CN106632694B

CN106632694B - 一种重组蛋白及药物组合物与应用

Info

Publication number: CN106632694B
Application number: CN201710059842.8A
Authority: CN
Inventors: 李建强; 葛君; 陈思; 陆凤; 任苏林; 周童; 戚凤春; 赵志强; 刘俊林; 殷相平; 蒲秀英; 徐继英; 王建锋; 焦文强
Original assignee: Nanjing Yikang Biomedical Co ltd
Current assignee: Nanjing Yikang Biomedical Co., Ltd.
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: CN106632694A; CN112574317B; CN112574317A

Abstract

本发明涉及领域生物医药，特别涉及一种重组蛋白及药物组合物与应用。本发明所述重组蛋白包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽具有特异的氨基酸序列，特异的空间结构，因此，具有强免疫原性，尤其是细胞免疫，且通过点突变解决了人体安全性问题。本发明所述药物组合物包括所述重组蛋白和佐剂能激发和强化针对人乳头瘤病毒E6、E7蛋白的特异性T细胞免疫应答，有效的治疗宫颈癌，具有良好的应用前景。

Description

一种重组蛋白及药物组合物与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种重组蛋白及药物组合物与应用。

背景技术

子宫颈癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中排名第二，仅次于乳腺癌。全世界约26.45亿的女性(大于15岁)面临宫颈癌的风险，每年53万例宫颈癌新发病例，占所有女性肿瘤的12％，死亡病例达26.5万例。中国约有5.52亿大于15岁的女性面临发展为宫颈癌的风险，最新统计显示，中国每年有61691名女性诊断为宫颈癌，其中29526名死亡，感染HPV16/18型的病例中，只有3.8％在一定时间显示正常的细胞学特点，76.1％发展为侵润性宫颈癌。

已知子宫颈癌主要由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起。70％以上HPV阳性的宫颈癌病变中存在HPV基因组的整合，其中以HPV16型和HPVl8型为主，其中约60％的宫颈癌与HPV16感染相关，约10％的宫颈癌与HPV18相关。对HPV的致癌机理研究显示：E6和E7基因是致癌型HPV的主要转化基因,两者共同具有锌指结构域的特征(zinc-binding structures)。HPVE6、E7蛋白分别可以与抑癌蛋白p53和pRb相结合，引起p53降解与pRb功能性灭活,这是HPVE6、E7癌蛋白干扰细胞周期负调控功能的主要机制，能导致上皮细胞永生化，细胞生长、增殖失控，细胞凋亡异常。因此，在HPV中E6和E7蛋白对宫颈癌的发病起主要作用，从而成为制备用于治疗和预防宫颈癌疫苗的主要靶抗原。

宫颈癌的传统治疗方法如手术、放疗、化疗等只对早期患者有一定的疗效，且治疗创伤大，不能防止HPV再度感染。研究显示，对于由病毒引起的肿瘤和传染性疾病，免疫疗法是一种有效的方法。重组蛋白疫苗纯度高安全性好，但其免疫原性低，蛋白更倾向于刺激体液免疫，不能诱导强的细胞免疫。研究还表明，单独使用原核表达的HPV E6或E7蛋白作为治疗性疫苗有一定的防治效果，但使用野生型的E6或E7蛋白作为治疗药物，由于其治疗效果不显著而无应用价值，且由于是未经改造的野生型癌基因产物，具有肿瘤转化活性，安全性受到人们的质疑。含有E6和E7基因的病毒，或以质粒为载体的DNA疫苗，由于可能整合到细胞基因组中，也存在安全性问题。用合成的多肽作为疫苗，其免疫原性低且受MHC限制，使用范围有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组蛋白及药物组合物以应用，以有效解决现在技术中重组蛋白疫苗免疫免疫原性低、不能诱导强的细胞免疫以及安全性问题等技术缺陷。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种重组蛋白，包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽；所述人乳头瘤病毒为16型和/或18型。

优选的，所述人乳头瘤病毒16型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV16型E6蛋白N端第1-83位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白N端的第1-62位氨基酸序列、HPV16型E6蛋白C端的第69-151位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白C端的第48-98位氨基酸序列，其中HPV16型E6的突变位点为F47R、L50G、C63G、C106R；HPV16 E7的突变位点为Y23G、C24G、Y25G、C58G、C91G；

优选的，所述人乳头瘤病毒18型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV18型E6蛋白N端第1-86位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白N端的第1-67位氨基酸序列、HPV18型E6蛋白C端的第72-158位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白C端的第53-105位氨基酸序列，其中HPV18型E6的突变位点为F49R、L52G、C65G、C108G；HPV18 E7的突变位点为L26G、C27G、H28G、C65G、C98G。

进一步的，在一些实施方案中，所述人乳头瘤病毒16型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列；或SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述人乳头瘤病毒18型E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

优选的，所述重组蛋白还包括免疫刺激分子。

其中，所述免疫刺激分子为fms样酪氨酸激酶3配体、TNF-ɑ、IL-2、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1ɑ和CD40配体、钙网蛋白N端、热休克蛋白、泛素中的至少一种。

优选的，所述免疫刺激分子为钙网蛋白N端或fms样酪氨酸激酶3配体。

进一步的，在一些实施方案中，所述钙网蛋白N端具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述fms样酪氨酸激酶3配体具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

优选的，所述免疫刺激分子与所述人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽以连接肽连接。

在一些实施方案中，所述连接肽具有如SEQ ID No.9所示氨基酸序列。

本发明还提供了编码所述重组蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述SEQ ID NO.1所示重组蛋白具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

优选的，所述SEQ ID NO.2所示重组蛋白具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。

优选的，所述SEQ ID NO.3所示钙网蛋白N端具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。

优选的，所述SEQ ID NO.4所示fms样酪氨酸激酶3配体具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组表达载体，含有所述核苷酸序列。

本发明还提供了一种工程菌，含有所述重组表达载体。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述的重组蛋白和佐剂。

其中，优选的，所述佐剂为油/水乳化剂ISA51、TLR3激动剂poly I:C、表面活性剂类免疫刺激复合物ISCOMATRIX、CpG-ODN中的至少一种。

进一步，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括可药用载体。

优选的，所述可药用载体包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、羟基苯甲酸甲酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油中的至少一种。

本发明还提供了所述的重组蛋白或/和所述的药物组合物在制备提高针对人乳头瘤病毒的体液免疫和细胞免疫免疫应答的药物中的应用。

本发明还提供了所述的重组蛋白或/和所述的药物组合物在制备治疗和/或预防人乳头瘤病毒引起疾病的药物中的应用。

其中，优选的，所述人乳头瘤病毒引起的疾病为子宫颈癌。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种重组蛋白及药物组合物与应用。本发明所述重组蛋白包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽具有特异的氨基酸序列，特异的空间结构，因此，具有强免疫原性，尤其是细胞免疫，且通过点突变解决了人体安全性问题。本发明所述药物组合物包括所述重组蛋白和佐剂能激发和强化针对人乳头瘤病毒E6、E7蛋白的特异性T细胞免疫应答，有效的治疗宫颈癌，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示四种融合蛋白结构图，其中图A为rm16E6E7蛋白结构图、图B为rm18E6E7蛋白结构图、图C为NCRT-RM16蛋白结构图、图D为Flt3l-RM16蛋白结构图；

图2示四种融合蛋白纯度鉴定图，其中A图为rm16E6E7蛋白纯度检测图；B图为rm18E6E7蛋白纯度检测图；C图为NCRT-RM16蛋白纯度检测图；D图为Flt3l-RM16蛋白纯度检测图)；

图3示ELISPOT测试rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白产生IFN-γ细胞免疫的应答结果；

图4示ELISPOT测试rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白产生IL-4细胞免疫的应答结果；

图5示流式细胞测试rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白产生IFN-γ⁺CD8⁺T细胞免疫的应答结果；

图6示ELISA测试rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白产生IgG抗体结果；

图7示ELISA测试rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白产生IgG1抗体结果；

图8示ELISA测试rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白产生IgG2a抗体结果；

图9示肿瘤治疗实验结果图；

图10示ELISPOT测试rm18E6E7蛋白、rm16E6E7+rm18E6E7蛋白的免疫应答的结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种重组蛋白及药物组合物与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

一方面，本发明涉及一种重组蛋白，包括人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽。

本发明中所述人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7变形体的融合多肽可以源于HPV16型、18型、31型、33型、45型、51型、52型和58型。优选的，所述E6和E7变形体融合多肽源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)和/或18型人乳头瘤病毒(HPV18)。

本发明所述的“人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7变形体的融合多肽”指对E6和E7的天然氨基酸序列进行点突变后重新排列融合形成新的多肽序列。其中“点突变”指氨基酸序列中碱基对发生改变而使其与天然氨基酸序列产生差异。其中“重新排列”指将点突变的E6、E7的N端和C端分别融合后再连接形成E6N-E7N-E6C-E7C的融合多肽序列。本发明中E6、E7的点突变和重新排列氨基酸序列只改变其三维结构去除转化细胞活性，并不改变免疫原性，并且在重排的连接处有15个氨基酸的重叠，保证所有的抗原表位不丢失，使其仍然具有与天然氨基酸序列相同的免疫原性。

本发明所述的一种重组蛋白可为氨基酸序列被突变并重排的人乳头瘤病毒16型E6/E7融合多肽。

更为具体地，该突变重排HPV16 E6/E7融合多肽具有多个突变位点：E6蛋白中第47位的苯丙氨酸(F)突变为精氨酸(R)、第50位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)、第63位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第106位的半胱氨酸(C)突变为精氨酸(R)，所述HPV16型E7蛋白中第23位的酪氨酸(Y)突变为甘氨酸(G)、第24位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第25位的酪氨酸(Y)突变为甘氨酸(G)、第58位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第91位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)肽，重排情况如下：由点突变的HPV16 E6蛋白N端第1-83位氨基酸、HPV16 E7蛋白的N端第1-62位氨基酸、HPV16 E6蛋白C端第69-151位氨基酸、HPV16 E7蛋白C端第48-98位氨基酸依次连接，

最为具体的，所述的突变重排的HPV16 E6E7融合多肽的氨基酸序列具有如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列；或SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。其中，所述具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的突变重排的HPV16 E6E7融合多肽命名为rm16E6E7。

本发明所述的另一种重组蛋白可为氨基酸序列被突变并重排的人乳头瘤病毒18型E6/E7融合多肽。

更为具体地，该突变重排HPV18 E6/E7融合多肽具有多个突变位点：HPV18 E6蛋白中第49位的苯丙氨酸(F)突变为精氨酸(R)、第52位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)、第65位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第108位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；HPV18型E7蛋白中第26位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)、第27位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第28位的组氨酸(H)突变为甘氨酸(G)、第65位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第98位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)。该突变重排HPV18 E6/E7融合多肽重排情况如下：由点突变的HPV18 E6蛋白N端第1-86位氨基酸、HPV18 E7蛋白的N端第1-67位氨基酸、HPV18 E6蛋白C端第72-158位氨基酸、HPV18 E7蛋白C端第53-105位氨基酸依次连接。

最为具体的，所述的突变重排的HPV18 E6E7融合多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示氨基酸序列；或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。其中，所述具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的突变重排的HPV18 E6E7融合多肽命名为rm18E6E7。

作为优选，所述取代几个中的几个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个。

本发明对HPV16/18 E6、E7蛋白中与肿瘤抑制蛋白p53和pRb的结合区域进行了氨基酸点突变，并且E6、E7氨基酸序列的重排破坏了其本身的二聚化，则使突变重排后的E6、E7蛋白失去转化正常细胞的能力。需要说明的是，本发明仅在几处关键位点进行了点突变并且重排序列交接处有15个氨基酸重合，所以突变重排的HPV16 E6/E7融合抗原仍具有全部的抗原表位，不影响抗原性。

本发明涉及的重组蛋白，可不仅含有人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7变形体融合多肽，还可包括免疫刺激分子。其中“免疫刺激分子”指刺激参与免疫应答的细胞以增强机体免疫应答的分子。

其中，所述免疫刺激分子为fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、TNF-ɑ、IL-2、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1ɑ(MIP-1ɑ)和CD40配体(CD40L)、钙网蛋白N端(NCRT)、热休克蛋白(Hsp)、泛素(ubiquitin)中的至少一种，但不限于此。

钙网蛋白(calreticulin，CRT)是内质网主要的钙结合蛋白，由3个功能区组成：N端的保守区、C端的钙结合区及中间的富含脯氨酸并有两段重复序列的P区。钙网蛋白N端可以与MHC-I类分子异二聚体(MHC-β2m)相互作用维持二聚体的稳定性，辅助抗原加工递呈，而且能通过产生特异性抗肿瘤免疫反应和抗肿瘤血管生成达到更强的抗肿瘤效果。进一步的，在一些实施方案中，所述钙网蛋白N端具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；或SEQ IDNO.3所示氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3ligand)是一种可以促进多种干细胞、血细胞及前体细胞生成、分化的细胞因子，对细胞的形态和细胞表型都没有影响，是一种良好的扩增剂，对于DC的前体细胞增殖具有重要意义。Flt3配体能够诱导DC细胞增殖与成熟，可增强免疫应答，而且在与肿瘤抗原融合时具有能非常有效的减少肿瘤的效果。

本发明所述的另一种重组蛋白可为氨基酸序列被突变并重排的人乳头瘤病毒E6、E7融合多肽进一步与免疫刺激分子融合形成的融合氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述连接肽具有如SEQ ID No.9所示氨基酸序列(GGGGS)。

在本发明中所述的人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7变形体融合多肽与免疫刺激分子通过一段序列为GGGGS的linker将免疫刺激分子蛋白的C端与人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7变形体融合多肽的N端连接，以减小融合蛋白的空间位阻，使其表达时构象能够正确折叠。

在一些实施例中，所述免疫刺激分子为钙网蛋白N端(NCRT)；所述rm16E6E7与NCRT连接时，重组蛋白命名为NCRT-RM16；所述rm18E6E7重组蛋白与NCRT连接时重组蛋白命名为NCRT-RM18。

在一些实施例中，所述免疫刺激分子为fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)；所述rm16E6E7重组蛋白与Flt3L连接时重组蛋白命名为Flt3l-RM16；所述rm18E6E7重组蛋白与Flt3L连接时重组蛋白命名为Flt3l-RM18。

另外，本发明所提供的重组蛋白不限于只包含一种所述的融合多肽。在一个实施方式中，所述重组蛋白包括16型人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7融合多肽和18型人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7融合多肽的融合蛋白。

另一方面，本发明还涉及编码所述重组蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述编码SEQ ID NO.1所示人乳头瘤病毒16型E6/E7变形体融合多肽具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

优选的，所述编码SEQ ID NO.2所示人乳头瘤病毒18型E6/E7变形体融合多肽具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。

优选的，所述编码SEQ ID NO.3所示免疫刺激分子钙网蛋白N端具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列。

优选的，所述编码SEQ ID NO.4所示免疫刺激分子fms样酪氨酸激酶3配体具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。

另一方面，本发明涉及一种重组表达载体，含有本发明所述的核苷酸序列。

在本发明中，“重组表达载体”指包括外源DNA的遗传结构，所述重组蛋白的核苷酸序列被插入于所述重组表达载体编码多肽的表达框中。本发明所述的“重组表达载体”可为质粒载体、粘粒载体、酵母载体或噬菌体载体，其中优选为质粒载体。

优选的，所述重组蛋白为rm16E6E7、rm18E6E7、Flt3l-RM16、Flt3l-RM18、NCRT-RM16或NCRT-RM18。

另一方面，本发明涉及一种工程菌，含有本发明所述的表达载体。

在本发明中，“工程菌”通过将重组表达载体热激转化进入宿主细胞所获得。本发明中所表达的“宿主细胞”包括原核或真核细胞。

所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

进一步优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。

在一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

此外，本发明的重组表达载体包含的所述核苷酸可用在宿主细胞中具有高表达频率的遗传密码子优化。本发明中所表达的“有高表达频率的遗传密码子优化”指，根据宿主细胞内DNA转录或翻译成蛋白过程中存在的更高偏爱性的遗传密码子，将核苷酸编码氨基酸的遗传密码子替换成具有宿主细胞更高偏爱性的遗传密码子，从而增强核苷酸编码蛋白的表达效率。

本发明还涉及一种药物组合物，包括所述的重组蛋白和佐剂。所述重组蛋白作为活性成分可以由所述宿主细胞表达得到。

其中，本发明所述“佐剂”指与抗原共同免疫后可非特异性的提高机体的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

优选的，所述佐剂为油/水乳化剂ISA51、TLR3激动剂poly I:C、表面活性剂类免疫刺激复合物ISCOMATRIX、CpG-ODN(非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸为基元的寡聚体)中的至少一种，但不限于此。

在一些实施方案中，所述佐剂为ISA51佐剂或CpG-ODN佐剂。

其中，CpG基序(CpG motifs)是指一类以非甲基化的CpG为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)，这种序列可激活多种免疫效应细胞，能够促进DC细胞成熟，增强抗凋亡能力,上调MHC分子和共刺激分子(CD86，CD80和CD40)，促进Th1型免疫反应的趋化因子和细胞因子的分泌，还可以介导DC通过MHC-I途径交叉递呈外源蛋白，对提高细胞免疫应答具有重大意义。而MONTANIDE ISA油包水佐剂不仅对抗原具有缓释作用，还能产生炎症反应并促进抗原递呈细胞(APC)的募集(如巨噬细胞、淋巴细胞)，通过表面活性剂与细胞膜的相互作用抗原被胞吞进APC，促进MHC II类分子表达和交叉递呈能诱导强的MHCI类分子的递呈，因此，可同时诱导抗原特异性的CD8+和CD4+细胞免疫应答和B细胞活化。

在一些实施例中，所述药物组合物包含有效成分为人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽rm16E6E7重组蛋白和CpG佐剂。

在一些实施例中，所述药物组合物包含有效成分为人乳头瘤病毒18型E6、E7变形体融合多肽rm18E6E7和ISA51佐剂。

在一些实施例中，所述药物组合物包含人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽进一步融合Flt3l免疫刺激分子形成的重组蛋白Flt3l-RM16和CpG佐剂。

在一些实施例中，所述药物组合物包含人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽进一步融合NCRT免疫刺激分子形成的重组蛋白NCRT-RM16和CpG佐剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包括可药用载体。

优选的，所述可药用载体包括但不限于乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、羟基苯甲酸甲酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油中的至少一种。

ELISPOT和流式结果表明，本发明所述的融合多肽免疫小鼠均能产生一定的细胞免疫，且融合了Flt3l免疫刺激分子和人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽的重组蛋白能产生最强的细胞免疫应答。依据现有对小鼠肿瘤模型的实验结果，人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽、融合了Flt3l免疫刺激分子和人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽的重组蛋白、融合了NCRT免疫刺激分子和人乳头瘤病毒16型E6、E7变形体融合多肽的重组蛋白，均能完全抑制TC-1肿瘤细胞的生长。表明这些疫苗在人体内也能激发和强化针对人乳头瘤病毒E6、E7蛋白的特异性T细胞免疫应答，从而对HPV感染细胞及宫颈癌病变细胞产生强大的杀伤作用，因此此类疫苗可用于治疗HPV感染所致的宫颈癌。

因此本发明还提供了所述的重组蛋白或/和所述的药物组合物在制备提高针对人乳头瘤病毒的体液免疫和细胞免疫免疫应答的药物中的应用。

同时，本发明还提供了所述的重组蛋白或/和所述的药物组合物在制备治疗和/或预防人乳头瘤病毒引起疾病的药物中的应用。

优选的，所述人乳头瘤病毒引起的疾病为子宫颈癌。

优选的，所述药物为预防性或治疗性疫苗。

本发明所述重组蛋白或所述药物组合物可通过静脉内、肌肉、口服、经皮、粘膜内、鼻内、气管内、皮下等的任何途径给药。

作为优选，所述给药途径为皮下给药或肌肉注射。

下面结合实施例，进一步阐述本发明，如无特征说明实施例中所用原料及试剂均可由市场购得。

本发明所述的重组蛋白可通过大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统进行表达，优选为大肠杆菌表达系统，但不限于此。本发明所涉及的用于编码重组蛋白的核苷酸序列可在用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换之后使用，根据不同的宿主细胞使用不同的偏爱密码子优化进行序列优化，本发明使用大肠杆菌偏爱密码子进行优化，但不限于此。

本发明所述重组蛋白可用于如人、猴、鼠、猪和兔的哺乳动物，但不限于此。

实施例1：DNA结构与质粒构建

人乳头瘤病毒(HPV)16/18型E6/E7蛋白是主要的致癌蛋白，具有转化活性，为了消除E6、E7蛋白的致癌性，在HPV16和HPV18的E6、E7蛋白的重要位点进行了点突变。

HPV16型E6中第47位的苯丙氨酸(F)突变为精氨酸(R)、第50位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)、第63位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第106位的半胱氨酸(C)突变为精氨酸(R)；HPV16 E7中第23位的酪氨酸(Y)突变为甘氨酸(G)、第24位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第25位的酪氨酸(Y)突变为甘氨酸(G)、第58位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第91位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)。

HPV18型E6中第49位的苯丙氨酸(F)突变为精氨酸(R)、第52位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)、第65位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第108位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；HPV18 E7中第26位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)、第27位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第28位的组氨酸(H)突变为甘氨酸(G)、第65位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)、第98位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)。

以大肠杆菌的表达适应性对点突变设计后的HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6、HPV18 E7，钙网蛋白(CRT)N端(N-terminal domain of CRT，NCRT)和Fms-like tyrosinekinase-3ligand(Flt3L)的氨基酸序列进行密码子优化，并由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

为进一步消除E6、E7转化细胞活性及提高其表达量，将E6、E7序列用overlap PCR方法进行重排连接，即以HPV16型E6、HPV16型E7的合成基因为模板，设计引物分别PCR获得编码HPV16型E6N端1-83氨基酸的核苷酸序列、编码HPV16 E7 N端的1-62氨基酸的核苷酸序列、编码HPV16型E6C端的69-151氨基酸的核苷酸序列、编码HPV16 E7 C端的48-98氨基酸的核苷酸序列，通过overlap PCR方法将这四段序列依次连接，获得重排突变的HPV16型E6E7序列，称为rm16E6E7，核酸序列如SEQ ID No.5；以HPV18型E6、HPV18型E7的合成基因为模板，设计引物分别PCR获得编码HPV18型E6N端1-86氨基酸的核苷酸序列、编码HPV18型E7 N端的1-67氨基酸的核苷酸序列、编码HPV18型E6C端的72-158氨基酸的核苷酸序列、编码HPV18型E7 C端的53-105氨基酸的核苷酸序列，通过overlap PCR方法将这四段序列依次连接，获得重排突变的HPV18型E6E7序列，称为rm18E6E7，核酸序列如SEQ ID NO.6。

经PCR方法在NCRT和Flt3l核酸序列后加一段连接肽(SEQ ID NO.9)，再通过overlap PCR方法将加入linker的NCRT和Flt3l片段分别与rm16E6E7连接得到新的序列称为NCRT-RM16和Flt3l-RM16，其中NCRT和Flt3l核酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。rm16E6E7、rm18E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16四种蛋白结构如图1。

同时在rm16E6E7和rm18E6E7序列两端加入Nde I/Hind III酶切位点和保护碱基，在NCRT-RM16和Flt3l-RM16两端加入Nde I/Xho I酶切位点和保护碱基。用Nde I/Hind III限制性内切酶(Takara)酶切pET26b载体质粒和rm16E6E7/rm18E6E7片段，用Nde I/Xho I限制性内切酶(Takara)酶切pET28a通用载体质粒和NCRT-RM16/Flt3l-RM16片段，最后用T4DNA连接酶(Takara)分别连接pET26b和rm16E6E7/rm18E6E7片段构建pET26b-rm16E6E7与pET26b-rm18E6E7表达载体，用T4 DNA连接酶分别连接pET28a和NCRT-RM16/Flt3l-RM16片段构建pET28a-NCRT-RM16与pET28a-Flt3l-RM16表达载体。

实施例2：重组蛋白在大肠杆菌中的表达与制备

pET28a-Flt3l-RM16重组表达载体转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态，涂kana抗性平板，通过菌落PCR鉴定获得可表达重组蛋白的大肠杆菌。LB培养基37℃扩培工程菌(成功表达Flt3l-RM16重组蛋白的大肠杆菌)，待OD600＝0.6～0.8时加入0.4mM IPTG，16℃诱导16h。诱导完成后7500g离心5min收集菌体，PBS(PH7.4)清洗菌体2次。取20g工程菌用100mlPBS(PH7.4)重悬并加入终浓度为1mM的PMSF(Beyotime)和EDTA(国药集团)，高压匀浆机1000bar破菌1次，收集破菌液15000g离心30min分离上清与沉淀。沉淀用30ml洗涤液(50mMTris-HCl+50mM NaCl，PH8.5)洗涤一次，15000g离心10min；沉淀再用30ml洗涤液(50mMTris-HCl+50mM NaCl+2M尿素+1％TritonX-100，PH8.5)洗一次，15000g离心10min，所得沉淀即为包涵体。取20ml包涵体用变性剂(50mM Tris-HCl+50mM NaCl+6M尿素+50mM DTT+0.5％SDS，PH8.5)重悬并上下颠倒直到包涵体几乎被全部溶解，15000g离心10min去除不溶物，收集上清为包涵体溶解液。取5ml包涵体溶解液装入透析袋中，1L 3M尿素+50mM Tris-HCl(PH8.5)+50mM NaCl室温透析2h，1L1M尿素+50mM Tris-HCl(PH8.5)+50mM NaCl室温透析2h，1L 50mM Tris-HCl(PH8.5)+50mM NaCl室温透析2h，1L PBS(PH8.0)室温透析4h后换液再过夜。透析后15000g离心10min去除不溶物。用去内毒素试剂盒(

HighCapacity Endotoxin Removal Spin Column，Thermo)处理蛋白去除内毒素，0.22μm滤膜过滤即得纯化后的Flt3l-RM16重组蛋白；以同样方法制得rm16E6E7、rm18E6E7和NCRT-RM16重组蛋白。

上述步骤制备的rm16E6E7、rm18E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测后在预期位置出现目的条带如图2。

表1相关序列

名称	编号	序列(方向为：5’-3’)
			CpG-ODN	SEQ ID NO.10	TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT

实施例3：ELISPOT检测细胞免疫水平

由于rm16E6E7与rm18E6E7；Flt3l-RM16、NCRT-RM16与Flt3l-RM18、NCRT-RM18结构功能类似，因此，以下实施例3～6以rm16E6E7、Flt3l-RM16、NCRT-RM16为例。

CpG-ODN制备：使用的CpG-ODN序列如表1所示。利用固相亚磷酰胺三酯法化学合成制备CpG-ODN，由3’端开始，1)脱保护基：先用三氯乙酸脱去连接在CpG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’羟基，以供下一步缩合反应使用；2)活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，此中间体与CpG上已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；3)连接：亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CpG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’羟基发生亲和反应，缩合并脱去四唑，此时寡核苷酸链向前延长一个碱基；4)氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CpG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸或碱水解，此时使用硫代试剂将亚磷酰胺氧化为硫磷双键的磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸；5)封闭：缩合反应后为了防止连在CpG上的未参与反应的5’羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基；经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就连到CpG的核苷酸上；重复以上的脱保护基、活化、连接、氧化、封闭过程即可得到一个DNA片段粗品；最后对其进行切割、脱保护基、纯化、定量等合成后处理即可得到符合的CpG-ODN；-20℃冰箱中保存备用。

ELISPOT检测步骤如下：使用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周(上海斯莱克)。使用的抗原通过实施例2的方法制备，将雌性C57BL/6小鼠分为四组(5只/组)，分别腹部皮下注射100μgrm16E6E7+100μg CpG-ODN、100μg NCRT-RM16+100μg CpG-ODN、100μg Flt3l-RM16+100μgCpG-ODN和PBS(Gibco)，共免疫两次，时间间隔两周，二免10天后处死小鼠分离脾脏制备脾细胞。具体如下：无菌操作取脾脏：用无菌镊子及剪刀剪取脾脏，放于70μm尼龙网筛(BD)中，置于含有5ml预冷处理的2％FBS(GIBCO)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾脏，脾脏细胞通过筛目进入平皿中，得到细胞悬液，用巴氏吸管将悬液放入经40μm尼龙网筛过滤(BD公司)的50ml无菌离心管；500g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入5ml 1×破红剂(BD)重悬细胞，室温作用10分钟，以破碎红细胞；加入5ml 2％FBS-PBS终止破红反应；500g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入5ml 2％FBS-PBS洗涤细胞；500g，4℃离心5分钟；弃去上清，加入1ml 2％FBS-PBS重悬细胞备用。

用PBS稀释Mouse IFN-γ/IL-4(1：200稀释，BD)，100μl/孔加至ELISPOT板，4℃包被过夜；弃去包被抗体，用封闭液(含10％FBS RPMI-1640培养液)洗孔1次，加入封闭液200μl/孔，室温孵育2h；采用10％FBS-1640培养基稀释肽至4μg/ml；采用10％FBS-1640培养基稀释ConA至20μg/ml；弃去封闭液，将1×10⁷细胞/ml的脾淋巴细胞悬液与配置好的刺激物按100μl/孔分别加入96孔板中；于37℃5％CO₂培养箱孵育48h；弃去细胞悬液，用去离子水洗板2次，3-5m/次，用PBST洗涤3次，200μl/孔，加入用10％FBS-PBS稀释的Mouse IFN-γ/IL-4ELISPOT detection Antibody(1：250稀释，BD)，100μl/孔，室温孵育2h；弃去检测抗体，用PBST洗板4次，200μl/孔，加入用10％FBS-PBS稀释Streptavidian-HRP(1：100稀释，BD)，100μl/孔，室温孵育1h；弃去酶结合物，用PBST洗4次，再用PBS洗3次，加入AEC底物100μl/孔显色，肉眼观察斑点形成，加去离子水终止反应；在ImmunoSPOT Series 3自动读板机上读取斑点数；结果显示在图3和图4中。

如图3和图4所示，ELISPOT结果表明，免疫rm16E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16重组蛋白的实验组中分泌IFN-r和IL-4的细胞数量都高于免疫PBS的对照组，并且免疫Flt3l-RM16实验组比免疫rm16E6E7和NCRT-RM16实验组具有更高的分泌IFN-r、IL-4细胞数量，说明rm16E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16重组蛋白都可以刺激小鼠产生一定强度的细胞免疫应答，同时Flt3l-RM16比rm16E6E7和NCRT-RM16能产生更强的细胞免疫，免疫效果更好。除去PBS组，在各免疫组间比较，E6、E7两个肽库刺激产生的强弱趋势基本相同，但E7肽库刺激产生各指标的绝对数值比E6刺激的要高很多，说明在小鼠中E7蛋白激发的细胞免疫应答强度要远高于E6蛋白所激发的强度。

实施例4：流式细胞术检测免疫水平

流式细胞术步骤：所用C57BL/6小鼠、抗原和CpG-ODN佐剂均与实施例3相同。使用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周(上海斯莱克)。使用的抗原通过实施例2的方法制备，将雌性C57BL/6小鼠分为四组(5只/组)，分别腹部皮下注射100μg rm16E6E7+100μg CpG-ODN、100μg NCRT-RM16+100μg CpG-ODN、100μg Flt3l-RM16+100μg CpG-ODN和PBS(Gibco)，共免疫两次，时间间隔两周，二免10天后处死小鼠分离脾脏制备脾细胞；5×10⁷cells/mL的脾淋巴细胞悬液100μl/well铺于96孔板中，设置阳性对照和阴性对照。实验组加入10％FBS-1640稀释的10μg/ml HPV16型E6E7 FACS肽库100μl，阳性对照组加入10％FBS-1640稀释的20μg/mlconA 100μl，阴性对照组补加100μl 10％FBS-1640培养液，37℃5％CO₂培养箱孵育3h后各加入3μl GolgiStop(BD)和4μl GolgiPlus(BD)，之后继续孵育3h，300g，4℃离心5min，弃上清，然后进行CD4、CD8和IFN-r细胞因子染色。具体情况如下：100μl staining buffer(1％BSA-PBS)中分别加入0.1μg/test的Anti-mouse-CD4-PE antibody(BD)和Anti-mouse-CD8α-FITC antibody(Biolegend)，混匀后于4℃避光静置30min；加200μl staining buffer洗涤1次；各加入200μl/孔fixation buffer(BioLegend)，室温，避光20min；300g，离心5min，弃上清；各加入200μl/孔Cyto-last buffer(BioLegend)，混匀后于4℃避光保存(可保存2星期)；300g，4℃离心5min，弃上清；加入1×Perm/Wash(BD)液100μl，室温放置15min，300g4℃离心5min，弃上清；100μl的1×Perm/Wash中加入Anti-IFN-r-APC antibody(Biolegen，0.1μg/test)，室温避光静置30min；300g 4℃离心5min，弃上清；加入1×Perm/Wash液200μL，洗涤1次；细胞重悬于150μL的1×Perm/Wash中，流式细胞仪测定，Cellquest软件分析；结果显示在图5中。

流式的检测结果与ELISPOT的结果相同，如图5所示，三个免疫组相对于对照组来说均能产生一定的细胞免疫，且免疫Flt3l-RM16实验组能产生的CD8⁺，IFN-r⁺细胞数比免疫rm16E6E7和NCRT-RM16实验组更高，细胞免疫更强。综上所诉，加了功能性片段的Flt3l-RM16重组蛋白比rm16E6E7和NCRT-RM16重组蛋白能产生更强的细胞免疫应答。

实施例5：ELISA检测免疫水平

本实施例所用C57BL/6小鼠、抗原和CpG-ODN佐剂均与实施例3相同。将雌性C57BL/6小鼠分为四组(5只/组)，分别腹部皮下注射100ug rm16E6E7+100ug CpG-ODN、100ugNCRT-RM16+100ug CpG-ODN、100ug Flt3l-RM16+100ug CpG-ODN和PBS(Gibco)，共免疫两次，间隔两周，在免前、一免二周和二免后十天进行眼眶采血；采出的血37℃放置40min后1000rpm离心10min分离出上层血清，用ELISA方法检测小鼠血清中的抗体水平。

用包被液将rm16E6E7重组蛋白稀释至0.5μg/ml，50μl/孔包被96孔酶标板(Nunc)，4℃过夜；PBST(0.05％Tween 20-PBS)洗涤2次后加入5％milk，200μl/孔，37℃封闭1h；PBST洗涤2次后，加入2％脱脂奶以3倍梯度稀释的待检血清，50μl/孔，37℃反应1h；PBST洗涤3次后分别加入酶标二抗：1:30000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG抗体(SIGMA)、1:20000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG1抗体(Southern Biotech)、1:6000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG2a抗体(SouthernBiotech)，每孔50μl，37℃作用40分钟；PBST洗涤3次后加入50μl/孔TMB显色液(Thermo)显色10min；每孔50μl的2M H₂SO₄终止反应；用酶标仪测定450nm处吸光值OD₄₅₀(以OD₆₃₀校正)，并确定终点滴度。结果显示在图6、图7、图8中。

由体液免疫结果可知，如图6、图7、图8所示，rm16E6E7和Flt3l-RM16免疫组产生的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平都明显高于NCRT-RM16免疫组和PBS对照组，说明rm16E6E7和Flt3l-RM16重组蛋白在小鼠体内均能产生HPV16 E6E7特异性抗体，且二免后的抗体水平相对于一免来说有大幅度提高，具有显著性差异。但NCRT-RM16免疫组产生的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平相对于PBS对照组来说没有显著提高，说明NCRT-RM16重组蛋白不能够有效的刺激机体产生体液免疫。Flt3l-RM16和rm16E6E7两组间产生的抗体水平差不多，在此剂量下无法区分两重组蛋白产生体液免疫水平的差异。综上所述，NCRT-RM16重组蛋白不能够有效的刺激机体产生体液免疫，Flt3l-RM16和rm16E6E7重组蛋白可以刺激机体产生较高的HPV16 E6E7特异性抗体，但免疫100μg的剂量无法区分Flt3l-RM16和rm16E6E7两重组蛋白产生体液免疫水平的差异。

实施例6：肿瘤抑制试验

本实施例所使用的C57BL/6小鼠、抗原和CpG-ODN佐剂与实施例3相同。TC-1肿瘤细胞购买于ATTC。C57BL/6小鼠于腹部皮下接种1×10⁴TC-1细胞建立肿瘤模型，接种一天后在小鼠腹部肿瘤接种位置皮下注射100μg rm16E6E7+100μg CpG-ODN、100μg NCRT-RM16+100μg CpG-ODN、100μg Flt3l-RM16+100μg CpG-ODN和100μl PBS(Gibco)，两周后同样的剂量和方法加强免疫一次。从肿瘤接种后开始观察小鼠肿瘤生长情况，每周测量两次肿瘤大小，测量肿瘤相互垂直的长径和短径，并通过公式(长径×短径2÷2)计算肿瘤体积；肿瘤生长情况展示在图9中。

如图9所示，可以看出抗原对肿瘤的抑制情况，免疫组均没有肿瘤生长，肿瘤抑制率为100％，PBS对照组平均肿瘤体积可达到将近4000mm³。说明rm16E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16在100μg的免疫剂量下都能够完全抑制肿瘤生长，均有较好的抑瘤效果，但在此剂量下无法区分各重组蛋白间肿瘤抑制作用的差异。

实施例7：ELISPOT实验检测HPV18特异性细胞免疫水平

本实施例所使用的抗原rm16E6E7和rm18E6E7由实施例2中的方法制得，所用C57BL/6小鼠与实施例3相同，ISA51佐剂购于(SEPPIC)。将雌性C57BL/6小鼠分为3组，分别右大腿肌肉注射10μg rm18E6E7+ISA51、10μg rm16E6E7+10μg rm18E6E7+ISA51和100μlPBS(Gibco)，共免疫两次，间隔两周，二免十天后处死小鼠分离脾脏制备脾细胞。根据实施例3所述的ELISPOT方法，测定本实施例中各免疫组细胞免疫情况；结果展示在图10中。

由图10可知，rm18E6E7和rm16E6E7+rm18E6E7免疫组相对于PBS对照组来说均能产生一定的细胞免疫应答。总体来说rm16E6E7+rm18E6E7共同免疫产生的细胞免疫水平要高于rm18E6E7单独免疫所产生的细胞免疫水平。其中rm16E6E7+rm18E6E7免疫组比rm18E6E7免疫组产生的HPV18型E6特异性细胞免疫要强很多，具有显著性差异，说明rm16E6E7能显著增强rm18E6E7产生的HPV18 E6特异性细胞免疫应答，提高免疫效果。但在两免疫组中，HPV18型E6肽库刺激产生指标的绝对数值比HPV18型E7刺激的要高很多，这是因为使用了不同的佐剂，ISA51佐剂较CpG-ODN佐剂来说更能刺激机体产生E6特异性细胞免疫应答。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州远康生物医药有限公司

<120> 一种重组蛋白及药物组合物与应用

<130> MP1624487

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro His Leu Cys

1 5 10 15

Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr

20 25 30

Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Arg Arg

35 40 45

Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp

50 55 60

Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys

65 70 75 80

Tyr Ser Val Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu

85 90 95

Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Gly Gly Gly Glu Gln Leu Ser

100 105 110

Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala

115 120 125

Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Gly Cys Lys Cys

130 135 140

Asp Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val

145 150 155 160

Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu

165 170 175

Leu Ile Arg Cys Ile Asn Arg Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys

180 185 190

Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg

195 200 205

Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg

210 215 220

Glu Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Gly Cys

225 230 235 240

Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp

245 250 255

Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly

260 265 270

Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro

275

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp

1 5 10 15

Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys

20 25 30

Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala

35 40 45

Arg Lys Asp Gly Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala

50 55 60

Gly His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His

65 70 75 80

Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Met Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp

85 90 95

Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Gly

100 105 110

Gly Gly Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp

115 120 125

Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg

130 135 140

His Thr Met Leu Cys Met Gly Cys Lys Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu

145 150 155 160

Arg His Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr

165 170 175

Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Gly Gln Lys

180 185 190

Pro Leu Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg

195 200 205

Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys

210 215 220

Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val

225 230 235 240

Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Gly Cys Lys Cys

245 250 255

Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Gly Pro Trp

275 280 285

Cys Ala Ser Gln Gln

290

<210> 3

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly Trp

1 5 10 15

Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys Phe

20 25 30

Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys Gly

35 40 45

Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser Phe

50 55 60

Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr Val

65 70 75 80

Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu Phe

85 90 95

Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn

100 105 110

Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His

115 120 125

Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp Ile

130 135 140

Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val Arg

145 150 155 160

Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu Ser

165 170 175

Gly Ser Leu Glu

180

<210> 4

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala

1 5 10 15

Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val

20 25 30

Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp

35 40 45

Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala

50 55 60

Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His

65 70 75 80

Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe

85 90 95

Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu

100 105 110

Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu

115 120 125

Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser

130 135 140

Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro

145 150 155

<210> 5

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtttcagg atccgcaaga acgtccgcgt aaactgccgc atctgtgtac cgaactgcag 60

accaccattc atgatatcat tctggaatgc gtgtattgca aacagcaact gctgcgtcgt 120

gaagtttatg attttgcacg tcgtgatggt tgcattgttt atcgtgatgg caatccgtat 180

gcagttggtg ataaatgcct gaaattctat agcaaaatca gcgagtatcg ctactattgc 240

tatagcgtta tgcatggtga taccccgacc ctgcatgaat atatgctgga tctgcagccg 300

gaaaccaccg atctgggtgg tggtgaacag ctgagcgata gcagcgaaga agaggacgaa 360

attgacggtc cggcaggtca ggcagaaccg gatcgtgcac attacaacat tgttaccttt 420

ggttgtaaat gcgatttcta tagcaaaatc agcgagtatc gctactattg ctatagcgtt 480

tatggcacca ccctggaaca gcagtataac aaaccgctgt gtgatctgct gattcgttgt 540

attaatcgtc agaaacctct gtgtccggaa gaaaaacagc gtcatctgga taaaaaacaa 600

cgctttcata atattcgtgg tcgttggacc ggtcgttgta tgagctgttg tcgtagcagc 660

cgtacccgtc gtgaaaccca gctggatcgt gcacattaca acattgttac ctttggttgt 720

aaatgcgata gcaccctgcg tctgtgtgtt cagagcaccc atgttgatat tcgtaccctg 780

gaagatctgc tgatgggcac cctgggtatt gttggtccga tttgtagcca gaaaccg 837

<210> 6

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggcacgtt ttgaagatcc gacccgtcgt ccgtataaac tgccggatct gtgtaccgaa 60

ctgaatacca gcctgcagga tattgaaatt acctgcgttt attgcaaaac cgttctggaa 120

ctgaccgaag tttttgaatt tgcacgcaaa gatggctttg tggtttatcg tgatagcatt 180

ccgcatgcag caggtcataa atgcattgat ttctatagcc gtattcgtga actgcgccat 240

tattcagata gcgtttatat gtatggtccg aaagcaaccc tgcaggatat tgttctgcat 300

ctggaaccgc agaatgaaat tccggttgat ctgggtggtg gtgaacagct gagcgatagc 360

gaagaagaaa acgacgaaat tgatggtgtg aatcatcagc atctgcctgc acgtcgtgcc 420

gaaccgcagc gtcataccat gctgtgtatg ggttgtaaat atagccgtat tcgtgaactg 480

cgccattatt cagatagcgt ttatggtgat accctggaaa aactgaccaa taccggtctg 540

tataatctgc tgattcgttg tctgcgtggt cagaaaccgc tgaatccggc agaaaaactg 600

cgtcatctga atgaaaaacg tcgctttcat aacattgccg gtcattatcg tggtcagtgt 660

catagctgtt gtaatcgtgc acgtcaagaa cgtctgcagc gtcgtcgtga aacccaggtt 720

cgtgccgaac cgcagcgtca taccatgctg tgtatgggtt gtaaatgtga agcacgtatt 780

gaactggttg ttgaaagcag cgctgatgat ctgcgtgcat ttcagcagct gtttctgagc 840

accctgagct ttgttggtcc gtggtgtgca agccagcag 879

<210> 7

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaccggcag tttatttcaa agaacagttt ctggatggtg atggttggac cagccgttgg 60

attgaaagca aacataaaag cgatttcggc aaatttgttc tgagcagcgg taaattctat 120

ggcgacgaag aaaaagataa aggcctgcag accagccagg atgcacgttt ttatgcactg 180

agcgccagct ttgaaccgtt tagcaataaa ggtcagaccc tggttgttca gtttaccgtg 240

aaacatgaac agaacattga ttgcggtggt ggttatgtta aactgtttcc gaatagcctg 300

gatcagaccg atatgcatgg tgatagcgaa tataacatta tgttcggtcc ggatatttgt 360

ggtccgggta caaaaaaagt gcacgtgatc tttaactata aaggcaaaaa tgtgctgatc 420

aacaaagata tccgctgcaa agatgatgaa tttacccatc tgtataccct gattgtgcgt 480

ccggataata cctatgaagt taaaattgat aatagccagg ttgaaagcgg tagcctggaa 540

<210> 8

<211> 468

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acccaggatt gtagctttca gcatagcccg attagcagcg attttgcagt taaaattcgt 60

gagctgagcg attatctgct gcaggattat ccggttaccg ttgcaagcaa tctgcaggat 120

gaagaactgt gtggtggtct gtggcgtctg gttctggccc agcgttggat ggaacgtctg 180

aaaaccgttg caggtagcaa aatgcagggt ctgctggaac gtgttaatac cgaaattcat 240

tttgttacca aatgcgcctt tcagcctccg cctagctgtc tgcgttttgt tcagaccaat 300

attagccgtc tgctgcaaga aaccagcgaa cagctggttg cactgaaacc gtggattacc 360

cgtcagaatt ttagccgttg tctggaactg cagtgtcagc cggatagcag caccctgcct 420

ccaccgtggt caccgcgtcc gctggaagca accgcaccga cagcaccg 468

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcgttcgttc gttcgttcgt t 21

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，其为16型人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽；

所述16型人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列排列依次为HPV16型E6蛋白N端第1-83位氨基酸序列、HPV16 型E7蛋白 N端的第1-62位氨基酸序列、HPV16型 E6蛋白 C端的第69-151位氨基酸序列、HPV16 型E7 蛋白C端的第48-98位氨基酸序列，其中HPV16型E6的突变位点为F47R、L50G、C63G、C106R；HPV16 E7 的突变位点为Y23G、C24G、Y25G、C58G、C91G；

所述16型人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，还包括免疫刺激分子。

3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述免疫刺激分子为fms样酪氨酸激酶3配体、TNF-ɑ、IL-2、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1ɑ和CD40配体、钙网蛋白N端、热休克蛋白、泛素中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述免疫刺激分子为钙网蛋白N端或fms样酪氨酸激酶3配体。

5.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，

所述钙网蛋白N端氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述fms样酪氨酸激酶3配体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求2-5任意一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述免疫刺激分子与所述16型人乳头瘤病毒E6和E7变形体的融合多肽以连接肽连接。

7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于，所述连接肽如SEQ ID No.9所示氨基酸序列。

8.编码权利要求1-7任意一项所述重组蛋白的核酸。

9.根据权利要求8所述的核酸，其特征在于，所述SEQ ID NO.1所示重组蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

10.根据权利要求8所述的核酸，其特征在于，

所述SEQ ID NO.3所示钙网蛋白N端核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述SEQ ID NO.4所示fms样酪氨酸激酶3配体核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

11.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求8所述核酸。

12.一种工程菌，其特征在于，含有权利要求11所述的重组表达载体。

13.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1至7任意一项所述的重组蛋白和佐剂。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述佐剂为油/水乳化剂ISA51、TLR3激动剂poly I:C、表面活性剂类免疫刺激复合物ISCOMATRIX、CpG-ODN中的至少一种。

15.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，还包括可药用载体，所述可药用载体包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、纤维素、水、羟基苯甲酸甲酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油中的至少一种。

16.根据权利要求1至7任意一项所述的重组蛋白或/和权利要求13至15任意一项所述的药物组合物在制备提高针对人乳头瘤病毒的体液免疫和细胞免疫免疫应答的药物中的应用。

17.根据权利要求1至7任意一项所述的重组蛋白或/和权利要求13至15任意一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防人乳头瘤病毒引起疾病的药物中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述人乳头瘤病毒引起的疾病为子宫颈癌。