KR20060015595A - 해독된 ｔｎｆ 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람의 TNFα 단백질의 면역원성 유사체를 제공하는 것으로, 상기 유사체는 면역원화된 모노머 TNFα 폴리펩타이드 또는 TNFα 다이머 또는 트라이머를 포함하는 것이고, 또한 Y87S, D143N 또는 A145R 중에서 선택된 독성 감소 또는 독성 회피 돌연변이를 부가적으로 포함하는 것으로서, 상기 아미노산 넘버링은 사람의 TNFα의 N 말단 발린으로부터 개수된 것이다. 본 발명은 또한, 상기 유사체를 코딩하는 핵산 단편 및 이 유사체를 제조하는데 유용한 벡터와 형질전환 세포도 제공한다. 또한 TNFα의 하향 조절이 필요한 대상자에 있어서 TNFα를 하향 조절하는 방법도 개시된다.
TNFα, 유사체, 하향 조절

Description

해독된 ＴＮＦ 및 그의 제조 방법{DETOXIFIED TNF AND METHOD OF PREPARING}
본 발명은 치료적 면역요법 분야, 특히 자가("자기") 단백질 및 기타 약한 면역원성 항원의 하향 조절을 표적으로 하는 능동 면역요법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 따라서 종양 괴사 인자 (TNFα)의 신규하고 개선된 면역원성, 해독 변이체와 이러한 변이체를 제조하는데 필요한 수단을 제공한다. 본 발명은 또한 면역요법과 관련된 방법 및 이러한 방법에 유용한 조성물에 관한 것이기도 하다.
질병을 치료 또는 경감시키는 수단으로서의 능동 면역요법 ("예방접종")은 지난 20년에 걸쳐 점차 많은 주목을 받아왔다. 특히, 보고된 것 중 피임과 관련된 최초의 실험이 행해진 70년대 후반 이래, 병리학적 (또는 기타 원치 않은) 생리적 증상과 어떤 식으로든 연관된 자가 단백질에 대한 내성을 파괴하기 위한 수단으로서 능동 면역요법을 사용하는 것이 알려져왔다.
자가 항원에 대한 백신은 전통적으로 관련 자기 단백질을 "면역원화"시킴으로써, 예컨대, 대형 외래 면역원성 캐리어 단백질에 대한 화학적 커플링 ("컨쥬게이션") (미국특허 4,161,519호 참조) 또는 자가 단백질과 외래 캐리어 단백질 간의 융합 구조물의 제작 (WO 86/07383 참조)에 의해 제조되어 왔다. 이러한 구조물에서 는, 면역원성 분자의 캐리어 부분이 자가내성을 파괴시킬 수 있는 T 헬퍼 임파구 TH 임파구에 대한 에피토프 ("TH 에피토프")의 제공에 책임이 있다.
그 후의 연구 결과 이러한 전략이 비록 실질적으로 자가 단백질에 대한 내성을 파괴시켜주기는 하나, 몇가지 문제점이 있다는 것이 밝혀졌다. 가장 중요한 문제점은 경시적으로 유발된 면역 반응이 면역원의 캐리어 부분에 대해 지향된 항체에 의해 지배되는 반면 자가 단백질에 대한 반응성이 종종 약화된다는 것으로, 캐리어가 이전에 면역원 역할을 했던 경우 두드러지는 효과인데 - 이 현상은 캐리어 억제로 알려져 있다 (예컨대 Kaliyaperumal 외, 1995, Eur. J. Immunol 25, 3375-3380 참조). 그러나, 치료적 예방접종을 이용하는 경우 대개 연간 수차례 재면역화가 필요할 뿐만 아니라 이러한 치료를 수년간 지속해야 하고 이것은 캐리어 부분에 대한 면역 반응이 자가 단백질에 대한 면역 반응을 약화시키는 것을 대가로 점차 우세하게 되는 상황을 야기시키게 된다.
자가내성을 파괴시키기 위한 합텐-캐리어 기술을 이용할 경우 관련된 추가의 문제점은 이러한 구조물에서 자가 단백질에 대한 캐리어의 부정적인 공간 배열적 입체 효과이다: 천연 자가 단백질에서 관찰되는 입체 배열 형태와 유사한 접근가능한 몇가지 B 세포 에피토프는 에피토프의 간단한 쉴딩이나 차단 또는 면역원의 자기 부분에서 유발된 입체 배열의 변화로 인해 종종 감소된다. 마지막으로, 합텐-캐리어 분자를 충분히 자세하게 특징화시키는 것이 어려운 경우가 매우 많다는 것 역시 문제점이다.
WO 95/05849는 전술한 합텐-캐리어 전략을 보다 구체화시키고 있다. 하나의 단일 외래 TH 에피토프만으로 치환된 자기 단백질이 자가 단백질에 대한 내성을 파괴시킬 수 있다는 것이 입증되었다. 외래 TH 요소의 도입에도 불구하고 면역원에서자가 B 세포 에피토프가 최대로 많이 유지되도록 자가 단백질의 3차 구조를 유지시키는데 연구가 집중되었다. 이 전략은 일반적으로, 유발된 항체가 광범할 뿐만 아니라 친화도가 높고, 면역 반응이 조기 개시되며 전통적인 캐리어 구조물로 면역화시킬 때 관찰되는 것보다 높은 역가를 나타낸다는 점에서 대체적으로 극히 성공적인 것으로 입증되었다.
WO 00/20027호는 전술한 이론을 더욱 확장시키고 있다. 자가 단백질의 코딩 서열에 단일 TH 에피토프를 도입하면 자기 단백질만을 발현시키는 세포와 특이적으로 발현하는 세포독성 T 임파구 (CTLs: cytotoxic T-lymphocytes)를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. WO 00/20027호의 기술 역시 항체와 CTLs 두가지 모두를 유발하는 복합 요법을 제공하는데 - 이 구체예들에서, 면역원은 B 세포 에피토프의 실질적 분획을 유지할 것이 여전히 요청된다.
종양 괴사 인자 (TNF, TNFα, 카켁틴, TNFSF2)는 염증 및 면역 기능의 강력한 측분비 (paracrine) 및 내분비 (endocrine) 매개자이다. TNFα는 특히 감마 인터페론과 병용시 많은 세포에 대해 세포독성적이다. TNFα는 1975년 최초로 동정되었는데 종양 괴사 및 퇴행을 개시시키는 것으로 입증되었다. 이것의 항암효과는 나중에 상세히 연구되었는데, 비록 TNFα를 이용하여 암을 치료하려는 시도가 여전히 행해지고는 있지만, 암치료 요법으로서는 그다지 성공을 거두지 못하였다. TNFα는 나중에 카켁시아의 원인이라는 것이 밝혀졌고 TNFα는 수용체 매개성 과정을 통해 기능을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 두가지 상이한 TNFα 수용체 (TNFR55와 TNFR75)가 TNFα의 세포독성 및 염증 효과를 매개하는 것으로 알려져있다. TNFα는 류마티스성 관절염 (RA)와 같은 만성 염증성 질환시 염증 반응을 유발 및 지속시키며 알레르기와 건선에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 의심되고 있다. 가용성 수용체, 수용체 특이적 억제제, 모노클로날 항TNFα 항체 또는 TNFα 생산의 하향 조절에 에 의한 TNFα 시그널의 차단은 TNFα 상향 조절 및 시그널링의 생물학적 효과를 악화시키는 매력적인 치료형태이다.
가용성 TNFα 수용체 및 모노클로날 항TNFα 항체를 이용하여 얻은 치료 결과로부터 항TNFα 요법은 RA 및 크론씨병과 같은 여러가지 질병에 성공적이라는 것이 명백하다. 항TNFα 치료는 안전하면서 효과적인 것으로 여겨지고 있다.
오늘날까지 두가지 TNFα 길항제, 레미케이드 (Remicade: Infliximab, Centocor/Johnson & Johnson)와 엔브렐 (Enbrel: Etanercept, Immunex)가 임상적으로 사용하는데 승인되었다.
레미케이드는 가용성의 세포 관련 TNFα에 지향된 키메라 마우스-인간 모노클로날 IgG1 항체이다. 레미케이드는 TNF가 그의 내인성 세포 표면 TNFα 수용체에 결합하는 것을 차단한다. 미국 식품의약청 (FDA)은 통상적인 치료법으로는 난치성인 보통 내지 심각한 또는 누공 형성 크론씨병을 치료하는데 레미케이드를 이용하는 것을 1998년 10월 승인하였다. 이러한 용도는 메토트렉세이트 단독으로는 난치 인 류마티스성 관절염을 치료하는데 보조적으로 이용하는 것과 2002년 7월 크론씨병의 유지 요법으로까지 확장되었다.
엔브렐은 사람의 IgG1의 Fc 부분에 융합된 사람의 TNFα의 세포외 부분으로 구성된 재조합 단백질이다. 엔브렐은 디코이 TNFα 수용체로서 작용함으로써 TNFα 활성을 억제한다. FDA는 1998년 11월 엔브렐을 류마티스성 관절염에 사용하는 것을 승인하였다. 350,000명이 넘는 환자들이 이들 TNFα 길항제로 치료되었다. 이들 약제의 임상적 효능 및 안정성 정보에 대한 검토가 끊임없이 행해지고 있고 비록 감염 및 기타 면역관련 사고가 TNFα 길항체와 관련한 중대한 문제로서 남아있지만, FDA 및 Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP)시판후 경험의 최근 평가 결과, 항TNFα 요법은 심각한 감염에 대한 변화를 비롯, 라벨링 변경이 요구되기는 하였지만, 유리할 정도의 위험성-유익성 밸런스가 얻어진 것으로 나타났다.
수립된 항TNFα 요법과 비교할 때, 본 발명에서 제안되는 TNFα 면역요법은, 모노클로날 항체의 대량 주입에 비해, 생체내에서 높은 항TNFα 역가를 유지시키는데, 주사를 덜 자주 하여도 되고 마이크로그램량으로 예방접종을 한다는 장점이 있다. 이러한 긍정적인 결과는 부작용 위험이 낮고 치료에 드는 경비를 낮춘다는 장점으로 이어진다. 또한 천연 폴리클로날 항체 반응은 다른 항TNFα 요법에 비해 보다 효율적으로 TNFα를 하향 조절하는 작용을 할 것이다.
TNFα는 233 아미노산 전구체 단백질로서 번역되어 트라이머형 II형 막투과 단백질로서 분비되며 이것은, 특이적인 메탈로프로테아제에 의해 트라이머 가용성 단백질로 절단되고 여기서 각각의 동일한 모노머 서브유닛은 157개의 아미노산으로 구성된다 (이것의 아미노산은 SEQ ID NO: 10, 잔기 2-158에 제시되어 있다). 사람의 TNFα는 글리코실화되지 않은 반면 쥐의 TNFα는 단일 N-글리코실화 좌위를 갖는다. TNFα 모노머는 분자량이 17 kDa인 반면 트라이머는 이론적 분자량이 52 kDa이고, 링크된 트라이머는 SDS-PAGE에서 43 kDa로서 움직인다. TNFα는 세포내 디설파이드 결합을 형성함으로써 이 구조를 안정화시키는 두개의 시스테인을 함유한다. TNFα의 두가지 N- 및 C-말단 모두가 활성에 중요하다. 특히 C 말단은 세개, 두개 또는 심지어는 하나의 아미노산의 결실이 용해도와 생물활성을 극적으로 저하시키기 때문에 민감하다. 중요한 아미노산은 Leu157이고, 이것은 트라이머 중 두개의 모노머간의 안정화 염다리를 형성한다. 다른 한편 최초의 8개의 아미노산의 결실은 1.5-5의 인수로 활성을 증가시키는 반면 최초 9개의 아미노산이 결실되어도 전장 활성이 복구된다. TNFα는 잘 연구된 단백질로서, 수용체 결합 및 트라이머 형성을 이끌어내는 많은 분자내 및 분자간 상호반응이 동정된 바 있다.
천연의 사람의 TNFα (SEQ ID NO: 10, 잔기 2-158)는 다이머와 트라이머의 두가지 모두로서 존재하는데, 이 분자는 두가지 모두의 형태로 본 발명의 후보 표적으로서 대단히 적합하다.
WO 95/05849호 및 WO98/46642호는 두가지 문헌 모두 I형 당뇨병, 류마티스성 관절염 및 염증성 장질환과 같은 몇가지 질환의 병리학과 연관된 시토카인인 TNFα (종양 괴사 인자α)를 하향 조절하는데 적합한 백신 기술을 개시한다. 두 문헌 모두 이 분자가 면역계에 직면할 때 모노머 TNFα의 3차원 구조의 보전을 개시하고 있다. 또한, WO 03/042244 (미공개)는 몇가지 일반적인, 그리고 특이적인 TNFα 변 이체를 개시하고 있다.
비록 전술한 기술들이 매우 유망한 결과를 제공하고는 있지만, 질병을 치료하는 백신 접근법의 실행가능성을 평가할 때 고려해야하는 몇가지 인자들이 있다. 이들 인자들 중 하나는 면역원 단백질의 발현 수준이다.
예컨대, 핵산 백신이 기능적이기 위해서는, "면역원화된" 자가 단백질을 코딩하는 구조물로 생체내 트랜스펙션된 세포가, 적절한 면역 반응을 유발하도록, 면역원을 충분량 발현할 수 있어야 한다. 또한, 폴리펩타이드에 기초한 백신들은 면역원성 단백질이 공업적 발효 공정으로 만족할만한 양으로 생산될 수 있어야 한다. 그러나, 공지 단백질의 아미노산 서열이 약간만 변해도 회수될 수 있는 단백질의 양에 극단적인 영향이 미칠 수 있음이 종종 관찰된다.
또한, 유전적으로 변형된 단백질 서열의 안정성 역시 최적 상태에 미치지 못할 수 있다 (유통 기간 측면과 생체내 안정성 측면의 두가지 모두에 있어서).
또한, TNFα의 경우에서와 마찬가지로, 하향조절이 요망되는 자기 단백질이 이종폴리머 또는 동종폴리머일 경우, 이 단백질의 모노머 단위의 변이체가 폴리머 단백질에 천연적인 입체 배열에 대해 충분히 특이적인 항체를 유발할 수 있어야만 할 필요는 없다.
마지막으로, TNFα는 독성 물질인데, 이러한 변이체는 생물학적으로 활성적인 트라이머 (또는 트라이머 구조를 모방하는 생물학적 활성 모노머로서 최적 폴딩)를 형성할 수 있기 때문에, 불행히도 최적상태로 폴딩된 TNFα의 면역원성 변이체들은 TNFα의 천연 독성을 그대로 지니는 것으로 관찰되었다.
발명의 목적
본 발명의 한가지 목적은 사람의 TNFα의 개선된 면역원성 해독 유사체를 제공하고 나아가 이 단백질에 대한 체액성 면역을 유발하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 가용성 TNFα 변이체 및 다른 단백질의 변이체를 배양하기 위한 개선된 방법을 제공하는데 있다. 마지막으로, 본 발명의 또 다른 목적은 개선된 면역원을 조제 및 이용할때 유용한 기타 수단 및 측정법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
재조합 단백질을 세균 숙주 세포에서 대량으로 생산할 경우, 발현 산물이 세균 내부의 봉입체 (inclusion bodies)로서 이용가능하게 되는 것이 소망되는 경우가 종종 있다. 여기에는 몇가지 이유가 있다: 예컨대 발현 수율은 보통 단백질이 불용성 봉입체로서 발현될 경우 상당히 더 높고, 단백질의 정제 역시 더 용이한데, 이는 소망되는 발현 산물이 세균 발효에 의한 가용성 단백질로부터 쉽고도 간편하게 분리되기 때문이다.
그러나, 재조합 단백질을 불용성 봉입체로서 발현시킬 경우, 생물학적으로 활성적인 형태로 수득하기 위해 종종 이 발현 산물을 여러가지 단백질 리폴딩(refulding) 프로세스로 처리해야할 필요가 있지만, 이러한 공정이 정확한 생물학적 활성 형태로 폴딩되지 않는 총재조합 단백질의 어떤 손실을 야기한다 해도 이것은 대체로 허용된다.
그러나, TNFα와 같은 비면역원성 자기 단백질의 재조합 면역원성 변이체를 생산할 경우에는 TH 에피토프를 도입할 필요가 있고 따라서 단백질 산물의 일차 구조가 천연의 자기 단백질에 비해 변형되는 것이다. 본 발명자들은 아주 사소한 변화라 할지라도 리폴딩을 수반하는 봉입체 발현의 전통적인 접근법을 무용지물로 만든다는 것을 경험하였다: 천연 자기 단백질에 비해 B 세포 에피토프를 만족할만한 비율로 유지하는 리폴딩 후 단백질의 수율은 많은 경우 낮으며, 이러한 문제는 문제의 단백질이 복잡할수록 더 심화된다.
세균으로부터 가용성 단백질로서 생산되는 단백질 구조물의 발현을 설계 및 실시하는 것이 자기 단백질의 면역원성 변이체를 제조하는 보다 우수한 방법이라는 것이 밝혀졌다 - 비록 다른 가용성 단백질을 제거해야만 하기 때문에, 후속 정제 공정이 보다 복잡해지기는 하지만, 최종적으로 정제되어 올바르게 폴딩된 산물이 전기에서 개략한 전통적 접근법에 비해 훨씬 더 높은 수율로 생산된다. 또한, 이러한 발현법으로부터 얻어진 정제된 단백질이, 이들이 유도된 천연 자기 단백질의 B 세포 에피토프를 전에 없이 보존하는 능력을 나타낸다는 것은 매우 놀라운 사실이다.
요약하면, 본 발명에 따른, 변이체 단백질의 가용성 발현은 예방접종 목적에 적합한 자기 단백질의 면역원성 변이체를 초기 선별할 경우 탁월한 선별 기준이다.
이러한 면역원화된 자기 단백질 (및 변화가 일차 서열에 도입되어 있는 다른 단백질들)의 가용성 단백질 발현 목적을 달성하기 위하여, 몇가지 변수들을 변형시킬 수 있다 - 조립이 어려운 멀티머 단백질을 모노머 수준에서 안정화시킴으로써 뿐만 아니라 TNFα 멀티머의 모노머 모방체를 제조함으로써 제조할 수 있고, 또한 간단한 모노머 단백질을 본 명세서에 개시된 설명에 따라 안정화시킬 수 있다.
또 다른 중요한 인자는 발효 조건이다 - 본 발명자들은 실험을 통하여, 예컨대, 고수준 발현을 달성하기 위하여, 통상 사용되는 온도보다 낮은 온도에서 세균을 발효시키면 변이체 단백질의 가용성 형태의 생산이 훨씬 용이하다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 "모노머화" 또는 안정화된 형태의 TNFα 조제물은 안정성이 높고, 면역원성이 탁월하며 소망되는 생산 특성을 갖는 면역원성 분자를 제공해준다는 사실을 이미 발견하였다. 본 발명은 면역원성을 유지하는 한편 이들을 보다 순응적으로 만들도록 몇가지 특이적인 해독 돌연변이를 변이체 내에 도입하는, 이러한 개념의 개선에 중점을 둔 것이다.
해독 돌연변이 외에, 본 발명의 TNFα 변이체는, TNFα 모노머의 정확한 폴딩을 가능케할 정도로 충분히 비파괴이면서, 동시에 적어도 하나의 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 도입하는, TNFα 모노머 구조에 몇가지 변이를 포함하는데 - 이러한 변이는 이미 WO 03/042244에 상술되어 있다. 예컨대, 단백질의 발현 특성 또는, 기능성 TNFα 다이머 또는 트라이머를 형성하는 모노머의 능력에 부정적인 영향을 미침이 없이, 외래 TH 에피토프를 천연 TNFα의 한군데 특정 루프 구조에 삽입시킬 수 있음이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 한가지 관점은 사람 TNFα의 해독된, 면역원성 유사체에 관한 것으로, 여기서 이 유사체는 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 포함하며 다음의 특징을 부가적으로 나타내는 것이다:
- 유연한 (flexible) 루프 3 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- TNFα 모노머 3D 구조를 안정화시키는 적어도 하나의 디설파이드 결합이 도입된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 아미노 말단의 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 중 어느 하나가 결실된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 인트론 좌위의 루프 1 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 사람의 TNFα의 N-말단 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 인공 스토크(stalk) 대역의 일부로서 도입된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 트라이머 상호반응 계면의 소수성을 증가시킴으로써 모노머 구조를 안정화시키도록 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 도입된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- TNFα 아미노산 서열 내로, 글리신 잔기가 측면에 배치된 (flanked) 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNF α 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- D-E 루프 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 사람의 TNFα의 두개의 동일한 서브서열 사이에 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 사람의 TNFα 내에 적어도 하나의 염다리가 강화되거나 또는 디설파이드 결합에 의해 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체, 및/또는
- 쥐의 TNFα 결정 구조를 모방하는 변이를 도입함으로써 가용성 및/또는 단백질분해에 대한 안정성이 개선된, 사람의 TNFα 모노머 또는 본 발명의 hTNFα의 모노머화 유사체,
이 때, 독성은 Y87S, D143N, 및 A145R (여기서 아미노산 넘버링은 사람의 TNFα의 N 말단 V로부터 시작되는 것임) 중에서 선택된 적어도 하나의 점돌연변이의 도입에 의해 경감되거나 회피됨.
일반적으로, 본 발명의 가장 적합한 모든 면역원성 유사체는 그의 재조합 숙주 세포로부터 가용성 형태로 생산 및 분리된 당시의 단계에서 이미 가용성인 단백질이라는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 또한 이러한 면역원성 유사체를 코딩하는 핵산 단편 (예컨대 DNA 단편) 및 이러한 DNA 단편을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 이 유사체를 제조하는데 유용한 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 자가 또는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 멀티머 단백질을 하향 조절시키는 치료 방법, 및 특정 멀티머 단백질과 관련된 특정 질병을 치료하는 방법도 제공한다.
정의
다음에, 본 발명의 범위와 개념을 보다 명확히 특정하기 위하여, 본 발명 명세서 및 청구범위에서 사용된 몇가지 용어들을 정의 및 설명하였다.
"T 임파구" 및 "T 세포"라 함은 체액성 면역 반응에서의 헬퍼 활성 뿐만 아니라 다양한 세포 매개성 면역 반응에 책임이 있는 흉선 기원의 임파구를 가리키는 것으로 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용된다. 마찬가지로, "B 임파구"와 "B 세포" 역시 항체 생산 임파구로서 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 "폴리머 단백질"이라 함은 펩타이드 결합을 경유하여 엔드-투-엔드 연결되지 않은 적어도 두개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 단백질인 것으로 정의된다 ("멀티머 단백질"도 같은 의미로 상호 교환적으로 사용된다). 따라서, 폴리머 단백질은 디설파이드 결합 및/또는 비공유 결합에 의해 폴리머 형태로 한데 유지된 몇가지 폴리펩타이드로 구성된 폴리머일 수 있다. 또한 이 용어는 가공 후 적어도 2개의 유리 C 말단 및 적어도 2개의 유리 N 말단을 포함하는, 가공된 프리 단백질 및 프로 단백질도 포함한다. 마지막으로, 이 용어는 불안정할 수 있으나 생물학적으로 활성적인, 독특한 3차원 구조를 갖는 적어도 2종의 폴리펩타이드 사이에 일시적으로 존재하는 복합체(complex)도 포함한다.
본 발명에서 "면역원성 유사체" (또는 "면역화된" 유사체 또는 변이체)라 함은 완전한 폴리머 단백질에서 발견되는 서열 정보의 실질적인 부분들을 포함하는 단일 폴리펩타이드를 지칭할 때 사용된다. 즉, 본 발명의 유사체 단백질은 하나의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 반면 폴리머 단백질은 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 유사체는 폴리머 모노머 서브유닛의 변이체일 수 있지만 그 경우, 면역원성 유사체는 천연 폴리머와 유사한 폴리머 단백질 복합체를 형성할 수 있다.
"모노머화" 유사체 또는 폴리머 단백질의 변이체라는 용어는 본 발명의 문맥상, 천연의 폴리머 단백질에서 발견되는 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬을, 펩타이드 결합을 통해 공유적으로 결합된 형태로 포함하는 단일 폴리펩타이드로서, 여기서 상기 2개의 폴리펩타이드 사슬은 펩타이드 결합을 통하여 링크된 것이 아니다.
멀티머 단백질의 모노머 유닛의 "실질적 단편 (a substantial fragment)"이라 함은 멀티머 단백질에서 발견가능한 것과 실질적으로 동일한 3D 입체 배열로 폴딩하는 도메인을 형성하도록, 모노머 폴리펩타이드를 적어도 충분히 구성하는 모노머 폴리펩타이드의 일부를 의미하는 것이다.
본 발명에서 "TNFα 폴리펩타이드"라 함은 사람 및 다른 포유동물로부터 유래된 TNFα 단백질의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 가리키는 것이다. 원핵생물계에서 만들어지는 TNFα의 글리코실화되지 않은 형태도 이 용어의 범주 내에 포함되며 예컨대, 효모나 기타 포유동물이 아닌 진핵세포 발현계를 이용함으로 인해 여러가지 글리코실화 패턴을 갖는 형태도 이 범주에 포함된다. 그러나, "TNFα 폴리펩타이드"라는 용어를 사용할 경우에는, 문제의 폴리펩타이드가 치료하고자 하는 동물에 제시될 경우 보통은 비면역원성이라는 것을 명심하여야 한다. 즉, TNFα 폴리펩타이드는 자기 단백질이거나 또는 이러한 자기 단백질의 이종 유사체 (xeno-analogue)로서, 보통은 문제의 동물의 TNFα에 대해 면역 반응을 일으키지 않는다.
"TNFα 유사체"라 함은 그의 일차 구조가 변화된 것 및/또는 다른 분자종으로부터의 요소와 연관된 TNFα 폴리펩타이드이다. 이러한 변화는 예컨대 TNFα 폴리펩타이드를 적절한 융합 파트너에 융합시키는 형태 (즉, C 및/또는 N 말단에 아미노산 잔기를 부가하는 것에만 관련된 일차 구조상의 변화)일 수 있고/또는 TNFα 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 삽입 및/또는 결실 및/또는 치환 형태일 수도 있다. 이 용어는 또한 유도화된 TNFα 분자도 포함한다. 후술하는 TNFα의 변형 (modification) 참고.
TNFα 유사체는 완전한 TNFα 멀티머 단백질의 실질적인 부분을 함유하는 모노머 변이체도 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에서 "TNFα"라는 약어를 사용할 경우, 이는 각각 성숙한, 야생형의 TNFα (본 발명에서 "TNFαm" 및 "TNFαwt"라고도 표기함) TNFα의 아미노산 구조를 지칭하는 것으로 의도된다. 성숙한 인간의 TNFα는 hTNFα, hTNFαm 또는 TNFαwt로, 쥐의 성숙한 TNFα는 mTNFα, mTNFαm, 또는 mTNFαwt로 표시된다. DNA 구조물이 리더 서열 또는 기타 물질을 코딩하는 정보를 포함할 경우, 이는 보통 문맥상 명료할 것이다.
본 발명의 문맥상 "폴리펩타이드"라는 용어는 2 내지 10개의 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100개 아미노산 잔기의 올리고펩타이드와, 아미노산 잔기가 100개보다 많은 포리펩타이드를 모두 포괄한다. 또한, 이 용어는 단백질, 즉, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 갖는 기능적 바이오분자도 포함하도록 의도된다; 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함할 경우, 이들은 복합체를 형성하거나, 공유적으로 링크되거나 또는 비공유적으로 링크될 수 있다. 단백질 중의 폴리펩타이드(들)은 글리코실화 및/또는 지질화될 수 있고/ 또는 배합군(prosthetic groups)을 함유할 수도 있다.
"서브서열"이란 자연발생적인 TNFα 아미노산 서열 또는 핵산 서열로부터 직접 유래하는, 각각 적어도 3개의 아미노산 또는 적어도 3개의 뉴클레오타이드의 연속 스트렛치를 의미한다.
본 발명에서 "해독 돌연변이 (detoxifying mutation)"이란 관련 동물 모델 (또는 TNFα 아미노산 서열이 유래된 자가 숙주에서)의 TNFα 아미노산 서열에서 유의적으로 덜 독성적인 분자를 결과시키는 돌연변이 (예컨대, 점돌연변이)로서 정의된다. 그러나, B 세포 에피토프는 보존될 것이 요망되므로, 해독 돌연변이는 TNFα 분자의 정확한 폴딩을 유의적으로 간섭하는 것은 아니다.
"동물"이란 본 발명에서 일반적으로, 예컨대 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 커니스 도메스티쿠스 (Canis domesticus)등과 같은 동물 종 (바람직하게는 포유류)을 가리키는 것이지만, 반드시 단일의 1종의 동물만을 가리키는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 방법에 따라 면역화된 각각의 개체 모두가, 동일한 면역원(들)에 의해 그 동물을 면역화시킬 수 있도록, 실제로 동일한 항원을 생산하는 것이 중요하기 때문에, 상기 용어는 그러한 동물 종 집단을 가리키는 것이기도 하다. 예컨대, 만일, 항원의 유전적 변이체들이 상이한 인간 서브집단 내에 존재할 경우, 각 집단마다 그 항원에 대한 자가내성을 파괴할 수 있도록 이들 상이한 집단마다 상이한 면역원들을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 당업자들에게는 본 명세서에서 말하는 동물이 면역계를 갖는 살아있는 동물이라는 것이 자명할 것이다. 동물은 포유동물과 같은 척추동물인 것이 바람직하다.
본 발명에서 "하향 조절"이라 함은 살아있는 생명체 내에서 TNFα의 생물학적 활성의 저하 (예컨대, TNFα 단백질과 이 분자의 생물학적으로 중요한 결합 파트너간의 상호반응의 교란에 의해)를 의미한다. 하향 조절은 몇가지 메카니즘에 의해 얻어질 수 있다: 이들 중, 항원 중의 활성 부위를 항체 결합에 의해 단순히 교란시키는 것이 가장 간단하다. 그러나, 항체 결합이 청소 세포 (scavenger cells: 대식세포 및 기타 식세포와 같은)에 의한 항원의 제거를 초래하는 것도 본 발명의 범위에 포괄된다.
"면역계에 대한 ... 제시를 수행하는"이라는 표현은 그 동물의 면역계가 잘 조절된 방식으로 면역원에 의해 챌린지된다는 것을 의미한다. 다음에서 명료히 설명되는 바와 같이, 면역계에 대한 이러한 챌린지는 여러가지 방식으로 수행될 수 있으며 가장 중요한 것은 "파막신(pharmaccines") (즉, 진행중인 질병을 치료 또는 경감시키기 위해 투여되는 백신)을 함유하는 폴리펩타이드를 이용한 예방접종 또는 핵산 "파막신" 예방접종이고, 생백신 및 바이러스 백신도 본 발명의 범위에 속한다. 달성해야 할 중요한 결과는, 그 동물 중의 면역 경쟁 세포들을 면역학적으로 유효한 방식으로 항원과 대면하도록 하는 것으로서, 이러한 결과를 달성하기 위한 정확한 수단(모드)는 본 발명의 발명 개념상 덜 중요하다.
"면역학적 유효량"이라 함은 면역학 기술분야에서 일반적으로 통용되는 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특성을 공유하는 분자에 유의적으로 연관된 면역 반응을 유발할 수 있는 면역원의 양을 가리킨다.
본 명세서에서 TNFα가 "변형되었다(modified)"라는 표현은 자기 단백질의 골격을 구성하는 폴리펩타이드를 화학적으로 변형시켰다는 의미이다. 이러한 변형은 예컨대, 스캐폴드의 폴리펩타이드 서열 내에 특정 아미노산 잔기를 유도화시키는 것 (예컨대 알킬화, 아실화, 에스테르화 등)일 수 있으나, 이하의 설명에서 명백히 알 수 있듯이, 바람직한 변형은 그 아미노산 서열의 일차 구조의 변경 (또는 일차 구조에 대한 부가)을 포함하는 것이다.
"TNFα에 대한 자가내성"을 얘기할 때, TNFα는 예방접종될 집단 중의 자기 항원이므로, 그 집단의 정상적인 개체는 그에 대한 면역 반응을 일으키지 않는 것으로 이해된다; 그럼에도, 어떤 동물 집단 중의 개체가 때때로, 예컨대 자가면역 질환의 일부로서 천연 TNFα에 대한 항체를 생산할 수 있다는 것을 배제할 수는 없다. 어떻든지 간에, 어떤 동물종은 정상적으로는 그 자신의 TNFα에 대해서만 자가내성 (자가관용적)일 것이지만, 다른 동물종으로부터 유래되거나 또는 표현형을 달리하는 집단으로부터 유래된 항원 유사체 역시 상기 동물에 의해 관용될 가능성을 배제 할 수는 없다.
"외래 T 세포 에피토프" (또는: "외래 T 임파구 에피토프")는 어떤 동물 종의 T 세포를 자극하고, MHC 분자에 결합할 수 있는 펩타이드이다. 본 발명에서 바람직한 외래 T 세포 에피토프는 "무차별(promiscuous)" 에피토프, 즉, 어떤 동물종 또는 동물 집단 중의 특정 부류의 MHC 분자의 실질적인 분획에 결합하는 에피토프이다. 이러한 무차별 T 세포 에피토프는 단지 매우 제한적인 수만 알려져 있으며, 이하에서 이들에 대해 자세히 설명한다. 본 발명에서 사용되는 면역원이 동물 집단의 가능한 한 커다란 분획에서 효과적이기 위해서는, 1) 동일한 키메라 결합 단백질 내로 여러개의 외래 T 세포 에피토프를 삽입하거나 2)서로 다른 무차별 에피토프가 삽입되어 있는 여러개의 키메라 결합 단백질을 제조할 필요가 있을 수 있다. 또한 외래 T 세포 에피토프의 개념은 은닉성(cryptic) T 세포 에피토프, 즉, 자가 단백질로부터 유래하며 문제의 자가 단백질의 일부로서가 아니라, 분리 형태로 존재할 경우 면역원성 거동만을 발휘하는 에피토프의 사용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"외래 T 헬퍼 임파구 에피토프" (외래 TH 에피토프)는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 외래 T 세포 에피토프이며, MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에 제시될 수 있다.
"멀티머 단백질에 이종적인 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열"이란 따라서 TNFα에 존재하지 않는 MHC 클래스 II 결합 펩타이드이다. 이러한 펩타이드는, 멀티머 단백질을 수확하는 동물종에 대해서도 진정으로 외래인 경우, 외래 TH 에피토프가 될 것이다.
본 발명에서 (바이오) 분자의 "기능적 부분"이라 함은 그 분자에 의해 발휘되는 적어도 한가지의 생화학적 또는 생리적 효과에 책임이 있는 분자의 부분을 의미한다. 당해 기술분야에서는 많은 효소와 기타 이펙터 분자들이 문제의 분자가 발휘하는 효과에 책임이 있는 활성 부위를 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 그 분자의 다른 부분은 안정화 또는 용해도 증진 목적을 위한 역할을 하는 것일 수 있으며 따라서 이러한 목적이 본 발명의 특정 구체예의 맥락에 해당하는 것이 아닐 경우에는 떼어버릴 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 가능한 한 많은 폴리머 분자를 사용하는 것이 바람직한데, 이는 본 발명에 설명된 모노머를 사용할 경우 증가된 안정성이 실질적으로 입증되었기 때문이다.
"애쥬번트"라는 용어는 백신 기술 분야에서 널리 사용되는 의미, 즉, 1)그 자체로는 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역 반응을 이끌어내지 못하지만, 2)그럼에도 불구하고 그 면역원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있는 물질 또는 물질들의 조성물을 의미한다. 또는, 다른 말로 하면, 애쥬번트 단독에 의한 예방접종은 그 면역원에 대한 면역 반응을 제공하지 못하고, 면역원에 의한 예방접종은 면역원에 대한 면역 반응을 일으킬수도, 일으키지 못할 수도 있지만, 면역원과 애쥬번트를 병용한 면역화는 면역원 단독에 의해 유발되는 것보다 더 강하게 면역원에 대한 면역 반응을 유발한다.
어떤 분자의 "표적화"는 본 발명의 문맥상 어떤 분자가 동물 내로 도입될 경우 특정 조직(들)에 우선적으로 나타나거나 특정 세포 또는 세포 유형과 우선적으로 결합되는 상황을 가리킨다. 이 효과는, 표적화를 용이화시키는 그룹의 분자 내로 도입하거나 표적화를 용이화시키는 조성물에 분자를 조성하는 등의 몇가지 방법에 의해 수행가능하다. 이 문제는 이하에 더욱 상세히 설명한다.
"면역계의 자극"이라 함은 어떤 물질 또는 물질의 조성물이 일반적이고, 비특이적인 면역자극적 효과를 나타냄을 의미한다. 몇가지 애쥬번트 및 추정적 애쥬번트 (특정 시토카인 등)는 면역계를 자극하는 능력을 공유한다. 면역자극제의 사용 결과 면역계의 "경계(alertness)"가 증가되면 면역원에 의한 동시적 또는 후속적 면역화가 면역원을 별도로 사용한 경우에 비해 훨씬 더 효과적인 면역 반응을 유발한다는 것을 의미한다.
본 발명의 해독된 면역원성 TNFα 유사체의 특징
본 발명에 따른 면역원성 유사체가, 천연의 생물학적 활성 TNFα에서 발견되는 B 세포 에피토프의 실질적인 단편, 실질적인 분획에 나타나는 것이 유리하다. 본 발명에서 B 세포 에피토프의 실질적 분획이라 함은 TNFα 대 다른 단백질을 항원적으로 특징짓는 B 세포 에피토프의 분획을 의미하는 것으로 의도된다. 실질적 분획은폴리머 단백질의 일부일 경우 대응하는 TNFα 모노머에서 발견되는 본질적으로 모든 B 세포 에피토프를 나타내는 것이 바람직하다 - 물론, 모노머 TNFα 서열내로 약간의 변화를 도입시키는 것이 필요할 수 있다. 예컨대, 전술한 바와 같이, 천연 단백질과 비교할 때 TNFα 유사체의 독성을 감소시키고/감소시키거나 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 도입하도록 모노머 유닛으로부터 유래된 아미노산 서열을 아미노산 삽입, 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형시킨다.
특히 바람직한 구체예는 실질적인 각각의 분획이 본질적으로 각각의 모노머의 TNFα 유닛의 완전한 아미노산 서열을. 연속적 서열로서든 삽입물을 포함하는 서열로서든 포함하는 면역원성 TNFα 유사체를 제공한다. 즉, (예컨대, 이러한 서열이 모노머 유닛의 3차원 구조 또는 TNFα의 4차원 구조에 기여하지 않는 경우) 모노머 TNFα 유닛 서열 중 무의미한 부분만이 유사체로부터 절단된다. 그러나, 이 구체예는 멀티머 TNFα 단백질의 3D 구조가 유지되는 한, 모노머의 치환이나 삽입을 허용한다. 따라서, 면역원성 TNFα 유사체가 하나인 경우, TNFα의 모든 모노머 유닛의 아미노산 서열이 유사체 내에 나타날 경우 특히 유리하며, 그 유사체가 절단되지 않은 서열로서든 삽입물을 포함하는 서열로서든, TNFα를 구성하는 (모든) 모노머의 완전한 아미노산 서열을 포함할 경우 특히 유리하다.
따라서 완전한 천연의 생물학적으로 활성인 TNFα의 3차원 구조는 본질적으로 유사체에서 보존되는 것이 바람직함이 자명할 것이다.
B 세포 에피토프의 실질적 분획이 보존되었다는 것 또는 심지어는 전술한 바와 같이 변형된 TNFα의 3차원 구조가 보존되었다는 것은 여러가지 방법으로 입증할 수 있다. 천연 TNFα (예컨대 토끼에서 제조된 항혈청)에 대하여 지향된 폴리클로날 항혈청을 제조한 다음 이 항혈청을, 제조된 변형 단백질에 대한 테스트 시약 (예컨대, 경쟁적 ELISA에서)으로서 사용하는 방법이 그것이다. 항혈청과 마찬가지로 동일한 정도로 반응하는 변형된 버젼 (유사체)는 천연 분자와 동일한 3D 구조를 갖는 것으로 간주되는 반면 그러한 항혈청과 제한된 (그러나 여전히 유의적이고 특이적인) 반응성을 나타내는 유사체는 본래의 B 세포 에피토프의 실질적 분획을 유지하는 것으로 간주된다.
또는, 천연의 TNFα에 미치는 독특한 에피토프와 반응성인 모노클로날 항체의 선별물을 제조하여 테스트 패널로 사용할 수 있다. 이러한 접근방식은 1) TNFα의 에피토프 지도작성 (mapping)을 가능하게 해주고 2) 제조된 유사체에서 유지된 에피토프의 지도작성을 가능케 해준다는 장점이 있다.
물론, 제3의 접근방법으로서 제조된 유사체의 3차원 해상 구조를 천연 TNFα의 3차원 해상 구조와 비교하는 방법도 있다. 3차원 구조는 TNFα선 회절 연구와 NMR- 분광법에 의해 해상될 수 있다. 3차원 구조에 관한 추가 정보는 어느 정도는 원형 광이색성 연구에 의해서도 얻을 수 있는데 이 연구는 주어진 분자의 3차원 구조에 대하여 유용한 정보를 얻는데, 폴리펩타이드를 순수항 형태로 제공하기만 하면 된다는 장점이 있다 (반면, X선 회절은 결정성 폴리펩타이드를 요구하고 NMR은 폴리펩타이드의 동위원서 변이체를 요구한다). 그러나, 원형 광이색성은 2차 구조 요소의 정보를 통해서 정확한 3차원 구조에 대한 간접적인 증거를 제공할 수 있을 뿐이므로, 궁극적으로는 X선 회절 및/또는 NMR이 필요하다.
본 발명의 면역원성 TNFα 유사체는 유사체 중에 멀티머 단백질에 이종적인 적어도 1종의 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열의 존재에 기여하거나 그러한 서열을 포함하는 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 이는 TNFα의 모노머 유닛에 대응하는 아미노산 서열을 변경시키는 것이 바람직하지 못할 경우 특히 유용하다. 또는, 이 펩타이드 링커는 TNFα 단백질이 유도된 동물종에서 MHC 클래스 II 결합 아미노산의 존재에 기여하지 않거나 그러한 아미노산을 갖지 않을 수 있다; 이는 아주 짧은 링커를 사용할 필요가 있을 경우, 또는, 본 발명에서처럼 활성 부위에서 MHC 클래스 II 결합 요소를 도입함으로써 잠재적으로 독성인 유사체를 해독시키는 것이 필수적인 경우 간편히 수행될 수 있다.
MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 멀티머 단백질로이 유도된 동물종으로부터의 MHC 클래스 II 분자의 대다수에 결합하는 것이 바람직하다. 즉, MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 보편적이거나 무차별성이다.
물론 이 서열은 면역원이 백신 구성원 역할을 하도록 의도된 종에서 T 세포 에피토프로서 작용하는 것이 중요하다. 어떤 동물 종의 개체 또는 동물 집단의 대부분에서 활성적인, 천연 발생적인 "무차별 (promiscuous)" TH 에피토프가 몇가지 존재하는데 이들을 백신 내로 도입할 경우 동일 백신에서, 매우 많은 수로 여러가지 유사체가 요구될 필요성이 감소되므로 바람직하다. 따라서, 적어도 1종의 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 천연 T 세포 에피토프와 인공 MHC-II 결합 펩타이드 서열로부터 선택되는 것이바람직하다. 특히 바람직한 서열은 P2 (SEQ ID NO: 2) 또는 P30 (SEQ ID NO: 4), 디프테리아 독소 에피토프, 인플루엔자 바이러스 헤카글루티닌 에피토프 및 P. falciparum CS 에피토프 중에서 선택된 천연 T 세포 에피토프이다.
지난 수년간 여러가지 무차별 TH 에피토프들이 동정되었다. 특히 여러가지 HLA-DR 대립 유전자에 의해 코딩된 HLA-DR 분자의 대부분에 결합할 수 있는 펩타이드들이 동정되었으며 이들은 모두 본 발명에 따라 사용되는 유사체에 도입시킬 수 있는 T 세포 에피토프들이다. 참조. 또한 본 발명에 참조로 통합된 다음 문헌에 설명된 에피토프들: WO 98/23635 (Frazer IH 외, The University of Queensland에 양도됨); Southwood S 외, 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F 외, 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM 외, 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J 외, 1993, Cell 74: 197-203; 및 Falk K 외, 1994, Immunogenetics 39: 230-242. 후자의 참조문헌은 HLA-DQ 및 -DP 리간드도 다루고 있다. 이들 5가지 참고 문헌에 수록된 모든 에피토프들은 본 발명에서 사용될 천연 에피토프의 후보로서 적당하며, 이들과 공통의 모티프를 공유하는 에피토프들도 그러하다.
또는, 이 에피토프는 대부분의 MHC 클래스 II 분자와 결합할 수 있는 여하한 인공적인 TH 에피토프일 수 있다. 이러한 맥락에서, WO95/07707 및 대응하는 논문인 Alexander J. 외, 1994, Immunity 1: 751-761 (두가지 문헌 모두 본 발명에 참조로 병합됨)에 설명된 범 DR 에피토프 펩타이드 ("PADRE": pan DR epitope)는 본 발명에 따라 사용될 에피토프의 흥미로운 후보들이다. 이들 논문에 개시된 것들 중 가장 효과적인 PADRE는 투여될 경우 안정성 증진을 위해 C- 및 N-말단에 D-아미노산을 가지는 것이라는 점을 숙지하여야 한다. 그러나, 본 발명은 주로 우사체의 일부로서, 적절한 에피토프를 병합하는 것을 주목적으로 하며, 이는 APCs의 리소좀 구획 내에서 효소적으로 분해되어 MHC-II 분자 관점에서 후속적인 제시되고 따라서 본 발명에서 사용된 에피토프에 D-아미노산을 병합시키는 것은 적당하지 않다.
특히 바람직한 한가지 PADRE 펩타이드는 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 6 및 8) 또는 그의 면역학적으로 효과적인 서브서열이다. 이것과 MHC 제한이 동일하게 결여된 다른 에피토프는 본 발명의 방법에 사용된 유사체에 존재하여야 하는 바람직한 T 세포 에피토프들이다. 이러한 초무차별 에피토프들은 백신화된 동물의 면역계에 오직 하나의 단일 키메라 결합 단백질 종만을 제시하는, 본 발명의 가장 간단한 구체예를 가능케 해 줄 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 적어도 1종의 면역우세적인 (immunodominant) TH 에피토프를 도입하는 것을 포함한다. TH 에피토프의 면역 우세성 문제는 문제의 동물 종에 따라 달라지리라는 것이 이해될 것이다. 본 발명에서, "면역우세"라는 용어는 단순히, 예방접종된 개체에서 유의적인 면역 반응을 일으키는 에피토프에 대한 것을 가리키는 것이지만, 한 개체에서 면역 우세적인 TH 에피토프가 자가의 다른 개체에서도 반드시 면역우세적인 것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다 (비록 후자의 개체에서 MHC-II 분자에 결합할 수 있다고 해도).
전술한 바와 같이, 외래 T 세포 에피토프의 도입은 적ㅇ도 1종의 아미노산의 삽입, 부가, 결실 또는 치환을 도입함으로써 달성가능하다. 물론, 정상적인 상황은 아미노산 서열 중 한가지보다 많은 변화를 도입하는 것이 되겠지만 (예컨대 완전한 T 세포 에피토프에 의한 삽입 또는 치환) 달성해야할 중요한 목표는 그 유사체가, 항원 제시 세포 (APC)에 의해 프로세싱될 경우 APC의 표면 상에서 MCH 클래스 II 분자 관점에서 이러한 T 세포 에피토프를 제시하여야 한다는 것이다. 따라서, 적절한 부분의 모노머 유닛의 아미노산 서열이 외래 TH 에피토프에서도 발견가능한 아미노산 잔기를 몇개 포함하는 경우, 외래 TH 에피토프의 도입은 아미노산 삽입, 부가, 결실 및 치환 수단에 의해 외래 에피톺의 나머지 아미노산을 제공함으로써 달성가능하다. 즉, 완전한 TH 에피토프를 삽입이나 치환에 의해 도입할 필요가 없다는 것이다.
본 발명에 따라, 유사체는 보다 큰 분자의 일부를 형성할 수 있고 여기서 이것은 적어도 1종의 기능성 부분 (moiety)에 커플링되는데, 그의 존재는 유사체의 항체-접근성의 유의도에 부정적으로 간섭하지 않는다. 이러한 부분 (유사체에 융합될 수 있음)의 특성은 항원 제시 세포 (APC) 또는 B 임파구에 변형된 분자를 표적화시키고, 면역계를 자극하고, 면역계에 대한 유사체의 제시를 최적화시키는 것일 수 있다.
표적화 부분은 B 임파구나 APC 상에 그에 대한 수용체가 있는, 예컨대 합텐이나 탄수화물과 같이, B 임파구 특이적인 표면 항원 또는 APC 특이적인 표면 항원에 대해 실질적으로 특이적으로 결합하는 파트너 중에서 간편하게 선택된다. 면역자극 부분은 시토카인, 호르몬 및 열충격 단백질 중에섯 ㅓㄴ택될 수 있다. 제시를 최적화시키는 부분은 지질기, 예컨대, 팔미토일기, 미리스틸기, 파르네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기 중에서 선택될 수 있다.
적절한 시토카인은 인터페론γ (IFN-g), Flt3L, 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF)이거나 그의 유효한 부분이다.
바람직한 열충격 단백질으로는 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 및 칼레티쿨린 (CRT)을 들 수 있다.
아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가의 수는 적어도 2개, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 25개의 삽입, 치환, 부가 또는 결실인 것이 좋다. 아미노산 삽입, 치환, 부가 또는 결실의 횟수는 150 이하, 예컨대 100 이하, 90 이하, 880 이하, 그리고 70이하인 것이 바람직하다. 치환, 삽입, 결실 또는 부가의 수는 60 이하, 특히 바람직한 수는 50 이하, 더욱 바람직하게는 40 이하인 것이 좋다. 가장 바람직한 것은 30을 초과하지 않는 것이다. 아미노산 부가와 관련하여, 결과적인 구조물이 융합 폴리펩타이드 형태일 경우, 이들은 종종 150보다 훨씬 크다.
본 발명의 바람직한 구체예는 적어도 1종의 면역우세적인 (immunodominant) TH 에피토프 (= "외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열")를 도입하는 것을 포함한다. TH 에피토프의 면역 우세성 문제는 문제의 동물 종에 따라 달라지리라는 것이 이해될 것이다. 본 발명에서, "면역우세"라는 용어는 단순히, 예방접종된 개체에서 유의적인 면역 반응을 일으키는 에피토프에 대한 것을 가리키는 것이지만, 한 개체에서 면역 우세적인 TH 에피토프가 자가의 다른 개체에서도 반드시 면역우세적인 것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다 (비록 후자의 개체에서 MHC-II 분자에 결합할 수 있다고 해도).
또 다른 중요한 사항은 TH 에피토프의 MHC 제한 문제이다. 일반적으로 자연발생적인 TH 에피토프는 MHC 제한된 것으로, 즉, 특정 펩타이드 구성 TH 에피토프는 MHC 클래스 II 분자의 서브세트에만 효과적으로 결합할 것이다. 이것은 대부분의 경우 하나의 특이적인 T 세포 에피토프를 사용하면 그 집단 분획에서만 효과적인 백신 성분을 결과시킨다는 효과를 가지며, 그 분획 크기에 따라, 동일한 분자 내에 더 많은 T 세포 에피토프를 포함시키거나, 또는, 그 성분들이 폴리펩타이드의 변이체들 (도입된 T 세포 에피토프의 특성에 따라 서로 구별됨)인 복수 성분의 백신을 제조하는 것이 필요할 수 있다
사용된 T 세포의 MHC 제한이 완전히 알려져 있지 않으면 (예컨대, 예방접종된 동물이 잘 정의되지 않은 MHC 조성을 갖는 상황), 특이적인 백신 조성물에 의해 커버되는 집단의 분획을 다음 식에 따라 구할 수 있다.
[식 I]
Figure 112005064547533-PCT00001
식 중, pi는 백신 조성물 중에 존재하는 i번째 외래 T 세포 에피토프에 대한 응답자들 집단 중의 빈도이고, n은 백신 조성물 중의 외래 T 세포 에피토프의 총수이다. 따라서, 집단중 응답 빈도가 각각 0.8, 0.7, 및 0.6인 3개의 외래 T 세포 에피토프를 함유하는 백신 조성물은 다음과 같을 것이다
1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976
즉, 통계적으로, 그 집단의 97.6%가 그 백신에 대해 MHC-II 매개된 응답을 일으킬 것이다.
상기한 식은 사용된 펩타이드의 다소 정확한 MHC 제한 패턴이 알려진 상황에는 적용되지 않는다. 예컨대, 어떤 펩타이드가 HLA-DR 대립유전자인 DR1, DR3, DR5 및 DR7에 의해 코딩된 인간의 MHC-II 분자들과만 결합한다면, 이 펩타이드를, HLA-DR 대립유전자에 의해 코딩된 나머지 MHC-II 분자와 결합하는 다른 펩타이드와 함께 사용할 경우 문제의 집단에서 100% 커버가 달성될 것이다. 마찬가지로, 두번째 펩타이드가 DR3과 DR5에만 결합한다면, 이 펩타이드의 부가는 커버리지를 전혀 상승시키지 않을 것이다. 백신 중의 T-세포 에피토프의 MHC 제한에만 기초해서 집단 응답을 계산한다면, 특이적인 백신 조성물에 의해 커버되는 집단의 분획은 다음 식에 의해 측정될 수 있다:
[식 II]
Figure 112005064547533-PCT00002
식 중, φ j 는 백신 중의 T 세포 에피토프들 중 어느 것이든 결합하는 MHC 분자를 코딩하는 대립유전자 반수체가 그 집단에서 나타나는 빈도의 합을 나타내며 이것은 공지의 3가지 HLA 위치 (DR, DR 및 DQ)의 j번째에 속하는 것이다; 실상, 어떤 MHC 분자가 백신 중 각각의 T 세포 에피토프를 인식할지를 먼저 결정한 후에 이들을 유형별로 (DP, DR 및 DQ) 목록화하고, 목록에 오른 서로 다른 대립유전자 반수체의 개별적인 빈도를 유형별로 합계를 냄으로써, φ 1 , φ 2 , 및 φ 3 을 산출한다.
식 I에서 pi 값은 대응하는 이론치 ni를 초과한다:
[식 III]
Figure 112005064547533-PCT00003
식 중, uj는 백신 중 i번째 T 세포 에피토프에 결합하는 MHC 분자들을 코딩하는 대립유전자 반수체가 그 집단에서 나타나는 빈도의 합으로서, 공지의 3가지 HLA 위치 (DP, DR 및 DQ)의 j번째에 속하는 것이다. 이것은 집단의 1-ni가 fresidual_j=(pi-ni)/(1-ni)의 응답자의 빈도임을 의미한다. 따라서, 식 II을 변형시키면 다음 IV가 얻어진다:
[식 IV]
Figure 112005064547533-PCT00004
식 중, 1- fresidual_i는 음수일 경우 0으로 설정된다. 식 V는 모든 에피토프가 동일한 반수체 세트에 대해 작성된 반수체였어야 함을 요한다는 것을 인식하여야 한다.
따라서, 유사체 내로 도입될 T 세포 에피토프의 선택시, 그 에피토프에 대해 입수가능한 모든 지식을 포함시키는 것이 중요하다: 1) 각각의 에피토프에 대한 집단 중에서의 응답 빈도, 2) MHC 제한 데이터 및 3) 그 집단 중에서의 타당한 반수체의 빈도.
본 발명의 바람직한 유사체는 TNFα의 대응 모노머 유닛 또는 길이가 적어도 10개 아미노산인 그의 서브서열과 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 결과시키는 변형을 포함한다. 서열 상동성이 높을수록, 더 바람직하다. 예컨대 적어도 75%, 또는 적어도 80% 또는 85%. 단백질 및 핵산에 대한 서열 상동성은 (Nref-Ndif)·100/Ndif로서 산출될 수 있으며 여기서 Ndif는, 정렬시 두개 서열 중의 동일하지 않은 잔기들의 총 숫자이고 Nref는 어떤 한 서열의 잔기의 수이다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75%의 서열상동성을 갖는다 (Ndif=2이고 Nref=8임).
마지막으로, 본 발명의 TNFα 유사체가 면역원으로서 실질적으로 효과적임을 종국적으로 확인하기 위하여, 필요한 배열을 제공하기 위한 여러가지 테스트를 수행할 수 있다. 이 점에서, WO 00/65058호의 유용한 IL5 유사체의 동정에 관한 논의도 참고할 수 있다. - 이 문헌은 본 발명의 기술에 따른 유사체 (IL5 유도되거나 되지 않은)의 유용성을 입증하는데 이용될 수 있다.
바람직한 TNFα 유사체는 1) 펩타이드 링커에 의해 엔드-투-엔드 결합된 두가지 이상의 완전한 TNFα 모노머 (여기서 적어도 하나의 펩타이드 링커는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 갖는다) 및 2) 불활성 펩타이드 링커에 의해 엔드-투-엔드 결합된 두개 또는 세개의 완전한 TNFα 모노머 (여기서 모노머들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 포함하거나 또는 여기서 적어도 하나의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 임의로 불활성 링커를 통해 N 또는 C 말단 모노머에 융합된다) 중에서 선택된다.
특히 흥미로운 것은 높은 안정성을 갖는 면역원성 TNFα 분자인데, 이는 본 발명자들이 일찌기 모노머 TNFα 구조물이 비교적 불안정하다는 것을 발견했기 때문이다. 그러나 이하의 후술 내용 참조.
앞서, 에피토프 및/또는 불활성 펩타이드 링커에 의해 서로 연결된 3개의 TNFα 서브유닛을 코딩하는 유전자가 생산된 바 있다. 그 목적은 천연 TNFα 트라이머에 가능한 한 근접한 입체 배열을 갖는 변이체 TNFα 분자를 생산하는데 있었다. 이 변이체들은 wtTNFα에 대한 무력화 항체를 효율적으로 이끌어내기 위해 고안된 것이었다. 가장 적절한 TNFα 변이체는 세제 또는 단백질 입체 배열을 파괴시킬 수 있는 기타 종류의 첨가제의 부재시 가용성이고 안정한 단백질인 것으로 밝혀졌다.
다음의 논의는 TNF의 바람직한 변형에 관한 것으로 그 자체로는 해독에 관련된 것은 아니다.
링커 및 TH 에피토프를 이용하녀 하나의 단일 폴리펩타이드로서 함께 연결된 세가지 모노머를 발현시킴으로써, 전술한 변이체 TNFα 면역원보다 더 안정한 TNFα 변이체를 제조하고자 한다. 이는, 수소 결합, 염다리 또는 디설파이드 다리를 안정화시키는 외에 필요한 TH 에피토프를 도입함으로써 TNFα 구조의 보존을 가능케 해준다.
TNFα의 X선 결정 구조로부터 N 말단의 최초 5개 잔기는 구조 결정하기에는 너무나 유연하다는 것을 알 수 있다. 그러나 C 말단은 모노머 계면의 중간에 위치하여 덜 유연하다. Arg-6과 Leu-157의 C 알파 원자간의 거리는 10Å인데, 이것은 3-4개 아미노산 잔기에 해당하는 거리이다. 따라서, 모노머 서브유닛을 함께 직접 연결시킬 수 있을 것으로 보이는데, C 말단은 미묘한 좌위에 위치하기 때문에, 이 연결을 위해 글라이신 링커와 같은 유연한 링커를 사용하는 것이 유리하다.
"모노머화 트라이머 (monomerized trimer)" 접근방식을 이용하여 이제까지 5가지 변이체가 설계되었다. 컨트롤 TNF_T0 (TNFα 트라이머 넘버 0, WO 03/042244의 SEQ ID NO:22)는 2개의 별개 글라이신 링커에 의해 직접적으로 함께 연결된 세개의 모노머로 구성된다 (GlyGlyGly). TNF_T0은 야생형 트라이머 단백질만큼 안정하도록 설계된 것이다. 물론, 단백질 화학 분야에 공지인 다른 불활성의 유연한 링커들을 전술한 글라이신 링커 대신 사용할 수 있으며, 그 유연한 링커가 생리적으로 활성적인 wtTNFα의 3D 구조와 유사한 3D 구조로 폴딩하는 모노머화 단백질의 능력에 악영향을 미치지 않을 것이 중요하다.
TNF-T0 구조물은 E.coli에서 가용성 단백질로서 발현되며, 예컨대, PADRE MHC 클래스 II 결합 펩타이드 (SEQ ID NO: 6)가 도입된 변이체인 TNF_T4 (WO 03/042244 참조)를 제조하는데 이용된 바 있다. 이 구조물에서, 모노머 유닛과 외래 에피토프 간의 비율은 따라서, 면역원화된 모노머 단백질에 의존하는 종래 기술의 변이체의 경우인 모노머 1개당 에피토프 1개 (이것은 또한 WO 03/042244의 SEQ ID NO:55의 경우이기도 하다)가 아니라 모노머 3개당 에피토프 1개의 비율이다. 이 사실은 트라이머 안정성에 잠재적으로 긍정적인 영향을 미친다. 이러한 접근방식에서 파생된 것으로 TNF_C2 변이체 (WO 03/042244)를 들 수 있는데, 이것은 TNF_T4에서와 동일한 좌위에 PADRE 에피토프를 갖는 TNFα 모노머이다.
마찬가지로, 각각의 링커 대역에서 하나의 에피토프를 함유하는 TNF_T1 및 TNF_T2 변이체 (WO 03/042244), 및 C 말단 에피토프를 함유하는 TNF_T3 (WO 03/042244) 및 두번째 링커 대역에서 파상풍 독소 P2 및 P30 에피토프 (각각 SEQ ID NOs: 2 및 4)가 사용된 바 있다. 단백질들은 대개 N 말단으로부터 시작하여 C 말단을 향해서 폴딩된다. TNF_T3의 기저에 흐르는 아이디어는 먼저 2개의 N 말단 도메인이 폴딩되면 이들이 에피토프에 의해 봉입된 제3 도메인 (모노머)에 대한 내부 샤프론 (후원자)로서 기능할 것이다.
WO 03/042244에는 폴리머 단백질을 "모노머화"하는 전술한 기술에 더하여, TNFα (및 가능하게는 다른 많은 멀티머 단백질들)가 1) 적어도 하나의 안정화 돌연변이를 포함하고/포함하거나 2) 적어도 하나의 비TNFα 유래된 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 포함하는 모노머의 생산을 가능케한다는 것이 기재되어 있는데, 여기서 이들 TNFα 모노머 변이체들은 3차 구조로 정확히 폴딩되고 이것은 이어서 정확한 4차 구조 (이들이 수용체 결합 활성을 갖는다는 것에 의해 입증됨)를 갖는 다이머 및 트라이머 TNFα 단백질을 형성한다. 따라서, 이들 구조물에서는 반드시 모노머화 트라이머로서 생산될 필요는 없는 모노머 TNFα의 변이체를 제조하는 것이 가능했는데, 이는, 모노머 서열에 도입된 변화가 모노머의 3차 구조를 극히 제한적으로 파괴함으로 해서 다이머 또는 트라이머가 형성될 수 있기 때문이다. 본 발명의 저변에 깔린 사상에 따라, 이러한 모든 변이체들은 세균 세포로부터 가용성 단백질로서 발현된다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 다음의 전략들 (이들은 서로 병용가능하고 앞서 논의된 바 있는 본 발명의 "모노머화 접근법"과도 병용가능함)에 따라 면역원성 TNFα 변이체를 제조하는 것이 가능한 것으로 입증되었다 (이는 이들 특정 변형이 모두 비파괴적인 특성을 갖기 때문이다):
유연한 루프 전략
본 발명자들은 Gly108-Ala109 좌위의 루프 3에 PADRE 에피토프 (SEQ ID NO: 6)를 삽입하는 것이 천연 TNFα 분자와 구조가 매우 유사한 TNFα 변이체를 제조하는 유망한 접근방법이라는 것을 발견하였다. 이것은 TNFα 결정 구조로부터 이 좌위에 직접 삽입된 TH 에피토프는 그 바로 근방에서는 그와 상호반응할만한 이웃하는 아미노산 잔기를 전혀 갖지 않을 것으로 연역되었다. 이러한 접근방식에 따라 만들어진 최초의 PADRE 구조물, TNF34를 이용한 연구 결과 발현된 단백질 TNF34의 약 5%는 E.coli에서 가용성이었고 TNF34의 95%는 이 숙주 세균 세포를 37℃에서 생육시킬 경우에는 봉입체로서 발현되었으나, 발효 온도를 25℃로 한 발효 공정에서는, 발효에 의한 가용성 단백질의 수율이 100%에 근접하다는 것을 보여주었다. 따라서, 생육 조건을 최적화시키면 가용성 단백질의 수율이 증가된다.
몇가지 다른 구조물도 제조하였는데 (TNF35-TNF39, WO03/042244 참조), 여기서는 이들 모두는 유연한 루프 3의 PADRE의 도입에만 의존한다. 본 발명에 따라 외래 에피토프를 도입하는 것은 루프 3의 다른 부위 또는 루프 3 외부에서 행해질 수도 있을 것으로 고려된다. 특히 삽입이 흥미로울 것으로 여겨지는데, PADRE 또는 P2 또는 P30과 같은 외래 에피토프의 삽입은 사람 TNFα의 아미노산 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 및 118 중 어느 하나의 다음에서 수행가능하다. 그러나, ℃의 동일 대역에 있어서의 치환은 유리할 것으로 고려되며, 그러한 치환이 동일 대역의 아미노산과 관련이 있다 (즉, 사람 TNFα의 아미노산 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 중 단일 또는 연속적인 몇개의 아미노산의 치환).
안정성 개선 돌연변이
유연한 루프 3에 TH 에피토프를 도입하면 TNFα 변이체의 구조가 잠재적으로 불안해질 수 있다. 그러나, 이러한 잠재적 불안정화는 디설파이드 다리를 형성할 시스테인을 도입함으로써 그 구조를 안정화시키는 것에 의해 상쇄될 수 있다. 두가지 서로 다른 좌위 중의 시스테인 쌍은이 TNF34-A 및 TNF34-B에 도입되었었다 (WO 03/042244 참조). 또한, 수용체 상호반응의 강도를 저하시키는 것으로 알려진 유연한 N 말단 (최초의 8개 아미노산)을 동시에 결실시켜 변이체 TNF34-C이 된다 (WO 03/042244). 에피토프 삽입 부위의 안정화를 위해, 천연 발생적인 디설파이드 다리 (Cys-67 Cys-101)와 함께 디설파이드 다리를 도입한다. 이 전략은 TNFα 모노머 자체 및 모노머화된 다이머 또는 트라이머도 안정화시키는 것으로 믿어진다.
다른 구조물
가용성 발현 산물이될 변이체의 설계에 몇가지 서로 다른 전략들이 사용되었다. TNFX1.1-2 (WO03/042244)는 TNFα의 최초 루프 중의 PADRE의 삽입에 기초하는데, 여기서 삽입 좌위는 인트론 좌위에 위치한다. TNF2.1에서 (WO 03/042244 참조), PADRE 삽입물을 함유하는 인공 "스토크 (stalk)" 대역을 만든다.
TNFα의 돌연변이는 대형 소수성 아미노산 치환, 트라이머 계면으로의 포인팅이 트라이머 구조를 안정화시킴을 밝혀주었다. TNFX3.1 및 TNFX3.2 (WO 03/042244 참조)는 기존의 TNF34 변이체를 안정화시키기 위한 제안이다. TNFX4.1 (WO 03/042244 참조)은 전체적인 TNF34 구조 상에서 PADRE 펩타이드로부터의 구조적 구속을 감소시키기 위해 디-글라이신 링커를 사용한다. TNFX5.1 (WO 03/04244 참조)은 삽입위치로서, TNF 패밀리 구성원 BlyS에서 발견되는 루프 구조를 이용한다. TNFX6.1-2, TNF7.1-2 및 TNFX8.1 (WO 03/042244 참조)은 부가적인 변이체들이다. TNFX9.1 및 TNFX9.2 (WO 03/042244 참조)는 에피토프 전 및 후의 4-6 아미노산의 TNFα 서열의 동일 중복 부분을 사용한다. 마지막으로, 두가지 변이체 (WO 03/042244에서 SEQ ID NOs; 46 및 47)는 TNF34의 PADRE 펩타이드에서와 동일한 좌위에서 P2/P30 더블 변이체이다.
또한, TNFα의 결정 구조로부터 Lys-98 및 Glu-116 잔기 사이에 TNFα 모노머 내에 하나의 안정화 염다리가 존재하는 것이 관찰되었다. 염다리의 정의는 Asp 또는 Glu의 측쇄 산소와 Arg, Lys 또는 His의 양전하를 띤 측쇄 질소 원자 간의 정전기적 상호반응으로서 원자간 거리는 7.0 옹스트롱 미만이다. 이 좌위에서 Lys-98을 Arg나 His로 좌위 지향된 치환 돌연변이시키는 한편 Glu116을 Asp로 치환시키면 이 염다리의 안정성이 증가되어 트라이머 분자의 안정성이 달성될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이들 염다리를 디설파이드 다리와 교환하는 것도 가능하다.
쥐의 TNFα는 용해도와 단백질분해라는 측면상 사람의 TNFα보다 훨씬 더 안정한 것으로 관찰되었다. TNFα 변이체의 개선에는 단백질분해적으로 보다 안정한 TNFα 생성물을 수득하기 위하여 쥐의 TNFα 결정 구조를 모방하도록 좌위 지향된 돌연변이를 만드는 것이 포함된다.
사람 및 쥐의 TNFα의 X선 결정 구조로부터, 트라이머의 중심 (세개의 TNFα 모노머의 중앙)은 소수성 힘으로 인해 함께 홀딩되어 있는 반면 트라이머의 상부와 하부는 자연발생적인 염다리로 인해 서로 연결된 것으로 관찰된다. 따라서, 이들 염다리를 보다 강력한 연결에 대해 스크리닝함으로써, TNFα 트라이머의 안정성 역시 개선시킬 수 있다.
요약하면, 다음의 특정 TNFα 변이체들이 이제까지 제조되었다:
Figure 112005064547533-PCT00005
Figure 112005064547533-PCT00006
사용된 번호는 SEQ ID NO:10에서 N 말단 V로부터이다 (즉, SEQ ID NO:10의 아미노산 2로부터). N-말단 발린은 몇몇 서열에서는 번역 개시를 위해 사용된 메티오닌이다.
WO 03/042244에 개시된 TNFα의 전술한 모든 변이체들을 본 발명에 따라 해독시킨다.
TNFα를 해독하거나 또는 적어도, 독성을 크게 저하시키기 위한 몇가지 점돌연변이가 기술분야에 알려져 있다. 이러한 점돌연변이는, 필요한 경우, 본 발명의 변이체에 도입될 것이다. 특히 바람직한 돌연변이는 성숙한 TNFα에서 Tyr-87을 Ser으로, Asp-143을 Asn으로, Ala-145를 Arg로 치환하는 것에 상당하는 것이다. 또한, Loetscher, H., Stueber, D., Banner, D. Mackay, F.및 Lesslauer, W. 1993 JBC 268 (35) 26350-7에 언급된 모든 유효한 돌연변이 역시 본 발명의 구체예를 해독하는 흥미로운 구체예이다. 이러한 점돌연변이는 WO 03/042244에 개시된 특정 구조물중 여하한 어느 하나에 대해 이용될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 단백질 구조물은 따라서 SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 16, 17 및 18 중 어느 하나로 대표되는 것과, 이들로부터 유래된 보존적 아미노산 변경만을 포함하는 여하한 아미노산 서열이다.
어떻든, 전술한 이들 TNFα 변이체들 모두가 E. coli와 같은 세균 세포로부터 가용성 단백질로서 발현가능하다는 것은 중요한 구체예이다.
목표가 E.coli로부터의 발현인 경우 바람직한 벡터는 pET28b+이고, p2Zop2F (WP 03/042244의 SEQ ID NO: 60)는 곤충 세포 발현에 이용되는 벡터이며, pHP1 (또는 그의 시판되는 "twin"pCI)은 포유류 세포에서 발현에 사용되는 벡터이다.
본 발명에 의해 제공되는 일반적인 요법
본 발명은 매우 유리한 방식으로 TNFα를 하향 조절할 수 있게 해주는 방법들을 제공한다.
일반적으로, 자가 숙주에서 TNFα를 하향 조절하는 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명의 적어도 1종의 면역원성 TNFα 유사체의 면역원성 유효량을 동물의 면역계에 제시하는 것을 포함한다. 자가 숙주가 포유류인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 사람인 것이 좋다.
이 방법은 여러가지 방식으로 실시될 수 있으며, 그 중, 단백질 백신을 투여하는 것이 한가지 선택일 수 있고, 핵산 예방접종 전략 또는 생백신화 전략 역시 매우 흥미롭다.
단백질/폴리펩타이드 예방접종 및 포뮬레이션
본 발명의 유사체를 동물에게 투여함으로써 동물의 면역계에 그 유사체를 제시하는 경우, 폴리펩타이드 포뮬레이션은 기술 분야에 일반적인 이론을 따른다.
활성 성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제조는 일반적으로 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대 미국특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 및 4,578,770호에 설명되어 있고 이 문헌들은 모두 본 발명에 참고로 통합된다. 일반적으로, 이러한 백신은 액상 용액으로나 현탁액으로서 주사가능하게 조제되며; 주사에 앞서 액상제, 용액제, 현탁제로 포함될 고형제 역시 제조가능하다. 이러한 제제는 또한 유화될 수도 있다. 활성 면역원 성분은 약학적으로 허용되며 활성 성분과 양립가능한 부형제와 종종 혼합시킨다. 적절한 부형제로는 예컨대 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라, 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 애쥬번트로서 보조 물질을 소량 함유할 수 있고, 이는 백신의 효능을 증강시킨다; 후술하는 애쥬번트 참조.
백신은 주사에 의해 경구적으로, 예컨대 피하, 피내, 진피내, 피하, 또는 근육내로 주사하여 간편하게 투여된다. 다른 투여 방식에 적합한 부가적인 포뮬레이션에는 좌제와 몇가지 경우, 경구, 볼내, 설하, 복강내, 질내, 항문내, 경막외, 척수내, 및 두개내용 포뮬레이션이 포함된다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제와 담체에는 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함된다; 이러한 좌제는 활성 성분을 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1-2% 범위로 함유하는 혼합물로부터 조성될 수 있다. 경구용 포뮬레이션은, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 이러한 부형제를 포함한다. 이들 조성물들은 용액, 좌약, 정제, 알약, 캡슐제, 서방형 포뮬레이션 또는 분말 형태이며 활성 성분을 10-95%, 바람직하게는 25-70%의 양으로 함유한다. 경구용 포뮬레이션의 경우, 콜레라 독소가 흥미로운 포뮬레이션 파트너이다 (그리고 가능한 컨쥬게이션 파트너이기도 함).
폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 조성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 산부가염 (펩타이드의 유리 아미노기와 함께 형성됨)이 포함되며 이것은 예컨대 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 조성된다. 유리 카르복실기와 함께 조성된 염 역시, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 가은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
백신을 투여 포뮬레이션과 혼화가능한 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적이면서 면역원성인 양으로 투여한다. 투여량은 예컨대, 면역 반응이 일어날 대상 개체의 면역계의 용량, 및 소망되는 보호도를 비롯하여, 치료될 대상자에 따라 다르다. 적절한 투여량 범위는 예방접종시마다 활성성분 수백 마이크로그램 수준이며 바람직하게는 약 0.1 ㎍ 내지 2,000 ㎍ (이보다 더 많은 1 - 10 mg 범위의 양도 고려된다), 예컨대 약 0.5 ㎍ 내지 2,000 ㎍ 또는 0.5 ㎍ 내지 1,000 ㎍, 바람직하게는 1 ㎍ 내지 500 ㎍, 특히 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 100 ㎍의 범위이다. 초기 투여 및 추가(부스터) 샷의 적절한 요법 역시 다양하지만 후속적인 접종 또는 다른 투여를 수반하는 초기 투여에 의해 정형화된다.
적용 방식은 크게 변할 수 있다. 종래기술에 따른 방법으로든 백신을 투여할 수 있다. 여기에는 생리적으로 허용가능한 고체상 베이스 또는, 생리적으로 허용가능한 분산제를 이용한 경구 투여, 주사 등에 의한 비경구 투여가 포함된다. 백신의 투여량은 투여 경로에 의존하며 예방접종될 대상자의 연령과 항원 포뮬레이션에 따라 달라질 것이다.
백신 중의 몇몇 폴리펩타이드는 백신에서 충분히 면역원성이지만, 다른 몇가지의 경우 백신이 애쥬번트 물질을 추가로 포함할 경우 그 면역 반응이 증강될 것이다.
백신에 대해 애쥬번트 효과를 얻는 방법이 여러가지 알려져 있다. 일반적인 이론과 방법은 "The Theory and Practical Application of Adjuvants" 1995, Dun-can E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, 및, "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants" 1995, Gregoriadis G 외 (편), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 잘 설명되어 있으며 이 두 문헌 모두 본 발명에 참조로 통합되었다.
자가항원에 대한 자가내성의 파괴를 용이하게 해주는 것으로 입증가능한 애쥬번트를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 적절한 애쥬번트의 비제한적인 예로는 면역 표적화 애쥬번트; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조정(modulating) 애쥬번트; 오일 포뮬레이션; 폴리머; 미셀 형성 애쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합체 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 애쥬번트; DNA 애쥬번트; γ-인슐린; 및 캡슐화 애쥬번트 중에서 선택된다. 일반적으로 유사체 중 제1, 제2 및 제3부분로서 유용한 제제 및 화합물과 관련하여 위에서 개시한 내용은 본 발명의 백신의 애쥬번트에 있어서의 그들의 사용에도 준용되는 것으로 한다.
애쥬번트 사용은 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄 (명반)과 같은 제제를 완충 염수 중에서 0.05 내지 0.1% 용액으로서, 0.25% 용액으로서 사용되는 슈가의 합성 폴리머 (예컨대 Carbopol
Figure 112005064547533-PCT00007
)과 혼합하여, 백신중에서 단백질과 70 내지 101℃에서 30초 내지 2분간 각각 열처리함으로써 응집시키는 것을 포함하며 교차결합제에 의한 응집도 가능하다. 알부민에 대한 펩신 처리된 항체 (Fab 단편)을 이용한 재활성화에 의한 응집, C. parvum과 같은 박테리아 세포 또는 내독소나 그램 음성 박테리아의 리포다당류 성분과의 혼합물, 만나이드 모노올리레이트와 같은 생리적으로 허용가능한 오일 비히클 중의 에멀젼 (Aracel A) 또는 블록 치환기로 사용되는 퍼플루오로카본의 20% 용액과의 에멀젼 (Fluosol-DA)도 사용가능하다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물도 바람직하다.
본 발명에서 DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는 DNA와 γ-인슐린과 같이 애쥬번트로서 흥미로운 후보이며, 또한 프로인드 완전 및 불완전 애쥬번트와 QuilA 및 QS21와 같은 퀼라자(quillaja) 사포닌도 RIBI로서 흥미롭다. 모노포스포릴 지질 A(MPL), 상기한 C3 및 C3d, 및 뮤라밀 디펩타이드 (MDP)도 가능하다.
리포좀 포뮬레이션 역시 애쥬번트 효과를 부여하는 것으로 알려져 있으므로, 리포좀 애쥬번트도 본 발명에서 바람직하다.
또한 본 발명에 따라, 면역자극 복합체 매트릭스 타입 (ISCOM
Figure 112005064547533-PCT00008
매트릭스) 애쥬번트를 선택하는 것도 바람직한데, 이는, 특히 이 유형의 애쥬번트가 APCs에 의한 MHC 클래스 II 발현을 상향조절할 수 있는 것으로 나타났기 때문이다. ISCOM
Figure 112005064547533-PCT00009
매트릭스는 Quillaja saponaria로부터의 (임의로 분획화된) 사포닌(트리테르페노이드), 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다. 면역원성 단백질과 혼합될 경우, 얻어진 입자상 포뮬레이션은 ISCOM 입자로 알려진 것으로서, 여기서 사포닌은 60-70 중량%, 콜레스테롤과 인지질은 10-15 중량%, 단백질은 10-15 중량%이다. 면역자극 복합체의 조성과 사용에 관한 상세 내용은 애쥬번트에 관해 다루고 있는 상기한 교재들 뿐만 아니라, Morein B 외, 1995, Clin. Immuno-ther. 3: 461-475 및 Barr IG 및 Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25에서도 찾아볼 수 있으며 (두가지 모두 본 발명에 참조 통합됨) 완전한 면역자극 복합체의 제조방법에 관한 유용한 지침을 제공해준다.
애쥬번트 효과를 달성할 수 있는 또 다른 매우 흥미로운 (따라서 바람직한) 가능성은 Gollelin 등의 1992년 방법 (본 발명에 참조 통합됨)에 설명된 기술을 사용하는 것이다. 요약하면, 본 발명의 항원과 같은 적절한 항원의 제시를, 그 항원을 단핵세포/대식세포 상의 Fcγ 수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편)에 컨쥬게이션시킴으로써 증강시킬 수 있다. 특히 항원과 항-FcγRI 간의 컨쥬게이션이 예방접종의 목적을 위한 면역원성을 증가시키는 것으로 입증되었다.
다른 가능성은 단백질 구조물 부분으로서 청구범위에 언급된 상기한 면역 조정 물질 (즉, 시토카인) 및 표적화를 이용하는 것이다. 이와 관련해서 폴리 I:C와 같은 시토카인의 합성 인듀서도 가능하다.
적절한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 프로인드 애쥬번트, RIBI 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로스의 디에스테르 중에서 선택된다.
적절한 면역 표적 애쥬번트가 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 그의 특이적 결합 단편 (상기 내용 참조), 만노스, Fab 단편 및 CTLA-4 중에서 선택된다.
적절한 폴리머 애쥬번트는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 라텍스 비드와 같은 라텍스 중에서 선택된다.
면역 응답을 조정하는 또 다른 흥미로운 방법은 면역원 (임의로 애쥬번트 및 약학적으로 허용되는 캐리어 및 비히클과 함께)을 "가상 임파절(VLN:virtual lympho node)" (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501에 의해 개발된 특허 의료기구) 내로 포함시키는 것이다. VLN (얇은 튜브형 장치)은 임파절을 모방한 구조와 기능을 갖는 것이다. 피부 밑에 VLN을 삽입하면 시토카인과 케모카인의 급증과 함께 멸균 염증 부위가 생성된다. T 세포와 B 세포 뿐만 아니라 APCs도 이 위험 신호에 신속이 대응해서, 염증 부위로 귀소해서 VLN의 다공성 매트릭스 내로 축적된다. 어떤 항원에 대한 면역 응답을 일으키는데 필요한 항원 투여량은 VLN을 사용할 경우 감소된다는 것과 VLN을 이용한 예방접종에 의해 부여된 면역 보호반응이 애쥬번트로서 Ribi를 이용한 통상적인 면역화를 뛰어넘는 것으로 나타났다. 이 기술은 예컨대, "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, Cali-fornia" 중의 Gelber C 외, 1998, "Elitation of Robust Cel-lular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immuno-gens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"에 간략히 설명되어 있다.
백신은 적어도 1년에 1회, 예컨대 1년에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 12회 투여된다. 더욱 구체적으로, 그것을 필요로 하는 개체에게 1년에 1-12회, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회 투여된다. 본 발명에 따른 바람직한 자가 백신의 사용에 의해 유발되는 메모리 면역이 영구적인 것은 아니기 때문에, 면역계는 유사체들에 의해 주기적으로 챌린지될 필요가 있는 것으로 밝혀진 바 있다.
유전적 변이로 인해, 상이한 개체들이 동일한 폴리펩타이드에 대해 여러 강도로 면역응답하여 반응할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백신은 면역 반응의 증가를 위해 여러가지 상이한 폴리펩타이드들을 포함할 수 있다. 이와 관련해서 외래 T 세포 에피토프 도입의 선택과 관련한 상기 설명 참조. 백신은 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드들 두가지 이상 포함할 수 있다.
백신은 결과적으로 3-20개의 상이한 유사체, 예컨대 3-10개의 유사체를 포함할 수 있다. 그러나, 대개 유사체의 수는 최소한 1 또는 2개의 유사체를 유지할 것이다.
핵산 예방접종
펩타이드를 기제로 한 백신의 전통적인 투여의 대안으로서, 핵산 예방접종 ("핵산 면역화", "유전적 면역화" 및 "유전자 면역화"라고도 알려져 있음)은 여러가지 흥미로운 특성을 제공한다.
먼저, 전통적인 백신 접근법과 대조적으로, 핵산 예방접종은 면역원성 제제의 대규모 생산을 소비하는 공급원을 필요로 하지 않는다 (예컨대, 단백질을 생산하는 미생물의 공업규모의 발효 형태). 뿐만 아니라, 면역원의 정제 장비 및 리폴딩 계획도 필요하지 않다. 그리고 마지막으로, 도입된 핵산의 발현 산물을 생산하기 위해서, 핵산 예방접종은 예방접종된 개체의 생화학적 장치에 의존하므로, 발현 산물의 최적의 후번역 프로세싱이 일어날 것으로 기대된다; 상기한 바와 같이, 본래의 폴리머의 B 세포 에피토프의 유의적 분획이 변형된 분자 중에 보존되어야 하고, B 세포 에피토프는 원래 여하한 (바이오)분자 (예컨대 탄수화물, 지질, 단백질등) 부분들에 의해 구성될 수 있기 때문에, 이것은 자가 예방접종의 경우 특히 중요하다. 따라서, 면역원의 천연 글리코실화 및 지질화 양상은 전반적인 면역원성에 있어 매우 중요한 것일 수 있고, 이것은 면역원을 생산하는 숙주를 가짐으로써 해결될 것으로 기대된다.
현재 개시된 유사체들 중 몇몇에서 관찰되는 증가된 발현 수준은 DNA 예방접종의 효능 측면에서 매우 중요한데, 이는 생체내 발현 수준은 DNA 백신의 면역원성 효능의 결정 인자들중 하나이기 때문이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 유사체를 코딩하는 핵산(들)을 동물 세포 내로 도입함으로써, 면역계에 유사체를 제시하고, 도입된 핵산(들)의 세포에 의해 생체내 발현을 수행하는 것을 포함한다.
이 구체예에서, 도입된 핵산은 바람직하게는 DNA인 것이 좋고, 이것은 네이키드(naked) DNA, 하전된 또는 하전되지 않은 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 중에 조성된 DNA, 바이러스 벡터 중에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제제와 함께 조성된 DNA, 불활성 캐리어 분자에 커플링된 DNA, 예컨대 PLGA와 같은 폴리머 (WO98/31398에 설명된 마이크로캡슐화 기술 참조) 또는 키틴 또는 키토산 중에 캡슐화된 DNA, 및 애쥬번트와 함께 조성된 DNA 형태인 것이 바람직하다. 이러한 관점에서, 전통적인 백신 포뮬레이션 중의 애쥬번트의 사용과 관련한 모든 고려사항이 DNA 백신의 포뮬레이션에도 실제로 적용된다. 따라서, 폴리펩타이드를 기재로 한 백신의 관점에서 애쥬번트의 사용과 관련한 모든 개시내용은 핵산 예방접종 기술에서의 그들의 사용에서도 준용된다.
상기한 폴리펩타이드 기제 백신의 투여 경로 및 투여 계획은 본 발명의 핵산 백신에도 적용가능하며 폴리펩타이드의 투여 경로 및 투여 계획과 관련한 상기한 모든 설명이 핵산의 경우에도 준용된다. 여기에 핵산 백신은 정맥 및 동맥내로 적절히 투여될 수 있음도 덧붙여진다. 뿐만 아니라, 핵산 백신은 소위 유전자총에 의해 투여될 수 있다는 것이 잘 알려져 있으므로, 이러한 투여방식과 그와 동등한 방식의 투여방식 역시 본 발명의 일부로 간주된다. 마지막으로, 핵산 투여시 VLN을 사용하면 우수한 결과 얻어지는 것으로 보고되었기 때문에, 특정한 투여 방식이 특히 바람직하다.
뿐만 아니라, 면역화 제제로서 사용되는 핵산(들)은, 청구범위에 명시된 부분들을 코딩하는 대역들, 예컨대, 유용한 애쥬번트로서 설명된 시토카인과 같은 상기한 면역조정 물질의 형태로 함유할 수 있다. 이 구체예의 바람직한 버젼은 상이한 리딩 프레임 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절 하에 유사체에 대한 코딩 대역과 면역조절물질에 대한 코딩 대역을 갖는 것을 포괄한다. 그렇게 함으로써 유사체 또는 에피토프가 면역조절물질에 대한 융합 파트너로서 생산되는 것을 피할 수 있다. 또는, 두가지 별개의 뉴클레오타이드 단편들을 사용할 수 있지만, 두가지 모두의 코딩 대역이 동일한 분자를 포함할 경우 확실한 공동 발현의 장점을 고려하면 덜 바람직하다.
따라서, 본 발명은 TNFα에 대한 항체 생산을 유발할 수 있는 조성물에 관한 것이기도 하며, 이 조성물은
- 본 발명의 핵산 단편 또는 벡터 (하기 벡터에 관한 내용 참조), 및
- 상기한 바와 같은 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 캐리어 및/또는 애쥬번트
를 포함하여 이루어진다.
정상적인 환경에서는, 핵산이 벡터 형태로 도입되며 여기서 바이러스 프로모터의 제어 하에 발현이 이루어진다. 본 발명에 따른 벡터와 DNA 단편의 상세는 하기 내용을 참조하면 된다. 또한, 핵산 백신의 포뮬레이션과 사용에 관한 상세한 설명이 Donnelly JJ 외, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 및 Donnelly JJ 외, 1997, Life Sciences 60: 163-172에 개시되어 있다. 이들 두가지 문헌 모두 본 발명에 참조 통합되었다.
생백신 (live vaccines)
본 발명의 유사체를 면역계에 제시하는 세번째 대체법은 생백신 기술을 사용하는 것이다. 생백신접종에서는, 본 발명의 유사체를 코딩하는 핵산 단편 또는 그러한 핵산 단편을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 비병원성 미생물을 동물에게 투여함으로써 면역계에 대한 제시가 수행된다. 비병원성 미생물은 예컨대 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis BCG.), 비병원성 스트렙토코커스 spp (Streptococcus spp.), 이. 콜라이 (E. coli), 살모넬라 (Salmonella spp.), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 시겔라 (Shigella) 등과 같은 적절한 약독화 박테리아 균주 (계대 수단을 통하거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의한 병원성 발현 생성물의 제거를 통해 약독화됨)일 수 있다. 현행 기술에 따른 생백신의 제조방법을 다룬 리뷰로 예컨대 Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990를 들 수 있으며, 이들 두 문헌 모두 본 발명에 참조로 통합되었다. 이러한 생백신에 사용되는 핵산 단편 및 벡터에 관한 상세를 다음에 설명하였다.
박테리아 생백신의 대체물로서, 후술하는 본 발명의 핵산 단편을 백시니아 균주 또는 기타 다른 적절한 폭스 바이러스와 같은 비바이러스성 바이러스 백신내로 통합시킬 수 있다.
일반적으로, 비병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에게 오직 1회만 투여하지만, 어떤 경우에는 보호성 면역을 유지하기 위해, 일생에 두번 이상 미생물을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 폴리펩타이드 예방접종을 위한 상기한 바와 같은 면역화 계획은 생백신 또는 바이러스 백신을 사용할 경우에도 유용할 것으로 생각된다.
또는, 생백신접종 이나 바이러스 예방접종을 전술 또는 후술하는 폴리펩타이드 및/또는 핵산 예방접종과 함께 병용한다. 예컨대, 생백신 또는 바이러스 백신으로 일차 면역화한 다음 폴리펩타이드 또는 핵산을 이용하여 후속적으로 추가(부스터) 면역화시킬 수 있다.
미생물 또는 바이러스는 유용한 애쥬번트로서 설명된 시토카인과 같은, 상술한 면역조절물질의 형태로 전술한 부분들을 코딩하는 대역을 함유하는 핵산(들)로 형질전환시킬 수 있다. 이 구체예의 바람직한 한가지 버젼은 상이한 리딩 프레임 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절 하에 유사체에 대한 코딩 대역과 면역조절물질에 대한 코딩 대역을 갖는 것을 포괄한다. 이렇게 함으로써, 유사체나 에피토프가 면역조절물질에 대한 융합 파트너로서 생산되는 것이 회피된다. 또는 두개의 별도의 뉴클레오타이드 단편들을 형질전환 제제로서 이용할 수 있다. 물론, 동일한 리딩 프레임 내에 애쥬베이팅 부분들을 가질 경우 발현 생성물로서 본 발명의 유사체를 제공할 수 있으며, 이러한 구체예는 본 발명에서 특히 바람직하다.
복합 요법
본 발명을 수행하는 특히 바람직한 한가지 방식은 일차 (프라임) 면역화로서 핵산 예방접종을, 이어서 전술한 바와 같은 폴리펩타이드 기제 백신 또는 생백신으로 2차 (부스터) 면역화시키는 것이다.
질병 치료에 있어서의 본 발명의 방법의 이용
류마티스성 관절염, 소아성 만성 관절염, 척추관절병증, 다발성근육염, 피부근육염, 혈관염, 건선 (프라크) 및 건선성 관절염, Mb. Crohn, 만성 폐쇄폐병, 골수형성이상증후군, 류마티스성 관절염중 포도막염, 급성 폐장애, 천식 (급성 및 만성 모두), 베그너씨 육아종증, 자극성 장질환, 턱관절 장애 (통증성 턱관절), 구내염다공증, 및 암 카켁시아 및 기타 염증성 질환과 TNFα의 악영향과 연관이 있는 것으로 기술 분야에서 일반적으로 인식되고 있는 기타 질환이 관련된 질환/상태이다. 따라서 멀티머 단백질의 활성을 하향 조절하기 위해 본 발명의 방법을 이용함으로써 이들 질환들과 연관된 증상을 치료 또는 경감시키는 것이 가능하다.
본 발명의 조성물
본 발명은 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 조성물에 관한 것이기도 하다. 따라서, 본 발명은 상기 정의된 유사체의 면역원성 유효량을 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이기도 하며, 여기서 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 희석제 및/또는 비히클 및/또는 캐리어 및/또는 부형제와 임의로 어쥬번트를 추가로 포함한다. 즉, 본 발명의 이 부분은 기본적으로 상술한 바와 같은 유사체 포뮬레이션에 관한 것이다. 애쥬번트, 캐리어 및 비히클의 선택은 따라서, 펩타이드 예방접종을 위한 유사체의 포뮬레이션과 관련해서 상기 논의된 것에 따른다.
유사체는 일반적으로 기술분야의 공지 방법에 따라 제조된다. 길이가 긴 폴리펩타이드는 보통, 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 적절한 벡터내로 도입하여, 적절한 숙주 세포를 그 벡터로 형질전환시킴으로써 핵산 서열을 발현시키고(적절한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써), 그 발현 산물을 숙주 세포 또는 그의 배양 상등액으로부터 회수한 다음 정제하고 임의로 더 변형, 예컨대 리폴딩 또는 유도화시키는 것을 포함하는 재조합 유전자 기술 수단에 의해 제조된다. 필요한 수단과 관련한 상세는 "본 발명의 핵산 단편 및 벡터"라는 제하의 단락 뿐만 아니라 실시예에서 다루어질 것이다. 이 섹션에서는 유사체의 바람직한 재조합 제조 방법, 즉, 가용성 TNFα 변이체를 얻기 위해 E. coli를 저온 발효시키는 것도 설명되어 있다.
펩타이드 합성 기술에 관한 최근의 기술 발전으로 인해 이들 수단에 의한 전장 폴리펩타이드와 단백질의 생산이 가능해졌고, 이에 따라, 잘 알려진 고상 또는 액상 펩타이드 합성 기술에 의해 긴 구조물을 제조하는 것 역시 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 핵산 단편 및 벡터
상기 내용으로부터 변형된 폴리펩타이드를 재조합 유전자 기술에 의해서 뿐만 아니라 화학 합성 또는 반합성 수단에 의해서도 제조할 수 있음을 알 수 있을 것이다; 후자의 두가지 옵션은 변형이 단백질 캐리어 (예컨대 KLH, 디프테리아 독소, 파상풍 톡소 및 BSA)와 탄수화물 폴리머와 같은 비단백질 분자를 커플링시키는 것으로 이루어진 경우 특히 타당하며 물론, 그 변형이 측쇄나 측기를 폴리펩타이드-유도된 펩타이드 사슬에 부가하는 것을 포함할 때도 그러하다.
재조합 유전자 기술의 목적상, 그리고 핵산 면역화 목적상, 유사체를 코딩하는 핵산 단편은 중요한 화학적 산물이다 (그의 상보 서열도 마찬가지이다). 따라서, 본 발명의 중요한 부분은 본 발명에 설명된 바와 같이 유사체를 코딩하는 핵산 단편, 즉, 전술한 바와 같이 폴리머 유도된 인공 폴리머 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편이다.
본 발명의 가장 바람직한 DNA 단편은 SEQ ID NOs; 12, 13, 14, 16, 17 및 18중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열 또는 이들 중 어느 하나에 상보적인 핵산 서열 중에서 선택된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 단편은 보통 적절한 벡터 내로 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 담지하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 형성할 것이다; 이러한 신규한 벡터들 역시 본 발명의 일부이다. 본 발명의 이들 벡터들의 구축에 관한 상세는 형질전환 세포 및 미생물과 관련해서 이하에 후술하기로 한다. 벡터는 그 적용 목적 및 유형에 따라, 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니염색체 또는 바이러스 형태일 수 있지만, 특정 세포 중에서 잠재적으로만 발현되는 네이키드 DNA가 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터들은 자가복제할 수 있기 때문에, 후속 클로닝을 위한 높으느 수준의 발현 또는 높은 수준의 복제 목적을 위한 높은 카피수가 가능하다.
본 발명의 벡터의 일반적인 윤곽은 다음의 5'→3' 방향 및 작동가능한 결합의 다음 특성들을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편, 임의로 (세포외상 또는 적용가능한 경우 말초혈장내로) 분비될 수 있는 리더 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열. 또는 폴리펩타이드 단편의 막내로 통합, 본 발명의 핵산 단편 및 임의로, 터미네이터를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 추진하기 위한 프로모터. 프로듀서 균주 또는 세포주에서 발현 벡터를 이용하여 조작하는 경우, 형질전환된 세포의 유전적 안정성이라는 목적상, 숙주 세포 내로 도입된 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것이 바람직하다. 이와 대조적으로, 어떤 동물 중에서의 생체내 발현을 실시하기 위해 사용되는 벡터를 이용할 경우 (즉, DNA 예방접종에서 백신을 이용할 경우)에는, 보안상, 벡터가 숙제 세포 게놈 내로 통합될 수 없는 것이 바람직하다; 일반적으로, 네이키드 DNA나 또는 비통합성 바이러스 벡터가 사용되며 그의 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 벡터는 본 발명의 변형된 TNFα 폴리펩타이드를 생산하기 위해 숙주 세포를 형질전환시키는데 이용된다. 본 발명의 일부분이기도 한 이러한 형질전환 세포는, 본 발명의 핵산 단편과 벡터 제조에 사용되는 배양세포 또는 세포주일수 있으며, 또는 본 발명의 변형된 TNFα 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 이용될 수도 있다. 다른 한편, 형질전환된 세포들은, 변형된 TNFα를 세균막 또는 세균벽내로 분비 또는 통합시키도록, 핵산 단편 (단일 또는 복수개의 카피)이 삽입되어 있는 적절한 생백신 균주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환 세포는 박테리아 (예컨대 대장균종 [예컨대 E. coli), 바실러스종 (예컨대 바실러스 서브틸리스), 살모넬라종, 또는 미코박테리움 (바람직하게는 예컨대 M. bovis BCG와 같은 비병원성의 것), 효모 (예컨대 사카로마이세스 세레비지에), 및 원생동물과 같은 미생물이다. 또는, 형질전환된 세포는 곰팡이, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포와 같은 다세포 생물로부터 유래한 것일 수 있다. 가장 바람직한 것은 인간으로부터 유래된 세포이다. 세포주와 벡터에 관해서는 하기 내용 참조. 최근의 연구 결과, 본 발명의 TNFα 유사체를 재조합 생산하는데, 시판되는 드로조필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 세포주 (Invitrogen사가 시판하는 벡터계 및 Schneider 2 (S2) 세포주)가 매우 유망한 것으로 나타났으며, 따라서, 이 발현계가 특히 바람직하며, 따라서, 이러한 유형의 계도 일반적으로 본 발명의 바람직한 구체예이다.
클로닝 및/또는 최적화 발현 목적상, 형질전환된 세포가 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것인 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포들이 본 발명의 바람직한 유용한 구체예이다; 이들은 유사체의 소규모 또는 대규모 제조시 사용되며, 또는, 비병원성 세균의 경우 생백신에서 백신 성분으로서 사용된다.
본 발명의 유사체를 형질전환된 세포를 이용하여 생산할 경우, 필수적인 것은 아니지만, 발현 벡터를 배지 밖으로 추출하거나 형질전환된 세포 표면 상에서 수행하는 것이 간편한데, 이는 이들 두가지 옵션 모두가 발현 산물의 후속적 정제를 용이하게 해 주기 때문이다.
효과적인 프로듀서 세포가 동정된 경우, 그에 기초해서, 본 발명의 벡터를 담지하고, 변형된 TNFα를 코딩하는 핵산 단편을 발현하는 적절한 세포주를 수립하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이 안정한 세포주가 본 발명의 TNFα 유사체를 분비 또는 담지함으로써, 그의 정제를 용이하게 해주는 것이 좋다.
일반적으로, 숙주 세포와 공존가능한 종으로부터 유래된 조절 서열과 레플리콘을 함유하는 플라스미드 벡터를 그 숙주세포와 관련해서 사용한다. 벡터는 보통 복제 부위와, 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 가능케 하는 마커 서열을 지닌다. 예컨대, E. coli는 전형적으로는, E.coli종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다 (예컨대 Bolivar 등, 1977 참조). pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라시클린 내성 유전자를 함유하므로 형질전환된 세포들의 간편한 동정 수단을 제공한다. pBR 플라스미드 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파지는 또한 발현을 위해, 원핵 미생물에 의해 사용가능한 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형되어야 한다.
원핵 재조합 DNA 구축시 가장 흔하게 사용되는 프로모터로는 B-락타마제(페니실리나제) 및 락토스 프로모터 시스템 (Chang 외, 1989; Itakura 외, 1977; Goeddel 외, 1979) 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템 (Goeddel 외, 1979; EP-A-0 036 776)을 들 수 있다. 이들이 가장 널리 사용되기는 하지만, 다른 미생물 프로모터들도 발견 및 사용되어 왔으며, 그들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 상세는 이미 출판되어, 당업자들은 플라스미드 벡터에 이들을 기능적으로 접합시킬 수 있다 (Siebwenlist 외, 1980). 원핵생물로부터의 특정 유전자들은 그들 자신의 프로모터 서열로부터의 E.coli 내에서 효율적으로 발현되어, 인위적 수단으로 다른 프로모터를 부가시킬 필요가 없다.
가용성 TNFα 변이체는 본 발명자들에 의해, 저온에서 E. coli 중에서 비교적 쉽고 간편하게 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. E. coli의 발효를 위한 통상적인 방법은 보통 37℃ 부근의 온도 범위를 이용하는데, 본 발명자들은 32℃ 미만의 온도에서 발효시킴으로써 가용성 TNFα 변이체의 수율을 증가시킬 수 있음을 발견하였다 - 재조합 단백질의 총수율이 37℃ 부근에서 발효 후 더 낮긴 하지만, 가장 적합한 변이체의 수율은 훨씬 더 높으며, 불용성, 변성 단백질의 리폴딩이 필요치 않다.
요약하면, 본 발명의 통상적인 발효 프로세스는 형질전환된 세균을 발효조에 접종한 다음 발효시켜 충분량의 바이오매스를 얻은 다음 재조합 발현을 유발함으로써, 마지막으로 재조합 단백질을 수확하는 공정을 포함한다. 유도가능한 계를 이용하는 것이 필수적인 것은 아니지만, 보다 편리하다.
따라서, 본 발명의 중요한 측면은 세균, 특히 E. coli에서 본 발명의 TNFα 변이체를 재조합 생산하는 것에 관한 것으로, 여기서는 재조합 TNFα 유사체 생산 유도 후의 공정 (phase) 만큼은 32℃ 미만의 온도에서 수행한다. 그러나, 실시예 9는 모든 발효 (유도 전 및 유도 후)가 이러한 저온에서 수행될 경우 가용성 재조합 TNFα 유사체가 높은 수율로 얻어짐을 입증해준다.
2상 발효 중 어느 한가지에서 저온은 30℃ 미만, 예컨대, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20℃ 미만인 것이 좋다. 20 내지 30℃ 범위의 온도, 바람직하게는 22 내지 28℃의 온도가 좋고, 가장 바람직한 온도는 약 25℃이다. 실시예 9에 설명된 바와 같이, 이 온도에서 발효시킬 경우 가용성 TNFα 유사체가 100%에 가까운 수율로 얻어졌다.
본 발명자들은 본 발명의 가용성 TNFα 변이체의 저온 생산 조건이 일반적으로 면역원성 단백질의 가용성 변이체를 재조합 생산하는데도 적용가능하다고 믿고 있다 - 비록 이러한 발효에 의해 수득되는 총 단백질 수율은 예컨대 37℃ 발효에 의해 달성되는 수율보다 낮지만, 유용한 3차원 구조를 갖는 단백질의 최종 수율은 저온 조건을 이용할 경우 훨씬 더 높으며, 후속적인 리폴딩 공정에 소요되는 시간과 자원을 피할 수 있다는 것이 매우 중요하다. 또는, 요약하면, 변이체 단백질의 소망되는 입체 배열의 수율이 더 높다.
따라서, 본 발명자들은 전술한 저온 발효 조건을 이용하는 것은 단백질의 유용한 면역원성 변이체를 생산하는데 일반적으로 이용가능하다고 제안하는 바이다.
원핵생물에 더해, 진핵 미생물, 예컨대 효모 배양체 역시 사용가능하며, 그 프로모터도 발현을 추진시킬 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에나 흔한 빵효모는, 비록 다른 균주들도 시판되기는 하지만, 진핵 미생물 중 가장 널리 사용되는 것들이다. 사카로마이세스에서의 발현에는, 예컨대 플라스미드 YRp7이 흔히 사용된다 (Stinchcomb 외, 1979; Kingsman 외, 1979; Tschemper 외, 1980). 이 플라스미드는 예컨대 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1과 같이 트립토판에서 자라는 능력이 결여된 효모의 변이 균주들에 대헌 선별 마커를 제공해주는 trpl 유전자를 이미 함유한다 (Jones, 1977). 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 병터(lesion)이 존재하면 트립토판 부재시 성장에 의한 형질전환의 효과적인 검색 환경이 제공된다.
효모 벡터에서의 적절한 프로모팅 서열로는 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzman 외, 1980) 또는 기타 해당 효소 (Hess 외, 1968; Holland 외, 1978), 예컨대 에놀라제, 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 들 수 있다. 적절한 발현 플라스미드를 구축함에 있어서, 이들 유전자와 연관된 종결 서열들 역시 발현하고자 하는 서열의 발현벡터 3'에 접합되어 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 부가적인 장점을 갖는 다른 프로모터들은 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해효소, 및 상기한 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용에 책임이 있는 효소들에 관한 프로모터 대역이다. 효소-공존 프로모터, 복제원점 및 종결 서열을 함유하는 플라스미드 벡터이면 어느 것이든 적합하다.
미생물에 더해, 다세포 생명체로부터 유래된 세포 배양체도 숙주로서 이용가능하다. 기본적으로, 척추동물 배양체건 무척추동물 배양체건간에, 이러한 세포 배양체가 작동가능하면 관계없다. 그러나, 척추동물 세포가 특히 흥미로우며 배지 중에 척추동물을 증식시키는 것 (조직배양) 최근 일상적인 공정이 되었다 (Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293, 스포돕테라 프루기페르다(SF) 세포 (완전 발현 시스템으로서 Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. 및 Invitrogen사가 시판), 및 MDCK 세포주를 들 수 있다. 본 발명에서, 특히 바람직한 세포주는 Invitrogen사 (PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands)가 판매하는 S2이다.
이러한 세포에 대한 발현 벡터는 일반적으로 (필요한 경우) 복제 원점, 여하한 필요한 리보좀 결합 부위와 함께, 발현하고자 하는 유전자 전방에 위치하는 프로모터, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다.
포유동물 세포에서의 사용을 위해서는, 발현 벡터상의 조절 기능이 바이러스 물질에 의해 종종 제공된다. 예컨대, 흔히 이용되는 프로모터들이 폴리오마, Adenovirus 2로부터 유래하며, 가장 흔하게는 Simian Virus 40 (SV40) 또는 시토메갈로바이러스 (CMV)으로부터 유래한다. SV40 바이러스의 조기 및 말기 프로모터들은 두가지 모두, 복제의 SV40 바이러스 원점 역시 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 얻어지기 때문에 특히 유용하다 (Fiers 외, 1978). 바이러스 복제원점 중에 위치하는 BglI 부위를 향해 HindIII 부위로부터 뻗어있는 250 bp 서열이 포함된 경우에는, 이보다 크거나 작은 SV40 단편 역시 사용가능하다. 또한, 소망되는 유전자 서열과 일반적으로 연관이 있는 프로모터나 조절 서열이 숙주 세포계와 공존가능하다면, 이러한 조절 서열을 사용하는 것이 가능하며 때로는 바람직하기도 하다.
복제 원점은 예컨대 SV40 또는 기타 바이러스 (예컨대, 폴리오마, Adeno, VSV, BPV)로부터 유래하는 것과 같이, 벡터로 하여금 외인성 원점을 포함하도록 만들거나, 또는 숙주 세포염색체 목제 메카니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다면, 후자가 종종 충분하다.
도 1은 TNFα 단백질의 E.coli 생산의 상류 프로세싱을 입증해주는 플로우 차트이다. 도시된 작업 흐름도는 본 발명의 TNFα 변이체의 재조합 생산시 여러가지 발효 조건의 상대적인 효율을 평가하는데 사용된다.
실시예 1
TNFα 변이체의 제조
야생형인 사람의 TNFα 모노머 폴리펩타이드 (SEQ ID NO: 10)을 코딩하는 합성 DNA 서열 "SMTNFWT3" (SEQ ID NO: 9)를 Entelechon GmbH로부터 접합 산물 (ligation product)로서 받았다. 사람의 hTNFα의 DNA 서열을 E. coli에서 10% 미만의 빈도를 갖는 모든 코돈들을 배제시킴으로써 Codon Usage Database에 따라 E. coli에서 발현하는데 최적화시켰다. 또한, 후속적인 클로닝 단계를 위해 5' NCoI 제한 자리를 포함하도록 이 서열을 설계하였다.
SMTNFWT3 접합 산물을 pCR 4 TOPO 블런트 벡터에 도입하여 E. coli DH10B 세포를 형질전환시켰다. 결과적인 SMTNFWT3TOPO 클론들중 10개로부터의 플라스미드 DNA를 정제하여 예상 단편 (제한효소 (RE: Restriction Enzyme 절단에 의해 분석할 경우)을 함유하는 5개 클론을 선별하였다.
5개의 잠재적으로 정확한 SMTNFWT3TOPO 클론으로부터의 NcoI/EcoRI DNA 단편들을 분리하여 pET28b (+) 벡터에 넣고 서열을 결정하였다. 4개의 클론에서는 삽입, 결실 또는 치환이 동정되니 반면 하나의 클론은 정확한 것으로 나타났다. 이어서 이 정확한 구조물 - SMTNFWT3pET28을 모든 단일 TNFα 변이체의 생산시 주형으로서 사용하였다.
실시예 2
TNFα 제작
PanDR 에피토프 아미노산 서열 (SEQ ID NOs: 6 및 8)을 E. coli에서의 발현 에 최적화되도록 수동으로 DNA 서열 (SEQ ID NO: 7)로 "역번역 (reverse translated)"시키고 (하기 내용 참조), SOE PCR에 의해 TNFα의 루프 3에 삽입시켰다.
결과적인 구조물 (WO 03/042244의 SEQ ID NO: 19를 코딩하는 DNA 서열)을 pET28b+ 벡터에 위치시켜 TNF34-pET28b+를 만들었다.
실시예 3
모노머화된 트라이머 제작
모노머화된 트라이머 구조물은 tri-글라이신 링커 및/또는 에피토프-코딩 대역에 의해 분리된 3개의 TNFα 코딩 대역에 기초한다.
TNFα 유전자를 세가지 분리된 독립체로서 합성하였다. 이들 세가지 단편들을 SOE PCR에 의해 조립하고, 조립된 유전자 (WO 03/042244에서 SEQ ID NO: 21)를 pCR2.1-TOPO 내로 클로닝시켰다. 서열 동정 후, 정확한 클론을 분리하였다. ThehTNFT_0 유전자 (TNFα-GlyGlyGly-TNFα-GlyGlyGly-TNFα를 코딩하는 WO 03/042244의 SEQ ID NO: 21, WO 03/042244의 SEQ ID NO: 22, 즉, 두개의 tri-글라이신 링커에 의해 분리된 SEQ ID NO: 17 카피 3개)를 pET28b+에 전달하여 hTNFT_0-pET28b+을 생산하였다. 정확한 클론을 분리하고, 서열을 결정한 다음 E. coli 세포주 BL21-STAR, BL21-GOLD 및 HMS174내로 형질전환시켰다.
SOE PCR를 이용하여 다음의 네가지 모노머화 트라이머를 제조하는데 hTNFT0_pET28b+를 주형으로서 사용하였다: hTNFT_1, hTNFT_2, hTNFT_3 및 hTNFT_4 (WO 03/042244의 SEQ ID NOs: 49, 51, 57, 및 59). 부가적인 변이체 (WO 03/042244 에서 SEQ ID NO: 53)도 유사한 방식으로 제조할 수 있다.
hTNFT_1, hTNFT_2 및 hTNFT_3은 SOE PCR을 2차례 수행하여 조립할 필요가 있는 파상풍 독소 에피토프 P2 및 P30 (각각 SEQ ID NOs: 2 및 4)를 포함하는 변이체이다. hTNFT_4는 PADRE (SEQ ID NO: 6) 삽입물을 갖는 변이체로서 SOE PCR을 일회 수행함으로써 조립가능하다. 부가적인 변이체 (WO 03/042244의 SEQ ID NO: 55)도 유사한 방식으로 제조가능하다.
hTNFT_4를 전술한 방법으로 제조하자 TOP 10개 세포에서 hTNFT_4- pET28b+의 정확한 클론이 발견되었으며 이 구조물을 BL21-STAR 및 HMS174 세포에 전달하였다.
TNFT_1, hTNFT_2 및 hTNFT_3을 생산하기 위해, 에피토프들을 SOE PCR에 의해 트라이머의 매우 적은 단편에 삽입하고, RE 절단 및 접합에 의해 이를 hTNFT_0-pET28b+ 내로 삽입하였다.
실시예 4
TNF34 돌연변이의 안정화
전술한 TNF34-pET28b+ 변이체를 더욱 안정화시키기 위해, 부가적인 디설파이드 다리의 도입 및 결실을 함유하는 변이체들을 제작하였다. 3가지 상이한 변이체들이 제작되었다:
TNF34-A-pET28b+는 치환 Q67C 및 A111C를, TNF34-B-pET28b+는 A96C 및 I118C를, 그리고 N 말단의 대부분의 8개 아미노산이 결실된 TNF34-C-pET28b+를 함유한다 - 발현 산물의 아미노산 서열은 WO 03/042244의 SEQ ID NOs: 20,30, 및 31에 제시 되어 있다.
이들 3가지 구조물 모두를 SOE PCR을 이용하여 만들고, BL21-STAR, BL21-GOLD 및 HMS174에서 클로닝시킨 다음 서열을 동정하였다.
실시예 5
유연한 루프 변이체
TNF34-pET28b+ 변이체에 비해 향상된 특징을 나타낼 수 있는 변이체를 찾기 위하여, PADRE 삽입물 (SEQ ID NO: 6)을 TNFα 분자의 유연한 루프 3 근방으로 옮김 구조물을 제조하였다.
이들 모두, 즉: TNF35-pET28b+, TNF36-pET28b+, TNF37-pET28b+, TNF38-pET28b+, TNF39-pET28b+ 및, 분자의 C 말단에 위치된 PADRE를 갖는 변이체; TNFC2- pET28b+를 SOE PCR을 이용하여 제조하고, BL21-STAR, BL21-GOLD 및 HMS174에 클로닝시킨 다음, 서열을 동정하였다. 발현 산물의 아미노산 서열은 WO 03/042244의 SEQ ID NOs: 23, 24, 24, 26, 27 및 28에 제시되어 있다.
발현계로서 곤충 세포를 이용할 수 있는지를 평가하기 위하여, TNFWT, TNF34, TNF35, TNF36, TNF37, TNF38, TNF39 및 TNFC2를 p2Zop2f 벡터 (PCT/DKI02/00764의 도 1 참조)에 옮겨, S2 곤충 세포에서 발현시켰다.
실시예 6
기타 구조물
부가적인 TNFα 변이체를 다수 제조하고, 모두 TNFX로 명명하였다 (상기 참조). 이들 변이체를 코딩하는 DNA를 SOE PCR로 제작하고 곧바로 pET28b+로 클로닝 시켰다.
정확한 TNFX 클론을 BL21-STAR 및 HMS174에 형질전환시킨 다음 서열을 동정하였다.
실시예 7
주변세포질 발현 (periplasmic expression)
LTB 리더 서열을 TNF34-pET28b+에서 WO03/042244의 SEQ ID NO: 16 바로 상류에 부가하여, 주변세포질 공간으로 발현을 표적화시켰다.
실시예 8
포유동물 발현
포유동물 세포에서의 발현을 테스트하기 위하여 WO 03/042244의 SEQ ID NO: 16과 TNF34를 코딩하는 DNA를 시판되는 pCI 벡터 (Promega Corporation)의 변이체인 pHP1 벡터에 넣었다. pHP1은 pCI의 AmpR 유전자 대신 마커로서 카나마이신 내성 유전자를 포함한다.
실시예 9
E. coli로부터의 가용성 단백질의 최적화 생산
서론
TNFα와 그의 변이체의 초기 발현으로는 E. coli 세포로부터 발현시킬 경우 가용성 단백질이 매우 제한된 양으로만 결과되었는데, 이 태스크는 TNFα 변이체의 발현 수준과 용해도를 크게 개선시켜 신속하고 간편한 단백질 발현계를 확고히 하기 위한 것이었다.
접근 방법
진탕 플라스크에 초기 실험재료를 넣고 과거의 경험을 이용하여 발효조로 작업하였다. 3개의 발효조를 한번에 가동시키고, 세포 성장, TNFα 생산 및 분해 수준을 분석하기 위해 발효 중에 샘플을 채취하였다.
목적
이 연구의 목적은 정의된 성장 배지 중에서 HMS174 E. coli에서 발현시킬 경우 면역원성 TNFα 변이체의 발현을 위한 최적 성장 조건을 정의하는데 있었다.
재료 및 방법
원료
정의된 최소 배지에 대한 발효용 출발 물질:
Figure 112005064547533-PCT00010
Figure 112005064547533-PCT00011
배지 및 완충액 조성물
주 배양배지 (main culture medium)의 제조
Figure 112005064547533-PCT00012
Figure 112005064547533-PCT00013
아이템 1-8을 탈이온수 중 최종 부피가 약 50%가 되도록 정해진 순서대로 용해시킨 다음 완전히 용해될 때까지 잘 혼합하였다. 이어서 최종 부피(오토클라빙 후에 첨가된 부피를 뺀다)가 되도록 부피를 조정하고 발효조에 넣은다음 오토클라브시켜 멸균한다.
아이템 9-11을 혼합하고 냉각 발효조 (37℃)에 무균적으로 넣는다. pH를 7로 조정한다.
전 배양배지 (pre culture medidum)의 제조
Figure 112005064547533-PCT00014
Figure 112005064547533-PCT00015
스톡 용액, 아이템 1-9을 소망되는 부피로 1L 측정 플라스크에 넣는다. RO수를 955 mL까지 첨가한다. 필요한 경우 pH를 측정하여 pH 7.0으로 조정한다. 용액을 교반하고 이를 각각 238 ml씩 1000 ml들이 진탕 플라스크 4개에 옮겼다. 오토클라브 처리한 후, 오토클라브 처리할 수 없는 성분들인 아이템 10-12를 진탕 플라스크에 무균적으로 첨가한다.
미량 염 용액의 제조
스캐닝 10 (JHM)
성분들을 약 20% 최종 부피로 혼합하였다. 산성화된 (pH=1) RO수를 1000 ml까지 첨가한다. 이 용액을 모든 염들이 용해될 때까지 교반한다. 이 용액을 1L 들이 블루캡 보틀에 넣고 오토클라브 처리한다.
황산제일철 (ferro sulfate) 용액의 제조
아이템 성분 양 (g/L)
1 FeSO4, 2H2O 7.5
2 구연산나트륨, 2H2O 100
염화제일철 용액의 제조
아이템 성분 양 (g/L)
1 FeCl3, 6H2O 7.5
2 구연산나트륨, 2H2O 100
장비
발효조
아이템 유형 총 용량 (L) 작업 용량 (L) 제조업체 공급업체 Cat. No.
발효조 시스템 LabFors 2 0.5-1.6 InFors Buch & Holm -
작업 용량이 각각 0.5-1.6L인 2L 발효조 6개와 데이타 수집 및 가공을 위한 소프트웨어가 장착된 컴퓨터에 연결된 마스터 컨트롤링 유닛 (Master Controlling Unit)으로 구성된 InFors Labfors 발효조 시스템.
방법
발현된 가용성 단백질의 백분율을 평가하기 위한 초기 실험을 풍부한 배지 w/60μ/ml 카나마이신 중 약 200 rpm/분으로 진탕중인 인큐베이터에서 250 ml 진탕 플라스크에서 수행하였다.
HMS174 세포주와 BL21 Star 세포주 모두에서의 TNFα 단백질 발현을 웨스턴 블롯 및 쿠마씨 염색 SDS PAGE에 의해 평가하였다. 세포를 용해시켜, 원심분리 단계 (20,000 x g, 10분간) 전 및 후의 상등액으로부터 샘플을 제거함으로써 총 TNFα 발현 및 가용성 TNFα 발현을 평가하였다. 가용성 TNFα의 백분율은 웨스턴 블롯을 "눈으로 대략 검사 (eyeballing)" 함으로써 평가하였다.
상이한 온도 조합을 시험하였다; 대부분, 바이오매스를 37℃에서 생산하고 이어서 유도시킨 다음, 25℃ (37/25) 또는 37℃ (37/37)의 발효 온도를 시험하였다.
TNF37 (A145R) (SEQ ID NO: 13)을 발현을 위한 모델 변이체로서 선택한 다음 정의된 배지, 진탕 플라스크에서 37/25℃ 조합을 이용하여 테스트하였다.
연구용 세포 은행의 제작
예열시킨 225 ml의 YEM을 함유하는 37℃ 1L 배플시킨 진탕 플라스크에 60 ㎍/ml 카나마이신이 함유된 효모 배지 (YEM) 중 250 ml ON 배지 25 ml를 접종시킨 다음 200 rpm에서 3½ 시간 동안 37℃에서 배양시킴으로써, 60 ㎍/ml 카나마이신이 함유된 효모 배지 (YEM) 중에, TNF37 (A145R)의 연구용 세포 은행 (RCB: Research cell bank)을 수립하였다. 대수 성장기 세포 배양체 60 ml과 86% 글리세롤 140 ml를 혼합한 다음 1 ml씩 분주함으로써 동일한 글리세롤 동결 스톡을 제조하였다. 이들 분주액을 -80℃에서 보관하고 단일 분주액을 이용하여 발효 전에 예비 배양하는데 이용하였다.
RCB의 품질을 측정하기 위하여, 전 배양 배지 w/60 ㎍/ml 카나마이신 250 ml를 함유하는 3개의 전 배양용 플라스크에 RCB 분주액을 각각 접종하고 OD 600에서 검사하였다.
배양체들은 OD600이 ~ 3.2에 도달할 때까지인 접종 후 11시간 까지는 동일한 거동을 보였다. 다음의 모든 실험에서, 전술하 조건 하에서 11시간 배양된 예비 배양체 50 ml를 1L 발효조에 접종하는 것으로 하였다.
발효조 조건의 최적화
최적의 발효 조건을 결정하기 위하여, 샘플들을 Inforss 발효조 중의 배양 배지로부터 수거하여 분광광도계로 OD600을 측정하고, TNF 발현 수준을 정량적인 TNF 특이적인 ELISA를 이용하여 측정한다음, TNF 분해를 웨스턴 블로팅에 의해 측정하였다.
여러가지 온도 조건, 25℃/25℃, 25℃/25℃/16℃, 37℃/25℃ 및 37℃/37℃에서 발효시험을 수행하였다.
OD600 및 TNF 발현을 다수 샘플에서 시험하고, TNF 발현과 관련한 소수의 대표적인 샘플들을 웨스턴 블롯에 의해 부가적으로 분석하여 분해를 측정하였다.
개략적 프레젠테이션
일반 공정 변수:
변수 세트 포인트 범위 알람 리미트
pH 7.0 6.5-7.5 < 6.4 - > 7.6
DO2 장력 30% 0-100% 4시간 넘게 100%
교반막대 속도 1000 RPM 1000-1500
특정 공정 변수
OD600 전배양 온도(℃) 바이오매스 산물 시간(h) 바이오매스 산물 유도시 OD600 IPTG농도 mM 발현 온도(℃) 발현 시간(h) 수확시 OD600 최대수율 mg TNF/L
2-6 37 10 10-20 1 37 4-5 30-40 10-20
2-6 37 10 10-20 1 25 24 10-30 50-100
2-6 25 24-36 5-10 1 25 24-36 10-30 150-200
2-6 25 24-36 5-10 1 25/16 24-36 10-30 150-200
IPTG 농도는 1 mM였고 유도시 온도는 37/37℃와 25/25℃ 공정을 제외하고 37℃에서 25℃로 저하시켰다. 총 발효 시간은 증식, 유도 및 단백질 생성을 포함하 여, 37/37℃ 공정의 경우 14 내지 18시간이었고 25/25℃ 공정과 37/25℃ 공정의 경우에는 61 시간 이하였다. 총 발효 시간은 배양체의 성장에 의존한다. 발효조 중의 OD600startsms은 접종 배양체 중의 OD로부터 환산하면 0.1 내지 0.3 (전 배양체에서는 2-6)이었다. 유도, 37/25℃ 공정은 OD600 = 20 ± 1-2 또는 접종 후 9 내지 11 시간이었다. 단백질 생산은 20-24시간 동안 일어났다. 25/25℃ 공정에서의 유도는 OD600 = 10 ± 1-2 또는 접종 후 22-24시간에 수행되었다. 단백질 생산은 24-36시간 동안 일어났다.
TNFα 변이체 발현
TNF 발현 수준을 2 x 1 ml 샘플을 취하여 -20℃에서 보관함으로써 수행하였다. 샘플을 얼음에서 해동시킨 다음 3 x 30 초 동안 초음파처리하고, 샘플의 가열이 방지되도록 적어도 30초동안은 얼음 상에서 행하였다. 샘플을 20,000 x g에서 10분간 원심분리하고 상등액을 TNFα 정량 ELISA를 이용하여 TNFα 함량에 대해 테스트하였다.
이 프로세스의 일반적인 개관을 도 1에 흐름도로 표시하였다.
결과 및 토론
이 연구에서 수행된 실험결과 진탕 플라스크와 발효조 두가지 모두에서 25℃에서 발효시키자 가용성 TNF가 유의적으로 증가된 것으로 나타났다.
진탕 플라스크 실험
100 ml 풍부한 배지에 37℃에서 생육된 5 ml ON 배양체를 접종하였다. 배양 체가 OD600에 도달하면 배양체를 1 mM IPTG로 유도시켰다. 이와 동시에, 37℃에서 생육시킨 배양체를 37℃에서 또는 25℃로 저하시켜 유지시키고 이들을 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 수확하고 용해시켜 TNFα 변이체의 총 발현 및 가용성 발현에 대하여 분석하였다.
그 결과 유도 시점에서의 37℃로부터 25℃로의 온도 천이는 가용성 TNFα의 발현량에 유의적으로 긍정적인 효과를 미치는 것으로 밝혀졌는데, 이에 따라, 다음의 실험에서 이 온도 천이를 유지시키도록 결정되었다.
선별된 변이체
모든 변이체들은 상기한 바와 같이 테스트하자, TNF34, TNF34A, TNF37, TNFX5.1, TNFX2.1 및 TNF_T2가 추가의 연구 조사에 충분히 높은 정도로 발현되는 것으로 선별되었다.
전술한 구조물의 해독 버젼이 입수가능한 경우, 이들 변이체들의 발현을 테스트하자 그 결과는 비해독화 (non-detoxified) 버젼에 필적할만한 발현 수준을 나타내었다.
발효조에서의 발현
정의된 배지 중 TNFα 변이체 발현을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 진탕 플라스크에서 몇가지 전술한 것과 동일한 조건 (37℃/25℃)를 이용하여 초기 실험을 수행하였다. 밤새 유도된 배양 결과 TNFα 변이체가 만족할 만한 수준으로 발현된 것으로 나타났으며, 이에 따라 본 발명자들은 발효조에서의 발현을 TNFα 변 이체 발현량을 최적화시키도록 테스트하기로 결정하고, 발현된 변이체 중에서 여전히 관찰된 변이체의 분해를 최소화하기 위한 시도도 하기로 하였다.
세포 성장
연구용 세포 은행을 전술한 바와 같이 만들고, 본 발명자들은 이 전배양체를 이용하여 OD600 ~ 3-4에서 예비 배양체 50 ml를 1L 발효조에 접종하였다. 발효조를 소정 온도 (37℃ 또는 25℃)로 예열시켜 온도 충격을 최소화시켰다. 37℃ 발효조의 경우, 세포들은 지체기 (lag-phase) 없이 대수 성장을 지속하였다. 37℃ 전배양체를 25℃ 발효조에 접종한 경우, 세포들의 지체기는 대수기 성장을 개시하기 전 느린 속도로 약 17 시간이었다. 이것은 이 경우에 처해지는 세포들의 온도 충격의 결과인 것으로 기대된다.
유도 직전에 37℃ 배양체를 25℃로 천이시킨 경우 동일한 지체기가 관찰되었다. 37℃에서 25℃로 한시간에 걸쳐 (2℃/10분) 온도를 서서히 천이시키려는 시도는 지체기를 감소시키지 않았다.
TNFα 변이체 발현 수준
발현 수준을 TNFα 특이적 정량 ELISA에 의해 측정하였다.
가장 높은 발현 수준은 25/25℃ 공정에서 관찰되며, 약 250 mg/l의 수준이 얻어졌다. 이 실험은 여전히 단일 입증방식이고, 유도 후 15 시 내지 35시 사이의 시간 역시 분석 대상이다.
36/37℃ 프로세스는 약 15 mg/l의 양으로 가용성 TNFα 변이체를 매우 한정 된 양으로 생산한 반면 37/25℃ 공정은 100 mg/l 근방에서 피크를 나타내었다.
결론
총 100회를 초과하는 결과에 기초할 때, 가용성 TNFα 변이체 단백질 생성을 ㅜ이한 상류 프로세스 (총 6회로부터)를 선별하였다. 잘 정의된 최소 배지에서 발효시켰다 (하기 설명 참조). 선택된 발효 프로세스는 4가지 서로 다른 온도 조합이 테스트된 온도 연구에 기초한 것이었다. 테스트된 TNFα 변이체는 E. coli 세포주 HMS174 중 TNF37-145였다.
유도전 및 유도후 모두를 25℃에서 한 경우 최적의 결과가 얻어졌다. 최적 수확 시간은 측정하지 않았다.
실시예 10
선별 분석
KD-4 및 Wehi 세포를 이용한 세포독성 분석과 폴리클로날 ELISA와 직접 수용체 ELISA를 퍼스트 라인 분석으로서 이용하여 스크리닝한 다음 정제하였다. TNFα 변이체에 대해 생산된 항체들을 이용하여 수용체와 세포독성 분석 모두에서 wtTNFα 결합 을 억제하는데 사용하고 항체 품질을 측정하였다.
실시예 11
정제 공정
이 실시예에서는, TNFα 변이체 (TNF37) 중 하나를 재조합 생산 및 후속 정제하는 것을 상세히 설명한다. 그러나, 이 정제 공정은 본 발명에서 선호되는 것으로 본 발명의 다른 TNFα 변이체에 대해서도 적용가능하다 (각 변이체마다 조금씩 알맞은 변형을 가하여).
그러나, 현재 본 발명자들은 TNFα 변이체의 대규모 발혀에 특히 적합한 개선된 정제 개략반응에 대해 연구하고 있다. 기본적으로, 후술되는 것과 동일한 개별적인 공정들이 이용되지만, 그 순서는 SP-세파로스 및 Q-세파로스 크로마토그래피 공정 후, 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용한 정제를 종료하도록 역전된다.
LB-카나마이신 플레이트 (60 mg 카나마이신/1.5% 한천을 함유하는 LB 1L)로부터의 E. coli 균주 BL21 STAR/TNF37 콜로니를 5 ml LB- 배지 (60 mg 카나마이신/ L LB)에 재현탁시키고 37℃에서 밤새 (16시간) 생육시키는 한편 New Braunswick 진탕기 중에서 220 RPM으로 진탕시킨다.
이 배양액 2x2 ml를 2L 배플된 진탕 플라스크 중 2 2x1 L LB (60 mg 카나마이신/L)에 옮기고 세포를 220 RPM으로 New Braunswick 진탕기 중, OD436 = 0.6-0.8이 될 때까지 생육시킨다. 이 공정을 예시적으로 37℃ 및 25℃에서 수행하지만, 온도는 각각의 배양체마다 달리 최적화시키는 것이 가능하다.
1 ml의 1 M IPTG를 각 플라스크에 첨가하고 세포를 16-20 시간동안 정치 생장시킨다. 유도 전, 이미 발효 온도가 아니면, 온도를 25℃로 조정한다.
Sorvall 원심분리기 중 SLA-3000 헤드를 이용하여 세포들을 5000 RPM에서 15분간 원심분리시킴으로써 세포들을 원심분리 튜브 (500 ml)에서 수확한다.
0.9% NaCl을 이용하여 세포들을 500 ml 칭량전 (pre-weight) 원심분리 튜브 에 옮기고 전과 같이 원심분리하여 세포를 수확한다.
상등액을 폐기하고 튜브를 칭량하여 세포 중량을 측정한다 (7-11 그램일 것임).
200 ml의 50 mM Na2HPO4, pH=7.0을 첨가한다 (세포가 재현탁되면 이들을 직접 사용하여야 하고, 그렇지 않으면 동결시킬 수 있다).
세포 파열, 원심분리 및 여과
세포의 기계적 파열은 다음의 정제 공정들에서 필요한 여하한 완충액을 선별할 수 있는 능력, 효율 및 신뢰도 측면에서 효소 파괴에 비해 몇가지 장점을 갖는다. 사용전 샘플 챔버에 냉수를 첨가하고, 두개의 샘플 통로 사이에 기계를 통해 냉수를 흘려서 공정 내내 APV-1000을 차갑게 유지시킨다. 원심분리 및 여과하여 단백질을 크로마토그래피 분리하기에 앞서 용액으로부터 모든 입자나 응집체를 제거한다. 세포 파괴 및 HA-크로마토그래피는 같은날 수행하여야 하는데 이는 이렇게 하여야 크로마토그래피 공정 중 이들로부터의 분리 결과 뚜렷한 프로테아제 활성을 최소화해주기 때문이다. 파열, 원심분리 및 여과 공정은 다음과 같다:
조심스럽게 재현탁시킨 세포 재료를 세포-파열기 (APV-1000)에 넣는다. 700바아의 배경압력을 이용하여 파열기를 통해 (매 통과 사이에 APV-1000을 통해 냉수를 흘려주고 각각의 통과후 얼음 냉각시킴) 세포 현탁액을 조심스럽게 2회 (2x) 통과시킨다 (용액은 이 시점에서 깨끗하여야 함)
파열된 세포를 500 ml 원심분리 튜브에 옮기고 세포를 45분간 SLA-3000 헤드 를 이용하여 Sorvall 원심분리기 중 10000 RPM에서 원심분리시킨다.
추출물 (약 225 ml)을 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시킨다.
히드록시아파타이트 (HA) 크로마토그래피
히드록시아파타이트 Bio-Gel HTP Gel (BIO-RAD; 카탈로그 # 130-0420)는 다른 방법으로는 분리될 수 없는, 모노클로날 항체 및 기타 단백질과 같은 단백질의 분리시 독특한 도구인 것으로 그 자체로 입증된 인산칼슘의 결정형태이다. 그러나, 본 발명자들의 경험상 이 물질의 유동 특성은 유속이 2 ml/분보다 높으면 허용불가능한 높은 수준으로 압력을 증가시킨다는 중대한 문제점이 있다. 이 물질은 또한 제조업체가 권장한 바와 같이 수산화나트륨을 이용하여 재생시키려 하자, 수차례 부서지기도 하였다.
완충액 및 컬럼
완충액 A + B용 스톡: 1 M Na2HPO4 x 2H2O, pH = 7.0 (HCl을 이용하여 pH7로 조정). 완충액 A+B 는 스톡을 희석하여 만듬.
완충액 A: 50 mM Na2HP04 x 2H20, pH = 7.0
완충액 B: 0.3 M Na2HPO4 x 2H2O, pH = 7.0
완충액 A와 XK 26/40 (Amersham Biosciences) 컬럼 중의 현탁액을 이용하여 히드록시아파타이트 Bio-Gel HTP Gel (BIO-RAD; 카탈로그 # 130-0420)로 약 50-60 ml 컬럼 충전함.
크로마토그래피 프로그램
퍼지 시스템: 30 ml/분의 유속에서 20 ml
평형: 2 ml/분의 유속에서 완충액 A 4 CV
2 ml/분의 유속에서 펌프를 통하여 샘플을 로딩 (BioCad 상의 입구 F) (튜빙 내의 샘플이 필요로 된다면, 약 225+5-10 ml).
2 ml/분의 유속으로 완충액 A 1.5 CV로 컬럼 세척
용출: 2 ml/분의 유속에서 1% 내지 100% 완충액으로부터 4 CV의 구배로 단백질을 용출시킴.
2 ml/분의 유속으로 완충액 B 2 CV로 컬럼 세정.
2 ml/분의 유속으로 완충액 A 4 CV로 재평형시킴.
15배 용량의 20 mM Tris-HCl, 0.075 M NaCl, pH 8.0에 대하여 4℃에서 분획을 선별, 수집 및 투석 ON한다.
HA 크로마토그래피 후 TNF37-함유 분획의 선별
HA 크로마토그래피 용출 분획 프로파일은 기본적으로 "런 쓰루 (run through)" 분획과 여러개의 피크로 나뉠 수 있는 하나의 용출 피크로 구성된다. TNF37을 함유하는 피크는 직접 동정할 수 없기 때문에, 피크 전체의 젤을 쿠마씨 염색하는 것을 기초로 하여 TNF37을 함유하는 분획을 선별해야 한다. 그러나, 후속 정제 공정 결과, 이 시점에서의 분획 선별은 덜 임계적이고 이 공정에서 후에 오염물질을 제거할 수 있다. 따라서, 분획들의 덜 보존적인 선별은 변이체의 최대 수율을 확고히 해준다.
우선 "런 쓰루"를 여하한 TNF37에 대한 "도트 블롯"에 의해 체크하였다. 이 것은 이론상 변이체의 유의적인 부분이 컬럼에 결합하지 않았음을 가리키는 것이라는 긍정적인 결과를 부여하였다. 그러나, "런 쓰루"를 매우 효율적인 SP-세파로스 양이온 교환 크로마토그래피 (다음 단계 참조) 처리하고 분획을 쿠마씨 염색된 젤을 이용하여 측정하자, 이들은 검출가능한 TNF37-변이체를 전혀 함유하지 않았는데, 이는 "도트 블롯"에서 몇가지 거짓 양성 반응이 있음을 가리키거나 SP-세파로스와 분획을 시사하는
SP-세파로스 양이온 교환 크로마토그래피
SP-세파로스는 wtTNFα pI가 7.8인 것에 비해 변이체의 pI가 9.4로 환산된 비교적 높은 결과로서 선택된 베이직 양이온 교환 공정이다. pI의 이러한 증가는 PADRE 에피토프를 경유하여 도입된 2개의 라이신의 결과이다. 이 크로마토그래피는 매우 효과적이며 TNF37 변이체에 대해 신속하고 TNFα의 다른 루프 변이체 다수에 대해 유용할 것으로 기대된다.
본 발명자들의 경험상 변이는 때때로 단백질의 결합 특성을 다르게 만들기 때문에 SP-세파로스 크로카토그래피를 이용하여 지속시키기 전에, 적용되는 샘플의 pH는 적어도 7.7로 하고 전도도는 8 mS/cm 미만이어야 한다.
완충액 및 컬럼
완충액 A + B용 스톡: 1M Tris-HCl, pH = 8.0.
완충액 A: 20 mM Tris-HCl, 0.075 M NaCl, pH = 8.0.
완충액 B: 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 8.0.
완충액 A와 XK 26/40 (Amersham Biosciences) 컬럼 중의 현탁액을 이용하여 SP-세파로스 FF (Amersham Biosciences: 카탈로그 # 17-0729-01)을 이용하여 60 ml 컬럼 충전함.
크로마토그래피 프로그램
퍼지 시스템: 30 ml/분의 유속에서 20 ml
평형: 4 ml/분의 유속에서 완충액 A 4 CV
4 ml/분의 유속에서 펌프를 통하여 샘플을 로딩 (BioCad 상의 입구 F) (튜빙 내의 샘플이 필요로 된다면, 샘플 + 10 ml)
4ml/분의 유속으로 완충액 A 1.5 CV로 컬럼 세척
용출: 4ml/분의 유속에서 0 내지 100% 완충액으로부터 4 CV의 구배로 단백질을 용출시킴.
4 ml/분의 유속으로 완충액 B 2 CV로 컬럼 세정.
4 ml/분의 유속으로 완충액 A 4 CV로 재평형시킴.
15배 용량의 20 mM Tris-HCl, 0.075 M NaCl, pH 8.0에 대하여 4℃에서 분획을 선별, 수집 및 투석 ON한다.
SP 세파로스 크로마토그래피 후 분획을 함유하는 TNF37의 선별
이 프로파일은 기본적으로 "런 쓰루" 분획 및 몇가지 단백질 함유 피크로 구성된다. 그러나 두개의 피크가 오염된 변이체를 함유한다. 이 시점에서는 피크 2의 오른쪽에 많은 분획을 포함하지 않게 하는 것이 중요한데, 이는 본 발명자들의 경험상 이것이 오염물질을 너무 많이 포함해서 후속 크로마토그래피 공정에서 쉽게 제거되지 않기 때문이다.
Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피
Q-세파로스는 HA-크로마토그래피 및 SP-세파로스를 비롯한 TNF37의 정제에 이어지는 높은 재생도로 주요 오염물질 단백질을 제거하도록 선택된 베이직 음이온 교환 공정이다. TNF37 변이체 자신은 컬럼에 결합하지 않지만 미지의 주요 오염물질을 결합한다. 그러나, SP-세파로스 공정에서 이미 보존적인 방식으로 분획을 선택하는 것이 가능한데 이러한 방식으로 오염물질을 회피한다. 그러나, 이것은 Q-세파로스를 공정에 사용할 때에 비해 TNF37 변이체의 수율을 저하시키며 다른 마이너한 오염물질도 이 공정에서 제거되므로, 전체 공정 중에 이를 포함시키는 것이 바람직하다. 결론적으로 Q-세파로스 공정은 변ㅇ체 37의 정제에 중요하며 높은 수율로 심지어 도 우수한 최종 생성물을 부여해준다.
완충액 및 컬럼
완충액 A + B용 스톡: 1M Tris-HCl, pH = 8.0.
완충액 A: 20 mM Tris-HCl, 0.075 M NaCl, pH = 8.0.
완충액 B: 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 8.0.
완충액 A와 XK 26/40 (Amersham Biosciences) 컬럼 중의 현탁액을 이용하여 Q-세파로스 FF (Amersham Biosciences: 카탈로그 # 17-0510-01)을 이용하여 50-60 ml 컬럼 충전함.
크로마토그래피 프로그램
퍼지 시스템: 30 ml/분의 유속에서 20 ml
평형: 4 ml/분의 유속에서 완충액 A 4 CV
2 ml/분의 유속에서 펌프를 통하여 샘플을 로딩 (BioCad 상의 입구 F) (튜빙 내의 샘플이 필요로 된다면, 샘플 + 10 ml)
4ml/분의 유속으로 완충액 A 3 CV로 컬럼 세척
용출: 4ml/분의 유속에서 100% 완충액으로부터 2 CV의 구배로 잔여 단백질을 용출시킴.
4 ml/분의 유속으로 완충액 B 4 CV로 컬럼 세정.
4 ml/분의 유속으로 완충액 A 4 CV로 재평형시킴.
분획을 선별, 수집하여 SP-세파로스 컬럼에 직접 적용시킨다.
실시예 12
면역화 연구
재료:
식염수 (멸균수 중 0.9% NaCl, Fresenius Kabi Norge AS, Norway)
완전 프로인드 애쥬번트 (Sigma, F-5881, 39H8926)
불완전 프로인드 애쥬번트 (Sigma, F-5506, 60K8937)
Alhydrogel 2% [10 mg Al/ml] (Brenntag Biosector, Batch 96 (3176))
Adjuphos [5 mg Al/ml] (Brenntag Biosector, Batch 2 (8937))
야생형 사람의 TNF (Invitrogen cat. no: 10062-024).
KYM-1D4: A. Meager에 의해 공급됨 (A. Meager, J. Immunol. Methods 1991, 144: 141-143)
WEHI 164 클론 13: T. Espevik에 의해 공급됨 (T. Espevik 및 J. Nissen- Myer, J. Immunol. Methods 1986,95 :99-105)
테트라졸륨염 (MTS, CellTiter 96 Aqueous one solution ; Promega, G3581)
회전 막대 (Rotamix, Heto, Denmark)
보테스 (Vortex: OLE DICH instrumentmakers ApS, Denmark)
포뮬레이션/애쥬번트의 선택
정제된 TNFα 변이체 단백질 (20 mM Tris-HCI, 0.075 MNaCl, pH 8.0 중)을 식염수(0.9% NaCl) 0.5 mg/ml로 희석하여 뱃치시키고 (375 x ㎍/바이알)-20℃에서 면역화에 사용하기 전까지 보관한다.
각각의 TNFα 변이체에 대해, 면역화를 두가지 애쥬번트에 대해 수행한다: 1) 완전 프로인드 애쥬번트 (CFA, 일차 면역화용) 및 불완전 프로인드 애쥬번트 (IFA, 부스트 면역화용) 및 2) Alhydrogel 또는 Adjuphos (현행 기술로는 각각 수산화알루미늄과 인산알루미늄 애쥬번트) - 이들은 두가지 모두 일차 및 부스트 주사 모두에 사용된다.
일차 면역화에 앞서, TNF 변이체에 대한 애쥬번트로서 Alhydrogel를 사용할지 Adjuphos를 사용할지를 결정한다. TNFα 변이체를 흡착하는 능력이 가장 우수한 애쥬번트를 면역화 실험에서 추가 사용을 위해 선택한다. TNFα 변이체의 두가지 분주액을 동부피의 Alhydrogel 및 Adjuphos과 두개의 바이알에서 혼합한다. 바이알들을 실온에서 30분간 회전 막대를 이용하여 가볍게 혼합한다. 이어서 바이알을 13000 g에서 15분간 원심분리하고 상등액을 SDS 젤 구배 (4-12%) 상에서 가용성TNFα 변이체 함량에 대해 테스트한다. 유리 변이체를 가장 적게 함유하는 애쥬번 트/변이체 분주액 (즉, 알루미늄 입자에 변이체가 더 많이 결합된 경우)을 최적 애쥬번트인 것으로서 선택한다.
항원/애쥬번트 에뮬게이트 (emulgate)의 제조
CFA/IFA 에뮬게이트를 다음 공정을 통해 제조한다:
TNFα 변이체 [0.5 mg/ml]가 들어있는 바이알을 해동하여 10 ml 멸균 바이알로 옮기고 동 부피의 CFA 또는 IFA와 혼합한다. 이어서 이 바이알을 20℃에서 30분간 3300 rpm으로 보텍스를 이용하여 더욱 혼합한다.
Alhydrogel/Adjuphos 에뮬게이트를 다음 공정에 따라 제조한다:
Alhydrogel/Adjuphos를 식염수를 이용하여 1.4 mg Al/ml로 희석한다. TNFα 변이체 [0.5 mg/ml]가 들어있는 바이알을 해동하여 10 ml 멸균 바이알로 옮기고 동 부피의 Alhydrogel [1.4 mg Al/ml] 또는 Adjuphos [1.4 mg Al/ml]와 혼합한다. 이어서 이 바이알을 20℃에서 30분간 3300 rpm으로 보텍스를 이용하여 더욱 혼합한다.
동물 모델 선택
6마리의 8주령 Balb/Ca 암컷 마우스를 TNFα 변이체로 반복적으로 면역시킨다. 여러 간격으로 혈액 샘플을 채취하여 분리된 혈청을 항wtTNFα 항체 역가에 대해 조사하였다. Taconic Farms, Inc. cquires M & B A/S, Denmark로부터 마우스를 주문하였다. 마우스들을 실험 개시 1주일 전까지 Pharmexa의 동물 시설에서 1주일간 키운다.
면역화 계획 및 투여
10 + 10 그룹의 마우스들을 각각 CFA/IFA 및 Alhydrogel/Adjuphos 중의 TNFα 변이체로 면역화시킨다. 20 + 20 마우스를 야생형 TNFα를 이용하여 면역화시키는데 사용하였다.
최초 면역화시, 애쥬번트 중의 단백질 50 ㎍을 피하 주사한다. 모든 마우스에게 최초 면역화한지 2주일, 6주일 및 10주일 후에 애쥬번트 중 단백질 25 ㎍으로 부가적으로 부스터 면역화시킨다.
사용된 측정법
WEHI 164 클론 13- 또는 KYM-1D4-세포를 이용한 세포독성 생검법: 이 측정법은 본 발명의 TNFα 변이체의 독성을 측정하는데 이용하였다. 적정된 양의 TNFα 변이체 존재 하에 세포를 48시간 동안 배양하고 살아있는 세포에 의해 유색 포르마잔 산물로 생체환원되는 테트라졸륨염 (MTS)를 부가함으로써 세포 사멸을 측정한다. TNFα 변이체의 세포독성을 사람의 야생형 TNFα의 그것과 비교한다.
WEHI 164 클론 13- 또는 KYM-1D4-세포를 이용한 세포독성-억제 생검법: 이 측정법은 TNFα 면역된 마우스에서 발생된 항혈청이 야생형 TNFα의 세포독성 효과를 무력화시키는 능력을 조사하기 위해 사용되었다. 세포를 48시간 동안 적정된 양의 항혈청 및 항혈청 부재시 세포의 50%의 세포 사멸을 유발하는데 충분한 일정 농도의 야생형 사람 TNFα와 함께 배양한다. 세포 사멸을 전술한 바와 같이 MTS에 의해 측정한다. TNFα 변이체-면역시킨 마우스로부터의 혈청의 무력화 능력을 야생형 TNFα로 면역화시킨 마우스로부터 얻어진 혈청의 경우와 비교한다.
생체외 연구
WEHI 164 클론 13- 또는 KYM-1D4-세포를 이용한 세포독성 생검법: WEHI 164 클론 13- 또는 KYM-1D4-세포를 이용한 세포독성-억제 생검법.
최상의 면역원서어 구조물의 선택 기준
TNFα 변이체는 세포독성을 최소로 나타내어야 한다. 마우스를 TNFα 변이체로 면역화시키면 사람의 야생형 TNFα으로 면역된 마우스로부터 얻어진 혈청과 동일하거나 더 우수한 능력으로 WEHI- 또는 KYM-1D4 세포에서 사람의 야생형 TNFα 매개성 세포독성을 무력화시키는 항혈청이 생산되어야 한다.
<110> PHARMEXA A/S <120> DETOXIFIED TNF AND METHOD OF PREPARING <130> KP-CH-056472 <150> DK PA 2003 00701 <151> 2003-05-09 <150> US 60/469,491 <151> 2003-05-09 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid P2 epitope <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 1 cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggc atc acc gaa ctg 45 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid P30 epitope <400> 3 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid P30 epitope <220> <221> CDS <222> (1)..(63) <400> 4 ttc aac aac ttc acc gtt tcc ttc tgg ctg cgc gtt cca aaa gtt tcc 48 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 gct tcc cac ctg gaa 63 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid P30 epitope <400> 6 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan DR binding peptide (PADRE) <220> <221> CDS <222> (1)..(39) <400> 7 gcc aag ttc gtg gcc gct tgg acc ctg aag gcc gca gct 39 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan DR binding peptide (PADRE) <400> 9 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> 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gcg aac gcc ctg ctg gcg aac ggc gtg gaa ctg cgt gat aac cag 144 Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln 35 40 45 ctg gtg gtc ccc agc gag ggg ctg tat ctg atc tat tca cag gtg ttg 192 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu 50 55 60 ttt aag ggt cag ggt tgt ccg agc acc cac gtt ctg ctg acg cat acc 240 Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 65 70 75 80 att tct cgt att gct gta tct tat caa act aaa gtc aat tta ctt tcg 288 Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 85 90 95 gcg atc aaa tcc ccg tgc caa cgt gag acc cct gaa gga gcg gaa gcc 336 Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala 100 105 110 aaa cct tgg tac gaa ccg atc tat ctg ggg ggc gtt ttt cag ctc gaa 384 Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu 115 120 125 aaa ggt gat cgg ctg agc gcc gaa att aat cgc ccg gac tac ctt gat 432 Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 135 140 ttc gca gag tcc ggt cag gtc tac ttc ggc att atc gca ttg taa 477 Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 14 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 1 5 10 15 Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg 20 25 30 Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln 35 40 45 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu 50 55 60 Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 85 90 95 Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu 115 120 125 Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 135 140 Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 15 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human wt TNF (codons optimised) <400> 15 Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 1 5 10 15 Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg 20 25 30 Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln 35 40 45 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu 50 55 60 Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 85 90 95 Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu 115 120 125 Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 135 140 Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 16 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTNF with 12 amino acids of PADRE inserted <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(121) <223> PADRE <400> 16 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 115 120 125 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 130 135 140 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 <210> 17 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha with PADRE insertion and detoxifying mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(121) <223> PADRE <220> <221> MUTAGEN <222> (155) <223> Asp to Arg mutation <400> 17 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 115 120 125 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 130 135 140 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Phe Ala Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 <210> 18 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha with PADRE insertion and detoxifying mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (157) <223> Ala to Arg mutation <400> 18 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 115 120 125 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 130 135 140 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 <210> 19 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha with PADRE insertion and detoxifying mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (87) <223> Tyr to Ser mutation <400> 19 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Ser Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 115 120 125 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 130 135 140 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 <210> 20 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTNF with inserted PADRE and additional disulfide bridge <220> <221> DISULFID <222> (67)..(124) <220> <221> MUTAGEN <222> (67) <223> Leu to Cys mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(121) <223> PADRE <220> <221> MUTAGEN <222> (124) <223> Ala to Cys muation <400> 20 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr 115 120 125 Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg 130 135 140 Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 170 <210> 21 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha with PADRE insertion and detoxifying mutation <220> <221> DISULFID <222> (67)..(124) <220> <221> MUTAGEN <222> (67) <223> Leu to Cys muation <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(121) <223> PADRE <220> <221> MUTAGEN <222> (124) <223> Ala to Cys mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (156) <223> Asp to Arg mutation <400> 21 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr 115 120 125 Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg 130 135 140 Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Phe Ala Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 170 <210> 22 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha with PADRE insertion and detoxifying mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (67) <223> Leu to Cys mutation <220> <221> DISULFID <222> (67)..(124) <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(121) <223> PADRE <220> <221> MUTAGEN <222> (124) <223> Ala to Cys mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (158) <223> Ala to Arg mutation <400> 22 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr 115 120 125 Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg 130 135 140 Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 170 <210> 23 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha with PADRE insertion and detoxifying mutation <220> <221> DISULFID <222> (67)..(124) <220> <221> MUTAGEN <222> (67) <223> Leu to Cys mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (87) <223> Lys to Ser mutation <220> <221> MUTAGEN <222> (124) <223> Ala to Cys muation <400> 23 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Ser Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val 100 105 110 Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr 115 120 125 Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg 130 135 140 Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser 145 150 155 160 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 165 170

Claims (33)

  1. a) 펩타이드 링커에 의해 엔드-투-엔드 결합된 두개 또는 세개의 완전한 TNFα 모노머로서, 여기서 적어도 하나의 펩타이드 링커는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 갖는 것인 모노머, 또는
    b) 불활성 펩타이드 링커에 의해 엔드-투-엔드 결합된 두개 또는 세개의 완전한 TNFα 모노머로서, 여기서 모노머들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 포함하거나 또는 여기서 적어도 하나의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 임의로 불활성 링커를 통해 N 또는 C 말단 모노머에 융합되는 것인 모노머, 또는
    c) 유연한 (flexible) 루프 3 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    d) TNFα 모노머 3D 구조를 안정화시키는 적어도 하나의 디설파이드 결합이 도입된 사람의 TNFα 모노머 또는 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체 또는
    e) 아미노 말단의 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 중 어느 하나가 결실된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    f) 인트론 좌위의 루프 1 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    g) 사람의 TNFα의 N-말단 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 인공 스토크(stalk) 대역의 일부로서 도입된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    h) 트라이머 상호반응 계면의 소수성을 증가시킴으로써 모노머 구조를 안정화시키도록 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 도입된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    i) TNFα 아미노산 서열 내로, 글리신 잔기가 측면에 배치된 (flanked) 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    j) D-E 루프 내로 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    k) 사람의 TNFα의 두개의 동일한 서브서열 사이에 적어도 1종의 외래 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열이 삽입 또는 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    l) 사람의 TNFα 내에 적어도 하나의 염다리가 강화되거나 또는 디설파이드 결합에 의해 치환된 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체, 또는
    m) 쥐의 TNFα 결정 구조를 모방하는 변이를 도입함으로써 가용성 및/또는 단백질분해에 대한 안정성이 개선된, 사람의 TNFα 모노머 또는 a) 또는 b)에서 정의된 유사체
    를 포함하는 사람의 TNFα 단백질의 면역원성 유사체.
    단, 잠재적인 독성은 Y87S, D143N, 또는 A145R (여기서 아미노산 넘버링은 사람의 TNFα의 N 말단 V로부터 시작되는 것임) 중에서 선택된 적어도 하나의 점돌연변이의 도입에 의해 경감되거나 회피됨.
  2. 제1항에 있어서, MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 멀티머 단백질이 유도된 동물종으로부터의 MHC 클래스 II 분자의 대다수에 결합하는 것인 면역원성 유사체.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 1종의 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열은 천연 T 세포 에피토프와 인공 MHC-II 결합 펩타이드 서열 중에서 선택되는 것인 면역원성 유사체.
  4. 제3항에 있어서, 천연 T 세포 에피토프는 P2 또는 P30과 같은 파상풍 독소 에피토프, 디프테리아 독소 에피토프, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 에피토프 및 피. 팔시파룸 (P. falciparum) CS 에피토프 중에서 선택되는 것인 면역원성 유사체.
  5. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유사체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17, 및 18, 및 오직 보존적인 아미노산 변화만을 유발하는 여 하한 아미노산 서열 중에서 선택되는 것인 면역원성 유사체.
  6. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세균 세포로부터 가용성 단백질로서 발현될 수 있는 것인 면역원성 유사체.
  7. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 따른 면역원성 유사체를 코딩하는 핵산 단편 또는 그에 상보적인 핵산 단편.
  8. 제7항에 있어서, DNA 단편인 핵산 단편.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17, 및 18 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열, 또는 그에 상보적인 핵산 서열 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 단편.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 면역원성 유사체 1종 이상의 면역원성 유효량을 동물의 면역계에 제시하는 것을 포함하여 이루어지는, 숙주 동물에 있어서, 자가 TNFα를 하향 조절하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 자가 숙주가 인간과 같은 포유동물인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 면역원성 유사체를 임의로 애쥬번트와 혼합하여 자가 숙주에게 투여함으로써 제시를 수행하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 애쥬번트는 면역 표적화 애쥬번트; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조정(modulating) 애쥬번트; 오일 포뮬레이션; 폴리머; 미셀 형성 애쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합체 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 애쥬번트; DNA 애쥬번트; γ-인슐린; 및 캡슐화 애쥬번트 중에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유사체의 면역학적 유효량을 피내, 피하, 및 근육내 경로와 같은 비경구 경로; 복강내 경로; 경구 경로; 볼내 경로; 설하 경로; 경막외 경로; 척수 경로; 항문 경로; 및 두개골 경로와 같은 비경구 경로 중에서 선택된 경로를 통해 동물에게 투여하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 유효량은 0.5 ㎍ 내지 2,000 ㎍ 사이인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 1년에 적어도 1회 투여, 예컨대 1년에 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 6회, 및 적어도 12회 투여하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 면역계에 대한 유사체의 제시는 유사체를 코딩하는 핵산(들)을 동물 세포 내로 도입함으로써, 그 세포에 의해 도입된 핵산(들)을 생체내 발현시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 도입된 핵산(들)은 네이키드 DNA, 하전된 또는 하전되지 않은 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 중에 조성된 DNA, 바이러스 벡터 중에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제제와 함께 조성된 DNA, 불활성 캐리어 분자에 커플링된 DNA, 및 애쥬번트와 함께 조성된 DNA 중에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 핵산은 동맥내, 정맥내 또는 제14항에 정의된 경로로 투여되는 것인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산을 1년에 적어도 1회 투여, 예컨대 1년에 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 6회, 및 적어도 12회 투여하는 방법.
  21. 제10항에 있어서, 면역계의 제시는 유사체를 코딩 및 발현시키는 핵산 단편을 지니는 비병원성 미생물 또는 바이러스의 투여에 의해 수행되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 바이러스는 백시니아 바이러스와 같은 비바이러스성 폭스 바이러스인 방법.
  23. 제22항에 이어서, 미생물은 세균인 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비병원성 미생물 또는 바이러스는 동물에게 1회 투여되는 것인 방법.
  25. - 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 면역원성 유사체, 및
    - 약학적 및 면역학적으로 허용되는 캐리어 및/또는 비히클 및/또는 애쥬번트를 포함하는 것이 특징인, 멀티머 단백질에 대한 항체 생산을 유발하기 위한 조성물.
  26. - 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산 단편, 및
    - 약학적 및 면역학적으로 허용되는 캐리어 및/또는 비히클 및/또는 애쥬번트를 포함하는 것이 특징인, 멀티머 단백질에 대한 항체 생산을 유발하기 위한 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 유사체는 제30항 또는 제31항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같이 조성되는 것인 조성물.
  28. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산 단편에 의해 형질전환된 숙주 세포를, 그의 발현을 용이화시키는 조건 하에서 배양한 다음 배양체로부터 단백질 발현 산물로서 유사체를 회수하는 단계를 포함하여 이루어지는, 숙주제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 유사체의 제조 방법
  29. 제28항에 있어서, 숙주 세포는 세균 숙주 세포인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 유사체는 가용성 발현 산물인 방법.
  31. 제28항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주 세포는 발현 산물이 숙주 세포에 의해 생산되는 실질적인 기간 동안 32℃ 미만의 온도에서 배양되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 온도는 약 25℃인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 온도는 숙주 세포를 배양하는 전기간에 걸쳐 실질적으로 일정하게 유지시키는 것인 방법.
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