RU2640017C1 - Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин - Google Patents
Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2640017C1 RU2640017C1 RU2016142688A RU2016142688A RU2640017C1 RU 2640017 C1 RU2640017 C1 RU 2640017C1 RU 2016142688 A RU2016142688 A RU 2016142688A RU 2016142688 A RU2016142688 A RU 2016142688A RU 2640017 C1 RU2640017 C1 RU 2640017C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tumor
- protein
- hsp
- buffer
- heat shock
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title description 14
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 title 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 12
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 abstract description 30
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 abstract description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 18
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 22
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 21
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 11
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 description 10
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 8
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101150051208 HSPH1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100031624 Heat shock protein 105 kDa Human genes 0.000 description 3
- 102100032510 Heat shock protein HSP 90-beta Human genes 0.000 description 3
- 101001016856 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-beta Proteins 0.000 description 3
- 101000988090 Leishmania donovani Heat shock protein 83 Proteins 0.000 description 3
- 101100071630 Mesocentrotus franciscanus HSP110 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 101100451677 Mus musculus Hspa4 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 101100124795 Caenorhabditis elegans hsp-110 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940037642 autologous vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001043564 Homo sapiens Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- FCHAMFUEENBIDH-UHFFFAOYSA-N Severin Natural products CC1CCC2C(C)C3CCC4(O)C(CC5C4CC(O)C6CC(CCC56C)OC(=O)C)C3CN2C1 FCHAMFUEENBIDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006355 external stress Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для выделения опухолевых антигенов для иммунотерапии опухолей. Для этого измельчают 1 грамм опухоли на охлаждаемой поверхности, добавляют 9 мл буфера (рН 7,0), состоящего из 10 мМ NaHCO, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ PMSF, и гомогенизируют. Затем центрифугируют сначала при 20000 g при 4°С в течение 30 минут, а затем при 100000 g при 4°С в течение 90 минут. Надосадочную жидкость подвергают ультра-/диафильтрации, используя мембрану с пределом отсечения 50 кДа, при этом используют формулирующий буфер (рН 7,0), состоящий из 10 мМ NaHCOи 150 мМ хлорида натрия. Использование данного способа позволяет получить фракцию, состоящую из комплексов, представленных различными классами белков теплового шока, что определяет широкий спектр связанных с ними опухолевых пептидов. 1 пр., 2 табл., 2 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к медицине и биотехнологии, фармакологии, онкологии, а именно к выделению и очистке биологического иммуногенного материала из опухолевой ткани, который может быть использован в качестве основы для получения противоопухолевых аутологичных вакцин. Способ позволяет получить биологический материал, обогащенный опухолевыми антигенами, способными вызвать специфический иммунный ответ против того вида опухоли, из которой он был получен. Изобретение характеризуется наиболее высоким выходом антигенов в комплексе с белками теплового шока (БТШ), широким спектром антигенов и относительно небольшим количеством технологических стадий, что способствует получению экономических и биологических преимуществ.
Уровень техники
Из уровня техники известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ70 и пептидов (Peng et al., 1997). Осадок клеток или ткань гомогенизируют (1:4) в гипотоническом буфере, центрифугируют при 100000 g, супернатант для замены буфера направляют на гель-фильтрацию. Далее раствор белков наносят на колонну с аффинным носителем (ADP-агароза) и после промывки инкубируют и смывают в буфере, содержащем ADP. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов БТШ70 и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с БТШ70.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ96 и пептидов (Zabrecky & Sawlivich, 2004). Осадок клеток гомогенизируют, осветляют центрифугированием при 18000 g и супернатант подвергают процедуре высаливания сульфатом аммония, после чего белковую смесь пропускают через колонну Con-A-сефарозой, проскок после смены буфера наносят на анионообменник (DEAE-), с которого целевой белок снимают в градиенте соли. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов БТШ96 и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с БТШ96.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ96 и пептидов (Meng et al, 2002). Осадок клеток гомогенизируют, центрифугируют при 100000 g и супернатант подвергают процедуре высаливания сульфатом аммония, после чего белковую смесь пропускают через колонну Con-A-сефарозой, проскок после смены буфера наносят на анионообменник (POROS 20QE-), с которого целевой белок снимают в градиенте соли. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов БТШ96 и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с БТШ96.
Известен способ получения биологического материала, состоящего комплексного выделения кальретикулина, БТШ70, БТШ90, gp96 (Graner et al, 2000a). Ткань гомогенизируют, центрифугируют при 100000 g, для удаления альбумина супернатант пропускают через колонну с цибакроновым красителем (Cibacron Blue 36А-), далее проскок наносят на колонну с Con-А-сефарозой, связавшийся материал элюируют и наносят на колонну с другим аффинным носителем (heparin-сефароза), с которого элюируют gp96. Несвязавшийся с Con-А-сефарозой материал подвергают высаливанию сульфатом аммония, после чего наносят на анионообменник (DEAE-). Снимают тремя ступенями концентрации соли. Первый элюат, с самой низкой концентрацией соли, направляют на аффинную хроматографию с ADP-агарозой для получения БТШ70. Второй элюат, снятый средней концентрацией соли - передают вначале на колонну с гидроксилаппатитом, затем на анионообменную хроматографию (Q-) для получения БТШ90. И, наконец, элюат, полученный с самой большой концентрацией соли, осаждают солью цинка и передают на анионообменник для получения кальретикулина. Недостатком данного изобретения является особенность самой технологии, которая предполагает индивидуальную очистку каждого из БТШ, что осуществляется большим количеством технологических шагов и использованием дорогих хроматографических методов.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из кальретикулина (Basu et al 1999). Осадок клеток гомогенизируют, центрифугируют при 100000 g, полученный супернатант подвергают ступенчатому высаливанию, полученный в результате осадок ресуспендируют и пропускают через колонну с ConA-сефарозой. В полученном проскоке меняют буфер с помощью гель-фильтрации и пропускают через колонну с катионообменником (СМ-). Проскок наносят на колонну с анионообменником (DEAE-). Кальретикулин снимают в градиенте хлорида натрия. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов кальретикулина и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с кальретикулином.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ70 (Udono et al 1993). Клетки гомогенизируют, центрифугируют при 100000 g, супернатант пропускают через колонну с ConA-сефарозой, проскок наносят на колонну с анионообменником (Q-) и целевой белок снимают в градиенте хлорида натрия, после чего концентрируют сульфатом аммония. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов БТШ70 и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с БТШ70.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ70 (Murshid et al 2013). Клетки гомогенизируют, центрифугируют при 15000 g, супернатант подвергают гель-фильтрации для смены буфера и наносят на колонну с анионообменником (DE52-), целевой белок элюируют в градиенте хлорида натрия. Фракции, содержащие БТШ70, наносят на колонну с ADP-агарозой. Целевой белок элюируют буфером, содержащим ADP. Полученную фракцию переводят в формулирующий буфер. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов БТШ70 и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с БТШ70.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ70, БТШ 90, gp96 (Северин и др., 2005). Ткань гомогенизируют, центрифугируют при 35000 g, супернатант подвергают ступенчатому высаливанию, обессоливают с помощью гель-фильтрации и наносят на колонну с heparin-сефарозой, снимают градиентом хлорида натрия, фракции, содержащие БТШ 70, 90 и gp96, объединяют. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов, а также использование дорогих хроматографических методов.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ70, БТШ 90, gp96 (Menoret et al 2000). Клетки гомогенизируют, центрифугируют при 100000 g, супернатант пропускают через колонну для смены буфера и наносят на колонну с heparin-сефарозой, снимают градиентом хлорида натрия, фракции, содержащие БТШ90, объединяют и пропускают через колонну для смены буфера, после чего наносят на колонну с анионообменником (HQ-POROS), целевой белок элюируют в градиенте хлорида натрия; фракции, содержащие gp 96, подвергают ступенчатому высаливанию. Полученный осадок ресуспендируют и пропускают через колонну с ConA-сефарозой. Проскок после смены буфера методом гель-фильтрации наносят на колонну с анионообменником (DEAE-), целевой белок снимали в градиенте соли. Фракции, содержащие БТШ70, объединяют, пропускают через колонну для смены буфера и затем наносят на колонну с ADP-агарозой, элюируют целевой белок и пропускают через колонну для смены буфера. Затем наносят на колонну с анионообменником (DEAE-) и элюируют в градиенте хлорида натрия. Недостатком данного изобретения является особенность самой технологии, которая предполагала индивидуальную очистку каждого из БТШ по отдельности, что предполагает введение большого количества технологических шагов. И хотя данный подход и позволяет получить 4 типа пептидов, ассоциированных с 4 видами БТШ, а также получение ограниченного спектра антигенов, использование дорогих хроматографических методов.
Известен способ получения биологического материала, состоящего из БТШ110 (Wang et al 2001). Клетки гомогенизируют в гипотоническом буфере, центрифугируют последовательно при 4000g и 100000g, супернатант пропускают через колонну с ConA-сефарозой, диализуют и сажают на колонну со слабым анионообменником (DEAE-), снимают в градиенте хлорида натрия, фракции, содержащие БТШ 110, объединяют и после диализа сажают на колонну с сильным анионообменником (Q-), элюцию проводят в градиенте хлорида натрия, фракции, содержащие БТШ 110, объединяют и пропускают через Superose 12. Недостатком данного изобретения является низкий выход комплексов БТШ110 и пептидов, использование дорогих хроматографических методов, а также получение ограниченного спектра антигенов, ассоциированных только с БТШ110.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения биологического материала, состоящего из кальретикулина, БТШ70, БТШ90, gp96 (прототип) (Graner et al 2000b). Осадок клеток гомогенизируют, осветляют центрифугированием при 10000 g, затем центрифугируют при 10000 g, супернатант используют как сырье для препаративной изоэлектрической фокусировки. Получают смесь белков, состоящую из кальретикулина, БТШ70, БТШ90 и gp96. Было показано, что для исследованных опухолей такой белковый коктейль более эффективен в качестве исходного материала для вакцины, чем один БТШ70, полученный из той же опухоли. Недостатками данного подхода является тот факт, что в процессе получения CRCL используются детергенты, что может приводить к потере пептидов из их комплекса с БТШ. Кроме того, использование этого метода приводит к захвату некоторых соединений, обладающих иммуносупрессорной активностью. Согласно оценке самих авторов, повышение дозы CRCL выше 20 мкг приводит к резкому падению эффективности данной вакцины. Наконец, основной технологический прием - препаративная изоэлектрическая фокусировка - представляется довольно трудоемкой и сложной в воспроизведении процедурой.
Общий недостаток большинства вышеперечисленных способов выделение в подавляющем числе случаев только одного представителя БТШ, что обедняет спектр получаемых антигенов, либо использование дорогих хроматографических стадий, что ведет к технологическим потерям целевых белков. Сравнение описываемых способов по отношению к заявляемому приведено на Фиг. 1.
Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «новизна».
Термины и определения
- Под термином «Caperon-Rich Cell Lysate» (CRCL) подразумевается смесь белков, включающих БТШ70, БТШ90, калретикулин и gp96, полученная с помощью метода препаративной изофокусировки.
- Под термином «БТШ + пептид (белок)» подразумевается комплекс того или иного белка теплового шока с пептидом или белком.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Сравнение наиболее часто используемых и заявляемых способов выделения и очистки комплексов «БТШ + пептид». Условные обозначения: ХР - хроматография; БТШ - белок теплового шока.
Фиг. 2. Содержание БТШ 70 и БТШ 90 во фракциях белков с молекулярной массой более 50 кДа. Условные обозначения: на оси абсцисс - объем элюата (в мл), на оси ординат - количество БТШ; Vо - значение свободного объема колонны; 669 кДа, 158 кДа и 43 кДа - объемы выхода калибровочных белков с разной молекулярной массой (тироглобулин, альдолаза и овальбумин, соответственно).
Раскрытие изобретения
Предложен способ выделения и очистки биологического иммуногенного материала для получения аутологичных противоопухолевых вакцин.
Использование противоопухолевых вакцин - одно из ведущих направлений иммунотерапии опухолей (Srivastava 2002; Никитин, Барышников 2007; Никитин 2008; Calderwood et al 2005; Wang et al 2006). Одним из перспективных направлений их создания является применение белков теплового шока (БТШ). Эти белки участвуют в формировании и поддержании трехмерной и четвертичной структуры белков, важных для выживания и поддержания метаболизма любой клетки, в том числе и опухолевой; уровень этих белков повышается в момент клеточного стресса. В отношении опухоли это может быть результат химиотерапии, радиотерапии, иммунотерапии, иных классических видов противоопухолевого лечения. Все эти виды стресса, несомненно, включают в опухолевой ткани защитные механизмы, что на биологическом уровне выражается в повышении экспрессии анти-апоптотических БТШ, защищающих пространственные структуры опухолевых белков от разрушения. Не являются исключением и такие белки, которые образовались в опухоли в результате неконтролируемых мутаций и которые присутствуют только в данной опухоли. Структура таких белков также защищается белками теплового шока; биологическая защита опосредуется через образование комплекса «БТШ + белок (пептид)», и количество таких комплексов в различных компартментах клетки тем выше, чем выше опухолевый стресс. Стоит отметить, что даже в отсутствие вышеуказанных видов внешнего стресса уровень БТШ в опухолевой клетке сам по себе на порядок выше, чем в нормальной, поскольку в самой опухоли имеет место и внутренний стресс, такой как, например, гипоксия, потребность в усилении энергетического обмена, множество других механизмов, неизбежно возникающих в условиях быстрого роста опухолевой ткани.
В этой связи БТШ, с точки зрения биотехнологических подходов, реализуемых для получения противоопухолевых вакцин, рассматриваются как наиболее привлекательные объекты, на основе которых проводится выделение и очистка комплексов, БТШ-связанных антигенов, в которых БТШ используются как целевые белки. Первооткрывателем данного феномена, использующего указанные свойства, стал P. Srivastava (Udono&Srivastava, 1993; Srivastava 1998).
Каковы природные механизмы, благодаря которым стало возможным применение комплексов «БТШ-пептид» в качестве иммунотерапевтического фактора? Во-первых, БТШ в опухолях никогда не мутируют, в отличие от связанных с ними белков (пептидов). Следовательно, введение таких комплексов в качестве вакцин пациенту не вызывет у него иммунного ответа против БТШ, что и подтверждается в ряде публикаций (Udono & Srivastava, 1993; Srivastava et al., 1998, 2001, 2002, 2010, 2016). С другой стороны, иммуногенными являются пептиды (белки), связанные с БТШ. Это и дает строго специфичный иммунный ответ против данного вида опухоли.
Во-вторых, концентрация БТШ в клетке может быть заметно увеличена после приложения любых вышеуказанных стрессовых условий. Это дает больше исходного материала для изготовления аутологичных вакцин.
В-третьих, многие антиген-представляющие клетки (АПК) имеют на своей поверхности рецепторы к БТШ (CD91, TLR2, TLR4 и др.) (Srivastava 2002; Noessner et al., 2002). Это позволяет не только захватить комплекс БТШ-пептид и затем представить пептид с помощью комплекса гистосовместимости на поверхности АПК, но и запустить синтез цитокинов и костимулирующих молекул. Все это, в конечном итоге, способствует активации клеточного и гуморального ответа против опухолевых антигенов (Srivastava 2002; Noessner et al 2002; Zuo et al 2016).
Таким образом, комплексы «БТШ + пептид (белок)» являются идеальным биологическим материалом для создания специфического противоопухолевого иммунного ответа.
Учитывая все вышесказанное, предлагается следующий способ получения материала для создания противоопухолевой вакцины: на первом этапе опухолевая ткань измельчается и гомогенизируется; на втором этапе из полученного гомогената выделяют цитозольную фракцию путем центрифугирования при 100000 g в течение 90 минут; на третьем этапе полученную цитозольную фракцию подвергают ультра-/диафильтрации, используя мембрану с пределом отсечения 50 кДа. Цель этапа - оставить БТШ и их комплексы; отбросить компоненты цитозоля с молекулярной массой ниже 50 кДа и заменить буфер на формулирующий.
В диапазоне молекулярных масс до 50 кДа находятся все факторы роста, в том числе и те, которые способствуют иммуносупрессии (Gross et al 2008; Бабышкина и др 2010; Khong et al 2002), протеазы, компоненты протеосом и белок-синтезирующего аппарата, которые гиперэкспрессируются в опухолях (Deng S.-S. et al 2006).
Высокомолекулярная часть (с молекулярной массой выше 50 кДа), которая остается для создания противоопухолевой вакцины, содержит все БТШ, участвующие в комплексообразовании с опухолевыми пептидами (белками), их олигомерные комплексы (Bernaroudj et al 1996; Poller et al 2008; Lee et al 2011), ингибиторы протеаз (Deng S.-S. et al 2006).
Технический результат, проявляющийся при использовании предложенного способа выделения и очистки комплексов «БТШ + пептид», заключается в том, что в результате выделения и очистки получают фракцию, состоящую из комплексов, представленных различными классами БТШ, что определяет широкий спектр связанных с ними опухолевых пептидов, что, в свою очередь, способствует индукции противоопухолевого специфического иммунитета на основе большого количества разнообразных антигенов. При этом предложенная технология позволяет получить наиболее высокий выход антигенов, по сравнению с аналогичными технологиями (Таблица 1).
Другим техническим результатом заявляемого способа выделения и очистки комплексов «БТШ + пептид» является расширение арсенала средств указанного назначения.
Заявляемые признаки, предопределяющие получение вышеуказанного технического результата, явно не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Выделение и очистка комплексов «БТШ + пептид» на примере опухоли молочной железы
1 г опухолевой ткани молочной железы мелко измельчают на охлаждаемой поверхности, добавляют 9 мл буфера (10 мМ NaHCO3, рН 7,0, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ PMSF /фенилметилсульфонилфлюорид/) и гомогенизируют. Полученный гомогенат подвергают центрифугированию сначала при 20000 g при 4°С в течение 30 минут, затем при 100000 g при 4°С в течение 90 минут. Надосадочную жидкость подвергают ультра-/диафильтрации, используя ячейку мембрану с пределом отсечения 50 кДа. В качестве формулирующего буфера используют 10 мМ NaHCO3, рН 7,0, содержащего 150 мМ хлорида натрия. В результате получают 34 мг белка в 84 мл формулирующего буфера. Белковый раствор стерильно разливают по 1 мл и замораживают при -20°С.
С помощью иммуноферментного анализа показано наличие в нем 25 мкг БТШ70 и 9,5 мкг БТШ90. В таблице 2 проиллюстрировано получение иммунобиологического материала из 1 г ткани опухоли молочной железы.
На Фиг. 2 приведен результат хроматографического разделения смеси белков с молекулярной массой выше 50 кДа.
На колонну 1×120 см (Econo-column, Bio-Rad), упакованную Sephacryl S-300HR (GE Healthcare) и уравновешенную 10 мМ NaHCO3, рН 7,0 буфером, была нанесена смесь белков в объеме 100 мкл (концентрация белка 10 мг/мл). Процесс проводился со скоростью 0,5 мл/мин при комнатной температуре. Элюат собирали по 1 мл. Приготовление образца: супернатант (надосадочную жидкость) получали, как описано в Примере 1. После этого проводили ультра-/диафильтрацию, используя мембрану с пределом отсечения 50 кДа. Диафильтрацию проводили против 8 объемов уравновешивающего буфера. Конечный объем белкового раствора составлял 3,5 мл. Из него и отбирали 100 мкл для нанесения на колонну. Измерения проводили, начиная с 33 по 61 мл. Количественную оценку проводили с использованием наборов для иммуноферментного анализа (EnzoLifeScience). Видно, что и БТШ70, и БТШ90 присутствуют в виде олигомерных комплексов в широком диапазоне молекулярных масс, заметно превосходящих 70 кДа и 90 кДа.
Список используемой литературы
1. Basu B.S., Srivastava P.K. Calreticulin, peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity. J. Exp. Med. 1999, 189, 797-802.
2. Bernaroudj N., Triniolles F., Ladjimi M. Effect of nucleotides, peptides, and unfolded proteins on the self-association of the molecular chaperone HSC70. J Biol Chem 1996, 271, 18471-18476.
3. Calderwood S.K., Theriault J.R., Gong J. Message in a bottle: role of the 70-kDa heat shock protein family in anti-tumor immunity. Eur. J. Immunol. 2005, 35, 2518-2527.
4. Callahan M.K., Garg M., Srivastava P. Heat-shock protein 90 associates with N-terminal extended peptides and is required for direct and indirect antigen presentation. Proc Nat Acad Sci USA 2008, 105, 1662-1667.
5. Deng S.-S., Xing T.-Y., Zhou H.-Y., Xiong R.-H., Lu Y.-G., Wen В., Liu S.-Q., Yang H.-J. Comparative proteome analysis of breast cancer and adjacent normal breast tissues in human. Geno. Prot. Bioinfo. 2006, 4, 165-172.
6. Denis M. Two-step purification and N-terminal amino acid sequence analysis of the rat Mr 90,000 heat shock protein. Anal Biochem. 1988, 173, 405.
7. Feng H., Zeng Y., Graner M.W., Likhacheva A., Katsanis E. Exogenous stress proteins enhance the immunogenicity of apoptotic tumor cells and stimulate antitumor immunity. Blood 2003, 101, 245-252.
8. Fu Q., Wu Y., Yan F., Wang N., Wang W., Cao X., Wang Y., Wan N. Cell. Mol. Immunol. 2011, 8, 424-432.
9. Graner M., Raymond A., Akporiaye E., Katsanis E. Tumor-derived multiple chaperone enrichment by free-solution isoelectric focusing yields potent antitumor vaccines. Cancer Immunol. Immunother. 2000b, 49, 476-484.
10. Graner M., Raymond A., Romney D., He L., Whitesell L., Katsanis E. Immunoprotective activites of multiple chaperone proteins isolated from murine B-cell leukemia/lymphoma. Clin. Cancer Res. 2000a, 6, 909-915.
11. Gross S., Walden P. Immunosupressive mechanisms in human tumors: why we still cannot cure cancer. Immunol. Lett. 2008, 116, 7-14.
12. Khong H.T., Restifo N. Natural selection of tumor variants in the generation of "tumor escape" phenotypes. Nat. Immunol. 2002, 3, 999-1005.
13. Lee C.-C., Lin T.-W., Ко T.-P., Wang A.H.-J. The hexameric structures of human heat shock protein 90. PlosOne 2011, 6, 1-14.
14. Li G., Andreansky S., Helguera G., Sepassi M., Janikashvili N., Canterll J., LaCasse C.L., Larmonier N., Penchet M.L., Katsanis E. A chaperon protein-enriched tumor cell lysate vaccine generates protective humoral immunity in a mouse breast cancer model. Mol. Cancer Ther. 2008, 7, 721-729.
15. Meng S-D., Song J., Rao Z., Tien P., Gao G.F. Three-step purification of gp96 from human liver tumor tissues suitable for isolation of gp-bound peptides. J. Immunol. Methods 2002, 264, 29-35.
16. Menoret A, Bell G. Purification of multiple heat shock proteins from a single tumor sample. J Immun Methods 2000, 237, 119-130.
17. Morol Y., Mayhew M., Trcka J., Hoe M.H., Takechi Y., Hartl F.U., Rothman J.E., Houghton A.N. Induction of cellular immunity by immunization with novel hybrid peptides complexed to heat shock protein 70. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2000, 97, 3485-3490.
18. Murshid A., Gong J., Calderwood S.K. Purification, preparation, and use of chaperon-peptide complex for tumor immunotherapy. Methods Mol. Biol. 2013, 960, 209-217.
19. Noesssner E., Gastpar R., Milani V., Brandl A., Hutzler P.J.S., Kuppner M.C., Roos M., Kremmer E., Asea A, Calderwood S.K., Issels R.D. Tumor-derived heat shock protein 70 peptide complexes are cross-presented by human dendritic cells. J Immunol 2002, 169, 5424-5432.
20. Peng P., Menoret A., Srivastava P.R. Purification of immunogenic heat shock protein 70-peptide complexes by ADP-affinity chromatography. J. Immunol. Methods 1997, 204, 13-21.
21. Poller S., Dragovic Z., Hartl F.U., Bracher A. structural basis for cooperation of hsp70 and hsp110 chaperones in protein folding. Cell 2008, 133, 1068-1079.
22. Srivastava P. Compositions and methods for eliciting an immune response using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy. USP 6322790, 2001.
23. Srivastava P. Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer. USP 5750119, 1998.
24. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins and peptides and antigen presenting cells; chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu Rev Immunol 2002, 20, 395-425.
25. Srivastava P. Method for preparing compositions comprising heat shock proteins useful for the treatment of cancer and infectious disease. USP 7666581, 2010.
26. Srivastava P. Using heat shock proteins to improve the therapeutic benefit of a non-vaccine treatment modality. USP 9352019, 2016.
27. Srivastava PK. Composition and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases. USP 5837251, 1998.
28. Srivastava PK. Endo-β-D-glucuronidase (heparanase) activity of the heat shock protein/tumor rejection antigen gp 96. Biochem. J. 1994, 301, 919
29. Udono B.H., Srivastava P.K. Heat shock protein 70 - associated peptides elicit specific cancer immunity. J. Exp. Med. 1993, 178, 1391-1396.
30. Udono H., Saito Т., Ogawa M., Yui Y. Hsp-antigen fusion and their use for immunization. Methods 2004, 32, 21-24.
31. Wang H.-H., Mao Y., Teng L.S., Cao J. Recent advances in heat shock protein-based chaperon vaccines. Hepatobiliary Pancreatic Dis Int. 2006, 5, 22-27.
32. Wang X.Y., Chen X., Manjili M.H., Repasky E., Henderson R., Subjeck J.R. Targeted immunotherapy using reconstituted chaperone complexes of heat shock protein 110 and melanoma-associated antigen gp100. Cancer res. 2003, 63, 2553-2560.
33. Wang X.Y., Kazim L., Repasky E.A., Subjeck J.R. Characterization of heat shock protein 110 and glucose-regulated protein 170 as cancer vaccines and the effect of fever range hyperthermia on vaccine activity. J. Immunol. 2001, 166, 490-497.
34. Wang X.Y., Sun X., Chen X., Facciponte J., Repasky E., Kane J., Subjeck J. Superior antitumor response induced by large stress protein chaperoned protein antigen compared protein antigen compared with peptide antigen. J Immunol. 2010, 184, 6309-6319.
35. Zabrecky J., Sawlivich W. Purification of the heat shock protein, gp96, from natural sources. Methods 2004, 32, 3-6.
36. Zeng Y., Feng H., Graner M.W., Katsanis E. Tumor-derived, chaperon-rich cell lysate activates dendritic cell and elicits potent antitumor immunity. Blood 2003, 101, 4485-4491.
37. Zuo D., Subjeck J., Wang X.Y. Unfolding the role of large heat shock proteins: new insights and therapeutic implications. Frontiers in immunologe 2016, 7, 1-15.
38. Бабышкина H.H., Малиновская Е.Ф., Стахеева M.H., Волкоморов В.В., Уфандеев А.А., Слонимская Е.М. Роль трансформирующего ростового фактора TGF-B1 в патогенезе рака молочной железы. Сибирский онкологический журнал 2010, 6, 63-70.
39. Никитин К.Д. Белки теплового шока: биологические функции и перспективы применения. Клиническая онкогематология 2008, 1, 125-130.
40. Никитин К.Д., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока. Российский биотерапевтический журнал 2007, 6, 3-12.
41. Северин С.Е., Ляшенко А.А., Коваленко Н.А., Обухова В.В., Кешелава В.В. Способ получения препарата, содержащего комплекс белков теплового шока 70, 90, 96, ассоциированных с антигенными пептидами. Патент RU №2287339, 2005.
Claims (1)
- Способ выделения опухолевых антигенов для иммунотерапии опухолей, характеризующийся тем, что измельчают 1 грамм опухоли на охлаждаемой поверхности, добавляют 9 мл буфера (рН 7,0), состоящего из 10 мМ NaHCO3, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ PMSF, гомогенизируют, затем центрифугируют сначала при 20000 g при 4°С в течение 30 минут, а затем при 100000 g при 4°С в течение 90 минут, надосадочную жидкость подвергают ультра-/диафильтрации, используя мембрану с пределом отсечения 50 кДа, при этом используют формулирующий буфер (рН 7,0), состоящий из 10 мМ NaHCO3 и 150 мМ хлорида натрия.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016142688A RU2640017C1 (ru) | 2016-10-31 | 2016-10-31 | Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016142688A RU2640017C1 (ru) | 2016-10-31 | 2016-10-31 | Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2640017C1 true RU2640017C1 (ru) | 2017-12-25 |
Family
ID=63857373
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016142688A RU2640017C1 (ru) | 2016-10-31 | 2016-10-31 | Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2640017C1 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2063768C1 (ru) * | 1991-08-14 | 1996-07-20 | Валентин Александрович Фигурнов | Способ предварительной обработки опухолевой ткани для получения антигена раковой опухоли |
WO2003015712A2 (en) * | 2001-08-20 | 2003-02-27 | University Of Connecticut Health Center | Methods for preparing compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin |
RU2287339C1 (ru) * | 2005-04-29 | 2006-11-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт Молекулярной Диагностики" (АНО ИнМоДи) | Способ получения препарата, содержащего комплекс белков теплового шока 70,90,96, ассоциированных с антигенными пептидами |
RU2367470C1 (ru) * | 2008-06-20 | 2009-09-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурская государственная медицинская академия | Способ получения антигена раковой опухоли |
-
2016
- 2016-10-31 RU RU2016142688A patent/RU2640017C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2063768C1 (ru) * | 1991-08-14 | 1996-07-20 | Валентин Александрович Фигурнов | Способ предварительной обработки опухолевой ткани для получения антигена раковой опухоли |
WO2003015712A2 (en) * | 2001-08-20 | 2003-02-27 | University Of Connecticut Health Center | Methods for preparing compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin |
RU2287339C1 (ru) * | 2005-04-29 | 2006-11-20 | Автономная некоммерческая организация "Институт Молекулярной Диагностики" (АНО ИнМоДи) | Способ получения препарата, содержащего комплекс белков теплового шока 70,90,96, ассоциированных с антигенными пептидами |
RU2367470C1 (ru) * | 2008-06-20 | 2009-09-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурская государственная медицинская академия | Способ получения антигена раковой опухоли |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20200157146A1 (en) | Controlled modulation of amino acid side chain length of peptide antigens | |
Breloer et al. | Isolation of processed, H‐2Kb‐binding ovalbumin‐derived peptides associated with the stress proteins HSP70 and GP96 | |
US5981706A (en) | Methods for synthesizing heat shock protein complexes | |
Deres et al. | In vivo priming of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with synthetic lipopeptide vaccine | |
Castelli et al. | Heat shock proteins: biological functions and clinical application as personalized vaccines for human cancer | |
Graner et al. | Tumor-derived multiple chaperone enrichment by free-solution isoelectric focusing yields potent antitumor vaccines | |
US8709405B2 (en) | Cancer vaccines containing epitopes of oncofetal antigen | |
Meng et al. | Three-step purification of gp96 from human liver tumor tissues suitable for isolation of gp96-bound peptides | |
Webb et al. | Functional and structural characteristics of NY-ESO-1-related HLA A2-restricted epitopes and the design of a novel immunogenic analogue | |
CN105175527B (zh) | 一种乳腺癌特异性的热休克蛋白复合物及其应用 | |
CN109810946B (zh) | 天花粉蛋白用于致敏和/激活树突状细胞中的应用 | |
CA2312049A1 (en) | Method for purifying heat shock peptides complexes | |
RU2640017C1 (ru) | Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин | |
Fedorov et al. | Molecular chaperone GroEL–toward a nano toolkit in protein engineering, production and pharmacy | |
CN111040038A (zh) | Ii-Key杂交多肽及其肿瘤疫苗制备方法和应用 | |
EP3380513A1 (en) | Peptides from npsr1 | |
Wang et al. | Current ideas about applications of heat shock proteins in vaccine design and immunotherapy | |
Chen et al. | Purification of heat shock protein 70-associated tumor peptides and its antitumor immunity on hepatoma in mice | |
JP2002523376A (ja) | ヒートショック蛋白から誘導されたサイトカインを含有するワクチン | |
Wang et al. | Glycoprotein 96 and α-fetoprotein cross-linking complexes elicited specific antitumor immunity | |
Skarga et al. | Purification of the 90 kDa heat shock protein (hsp90) and simultaneous purification of hsp70/hsc70, hsp90 and hsp96 from mammalian tissues and cells using thiophilic interaction chromatography | |
RU2283129C1 (ru) | Белковопептидный противоопухолевый композит, клеточный препарат, активированный этим композитом, и способ профилактики или лечения опухолей | |
CA2382331C (en) | Vaccine against intra-cellular pathogens | |
RU2287339C1 (ru) | Способ получения препарата, содержащего комплекс белков теплового шока 70,90,96, ассоциированных с антигенными пептидами | |
Gullo et al. | The Role of Heat Shock Proteins in the Elicitation of Immune Responses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181101 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200122 |