Fmoc, acetilou-se o grupo amino terminal para se efectuar a redução da carga não natural do terminal N do péptido. Os grupos de protecção das cadeias laterais foram removidos por meio de uma mistura de ácido trifluoroacético:fenol:etanoditiol (95: 2,5: 2,5, v/w/v).

Os péptidos, ainda acoplados à superfície dos pinos, foram testados em presença dos soros, por meio de um imunoensaio enzimático (IEE). Os pinos foram previamente recobertos, durante 1 hora, em placas de microtitulação que continham 1% de ovalbumina, 1% de albumina de soro de bovino (ASB) em STP-T (soluto salino tamponado com fosfato contendo 0,1% de ‘Tween 20’). Depois efectuou-se a incubação a 4°C em soros de pacientes, (1/200) tendo esses soros sido lavados quatro vezes com STP-T e tendo a incubação sido realizada durante 1 hora com anti-imunoglobulina conjugada com peroxidase do rábano silvestre (1/1000; Sigma, Poole). A seguir a uma outra lavagem, mergulhou-se os pinos durante 30 minutos em ABTS (amino-di-3-etilbenztiazolina-6-sulfonato na concentração de 0,5 mg/mL em tampão de citrato a pH 4,0 com 0,03% de peróxido de hidrogénio) e foram realizadas medições do valor A405 num leitor de placas por meio de um IEE. A limpeza dos pinos foi realizada por acção de ultra-sons.

Considera-se que uma reacção foi específica se a leitura do valor da DO, pelo menos em três cavidades, tiver correspondido pelo menos a um valor duas vezes acima do valor espontâneo. O grande número de péptidos sintetizados serviu eficazmente como contraprova negativa em cada teste. A absorvência média destes péptidos foi fraca e serviu para definir o nível espontâneo (Geysen et ai, 1987). 8

PORMENORES SOBRE OS SOROS DE PACIENTES EXAMINADOS I.

Candidíase disseminada Número Historial 1. 2. 3. 4. 6. 7. 8. 9.

Leucemia, neutropenia, cultura sanguínea positiva à C. albicans Pós-esofagotomia, cultura sanguínea positiva a C. albicans Toxicodependente positivo aos VIH, coriorretinite provocada por Condidas Peritonite provocada por Candidas, paciente em diálise peritoneal ambulatória crónica, cultura sanguínea positiva a C. Albicans Pós-ressecção duodenal, positivo a C. albicans em dois conjuntos de culturas sanguíneas

Pré-negativo aos anticorpos, pós-positivo aos anticorpos. Positivo a C. albicans em dois grupos de culturas sanguíneas. Pós-colecistectomia Pós-esofagotomia, dreno peitoral, culturas sanguíneas positivas a C. albicans Candidíase hepatosplénica, observadas leveduras na biópsia Paciente em diálise peritoneal ambulatória crónica, peritonite, abcesso abdominal, positivo à C. albicans em dois grupos de culturas sanguíneas.

Perfil de anticorpos N° do caso Candida albicans Aspergillus fumigaíus 1. M 47, 40 KD Nada G 47,40 KD 2. M47KD 88, 84 KD (vestígios) G47KD (M+G combinadamente) 9 3. Μ 47,48 KD Nada G 47 Nada 4. M47KD Nada

G47KD 5. M47KD Nada

G47KD 6. Pré Nada Nada

Pós M 40,47KD

Pós G 40, 47KD 7. M 47 KD Nada

G47KD 8. 11/12/91 Nada Nada

17/1/92 M+G 47 KD (positivo combinadamente) 9. M 47 KD 88/84 KD (vestígios) G 47 KD (M+G combinadamente)

Comentário: A PCT90 de C. albiccms possui bandas a 92, 47 e 40 Kd (conforme descrito no documento GB 2 034 504); A PCT90 de A. fumigatns possui bandas a 88/84, 51 e 40 KD.

Os soros dos pacientes positivos aos VIH são positivos aos anticorpos contra a PCT90 das Candidas, contra a PCT90 de Pneumocystis camii e contra Aspergillus. Assim, sugere-se a utilização de anticorpos na terapia de manutenção de tais pacientes, uma vez que a perda de anticorpos nesses pacientes pode levar à ocorrência de infecções oportunistas, tais como as provocadas por Pneumocystis camii e outros organismos produtores de antigénios, isto é, as PCT90. Π. Aspergilose invasiva N°do caso Historial 10. fatal, aspergilose invasiva, leucemia aguda 11. fatal, aspergilose invasiva, leucemia aguda 12. fatal, aspergilose invasiva, leucemia aguda 13. sobrevivente, aspergilose invasiva, leucemia aguda 14. sobrevivente, aspergilose invasiva, leucemia aguda 15. sobrevivente, aspergilose invasiva, leucemia aguda

Perfil de anticorpos

N° do caso Candida albicam Aspergillus fumigatus 10 Nada Nada 11 Nada Nada 12 Nada M 88, 84KD, G 88, 84KD 13 Nada M 88, 84KD, G 88, 84KD 14 Nada M 88, 84KD, G 88, 84KD 15 Nada M 88, 84KD, G 88, 84KD ΙΠ. Aspergilose broncopulmonar alérgica N° do caso C. albicam Aspergillus fumigatus 16. Nada M 88,84KD,

Nada 17. G 88, 84KD M 88, 84KD,

G 88, 84KD 11 IV. Aspergiloma N° do caso 18. C. albicans Nada

Aspergillus fumigaius M 88, 84KD, G 88, 84KD V. Endocardite provocada por Streptococcus fàecalis 19. C. albicans M 47 KD,

G47KD

A. fumigaius 88, 51 KD O anticorpo monoclonal descrito no documento GB 2 034 504 interreage com a banda imunodominante de S. faecalis a 90 KD, tal como sucedia com o soro de coelho criado em presença deste péptido (LKVIRKNIVKKME-cis-KLH).

Trabalhos anteriores (Bumie et ai, 1985) identificaram esta banda antigénica como sendo imunodominante na endocardite provocada por S. faecalis, sugerindo tal facto que pode eventualmente constituir a base de um teste para a endocardite negativa em cultura. VI. Malária C. albicans Aspergillus fumigaius

20. M 92 KD

G47KD 51, 40 KD

Houve mais 5 casos de malária em que foram obtidas as imagens por imunotransferência em presença de extractos contendo Candidas e Aspergillus para demonstrar que possuem anticorpos que interreagem com a PCT90 fúngica. VII. Endocardite provocada por Corvnebacterium ieikeium C. albicam Aspergillus fumigatus 21. M47KD G47KD Nada Lúpus eritematoso sistémico (LES) C. albicam Aspergillus fumigatus 22. G47KD Nada 23. Nada M 88, 84KD, G 88KD 24. G 47, 92KD Nada 25. M 47KD, G 47KD Nada 26. M 40,47KD G 40, 47KD Nada 27. M 47KD, G 47KD M 88, 84, 51, 40KD G 88, 84, 51,40KD 28. Nada Nada 1

Aspergillus fimigatus Nada 29. 1 soro de contraprova, pelo que 6 soros de LES estavam no grupo experimental (ver os resultados) IX. Meningite/Septicemia provocada por C auilliermondii C. albicam M 40KD, G 40KD M 47KD, G 47KD (vestígios)

RESULTADOS CARTOGRAFIA DOS EPÍTOPOS DA PCT90 HUMANA Epítopo Posição da Sequência Reconhecida por: PCT90 humana 1. 57 KIRY 1/3 aspergilose invasiva

1/1 aspergiloma 4/6 soros de LES 2. 101 NNLGTI 7/9 candidíase disseminada 47 KDa+(incluindo o paciente com seroconversão *) 1/1 malária 1/1 meningite provocada por C. quilliermondii * paciente com seroconversão - refere-se ao paciente 6 cujo soro inicial era negativo aos anticorpos mas que ao recuperar depois da doença se comprovou ser positivo aos anticorpos. J. 4. 210 QFIGYPI 2/9 candidíase disseminada, 47 KDa + incluindo o paciente seroconvertido *) 3/3 aspergilose invasiva (sobreviventes)

1/2 aspergilose broncopulmonar alérgica 1/6 soros de LES 271 404 (100% de Candidas conservadas) KKIK 5/9 candidíase disseminada, 47 KDa + incluindo o paciente seroconvertido *) 2/3 aspergilose invasiva (sobreviventes) 3/3 aspergilose invasiva (fatal)

1/1 aspergiloma 1/4 soros de LES 1/1 endocardite provocada por 5. faecalis KILKVTRK 5/9 candidíase disseminada, incluindo o paciente seroconvertido *) 3/3 aspergilose invasiva (sobreviventes) 1/1 aspergilose invasiva (fatal, caso n° 12) 1/1 malária 5. 497 ÍSEKAV de Candidas) SKEQV 2/9 candidíase disseminada 3/3 aspergilose invasiva (sobreviventes) 1/3 aspergilose invasiva (fatal) 1/1 aspergiloma 3/6 LES 1/1 malária 549 (FELEES de Condidas) GLELPE 2/9 candidíase disseminada, incluindo o paciente seroconvertido *) 3/4 aspergilose invasiva (sobreviventes) 1/2 aspergilose broncopulmonar alérgica 1/1 aspergiloma 4/6 LES 1/1 endocardite provocada por JK 580 LGDO de Candidas) LDKK 5/9 candidíase disseminada 1/1 aspergilose invasiva 4/6 LES 1/1 malária 1/1 endocardite provocada por S. faecalis 607 WSANde Candidas) WATN 2/9 candidíase disseminada, incluindo o paciente seroconvertido *) 3/3 aspergilose invasiva (sobreviventes) 1/1 aspergiloma 1/1 malária 1/1 endocardite provocada por S. faecalis 625 (TTMSSY de Candidas) NSTMGY 5/9 candidíase disseminada, incluindo o paciente seroconvertido *) 3/3 aspergilose invasiva (sobreviventes) 1/3 aspergilose invasiva (fatal) 1/1 malária 1/1 endocardite provocada por S. faecalis 11. 15

11. 15 642 PIVET 2/3 aspergilose invasiva (ΡΠΚΕ de 2/2 aspergilose broncopulmonar alérgica Cândidos) 3/6 LES 655 KNDK 4/9 candidíase disseminada, incluindo o paciente (AEDKde seroconvertido *) Cândidos) 3/3 aspergilose invasiva (sobreviventes) 2/3 aspergilose invasiva (fatal) 2/2 aspergilose broncopulmonar alérgica 1/1 aspergiloma 5/6 LES 12.

Conclusão: os epítopos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 11 e 12 produziram uma resposta positiva nos soros de pacientes com LES, isto é, cada epítopo reconheceu um anticorpo autoimunitário, podendo ser classificados como domínios de autoanticorpos.

Admite-se que os epítopos 2, 5, 9 e 10 sejam específicos de fungos, sendo o epítopo 2 um epítopo candídico potencial e sendo o epítopo 9 um epítopo potencial específico da aspergilose. Além disso, os epítopos 2, 5, 9 e 10 podem ser elegíveis como epítopos potenciais maláricos e os epítopos 9 e 10 podem ser epítopos potenciais de S. faecalis. EXEMPLO 2

Utilizou-se o péptido LKVIRKNrVKKMIE-cis para gerar os soros monoclonais utilizados no documento GB 2 034 504. No entanto, é desconhecida a imunogenicidade pormenorizada deste péptido. Foi decidido efectuar uma investigação, substituindo cada um dos aminoácidos do péptido anterior para observar o efeito, no caso de haver algum, sobre a imunogenicidade.

Em primeiro lugar, efectuou-se a síntese dos péptidos necessários, utilizando técnicas convencionais, e mediu-se a sua imunogenicidade, utilizando os soros de seres humanos que 16 continham o anticorpo monoclonal descrito antes. Também foi decidido examinar um epítopo maior, designadamente o NKILK\fiRKNTV.

Os protocolos praticados e as concentrações de anticorpos foram iguais aos do exemplo 1 descrito antes. Péptidos estudados

Péptido 1 LKVIRKNIV

estudadas as alterações em LKVIRK Péptido 2 NKILKVIRK

estudadas as alterações em KILK Péptido 3 LKVIRKNTV

estudadas as alterações em KNTV

Assim, na sequência total, foram examinadas as alterações

N K I L R V I R KN I V Péptido

Soros experimentados 1. Monoclonal específico para LKVIRKNTVKKMIE-cis contra os péptidos 1 e 2 2. Soros humanos

Paciente N° Soros Diagnóstico 2 um só pós-esofagotomia, cultura sanguínea positiva a C. albicans 6 um para pós-colecistectomia, cultura sanguínea positiva a C. albicans em dois grupos de culturas sanguíneas 17

30 um para Neutropenia, leucemia, cultura sanguínea positiva a C. tropicalis em três grupos de culturas sanguíneas 31 um para Neutropenia, leucemia, cultura sanguínea positiva a C. parapsilosis em dois grupos de culturas sanguíneas 16 um para Sobrevivente, aspergjlose invasiva, leucemia aguda 33 um só Malária provocada por P. vivax 34 um só Malária provocada por P. falciparum 35 um só Malária provocada por P. falciparum 20 um só Malária provocada por P. vivax 24 um só LES a um par significa que havia um soro inicial que era negativo aos anticorpos quando comparado com um segundo soro positivo aos anticoipos.

PERFIS DE ANTICORPOS

Paciente N° C. albicans A. fumizatus 2 M47KD M/G 88, 84KD (vestígios) G47KD (combinadamente) 6 pós-soro M 40, 47KD G 40, 47KD Nada 30 pós-soro M47KD G47KD Nada 31 pós-soro M47KD G47KD G40KD 16 Nada M 88, 84KD G 88, 84KJD 33 M47KD, G47KD Nada 34 M 92, 47KD, G47KD G88KD

18 35 M47KD Nada 20 M92KD, G47KD G51,40KD 24 G47KD Nada Resultados:

1. Monoclonal específico para LKVIRXMVKKMIE - cis Péptido 1 - LKVIRKNrV

Valores de EISLE (o mesmo que ELISA) medidos aos 30 minutos, diluição dos anticorpos 1:200.

Contraprova de EISLE LKVIRKNrV, valor médio da DO = 0,923 (contraprovas)

Aminoácido substituído L K V I R K (DO resultante) A 0,875 1,102 0,594 0,526 0,111 0,132 C 0,849 0,797 0,527 0,324 0,125 0,119 D 0,909 1,208 0,730 0,195 0,126 0,138 E 1,005 1,183 1,021 0,977 0,141 0,135 F 1,052 0,760 0,512 0,483 0,116 0,108 G 0,054 1,016 0,525 0,161 0,131 0,133 H 0,798 0,926 0,905 0,454 0,107 0,190 I 1,021 0,714 0,491 contraprova 0,117 0,12 K 0,392 contraprova 0,881 0,486 0,092 contraprova L contraprova 0,946 0,673 0,659 0,122 0,114 M 0,836 1,075 0,508 0,715 0,118 0,364 N 0,764 1,223 0,769 0,306 0,124 0,137 P 0,77 0,662 0,612 0,489 0,095 0,132

19 Q 0,656 1,073 0,813 0,602 0,120 0,231 R 0,668 1,032 0,657 0,538 contraprova 0,591 S 0,500 1,026 0,620 0,434 0,121 0,146 T 0,693 0,944 0,740 0,760 0,127 0,139 V 0,788 0,799 contraprova 0,977 0,126 0,124 w 1,022 0,991 1,082 0,895 0,104 0,115 Y 0,584 1,007 1,196 0,788 0,110 0,119 (L) (K) (V) 0) (R) (K)

Estes resultados mostram a importância dos aminoácidos IRK, sendo os aminoácidos RK insubstituíveis, em que a ligação dos anticorpos é desprezável perante a substituição destes aminoácidos.

Péptido 3 - LKVIRKNrV

Valores de EISLE medidos aos 30 minutos, diluição dos anticorpos 1:200.

Contraprova de EISLE LKVTRKNIV, valor médio da DO = 0,842 K N I V A 0,101 0,615 0,109 0,134 C 0,105 0,196 0,122 0,148 D 0,100 0,344 0,100 0,120 G 0,102 0,446 0,101 0,113 F 0,101 0,166 0,142 0,456 G 0,099 0,331 0,100 0,124 H 0,107 0,655 0,114 0,123 I 0,100 0,169 contraprova 0,938 K contraprova 0,746 0,095 0,136 L 0,103 0,248 0,268 0,831 M 0,099 0,630 0,283 0,430 20 N 0,101 contraprova 0,103 0,107 P 0,101 0,247 0,107 0,095 Q 0,103 0,596 0,103 0,112 R 0,192 0,819 0,105 0,121 S 0,104 0,942 0,127 0,128 T 0,101 0,691 0,181 0,227 V 0,100 0,210 0,765 contraprova W 0,098 0,139 0,106 0,123 Y 0,102 0,145 0,107 0,105

Estes resultados mostram a importância dos aminoácidos KNTV. O epítopo total é IR K NIV, sendo virtualmente impossível substituir os aminoácidos sublinhados. 2. Soros humanos

Em todos os ensaios de EISLE realizados teve lugar a combinação de IgM e de IgG aos 30 minutos. Diluição dos anticorpos 1:200. 21 21 Péptido 1 N°do valores médios paciente nos EISLE 2 1,01 6 pré 0,1 pós 0,501 30 pré 0,22 pós 0,752 31 pré 0,1 pós 0,648 16 pré 0,347 pós 0,647 33 1,18 34a 0,6 35 1,24 20 1,3 24 0,379 Número de aminoácidos que originam uma redução para um máximo de 70% de controlo L K V I R K 14 4 14 16 5 8 não aplicável 16 9 16 15 4 3 não aplicável 9 0 11 15 2 1 não aplicável 14 0 15 17 4 0 não aplicável 10 2 17 6 l 12 12 0 6 8 2 7 10 1 8 12 2 0 15 2 0 6 0 0 7 2 2 8 1 1 não aplicável a soro examinado com uma diluição de 1:1000.

No caso das leituras dos EISLE corresponderem a valores inferiores a 0,4, considerou--se que estes resultados não eram aplicáveis, pois tais valores são da ordem de grandeza do valor natural ou espontâneo.

Péptido 2 N° do valores Número de aminoácidos que originam uma redução para paciente médios nos máximo de 70% de controlo EISLE K I L K 2 1,37 8 19 19 8 6 pré 0,10 não aplicável pós 0,33 não aplicável 30 pré 0,22 não aplicável - pós 0,62 10 18 17 1 31 pré 0,11 não aplicável pós 0,58 10 18 17 1 16 pré 0,3115 não aplicável pós 0,531 2 17 14 13 33 7 16 12 2 34a 0,47 4 17 16 2 35 1,36 10 18 17 20 1,2 8 16 16 2 24 0,32 não aplicável a soro examinado com uma diluição de 1:1000.

No caso das leituras dos EISLE corresponderem a valores inferiores a 0,4, considerou- -se que estes resultados não eram aplicáveis. 23 Péptido 3 N° do valores Número de aminoácidos que originam uma redução para paciente médios nos máximo de 70% de controlo EISLE K N I V 2 0,89 0 0 0 0 6 pré 0,01 não aplicável pós 0,438 0 0 0 0 30 pré 0,2 não aplicável - pós 0,52 0 0 3 o J 31 pré 0,35 não aplicável pós 0,66 0 1 9 4 16 pré 0,3 não aplicável pós 0,59 3 8 15 11 33 1,03 1 13 11 7 34a 0,566 3 15 14 12 35 1,437 0 8 10 n J 20 1,18 8 14 15 15 24 0,37 não aplicável a soro examinado com uma diluição de 1:1000.

No caso das leituras dos EISLE corresponderem a valores inferiores a 0,4, considerou--se que estes resultados não eram aplicáveis. EXEMPLO 3

Preparou-se um banco de genes de cadeias variáveis (V) pesadas e leves de imuno-globulina a partir de linfócitos do sangue periférico de um paciente que havia recuperado de candidíase sistémica. Esse banco foi enriquecido e nele foi pesquisada a actividade de 24 LKVIRKNTVKKMIE e NK.ILKVTRKNIVKK, tendo os anticorpos recombinantes humanos resultantes sido examinados para pesquisa da sua acdvidade terapêutica no modelo de candidíase sistémica em murganhos.

Pormenores Experimentais O banco de genes foi produzido essencialmente conforme descrito por Marks et ai (J. Mol Biol 1991; 222: 581-597), utilizando para tal o vector pCANTAB 5 que se encontra presentemente disponível nos circuitos comerciais como parte de um estojo produzido por Pharmacia (Milton Keynes, Reino Unido). Os genes de cadeia variável (V) pesada e leve, obtidos a partir de ADNc preparado a partir do ARNm dos linfócitos do sangue periférico de um paciente a recuperar de candidíase sistémica, foram combinados aleatoriamente e subclonados dentro do pCANTAB 5 digerido com Not I/Sfi I. Os fragmentos Fv de cadeia singular resultantes (FvCs, o mesmo que ScFv) expressos sobre a superfície do fago, foram enriquecidos procurando entre epítopos de péptidos sintéticos específicos, incluindo o LKVIRKNTVKKMIE e o NKLKVIRKNIVKK. Recorreu-se à obtenção de imagens por imunotransferência (ver o exemplo 4) para identificar cada um dos clones com actividade contra o antigénio de 47 kD de Candida albicans. Foram seleccionados dois anticorpos recombinantes fortemente positivos para estudo posterior: ο A2 (conseguido em presença de LKXTRKNIVKKMIE) e ο B3 (conseguido em presença de NKILKVÍRKNIVKK).

Injectou-se fêmeas de murganho da estirpe Balb/c por via intravenosa com uma dose letal de Candida albicans. Foram estudados dois grupos etários diferentes: fêmeas de murganho adultas com uma massa corporal de cerca de 20 kg (experiências 1 e 2) e fêmeas de murganho jovens com uma massa corporal com cerca de 12 g. Foram examinados dois lotes 25 diferentes de anticorpos B recombinantes humanos (experiência n° 1 em contraposição às experiências n- 2 e 3). Na experiência n° 1 comparou-se este anticorpo recombinante com o anticorpo A recombinante humano e com o bacteriófago auxiliar M13 K07, tendo sido administrados 20 pL de soluto salino, bacteriófago Ml3 K07 ou anticoipo recombinante humano aproximadamente 2 horas após o estímulo por via i.v. com Ccmdidas. Nas experiências 2 e 3 administrou-se 100 pL de soluto salino ou de anticorpo B3 decorrida 1 hora após o estímulo por via i.v. com Condidas.

Resultados

Exp, n° UFC peso médio dos Grupo de tratamento (n° de % de mortalidade às 24 h murganhos (g) murganhos) (ausência de mortes) 1 108 21 ±3 g soluto salino (11) 73% (8) 9 9 9 9 M13K07 (17) 76% (13) 9 9 99 A (16) 94% (15) 9 9 99 B (10) 10% (D 2 107 19±2g soluto salino (10) 40% (4) 9 9 99 B (10) 10% (1) 3 108 12 ±2 g soluto salino (16) 25% (4) 99 99 B (16) 0% (0)

Comentário

As fêmeas de murganho mais jovens pareceram ser relativamente resistentes a Candida albicans (ocorre uma situação análoga com os seres humanos). O anticorpo B recombinante humano comprovou repetidamente que possuía actividade terapêutica contra as Candidas - ao contrário do anticoipo A recombinante humano. 26 EXEMPLO 4

Procedeu-se a um estudo dos anticorpos B3 e A2 recombinantes humanos para pesquisar a sua interreactividade em presença de Slreptococcus faecalis e Corynebacterium jeikeium.

Pormenores Experimentais

Foram obtidas imagens por imunotransferência de Candida albicans, Corynebacterium jeikeium e Slreptococcus faecalis, conforme descrito em trabalhos anteriores (Matthews, Epidemiol. Infect. 1991; 1Ό7: 273-283; Bumie et ai, J. Clin. Path. 1987; 40: 1149-1158). Os locais de ligação livres nas proteínas foram bloqueados com albumina de soro de bovino (ASB) antes de se realizar a incubação de cada autorradiografia com a suspensão de fagos (B3 ou A2) durante 2 horas à temperatura ambiente, sob agitação suave. Depois efectuou-se a lavagem 5 vezes durante 30 minutos em soluto salino contendo 0,05% de ‘Tween 20’ e realizou-se a incubação durante 90 minutos com o anticorpo anti-M13 (encontra-se comercialmente disponível e pode ser adquirido em 5’-3’, Inc. Boulder, E.U.A.), diluído a 1:1000 em ASB a 3%. Repetiu-se a lavagem e depois realizou-se a incubação com um anti--anticorpo de cabra conjugado com fosfatase alcalina (diluído a 1:1000), fornecido por ‘Sigma’, durante 1 hora. Repetiu-se a lavagem e depois procedeu-se à revelação das autorradiografias com o substrato de cor ‘BCIP NBT’, conforme descrito em trabalhos anteriores (Matthews 1991). j

Resultados O anticorpo B3, e com menor intensidade o anticorpo A2, interreagiram com Streptococcus faecalis e Corynebacterium jeikeium e também com Candida albicans. Foram obtidas diversas bandas. No caso de S. faecalis estavam a cerca de 112 kD, 88-90 kD e 32 kD. No caso de C. 27

13 jeikeium as bandas estavam a cerca de 160 kD, 52 kD, 47 kD e 40 kD. No caso de C. albicans surgiu uma banda distinta a 47 kD.

Comentários

Os anticorpos B3 e A2 recombinantes humanos interreagiram com S. faecalis e C. jeikeium e podem ter um potencial terapêutico contra estas e outras bactérias Gram-positivas. EXEMPLO 5

Ensaio de imunoligação - pingos.

Materiais e métodos

Aplicou-se 1 pL de soro humano, em pingos, sobre uma membrana de nitrocelulose (Biorad Laboratories, Califórnia). Deixou-se os pingos secar durante 10 minutos. A seguir bloqueou-se durante 1 hora a 37°C com albumina de soro de bovino a 3% em soluto salino tamponada com Tris a pH 7,5. Depois de efectuada a lavagem em soluto salino a 0,9% (peso/ /volume) contendo 0,05% de ‘Tween 80’, cinco vezes durante 5 minutos, efectuou-se a incubação durante 1 hora à temperatura ambiente com o anticorpo B3 recombinante humano diluído a 1 para 5. A seguir efectuou-se a lavagem durante 30 minutos, conforme descrito antes, e realizou-se nova incubação com o anti-M 13 conjugado com peroxidase do rábano silvestre (Pharmacia Ltd.), diluído a 1 para 5 000 em albumina de soro de bovino a 3% em soluto salino tamponado com Tris. Após a nova lavagem efectuou-se a revelação com o substrato de 3-amino-9-etilcarbazol (0,67 mL de uma solução de 0,4 g de 3-amino-9-etil-carbazol/100 mL da dimetilformamida em 10 mL de acetato de sódio 0,1 M (pH 5,2)). Activou--se então com 10 pL de H202. H202 a 30%. Efectuou-se a incubação do material da mancha 28 obtida, durante 30 minutos, e lavou-se. Procedeu-se a uma comparação de resultados com uma contraprova positiva de 1 pL de prensado candídico (100 mg/mL) e classificou-se com os graus de negativo (nada), fiacamente positivo (vestígios) e positivo (equivalente ao resultado obtido com o extracto candídico).

Ensaio de Imunoligação com Anticorpos Recombinantes - pingos Resultados

Soros de contraprova (soros de pacientes sem nenhuns sinais de Candidas disseminadas ou orais, quer com leucemia quer após uma cirurgiã importante gastrointestinal). Título Nada Vestígios Positivo N° de soros 79 2 Nenhum

Os dois pacientes com vestígios positivos eram provenientes de um grupo de 5 com uma septicémia subjacente provocada por Corymbacterium jeikeium.

Pacientes colonizados (soros de pacientes com um local colonizado, quer por via oral, ferimento, vaginal, intravenosa ou urina). Título Nada Vestígios Positivo

Oral 6 1

Lesão 1

Vaginal 1

Intravenosa

Urina 2 a

Inclui um caso de colonização com C. parapsiliosis b

Tratamento necessário com anfotericina B. 29

Pacientes sistémicos

Definidos em alternativa como (1) dois grupos de culturas sanguíneas positivas de amostras colhidas com um intervalo de 24 horas, pelo menos, em dois locais intravenosos diferentes ou então (2) provas em cultura e histopatológicas obtidas post mortem.

Cada paciente é classificado em função do título máximo em antigénios, se houver um conjunto de amostras disponíveis. Título máximo detectado em antigénios

Levedura causadora Nenhuma Vestígios Positivo

Candida tropicallis 1 1 1 1

Torulupsis glabrata Ccmdida parapsilosis

Candida albicans 2 3 17

Comentários O antigénio detectado pela imunoligação dos pingos, com o anticorpo recombinante B3, permitiu efectuar a distinção entre os soros de contraprova e os soros de pacientes colonizados e os soros de pacientes com candidíase sistémica.

CONCLUSÕES

No que diz respeito aos epítopos de proteínas do choque térmico: 7% 30 os aminoácidos adiante sublinhados são vitais, isto é, insubstituíveis, para a função do epítopo como imunogénio; além disso, os soros de pacientes com diferentes doenças produziram anticorpos que reconhecem moderadamente diferentes aminoácidos no mesmo epítopo.

Caso 24: um paciente com LES serviu de contraprova positiva mas, embora o soro deste paciente fosse positivo relativamente à proteína de 47 KD candídica, não reconheceu nenhum dos três péptidos do epítopo da presente invenção.

Epítopo monoclonal L K V I R K N I V Epítopo de C. albicans caso 2 NK1LKV1RKN I V caso 6 NKILKVIRKN I V C. tropicalis caso 30 NKILKVIRKN I V C. parapsilosis caso 31 NKILKVIRKN I V A.jumigatus caso 16 NKILKVIRKN I V Malária: vivax caso 33 NKILKVIRKN I V caso 20 NKILKVIRKN I V falciparum caso 34 NKILKVIRKN I V caso 35 NKILKVIRKN I V 0 anticorpo monoclonal descrito no documento GB 2 034 504 reage com um epítopo que apenas representa uma parte do epítopo para a infecção com leveduras (C. albicans/ /C. tropicalis/C. parapsilosis). As infecções provocadas por C. tropicalis, A. fumigatus e pelo microrganismo da malária são mais imunorreactivas ao epítopo KILK. As infecções devidas ao microrganismo da malária e a A. fiimigatus também reconhecem um epítopo que contem NTV. 31

Assim, é possível produzir um anticorpo mais activo que reconheça as proteínas do stress produzidas num conjunto mais vasto de doenças do que as descritas no documento GB 2 034 504, contra o epítopo NKILKVIRKNIV (isto é, o anticorpo B3). Respeitantes ao anticorpos contra os epítopos da proteína do choque térmico: os dados obtidos demonstram que os anticorpos criados em presença de X X X L X V I R K X I V e/ou X X I L X V I X X X X X,em que o símbolo X designa um aminoácido qualquer, em particular os anticorpos recombinantes humanos, conferem protecção contra a candidíase sistémica em modelos com murganhos.

Lisboa, 28 de Abril de 2000

J

[ff O Agente Oficia! da Propriedade industrial

JOSÉ BE SAMPAIO Α.Ο.ΡΧ· Rua do Salitre, 195, F/c-Brt 125« LISBOA

Claims (9)

1 Reivindicações 1. Péptido idêntico a um epítopo que possui a sequência de aminoácidos NKJLKVIRKNÍV.

2. Péptido de acordo com a reivindicação 1, o qual é também caracterizado pelo facto de interreagir com um anticorpo criado contra a PCT90 (o mesmo que HSP90) de Candida albicans, C. tropicallis ou C. parapsilosis, Aspergillus fumigatus, Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum.

3. Péptido de acordo com a reivindicação 2, em que a PCT90 candídica é uma proteína do stress de 92 KDa e/ou 47 KDa.

4. Péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3, em que a PCT90 de Aspergillus compreende uma proteína do stress de 40 KDa, 51 KDa e/ou 88/84 KDa.

5. Péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, utilizável num teste de diagnóstico para detectar uma infecção parasítica ou fúngica.

6. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 5, para a produção de um teste de diagnóstico para a PCT90 de Candida albicans, C. tropicallis ou C. parapsilosis, Aspergillus fumigatus, Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum.

7. Péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 ou 6, em que o teste de diagnóstico é um ensaio de imunotransferência de pingos para uma matriz, um radio-imunoensaio ou um ensaio de aglutinação de látex. 2

8. Péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, utilizável para o tratamento de um estado patológico em que sejam produzidas proteínas do síress.

9. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 8, para a produção de um medicamento contra a malária. Lisboa, 28 de Abril de 2000 O Agenfo Oficia! da Propriedade industriai

A.Q.P.I. Rua do Salitre, 195, r/e-Drí. 1250 LISBOA A 1 Resumo “Epítopos de proteínas do stress” A invenção descreve um epítopo funcional que é purificado a partir da PCT90 (o mesmo que HSP90) humana ou que é sintetizado de modo a corresponder a esse epítopo purificado, sendo tal epítopo, se purificado, inalterado ou alterado por substituição de aminoácidos seleccionados, e o qual é idêntico, se sintetizado, a um epítopo purificado ou diferente de um epítopo purificado por substituição de aminoácidos seleccionados e o qual interreage com um anticorpo criado contra uma proteína do stress. Lisboa, 28 de Abril de 2000

1250 L5SBOA