JP4384489B2 - 癌及び感染性疾患の治療に有用な熱ショックタンパク質又はα−２−マクログロブリンを含む組成物の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、米国特許仮出願第６０／３１３，６２９号（２００１年８月２０日出願）、第６０／３７７，２２２号（２００１年１２月６日出願の優先権を主張するものであり、これらの全文が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた助成金番号ＣＡ／Ａ１８４４７９の下での合衆国政府の支援に基づいて為された。政府は本発明において一定の権利を有する。

１．序論
本発明は、感染性疾患、並びに原発性及び転移性の腫瘍性疾患の予防及び治療のための方法及び組成物に関する。感染性疾患及び癌の予防及び治療の実施においては、抗原性細胞及び／又はその消化産物からのサイトゾル及び膜由来タンパク質を含む組成物を、熱ショックタンパク質及び／又はα−２−マクログロブリンと複合体化し、腫瘍及び感染因子に対する免疫応答を増強する。

２．本発明の背景
２．１．熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、ストレスタンパク質とも呼ばれており、初めは、細胞が熱ショックに応答して合成するタンパク質として同定されたものである。ＨＳＰは分子量に基づいて５つのファミリーに分類されており、ＨＳＰ１００、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０及びｓｍＨＳＰがある。その後、これらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが見出された（Welch, May 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Craig, 1993, Science 260:1902-1903; Gethingら, 1992, Nature 355:33-45; 及びLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677を参照のこと）。

熱ショックや他の生理的ストレスに対する細胞性応答の研究から、ＨＳＰはこうした不利な状態から細胞を保護することに関わっているだけでなく、ストレスを受けていない細胞においても必須の生化学的及び免疫学的プロセスに関係していることが明らかにされた。例えば、ＨＳＰ７０ファミリーのメンバーは、細胞質、核、ミトコンドリア、又は小胞体に存在し（Lindquist ら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677）、免疫系の細胞への抗原提示に関与しており、さらに、正常細胞においてはタンパク質の輸送、折りたたみ及び組み立てにも関係している。ＨＳＰはタンパク質又はペプチドと結合し、その結合したタンパク質又はペプチドをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下又は酸性条件下で放出することができる（Udono及びSrivastava, 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396）。

Srivastavaらは、メチルコラントレンで誘発させた近交マウスの肉腫に対する免疫応答を実証した（1988, Immunol. Today 9:78-83）。これらの研究において、これらの腫瘍の個々に異なる免疫原性に応答可能な分子は９６ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ９６）と８４〜８６ｋＤａの細胞内タンパク質であることが判った（Srivastavaら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3407-3411; Ullrichら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3121-3125）。特定の腫瘍から単離されたｇｐ９６又はｐ８４／８６でマウスを免疫すると、マウスはその特定の腫瘍に対して免疫性となるが、抗原として区別される腫瘍に対しては免疫されない。ｇｐ９６及びｐ８４／８６をコードする遺伝子を単離して特性決定を行ったところ、それらの間には有意な相同性が見られ、しかもｇｐ９６とｐ８４／８６は同一の熱ショックタンパク質のそれぞれ小胞体とサイトゾルにある同等物であることが示された（Srivastavaら, 1988, Immunogenetics 28:205-207; Srivastavaら, 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109-123）。さらに、ＨＳＰ７０はそれが単離された腫瘍に対する免疫を誘導するが、抗原として異なった腫瘍に対しては免疫を誘導しないことが示された。しかしながら、ペプチドを枯渇させたＨＳＰ７０はその免疫原活性を失うことが見出された（Udono及びSrivastava, 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396）。これらの観察から、熱ショックタンパク質はそれ自体に免疫原性があるのではなく、抗原ペプチドと非共有結合による複合体を形成して、その複合体が抗原ペプチドに特異的な免疫を引き出すことができることが示唆された（Srivastava, 1993, Adv. Cancer Res. 62:153-177; Udonoら, 1994, J. Immunol., 152:5398-5403; Sutoら, 1995, Science, 269:1585-1588）。

ＨＳＰとペプチドとの非共有結合による複合体（癌細胞から精製されたもの）は、癌の治療及び予防に使用することができ、１９９６年４月１１日付けのＰＣＴ国際公開第９６／１０４１１号及び１９９７年３月２０日付けの国際公開第９７／１０００１号（それぞれ、１９９８年４月１２日発行の米国特許第５，７５０，１１９号及び１９９８年１１月１７日発行の米国特許第５，８３７，２５１号；これらの各特許は参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されている。ＨＳＰ−ペプチド複合体の（例えば、病原体に感染した細胞からの）単離及び精製も記載されており、これらはウイルスのような病原体や細菌、原生動物、真菌、寄生虫などの他の細胞内病原体が引き起こす感染症の治療及び予防に使用されている（例えば、１９９５年９月２１日付けのＰＣＴ国際公開第９５／２４９２３号を参照のこと）。また、免疫原性のあるストレスタンパク質−抗原複合体は、ストレスタンパク質と抗原ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体化によっても調製することができ、そのような複合体を癌や感染症の治療及び予防に使用することは、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１００００号（２０００年２月２９日発行の米国特許第６，０３０，６１８号）に記載されている。養子免疫療法で使用するために抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作するためのストレスタンパク質−抗原複合体の使用は、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開第９７／１０００２号に記載されている（１９９９年１１月１６日発行の米国特許第５，９８５，２７０号も参照のこと）。

２．２．α（２）マクログロブリン
αマクログロブリンは、補体成分であるＣ３、Ｃ４及びＣ５をも含む構造的に関連したタンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ヒト血漿タンパク質α（２）マクログロブリン（α２Ｍ）は、主にプロテイナーゼインヒビター並びに血漿性及び炎症性液性プロテイナーゼスカベンジャー分子として知られている７２０ｋＤａのホモ四量体タンパク質である（総説としては、Chu及びPizzo, 1994, Lab. Invest. 71: 792を参照されたい）。α２Ｍは１４７４アミノ酸残基を有する前駆体として合成される。シグナル配列として機能する最初の２３個のアミノ酸が切り離されて１４５１アミノ酸残基の成熟タンパク質となる（Kanら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 2282-2286）。

α２Ｍは求核性アミノ酸側鎖を有するタンパク質及びペプチドに共有結合により無差別に結合し（Chuら, 1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737: 291-307）、それらをα２Ｍ受容体（α２ＭＲ）を発現する細胞に標的化する（Chu及びPizzo, 1993, J. Immunol. 150: 48）。α２Ｍのα２Ｍ受容体への結合はα２Ｍのカルボキシ末端部分により仲介され（Holtetら, 1994, FEBS Lett. 344: 242-246）、その重要な残基が特定されている（Nielsenら, 1996, J. Biol. Chem. 271: 12909-12912）。

プロテイナーゼ活性の阻害について一般的に知られているように、α２Ｍは複数の結合部位で種々のプロテアーゼに結合する（例えばHallら, 1981, Biochem. Biophys. Res. Commum. 100(1): 8-16を参照されたい）。α２Ｍとプロテアーゼが相互作用すると、トランスフォーメーションと呼ばれる複雑な構造的再編成がおこる。これは、プロテイナーゼがチオエステルによって「トラップ」された後に、α２Ｍの「ベイト（bait; おとり）」領域内において開裂が起こる結果である。当該コンホメーション変化により受容体結合に必要な残基が露出し、α２Ｍプロテイナーゼ複合体がα２ＭＲに結合することが可能になる。メチルアミンは、プロテイナーゼにより誘導されたのと同様のコンホメーション変化と開裂を引き起こすことができる。本受容体に認識されないα２Ｍの未開裂の形態のものは、しばしば「遅延型」形態（ｓ−α２Ｍ）と称される。開裂した形態は「急速型」形態（ｆ−α２Ｍ）と称される（Chuら, 1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737: 291-307に概説されている）。最近、α２ＭＲがＨＳＰ（例えばｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０及びカルレティキュリンなど）に結合しうることが示されている（Basuら、2001, Immunity 14(3):303-13）。

プロテイナーゼ阻害機能のほかに、α２Ｍは、抗原と複合体を形成したときに、マクロファージのような抗原提示細胞に取り込まれてＴ細胞ハイブリドーマに提示されるその抗原の能力をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて最大で２桁高め（Chu及びPizzo, 1994, Lab. Invest. 71: 792）、Ｔ細胞の増殖を誘導することができる（Osadaら, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 26-31）ことが、研究により明らかになっている。更なる証拠により、α２Ｍと抗原との複合体形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて粗脾臓細胞による抗体産生を高め（Osadaら, 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150: 883）、実験用ウサギ（Chuら, 1994, J. Immunol. 152: 1538-1545）及びマウス（Mitsudaら, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101: 1326-1331）でのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体反応を誘起することが示唆されている。α２Ｍ−抗原ペプチド複合体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞傷害性Ｔ細胞の応答を誘導することも示されている（Binderら、2001, J.Immunol. 166:4698-49720）。

３．発明の概要
本発明は、癌及び感染性疾患の予防及び治療に有用な抗原タンパク質及びペプチドと、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）又はα−２−マクログロブリン（α２Ｍ）との複合体の製造方法を包含する。

一実施形態において、本発明は、ＨＳＰと、抗原性細胞又はウイルス粒子の集団抗原タンパク質との複合体の製造方法を提供する。この方法は、抗原性細胞又はウイルス粒子に由来する抗原タンパク質の集団を、１つ以上の異なる熱ショックタンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化することを含み、ここで該集団は、抗原性細胞若しくはウイルス粒子中に存在するか又は抗原性細胞の細胞画分に存在する少なくとも５０％の異なるタンパク質又は少なくとも５０種の異なるタンパク質を含む。別の実施形態において本方法は、タンパク質調製物中のタンパク質が熱ショックタンパク質と複合体化するような条件下で、タンパク質調製物をｉｎ ｖｉｔｒｏで１つ以上の異なる熱ショックタンパク質と接触させることを含む。

さらに別の実施形態において、本発明は、ＨＳＰと、抗原性細胞又はウイルス粒子の抗原ペプチドの集団とを含む複合体を提供し、ここで抗原ペプチドの集団は、抗原性細胞、その細胞画分、又はウイルス粒子のタンパク質調製物を、１つのプロテアーゼ又は複数の異なるプロテアーゼで別々に消化することを含む方法により生成されたものである。抗原ペプチドの集団はまた、抗原性細胞、その細胞画分、又はウイルス粒子のタンパク質調製物を、ＡＴＰ、塩酸グアニジン、及び／又はタンパク質調製物中に存在するタンパク質複合体から抗原ペプチドを溶出するのに十分な酸性条件に暴露することにより生成されたものであってもよい。いずれか又は両方の方法により生成される抗原ペプチドは、１つ以上の異なるＨＳＰとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化される。

さらに別の実施形態において本発明は、α２Ｍと、抗原性細胞の抗原タンパク質の集団との複合体の製造方法を提供する。この方法は、抗原性細胞又はウイルス粒子に由来する抗原タンパク質の集団をα２Ｍとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化することを含み、ここで該集団は、抗原性細胞若しくはウイルス粒子中に存在するか又は抗原性細胞の細胞画分に存在する少なくとも５０％の異なるタンパク質又は少なくとも１００種の異なるタンパク質を含む。別の実施形態において、本方法は、タンパク質調製物中のタンパク質がα２Ｍと複合体化するような条件下で、タンパク質調製物をｉｎ ｖｉｔｒｏでα２Ｍと接触させることを含む。

さらに別の実施形態において、本発明は、α２Ｍと、抗原性細胞又はウイルス粒子の抗原ペプチドの集団とを含む複合体を提供し、ここで抗原ペプチドの集団は、抗原性細胞、その細胞画分、又はウイルス粒子のタンパク質調製物を、１つのプロテアーゼ又は複数の異なるプロテアーゼで別々に消化することを含む方法により生成されたものである。抗原ペプチドの集団はまた、抗原性細胞、その細胞画分、又はウイルス粒子のタンパク質調製物を、ＡＴＰ、塩酸グアニジン、及び／又は酸性条件に暴露することにより生成されたものである。いずれか又は両方の方法により生成される抗原ペプチドは、α２Ｍとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化される。

種々の実施形態において、抗原性細胞は、癌細胞、又は病原体若しくは感染因子に感染した細胞とすることができ、好ましくはヒト細胞である。抗原性細胞はまた、病原体若しくは感染因子又はこれらの変異体の細胞でもよい。抗原性細胞のタンパク質調製物は、サイトゾルタンパク質のみ、膜由来タンパク質のみ、又はサイトゾルタンパク質と膜由来タンパク質の両方を含む。タンパク質調製物は、粗未分画細胞溶解物でもよい。具体的な実施形態において、タンパク質調製物は、当該分野で公知の方法により抗原性細胞を溶解し、細胞破片と非タンパク質物質を除去し、場合によりタンパク質を精製することにより生成することができる。特定の実施形態において、タンパク質調製物は、抗原性細胞中の他のタンパク質から１つ以上の特定のタンパク質を選択的に取り出す又は保持する調製方法が行なわれていないものである。

特定の実施形態において、抗原性細胞、その細胞画分又はウイルス粒子のタンパク質調製物は、特に限定されないが、トリプシン、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ（プロテアーゼＶ８としても知られている）、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＧ、サーモリシン、エラスターゼ、及びパパインのような種々のプロテアーゼにより、酵素反応に適した条件下で消化することができる。消化の程度は、試料を取り、ペプチドの長さを測定するための公知の方法によりこれを分析することによりモニターすることができる。消化ステップは、得られる抗原ペプチドを含むペプチドの集団が、約７アミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基の平均サイズを有するような条件下で行うことが好ましい。また、タンパク質調製物から、タンパク質調製物のアリコートを異なるプロテアーゼを用いて消化することにより、異なるペプチドの集団を生成することも好ましい。異なる消化物から生じるペプチドは、ＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化する前に一緒にされうる。抗原ペプチドを含むペプチドの集団をＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化する前に、ペプチドの集団からプロテアーゼを不活性化又は分離し、場合によりペプチドの集団を精製することが好ましいこともある。

特定の実施形態において、抗原性細胞、その細胞画分、又はウイルス粒子のタンパク質調製物は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、塩酸グアニジン、及び／又は、ＨＳＰ複合体を最初に単離する必要なく抗原ペプチドを溶出できるような酸性条件と接触される。この方法で溶出される抗原ペプチドは、ＨＳＰ及びＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子に内因性に結合したペプチドを含む。

本発明の種々の実施形態において、抗原ペプチドの集団とＨＳＰ又はα２Ｍとを複合体化するのに使用される方法に応じて、共有結合又は非共有結合によりＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化した抗原ペプチドが得られる。複合体化することが意図される熱ショックタンパク質には、特に限定されないがＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｇｒｐ７８（又はＢｉＰ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＨＳＰ１１０、及びｇｒｐ１７０がある。一般にヒトＨＳＰ及びヒトα２Ｍが好ましい。ＨＳＰと抗原ペプチドの複合体は、治療又は予防組成物中で又は治療又は予防組成物として使用する前に、さらに精製することができる。このような組成物はさらにアジュバントを含んでよい。また、ＨＳＰ及び／若しくはα２Ｍ、抗原性細胞、タンパク質調製物、並びに／又はプロテアーゼを含むキットを提供する。

本発明の別の実施形態において、被験体において第１の抗原性細胞又はウイルス粒子に対する免疫応答を誘導する方法であって、第２の抗原性細胞又はウイルス粒子から調製された抗原タンパク質／ペプチドの集団と複合体化したＨＳＰ及び／又はα２Ｍの免疫原性量を含む組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。抗原ペプチドは、抗原性細胞又はウイルス粒子のタンパク質調製物を、プロテアーゼを用いて消化するか、又はタンパク質調製物をＡＴＰ、塩酸グアニジン、及び／若しくは酸性条件に暴露することにより得ることができる。第１及び第２の抗原性細胞又はウイルス粒子は、少なくとも１つの共通の抗原決定基を発現する。

さらに別の実施形態において、ある種の癌又は感染性疾患を治療又は予防する方法であって、その治療又は予防の必要な被験体に、抗原ペプチドの集団と複合体化したＨＳＰ及び／又はα２Ｍの治療上又は予防上有効な量を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。抗原タンパク質／ペプチドは、癌細胞、又は癌若しくは感染性疾患と抗原が関連した病原体に感染した細胞から調製される。病原体又は感染因子（ウイルス粒子を含む）もまた、抗原ペプチドを調製するのに使用することができる。抗原ペプチドは、抗原性細胞、その細胞画分、又はウイルス粒子のタンパク質調製物をプロテアーゼで消化するか、又はタンパク質調製物をＡＴＰ、塩酸グアニジン、及び／若しくは酸（例えば、トリフルオロ酢酸）に暴露することにより得ることができる。

さらに別の実施態様において、ある種の癌又は感染性疾患を治療又は予防する方法であって、その治療又は予防の必要な個体に、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと抗原タンパク質／ペプチドの集団との複合体で感作した抗原提示細胞を投与することを含む方法を提供する。感作された抗原提示細胞以外に、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと抗原ペプチドの集団との複合体もまた、被験体に投与することができる。

種々の実施形態において、被験体への複合体の投与は、同じ部位に、及び周期的、例えば１週間の間隔で反復して行なうことができる。組成物は、多くの経路、例えば皮内又は皮下投与により投与することができる。

４．発明の詳細な説明
本発明は、癌及び感染性疾患の予防及び治療に有用な、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）又はα−２−マクログロブリン（α２Ｍ）を含む組成物の製造方法を提供する。本発明の方法は、ＨＳＰ又はα２Ｍと、抗原性細胞の抗原タンパク質及びペプチドとの複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することを含む。一実施形態において、本方法は、抗原タンパク質の集団を含む抗原性細胞のタンパク質調製物を生成し、抗原タンパク質の集団とＨＳＰ又はα２Ｍとをｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化することを含む。別の実施形態において、本方法は、抗原性細胞のタンパク質調製物を、少なくとも１つのプロテアーゼで消化して抗原ペプチドの集団を生成した後、抗原ペプチドをＨＳＰ又はα２Ｍとｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化することを含む。本発明は、抗原性細胞の完全な抗原性の可能性を利用する。

本発明の治療及び予防方法は、感染性疾患又は癌の治療又は予防が望まれる被験体で免疫応答を誘発することに基づく。免疫応答は特に、癌細胞の抗原決定基、感染性疾患を引き起こす感染因子に感染した細胞、又は感染因子の抗原決定基に対するものである。抗原性細胞のペプチドに複合体化したＨＳＰ及び／又はα２Ｍを含む組成物を個体に投与することにより、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと抗原ペプチドとの複合体を含む組成物は、免疫応答（例えば、細胞障害性Ｔ細胞応答）を刺激しうる。抗原性細胞は、癌細胞若しくは感染細胞、又は癌細胞若しくは感染細胞と同様の抗原性と抗原性決定基を有するか、同様の抗原性を示す細胞でありうる。免疫応答の結果として、個体の種々の免疫エフェクター機構が、このような疾患の治療又は予防を導くような癌細胞又は感染細胞に作用する。

感染性疾患又は癌の治療又は予防が好ましい個体又は被験体は、動物、好ましくは哺乳動物、非ヒト霊長類であり、最も好ましくはヒトである。「動物」という用語は、特に限定されないが、農場動物又はペット動物、例えばネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ニワトリなどを含む。

本発明の治療法及び医薬組成物は、別の免疫応答エンハンサー又は生物学的応答調節物質（特に限定されないが、サイトカインであるＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、又は免疫細胞に影響を及ぼす他のサイトカイン）とともに使用してもよい。

本発明の組成物及び方法は、癌又は感染性疾患を治療又は予防するための、天然に存在するＨＳＰ抗原ペプチド複合体を使用する他の組成物や方法に対する改良である。そのような他の方法では、特異的ＨＳＰ及びその抗原ペプチドとの複合体は、癌細胞又は感染細胞から単離され、患者に投与されて、ｉｎ ｖｉｖｏで癌又は感染細胞に対する免疫応答を誘導する（例えば、米国特許第５，７５０，１１９号及び同５，９６１，９７９号を参照）。天然に存在する複合体は、所望の種類のＨＳＰに関する方法により単離される。すなわちある種のＨＳＰと抗原ペプチドの天然に存在する複合体は、その種類のＨＳＰを有する抗原性細胞の細胞小器官において同じように局在化した抗原ペプチドのみを含む。特定の種のＨＳＰはある細胞小器官にのみ特有に見いだされ、ある抗原ペプチドは抗原性細胞のある細胞小器官にのみ見いだされる。例えば、ＨＳＰ９０とＨＳＰ７０は、サイトゾル中にのみ見いだされる。すなわちこれらは、サイトゾル中に存在する抗原ペプチドとのみ複合体化するが、別の場所（例えば、小胞体）に存在する抗原ペプチドとは複合体化しない。すなわち、抗原性細胞のあるサブセットの抗原ペプチドのみが、それぞれ特定のＨＳＰに結合することができる。すなわち、癌又は感染細胞の最大数の抗原決定基に対する免疫応答を刺激するために、すべての種類のＨＳＰ及びそのペプチド複合体を、各単離法により癌又は感染細胞から単離し、患者に投与しなければならないであろう。この手法は手間がかかり、ある状況では利用できない多量の抗原性細胞を必要とするであろう。本発明の方法は、抗原性細胞の実質的にすべての抗原のペプチドプロフィールをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、次にペプチドを１つ以上の異なるＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化し、これを次に、患者の免疫応答を刺激するのに使用することにより、この問題を解決する。本発明の方法を使用することにより、抗原性細胞の同じ細胞小器官内に同じように局在化していない抗原ペプチドとＨＳＰさえも、複合体を形成することができる。本発明の方法は、特定の種類のＨＳＰと抗原性細胞のほとんどの若しくはすべての抗原ペプチドとの複合体を形成する可能性を提供する。従って本発明の方法により調製される組成物により、抗原性細胞に対するより有効な免疫応答を誘導することができる。さらにこの方法は、ＨＳＰ複合体及び関連ペプチドをあらかじめ単離する必要がなく、従って、しばしば供給が限定された非常に少量の開始物質の使用が可能になる。

さらに、癌細胞、感染細胞、又は病原体の抗原プロフィールは、ある期間に、例えば治療過程においても、変化することがある。多くの病原体は、突然変異により、及び免疫細胞や抗体に認識されない変異タンパク質の合成により、宿主免疫系を回避する。癌細胞は、突然変異を起こして変異タンパク質（その一部は免疫系により認識されないことがある）を合成して、いくつかの薬剤に対して耐性になることが知られている。本発明の実施形態の１つを使用する利点は、癌細胞、感染細胞又は病原体からのサイトゾル及び／又は膜由来タンパク質を消化することにより、より広範囲の抗原タンパク質、従ってより多様な抗原ペプチドがＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化することである。その結果、抗原性細胞上のより多くの抗原決定基に対して免疫応答が誘発され、従って抗原性細胞（例えば癌細胞又は感染細胞）が、免疫系による認識と作用から回避することが困難になる。

他の具体的な実施形態において、本発明の方法は、天然に存在しないα２Ｍ−ペプチド複合体を生成する。α２Ｍは細胞外タンパク質であり、種々の細胞外タンパク質、特にプロテアーゼに結合してこれらを不活性化し、次にこれらを細胞内環境に持ってくることが知られている。α２Ｍは一般に、抗原性細胞の全範囲の抗原ペプチドに近づくことはなく、従って複合体を形成しない。本発明の方法は、α２Ｍが、サイトゾル若しくは膜由来の、又は抗原性細胞のサイトゾル及び膜由来タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化により生成する、より広範囲のペプチドと複合体化することを可能にする。

タンパク質調製物が生成される抗原性細胞の供給源は、第４．１節に記載される。第４．２節では、抗原性細胞の異なる種類のタンパク質調製物の生成方法、及びタンパク質調製物の消化方法が記載される。第４．３節と第４．４節はそれぞれ、抗原ペプチドと複合体化するのに使用されるＨＳＰ又はα２Ｍの単離又は生産を記載する。ＨＳＰと抗原ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏの複合体化は、第４．５節に記載される。第４．６節には、癌及び感染因子の予防及び治療における複合体の使用方法、並びに治療される癌及び感染性疾患の種類が記載される。養子免疫療法における本発明の方法により調製される組成物の使用は、第４．７節に記載される。第５節は、癌細胞増殖からの動物の予防的防御における、本発明の複合体の有効性を示す実験データを提供する。

４．１．抗原性細胞の供与源
本発明の抗原性細胞は、それに対する被験体の免疫応答が望まれる抗原決定基を含む。

癌又は感染性疾患の治療又は予防のために、本発明の方法は、抗原タンパク質及びペプチドと複合体化したＨＳＰ及びα２Ｍの組成物を提供し、この抗原タンパク質／ペプチドは、癌細胞、好ましくはヒトの癌に由来するものであり、例えば腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原の断片である。ペプチドは、癌細胞、又は癌細胞と同じ抗原決定基を有するか若しくは同様の抗原性を示す抗原性細胞に由来する、タンパク質（例えば、サイトゾル及び／又は膜由来タンパク質）のタンパク質分解的消化により生成される。抗原ペプチドはまた、タンパク質をＡＴＰ、塩酸グアニジン、及び／又は酸性条件に暴露することにより生成することができる。本明細書において「同じ種類の癌」の細胞又は組織という用語は、同じ組織型の癌、又は同じ組織型の癌から転移した癌の細胞又は組織を意味する。

感染性疾患の治療又は予防のために、本発明の方法は、感染性疾患を引き起こす病原体又は感染因子、又は特に限定されないが、ウイルス、細菌，真菌、原生動物、寄生生物などを含む病原体に感染した細胞から得られる抗原ペプチドと複合体化したＨＳＰ及びα２Ｍの組成物を提供する。好ましくは病原体はヒトに感染するものである。抗原ペプチドは、感染細胞、又は感染細胞と同じ抗原決定基を有するか若しくは同様の抗原性を示す抗原性細胞、あるいはウイルス粒子などの病原体に由来するタンパク質（例えば、サイトゾル及び／又は膜由来タンパク質）のタンパク質分解的消化により生成される。抗原ペプチドはまた、タンパク質をＡＴＰ、塩酸グアニジン、及び／又は酸に暴露することにより生成することができる。抗原ペプチドはまた、感染性疾患を引き起こす因子（病原体）又はそのような因子の変異体の抗原性を示す抗原性細胞から生成することができる。

本発明では、癌細胞、感染細胞又は他の抗原性細胞の全体が使用されるため、本方法を使用する前に、これらの抗原ペプチドを単離若しくは特性決定するか又は同定することが必要である。抗原性細胞の供給源は、抗原が関連している疾患の性質に依存して選択される。本発明の一実施形態において、癌（複数の部位に転移した癌を含む）から単離される任意の組織又は細胞は、本方法において抗原性細胞として使用することができる。例えば、血液、リンパ又は他の体液中を循環する白血病細胞もまた使用でき、固形腫瘍組織（例えば、生検からの１次組織）を使用することができる。本明細書において癌細胞という用語は、正常型から新生物型への移行中の細胞である新生物発生前細胞も包含する。非新生物細胞増殖から新生物への移行は一般に、肥厚、化生、及び異形成からなる（このような異常増殖症状の総説については、Robbins及びAngell, 1976, Basic Pathology、第２版、W.B. Saunders Co.、フィラデルフィア、６８−７９頁を参照）。本発明で使用される細胞の癌は、限定するものではないが、後述の第４．５．２節に記載されている。

本発明の別の実施形態において病原体又は感染因子に感染した任意の細胞（すなわち、感染細胞）は、抗原ペプチドの調製のための抗原性細胞として使用することができる。特に、細胞内病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、又は原生動物）に感染した細胞が好適である。本発明で使用できる細胞に感染する感染因子は、限定するものではないが、第４．５．１節に記載される。

さらに別の実施形態において、感染性疾患を引き起こし得る任意の病原体又は感染因子は、抗原ペプチドの調製のための抗原性細胞として使用することができる。病原体又は感染因子の変異体（例えば、特に限定されないが、複製欠陥変異体、非病原性若しくは弱毒化変異体、非感染性変異体）もまた、この目的の抗原性細胞として使用することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できるか、又は感染因子から単離できる多くのウイルス、細菌、真菌、寄生生物及び原生動物が、抗原性細胞の供給源となることができる。ウイルス粒子を含むそのような病原体を増殖させるための当該分野で公知の方法を使用することができる。

癌組織、癌細胞、又は感染細胞由来の細胞株もまた、抗原性細胞として使用することができる。ヒト起源の癌又は感染組織、細胞又は細胞株が好ましい。癌細胞、感染細胞、又は抗原性細胞を同定し、当該分野で公知の方法により単離することができる。例えば、感染細胞の癌細胞は、形態、酵素アッセイ、増殖アッセイ、又は病原性若しくは発ガン性ウイルスの存在により同定することができる。目的の抗原の性状が公知であるなら、当該分野で公知の生化学的又は免疫学的方法により抗原性細胞を同定又は単離することができる。例えば、癌細胞又は感染細胞は、手術、内視鏡、他の生検法、アフィニティクロマトグラフィー、及び蛍光活性化セルソーター解析（例えば、細胞が発現する抗原に対する蛍光標識抗体を用いる）により、単離することができる。同様の抗原性を示す抗原性細胞は、（例えば、治療又は予防目的で）被験体においてそれに対する免疫応答が好ましい１つ以上の共通の抗原決定基を有する。

被験体から得られる抗原性細胞の数が不十分であるときには、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標準的方法で細胞を培養して、細胞数を増やしてから、本方法で使用してもよい。抗原性細胞のクローン性又は均一な又は精製集団を使用する必要性は無い。混合物中の実質的な数の細胞が目的の抗原を含有するなら、細胞混合物を使用することもできる。具体的な実施形態において、抗原性細胞及び／又は免疫細胞は精製される。

病原体感染細胞を調製するために、疾患を引き起こす病原体又は感染因子の感染を受けやすい細胞型の非感染細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることができる。病原体又は感染因子の感染様式と生物学に依存して、標準的方法を使用して、病原体又は感染因子による感染及び感染細胞の増殖を促進することができる。例えば、インフルエンザウイルスを使用して、正常なヒト繊維芽細胞に感染させ、マイコバクテリウアを使用して正常なヒトシュワン細胞に感染させてもよい。種々の実施形態において感染因子の変異体、例えば複製欠陥ウイルス、非病原性若しくは弱毒化変異体、又は温度感受性変異体を使用して細胞に感染又は形質転換を行なって、抗原ペプチドの調製のための抗原性細胞を生成することもできる。細胞を感染させるのに多数の病原体が必要な場合、又は抗原性細胞として病原体が直接使用される場合、当該分野で公知の任意の方法を使用して、病原体を増殖及び成長させることができる。このような方法は、病原体に依存し、宿主の感染がなくてもよい。例えば、病原体細菌、真菌及び他の非ウイルス微生物を増殖させるための多くの方法（大規模発酵を含む）が当該分野で公知である。

あるいは、腫瘍抗原（例えば、腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原）又は病原体の抗原をコードする遺伝子が利用できるなら、抗原がレシピエントの細胞中で発現されるように、このような抗原をコードする核酸分子を含む発現構築体を用いて、目的のレシピエントに由来する適切な細胞型の正常細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換又はトランスフェクトしてもよい。一実施形態において、腫瘍関連抗原は、正常細胞と比較して腫瘍細胞中でより高レベルに発現される抗原であり、腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞のみで発現され、正常細胞では発現されない抗原である。場合により２つ以上のこのような抗原を、当業者により理解されるように、任意の公知の方法、例えばAusubelら、1989、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience）に記載のような方法を使用して、形質転換又はトランスフェクションを行い、次にレシピエントの細胞中で抗原遺伝子の組換え発現を行ってもよい。

このような細胞中で発現される適当なタンパク質及びペプチドには、特に限定されないが、以下の抗原性を示すものがある：（癌の治療又は予防のための）チロシナーゼ、ｇｐ１００、メラン−Ａ、ｇｐ７５、ムチンなどの腫瘍抗原；及び（感染性疾患の治療又は予防のための）免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、及びポリオウイルスのタンパク質などのウイルスタンパク質、ならびに感染因子（特に限定されないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レギオネラ、レイシュマニア、コクジヂオア（kokzidioa）、トリパノソーマ、クラミジア及びリケッチア）のタンパク質若しくはタンパク質断片。

４．２．抗原タンパク質及びペプチドの調製
本発明において本発明の組成物は、ＨＳＰと複合体化した抗原タンパク質を含み、抗原タンパク質は目的の抗原性細胞のタンパク質の調製物に由来する。本発明の組成物はまた、α２Ｍと複合体化した抗原タンパク質を含み、抗原タンパク質は目的の抗原性細胞のタンパク質の調製物に由来する。本発明の組成物はまた、ＨＳＰと抗原ペプチドの複合体、又はα２Ｍと抗原ペプチドの複合体（まず、目的の抗原性細胞のタンパク質の調製物からペプチドの集団を生成し、次にＨＳＰ又はα２Ｍとペプチドとを複合体化することにより調製される）を含む。

種々の実施形態において、抗原タンパク質とペプチドの多様性を最大にしてかつ保存するために、抗原性細胞のタンパク質調製物を調製するために使用される方法は、抗原性細胞中の他のタンパク質及びペプチドから、特定のタンパク質又はペプチドを選択的に取り出す又は保持するものではない。サイトゾルタンパク質又は膜由来タンパク質が使用される特定の実施形態においても、調製物を生成するために使用される方法は、サイトゾル又は膜の特定のタンパク質を、選択的に取り出したり保持するものではない。従って、サイトゾル又は膜中に存在するほとんどのタンパク質は、抗原性細胞からの抗原タンパク質とペプチドの各調製物中に存在する。好適な実施形態において、抗原性細胞の実質的にすべての範囲の抗原タンパク質とペプチド、及びサイトゾル又は膜中の実質的にすべての抗原タンパク質とペプチドは、複合体化反応物において存在し、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化する。

４．２．１．抗原性細胞のタンパク質調製物
本発明の一実施形態において、癌細胞、感染細胞、又は病原体から得られるタンパク質調製物が提供される。例えば癌の治療のために、癌患者から得られた腫瘍細胞から、術後にタンパク質調製物が調製される。本発明の別の実施形態において、抗原をコードする組換え発現系の導入により改変された細胞株中で、目的の１つ以上の抗原タンパク質を合成し、このような細胞はタンパク質を調製するために使用される。タンパク質は１つ以上の細胞画分（例えば抗原性細胞のサイトゾル）に由来するか、又は抗原性細胞の膜若しくは細胞壁から抽出若しくは可溶化される。細胞溶解、細胞内容物の分画、及びタンパク質濃縮又は単離のために当該分野で公知の任意の方法が使用できる。例えば、Current Protocols in Immunology、第２巻、第８章、Coliganら（編）、John Wiley and Sons；Pathogenic and Clinical Microbiology: A Laboratory Manual、Rowlandら、Little Brown & Co.、1996年６月を参照されたい（これらは、参照することによりその全文が本明細書に組み込まれる）。細胞内容物を分画するために使用される方法に応じて、細胞画分は、少なくとも２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００又は２０，０００種の異なるタンパク質を含む。

本明細書において「タンパク質調製物」という用語は、抗原性細胞、抗原性細胞の細胞画分、又はウイルス粒子に由来するタンパク質の混合物を意味する。タンパク質は、細胞画分（例えば、サイトゾル）から得ることができる。タンパク質はまた、非サイトゾルタンパク質（例えば、細胞壁、細胞膜又は細胞小器官に由来するもの）であってもよいし、又は両方でもよい。細胞画分は、特に限定されないが、サイトゾル画分、膜画分、及び細胞小器官画分（例えば、核、ミトコンドリア、リソソーム、及び小胞体由来画分）がある。タンパク質調製物は、非組換え細胞又は組換え細胞から得ることができる。本明細書において「抗原タンパク質」という用語はまた、調製物中に存在する抗原ポリペプチド及び抗原ペプチドを包含する。抗原性細胞若しくはその細胞画分又はウイルス粒子に由来するタンパク質調製物は、当該分野で公知の方法により、他の非タンパク質性物質から種々の程度まで、任意により精製することができる。タンパク質調製物は、抗原性細胞若しくはウイルス粒子、又は抗原性細胞の画分中に存在する異なるタンパク質及びタンパク質の、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％を含有してもよい。

具体的な実施形態において、タンパク質調製物は、抗原性細胞中の他のタンパク質からの１つ以上の特定のタンパク質を選択的に取り出す又は保持する調製方法を行なうものではない。

具体的な実施形態において、タンパク質調製物は、分画及び／又は精製されていない総細胞溶解物であり、細胞の他の非タンパク質性物質を含有してもよい。別の具体的な実施形態において、タンパク質調製物は細胞画分中の総タンパク質であり、これはさらなる分画又は精製を受けておらず、細胞の他の非タンパク質性物質を含有してもよい。さらに別の実施形態において、タンパク質調製物はウイルス粒子調製物中の総タンパク質である。具体的な実施形態において、タンパク質調製物は、抗原性細胞の総細胞タンパク質、総サイトゾルタンパク質、又は総膜結合タンパク質を含む。種々の実施形態においてタンパク質調製物は、少なくとも２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００又は２０，０００種の異なるタンパク質を含む。抗原性細胞のタンパク質調製物中に、複数の異なる抗原タンパク質が存在する。さらにタンパク質調製物中のタンパク質は、プロテアーゼ消化のステップを行なってから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化される。あるいはタンパク質調製物中のタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化される前に、プロテアーゼ消化のステップを行なっていない。

抗原性細胞又はウイルス粒子のタンパク質調製物を生成するために、抗原性細胞の溶解、又は細胞壁、細胞膜、若しくはウイルス粒子構造の破壊は、当該分野で公知の標準的方法を使用して行うことができる。種々の実施形態において抗原性細胞は、例えば機械的剪断、超音波処理、凍結と融解、細胞周囲の媒質の浸透圧調整、又はこれらの方法の組合せにより溶解することができる。あまり好ましくない実施形態において、抗原性細胞は、化学物質（例えば、界面活性剤）により溶解することができる。

細胞を溶解した後、非タンパク質物質、又はサイトゾルタンパク質及び／若しくは膜由来タンパク質（細胞小器官の膜中のタンパク質を含む）を含有しない物質である細胞破片を除去することが好ましい。これらの成分の除去は、低速遠心分離又はろ過のような方法により行われる。細胞破片及び無傷の細胞を除去した後、高速遠心分離ステップを使用して、上清中にあるサイトゾルタンパク質、及びペレット中に集められる膜由来タンパク質を分離することができる。当該分野で公知の標準的方法により、ペレットからの膜由来タンパク質のさらなる単離を行なうことができる。当該分野で公知の標準的方法を使用して、ウイルス粒子からウイルスタンパク質を抽出することができる。特定の実施形態において使用される方法は、抗原性細胞、サイトゾル又は膜中に存在する他のタンパク質から、１つ以上の特定のタンパク質を選択的に取り出す又は保持するように設計されていない。

場合により他の実施形態において、抗原性細胞に由来するタンパク質は、一般的な生化学的及び／又は生物物理的性質（例えば、サイズ、電荷）あるいはこれらの組合せにより分離することができる。当該分野で公知の任意の方法を使用して、分離を行うことができる。抗原性細胞若しくはその細胞画分又はウイルス粒子中に存在する、少なくとも２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００又は２０，０００種の異なるタンパク質を含むか、又は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の異なるタンパク質を含むタンパク質／ペプチドの選択された画分は、ＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化するために使用される。

例として、特に限定されないが、サイトゾルタンパク質を含むタンパク質調製物を生成するために使用される方法は以下の通りである：
細胞（患者の生検により得られた腫瘍細胞、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した腫瘍細胞、又は病原因子に感染した細胞）を、３倍量の１×溶解バッファー（３０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む）に懸濁し、氷上で２０分間インキュベートし、次に低張膨潤させた細胞を、９５％を超える細胞が溶解されるまでダウンスホモジナイザーでホモジナイズする。剪断の代わりに、細胞を、顕微鏡観察で測定した時９９％を超える細胞が溶解するまで氷上で超音波処理してもよい。超音波処理を使用する場合には、超音波処理前に細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のようなバッファーに懸濁する。

溶解物を１，０００×ｇで１０分間遠心して、無傷の細胞、核及び他の細胞破片を除去する。得られる上清を約１００，０００×ｇで約１時間再度遠心し、上清を回収する。１００，０００×ｇの上清をＰＢＳ又は他の適当なバッファーに対して４℃で３６時間透析（３回、各回に１００倍容量）して、本発明の可溶性サイトゾルタンパク質を得る。必要であれば調製物中の不溶性物質を、ろ過又は低速遠心分離により除去する。

特に限定されないが、膜由来タンパク質を含むタンパク質調製物を生成するのに使用される方法の例は以下の通りである：
細胞（患者の生検により得られた腫瘍細胞、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した腫瘍細胞、又は病原因子に感染した細胞）を、３倍量の１×溶解バッファー（３０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む）に懸濁し、氷上で２０分間インキュベートし、次に低張膨潤させた細胞を、９５％を超える細胞が溶解されるまでダウンスホモジナイザーでホモジナイズする。剪断の代わりに、細胞を、顕微鏡観察で測定した時９９％を超える細胞が溶解するまで氷上で超音波処理してもよい。超音波処理を使用する場合には、超音波処理前に細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のようなバッファーに懸濁する。

溶解物を１００，０００×ｇで１０分間遠心して、細胞膜を回収する。膜由来タンパク質を脂質二重層から分離させ、１００，０００ｇのペレット（膜由来タンパク質が局在化している）を、１％デオキシコール酸ナトリウムを含有する５倍量のＰＢＳ（Ｃａ^２＋とＭｇ^２＋を含まない）に再懸濁してペレットから単離し、氷上で１時間インキュベートする。得られる懸濁液を２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、生じる上清を採取し、ＰＢＳ（Ｃａ^２＋とＭｇ^２＋を含まない）を数回交換して透析して、界面活性剤を除去する。生じる透析物を約１００，０００ｇで９０分間再度遠心し、上清をさらに精製する。次にカルシウムとマグネシウムを上清に加えて、最終濃度を２ｍＭとする。必要であれば、調製物中の不溶性物質を、ろ過又は低速遠心分離により除去する。

具体的な実施形態において、抗原性細胞から得られるサイトゾル及び／又は膜由来タンパク質の集団は、プロテアーゼ処理を行なわず又はさらなる抽出若しくは選択プロセスを行なわないで、直接ＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化することができる。あるいは、タンパク質をプロテアーゼ処理に付した後、複合体化することができる。

４．２．２．抗原性細胞に由来するペプチド
本発明において、抗原性細胞に由来するサイトゾル及び膜由来タンパク質は、場合により消化して抗原ペプチドを生成することができる。一実施形態において、サイトゾル又は膜由来タンパク質は、消化して使用される。別の実施形態において、サイトゾル及び膜由来タンパク質は消化反応で組合わされて、抗原ペプチドを生成する。好適な実施形態において、プロテアーゼ消化に使用されるタンパク質調製物は、抗原性細胞、又は抗原性細胞のサイトゾル若しくは膜中の他のタンパク質から、１つ以上の特定のタンパク質を選択的に取り出したり保持する調製方法を行なっていない。

種々のプロテアーゼ又はタンパク質分解酵素を本発明で使用して、抗原性細胞のタンパク質調製物、又は抗原ペプチドを含むペプチドの集団を生成することができる。酵素的消化は、当該分野で公知の任意のタンパク質分解酵素、例えばトリプシン、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ（プロテアーゼＶ８としても知られている）、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＧ、サーモリシン、エラスターゼ、及びパパインなどを個々に又は適当に組み合わせて行うことができる。トリプシンは、リジンとアルギニンのカルボキシル末端側を切断する特異性の高いセリンプロテイナーゼである。切断部位の数が限定されているため、多くのＭＨＣ結合エピトープが完全なまま残ると予測される。セリンプロテアーゼであるブドウ球菌ペプチダーゼＩは、グルタミン酸残基とアスパラギン酸残基の後の切断に対する特異性を有する。消化は、単一のプロテアーゼ又はプロテアーゼの混合物を用いて行うことができる。使用されるプロテアーゼ又はタンパク質分解酵素は、特定の酵素に適した条件下でインキュベートされる。好ましくは酵素は精製されたものである。非酵素的方法（例えば、臭素シアン切断）もまた、ペプチドの生成に使用することができる。消化されるタンパク質調製物は、それぞれ異なる酵素を使用して複数の反応物中に分割することができ、得られるペプチドは任意により使用のためにまとめてプールされる。酵素反応ではタンパク質を完全に消化することが必要ではないこともある。これらの反応により、タンパク質調製物中に存在する各タンパク質について、多様かつ異なるセットのペプチドが生成される。異なるペプチドセットの生成により、ＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化した時に、タンパク質調製物中の抗原に対する免疫応答を誘導することができる抗原ペプチドを生成する可能性がより大きくなる。好適な実施形態において消化されるタンパク質調製物は、２つの別の反応物に分割され、タンパク質調製物中に存在するタンパク質の２つの異なるセットのペプチドを生成するのに、２つの異なるタンパク質分解酵素が使用される。タンパク質、酵素及び反応条件に応じて、未消化タンパク質が反応物中に残存することがある。好適な実施形態において、トリプシンとブドウ球菌ペプチダーゼＩは別々に使用されて、タンパク質調製物を消化する。

別の好適な実施形態において、本発明で使用されるタンパク質分解酵素は、プロテアソーム（proteasome）中で見いだされるタンパク質分解活性と同様の活性を示す。プロテアソームは、細胞中で誤って折りたたまれているか傷害を受けているサイトゾル及び核タンパク質のリソソーム外の内部加水分解を担う。プロテアソームはタンパク質を完全に分解して単一のアミノ酸を産生し、最適な主要組織適合複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）結合エピトープを生成することができ、細胞中で別の場所でさらに切断されて細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを生成する可能性のある、より長いペプチド前駆体を生成することができる。プロテアソームの切断優先性は、塩基性、酸性及び疎水性アミノ酸のカルボキシル（ＣＯＯＨ）側である。プロテアソーム中に存在する３つの公知のタンパク質分解酵素活性は、キモトリプシン様活性、トリプシン様活性、及びペプチジルグルタミルペプチド加水分解活性である（Uebel及びTampe、1999、Curr. Opin. Immunol. 11:2 203-208）。従ってこのような活性と特異性を有する酵素は、別々に又は組み合わせて使用してタンパク質調製物を消化することができる。好適な実施形態において、キモトリプシン、トリプシン、及びペプチジルグルタミルペプチド加水分解酵素が使用される。

生じるペプチド消化物は、抗原ペプチド、非抗原ペプチド、及び単一のアミノ酸残基を含む。反応物はまた、未消化の又は不完全に消化された抗原タンパク質を含んでもよい。本発明のタンパク質分解酵素による消化は、所望の範囲の長さのペプチドを生成するためにモニターされる。好適な実施形態において、生成するペプチドは約７〜約２０アミノ酸残基である。ＭＨＣクラスＩ及びＩＩによりＴ細胞に提示されるほとんどの抗原ペプチドは、この範囲に入る。種々の実施形態においてペプチドの集団は、サイズ範囲が６〜２１、８〜１９、１０〜２０、又は少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、４０、４５、又は５０アミノ酸残基を有するペプチドを含む。好適な実施形態において抗原ペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸残基を有する。タンパク質消化の進行をモニターするために試験反応が行われ、ここでタンパク質消化物の小アリコートを反応物から取り出し、トリシン−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（トリシン−ＰＡＧＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析法、又はペプチドのサイズを測定するための当該分野で公知の任意の他の方法により、消化の進行をモニターする。そのような試験反応を使用して、特定のサイズ範囲のペプチド断片が特定の酵素濃度で生成する時点について決定しうる。操作される反応の他の因子には、反応物中のタンパク質の量、温度、インキュベーションの持続時間、補因子の存在などがある。

ある種の抗原性細胞から特定のサイズ範囲のペプチド断片を生成するための正しい条件がいったん確立されると、その酵素反応条件を再現して抗原ペプチドが生成され、これはプールされる。ペプチドがＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化する前に、酵素的消化を停止させることが好ましい。本発明の一実施形態において、酵素消化を停止させるためにインヒビターを使用することができる。本発明で使用できる酵素インヒビターには、タンパク質消化で使用される酵素に応じて、特に限定されないが、ＰＭＳＦ、ベスタチン、アマスタチン、ロイペプチン、及びシスタチンがある。ほとんどのプロテアーゼについてインヒビターが当該分野で公知である。あるいは、酵素的消化を停止させる他の方法は、反応物からの酵素の物理的除去である。これは、選択された酵素を固相（例えば、樹脂や、遠心分離又はろ過のような公知の方法により反応物から容易に除去することができる物質）に結合させることにより行われる。タンパク質調製物は、ある時間固相と接触させてもよいし又は固相に沿って流される。そのような固定化酵素は市販品を購入するか、又は当該分野で公知の酵素固定化法により製造することができる。

消化反応の最後に、場合によりペプチドは調製物中の低分子量物質（例えば、ジペプチド又は単一のアミノ酸残基）から分離することができる。例えばペプチドは、膜（例えば、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３）を通して遠心することにより分離することができる。場合によりペプチドは、生化学的及び／又は生物物理的性質（例えば、サイズ、電荷又はこれらの組合せ）により分離することができる。当該分野で公知の任意の方法を使用して、分離を行い、少なくとも５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００又は１００，０００種の異なるペプチドを含む消化タンパク質調製物を得ることができる。

本発明の別の実施形態において、抗原性細胞中に内因性に存在するペプチドを単独で、又はサイトゾル及び膜由来タンパク質のタンパク質分解消化により得られるペプチドと組み合わせて、本発明に使用することができる。抗原性細胞中に内因性に存在するペプチドには、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＳＰ及び／又はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子と複合体化されるペプチドが含まれる。本発明において、抗原性細胞のタンパク質調製物から直接単離されるそのようなペプチドは、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化することができる。

具体的な実施形態において、サイトゾル又は膜由来タンパク質のいずれかを単離法で使用する。別の具体的な実施形態において、サイトゾル及び膜由来タンパク質は、単離方法において組み合わされる。好適な実施形態において、単離して使用されるタンパク質調製物は、抗原性細胞中、又は抗原性細胞のサイトゾル若しくは膜中の他のタンパク質から、１つ以上の特定のタンパク質を選択的に取り出す又は保持する調製方法を行なっていない。抗原ペプチドは、抗原ペプチドとＨＳＰ又はＭＨＣ分子との複合体を最初に単離することなく、細胞のタンパク質調製物から直接単離される。好ましくはタンパク質調製物は、抗原性細胞若しくはその細胞画分又はウイルス粒子中に存在する、少なくとも２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００又は２０，０００種の異なるタンパク質を含むか、又は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の異なるタンパク質を含む。

種々の実施形態において、本方法は、タンパク質調製物をＡＴＰ、塩酸グアニジンで処理するか、及び／又はタンパク質調製物中のＨＳＰやＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子のようなタンパク質に結合した抗原ペプチドが溶出できるような酸性条件下に、タンパク質調製物を暴露することを含む。多くの異なる酸を使用することができ、特に限定されないがトリフルオロ酢酸がある。ＨＳＰ−ペプチド複合体からペプチドを単離するための方法が当該分野で公知であり、例えばMenoretら、1999, Biochem.Biophys.Res.Commun. 262(3):813-8（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）がある。タンパク質凝集物を解離するためのMarston及びHartley（1990、Meth.Enzymolo. 182:264-276）に記載のような方法を使用することもできる。

特に単離方法は、抗原性細胞のタンパク質調製物をＡＴＰに、例えば室温で１時間暴露するか、及び／又は、抗原性細胞のタンパク質調製物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、例えば０．１％ ＴＦＡで処理することを含む。処理は好ましくは、タンパク質調製物を０．１％ ＴＦＡ中で超音波処理することを含む。最も好適な実施形態において、タンパク質調製物は、まずＡＴＰに暴露し、次に０．１％ ＴＦＡ中で超音波処理する。ＨＳＰ又はα２Ｍに内因性に結合していないペプチドを生成する細胞タンパク質の切断を防止又は低減するために、細胞溶解及び単離方法の前に、本発明において種々のプロテアーゼインヒビターを使用することができる。例えば、１４種のプロテアーゼの混合物を使用することができる。すなわち、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）２ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１ｍＭ、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）１ｍＭ（すべてSigma、セントルイス、ミズーリ州より入手）、及びアンチパイン２０ｍｇ／ｍｌ、ベスタチン５ｍｇ／ｍｌ、ケモスタチン２０ｐｔｇ／ｎｉｌ、Ｅ６４ ２０Ｊｉｇ／ｍｌ、ロイペプチン１ｔｔｇ／ｍｌ、ペプスタチン１ｇｇ／ｍｌ、ペファブロック４０Ａｇ／ｍｌ、及びアポプロテイン１０ｔｋｇ／ｍｌ（すべてBoehringer Mannheim、インディアポリス、インディアナ州より入手）。タンパク質調製物から得られるペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、４０、４５、又は５０アミノ酸残基の範囲の種々のサイズの抗原ペプチド及び非抗原ペプチドを含む。方法の最後に、ペプチドは、好ましくは、ＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化する前に、調製物中のタンパク質から分離することにより回収される。例えば、ペプチドは、膜（例えば、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３）を通す遠心、真空乾燥、又は逆相クロマトグラフィー、例えば水中０．１％ ＴＦＡで平衡化させアセトニトリルで溶出するＢｉｏＣａｄ２０マイクロ分析ＨＰＬＣ ＰｏｒｏｓＲＨ２ カラム（Perseptive Biosystems、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で分画することにより、回収できる。従って、抗原性細胞中に内因的に存在し、かつタンパク質調製物から直接単離される抗原ペプチドは、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化することができる。あるいは、抗原性細胞中に内因性に存在するペプチド、並びに消化したサイトゾル及び膜由来タンパク質からのペプチドを含むペプチドの混合集団を、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化することができる。

４．３．ＨＳＰ及びα２Ｍの調製
本発明においては、抗原性細胞に由来する抗原ペプチドをＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化させる。本明細書には、本発明において用いるためのＨＳＰ及びα２Ｍの単離及び調製に使用しうる方法を例示する。

本発明の実施に有用な熱ショックタンパク質は、本明細書中ではストレスタンパク質とも称し、以下の基準を満たすあらゆる細胞タンパク質の中から選択することができる。またこれは、細胞がストレス刺激に暴露された際にその細胞内濃度が増大するタンパク質であり、他のタンパク質又はペプチドと結合可能であり、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下又は酸性条件下において結合タンパク質又はペプチドを放出することができ、さらに上記の性質のいずれかを有する任意の細胞タンパク質と少なくとも３５％の相同性を示すものである。

最初のストレスタンパク質は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）として同定されたものである。その名が意味するように、ＨＳＰは熱ショックに応答して細胞により合成される。現在までに、ＨＳＰにはファミリーメンバーの分子量に基づいて５つの主要なクラスがある。これらのクラスは、ｓＨＳＰ（小さい熱ショックタンパク質）、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＨＳＰ１００と呼ばれ、この数値は、そのＨＳＰのおおよその分子量（キロダルトン）を反映している。主要なＨＳＰファミリーの他、小胞体に内在するタンパク質であるカルレティキュリンもまた、抗原分子と複合体化させた場合に免疫応答を誘発するのに有用な別の熱ショックタンパク質として同定されている（Basu及びSrivastava, 1999, J. Exp. Med. 189:797-202）。本発明において使用しうる他のストレスタンパク質としては、限定されるものではないが、ｇｒｐ７８（又はＢｉＰ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＨＳＰ１１０、及びｇｒｐ１７０が挙げられる（Linら、1993, Mol.Biol.Cell, 4:1109-1119；Wangら、2001,J.Immunol., 165:490-497）。上記ファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、低酸素状態及び細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが見出されている（Welch, May 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Craig, 1993, Science 260:1902-1903; Gethingら, 1992, Nature 355:33-45; 及びLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677を参照のこと。この開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）。これら３つのファミリーに属するＨＳＰ／ストレスタンパク質は、本発明の実施に用いることができると考えられる。

主要なＨＳＰは、ストレスをうけた細胞中に非常に高レベルで蓄積するが、これらはストレスをうけていない細胞においては低〜中程度のレベルで存在する。例えば、誘導性の高い哺乳動物ＨＳＰ７０は、通常の温度ではほとんど検出されないが、熱ショックをうけた細胞においては最も活発に合成されるタンパク質となる（Welchら, 1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211）。対照的に、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ６０タンパク質は、通常の温度で全てではないが大部分の哺乳動物細胞中に多量に存在し、熱によりさらに誘導される（Laiら, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-10；van Bergen en Henegouwenら, 1987, Genes Dev. 1:525-31）。

熱ショックタンパク質は現存するタンパク質のうちで最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のＨＳＰ７０であるＤｎａＫは、擦過傷（excoriate）からのＨＳＰ７０タンパク質に対して約５０％のアミノ酸配列同一性を有する（Bardwellら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852）。ＨＳＰ６０及びＨＳＰ９０ファミリーも同様に高いレベルのファミリー内保存性を示す（Hickeyら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283）。さらに、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０ファミリーは、配列の点では例えば３５％を超えるアミノ酸同一性を有し、ストレスタンパク質に関係しているが、その発現レベルがストレスによって変化しないタンパク質を含むことが発見されている。従って、本明細書中で使用する熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質の定義は、ストレス刺激に応答して細胞内での発現レベルが増大する上記３つのファミリーのメンバーと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、その変異型タンパク質、類似体及び変異体も含まれるものとする。

ＨＳＰ−抗原ペプチド複合体のＨＳＰ部分を細胞から精製することが望ましい実施形態において、以下の第４．３．１節〜第４．３．３節に記載される精製手順は、ＨＳＰ−ペプチド複合体を精製し、その後その内因性ＨＳＰ−ペプチド複合体からＡＴＰの存在下又は酸性条件下にてＨＳＰを分離することができ、その後、抗原ペプチド集団とのｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体形成を行うものである。Pengら、1997, J.Immunol.Methods, 204:13-21；Li及びSrivastava、1993, EMBO J. 12:3143-3151（これらは参照により本明細書に組み入れるものとする）を参照されたい。腫瘍細胞について説明するが、後述するプロトコールは、任意の感染細胞、及び細胞内病原体に感染した任意の真核細胞（例えば組織、単離細胞、又は不死化真核細胞系）、腫瘍細胞又は腫瘍細胞系からＨＳＰを単離するために用いることができる。

４．３．１．ＨＳＰ７０−ペプチド複合体の調製及び精製
ＨＳＰ７０−ペプチド複合体の精製は、以前に記載されており、例えば、Udonoら、1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396を参照されたい。使用できる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない：
最初に、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭ ＰＭＳＦとからなる、３容量の１×溶解バッファーに腫瘍細胞を懸濁させる。次に、ペレットを氷上で音波処理することにより、９９％以上の細胞を溶解させるが、これは顕微鏡検定により決定される。音波処理に代わり、細胞を機械的せん断により、９５％以上の細胞が溶解するまで、ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーで均質化することにより、細胞を溶解しうる。

次に、溶解物を１，０００ｇで１０分遠心することにより、破壊されていない細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。得られた上清を１００，０００ｇで９０分遠心した後、上清を回収してから、２ｍＭ Ｃａ^２＋及び２ｍＭ Ｍｇ^２＋を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化させたＣｏｎＡセファロースと混合する。機械的せん断により細胞を溶解させる場合には、、上清を等量の２×溶解バッファーで希釈した後、ＣｏｎＡセファロースと混合する。次に、上清をＣｏｎＡセファロースと４℃で２〜３時間結合させる。結合しなかった物質を回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦに対して３６時間透析する（１００容量ずつ３回）。次に、透析物を１７，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）で２０分遠心する。得られた上清を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５ｍＭ ２−メルカプトエタノール中で平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムにアプライする。このカラムを２０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で展開させた後、溶離した分画をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離してから、適当な抗ＨＳＰ７０抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ製のクローンＮ２７Ｆ３−４由来のものなど）を用いたイムノブロッティングにより特性決定する。

抗ＨＳＰ７０抗体と強い免疫反応性を示す分画をプールし、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体を硫酸アンモニウム、具体的には、５０％〜７０％の硫酸アンモニウムカットで沈殿させる。得られた沈殿物を１７，０００ｒｐｍ（ＳＳ３４ Ｓｏｒｖａｌｌローター）での遠心分離により回収した後、７０％硫酸アンモニウムで洗浄する。洗浄した沈殿物を溶解させ、残留する硫酸アンモニウムをＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのゲルろ過により全て除去する。必要であれば、このようにして得られたＨＳＰ７０調製物を前述のように、ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムを用いて再精製することもできる。

この方法を用いて、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。典型的には、１ｇの細胞／組織から、１ｍｇのＨＳＰ７０−ペプチド複合体を精製することができる。

ＨＳＰ７０−ペプチド複合体を精製するための改良法は、細胞タンパク質を、固相基質に固定したＡＴＰ又はＡＴＰの非加水分解性類似体と接触させることにより、溶解物中のＨＳＰ７０を、ＡＴＰ又は非加水分解性ＡＴＰ類似体と結合させた後、結合ＨＳＰ７０を溶離することを含む。好ましい方法では、固相基質に固定したＡＴＰ（例えば、ＡＴＰ−アガロース）を用いたカラムクロマトグラフィーを用いる。得られたＨＳＰ７０調製物は、これまでより純度が高く、混入ペプチドを全く含まない。ＨＳＰ７０の収率も約１０倍以上有意に高まる。

これ以外に、ＡＴＰに代わり、ＡＤＰの非加水分解性類似体を用いるクロマトグラフィーを用いて、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体を精製することもできる。例として、限定するものではないが、ＡＴＰ−アガロースクロマトグラフィーによるＨＳＰ７０−ペプチド複合体の精製は、次のように実施することができる：
ＭｅｔｈＡ肉腫細胞（５億個の細胞）を低張性バッファー中で均質化させ、溶解物を４℃にて１００，０００ｇで９０分遠心する。上清をＡＴＰ−アガロースカラムにアプライする。カラムをバッファー中で洗浄し、５カラム容量の３ｍＭ ＡＴＰで溶離する。ＨＳＰ７０−ペプチド複合体は、溶離する合計１５分画のうち２〜１０分画に溶離する。溶離した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。この手順を用いて、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。

４．３．２．ＨＳＰ９０−ペプチド複合体の調製及び精製
用いることができる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を制限するものではない：
最初に、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ７．５）と１ｍＭ ＰＭＳＦとからなる、３容量の１×溶解バッファーに腫瘍細胞を懸濁させる。次に、このペレットを氷上で音波処理することにより、９９％以上の細胞を溶解させるが、これは顕微鏡検定により決定される。音波処理に代わり、細胞を機械的せん断により、ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーで均質化させることにより、細胞を溶解しうる。

次に、溶解物を１，０００ｇで１０分遠心することにより、破壊されていない細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。得られた上清を１００，０００ｇで９０分再度遠心した後、上清を回収してから、２ｍＭ Ｃａ^２＋及び２ｍＭ Ｍｇ^２＋を含むＰＢＳで平衡化させたＣｏｎＡセファロースと混合する。機械的せん断により細胞を溶解させる場合には、上清を等量の２Ｘ溶解バッファーで希釈した後、ＣｏｎＡセファロースと混合する。次に、上清をＣｏｎＡセファロースと４℃で２〜３時間結合させる。結合しなかった物質を回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦに対して３６時間透析する（１００容量ずつ３回）。次に、透析物を１７，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）で２０分遠心する。得られた上清を回収し、溶解バッファーで平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムにアプライする。次に、２００ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌの塩勾配で、タンパク質を溶離する。

溶離した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別した後、３Ｇ３（Affinity Bioreagents）などの抗ＨＳＰ９０抗体を用いて、イムノブロッティングすることにより、ＨＳＰ９０−ペプチド複合体を含む分画を同定する。この手順を用いて、ＨＳＰ９０−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。典型的には、１ｇの細胞／組織から、１５０〜２００μｇのＨＳＰ９０−ペプチド複合体を精製することができる。

４．３．３．ｇｐ９６−ペプチド複合体の調製及び精製
用いることができる手順を以下に記載するが、これは例として示すに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない：
３０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と１ｍＭ ＰＭＳＦとからなる、３容量のバッファーに腫瘍のペレットを再懸濁させ、細胞を氷上で２０分膨潤させる。次に、９５％以上の細胞が溶解するまで、細胞ペレットをダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（ホモジナイザーの適切なクリアランスは、各細胞型に応じて変動する）で均質化させる。

溶解物を１，０００ｇで１０分遠心することにより、破壊されていない細胞、核及びその他の細胞屑を除去する。次に、この遠心分離ステップで得られた上清を１００，０００ｇで９０分再遠心する。１００，０００ペレット又は上清のいずれかから、ｇｐ９６−ペプチド複合体を精製することができる。

上清から精製したら、この上清を等量の２×溶解バッファーで希釈した後、２ｍＭ Ｃａ^２＋及び２ｍＭ Ｍｇ^２＋を含むＰＢＳで平衡化させたＣｏｎＡセファロースと４℃で２〜３時間混合する。次に、このスラリーをカラムにパッキングした後、ＯＤ_２８０がベースラインに下降するまで、１×溶解バッファーで洗浄する。次に、２ｍＭ Ｃａ^２＋及び２ｍＭ Ｍｇ^２＋を含むＰＢＳ中に溶解させた１／３カラム床容量の１０％α−メチルマンノシド（α−ＭＭ）でカラムを洗浄した後、カラムをパラフィン片で密封してから、３７℃で１５分インキュベートする。次に、カラムを室温まで冷却し、カラム底部からパラフィンを除去する。５カラム容量のα−ＭＭバッファーをカラムに導入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶離液を分析する。典型的には、得られる物質は約６０〜９５％純粋であるが、これは、用いた細胞型及び組織対溶解バッファー比によって異なる。次に、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を含むバッファーで平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサンプルをアプライする。０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いてカラムからタンパク質を溶離させると、ｇｐ９６分画が、４００ｍＭ〜５５０ｍＭ ＮａＣｌの間で溶離する。

しかし、この手順は、２つの別のステップ（単独又は組み合わせて用いることができる）によって改変することにより、見かけ上均質なｇｐ９６−ペプチド複合体を常に生成することも可能である。１つの任意ステップは、ＣｏｎＡ精製ステップの前に硫酸アンモニウム沈殿を行なうものであり、もう一つの任意ステップは、ＣｏｎＡ精製ステップ後で、しかもＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣステップ前にＤＥＡＥ−セファロース精製を実施するものである。

第１の任意ステップを以下に例として説明するが、このステップでは、１００，０００ｇ遠心ステップから得られた上清を、硫酸アンモニウムの添加により、最終濃度が５０％硫酸アンモニウムとなるようにする。硫酸アンモニウムは、氷水のトレイ内に配置したビーカー中の溶液を穏やかに攪拌しながら、ゆっくりと添加する。この溶液を４℃で０．５〜１２時間攪拌し、得られた溶液を６，０００ｒｐｍで遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）。このステップから得られた上清を取り出し、硫酸アンモニウム溶液の添加により、７０％硫酸アンモニウム飽和に到らせた後、６，０００ｒｐｍで遠心する（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）。このステップから得られたペレットを回収し、７０％硫酸アンモニウムを含むＰＢＳ中に懸濁させることにより、ペレットをすすぐ。この混合物を６，０００ｒｐｍで遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）した後、２ｍＭ Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を含むＰＢＳ中にペレットを溶解させる。非溶解物質を１５，０００ｒｐｍでの短い遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター）により除去する。次に、溶液をＣｏｎＡセファロースと混合した後、前記と同様の手順を実施する。

第２の任意ステップを以下に例として説明するが、このステップでは、ＣｏｎＡカラムから溶離した分画を含むｇｐ９６をプールした後、透析により、又は好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上でのバッファー交換により、バッファーを５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ ＮａＣｌと交換する。バッファー交換後、予め５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化させておいたＤＥＡＥ−セファロースと溶液を混合する。タンパク質溶液とビーズを１時間穏やかに混合し、カラムに注ぎ込む。次に、２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに降下するまで、カラムを５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、３００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次に、５容量の５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、７００ｍＭ ＮａＣｌを含むカラムから、結合したタンパク質を溶離する。タンパク質を含む分画をプールし、５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で希釈することにより、塩濃度を１７５ｍＭまで低下させる。５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化させたＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、得られた物質を導入し、ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と結合したタンパク質を前記と同様に溶離する。

しかし、当業者であれば、通常の実験により、第２の任意ステップを精製プロトコールに組み込む利点の評価を理解できる。さらに、任意ステップの各々を加える利点が、出発材料の供与源によって異なることも理解できる。

ｇｐ９６分画を１００，０００ｇペレットから単離する場合、このペレットを１％デオキシコール酸ナトリウム又は１％オクスチル（oxtyl）グルコピラノシドのいずれかを含む５容量のＰＢＳ（ただし、Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋は含まない）中に懸濁させ、氷上で１時間インキュベートする。懸濁液を２０，０００ｇで３０分遠心し、得られた上清をＰＢＳのいくつかの変種（同様に、Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋を含まない）に対して透析することにより、界面活性剤を除去する。透析物を１００，０００ｇで９０分遠心し、上清を回収した後、カルシウム及びマグネシウムを上清に添加することにより、それぞれ、最終濃度を２ｍＭとする。次に、非改変又は改変した方法のいずれかでサンプルを精製することにより、ｇｐ９６−ペプチド複合体を１００，０００ｇ上清から単離する（前記参照）。

以上の手順を用いて、ｇｐ９６−ペプチド複合体を見かけ均質性まで精製することができる。約１０〜２０μｇのｇｐ９６を１ｇ細胞／組織から単離することができる。

４．３．４．α２Ｍの調製及び精製
α−２−マクログロブリンは、市販のものを購入してもよいし、又はヒトの血液から精製して調製してもよい。血液からα２Ｍを精製するために、例として以下のプロトコールを用い得るが、これに限定されるものではない。

被験者から血液を採取し、凝血させる。次に、１４，０００×ｇで３０分遠心して血清を取得し、それを０．０４Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．６）及び０．３Ｍ ＮａＣｌで平衡化したゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００Ｒ）にアプライする。約１０ｍｌの血清について６５ｍｌのカラムを使用する。画分を３ｍｌ回収し、各画分を、α２Ｍ特異的抗体を用いてドットブロットによりα２Ｍの存在について試験する。α２Ｍ陽性画分をプールし、ＰＤ１０カラムにアプライして、バッファーを、ＰＭＳＦ添加０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と交換する。次にプールした画分をリン酸バッファーで平衡化したＣｏｎＡカラム（１０ｍｌ）にアプライする。カラムを洗浄し、５％メチルマンノースピラノシドを用いてタンパク質を溶出する。溶出液をＰＤ１０カラムに通過させて、バッファーを酢酸ナトリウムバッファー（０．０５Ｍ；ｐＨ６．０）と交換する。続いてＤＥＡＥカラムを酢酸バッファーで平衡化し、サンプルをこのＤＥＡＥカラムにアプライする。カラムを洗浄し、０．１３Ｍ酢酸ナトリウムを用いてタンパク質を溶出させる。次にα２Ｍを含む画分をプールする。α２Ｍは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりアッセイしたように、この手法を用いて見かけ均質となるよう精製しうる。

４．３．５．熱ショックタンパク質及びα２Ｍの組換え発現
本発明の特定の実施形態では、ＨＳＰ及びα２Ｍは、組換え手法によりＨＳＰ及びα２Ｍを高レベルで発現する細胞から調製することができる。多くのＨＳＰ及びα２Ｍのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースから一般に入手可能である。Ｅｎｔｒｅｚなどのコンピュータープログラムを用いて、データベースを閲覧することができ、目的とするアミノ酸配列及び遺伝子配列をアクセッション番号により検索することができる。また、これらのデータベースは、アラインメントスコアや統計によって類似の配列を分類する、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴのようなプログラムを用いて、問合せ配列に対し様々な程度の類似性を有する配列を同定するために検索することもできる。本発明の組成物、方法、並びに、ＨＳＰペプチド複合体の調製に用いることができるＨＳＰのヌクレオチド配列としては、限定するものではないが下記のものが挙げられる：ヒトＨＳＰ７０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２４７４３（Huntら、1995, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 82:6455-6489）；ヒトＨＳＰ９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１８３（Yamazakiら、Nucl. Acids Res. 17:7108）；ヒトｇｐ９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１８７（Makiら、1990, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 87:5658-5562）；ヒトＢｉＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１９６４５（Tingら、1988, DNA 7:275-286）；ヒトＨＳＰ２７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２４７４３（Hickeyら、1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45）；マウスＨＳＰ７０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３５０２１（Huntら、1990, Gene 87:199-204）：マウスｇｐ９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１６３７０（Srivastavaら、1987, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 85:3801-3811）；及びマウスＢｉＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１６２７７（Haasら、1988, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 85:2250-2254）。ＨＳＰをコードする縮重配列もまた使用しうる。

本明細書において使用される用語「α２Ｍ」は、α２Ｍと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有し、かつ抗原ペプチドと複合体を形成可能なα２Ｍの他のポリペプチド断片、類似体及び変異体を包含する。ここで複合体は、抗原提示細胞により取り込まれることができ、抗原分子に対する免疫応答を誘発しうるものである。本発明のα２Ｍ分子は、市販品を購入する、天然源より精製する（Kureckiら、1979, Anal.Biochem. 99:415-420）、化学合成する、又は組換えにより生成することができる。本発明のα２Ｍポリペプチドの調製のために使用しうるα２Ｍ配列の例としては、限定するものではないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１１３１３、Ｐ０１０２３、ＡＡＡ５１５５１、Kanら、1985, Proc.Nat.Acad.Sci. 82:2282-2286が挙げられる。α２Ｍをコードする縮重配列もまた使用しうる。

目的とするＨＳＰ又はα２Ｍをコードするヌクレオチド配列を同定した後、ヌクレオチド配列、又はその断片を取得し、これを組換え発現用の発現ベクターにクローニングする。次に、上記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、ＨＳＰ又はα２Ｍを複製させることができる。ＨＳＰ又はα２Ｍの組換え生産の方法は、本明細書に詳細に記載する。

上記ＤＮＡは、標準的な分子生物学的方法を用いて、ＤＮＡ増幅を行うことによって、又はある組織、細胞培養物、若しくはクローン化ＤＮＡ(例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」)から直接的に分子クローニングを行うことによって得ることができる（例えば、Methods in Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press；Sambrookら、1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら（編） Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。なお、各文献は参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。ゲノムＤＮＡ由来のクローンはコード領域の他に調節領域及びイントロンＤＮＡ領域を含んでいる可能性がある。ｃＤＮＡ由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、ＨＳＰ又はα２Ｍ遺伝子は、遺伝子の増殖のためには適切なベクター中にクローニングする必要がある。

好ましい実施形態では、関連する又は相同なＨＳＰ又はα２Ｍの既知の配列から設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡを増幅できる。ＰＣＲを用いて、ＤＮＡクローン又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリーにおける所望の配列を増幅した後、選択ｓるう。ＰＣＲは、例えばサーマルサイクラー及びＴａｑポリメラーゼ（商標名ＧｅｎｅＡｍｐで市販）を用いて行なうことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、目的の遺伝子又は遺伝子断片を得るために一般に用いられている。例えば、所望する任意の長さのＨＳＰ又はα２Ｍをコードするヌクレオチド配列を、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列に隣接するＰＣＲプライマーを用いて生成することができる。或いは、ＨＳＰ又はα２Ｍ遺伝子配列を、そのような部位が利用可能である場合は制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断して、ＨＳＰ又はα２Ｍ遺伝子をコードするＤＮＡの断片を取り出すことができる。都合のよい制限部位が利用可能でない場合は、当該技術分野において既知の部位特異的突然変異誘発法及び／又はＤＮＡ増幅法により適当な位置にそのような部位を作製することができる（例えば、Shankarappaら, 1992, ＰＣＲ Method Appl. 1:277-278を参照されたい）。次に、ＨＳＰ又はα２ＭをコードするＤＮＡ断片を単離し、正常な翻訳リーディングフレームが維持されるように注意しながら適当な発現ベクターに連結する。

別の実施形態では、ゲノムＤＮＡからのＨＳＰ又はα２Ｍ遺伝子の分子クローニングのために、ＤＮＡ断片を生成してゲノムライブラリーを形成する。関連するＨＳＰ又はα２Ｍをコードする配列のうちの幾つかは入手し精製して標識化することができるので、ゲノムＤＮＡライブラリー中のクローニングされたＤＮＡ断片を、標識化プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングできる（Benton及びDavis, 1977, Science 196:180; Grunstein及びHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。これにより、該プローブと実質的な相同性を有するＤＮＡ断片がハイブリダイズすることとなる。制限酵素消化、及び、既知の制限酵素地図から予想される断片サイズとの比較により、適当な断片を同定することもまた可能である。

ＨＳＰ又はα２ＭのゲノムＤＮＡを単離することに替わる方法としては、限定されるものではないが、既知の配列から遺伝子配列自体を化学的に合成すること、又は、ＨＳＰ又はα２ＭをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成することが挙げられる。例えば、ＨＳＰ又はα２Ｍ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡは、ＨＳＰ又はα２Ｍを発現する細胞から単離できる。ｃＤＮＡライブラリーを当該技術分野で既知の方法により作製して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために開示されている方法などの方法によりスクリーニングすることができる。ＨＳＰ又はα２Ｍに対する抗体が入手できるのであれば、ＨＳＰ又はα２Ｍは、ＨＳＰ又はα２Ｍ合成クローンである可能性の有るものへの標識化抗体の結合により同定することができる。

ＨＳＰ又はα２Ｍをコードするヌクレオチド配列のクローニングのための他の特定の実施形態を以下に示す（これは例であって限定するためのものではない）：ある特定の実施形態では、あるファミリーに属するＨＳＰ又はα２Ｍをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の種々のストリンジェンシー条件下（異種間ハイブリダイゼーションに用いられる条件を含む）においてＨＳＰ又はα２Ｍをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションすることにより同定し、得ることができる。

発現されるペプチド配列にアミノ酸の置換を引き起こす目的で、又は、以後の操作が容易になるように制限部位を作製／欠失するために、当該技術分野において既知の突然変異誘発のためのあらゆる技術を用いて、ＤＮＡ配列における個々のヌクレオチドを改変することができる。かかる技術には、限定するものではないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Hutchinsonら, 1978, J. Biol. Chem 253:6551）、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; Hillら, 1987, Methods Enzymol. 155:558-568）、ＰＣＲに基づく重複伸長（Hoら, 1989, Gene 77:51-59）、ＰＣＲに基づくメガプライマー突然変異誘発（Sarkarら, 1990, Biotechniques, 8:404-407）などが含まれる。改変は、二本鎖ジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列決定により確認することができる。

特定の実施形態において、分泌されないＨＳＰの分泌形態をコードする核酸を用いて、本発明の方法を実施することができる。そのような核酸は、ＥＲ保持シグナルであるＫＤＥＬをコードする配列を欠失させることにより構築することができる。場合により、このＫＤＥＬコード配列を分子標識（例えばマウスＩｇＧ１のＦｃ部分）と置換することにより、ＨＳＰの認識と精製を容易にすることができる。別の実施形態において、分子標識は、天然に分泌されるＨＳＰ又はα２Ｍに付加してもよい。ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４２１２１号は、ｇｐ９６のＥＲ保持シグナルを欠失させた結果、ｇｐ９６−Ｉｇペプチド複合体がトランスフェクト癌細胞から分泌され、マウスＩｇＧ１とＫＤＥＬ−欠失ｇｐ９６を融合させた結果、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる検出が容易となり、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができたことを示している。

４．３．５．１．発現系
ＨＳＰ又はα２Ｍ分子をコードするヌクレオチド配列は、組換え細胞において増殖及び発現するために発現ベクターに挿入することができる。発現構築物とは、本明細書中で使用する場合、適切な宿主細胞中でのＨＳＰ又はα２Ｍ分子の発現を可能にする１以上の調節領域と機能的に連結されたＨＳＰ又はα２Ｍをコードするヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結された」とは、調節領域と発現しようとするＨＳＰ又はα２Ｍのポリペプチド配列とが、ＨＳＰ又はα２Ｍの配列が転写及び最終的には翻訳されるように連結され、配置されている関係を指す。ＨＳＰ又はα２Ｍの発現のために、種々の発現ベクターを用いることが可能であり、例えば限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、又は改変ウイルスが挙げられる。例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミドなどが挙げられる。典型的には、そのような発現ベクターは、適当な宿主細胞において該ベクターが増殖するための機能的な複製起点、ＨＳＰ又はα２Ｍの遺伝子配列を挿入するための１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１以上の選択マーカーを含む。

哺乳動物宿主細胞中でのＨＳＰ又はα２Ｍの発現には、種々の調節領域を用いることができ、そのようなものとしては例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で有用と考えられる誘導性プロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性の長い末端反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、及びＨＳＰ７０遺伝子と結合しているものが挙げられる(Williamsら, 1989, Cancer Res. 49:2735-42; Taylorら, 1990, Mol. Cell Biol., 10:165-75)。宿主細胞内でのＨＳＰ又はα２Ｍの発現効率は、ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β−アクチン内に見出されるものなどの適切な転写エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含ませることによって増強することができる（Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544; Gorman, 1990, Curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47を参照されたい）。

発現ベクターはまた、２つ以上のタイプの宿主細胞でのベクターの維持と複製を可能にする、又はそのベクターを宿主の染色体中に組み入れることを可能にする配列をも含むことができる。そのような配列としては、限定はされないが、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ、及びテロメアＤＮＡが挙げられうる。また、少なくとも２つのタイプの宿主細胞中で複製し維持されうるシャトルベクターを用いることも有利でありうる。

さらに、発現ベクターは、ＨＳＰ又はα２ＭをコードするＤＮＡを含んでいる宿主細胞を最初に単離若しくは同定するための選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことができる。ＨＳＰ又はα２Ｍの長期にわたる高収率の産生のためには、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。哺乳動物細胞では多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalski及びSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）の遺伝子をそれぞれｔｋ⁻、ｈｇｐｒｔ⁻、若しくはａｐｒｔ⁻胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も次のものの選択の基礎として用いることができる：ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）（この酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する；Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567；O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；ｇｐｔ（これはミコフェノール酸への耐性を付与する；MulliganとBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）；及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する；Santerreら, 1984, Gene 30:147）。他の選択マーカー、例えば、限定はされないが、ヒスチジノール及びＺｅｏｃｉｎ^ＴＭも用いることができる。

調節領域と機能的に連結されたＨＳＰ又はα２Ｍのコード配列を含む発現構築物を、それ以上クローニングすることなく、本発明のＨＳＰ又はα２Ｍの複合体の発現及び産生のための適切な宿主細胞中に直接的に導入することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。発現構築物にはまた、コード配列の宿主細胞ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするＤＮＡ配列を含ませることができる。この場合には、宿主細胞中でのＨＳＰ又はα２Ｍ分子の増幅と発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。

クローニングされたＨＳＰ又はα２Ｍのコード配列を含む発現構築物を、当該技術分野で既知の種々の技術によって哺乳動物宿主細胞内に導入することができ、そのような技術としては、限定されないが、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（Wiglerら, 1977, Cell 11:223-232）、リポソーム介在トランスフェクション（Schaefer-Ridderら, 1982, Science 215:166-168）、エレクトロポレーション（Wolffら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344）、及びマイクロインジェクション（Cappechi, 1980, Cell 22:479-488）が挙げられる。

本明細書中に記載するクローニングベクター及び発現ベクターのいずれも、当該技術分野で周知の技術により既知のＤＮＡ配列から合成し組み立てることができる。調節領域及びエンハンサーエレメントは、天然及び合成のどちらであってもよい種々の起源のものとすることができる。ベクター及び宿主細胞には市販されているものもある。有用なベクターの非限定的な例は、Current Protocols in Molecular Biology, 1988, Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceの補遺5（これは参照により本明細書中に組み入れる）；並びにClontech Laboratories, Stratagene Inc., 及びInVitrogen, Incのような業者のカタログに記載されている。

あるいは、いくつかのウイルスに基づく発現系もまた、ＨＳＰ又はα２Ｍの組換え発現のために、哺乳動物細胞と共に利用できる。ＤＮＡウイルスのバックボーンを利用するベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Hamerら, 1979, Cell 17:725）、アデノウイルス（Van Dorenら, 1984, Mol Cell Biol 4:1653）、アデノ随伴ウイルス（McLaughlinら, 1988, J Virol 62:1963）、及びウシパピローマウイルス（Zinnら, 1982, Proc Natl Acad Sci 79:4897）に由来している。アデノウイルスが発現ベクターとして利用される場合は、供与ＤＮＡ配列をアデノウイルス転写／翻訳制御領域（例えば後期プロモーター及び三部リーダー配列）に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換え手法によりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）へ挿入すればその結果として、感染宿主内で生存することができ且つ異種産物を発現することができる組換えウイルスが得られることになる（例えばLogan及びShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659を参照されたい）。

ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染することができ、そしてそのＤＮＡはエピソームとして複製する。安定で、多コピー型の（２０〜３００コピー／細胞）染色体外エレメントとして哺乳動物細胞中に存在する多くのシャトルベクターが、組換え遺伝子発現のために開発されている。典型的には、これらのベクターは、ＢＰＶ ＤＮＡ（全ゲノム又は６９％形質転換断片）のある部分断片、広範な宿主範囲を有するプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、選択マーカー、及び該ベクターが大腸菌内で増殖することが可能となる「無毒の」プラスミド配列を含む。細菌内での構築及び増殖の後に、該発現遺伝子構築物を、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーションの技術により、培養した哺乳動物細胞内へトランスフェクトする。形質転換された表現型を表さないこれらの宿主細胞については、形質転換体の選択はヒスチジノール及びＧ４１８耐性のような優性選択マーカーを用いて行われる。例えばｐＢＣＭＧＳＮｅｏ及びｐＢＣＭＧＨｉｓのようなＢＰＶベクターを用いて、ＨＳＰ又はα２Ｍを発現することができる（Karasuyamaら, Eur. J. Immunol. 18:97-104; Oheら, Human Gene Therapy, 6:325-33）。該ベクターは続いてＨＳＰ又はα２Ｍの発現のために広範な細胞型にトランスフェクトすることができる。

あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することもできる（例えば、Mackettら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackettら, 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicaliら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927-4931を参照されたい）。ヒト宿主細胞を使用する場合は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）起点（ＯｒｉＰ）及びＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１；トランス作用複製因子）に基づくベクターを使用することができる。かかるベクターは広範なヒト宿主細胞に使用できる（例えば、ＥＢＯ−ｐＣＤ（Spickofskyら, 1990, DNA Prot Eng Tech 2:14-18）、ｐＤＲ２及びλＤＲ２（Clontech Laboratoriesから入手可能））。

組換えＨＳＰ又はα２Ｍの発現はまた、レトロウイルスに基づく発現系を用いて実施することもできる。トランスフェクションとは対照的に、レトロウイルスは、例えば主な造血細胞を含む広範な細胞型に効率的に感染して遺伝子を導入することができる。モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルスでは、ウイルス遺伝子配列の大部分を取り除き、ＨＳＰ又はα２Ｍのコード配列で置換することができる。この際、失われたウイルスの機能はトランス活性で供給することができる。レトロウイルスベクターで感染する宿主の範囲はまた、ベクターパッケージングに用いるエンベロープの選択により操作することができる。

例えば、あるレトロウイルスベクターは、５’長い末端反復配列（ＬＴＲ）、３’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、細菌の複製起点及び選択マーカーを含むことができる。ＮＤ関連抗原ペプチドＤＮＡは５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間の位置に挿入されて、５’ＬＴＲプロモーターからの転写によりクローニングされたＤＮＡが転写されるようになる。５’ＬＴＲは、ＬＴＲプロモーターを含むがこれには限らないプロモーター、Ｒ領域、Ｕ５領域及びプライマー結合部位をこの順で含む。これらのＬＴＲエレメントのヌクレオチド配列は当該技術分野において周知である。また異種プロモーター並びに複数の薬剤選択マーカーを、感染細胞の選択を容易にするために発現ベクターに含めることもできる（McLauchlinら, 1990, Prog. Nucleic Acid Res. 及び Molec. Biol. 38:91-135；Morgensternら, 1990, Nucleic Acid Res. 18:3587-3596；Choulikaら, 1996, J. Virol 70:1792-1798；Boesenら, 1994, Biotherapy 6:291-302；Salmons及びGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；及びGrossman及びWilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114を参照のこと）。

組換え細胞は、温度、インキュベーション時間、吸光度、及び培地組成の標準的な条件下で培養することができる。あるいはまた、細胞は、ＨＳＰが内因的に発現される細胞の栄養素要求性及び生理学的要求性に適合する条件下で培養することができる。またＨＳＰ−ペプチド複合体の産生を増強するために、改変された培養条件及び培地を用いてもよい。例えば、ＨＳＰ発現の誘導を促進する条件下にて組換え細胞を増殖させることができる。

本発明のα−２−マクログロブリン及びＨＳＰポリペプチドは、発現される細胞からの回収及び精製が容易になるように融合タンパク質として発現させることができる。例えば、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドが、培養培地中に分泌されるように、それがＥＲ膜を横切って輸送を指令するシグナル配列リーダーペプチドを含んでいてもよい。更には、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドは、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドの、抗原ペプチドの結合に関与しない任意の位置（例えば、カルボキシル末端等）に融合されたアフィニティーラベルなどのアフィニティーラベルを含んでいてもよい。アフィニティーラベルを用いて、アフィニティーパートナー分子に結合することによりタンパク質の精製を容易にすることができる。

このような融合タンパク質の種々の産生方法が当該技術分野において周知である。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子又はタンパク質のレベルで、好ましくは遺伝子のレベルで行なうことができる。例えば、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドのクローニングされたコード領域を、当該技術分野において既知の多くの組換えＤＮＡ法のうちのいずれかにより改変することができる（Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkの第８章の Ausubelら）。置換、欠失、挿入又はそれらの任意の組合わせを導入するか又は結合することによってＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドをコードする最終的なヌクレオチド配列を得ることは、以後の議論から明らかであろう。

種々の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を用いてＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドを含む融合タンパク質を作製することができる。例えば、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドがペプチドで標識された融合タンパク質として発現されるように、アフィニティーラベルの配列を含むベクター内に適切なリーディングフレームでＨＳＰ又はα２Ｍ遺伝子断片を導入することにより、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドをコードする組換え遺伝子を構築することができる。特定の結合パートナーに認識され得るアフィニティーラベルが、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドのアフィニティー精製のために使用できる。

好ましい実施形態では、アフィニティーラベルはＨＳＰ又はα２Ｍのアミノ末端からカルボキシル末端にて融合される。カルボキシル末端において融合が起こる正確な部位は重要ではない。最適な部位は、日常的な実験により決定できる。

当該技術分野において既知の種々のアフィニティーラベルを使用することができ、例えば、限定されるものではないが、免疫ブロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubelら編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience中の、Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Guanら, 1987, Gene 67:21-30）、及び種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号；第５，２０２，２４７号；第５，１３７，８１９号；Tommeら, 1994, Protein Eng. 7:117-123）などが挙げられる。例えば緑色蛍光タンパク質の一部分などの他のアフィニティーラベルにより、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドに蛍光特性を付与できる。他の可能性のあるアフィニティーラベルは、モノクローナル抗体に利用可能である短いアミノ酸配列であり、例えば限定されるものではないが、以下の周知の例、すなわちＦＬＡＧエピトープ、アミノ酸４０８−４３９でのｍｙｃエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープなどが挙げられる。他のアフィニティーラベルは特異的な結合パートナーにより認識され、従って、固相支持体上に固定化され得る結合パートナーへのアフィニティー結合により単離が容易となる。いくつかのアフィニティーラベルは、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドに新しい構造上の特性、例えば多量体を形成する能力をもたらすことができる。結合したペプチドによるＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドの二量体化は、抗原提示の過程でＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドとそのパートナーとの間の相互作用の結合力を上昇させることができる。これらのアフィニティーラベルは、一般的には通常はホモポリマーとして存在するタンパク質から導かれる。ＣＤ８の細胞外ドメイン（Shinueら, 1988, J. Exp. Med. 168:1993-2005）若しくはＣＤ２８（Leeら, 1990. J. Immunol. 145:344-352）、又は鎖間のジスルフィド結合のための部位を含む免疫グロブリン分子の一部分のようなアフィニティーラベルにより、多量体が形成され得る。当業者であれば理解されるように、限定されないが、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、及び合成方法を含む多くの方法を用いて、上記アフィニティーラベルのコード領域を得ることができる。アフィニティーラベル並びにその検出及び単離のための試薬には市販されているものがある。

好ましいアフィニティーラベルは、免疫グロブリン分子の非可変部分である。典型的には、かかる部分は少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に働くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のカルボキシル末端、又は重鎖若しくは軽鎖のＣ１に対してすぐ接するアミノ末端の領域を用いて行なう。好適な免疫グロブリンに基づくアフィニティーラベルは、ＩｇＧ−１、−２、−３若しくは−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１からである。ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドをヒトに対してｉｎ ｖｉｖｏで使用することを意図するのであれば、好ましくは、ヒト免疫グロブリンを使用する。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常領域をコードする多くのＤＮＡが、知られているか、又はｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能である。例えば、Adamsら, Biochemistry, 1980, 19:2711-2719; Goughら, 1980, Biochemistry, 19:2702-2710; Dolbyら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:6027-6031; Riceら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:7862-7865; Falknerら, 1982, Nature, 298:286-288; 及びMorrisonら, 1984, Ann. Rev. Immunol, 2:239-256を参照されたい。免疫グロブリンの検出に関しては、多くの免疫学的試薬及びラベル系が利用可能であるので、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等を使用するなど当該技術分野において既知の種々の免疫学的技術により、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチド−Ｉｇ融合タンパク質は容易に検出及び定量することができる。同様に、アフィニティーラベルが容易に入手できる抗体に対するエピトープである場合は、かかる試薬を使用し、上記の技術を用いて、アフィニティーラベルを含むＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドを検出、定量及び単離することができる。多くの例において、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドに特異的な抗体を作製する必要はない。

特に好ましい実施形態は、ＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドの、ヒト免疫グロブリンＧ−１（ＩｇＧ１；Bowenら, 1996, J. Immunol. 156:442-49を参照されたい）のヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインへの融合体である。このヒンジ領域は、通常はＩｇ分子中の他のシステインとのジスルフィド結合に関与する３つのシステイン残基を含む。当該システインはいずれもペプチドが標識として機能するためには必要ではないので、これらのシステイン残基のうちの１つ以上が、例えばセリンのような他のアミノ酸残基により任意に置換されていてもよい。

当該技術分野において既知の種々のリーダー配列は、細菌細胞及び哺乳動物細胞からＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチドを効率的に分泌させるために使用することができる（von Heijne, 1985, J. Mol. Biol. 184:99-105）。リーダーペプチドは、対象とする宿主細胞に基づいて選択され、細菌、酵母、ウイルス、動物及び哺乳動物の配列を含んでいてもよい。例えば、ヘルペスウイルス糖タンパクＤリーダーペプチドが種々の哺乳動物細胞に使用するのに好適である。哺乳動物細胞に使用するための好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンκ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域から得ることができる（Bernardら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5812-5816）。細菌細胞においてＨＳＰ又はα２Ｍポリペプチド発現を標的化するための好ましいリーダー配列には、大腸菌タンパク質ＯｍｐＡ（Hobomら, 1995, Dev. Biol. Stand. 84:255-262）、ＰｈｏＡ（Okaら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212-16）、ＯｍｐＴ（Johnsonら, 1996, Protein Expression 7:104-113）、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦ（Hoffman及びWright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5107-5111）、β−ラクタマーゼ（Kadonagaら, 1984, J. Biol. Chem. 259:2149-54）、エンテロトキシン（Morioka-Fujimotoら, 1991, J. Biol. Chem. 266:1728-32）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（Abrahmsenら, 1986, Nucleic Acids Res. 14:7487-7500）及びＢ．ズブチリス（B. subtilis）エンドグルカナーゼ（Loら, Appl. Environ. Microbiol. 54:2287-2292）並びに人工及び合成シグナル配列（MacIntyreら, 1990, Mol. Gen. Genet. 221:466-74; Kaiserら, 1987, Science, 235:312-317）が含まれるがこれらには限らない。

ライブラリーから容易に得ることができる、合成により生産することができる、又は業者から入手することができる所望のアフィニティーラベル又はリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列は、本発明の実施のために好適である。かかる方法は当該技術分野において周知である。

４．４．タンパク質及びペプチドとＨＳＰ及びα２Ｍとの複合体化
ＨＳＰ又はα２Ｍと、抗原性細胞、その細胞画分又はウイルス粒子から調製されたタンパク質及び／又はペプチド集団とをｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化するための方法の例を本明細書に記載する。タンパク質及び／又はペプチドの集団は、第４．２．１節に記載のような抗原性細胞のタンパク質調製物に由来する。特定の実施形態において、ペプチドは、抗原性細胞、その細胞画分又はウイルス粒子のタンパク質調製物の消化の結果物である。複合体化反応によって、ＨＳＰと抗原性細胞又はウイルス粒子のタンパク質又はペプチドとの共有結合の形成が生じうる。複合体化反応によって、α２Ｍと抗原性細胞又はウイルス粒子のタンパク質又はペプチドとの共有結合の形成が生じうる。複合体化反応によって、ＨＳＰとタンパク質及び／又はペプチドとの非共有結合、あるいはα２Ｍとタンパク質及び／又はペプチドとの非共有結合の形成が生じることもある。

複合体化の前に、ＨＳＰをＡＴＰで前処理又は酸性条件に暴露することにより、目的とするＨＳＰと非共有結合している可能性のあるペプチドを全て除去する。ＡＴＰ手法を用いる場合には、Levyら、1991, Cell 67:265-274により記載されているように、過剰なＡＴＰをアピラーゼ（apyranase）の添加により調製物から除去する。酸性条件を用いる場合には、ｐＨ調節試薬の添加により、バッファーのｐＨを中性ｐＨとなるよう再調節する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてペプチド集団（平均７〜２０アミノ酸長）とＨＳＰ又はα２Ｍとを非共有結合で複合体化させるための好ましいプロトコールの例を以下に記載する。

ペプチド集団（１μｇ）と前処理したＨＳＰ（９μｇ）を混合して、ペプチド（又はタンパク質）約５：ＨＳＰ１のモル比を達成する。次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２と１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含むバッファーなどの好適な結合バッファー中で、上記混合物を４〜４５℃で、１５分〜３時間インキュベートする。調製物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０アセンブリー（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）により遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。タンパク質／ペプチドとＨＳＰとの非共有結合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は質量分析法（ＭＳ）によりアッセイすることができる。

ＨＳＰ７０とタンパク質／ペプチドとの非共有結合複合体を生成するのに好ましい本発明の別の実施形態では、５〜１０μｇの精製ＨＳＰ７０を等モル量のタンパク質／ペプチドと一緒に、容量が１００μＬの２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び１ｍＭ ＡＤＰにおいて３７℃で１時間インキュベートする。このインキュベーション混合物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０アセンブリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により必要であれば１回以上遠心して、非結合ペプチドを除去する。

ｇｐ９６又はＨＳＰ９０とペプチドとの非共有結合複合体を生成するのに好ましい本発明の別の実施形態では、５〜１０μｇの精製ｇｐ９６又はＨＳＰ９０を等モル量又は過剰量のタンパク質／ペプチドと一緒に、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｎＭ ＭｇＣｌ_２を含むバッファーのような好適なバッファーにおいて６０〜６５℃で５〜２０分インキュベートする。このインキュベーション混合物を室温まで冷却させ、必要であれば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０アセンブリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１回以上遠心分離することにより、非結合ペプチドを全て除去する。

抗原タンパク質及び／又は抗原ペプチドとの複合体形成の後、場合により、例えば以下に説明する混合リンパ球標的細胞アッセイ（ＭＬＴＣ）を用いて、免疫原ＨＳＰ又はα２Ｍ複合体をアッセイしてもよい。ＨＳＰ−ペプチド複合体及び／又はＨＳＰ−タンパク質複合体を単離し、希釈した後、場合により、以下に説明する好ましい投与プロトコール及び賦形剤を用いて、これら複合体をさらに動物モデルにおいて特性決定してもよい。

ＨＳＰとタンパク質／ペプチドとの非共有結合複合体を作製するための別法では、タンパク質／ペプチドの集団をＨＳＰと共有結合により結合させてもよい。

一実施形態において、ＨＳＰは、化学的架橋によりタンパク質調製物中のタンパク質及び／又はペプチドと共有結合させる。化学的架橋方法は当該技術分野において周知である。例えば好ましい実施形態では、グルタルアルデヒド架橋を使用することができる。グルタルアルデヒド架橋はペプチドとＨＳＰとの共有結合による複合体形成のために使用されている（Barriosら, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372を参照されたい）。好ましくは、１〜２ｍｇのＨＳＰ−ペプチド複合体を０．００２％のグルタルアルデヒドの存在下にて２時間かけて架橋させる。グルタルアルデヒドはリン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)に対する終夜にわたる透析により除去される（Lussowら, 1991, Eur. J. Immunol. 21:2297-2302）。あるいは、当技術分野で公知の条件下にて紫外線（ＵＶ）架橋によりＨＳＰとタンパク質／ペプチド集団とを架橋しうる。

本発明の別の実施形態においては、タンパク質調製物中のタンパク質及び／又はペプチドの集団とα２Ｍとを、タンパク質／ペプチドとα２Ｍとを５０：１のモル比でインキュベートすることにより非共有結合で複合体化し、５０℃にて１０分インキュベートした後、２５℃にて３０分インキュベートしうる。遊離（複合体化していない）ペプチドは、サイズ排除フィルターにより除去しうる。複合体は、好ましくはシンチレーションカウンターにより測定し、１モル当たりを基準として、各ＨＳＰ又はα２Ｍが等量のタンパク質／ペプチド（ペプチドの出発量の約０．１％）と結合していることを観察して確認する。詳細については、Binder, 2001, J.Immunol. 166(8):4968-72を参照されたい（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。これらの反応においてα２Ｍとタンパク質及びペプチドとの共有結合複合体が形成される傾向を低くするため、複合体化を行なう前にプロテアーゼ活性を阻害又は排除しておくことが望ましい。これは、プロテアーゼインヒビターの使用により、例えば第４．２．１節に記載されている方法により達成することができる。タンパク質調製物中に存在する、共有結合のためのα２Ｍを活性化する可能性のある求核化合物を中和するために、還元剤（例えば２−メルカプトエタノールなど）を反応に加えることも望ましい。

さらに別の実施形態において、タンパク質調製物中の抗原タンパク質及び／又は抗原ペプチドの集団は、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１４９７６及びＷＯ９９／５０３０３（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）に記載されているペプチドとα２Ｍとの複合体化のための方法によりα２Ｍと共有結合により複合体化させることもできる。例えば、抗原タンパク質及び／又は抗原ペプチドを、熱を用いた求核活性化の逆転反応の間にアンモニア又はメチルアミン（あるいは他の小さなアミン求核試薬、例えばエチルアミン）によりα２Ｍに組み込んでもよい（Gron及びPizzo, 1998, Biochemistry, 37:6009-6014；参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。α２Ｍによるペプチドの偶然の捕捉を可能とするような条件を用いて、本発明のα２Ｍ複合体を調製しうる。抗原タンパク質／ペプチド集団とα２Ｍとの共有結合はまた、二官能性架橋剤を用いて実施することもできる。そのような架橋剤及びその使用方法は当技術分野で周知である。好ましくは、架橋剤は、複合体形成の後に不活性化及び／又は除去される。

またさらに別の実施形態において、タンパク質／ペプチド集団を、上述した非共有結合又は共有結合の方法により同じ反応においてＨＳＰ及びα２Ｍの混合物を複合体化させてもよい。

別々の共有結合及び／又は非共有結合複合体化反応からのＨＳＰと抗原タンパク質及び／又はペプチドの複合体は、被験者に投与する前に、場合により組み合わせて組成物を形成してもよい。また、別々の共有結合及び／又は非共有結合複合体化反応からのα２Ｍと抗原タンパク質及び／又はペプチドの複合体は、被験者に投与する前に、場合により組み合わせて組成物を形成してもよい。

４．５．癌及び感染性疾患の予防と治療
本発明によれば、抗原性細胞又はウイルス粒子の消化したサイトゾル及び／又は膜由来タンパク質に由来する抗原ペプチドと、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍとの複合体を含む本発明の組成物を、癌又は感染性疾患に罹患した被験者に投与する。一実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、癌若しくは感染性疾患、又は少なくとも１つの認識可能なその症状の改善を意味する。別の実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、必ずしも被験者により認識可能ではない、癌若しくは感染性疾患に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を意味する。さらに別の実施形態では、「治療」又は「治療すること」とは、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかにより、癌又は感染性疾患の進行を阻止することを意味する。

特定の実施形態では、癌又は感染性疾患に対する予防対策として、本発明の組成物を被験者に投与する。本明細書で用いる「予防」又は「予防すること」とは、所与の癌又は感染性疾患を獲得するリスクの低減を意味する。この実施形態の一例では、癌の遺伝的素因を有する被験者に対し、予防対策として本発明の組成物を投与する。この実施形態の別の例では、限定するものではないが、化学薬品及び／又は放射線などの発癌因子への暴露を被る被験者、あるいは、感染性疾患の因子への暴露を被る被験者に、予防対策として、本発明の組成物を投与する。

本発明の治療及び予防方法においてはヒト被験者が好ましい。

本発明の方法により調製される組成物は、熱ショックタンパク質と抗原ペプチドの集団との複合体、及び／又はα−２−マクログロブリンと抗原ペプチドの集団との複合体を含む。この組成物は、腫瘍部位における炎症反応を誘導し、最終的には治療対象の癌患者における腫瘍組織量を低減させうる。本発明の方法により調製される組成物は、被験者の免疫能力を高め、病原体に対する特異的免疫又は前新生物及び新生物細胞に対する特異的免疫を誘発しうる。これらの組成物は、腫瘍細胞の発生を予防し、腫瘍細胞の増殖及び進行を阻害する能力を有する。

本発明の治療法、及びサイトゾル及び膜由来タンパク質の複合体を含む医薬組成物は、別の免疫応答増強剤又は生物応答修飾物質と一緒に用いてもよく、その例として、限定するものではないが、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、又は免疫細胞に作用する他のサイトカインが挙げられる。本発明のこの態様によれば、本発明の組成物は、１以上の上記サイトカインによる治療と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明の組成物は、癌治療のための放射線療法又は１以上の化学療法剤と一緒に投与する。

４．５．１．標的感染性疾患
本発明の方法により治療又は予防することができる感染性疾患は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物及び寄生生物などの感染因子により引き起こされる。本発明は、細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患の治療又は予防に限定されない。

本発明の方法により治療又は予防することができるウイルス性疾患として、限定するものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）により引き起こされる疾患が挙げられる。

本発明の方法により治療又は予防することができる細菌性疾患は、限定するものではないが、その生活環が細胞内段階である細菌、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア及びレジオネラなどの細菌により引き起こされる。

本発明の方法により治療又は予防することができる原生動物性疾患は、限定するものではないが、リーシュマニア、コクジジオア、及びトリパノソーマなどの原生動物により引き起こされる。

本発明の方法により治療又は予防することができる寄生生物性疾患は、限定するものではないが、クラジミア及びリケッチアなどの寄生生物により引き起こされる。

４．５．２．標的癌
本発明の方法により治療又は予防することができる癌の種類には、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経系腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病（例えば急性リンパ性及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病））；及び真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び、Ｈ鎖病が含まれるがこれらに限定されない。

ある特定の実施形態では癌は転移性である。他の特定の実施形態では、癌を有する患者は、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍ−ペプチド複合体又はＨＳＰ及び／又はα２Ｍ感作ＡＰＣを投与する前に抗癌治療（例えば化学療法、放射線療法）を受けたために免疫抑制されている。

本発明により提供される免疫療法を癌患者において使用することが望ましいのには多くの理由がある。第一には、癌患者が免疫抑制状態である場合には麻酔を用いた手術及びその後の化学療法は免疫抑制を悪化させることがある。適切な免疫療法を手術前の期間に行えばこの免疫抑制が回避されたり回復したりする可能性がある。このことは、感染の合併症の低減及び創傷の治癒の加速につながり得る。第二には、腫瘍の大きさは手術後において最も小さく、免疫療法はこの状況で効果的である可能性が高い。第三の理由は、腫瘍細胞は手術の際に循環系に流出するので有効な免疫療法をこの時点で適用すればこれらの細胞を排除することができる可能性があることである。

本発明の予防及び治療方法は、癌患者の免疫能を手術の前、手術時、又は手術後に高めること、及び、癌細胞に対する腫瘍特異的免疫を誘導することを意図するものであり、その目的は癌の阻害であり、また、最終的な臨床上の目的は癌の完全な治癒及びその根除である。本発明の方法はまた、例えば家系又は環境危険因子によりある種の癌のリスクが高い個体において用いることもできる。

４．５．３．自己由来の実施形態
ＨＳＰ及びα２Ｍの特異的免疫原性は、ＨＳＰ又はα２Ｍ自体に由来するのではなく、それらに結合した抗原ペプチドに由来する。本発明の好ましい実施形態では、癌ワクチンとして用いる本発明の組成物における複合体は、自己由来の（autologous）複合体であるため、癌免疫療法における最も困難な問題の２つを回避することができる。１つは、実験動物の癌と同様、ヒト癌は、抗原が異なる可能性があることである。本発明の好ましい実施形態では、上記の問題を回避するため、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍは抗原ペプチド及びペプチドと複合体化し、該複合体をタンパク質又はペプチドが由来する同じ被験者の癌を治療するために用いることができる。２つめは、癌免疫療法の現在最も一般的な手法が、癌細胞系のＣＴＬ−認識エピトープの決定に焦点を絞っていることである。この手法では、癌に対する細胞系及びＣＴＬが利用可能でなければならない。これらの試薬は、ヒト癌の大部分には利用不可能である。自己由来の抗原ペプチドの使用に関する本発明の実施形態では、癌免疫療法は、細胞系又はＣＴＬの利用可能性に依存せず、また、癌細胞の抗原エピトープの決定も必要としない。これらの利点によって、自己由来の抗原ペプチドに結合したＨＳＰ及び／又はα２Ｍの複合体は、魅力的な対癌免疫原となる。

他の実施形態においては、治療又は予防用複合体における抗原ペプチドは、複合体を投与する被験者と同種異型の被験者に由来する同じ種類の癌の癌組織から調製してもよい。

４．６．養子免疫療法
養子免疫療法とは、癌又は感染性疾患を治療するための治療上の手法であって、免疫細胞が、腫瘍細胞及び／若しくは抗原成分に対し特異的な免疫を直接的又は間接的に媒介する、あるいは場合によっては感染性疾患を治療するか又は腫瘍を退縮させることを目的として、免疫細胞を宿主に投与するものである（１９９９年１１月１６日に登録された米国特許第５，９８５，２７０号を参照されたい；この文献はその全体を参照により本明細書に組み入れるものとする）。

一実施形態において、養子免疫療法に使用するための抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、本明細書に記載する方法に従って調製した抗原タンパク質及びペプチドと複合体化したＨＳＰ及び／又はα２Ｍを用いて感作される。複合体は、熱ショックタンパク質又はα−２−マクログロブリンと、感染性疾患を引き起こす因子の抗原決定基を発現する抗原性細胞又はウイルス粒子に存在する少なくとも５０％の異なるタンパク質又は少なくとも１００種の異なるタンパク質に由来する抗原タンパク質との複合体化により生成しうる。複合体はまた、（ａ）上記の種の癌の細胞に由来するタンパク質調製物を、プロテアーゼによる消化、又はＡＴＰ、塩酸グアニジウム及び／若しくは酸との接触を行い、抗原ペプチドの集団を生成させ、（ｂ）抗原ペプチド集団と熱ショックタンパク質又はα−２−マクログロブリンとの複合体化により作製することもできる。

別の実施形態においては、本発明の方法により調製されたｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化された抗原ペプチドとＨＳＰ及び／又はα２Ｍの投与による治療は、当技術分野で公知の方法（例えば米国特許第５，９８５，２７０号参照）により調製されたＨＳＰ−及び／又はα２Ｍ−抗原ペプチド複合体（抗原ペプチドは、例えばある種の癌又は病原体の、所望の抗原性を示す）で感作されたＡＰＣを用いた養子免疫療法と組み合わせてもよい。感作されたＡＰＣは、単独で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化したタンパク質／ペプチドとＨＳＰ及び／又はα２Ｍと組み合わせて、あるいは、複合体化したタンパク質／ペプチドとＨＳＰ及び／又はα２Ｍの投与前若しくは投与後に投与しうる。特に、癌の予防及び治療のための感作ＡＰＣの使用は、さらに、その治療上又は予防上有効な量の複合体（熱ショックタンパク質及び／又はα２Ｍを含み、抗原タンパク質／ペプチドと複合体化され、上述のように生成された複合体）を被験者に投与することを含み得る。同様に、ある種の感染性疾患の治療又は予防における感作ＡＰＣの使用は、さらに、その治療上又は予防上有効な量の複合体（熱ショックタンパク質及び／又はα２Ｍを含み、抗原タンパク質／ペプチドと複合体化されたもの）を被験者に投与することを含み得る。

さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体化された抗原タンパク質／ペプチドとＨＳＰ及び／又はα２Ｍの投与方法は多様であり、限定するものではなく、例えば経皮、静脈内又は筋肉内投与が挙げられるが、皮内投与が好ましい。別の特定の実施形態において、本発明に従って生成された複合体で感作された抗原提示細胞の投与による養子免疫療法を、当技術分野で公知の方法（例えば、米国特許第５，７５０，１１９号、同第５，８３７，２５１号、同第５，９６１，９７９号、同第５，９３５，５７６号、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１４９７６又はＷＯ９９／５０３０３参照）により調製されたＨＳＰ−及び／又はα２Ｍ−抗原分子（例えばペプチド）複合体の投与による療法とを組み合わせてもよい。ここで抗原分子は所望の抗原性（例えばある種の癌又は病原体の抗原性）を示すものである。

４．６．１．抗原提示細胞の取得
抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞を含むがこれらに限定されない）は、好ましくは、Inaba, K.ら, 1992, J. Exp. Med. 176:1693-1702に記載のようにヒトの末梢血又は骨髄からの幹細胞及び前駆細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することにより得る。樹状細胞は当該技術分野において既知の種々の任意の方法により得ることができる。例えば限定するものではないが、樹状細胞は、Sallustoら、1994, J Exp Med 179:1109-1118及びCauxら、1992, Nature 360, 258-261（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）に記載の方法により得ることができる。このましい態様においては、ヒトの血球から得られたヒト樹状細胞を使用する。

ＡＰＣは当該技術分野において既知の種々の任意の方法により得ることができる。ある好ましい態様では、用いるヒトマクロファージをヒト血球から得る。例えばマクロファージを次のように得ることができるがこれに限定されない：
単核細胞を患者（好ましくは治療対象の患者）の末梢血から、フィコール−ハイパーク勾配遠心法により単離し、患者自身の血清又は他のＡＢ＋ヒト血清によりコーティングした組織培養ディッシュ上に播種する。該細胞を３７℃にて１時間インキュベートし、次いで付着しなかった細胞をピペッティングにより除く。該ディッシュに残された付着細胞に冷たい（４℃）リン酸緩衝化生理食塩水中１ｍＭのＥＤＴＡを添加し、室温にて１５分間静置する。細胞を回収し、ＲＰＭＩバッファーで洗浄し、ＲＰＭＩバッファー中に懸濁させた。マクロファージの数は、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）と共に３７℃にてインキュベートすることにより増加させる。

４．６．２．ＨＳＰ−ペプチド複合体又はα２Ｍ−ペプチド複合体によるマクロファージ及び抗原提示細胞の感作
ＡＰＣを、抗原分子と結合したＨＳＰ又はα２Ｍで、好ましくは該細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにて該複合体とインキュベートすることにより、感作させる。ＡＰＣを、ＨＳＰ又はα２Ｍと抗原分子の複合体で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてＨＳＰ−複合体又はα２Ｍ−複合体と共に３７℃にて１５分間〜２４時間インキュベートすることにより、感作させる。限定するものではないが、例えば、４×１０^７個の樹状細胞を、１ｍｌあたり１０μｇのｇｐ９６−ペプチド複合体と共に、又は、１ｍｌあたり１００μｇのＨＳＰ９０−ペプチド複合体と共に、３７℃にて１５分間〜２４時間、１ｍｌの無添加ＲＰＭＩ培地中でインキュベートすることができる。細胞を３回洗浄し、患者に注射するのに適切な濃度（例えば１×１０^７／ｍｌ）で好ましくは無菌の生理学的培地中に再懸濁する。好ましくは、感作された樹状細胞を注入する患者は、もともと樹状細胞を単離した患者である（自己由来の実施形態）。

場合により、感作されたＡＰＣの、例えば抗原特異的な、クラスＩに限定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激する能力を、それがＣＴＬを刺激して腫瘍壊死因子を放出させる能力によりモニターすることができ、また、それがかかるＣＴＬの標的としてはたらく能力によりモニターすることができる。

４．６．３．感作ＡＰＣの再注入
感作したＡＰＣを、通常の臨床的な手順により、好ましくは皮内投与により、患者に全身的に再注入する。これらの活性化された細胞を、好ましくは、該細胞が由来する（自己由来）患者に全身投与することにより、再注入する。患者は、該患者の状態に応じて一般的に約１０^６〜約１０^１２個の感作樹状細胞を投与される。治療計画においては場合により、患者に対し、上記に加えて、限定するものではないが、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ又はその他のサイトカイン増殖因子など、適量の生物応答修飾物質を投与してもよい。

４．７．医薬組成物及び投与方法
本発明の方法により調製されたＨＳＰ及び／又はα２Ｍに結合した抗原ペプチドの複合体は、細胞増殖性疾患又は感染性疾患を治療又は改善するために治療上有効な量で患者に投与しうる。治療上有効な量とは、かかる疾患の症状の改善をもたらすのに十分な量の複合体を意味する。

４．７．１．有効量
本発明の組成物は、抗原ペプチド集団とＨＳＰ及び／又はα２Ｍとの複合体の免疫原性の有効量を含み、これを癌又は感染性疾患に対する治療が必要な被験者に投与する。ここでこの方法は、癌又は感染性疾患に対する免疫応答を誘導するものである。上記複合体の毒性及び治療効力は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死する量）及びＥＤ_５０（集団の５０％に治療上有効な量）の決定について、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手法により決定しうる。毒性と治療効果との用量比は治療インデックスであり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０で表される。高い治療インデックスを示す複合体が好ましい。毒性の副作用を示す複合体も用いることができるが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小限に抑えるように罹患組織部位に上記複合体をターゲティングする送達系を設計し、それにより副作用を低減するように注意を払う必要がある。

一実施形態において、細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を決定する際に用いることができる。複合体の投与量は、好ましくは、毒性がない又はほとんどないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、この範囲内で、使用する剤形及び採用する投与経路に応じて変動しうる。本発明の方法に用いる複合体のすべてについて、治療上有効な量は、最初は細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養において決定されたＩＣ_５０（すなわち、症状の最大値の半分の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて用量を決定しうる。そのような情報を用いることにより、ヒトにおける有効量をより正確に決定することが可能となる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定しうる。

別の実施形態において、ｈｓｐ７０−及び／又はｇｐ９６−抗原分子複合体の量は、ヒト患者に対して約１０μｇ〜約６００μｇの範囲内で投与しうる。本発明により提供されるヒト患者におけるｈｓｐ９０−ペプチド複合体の投与量は、約５０〜５０００μｇ、好ましくは１００μｇの範囲内である。上述した用量は、好ましくは約４〜６週間の期間で１週間に１回投与し、また投与方法又は部位は、好ましくは投与毎に変更する。従って、例示であって限定するものではないが、最初の注射は、左腕に、２回目は右腕に、３回目は左腹に、４回目は右腹に、５回目は左腿に、６回目は右腿に、などで経皮投与しうる。間隔をおいた後は１回以上の注射を同じ部位に反復して行なってもよい。また、分割注射も行ない得る。従って、例えば投与量の半分をある部位に投与し、同じ日にもう半分の量を別の部位に投与しうる。あるいは、投与方法を連続して変更し、例えば、皮内、筋肉内、静脈内又は腹腔内に連続して毎週の注射を行なってもよい。４〜６週間後、１ヶ月の期間にわたって２週間間隔でさらに注射を行なうことが好ましい。最後の注射の時期は、患者の臨床的進行及び免疫療法に対する応答性に応じて変更しうる。

本発明のまた別の実施形態では、ｈｓｐ７０−及び／又はｇｐ９６−抗原ペプチド複合体の量は、ヒト患者について、約０．１μｇ〜約６０μｇの範囲内で投与する。別の特定の実施形態では、ｈｓｐ７０−及び／又はｇｐ９６−抗原ペプチド分子複合体の治療上有効な量は、１０μｇ未満、例えば０．１〜９μｇの範囲内であり、好ましいヒト投与量は、マウスにおける２５ｇ、例えば０．５〜２．０μｇの範囲内で使用される投与量と実質的に等価なものである。本発明により提供されるヒト患者におけるｈｓｐ９０−抗原分子複合体の好ましい投与量は、約５〜５００μｇの範囲内である。特定の実施形態において、ｈｓｐ９０−抗原分子複合体の治療上有効な量は、５０μｇ未満、例えば５〜４９μｇの範囲内であり、好ましい投与量は５〜４０μｇの範囲内である。これらの投与量は、好ましくは皮内又は経粘膜投与される。例示であるが、用量は、好ましくは皮内経路で、計５回の注射を一日おきに投与しうる。好ましい実施形態では、上述した用量は、約４〜６週間の期間にわたり週に１回投与され、投与部位については投与毎に変更することが好ましい。好ましい例において、皮内投与は、連続的に投与部位を変更してそれぞれに投与する。

従って、本発明は、宿主個体の免疫能力を刺激し、前新生物及び／若しくは新生物細胞又は感染細胞に対する特異的免疫を誘発する組成物を投与することを含む、被験者における癌又は感染性疾患の予防及び治療方法を提供する。

４．７．２．製剤及び使用
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１以上の生理学的に許容される担体又は賦形剤を用いて通常の方法により製剤化しうる。

従って、複合体及びその生理学的に許容される塩及び溶媒和物を、吸入法若しくは気体注入法（口若しくは鼻による）による投与、又は経口投与、舌下投与、非経口投与、直腸投与のために製剤化することができる。

経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤とともに通常の方法により調製した錠剤又はカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は当該技術分野において周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与のための液状調製物は、例えば溶剤、シロップ剤又は懸濁剤の形態をとることができ、あるいは使用直前に水若しくは他の好適なビヒクルにより再構成するための乾燥製品として提供してもよい。かかる液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化油脂）；乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル又は精製植物油）；保存剤（例えばメチル−若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、又はソルビン酸）などの薬学的に許容される添加物とともに通常の方法により調製することができる。調製物はまた、適当であれば緩衝塩、香料、着色料及び甘味剤を含んでもよい。

経口投与のための調製物は、活性複合体を制御放出できるように好適に製剤化することもできる。

舌下投与のために、かかる組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジ剤の形態をとり得る。

吸入法により投与する場合、本発明に従って使用する複合体は、適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適な気体）を用いて、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレーとして都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを備えることにより送達することができる。吸入器又は気体注入器で用いるカプセル及び薬包（例えばゼラチン製など）は、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末基剤と複合体との混合粉末を含むように製剤化することができる。

複合体は、注射による（例えばボーラス注射又は連続注入などによる）非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位投与剤形として、例えばアンプル又は複数投薬容器の中に保存剤を加えた形で提供することができる。本発明の組成物は、油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶剤又は乳剤などの形態であってもよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤化用物質を含み得る。あるいは、有効成分は、使用する前に好適なビヒクル（例えば発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末状のものであってもよい。

また複合体は、例えばカカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む坐剤又は貯留浣腸等の直腸投与用組成物として製剤化してもよい。

先に記載した製剤のほかに、複合体は、デポ製剤として製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、埋込（例えば皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により、投与することができる。したがって、例えば複合体は、好適なポリマー材料若しくは疎水性材料と一緒に（例えば許容可能な油中の乳剤として）、又はイオン交換樹脂と一緒に、あるいは例えば難溶性塩等の難溶性誘導体として、製剤化することができる。

望ましい場合、本発明の組成物は、有効成分を含む単位投与剤形を１つ以上含むパック又はディスペンサーデバイスに入れて提供してもよい。このパックは、例えば金属箔又はプラスチック箔製のもの（例えばブリスターパック等）としうる。パック又はディスペンサーデバイスに、投与に関する説明書を添付してもよい。

４．７．３．キット
本発明はまた、本発明の方法及び／又は治療方法を行うためのキットをも提供する。一実施形態において、かかるキットは、１以上の容器内に、第２の容器に収容されるＨＳＰ及び／又はα２Ｍと組み合わせるための抗原タンパク質及びペプチドを含むタンパク質調製物を含む。別の実施形態において、かかるキットは、１以上の容器内に、第２の容器に収容されるＨＳＰ及び／又はα２Ｍと組み合わせるための抗原ペプチドを含む消化ペプチドを含有する。あるいは、１以上の容器に、自己由来の投与のために特定の患者から単離されるＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化させるためのタンパク質及び／又はペプチドを供給しうる。場合により、さらに、タンパク質及びペプチドと複合体化させるための精製ＨＳＰを第２容器中に提供してもよい。

別の実施形態において、かかるキットは、１以上の容器内に、治療上又は予防上有効な量の、ＨＳＰ及び／又はα２Ｍと複合体化したタンパク質／ペプチド、好ましくは精製された複合体を薬学的に許容し得る形態で含んでいる。上記キットは場合によりさらに、第２容器中に感作されたＡＰＣ（好ましくは精製されたもの）を含んでもよい。

本発明のキットの容器内のＨＳＰ又はα２Ｍ複合体は、薬学的に許容される溶液の形態としうる。例えば、無菌の生理食塩水、デキストロース溶液、若しくは緩衝化溶液、又は薬学的に許容され得る無菌の溶液と組合わせられている。あるいは、ＨＳＰ又はα２Ｍ複合体は、凍結乾燥されているか又は乾燥されていてよい。この場合は、該キットは更に、場合により、注射する目的でＨＳＰ及びα２Ｍ又はα２Ｍ及びＨＳＰ含有複合体を溶液として再構成するために、容器中に、好ましくは無菌の、薬学的に許容される溶液（例えば生理食塩水、デキストロース溶液等）を含んでもよい。

他の実施形態では、本発明のキットは更に、ＨＳＰ及びα２Ｍ複合体を注射するための、好ましくは無菌の形態で包装された針若しくはシリンジ、及び／又は包装されたアルコールパッドを含む。場合により、臨床医又は患者がα２Ｍ及びＨＳＰ−ペプチド複合体を投与するための説明書を含んでもよい。

４．８．ＨＳＰ及びα２Ｍ複合体の免疫原性の決定
場合により、当該技術分野で公知の方法を用いて、本発明のＨＳＰ−タンパク質複合体、ＨＳＰ−ペプチド複合体、α２Ｍ−タンパク質複合体及びα２Ｍ−ペプチド複合体を免疫原性についてアッセイしてもよい。例として、限定するものではないが、以下に挙げる手順の１つを用いることができる。好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いる（後掲、第４．９．４節を参照）。

４．８．１．ＭＬＴＣアッセイ
簡単に説明すると、任意の好適な投与経路を用いて、マウスに所定量のＨＳＰ−及び／又はα２Ｍ複合体を注射する。陰性対照として、例えば正常組織から調製されたタンパク質及び／又はペプチドと複合体化したＨＳＰを他のマウスに注射する。特異的抗原を含むことがわかっている細胞、例えば、腫瘍細胞又は感染性疾患の因子に感染した細胞は、このアッセイの陽性対照として用いることができると考えられる。マウスには、７〜１０日あけて、２回注射する。最後の免疫感作から１０日後に、脾臓を取り出して、リンパ球を放出させる。放出されたリンパ球は、後に、目的とする抗原を発現した死細胞の添加によりｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することができる。

例えば、８×１０^６個の免疫脾細胞は、１０％ウシ胎児血清を含む３ｍｌのＲＰＭＩ培地中で目的とする抗原を含む、４×１０^４個のマイトマイシンＣ処理又はγ線照射（５〜１０，０００ラド）細胞（又は、場合によっては、適当な遺伝子でトランスフェクトした細胞）で刺激することができる。特定の事例では、Ｔ細胞増殖因子の供与源として、３３％二次混合リンパ球培養物上清を培地に含有させる（Glasebrookら、1980, J. Exp. Med. 151:876）。免疫感作後の一次細胞傷害性Ｔ細胞応答を試験するため、脾細胞を刺激なしで培養する。いくつかの実験では、免疫感作したマウスの脾細胞を、抗原が異なる細胞で再刺激することにより、細胞傷害性Ｔ細胞応答の特異性を決定する。

６日後、４時間の^５１Ｃｒ−放出アッセイで細胞傷害性について培養物を試験する（Palladinoら、1987, Cancer Res. 47:5074-5079及びBlachereら、1993, J. Immunotherapy 14:352-356）。このアッセイでは、混合したリンパ球培養物を標的細胞懸濁液に添加することにより、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（通常１：１〜４０：１）とする。２０ｍＣｉ^５１Ｃｒ／ｍｌを含む培地中で１×１０^６個の標的細胞を３７℃で１時間インキュベートすることにより、標的細胞を前標識する。標識後、これらの細胞を３回洗浄する。各アッセイ点（Ｅ：Ｔ比）を三連で実施し、好適な対照を用いて、自然^５１Ｃｒ放出（リンパ球はアッセイに一切添加しない）及び１００％放出（界面活性剤で溶解させた細胞）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベートした後、２００ｇで５分遠心することにより、細胞をペレット化する。上清に放出された^５１Ｃｒの量をガンマカウンターで測定する。細胞傷害性率（％）は、試験サンプル中のｃｐｍから自然放出したｃｐｍを引いた差を、界面活性剤を用いた放出ｃｐｍの合計から自然放出ｃｐｍを引いた差で割った商として評価する。

ＭＨＣクラスＩカスケードを阻止するために、Ｋ−４４ハイブリドーマ細胞（抗ＭＨＣクラスＩハイブリドーマ）に由来する濃縮ハイブリドーマ上清を試験サンプルに添加して、最終濃度を１２．５％にする。

４．８．２．ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイ
Kruse及びSebald, 1992, EMBO J. 11:3237-3244に記載されているのとほぼ同様に、一次Ｔ細胞を脾臓、新鮮な血液又はＣＳＦから取得した後、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ ＰＬＵＳ（Pharmacia、スエーデンUpsalla）を用いた遠心分離により精製する。末梢血単核細胞を、抗原分子を発現する細胞の溶解物と一緒に７〜１０日インキュベートする。溶解物中の抗原を処理及び提示するために、任意によりアッセイの２４〜４８時間前に抗原提示細胞を培養物に添加してもよい。次に、遠心分離により細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０倍地中で洗浄する（GibcoBRL、メリーランド州Gaithersburg）。５×１０^４個の活性化Ｔ細胞／ウェルを、９６ウェルプレート上の１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０倍地中で３７℃で７２時間培養し、次いで、１μｌＣｉ^３Ｈ−チミジン（Dupont NEN、マサチューセッツ州ボストン）／ウェルで６時間パルスした後、回収し、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンター（Packard Instrument Co.、コネティカット州メリデン）で放射能測定した。

４．８．３．抗体応答アッセイ
本発明の特定の実施形態では、ＨＳＰ−又はα２Ｍ−複合体のワクチン接種に応答して産生された抗体を測定することにより、該複合体の免疫原性を決定する。実施形態の一例では、ＰＢＳ中のワクチンに用いたタンパク質／ペプチドの精製された非ＨＳＰ−又はα２Ｍ−複合体化形態の０．７５μｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ／ウェルで、マイクロプレート（９６ウェルイムノプレートＩＩ、Ｎｕｎｃ）を４℃で１６時間、２０℃で１時間かけてコーティングする。ウェルを空にし、１ウェルにつき、２００μｌのＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ（０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０及び１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で２０℃で１時間かけてブロッキングした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ワクチン接種した動物（モデルマウス又はヒト患者など）から得た５０μｌ／ウェルの血漿又はＣＳＦを２０℃で１時間かけて添加・放置した後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。次に、必要に応じて、ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中で１：１，５００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とコンジュゲートさせた５０μｌ／ウェルのヒツジ抗マウス又は抗ヒト免疫グロブリンと一緒に、次いで（前記と同様ＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄後）、５０μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ_２Ｏ_２基質溶液と一緒に、２０℃で１時間インキュベートした後、抗ペプチド抗体活性を熱量計により測定する。５分後１５０μｌの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止し、Ｋｏｎｔｒｏｎ ＳＬＴ−２０光度計（SLT Lab-instr., スイスチューリッヒ）により４９２ｎｍ（基準６２０ｎｍ）で吸光度を測定する。

４．８．４．サイトカイン検出アッセイ
本発明のＨＳＰ−又はα２Ｍ−複合体に対するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答は、特定のサイトカインのレベルの検出及び定量により測定することができる。一実施形態では、例えば、本発明の複合体の免疫原性を調べるＩＦＮ−γ検出アッセイを用いて、細胞内サイトカインを測定することができる。この方法の一例では、ＨＳＰ−ペプチド複合体又はα２Ｍ−ペプチド複合体で治療する被験者からの末梢血単核細胞を、所与の腫瘍のペプチド抗原又は感染性疾患の因子のペプチド抗原で刺激する。次に、フローサイトメトリーにより検出可能なＴ細胞特異的標識抗体、例えば、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＣＤ８やＰｅｒＣＰ標識抗ＣＤ４抗体で、細胞を染色する。洗浄後、細胞を固定し、透過性にし、ヒトＩＦＮ−γと反応性の色素標識抗体（ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ）と反応させる。標準的方法を用いて、サンプルをフローサイトメトリーにより分析する。

これ以外にも、フィルター免疫アッセイ、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて、Ｔ細胞に存在する特定のサイトカインを検出することもできる。一実施形態では、例えば、ニトロセルロースを裏打ちした（backed）マイクロプレートを、精製したサイトカイン特異的一次抗体、例えば、抗ＩＦＮ−γでコーティングした後、プレートをブロッキングし、他のタンパク質の非特異的結合によるバックグラウンドを回避する。ＨＳＰ−ペプチド複合体及び／又はα２Ｍペプチド複合体で治療した被験者から得た、サイトカイン分泌細胞を含む単核血液細胞のサンプルをマイクロプレートのウェル上に希釈する。標識した、例えばビオチン標識した二次抗サイトカイン抗体を添加する。次に、抗体サイトカイン複合体を検出することができる。すなわち、酵素コンジュゲートストレプトアビジンにより、サイトカイン分泌細胞は、視覚、顕微鏡、又は電子検出方法により「スポット」として出現する。

４．８．５．四量体アッセイ
別の実施形態では、「四量体染色」アッセイ（Altmanら、1996, Science 274:94-96）を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を同定することができる。例えば、一実施形態では、腫瘍特異的抗原のような特異的ペプチド抗原を含むＭＨＣ分子を多量体化することにより、可溶性ペプチド四量体を作製してから、例えば、ストレプトアビジンと複合体化させることにより、標識する。次に、ＭＨＣ−ペプチド抗原複合体を、ＨＳＰ−又はα２Ｍ−複合体で治療する被験者から取得したＴ細胞集団と混合する。次に、ビオチンを用いて、目的とする抗原、すなわち、腫瘍特異的抗原を発現するＴ細胞を染色する。

４．９．癌の予防及び免疫療法における効果のモニタリング
ＨＳＰ−又はα２Ｍ−複合体による免疫療法の、新生物疾患の発症及び進行に対する効果は、当業者にとって既知の任意の方法によりモニターすることができる。その方法には、限定するものではないが、ａ）細胞性免疫の評価としての遅延型過敏性の測定；ｂ）細胞傷害性Ｔリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性の測定；ｃ）腫瘍特異的抗原、例えば胎児性癌抗原（ＣＥＡ）のレベルの測定；ｄ）コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン等の技法を用いた腫瘍の形態の変化の測定；及び、ｅ）リスクの高い個体における、特定の癌のリスクに関する推定バイオマーカーのレベルの変化の測定；並びに、ｆ）ソノグラムを用いた腫瘍の形態の変化の測定が挙げられる。

以下の小節において、最適な例示的手法を説明する。

４．９．１．遅延型皮膚過敏症試験
遅延型過敏性に関する皮膚試験は、ある抗原に対する全般的な免疫能及び細胞性免疫において非常に有用である。一群の共通皮膚抗原に対して反応できなくなることはアネルギーと称される（Sato, T.ら, 1995, Clin. Immunol. Pathol. 74:35-43）。

皮膚試験の正しい技法では、抗原を４℃にて無菌状態で保存し、光から保護し、そして使用直前に再構成することが必要である。Ａ２５−又は２７−ゲージ針により、皮下投与ではなく皮内投与により抗原を確実に投与する。抗原の皮内投与の２４時間後及び４８時間後に、紅斑及び硬化（しこり）の両者の最大寸法を物差しで測定する。所定の抗原又は抗原群に対する活性低下を、より高い濃度の抗原を用いた試験、又は、あいまいな状況での中間的な試験を用いる反復的な試験によって確認する。

４．９．２．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害性Ｔリンパ球の活性
フィコール−ハイパーク勾配遠心法により単離した８×１０^６個の末梢血由来Ｔリンパ球を、１０％ウシ胎仔血清を含む３ｍｌのＲＰＭＩ培地中にて、４×１０^４個のマイトマイシンＣ処理腫瘍細胞により再刺激する。場合により、３３％の二次混合リンパ球培養物の上清又はＩＬ−２を、Ｔ細胞増殖因子の供与源として培地中に含ませる。

免疫後の細胞傷害性Ｔリンパ球の一次応答を測定するために、刺激用の腫瘍細胞を用いずにＴ細胞を培養する。他の実験では、Ｔ細胞を抗原性の異なる細胞により再刺激する。６日後に、４時間^５１Ｃｒ放出アッセイにより培養物の細胞傷害性について試験する。標的物の自然な^５１Ｃｒの放出は２０％未満のレベルとなるはずである。抗ＭＨＣクラスＩブロッキング活性のため、Ｗ６／３２ハイブリドーマの１０倍濃縮上清を最終濃度が１２．５％になるまで試験系に添加する（Heike M.ら, J. Immunotherapy 15:165-174）。

４．９．３．腫瘍特異的抗原のレベル
全ての腫瘍上に特有の腫瘍抗原を検出するのは不可能かもしれないが、多くの腫瘍が正常細胞とは異なる抗原を提示する。モノクローナル抗体試薬は、抗原の単離や生化学的分析を可能にするとともに、形質転換細胞と形質転換されていない細胞との区別のため、及び形質転換細胞の細胞系統を確定するために、診断上非常に有益である。最も解明が進んでいるヒト腫瘍関連抗原は腫瘍胎児性抗原である。かかる抗原は胚形成の際に発現されるが、正常な成人の組織には存在しないか又は検出することが非常に難しい。この標準的な抗原が胎児性癌抗原（ＣＥＡ）である。この抗原は、胎児の腸及びヒトの大腸癌細胞に見られる糖タンパク質であるが正常な成人の大腸細胞には見られない。ＣＥＡは大腸癌細胞から流出して血清中に見られるので、元々は、血清中のこの抗原の存在は大腸癌の患者をスクリーニングするために用いることができると考えられていた。しかしながら、他の腫瘍（脾臓癌及び乳癌など）を有する患者も血清ＣＥＡレベルの上昇を示す。従って、治療を受ける癌患者においてＣＥＡレベルの下降及び上昇をモニターすることは腫瘍の進行及び治療への応答を予測するのに有用であることが分かっている。

幾つかの他の腫瘍胎児性抗原がヒトの腫瘍を診断したりモニターするために有用である。例えば、通常は胎児の肝臓及び卵黄嚢細胞により分泌されるα−グロブリンであるα−フェトプロテインは、肝臓腫瘍及び生殖細胞腫瘍を有する患者の血清中に見いだされ、疾患状態のマーカーとして用いることができる。

４．９．４．コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン
癌の正確なステージ分類のための技術の選択肢としてＣＴがある。ＣＴは転移を検出するための他のいかなるイメージング技法よりも高感度かつ特異的であることが判っている。

４．９．５．推定バイオマーカーの測定
特定の癌のリスクに対する推定バイオマーカーのレベルを、サイトゾル及び膜由来タンパク質を含む組成物の効果をモニターするために測定する。例えば、前立腺癌のリスクが高い個体において、血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をBrawer, M.K.ら, 1992, J. Urol. 147:841-845及びCatalonaら, 1993, JAMA 270:948-958に記載の手順により測定する。あるいは、大腸癌のリスクがある個体において、第４．５．３節に記載したように、ＣＥＡを測定する。さらに、乳癌のリスクが高い個体において、エストラジオールの１６−α−ヒドロキシル化を、Schneider, J.ら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3047-3051に記載の手順により測定する。上記引用した参照文献は、参照によりその全文を本明細書に組み入れる。

４．９．６．音波検査
癌の正確なステージ分類のための技術の他に採り得る選択肢としてソノグラムがある。

５．実施例
以下の実験では、（ａ）細胞画分に由来する抗原ペプチドと、（ｂ）ＨＳＰ又はα−２−マクログロブリン（α２Ｍ）のいずれかとの複合体が、癌細胞増殖から動物を予防的に防御する上で有効であることを実証する。

５．１．材料と方法
５．１．１．タンパク質精製
α２Ｍの精製のために、マウスの血清を０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、０．１５Ｍ ＮａＣｌで１：１希釈し、同じバッファーで平衡化した６５ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００Ｒ（Sigma）カラムにアプライし溶出を行なった。α２Ｍ陽性画分をドットブロットにより測定し、その画分のバッファーをＰＤ−１０カラムを使用して０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に交換した。タンパク質含有画分をコンカナバリンＡセファロースカラムにアプライした。結合したタンパク質を０．２Ｍメチルマンノースピラノシドで溶出し、０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで平衡化したＤＥＡＥカラムにアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと０．１３Ｍ酢酸ナトリウムを用いる免疫ブロッティングで分析すると、α２Ｍは純粋な形で溶出された。

いくつかの実験では、α２ＭはＳｉｇｍａから購入した。

ｇｐ９６は、第４．３．３節に記載の方法により得た。

５．１．２．腫瘍拒絶アッセイ
すべての免疫は、１００μｌ容量のＰＢＳで皮内投与により行った。１週間置いて２回の免疫を行った。１回の注射で複合体として又は単独で、７μｇのα２Ｍ又は１μｇのｇｐ９６を使用した。肝腫瘍細胞（１００，０００）から培地を洗い流し、ＰＢＳに再懸濁し、最後の免疫の１週間後に皮内注射した。２次元で腫瘍を測定した。平均の半分を腫瘍の半径として、腫瘍容量を計算した。一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してＰ値を決定した。

５．１．３．複合体の生成
ＭｅｔｈＡ生細胞からダウンスを用いたホモジナイズと次に超遠心分離により、細胞溶解物を得た。１００，０００ｇの上清を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と３ｍＭ ＡＴＰで１０時間処理し、次にカットオフ限界値１０ｋＤａのＣＥＮＴＲＩＣＯＮ膜フィルター（Millipore）で遠心分離した。１０ｋＤａより小さいペプチド（「ＭｅｔｈＡ１０」と呼ぶ）を、Ｃ１８逆相カラムに結合させ、ペプチドをメタノールで溶出し、ペプチドを真空下で乾燥し、複合体化に適したバッファー中でペプチドを再生することにより、さらに単離した。ｇｐ９６、α２Ｍ、又はアルブミン（これは対照として使用した）を、５０モル過剰のＭｅｔｈＡ１０の存在下で、５０℃に加熱した。得られる複合体を含有する反応物を室温に３０分置き、次に氷上に置いた。遊離の複合体化していないペプチドを、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ５０（Millipore）を使用して除去した。こうして作製した複合体を免疫に使用した。

５．２．結果
この実験では、ＭｅｔｈＡ腫瘍モデルを使用して、ｇｐ９６−ペプチド複合体及びα２Ｍ−ペプチド複合体により誘発される抗腫瘍免疫を証明した。この腫瘍の抗原性ＭＨＣＩエピトープは不明である。ＭｅｔｈＡ細胞溶解物をＡＴＰとトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、１０ｋＤａより小さいペプチドの画分（ＭｅｔｈＡ１０）を採取し、上記したようにα２Ｍ又はｇｐ９６と複合体化させた。複合体化していないか又はＭｅｔｈＡ１０と複合体化したα２Ｍ又はｇｐ９６で、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。ＢＡＬＢ／ｃマウスはまた、アルブミン−ＭｅｔｈＡ１０又は陰性対照としてＰＢＳで免疫した。免疫は１週間置いて２回行った。最後の免疫の１週間後にすべてのマウスに、１００，０００個のＭｅｔｈＡ生細胞を皮内投与することによりチャレンジした。腫瘍増殖を５日ごとにチャレンジの２０日後までモニターした。

表１のデータは、α２Ｍ−ＭｅｔｈＡ１０（ｐ＜０．０５）又はｇｐ９６−ＭｅｔｈＡ１０（ｐ＜０．０５）複合体で免疫したマウスで有意な腫瘍防御を示すが、α２Ｍ単独、ｇｐ９６単独、アルブミン−ＭｅｔｈＡ１０又はＰＢＳで免疫したマウスでは腫瘍防御を示さなかった。

５．３．考察
本明細書に記載の腫瘍に対する免疫についての実験は、腫瘍からの総細胞ペプチドのアレイ（自己及び抗原ペプチドを含む）をＨＳＰ又はα２Ｍと複合体化するという癌の免疫療法に対する新規手法を実証する。そのような複合体は、宿主の免疫系を有効に刺激して、本明細書に記載のように特異的に応答させた。データは、予防におけるこの手法の有用性が、既存の疾患の治療、ならびに病原性感染症の治療及び予防にも拡張できることを示す。

本明細書に引用されたすべて文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるものとし、各個別の刊行物又は特許若しくは特許出願が、そのすべての目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれて具体的かつ個別に記載するのと同じ程度であることを意図する。

当業者には明らかなように、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、その修飾と変更が可能である。本明細書に記載の具体的な実施形態は例示目的であり、本発明は、添付の請求の範囲、及びそのような請求の範囲と同等の全範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims (30)

1. 抗原ペプチドと複合体化された1つ以上の熱ショックタンパク質を含む複合体を製造する方法であって、抗原ペプチドの集団を1つ以上の異なる熱ショックタンパク質と、該ペプチドが該熱ショックタンパク質と複合体化する条件下においてin vitroで接触させるステップを含み、ここで、該抗原ペプチドの集団は、少なくとも50種の異なるペプチドを含み、かつタンパク質調製物を複数の反応混合物に分割することによって2以上のプロテアーゼによる消化に供すること、および消化反応混合物をプールすることを含む方法により作製され、その際、各反応混合液は異なるプロテーゼによる消化に供されるものであり、該タンパク質調製物は、(a)抗原性細胞またはその細胞画分に由来し、かつ(b)該抗原性細胞または該細胞画分それぞれの、少なくとも50％の異なるタンパク質または少なくとも50種の異なるタンパク質を含む、上記方法。
2. 2以上のプロテアーゼはトリプシン、ブドウ球菌ペプチダーゼI、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンG、サーモリシン、エラスターゼおよびパパインよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
3. 前記集団を作製する方法が、前記消化に供するステップ後、前記接触ステップ前に、プロテアーゼを不活性化するステップ、または抗原ペプチドの集団からプロテアーゼを分離するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. タンパク質調製物は総サイトゾルタンパク質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. タンパク質調製物は総膜結合タンパク質である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
6. 前記抗原性細胞は癌細胞である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記抗原性細胞は感染性疾患を引き起こす因子の抗原性を示す細胞である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
8. 前記抗原性細胞は、抗原を発現する感染因子の抗原をコードする核酸分子で形質転換された細胞である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
9. 前記抗原性細胞は、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原で形質転換され、かつ腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原を発現する細胞である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
10. 前記抗原性細胞はヒト細胞である請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 前記熱ショックタンパク質は精製されている請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 前記熱ショックタンパク質は、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｇｒｐ７８、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＨＳＰ１１０、およびｇｒｐ１７０よりなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 前記熱ショックタンパク質は、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、ｇｒｐ７８、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＨＳＰ１１０、およびｇｒｐ１７０よりなる群から選択される異なる熱ショックタンパク質の組合せである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
14. 前記接触は、抗原ペプチドの集団及び熱ショックタンパク質を架橋剤で処理することを含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. 前記接触は、抗原ペプチドの集団及び熱ショックタンパク質の非共有結合を介した複合体化を含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
16. 複合体化のステップの前に抗原ペプチドの集団を回収することをさらに含む請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. 熱ショックタンパク質はヒト熱ショックタンパク質である請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. 熱ショックタンパク質は組換え熱ショックタンパク質である請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
19. 熱ショックタンパク質はＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、およびＨＳＰ９０ファミリーよりなる群から選択される熱ショックタンパク質のファミリーのメンバーである、請求項１〜１１および１４〜１８のいずれか１項記載の方法。
20. 抗原ペプチドの集団は少なくとも１００種、５００種、１０００種、５０００種又は１０，０００種の異なるペプチドを含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
21. 前記タンパク質調製物は、前記抗原性細胞の、総細胞タンパク質、総サイトゾルタンパク質又は総膜結合タンパク質である請求項１〜３及び６〜２０のいずれか１項記載の方法。
22. 前記タンパク質調製物は細胞小器官画分中の総タンパク質であり、該細胞小器官画分は、核画分、ミトコンドリア画分、リソソーム画分又は小胞体由来画分である、請求項１〜３および６〜２０のいずれか１項記載の方法。
23. ペプチドの集団は少なくとも２０アミノ酸残基のサイズ範囲であるペプチドを含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
24. ペプチドの集団は７〜２０アミノ酸残基のサイズ範囲であるペプチドを含む、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
25. 抗原ペプチドと複合体化された１つ以上の熱ショックタンパク質を含む複合体の免疫原性量を含む組成物であって、該複合体は請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法によって作製されたものである、前記組成物。
26. 医薬として使用するための請求項２５記載の組成物。
27. アジュバントをさらに含む請求項２５または２６記載の組成物。
28. 請求項１〜６および９〜２４のいずれか１項記載の方法によって作製された、抗原ペプチドと複合体化された１つ以上の熱ショックタンパク質を含む複合体の免疫原性量の、あるタイプの癌を治療または予防するための医薬の製造のための使用。
29. 請求項１〜５、７、８および１０〜２４のいずれか１項記載の方法によって作製された、抗原ペプチドと複合体化された１つ以上の熱ショックタンパク質を含む複合体の免疫原性量の、あるタイプの感染性疾患を治療または予防するための医薬の製造のための使用。
30. 請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法によって作製された、抗原ペプチドと複合体化された１つ以上の熱ショックタンパク質を含む複合体の免疫原性量の、第２の抗原性細胞に対する免疫応答を被験体において誘導するための医薬の製造のための使用であって、該第２の抗原性細胞は、抗原ペプチドの集団の由来となる抗原性細胞に共通する少なくとも１つの抗原決定基を発現する、前記使用。