EA006940B1 - Применение opgl и его аналогов для отрицательной регуляции opgl в организме животного - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новому способу отрицательной регуляции биологической активности лиганда остеопротегерина (OPGL, TRANCE), который делает возможным лечение/ослабление заболеваний, характеризующихся избыточной потерей костной массы, например остеопороза. Отрицательная регуляция осуществляется индукцией иммунного ответа против OPGL в индивидууме, нуждающемся в этом. Иммунные ответы могут быть индуцированы классической иммунизацией иммуногенными вариантами OPGL или иммунизацией нуклеиновыми кислотами, кодирующими вариант OPGL. Данное изобретение относится также к композициям, полипептидам и нуклеиновым кислотам, применимым в данном изобретении, а также к векторам и трансформированным клеткам-хозяевам, применимым в их получении.

Description

Данное изобретение относится к усовершенствованиям в терапии и профилактике остеопороза и других заболеваний, характеризующихся разрежением костной ткани. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способ отрицательной регуляции лиганда остеопротегерина (ОРСЬ) путем создания возможности образования антител против ОРСЬ в субъектах, страдающих от остеопороза или имеющих риск страдания от остеопороза. Данное изобретение обеспечивает также способы получения модифицированного ОРСЬ, применимого в этом способе, а также сам модифицированный ОРСЬ. Данное изобретение включает также фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный ОРСЬ, а также векторы, включающие эти фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации аналогов ОРСЬ, которые применимы в способе данного изобретения, а также композиции, содержащие модифицированный ОРСЬ или содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие аналоги ОРСЬ.

Остеопороз является основной и растущей проблемой здоровья во всем мире. Он поражает, согласно оценке, общее количество 75 миллионов человек в Соединенных Штатах Америки, Европе и Японии. Таким образом, остеопороз является наиболее обычным системным костным нарушением в индустриализованной части мира.

Остеопороз поражает одну из четырех постклимактерических женщин и большинство пожилых людей, в том числе значительное число мужчин. Согласно оценке в 1984 году, стоимость лечения остеопороза в Соединенных Штатах Америки с 15 миллионами заболевших составляла 3,8 миллиарда долларов США ежегодно. При экстраполяции на стоимость во всем мире это составляет около по меньшей мере 20 миллиардов долларов США.

Остеопороз представляет собой системное скелетное заболевание, характеризующееся низкой костной массой и микроархитектурной деградацией костной ткани, с последующим увеличением ломкости костей и подверженности переломам. Хотя поражаются все кости, типичными и наиболее обычными являются переломы позвоночника, запястья и бедра. Риск развития остеопороза увеличивается с возрастом и является более высоким у женщин, чем у мужчин. Его этиология, по-видимому, находится в механизмах, лежащих в основе чрезмерного усиления обычной потери костной массы, которая наблюдается после менопаузы у женщин и имеет место во всех индивидуумах с увеличением возраста.

Максимум костной массы достигается в возрасте приблизительно 35 лет. После достижения этого максимума костная масса снижается в течение всей жизни вследствие дисбаланса в ремоделировании костей. Кости теряют как минеральный, так и органический матрикс, но сохраняют их основную организацию.

Кость состоит из минерализованного внеклеточного матрикса, состоящего из множества белков и протеогликанов; причем основным компонентом является коллаген типа I. Инкрустирующим этот внеклеточный матрикс минералом является гидроксиапатит (Са₃(РО₄)₂Са(ОН)₂). Кость непрерывно моделируется во время роста и развития и ремоделируется на протяжении всей жизни в ответ на физические и химические сигналы.

Рост, развитие и поддержание кости представляют собой высокорегулируемые процессы, которые на клеточном уровне включают в себя координированную регуляцию костеобразующих (остеогенных) клеток (остеобластов) и резорбирующих (рассасывающих) кость клеток (остеокластов). Уровень костной массы отражает баланс костеобразования (остеогенеза) и резорбции костей.

Остеобласты возникают из мезенхимных стволовых клеток и продуцируют костный матрикс во время развития, после повреждения костей и во время нормального ремоделирования костей, котог рое происходит на протяжении всей жизни. Остеокласты дифференцируются из гемопоэтических предшественников моноцитарномакрофагальной линии дифференцировки и резорбируют (рассасывают) костный матрикс.

Дисбаланс функций остеобластов и остеокластов может приводить к скелетным нарушениям, характеризующимся увеличенной костной массой (остеопетроз) или уменьшенной костной массой (остеопороз).

Исследования остеопетроза в мутантных мышах показало, что генетические дефекты в развитии, созревании и/или активации остеокластов ведут к уменьшенной резорбции костей и неизменно приводят к тяжелому остеопетрозу (Магкк, 1989). Несмотря на это, до сих пор относительно мало было известно о растворимых факторах, которые действуют физиологически, регулируя развитие остеокластов.

Однако недавно были описаны и охарактеризованы два белка, которые участвуют в этой регуляции (81шопе1 с( а1., 1997; Ьасеу с( а1., 1998). Эти два белка представляют собой остеопротегерин и лиганд остеопротегерина.

Остеопротегерин представляет собой новый секретируемый член семейства рецепторов фактора некроза опухолей. Ιη νίίτο, остеопротегерин блокирует остеокластогенез зависимым от дозы образом. Трансгенные мыши, экспрессирующие остеопротегерин, обнаруживают общее увеличение плотности костей (остеопетроз), связанное с уменьшением количества остеокластов. Введение рекомбинантного остеопротегерина производит сходные эффекты в нормальных мышах и защищает против связанной с овариэктомией потерей костной массы у крыс (81шопе1 е( а1., 1997). Кроме того, остеопротегерин

- 1 006940 недостаточные мыши (мыши с нокаутом гена), хотя и являются нормальными при рождении, развивают раннее появление остеопороза и кальцификацию артерий (Висау е! а1., 1998). Эти наблюдения в сильной степени указывают на возможность того, что остеопротегерин блокирует дифференцировку остеокластов, основного, если не единственного типа резорбирующих кость клеток, что предполагает, что он может действовать в качестве гуморального регулятора резорбции костей. Остеопротегерин является объектом по \νϋ 97/23614.

Высказывалась гипотеза, что остеопротегерин может проявлять его действие путем связывания с фактором, стимулирующим развитие остеокластов, и нейтрализацией его, ингибируя таким образом созревание остеокластов (ΞίιηοποΙ е! а1., 1997).

Лиганд остеопротегерина (ОРОЬ) является новым членом семейства цитокинов, являющихся факторами некроза опухолей, которые существуют как в мембраносвязанной, так и в растворимой форме. ОРОЬ связывается с остеопротегерином с аффинностью связывания 4 нМ. Ιη νίίτο, ОРОЬ активирует зрелые остеокласты и модулирует образование остеокластов из предшественников костного мозга в присутствии С8Р-1. Было также продемонстрировано, что ОРОЬ связывается с поверхностью клетокпредшественников остеокластов в обработанном С8Р-1 костном мозге. Однако рецептор для ОРОЬ на этих гемопоэтических клетках-предшественниках является неизвестным. Рекомбинантный растворимый ОРОЬ является сильнодействующим индуктором резорбции костей ίη νΐνο (Ьасеу е! а1., 1998).

Описание ОРСЬ

ОРОЬ синтезируется в виде трансмембранного белка типа II, состоящего из 317 аминокислотных остатков (человеческий, см. 8ЕО ΙΌ N0:2) или 316 аминокислотных остатков (мышиный, см. 8Е0 ΙΌ N0:4 и 6). Сопоставление выстраиванием этих двух аминокислотных последовательностей показывает, что идентичные аминокислотные остатки обнаруживаются в 87% гомологичных положений.

Аминокислотная последовательность ОРОЬ содержит короткий цитоплазматический домен в Νконце с последующим предположительным трансмембранным участком между аминокислотными остатками 49 и 69. На основании его гомологии фактору некроза опухолей α было предположено, что внеклеточная часть ОРОЬ состоит из двух доменов: участка ножки от аминокислотного остатка 70 до остатка 157 и активной лигандной части от аминокислотного остатка 158 до С-конца.

Наиболее близкородственным белком для ОРОЬ является, по-видимому, индуцирующий апоптоз цитокин ТКАГЬ с менее чем 25% идентичных аминокислотных остатков. ОРОЬ был также недавно клонирован в других контекстах и был назван ТКА^Е (\νοη§ е! а1., 1997, 1. Βίο1. Сйеш. 272: 25190-25194) и ΚΑΝΚΕ, соответственно (Ληώ^ΐΈοη е! а1., 1997, №Ц.1ге 390: 175-179). Этот белок также известен как фактор дифференцировки остеокластов (ОЭР).

Несколько вариантов с Ν-концевыми делециями мышиного ОРОЬ были экспрессированы в Е. сο1^ и очищены. Эти варианты состояли из аминокислотных остатков 75-316, 128-316, 137-316 и 158-316, соответственно. Три наиболее коротких варианта имели одинаковую β-складчатую структуру согласно исследованиям кругового дихроизма, и все были способны связывать остеопротегерин. Хотя наиболее важным является то, что эти три варианта были активными в тестах ίη νίίτο (Ьасеу е! а1., 1998).

Самый короткий вариант был исследован дополнительно. Подобно фактору некроза опухолей α, этот вариант ОРОЬ существует в виде тримера в растворе и образует комплексы 3:3 при инкубировании с остеопротегерином. Было найдено, что аффинность связывания была равна 4 нМ. Этот вариант индуцирует существенные увеличения в содержании ионизированного кальция в крови (гиперкальциемию) в мышах ίη νΐνο. Совместное введение остеопротегерина значимо уменьшает этот гиперкальциемический эффект ОРОЬ.

Самый длинный вариант (аминокислотные остатки 75-316) ОРОЬ не связывался с остеопротегерином и не обладал никакой биологической активностью.

Во время конструирования Ν-концевых делеционных вариантов не был известен природный сайт расщепления в ОРОЬ. Экспрессия полноразмерного ОРОЬ в фибробластах 293 человека приводила к растворимому ОРОЬ, начинающемуся с аминокислотного остатка 139 в мышином белке или с гомологичного аминокислотного остатка 140 в белке человека. Эти исследования экспрессии показали также, что растворимый ОРОЬ, образующийся при экспрессии в клетках человека, является гликозилированным. Это не является удивительным, так как, как мышиный, так и человеческий ОРОЬ содержит три потенциальных сайта Ν-гликозилирования в С-концевом лигандном домене.

Концентрации остеопротегерина в крови и тканях неизвестны, но этот белок имеет существенную биологическую активность при концентрации 1 нг/мл.

Биологическая активность ОРСЬ

ОРОЬ является сильным фактором дифференцировки остеокластов при объединении с С8Р-1. Ни один из этих компонентов по отдельности не способен индуцировать дифференцировку остеокластов из клеток-предшественников.

ОРОЬ является сильным активатором зрелого остеокласта. ОРОЬ, сам по себе, активирует зрелые остеокласты для резорбции кости. Наблюдали, что ОРОЬ действует как фактор роста остеокластов или фактор выживания остеокластов в этих экспериментах.

- 2 006940

Действие ОРСЬ, по-видимому, не является видоограниченным, так как мышиный ОРСЬ также индуцировал образование остеокластов в культурах мононуклеарных клеток периферической крови человека.

Цель изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение новых терапий против состояний, характеризующихся избыточной резорбцией кости, таких как остеопороз. Следующей целью является разработка аутовакцины против ОРСЬ для получения нового способа лечения для остеопороза и для других патологических нарушений, включающих в себя избыточную резорбцию костей.

Краткое содержание изобретения

Авторы изобретения считают, что приведенная выше информация предполагает патофизиологическую роль ОРСЬ. Полученное ίη νΐνο доказательство является частично косвенным или непрямым, но, по мнению авторов, убедительным, особенно в сочетании с прямым доказательством.

Наблюдение, что инъекция в мышей рекомбинантного С-концевого домена ОРСЬ приводит к тяжелой гиперкальциемии, по мнению авторов, непосредственно указывает на патофизиологическую роль.

Косвенное доказательство вытекает из результатов для остеопротегерин-дефектных мышей (мышей с нокаутом гена), которые, хотя и являются нормальными при рождении, развивают раннее появление остеопороза. Это свидетельствует о том, что удаление белка, который связывает ОРСЬ и нейтрализует его действия, приводит к остеопорозу. Авторы приходят к выводу, что наиболее вероятной причиной этого является повышенное созревание остеокластов и повышенная активация остеокластов, вызываемые ОРСЬ.

Две другие части непрямого доказательства заключаются в том, что как мыши, трансгенные в отношении остеопротегерина, так и мыши, инъецированные рекомбинантным остеопротегерином, развивают остеопетроз. Это указывает на то, что неестественно высокие уровни белка, который связывает ОРСЬ и нейтрализует его эффекты, приводят к остеопетрозу. На основании этого авторы делают вывод, что причины этого лежат в сниженном созревании и сниженной активации, вызываемых нейтрализацией ОРСЬ.

Таким образом, авторы данного изобретения предлагают модель, в которой ОРСЬ и остеопротегерин действуют в качестве положительного и отрицательного регуляторов развития остеокластов соответственно. Другими словами, ОРСЬ стимулирует резорбцию кости, тогда как остеопротегерин ингибирует резорбцию кости.

Таким образом, в отношении остеопороза ОРСЬ мог бы рассматриваться как патогенный агент, стимулирующий резорбцию костей, которая в конце концов приводит к остеопорозу. Подобным образом, остеопротегерин может рассматриваться как терапевтический агент, который противодействует этому патогенному агенту путем нейтрализации его действий.

Таким образом, авторы изобретения предлагают отрицательно регулировать дифференцировку/созревание/образование остеокластов и активацию остеокластов посредством ίη νΐνο образования антител, способных нейтрализовать ОРСЬ, обеспечивая посредством этого безопасный и эффективный способ лечения/ослабления и/или предупреждения остеопороза и других заболеваний, характеризуемых избыточной скоростью резорбции кости, в сравнении со скоростью костеобразования.

Таким образом, в его самом широком смысле и наиболее общем объеме, данное изобретение относится к способу отрицательной регуляции ίη νΐνο активности лиганда остеопротегерина (ОРСЬ) в животном, в том числе в человеке, причем этот способ предусматривает представление (презентацию) иммунной системе этого животного иммунологически эффективного количества - по меньшей мере одного полипептида ОРСЬ или его субпоследовательности, которые были приготовлены таким образом, что иммунизация этого животного этим полипептидом ОРСЬ или его субпоследовательностью индуцирует продуцирование антител против полипептида ОРСЬ; и/или по меньшей мере одного аналога ОРСЬ, в котором введена модификация в полипептид ОРСЬ, которая приводит к тому, что иммунизация этого животного этим аналогом индуцирует продуцирование антител против полипептида ОРСЬ.

Наиболее привлекательным аспектом данного подхода является то, что, например, остеопороз может регулироваться периодическими, но не очень частыми иммунизациями, в противоположность терапевтическому подходу, который включает частое (например, ежедневное) введение остеопротегерина или молекул, имеющих связывающую аффинность в отношении ОРСЬ, аналогичную связывающей аффинности остеопротегерина. Ожидается, что 1-4 инъекции в год иммуногенной композицией будут достаточны для получения желаемого эффекта, тогда как введение остеопротегерина или других ингибиторов активности ОРСЬ могло бы требовать ежедневных введений.

Данное изобретение относится также к аналогам ОРСЬ, а также к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующим подсерию этих аналогов. Частью данного изобретения являются также иммуногенные композиции, содержащие аналоги этих фрагментов нуклеиновых кислот.

Данное изобретение относится также к способу идентификации аналогов ОРСЬ, а также к способу получения композиции, включающей аналоги ОРСЬ.

Наконец, данное изобретение относится к способу лечения остеопороза и других заболеваний, характеризующихся избыточной резорбцией костей, предусматривающему введение молекулы, не являю

- 3 006940 щейся ОРСЬ (обычно антитела), которая блокирует взаимодействие между ОРСЬ и его рецептором на клетках остеокластов.

Подробное описание изобретения

Определения

Далее, ряд терминов, используемых в данном описании и формуле изобретения, будут определены и объяснены подробно для разъяснения границ и пределов данного изобретения.

Термины Т-лимфоцит и Т-клетка будут использоваться взаимозаменяемо для лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные клеточноопосредованные иммунные ответы, а также для активности лимфоцитов-хелперов в гуморальном иммунном ответе. Также термины Влимфоцит и В-клетка будут использоваться взаимозаменяемо для продуцирующих антитела лимфоцитов .

Термин полипептид ОРСЬ обозначает здесь полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность обсужденных выше белков ОРСЬ, полученных из людей и мышей, (или их укороченные варианты, имеющие существенное число общих В-клеточных эпитопов с интактным ОРСЬ), но полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, идентичную аналогам этих двух белков, выделенным из других видов, также охватываются этим термином. Негликозилированные формы ОРСЬ, которые получают в прокариотической системе, также включены в границы этого термина, как и формы, имеющие различные параметры гликозилирования вследствие использования, например, дрожжей или других эукариотических экспрессионных систем, не являющихся системами млекопитающих. Однако следует отметить, что при использовании термина полипептид ОРСЬ имеется в виду, что рассматриваемый полипептид обычно является неиммуногенным при представлении животному, подлежащему лечению. Другими словами, полипептид ОРСЬ является своим (ауто)белком или является аналогом такого своего (ауто)белка, который в норме не будет индуцировать иммунный ответ против ОРСЬ рассматриваемого животного.

Аналог ОРСЬ представляет собой полипептид ОРСЬ, который был подвергнут изменениям его первичной структуры. Такое изменение может быть, например, в форме слияния полипептида ОРСЬ с подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре, включающее в себя исключительно С- и/или Ν-концевые добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности полипептида ОРСЬ. Этот термин охватывает также производные молекул ОРСЬ, см. обсуждение ниже модификаций ОРСЬ.

Следует отметить, что применение в качестве вакцины для человека ксеноаналога (например, собачьего или свиного аналога) ОРСЬ человека может предполагаться для получения желательного иммунитета против ОРСЬ. Такое применение ксеноаналога для иммунизации является также рассматриваемой частью данного изобретения.

Термин «полипептид» в данном контексте предназначен для обозначения как коротких пептидов из 2-10 аминокислотных остатков, олигопептидов из 11-100 аминокислотных остатков, так и полипептидов из более, чем 100, аминокислотных остатков. Кроме того, этот термин включает в себя также белки, т.е. функциональные биомолекулы, содержащие по меньшей мере один полипептид; при содержании по меньшей мере двух полипептидов они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть не ковалентно связанными. Этот полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидированными и/или содержать простетические группы.

Термин «подпоследовательность» обозначает любой последовательный отрезок из по меньшей мере 3 аминокислот или, в случае нуклеотидных последовательностей, из по меньшей мере 3 нуклеотидов, происходящих непосредственно из природно встречающейся аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности ОРСЬ соответственно.

Термин животное в данном контексте обычно обозначает вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Ното 5ар1еи5, Сашк боте^Ост и т.д., а не только одно единственное животное. Однако этот термин обозначает также популяцию таких видов животных, так как важно, что все индивидуумы, иммунизированные в соответствии со способом данного изобретения, несут, по существу, один и тот же ОРСЬ, что позволяет иммунизировать этих животных одним и тем же иммуногеном (иммуногенами). Если, например, генетические варианты ОРСЬ существуют в отличающихся популяциях людей, может быть необходимым использование различных иммуногенов в этих отличающихся популяциях, чтобы суметь разрушить аутотолерантность в отношении ОРСЬ в каждой популяции. Лицу с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что животное в данном контексте является живым существом, имеющим иммунную систему. Предпочтительно это животное является позвоночным животным, таким как млекопитающее.

Под термином отрицательная (понижающая) регуляция ίη νίνο активности ОРСЬ имеют в виду уменьшение в живом организме числа взаимодействий между ОРСЬ и его (неизвестным) рецептором (или между ОРСЬ и другими возможными биологически важными партнерами связывания для этой молекулы). Понижающая регуляция может быть получена посредством нескольких механизмов: из них наиболее простым является простое блокирование активного сайта в ОРСЬ посредством связывания антитела. Однако в объеме данного изобретения является также и то, что связывание антитела приводит к

- 4 006940 удалению ОРСЬ поглощающими клетками (такими как макрофаги и другие фагоцитирующие клетки).

Выражение осуществление представления (презентации) ... иммунной системе предназначено для обозначения того, что иммунную систему животного подвергают иммуногенной стимуляции контролируемым образом. Как будет видно из приведенного ниже описания, такая стимуляция иммунной системы может выполняться различными путями, из которых наиболее важными являются вакцинация полипептидом, содержащим фармакцины (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления развития заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту фармакцинами. Важным результатом, который должен быть достигнут, является то, что иммунокомпетентные клетки в этом животном противостоят этому антигену иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата является менее важным относительно идеи изобретения, лежащей в основе данного изобретения.

Термин иммуногенно эффективное количество имеет обычное значение, используемое в данной области, т. е. количество иммуногена, способное индуцировать иммунный ответ, который в существенной степени связывает патогенные агенты, имеющие общие иммунологические свойства с этим иммуногеном.

При использовании выражения, что ОРСЬ был модифицирован, здесь имеется в виду химическая модификация полипептида, который составляет каркас (скелет) ОРСЬ. Такая модификация может быть, например, производной (например, алкилированием) определенных аминокислотных остатков в последовательности ОРСЬ, но, как будет понятно из приведенного ниже описания, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности ОРСЬ.

При обсуждении «аутотолерантности в отношении ОРСЬ» понятно, что, поскольку ОРСЬ является «своим» белком в подлежащей вакцинации популяции, нормальные индивидуумы в этой популяции не развивают иммунный ответ против ОРСЬ; однако, нельзя исключить того, что случайные индивидуумы в популяции животных будут способны продуцировать антитела против нативного ОРСЬ, например, как части аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, животное обычно будет аутотолерантным только в отношении его собственного ОРСЬ, но нельзя исключить, что аналоги ОРСЬ, полученные из других видов животных или из популяции, имеющей отличающийся фенотип ОРСЬ, могли бы также быть переносимыми указанным животным.

«Чужеродный Т-клеточный эпитоп» (или «чужеродный эпитоп Т-лимфоцитов») представляет собой пептид, который способен связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости МНС и который стимулирует Т-клетки в видах животных. Предпочтительными чужеродными Т-клеточными эпитопами в данном изобретении являются «смешанные» эпитопы, т. е. эпитопы, которые связываются с существенной фракцией конкретного класса молекул МНС в виде или популяции животного. Известно лишь очень ограниченное число таких смешанных Т-клеточных эпитопов, и они будут обсуждаться подробно ниже. Следует отметить, что, для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с данным изобретением, были эффективными в по возможности большой фракции популяции животного, может быть необходимо 1) встраивание нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог ОРСЬ или 2) получение нескольких аналогов ОРСЬ, причем каждый аналог имеет отличающийся от других встроенный смешанный эпитоп. Следует отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов включает в себя также применение криптических (замаскированных) Т-клеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые получены из «своего» белка и которые проявляют иммуногенное поведение только в том случае, когда они существуют в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого «своего» белка.

«Чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита» (чужеродный Т_н-эпитоп) является чужеродным Тклеточным эпитопом, который связывается на молекуле МНС Класса II и может быть представлен на поверхности антигенпредставляющей (антигенпрезентирующей) клетки (АПК), связанной с молекулой МНС Класса II.

«Функциональная часть» (био)молекулы в данном контексте обозначает часть этой молекулы, которая ответственна за по меньшей мере один из биохимических или физиологических эффектов, проявляемых данной молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за эффекты, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут выполнять стабилизирующую или усиливающую растворимость роль и могут быть, следовательно, опущены, если эти цели не имеют отношения к рассматриваемому вопросу в контексте определенного варианта данного изобретения. Например, можно использовать определенные цитокины в качестве модифицирующей части в ОРСЬ (см. подробное описание ниже), и в таком случае вопрос стабильности может быть не относящимся к делу, так как связывание с ОРСЬ обеспечивает необходимую стабильность.

Термин «адъювант» имеет его обычное значение в области приготовления вакцин, т.е. он представляет собой вещество или композицию, которые 1) сами не способны вызывать специфический иммунный ответ против иммуногена данной вакцины, но которые 2), тем не менее, способны усиливать иммунный ответ против данного иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только одним адъювантом не обеспечивает иммунного ответа против иммуногена, вакцинация иммуногеном может индуцировать или

- 5 006940 может не индуцировать иммунный ответ против иммуногена, но объединенная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунный ответ против этого иммуногена, который является более сильным, чем иммунный ответ, индуцируемый одним иммуногеном.

«Нацеливание» молекулы означает в данном контексте ситуацию, в которой молекула при введении в животное будет появляться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связана с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может быть достигнут рядом способов, в том числе путем приготовления этой молекулы в композиции, облегчающей нацеливание, или путем введения в эту молекулу групп, облегчающих нацеливание. Эти вопросы будут подробно обсуждаться ниже.

«Стимуляция иммунной системы» обозначает, что вещество или рассматриваемая композиция проявляет общее, неспецифическое иммуностимулирующее действие. Ряд адъювантов и возможных адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является увеличенная «бдительность» иммунной системы, что означает, что одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном индуцирует значительно более эффективный иммунный ответ в сравнений с отдельным использованием данного иммуногена.

Предпочтительные варианты отрицательной регуляции активности ОРСЬ

Предпочтительно, чтобы полипептид ОРСЬ, используемый в качестве иммуногена в способе данного изобретения, был модифицированной молекулой, в которой по меньшей мере одно изменение присутствует в аминокислотной последовательности ОРСЬ, так как шансы получения всеобъемлюще важного разрушения аутотолерантности в отношении ОРСЬ значительно облегчается таким образом. Следует отметить, что это не исключает возможности применения такого модифицированного ОРСЬ в композициях, которые дополнительно разрушают аутотолерантность против ОРСЬ, например, в композициях, содержащих адъюванты.

Было показано (в Эа1ит I. с1 а1., 1996, 1. 1ттипо1. 157: 4796-4804), что потенциально аутореактивные В-лимфоциты, узнающие «свои» белки, физиологически присутствуют в нормальных индивидуумах. Однако для того чтобы эти В-лимфоциты были индуцированы для действительного продуцирования антител, реактивных с соответствующими своими белками, требуется помощь продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов (Т_н-клеток или Т_н-лимфоцитов). Обычно эта помощь не обеспечивается, так как Т-лимфоциты обычно не узнают Т-клеточные эпитопы, происходящие из своих белков, при предоставлении антигенпредставляющими клетками (АПК). Однако путем обеспечения элемента чужеродности в своем белке (т.е. путем введения иммунологически значимой модификации), Т-клетки, узнающие этот чужеродный элемент, активируются при узнавании этого чужеродного эпитопа на АПК (такой как, прежде всего, мононуклеарная клетка). Поликлональные В-лимфоциты (которые также являются АПК), способные узнавать свои эпитопы на модифицированном своем белке, также интернализуют этот антиген и затем представляют его чужеродный Т-клеточный эпитоп (эпитопы), а активированные Т-лимфоциты впоследствии обеспечивают помощь в виде цитокинов этим реактивным против своих антигенов поликлональным В-лимфоцитам. Поскольку антитела, продуцируемые этими поликлональными В-лимфоцитами, являются реактивными с различными эпитопами на модифицированном полипептиде, в том числе теми, которые присутствуют также и в нативном полипептиде, индуцируется антитело, перекрестно реагирующее с немодифицированным своим белком. В результате, можно заставить Т-лимфоциты действовать таким образом, как если бы популяция поликлональных Влимфоцитов узнавала полностью чужеродный антиген, тогда как на самом деле только встроенный эпитоп (эпитопы) является (являются) чужеродным(и) для данного хозяина. Таким путем индуцируются антитела, способные перекрестно реагировать с немодифицированными аутоантигенами.

Несколько способов модификации пептидного аутоантигена для достижения разрушения аутотолерантности известны в данной области. Таким образом, в соответствии с данным изобретением, эта модификация может включать в себя следующее:

вводят по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный эпитоп, и/или вводят по меньшей мере одну первую часть молекулы, которая осуществляет нацеливание модифицированной молекулы на антиген-представляющую клетку (АПК), и/или вводят по меньшей мере одну вторую часть молекулы, которая стимулирует иммунную систему, и/или вводят по меньшей мере одну третью часть молекулы, которая оптимизирует представление (презентацию) модифицированного полипептида ОРСЬ иммунной системе.

Однако все эти модификации должны выполняться при сохранении существенной фракции первоначальных эпитопов В-лимфоцитов в ОРСЬ, так как в результате этого усиливается узнавание Влимфоцитами нативной молекулы.

В одном предпочтительном варианте вводят ковалентно или нековалентно боковые группы (в форме чужеродных Т-клеточных эпитопов или вышеуказанных первой, второй и третьей частей). Это должно означать, что отрезки аминокислотных остатков, полученные из ОРСЬ, дериватизуют без изменения первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без введения изменений в пеп

- 6 006940 тидные связи между отдельными аминокислотами в этой цепи.

Альтернативный и предпочтительный вариант использует замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавление аминокислоты (которые могут достигаться при помощи рекомбинантных способов или с использованием пептидного синтеза; модификации, включающие в себя более длинные отрезки аминокислот, могут давать слитые полипептиды). Одной из особенно предпочтительных версий этого варианта является способ, описанный в ШО 95/05849, который раскрывает способ отрицательной регуляции «своих» белков путем иммунизации аналогами «своих» белков, в которых ряд аминокислотных последовательностей был заменен соответствующим числом аминокислотных последовательностей, каждая из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, с сохранением в то же самое время общей третичной структуры данного своего белка в этом аналоге. Однако для целей данного изобретения достаточно, если эта модификация (будь то инсерция, добавление, делеция или замена) создает чужеродный Т-клеточный эпитоп и в то же самое время сохраняет существенное число В-клеточных эпитопов в ОРСБ. Однако для получения максимальной эффективности индуцированного иммунного ответа предпочтительно, чтобы в этой модифицированной молекуле была сохранена вся третичная структура ОРСБ.

Следующая формула описывает конструкции ОРСБ, обычно охватываемые данным изобретением: (ΜΟϋ!) ₃₁ (ОРСЬ_е1) _П1 (ΜΟϋ₂) 32 (ОРСЬ_е2) п2 .. . (М00_х)_ах(0Р6Ьех)пх (I) где ОРСБ_е1-ОРСБ_ех обозначают х содержащих В-клеточный эпитоп подпоследовательностей ОРСБ, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродные боковые группы, х обозначает целое число >3, п1-пх обозначают х целых чисел >0 (по меньшей мере один из них >1), МОЭ|-МОЭ_х обозначают х модификаций, введенных между сохраненными В-клеточными эпитопами, и §1-8х обозначают х целых чисел >0 (по меньшей мере один из них > 1, если в последовательности ОРСБ не введены боковые группы). Таким образом, при условии обычных функциональных ограничений в отношении иммуногенности этих конструкций, данное изобретение делает возможными все типы пермутаций первоначальной последовательности ОРСБ и все типы модификаций в ней. Таким образом, в данное изобретение включены все модифицированные ОРСБ, полученные опущением частей последовательности ОРСБ, которые, например, проявляют побочные действия ίη νίνο, или опущением частей, которые обычно являются внутриклеточными и, следовательно, могут индуцировать нежелательные иммунологические реакции.

Сохранение существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, который подвергают модификации, как описано здесь, может быть достигнуто несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против ОРСБ (например, сыворотки, полученной в кролике) и после этого использование этой антисыворотки в качестве тест-реагента (например, в конкурентном ЕБ18А) против получаемых модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в той же самой степени с этой антисывороткой, что и ОРСБ, должны рассматриваться как имеющие одинаковую третичную структуру с ОРСБ, тогда как аналоги, обнаруживающие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность с такой антисывороткой, рассматриваются как сохранившие существенную фракцию исходных Вклеточных эпитопов.

Альтернативно, могут быть отобраны моноклональные антитела, реактивные с различающимися эпитопами на ОРСБ, и использованы в качестве тест-панели. Этот подход имеет то преимущество, что он делает возможным 1) картирование эпитопов ОРСБ и 2) картирование эпитопов, которые сохраняются в полученных аналогах.

Конечно, третьим подходом было бы выяснение трехмерной структуры ОРСБ или его биологически активного укороченного варианта (см. выше) и сравнение ее с выясненной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть выяснена при помощи рентгенографических исследований и ЯМР-спектроскопии. Дополнительная информация относительно третичной структуры может быть до некоторой степени получена из исследований кругового дихроизма, которые имеют то преимущество, что требуют только наличия этого полипептида в чистой форме (тогда как рентгенография требует обеспечения кристаллизуемого полипептида, а ЯМР-спектроскопия требует обеспечения изотопных вариантов этого полипептида) для получения полезной информации о третичной структуре конкретной молекулы. Однако в конечном счете рентгенография и/или ЯМР являются необходимыми для получения заключительной информации, так как круговой дихроизм может дать только косвенное доказательство правильной трехмерной структуры посредством информации об элементах вторичной структуры.

Один предпочтительный вариант данного изобретения использует множественные представления (презентации) эпитопов В-лимфоцитов ОРСБ (т.е. формулы I, в которой по меньшей мере один Вклеточный эпитоп присутствует в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными путями, например просто получением слитых полипептидов, содержащих структуру (ОРСБ)_т, где т обозначает целое число >2, и затем введением обсуждаемых здесь модификаций в по меньшей мере одну из этих последовательностей ОРСБ. Предпочтительно, чтобы введенные модификации включали по меньшей мере одну дупликацию В-лимфоцитарного эпитопа и/или введение гаптена.

- 7 006940

Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено введением, по меньшей мере, инсерции, добавления, делеции или замены одной аминокислоты. Конечно, обычной ситуацией будет введение более чем одного изменения в аминокислотной последовательности (например, инсерции или замены всего Т-клеточного эпитопа), но важной задачей, которая должна быть достигнута, является то, что аналог ОРОЬ при обработке антигенпредставляющей клеткой (АПК) будет приводить к тому, что такой чужеродный Т-клеточный эпитоп будет представлен в контексте молекулы МНС Класса II на поверхности этой АПК. Таким образом, если аминокислотная последовательность ОРСЬ в подходящих положениях содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также обнаружены в чужеродном Т_н-эпитопе, то введение Т_н-эпитопа может быть выполнено обеспечением остальных аминокислот этого чужеродного эпитопа посредством инсерции, добавления, делеции и замены аминокислот. Другими словами, необходимо ввести полный Т_н-эпитоп путем инсерции или замены для удовлетворения цели данного изобретения.

Предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений было по крайней мере 2, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 инсерций, замен, добавлений или делеций. Кроме того, предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений не превышало 150, и было, например, самое большее 100, самое большее 90, самое большее 80 и самое большее 70. Особенно предпочтительно, чтобы число замен, инсерций, делеций или добавлений не превышало 60 и, в частности, это число не должно превышать 50 или даже 40. Наиболее предпочтительным является число не более 30. Что касается добавлений аминокислот, следует отметить, что они, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, часто значительно превышают число 150.

Предпочтительные варианты данного изобретения включают модификацию посредством введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Должно быть понятно, что вопрос иммунодоминантности Т-клеточного эпитопа зависит от рассматриваемого вида животного. В применении здесь, термин иммунодоминантность относится просто к эпитопам, которые в вакцинированном индивидууме/вакцинированной популяции индуцируют возникновение значимого иммунного ответа, но хорошо известным является тот факт, что Т-клеточный эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме/одной популяции необязательно является иммунодоминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже хотя он может быть способным связывать молекулы МНС-11 в последнем упомянутом индивидууме. Таким образом, для целей данного изобретения иммунодоминантным Т-клеточным эпитопом является Т-клеточный эпитоп, который будет эффективным в обеспечении помощи Т-клеток при его присутствии в антигене. Обычно иммунодоминантные Тклеточные эпитопы имеют присущий им признак, заключающийся в том, что они будут, по существу, всегда представлены в связанном с молекулой МНС Класса II виде, независимо от полипептида, в котором они появляются.

Другим важным моментом является вопрос МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов. Обычно, природно встречающиеся Т-клеточные эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенные пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с подсерией молекул МНС Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев использование одного специфического Т-клеточного эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который эффективен только во фракции этой популяции, и, в зависимости от размера этой фракции, может возникать необходимость во включении большего числа Т-клеточных эпитопов в ту же самую молекулу или, альтернативно, в получении мультикомпонентной вакцины, в которой эти компоненты представляют собой варианты ОРОЬ, которые отличаются друг от друга природой введенного Т-клеточного эпитопа.

Если МНС-рестрикция используемых Т-клеток является совершенно неизвестной (например, в ситуации, когда вакцинированное животное имеет слабо определенный состав МНС), фракция популяции, охватываемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы:

где Ρϊ обозначает частоту встречаемости в популяции респондеров на ΐ-й чужеродный Т-клеточный эпитоп, присутствующий в этой вакцинной композиции, а η обозначает общее число чужеродных Тклеточных эпитопов в данной вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющих частоты встречаемости ответов в популяции 0,8, 0,7 и 0,6, соответственно, дала бы 1 - 0,2 х 0,3 х 0,4 = 0,976, т.е. 97,6% этой популяции будут статистически продуцировать МНС-П-опосредованный ответ на эту вакцину.

Приведенная выше формула неприменима в ситуациях, когда известны более или менее точные параметры МНС-рестрикции используемых пептидов. Если, например, определенный пептид связывается только с молекулами МНС-П человека, кодируемыми НЕА-ΏΚ-аллелями ΏΚ1, ΏΚ3, ΏΚ5 и ΏΚ7, то применение этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы МНС-П, кодируемые НЬА-ОК-аллелями, будет выполнять 100% охват в рассматриваемой популяции. Таким же

- 8 006940 образом, если этот второй пептид связывает только ЭК3 и ЭК5, добавление этого пептида вообще не увеличит этого охвата. Если производить расчет ответа популяции на основе только МНС-рестрикции Тклеточных эпитопов в вакцине, фракция популяции, охватываемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы:

⁽¹¹¹⁾ где φ_, обозначает сумму частот встречаемости в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к |-му из 3 известных локусов НЕЛ (ЭР, ЭК и практически сначала определяют, какие молекулы МНС будут узнавать каждый Т-клеточный эпитоп в данной вакцине, и после этого их распределяют в соответствии с типом (ЭР, ЭК и ЭО), а затем индивидуальные частоты встречаемости распределенных аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, получая в результате φ_μ φ₂ и φ₃.

Может встретиться случай, когда величина р, в формуле II превышает соответствующую теоретическую величину πι

^. = )-11()-^)² <^ιν>

7*1 где V обозначает сумму частот встречаемости в популяции аллель-ного гаплотипа, кодирующего молекулы МНС, которые связывают ΐ-й Т-клеточный эпитоп в вакцине и которые принадлежат к р-му из 3 известных локусов НЕЛ (ЭР, ЭК и ^^) . Это означает, что в 1-π_Ι этой популяции имеется частота респондеров Е_{остаточный-}1 = (рУП])/(1-п0. Таким образом, формула III может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу V ^=ι-Πη»(ι-Π(ι-/__,)) (V) где термин 1-Н_{остаточный-}1 принимают за нуль, если он является отрицательным. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы были гаплотипом, картированным против идентичных наборов гаплотипов.

Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог ОРСЕ важно включать всю известную информацию об этих эпитопах, которая является доступной: 1) частоту встречаемости респондеров в популяции для каждого эпитопа, 2) информацию об МНС-рестрикции и 3) частоту встречаемости в популяции соответствующих гаплотипов.

Существует ряд природно встречающихся «смешанных» Т-клеточных эпитопов, которые являются активными в большой части индивидуумов видов животных или популяции животных, и их предпочтительно вводить в вакцину, уменьшая тем самым необходимость в очень большом количестве различных аналогов ОРСЕ в одной и той же вакцине.

Этот смешанный эпитоп согласно данному изобретению может быть природно встречающимся Тклеточным эпитопом человека, таким как эпитопы из столбнячного токсоида (например, эпитопы Р2 и Р30), дифтерийного токсоида, гемаглюттинин вируса гриппа (НА) и антиген С8 Р. 1а1е1рагиш.

На протяжении последних лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую часть молекул НЕЛЭК, кодируемых различными аллелями НЕЛ-ЭК, и все они являются возможными Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги ОРСЕ, используемые в соответствии с данным изобретением. Эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, включены в качестве ссылок: АО 98/23635 (Егазег Ш е! а1., переуступленный ТЕе ишуегзИу о£ ^иееη§1аηά); 8ои!Е^ооб 8 е! а1., 1998, I. Iттиηο1. 160, 3363-3373; МшдадНа Е е! а1., 1988, №!иге 336: 778-780; САс/ КМ е! а1., 1993, I. Ехр. Меб. 178: 27-47; Наттег I е! а1., 1993, Се11 74: 197-203 и Еа1к К е! а1., 1994, ИитипоцепеЦс^ 39: 230-242. Последняя ссылка также рассматривает лиганды IIIΛ-ΙΧ) и -ЭР. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, являются соответствующими кандидатами природных эпитопов для применения в данном изобретении, так же как и эпитопы, имеющие общие с ними мотивы последовательностей.

Альтернативно, эпитоп может быть любым синтетическим Т-клеточным эпитопом, который способен связывать большую часть молекул МНС Класса II. В этом контексте, пептиды рап ЭК-эпитопа (РАЭКЕ), описанные в АО 95/07707 и в соответствующей статье А1ехапбег I е! а1., 1994, ^типНу 1: 751761 (оба описания включены здесь в качестве ссылки) являются представляющими интерес кандидатами на эпитопы для использования в соответствии с данным изобретением. Следует отметить, что наиболее эффективные пептиды РАЭКЕ, описанные в этих статьях, несут Э-аминокислоты в С- и Ν-концах для улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение нацелено прежде всего на включение соответствующих эпитопов в виде части модифицированного ОРСЕ, которая должна впоследствии отщепляться ферментативно в лизосомном компартменте АПК, чтобы сделать возможным представление (презентацию) в контексте молекулы МНС-П, и, следовательно, включение Э-аминокислот в эпитопы, используемые в данном изобретении, является нецелесообразным.

Одним из особенно предпочтительных пептидов РАЭКЕ является пептид, имеющий аминокислот

- 9 006940 ную последовательность ЛКЕУЛЛ^ТЬКЛЛЛ, или его иммунологически эффективная субпоследовательность. Этот эпитоп и другие эпитопы, имеющие такое же отсутствие МНС-рестрикции, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах ОРСЬ в способе данного изобретения. Такие сверхразнородные эпитопы сделают возможными наиболее простые варианты данного изобретения, в которых только один единственный модифицированный ОРСЬ представляется иммунной системе вакцинированного животного.

Как упоминалось выше, модификация ОРСЬ может также включать введение первой части молекулы, которая нацеливает модифицированный ОРСЬ на АПК или В-лимфоцит. Например, первая часть молекулы может быть партнером специфического связывания для поверхностного антигена, специфического для В-лимфоцитов, или для АПК-специфического поверхностного антигена. Многочисленные подобные специфические поверхностные антигены известны в данной области. Например, эта часть может быть углеводом, для которого имеется рецептор на В-лимфоцитах или АПК (например, маннаном или маннозой). Альтернативно, вторая часть может быть гаптеном. Фрагмент антитела, который специфически узнает поверхностную молекулу на АПК или лимфоцитах, может быть использован в качестве первой части молекулы (эта поверхностная молекула может быть, например, ЕСу-рецептором макрофагов или моноцитов, таким как ЕСуК1, или, альтернативно, любым другим специфическим поверхностным маркером, таким как СЭ40 или СТЬА-4). Следует отметить, что все эти являющиеся примерами нацеливающие молекулы могут быть использованы также в виде части адъюванта, см. ниже.

В качестве альтернативы или дополнения, для нацеливания модифицированного полипептида ОРСЬ на определенный тип клеток для достижения усиленного иммунного ответа, можно увеличивать уровень отвечаемости иммунной системы путем включения вышеуказанной второй части молекулы, которая стимулирует иммунную систему. Типичными примерами таких вторых частей молекул являются цитокины и белки теплового шока или молекулярные «наставники», а также их эффективные части.

Подходящими цитокинами для применения в соответствии с данным изобретением являются такие цитокины, которые будут обычно функционировать также в качестве адъювантов в вакцинной композиции, т.е., например, интерферон у (ΙΕΝ-у), интерлейкин 1 (1Ь-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (ГЬ-12), интерлейкин 13 (ГЬ-13), интерлейкин 15 (ГЬ-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е); альтернативно, функциональной части молекулы цитокина может быть достаточно в качестве второй части. Что касается использования таких цитокинов в качестве адъювантных веществ, см. обсуждение ниже.

В соответствии с данным изобретением, подходящими белками теплового шока или молекулярными наставниками, используемыми в качестве второй части молекулы, могут быть Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, СКР94 (также известный как др96, сравните \Усагс11 РА е! а1., 1998 ВюсЬетМгу 37: 5709-19) и СКТ (кальретикулин).

Альтернативно, второй частью молекулы может быть токсин, такой как листериолицин (ЬЬО), липид А и термолабильный энетротоксин. Ряд микобактериальных производных, таких как МЭР (мурамилдипептид), СЕА (полный адъювант Фрейнда) и диэфиры трегалозы ТОМ и ΤΌΕ, также являются представляющими интерес возможностями.

Возможность введения третьей части молекулы, которая усиливает представление модифицированного ОРСЬ иммунной системе, является также важным вариантом данного изобретения. В данной области описаны несколько примеров этого принципа. Например, известно, что якорь пальмитоиллипидирования в белке ОкрА Воггейа ЬигдбогГеп может быть использован таким образом, чтобы обеспечить полипептиды с аутоадъювантными свойствами (см., например, XVО 96/40718) - по-видимому, липидированные белки образуют мицеллоподобные структуры с центральной частью, состоящей из якорных частей липидирования этих полипептидов, а остальные части этой молекулы выступают из нее, что приводит к множественным представлениям антигенных детерминант. Таким образом, использование этого и родственных подходов с использованием различных якорей липидирования (например, миристильной группы, фарнезильной группы, геранилгеранильной группы, СР1-якоря и Ν-ацилдиглицеридной группы) составляет предпочтительные варианты данного изобретения, в частности, потому, что обеспечение такого якоря липидирования в рекомбинантно получаемом белке является довольно простым и требует лишь использования, например, природно встречающейся сигнальной последовательности в качестве партнера слияния для модифицированного полипептида ОРСЬ. Другой возможностью является использование фрагмента С3б фактора комплемента С3 или самого фактора С3 (см. Эетркеу е! а1., 1996, 8с1еисе 271: 348-350 и Ьои & КоЫег, 1998, №1Шге Вю1ес1шо1оду 16, 458-462).

Альтернативным вариантом данного изобретения, который также приводит к предпочтительному представлению множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных районов эпитопов ОРСЬ иммунной системе, является ковалентное связывание ОРСЬ, его субпоследовательности или вариантов с определенными молекулами. Например, могут быть использованы полимеры, например, углеводы, такие как декстран, см., например, Ьеек А е! а1., 1994, Уассше 12: 1160-1166; Ьеек А е! а1., 1990, 1. 1ттипо1. 145: 3594-3600, но применимыми альтернативами являются также манноза и маннан. Интегральные мембранные белки, например, из Ε. сой и других бактерий, также являются применимыми партнерами конъюга

- 10 006940 ции. Традиционные молекулы-носители, такие как гемоцианин фисуреллы (КЬН), столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид и бычий сывороточный альбумин (БСА), также являются предпочтительными и применимыми партнерами конъюгации.

Определенные зоны нативного ОРОЬ, по-видимому, являются наиболее пригодными для проведения модификаций. Вследствие структурного родства ОРОЬ с ΤΝΕ-α и другими членами семейства факторов некроза опухолей, прогнозируется, что введения Τ-клеточных эпитопов или других модификаций в зонах, определяемых положениями 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 или 285-316 (нумерация аминокислот 8ЕО Ш N0:4, 6 и 12), будут, наиболее вероятно, давать желательные результаты. Эти положения относятся к мышиному ОРОЬ - соответствующими положениями в молекуле человека являются 171-193, 199-219, 222-247, 257-262 и 286-317 (нумерация аминокислот 8Е0 Ш N0:2).

Соображениями, обосновывающими эти выбранные зоны, являются а) сохранение известных и предсказанных В-клеточных эпитопов, Ь) сохранение третичной структуры и т.д. Во всяком случае, как обсуждалось выше, довольно легко подвергнуть скринингу набор модифицированных молекул ОРОЬ, которые были подвергнуты введению Т-клеточного эпитопа в различных положениях.

Поскольку наиболее предпочтительные варианты данного изобретения включают отрицательную регуляцию ОРОЬ человека, является, следовательно, предпочтительным, чтобы обсуждаемый выше полипептид ОРОЬ был полипептидом ОРОЬ человека. В этом варианте особенно предпочтительно, чтобы полипептид ОРОЬ человека был модифицирован заменой по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в 8Е0 1Э NО:2 (или в полипептиде, в котором Сук-221 в 8Е0 1Э NО:2 был заменен серином), по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины и содержащей чужеродный Т_н-эпитоп. Замещенные аминокислотные остатки выбраны из остатков 257-262, 289-303 и 222-243 в 8Е0 1Э NО:2. Обоснование таких конструкций обсуждается подробно в примерах.

Приготовление ОРСЬ и модифицированных полипептидов ОРСЬ

При осуществлении представления (презентации) полипептида ОРОЬ или модифицированного полипептида ОРОЬ иммунной системе животного посредством введения его этому животному, приготовление этого полипептида выполняется согласно принципам, общепринятым в данной области.

Приготовление вакцин, содержащих пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как описано, например, патентами 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, все они включены здесь в качестве ссылок. Обычно такие вакцины получают в виде инъекций, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъецированием. Препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющий или эмульгирующий агенты, забуферивающие рН агенты или адъюванты, которые повышают эффективность вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов ниже.

Эти вакцины обычно вводят парентерально, инъекцией, например, подкожно, внутрикожно, интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые пригодны для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, сублингвальные (подъязычные), интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные (внутричерепные) композиции. Для суппозиториев, традиционные связывающие вещества и носители могут включать, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают обычно применяемые наполнители, такие как, например, имеющие фармацевтическую чистоту маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для пероральных композиций, холерный токсин является представляющим интерес партнером композиции (и также возможным партнером конъюгации).

Эти полипептиды могут быть приготовлены в виде вакцины в нейтральной форме или в виде солей. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами пептида) и соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, минальная кислота, и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также произведены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа (III), и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т. п.

Эти вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией и в таком количестве,

- 11 006940 которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от проходящего лечение субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума устанавливать иммунный ответ, и желательной степени защиты. Подходящие диапазоны доз являются диапазонами порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на одну вакцинацию с предпочтительным диапазоном от приблизительно 0,1 до 2000 мкг (хотя обсуждаются даже более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), такие как дозы в диапазоне от приблизительно 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг и, в частности, в диапазоне от приблизительно 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для начального введения и бустер-дозы также являются вариабельными, но типичным является начальное введение с последующими инокуляциями или другими введениями.

Способ применения может широко варьироваться. Любой из общепринятых способов введения вакцин является применимым. Эти способы включают в себя пероральное введение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентеральное введение посредством инъекции или т.п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет меняться в соответствии с возрастом вакцинируемого лица и композицией антигена.

Некоторые полипептиды этой вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ будет усиливаться, если эта вакцина дополнительно содержит адъювантное вещество.

Известны разнообразные способы достижения адъювантного эффекта в отношении вакцины. Общие принципы и способы подробно описаны в Т11С Тйеоту апб РтасДса1 Αρρίίοαίίοη о£ Абщуапй, 1995, Эппсам Е.8. 81е\уаП-Ти11 (еб.), ίοΐιη XVНеу & 8ойп5 ЬЙ, Ι8ΒΝ 0-471-95170-6, а также в Уассшек: Ыете Оепетайоп 1ттипо1од1са1 Абщуапй, 1995, Огедопаб18 О. е1 а1. (ебк), Р1епит Ргекк, Νονν Уотк, Ι8ΒΝ 0-30645283-9, обе статьи включены здесь в качестве ссылок.

Особенно предпочтительно использовать адъювант, который может продемонстрировать облегчение разрушения аутотолерантности к аутоантигенам; действительно, это является существенным в случаях, когда в качестве активного ингредиента в аутовакцине используют немодифицированный ОРОЬ. Неограничительные примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из адъюванта иммунного нацеливания; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин, и микобактериальное производное; масляной композиции, полимера; образующего мицеллы адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (18СОМ-матрикса); частицы; ЭЭА; алюминийсодержащих адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта. В общем, следует отметить, что приведенные выше описания, которые относятся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в аналогах, относятся также ти1аЙ8 ти1апб18 (с соответствующими изменениями) к их использованию в адъюванте вакцины данного изобретения.

Применение адъювантов включает применение агентов, таких как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1-процентного раствора в забуференном солевом растворе, смеси с синтетическими полимерами сахаров (например, Карбополом®), используемыми в виде 0,25% раствора, возможной является также агрегация белка в вакцине тепловой обработкой температурами в диапазоне между 70-101°С в течение периодов 30 с - 2 мин, соответственно, и также агрегация с использованием сшивающих агентов. Могут быть также использованы агрегация реактивацией обработанными пепсином антителами (ЕаЬ-фрагментами) на альбумине, смешивание с бактериальными клетками, такими как С. ратуит, или эндотоксинами или липосахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульгирование в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как моноолеат маннида (Агасе1 А), или эмульгирование с 20-процентным раствором перфторуглерода (Е1и8о1-ЭА), используемым в качестве заменителя блокады. Предпочтительным является также смешивание с маслами, такими как сквален и ΙΕΑ.

В соответствии с данным изобретением ЭЭА (диметилдиоктаде-циламмонийбромид) является представляющим интерес кандидатом на адъювант, как и ДНК и γ-инулин, но также полный адъювант Фрейнда и неполные адъюванты Фрейнда, а также сапонины РиШа_)а, такие как ΟιιίΙΑ и 0821, являются представляющими интерес кандидатами на адъювант, как и Κ.ΙΒΙ. Дополнительными возможностями являются монофосфориллипид А (МРЬ), вышеупомянутые С3 и С3б и мурамилди-пептид (МЭР).

Известно, что липосомные композиции также сообщают адъювантные эффекты, и, следовательно, липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением.

Адъюванты типа матрикса, состоящего из молекулярного комплекса с иммуностимулирующими свойствами, (I8СОМ®-матрикса), также являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением, особенно потому, что было показано, что этот тип адъювантов способен положительно регулировать (повышать) экспрессию МНС Класса ΙΙ антигенпредставляющими клетками (АПК).

I8СОМ®-матрикс состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) из Ош11а)а каропапа, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная состоящая из частиц композиция представляет собой то, что известно как КСОМ-частица, где сапонин составляет 60-70% в/в, холестерин и фосфолипид 10-15% в/в и белок 10-15% в/в. Подробности, относящиеся к составу и применению иммуностимулирующих комплексов, могут быть, например, найдены в

- 12 006940 вышеуказанных учебниках, касающихся адъювантов, а также Могеш В е! а1., 1995, С1ш. 1тшипо1йег. 3: 461-475, а также Вагг Ю апй Мйс11е11 СЕ, 1996, 1ттипо1. апй Се11 Вю1. 74: 8-25 (обе статьи включены здесь в качестве ссылок) обеспечивают полезные инструкции для приготовления полных иммуностимулирующих комплексов.

Другой очень интересной (и, следовательно, предпочтительной) возможностью достижения адъювантного действия является применение способа, описанного в работе Ооккейп е! а1., 1992 (включенной здесь в качестве ссылки). Вкратце, представление соответствующего антигена, такого как антиген данного изобретения, может быть усилено конъюгацией этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против рецепторов Есу на моноцитах/макрофагах. В частности, было показано, что конъюгаты между антигеном и анти-ЕсуВ1 повышают иммуногенность для целей вакцинации.

Другие возможности включают применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (1п1ег айа цитокинов), упомянутых выше в качестве кандидатов для первой и второй частей молекулы в модифицированных версиях ОРСБ. В этой связи, синтетические индукторы цитокинов, такие как поли 1:С, являются также возможными кандидатами.

Подходящие микобактериальные производные выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, Р1В1 и диэфира трегалозы, такого как ТОМ и ТОЕ.

Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбраны из группы, состоящей из лиганда ί'.Ό40 и антител ί'.Ό40 или их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, ЕаЬфрагмента и СТЬЛ-4.

Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; полимера-пластика и латекса, такого как гранулы латекса.

Еще одним представляющим интерес путем модуляции иммунного ответа является включение иммуногена ОРСБ (необязательно с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в «виртуальный лимфатический узел» (УБЫ) (патентованное медицинское устройство, разработанное 1тшипоТйегару, 1пс., 360 БехшдФп Ауепие, Ые\г Уогк, ΝΥ 10017-6501). Это устройство (УБЫ) (тонкотрубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Введение УБЫ под кожу создает участок стерильного воспаления с сильным увеличением цитокинов и хемоки-нов. Τ- и Вклетки, а также АПК быстро отвечают на сигналы опасности, перемещаются к воспаленному участку и накапливаются в пористом матриксе УБЫ. Было показано, что необходимая доза антигена, требующаяся для установления иммунного ответа на антиген, уменьшается при использовании УБЫ и что иммунная защита, обеспечиваемая вакцинацией с использованием УБЫ, превосходила общепринятую иммунизацию с использованием В1В1 в качестве адъюванта. Этот способ описан т!ег айа вкратце в Се1Ьег С е! а1., 1998, Ейсйайоп оБ ВоЬик! Се11и1аг апй Нитога1 1ттипе Векропкек !о 8та11 Атоип!к оБ 1ттиподепк Иктд а Ыоуе1 Мейюа1 Эеу1се Эекщпа1ей 1йе У1йиа1 Бутрй Ыойе, т: Егот 1Пе БаЬога1огу !о 1йе Сйшс, Воок оБ ЛЬк1гас1к. ОсЮЬег 12¹¹' - 15* 1998, 8еаксаре Векой, Ар!ок, СаШогша.

Ожидается, что эта вакцина должна вводиться 1-6 раз в год, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в год, индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. Ранее было показано, что запоминающий иммунитет, индуцированный путем применения предпочтительных аутовакцин в соответствии с данным изобретением, не является постоянным, и, следовательно, иммунная система требует периодической стимуляции ОРСБ или модифицированными полипептидами ОРСБ.

Вследствие наследственной изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать иммунными ответами варьирующей силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина данного изобретения может содержать несколько различных полипептидов для увеличения иммунного ответа, см. также приведенное выше обсуждение относительно выбора введений чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцина может содержать два или более полипептидов, где все из этих полипептидов являются определенными выше полипептидами.

Таким образом, вакцина может содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных полипептидов.

Вакцинация нуклеиновыми кислотами

В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе пептидов, способ вакцинации нуклеиновыми кислотами (известный также как «иммунизация нуклеиновыми кислотами», «генетическая иммунизация» и «генная иммунизация») предоставляет ряд привлекательных признаков.

Во-первых, в противоположность подходу с традиционными вакцинами, вакцинация нуклеиновыми кислотами не требует дорогостоящего крупномасштабного производства иммуногенного агента (например, в форме ферментации промышленного масштаба микроорганизмов, продуцирующих модифицированный ОРСБ). Кроме того, нет необходимости в разработке схем очистки и повторной укладки для иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основывается на биохимическом аппарате вакцинированного индивидуума для продуцирования продукта экспрессии введенных нуклеиновых кислот, ожидается, что будет иметь место оптимальный посттрансляционный процессинг этого продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, поскольку, как упоминалось выше, значительная фракция первоначальных В-клеточных эпитопов ОРСБ должна сохраняться в модифици

- 13 006940 рованной молекуле и поскольку В-клеточные эпитопы в принципе могут состоять из частей любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, вполне возможно, что природные параметры гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть важными для общей иммуногенности, и это лучше всего гарантируется при продуцировании иммуногена хозяином.

Таким образом, предпочтительный вариант данного изобретения предусматривает проведение представления модифицированного ОРСЬ иммунной системе путем введения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей модифицированный ОРСЬ, в клетки животного и получения в результате этого экспрессии ίη νΐνο этими клетками введенной нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).

В этом варианте, вводимой нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК, которая может быть в форме голой ДНК, ДНК, приготовленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, приготовленной в липосомах, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, приготовленной в виде препарата с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, приготовленной в виде препарата с нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, приготовленной с агентами кальций-преципитации, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в хитине или хитозане, и ДНК в виде препарата с адъювантом. В этом контексте следует отметить, что практически все рассмотрения, касающиеся использования адъювантов в приготовлении традиционных вакцин, применимы для приготовления ДНК-вакцин. Таким образом, все приведенные здесь описания, относящиеся к применению адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, относятся ιηαιιίαίιικ ιηιιίαηάίκ (с соответствующими изменениями) к их применению в технологии вакцинации нуклеиновыми кислотами.

Что касается путей введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые были подробно описаны выше, они также являются применимыми для вакцин на основе нуклеиновых кислот данного изобретения, и все приведенные выше обсуждения, касающиеся способов введения и схем введения для полипептидов, относятся ιηιιίαΐίκ ти1аиб1к (с соответствующими изменениями) и к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут подходящим образом вводиться внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть введены с использованием так называемого генного «ружья», и, следовательно, этот и эквивалентные способы введения рассматриваются как часть данного изобретения. Наконец, сообщалось также, что применение УЬЫ во введении нуклеиновых кислот давало хорошие результаты, и, таким образом, этот конкретный способ введения является особенно предпочтительным.

Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать участки, кодирующие 1-ую, 2-ую и/или 3-ю части молекулы, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта охватывает наличие кодирующего участка для аналога и кодирующего участка для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем разных промоторов. Посредством этого можно избежать того, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отдельных нуклеотидных фрагмента, но это менее предпочтительно вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии в случае присутствия обоих кодирующих участков в одной и той же молекуле.

Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования антител против ОРСЬ, причем эта композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор данного изобретения (см. обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически приемлемый наполнитель, и/или носитель, и/или адъювант, описанные выше.

При нормальных условиях, кодирующую вариант ОРСЬ нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора, в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробных обсуждений векторов в соответствии с данным изобретением, см. обсуждение ниже. Подробные описания, касающиеся приготовления и применения вакцин на основе нуклеиновых кислот, также доступны, сравните Όοηηβ^ Л е! а1., 1997, Апии. Κβν. Iттиηο1. 15: 617-648 и Όοηηβ^ Л е! а1., 1997, Ьйе δοίепсек 60: 163-172. Обе эти работы включены здесь в качестве ссылок.

Живые вакцины

Третьей альтернативой для проведения представления модифицированного ОРСЬ иммунной системе является использование технологии живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами, представление иммунной системе выполняют введением животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный ОРСЬ, или вектором, содержащим такой фрагмент нуклеиновой кислоты, включенный в него. Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим ослабленным бактериальным штаммом (ослабленным посредством пассирования или посредством удаления патогенных продуктов экспрессии при помощи технологии рекомбинантных ДНК), например Му^а^ейит ϋονίκ ВСС., непатогенные 8ΐΐΌρΙοοοοοιικ крр., Е. οοΐί. Ба^сиеНа крр., νίόπο сМетае, 8Ыде11а, и т.д. Обзоры с описаниями приготовления известных в данной области живых вакцин могут быть найдены, например, в 8а1юи Р, 1995, Κον. Рга!. 45: 1492-1496 и \Уа1кег

- 14 006940

РЬ, 1992, Уассте 10: 977-990, обе статьи включены здесь в качестве ссылок. В отношении подробностей относительно фрагментов нуклеиновых кислот и векторов, используемых в таких живых вакцинах, см. обсуждение ниже.

В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения, обсуждаемый ниже, может быть включен в невирулентный вирусный вакцинный вектор, такой как штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус.

Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят только один раз животному, но в некоторых случаях может быть необходимым введение микроорганизма более чем один раз, на протяжении жизни для поддержания защитного иммунитета. Предполагается даже, что схемы иммунизации, такие как описанные выше для вакцинации полипептидами, будут применимы при использовании живых или вирусных вакцин.

Альтернативно, вакцинацию живыми или вирусными вакцинами комбинируют с предварительной или последующей вакцинацией полипептидом и/или нуклеиновой кислотой. Например, можно выполнить первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующими последовательными бустер-иммунизациями с использованием подхода с полипептидом или нуклеиновой кислотой.

Микроорганизм или вирус могут быть трансформированы нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами), содержащей участки, кодирующие 1-ую, 2-ую и/или 3-ю части молекулы, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсужденные в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта охватывает наличие кодирующего участка для аналога и кодирующего участка для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем разных промоторов. Таким образом можно избежать того, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнеров слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отдельных нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно, наличие 1-ой, и/или 2-ой, и/или 3-ей частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечить в качестве продукта экспрессии аналог данного изобретения, и такой вариант является особенно предпочтительным в соответствии с данным изобретением.

Применение способа данного изобретения в лечении заболевания

Как должно быть понятно из приведенных выше обсуждений, обеспечение способа данного изобретения позволяет контролировать заболевания, характеризующиеся избыточной потерей костной массы. В этом контексте, заболевание остеопороз является основной мишенью для способа изобретения, но разрежение кости, связанное со сложными переломами костей, также является возможной мишенью для лечения/ослабления. Таким образом, важный вариант способа данного изобретения для отрицательной регуляции активности ОРСЬ предусматривает лечение, и/или профилактику, и/или ослабление остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией кости, причем этот способ предусматривает отрицательную регуляцию активности ОРСЬ в соответствии со способом данного изобретения до такой степени, что скорость резорбции кости значимо уменьшается.

В данном контексте такое значимое уменьшение резорбции костей является по меньшей мере 3% в сравнении с патологической скоростью, но рассматриваются более высокие проценты, такие как по меньшей мере 5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 15% и по меньшей мере 17%, но ожидаются даже более высокие проценты, такие как по меньшей мере 20%, или даже по меньшей мере 30%. Особенно предпочтительным является то, что уменьшение резорбции костей приводит к инверсии баланса между костеобразованием и резорбцией кости, т. е. то, что скорость костеобразования начинает превышать скорость резорбции костей. Конечно, этот дисбаланс не должен сохраняться (так как это привело бы к остеопетрозу), но путем тщательного контроля числа и иммунологического эффекта иммунизаций индивидуума, нуждающегося в лечении, можно получить баланс на протяжении времени, который приводит к нетто-сохранению костной массы. Альтернативно, если в индивидууме способ данного изобретения не может прекратить рарефикацию костей, способ данного изобретения может (необязательно в комбинации с другими известными способами для снижения рарефикации костей у пациентов с остеопорозом) быть использован для получения значимого уменьшения рарефикации костей, продлевая тем самым время, в течение которого достаточная костная масса присутствует в этом индивидууме.

Способы измерения скорости резорбции костей и костеобразования известны в данной области. При помощи биохимических анализов можно оценивать скорость резорбции кости путем измерения концентрации в крови определенных фрагментов коллагена типа I (см. XVО 93/15107 и XVО 94/14844). Альтернативно, скорость разрежения костей может быть оценена физическими способами; характерные описания в данной области способов для оценки костной массы при помощи неинвазивных, физических способов могут быть найдены в АО 88/06862, АО 94/12855, АО 95/14431 и АО 97/00643.

Пептиды, полипептиды и композиции данного изобретения

Как понятно из вышеописанного, данное изобретение основывается на концепции иммунизации индивидуумов против антигена ОРСЬ для непосредственного получения уменьшенной активности остеокластов. Предпочтительным способом получения такой иммунизации является использование модифицированных версий ОРСЬ с обеспечением посредством этого молекул, которые не были ранее описа

- 15 006940 ны в данной области.

Авторы изобретения считают, что описанные здесь модифицированные молекулы ОРСЬ являются сами обладающими признаками изобретения, и, таким образом, важная часть данного изобретения относится к аналогу ОРСЬ, который произведен из ОРСЬ животного, в который введена модификация, результатом чего является то, что иммунизация животного этим аналогом индуцирует продуцирование антител, реагирующих специфически с немодифицированным полипептидом ОРСЬ. Предпочтительно, характер этой модификации согласуется с типами модификаций, описанными выше при обсуждении различных вариантов способа данного изобретения при использовании модифицированного ОРСЬ. Таким образом, любое представленное здесь описание, касающееся модифицированных молекул ОРСЬ, является важным для цели описания аналогов ОРСЬ данного изобретения, и любое из подобных описаний применимо тЩаДк ти1ап618 (с соответствующими изменениями) к описанию этих аналогов.

Следует отметить, что предпочтительные модифицированные молекулы ОРСЬ содержат модификации, обуславливающие полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70% с ОРСЬ или его субпоследовательностью с длиной по меньшей мере 10 аминокислот. Более высокие идентичности являются предпочтительными, например, по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%. Идентичность последовательности для белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как (Ы_ге£ - Ν_ά1£)·100/Ν_Γ6£, где Ν_Η|Γ обозначает общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при сопоставлении и где Ν_Γ(._£ обозначает число остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК АСТСАСТС будет иметь идентичность последовательности 75% с последовательностью ААТСААТС (Ν,|_£=2 и Ν_γ£=8).

Данное изобретение относится также к композициям, применимым в применении способа данного изобретения на практике. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество полипептида ОРСЬ, который является «своим» белком в животном, причем указанный полипептид ОРСЬ готовят вместе с иммунологически приемлемым адъювантом, чтобы разрушить аутотолерантность животного в отношении полипептида ОРСЬ, причем эта композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или наполнитель, и/или носитель, и/или эксипиент. Другими словами, эта часть данного изобретения относится к композициям природно встречающихся полипептидов ОРСЬ, которые были описаны в связи с вариантами способа данного изобретения.

Данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество определенного выше аналога ОРСЬ, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или наполнитель, и/или носитель, и/или эксипиент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть изобретения относится к композициям модифицированного ОРСЬ, по существу, описанного выше. Выбор адъютантов, носителей и наполнителей соответствует тому, что обсуждалось выше при описании приготовления модифицированного и немодифицированного ОРСЬ для применения в обладающем признаком изобретения способе отрицательной регуляции ОРСЬ.

Эти полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК, включающей введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог ОРСЬ, в подходящий вектор, трансформацию подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессию этой последовательности нуклеиновой кислоты, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующую очистку и необязательную дополнительную модификацию, например, повторную укладку или дериватизацию.

Более короткие пептиды предпочтительно получают при помощи хорошо известных способов синтеза пептидов в твердой или жидкой фазе. Однако недавний прогресс в этой технологии сделал возможным получение полноразмерных полипептидов и белков при помощи этих способов, и, таким образом, в сфере действия данного изобретения находится также получение длинных конструкций при помощи синтетических способов.

Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы данного изобретения

Из приведенного выше описания должно быть понятно, что модифицированные полипептиды ОРСЬ могут быть получены при помощи технологии рекомбинантных генов, но также при помощи химического синтеза или неполного химического синтеза; две последние возможности являются особенно предпочтительными, когда модификация состоит в связывании с белковыми носителями (такими как КЬН, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и БСА) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры и, конечно, также в случае, когда модификация предусматривает присоединение боковых цепей или боковых групп к полученной из полипептида ОРСЬ пептидной цепи.

Для цели технологии рекомбинантных генов и, конечно, также для цели иммунизации нуклеиновыми кислотами, фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный ОРСЬ, являются важными химическими продуктами. Таким образом, важная часть изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует аналог ОРСЬ, т.е. произведенный из ОРСЬ полипептид, который либо содержит природную последовательность ОРСЬ, к которой присоединен или в которую встроен

- 16 006940 партнер слияния, либо произведенный из ОРСЬ полипептид, в который был введен чужеродный Тклеточный эпитоп посредством инсерции и/или присоединения, предпочтительно посредством замены и/или делеции. Фрагменты нуклеиновых кислот данного изобретения являются либо ДНК-, либо РНКфрагментами.

Фрагменты нуклеиновых кислот данного изобретения обычно встраивают в подходящие векторы для образования клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот данного изобретения; такие новые векторы также являются частью данного изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов данного изобретения, будут обсуждаться в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Эти векторы могут, в зависимости от цели и типа применения, быть в форме плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но также важным вектором является голая ДНК, которая экспрессируется лишь временно (транзисторно) в определенных клетках. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы данного изобретения способны к автономной репликации, таким образом делая возможными высокие числа копий для целей экспрессии высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования.

Вектор данного изобретения в общих чертах содержит следующие признаки в направлении 5'^3' и в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты данного изобретения, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию (во внеклеточную фазу или, если возможно, в периплазму) или интеграцию в мембрану полипептидного фрагмента, фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях-продуцентах, для целей генетической стабильности трансформированных клеток предпочтительно, чтобы вектор при введении в клеткухозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами, используемыми для выполнения экспрессии ίη νίνο в животном (т.е. при использовании этого вектора для ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы этот вектор не был способен интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых хорошо известен лицам с обычной квалификацией в данной области.

Векторы данного изобретения применимы для трансформации клеток-хозяев с целью получения модифицированного полипептида ОРСЬ данного изобретения. Такие трансформированные клетки, которые также являются частью данного изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов данного изобретения или используемыми для рекомбинантного получения модифицированных полипептидов ОРСЬ данного изобретения. Альтернативно, трансформированные клетки могут быть пригодными штаммами живых вакцин, в которые был встроен фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная копия или множественные копии) таким образом, чтобы выполнять секрецию или интегрирование в бактериальную мембрану или клеточную стенку модифицированного ОРСЬ.

Предпочтительные трансформированные клетки данного изобретения являются микроорганизмами, такими как бактерии (такие как виды ЕксЬепсЫа [например, Е. со11], ВасШик [например, ВасШик киЬбНк], 8а1топе11а или МусоЬас!епит [предпочтительно непатогенная, например, М. ЬоуЬ ВСС]), дрожжи (такие как 8ассЬатотусек се^еν^к^ае), и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, такие как клетка гриба, клетка насекомого, растительная клетка или клетка млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные из человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты были многообещающими в отношении применения коммерчески доступной клеточной линии ЭгокоркЛа те1аподак1ег (клеточной линии 8сЬпе1бег 2 (8₂) и векторной системы, доступных из Шубгодеп) для рекомбинантного получения полипептидов в лаборатории заявителей, и, следовательно, эта экспрессионная система является особенно предпочтительной.

Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения. Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительными применимыми вариантами данного изобретения; они могут быть также использованы для лабораторного (небольшого масштаба) или крупномасштабного получения модифицированного ОРСЬ или, в случае непатогенных бактерий, получения его в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине.

При получении модифицированного ОРСЬ данного изобретения с использованием трансформированных клеток, удобным, хотя далеко не необходимым, является то, что продукт экспрессии либо транспортируется из клеток в культуральную среду, либо переносится на поверхность трансформированной клетки.

После идентификации эффективной клетки-продуцента, предпочтительным является установление на ее основе стабильной клеточной линии, которая несет вектор данного изобретения и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный ОРСЬ. Предпочтительно, эта стабильная клеточная линия секретирует или несет аналог ОРСЬ данного изобретения, облегчая тем самым его очистку.

- 17 006940

Обычно используют плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, произведенные из видов, совместимых с этой клеткой-хозяином, вместе с этими хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, Е. сок обычно трансформируют с использованием рВВ322, плазмиды, полученной из видов Е. сок (см., например, Во1Еаг е1 а1., 1977). Плазмида рВК.322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает легкое средство для идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВВ, или другая микробная плазмида или фаг, должны также содержать, или быть модифицированы, чтобы содержать, промоторы, которые могут быть использованы прокариотическим микроорганизмом для экспрессии.

Эти промоторы, наиболее часто используемые в рекомбинантной конструкции ДНК, включают в себя промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Скапд е1 а1., 1978; Иакига е1 а1., 1977; Соеббе1 ек а1., 1979), и промоторную систему триптофана (кгр) (Соеббе1 ек а1., 1979; ЕР-А-0 036 776). Хотя эти промоторы являются наиболее обычно используемыми, были обнаружены и использованы другие микробные промоторы, и детали в отношении их нуклеотидных последовательностей были опубликованы, что позволяет работнику с квалификацией в данной области лигировать их функционально с плазмидными векторами (81еЬтеепккк ек а1., 1980). Некоторые гены из прокариот могут быть экспрессированы эффективно в Е. сок от их собственных промоторных последовательностей, что позволяет устранить необходимость присоединения другого промотора синтетическим способом.

Кроме прокариот, могут быть также использованы эукариотические микробы, такие как дрожжевые культуры, и в этом случае промотор должен быть способен запускать экспрессию. 8асскатотусек сеге\'151ае. или обычные хлебопекарные дрожжи, являются наиболее обычно применяемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя ряд других штаммов являются обычно доступными. Для экспрессии в 8асскатотусек обычно используют, например, плазмиду УКр7 (8кпсксотЬ ек а1., 1979; Ктдктап ек а1., 1979; Ткскетрег ек а1., 1980). Эта плазмида уже содержит ген кгр1, который обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, неспособного расти в триптофане, например, АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опек, 1977). Присутствие кгр1-повреждения в качестве характеристики генома этой дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает затем эффективную среду для детектирования трансформации по росту в отсутствие триптофана.

Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают промоторы для 3фосфоглицераткиназы (Нкхтап ек а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Некк ек а1., 1968; Но11апб ек а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид, последовательности терминации, связанные с этими генами, также лигируют в экспрессионный вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать, для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.

Другие промоторы, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями выращивания, представляют собой промоторный участок алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, связанных с азотным метаболизмом, и вышеупомянутой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, начало репликации и последовательности терминации, является пригодным.

Кроме микроорганизмов в качестве хозяев могут быть также использованы культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов. В принципе, любая такая клеточная культура является пригодной, независимо от того, является ли она культурой клеток позвоночных или клеток беспозвоночных животных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных животных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой в последние годы (Т1ккие Си1киге, 1973). Примерами таких применимых хозяйских клеточных линий являются клетки Уего и клетки НеЬа, линии клеток яичника Китайского хомячка (СНО) и клетки ^138, ВНК, СО8-7 293, 8роборкета Ггищрегба (8Е) (коммерчески доступные в виде полных экспрессионных систем из, шкет ака, Ртокеш 8с1епсек, 1000 Векеагск Ратк^ау, Мекбеп, СТ 06450, И.8.А. и из 1№1ктодеп), и клеточные линии МОСК. В данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является 8₂, доступная из 1пу1ктодеп, РО Вох 2312, 9704 СН Стошпдеп, Тке №ккет1апбк.

Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают (если необходимо) начало репликации, промотор, локализованный впереди экспрессируемого гена, вместе с любыми необходимыми сайтами связывания рибосом, сайтами сплайсинга РНК, сайтами полиаденилирования и последовательностями терминации транскрипции.

Для использования в клетках млекопитающих, регуляторные функции на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы часто получают из вируса полиомы, аденовируса 2, и наиболее часто обезьяньего вируса 40 (8У40). Ранний и поздний промоторы вируса 8У40 являются особенного применимыми, так как оба эти промотора легко получают из вируса в виде фрагмента, который также содержит начало репликации вируса 8У40 (Иетк ек

- 18 006940 а1., 1978). Могут быть также использованы меньшие или большие фрагменты 8У40 при условии, что включена последовательность приблизительно 250 п.н., простирающаяся от ΗίηάΙΙΙ-сайта в направлении ВдИ-сайта, локализованного в начале репликации вируса. Кроме того, также возможно и часто желательно использование промотора или регуляторных последовательностей, обычно связанных с целевой генной последовательностью, при условии, что такие регуляторные последовательности совместимы с системами клетки-хозяина.

Начало репликации может быть обеспечено либо конструированием вектора таким образом, что он включает в себя экзогенный участок начала репликации, такой, который может быть получен из 8У40 или другого вируса (например, вируса полиомы, аденовируса, У8У, ВРУ), или он может быть обеспечен механизмом репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клетки-хозяина, последний механизм является часто достаточным.

Идентификация применимых аналогов ОРСЬ

Специалисту в данной области должно быть понятно, что не все возможные варианты или модификации нативного ОРОЬ будут обладать способностью индуцировать антитела в животном, которые являются перекрестно-реактивными с нативной формой. Однако нетрудно создать эффективный стандартный скрининг на модифицированные молекулы ОРОЬ, которые удовлетворяют минимуму требований для обсуждаемой здесь иммунологической реактивности. Таким образом, другая часть данного изобретения относится к способу идентификации модифицированного полипептида ОРОЬ, который способен индуцировать антитела против немодифицированного ОРОЬ в видах животных, в которых немодифицированный полипептид ОРОЬ является (неиммуногенным) «своим» (ауто) белком, причем этот способ предусматривает получение, посредством синтеза пептидов или способами генетической инженерии, набора взаимоотличающихся модифицированных полипептидов ОРОЬ, в которых аминокислоты были добавлены, вставлены, делетированы или заменены в аминокислотной последовательности полипептида ОРОЬ вида животного, с образованием таким образом аминокислотных последовательностей в этом наборе, которые содержат Т-клеточные эпитопы, которые являются чужеродными для данного вида животного, или получение набора фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих набор взаимоотличающихся модифицированных полипептидов ОРОЬ, испытание членов этого набора модифицированных полипептидов ОРОЬ или фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать продуцирование антител этим видом животного против немодифицированного ОРОЬ, и идентификацию и необязательно выделение члена (членов) этого набора модифицированных полипептидов ОРОЬ, который значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного ОРОЬ в этом виде, или идентификацию и необязательно выделение полипептидного продукта экспрессии, кодируемого членами набора фрагментов нуклеиновых кислот, который значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного ОРОЬ в этом виде животного.

В этом контексте, набор взаимоотличающихся модифицированных полипептидов ОРОЬ представляет собой коллекцию неидентичных модифицированных полипептидов ОРОЬ, которые, например, были отобраны на основе обсужденных выше критериев (например, в сочетании с исследованиями кругового дихроизма, ЯМР-спектров и/или рентгенограмм). Этот набор может состоять всего лишь из нескольких членов, но предполагается, что этот набор может содержать несколько сотен членов.

Испытание членов этого набора может в конечном счете проводиться ίη νΐνο, но может быть использован ряд испытаний ίη νίίτο для сужения числа модифицированных молекул, которые будут служить цели данного изобретения.

Поскольку задача введения чужеродных Т-клеточных эпитопов заключается в поддержании Вклеточного ответа с помощью Т-клеток, предварительным необходимым условием является индуцирование пролиферации Т-клеток модифицированным ОРОЬ. Пролиферация Т-клеток может тестироваться при помощи стандартизованных анализов пролиферации ίη νίίτο. Вкратце, из субъекта получают пробу, обогащенную Т-клетками, и затем выдерживают в культуре. Культивируемые Т-клетки приводят в контакт с АПК этого субъекта, которые предварительно поглощали модифицированную молекулу и процессировали ее для представления ее Т-клеточных эпитопов. Пролиферацию Т-клеток подвергают мониторингу и сравнивают с подходящим контролем (например, с Т-клетками в культуре, контактированными с АПК, которые процессировали интактный, нативный ОРОЬ). Альтернативно, пролиферация может быть измерена путем определения концентрации соответствующих цитокинов, высвобождаемых этими Тклетками в ответ на их узнавание чужеродных Т-клеток.

Получив результат о высокой вероятности того, что по меньшей мере один модифицированный ОРОЬ набора любого типа способен индуцировать продуцирование антител против ОРОЬ, можно получить иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один модифицированный полипептид ОРОЬ, который способен индуцировать антитела против немодифицированного ОРОЬ в виде животного, в котором этот немодифицированный ОРОЬ является своим (ауто)белком, причем этот способ предусматривает смешивание члена (членов) набора, который значимо индуцирует продуцирование антител в этом виде животного, которые являются реактивными с ОРОЬ, с фармацевтически и иммунологически

- 19 006940 приемлемым носителем, и/или наполнителем, и/или разбавителем, и/или эксипиентом необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.

Приведенные выше аспекты данного изобретения, относящиеся к испытанию наборов полипептидов, удобно проводить путем первоначального получения ряда взаимоотличающихся последовательностей нуклеиновых кислот или векторов данного изобретения, встраивания их в подходящие экспрессирующие векторы, трансформации подходящих клеток-хозяев этими векторами и экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения. Эти стадии могут сопровождаться выделением продуктов экспрессии. Предпочтительным является получение этих последовательностей нуклеиновых кислот и/или векторов при помощи способов, предусматривающих использование способа молекулярной амплификации, такого как ПЦР, или посредством синтеза нуклеиновых кислот.

Другая часть данного изобретения относится к способу лечения, профилактики или ослабления заболеваний, характеризующихся избыточной резорбцией костей в животном, в том числе человеке, причем этот способ предусматривает введение этому животному эффективного количества по меньшей мере одного вещества, отличающегося от остеопротегерина, которое блокирует стимулирующее действие ОРСЬ на активность остеокластов. Авторы изобретения считают, что в настоящее время такой подход никогда не предполагался в данной области.

Предпочтительный вариант этой части данного изобретения включает применение ОРСЬспецифического антитела (поликлонального или моноклонального) или его специфически связывающего варианта в качестве вещества, блокирующего стимулирующее действие ОРСЬ. Предпочтительно, чтобы это антитело было молекулой ЦС или ЦМ. или чтобы специфически связывающий вариант был произведен из ЦС или ЦМ. Удобно, чтобы специфически связывающий вариант этого антитела был ЕаЬфрагментом, Е(аЬ')-фрагментом, гуманизированным моноклональным антителом или его фрагментом или ди- или мультимерным фрагментом антитела, таким как диатело (биспецифическая и димерная синтетическая, произведенная из антитела молекула, производимая СашЬпбде АпШЬобу Тес1по1оду).

Пример

Было решено клонировать или синтезировать кДНК, кодирующие мышиный и человеческий ОРСЬ, в укороченной версии, содержащей аминокислотные остатки 158-316 в случае мышей и остатки 159-317 в случае человека (номера соответствуют нумерации в последовательностях 8ЕЦ Ш ΝΌ:2 и 4 соответственно). Поскольку эти укороченные версии проявляют биологическую активность, логичным является направление аутоантител против этой части ОРСЬ. Кроме того, этот подход уменьшает белки и, следовательно, ими становится легче манипулировать.

Синтетическая кДНК, кодирующая остатки 158-316 мышиного ОРСЬ, была синтезирована путем удаления субоптимальных кодонов ЕксйейсЫа сой и РюЫа раЦогк из опубликованной последовательности. Кроме того, Ν-концевой гистидиновый маркер (тэг), часть сайта расщепления сигнальной последовательности альфа-фактора пола из Зассйагошусек сегеуШае и сайты подходящих рестрикционных ферментов были включены в открытую рамку считывания (см. 8ЕЦ Ш NО:7).

Эту кДНК, кодирующую мышиный ОРСЬ дикого типа, клонировали в стандартный экспрессирующий вектор ЕксйейсЫа сой (рТгс99а) с использованием рестрикционных ферментов В^ и НтбШ и стандартный клонирующий вектор (рВШексйр! КБ+) с использованием рестрикционных ферментов БаН и Крй (с получением БЕЦ Ю NО:9).

Экспрессия в клетках ЕксйейсЫа сой приводила к приблизительно 30% рекомбинантного ОРСЬ от общего белка ЕксйейсЫа сой. Этот белок повторно укладывали и очищали с использованием следующей процедуры.

1. Клетки собирают центрифугированием.

2. Клетки ресуспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) и повторно центрифугируют.

3. Супернатант выбрасывают и клетки ресуспендируют в трех объемах (100 мМ Трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорид, 5 мМ дитиотреитол (ДТТ), 0,5 М №С1, рН 8,0).

4. К клеткам добавляют 8 мкл 50 мМ ПМСФ и 80 мкл лизоцима (10 мг/мл) на грамм клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.

5. На каждый грамм осадка клеток добавляют 4 мг дезоксихлорной кислоты и эту суспензию инкубируют при 37°С, пока она не становится вязкой.

6. Добавляют 20 мкл ДНКазы (1 мг/мл) на грамм веса клеток и МдС1₂ до 5 мМ и суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

7. Суспензию обрабатывают ультразвуком на льду до исчезновения вязкости.

8. После центрифугирования (20000 х д в течение 30 мин) осадок ресуспендируют в Н₂О, повторно центрифугируют и ресуспендируют в 3 мл 1 М мочевины на грамм веса клеток.

9. После центрифугирования (20000 х д в течение 30 мин) осадок ресуспендируют в 1 М гуанидингидрохлориде, 100 мМ Трис [гидроксиметил] аминометангидрохлориде, рН 7,5.

10. После центрифугирования (20000 х д в течение 30 мин) осадок ресуспендируют в 6 М гуанидингидрохлориде, 20 мМ 100 мМ Трис[гидроксиметил]аминометангидрохлориде, 5% этаноле, 1% бетамеркаптоэтаноле, рН 8,0, и перемешивают при 4°С в течение ночи.

- 20 006940

11. После центрифугирования (40000 х д в течение 1-4 ч) супернатант фильтруют и хранят при 20°С.

12. Солюбилизированные тела включения отделяют гель-фильтрационной хроматографией с использованием материала 8ирегбех 200 (Рйагтас1а).

13. Фракции, содержащие рекомбинантный ОРОЬ, объединяют и разбавляют до 1 мг/мл 1,5 М гуанидингидрохлоридом, 20 мМ трис [гидроксиметил] аминометангидрохлоридом, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.

14. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 1,5 М гуанидингидрохлорида, 20 мМ трис [гидроксиметил] аминометангидрохлорида, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.

15. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 1,0 М гуанидингидрохлорида, 20 мМ трис [гидроксиметил] аминометангидрохлорида, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.

16. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 0,5 М гуанидингидрохлорида, 20 мМ трис [гидроксиметил] аминометангидрохлорида, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.

17. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 20 мМ трис [гидроксиметил] аминометангидрохлорида, 150 мМ аргинина, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.

18. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 20 мМ трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорида, 150 мМ аргинина, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.

19. Повторно уложенный материал лиофилизируют и хранят при -20°С.

Эффективность повторной укладки с использованием этой процедуры равна приблизительно 40%, а чистота превышает 65%. Эта процедура очистки и повторной укладки все еще является предметом дальнейшего усовершенствования. Исследуется повторная укладка при иммобилизации и ферментативное удаление гистидинового маркера (тэга) будет проводиться, по существу, как описано Ребегкеп е1 а1., 1999. Природа этого рекомбинантного белка была охарактеризована и подтверждена с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ, Ν-концевого секвенирования, аминокислотного анализа и масс-спектрометрии.

Проводится конструирование мутанта с заменой цистеина мышиного ОРОЬ дикого типа (в котором цистеин, соответствующий аминокислотному остатку в 8ЕЦ ГО NО:4 заменен серином; ср. 8ЕЦ 10 NО:11 и 8ЕЦ ГО NО:12). Это сделано для исключения потенциальных проблем стабильности в случае очищенного рекомбинантного белка. Этот мутированный укороченный ОРОЬ будет служить основой для вакцинных конструкций в полной аналогии с приведенным ниже описанием, которое дается для ДНК, имеющей последовательность 8ЕЦ ГО NО:9. Далее, соответствующий Сук^8ег-мутант (где Сук221 является замененным) человеческого ОРОЬ будет также получен для тех же самых целей.

Вакцинные молекулы конструируют сначала сравниванием или заменой введением либо эпитопа Р2, либо эпитопа Р30 из столбнячного токсоида в выбранных положениях. Другие подходящие иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы могут быть использованы в более поздней стадии.

Выбранные положения для введения изменения выбирают на основе знания существующих или предсказанных В-клеточных эпитопов и предсказанных элементов вторичной структуры нативной молекулы, а также с использованием сопоставлений с существующими трехмерными структурами ΤΝΡα (1а8т.рбЬ) и лиганда СЭ40 (1а1у.рбЬ) для моделирования вторичной и третичной структуры внеклеточной части ОРОЬ. Введение в мышиную молекулу будет иметь место в зонах, соответствующих аминокислотным остаткам 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 и 285-316 (см. нумерацию аминокислот в 8ЕЦ ГО NО:4), тогда как введение в молекуле человека будет иметь место в зонах, соответствующих аминокислотным остаткам 171-193, 199-219, 222-247, 257-262 и 286-317.

В настоящее время четыре варианта мышиного ОРОЬ были сконструированы и экспрессированы рекомбинантно в Екс11епс1иа сой. ДНК, кодирующая тОРОЬ[158-316] Р30[256-261], с Ν-концевым гистидиновым маркером (тэгом) (8ЕЦ ГО NО:13): ПЦР 8ЕЦ ГО NО:9 проводили с использованием 8ЕЦ ГО NО:22 и 25 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами 8асП и Крп1 и затем очищали из агарозного геля. Вторую ПЦР с использованием 8ЕЦ ГО NО:9 в качестве матрицы проводили с использованием праймера 8ЕЦ ГО NО:26 и вектор-специфического праймера. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами Крп1 и НшбШ. Затем оба фрагмента лигировали с 8ЕЦ ГО NО:9 в рВ1иекспр1 К8+, расщепленной 8асП и НшбШ. Для коррекции мутации одного основания в этой конструкции проводили ПЦР с использованием этой конструкции в качестве матрицы с праймерами 8ЕЦ ГО NО:33 и 29. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами Рк(! + ЕсоШ. очищали в геле и затем лигировали с ошибочной конструкцией, расщепленной РкП и ЕсоШ. Затем подтвержденную конструкцию (8ЕЦ ГО NО:13) переносили в рТгс99а с использованием рестриктаз ВкрН1 и НшбШ.

ДНК, кодирующая тОРОЬ[158-316]_Р2[256-261], с Ν-концевым гистидиновым маркером (тэгом) (8ЕЦ ГО NО:15): ПЦР проводили с использованием праймеров 8ЕЦ ГО NО:27 и 28 без матрицы. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами РкП и ЕсоШ и затем очищали из агарозного геля. Затем полученный фрагмент лигировали с 8ЕЦ ГО NО:9 в рВ1иексг1р( К8+, расщепленной 8асП и НшбШ. Затем подтвержденную конструкцию (8ЕЦ ГО NО: 15) переносили в рТгс99а с использованием рестриктаз ВкрН1 и НшбШ.

ДНК, кодирующая тОРОЬ[158-316]_Р2[288-302], с Ν-концевым гистидиновым маркером (тэгом) (8ЕЦ ГО NО:17): ПЦР 8ЕЦ ГО NО:9 проводили с использованием праймеров 8ЕЦ ГО NО:22 и 29. Полу- 21 006940 ченный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами РкН и ВкЕШ и затем очищали из агарозного геля. Вторую ПЦР с использованием 8Е0 ГО ΝΘ:9 в качестве матрицы проводили с использованием праймера 8ЕС ГО ΝΘ:30 и вектор-специфического праймера. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами ΒδίΒΙ и ΚρηΙ и затем очищали в геле. Затем оба фрагмента лигировали с 8ЕО ГО NΘ:9 в рВ1не5СГ1р1 Κ8+, расщепленной РкН и ΚρηΙ. Затем подтвержденную конструкцию (8ЕО ГО NΘ: 17) переносили в рТгс99а с использованием рестриктаз ΒκρΗΙ и ΗίηάΙΙΙ.

ДНК, кодирующая тОРСБ[158-316]_Р30[221-241], с Ν-концевым гис-тидиновым маркером (тэгом) (8ЕО ГО NΘ:19): ПЦР 8ЕО ГО NΘ:9 проводили с использованием праймеров 8ЕС ГО NΘ:22 и 23. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами 8ас11 и ΚρηΙ и затем очищали из агарозного геля. Вторую ПЦР с использованием 8ЕС ГО NΘ:9 в качестве матрицы проводили с использованием праймеров 8ЕО ГО NΘ:24 и 31. ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами ΚρηΙ и ЕсоВ1 и затем очищали в геле. Затем оба фрагмента лигировали с 8ЕО ГО NΘ:9 в ρβ1ικ^πρΙ Κ8+, расщепленной 8ас11 и ЕсоШ. Затем подтвержденную конструкцию (8ЕО ГО NΘ: 19) переносили в рТгс99а с использованием рестриктаз ΒκρΗΙ и ΗίηάΙΙΙ.

Экспрессия этих укороченных вариантов ОРСБ имела место в Е. сой, давая более 20% общего белка для всех вариантов. Будет проводиться дальнейшее развитие вышеописанной процедуры очистки и повторной укладки белка дикого типа (8ЕО ГО NΘ: 9). Эта процедура будет служить основой для разработки оптимальных процедур для каждого из этих вариантов. Повторная укладка с иммобилизацией этих вариантных белков с использованием гистидинового маркера (тэга) представляет собой другой подход, который продолжает разрабатываться.

Альтернативно, эти варианты могут быть непосредственно перенесены в экспрессирующие векторы Р1сЫа ρ;·ΐ5ΐοπ5 с использованием рестриктаз или другие дрожжевые экспрессионные системы с использованием ПЦР, если желательно гликозилирование. Следует отметить, что гликозилирование не является необходимым для биологической активности ίη νίνο ОРСБ. Можно также экспрессировать укороченный ОРСБ в фибробластах 293 человека, как сообщалось в Басеу е! а1. Экспрессия в клетках насекомых будет также принята во внимание (например, клеточная линия 8с1те1Йег 2 (8₂) и векторная система или клетка 8ροάορ!е^а ί^ид^ρе^άа (8Р) и векторные системы, обе доступные из Ιηνίίτο^η).

Эти очищенные варианты будут использованы для получения антител в кроликах для последующего применения в качестве инструментов детектирования, так как не существуют коммерчески доступные антитела. Кроме того, этот материал будет очень ценным инструментом в биологических анализах, необходимых для оценки аутовакцинных кандидатов. Получение этих антител будет проводиться с использованием стандартных способов, известных в данной области.

Отбор наилучших аутовакцинных кандидатов основан на оценке ингибиторной активности в анализах на созревание/активацию остеокластов ίη νίίτο или в анализе на остеопороз ίη νίνο на модели животного. Применимые анализы и модельные системы описаны в литературе (например, в Басеу е! а1., Ри11ег е! а1., и δΜοηά е! а1.).

Активность рекомбинантных белков будет анализироваться внутривенной инъекцией 100 мкл в неанестезированных самцов мышей Ва1Ь/С (0, 0,1 и 1,0 мг белка на кг веса мыши) и извлечением спустя один час 125 мкл крови из большой глазной вены с использованием капиллярных трубочек, покрытых насыщенным кальцием гепарином. Уровни кальция измеряют при помощи Ιί'Ά2 (Кабюте!ег, Оешпагк). Очищенный и повторно уложенный рекомбинантный мышиный ОРСБ (8БС ГО NΘ:9) является реактивным в этом анализе, увеличивая уровни ионизированного кальция в кровотоке до 10%.

Аутовакцинные кандидаты будут, например, оцениваться с использованием аутовакцинации и последующего мониторинга ингибирования ими высвобождения ионизированного кальция в периферическую кровь при инъекции рекомбинантного тОРСБ в мышей (как описано Вигдекк е! а1.).

Следует отметить, что в качестве альтернативы модифицированному ОРСБ, антиидиотипические антитела, направленные против идиотипа антитела против ОРСБ, будут также служить в качестве применимых иммуногенов в объеме данного изобретения. Подобным образом, применение мимотипических полипептидов, которые могут быть выделены, например, в системе фагового представления с использованием анти-ОРСБ или остеопротегерина в качестве улавливающего зонда, также рассматривается как часть иммуногенов данного изобретения.

Список ссылок

1. Висау, Ν. е! а1. (1998), Сенек 1)е\. 12, 1260-1268.

2. Басеу, Ό. Б. е! а1. (1998), Се11 93, 165-176.

3. Магкк, 8. С, 1г. (1989), Ат. 1. Меб. Сене!. 34, 43-53.

4. 8™οηά, Ш. 8. е! а1. (1997), Се11 89, 309-319.

5. Ри11ег, Κ. е! а1. (1998), 1. Еxρ. Меб. 188, 997-1001.

6. Вигдекк, Т. Б. е! а1. (1999), 1. Се11 Вю1. 145, 527-538.

7. Ребегкем 1 е! а1. (1999) Рго!ет ΞχρΓ. РилБ. 15, 389-400.

- 22 006940

Список последовательностей <110> М&Е В1оСесЬ А/3

ΗΑΙΚΙΕΗ, ТогЬеп

ΗΑΑΝΙΝ6, йезрег <120> Способ отрицательной регуляции активности лиганда остеопротегерина <130> 22021 РС 1 <140> ⁴ <141>

<160> 35 · <170> РаСепС1п Уег. 2.1 <210> 1 <211> 2271 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>

<221> С05 <222> (185)..(1138) <400> 1 аадсССддСа ссдадсСсдд аСссасСасС сдасссасдс дСссдсдсдс сссаддадсс 60 ааадссдддс СссаадСсдд сдссссасдС сдаддсСссд ссдсадссСс сддадССддс 120 сдсадасаад ааддддаддд адсдддадад ддаддададс Сссдаадсда дадддссдад 180 сдсс аСд сдс сдс дсс аде ада дас Сас асе аад Сас сСд сдС ддс Сед 229 МеС Ахд Ахд А1а Зег Агд Азр Туг ТЬг Ьуз Туг 1»еи Агд 61 у Зег 15 10 15

дад дад аСд ддс ддс

ддс ссс дда дсс ссд сас дад ддс ссс сСд сас

277

61и

61и МеС

61у 61у 20

61у

Рго

61у

А1а Рго Нхз 61и 61у Рго Ьеи Нхз

25

30

дсс

ссд

ссд

ссд

ссС

дед

ссд

сас

сад

ссс

ссс

дсс

дсс

Ссс

сдс

Ссс

325

А1а

Рго

Рго

Рго

Рго

А1а

Рго

Нхз

61п

Рго

Рго

А1а

А1а

Зег

Агд

Зег

35

40

45

аСд

ССС

дЪд

дсс

сСс

сСд

ддд

сСд

ддд

сСд

ддс

сад

дСС

дСс

Сдс

аде

373

МеС

РИе

Уа1

А1а

Ьеи

Ьеи

61 у

Ьеи

61 у

Ьеи

61у

61 η

Уа1

Уа1

Суз

Зег

50

55

60

- 23 006940

дЕс дсс сЕд ЕЕс ЕЕс

ЕаЕ Туг

ЕЕс ада дед сад аЕд даЕ ссЕ ааЕ ада аЕа

421

Уа1

А1а 65

Ьеи

РЬе РЬе

РЬе 70

Агд

А1а

61п

МеЕ Азр 75

Рго

Азп Агд

Не

Еса

даа

даЕ

ддс

асЕ

сас

Еде

аЕЕ

ЕаЕ

ада

аЕЕ

ЕЕд

ада

сЕс

саЕ

даа

469

Зег

61и

Азр

61 у

ТЬг

НЬз

Су5

Не

Туг

Агд

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

Нхз

61и

80

85

90

95

ааЕ

дса

даЕ

ЕЕЕ

саа

дас

аса

асЕ

сЕд

дад

адЕ

саа

даЕ

аса

ааа

ЕЕа

517

Азп

А1а

Азр

РЬе

61п

Азр

ТЬг

ТЬг

Ьеи

61и

Зег

61п

Азр

ТЬг

Ьуз

Ьеи

100

105

но

аЕа

ссЕ

даЕ

Еса

ЕдЕ

адд

ада

аЕЕ

ааа

сад

дсс

ЕЕЕ

саа

дда

дсЕ

дЕд

565

Не

Рго

Азр

Зег

Суз

Агд Агд

Не

Ьуз

61п

А1а

РЬе

61п

61у

А1а

Уа1

115

120

125

саа

аад

даа

ЕЕа

саа

саЕ

аЕс

дЕЕ

дда

Еса

сад

сас

аЕс

ада

дса

дад

613

61п

Ьуз

61и

Ьеи

61п

Нхз

Не

Уа1

61у

Зег

61п

ΗΪ5

11е

Агд

А1а

61и

130

135

140

ааа

дед

аЕд

дЕд

даЕ

ддс

Еса

Едд

ЕЕа

даЕ

сЕд

дсс

аад

адд

аде

аад

661

Ьуз

А1а

МеЕ

Уа1

Азр

61у

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Ьеи

А1а

Ьуз

Агд

Зег

Ьуз

145

150

155

сЕЕ

даа

дсЕ

сад

ссЕ

ЕЕЕ

дсЕ

саЕ

сЕс

асЕ

аЕЕ

ааЕ

дсс

асе

дас

аЕс

709

Ьеи

61и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬг

Не

Азп

А1а

ТЫ

Азр

Не

160

165

170

175

сса

ЕсЕ

ддЕ

Есс

саЕ

ааа

дЕд

адЕ

сЕд

Есс

ЕсЕ

Едд

Еас

саЕ

даЕ

едд

757

Рго

Зег

61у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Ηί3

Азр

Агд

180

185

190

ддЕ

Едд

дсс

аад

аЕс

Есс

аас

аЕд

асЕ

ЕЕЕ

аде

ааЕ

дда

ааа

сЕа

аЕа

805

61у

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

МеЕ

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

11е

195

200

205

дЕЕ

ааЕ

сад

даЕ

ддс

ЕЕЕ

ЕаЕ

Еас

сЕд

ЕаЕ

дсс

аас

аЕЕ

Еде

ЕЕЕ

еда

853

Уа1

Азп

61п

Азр

61 у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

210

215

220

саЕ

саЕ

даа

асЕ

Еса

дда

дас

сЕа

дсЕ

аса

дад

ЕаЕ

сЕЕ

саа

сЕа

аЕд

901

Н1з

Н1з

61и

ТЬг

Зег

61 у Азр

Ьеи

А1а

ТЬг

61и

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеЕ

225

230

235

дЕд

Еас

дЕс

асЕ

ааа

асе

аде

аЕс

ааа

аЕс

сса

адЕ

ЕсЕ

саЕ

асе

сЕд

949

Уа1

Туг

Уа1

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Зег

Не

Ьуз

Не

Рго

Зег

Зег

НЬз

ТЬг

Ьеи

240

245

250

255

аЕд

ааа

дда

дда

аде

асе

аад

ЕаЕ

Едд

Еса

ддд

ааЕ

ЕсЕ

даа

ЕЕс

саЕ

997

МеЕ

Ьуз

61у

61 у

Зег

ТЬг

Ьуз

Туг

Тгр

Зег

61 у

Азп

Зег

61и

РЬе

НЬз

260

265

270

- 24 006940

БББ БаБ Бсс аБа аас

дРР Уа1

ддБ дда БББ БББ аад ББа едд БсБ дда дад

1045

РЬе Туг Зег

11е 275

Аз и

61у

61 у

РЬе РНе 280

Ьуз Ьеи

Агд

Зег 61у 61и 285

даа

аБс

аде

аРс

дад

дБ с

Рсс

аас

ссс

Рсс

ББа

сРд

дар

ссд

даР

сад

1093

61 и

Не

Зег

11е

61и

Уа1

Зег

Аз η

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

290

295

300

даБ

дса

аса

Рас

РРР

ддд

дсР

РРР

ааа

дРР

еда

даР

аБа

даБ

Рда

1138

Азр

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

С1у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

Ахд Азр

11е

Азр

305

310

315

дссссадРБР	РРддадБдБР	аБдБаБББсс	БддаБдБББд	дааасаББББ	ББаааасаад	1198
ссаадааада	РдРаРаРадд	БдБдБдадас	БасБаададд	саБддсссса	асддБасасд	1258
асРсадРаРс	саРдсРсБРд	ассББдБада	даасасдсдБ	аБББасадсс	адБдддадаБ	1318
дРРадасРса	Бддрдрдрра	сасааБддББ	БББаааББББ	дБааБдааББ	ссБадааББа	1378
аассадаРРд	дадсааББас	дддББдассБ	БаБдадааас	БдсаБдБддд	сБаБдддадд	1438
ддББддБссс	БддБсаБдБд	ссссББсдса	дсБдаадБдд	ададддБдБс	аБсБадсдса	1498
аББдааддаБ	саБсБдаадд	ддсаааББсБ	БББдааББдБ	БасаБсаБдс	БддаассБдс	1558
ааааааБасБ	ББББсБааБд	аддададааа	аБаБаБдБаБ	ББББаБаБаа	БаБсБааадБ	1618
БаБаБББсад	аБдБааБдББ	ББсБББдсаа	адБаББдБаа	аББаБаБББд	БдеБаБадБа	1678
БББдаББсаа	ааБаБББааа	ааБдБсББдс	БдББдасаБа	БББааБдБББ	БаааБдБаса	1738
дасаРаРРРа	асБддБдсас	БББдБаааББ	сссБддддаа	аасББдсадс	Бааддадддд	1798
аааааааРдР	БдБББссБаа	БаБсаааБдс	адБаБаБББс	ББедББеБББ	ББаадББааБ	1858
адаББББББс	адасББдБса	адссБдБдса	ааааааББаа	ааБддаБдсс	ББдааБааБа	1918
адсаддаБдБ	Бддссассад	дБдссБББса	ааБББадааа	сБааББдасБ	ББадааадсБ	1978
дасаРРдсса	ааааддаБас	аБааБдддсс	асБдаааБсБ	дБсаададБа	дББаБаБааБ	2038
БдББдаасад	дБдБББББсс	асаадрдссд	саааББдБас	еБББББББББ	ББББсааааБ	2098
адаааадРРа	ББадБддБББ	аРсадсаааа	аадБссааББ	ББааБББадБ	аааБдББаБс	2158
ББаБасБдБа	сааБааааас	аББдссБББд	ааБдББааББ	ББББддБаса	ааааБаааББ	2218
РаРаРдаааа	аааааааааа	адддсддссд	сБсБададдд	сссБаББсБа	Бад	2271

<210> 2 <211> 317

- 25 006940 <212> ΡΗΤ <213> Ното зархепз <400> 2

Меб Агд Агд А1а 5ег Агд Азр Туг ТЬг Ьуз Туг Ьеи Ахд 01 у Зег С1и

1

5

10

15

01 и

Меб

С1у

С1у

С1у

Рго

С1у

А1а

Рхо

Нхз

С1и

01 у

Рхо

Ьеи

Нхз

А1а

20

25

30

Рго

Рго

Рго

Рго

А1а

Рго

Нхз

С1п

Рхо

Рхо

А1а

А1а

Зех

Ахд

Зех

Меб

35

40

45

РЬе

Уа1

А1а

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

С1п

Уа1

Уа1

Суз

Зех

Уа1

50

55

60

А1а

Ьеи

РЬе

РЬе

Туг

РЬе

Ахд

А1а

С1п

Меб

Азр

Рхо

Азп

Ахд

11е

Зех

65

70

75

80

С1и

Азр

С1у

ТЬг

Н15

Суз

11е

Тух

Ахд

11е

Ьеи

Ахд

Ьеи

ΗΪ3

01и

Азп

85

90

95

А1а

Азр

РЬе

С1п

Азр

ТЬг

ТЬх

Ьеи

С1и

Зех

С1п

Азр

ТЬх

Ьуз

Ьеи

11е

100

105

110

Рго

Азр

Зег

Суз

Агд Ахд

11е

Ьуз

01п

А1а

РЬе

О1п

С1у

А1а

Уа1

О1п

115

120

125

Ьуз

С1и

Ьеи

О1п

Н1з

11е

Уа1

С1у

Зех

С1п

НЬз

11е

Ахд

А1а

С1и

Ьуз

130

135

140

А1а

Меб

Уа1

Азр

О1у

Зег

Тхр

Ьеи

Азр

Ьеи

А1а

Ьуз

Ахд

Зех

Ьуз

Ьеи

145

150

155

160

С1и

А1а

С1п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬх

11е

Азп

А1а

ТЬх

Азр

11е

Рхо

165

170

175

Зег

С1у

5ег

Н±з

Ьуз

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

С1у

180

185

190

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

Меб

ТЬх

РЬе

Зех

Азп

01у

Ьуз

Ьеи

11е

Уа1

195

200

205

Аэп

О1п

Азр

С1у

РЬе

Туг

Тух

Ьеи

Тух

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Ахд

Нхз

210

215

220

Нхз

С1и

ТЬг

Зег

С1 у Азр

Ьеи

А1а

ТЬх

С1и

Тух

Ьеи

О1п

Ьеи

Меб

Уа1

225

230

235

240

Туг

Уа1

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

11е

Рхо

Зех

Зех

Нхз

ТЬх

Ьеи

Меб

245

250

255

Ьуз

С1у

С1 у

Зег

ТЬг

Ьуз

Тух

Тхр

Зех

С1у

Азп

Зех

О1и

РЬе

Нхз

РЬе

- 26 006940

260

265

270

Туг

Зег

11е

Аз η

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

С1у С1и 61и

•

275

280

285

Не

Зег

11е

61и

Уа1

Зег

Аз η

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр 61п Азр

290

295

300

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

Агд

Азр

Не

Азр

315

305

310 <210> 3 <211> 951 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(951) <22 0>

<221> пи.зс_£еаЬиге <222> (142)..(213) <223> Трансмембранный домен <220>

<221> т±зс_£еа£иге <222> (454)..(948) <223> Домен, подобный фактору некроза опухолей (ΤΝΡ) <400> 3

асд Ме£ 1

сдс едд дсс аде еда

дас £ас

ддс аад Ьас с£д сдс

аде Ссд дад Зег Зег 61и 15

Агд

Агд

А1а

Зег 5

Агд

Азр

Туг

61у

Ьуз 10

Туг

Ьеи

Агд

дад

а£д

ддс

аде

ддс

ссс

ддс

дСс

сса

сас

дад

дд£

ссд

с£д

сас

ссс

61и

Меи

С1у

Зег

С1у

Рго

С1у

Уа1

Рго

Н1з

61и

61у

Рго

Ьеи

Н1з

Рго

20

25

30

дед

ссЬ

ЪсЬ

дса

сед

дс£

сед

дед

ссд

сса

ссс

дсс

дсс

Ьсс

сдс

Ьсс

А1а

Рго

Зег

А1а

Рго

А1а

Рго

А1а

Рго

Рго

Рго

А1а

А1а

Зег

Агд

Зег

35

40

45

а£д

ЬЬс

сЬд

дсс

сЬс

сЬд

ддд

с£д

дда

с£д

ддс

сад

д£д

д£с

Ьдс

аде

МеЪ

РЬе

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

61 у

Ьеи

61у

Ьеи

61у

61п

Уа1

Уа1

Суз

Зег

50

55

60

а£с

дс£

сЬд

ЬЬс

сЬд

Ьас

£££

еда

дед

сад

а£д

да£

сс£

аас

ада

аба

Не

А1а

Ьеи

РЬе

Ьеи

Туг

РЬе

Агд

А1а

61п

Ме£

Азр

Рго

Аз η

Агд

Не

65

70

75

80

- 27 006940

Ьса даа дас аде

асЬ ТЬг 85

сас Ьдс

ььь РЬе

ЬаЬ ада айс сЪд ада сЪс саЬ даа

288

Зег

61и

Азр

Зег

ΗΪ3

Суз

Туг

Агд 11е 90

Ьеи

Агд

Ьеи

Ηί3 95

61и

аас

дса

ддЬ

ЪЬд

сад

дас

Ъсд

асЕ

ейд

дад

адЬ

даа

дас

аса

сЬа

ссЬ

336

Азп

А1а

61у

Ьеи

61п

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

61 и

Зег

61и

Азр

ТЬг

Ьеи

Рго

100

105

110

дас

Ьсс

Ьдс

адд

адд

аЪд

ааа

саа

дсс

ЬЬЬ

сад

ддд

дсс

дйд

сад

аад

384

Азр

Зег

Суз

Агд Агд

МеЪ

Ьуз

61п

А1а

РЬе

61п

61у

А1а

Уа1

61п

Ьуз

115

120

125

даа

ейд

саа

сас

аЪЬ

дЬд

ддд

сса

сад

сдс

ЬЬс

Ьса

дда

дсС

сса

дсЪ

432

61и

Ьеи

61п

ΗΪ3

11е

Уа1

61у

Рго

61п

Агд

РЬе

Зег

61у

А1а

Рго

А1а

130

135

140

аЬд

аЬд

даа

ддс

Ьса

Ьдд

ььд

даЬ

дьд

дсс

сад

еда

ддс

аад

ССЙ

дад

480

Мей

МеС

61и

61 у

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Уа1

А1а

61п

Агд

61 у

Ьуз

Рго

61и

145

150

155

160

дес

сад

сса

ЬЕЬ

дса

сас

сЬс

асе

аЬс

ааЪ

дсЬ

дсс

аде

айс

сса

Ьсд

528

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Н1з

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

Зег

165

170

175

ддй

Ьсс

сай

ааа

дЬс

асЬ

сЬд

Ьсс

ЬсЬ

Ъдд

Еас

сас

дай

еда

ддс

Ьдд

576

61у

Зег

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Ηί5

Азр

Агд

61у

Тгр

180

185

190

дес

аад

айс

ЬсЕ

аас

аЕд

асд

ЬЬа

аде

аас

дда

ааа

сЬа

адд

дЬЬ

аас

624

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеЬ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

Азп

195

200

205

саа

дай

ддс

ЬЬс

ЕаС.

Ьас

ейд

Нас

дсс

аас

аЬЪ

Ъдс

ЬЕЬ

едд

саЬ

саЕ

672

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

ΗΪ3

Шз

210

215

220

даа

аса

Ьсд

дда

аде

дЬа

ссЬ

аса

дас

ЬаЬ

сьъ

сад

сЪд

аЬд

дЬд

ЬаЬ

720

61ц

ТЬг

Зег

61 у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61 п

Ьеи

МеС

Уа1

Туг

225

230

235

240

дйс

дЬЬ

ааа

асе

аде

аЬс

ааа

аЪс

сса

адЬ

ЬсЬ

саЬ

аас

сЬд

аЬд

ааа

768

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

11е

Рго

Зег

Зег

ΗΪ3

Азп

Ьеи

МеЬ

Ьуз

245

250

255

дда

ддд

аде

асд

ааа

аас

Ьдд

Ьсд

ддс

ааЪ

ЬсЪ

даа

ЬЬс

сас

ььь

ЬаЬ

816

61у 61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

61и

РЬе

Н±з

РЬе

Туг

260

265

270

Есс

аЪа

ааЪ

дЬЬ

ддд

дда

СЪЪ

ЬЪс

аад

СЙС

еда

дсЪ

ддЬ

даа

даа

аЬЬ

864

Зег

Не

Азп

Уа1

61у

61 у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

11е

275 280 285

- 28 006940

аде аФФ сад дфд Зег Не С1п Уа1 290

Фсс аас ссФ Фсс ефд сфд даФ сед даФ саа даФ дед

912

Зег Азп

Рго 295

Зег

Ьеи Ьеи

Азр Рго Азр 300

С1п Азр А1а

асд

Фас

ФФФ

ддд

дсФ

ФФс

ааа

дфф

сад

дас

аФа

дас

Фда

951

ТЬх

Туг

РЬе

С1у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

305

310

315

<210> 4 <211> 316 <212> РАТ <213> Миз тизси1из <400> 4

МеФ 1

Агд

Агд А1а Зег 5

Агд Азр Туг 61у Ьуз Туг Ьеи Агд Зег Зег 61и

10

15

С1и

МеФ

61у

Зег

61у

Рго

61у

Уа1

Рхо

Ηίβ

С1и

61у

Рхо

Ьеи

ΗΪ3

Рхо

20

25

30

А1а

Рго

Зег

А1а

Рго

А1а

Рго

А1а

Рхо

Рхо

Рго

А1а

А1а

Зег

Ахд

Зех

35

40

45

МеФ

РЬе

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

61у

Ьеи

61 у

Ьеи

61у

С1п

Уа1

Уа1

Суз

Зех

50

55

60

11е

А1а

Ьеи

РЬе

Ьеи

Туг

РЬе

Агд

А1а

01п

МеФ

Азр

Рхо

Азп

Ахд

11е

65

70

75

80

Зег

61и

Азр

Зег

ТЬх

Нхз

Суз

РЬе

Тух

Ахд

Не

Ьеи

Ахд

Ьеи

Н1з

С1и

85

90

95

Азп

А1а

61у

Ьеи

С1п

Азр

Зег

ТЬх

Ьеи

С1и

Зех

С1и

Азр

ТЬх

Ьеи

Рхо

100

105

110

Азр

Зег

Суз

Агд

Агд

МеФ

Ьуз

61п

А1а

РЬе

С1п

61у

А1а

Уа1

61п

Ьуз

115

120

125

61и

Ьеи

61п

ΗΪ3

Не

Уа1

С1у

Рхо

61п

Ахд

РЬе

Зех

С1у

А1а

Рхо

А1а

130

135

140

МеФ

МеФ

С1и

61у

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Уа1

А1а

61п

Ахд

С1у

Ьуз

Рхо

61и

145

150

155

160

Ма

61п

Рго

РЬе

А1а

ΗΪ3

Ьеи

ТЬх

11е

Азп

А1а

А1а

Зех

11е

Рхо

Зех

165

170

175

61у

Зег

Н1з

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зех

Зех

Тхр

Тух

ΗΪ3

Азр

Ахд

61у

Тхр

180

185

190

Ма

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеФ

ТЬг

Ьеи

Зех

Азп

С1у

Ьуз

Ьеи

Ахд

Уа1

Азп

195

200

205

- 29 006940

61п Азр 61у РЬе Туг Туг Ьеи Туг А1а Азп Не Суз РЬе Агд Ηίβ Н±з

210

215

220

61и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

Мер

Уа1

Туг

225

230

235

240

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

11е

Рго

Зег

Зег

Н13

Азп

Ьеи

Мер

Ьуз

245

250

255

61у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

61и

РЬе

Нхз

РЬе

Туг

260

265

270

Зег

11е

Азп

Уа1

61 у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

11е

275

280

285

Зег

11е

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

А1а

290

295

300

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

305

310

315

<210> 5 <211> 2299 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>

<221> СОЗ <222> (170)..(1120) <400> 5 дадсРсддаР аассддРсдд дддададаас ссасРасРсд ддсдддддсс даРсдсддад асссасдсдр дссРддссдд садддсдссс ссдсссасдс дадРсРдсРс даасРссддд дрссддссад дассРсРдРд 60 ддсддрдддр ддссдаддаа 120 сдссдсдас аРд сдс сдд 178

Мек Агд Агд '

дсс аде еда дас Рас ддс аад Рас сРд сдс аде Рсд дад дад аРд ддс

А1а

Зег Агд 5

Азр Туг 61у Ьуз 10

Туг

Ьеи

Агд

Зег Зек 61и 15

61и Мер

61у

аде

ддс

ссс

ддс

дРс

сса

сас

дад

ддр

ссд

сРд

сас

ссс

дед

ссР

РсР

Зег

61 у

Рго

61у

Уа1

Рго

Н1з

61и

61у

Рго

Ьеи

Ηί3

Рго

А1а

Рго

Зег

20

25

30

35

дса

ссд

дсР

ссд

дед

ссд

сса

ссс

дсс

дсс

Рсс

сдс

Рсс

аРд

РРс

сРд

А1а

Рго

А1а

Рго

А1а

Рго

Рго

Рго

А1а

А1а

Зег

Агд

Зег

МеР

РЬе

Ьеи

40

45

50

226

274

- 3О 322

дес сес сед

ддд сед дда

сед Ьеи

ддс сад дед дес еде аде аес дсе сед

370

А1а Ьеи

Ьеи

61у 55

Ьеи

61у

61 у

61п 60

Уа1

Уа1

Суз

Зег

11е А1а 65

Ьеи

А еее

сед

еас

еее

еда

дед

сад

аед

дае

ссе

аас

ада

аеа

еса

даа

дас

418

РЬе

Ьеи

Туг

РЬе

Агд

А1а

61п

Мее

Авр

Рго

Азп

Агд

Не

Зег

61и

Азр

70

75

80

аде

асе

сас

еде

еее

еае

ада

аес

сед

ада

сес

сае

даа

аас

дса

дде

466

Зег

ТЬг

НЬз

Суз

РЬе

Туг Агд

11е

Ьеи

Агд

Ьеи

Нхз

61и

Азп

А1а

61у

85

90

95

ССд

сад

дас

есд

асе

сед

дад

аде

даа

дас

аса

сеа

ссе

дас

есс

еде

514

Ьеи

61п

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

61и

Зег

61и

Азр

ТЬг

Ьеи

Рго

Азр

Зег

Суз

100

105

110

115

адд

адд

аед

ааа

саа

дсс

еее

сад

ддд

дсс

дед

сад

аад

даа

сед

саа

562

Агд

Агд

Мее

Ьуз

61п

А1а

РЬе

61п

61у

А1а

Уа1

61п

Ьуз

61и

Ьеи

61п

120

125

130

сас

аее

дед

ддд

сса

сад

сдс

еее

еса

дда

дсе

сса

дсе

аед

аед

даа

610

Нхз

Не

Уа1

61у

Рго

61п

Агд

РЬе

Зег

61у

А1а

Рго

А1а

Мее

Мее

61и

135

140

145

ддс

еса

едд

еед

дае

дед

дсс

сад

еда

ддс

аад

ссе

дад

дсс

сад

сса

658

61 у

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Уа1

А1а

61п

Агд

61у

Ьуз

Рго

61и

А1а

61п

Рго

150

155

160

еее

дса

сас

сес

асе

аес

аае

дсе

дсс

аде

аес

сса

есд

дде

есс

сае

706

РЬе

А1а

Ηίβ

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

Не

Рго

Зег

61у

Зег

Нхз

165

170

175

ааа

дес

асе

сед

Ъсс

есе

едд

еас

сас

дае

еда

ддс

едд

дсс

аад

аес

754

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61у

Тгр

А1а

Ьуз

11е

180

185

190

195

есе

аас

аед

асд

ееа

аде

аас

дда

ааа

сеа

адд

дее

аас

саа

дае

ддс

802

Зег

Азп

Мее

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

Азп

61п

Азр

С1у

200

205

210

еее

еае

Ьас

сед

еас

дсс

аас

аее

еде

еее

едд

сае

сае

даа

аса

есд

850

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

Н1з

Н1з

61и

ТЬг

Зег

215

220

225

дда

аде

дСа

ссе

аса

дас

еае

сее

сад

сед

аед

дЪд

еае

дес

дее

ааа

898

61 у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

Мее

Уа1

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

230

235

240

асе

аде

аес

ааа

аес

сса

аде

есе

сае

аас

сед

аед

ааа

дда

ддд

аде

946

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

11е

Рго

Зег

Зег

Нхз

Азп

Ьеи

Мее

Ьуз

61 у

61 у

Зег

245 250 255

- 31 006940

асд ааа ТЬг Ьуз 260

аас Сдд Сед

ддс аас СсЬ даа ССс сас ССС СаС Ссс аСа ааС

994

Азп

Тгр Зег

61у Азп 265

Зег

61и

РЬе Нхз РЬе Туг Зег 11е Азп

270

275

4 дсе

ддд

дда

ссс

ССс

аад

сСс

еда

дсС

ддЬ

даа

даа

асе

аде

аСС

сад

1042

Уа1

01 у

С1у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

С1у

С1и

С1и

11е

Зег

11е

С1п

280

285

290

дьд

Ьсс

аас

ссС

Ссс

сСд

сСд

да С

ссд

да С

саа

да к

дед

асд

Сас

ССС

1090

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

295

300

305

ддд

дсС

ССс

ааа

дСС

сад

дас

аСа

дас

Сда

дасСсаСССс дСддаасаСС

1140

С1у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

Не

Азр

310

315

адсаСддаСд	СсссадаСдС	ССддааасСС	сССааааааС	ддаСдаСдСс	СаСасаСдСд	1200
СаадасСасС	аададасаСд	дсссасддСд	СаСдааасСс	асадсссСсС	сСсССдадсс	1260
СдСасаддСС	дСдСаСаСдС	ааадСссаСа	ддСдаСдССа	даССсаСддС	даССасасаа	1320
сддССССаса	аССССдСааС	даСССссСад	ааССдаасса	даССдддада	ддСаССссда	1380
СдсССаСдаа	ааасССасас	дСдадсСаСд	даадддддСс	асадСсСсСд	ддСсСаассс	1440
сСддасаСдС	дссасСдада	ассССдаааС	СаададдаСд	ссаСдСсаСС	дсааадаааС	1500
даСадСдСда	адддССаадС	СсССССдааС	СдССасаССд	сдсСдддасс	СдсаааСаад	1560
ССсССССССС	сСааСдадда	дадаааааСа	СаСдСаСССС	СаСаСааСдС	сСааадССаС	1620
аСССсаддСд	СааСдССССс	СдСдсааадС	СССдСаааСС	аСаСССдСдс	СаСадСаССС	1680
даССсааааС	аСССаааааС	дСсСсасСдС	СдасаСаССС	ааСдССССаа	аСдСасадаС	1740
дСаСССаасС	ддСдсасССС	дСааССсссс	СдааддСасС	сдСадсСаад	ддддсадааС	1800
асСдСССсСд	дСдассасаС	дСадСССаСС	СсСССаССсС	ССССаасССа	аСададСсСС	1860
садасССдСс	аааасСаСдс	аадсааааСа	ааСаааСааа	ааСааааСда	аСассССдаа	1920
СааСаадСад	даСдССддСс	ассаддСдсс	СССсаааССС	адаадсСааС	СдасСССадд	1980
адсСдасаСа	дссааааадд	аСасаСааСа	ддсСасСдаа	аСсСдСсадд	адСаСССаСд	2040
сааССаССда	асаддСдСсС	ССССССасаа	дадсСасааа	ССдСаааССС	СдСССсСССС	2100
ССССсссаСа	дааааСдСас	СаСадСССаС	садссааааа	асааСссасС	ССССааСССа	2160
дСдааадССа	ССССаЪСаСа	сСдСасааСа	ааадсаССдС	сСсСдааСдС	СааССССССд	2220
дСасаааааа	СаааСССдСа	сдаааассСд	аааааааааа	аааааааддд	сддссдсСсС	2280

- 32 006940 ададддсссЬ аЬЬсЬаФад 2299 <210> б <211> 316 <212> РВТ <213> Миз тизси1из <400> б

МеЪ Агд Агд А1а Зег

Агд Азр

Туг

61у Ьуз Туг Ьеи Агд Зег Зег 61и

1

5

10

15

61 и

МеЪ

61у

Зег

61у

Рго

61у

Уа1

Рго

Н±з

61и

61у

Рго

Ьеи

Нхз

Рго

20

25

30

А1а

Рго

Зег

А1а

Рго

А1а

Рго

А1а

Рго

Рго

Рго

А1а

А1а

Зег

Агд

Зег

35

40

45

МеЪ

РЬе

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

61у

Ьеи

61у

Ьеи

61 у

61п

Уа1

Уа1

Суз

Зег

50

55

60

Не

А1а

Ьеи

РЬе

Ьеи

Туг

РЬе

Агд

А1а

61п

МеЪ

Азр

Рго

Азп

Агд

11е

65

70

75

80

Зег

61 и

Азр

Зег

ТЬг

Н±з

Суз

РЬе

Туг Агд

11е

Ьеи

Агд

Ьеи

Нхз

61и

85

90

95

Азп

А1а

61у

Ьеи

61п

Азр

Зег

ТЬг

Ьеи

61и

Зег

61и

Азр

ТЬг

Ьеи

Рго

100

105

110

Азр

Зег

Суз

Агд

Агд

Мей

Ьуз

61 п

А1а

РЬе

61п

61у

А1а

Уа1

61п

Ьуз

115

120

125

61 и

Ьеи

61п

Н1з

11е

Уа1

61 у

Рго

61 п

Агд

РЬе

Зег

61у

А1а

Рго

А1а

130

135

140

МеЬ

МеЪ

61и

61у

Зег

Тгр

Ьеи

Азр

Уа1

А1а

61п

Агд

61у

Ьуз

Рго

61и

145

150

155

160

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

Зег

165

170

175

61у

Зег

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61у

Тгр

180

185

190

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеЪ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

Азп

195

200

205

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

Ηίβ

Ηί3

210

215

220

61и

ТЬг

Зег

6*1у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеЬ

Уа1

Туг

225

230

235

240

- 33 006940

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег 245

11е

Ьуз 11е Рго Зег 250

Зег Нхз Азп Ьеи

МеС 255

Ьуз

61 у

61 у

Зег

ТЬг

Ьуз

Аз η

Тгр

Зег

61у

Аз η

Зег

61и

РЬе

Нхз

РЬе

Туг

260

265

270

Зег

Не

Аз η

Уа1

61 у

61 у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

11е

275

280

285

С а«»

τι·

3 г- ι

С А Г»

& е т

Саг

Т А«1

Тан

&

ϋ»·Λ

Йел

Г?! «

а

V Ы-4.

Л.

X. 4- **

а.

иси

4~МЭ

ги.и

290

295

300

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

305

310

315

<210> 7 <211> 564 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(564) <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-продукт с оптимальными кодонами для экспрессии Е. со!1 и Р. разЪогхз <220>

<221> тхзс_Ып<1хпд <222> (43)..(84) <223> Нхз Ъад <220>

<221> шхзс_£еа£иге <222> (1)..(36) <223> С-концевая часть альфа-фактора пола ЗассЪагошусез сегечхзхае <220>

<221> тхзс_£еаЪиге <222> (85)..(561) <223> Кодирующая мышиный ОРСЬ дикого типа, остатки 158-316 <400> 7 дад с£с дда йсс с£с дад ааа ада дад дс£ даа дсЬ саЪ д£с а£д ааа 48

61и Ьеи 61у Зег Ьеи 61и Ьуз Агд 61и А1а 61и А1а Нхз Уа1 Ме£ Ьуз

10 15

- 34 006940

сас саа сас

саа С1п 20

сае ΗΪ3

саа сае С1п Н1з

саа сае С1п ΗΪ3 25

саа 61п

сае саа ааа ссе даа дсе

96

ΗΪ3

С1п Н1з

НЬз

61п Ьуз

Рго 30

С1и А1а

сад

сса

еес

дсе

сае

сед

асе

аес

аас

дсе

дса

есд

аес

ссе

есе

дде

144

61п

Рго

РЬе

А1а

Н1з

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

Зег

О1у

35

40

45

есе

сае

ааа

дее

асе

сед

есе

есе

едд

еае

сас

дас

сдс

дде

едд

дсе

192

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

ΗΪ3

Азр Агд

01у Тгр

А1а

50

55

60

ааа

аес

есе

аас

аед

асе

сед

есе

аас

дде

ааа

сед

ада

дее

аас

сад

240

Ьуз

Не

Зег

Азп

Мее

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

С1у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

Азп

С1п

65

70

75

80

да с

ддЬ

еес

еас

еас

сед

Сас

дсе

аас

аес

еде

еес

ада

сае

сас

даа

288

Азр

01 у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

ΗΪ3

ΗΪ3

О1и

85

90

95

асе

бее

ддЬ

есе

дее

сса

асе

дас

еас

сед

сад

сед

аед

дее

еас

дее

336

ТЬг

Зег

С1у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

С1п

Ьеи

Мее

Уа1

Туг

Уа1

100

105

110

дее

ааа

асе

есе

аес

ааа

аес

сса

есе

еса

сае

аас

сед

аед

ааа

дде

384

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

Не

Рго

Зег

Зег

Н1з

Азп

Ьеи

Мее

Ьуз

61у

115

120

125

ддЪ

есе

асе

ааа

аас

Ьдд

есе

дде

аас

есе

даа

еес

сае

еес

еас

есе

432

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

О1у

Азп

Зег

С1и

РЬе

Ηίβ

РЬе

Туг

Зег

130

135

140

аес

аас

дее

ддь

ддЪ

еес

еес

ааа

сед

ада

дсе

дде

даа

даа

аес

есе

480

Не

Азп

Уа1

01 у

С1у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

С1у

О1и

О1и

Пе

Зег

145

150

155

160

аес

сад

дЬЬ

есе

аас

ссе

есе

сед

сед

дас

сса

дас

сад

дас

дсе

асе

528

11е

С1п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

О1п

Азр

А1а

ТЬг

165

170

175

еас

еес

ддд

дсс

еес

ааа

дее

сад

дас

аес

дас

еад

564

Туг

РЬе

о1у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

180

185

<210> 8 <211> 187 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-продукт с оптимальными кодонами для экспрессии Е. со11 и Р. разЬогтз

- 35 006940 <400> 8

С1и Ьеи 61у Зег Ьеи

61и

Ьуз

Агд 61и А1а 61и А1а Н1з Уа1 МеС Ьуз

1

5

10

15

Нхз

61п

Нхз

61п

Нхз

С1п

Нхз

61п

Нхз

61п

Н±з

61п

Ьуз

Рго

61и

А1а

20

25

30

61п

Рго

РЬе

А1а

Н1з

Ьеи

ТЬг

11е

А5П

А1а

А1а

Зег

Не

Рго

Зег

61 у

35

40

45

Зег

Н1з

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61у

Тгр

А1а

50

55

60

Ьуз

Не

Зег

Азп

МеС

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

Азп

61п

65

70

75

80

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

Нхз

Н1з

61и

85

90

95

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеС

Уа1

Туг

Уа1

100

105

110

Уа1

Ьуз

ТЫ

Зег

Не

Ьуз

Не

Рго

Зег

Зег

Нхз

Азп

Ьеи

МеС

Ьуз

61у

115

120

125

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

С1и

РЬе

Н1з

РЬе

Туг

Зег

130

135

140

Не

Азп

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Ахд

А1а

61у

61и

61и

Не

Зег

145

150

155

160

Не

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

А1а

ТЬг

165

170

175

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

Не

Азр

180

185

<210> 9 <211> 519 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, кодирующая мышиный ОРСЬ, остатки 158-316, слитый с Нхз-меткой <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(519) <220>

- 36 006940 <221> пйзс_Ып<11пд <222> (1)..(42) <223> ΗΪ3-метка <220>

<221> пй.зс_£еабиге <222> (43)..(519) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 158-316 <400> 9

абд ааа

сас Н1з

саа 61п

сас ΗΪ3 5

саа саб

саа саб

саа саб саа саб

саа 61п

ааа Ьуз 15

ссб Рго

48

Меб 1

Ьуз

61п

Н1з

61п

ΗΪ5

61η ΗΪ3 10

61п

Н1з

даа

дсб

сад

сса

ббс

дсб

саб

ебд

асе

абс

аас

дсб

дса

бед

абс

ссб

96

С1и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Н1з

Ьеи

ТЬг

Не

Азп

А1а

А1а

Зег

Не

Рго

20

25

30

бсб

ддб

бсб

саб

ааа

дбб

асе

ебд

бсб

бсб

бдд

баб

сас

дас

сдс

ддб

144

Зег

61у

Зег

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Ηίβ

Азр

Агд

61у

35

40

45

Ъдд

дсб

ааа

абс

бсб

аас

абд

асе

ебд

бсб

аас

ддб

ааа

ебд

ада

дбб

192

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

Меб

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

аас

сад

да с

ддб

ббс

бас

бас

ебд

бас

дсб

аас

абс

бдб

ббс

ада

саб

240

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Суз

РЬе

Агд

Ηί3

65

70

75

80

сас

даа

асе

бсб

ддб

бсб

дбб

сса

асе

дас

бас

ебд

сад

ебд

абд

дбб

288

ΗΪ3

61и

ТЬг

Зег

61 у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

Меб

Уа1

85

90

95

бас

дбб

дбб

ааа

асе

бсб

абс

ааа

абс

сса

бсб

бса

саб

аас

ебд

абд

336

Туг

УаЬ

Уа1

Ьуз

ТЫ

Зег

11е

Ьуз

Не

Рго

Зег

Зег

Н1з

Азп

Ьеи

МеЪ

100

105

НО

ааа

ддб

ддб

бсб

асе

ааа

аас

*дд

бсб

ддб

аас

бсб

даа

ббс

саб

ббс

384

Ьуз

61у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

61и

РЬе

ΗΪ3

РЬе

115

120

125

бас

бсб

абс

аас

дбб

ддб

ддб

ббс

ббс

ааа

ебд

ада

дсб

ддб

даа

даа

432

Туг

Зег

Не

Азп

Уа1

61у

61 у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

130

135

140

абс

бсб

абс

сад

дбб

бсб

аас

ссб

бсб

ебд

ебд

дас

сса

дас

сад

дас

480

Не

Зег

Не

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

145

150

155

160

дсб

асе

бас

ббс

ддд

дсс

ббс

ааа

дбб

сад

дас

абс

дас

519

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

Не

Азр

165

170

- 37 006940 <210> 10 <211> 173 <212> РПТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: ДНК, кодирующая мышиный ОРСЬ, остатки 158-316, слитый с Нхз-меткой <400> 10

МеЕ 1

Ьуз Нхз С1п Нхз С1п Нхз С1п Нхз О1п Нхз О1п Нхз С1п Ьуз

Рго

5

10

15

01и

А1а

С1п

Рго

РЬе

А1а

Н1з

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

Не

Рго

20

25

30

Зег

С1у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Ахд

01 у

35

40

45

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

МеЕ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

Азп

С1п

Азр

С1у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

Нхз

65

70

75

80

НЬз

О1и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

О1п

Ьеи

МеЕ

Уа1

85

90

95

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

11е

Рго

Зег

Зег

Нхз

Азп

Ьеи

МеЕ

100

105

110

Ьуз

О1у

С1у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

О1и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

Туг

Зег

11е

Азп

Уа1

01у С1у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

01 у

О1и

С1и

130

135

140

Не

Зег

Не

С1п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

О1п

Азр

145

150

155

160

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

С1п

Азр

11е

Азр

165 170 <210> 11 <211> 519 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316 с мутацией С в 3, и Нхз-метка

- 38 006940 <22 0>

<221> СОЗ <222> (1)..(519) <220>

<221> т1зс_Ыпс!хпд <222> (1).7(42) <223> Нхз-метка <220>

<221> шхзс_£еаБиге <222> (43)7.(228) <223> Медийный ОРСЬ, остатки 158-219 <220>

<221> тхзс_£еаБиге <222> (232)..(519) <223> Мышиный ОРбЬ, остатки 221-316 <220>

<221> Мутация <222> (229)..(231) <223> БдБ (Суз) Бо Бсс (Зег) <220>

<400> 11

аБд ааа сас саа

сас саа

саБ саа саБ саа саБ

саа саБ 61п Нхз

саа 61п

ааа Ьуз 15

ссБ Рго

48

МеБ 1

Ьуз

Н1з

61п

Н1з 5

61п

Нхз 61η Нхз

61п 10

Нхз

даа

дсБ

сад

сса

ББс

дсБ

саБ

сБд

асе

аБс

аас

дсБ

дса

Бед

аБс

ссБ

96

61и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

ΗΪ3

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

20

25

30

БсБ

ддБ

БсБ

саБ

ааа

дББ

асе

сБд

БсБ

БсБ

Бдд

БаБ

сас

дас

сдс

ддБ

144

Зег

61 у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Н1з

Азр

Агд

61у

35

40

45

Бдд

дсБ

ааа

аБс

БсБ

аас

аБд

асе

сБд

БсБ

аас

ддБ

ааа

сБд

ада

дББ

192

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеБ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

аас

сад

дас

ддБ

ББс

Бас

Бас

сБд

Бас

дсБ

аас

аБс

Бсс

ББс

ада

саБ

240

Аз η

61п

Азр

61 у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Не

Зег

РЬе

Агд

Нхз

65

70

75

80

сас

даа

асе

БсБ

ддБ

БсБ

дББ

сса

асе

дас

Бас

сБд

сад

сБд

аБд

дББ

288

Н±з

61и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеБ

Уа1

85

90

95

- 39 006940

Рас Туг

дрр дРР ааа

асе ТЬг

РсР аРс ааа Зег 11е Ьуз

аРс сса РсР Рса саР аас сРд аРд

336

Уа1 Уа1

Ьуз 100

11е 105

Рго

Зех

Зех Нхз

Азп Ьеи Мер 110

ааа

ддр

ддр

РсР

асе

ааа

аас

Рдд

РсР

ддр

аас

РсР

даа

РРс

саР

РРс

384

Ьуз

61у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зех

61и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

Рас

РсР

аРс

аас

дрр

ддр

ддр

РРс

РРс

ааа

сРд

ада

дсР

дд^

даа

даа

432

Туг

Зег

11е

Азп

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Ахд

А1а

61у

61и

С1и

130

135

140

аРс

РсР

аРс

сад

дрр

РсР

аас

ССР

РсР

сРд

сРд

дас

сса

дас

сад

дас

480

11е

Зег

11е

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рхо

Азр

61п

Азр

145

150

155

160

дсР

асе

Рас

РРс

ддд

дсс

РРс

ааа

дрр

сад

дас

аРс

дас

519

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

О1п

Азр

11е

Азр

165

170

<210> 12 <211> 173 <212> РЯТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316 с мутацией С в 8, и Нхз метка <400> 12

Мер Ьуз Нхз 1

С1п Нхз С1п Нхз 61п Н1з 5

61п 10

Н1з С1п

Н1з

61п

Ьуз 15

Рхо

С1и

А1а

61п

Рхо

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬх

11е

Азп

А1а

А1а

Зех

11е

Рхо

20

25

30

Зех

61у

Зех

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬх

Ьеи

Зех

Зех

Тхр

Тух

Нхз

Азр Ахд

61у

35

40

45

Тхр

А1а

Ьуз

11е

Зех

Азп

Мер

ТЬх

Ьеи

Зех

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Ахд

Уа1

50

55

60

Азп

61п

Азр

С1у

РЬе

Тух

Тух

Ьеи

Тух

А1а

Азп

11е

Зех

РЬе

Ахд

Нхз

65

70

75

80

Нхз

С1и

ТЬх

Зех

61у

Зех

Уа1

Рхо

ТЬх

Азр

Тух

Ьеи

61п

Ьеи

Мер

Уа1

85

90

95

Тух

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬх

Зех

11е

Ьуз

Не

Рхо

Зех

Зех

Нхз

Азп

Ьеи

МеР

100

105

110

Ьуз

<31у

61у

Зех

ТЬх

Ьуз

Азп

Тхр

Зех

С1у

Азп

Зех

61и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

- 40 006940

Туг

Зег

Не

Аз η

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд А1а 61у

61и 61и

130

135

140

Не

Зех

Не

61п

Уа1

Зег

Аз η

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр Рго Азр

61п Азр

145

150

155

160

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е Азр

165 170 <210> 13 <211> 564 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316, модифицированные введением эпитопа РЗО столбнячного токсоида, и Н1з-метка <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(564) <220>

<221> ш1зс_Ып0хпд <222> (1)..(42) <223> Н±з-метка <220>

<221> ш1зс_£еа1:иге <222> (43)..(336) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 158-255 <220>

<221> шхзс_£еаЕиге <222> (337)..(399) <223> Эпитоп РЗО столбнячного токсоида .

<220>

<221> т1зс_£еаЕиге <222> (400)..(564) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 262-316 <400> 13 а£д ааа сас саа сас саа саЬ саа саЪ саа саЪ саа саб саа ааа ссЪ 48

МеЪ Ьуз Нбз 61п Н1з С1п ΗΪ3 61п Н1з 61η Н1з 61п Нхз 61η Ьуз Рго

10 15

- 41 006940

даа дсб сад сса

ббс дсб саб ебд асе абс аас дсб дса бед абс ссб

96

С1и

А1а

61п

Рго 20

РЬе А1а

Н1з

Ьеи ТЬх 11е 25

Азп А1а А1а

Зех 30

11е

Рхо

4 бсб

ддб

бсб

саб

ааа

дбб

асе

ебд

бсб

бсб

бдд

баб

сас

дас

сдс

ддб

144

Зег

61у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬх

Ьеи

Зех

Зех

Тхр

Тух

Нхз

Азр Ахд

С1у

35

40

45

бдд

дсб

ааа

абс

бсб

аас

абд

асе

ебд

бсб

аас

ддб

ааа

ебд

ада

дбб

192

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зех

Азп

Меб

ТЬх

Ьеи

Зех

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Ахд

Уа1

50

55

60

аас

сад

дас

ддб

ббс

бас

бас

ебд

бас

дсб

аас

абс

бдб

ббс

ада

саб

240

Азп

61п

Азр

61 у

РЬе

Тух

Тух

Ьеи

Тух

А1а

А5П

11е

Суз

РЬе

Ахд

Нхз

65

70

75

80

сас

даа

асе

бсб

ддб

бсб

дбб

сса

асе

дас

бас

ебд

сад

ебд

абд

дбб

288

Нхз

61и

ТЬг

Зех

61у

Зех

Уа1

Рхо

ТЬх

Азр

Тух

Ьеи

61п

Ьеи

Меб

Уа1

85

90

95

бас

дбб

дбб

ааа

асе

бсб

абс

ааа

абс

сса

бсб

бса

саб

аас

ебд

абд

336

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬх

Зег

11е

Ьуз

11е

Рхо

Зех

Зех

Нхз

Азп

Ьеи

Меб

100

105

110

ббс

аас

аас

ббс

асе

дбб

бсб

ббс

бдд

ебд

адд

дба

ссд

ааа

дбб

бсб

384

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬх

Уа1

Зех

РЬе

Тхр

Ьеи

Ахд

Уа1

Рхо

Ьуз

Уа1

Зех

115

120

125

дсб

бсб

сас

ебд

даа

аас

бдд

бсб

ддб

аас

бсб

даа

ббс

саб

ббс

бас

432

А1а

Зег

Нхз

Ьеи

61и

Азп

Тгр

Зех

61у

Азп

Зех

61и

РЬе

Н1з

РЬе

Тух

130

135

140

бсб

абс

аас

дбб

ддб

ддб

ббс

ббс

ааа

ебд

ада

дсб

ддб

даа

даа

абс

480

Зег

Не

Азп

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Ахд

А1а

61у

61и

61и

11е

145

150

155

160

бсб

абс

сад

дбб

бсб

аас

ссб

бсб

ебд

ебд

дас

сса

дас

сад

дас

дсб

528

Зег

11е

61η

Уа1

Зех

Азп

Рхо

Зех

Ьеи

Ьеи

Азр

Рхо

Азр

61п

Азр

А1а

165

170

175

асе

бас

ббс

ддд

дсс

ббс

ааа

дбб

сад

дас

абс

дас

564

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

180 185 <210> 14 <211> 188 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316, модифицированные введением эпитопа РЗО столбнячного токсоида, и Нхз-метка

- 42 006940 <400> 14

МеЪ Ьуз 1 61и А1а

Нхз 61 п

61η Нхз 5

61п Нхз 61п Нхз 61п Нхз 10

61п Нхз 61п Ьуз 15

Рхо Рго

Рго 20

РЬе

А1а Нхз

Ьеи

ТЬг 25

11е

Авп

А1а А1а

Зег 30

11е

Зег

61 у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61у

35

40

45

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеЬ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

НЬз

65

70

75

80

Нхз

61и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеЬ

Уа1

85

90

95

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

Не

Ьуз

11е

Рго

Зег

Зег

Нхз

Азп

Ьеи

Ме£

100

105

110

РЬе

Азп

Азп

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

115

120

125

А1а

Зег

Нхз

Ьеи

61и

Азп

Тгр

Зег

61 у

Азп

Зег

61и

РЬе

НЬз

РЬе

Туг

130

135

140

Зег

11е

Азп

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

11е

145

150

155

160

Зег

Не

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

А1а

165

170

175

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

180

185

<210> 15 <211> 546 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРОЬ, остатки 158-316, с введенным эпитопом Р2 столбнячного токсоида, и Нхз-метка <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(546)

- 43 006940 <220>

<221> ш1зс_Ыпс11пд <222> (1)..(42) <221> Нхз-метка <220>

<221> тхзс_£еаФиге <222> (43)..(336) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 158-255 <220>

<221> шхзс_£еаФиге <222> (382)..(546) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 262-316 <220>

<221> ш1зс_£еаФиге <222> (337)..(381) <223> Эпитоп Р2 столбнячного токсоида <400> 15

аФд ааа МеФ Ьуз 1

сас саа сас

саа саФ саа саФ

саа саФ саа

саФ Нхз

саа 61п

ааа Ьуз 15

ссФ Рго

48

Нхз

61п

Н±з 5

С1п Нхз 61п

Ηίβ

С1п Нхз 10

61 п

даа

дсФ

сад

сса

ФФс

дсФ

саФ

сФд

асе

аФс

аас

дсФ

дса

Фсд

аФс

ссФ

96

61и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

ΗΪ3

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

20

25

30

ФсФ

ддф

ФсФ

саФ

ааа

дфф

асе

сФд

ФсФ

ФсФ

ъдд

ФаФ

сас

дас

сдс

ддф

144

П ль м

а.

С* а.

ти —

▼

1Г- 1

тк

Т -.··

с -

е» _ м

ПЧ Ь—»

т ·

и«: -

Λ

«ж

ОСЬ

ПХД

χι у а

ναχ

1НХ

□ сх

ОСЬ

хух

лхэ

лар

ЛХ. У

35

40

45

сдд

дсФ

ааа

аФс

ФсФ

аас

аФд

асе

сФд

ФсФ

аас

ддф

ааа

сФд

ада

дфф

192

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеФ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

аас

сад

дас

ддф

ФФс

Фас

Фас

сФд

Фас

дсФ

аас

аФс

ФдФ

ФФс

ада

саФ

240

Азп

61п

Азр

С1у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

Нхз

65

70

75

80

сас

даа

асе

ФсФ

ддф

ФсФ

дфф

сса

асе

дас

Фас

сФд

сад

сФд

аФд

дфф

288

НХЗ

О1и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

С1п

Ьеи

МеФ

Уа1

85

90

95

Фас

дфф

дфф

ааа

асе

ссФ

аФс

ааа

аФс

саа

ФсФ

Феа

саФ

аас

сФд

аФд

336

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Рго

11е

Ьуз

11е

61п

Зег

Зег

ΗΪ3

Азп

Ьеи

МеФ

100

105

110

сад

Фас

аФс

ааа

дсФ

ааФ

Фсд

ааа

ФФс

аФс

ддф

аФс

асе

даа

сФд

аас

384

С1п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

61и

Ьеи

Азп

115

120

125

- 44 006940

едд есе дде аас есе даа еее сае еее еас есе аес аас дее дде дде

432

Тгр

Зег 01у 130

Азп Зег 61и РЬе 135

Ηίβ

РЬе

Туг

Зег 11е 140

Азп

Уа1 61у 61у

еее

еее

ааа

сед

ада

дсе

ддЪ

даа

даа

аес

есе

аес

сад

дее

есе

аас

480

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61 у

61и

61 и

11е

Зег

11е

61 п

Уа1

Зег

Азп

145

150

155

160

ссе

есе

сед

сед

дас

сса

дас

сад

дас

дсе

асе

еас

еее

ддд

дсс

еее

528

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

165

170

175

ааа	дее	сад	дас	аес	дас	546
Ьуз	Уа1	61п	Азр	11е	Азр

180 <210> 16 <211> 182 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316 с введенным эпитопом Р2 столбнячного токсоида, и Нхз-метка <400> 16

Мее Ьуз 1

Нхз 61η Нхз 5

01 п

Н1з

61п

НЬз

61η ΗΪ3 О1п Нхз 61п Ьуз

Рго

10

15

61и

А1а

О1п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

20

25

30

Зег

61у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61у

35

40

45

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

Мее

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

Нхз

65

70

75

80

Нхз

61и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

Мее

Уа1

85

90

95

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Рго

Не

Ьуз

11е

61п

Зег

Зег

Нхз

Азп

Ьеи

Мее

100

105

110

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

61и

Ьеи

Азп

115

120

125

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

61и

РЬе

Н1з

РЬе

Туг

Зег

11е

Азп

Уа1

61у

61у

130

135

140

- 45 006940

РЬе РЬе Ьуз Ьеи Агд А1а 61у 61и 61и 11е Зег 11е С1п Уа1 Зег Азп
145	150	155	160
Ραίο Зег	Ьеи Ьеи Азр Рго Азр	61п Азр А1а ТЬг	Туг РЬе 61 у А1а РЬе
	165	170	175
Ьуз Уа1	С1п Азр 11е Азр

180 <210> 17 <211> 519 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРОЬ, остатки 158-316 с введенным эпитопом Р2 столбнячного токсоида, и Нхз-метка <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(519) <220>

<221> тхзс_Ыпс11пд <222> (1).. (42) <221> Нхз-метка <220>

<221> шхзс_£еаЬиге <222> (43)..(432) <223> Мышиный ОРОЬ, остатки 158-287 <22 0>

<221> пйзс_£еа£иге <222> (478)..(519) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 303-316 <220>

<221> ш1зс_£еа£иге <222> (433)..(477) <223> Эпитоп Р2 столбнячного токсоида <400> 17

а£д МеС 1

ааа Ьуз

сас Нхз

саа С1п

сас Ηί3 5

саа 61п

саС Нхз

саа 61п

са£ Нхз

саа 61п 10

са£ Нхз

саа 61п

са£ Нхз

саа 61п

ааа Ьуз 15

ссС Рго

48

даа

дсС

сад

сса

ьес

дсС

саС

сСд

асе

а£с

аас

дес

дса

Сед

аСс

сс£

96

61и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Н1з

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

20

25

30

- 46 006940

СсС ддС

СсС Зег 35

саС Нхз

ааа Ьуз

дСС асе сСд

СсС СсС Сдд СаС сас

дас сдс Азр Агд

ддс 61у

144

Зег

61у

Уа1

ТЬг

Ьеи 40

Зег

Зег

Тгр

Туг Нхз 45

Ъдд

дсС

ааа

аСс

СсС

аас

аСд

асе

сСд

СсС

аас

ддс

ааа

сСд

ада

дСС

192

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеС

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

аас

сад

дас

ддС

ССс

Сас

Сас

сСд

Сас

дсС

аас

аСс

СдС

ССс

ада

саС

240

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Агд

Нхз

65

70

75

80

сас

даа

асе

СсС

ддС

СсС

д«

сса

асе

дас

Сас

сСд

сад

сСд

аСд

дсс

288

Нхз

61 и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеС

Уа1

85

90

95

Сас

дСС

дСС

ааа

асе

СсС

аСс

ааа

аСс

сса

СсС

Сса

саС

аас

сСд

аСд

336

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

Не

Ьуз

11е

Рго

Зег

Зег

ΗΪ5

Азп

Ьеи

МеС

100

105

110

ааа

ддС

ддС

СсС

асе

ааа

аас

Сдд

СсС

ддС

аас

СсС

даа

ССс

саС

ССс

384

Ьуз

61у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зег

61и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

Сас

СсС

аСс

аас

дСС

ддС

ддс

ССс

ССс

ааа

сСд

ада

дсС

ддс

даа

даа

432

Туг

Зег

11е

Азп

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

130

135

140

сад

Сас

аСс

ааа

дсС

ааС

Ссд

ааа

ССс

аСс

ддс

аСс

асе

даа

сСд

дас

480

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

61и

Ьеи

Азр

145

150

155

160

дсС

асе

Сас

ССс

ддд

дсс

ССс

ааа

дСС

сад

дас

аСс

дас

519

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

Не

Азр

165 170 <210> 18 <211> 173 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316 с введенным эпитопом Р2 столбнячного токсоида, и Нхз-метка <400> 18

МеС 1

Ьуз Нхз

61п Нхз 5

61п Нхз

61п НЬз 61η Нхз 61п Нхз 61п Ьуз

Рго

10

15

61и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зег

11е

Рго

20

25

30

Зег

61у

Зег

Нхз

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61у

- 47 006940

35

40

45

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеЬ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

>

50

55

60

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

Пе

Суз

РЬе

Агд

Н1з

65

70

75

80

Н1з

61и

ТЬг

Зег

61у

Зег

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

Ьеи

МеЬ

Уа1

85

90

95

Туг

Уа1

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

Пе

Ьуз

Пе

Рго

Зег

Зег

Н1з

Азп

Ьеи

МеЬ

100

105

110

Ьуз

61 у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61 у

Азп

Зег

61и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

Туг

Зег

11е

Азп

Уа1

61у 61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

130

135

140

61п

Туг

11е

Ьуз

А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

11е

61у

11е

ТЬг

61и

Ьеи

Азр

145

150

155

160

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

Не

Азр

165

170

<210> 19 <211> 519 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРСЬ, остатки 158-316 с введенным эпитопом РЗО столбнячного токсоида, и Нхв-метка <22 0>

<221> СР5 <222> (1)..(519) <220>

<221> пй.зс_Ы.псНпд <222> (1)..(42) .

<221> Н±з-метка <22 0>

<221> пи.зс_£еаЬиге <222> (43)..(231) <223> Мышиный ΟΡΟΙι, остатки 158-220 <220>

- 48 006940 <221> ш±зс_£еаЕиге <222> (295)..(519) <223> Мышиный ОРСЬ, остатки 242-316 <220>

<221> гп1зс_£еаЕиге <222> (232)..(294) <223> Эпитоп РЗО столбнячного токсоида <400> 19

аЕд ааа МеЕ Ьуз 1

сас Нхз

саа С1п

сас Нхз 5

саа саЕ саа 61п Нхз 61п

саЕ Нхз

саа 61п 10

саЕ Нхз

саа саЕ саа

ааа Ьуз 15

ссЕ Рго

48

61п

Нхз

61п

даа

дсЕ

сад

сса

ЕЕс

дсЕ

саЕ

сЕд

асе

аЕс

аас

дсЕ

дса

Есд

аЕс

ссЕ

96

61и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬг

Не

Азп

А1а

А1а

Зег

Не

Рго

20

25

30

ЕсЕ

ддЕ

ЕсЕ

саЕ

ааа

дЕЕ

асе

сЕд

ЕсЕ

ЕсЕ

Едд

ЕаЕ

сас

дас

сдс

ддЕ

144

Зег

61у

Зег

ΗΪ5

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тгр

Туг

Нхз

Азр

Агд

61 у

35

40

45

Едд

дсЕ

ааа

аЕс

ЕсЕ

аас

аЕд

асе

сЕд

ЕсЕ

аас

ддЕ

ааа

сЕд

ада

дЕЕ

192

Тгр

А1а

Ьуз

Не

Зег

Азп

МеЕ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

50

55

60

аас

сад

дас

ддЕ

ЕЕс

Еас

Еас

сЕд

Еас

дсЕ

аас

аЕс

ЕдЕ

ЕЕс

аас

аас

240

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Азп

Азп

65

70

75

80

ЕЕс

асе

дЕЕ

ЕсЕ

ЕЕС

Едд

сЕд

адд

дЕа

ссд

ааа

дЕЕ

ЕсЕ

дсЕ

ЕсЕ

сас

288

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Ахд

Уа1

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

А1а

Зег

Нхз

85

90

95

сЕд

даа

дЕЕ

ааа

асе

ЕсЕ

аЕс

ааа

аЕс

сса

ЕсЕ

Еса

саЕ

аас

сЕд

аЕд

336

Ьеи

61и

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

Не

Ьуз

Не

Рго

Зег

Зег

Нхз

Азп

Ьеи

МеЕ

100

105

110

ааа

ддЕ

ддЕ

ЕсЕ

асе

ааа

аас

Едд

ЕсЕ

ддЕ

аас

ЕсЕ

даа

ЕЕс

саЕ

ЕЕс

384

Ьуз

61у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61 у

Азп

Зег

С1и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

Еас

ЕсЕ

аЕс

аас

дЕЕ

ддЕ

ддЕ

ЕЕс

ЕЕс

ааа

сЕд

ада

дсЕ

ддЕ

даа

даа

432

Туг

Зег

Не

Азп

Уа1

61 у

61 у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Агд

А1а

61у

61и

61и

130

135

140

аЕс

ЕсЕ

аЕс

сад

дЕЕ

ЕсЕ

аас

ссЕ

ЕсЕ

сЕд

сЕд

дас

сса

дас

сад

дас

480

11е

Зег

Не

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

145

150

155

160

дсЕ

асе

Еас

ЕЕс

ддд

дсс

ЕЕс

ааа

дЕЕ

сад

дас

аЕс

дас

519

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

Не

Азр

165 170

- 49 006940 <210> 20 <211> 173 <212> РВТ <213> Искусственная последовательность <223> Описание искусственной последовательности: Слитый мышиный ОРбЬ, остатки 158-316 с введенным эпитопом РЗО столбнячного токсоида, и Нхз-метка <400> 20

МеБ Ьуз Нхз <31 η Нхз

61п Нхз

61п

Нхз 61 п Нхз 61п Нхз 10

61п Ьуз 15

Рхо

1

5

61 и

А1а

61п

Рго

РЬе

А1а

Нхз

Ьеи

ТЬг

11е

Азп

А1а

А1а

Зех

11е

Рхо

20

25

30

Зег

61у

Зег

Н1з

Ьуз

Уа1

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

Тхр

Тух

Нхз

Азр Агд

61у

35

40

45

Тгр

А1а

Ьуз

11е

Зег

Азп

МеБ

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Ахд

Уа1

50

55

60

Азп

61п

Азр

61у

РЬе

Туг

Туг

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Суз

РЬе

Азп

Азп

65

70

75

80

РЬе

ТЬг

Уа1

Зег

РЬе

Тгр

Ьеи

Агд

Уа1

Рхо

Ьуз

Уа1

Зех

А1а

Зех

Н1з

85

90

95

Ьеи

С1и

Уа1

Ьуз

ТЬг

Зег

11е

Ьуз

Не

Рго

Зех

Зех

Нхз

Азп

Ьеи

МеБ

100

105

110

Ьуз

61у

61у

Зег

ТЬг

Ьуз

Азп

Тгр

Зег

61у

Азп

Зех

61и

РЬе

Нхз

РЬе

115

120

125

Туг

Зег

11е

Азп

Уа1

61у

61у

РЬе

РЬе

Ьуз

Ьеи

Ахд

А1а

61у

61и

61и

130

135

140

11е

Зег

11е

61п

Уа1

Зег

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азр

61п

Азр

145

150

155

160

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

61у

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

61п

Азр

11е

Азр

165 170 <210> 21 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности

Синтетический ПЦР-праймер

- 50 006940 <400> 21 адсЪдсаддЪ адЬсддЪЪдд аасадаасса даддЬЪйсдЪ даЬдЪсйдаа асадаЪдЬЬа 60 дсдЬасад ®8 <210> 22 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-праймер <400> 22 сЪсаСсЬдас саЪсаасдсЪ дсаЪ 24 <210> 23 <211> 64 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-праймер <400> 23

ЕЬЬсддЬасс сЬсадссада аадааасддЬ даадЪЪдЬЬд ааасадайдЪ ЬадсдЬасад 60 дйад 64 <210> 24 <211> 61 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-праймер <400> 24

ЪдадддЬасс дааадЬЪЬсЕ дсЪЪсЪсасс ЬддаадЪЬаа аассссЪаЬс ааааЬссаай 60 _е 61 <210> 25 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности

Синтетический ПЦР-праймер

- 51 006940 <400> 25

йЪЪсддРасс с£ саде сада аадааасддЪ даадС'Сд'С'Сд ааса^саддС ЬаЪдЬдаада 60
ЬЪд	63
<210> 26
<211> 62
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности:
Синтетический ПЦР-праймер
<400> 26
ЪдадддЪасс дааадЪЬЬсЪ дсСЪсЪсасс СддаааасЬд	дЪсЪддЬаас ЪсЪдааЬСсс 60
аЪ	62

<210> 27 <211> 79 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-праймер <400> 27 ЬассЬдсадс ЪдаЬддЬРЪа сдЬСдЬЪааа ассссйаЬса ааайссааЬс	ЪЪсасайаас 6
сЪдаЬдсад!: асаЬсааад		7

<210> 28 <211> 83 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

Синтетический ПЦР-праймер <400> 28

ЪддааЫхсад адССассада ссадЫхсадР СсддЪдаЬас сдаЬдааЬЬЬ сдааЕЬадсЕ 60

ЪЪдаЬдЬасЬ дсаЪсаддРЬ аЬд 83 <210> 29 <211> 49 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 52 006940 <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

Синтетический ПЦР-праймер <400> 29 даабббсдаа Сбадсбббда бдбасбдббс ббсассадсб сбсадбббд 49 <210> 30 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический ПЦР-праймер <400> 30 дсбааббсда ааббсабсдд бабсассдаа сбддасдсба ссбасббсдд ддс 53 <210> 31 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

Синтетический ПЦР-праймер <400> 31 сббасбадбс дабдбссбда асбббд 26 <210> 32 <211> 74 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

Синтетический ПЦР-праймер <400> 32 адбддааббс ададббасса дассадбббб бддбадаасс ассбббсабс аддббабдбд 60 аадабдддаб бббд 74 <210> 33 <211> 65 <212> ДНК <213> ΟΙοΒϋΓίάϊυπι Ъебапх

- 53 006940 <400> 33 асЪассЪдса дсЪдаеддее ЪасдеедеЪа ааассСсеаЪ сааааЬсеса ЪсеЪсасаеа 60 ассЬд 65 <210> 34 <211> 15 <212> РНТ <213> ΟΙοΒίΓίάΐυπι ееЪапх <400> 34

61п Туг 11е Ьуз А1а Азп Зег Ьуз РЬе 11е О1у 11е ТЬг 61и Ьеи

10 15 <210> 35 <211> 21 <212> РНТ <213> С1озегхдхит ЬеСапх <400> 35

РЬе Азп Азп РЬе ТЬг Уа1 Зег РЬе Тгр Ьеи Агд Уа1 Рго Ьуз Уа1 Зег 15 10 15

А1а Зег Нхз Ьеи 01 и

Claims (39)

1. Применение (а) полипептида ОРСЬ животного или его фрагмента или (б) аналога ОРСЬ, полученного из полипептида ОРСЬ животного, в который введена модификация, приводящая к тому, что иммунизация животного указанным аналогом индуцирует образование антител против аутологичного полипептида ОРСЬ, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции ОРСЬ в организме указанного животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанная модификация сохраняет существенное число В-клеточных эпитопов ОРСЬ и в ОРСЬ вводится по меньшей мере один чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита (Т_н-эпитоп), и/или в ОРСЬ вводится по меньшей мере одна первая структура, которая обеспечивает нацеливание модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АПК) или В-лимфоцит, и/или в ОРСЬ вводится по меньшей мере одна вторая структура, которая стимулирует иммунную систему, и/или в ОРСЬ вводится по меньшей мере одна третья структура, которая оптимизирует представление модифицированного полипептида ОРСЬ иммунной системе.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что модификация предусматривает введение в качестве боковых групп посредством ковалентного или нековалентного связывания с подходящими химическими группами в ОРСЬ или его фрагмент чужеродного Т_н-эпитопа и/или первой, и/или второй, и/или третьей структуры.

4. Применение по п.3, отличающееся тем, что модификация ОРСЬ предусматривает замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавление аминокислот.

5. Применение по п.4, отличающееся тем, что модификация приводит к образованию слитого полипептида.

6. Применение по любому из пп.4 или 5, отличающееся тем, что замена, и/или делеция, и/или инсерция, и/или добавление аминокислот обеспечивает сохранение практически всей третичной структуры ОРСЬ.

7. Применение по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что модификация включает удвоение по меньшей мере одного В-клеточного эпитопа ОРСЬ и/или введение гаптена.

- 54 006940

8. Применение по любому из пп.2-7, отличающееся тем, что чужеродный Т-клеточный эпитоп является иммунодоминантным у животного.

9. Применение по любому из пп.2-8, отличающееся тем, что чужеродный Т-клеточный эпитоп способен связываться с большой частью молекул МНС класса ΙΙ.

10. Применение по п.9, отличающееся тем, что по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный эпитоп выбран из природного Т-клеточного эпитопа и синтетических связывающих молекулы МНС класса ΙΙ пептидных последовательностей.

11. Применение по п.10, отличающееся тем, что природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного токсоида, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного токсоида, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р. £а1арагит.

12. Применение по любому из пп.2-11, отличающееся тем, что первая структура является партнером специфического связывания для специфического поверхностного антигена Β-лимфоцита или для специфического поверхностного антигена АПК, таким как гаптен или углевод, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или на АПК.

13. Применение по любому из пп.2-12, отличающееся тем, что вторая структура выбрана из цитокина, гормона и белка теплового шока.

14. Применение по п.13, отличающееся тем, что цитокин выбран из интерферона γ (ΙΓΝ-γ), лиганда ГМ8-подобной тирозин-3-киназы (Г113Ь), интерлейкина 1 (ГС-1), интерлейкина 2 (ΙΓ-2), интерлейкина 4 (ΙΓ-4), интерлейкина 6 (ΙΓ-6), интерлейкина 12 (ΙΓ-12), интерлейкина 13 (ЕС-13), интерлейкина 15 (ЕС-15) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Г) или является их эффективным фрагментом, а белок теплового шока выбран из Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, СНР94 кальретикулина (СНТ) или является их эффективным фрагментом.

15. Применение по любому из пп.2-14, отличающееся тем, что третья структура представляет собой липидную группу, такую как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранил-геранильная группа, СРГякорь и Ν-ацилдиглицеридная группа.

16. Применение по любому из пп.1-15, отличающееся тем, что полипептид ОРСЬ или его фрагмент модифицированы по любому из положений 170-192, или 198-218, или 221-246, или 256-261, или 285-316 любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ NО: 4, 6 и 12.

17. Применение по любому из пп.1-15, отличающееся тем, что полипептид ОРСЬ модифицирован по любому из положений 171-193, или 199-219, или 222-247, или 257-262, или 286-317 последовательности 8ЕО ΙΌ 2.

18. Применение по п.16 или 17, отличающееся тем, что модификация включает в себя замену по меньшей мере одной аминокислотной последовательности по положению, определенному в п.16 или 17, аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины, которая содержит чужеродный Т_н-эпитоп.

19. Применение по п.16 или 18, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность, содержащая чужеродный Тн-эпитоп, заменяет аминокислоты 256-261, и/или 288-302, и/или 221-241 последовательности 8Е0 ΙΌ NО: 4.

20. Применение по п.17 или 18, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность, содержащая чужеродный Т_н-эпитоп, заменяет аминокислоты 257-2 62, и/или 28 9-303, и/или 222-243 последовательности 8ЕО ΙΌ NО:2, при этом Сук в положении 221 может быть заменен на 8ег.

21. Применение иммуногенной композиции, содержащей (а) иммунологически эффективное количество полипептида ОРСЬ, аутологичного для животного, объединенного вместе с иммунологически приемлемым адъювантом таким образом, чтобы нарушить аутотолерантность животного в отношении полипептида ОРСЬ, дополнительно содержащей фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель, или (б) иммунологически эффективное количество аналога ОРСЬ, охарактеризованного в любом из пп.1-20, и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель и необязательно адъювант, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции ОРСЬ в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.

22. Применение фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего ОРСЬ, фрагмент ОРСЬ или аналог ОРСЬ, охарактеризованные в любом из пп.1-20, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции ОРСЬ в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.

23. Применение вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, охарактеризованный в п.22, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции ОРСЬ в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.

24. Применение по п.23, отличающееся тем, что вектор способен к автономной репликации.

25. Применение по п.23 или 24, отличающееся тем, что вектор представляет собой плазмиду или вирусный вектор.

26. Применение по любому из пп.23-25, отличающееся тем, что вектор содержит в направлении

- 55 006940

5'^3' в функциональной взаимосвязи, промотор для регуляции экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты, охарактеризованного в п.22, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию или интеграцию в мембрану полипептидного фрагмента, указанный фрагмент нуклеиновой кислоты и необязательно терминатор.

27. Применение по любому из пп.23-26, отличающееся тем, что вектор при введении в клеткухозяин необязательно интегрируется в геном клетки-хозяина.

28. Применение по п.26 или 27, отличающееся тем, что промотор регулирует экспрессию указанного фрагмента нуклеиновой кислоты в эукариотической клетке и/или прокариотической клетке.

29. Применение непатогенной трансформированной клетки, содержащей вектор, охарактеризованный в любом из пп.23-28, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции ОРСБ в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.

30. Применение по п.29, отличающееся тем, что указанный вектор способен реплицироваться в указанной клетке.

31. Применение по п.30, отличающееся тем, что трансформированная клетка является бактериальной клеткой.

32. Применение по п.31, отличающееся тем, что бактериальная клетка является клеткой МутоЬас!егшт Ьον^к ВСС, 8!^еρ!οсοссик φρ.. Е. той, 8а1тοηе11а φρ.. У1Ьгю с1ю1егае. и 8Ыде11а.

33. Применение по п.32, отличающееся тем, что трансформированная клетка способна секретировать или экспрессировать на своей поверхности ОРСБ, фрагмент ОРСБ или аналог ОРСБ, охарактеризованные в любом из пп.1-20.

34. Применение композиции, содержащей фрагмент нуклеиновой кислоты, охарактеризованный в п.22, или вектор, охарактеризованный в любом из пп.23-28, в качестве активного ингредиента и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант для получения фармацевтической композиции для индукции образования антител против полипептида ОРСБ и для отрицательной регуляции ОРСБ в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.

35. Способ идентификации модифицированного аналога ОРСБ, охарактеризованного в любом из пп.1-20, способного индуцировать образование антител против аутологичного немодифицированного ОРСБ в организме животного, предусматривающий получение посредством пептидного синтеза или методов генной инженерии набора различающихся между собой модифицированных полипептидов ОРСБ, содержащих добавления, инсерции, делеции или замены аминокислот, обеспечивающие образование последовательностей, содержащих чужеродные Тклеточные эпитопы, испытание составляющих набор модифицированных полипептидов ОРСБ на их способность индуцировать образование антител против немодифицированного ОРСБ в организме животного и идентификацию и необязательно выделение составляющих набор модифицированных полипептидов ОРСБ, которые в значительной степени индуцируют образование указанных антител.

36. Способ идентификации модифицированного аналога ОРСБ, охарактеризованного в любом из пп.1-20, способного индуцировать образование антител против аутологичного немодифицированного ОРСБ в организме животного, предусматривающий получение посредством пептидного синтеза или методов генной инженерии набора фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих различные модифицированные полипептиды ОРСБ, содержащие добавления, инсерции, делеции или замены аминокислот, обеспечивающие образование последовательностей, содержащих чужеродные Т-клеточные эпитопы, испытание составляющих набор фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать образование антител против немодифицированного ОРСБ в организме животного и идентификацию и необязательно выделение полипептидных продуктов экспрессии, кодируемых фрагментами нуклеиновых кислот, которые в значительной степени индуцируют образование указанных антител.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что получение составляющих набора предусматривает получение различных последовательностей нуклеиновых кислот, каждая из которых является фрагментом нуклеиновой кислоты, охарактеризованным в п.22, встраивание указанных последовательностей в подходящие экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток-хозяев указанными векторами и обеспечение экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот с необязательным последующим выделением продуктов экспрессии.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что последовательности нуклеиновых кислот и/или векторов получают посредством молекулярной амплификации, например, ПЦР, или путем синтеза нуклеиновых кислот.

39. Способ получения иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один модифицированный аналог ОРСБ, охарактеризованный в любом из пп.1-20, предусматривающий

- 56 006940 получение посредством пептидного синтеза или методов генной инженерии набора различающихся между собой модифицированных полипептидов ОРСЬ, содержащих добавления, инсерции, делеции или замены аминокислот, обеспечивающие образование последовательностей, содержащих чужеродные Тклеточные эпитопы, испытание составляющих набора на их способность индуцировать образование антител против немодифицированного ОРСЬ в организме животного и смешивание составляющих набора, которые в значительной степени индуцируют образование антител против немодифицированного ОРСЬ в организме животного, с фармацевтически и иммунологически приемлемым носителем и/или наполнителем необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.