EA008254B1 - Детоксифицированный tnf и способ получения - Google Patents
Детоксифицированный tnf и способ получения Download PDFInfo
- Publication number
- EA008254B1 EA008254B1 EA200501773A EA200501773A EA008254B1 EA 008254 B1 EA008254 B1 EA 008254B1 EA 200501773 A EA200501773 A EA 200501773A EA 200501773 A EA200501773 A EA 200501773A EA 008254 B1 EA008254 B1 EA 008254B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- τνεα
- analogue
- amino acid
- protein
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 97
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 72
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 59
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 165
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 148
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 115
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 90
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 77
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 65
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 60
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 41
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 30
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 21
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 10
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 5
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 5
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 5
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 claims description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 4
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 claims description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 claims description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 claims 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 42
- 239000013638 trimer Substances 0.000 abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 22
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 abstract description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 6
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 abstract 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 abstract 2
- 102220033889 rs62643621 Human genes 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 138
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 53
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 40
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 32
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 31
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 29
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 28
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 23
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 22
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 16
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 10
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 9
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- -1 for example Chemical class 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 3
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 3
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 2
- 101100346189 Caenorhabditis elegans mpc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 2
- MYEJFUXQJGHEQK-ALRJYLEOSA-N Proscillaridin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C=C2CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C5=COC(=O)C=C5)[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1 MYEJFUXQJGHEQK-ALRJYLEOSA-N 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100109216 Caenorhabditis elegans apy-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 240000004385 Centaurea cyanus Species 0.000 description 1
- 235000005940 Centaurea cyanus Nutrition 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100031051 Cysteine and glycine-rich protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710185487 Cysteine and glycine-rich protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102220580942 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1_Y57Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- REDMNGDGDYFZRE-WKWISIMFSA-N O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@H](N)C(O)=O REDMNGDGDYFZRE-WKWISIMFSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002730 Poly(butyl cyanoacrylate) Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- LUXUAZKGQZPOBZ-SAXJAHGMSA-N [(3S,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] (Z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LUXUAZKGQZPOBZ-SAXJAHGMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical class C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000005980 lung dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000005671 spondyloarthropathy Diseases 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004367 thymic lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Данное изобретение обеспечивает иммуногенный аналог белка TNFα человека, где указанный аналог содержит иммуногенный мономерный полипептид TNFα или ди- или тример TNFα и где этот аналог дополнительно содержит уменьшающую или устраняющую токсичность мутацию, выбранную из группы, состоящей из Y87S, D143N или A145R, причем нумерация аминокислот устанавливается от N-концевого валина в TNFα человека. Данное изобретение обеспечивает также фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий этот аналог, а также векторы и трансформированные клетки, применимые в получении этого аналога. Описаны также способы понижающей регуляции TNFα у субъекта, нуждающегося в этом.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области терапевтической иммунотерапии, и в частности к области активной иммунотерапии, нацеленной на отрицательно регулирующие аутологичные (собственные) белки и другие слабоиммуногенные антигены. Таким образом, данное изобретение обеспечивает новые и улучшенные иммуногенные детоксифицированные варианты фактора некроза опухолей альфа (ΤΝΡα), а также необходимый инструмент для получения таких вариантов. Кроме того, данное изобретение относится к способам иммунотерапии, а также к композициям, применимым в таких способах.
Уровень техники
Использование активной иммунотерапии (вакцинации) в качестве средства лечения или ослабления заболевания привлекает все большее внимание на протяжении последних двух десятилетий. Следует отметить, что использование активной иммунотерапии как средства разрушения толерантности к аутологичным белкам, которые каким-либо образом связаны с патологическим (или иным образом нежелательным) физиологическиим состоянием, было известно с конца 70-х годов, когда были опубликованы первые эксперименты с вакцинами против фертильности.
Вакцины против аутологичных антигенов получали традиционно путем иммуногенизации релевантного аутологичного белка, например путем химического связывания (конъюгации) с большим чужеродным и иммуногенным белком-носителем (см. И8 4161519) или путем получения слитых конструкций между этим аутологичным белком и чужеродным белком-носителем (см. №0 86/07383). В таких конструкциях часть-носитель этой иммуногенной молекулы ответственна за обеспечение эпитопов для Т-хелперных лимфоцитов (Тн-эпитопов), которые позволяют нарушить аутотолерантность.
Более позднее исследование показало, что, хотя такие стратегии, действительно, могут обеспечить нарушение толерантности против аутологичных белков, при этом возникает ряд проблем. Наиболее важным является тот факт, что в иммунной реакции, которая индуцируется во времени, будут доминировать антитела, направленные против части-носителя иммуногена, в то время как реактивность против аутологичного белка часто уменьшается, т.е. возникает эффект, который особенно ярко выражен, когда этот носитель служил ранее в качестве иммуногена, - этот феномен известен как супрессия носителя (см., например, Ка11уарегита1 с1 а1., 1995, Еиг. 1. 1ттипо1. 15, 3375-3380). Однако при использовании терапевтической вакцинации обычно необходимо проводить реиммунизацию несколько раз в год и поддерживать эту обработку в течение ряда лет, и это также приводит к ситуации, когда иммунная реакция против части-носителя будет все более доминировать за счет иммунной реакции против аутологичной молекулы.
Дополнительными проблемами, возникающими при использовании технологии гаптен-носитель для разрушения аутотолерантности, являются негативные стерические эффекты, проявляемые носителем на часть аутологичного белка в таких конструкциях: ряд доступных В-клеточных эпитопов, которые сходны с конформационными картинами, наблюдаемыми в нативном аутологичном белке, часто уменьшается вследствие простого экранирования или маскирования эпитопов или вследствие конформационных изменений, индуцируемых собственной частью этого иммуногена. Наконец, очень часто бывает трудно охарактеризовать молекулу гаптен-носитель достаточно подробно.
В публикации №0 95/05849 обеспечено усовершенствование вышеупомянутых стратегий с использованием гаптен-носителя. Было продемонстрировано, что аутологичные белки, в которых встроен в виде замены всего лишь один-единственный чужеродный Тн-эпитоп, способны разрушать толерантность в отношении аутологичного белка. Все усилия были направлены на сохранение третичной структуры аутологичного белка для гарантии того, что максимальное количество аутологичных эпитопов В-клеток будет сохранено в этом иммуногене, несмотря на введение чужеродного Тн-элемента. Эта стратегия оказалась, в общем, чрезвычайно успешной ввиду того, что индуцированные антитела имеют широкий спектр, а также высокую аффинность и что иммунная реакция возникает раньше и имеет более высокий титр, чем это происходит при иммунизации традиционной конструкцией с носителем.
В №0 00/20027 обеспечено расширение вышеуказанного принципа. Было обнаружено, что введение единственных Тн-эпитопов в кодирующую последовательность для аутологичных белков может индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ), которые реагируют специфически с клетками, экспрессирующими данный аутологичный белок. Технология №0 00/20027 обеспечила также комбинированную терапию, в которой индуцируются как антитела, так и СТЬ, - в этих вариантах иммуногены все еще необходимы для сохранения существенной фракции В-клеточных эпитопов.
Фактор некроза опухолей (ΤΝΡ, ΤΝΡα, кахектин, ΤΝΡ8Ρ2) является сильным паракринным и эндокринным медиатором воспалительных и иммунных функций. ΤΝΡα является цитотоксическим для многих клеток, особенно в комбинации с гамма-интерфероном. ΤΝΡα был впервые идентифицирован в 1975 году, и было показано, что он инициирует некроз и регрессию опухоли. Позднее этот антираковый эффект был исследован подробно, но этот способ лечения не имел успеха в качестве раковой терапии, хотя все еще проводятся испытания в отношении рака с использованием ΤΝΡα. Позднее было обнаружено, что ΤΝΡα был причиной кахексии, и было показано, что ΤΝΡα проявляет его действие через опосредованный рецептором процесс. Были идентифицированы два различных рецептора ΤΝΡα (ΤΝΡΚ.55 и ΤΝΡΚ.75), которые опосредуют цитотоксические и воспалительные эффекты ΤΝΡα. ΤΝΡα индуцирует и
- 1 008254 поддерживает воспалительные процессы во время хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА), и предполагается, что он играет решающую роль в аллергиях и псориазе. Блокирование сигнала ΤΝΡα растворимыми рецепторами, рецептор-специфическими ингибиторами, понижающей регуляцией продуцирования ΤΝΡα или моноклональными антителами против ΤΝΡα является привлекательными формами терапии для неблагоприятных биологических действий повышающей регуляции и передачи сигнала ΤΝΡα.
Из результатов, полученных при лечении растворимыми рецепторами ΤΝΡα и моноклональными антителами против ΤΝΡα, очевидно, что анти-ΤNБα-терапия является успешной в случае нескольких заболеваний, таких как РА и болезнь Крона. Лечение антителами против ΤΝΡα считается как безопасным, так и эффективным.
К настоящему времени два ΤΝΡα-антагониста, Кеш1еабе (1иШх1шаЬ, Ссп1госог/1ойп5оп & Ιοίιηδοη) и ЕпЬте1 (Е!аиегсер!, 1ттипех), были одобрены для клинического применения.
Ееткабе является химерным мышь-человек моноклональным 1дО1-антителом, направленным против растворимого и клеточно-ассоциированного ΤΝΡα. Ееткабе блокирует связывание ΤΝΡ с его эндогенным находящимся на поверхности клетки рецептором ΤΝΡα. Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (ΕΌΑ) одобрил Яетюабе в октябре 1998г. для использования в умеренной-тяжелой или образующей свищи болезни Крона, не поддающейся общепринятым способам терапии. Это показание было расширено для включения вспомогательного использования с метотрексатом при ревматоидном артрите, не поддающемся терапии только метотрексатом, а в июле 2002г. в поддерживающей терапии при болезни Крона.
ЕпЬге1 представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточной части ΤΝΡα-рецептора человека, слитой с Ес-частью 1дО1 человека. ЕпЬге1 ингибирует активность ΤΝΡα, функционируя в качестве ловушки ΤΝΡα-рецептора. ΡΌΑ одобрил ЕпЬге1 для применения при ревматоидном артрите в ноябре 1998г. Более 350000 пациентов лечили этими антагонистами ΤΝΡα. Обзор клинической эффективности и информации о безопасности этих агентов выполняют непрерывно, и, хотя инфекционные и другие иммуноассоциированные побочные неблагоприятные явления остаются основной проблемой для антагонистов ΤΝΡα, при недавней оценке безопасности постмаркетинговых испытаний, проведенной ΡΌΑ и СРМР (Комитетом по патентованным медицинским продуктам), установили, что анти-ΤΝΡαтерапии имеют благоприятный баланс риска-пользы, хотя были необходимы изменения в сопроводительном описании, в том числе изменения в отношении тяжелых инфекций.
В сравнении с установленными анти-ΤΝΡα-терапиями предлагаемая здесь ΤΝΡα-терапия имеет преимущества вакцинаций в микрограммовых количествах и менее частых инъекций для сохранения высокого титра антител против ΤΝΡα ш νίνο в сравнении с обширными инфузиями моноклональных антител. Положительными следствиями являются более низкий риск в отношении побочных эффектов и менее дорогостоящая терапия. Считается также, что природная реакция поликлональных антител будет действовать в качестве более эффективного понижающего регулятора ΤΝΡα, чем другие анти-ΤNΡα-терапии.
ΤΝΡη транслируется в виде белка-предшественника из 233 аминокислот и секретируется в виде тримерного трансмембранного белка типа II, который расщепляется специфическими металлопротеазами до тримерного растворимого белка, где каждая идентичная мономерная субъединица состоит из 157 аминокислот (аминокислотная последовательность которой представлена в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, остатки 2-158). ΤΝΡα человека является негликозилированным, тогда как мышиный ΤΝΡα имеет единственный сайт Νгликозилирования. ΤΝΡα-мономер имеет молекулярную массу 17 кДа, тогда как тример имеет теоретическую молекулярную массу (М№) 52 кДа, хотя сшитый тример перемещается в виде 43 кДа при электрофорезе в ДСН-ПААГ. ΤΝΡα содержит два цистеина, которые стабилизируют эту структуру образованием внутримолекулярного дисульфидного мостика. Как Ν-, так и С-конец ΤΝΡα являются важными для активности. В частности, С-конец является чувствительным, так как делеция трех, двух аминокислот и даже одной аминокислоты разительно уменьшает растворимость и биоактивность. Важной аминокислотой является Ьеи157, которая образует стабилизирующий солевой мостик между двумя мономерами в этом тримере. С другой стороны, делеция первых восьми аминокислот увеличивает активность в 1,5-5 раз, тогда как делеция первых девяти аминокислот восстанавливает полноразмерную активность. ΤΝΡα является хорошо изученным белком, и были раскрыты многие внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия, приводящие к образованию тримера и связыванию рецептора.
Таким образом, в природе ΤΝΡα человека (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10, остатки 2-158) существует как в виде димера, так и в виде тримера, но эта молекула в обоих случаях является очень подходящей в качестве мишени-кандидата согласно изобретению.
Как в №О 95/05849, так и в №О 98/46642 описан способ вакцинации, который пригоден для понижающей регуляции активности ΤΝΡα (фактора альфа некроза опухолей), цитокина, участвующего в патологии нескольких заболеваний, таких как диабет типа I, ревматоидный артрит и воспалительная болезнь пищеварительного тракта. В обоих описаниях предполагается сохранение третичной структуры мономерного ΤΝΡα при конфронтации с иммунной системой. Кроме того, №О 03/042244 (еще не опуб
- 2 008254 ликованный) описывает ряд общих и специфических вариантов ΤΝΕα.
Даже несмотря на то, что вышеуказанные способы обеспечили очень многообещающие результаты, существуют несколько факторов, которые могут начинать действовать при оценке жизненности вакцинного подхода в борьбе с заболеванием. Одним из этих факторов является уровень экспрессии этого иммуногенного белка.
Например, для того, чтобы вакцина нуклеиновой кислоты была функциональной, клетки, трансфицированные ίη νίνο конструкцией, кодирующей иммуногенизированный аутологичный белок, должны быть способны экспрессировать этот иммуноген в достаточных количествах, чтобы индуцировать подходящую иммунную реакцию. Кроме того, вакцины на основе полипептидов требуют, чтобы этот иммуногенный белок мог продуцироваться в удовлетворительных количествах в промышленном ферментационном процессе. Однако часто наблюдается, что даже небольшое изменение в аминокислотной последовательности известного белка может иметь драматические последствия в отношении количеств белка, которые могут быть извлечены.
Кроме того, стабильность генетически модифицированных белковых последовательностей может быть также меньше оптимальной (как в отношении времени хранения, так и в отношении стабильности ίη νίνο).
Кроме того, когда, как это имеет место для ΤΝΕα, аутологичный белок, который желательно регулировать понижающим образом, является гетерополимером или гомополимером, совсем необязательно, что вариант мономерной единицы этого белка будет способен индуцировать антитела, которые являются достаточно специфическими в отношении конформации, нативной для этого полимерного белка.
Наконец, ΤΝΕα является токсичным веществом, и, к сожалению, наблюдали, что оптимально уложенные иммуногенные варианты ΤΝΕα сохраняют нативную токсичность ΤΝΕα, так как эти варианты способны образовывать биологически активные тримеры (или укладываться в виде биологически активных мономеров, которые имитируют эту тримерную структуру).
Цель изобретения
Целью данного изобретения является обеспечение улучшенных иммуногенных и детоксифицированных аналогов ΤΝΕα человека, а также обеспечение улучшенных способов индукции гуморального иммунитета против этого белка. Далее, целью данного изобретения является обеспечение улучшенных способов культивирования вариантов растворимого ΤΝΕα, а также вариантов других белков. Наконец, целью данного изобретения является также обеспечение других способов и критериев, которые применимы при получении или использовании этих улучшенных иммуногенов.
Сущность изобретения
При крупномасштабном продуцировании рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах часто желательно, чтобы продукт экспрессии стал доступен в виде телец включения в бактериях. Для этого имеются несколько причин: например, выходы экспрессии обычно значительно более высоки при экспрессии этого белка в виде нерастворимых телец включения, и очистка этого белка также облегчается, так как желаемый продукт экспрессии может быть легко и удобно отделен от растворимого белка из бактериальной ферментации.
Однако при экспрессии рекомбинантного белка в виде нерастворимых телец включения часто необходимо подвергать этот продукт экспрессии различным процессам рефолдинга белка для получения его биологически активной формы, но это обычно приемлемо, даже если стадия приводит к некоторой потере общего рекомбинантного белка, который никогда не укладывается в точную биологически активную форму.
Однако при получении рекомбинантных иммуногенных вариантов неиммуногенных аутологичных белков, таких как ΤΝΕα, необходимо вводить Тн-эпитопы, и посредством этого первичная структура этого белкового продукта становится измененной в сравнении с нативным аутологичным белком. Авторы данного изобретения обнаружили, что даже самое слабое изменение делает этот традиционный подход экспрессии телец включения с последующим рефолдингом непрактичным: выходы белка после рефолдинга, который сохранял удовлетворительную фракцию В-клеточных эпитопов в сравнении с нативным аутологичным белком, являются очень часто низкими, и эта проблема увеличивается из-за сложности рассматриваемого белка.
Теперь авторами было обнаружено, что конструирование и выполнение экспрессии белковых конструкций, которые продуцируются в виде растворимых белков из бактерий, является превосходным способом получения иммуногенных вариантов аутологичных белков, даже хотя последующие стадии очистки усложняются, поскольку необходимо удалить другие растворимые белки, конечный очищенный и правильно уложенный продукт получают со значительно более высокими выходами, чем при изложенном выше традиционном подходе. И, что очень важно, очищенные белки, полученные при этом типе экспрессии, проявляют беспрецедентную до сих пор способность сохранять В-клеточные эпитопы нативного аутологичного белка, из которого они получены.
Вкратце, в соответствии с данным изобретением растворимая экспрессия вариантных белков является превосходным критерием выбора при первоначальном отборе иммуногенных вариантов аутологичного белка, которые являются подходящими для целей вакцинации.
Для того, чтобы получить экспрессию растворимого белка таких иммуногенизированных аутоло
- 3 008254 гичных белков (и других белков, где были введены изменения в первичной последовательности), можно варьировать ряд параметров - мультимерные белки, которые трудно собрать, могут быть получены стабилизацией их структуры на уровне мономеров, но также и получением мономерных миметиков ΤΝΕαмультимера, а также простые мономерные белки могут быть стабилизированы в соответствии с описаниями, приведенными здесь.
Другим важным фактором являются условия ферментации - полученные данные в лаборатории авторов данного изобретения показали, например, что ферментация бактерий при более низких температурах, чем температуры, обычно используемые для получения высоких уровней экспрессии, в значительной степени облегчают продуцирование растворимых форм вариантных белков.
Авторы данного изобретения ранее обнаружили, что получение мономеризованных или стабилизированных форм ΤΝΕα может быть обеспечено в отношении иммуногенных молекул, имеющих высокую стабильность, превосходную иммуногенность и желаемые характеристики продуцирования. Данное изобретение направлено на улучшение концепций, где ряд специфических детоксифицирующих мутаций вводятся в варианты таким образом, чтобы сделать их более удобными для пациентов при сохранении их иммуногенности.
Помимо этой детоксифицирующей мутации, ΤΝΕα-варианты согласно изобретению включают в себя ряд вариаций в мономерной структуре ΤΝΕα, которые являются достаточно недеструктивными, так что они позволяют скорректировать фолдинг ΤΝΕα-мономеров при одновременном введении по меньшей мере одной связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности - эти вариации уже описаны подробно в \УО 03/042244. Было обнаружено, что встраивание чужеродного Тн-эпитопа может быть выполнено в одной конкретной петлевой структуре в нативном ΤΝΕα без негативного воздействия на характеристики экспрессии этого белка или на способность мономера образовывать функциональный димер или тример ΤΝΕα.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к детоксифицированному, иммуногенному аналогу ΤΝΕα человека, где этот аналог включает в себя по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность и дополнительно является:
мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в гибкую петлю 3, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα согласно изобретению, в котором введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует трехмерную структуру мономеров ΤΝΕα, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором делетирована любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на аминоконце, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в петлю 1 в положении интрона, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором введена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в виде части искусственного района ножки на Ν-конце ΤΝΕα человека, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором введена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность таким образом, чтобы стабилизировать структуру мономера путем увеличения гидрофобности границы тримерного взаимодействия, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, в аминокислотной последовательности ΤΝΕα, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором инсертирована или встроена в виде замены по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность в петле Ό-Ε, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором введена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность между двумя идентичными субпоследовательностями ΤΝΕα человека, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα. согласно изобретению, в котором по меньшей мере один солевой мостик в ΤΝΕα человека усилен или заменен дисульфидным мостиком, и/или мономером ΤΝΕα человека или мономеризованным аналогом ΙιΤΝΕα согласно изобретению, в котором растворимость и/или стабильность в отношении протеолиза усилена введением мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного ΤΝΕα, причем токсичность уменьшается или элими
- 4 008254 нируется введением по меньшей мере одной точковой мутации, выбранной из группы, состоящей из Υ878, Ό143Ν и Л145К, причем нумерация аминокислот начинается с Ν-концевого V в ΤΝΡα человека.
В целом, было обнаружено, что все наиболее подходящие иммуногенные аналоги согласно изобретению являются аналогами, которые являются растворимыми белками уже на той стадии, когда они продуцируются и выделяются в растворимой форме из их рекомбинантных клеток-хозяев.
Данное изобретение обеспечивает также фрагменты нуклеиновых кислот (например, ДНК-фрагменты), кодирующие такие иммуногенные аналоги, а также векторы, включающие в себя такие ДНК-фрагменты.
Данное изобретение обеспечивает также трансформированные клетки, применимые для получения этих аналогов.
Данное изобретение относится, далее, к иммуногенным композициям, содержащим аналоги и векторы согласно изобретению.
Данное изобретение обеспечивает также способы лечения, в которых понижающим образом регулируются мультимерные белки, и лечения конкретных заболеваний, связанных с конкретными мультимерными белками.
Описание фигуры
Блок-схема, на которой демонстрируется предварительная обработка продуцирования ΤΝΡα-белков Е. сой. Представленная рабочая схема используется для оценки относительной эффективности различных условий ферментации при рекомбинантном получении ΤΝΡα-вариантов согласно изобретению.
Подробное описание изобретения
Определения
Далее будет определен и объяснен подробно ряд терминов, используемых в данном описании и данной формуле изобретения для разъяснения границ и пределов изобретения.
Термины Т-лимфоцит и Т-клетка будут использоваться взаимозаменяемо для лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за опосредованные различными клетками иммунные реакции, а также за хелперную активность в гуморальной иммунной реакции. Подобным образом, термины В-лимфоцит и В-клетка будут использоваться взаимозаменяемо для антителопродуцирующих лимфоцитов.
Полимерный белок определен здесь как белок, который включает в себя по меньшей мере две полипептидные цепи, которые не соединены одна за другой пептидной связью (термин мультимерный белок используется взаимозаменяемо с ним). Таким образом, полимерные белки могут быть полимерами, состоящими из нескольких полипептидов, которые удерживаются вместе в полимерной форме посредством дисульфидных связей и/или нековалентного связывания. В этот термин включены также процессируемые пребелки и пробелки, которые после процессинга включают в себя по меньшей мере два свободных С-конца и по меньшей мере два свободных Ν-конца. Наконец, в этот термин включены также временно существующие комплексы между по меньшей мере двумя полипептидами, которые могут образовывать нестабильную, но несмотря на это биологически активную молекулярную частицу, которая имеет явную трехмерную структуру.
Под иммуногенным аналогом (или иммуногенизированным аналогом или вариантом) здесь подразумевается отдельный полипептид, который включает в себя существенную часть информации последовательности, обнаруживаемой в полном полимерном белке. То есть белок-аналог согласно изобретению включает в себя одну полипептидную цепь, тогда как полимерный белок включает в себя по меньшей мере две полипептидные цепи. Следует отметить, что аналог может являться вариацией структуры мономерной субъединицы полимера, но в этом случае иммуногенный аналог способен образовывать комплексы полимерного белка, которые сходны с нативным полимером.
Мономеризованный аналог или вариант полимерного белка является в данном контексте единственным полипептидом, который включает в себя, в ковалентно связанной форме через пептидную связь, по меньшей мере две полипептидные цепи, обнаруживаемые в полимерном белке в природе, где эти две полипептидные цепи не связаны через пептидную связь.
Существенный фрагмент мономерной единицы мультимерного белка обозначает часть мономерного полипептида, которая составляет по меньшей мере достаточную часть мономерного полипептида для образования домена, который укладывается, по существу, в ту же самую трехмерную конформацию, которая может быть обнаружена в мультимерном белке.
ΤΝΡα-полипептид обозначает в данном контексте полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность ΤΝΕα-белков, полученных из людей и других млекопитающих. Негликозилированные формы ΤΝΡα, которые получают в прокариотических системах, также включены в границы этого термина, как и формы, имеющие варьирующиеся картины гликозилирования вследствие использования, например, дрожжей или других эукариотических экспрессионных систем немлекопитающих. Однако следует отметить, что при использовании термина ΤΝΡα-полипептид предполагается, что рассматриваемый полипептид является в норме неиммуногенным, когда его презентируют подлежащему лечению животному. Другими словами, ΤΝΡα-полипептид является аутологичным белком или ксеноаналогом аутологичного белка, который в норме не будет индуцировать иммунную реакцию против ΤΝΡα рассматриваемого животного.
- 5 008254
ΤΝΡα-аналог является ΤΝΡα-полипептидом, который был подвергнут изменениям в его первичной структуре и/или который ассоциирован с элементами из других молекулярных частиц. Такое изменение может быть, например, в виде слияния ΤΝΡα-полипептида с подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре, исключительно включающее в себя добавления аминокислотных остатков по С- и/или Ν-концу), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности ΤΝΡα-полипептида. Этот термин включает в себя также дериватизованные молекулы ΤΝΡα, см. обсуждение ниже модификаций ΤΝΡα.
Должно быть понятно, что аналоги ΤΝΡα включают в себя также мономерные варианты, которые содержат существенные части полных мультимерных ΤΝΡα-белков.
Используемая здесь аббревиатура ΤΝΡα означает аминокислотные последовательности зрелого ΤΝΡα, ΤΝΡα дикого типа (также обозначаемые здесь ΤNΡαт и ΤΝΡα^ΐ), соответственно. Зрелый ΤΝΡα человека обозначают ΡΤΝΡα, ΙιΤΝΡαιη или ΡΤΝΡα^ΐ, а мышиный зрелый ΤΝΡα обозначают тΤNΡα, тΤNΡαт или ιηΤΝΡα\\1. В случаях, когда ДНК-конструкция включает в себя информацию, кодирующую лидерную последовательность или другой материал, это будет обычно ясно из контекста.
Термин полипептид обозначает в данном контексте короткие пептиды из 2-10 аминокислотных остатков, олигонуклеотиды из 11-100 аминокислотных остатков и полипептиды из более 100 аминокислотных остатков. Кроме того, этот термин также означает белки, т.е. функциональные биомолекулы, содержащие по меньшей мере один полипептид; причем когда они содержат по меньшей мере два полипептида, они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или могут не быть ковалентно связанными. Этот полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидированными и/или содержат простетические группы.
Термин субпоследовательность обозначает любую последовательность из по меньшей мере 3 аминокислот или, соответственно, из по меньшей мере 3 нуклеотидов, полученную непосредственно из природной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты ΤΝΡα, соответственно.
Детоксифицирующая мутация определена в данном контексте как мутация (например, точковая мутация) в аминокислотной последовательности ΤΝΡα, которая делает полученную молекулу значительно менее токсичной в отношении соответствующей модели животного (или аутологичного хозяина, из которого получена эта аминокислотная последовательность ΤΝΡα). Однако будет понятно, что эта детоксифицирующая мутация не должна быть мутацией, которая значимо мешает правильному фолдингу молекулы ΤΝΡα, так как желательно сохранить В-клеточные эпитопы.
Термин животное обычно обозначает в данном контексте вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Ното 8ар1еи8, Саищ ботеШеик и т.д., а не только одно-единственное животное. Однако этот термин обозначает также популяцию таких видов животных, так как важно, что у всех индивидуумов, иммунизированных в соответствии со способом согласно изобретению, все захватывают, по существу, один и тот же ΤΝΡα, что позволяет производить иммунизацию этих животных одним и тем же иммуногеном (одними и теми же иммуногенами). Если, например, генетические варианты ΤΝΡα существуют у различных популяций человека, может быть необходимо использование различных иммуногенов в этих различных популяциях для разрушения аутотолерантности против ΤΝΡα в каждой популяции. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что животное в данном контексте является существом, которое имеет иммунную систему. Предпочтительно это животное является позвоночным животным, таким как млекопитающее.
Под термином понижающая регуляция (отрицательная регуляция) здесь подразумевается снижение биологической активности ΤΝΡα в живом организме (например, посредством интерференции с взаимодействием между белком ΤΝΡα и биологически важными партнерами связывания для этой молекулы). Понижающая регуляция может быть получена посредством нескольких механизмов, наиболее простым является простая интерференция с активным сайтом в мультимерном белке посредством связывания антитела. Однако в объеме данного изобретения находится также то, что связывание антитела приводит к удалению мультимерного белка гистиоцитами-макрофагами (такими, как макрофаги и другие фагоцитарные клетки).
Выражение выполнение презентации... иммунной системе обозначает, что иммунная система животного подвергается иммунизации контролируемым образом. Как видно из приведенного ниже описания, такая иммунизация иммунной системы может быть выполнена несколькими путями, наиболее важными из которых являются вакцинация содержащими полипептид фармакцинами (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления существующего заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту фармакцинами. Важный результат, который должен быть достигнут, заключается в том, что иммунокомпетентные клетки в животном конфронтируют с этим антигеном иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата является менее важным для изобретательской идеи, лежащей в основе данного изобретения.
Термин иммунногенно эффективное количество имеет свое значение в данной области, т.е. это количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунную реакцию, которая значимо связыва
- 6 008254 ет патогенные агенты, имеющие общие иммунологические признаки с данным иммуногеном.
При использовании выражения, что ΤΝΕα был модифицирован, здесь имеется в виду химическая модификация полипептида, который составляет каркас аутологичного белка. Такой модификацией может быть, например, дериватизация (например, алкилирование, ацилирование, этерификация и т.д.) определенных аминокислотных остатков, но, как будет понятно из описания ниже, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности (или добавления к ней).
При обсуждении аутотолерантности в отношении ΤΝΕα понятно, что, поскольку ΤΝΕα является аутологичным белком в подлежащей вакцинации популяции, нормальные индивидуумы в этой популяции не развивают иммунную реакцию против него; хотя нельзя исключить того, что случайные индивидуумы в популяции животных могут быть способны продуцировать антитела против нативного ΤΝΕα, например, как часть аутоиммунного нарушения. В любом случае, вид животного обычно обладает аутотолерантностью в отношении только его собственного ΤΝΕα, но нельзя исключить того, что аналоги, полученные из другого вида животного или из популяции, имеющей отличающийся фенотип, могут также переноситься указанным животным.
Чужеродный Т-клеточный эпитоп (или чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп) является пептидом, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки в виде животного, - таким образом, является взаимозаменяемым термином. Предпочтительные чужеродные Т-клеточные эпитопы в данном изобретении представляют собой смешанные (или универсальные, или широкого спектра) эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с существенной долей определенного класса молекул МНС в виде или в популяции животных. Известно только очень ограниченное количество таких смешанных Т-клеточных эпитопов, и они будут подробно обсуждаться ниже. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с данным изобретением, были эффективными у как можно большей части популяции животных, может потребоваться 1) инсертирование нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) приготовление нескольких аналогов, в каждый из которых инсертирован отличающийся смешанный эпитоп. Следует отметить также, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов включает в себя также использование криптических (латентных) Т-клеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые получены из аутологичного белка и которые проявляют свое иммуногенное поведение только при существовании в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого аутологичного белка.
Чужеродным Т-хелперным лимфоцитарным эпитопом (чужеродным Тн-эпитопом) является чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывает молекулу МНС Класса II и может презентироваться на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АПК), связанной с молекулой МНС Класса II.
Таким образом, связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательностью, которая является гетерологичной относительно мультимерного белка, является связывающий МНС Класса II пептид, который не существует в ΤΝΕα. Такой пептид, если он является также действительно чужеродным для вида животного, захватывающего этот мультимерный белок, будет чужеродным Тн-эпитопом.
Функциональной частью (био)молекулы является в данном контексте часть молекулы, которая является ответственной по меньшей мере за часть биохимических или физиологических эффектов, проявляемых этой молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за эффекты, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут служить цели стабилизации или увеличения растворимости и, следовательно, могут быть опущены, если эти цели не имеют значения в контексте определенного варианта воплощения данного изобретения. Однако согласно данному изобретению предпочтительно использовать как можно большую часть этой полимерной молекулы, так как фактически было продемонстрировано увеличение стабильности при использовании описанных здесь мономеров.
Термин адъювант используется здесь в обычном для области вакцинной технологии значении, т.е. как вещество или композиция, которые 1) сами не способны развивать иммунную реакцию против иммуногена вакцины, но которые 2) тем не менее, способны усиливать иммунную реакцию против данного иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только адъювантом не вызывает иммунной реакции против иммуногена, вакцинация иммуногеном может вызвать или может не вызывать иммунную реакцию против этого иммуногена, но комбинирование вакцинации иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунную реакцию против данного иммуногена, которая является более сильной, чем иммунная реакция, индуцированная только иммуногеном.
Нацеливание молекулы в данном контексте означает ситуацию, в которой молекула при введении в животное будет оказываться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связываться с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может достигаться несколькими путями, в том числе путем составления данной молекулы в композиции, облегчающие нацеливание, или путем введения в эту молекулу групп, которые облегчают нацеливание. Этот вопрос будет обсуждаться подробно ниже.
Стимуляция иммунной системы означает, что рассматриваемые вещество или композиция прояв
- 7 008254 ляют общее, неспецифическое иммуностимуляторное действие. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких, как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является повышение состояния готовности иммунной системы, что означает, что одновременная или последующая иммунизация иммуногеном индуцирует значимо более эффективную иммунную реакцию в сравнении с отдельным использованием данного иммуногена.
Характеристики детоксифицированных иммуногенных аналогов ΤΝΡα согласно изобретению
Очень выгодно, если иммуногенный аналог в соответствии с данным изобретением воспроизводит, в существенных фрагментах, существенную фракцию В-клеточных эпитопов, обнаруживаемых в нативном, биологически активном ΤΝΡα. Существенной фракцией В-клеточных эпитопов в данном контексте является доля В-клеточных эпитопов, которые антигенно характеризуют ΤΝΡα в сравнении с другими белками. Предпочтительно эти существенные фрагменты отображают, по существу, все В-клеточные эпитопы, обнаруживаемые в соответствующих мономерах ΤΝΡα, когда они являются частью полимерного белка, - конечно, может быть необходимо введение минорных изменений в последовательность мономера ΤΝΡα. Например, как объяснено выше, аминокислотную последовательность из мономерной единицы модифицируют с использованием инсерции, замены, делеции или добавления аминокислот таким образом, чтобы уменьшить токсичность аналога ΤΝΡα в сравнении с нативным белком, и/или таким образом, чтобы ввести связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность, если нежелательно или неудобно иметь эту последовательность, расположенную в линкере.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения обеспечивается иммуногенный аналог ΤΝΡα согласно изобретению, где каждая из существенных фракций содержит, по существу, полную аминокислотную последовательность каждой мономерной единицы ΤΝΡα, либо в виде непрерывной последовательности, либо в виде последовательности, включающей в себя инсерты. То есть лишь незначительные части последовательности мономерной единицы ΤΝΡα отсутствуют в этом аналоге, например, в случаях, когда такая последовательность не вносит вклад в третичную структуру мономерной единицы или четвертичную структуру ΤΝΡα. Однако в этом варианте воплощения возможность замены или инсерции в мономере существует до тех пор, пока сохраняется трехмерная структура этого мультимерного белка ΤΝΡα. Таким образом, особенно выгодно, если иммуногенный аналог ΤΝΡα является аналогом, в котором аминокислотные последовательности всех мономерных единиц ΤΝΡα представлены в данном аналоге, и особенно предпочтительно, если этот аналог включает в себя полные аминокислотные последовательности (всех) мономеров, составляющих ΤΝΡα, либо в виде неразорванных последовательностей, либо в виде последовательностей, включающих в себя инсерты.
Таким образом, очевидно, что предпочтительно, чтобы трехмерная структура полного нативного, биологически активного ΤΝΡα, по существу, сохранялась в аналоге.
Демонстрация сохранения существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже трехмерной структуры ΤΝΡα, которая подвергнута модификации, описанной здесь, может быть получена несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против нативного ΤΝΡα (например, антисыворотки, полученной в кролике), и после этого использование этой антисыворотки в качестве тест-реагента (например, в конкурентном ЕЫ8А) против модифицированных белков, которые получают. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в такой же степени с этой антисывороткой, что и нативная молекула, должны рассматриваться как имеющие такую же трехмерную структуру, что и нативная молекула, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность с такой антисывороткой, рассматриваются как имеющие сохраненную существенную фракцию исходных В-клеточных эпиопов.
Альтернативно, ряд выбранных моноклональных антител, реактивных с отдельными эпитопами на нативном ΤΝΡα, может быть получен и использован в качестве тест-панели. Этот подход имеет преимущество, заключающееся в том, что он позволяет 1) картировать эпитопы ΤΝΡα и 2) картировать эпитопы, которые сохранились в полученных аналогах.
Конечно, третьим подходом является сравнение установленной трехмерной структуры нативного ΤΝΡα с установленной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть разрешена при помощи рентгенографических исследований и ЯМР-спектроскопии. Дополнительную информацию, касающуюся третичной структуры, можно в некоторой степени получить из исследований методом кругового дихроизма, преимущество которого в том, что требуется только полипептид в чистой форме (в то время, как рентгенография требует обеспечения кристаллического полипептида, а ЯМР требует обеспечения изотопических вариантов этого полипептида) для обеспечения полезной информации в отношении третичной структуры конкретной молекулы. Однако, в конечном счете, рентгенография и/или ЯМР являются необходимыми для получения заключительных данных, так как круговой дихроизм может давать только опосредованное доказательство правильной трехмерной структуры через информацию об элементах вторичной структуры.
Иммуногенный аналог ΤΝΡα согласно изобретению может включать в себя пептидный линкер, ко
- 8 008254 торый включает в себя по меньшей мере одну связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность или способствует присутствию в этом аналоге по меньшей мере одной связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности, которая является гетерологичной относительно этого мультимерного белка. Это особенно выгодно в тех случаях, когда нежелательно изменять аминокислотную последовательность, соответствующую мономерным единицам в ΤΝΕα. Альтернативно, этот пептидный линкер может не содержать связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности или не способствовать присутствию связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности в виде животного, из которого был получен этот белок ΤΝΕα; это может быть удобным образом выполнено в случаях, когда необходимо использовать очень короткий линкер, или это, как в данном изобретении, является существенным для детоксификации потенциально токсичного аналога, например, введением связывающего МНС Класса II элемента в активный сайт.
Предпочтительным является то, что связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность связывает большинство молекул МНС Класса II из вида животного, из которого был получен мультимерный белок, т.е. связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность является универсальной или смешанной.
Конечно, важно, что эта последовательность служит своей цели в качестве Т-клеточного эпитопа в виде, для которого этот иммуноген предназначен в качестве вакцинного компонента. Существует ряд природных смешанных Т-клеточных эпитопов, которые являются активными у большой доли индивидуумов видов животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в вакцине, тем самым уменьшая необходимость в очень большом количестве различных аналогов в одной и той же вакцине. Таким образом, по меньшей мере одна связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность предпочтительно выбрана из природного Т-клеточного эпитопа и искусственной связывающей МНС-П пептидной последовательности. Особенно предпочтительными последовательностями являются природный Т-клеточный эпитоп, выбранный из эпитопа столбнячного токсоида, такой как Р2 (8ЕЦ ГО N0: 2) или Р30 (8Е0 ГО N0: 4), эпитоп дифтерийного токсоида, эпитоп гемагглютинина вируса гриппа и эпитоп С8 Р. £а1с1решт.
На протяжении ряда лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую долю молекул НЬА-ΌΚ, кодируемых различными аллелями НЬА-ΌΚ, и они все являются возможными Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги, используемые в соответствии с данным изобретением. Сравните также эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, которые все включены сюда посредством ссылки: XV0 98/23635 (Ргакег ГН. е! а1., аккщпей 1о ТНе ИшуеткИу о£ ОнеегМапй); 8ои111\\'оой 8. е! а1., 1998, I. ТштипоЕ 160: 33633373; 8шщадНа Р. е! а1., 1988, №11иге 336: 778-780; С’1ис/ К.М. е! а1., 1993, I. Ехр. Мей. 178: 27-47; Наттег I. е! а1., 1993, Се11 74: 197-203 и Ра1к К. е! а1., 1994, Iттиподепе!^ск 39: 230-242. В последней ссылке также рассматриваются НЬА-ОЦ и -ОР-лиганды. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, являются релевантными в качестве природных эпитопов-кандидатов, подлежащих использованию в данном изобретении, а также эпитопы, имеющие общие с ними мотивы.
Альтернативно, эпитопом может быть любой искусственный Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую долю молекул МНС Класса II. В этом контексте пептиды пан-ОК-эпитопа (РАЭРЕ). описанные в ν0 95/07707 и в соответствующей статье А1ехапйег I. е! а1., 1994, [ттшШу 1: 751761 (оба описания включены сюда посредством ссылки), являются эпитопами-кандидатами для использования в соответствии с данным изобретением. Следует отметить, что наиболее эффективные пептиды РАОКЕ, описанные в этих статьях, несут Ό-аминокислоты на С- и Ν-концах для улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение нацелено, прежде всего, на включение релевантных эпитопов в качестве части аналога, которые должны быть впоследствии ферментативно разрушены внутри липосомного компартмента АПК, чтобы сделать возможной последующую презентацию в контексте молекулы МНС-П, и, следовательно, нецелесообразно включать Ό-аминокислоты в эпитопы, используемые в данном изобретении.
Одним особенно предпочтительным пептидом РАОКЕ является пептид, имеющий аминокислотную последовательность ΛΚΕνΛΛΧνΤΕΚΛΛΛ (8Е0 ГО N0: 6 и 8) или его иммунологически эффективную субпоследовательность. Этот и другие эпитопы, имеющие то же самое отсутствие рестрикции по МНС, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах, используемых в способе согласно изобретению. Такие суперсмешанные эпитопы делают возможными самые простые варианты осуществления изобретения, в которых только один-единственный модифицированный ΤΝΕα презентируется иммунной системе вакцинированного животного.
Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают в себя модификацию посредством введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного ТН-эпитопа. Понятно, что вопрос иммунной доминантности ТН-эпитопа зависит от вида рассматриваемого животного. Как используется здесь, термин иммунодоминантности относится просто к эпитопам, которые у вакцинированных индивидуумов приводят к возникновению значимой иммунной реакции, но хорошо известно, что ТНэпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме, необязательно является иммуно
- 9 008254 доминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже если он способен связывать молекулы МНС-11 в последнем индивидууме.
Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено путем введения по меньшей мере одной инсерции, добавления, делеции или замены аминокислоты. Конечно, в обычном случае будет осуществляться введение более одного изменения в аминокислотной последовательности (например, инсерции полного Т-клеточного эпитопа или замены полного Т-клеточного эпитопа), но важной задачей, которая должна быть достигнута, является то, чтобы этот аналог при процессировании антигенпрезентирующей клеткой (АПК) приводил к такому Т-клеточному эпитопу, представленному в контексте с молекулой МНС Класса II на поверхности АПК. Таким образом, если аминокислотная последовательность мономерной единицы в подходящих положениях содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также обнаружены в чужеродном Т-клеточном эпитопе, то введение чужеродного ТН-эпитопа может быть выполнено обеспечением остальных аминокислот этого чужеродного эпитопа посредством инсерции, добавления, делеции или замены аминокислот. Другими словами, необязательно вводить полный ТН-эпитоп инсерцией или заменой.
Согласно данному изобретению аналог может также образовывать часть большей молекулы, в которой он связан по меньшей мере с одной функциональной частью молекулы, присутствие которой в значительной степени отрицательно не влияет на доступность антитела этого аналога. Природа таких частей молекул (которые могут быть слиты с аналогом) может быть такой, что она обеспечивает нацеливание этой модифицированной молекулы на антигенпрезентирующую клетку (АПК) или В-лимфоцит, для стимуляции иммунной системы и для оптимизации презентации этого аналога иммунной системе.
Нацеливающие части молекул предпочтительно выбирают из группы, состоящей из партнера, по существу, специфического связывания для В-лимфоцит-специфического поверхностного антигена или для АПК-специфического поверхностного антигена, такого как гаптен или углевод, для которых имеется рецептор на В-лимфоците или АПК. Иммуностимулирующие части могут быть выбраны из группы, состоящей из цитокина, гормона и белка теплового шока. Оптимизирующая презентацию часть молекулы может быть выбрана из группы, состоящей из липидной группы, такой как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранилгеранильная группа, СР1-якорь и Ν-ацилдиглицеридная группа.
Подходящим цитокином является интерферон γ (ΙΡΝγ), Р113Ь, интерлейкин 1 (1С-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь-4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Ь-12) интерлейкин 13 (1С-13), интерлейкин 15 (1С-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р) или эффективная часть любого из них.
Подходящим белком теплового шока является Н8Р70, Н8С70, СКР94 и калретикулин (СРТ) или эффективная часть любого из них. Предпочтительно, чтобы количество аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений было равно по меньшей мере 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 25 инсерциям, заменам, добавлениям или делециям. Кроме того, предпочтительно, чтобы количество аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений не превышало 150, например было равно максимально 100, максимально 90, максимально 80 и максимально 70. Особенно предпочтительно, чтобы количество замен, инсерций, делеций или добавлений не превышало 60, и в частности это количество не должно превышать 50 или даже 40. Наиболее предпочтительно это количество равно не более 30. Что касается добавлений аминокислот, следует отметить, что, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, их количество часто является значительно более высоким, чем 150.
Предпочтительные варианты согласно изобретению включают в себя модификацию путем введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного ТН-эпитопа (=чужеродной связывающей МНС Класса II аминокислотной последовательности). Будет понятно, что вопрос иммунодоминантности ТН-эпитопа зависит от вида рассматриваемого животного. Как используется здесь, термин иммунодоминантность относится просто к эпитопам, которые в вакцинированном животном приводят к возникновению значимой иммунной реакции, но хорошо известно, что ТН-эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме, необязательно является иммунодоминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже если он способен связывать молекулы МНС-П в последнем индивидууме.
Другим важным моментом является проблема рестрикции по МНС ТН-эпитопов. Обычно природные ТН-эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенный пептид, составляющий ТНэпитоп, будет эффективно связываться только с субпопуляцией молекул МНС Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев использование одного специфического ТН-эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который является эффективным только в части этой популяции, и, в зависимости от размера этой фракции, может быть необходимым включение большего количества ТН-эпитопов в ту же самую молекулу или, альтернативно, приготовление мультикомпонентной вакцины, в которой эти компоненты являются вариантами, которые отличаются друг от друга природой введенного ТН-эпитопа.
Если рестрикция по МНС Т-клеток является полностью неизвестной (например, в ситуации, когда вакцинируемое животное имеет плохо определенный состав МНС), часть популяции животных, охватываемая конкретным составом вакцины, может быть определена с использованием следующей формулы:
- 10 008254 л
^ρορ^υοη ^Ι-ΓΒ1 -Ρ/) (Ι) /-1 где ρ1 является частотой в популяции респондеров на ί'1' чужеродный Т-клеточный эпитоп, присутствующий в вакцинной композиции, а η равно общему количеству чужеродных Т-клеточных эпитопов в вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющая частоты реакции в этой популяции 0,8, 0,7 и 0,6, соответственно, будет давать
- 0,2 х 0,3 х 0,4 = 0,976
т.е. 97,6% этой популяции будет статистически развивать МНС-11-опосредованную реакцию на эту вакцину.
Приведенная выше формула не приложима в ситуациях, когда более или менее точная картина МНС-рестрикции этих пептидов является известной. Если, например, определенный пептид связывает только молекулы МНС-11 человека, кодируемые аллелями ΌΚ1, ΌΚ3, ΌΚ5 и ΌΚ7 НЬА-ОК, то применение этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы МНС-ΙΙ, кодируемые аллелями НЬА-ΌΚ, будет давать 100% охват в рассматриваемой популяции. Подобным образом, если второй пептид связывает только ΌΚ3 и ΌΚ5, добавление этого пептида вообще не будет увеличивать охвата. Если оценивать реакцию популяции, основываясь исключительно на МНС-рестрикции Тклеточных эпитопов в вакцине, часть этой популяции, охватываемая специфической вакцинной композицией, может быть определена по следующей формуле:
з (п) где φ1 является суммой частот в этой популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают любой один из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к)''' из 3 известных НЬЛ-локусов (ΌΡ, ΌΚ и ЭР): на практике, сначала определяют, какие молекулы МНС будут узнавать каждый Т-клеточный эпитоп в этой вакцине, после чего эти молекулы МНС перечисляют по типу (ΌΡ, ΌΚ и ЭР), затем индивидуальные частоты разных перечисленных аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, с получением в результате φ1, φ2 и φ3.
Может быть ситуация, когда величина ρ1 в формуле I превышает теоретическую величину η1:
м где ν является суммой частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают ί'1' Т-клеточный эпитоп в вакцине и которые принадлежат к из 3 известных НЬА-локусов (ΌΡ, ΌΚ и ЭР). Это означает, что в 1-η1 популяции имеется частота респондеров ΓινίΙΗ,ΙΗιι=(ρι-πι)/(1-πι). Таким образом, формула II может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу IV:
где член Гге81аиа1_1 принимают за ноль, если он отрицательный. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы были картированы по гаплотипу против идентичных наборов гаплотипов.
Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналоги согласно изобретению важно учитывать все доступные сведения об этих эпитопах: 1) частоту респондеров в данной популяции для каждого эпитопа, 2) данные по МНС-рестрикции и 3) частоту в популяции релевантных гаплотипов.
Следует отметить, что предпочтительные аналоги согласно изобретению содержат модификации, которые приводят к полипептиду, который включает в себя отрезки (участки), имеющие последовательности, идентичные по меньшей мере на 70% соответствующим мономерным единицам ΤΝΕα или их субпоследовательностям с длиной по меньшей мере 10 аминокислот. Предпочтительной является более высокая идентичность последовательностей, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80 или 85%. Идентичность последовательности для белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как (ΝΙϊΓ-ΝάίΓ)· 100/ΝκΓ, где Ν41Γ равно общему числу неидентичных остатков в этих двух последовательностях при сопоставлении и где ΝγΓ равно числу остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, ДНК-последовательность АРТСАРТС будет идентична последовательности ААТСААТС на 75% (ΝΛί=2 и Νκί=8).
Наконец, для заключительного подтверждения, что аналог ΤΝΕα согласно изобретению действительно является эффективным в качестве иммуногена, могут быть выполнены различные тесты для обеспечения необходимого подтверждения. В этой связи сюда включена ссылка на νθ 00/65058, где обсуждается идентификация применимых аналогов ГЕ-5, - это описание может быть использовано для подтверждения применимости рассматриваемого аналога (полученного из [Б-5 или не полученного из ^-5) в способе согласно изобретению.
Предпочтительный аналог ΤΝΕα выбирают из группы, состоящей из 1) двух или трех полных мо
- 11 008254 номеров ΤΝΕα. соединенных непрерывно (один за другим) пептидным линкером, где по меньшей мере один пептидный линкер включает в себя по меньшей мере одну связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность. и 2) двух или трех полных мономеров ΤΝΕα. соединенных непрерывно (один за другим) инертным пептидным линкером. где по меньшей мере один из мономеров включает в себя по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность или где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность слита с Ν- или С-концевым мономером. необязательно через инертный линкер.
Особый интерес представляют иммуногенные молекулы ΤΝΕα с высокой стабильностью. так как ранее авторами изобретения было обнаружено. что мономерные конструкции ΤΝΕα имеют тенденцию быть относительно нестабильными. см.. однако. обсуждение ниже.
Ранее был получен ген. кодирующий 3 субъединицы ΤΝΕα. связанные вместе эпитопами и/или инертными пептидными линкерами. Задачей было создание вариантных молекул ΤΝΕα с конформацией настолько близкой к нативному тримеру ΤΝΕα. насколько это возможно. Эти варианты были сконструированы для эффективной индукции нейтрализующих антител против \\1ΤΝΕα. Было обнаружено. что наиболее подходящие варианты ΤΝΕα являются растворимыми и стабильными белками в отсутствие детергентов или другого типа добавок. которые могли бы нарушать конформацию белка.
Последующее обсуждение сосредоточено на предпочтительных модификациях ΤΝΕ. которые не относятся к детоксификации рег 8е.
Посредством экспрессии трех мономеров. связанных вместе в виде одной-единственной полипептидной цепи с использованием линкеров и Тн-эпитопов. предполагается получить варианты ΤΝΕα. которые являются более стабильными. чем прежние вариантные иммуногены ΤΝΕα. Это позволяет сохранить структуру ΤΝΕα посредством введения необходимых Тн-эпитопов вне стабилизирующих водородных связей. солевых мостиков или дисульфидных мостиков.
Из кристаллической структуры ΤΝΕα. полученной с помощью рентгеноструктурного анализа. видно. что первые 5 остатков Ν-конца являются слишком гибкими. чтобы сделать возможным определение структуры. Однако С-конец расположен близко к середине границы раздела мономеров и является менее гибким. Расстояние между С-альфа-атомами Агд-6 и Ьеи-157 равно 10 А. что соответствует отрезку 3-4 аминокислотных остатков. Таким образом. связывание этих мономерных субъединиц непосредственно вместе оказывается возможным. но. поскольку С-концы расположены в чувствительном сайте. предпочтительно использовать гибкие линкеры. например глициновые линкеры. для этого соединения.
Пока сконструировано пять вариантов. в которых используется подход мономеризованного тримера. Контрольный ΤΝΕ_Τ0 (ΤΝΕα-тример номер 0. 8ЕО ГО ΝΟ: 22 в ΧνΟ 03/042244) состоит из трех мономеров. непосредственно связанных вместе 2 отдельными глициновыми линкерами (С1уС1уС1у). ΤΝΕ_Τ0 сконструирован таким образом. чтобы он был таким же стабильным. как и тримерный белок дикого типа. Конечно. другие инертные гибкие линкеры. известные в области химии белков. могут быть использованы вместо вышеупомянутых глициновых линкеров. причем важным признаком является то. что этот гибкий линкер не должен действовать неблагоприятным образом на способность фолдинга мономеризованного белка в трехмерную структуру. которая является сходной с трехмерной структурой физиологически активного \\1ΤΝΕα.
Конструкция ΤΝΕ_Τ0 экспрессируется в виде растворимого белка в Е. сой. и она была использована для получения конструкции-примера ΤΝΕ_Τ4 (см. XVО 03/042244). которая является вариантом. в котором введен связывающий МНС Класса II РАИКЕ (8ЕО ГО ΝΟ: 6). В этой конструкции отношение между мономерными единицами и чужеродными эпитопами равно. следовательно. 1 эпитопу на 3 мономера. вместо отношения 1 эпитоп на мономер. как это имеет место в вариантах предыдущего уровня техники. которые основаны на иммуногенизированных мономерных белках (это также имеет место для 8ЕО ГО ΝΟ: 55 в ΧνΟ 03/042244). Этот факт обеспечивает потенциально положительное влияние на стабильность тримера. Полученным при таком подходе продуктом является вариант ΤΝΕ_Ο2 (см. ΧνΟ 03/042244). который является мономером ΤΝΕα с эпитопом РАИКЕ в том же положении. что и положение в ΤΝΕ_Τ4.
Параллельно. эпитопы столбнячного токсоида Р2 и Р30 (8ЕО ГО ΝΟ: 2 и 4. соответственно) использовали в вариантах ΤΝΕ_Τ1 и ΤΝΕ_Τ2 (см. ΧνΟ 03/042244). содержащих один эпитоп в каждом линкерном районе. а также в ΤΝΕ_Τ3 (см. XVΟ 03/042244). который содержит один С-концевой эпитоп и один эпитоп во втором линкерном районе. Белки являются. в основном. уложенными от Ν-конца к С-концу. Идея. лежащая в основе ΤΝΕ_Τ3. заключается в том. что. когда первые два Ν-концевых домена уложены. они будут функционировать как внутренние шепероны для третьего домена (мономера). который фланкирован эпитопами.
В XVΟ 03/042244 описано. что. кроме способа. описанного подробно выше. где полимерные белки являются мономеризованными. ΤΝΕα (и. возможно. другие мультимерные белки) позволяют получать мономеры. которые 1) включают в себя по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию и/или 2) включают в себя по меньшей мере одну не происходящую из ΤΝΕα связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность. где эти мономерные варианты ΤΝΕα способны правильно укладываться в
- 12 008254 третичную структуру, которая затем делает возможным образование димерных и тримерных белков ΤΝΕα, имеющих правильную четвертичную структуру (что доказывается этими белками, имеющими рецепторсвязывающую активность). Таким образом, в этих конструкциях можно было получить варианты мономерного ΤΝΕα, который необязательно должен быть образован в виде мономеризованных тримеров, так как изменения, вводимые в мономерные последовательности, вводят настолько ограниченное нарушение третичной структуры мономера, что может образовываться ди- или тример. В соответствиии с идеями, лежащими в основе данного изобретения, дополнительно было обнаружено, что все такие варианты являются экспрессируемыми в виде растворимых белков из бактериальных клеток.
Таким образом, была показана возможность получения иммуногенных вариантов ΤΝΕα в соответствии со следующими стратегиями, которые могут быть объединены и которые могут быть дополнительно объединены с уже обсужденным подходом мономеризации согласно изобретению (так как все эти конкретные модификации являются недеструктивными по природе).
Стратегия гибкой петли
Авторами данного изобретения было обнаружено, что инсерция эпитопа ΡΑΌΚΕ (БЕС ΙΌ N0: 6) в петлю 3 в положении С1у108-А1а109 является перспективным подходом к получению вариантов ΤΝΕα со структурой, близко сходной с нативной молекулой ΤΝΕα. На основании кристаллической структуры ΤΝΕα было установлено, что Тн-эпитоп, инсертированный непосредственно в это положение, не будет иметь по соседству никаких близко расположенных для взаимодействия с ним аминокислотных остатков. Исследования с ΤΝΕ34 (см. \У0 03/042244), первой конструкцией ΡΑΌΚΕ, изготовленной в соответствии с этим подходом, показали, что приблизительно 5% экспрессируемого белка ΤΝΕ34 были растворимыми в Е. со11 и 95% ΤΝΕ34 экспрессировались в виде телец включения при выращивании бактериальных клеток-хозяев при 37°С, но после адаптации ферментационного процесса, где температура ферментации 25°С, выходы растворимого белка в случае такой ферментации были близки к 100%. Таким образом, оптимизация условий выращивания увеличивает выход растворимого белка.
Был получен ряд других конструкций (ΤΝΕ35-ΤΝΕ39, см. XVО 03/042244), которые все основаны только на введении ΡΑΌΚΕ в гибкую петлю 3. Далее предполагается в соответствии с данным изобретением, что введение чужеродного эпитопа может быть произведено в других частях петли 3 или даже вне петли 3. Особенно интересные инсерции рассматриваются, и инсерция чужеродного эпитопа, такого как ΡΑΌΚΕ или Р2 или Р30, может быть предпочтительно получена после любой из аминокислот 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 и 118 в ΤΝΕα человека. Однако выгодными считаются также замены в том же самом диапазоне аминокислот (т.е. замена одной-единственной или нескольких последовательных аминокислот 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 и 118 в ΤΝΕα человека).
Усиливающие стабильность мутации
Введение Тн-эпитопов в гибкой петле 3 могло бы потенциально дестабилизировать структуру варианта ΤΝΕα. Однако этой потенциальной дестабилизации может быть противопоставлена стабилизация этой структуры посредством введения цистеинов, которые будут образовывать дисульфидный мостик. До сих пор пара цистинов в двух различных положениях была введена в вариантах ΤΝΕ34-Α и ΤΝΕ34-Β (см. ν0 03/042244). Параллельно может быть также делетирован гибкий Ν-конец (первые 8 аминокислот), который, как известно, уменьшает силу взаимодействия с рецептором, с получением варианта ΤΝΕ34-Ο (см. ν0 03/042244). Дисульфидный мостик вводят в мономер для стабилизации сайта инсерции эпитопа вместе с природным дисульфидным мостиком (Сук-67 Сук-101). Считается, что в случае такой стратегии также стабилизируется как мономер ΤΝΕα, так и мономеризованный ди- или тример.
Другие конструкции
Несколько разных стратегий использовали при конструировании вариантов, которые будут растворимыми продуктами экспрессии. ΤΝΕΧ1.1-2 (см. ν0 03/042244) основан на инсерциях ΡΑΌΚΕ в первую петлю ΤΝΕα, где сайт инсерции локализован в области интрона. В ΤΝΕΧ2.1 (см. ν0 03/042244) создан искусственный район ножки, содержащий инсерцию ΡΑΌΚΕ.
В результате мутаций ΤΝΕα было выявлено, что большие замены гидрофобных аминокислот, направленные в область контакта тримера, стабилизируют структуру тримера. ΤΝΕΧ3.1 и ΤΝΕΧ3.2 (см. ν0 03/042244) являются предложениями стабилизировать существующий вариант ΤΝΕ34. В случае ΤΝΕΧ4.1 (см. ν0 03/042244) используются диглициновые линкеры для уменьшения структурных ограничений из-за пептида ΡΑΌΚΕ на общую структуру ΤΝΕ34. В ΤΝΕΧ5.1 (см. ν0 03/042244) используется, в качестве точки инсерции, структура петли, обнаруженная у члена семейства ΤΝΕ В1уБ. ΤΝΕΧ6.1-2, ΤΝΕ7.1-2 и ΤΝΕΧ8.1 (см. ν0 03/042244) являются дополнительными вариантами. ΤΝΕΧ9.1 и ΤΝΕΧ9.2 (см. ν0 03/042244) являются вариантами ΤΝΕ34, в которых использованы идентичные перекрывающиеся ΤΝΕα-последовательности из 4-6 аминокислот, как перед эпитопом, так и после эпитопа. Наконец, два варианта (ББО ΙΌ Ν0: 46 и 47 в ν0 03/042244) являются двойными вариантами Р2/Р30 в том же самом положении, что и пептид ΡΑΌΚΕ в ΤΝΕ34.
Далее, было обнаружено в кристаллической структуре ΤΝΕα, что один стабилизирующий солевой мостик присутствует в мономере ΤΝΕα между остатками Бук-98 и С1ц-116. Объяснением солевого мос
- 13 008254 тика является электростатическое взаимодействие между атомами кислорода боковых цепей Азр или О1и и положительно заряженными атомами азота боковых цепей Агд, Ьуз или Н1з с межатомным расстоянием менее 7,0 А. Посредством сайт-направленных мутаций-замен Ьуз-98 на Агд или Н1з в этом положении в комбинации с заменами О1и-116 на Азр может быть достигнуто улучшение стабильности солевого мостика и тем самым стабильности тримерной молекулы. Можно также заменить эти солевые мостики на дисульфидные мостики, как описано выше.
Обнаружено, что мышиный ΤΝ1α является значительно более стабильным, чем ΤΝ1α человека, в отношении растворимости и протеолиза. Улучшение вариантов ΤΝΡα включает в себя получение сайтнаправленных мутантов, так чтобы имитировать кристаллическую структуру мышиного ΤΝ1 ('/., для получения более протеолитически стабильного продукта ΤΝΡ α.
Из рентгеновских структур ΤΝΡ α человека и мыши видно, что центр тримера (в середине трех мономеров ΤΝΡ α) удерживается вместе вследствие гидрофобных сил, в то время как верхняя часть и нижняя часть тримера соединены вследствие природных солевых мостиков. Таким образом, посредством скрининга этих солевых мостиков на более сильные связи стабильность тримера ΤΝΡα также может быть улучшена.
В целом, до сих пор были получены следующие специфические варианты ΤΝΡ α.
Конструкции ΤΝΡα | Последняя аминокислота (аа) перед эпитопом | Первая аминокислота (аа) после эпитопа | Аминокислоты, делегированные инсертом | Мутации | Общая длина |
ΤΝΕ34 | 108 | 109 | - | 170 | |
ΤΝΕ35 | 106 | 107 | - | 170 | |
ΤΝΕ36 | 107 | 108 | - | 170 | |
ΤΝΕ37 | 108 | 110 | А | 169 | |
ΤΝΕ38 | 108 | 112 | АЕА | 167 | |
ΤΝΕ39 | 106 | 112 | ЕСАЕА | 165 | |
ΤΝΕΟ2 | 170 | ССС+ΡΑϋΒΕ, добавленные на С-конце | 173 | ||
ΤΝΕ34-Α | 108 | 109 | - | О67С,А111С | 170 |
ΤΝΕ34-Β | 108 | 109 | - | А96С,1118С | 170 |
ΤΝΕ34-Ο | 108 | 109 | Ν-концевые УКЗЗЗКТР делегированы | 162 | |
ΤΝΕΧ1.1 | 17 | 19 | А | 169 | |
ΤΝΕΧ1.2 | 17 | 96 | ΑΝΡ0Α | 165 | |
ΤΝΕΧ2.1 | 0 | 2 | V | РАШЗЕ, добавленный на Ν-конце | 170 |
ΤΝΕΧ3.1 | 108 | 109 | - | Ы57Е | 170 |
ΤΝΕΧ3.2 | 108 | 109 | - | У49Е | 170 |
ΤΝΕΧ4.1 | 108 | 109 | Два глицина перед и после ΡΑϋΒΕ | 174 | |
ΤΝΕΧ5.1 | 83 | 87 | АУЗ | 167 | |
ΤΝΕΧ6.1 | 132 | 146 | 3ΑΕΙΝΚΡϋΥΣΟΓΑ | 157 | |
ΤΝΕΧ6.2 | 135 | 146 | ΙΝΚΡϋΥΣϋΕΑ | 160 | |
ΤΝΕΧ7.1 | 63 | 77 | ЕКСОССРЗТНУЪЪ | 157 | |
ΤΝΕΧ7.2 | 71 | 85 | ТНУЬЬТНТ13В1А | 157 | |
ΤΝΕΧ8.1 | 126 | 140 | ΕΚΘϋΚΙι3ΑΕΙΝΒΡ | 157 | |
ΤΝΕΧ9.1 | 108 | 103 | Шесть аминокислот, предшествующих ΡΑΩΡΕ, удвоены после этого эпитопа | 176 | |
ΤΝΕΧ9.2 | 108 | 105 | Четыре аминокислоты, предшествующие ΡΑΩΡΕ, удвоены после этого эпитопа | 174 | |
ΤΝΕΧ34- Р2-Р30 | 108 | 109 | Как Р2, так и РЗО | 194 | |
ΤΝΕΧ34- Р30-Р2 | 108 | 109 | Как РЗО, так и Р2 | 194 |
- 14 008254
Используемая здесь нумерация ведется от Ν-концевого V в 8ЕО ΙΌ N0: 10 (т.е. от аминокислоты № 2 в 8Е0 ΙΌ N0: 10). Предшествующий Ν-концевой валин является в некоторых последовательностях метионином, используемым в качестве сайта трансляции.
Все обсуждаемые выше варианты ΤΝΡα. которые описаны в XV0 03/042244, являются детоксифицированными согласно данному изобретению.
В данной области известен ряд точковых мутаций, необходимых для детоксификации ΤΝΕα или, по меньшей мере, уменьшения токсичности в наибольшей степени. Эти точковые мутации будут, если необходимо, вводиться в варианты согласно изобретению. Особенно предпочтительными мутациями являются замены, соответствующие зрелому ΤΝΕα, Туг-87 на 8ег, Αδρ-143 на Αδη и А1а-145 на Агд. Далее, все эффективные мутации, упомянутые в Ьое18сйег, Н., 81иеЬет, Ό., Ваппег, 8., Маскау, Ε. и Ье881аиег, V. 1993 1ВС 268 (35) 26350-7, также являются представляющими интерес детоксифицирующими мутациями в вариантах воплощения согласно изобретению. Эти точковые мутации могут быть использованы с любой из конкретных конструкций, описанных в νθ 03/042244.
Таким образом, наиболее предпочтительными конструкциями белка согласно изобретению являются конструкции, представленные любой из 8Е0 ΙΌ N0: 12, 13, 14, 16, 17 и 18, а также любая аминокислотная последовательность, полученная из них, которая включает в себя только консервативные замены аминокислот.
В любом случае, важным вариантом осуществления является то, что все из обсужденных выше вариантов ΤΝΕα могут экспрессироваться в виде растворимых белков из бактериальных клеток, таких как Е. со11.
Предпочтительным вектором является рЕТ28Ь+, когда задачей является экспрессия из Е. сой, ρ2Ζορ2Ε (8Е0 ΙΌ N0: 60 в ν0 03/042244) является вектором, используемым для экспрессии в клетках насекомых, и рНР1 (или его коммерчески доступный близнец рС1) является вектором, используемым для экспрессии в клетках млекопитающих.
Общие терапии, обеспечиваемые данным изобретением
Данное изобретение относится к способам, посредством которых становится возможной очень выгодным образом понижающая регуляция ΤΚΕα очень выгодным образом.
В общем, обеспечен способ понижающей регуляции Τ\Εα у аутологичного хозяина, предусматривающий выполнение презентации иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога ΤΉΕα согласно изобретению. Предпочтительно этим аутологичным хозяином является млекопитающее, наиболее предпочтительно человек.
Этот способ может быть применен на практике различными путями, одним из которых является введение белковой вакцины, но стратегия вакцинации нуклеиновыми кислотами или стратегия живой вакцинации также представляют интерес.
Белковая/полипептидная вакцинация и приготовление композиции
При выполнении презентации аналогов иммунной системе животного посредством введения их этому животному в технологии приготовления полипептида следуют принципам, общепризнанным в данной области.
Приготовление вакцин, которые содержат пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как представлено в качестве примера в патентах США 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, которые включены сюда посредством ссылки. Обычно такие вакцины готовят как для инъекций, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены в твердой форме, пригодной для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Этот препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферирующие рН агенты или адъюванты, которые усиливают эффективность этих вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов ниже.
Вакцины обычно вводят парентерально, инъекцией, например, либо подкожно, внутрикожно, либо внутримышечно. Другие готовые формы, которые являются пригодными для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, сублингвальные, внутрибрюшинные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные композиции. Для суппозиториев традиционные связывающие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно применяемые эксципиенты, как, например, фармацевтические категории маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, натрий-сахарина, целлюлозы, карбоната магния и т. п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, форм пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25
- 15 008254
70%. Для пероральных композиций представляющим интерес партнером композиции (а также возможным партнером конъюгации) является холерный токсин.
Полипептиды могут быть составлены в вакцину в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами пептида), которые образованы с неорганическими солями, такими как, например, хлористо-водородная и фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная кислоты и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также образованы из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.
Вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от получающего лечение субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума развивать иммунную реакцию и от степени желаемой защиты. Подходящие диапазоны доз являются диапазонами порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на вакцинацию с предпочтительным диапазоном приблизительно от 0,1 до 2000 мкг (хотя обсуждаются даже еще более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне приблизительно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг, и в частности в диапазоне приблизительно от 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для первоначального введения и бустерных инъекций также являются вариабельными, но обычно характеризуются начальным введением, за которым следуют последующие инокуляции или другие введения.
Способ применения может широко варьироваться. Любые из общепринятых способов введения вакцины являются применимыми. Они включают в себя пероральное введение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентеральное введение, инъекцией или т. п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет варьироваться в зависимости от возраста вакцинируемого субъекта и композиции антигена.
Некоторые аналоги вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунная реакция будет усиливаться, если эта вакцина дополнительно содержит вещество-адъювант.
Известны различные способы достижения адъювантного эффекта для вакцины. Общие принципы и способы подробно описаны в ΤΗβοτγ апб Ргасбса1 Αρρίίοαίίοη ο£ ΛφίιιναηΙκ. 1995, Иипсап Е.8. 81с\\'аг1Τυίί (еб.), ίοΗη \УПсу & 8οηκ Иб. Ι8ΒΝ 0-471-95170-6, а также в Уассшск: №\ν СспспЦюп Ιιηιηιιηο1οβ№1 Аб^аШв, 1995, С^сдο^^аб^κ С. с! а1. (ебк.), Ркшт Ргекк, №\ν ΥοΑ, Ι8ΒΝ 0-306-45283-9, обе включены сюда посредством ссылки.
Особенно предпочтительно использование адъюванта, который, как может быть продемонстрировано, облегчает разрушение аутотолерантности к аутоантигенам. Неограничивающие примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из иммуннонацеливающего адъюванта; иммунномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллу адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикса 18СОМ); частицы; ΌΌΑ; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; γинулина и инкапсулирующего адъюванта. В целом, следует отметить, что приведенные выше описания, которые относятся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в этих аналогах, относятся также пиПаОк ти1анб1к к их использованию в адъюванте вакцины согласно изобретению.
Применение адъювантов включает в себя использование таких агентов, как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемых в виде 0,05-0,1% раствора в забуференном солевом растворе, смеси с синтетическими полимерами сахаров (например, Са^Ьορο1®), используемыми в виде 0,25% раствора, и возможна агрегация белка в вакцине при нагревании до температур в диапазоне между 70 и 101°С в течение периодов 30 с - 5 мин, соответственно, а также агрегация сшивающими агентами. Может быть также использована агрегация, которая получена в результате реактивации обработанных пепсином антител (ЕаЬ-фрагментов) против альбумина, смесь с бактериальными клетками, такими как С. раг^'ит, или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами грамположительных бактерий, эмульгирование в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как моноолеат маннида (Агасс1 Α), или эмульгирование с 20% раствором перфторуглерода (Είποκοί-ΌΑ), используемым в качестве блокзаменителя. Предпочтительны также смеси с маслами, такими как сквален и ΙΕΑ.
В соответствии с данным изобретением ΌΌΑ (бромид диметилдиоктадециламмония) является представляющим интерес адъювантом-кандидатом, как и ДНК и γ-инулин, но также полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины 0ш11а_)а, такие как ΟυίΙΑ и 0821, представляют интерес, как и ΚΙΒΙ. Кроме того, возможно применение монофосфориллипида Α (МРЬ), вышеуказанных С3 и С3б и мурамилдипептида (МИР).
Известно также, что липосомные композиции обладают адъювантным действием, и, следовательно, липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением.
Кроме того, иммуностимулирующие адъюванты комплексного матриксного типа (матрикс
- 16 008254
18С0М®) являются предпочтительными согласно изобретению, в частности, поскольку было показано, что этот тип адъювантов способен положительно регулировать экспрессию МНС Класса II клетками АПК. Матрикс 18С0М® состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) из 0ш11а)а варопапа, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная состоящая из частиц композиция является тем, что называют 18С0М-частицей, в которой сапонин составляет 60-70 мас.%, холестерин и фосфолипид 10-15 мас.% и белок 10-15 мас.%. Подробности, касающиеся состава и применения иммуностимулирующих комплексов, могут быть найдены в вышеупомянутых справочниках по адъювантам, а также у Могеш В. е1 а1., 1995, С1т. 1ттипо111сг. 3: 461-475, а также у Вагг 1.6. апй Мйсйе11 6.Ρ., 1996, 1ттипо1. апй Се11 Вю1. 74: 8-25 (обе включены сюда посредством ссылки), которые обеспечивают полезные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов.
Другой представляющей большой интерес (и, следовательно, предпочтительной) возможностью получения адъювантного эффекта является использование способа, описанного в Соввейп е1 а1., 1992 (включенном сюда посредством ссылки). Вкратце, презентация релевантного антигена, такого как антиген согласно изобретению, может быть усилена конъюгацией этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Рсу-рецепторов на моноцитах/макрофагах. Было показано, в частности, что конъюгаты между антигеном и антителом против РсуШ усиливают иммуногенность вакцин.
Другие возможности включают в себя использование нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (т.е. цитокинов), упомянутых в формуле изобретения в качестве частей молекулы для белковых конструкций. В этой связи возможными являются также синтетические индукторы цитокинов, подобные поли 1:С.
Подходящие микобактериальные производные выбирают из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, КРВ1 и диэфира трегалозы, такого как ТОМ и ΤΌΕ.
Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбирают из группы, состоящей из лиганда ΓΌ40 и антител ί.Ό40 и их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, РаЬ-фрагмента и СТЕ-Л-4.
Подходящие полимерные адъюванты выбирают из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера и латекса, такого как латексные гранулы.
Другим представляющим интерес способом модуляции иммунной реакции является включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в виртуальный лимфатический узел (νΣΝ) (патентованное медицинское устройство, разработанное ^типо^етру, 1пс., 360 ЬехтдЮп Луепие, Ыете Υо^к, ΝΥ 10017-6501). νΕΝ (устройство в виде тонкой трубки) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Введение νΒΝ под кожу создает сайт (участок) стерильного воспаления с повышением цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АПК быстро отвечают на сигнал опасности, устремляются к этому воспаленному участку и накапливаются внутри пористого матрикса νΈΝ. Было показано, что необходимая доза антигена, требуемая для развития иммунной реакции на антиген, уменьшается с использованием νΈΝ и что иммунная защита, сообщаемая вакцинацией с использованием νΈΝ, превосходила общепринятую иммунизацию с использованием ШЬ1 в качестве адъюванта. Этот способ описан 1.а. вкратце у 6е1Ьег С. е1 а1., 1998, ЕНсИайоп о£ ВоЬнв! Се11и1аг апй Нитога1 1ттипе Вевропвев 1о 8та11 ЛтонШв о£ 1ттнподепв Ивтд а №уе1 Мей1са1 Ое\тсе Оевщпа1ей 111е νίΠι.ιη1 Ьутрй №йе, ш: Ргот 1йе ЬаЬогаФгу 1о 111е Сйшк, Воок о£ ЛЬв1гас1в, 0с1оЬег 124Ь-154Ь 1998, 8еавсаре Невой, Лр!ов, СаШогша.
Ожидается, что эта вакцина должна вводиться по меньшей мере 1 раз в год, например по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 12 раз в год. Более конкретно, ожидается введение 1-12 раз в год, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 раз в год индивидууму, нуждающемуся в этом введении. Ранее было показано, что память иммунитета, индуцированная использованием предпочтительных аутовакцин в соответствии с данным изобретением, не является перманентной, и, следовательно, иммунная система должна периодически стимулироваться этими аналогами.
Вследствие генетической изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать иммунными реакциями варьирующейся силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина по данному изобретению может содержать несколько различных полипептидов для увеличения иммунной реакции, см. также обсуждение, приведенное выше, касающееся выбора введений чужеродных Т-клеточных эпитопов. Эта вакцина может содержать два или более полипептидов, где все полипептиды являются полипептидами, определенными выше.
Вакцина может, следовательно, содержать 3-20 различных аналогов, например 3-10 аналогов. Однако обычно количество аналогов будет поддерживаться на минимальном уровне, таком как 1 или 2 аналога.
Вакцинация нуклеиновыми кислотами
Как очень важная альтернатива классическому введению вакцины на основе пептидов, способ вакцинации нуклеиновыми кислотами (также известный как иммунизация нуклеиновыми кислотам, генетическая иммунизация и генная иммунизация) обладает рядом привлекательных признаков.
Прежде всего, в отличие от традиционного подхода к вакцинам, вакцинация нуклеиновыми кисло
- 17 008254 тами не требует интенсивно потребляющего ресурсы крупномасштабного получения иммуногенного агента (например, в виде ферментации в промышленном масштабе микроорганизмов, продуцирующих белки). Кроме того, нет необходимости в разработке схем очистки и рефолдинга для иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основана на биохимическом аппарате вакцинируемого индивидуума для получения продукта экспрессии вводимой нуклеиновой кислоты, ожидается, что происходит оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это, в частности, важно в случае аутовакцинации, поскольку как упоминалось выше, значительная доля исходных В-клеточных эпитопов полимера должна быть сохранена в модифицированной молекуле и поскольку В-клеточные эпитопы, в принципе, могут быть составлены частями любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, нативные картины гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть очень важными для общей иммуногенности, и ожидается, что это гарантируется наличием хозяина, продуцирующего данный иммуноген.
Следует отметить, что увеличенные уровни экспрессии, наблюдаемые для некоторых из раскрытых в настоящее время аналогов, являются очень важными для эффективности ДНК-вакцинации, так как уровень экспрессии ίη νίνο является одним из определяющих факторов в иммуногенной эффективности ДНК-вакцины.
Таким образом, предпочтительный вариант осуществления согласно изобретению включает в себя выполнение презентации аналога согласно изобретению иммунной системе введением нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующих этот аналог, в клетки животного и получение посредством этого экспрессии ίη νίνο этими клетками этой нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
В этом варианте осуществления введенной нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК, которая может быть в форме голой ДНК, ДНК, составленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, заключенной в липосомы, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, составленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, составленной с нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, составленной с кальций-осаждающими агентами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимер, например в РЬСА (см. способ микроинкапсулирования, описанный в №0 98/31398) или в хитин или хитозан, и ДНК, составленной с адъювантом. В этом контексте отмечается, что практически все примеры, относящиеся к использованию адъювантов при приготовлении традиционных вакцин, приложимы для приготовления ДНК-вакцин. Таким образом, все приведенные здесь описания, которые относятся к использованию адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, могут применяться ιηιιΐηΐίδ ти1апй18 в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами.
Что касается способов введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые подробно описаны выше, они также применимы для вакцин нуклеиновых кислот согласно изобретению, и все описания выше, относящиеся к способам введения и схемам введения для полипептидов, применимы ти1а118 ιηιΠηηάίδ к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины нуклеиновых кислот могут быть легко введены внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что вакцины нуклеиновых кислот могут быть введены с использованием так называемого генного пистолета, и, следовательно, также и этот и эквивалентные способы введения рассматриваются как часть данного изобретения. Наконец, сообщалось также, что использование ΥΈΝ во введении нуклеиновых кислот дает хорошие результаты, и, следовательно, этот конкретный способ введения является особенно предпочтительным.
Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать районы, кодирующие части молекул, указанные в пунктах формулы изобретения, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, описанные в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта осуществления включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем разных промоторов. Посредством этого можно избежать того, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы разные нуклеотидные фрагменты, но это является менее предпочтительным, вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии в случае присутствия обеих кодирующих областей, включенных в одну и ту же молекулу.
Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования антител против ΤΝΡα, содержащей:
фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор согласно изобретению (см. обсуждение нуклеиновых кислот и векторов ниже), и фармацевтически и иммунологически приемлемый наполнитель, и/или носитель, и/или адъювант, обсуждаемые выше.
При нормальных обстоятельствах эту нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора, в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробного обсуждения векторов и ДНК-фрагментов в соответствии с данным изобретением, см. обсуждение, приведенное ниже. Доступны также подробные описания, касающиеся приготовления и применения вакцин нуклеиновых кислот, см. ИоппеНу 1.1. е! а1., 1997, Аппи. Реу. 1ттипо1. 15: 617-648 и Иоппе11у 1.1. е! а1., 1997, Ь1£е
- 18 008254
8с1епсе8 60: 163-172. Обе эти публикации включены сюда посредством ссылки.
Живые вакцины
Третьей альтернативой для выполнения презентации аналогов согласно изобретению иммунной системе является использование технологии живых вакцин. В живой вакцинации презентацию иммунной системе выполняют введением животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог согласно изобретению, или вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Этим непатогенным микроорганизмом может быть любой подходящий аттенуированный бактериальный штамм (аттенуированный посредством пассажа или посредством удаления патогенных продуктов экспрессии технологией рекомбинантных ДНК), например МусоЬас1епит Ьоуб ВСО, непатогенный 81герЮсосси5 §рр., Ε. сой, 8а1топе11а §рр., УЛгю с1ю1егае, 8Ыде11а и т.д. Обзоры, касающиеся приготовления живых вакцин существующего уровня техники, могут быть, например, найдены у 8а1юи Р., 1995, Неу. Рга£ 45: 1492-1496 и \Уа1кег Ρ.Ό., 1992, Уассте 10: 977-990, оба включены сюда посредством ссылки. В отношении подробностей о фрагментах нуклеиновых кислот и векторах, используемых в таких живых вакцинах, см. обсуждение ниже.
В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению, обсуждаемый ниже, может быть включен в невирулентный вирусный вакцинный вектор, такой как штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус.
Обычно этот непатогенный микроорганизм или вирус вводят только 1 раз животному, но в некоторых случаях может быть необходимо введение этого микроорганизма более 1 раза, на протяжении жизни для поддержания защитного иммунитета. Обсуждается даже, что схемы иммунизации, такие как схемы, подробно описанные для полипептидной вакцинации, будут полезны при использовании живых или вирусных вакцин.
Альтернативно живую или вирусную вакцинацию комбинируют с предыдущей или последующей полипептидной вакцинацией и/или вакцинацией нуклеиновой кислотой. Например, можно выполнять первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующими бустер-иммунизациями с использованием полипептидного подхода или подхода с использованием нуклеиновых кислот.
Микроорганизм или вирус может быть трансформирован нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами), содержащими районы, кодирующие вышеупомянутые части молекулы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве полезных адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта осуществления включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем разных промоторов. Посредством этого можно избежать продуцирования аналога или эпитопа в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два различных нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно, наличие адъювантных частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечить аналог согласно изобретению в виде продукта экспрессии, и такой вариант осуществления является особенно предпочтительным в соответствии с данным изобретением.
Комбинированная обработка
Один особенно предпочтительный способ осуществления изобретения включает в себя использование вакцинации нуклеиновыми кислотами в качестве первой (первичной) иммунизации, с последующими вторичными (бустерными) иммунизациями вакциной на основе полипептида или живыми вакцинами, как описано выше.
Применение способа согласно изобретению в лечении заболеваний
Заболеваниями/состояниями, которые являются релевантными, являются ревматоидный артрит, подростковый хронический артрит (болезнь Стилла), спондилоартропатии, полимиозит, дерматомиозит, васкулит, псориаз (чешуйчатый) и псориатический артрит, болезнь Крона, хроническая обструктивная болезнь легких, миелодиспластический синдром, увеит в ревматоидном артрите, острая легочная дисфункция, астма (как острая, так и хроническая), гранулематоз Вегенера, болезнь раздраженного пищеваригельного тракта, височно-нижнечелюстной синдром (болезненный челюстной сустав), стоматит, остеопороз и раковая кахексия, а также другие воспалительные заболевания и другие состояния, обычно признаваемые в данной области как заболевания, связанные с неблагоприятными эффектами ΤΝΕα. Таким образом, можно лечить или ослаблять симптомы, которые ассоциированы с любым из этих заболеваний, с использованием способа согласно изобретению для понижающей регуляции активности мультимерного белка.
Композиции согласно изобретению
Данное изобретение относится также к композициям, пригодным для практического применения способа согласно изобретению. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или наполнитель, и/или носитель, и/или эксципиент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть согласно изобретению относится к готовым формам аналогов, по существу, описанным выше. Выбор адъювантов, носителей и наполнителей согласуется с тем, что было обсуждено выше
- 19 008254 при ссылке на приготовление аналогов для пептидной вакцинации.
Аналоги готовят обычно в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных генов, в том числе путем введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей этот аналог, в подходящий вектор, трансформации подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессии этой последовательности нуклеиновой кислоты (культивированием этой клетки-хозяина при подходящих условиях), извлечения продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующей очистки и необязательной дополнительной модификации, например рефолдинга или дериватизации. Детали, касающиеся этих необходимых способов, можно найти ниже под заголовком Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению, а также в примерах. В этом разделе описан также способ рекомбинантного получения аналогов, т.е. низкотемпературной ферментации Е. сой, для получения растворимых вариантов ΤΝΕα.
Недавние достижения в технологии пептидного синтеза сделали возможным получение полноразмерных полипептидов и белков этими способами, и, следовательно, получение длинных конструкций при помощи хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза также находится в объеме данного изобретения.
Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению
Из приведенного выше описания будет понятно, что модифицированные полипептиды могут быть получены посредством технологии рекомбинантых генов, но также посредством химического синтеза или полусинтеза; две последние возможности являются особенно релевантными, когда модификация включает в себя или предусматривает связывание с белками-носителями (такими, как КЬН, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и БСА) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры, и, конечно, также в том случае, когда эта модификация предусматривает добавление боковых цепей или боковых групп к полученной из полимера пептидной цепи. Эти варианты осуществления, как будет понятно из приведенного выше описания, не являются предпочтительными вариантами.
Для целей технологии рекомбинантных генов и, конечно, для цели иммунизации с использованием нуклеиновых кислот важными химическими продуктами являются фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие эти аналоги (как и комплементарные им последовательности). Таким образом, важная часть изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует описанный здесь аналог, т.е. полученный из полимера искусственный полимерный полипептид, как описано подробно выше. Фрагментами согласно изобретению являются либо ДНК-, либо РНК-фрагменты.
Наиболее предпочтительный ДНК-фрагмент согласно изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих любую из БЕО ГО N0: 12, 13, 14, 16, 17 и 18, или последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную любой из них.
Фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению будут обычно инсертированы в подходящие векторы для образования клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих эти фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов согласно изобретению, будут обсуждаться в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Эти векторы могут быть, в зависимости от цели и типа применения, в виде плазмид, фага, космид, минихромосом или вируса, но также и голой ДНК, которая экспрессируется только транзиторно в определенных клетках и которая является важным вектором (и может быть применима в ДНК-вакцинации). Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, позволяя достигать высокой копийности с целью экспрессии высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования.
Общая схема вектора согласно изобретению содержит следующие элементы в направлении 5'^-3' и в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, позволяющий секрецию (во внеклеточную среду или, где это применимо, в периплазму) или интеграцию в мембрану этого полипептидного фрагмента, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях, для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы этот вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами, которые должны использоваться для выполнения экспрессии в животном (т.е. при использовании этого вектора в ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы этот вектор не мог интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, которые хорошо известны лицу с квалификацией в данной области.
Векторы согласно изобретению используют для трансформации клеток-хозяев для получения модифицированного ΤΝΕα-полипептида согласно изобретению. Такие трансформированные клетки, кото
- 20 008254 рые являются частью данного изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов согласно изобретению или используемыми для рекомбинантного получения модифицированных ΤΝΡα-полипептидов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированные клетки могут быть подходящими живыми вакцинными штаммами, в которых фрагмент нуклеиновой кислоты (одна-единственная копия или множественные копии) были инсертированы таким образом, чтобы осуществлялась секреция или интеграция в бактериальную мембрану или клеточную стенку этого модифицированного ΤΝΡα.
Предпочтительными трансформированными клетками согласно изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (такие как виды ЕзсйепсШа [например, Е. сой], ВасШиз [например, ВасШиз зиЬййз], 8а1топе11а или МусоЬас!егшт [предпочтительно непатогенный, например М. Ьо\38 ВС6]), дрожжи (такие как 8ассйаготусез сеге^'Ыае) и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, такого как гриб, клетка насекомого, клетка растения или клетка млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные из человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты показали хорошую перспективу для использования коммерчески доступной клеточной линии ОгозорЫ1а те1аподаз1ег (клеточная линия 8сЬие1бег 2 (82) и векторная система, доступная от 1п\Цгодеп) для рекомбинантного получения аналогов ΤΝΡα согласно изобретению, и, следовательно, эта система экспрессии является особенно предпочтительной, и, следовательно, этот тип системы является также предпочтительным вариантом осуществления согласно изобретению, в целом.
Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительными применимыми вариантами согласно изобретению; они могут быть использованы для мелкосерийного или крупномасштабного получения аналога или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине.
При получении этих аналогов согласно изобретению с использованием трансформированных клеток удобно, хотя и далеко не обязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо переносился на поверхность трансформированной клетки, так как в обоих случаях облегчается последующая очистка продукта экспрессии.
После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно получение на ее основе стабильной клеточной линии, которая несет вектор согласно изобретению и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный ΤΝΡα. Предпочтительно эта стабильная клеточная линия секретирует или несет аналог ΤΝΡα согласно изобретению, облегчая тем самым его очистку.
Обычно, в зависимости от природы хозяина, используют плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые получены из вида, совместимого с данной клеткойхозяином. Этот вектор исходно несет сайт инициации репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, Е. со11 обычно трансформируют с использованием рВК322, плазмиды, полученной из вида Е. со11 (см., например, Во1Каг е1 а1., 1977). Плазмида рВК322 содержит гены для устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает легкое средство для идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВВ или другая микробная плазмида или фаг должны также содержать или быть модифицированы, чтобы содержать, промоторы, которые могут быть использованы прокариотическими микроорганизмами для экспрессии.
Промоторы, наиболее часто используемые в прокариотической рекомбинантной конструкции ДНК, включают в себя промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Сйапд е1 а1., 1978; Иакига е1 а1., 1977; Соеббе1 е1 а1., 1979) и промоторную систему триптофана (1гр) (Соеббе1 е1 а1., 1979; ЕРА-0036776). Хотя они являются наиболее часто используемыми, были открыты и использованы другие микробные промоторы, и подробности, касающиеся их нуклеотидных последовательностей, были опубликованы и позволяют работнику с квалификацией в данной области лигировать их функционально с плазмидными векторами (81еЬ^еп11з1 е1 а1., 1980). Некоторые гены из прокариот могут экспрессироваться эффективно в Е. со11, используя их собственные промоторные последовательности, что исключает необходимость добавления другого промотора искусственными способами.
Согласно данному изобретению предпочтительно, чтобы получение аналогов ΤΝΡα в прокариотических клетках приводило к обеспечению растворимых белков, см. пример 9, и особенно предпочтительно, чтобы используемой клеткой-хозяином была клетка Е. сой.
Авторами данного изобретения было теперь показано, что растворимые варианты ΤΝΡα относительно легко и удобно получать в Е. со11 при пониженных температурах. Если в случае общепринятых способов ферментации Е. сой обычно используют температуры в диапазоне около 37°С, авторами данного изобретения было обнаружено, что увеличенные выходы растворимых вариантов ΤΝΡα могут быть получены ферментацией при температурах ниже 32°С, - даже хотя общий выход рекомбинантного белка
- 21 008254 является более низким, чем после ферментации при приблизительно 37°С, выход наиболее выгодных вариантов является значительно более высоким и рефолдинг нерастворимого, денатурированного белка не является необходимым.
Вкратце, типичный ферментационный процесс согласно изобретению включает в себя стадии инокуляции ферментера трансформированной бактерией, последующей ферментации для получения достаточного количества биомассы с последующей индукцией рекомбинантной экспрессии и, наконец, сбора рекомбинантного белка. Использование индуцибельных систем не является обязательным, но является более удобным.
Таким образом, в важном аспекте изобретение относится к рекомбинантному получению в бактериях, особенно Е. сой, вариантов ΤΝΕα согласно изобретению, где по меньшей мере одну фазу после индукции продуцирования рекомбинантного аналога ΤΝΕα проводят при температуре менее 32°С (т.е. в случае использования индуцибельной системы). Однако в примере 9 показаны наивысшие выходы растворимых рекомбинантных аналогов ΤΝΕα, когда всю ферментацию (как до, так и после индукции) выполняют при такой низкой температуре.
Предпочтительно, чтобы пониженная температура в любой из этих двух фаз ферментации (до и после индукции) была ниже 30°С, например ниже 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 или 20°С. Предпочтительно, чтобы температура находилась в диапазоне между 20 и 30°С, более предпочтительно в диапазоне между 22 и 28°С, и наиболее предпочтительно, чтобы температура была равна приблизительно 25°С. Как показано в примере 9, выходы, близкие к 100%, растворимых аналогов ΤΝΕα, получали при ферментации при этой температуре.
Следует отметить, что авторы данного изобретения считают, что условия низких температур для получения растворимых вариантов ΤΝΕα согласно изобретению применимы, в общем, для рекомбинантного получения растворимых вариантов иммуногенных белков - даже хотя выходы общего белка, полученные такой ферментацией, являются более низкими, чем выходы, достигаемые, например, ферментацией при 31°С, причем конечный выход белка, имеющего применимую трехмерную структуру, является значительно более высоким при использовании условий низких температур, и, что важно, можно избежать последующих занимающих много времени и дорогостоящих процедур рефолдинга. Или, вкратце, выход желаемой конформации этого вариантного белка является более высоким.
Таким образом, авторы данного изобретения предполагают также, что стратегия использования вышеуказанных низкотемпературных условий ферментации является общим применимым способом получения применимых иммуногенных вариантов белков.
Кроме прокариот, эукариотические микробы, такие как культуры дрожжей, могут быть также использованы, и здесь промотор должен быть способен запускать и регулировать экспрессию. Зассйаготусек ссгсуыахс. или обычные пекарные дрожжи, является наиболее часто используемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя обычно доступным является ряд других штаммов. Для экспрессии в 8ассйаготусе§ обычно используют, например, плазмиду УКр7 (8йпсйсотй е1 а1., 1979; Кшдктап е1 а1., 1979; ΤβοΗ^ρ^ е1 а1., 1980). Эта плазмида уже содержит ген 1гр1, который обеспечивает маркер отбора на мутантный штамм дрожжей, лишенный способности расти в триптофане, например АТСС №. 44076 или РЕР4-1 (1опе8, 1977). Присутствие 1гр1-повреждення как характеристики генома дрожжевой клеткихозяина обеспечивает затем эффективное окружение для детектирования трансформации по росту в отсутствие триптофана.
Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткнназы (Нйхтап е1 а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Не88 е1 а1., 1968; Нойапй е1 а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид последовательности терминации, ассоциированные с этими генами, также лигируют в экспрессионный вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать, для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.
Другими промоторами, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями роста, являются район промотора для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, деградационных ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, и вышеуказанной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, сайт инициации репликации и последовательности терминации, является подходящим.
Кроме микроорганизмов, культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов, могут также использоваться в качестве хозяев. В принципе, любая такая клеточная культура является работающей, независимо от того, является ли она культурой клеток позвоночных или беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляли клетки позвоночных, и размножение позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой за последние годы (Τ№ικ СиЙиге, 1973). Примерами таких применимых линий клеток-хозяев являются клетки ΥΕΚΘ и клетки НеЬа, линии клеток яичника китайского хо
- 22 008254 мячка (СНО) и клетки Α138, ВНК, СО8-7, 8робор1ега Ггищрегба (8Ρ) (коммерчески доступные в виде полных систем экспрессии от 1.а. Рго1ет Заеисек, 1000 Кекеагсй Рагк^ау, Мепбеи, СТ 06450, И8Л и от Шуйгодеи), и линии клеток МОСК. В данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является линия клеток насекомых 82, доступная от 1иуйгодеи, РО Вох 2312, 9704 СН бгошидеи, Τίκ №111ег1апб5.
Экспрессионные векторы для таких клеток обычно включают в себя (если необходимо) сайт инициации репликации, промотор, расположенный перед геном, который должен экспрессироваться, сайты сплайсинга РНК, сайт полиаденилирования и последовательности терминатора транскрипции.
В случае использования в клетках млекопитающих регуляторные функции на экспрессионных векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы получают из вируса полиомы, аденовируса 2 и наиболее часто из вируса 40 обезьян (8У40) или цитомегаловируса (СМУ). Ранний и поздний промоторы вируса 8У40 особенно применимы, так как оба могут быть легко получены из вируса в виде фрагмента, который содержит также сайт инициации репликации вируса 8У40 (Вхегк е1 а1., 1978). Могут быть использованы меньшие или большие фрагменты 8У40, при условии, что включена последовательность приблизительно 250 п.н., простирающаяся от сайта НюбШ к сайту ВдИ, расположенному в вирусном сайте инициации репликации. Далее, можно также, и даже желательно, использовать промоторные или регуляторные последовательности, обычно ассоциированные с желаемой генной последовательностью, при условии, что такие регуляторные последовательности совместимы с системами клетки-хозяина.
Сайт инициации репликации может быть обеспечен либо путем конструирования вектора для включения экзогенного сайта инициации репликации, например он может происходить из 8У40 или другого вируса (например, полиомавируса, аденовируса, У8У, ВРУ), либо он может быть обеспечен путем использования механизма репликации хромосом клетки-хозяина. Если этот вектор интегрирован в хромосому клетки-хозяина, последнее часто является достаточным.
Пример 1. Получение вариантов ΤΝΡα.
Синтетическую ДНК-последовательность 8ΜΤΝΡΑΤ3 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9), кодирующую человеческий мономерный полипептид ΤΝΡα дикого типа (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10), получали в виде продукта лигирования от Еи1е1есйои СтЬН. ДНК-последовательность ΙιΤΝΕα оптимизировали для экспрессии в Е. сой в соответствии с базой данных Собои Икаде путем исключения всех кодонов с частотой в Е. сой менее 10%. Далее, эту последовательность конструировали таким образом, чтобы она включала в себя 5'-сайт рестрикции Ысо1 для последующих стадий клонирования.
Продукт лигирования 8ΜΤΝΡΑΤ3 вводили в вектор рСК 4 ТОРО В1ип1 и трансформировали клетки Е. сой ИН10В. Плазмидную ДНК из 10 полученных клонов 8ΜΤΝΡΑΤ3ΤΟΓΟ очищали и отбирали пять клонов, содержащих ожидаемый фрагмент (при анализе продукта расщепления рестрикционными ферментами (КЕ)).
ДНК-фрагменты Ысо1/ЕсоШ из пяти потенциально правильных клонов 8ΜΤΝΡΑΤ3ΤΟΕΟ выделяли и переносили в вектор рЕТ28Ь(+) и определяли последовательность. Инсерции, делеции или замены идентифицировали в четырех клонах, в то время как один клон оказался правильным. Затем эту правильную конструкцию 8ΜΤNΕ\VΤ3рЕΤ28 использовали в качестве матрицы для генерирования каждого из вариантов ΤΝΡα.
Пример 2. Конструирование ΤΝΡ34.
Аминокислотную последовательность эпитопа РаиОК (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 и 8) вручную обратнотранслировали в ДНК-последовательность (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7), оптимизированную для экспрессии в Е. сой, см. ниже, и встраивали в петлю 3 ΤΝΡα с использованием 8ΟΕ РСК (крйстд Ьу оуебарртд ехЕеиаои РСК).
Полученную конструкцию (ДНК-последовательность, кодирующую 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19 в ΑΟ 03/042244) помещали в вектор рЕΤ28Ь+ с получением ΤNΡ34-рЕΤ28Ь+.
Пример 3. Конструирование мономеризованного тримера.
Конструкции мономеризованных тримеров основаны на 3 ΤΝΡα-кодирующих районах, разделенных или линкером из трех глицинов, и/или эпитопкодирующим районом.
Ген ΤΝΡα синтезировали в виде трех отдельных единиц. Этих три фрагмента собирали с использованием 8ΟΕ РСК и собранный ген (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 21 в ΑΟ 03/042244) клонировали в рСК2.1-ΤΟРΟ. После подтверждения последовательности выделяли правильный клон. Затем ген ΡΤΝΡΤ_0 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 21 в ΑΟ 03/042244, кодирующий ΤNΕα-61у61у61у-ΤNΡα-61у61у61у-ΤNΡα, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22 в ΑΟ 03/042244, т.е. 3 копии 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17, разделенные двумя линкерами, состоящими из трех глицинов) переносили в рЕТ28Ь+ с получением 11ΤNΕΤ_0-рЕΤ28Ь+. Правильный клон выделяли, последовательность проверяли и трансформировали в линии Е. сой В^21-8ΤΑΒ, ВЕ-21-ΟΟΕΌ и НМ8174.
йΤNΕΤ_0-рЕΤ28Ь+ использовали в качестве матрицы для получения четырех мономеризованных вариантов тримеров: ΡΤΝΡΤ_1, ΡΤΝΡΤ_2, ΡΤΝΡΤ_3 и Ι1ΤΝΈΤ4 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49, 51, 57 и 59 в ΑΟ 03/042244) при помощи 8ΟΕ РСК. Дополнительный вариант (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 53 в ΑΟ 03/042244) может быть изготовлен сходным образом.
ΡΤΝΡΤ_1, 1ιΤΝΡΤ_2 и 1ιΤΝΡΤ_3 являются вариантами, включающими в себя эпитопы Р2 и Р30
- 23 008254 столбнячного токсоида (БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 и 4 соответственно), которые должны собираться двумя раундами БОЕ РСК. 11ΤΝΡΤ-4 является вариантом с инсертом РАЭКЕ (БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6) и может быть собран одним раундом БΟЕ РСК. Дополнительный вариант (БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 55 в №Ο 03/042244) может быть изготовлен сходным образом.
1ιΤΝΡΤ_4 конструировали вышеупомянутыми способами, и правильный клон 11ΤNЕΤ_4-ρЕΤ28Ь+ обнаруживали в клетках ТОР 10, и эту конструкцию переносили в клетки ΒΕ21^ΤΑΚ и НМБ174.
Для генерирования 6ΤΝΡΤ_1, 1ιΤΝΡΤ_2 и 1ιΤΝΡΤ_3 эпитопы встраивали при помощи БΟЕ РСК в очень малые фрагменты тримера, которые инсертировали в 11ΤNЕΤ_0-рЕΤ28Ь+ путем разрезания рестрикционными ферментами (КЕ) и лигирования.
Пример 4. Стабилизация мутантов ΤΝΡ34.
Для дополнительной стабилизации варианта ΤNΡ34-рЕΤ28Ь+, описанного выше, конструировали варианты, содержащие введенный дополнительно дисульфидный мостик, а также делеционный мутант. Конструировали 3 различных варианта: ΤNΡ34-Α-рЕΤ28Ь+ содержит замены Ц67С и А111С, ΤΝΡ34-ΒрЕТ28Ь+ содержит А96С и 1118С и ΤNΡ34-С-рЕΤ28Ь+, который содержит делецию 8 крайних Ν-концевых аминокислот, аминокислотные последовательности продуктов экспрессии представлены в БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 20, 30 и 31 в №Ο 03/042244.
Все 3 конструкции получали с использованием БΟЕ РСК и клонировали в ΒΕ21^ΤΆΚ, ΒΕ21-ΟΟΕΌ и NМБ174 с последующим подтверждением последовательности.
Пример 5. Варианты гибкой петли.
Для поиска варианта, который может проявлять улучшенные характеристики в сравнении с вариантом ΤNΡ34-рЕΤ28Ь+, получали конструкции, в которых инсерт РАЭКЕ (БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6) перемещается вокруг в гибкой петле 3 молекулы ΤΝΡα.
Все варианты ΤNΡ35-рЕΤ28Ь+, ΤNΡ36-рЕΤ28Ь+, ΤNΡ37-рЕΤ28Ь+, ΤNΡ38-рЕΤ28Ь+, ΤNΡ39-рЕΤ28Ь+ и вариант с РАЭКЕ, помещенным на С-конце этой молекулы; ΤNΡС2-рЕΤ28Ь+, получали при помощи способа БΟЕ-РСΚ и клонировали в Β^21-БΤАΚ, ΒΕ21-ΟΟΕΌ и NМБ174 с последующим подтверждением последовательности. Аминокислотные последовательности этих продуктов экспрессии представлены в БЕС) ΙΌ ΝΟ: 23, 24, 26, 27 и 28 в №Ο 03/042244.
Также для оценки возможности использования клеток насекомых в качестве системы экспрессии ΤΝΡ№Τ, ΤΝΡ34, ΤΝΡ35, ΤΝΡ36, ΤΝΡ37, ΤΝΡ38, ΤΝΡ39 и ΤΝΕ62 переносили в вектор ρ2Ζορ2ί (см. фигуру в РСТ/ПКЮ2/00764) и экспрессировали в клетках насекомых Б2.
Пример 6. Другие конструкции.
Готовили большое количество других вариантов ΤΝΡα, все названные ΤΝΡΧ, см. выше. ДНК, кодирующую эти варианты, получали при помощи БΟЕ РСК и клонировали непосредственно в рЕТ28Ь+.
Правильные клоны ΤΝΡΧ трансформировали в Β^21-БΤАΚ и НМБ174 и затем подтверждали последовательность.
Пример 7. Периплазматическая экспрессия.
Лидерную последовательность ЫВ добавляли непосредственно слева от БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 16 №Ο 03/042244 в ΤNΡ34-ρЕΤ28Ь+ для нацеливания экспрессии в периплазматическое пространство.
Пример 8. Экспрессия в млекопитающих.
Для испытания экспрессии в клетках млекопитающих БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 16 №Ο 03/042244 и ДНК, кодирующую ΤΝΡ34, переносили в вектор рНР1, который является вариантом коммерчески доступного вектора рСЧ (Рготеда Согрогабоп). рНР1 включает в себя ген устойчивости к канамицину в качестве маркера вместо гена АтрК рСЕ
Пример 9. Оптимизированное продуцирование растворимого белка из Е. соб.
Введение.
Поскольку первоначальная экспрессия ΤΝΡα и его вариантов приводила лишь к очень ограниченным количествам растворимого белка при экспрессии из клеток Е. соб, задача состояла в значимом улучшении уровней экспрессии и растворимости вариантов ΤΝΡα, чтобы гарантировать быструю и удобную систему экспрессии белков.
Подход.
Первоначально эксперименты проводили во встряхиваемых колбах и приобретенный опыт использовали в работе с ферментерами. 3 ферментера работали одновременно, пробы брали во время ферментации для анализа роста клеток, продукции ΤΝΡα и уровней деградации.
Цель.
Цель данного исследования состояла в определении оптимальных условий роста для экспрессии иммуногенных вариантов ΤΝΡα при экспрессии в клетках Е. соб НМБ174 в средах с определенным составом.
Материалы и способы.
Исходные материалы.
Исходные материалы для ферментации с минимальной средой определенного состава.
- 24 008254
Позиция | Компонент | Поставщик | Номер по каталогу | Спецификация |
1 | МдЗО4, 7Н2О | Опгкет | 329516 | Рй.Еиг.ЗКО |
2 | СаС12,2Н2О | ипгкет | 260455 | РИ.Еиг.ЗКО |
3 | КН2РО4 | ипгкет | 317545 | РЪ.Еиг.ЗКО |
4 | К2НРО4 | УИК | 105101 | РЬ.Еиг.3ΚΌ/ΒΡ |
5 | ЫаС1 | ипгкет | 284356 | РН.Еиг.ЗКО |
6 | (ΝΗ4)23Ο4 | ипгкет | 257022 | РИ.Еиг.ЗКО |
7 | ЕеЗО4,2Н2О | Опгкет | 269613 | РИ.Еиг.ЗКО |
8 | ЕеС13, 6Н2О | ипгкет | 269357 | РИ.Эап |
9 | Ыа-цитрат, 2Н2О | ипгкет | 284539 | РИ.Еиг.ЗКЭ |
10 | Вит. В1 (тиамин·НС1) | Опгкет | 319129 | РН.Еиг.ЗКО |
11 | Канамицин | УИК (КезеагсИ Огд.) | 10810 | изр |
12 | Глюкоза, 1 Н2О | Опгкет | 311688 | РИ.Еиг.3ΚΩ |
13 | Глицерин | Опгкет | 273805 | РИ.Еиг.3Κϋ |
14 | А12(ЗО4), 18Н2О | Опгкет | 303545 | РИ.Еиг.ЗКО |
15 | СоС12,2Н20 | Опгкет | 263913 | РИ.Иогс!. 63 |
16 | СиС12, 2Н2О | Опгкет | 360321 | - |
17 | Н3ВОз | Опгкет | 251231 | РИ.Еиг.ЗКО |
18 | МпС12, 4Н2О | Уогдк С1оЬа1 | М1106 | озр |
19 | Иа2Мо04, 2Н2О | УИК | 106524 | РИ.Еиг.3Κϋ |
20 | Νί3Ο4, 6Н2О | Уогдк С1оЬа1 | N1070 | АСЗ |
21 | ΖηΟ12 | ипгкет | 14422 | РИ.Еиг.ЗКО |
22 | Дрожжевой экстракт | Меге к | 1.03753 | |
23 | 1РТС | Згдта | 1-6758 | - |
24 | Н3РО4 | ипгкет | 1.00563.10 00 | РЬ.Еиг.3Κϋ |
25 | ЫаОН | ипгкет | 284885 | РИ.Еиг.3Κϋ |
Составы сред и буферов.
Приготовление основной культуральной среды.
Позиция | Компонент | Концентрация ИСХОДНОГО раствора (г/л) | Количество ИСХОДНОГО раствора (мл/л) | Конечная концентрация (г/л) |
1 | МдЗО4,7Н20 | 300 | 3 | 0,9 |
2 | СаС12,2Н20 | 15 | 1 | 0,015 |
3 | КН2РО4 | 150 | 20 | 3 |
4 | ЫаС1 | 100 | 10 | 1 |
5 | (ЫН4)2ЗО4 | 250 | 40 | 10 |
6 | Раствор микроэлементов | - | 1,5 | - |
7 | Раствор ГеЗО4,7Н2О | 7,5 | 7,5 | 0,0563 |
8 | Раствор ЕеС1з, 6Н2О | 7,5 | 7,5 | 0,0563 |
9 | Тиамин·НС1 | 1 | 10 | 0,01 |
10 | Канамицин | 60 | 1 | 0,06 |
11 | Глюкоза | 500 | 60 | 30 |
- 25 008254
Соединения позиций 1-8 растворяют в указанном порядке в приблизительно 50% конечного объема в деионизованной воде и смешивают тщательно до полного растворения. Затем объем доводят до конечного объема (минус объем. добавленный после автоклавирования) и переносят в ферментер и стерилизуют автоклавированием.
Позиции 9-11 смешивают и переносят асептически в охлажденный ферментер (37°С). Значение рН доводят до 7.
Приготовление прекультуральной среды.
Позиция | Компонент | Концентрация исходного раствора (г/л) | Количество исходного раствора (мл/л) | Конечная концентрация (г/л) |
1 | МдЗО4,7Н20 | 300 | 1 | 0, 3 |
2 | СаС12, 2Н20 | 15 | 1 | 0,015 |
3 | КН2РО4 | 150 | 20 | 3 |
4 | К2НРО4 | 600 | 20 | 12 |
5 | ЫаС1 | 100 | 1 | 0,1 |
6 | (ΝΗ4)23Ο4 | 250 | 20 | 10 |
7 | Раствор микроэлементов | - | 1 | - |
8 | Раствор ЕеЗО4,7Н2О | 7,5 | 5 | 0,0375 |
9 | Раствор ЕеС13, 6Н2О | 7,5 | 5 | 0,0375 |
10 | Тиамин·НС1 | 1 | 5 | 0,01 |
11 | Канамицин | 60 | 0,25 | 0,06 |
12 | Глюкоза | 500 | 40 | 20 |
Желаемые объемы исходных растворов. позиции 1-9. переносят в мерную колбу на 1 л. Добавляют ΚΟ-воду до 955 мл. Измеряют рН и доводят рН до 7.0. если необходимо. Перемешивают этот раствор и переносят его в 4 встряхиваемые колбы на 1000 мл с 238 мл в каждой. После автоклавирования компоненты. не подлежащие автоклавированию. позиции 10-12. добавляют асептически в эти встряхиваемые колбы.
Приготовление раствора солей микроэлементов.
Позиция | Компонент | Количество (г/л) | Конечная концентрация в основной культуральной среде (г/л) | Конечная концентрация в пре-культуральной среде (г/л) |
1 | А12(ЗО4), 18Н20 | 2,00 | 0,003 | 0,002 |
2 | СоС12,2Н20 | 0, 70 | 0,0011 | 0,0007 |
3 | СиС12,2Н20 | 2,50 | 0,00375 | 0,00250 |
4 | нво3 | 0,50 | 0,00075 | 0,00050 |
5 | МпС12, 4Н2О | 20,00 | 0,030 | 0,020 |
6 | Ыа2Мо04, 2Н2О | 3,00 | 0,0045 | 0,0030 |
7 | Νί304, 6Н2О | 2,00 | 0,003 | 0,002 |
8 | ΖηΟ12 | 15,00 | 0,0225 | 0,0150 |
Компоненты смешивают в приблизительно 20% конечного объема. Добавляют подкисленную (рН=1) ΚΟ-воду до 1000 мл. Раствор перемешивают до растворения всех солей. Раствор переносят в синюю склянку с крышкой на 1 л и автоклавируют его.
Приготовление раствора ферросульфата.
Позиция | Компонент | Количество (г/л) |
1 | ГеЗО4, 2Н20 | 7,5 |
2 | Цитрат натрия, 2Н2О | 100 |
- 26 008254
Приготовление раствора феррохлорида.
Позиция | Компонент | Количество (г/л) |
1 | ГеС13, 6Н2О | 7,5 |
2 | Цитрат натрия, 2Н2О | 100 |
Оборудование. Ферментеры.
Позиция | Тип | Общий объем (л) | Рабочий объем (л) | Изготовитель | Поставщик | Номер по каталогу |
Система ферментеров | ЬаЬГогз | 2 | 0,5-1,6 | 1пГогз | ВисЬ&Но1ш |
Систему ферментеров ΣπΕοτδ ЬаЪ+огз, состоящую из 6 ферментеров на 2 л, каждый из которых имеет рабочий объем 0,5-1,6 л, и основной контролирующий элемент соединяли с компьютером, инсталлированным программным обеспечением (ΣγΪ8 ΝΤ 4.1 для \\'ίικΙο\ν) для получения и обработки информации.
Способы.
Первоначальные эксперименты для оценки процента экспрессируемого растворимого белка выполняли во встряхиваемых колбах на 250 мл, в термостате, встряхиваемом при приблизительно 200 об./мин, в богатой среде с 60 мкг/мл канамицина.
Экспрессию белка ΤΝΕα оценивали с использованием Вестерн-блотов и электрофореза в ДСНПААГ с окрашиванием Кумасси синим, как в штамме НМБ174, так и в штамме ВЕ21 Б1аг. Оценивали экспрессию как общего, так и растворимого ΤΝΕα путем лизиса этих клеток и отбора пробы из супернатанта до и после стадии центрифугирования (20000хд в течение 10 мин). Процент растворимого ΤΝΕα оценивали путем визуального осмотра Вестерн-блота.
Испытывали различные комбинации температуры: в основном, биомасса продуцировалась при 37°С с последующей индукцией, и испытывали температуры экспрессии 25°С (37/25) или 37°С (37/37).
ΤΝΕ37 (А145К) (БЕО !□ Ν0: 13) выбирали в качестве модельного варианта для экспрессии и затем тестировали со средами определенного состава во встряхиваемых колбах с использованием комбинации 37/25°С.
Создание банка клеток для исследований.
Банк клеток для исследований (КСВ) ΤΝΕ37(Α145Κ) создавали в дрожжевой среде (ΥΕΜ) с 60 мкг/мл канамицина, путем инокуляции предварительно нагретой до 37°С встряхиваемой колбы с перегородкой на 1 л, содержащей 225 мл ΥΕΜ, с 25 мл из 250 мл ночной культуры в ΥΕΜ с 60 мкг/мл канамицина, и выращивания при 37°С при 200 об./мин в течение 3½ ч. Идентичные содержащие глицерин исходные растворы для замораживания готовили смешиванием 60 мл экспоненциально растущей культуры клеток с 140 мл 86% глицерина и приготовлением аликвот в 1 мл. Эти аликвоты хранили при -80°С и использовали одну аликвоту для прекультуры перед ферментацией.
Для определения качества КСВ 3 колбы прекультуры, содержащие 250 мл среды прекультуры с 60 мкг/мл канамицина, инокулировали КСВ-аликвотой, каждую, и следили за ΟΏ600.
Культуры вели себя идентично до 11 ч после инокуляции, когда они достигали ΟΏ600 ~3,2. Было решено инокулировать ферментеры на 1 л 50 мл прекультур, которые выращивали в течение 11 ч при вышеупомянутых условиях, во всех последующих экспериментах.
Оптимизация условий ферментеров.
Для определения оптимальных условий ферментации брали пробы из растущих культур в ферментерах ΣηίοΓδ и анализировали 0Е)600 спектрофотометрией, уровни экспрессии ΤΝΕ определяли с использованием количественного ΤΝΕ-специфического ЕЕ!БЛ и деградацию ΤΝΕ определяли Вестерн-блоттингом.
Ферментации тестировали при различных температурных условиях, 25°С/25°С, 25°С/25°С/16°С, 37°С/25°С и 37°С/37°С.
ОЕ)600 и экспрессию ΤΝΕ испытывали на большом количестве проб и несколько репрезентативных проб в отношении экспрессии ΤΝΕ дополнительно анализировали Вестерн-блоттингом для определения деградации.
Схематическое представление. Общие параметры процесса.
Параметр | Заданная точка | Диапазон | Предел сбоя |
рН | 7,0 | 6,5-7,5 | <6,4->7,6 |
ОО2-напряжение | 30% | 0-100% | 100% в течение более 4 ч |
Скорость перемешивания | 1000 об/мин | 1000-1500 |
- 27 008254
Конкретные параметры процесса.
Οϋ6οο прекультуры | Температура (°С) биомассы продукта | Время (Ч) биомассы продукта | θΒβοο при индукции | Концентрация ΙΡΤ6 (мМ) | Температура (°С) при экспрессии | Время экспрессии | Οϋ60ο при сборе | Максимальный выход мг ΤΝΕ/л |
2-6 | 37 | 10 | 10-20 | 1 | 37 | 4-5 | 30-40 | 10-20 |
2-6 | 37 | 10 | 10-20 | 1 | 25 | 24 | 10-30 | 50-100 |
2-6 | 25 | 24-36 | 5-10 | 1 | 25 | 24-36 | 10-30 | 150-200 |
2-6 | 25 | 24-36 | 5-10 | 1 | 25/16 | 24-36 | 10-30 | 150-200 |
Концентрация ШТО была 1 мМ, и температура при индукции снижалась с 37 до 25°С, за исключением процессов 37/37°С и 25/25°С. Общее время ферментации было между 14 и 18 ч для процесса 37/37°С и до 61 ч для процессов 25/25°С и 37/25°С, включая размножение, индукцию и продуцирование белка. Общее время ферментации зависит от роста культуры. 0Э600 в ферментере было между 0,1-0,3 (26 в прекультуре), как рассчитано из 0Э в культуре инокуляции. Индукцию в процессе 37/25°С выполняли при 0И600=20±1-2 или спустя 9-11 ч после инокуляции. Продуцирование белка имело место в течение 20-24 ч. Индукцию при процессе 25/25°С выполняли при 0И600=10±1-2 или спустя 22-24 ч после инокуляции. Продуцирование белка имело место в течение 24-36 ч.
Экспрессия варианта ΤΝΕα.
Уровни экспрессии ΤΝΕ исследовали путем взятия 2x1 мл проб и хранения при -20°С. Затем эти пробы оттаивали на льду и обрабатывали ультразвуком 3x30 с, с помещением на лед по меньшей мере на 30 с между обработками для предотвращения нагревания проб. Пробы центрифугировали при 20000хд в течение 10 мин и супернатант исследовали на содержание ΤΝΕα с использованием количественной ЕМ8А ΤΝΕα.
В общих чертах, этот процесс представлен на блок-схеме нижеприведенной фигуры.
Результаты и обсуждение.
Эксперименты, проведенные в этом исследовании, показали, что экспрессия растворимого ΤΝΕ значимо увеличивалась при экспрессии при 25°С как во встряхиваемых колбах, так и в ферментерах.
Эксперименты со встряхиваемыми колбами 100 мл богатой среды инокулировали 5 мл ночной культуры и выращивали при 37°С. Когда эта культура достигала 0И600, культуру индуцировали 1 мМ №ΤΟ. В то же самое время, культуры, росшие при 37°С, либо хранили при 37°С, либо перемещали в условия 25°С, где они росли в течение ночи. На следующий день клетки собирали, лизировали и анализировали на экспрессию общего ΤΝΕα или растворимого варианта ΤΝΕα.
Результаты показали, что смещение температуры с 37 до 25°С в момент индукции имело значимое положительное действие на количество экспрессируемого растворимого ΤΝΕ, и, таким образом, авторы решили сохранить это смещение температуры в последующих экспериментах.
Выбранные варианты.
Все варианты тестировали, как описано выше, и ΤΝΕ34, ΤΝΕ34Λ, ΤΝΕ37, ΤΝΕΧ5.1, ΤΝΕΧ2.1 и ΤΝΕ_Τ2 были отобраны как экспрессирующие с достаточно высокими выходами для дальнейшего исследования.
Когда были доступны детоксифицированные версии вышеупомянутых конструкций, тестировали экспрессию этих вариантов, и результаты показали сравнимые уровни экспрессии относительно недетоксифицированных версий.
Экспрессия в ферментерах.
Для тестирования экспрессии вариантов ΤΝΕα в средах с определенным составом авторы провели предварительный эксперимент во встряхиваемых колбах с условиями, описанными выше (37°С/25°С). В течение ночи индуцированная культура обнаружила удовлетворительные уровни экспрессии варианта ΤΝΕα, и, следовательно, авторы изобретения решили испытать экспрессию в ферментерах для оптимизации количеств экспрессированного варианта ΤΝΕα, а также попытаться минимизировать деградацию этих вариантов, которая все еще наблюдается в экспрессируемых вариантах.
Рост клеток.
Банк клеток для исследований готовили, как описано выше, и авторы использовали прекультуру для инокуляции ферментеров на 1 л 50 мл прекультуры при 0Э600 ~3-4. Ферментеры предварительно нагревали до выбранной температуры (37 или 25°С) для минимизации температурного шока. В случае ферментеров с 37°С клетки продолжали экспоненциальный рост без какой-либо лаг-фазы. При инокуляции прекультуры 37°С в ферментер с 25°С эти клетки имели лаг-фазу приблизительно 17 ч, перед нача
- 28 008254 лом экспоненциального роста при более медленной скорости. Этого следовало ожидать как следствия температурного шока, которому клетки в этом случае подвергаются.
Такую же самую лаг-фазу наблюдали при смещении культуры 37°С в условия 25°С непосредственно перед индукцией. Попытка постепенного смещения температуры от 37 до 25°С на протяжении часа (2°С на 10 мин) не уменьшала лаг-фазу.
Уровни экспрессии варианта ΤΝΕα.
Уровни экспрессии определяли с использованием ΤΝΕα-специфического количественного анализа ЕЫ8А.
Наивысшими наблюдаемыми уровнями в случае процесса 25/25°С были полученные уровни приблизительно 250 мг/л. Эти эксперименты являются все еще единственным подтверждением, и время между 15 и 35 ч после индукции все еще следует анализировать.
Процесс 37/37°С дает только очень ограниченное количество растворимого варианта ΤΝΕα, приблизительно 15 мг/л, а в случае процесса 37/25°С наблюдается, максимум, при приблизительно 100 мг/л.
Выводы.
На основании результатов из более 100 ферментаций, в целом, были выбраны 2 наилучших процесса (из общего числа 6) для получения вариантных белков растворимого ΤΝΕα. Эти ферментации выполняли в минимальной среде определенного состава (см. описание ниже). Выбранные процессы ферментации были основаны на температурных исследованиях, в которых испытывали 4 различные температуры. Испытываемым вариантом ΤΝΕα был ΤΝΕ37-145 в штамме Е. сой НМ8174.
Оптимальные результаты были получены с использованием 25°С как до, так и после индукции. Остается определить оптимальное время сбора.
Пример 10. Анализы отбора.
Прямой рецепторный анализ ЕЫ8А вместе с поликлональным ЕЫ8А и анализом цитотоксичности с клетками ΚΌ-4 и \Уе1и используют в анализах первой очереди для скрининга и контроля очистки. Антитела, продуцируемые против вариантов ΤΝΕα, используют для ингибирования связывания \\1ΤΝΕα как в рецепторном анализе, так и в анализе цитотоксичности для измерения качества антител.
Пример 11. Процедуры очистки.
В этом примере подробно описаны рекомбинантное получение и последующая очистка одного из вариантов ΤΝΕα (ΤΝΕ37). Однако эта процедура очистки является предпочтительной процедурой согласно данному изобретению и будет также применима (с небольшими коррекциями, относящимися к каждому варианту) для других вариантов ΤΝΕα согласно изобретению.
Однако в настоящее время авторы данного изобретения работают с улучшенной схемой очистки, которая особенно подходит для крупномаштабной ферментации вариантов ΤΝΕα. В основном, используют те же самые индивидуальные стадии, описанные ниже, но порядок обращен таким образом, чтобы очистка заканчивалась хроматографической стадией с использованием гидроксиапатита после стадий хроматографии с использованием 8Р-сефарозы и Ц-сефарозы.
Колонию штамма Е. сой ВЬ21 8ΤΆΚ/ΤΝΕ37 из чашки с ЬВ-канамицином (60 мг канамицина/л ЬВсреды, содержащей 1,5% агар) ресуспендируют в 5 мл ЬВ-среды (60 мг канамицина/л ЬВ) и выращивают в течение ночи (16 ч) при 37°С при встряхивании (220 об./мин) в шейкере №\ν Вгаип5\\юк.
2x2 мл этой культуры переносят в 2x1 л ЬВ (60 мг канамицина/л) во встряхиваемые колбы с перегородками на 2 л и клеткам дают расти в шейкере №\ν ВгаипзМск при 220 об./мин до ΟΌ436=0,6-0,8. Эту стадию выполняли при примерных температурах 37 и 25°С, но температура может быть оптимизирована для каждой культуры.
мл 1М ΓΡΤΘ добавляют в каждую колбу и клеткам дают расти в течение 16-20 ч. Перед индукцией температуру доводят до 25°С, если она не является уже температурой ферментации.
Клетки собирают в центрифужные пробирки (500 мл) центрифугированием при 5000 об./мин в течение 15 мин с использованием головки 8ЬА-3000 в центрифуге 8огуа11.
Клетки переносят в одну предварительно взвешенную центрифужную пробирку на 500 мл с использованием 0,9% №1С1 и клетки собирают центрифугированием, как описано выше.
Супернатант выбрасывают и пробирку взвешивают для определения массы клеток (должно быть 711 г).
Добавляют 200 мл 50 мМ Ν2ΗΡΟ4, рН=7,0 (если клетки ресуспендируют, они должны быть сразу же использованы, в противном случае, их можно заморозить).
Разрушение, центрифугирование и фильтрование клеток.
Механическое разрушение клеток предоставляет несколько преимуществ в сравнении с ферментативным разрушением в отношении эффективности, надежности и возможности выбрать любой буфер, необходимый в следующих стадиях очистки. АРУ-1000 поддерживают в охлажденном состоянии во время этой операции добавлением ледяной воды в камеру с пробой перед использованием и пропускают ледяную воду через эту машину между двумя пассажами пробы. Центрифугирование и фильтрование служат для удаления любых частиц или агрегатов из раствора перед хроматографическим разделением этих белков. Разрушение клеток и НА-хроматография должны выполняться в один и тот же день, так как
- 29 008254 это может минимизировать активность возможных протеаз как следствие отделения от них в хроматографической стадии. Процедура разрушения, центрифугирования и фильтрования является следующей.
Осторожно ресуспендированный клеточный материал переносят в разрушитель клеток (ΑΡν-1000). Суспензию клеток осторожно пропускают 2х через разрушитель (охлаждая на льду после каждого пассажа и пропуская ледяную воду через ΑΡν-1000 между пассажами) с использованием 700 бар противодавления (в этот момент раствор должен быть прозрачным).
Разрушенные клетки переносят в центрифужную пробирку на 500 мл и клетки центрифугируют в течение 45 мин при 10000 об./мин в центрифуге БогуаИ с использованием головки Б^Α-3000.
Экстракт (приблизительно 225 мл) пропускают через фильтр 0,22 мкм.
Гидроксиапатитная (НА) хроматография.
Гидроксиапатитный гель Вю-Се1 ΗΤΡ (ΒΙ0-ΚΑΌ; номер по каталогу 130-0420) является кристаллической формой фосфата кальция, оказавшейся уникальным инструментом в разделении белков, таких как моноклональные антитела и другие белки, которые, в противном случае, не могли быть разделены другими способами. Однако в практике авторов данного изобретения характеристики текучести этого материала являются в некоторой степени критическими в том смысле, что поток, более сильный, чем 2 мл/мин, НС1 индуцирует давление до неприемлемо высокого уровня. Кроме того, этот материал разрушался несколько раз, когда предпринималась попытка его регенерации гидроксидом натрия, как это рекомендовано изготовителем.
Буферы и колонка.
Исходный раствор для буфера А+В: 1М Nа2ΗΡО4x2Н2О, рН=7,0 (рН доводят до 7 с использованием НС1). Буферы А+В готовят путем разведения исходного раствора.
Буфер А: 50 мМ №2ОТ04х2Н20, рН=7,0.
Буфер В: 0,3 мМ ^^0^^0, рН=7,0.
Колонку заполняли до приблизительно 50-60 мл гидроксиапатитным гелем В|о-Сс1 ΗΤΡ (ΒΙ0-ΚΑΌ; номер по каталогу 130-0420) с использованием суспензии в буфере А и колонки ХК 26/40 (ΑιηοΓκΙιαιη Вюкшепсе).
Схема хроматографии.
Система вытеснения 20 мл при токе 30 мл/мин.
Уравновешивание: 4 объема колонки (Ον буфера А при токе 2 мл/мин.
Пробу наносят при помощи насоса (входное отверстие Ε на ВюСаб) (приблизительно 225+5-10 мл, если требуется эта проба в трубопроводе) при токе 2 мл/мин.
Колонку промывают 1,5 ϋν буфера А при токе 2 мл/мин.
Элюция: белок элюируют градиентом 4 СV от 0 до 100% буфера В при токе 2 мл/мин.
Колонку очищают 2 СV буфера В при токе 2 мл/мин.
Повторно уравновешивают колонку 4 СV буфера А при токе 2 мл/мин.
Фракции отбирают, объединяют и диализуют в течение ночи (0Ν) при 4°С против 15х объема 20 мМ Трис-НС1, 0,075М №С1, рН 8,0.
Отбор ΤΝΕ'37-содержащих фракций после НА-хроматографии.
Профиль фракций элюции НА-хроматографии состоит, в основном, из проходящей фракции и одного элюированного пика, который может быть разделен на несколько пиков. ΤΝΕ'37-содержащие фракции должны отбираться на основе окрашенного Кумасси геля всего пика, так как пик, содержащий ΤΝΕ37, не может быть непосредственно идентифицирован. Однако в результате последующих стадий очистки отбор фракций в этой точке является менее критическим, и загрязнители могут быть удалены позднее в этой процедуре. Таким образом, менее консервативный отбор фракций гарантирует максимальный выход варианта.
Сначала проходящую через колонку фракцию проверяют дот-блотами на любой ΤΝΕ37. Это дает положительный результат, который теоретически должен свидетельствовать о том, что значительная часть этого варианта не связалась с колонкой. Однако при подвергании проходящей фракции очень эффективной катионообменной хроматографии на БΡ-сефарозе (см. следующую стадию) и анализе этих фракций с использованием окрашенных Кумасси гелей они не содержат какого-либо детектируемого ΤNΕ37-варианта, что свидетельствует о некой ложноположительной реакции в дот-блоте или фракции этого варианта, которая связывается совершенно отличающимся образом с БΡ-сефарозой.
Катионообменная хроматография на БΡ-сефарозе.
БΡ-сефароза является основной катионообменной стадией, выбранной вследствие более высокого рассчитанного ρΙ 9,4 этого варианта в сравнении с ρΙ 7,8 \\1ΤΝΕα. Увеличение ρΙ является следствием 2 лизинов, введенных посредством эпитопа ΡΑΌΚΕ. Эта хроматография является очень эффективной и быстрой для варианта ΤΝΕ37, и ожидается, что она применима для большого количества других петлевых вариантов ΤΝΕα.
Нанесенная проба должна иметь проводимость меньше 8 мС/см, и рН должен быть по меньшей мере 7,7 перед продолжением хроматографии на БΡ-сефарозе, поскольку отклонения от этих значений, как показала практика авторов данного изобретения, делали характеристики связывания белка отличающи
- 30 008254 мися время от времени.
Буферы и колонка.
Исходные растворы для буферов А+В: 1М Трис-НС1, рН=8,0.
Буфер А: 20 мМ Трис-НС1, 0,075М №С1, рН=8,0.
Буфер В: 20 мМ Трис-НС1, 1М №С1, рН=8,0.
Колонку заполняли до приблизительно 60 мл 8Р-сефарозой ΡΡ (АтегзЬат Вюзаепсез; номер по каталогу 17-0729-01) с использованием суспензии в буфере А и колонки ХК 26/40 (АтегзЬат Вюзаепсе).
Схема хроматографии.
Система вытеснения 20 мл при токе 30 мл/мин.
Уравновешивание: 4 СУ буфера А при токе 4 мл/мин.
Пробу наносят при помощи насоса (входное отверстие Ρ на ВюСаф (проба+10 мл, если требуется эта проба в трубопроводе) при токе 4 мл/мин.
Колонку промывают 1,5 СУ буфера А при токе 4 мл/мин.
Элюция: белок элюируют градиентом 4 СУ от 0 до 100% буфера В при токе 4 мл/мин.
Колонку очищают 2 СУ буфера В при токе 4 мл/мин.
Повторно уравновешивают колонку 4 СУ буфера А при токе 4 мл/мин.
Фракции отбирают, объединяют и диализуют в течение ночи (0Ν) при 4°С против 15х объема 20 мМ Трис-НС1, 0,075М №С1, рН 8,0.
Отбор ΤΝΕ'37-содержащих фракций после хроматографии на 8Р-сефарозе.
Профиль состоит, в основном, из проходящей фракции и нескольких содержащих белок пиков. Однако два пика содержат этот вариант с некоторыми примесями. В этот момент важно не включать слишком много фракций на правой стороне пика два, поскольку, исходя из опыта авторов изобретения, они включают в себя слишком много примесей, которые нелегко удаляются в последующих хроматографических стадиях.
0-Сефарозная анионообменная хроматография.
0-Сефароза является основной анионообменной стадией, выбранной для удаления основного загрязняющего белка, который с высокой воспроизводимостью сопровождает очистку ΤΝΡ37, в том числе при НА-хроматографии и 8Р-сефарозной хроматографии. Сам вариант ΤΝΡ37 не связывается с этой колонкой, а основной неизвестный загрязнитель связывается с ней. Однако можно разделить фракции консервативным способом уже в стадии 8Р-сефарозы таким образом, чтобы избежать этого загрязнителя. Однако это ухудшает выход варианта ΤΝΡ37 в сравнении с вариантом осуществления с использованием 0-сефарозы в этой процедуре, а поскольку также и другие минорные загрязнители удаляются в этой стадии, предпочтительно включать ее в общую процедуру. В заключение, можно утверждать, что О-сефарозная стадия является важной в очистке варианта 37 и дает даже еще более хороший конечный продукт с высоким выходом.
Буферы и колонка.
Исходные растворы для буферов А+В: 1М Трис-НС1, рН=8,0.
Буфер А: 20 мМ Трис-НС1, 0,075М №С1, рН=8,0.
Буфер В: 20 мМ Трис-НС1, 1М №С1, рН=8,0.
Колонку заполняли до приблизительно 50-60 мл 0-сефарозой ΡΡ (АтегзЬат Вюзаепсез; номер по каталогу 17-0510-01) с использованием суспензии в буфере А и колонки ХК 26/40 (АтегзЬат Вюзаепсе).
Схема хроматографии.
Система вытеснения 20 мл при токе 30 мл/мин.
Уравновешивание: 4 СУ буфера А при токе 4 мл/мин.
Пробу наносят при помощи насоса (входное отверстие Ρ на ВюСаф (проба+10 мл, если требуется эта проба в трубопроводе) при токе 2 мл/мин.
Колонку промывают 3 СУ буфера А при токе 4 мл/мин.
Элюция: оставшийся белок элюируют 2 СУ 100% буфера В при токе 4 мл/мин.
Повторно уравновешивают колонку 4 СУ буфера А при токе 4 мл/мин.
Фракции отбирают, объединяют и наносят непосредственно на 8Р-сефарозную колонку.
Профиль элюции состоит, в основном, из проходящей фракции и нескольких содержащих белок пиков. Проходящая фракция может иногда разделяться на несколько чисто разделенных пиков, которые все содержат вариант ΤΝΡ37, и, следовательно, их объединяют вместе. Вопрос о гетерогенности ΤΝΡ37, возможно, будет решен, когда будет разрешена проблема наблюдаемой протеолитической деградации.
Пример 12. Исследования иммунизации.
Материалы:
солевой раствор (0,9% №1С1 в стерильной воде, Вгезепшз КаЫ №где А8, №г\уау);
полный адъювант Фрейнда (81дта, Ρ-5881, 39Н8926);
неполный адъювант Фрейнда (81дта, Ρ-5506, 60К8937);
А1Ьуйгоде1 2% [10 мг А1/мл] (Вгепп!ад ВюзесФг, Ва!сЬ 96 (3176));
АфирЬоз [5 мг А1/мл] (Вгепп!ад ВюзесФг, Ва1сЬ 2 (8937));
- 31 008254
ΤΝΡ дикого типа человека (Iην^ΐ^οдеη, номер по каталогу: 10062-024):
ΚΎΜ-1Ό4: предоставлен А. Меадег (А Меадег, 1. Iттиηο1. Ме11юЙ5 1991, 144:141-143):
^ЕШ 164 клон 13: предоставлен Т. Е§реу1к (Т. Е§реу1к апй 1. №55еп-Муег 1. ^типок Ме11юЙ5 1986, 95:99-105):
соль тетразолия (МТС, СейШет 96 Лс.|иеои5 опе δοϊιιΐίοη: Рготеда, 63581):
вращающийся стержень (Ко!ат1х, Не!о, Эентагк): вортекс (ОЬЕ ЭШН тйтитеШтакега Ар8, Эентагк).
Выбор композиции/адъюванта.
Очищенные вариантные белки ΤΝΕα (в 20 мМ Трис-НС1, 0,075М ЫаС1, рН 8,0) разводили до 0,5 мг/мл солевым раствором (0,9% НС1), распределяли по группам (375 мкг/флакон) и хранили при -20°С до использования для иммунизации.
Для каждого варианта ΤΝΕα иммунизации проводили с двумя адъювантами: 1) полный адъювант Фрейнда (СЕА, для первичной иммунизации) и неполный адъювант Фрейнда ЦБА, для бустерных иммунизации) и 2) А1Ьуйтоде1 (альгидрогель) или Айщркок (адъюфос) (адъюванты существующего уровня техники гидроксид алюминия и фосфат алюминия, соответственно), их используют как для первичной, так и для повторных (бустер) инъекций.
Перед первичной иммунизацией выбирается либо альгидрогель, либо адъюфос в качестве адъюванта для варианта ΤΝΕ. Выбирают адъювант с наилучшей способностью абсорбировать вариант ΤΝΕα для дальнейшего применения в эксперименте по иммунизации. Две аликвоты ΤΝΕα смешивают с равным объемом альгидрогеля или адъюфоса в двух флаконах. Эти флаконы осторожно смешивают при комнатной температуре в течение 30 мин на вращающемся стержне. Затем флаконы центрифугируют при 13000 д в течение 15 мин и супернатант тестируют на содержание растворимого варианта ΤΝΕα на градиенте (412%) ДСН-геля. Затем аликвоту адъювант/вариант, содержащую наименьшее количество свободного варианта (т. е. где больше варианта связалось с содержащими алюминий частицами), отбирают в качестве наилучшего адъюванта.
Приготовление эмульгата антиген/адъювант.
СЕАДЕА-эмульгаты готовят с использованием следующей процедуры.
Флаконы с вариантом ΤΝΕα (0,5 мг/мл) оттаивают, переносят в стерильный флакон на 10 мл и смешивают с равным объемом СЕА или ЮА. Затем флакон смешивают дополнительно на вортексе при 3300 об./мин в течение 30 мин при 20°С.
Эмульгаты альгидрогель/адъюфос готовят с использованием следующей процедуры.
Альгидрогель/адъюфос разводят до 1,4 мг А1/мл солевым раствором. Флаконы с вариантом ΤΝΕα (0,5 мг/мл) оттаивают, переносят в стерильный флакон на 10 мл и смешивают с равным объемом альгидрогеля (1,4 мг А1/мл) или адъюфоса (1,4 мг А1/мл). Затем флакон смешивают дополнительно на вращающемся стержне в течение 30 мин при 20°С.
Выбор модели животного.
Шести-восьминедельных самок мышей Ва1Ь/Са повторяемо иммунизируют вариантами ΤΝΕα. Пробы крови собирают при различных интервалах и выделенные сыворотки исследуют на титры антитела против \\1ΤΝΕα. Мышей заказывают из Τη^ηία Еагт^ Шс. Асдштек М&В А/δ, Эентагк. Мышей содержат в установках для животных Ркаттеха в течение 1 недели перед началом эксперимента.
Схема и доза иммунизации.
Группам 10+10 мышей проводят иммунизацию каждым вариантом ΤΝΕα в СΕЛ/IΕА и альгидрогель/адъюфос, соответственно. Для иммунизации ΤΝΕα дикого типа используют 20+20 мышей.
При первой иммунизации 50 мкг белка в адъюванте инъецируют подкожно. Все мыши получают дополнительные бустер-иммунизации подкожно с 25 мкг белка в адъюванте спустя 2, 6 и 10 недель после первой иммунизации.
Пробы крови собирают непосредственно перед первой иммунизацией и спустя 1 неделю после каждой бустер-иммунизации.
Используемые анализы.
Биоанализ цитотоксичности, использующий клетки клона 13 164 ^ЕШ или клетки КУМ-1Э4: этот анализ используют для определения токсичности вариантов ΤΝΕα согласно изобретению. Клетки культивируют в течение 48 ч в присутствии титрованных количеств вариантов ΤΝΕα и смерть клеток определяют добавлением соли тетразолия ^Τδ), которая биовосстанавливается в окрашенный продукт формазана живыми клетками. Цитотоксичность вариантов ΤΝΕα сравнивают с цитотоксичностью ΤΝΕα дикого типа.
Биоанализ ингибирования цитотоксичности, использующий клетки клона 13 164 ХУЕЮ или клетки КУМ-Ю4: этот анализ используют для исследования способности антисывороток, индуцированных в иммунизированных ΤΝΕα мышах, нейтрализовать цитотоксическое действие ΤΝΕα дикого типа. Клетки культивируют в течение 48 ч с титрованными количествами антисывороток и ΤΝΕα дикого типа человека с постоянной концентрацией, которая является достаточной для индукции смерти клеток в 50% клеток в отсутствие антисывороток. Смерть клеток определяют с использованием МΤ8, как описано выше. Спо
- 32 008254 собность нейтрализации сывороток из иммунизированных ΤΝΕα-вариантами мышей сравнивают с сыворотками, полученными из мышей, иммунизированных ΤΝΕα дикого типа человека.
Исследования ίη νίίτο.
Биоанализ цитотоксичности, где используются клетки клона 13 164 УЕН1 или клетки ΚΥΜ-1Ό4: биоанализ ингибирования цитотоксичности с использованием клеток клона 13 164 УЕН1 или клеток ΚΥΜ-1Ό4.
Критерии для выбора наилучших иммуногенных конструкций.
Варианты ΤΝΕα должны проявлять минимальную цитотоксичность. При иммунизации мышей вариантами ΤΝΕα должны генерироваться антисыворотки с лучшей или равной способностью нейтрализовать опосредованную ΤΝΕα дикого типа человека цитотоксичность в клетках \УЕН1 или клетках ΚΥΜ1Ό4, как сыворотки, полученные из мышей, иммунизированных ΤΝΕα дикого типа человека.
Claims (33)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Иммуногенный аналог белка ΤΝΕα человека, причем указанный аналог содержит:(a) два или три полных мономера ΤΝΕα, соединенных последовательно пептидным линкером, где по меньшей мере один пептидный линкер включает в себя по меньшей мере одну связывающую МНС Класса ΙΙ аминокислотную последовательность, или (b) два или три полных мономера ΤΝΕα, соединенных последовательно инертным пептидным линкером, где по меньшей мере один из этих мономеров включает в себя по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС Класса ΙΙ аминокислотную последовательность или где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность слита с Ν- или Сконцевым мономером, необязательно через инертный линкер, или (c) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены в гибкую петлю 3, или (б) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует трехмерную структуру мономера ΤΝΕα, или (с) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором делетирована любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на аминоконце, или (ί) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены в петлю 1 в положении интрона, или (д) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность введена в виде части искусственного района ножки на Ν-конце ΤΝΕα человека, или (11) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность введена таким образом, чтобы стабилизировать структуру мономера путем увеличения гидрофобности границы тримерного взаимодействия, или (ί) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, инсертирована или встроена в виде замены в аминокислотную последовательность ΤΝΕα, или (ί) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены в петлю Ό-Е, или (k) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса ΙΙ аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены между двумя идентичными субпоследовательностями ΤΝΕα человека, или (l) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), в котором по меньшей мере один солевой мостик в ΤΝΕα человека усилен или заменен дисульфидным мостиком, или (т) мономер ΤΝΕα человека или аналог, определяемый в (а) или (Ь), где растворимость или стабильность в отношении протеолиза усилена введением мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного ΤΝΕα, где потенциальная токсичность уменьшена или устранена введением по меньшей мере одной точковой мутации, выбранной из группы, состоящей из Υ878, Ό143Ν или Α145Β, причем нумерация этих аминокислот устанавливается от Ν-концевого валина в ΤΝΕα человека.
- 2. Иммуногенный аналог по п.1, где связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность связывает большинство молекул МНС Класса ΙΙ из вида животного, из которого был получен мультимерный белок.- 33 008254
- 3. Иммуногенный аналог по п.2, где по меньшей мере одна связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность выбрана из природного Т-клеточного эпитопа и искусственной связывающей МНС-П пептидной последовательности.
- 4. Иммуногенный аналог по п.3, где природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного токсоида, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного токсоида, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р. £а1арагит.
- 5. Иммуногенный аналог по любому из предыдущих пунктов, где аминокислотная последовательность аналога выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ГО ΝΟ: 12, 13, 14, 16, 17 и 18 и любой аминокислотной последовательности, которая включает в себя только консервативные замены ее аминокислот.
- 6. Иммуногенный аналог по любому из предыдущих пунктов, который может быть экспрессирован в виде растворимого белка из бактериальных клеток.
- 7. Фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует иммуногенный аналог по любому из предыдущих пунктов, или комплементарный ему фрагмент нуклеиновой кислоты.
- 8. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.7, который является ДНК-фрагментом.
- 9. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.7 или 8, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из 8Е0 ГО ΝΟ: 12, 13, 14, 16, 17 и 18, или комплементарную ей последовательность нуклеиновой кислоты.
- 10. Способ понижающей регуляции аутологичного ΤΝΡα у животного-хозяина, предусматривающий выполнение презентации иммунной системе этого животного иммуногенного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога по любому из пп.1-6.
- 11. Способ по п.10, в котором аутологичным хозяином является млекопитающее, такое как человек.
- 12. Способ по п.10 или 11, в котором презентацию выполняют путем введения аутологичному хозяину иммуногенного аналога по любому из пп.1-6, необязательно в смеси с адъювантом.
- 13. Способ по п.12, в котором адъювант выбран из группы, состоящей из иммунного нацеливающего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллу адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикса КСОМ); частицы; ΌΌΑ; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта.
- 14. Способ по любому из пп.10-13, в котором иммуногенно эффективное количество аналога вводят животному посредством способа, выбранного из парентерального способа, такого как интрадермальный, субдермальный и внутримышечный способы; перитонеального способа; перорального способа; буккального способа; сублингвального способа; эпидурального способа; спинального способа; анального способа и интракраниального способа.
- 15. Способ по п.14, в котором эффективное количество составляет от 0,5 до 2000 мкг.
- 16. Способ по п.14 или 15, который предусматривает по меньшей мере одно введение в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
- 17. Способ по п.10, в котором презентацию аналога иммунной системе выполняют путем введения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей этот аналог, в клетки животного и получения посредством этого экспрессии ίη νί\Ό этими клетками введенной нуклеиновой кислоты (введенных нуклеиновых кислот).
- 18. Способ по п.17, в котором вводимая нуклеиновая кислота (вводимые нуклеиновые кислоты) выбрана/выбраны из голой ДНК, ДНК, составленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, заключенной в липосомы, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, составленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, составленной с нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, составленной с осаждающими кальций агентами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан, и ДНК, составленной с адъювантом, таким как адъюванты, определяемые в п.13.
- 19. Способ по п.17 или 18, в котором эти нуклеиновые кислоты вводят внутриартериально, внутривенно или способами, определяемыми в п.14.
- 20. Способ по любому из пп.17-19, который предусматривает по меньшей мере одно введение нуклеиновых кислот в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
- 21. Способ по п.10, в котором презентацию иммунной системе выполняют путем введения непатогенного микроорганизма или вируса, который несет фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует и экспрессирует этот аналог.
- 22. Способ по п.21, в котором вирусом является невирулентный поксвирус, такой как вирус коровьей оспы.
- 23. Способ по п.21, в котором микроорганизмом является бактерия.
- 24. Способ по любому из пп.21-23, в котором непатогенный микроорганизм или вирус вводят жи- 34 008254 вотному один-единственный раз.
- 25. Композиция для индукции продуцирования антител против мультимерного белка, содержащая иммуногенный аналог по любому из пп.1-6 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.
- 26. Композиция для индукции продуцирования антител против мультимерного белка, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.
- 27. Композиция по п.25 или 26, в которой аналог составлен, как определено в любом из пп.30 или 31.
- 28. Способ получения аналога по любому из пп.1-6, предусматривающий культивирование клеткихозяина, трансформированной фрагментом нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9, в условиях, которые облегчают его экспрессию, и затем извлечение аналога в виде белкового продукта экспрессии из культуры.
- 29. Способ по п.28, в котором клеткой-хозяином является бактериальная клетка-хозяин.
- 30. Способ по п.29, в котором аналогом является растворимый продукт экспрессии.
- 31. Способ по любому из пп.28-29, в котором клетку-хозяина культивируют при температуре ниже 32°С в течение значительного периода, при котором продукт экспрессии продуцируется клеткойхозяином.
- 32. Способ по п.31, где температура составляет приблизительно 25°С.
- 33. Способ по п.31 или 32, где температуру поддерживают, по существу, постоянной в течение всего периода культивирования клетки-хозяина.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US46949103P | 2003-05-09 | 2003-05-09 | |
DKPA200300701 | 2003-05-09 | ||
PCT/DK2004/000329 WO2004099244A2 (en) | 2003-05-09 | 2004-05-06 | Immunogenic human tnf alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200501773A1 EA200501773A1 (ru) | 2006-06-30 |
EA008254B1 true EA008254B1 (ru) | 2007-04-27 |
Family
ID=33436006
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200501773A EA008254B1 (ru) | 2003-05-09 | 2004-05-06 | Детоксифицированный tnf и способ получения |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060222624A1 (ru) |
EP (1) | EP1625157A2 (ru) |
JP (1) | JP2007523605A (ru) |
KR (1) | KR20060015595A (ru) |
AU (1) | AU2004235875A1 (ru) |
CA (1) | CA2524623A1 (ru) |
EA (1) | EA008254B1 (ru) |
MX (1) | MXPA05011965A (ru) |
NO (1) | NO20055724L (ru) |
NZ (1) | NZ543976A (ru) |
WO (1) | WO2004099244A2 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102004014983A1 (de) * | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Univ Stuttgart | Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung |
GB201510758D0 (en) | 2015-06-18 | 2015-08-05 | Ucb Biopharma Sprl | Novel TNFa structure for use in therapy |
GB201621907D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Ucb Biopharma Sprl And Sanofi | Antibody epitope |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02177896A (ja) * | 1988-12-28 | 1990-07-10 | Teijin Ltd | 新規生理活性ポリペプチド |
WO2003042244A2 (en) * | 2001-11-16 | 2003-05-22 | Pharmexa A/S | Immunogenic mimetics of multimer proteins with promiscuous t cell epitope inserts |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1054937A (en) | 1975-01-28 | 1979-05-22 | Gursaran P. Talwar | Antipregnancy vaccine |
US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
US4596792A (en) | 1981-09-04 | 1986-06-24 | The Regents Of The University Of California | Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin |
JPS5938877A (ja) | 1982-08-30 | 1984-03-02 | Musashi Eng Kk | 紙葉判別方法 |
US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
US4599231A (en) | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4599230A (en) | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4608251A (en) | 1984-11-09 | 1986-08-26 | Pitman-Moore, Inc. | LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues |
US4601903A (en) | 1985-05-01 | 1986-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease |
EP0224574A4 (en) | 1985-06-04 | 1988-04-26 | Biotech Res Partners Ltd | SELF-ANTIGEN VACCINES. |
US20030185845A1 (en) * | 2001-11-16 | 2003-10-02 | Steen Klysner | Novel immunogenic mimetics of multimer proteins |
-
2004
- 2004-05-06 EA EA200501773A patent/EA008254B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-05-06 WO PCT/DK2004/000329 patent/WO2004099244A2/en active Search and Examination
- 2004-05-06 MX MXPA05011965A patent/MXPA05011965A/es unknown
- 2004-05-06 JP JP2006504380A patent/JP2007523605A/ja active Pending
- 2004-05-06 KR KR1020057021347A patent/KR20060015595A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-05-06 EP EP04731308A patent/EP1625157A2/en not_active Withdrawn
- 2004-05-06 NZ NZ543976A patent/NZ543976A/en unknown
- 2004-05-06 CA CA002524623A patent/CA2524623A1/en not_active Abandoned
- 2004-05-06 AU AU2004235875A patent/AU2004235875A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-11-09 US US11/270,276 patent/US20060222624A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-30 NO NO20055724A patent/NO20055724L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02177896A (ja) * | 1988-12-28 | 1990-07-10 | Teijin Ltd | 新規生理活性ポリペプチド |
WO2003042244A2 (en) * | 2001-11-16 | 2003-05-22 | Pharmexa A/S | Immunogenic mimetics of multimer proteins with promiscuous t cell epitope inserts |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
DALUM I. ET AL.: "THERAPEUTIC ANTIBODIES ELICITED BY IMMUNIZATION AGAINST TNF-ALPHA", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 17, no. 7, 1999, pp. 666-669, XP000910155, ISSN: 1087-0156, page 666, page 668, right-hand column, last paragraph - page 669, right-hand column, paragraph 1 * |
DATABASE EMBL 'Online! EBI; 13 December 1990 (1990-12-13), XP002304718, retrieved from EBI, Database accession no. AAR06359, abstract & PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 014, no. 446 (C-0763), 25 September 1990 (1990-09-25) & JP 02 177896 A (TEIJIN LTD), 10 July 1990 (1990-07-10), abstract & DATABASE WPI Derwent Publications Ltd., London, GB; AN, 1990-252060, XP002304720 & JP 02 177896 A (TEIJIN), 10 July 1990 (1990-07-10), abstract * |
DATABASE EMBL 'Online! EBI; 22 September 2003 (2003-09-22), XP002304719, retrieved from EBI, Database accession no. AA030467, abstract & WO 03/042244 A (BRATT TOMAS; KLYSNER STEEN (DK); PHARMEXA AS (DK); VOLDBORG BJOERN (D) 22 May 2003 (2003-05-22), page 34, line 23 - page 47, line 5; claims 21, 22 * |
LOETSCHER HANSRUEDI ET AL.: "Human tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF receptors", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 268, no. 35, 1993, pages 26350-26357, XP002304715, ISSN: 0021-9258, abstract, page 26355, right-hand column, paragraph 2, page 26356, right-hand column, paragraph 3; figure 4 * |
NIELSEN FINN S. ET AL.: "A therapeutic HTNFalpha vaccine induces anti-TNFalpha antibodies that inhibit signalling through the TNFalpha: TNF receptor pathway", EUROPEAN CYTOKINE NETWORK, vol. 14, no. Supplement 3, September 2003 (2003-09), page 16, XP009039612 & ANNUAL MEETING OF THE INTERNATIONAL CYTOKINE SOCIETY; DUBLIN, IRELAND; SEPTEMBER 20-24, 2003, ISSN: 1148-5493, the whole document * |
NIELSEN FINN STAUSHOLM ET AL.: "Insertion of foreign T cell epitopes in human tumor necrosis factor alpha with minimal effect on protein structure and biological activity", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 279, no. 32, 6 August 2004 (2004-08-06), pages 33593-33600, XP002304716, ISSN: 0021-9258, the whole document * |
ZHANG X.M. ET AL.: "SITE-DIRECTED MUTATIONAL ANALYSIS OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA RECEPTOR BINDING SITE AND STRUCTURE-FUNCTIONAL RELATIONSHIP", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 267, no. 33, 25 November 1992 (1992-11-25), pages 24069-24075, XP002922635, ISSN: 0021-9258, abstract, page 24074, right-hand column, paragraph 1; table 1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20060222624A1 (en) | 2006-10-05 |
CA2524623A1 (en) | 2004-11-18 |
NZ543976A (en) | 2008-04-30 |
EA200501773A1 (ru) | 2006-06-30 |
WO2004099244A2 (en) | 2004-11-18 |
MXPA05011965A (es) | 2006-02-02 |
EP1625157A2 (en) | 2006-02-15 |
KR20060015595A (ko) | 2006-02-17 |
JP2007523605A (ja) | 2007-08-23 |
AU2004235875A1 (en) | 2004-11-18 |
WO2004099244A3 (en) | 2004-12-29 |
NO20055724L (no) | 2005-11-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0975668B1 (en) | MODIFIED TNFalpha MOLECULES, DNA ENCODING SUCH MODIFIED TNFalpha MOLECULES AND VACCINES COMPRISING SUCH MODIFIED TNFalpha MOLECULES AND DNA | |
EP1114166B1 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity | |
US7070784B1 (en) | Method for down-regulating GDF-8 activity using immunogenic GDF-8 analogues | |
US20070184023A1 (en) | Method for down-regulation of vegf | |
JP2005518194A (ja) | 乱交雑t細胞エピトープ挿入物を有するマルチマータンパク質の免疫原性擬態物 | |
ZA200509031B (en) | Immunogenic human TNF alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation | |
US20030185845A1 (en) | Novel immunogenic mimetics of multimer proteins | |
EA008254B1 (ru) | Детоксифицированный tnf и способ получения | |
AU2002342596A1 (en) | Immunogenic mimetics of multimer proteins with promiscuous T cell epitope inserts | |
MXPA99009394A (es) | Moleculas de tnfa modificadas, adn que modifica tales moleculas de tnfa modificadas y vacunas que comprenden tales moleculas tnfa modificadas y adn | |
EA006940B1 (ru) | Применение opgl и его аналогов для отрицательной регуляции opgl в организме животного | |
EP1541587A2 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |