CN111040038A - Ii-Key杂交多肽及其肿瘤疫苗制备方法和应用 - Google Patents

Ii-Key杂交多肽及其肿瘤疫苗制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Ii‑Key杂合多肽，MHC II类分子的稳定多肽链(Ii)氨基酸序列中的LRMK四肽够被TH细胞识别的多肽相连，其在体外显示出大于250倍的MHCⅡ类分子结合效力，并且更容易的被抗原呈递细胞识别和呈递。本发明提供了一种杂交多肽肿瘤疫苗的制备方法，以及其联合免疫佐剂粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)治疗癌症的应用。本发明的杂交多肽肿瘤疫苗是一种最新机制的激活自身免疫系统的高效癌症免疫治疗疫苗。本发明提供的Ii‑Key杂交多肽肿瘤疫苗，提高抗癌效能。

Description

Ii-Key杂交多肽及其肿瘤疫苗制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体地说，涉及一种Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗。
背景技术
前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性生殖系统较为常见的恶性肿瘤，世界范围内，其发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二；在美国，其发病率已超过肺癌，成为第一位严重威胁男性健康的肿瘤。我国前列腺癌的发病率虽然低于西方国家，但近年来随着人口老龄化、人群健康意识提高、饮食结构改变以及诊断技术的不断提高，前列腺癌的发病率和死亡率均呈现明显上升趋势，正在成为影响我国男性健康的重要恶性肿瘤。以上海为例，前列腺癌发病率从 1990年2.6/10万上升到2008年22.1/10万(同年，城市男性肝癌发病率34/10 万)，平均年增长率达12.6％。
前列腺癌的病因及发病机制十分复杂，其确切病因尚不明确，病因学研究显示前列腺癌与遗传、年龄、外源性因素如环境因素、饮食习惯等有密切关系。前列腺癌早期缺乏特异性临床表现，当患者出现症状时多数已有局部浸润或远处转移。与欧美前列腺癌人群不同的是，中国前列腺癌患者中晚期、转移性前列腺癌患者的比例更高。有数据表明，至少有65％-75％的前列腺癌患者发生骨转移，出现骨痛、病理性骨折、肢体活动障碍、脊髓压迫和高钙血症等骨相关事件，甚至是下肢瘫痪。同时，晚期前列腺癌患者还会出现情绪低落消沉、失眠、抑郁、全身乏力等症状，严重影响患者的总体生存期和生活质量。
目前，临床上对前列腺癌的治疗方法包括手术治疗、放射治疗、内分泌治疗、化学治疗、免疫治疗、冷冻治疗等。
根治性前列腺癌切除术和根治性前列腺癌放疗是局限性前列腺癌治疗的首选方案，可有效降低前列腺癌病死率，改善患者预后。但前列腺癌起病隐匿，出现症状时常常已失去根治性手术和放疗机会，内分泌治疗成为晚期或进展期前列腺癌最主要的治疗手段。但经过1-2年的缓解期，几乎所有患者均对激素不再敏感，发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，甚至转移至前列腺以外的其他器官成为转移性CRPC。而一旦前列腺癌对雄激素产生抵抗，肿瘤进展迅速。二线内分泌治疗和化学治疗(如多西他赛、卡巴他赛等)在一定程度上延缓了肿瘤进展，可延长患者生存期，但仍然无法彻底杀灭肿瘤细胞。另外，昂贵的治疗费用和严重的不良反应，降低了患者的生活质量，使患者获益有限。
近年来，前列腺癌冷冻治疗、高能聚焦超声和组织内肿瘤射频消融等多种形式的治疗相继出现，对肿瘤的控制及临床症状缓解有一定的作用，但其疗效及安全性尚需进一步大规模的长期临床研究进行验证。
综上可见，前列腺癌的现有治疗手段局限，其治疗仍存在诸多未能满足的治疗需求和挑战，因此，迫切需要可以提供持久疾病控制和长期生存获益的治疗方法。
乳腺癌(BCa)是最常见的恶性肿瘤，是导致美国妇女死于癌症的第二常见原因。尽管近些年来标准治疗取得了很大的进步，但仍有很大一部分患者最终死于疾病复发，尤其见于肿瘤具有侵袭性的亚组患者中，如人表皮生长因子受体2(HER2/neu)高表达的肿瘤患者。HER2/neu是许多恶性肿瘤上皮细胞中表达的原癌基因。25％BCa发现有HER2/neu高表达，其往往导致预后不良。
虽然淋巴结状态仍然是乳腺癌最重要的预后因素，但是其他指标如 HER-2/neu的表达也会影响疾病复发和最终生存率。大约60-70％乳腺癌患者有 HER-2/neu表达，而20-30％乳腺癌患者高表达HER-2/neu(3)。赫赛汀 (Herceptin)是一种能够与HER2蛋白结合的单克隆抗体(mAb)，目前广泛应用于淋巴结阳性(NP)和高危淋巴结阴性(NN)乳腺癌患者的辅助治疗。在这两种适应症治疗中，已经证明赫赛汀(Herceptin)能使乳腺癌的复发率降低约50％。不幸的是，赫赛汀只能用于少数HER2蛋白高表达的肿瘤患者。
对肿瘤免疫应答认识的进展也促使了其他免疫治疗方法的出现和发展。具体来说，抗癌疫苗的研发有望成为高复发风险乳腺癌患者接收一线治疗后的辅助和预防治疗。杂交多肽插入称作Ii-Key的4个氨基酸修饰序列，Ii-Key通过特异性激活CD4+T辅助细胞提高疫苗有效性。
在对癌症免疫应答的理解方面的进展促进了免疫治疗的出现，特别是抗癌疫苗的开发，使之有望成为一线治疗后高复发风险的BCa患者的一种辅助和预防性疗法。原癌基因HER2/neu的蛋白产物是多种免疫源性多肽，多肽是一种抗癌疫苗和一种免疫佐剂(最常见的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 联用的基础。
疫苗临床试验的初步结果证实了该疫苗的安全性，但也证明了如果疫苗剂量低和(或)接种次数少，会导致免疫应答缺失。而且，在疫苗接种结束6个月后，多肽特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应极其微弱。虽然这种疫苗有希望，但要有效诱导持久的疫苗特异性免疫应答，还需要改进。为了提高诱导效率并建立长期记忆应答，可能需要使用辅助多肽来刺激辅助T淋巴细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗，使用方便、安全且健康环保。
本发明公开的Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗所采用的技术方案是:
一种Ii-Key杂交多肽，MHC II类分子的稳定多肽链(Ii)氨基酸序列中的LRMK四肽够被TH细胞识别的多肽相连，Ii-Key四肽可连接到以下TH多肽中的一种，
a)、细胞色素C：PGCC(95-104)、
b)、HER2/neu(777-790)、
c)、gp-100(48-58)、
d)、细胞色素C：PGCC(81-104)、
e)、髓磷脂碱性蛋白(MBP 90-102)、
f)、HPVgp160(843-852)、
g)、HPVgag(279-272)、
h)、HER2/neu(776-790)。
作为优选方案，所述a)和d)多肽是Ac-LRMK-ava-IAYLKQATAK-NH2、 Ac-LRMK-ava-ava-IAYLKQATAK-NH2、Ac-LRMK-LPKS-IAYLKQATAK-NH2、 Ac-LRMK-LPKS-AKP-IAYLKQATAK-NH2或Ac-LRMK-LPKS-AKP-VSK-IAYLKQATAK-NH2中的任意一种。
作为优选方案，所述b)和h)多肽是Ac-GVGSPYVSRLLGICL-NH2、 Ac-LRMK-GVGSPYVSRLLGICL-NH2，Ac-LRMK-ava-SPYVSRLLGICL-NH2、
Ac-LRMK-ava-GSPYVSRLLGICL-NH2，Ac-LRMK-ava-VGSPYVSRLLGICL
–NH2或Ac-LRMK-ava-GVGSPYVSRLLGICL-NH2中的任意一种。
作为优选方案，所述Ii-Key四肽与h)偶联后得到杂合肽 Ac-LRMK-GVGSPYVSRLLGICL-NH2。
一种Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗，包括上述的Ii-Key杂交多肽，
步骤一，选用Ii-Key杂交多肽10-20mol，加入30-60g的 Rink-Amide-MBHA-Resin树脂；
步骤二，肽链装配中使用Fmoc化学物质。溶剂洗涤体积的计算基于8mL/g 的起始树脂。用10-15mL每克起始树脂用25％哌啶溶解在二甲基甲酰胺(DMF) 中进行去保护步骤(去除Fmoc)，使用DIC与羟基苯并三唑(HOBt)作为活化剂偶联氨基酸。DIC和HOBt的量是基于取代和批量大小的两倍。使用茚三酮测试“监测每个偶联过程。树脂和溶剂的混合是通过惰性气体鼓泡实现。复投用 3倍过量的氨基酸和HOBt及DIC，Leu14 Ser12,Val11,Tyr10,Pro9,Ser8, Gly5,Lys4,and Arg2全部再偶联一次。
步骤三，得到保护氨基酸，精氨酸得到分子量为648.77的 Fmoc-Arg(Pbf)-OH保护氨基酸，半胱氨酸得到分子量为585.7的 Fmoc-Cys(Trt)-OH保护氨基酸，甘氨酸得到分子量为297.3的Fmoc-Gly-OH 保护氨基酸，异亮氨酸得到分子量为353.4的Fmoc-Ile-OH保护氨基酸，亮氨酸得到分子量为353.4的Fmoc-Leu-OH保护氨基酸，赖氨酸得到分子量为468.5的Fmoc-Lys(Boc)-OH保护氨基酸，蛋氨酸得到分子量为371.5的 Fmoc-Met-OH保护氨基酸，脯氨酸得到分子量为337.4的Fmoc-Pro-OH保护氨基酸，丝氨酸得到分子量为383.4的Fmoc-Ser(tBu)-OH保护氨基酸，酪氨酸得到分子量为459.5的Fmoc-Tyr(tBu)-OH保护氨基酸，缬氨酸得到分子量为 339.4的Fmoc-Val-OH保护氨基酸。
步骤四，乙酰化及树脂收缩，加入220-280ml左右DMF，然后加入20-30ml 乙酸酐，15-20ml吡啶，用惰性气体鼓吹。茚三酮测试偶联完成后抽去液体。然后依次用DMF/DCM/甲醇洗涤，放入烘箱干燥。
步骤五，配制三氟乙酸(TFA)/乙二硫醇(EDT)/水(90/5/5)的切割液，先将切割液冷冻至0℃，按照10ml/g的比例加入到树脂中，室温下反应2-3 小时，然后过滤树脂并用120mL的TFA进行冲洗来完成肽的提取，用惰性气体吹掉30％的切割液，然后将残留的肽溶液倒入冷冻的8-12倍乙醚中来沉淀出肽，沉淀一段时间后过滤并加入乙醚清洗5-8次，然后抽干。
步骤六，抽干后的沉淀溶于1-1.5L 10％HOAc中，溶液在砂芯过滤器上用 0.45um滤膜过滤，使用反相高效液相色谱纯化多肽，经过一次纯化后，合并大于95％的进行本步骤进行二次纯化，最后合并大于98％的做为合格品；
步骤七，转盐，纯化参数如下：
柱:C18,10μm,5*250cm；
溶剂A:0.8％HAC H,O；
溶剂B:CAN；
溶剂C:20mmol/L醋酸铵溶液；
溶剂D:H,O；
梯度:5％B 95％D 15min流速50mL/min；
5％C 95％D 15min流速50mL/min；
5％B 95％D 15min流速50mL/min；
5％A 95％D 15min流速50mL/min；
25％A 40％D 60min流速50mL/min；
检测器:220nm；
收集检测合格经过过聚丙烯过滤器过滤，分装于培养皿中经冻干机冻干 72H得到冻干粉末，得到的冻干粉末即为肿瘤疫苗。
一种Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的应用，根据上述制备的肿瘤疫苗在治疗肿瘤的药物方面的应用。
作为优选方案，所述肿瘤包括乳腺癌癌、前列腺癌或宫颈癌。
本发明公开的Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的有益效果是：杂交多肽含有氨基酸的Ii蛋白片段(称为Ii-Key)通过活动或固定的APC增强对T细胞杂交瘤 (Sax2)的抗原肽呈递。发现了一种“核心”LRMKLPK结构，其效力大于原始 16-氨基酸肽，LRMK保留了半数最大活性。Ii-Key杂合抗原多肽，联结经由生物信息学技术筛选出的4肽氨基酸序列LRMK后，通过CD4+T细胞，提呈癌细胞信息，从而激活CD8+T细胞，杀死癌细胞；同时又通过与癌细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)结合，消除CD8+T细胞杀癌细胞的MHC限制，提高抗癌效能，其抗癌机理是独特的。
附图说明
图1是本发明Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的工艺流程图。
图2是本发明Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的Ii-Key/gp100(46-58)杂合肽的成分表。
图3是本发明Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的Ii-Key/gp100(46-58)杂合肽的实验结果图。
图4是本发明Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的临床测试图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明做进一步阐述和说明:
本发明提供了一种Ii-Key杂交多肽，在于MHC II类分子的稳定多肽链 (Ii)氨基酸序列中的LRMK四肽通过合适的接头与能够被TH细胞识别的多肽相连可以显著增强免疫反应。其中Ii-Key四肽可连接到以下TH多肽：
a)、细胞色素C：PGCC(95-104)
b)、HER2/neu(777-790)
c)、gp-100(48-58)
d)、细胞色素C：PGCC(81-104)
e)、髓磷脂碱性蛋白(MBP 90-102)
f)、HPVgp160(843-852)
g)、HPVgag(279-272)
h)、HER2/neu(776-790)
Ii-Key杂交多肽疫苗的制备方法包括如下步骤：
步骤一：树脂选择。
多肽合成量10-20mmol，选用Rink-Amide-MBHA Resin树脂，摩尔量为 0.344mmol/g，算出来需要30-60g原始树脂；
步骤二：偶联。
肽链装配中使用Fmoc化学物质。溶剂洗涤体积的计算基于8mL/g的起始树脂。用10-15mL每克起始树脂用25％哌啶溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中进行去保护步骤(去除Fmoc)，保证完全去除的预防措施。使用DIC与羟基苯并三唑(HOBt)作为活化剂偶联氨基酸。计算氨基酸，DIC和HOBt的量是基于取代和批量大小的两倍。使用茚三酮测试“监测每个偶联过程。树脂和溶剂的混合是通过惰性气体鼓泡实现。
Leu14 Ser12,Val11,Tyr10,Pro9,Ser8,Gly5,Lys4,and Arg2这些氨基酸全部再偶联一次(复投用3倍过量的氨基酸和HOBt及DIC)；
步骤三：保护氨基酸。
Figure RE-GDA0002409394290000071
Figure RE-GDA0002409394290000081
步骤四：乙酰化及树脂收缩。
加入220-280ml左右DMF，然后加入20-30ml乙酸酐，15-20ml吡啶，用惰性气体鼓吹。茚三酮测试偶联完成后抽去液体。然后依次用DMF/DCM/甲醇洗涤，放入烘箱干燥。
步骤五：切割。
配制三氟乙酸(TFA)/乙二硫醇(EDT)/水(90/5/5)的切割液，按照10ml/g 的比例加入到树脂中，加入之前先将切割液冷冻至0℃。
室温下反应2-3小时，然后过滤树脂并用120mL的TFA进行冲洗来完成肽的提取。用惰性气体吹掉30％的切割液，然后将残留的肽溶液倒入冷冻的8-12 倍乙醚中来沉淀出肽。沉淀一段时间后过滤并加入乙醚清洗5-8次，然后抽干送纯化。
步骤六：粗品的纯化。
粗品溶于1-1.5L 10％HOAc中。粗品溶液在砂芯过滤器上用0.45um滤膜过滤。使用反相高效液相色谱纯化多肽。
经过一次纯化后，合并大于95％的进行二次纯化，最后合并大于98％的做为合格品。
步骤七：转盐，纯化参数如下：
柱:C18,10μm,5*250cm；
溶剂A:0.8％HAC H,O；
溶剂B:CAN；
溶剂C:20mmol/L醋酸铵溶液；
溶剂D:H,O；
Figure RE-GDA0002409394290000091
检测器:220nm；
收集检测合格经过过聚丙烯过滤器过滤，分装于培养皿中经冻干机冻干 72H得到冻干粉末，得到的冻干粉末即为肿瘤疫苗。本发明中在树脂上制备肽的流程。室温下，在底部装有烧结过滤器以便溶剂洗涤和过滤固体2L反应容器中合成。在30克(批量大小)的FmocRink酰胺甲基二苯甲基胺树脂上进行合成，取代度为0.84meq/g。在整个肽链装配中使用Fmoc化学物质。溶剂洗涤体积的计算基于8mL/g的起始树脂。用12mL每克起始树脂用25％哌啶溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中进行去保护步骤(去除Fmoc)，保证完全去除的预防措施。使用DIC与羟基苯并三唑(HOBt)作为活化剂偶联氨基酸。计算氨基酸， DIC和HOBt的量是基于取代和批量大小的两倍。茚三酮测试“监测每个偶联过程。树脂和溶剂的混合是通过惰性气体鼓泡实现。
本发明中再偶联的阳性茚三酮测试显示氨基酸Leu14 Ser12,Val11, Tyr10,Pro9,Ser8,Gly5,Lys4,和Arg2藕联。Leu14再偶联三次以实现完全连接。第一次和第三次补充使用2倍过量的氨基酸和HOBt。第二次再偶联仅使用2倍过量的氨基酸。将Val11重新偶联两次，一次用2倍过量的氨基酸和 HOBt，一次用2倍量的氨基酸。使用2倍过量的氨基酸和HOBt将Ser12，Ser8， Gly5和Lys4重新偶联一次。将Tyr102倍量的氨基酸重新偶联一次，并且Pro9 仅使用2倍量的氨基酸重新偶联一次。使用2倍过量的氨基酸和HOBt将Arg2 重新偶联两次。
在本发明的乙酰化在氨基末端的最终去保护之后用乙酸化混合物乙酸酐/ DCM/DMF/DIEA(20/40/35/5)以8mL/g的批量大小进行。该乙酰化树脂用 DMF和DCM冲洗，反应的完成使用茚三酮试验监测并验证。树脂在惰性气体流下干燥。树脂上干燥肽的最终产量为91.1克，相当于理论值的89.1％。产量低于预期可能是由于树脂替代量低于原本的估计值。低产量对粗肽的质量没有影响和随后的纯化步骤质量。
本发明的乙酰化是将肽从树脂上分离，同时用三氟乙酸(TFA)酸解处理使侧链脱保护。对于45.3g肽以三氟乙酸(TFA)/乙二硫醇(EDT)/水(90/5/5) 的冷冻的混合物树脂10mL/g处理。加入到树脂上的肽上前，将TFA切割溶液冷却至0℃以减少副反应。使用EDT和H2O作为清除剂以捕获叔丁基和在分裂过程中产生的三苯甲基碳阳离子。室温下反应2.5小时，然后过滤树脂并用 45.3mL的TFA进行冲洗来完成肽的提取。保持温度<25℃，用旋转蒸发器，将肽溶液的体积减少到60％。将残留的肽溶液倒入冷冻的叔丁基甲基醚(MTBE) 的2.5L中来沉淀出肽。通过离心分离沉淀物。倒出上清液，将所得沉淀溶于 1000mL 90％乙酸中。合并肽溶液，并置于1200mL冻干烧瓶中，冷冻壳，并在 VirtisFM25EL冻干机上冻干64小时。产量为20.8克，相当于理论值的89％。产品是通过RP.HPLC分析，平均纯度为72％。对于a粗产物的代表性HPLC色谱图。在下述条件下，粗肽洗脱15.5分钟。在LCQ质谱仪上通过质谱分析使用电喷雾电离和四极离子阱检测确定粗肽成分。在1052.6amu观察到(M+2H) 2+/2离子，与计算的肽的平均分子量2103.6amu很好的吻合。树脂上45g 肽的另一项裂解操作使相近纯度的粗肽产量增多21.2g。
粗肽的分析:
HPLC系统：Beckman Gold Nouveau
柱：Vydac C18柱，4.6mm×250mm，5μm，300A
溶剂A：0.1％TFN/H，O
溶剂B：0.1％TFN/乙腈
梯度：30分钟内26-56％B。
流速：1.0mL/min。
检测器：215nm。
在本发明中粗肽的纯化是使用反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化肽，以C18 衍生二氧化硅作为固定相，在制备型HPLC系统上进行。流动相由TFA缓冲水溶剂和乙腈(ACN)组成。一步纯化足以达到所需的纯度。这也导致纯化肽中含TFA盐。使用这个纯化方案，进行了四次粗肽的注入来获得足够数量的材料。作为纯化的说明，8.0克粗冻干肽溶于800mL 10％HOAc中。粗肽溶液在多孔玻璃漏斗上过滤，以加载到流速150mL/min的专用制备柱上，并且使用以下条件纯化肽溶液：
纯化参数
HPLC系统：Waters Delta Prep Asset#：000081
柱：C18,15μm，7.5×30cm Asset#：001284
溶剂A：0.1％TFAIH，O
溶剂B：ACN
梯度：0％B，持续10分钟，流速150mL/min；
10分钟内0-18％B，流速90mL/min；
120分钟内18-48％B，流速90mL/min。
检测器：230nm
将含有纯肽的每个级分的样品混合并通过HPLC分析。成分被消除或加入，直到最大比例成分显示具有期望纯度的主峰的量(批号S1379产品的成分3R2 至22R2)。合并含有纯肽的级分，分配在1200mL Virtis冻干瓶中，冷冻，并在Virtis FM25EL冻干机上冻干18小时至干燥。批号S1379的产量为4.81克的纯化材料。
HPLC分析收集的成分
HPLC系统：Beckman Gold Nouveau
柱：Vydac C184.6 mm x 250mm，5μm，300A.
溶剂A：0.1％TFAIH，O
溶剂B：0.1％TFAlACN
梯度：20分钟内31-51％B。
流速：1.0mL/min。
检测器：215nm
标准：合并的纯度必须>95％
本发明中的肽的合并和交换，总共16.1克纯肽，三氟乙酸盐从四个不同批号的纯化28.1克粗肽中得到。作为过程检查，将来自每个批次的样品按比例合并在一起，每2747mg纯肽TFA盐为2.0mg，并使用如上所述的类似条件通过HPLC进行分析。所得“小池”的纯度为95.7％，表示在合并和交换所有批次时预期的纯度。
用109.1千克Dowex 1X 2-100(1-氯离子交换树脂取代物1.05meq/g；相对于碱性位点数量5倍过量)制备交换柱。肽加载到色谱柱前该柱依次用1N NaOH适量,pH 14，H2O适量。pH 7,25％HOAc适量。pH 2和USP纯化水适量洗涤。向16克纯化的肽中加入800毫升ACN/醋酸(HOAc)/H 2O(50/5/5)，但肽未完全溶解。ACN/HOAc/H 2O的体积增加至1500毫升并将溶液超声处理20分钟。为了防止肽在柱上沉淀，在加入肽溶液之前，用1倍柱体积的 90％HOAc冲洗柱子。将肽加载到柱上并用1倍柱体积的90％HOAc洗脱。洗脱的肽溶液通过聚丙烯过滤器过滤，在8个1200mL Virtis冻干烧瓶中在干冰/ IPA浴中冷冻壳化，并在VirtisFM25EL冻干机上冻干至63小时。总共获得 14.7克纯化的肽乙酸盐，相当于理论量的98.0％。
请参考图2-图3，图3是接种各种Ii-Key/gp100(46-58)杂合肽的小鼠的IFN-γ和IL-4ELISPOT试验的典型结果。仅用gp100(46-58)(多肽A)进行试验。非特异性多肽是GVGSPYVSRLLGICL。初种小鼠未接受过多肽接种。 Ii-Key通过gp100(46-58)抗原表位增强CD4+T细胞的体内致敏：
这些研究以HLA-DR4-IE小鼠(Taconic)为模型进行黑色素瘤相关抗原 gp100(46-58)试验。必须使用gp100抗原表位，因为如计算机算法(29,30) 和先前的体外结合研究(31)所预测，HER2/neu(776-790)抗原表位不会与转基因小鼠(DRB1*0401)体内存在的DR4亚等位基因互作。我们设计了一些 Ii-Key/gp100(46-58)杂合体，这些杂合体的Ii-Key与抗原表位连接空间不同(表1)。将Ii-Key/gp100(46-58)杂合体与完全弗氏佐剂(CFA)一同使用，接种HLA-DR4-IE转基因小鼠(Taconic)。接种后第21天，收获免疫小鼠的脾细胞，进行gp100(46-58)特异性ELISPOT试验。图1显示，ELISPOT试验中用gp100(46-58)抗原表位进行刺激时，用Ii-Key/gp100(46-58)杂合体E免疫的小鼠脾细胞产生的IFN-γ分泌斑点远远多于只用gp100(46-58)免疫的小鼠脾细胞。其它gp100 Ii-Key杂合体未表现出活性。值得注意的是，杂合体E是一种短链杂合体，因为LRMK Ii-Key部分与gp100(46-58)抗原表位的“L”之间只有一个ava接头，计算机算法表明这很适合MHC II类抗原肽结合槽的P1位点。该结果与我们以前得到的结果一致：使用更短的PGCC杂合体抗原表位(疫苗)时，体外刺激增加；用更短的HPV杂合体(疫苗)免疫后，体内应答更强。
虽然Ii-Key/gp100(46-58)杂合体E接种后的IL-4ELISPOT试验表现出的增强作用与IFN-γELISPOT观察到的作用相似，但这种杂合体的IL-2 ELISPOT试验并未显示增强作用(数据未显示)。重复试验得到了相似的结果(数据未显示)。我们的数据清楚表明，在体内免疫后，Ii-Key大大增强了gp100 (46-58)在激活gp100(46-58)特异性CD4+T细胞方面的活性。这些数据显示，Ii-Key与MHC II类抗原表位连接，成为抗原特异性免疫应答的增强因子。尽管IL-4生成也增强，但这并不会抑制IFN-γ的分泌。Ii-Key杂合体促进Th1 或Th2的趋势可能具有佐剂依赖性。CpG用作佐剂的其它试验中，Ii-Key杂合体有效诱导了IFN-γ分泌，但却是在没有IL-4的情况下(数据未显示)。
请参考图4，图4是使用XXμg各Ii-Key/HER2/neu杂合体和仅抗原表位孵育患者的PBMC 48、72和96小时。收获上清液，然后用夹心ELISA试验测量IFN-γ浓度。甚至在没有多肽的培养孔中，患者HW也有非特异性反应。 Ii-Key/HER2/neu杂合体对正常供者和乳腺癌患者PBMC的刺激实验。
GVGSPYVSRLLGICL(776-790)是我们重点关注的用于制备杂合体的 HER2/neu多肽，已证明其是一种混杂的HLA-DR抗原表位(23)，并一直应用于临床试验(24,25)。临床试验的结果显示，HER2/neu(776-790)安全(用500μg 多肽和GM-CS进行6次接种(每月一次)期间或接种后未观察到III或IV级毒性)，可诱导接种患者产生免疫应答。
在一项初步研究中，我们发现G89的Ii-Key/HER-2/neu(777-789)杂合体导致健康志愿者的PBMC以及转移性乳腺癌患者的淋巴结样本释放大量IFN- γ(32)。随后，我们构建了一系列Ii-Key/HER2/neu杂合体，供进一步研究 (表2)。从本质上讲，BSK38与G89相似，只是在G89中，最后一个氨基酸被删除。BSK47与以前描述的多肽F7相当，只是添加了Ii-key链。表2所示的其它Ii-key多肽(BSK36、37和48)都是F7(BSK47)的变异，BSK48中添加了一个缬氨酸，BSK36/37中添加了一个缬氨酸和一个甘氨酸。
上述方案中，杂交多肽肿瘤疫苗是含有Ii-Key杂合的抗原多肽，与未修饰的天然肽相比，其在体外显示出大于250倍的MHCⅡ类分子结合效力，并且更容易的被抗原呈递细胞识别和呈递。本发明提供了一种杂交多肽肿瘤疫苗的制备方法，以及其联合免疫佐剂粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)治疗癌症的应用。本发明的杂交多肽肿瘤疫苗是一种最新机制的激活自身免疫系统的高效癌症免疫治疗疫苗。独特的Ii-Key杂合抗原多肽，联结经由生物信息学技术筛选出的4肽氨基酸序列LRMK后，通过CD4+T细胞，提呈癌细胞信息，从而激活CD8+T细胞，杀死癌细胞；同时又通过与癌细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)结合，消除CD8+T细胞杀癌细胞的MHC限制，提高抗癌效能，其抗癌机理是独特的。因此，在制备治疗肿瘤药物中的应用，特别对肿瘤为乳腺癌、前列腺癌或宫颈癌。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种Ii-Key杂交多肽，其特征在于，MHC II类分子的稳定多肽链(Ii)氨基酸序列中的LRMK四肽够被TH细胞识别的多肽相连，Ii-Key四肽可连接到以下TH多肽中的一种，
a)、细胞色素C：PGCC(95-104)、
b)、HER2/neu(777-790)、
c)、gp-100(48-58)、
d)、细胞色素C：PGCC(81-104)、
e)、髓磷脂碱性蛋白(MBP 90-102)、
f)、HPVgp160(843-852)、
g)、HPVgag(279-272)、
h)、HER2/neu(776-790)。
2.如权利要求1所述的Ii-Key杂交多肽，其特征在于，所述a)和d)多肽是Ac-LRMK-ava-IAYLKQATAK-NH2、Ac-LRMK-ava-ava-IAYLKQATAK-NH2、Ac-LRMK-LPKS-IAYLKQATAK-NH2、Ac-LRMK-LPKS-AKP-IAYLKQATAK-NH2或Ac-LRMK-LPKS-AKP-VSK-IAYLKQATAK-NH2中的任意一种。
3.如权利要求1所述的Ii-Key杂交多肽，其特征在于，所述b)和h)多肽是Ac-GVGSPYVSRLLGICL-NH2、Ac-LRMK-GVGSPYVSRLLGICL-NH2，Ac-LRMK-ava-SPYVSRLLGICL-NH2、Ac-LRMK-ava-GSPYVSRLLGICL-NH2，Ac-LRMK-ava-VGSPYVSRLLGICL–NH2或Ac-LRMK-ava-GVGSPYVSRLLGICL-NH2中的任意一种。
4.如权利要求1-3任一项所述的Ii-Key杂交多肽，其特征在于，所述Ii-Key四肽与h)偶联后得到杂合肽Ac-LRMK-GVGSPYVSRLLGICL-NH2。
5.一种Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的制备方法，包括上述1-4任一项所述的Ii-Key杂交多肽，其特征在于，
步骤一，选用Ii-Key杂交多肽10-20mol，加入30-60g的Rink-Amide-MBHA-Resin树脂；
步骤二，肽链装配中使用Fmoc化学物质。溶剂洗涤体积的计算基于8mL/g的起始树脂。用10-15mL每克起始树脂用25％哌啶溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中进行去保护步骤(去除Fmoc)，使用DIC与羟基苯并三唑(HOBt)作为活化剂偶联氨基酸。DIC和HOBt的量是基于取代和批量大小的两倍。使用茚三酮测试“监测每个偶联过程。树脂和溶剂的混合是通过惰性气体鼓泡实现。复投用3倍过量的氨基酸和HOBt及DIC，Leu14 Ser12,Val11,Tyr10,Pro9,Ser8,Gly5,Lys4,and Arg2全部再偶联一次。
步骤三，得到保护氨基酸，精氨酸得到分子量为648.77的Fmoc-Arg(Pbf)-OH保护氨基酸，半胱氨酸得到分子量为585.7的Fmoc-Cys(Trt)-OH保护氨基酸，甘氨酸得到分子量为297.3的Fmoc-Gly-OH保护氨基酸，异亮氨酸得到分子量为353.4的Fmoc-Ile-OH保护氨基酸，亮氨酸得到分子量为353.4的Fmoc-Leu-OH保护氨基酸，赖氨酸得到分子量为468.5的Fmoc-Lys(Boc)-OH保护氨基酸，蛋氨酸得到分子量为371.5的Fmoc-Met-OH保护氨基酸，脯氨酸得到分子量为337.4的Fmoc-Pro-OH保护氨基酸，丝氨酸得到分子量为383.4的Fmoc-Ser(tBu)-OH保护氨基酸，酪氨酸得到分子量为459.5的Fmoc-Tyr(tBu)-OH保护氨基酸，缬氨酸得到分子量为339.4的Fmoc-Val-OH保护氨基酸。
步骤四，乙酰化及树脂收缩，加入220-280ml左右DMF，然后加入20-30ml乙酸酐，15-20ml吡啶，用惰性气体鼓吹。茚三酮测试偶联完成后抽去液体。然后依次用DMF/DCM/甲醇洗涤，放入烘箱干燥。
步骤五，配制三氟乙酸(TFA)/乙二硫醇(EDT)/水(90/5/5)的切割液，先将切割液冷冻至0℃，按照10ml/g的比例加入到树脂中，室温下反应2-3小时，然后过滤树脂并用120mL的TFA进行冲洗来完成肽的提取，用惰性气体吹掉30％的切割液，然后将残留的肽溶液倒入冷冻的8-12倍乙醚中来沉淀出肽，沉淀一段时间后过滤并加入乙醚清洗5-8次，然后抽干。
步骤六，抽干后的沉淀溶于1-1.5L 10％HOAc中，溶液在砂芯过滤器上用0.45um滤膜过滤，使用反相高效液相色谱纯化多肽，经过一次纯化后，合并大于95％的进行本步骤进行二次纯化，最后合并大于98％的做为合格品。
步骤七，转盐，纯化参数如下：
柱:C18,10μm,5*250cm；
溶剂A:0.8％HAC H,O；
溶剂B:CAN；
溶剂C:20mmol/L醋酸铵溶液；
溶剂D:H,O；
Figure FDA0002335758040000031
检测器:220nm；
收集检测合格经过过聚丙烯过滤器过滤，分装于培养皿中经冻干机冻干72H得到冻干粉末，得到的冻干粉末即为肿瘤疫苗。
6.一种Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的应用，其特征在于，根据权利要求5制备的肿瘤疫苗在治疗肿瘤的药物方面的应用。
7.如权利要求6所述的Ii-Key杂交多肽肿瘤疫苗的应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌癌、前列腺癌或宫颈癌。
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