EA008762B1 - АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents
АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- EA008762B1 EA008762B1 EA200200889A EA200200889A EA008762B1 EA 008762 B1 EA008762 B1 EA 008762B1 EA 200200889 A EA200200889 A EA 200200889A EA 200200889 A EA200200889 A EA 200200889A EA 008762 B1 EA008762 B1 EA 008762B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell
- analogue
- app
- autologous
- epitope
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 99
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 256
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 228
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 211
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 91
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 76
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 45
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 43
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 40
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 111
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 62
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 32
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 claims description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 claims description 23
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 claims description 23
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 claims description 23
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 claims description 23
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 21
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 15
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 13
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 4
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- REDMNGDGDYFZRE-WKWISIMFSA-N O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@H](N)C(O)=O REDMNGDGDYFZRE-WKWISIMFSA-N 0.000 claims description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 3
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 claims description 2
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims 2
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 abstract description 172
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 abstract description 172
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 abstract description 156
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 71
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 25
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract description 8
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 36
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 29
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 28
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 24
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 24
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 11
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- -1 trehalose diesters Chemical class 0.000 description 11
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 10
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 10
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 8
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 8
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 7
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 7
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 7
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 5
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 5
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 5
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 4
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 4
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 4
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride Chemical compound FC(F)(F)CS(Cl)(=O)=O CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 3
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 3
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 3
- 102100027058 Bleomycin hydrolase Human genes 0.000 description 3
- 108010025544 Bleomycin hydrolase Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 3
- 102000012412 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000012419 Presenilin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010036908 Presenilin-2 Proteins 0.000 description 3
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 description 3
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 description 3
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 3
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 3
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 101150106357 slc32a1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000023697 ABri amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 2
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 2
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 2
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 2
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 101001039696 Homo sapiens Lysophospholipid acyltransferase 7 Proteins 0.000 description 2
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 2
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 2
- 201000000162 ITM2B-related cerebral amyloid angiopathy 1 Diseases 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 2
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 2
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- XHPWRTXYJFNZAW-OWOJBTEDSA-N 5-azido-2-[(e)-2-(4-azido-2-sulfophenyl)ethenyl]benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1S(O)(=O)=O XHPWRTXYJFNZAW-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 101710122462 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101150018711 AASS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000197455 Achaeus Species 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001182632 Akko Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 102400000269 Amyloid protein A Human genes 0.000 description 1
- 101710144835 Amyloid protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000507564 Aplanes Species 0.000 description 1
- 108010060159 Apolipoprotein E4 Proteins 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000212312 Blighia sapida Species 0.000 description 1
- 235000011349 Blighia sapida Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000024806 Brain atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 1
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 1
- 102000003780 Clusterin Human genes 0.000 description 1
- 108090000197 Clusterin Proteins 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000015833 Cystatin Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000016936 Dendrocalamus strictus Nutrition 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101000633756 Echis pyramidum leakeyi Snaclec 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000034846 Familial Amyloid Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010016202 Familial Amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007487 Familial Cerebral Amyloid Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102400000524 Fibrinogen alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101710137044 Fibrinogen alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 241001290006 Fissurella Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000004878 Gelsolin Human genes 0.000 description 1
- 108090001064 Gelsolin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019889 Hereditary neuropathic amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- 101100395310 Homo sapiens HLA-A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000691618 Homo sapiens Inactive phospholipase C-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000629937 Homo sapiens Translocon-associated protein subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100026207 Inactive phospholipase C-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 102100027670 Islet amyloid polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000037196 Medullary thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010027374 Mental impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 101100182721 Mus musculus Ly6e gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000932075 Priacanthus hamrur Species 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 101100328105 Sus scrofa CLCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 1
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001664469 Tibicina haematodes Species 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100026231 Translocon-associated protein subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- GBXZONVFWYCRPT-JGWLITMVSA-N [(2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-1-oxohexan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C=O)OP(O)(O)=O GBXZONVFWYCRPT-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000036626 alertness Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 108010091628 alpha 1-Antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006991 amyloid degrading activity Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 229940037642 autologous vaccine Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical group N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108050004038 cystatin Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001983 electron spin resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 208000017105 hereditary amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- DJQJFMSHHYAZJD-UHFFFAOYSA-N lidofenin Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O DJQJFMSHHYAZJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 230000003923 mental ability Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000007406 plaque accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000848 poly(L-lactide-ε-caprolactone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 230000006403 short-term memory Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000004808 supercritical fluid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000004697 synapse damage Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004367 thymic lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000013818 thyroid gland medullary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 201000007905 transthyretin amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- FEPMHVLSLDOMQC-UHFFFAOYSA-N virginiamycin-S1 Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2CC(=O)CCN2C(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O FEPMHVLSLDOMQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027121 wild type ATTR amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
Описаны новые способы лечения заболеваний, характеризующихся отложением амилоида. Указанные способы обычно основаны на иммунизации против амилоидогенных белков (белков, способствующих образованию амилоида), таких как бета-амилоид (Аβ). Иммунизацию предпочтительно выполняют путем введения аналогов аутологичных амилоидогенных полипептидов, причем указанные аналоги способны вызывать продуцирование антител против аутологичных амилоидогенных полипептидов. Особенно предпочтительным в качестве иммуногена является аутологичный Аβ, который модифицирован путем введения одного или нескольких чужеродных, иммунодоминантных и смешанных Т-клеточных эпитопов, с сохранением в то же время, по существу, большей части В-клеточных эпитопов Аβ. Описаны также вакцинация нуклеиновыми кислотами против амилоидогенных полипептидов и вакцинация с использованием живых вакцин, а также способы и средства, применимые для вакцинации. Такие способы и средства включают в себя способы идентификации аналогов амилоидогенных белков, способы получения аналогов и фармацевтических композиций, а также фрагменты нуклеиновых кислот, векторы, трансформированные клетки, полипептиды и фармацевтические композиции.
Description
Данное изобретение относится к улучшению терапии и профилактики болезни Альцгеймера (БА) и других заболеваний, характеризующихся отложением амилоида, например характеризующихся отложениями амилоида в центральной нервной системе (ЦНС). Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способ супрессии (нежелательных) отложений амилоида путем обеспечения возможности продуцирования антител против соответствующего белка или его компонентов у субъектов, имеющих риск или страдающих заболеваниями, патология которых включает в себя отложение амилоида. Данное изобретение обеспечивает также способы получения полипептидов, применимых в данном способе, а также сами модифицированные полипептиды. Данное изобретение обеспечивает также фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие эти модифицированные полипептиды, а также векторы, включающие в себя эти фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации аналогов депонированных полипептидов, которые применимы в способе данного изобретения, а также композиции, содержащие модифицированные полипептиды или содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды.
Предпосылки изобретения
Амилоидоз представляет собой внеклеточное отложение нерастворимых белковых фибрилл, приводящее к разрушению ткани и заболеванию (Реруз, 1966; Тап с1 а1., 1995; Ке11у, 1996). Эти фибриллы образуются, когда нормально растворимые белки и пептиды аномальным образом ассоциируются друг с другом (Ке11у, 1997).
Амилоид ассоциирован с серьезными заболеваниями, в том числе системным амилоидозом, БА, диабетом взрослых, болезнью Паркинсона, болезнью Хангтингтона, лобно-височной деменцией и связанными с прионами трансмиссивными энцефалопатиями (куру и болезнью Крейтцфельдта-Якоба у человека и скрепи (почесухой) и В8Е у овец и крупного рогатого скота соответственно), и образование амилоидных бляшек, например, в случае болезни Альцгеймера, по-видимому, тесно связано с прогрессированием этого заболевания у человека. На моделях животных было показано, что сверхэкспрессия или экспрессия, обнаруживаемых в отложениях модифицированных форм белков, наподобие β-амилоидного белка, индуцирует различные симптомы заболевания, например симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера. Не существует специального лечения отложений амилоида, и эти заболевания являются обычно фатальными.
Субъединицы амилоидных фибрилл могут быть белками дикого типа, вариантными или укороченными белками, и сходные фибриллы могут быть образованы ΐη νίίτο из олигопептидов и денатурированных белков (ВгаОЬшу е1 а1., 1960; РИзЫе е1 а1., 1964; Вигке апб Вои^те, 1972). Природа полипептидного компонента фибрилл определяет характер амилоидоза. Несмотря на большие различия в размере, природной структуре и функции амилоидных белков, все амилоидные фибриллы имеют неопределенную длину, являются неразветвленными, имеют в диаметре 70-120 А и проявляют характерное окрашивание Конго красным (Реруз, 1996). Они являются типичной поперечной β-складчатой структурой (Раийпд апб Согеу, 1951), в которой полипептидная цепь организована в β-складки. Хотя амилоидные белки имеют очень различные структуры-предшественники, они все могут подвергаться структурной конверсии, возможно, по сходному пути, в неправильно упакованную форму, которая является элементом структуры протофиламента β-складчатой спирали.
Этот отчетливо выраженный волокнистый характер привел к тому, что амилоидоз называли βфибриллезом (О1еппег, 1980а,Ь), а фибриллярный белок БА был назван β-белком прежде, чем была выяснена его вторичная структура (О1еппег апб \Уопд. 1984). Характеристическая поперечная βдифрактограмма вместе с фибриллярным видом и свойствами окрашивания являются в настоящее время общепринятыми диагностическими отличительными признаками амилоида и предполагается, что эти фибриллы, хотя они и образованы из совершенно различных белков-предшественников, имеют общее структурное сходство и составляют структурное суперсемейство, независимо от природы их белковпредшественников (Зипбе М., 8егре1 Ь.С., ВагИап М., Ргазег Р.Е., Реруз М.В., В1аке ССР1 Мо1. Вю1. 1997, Ос1. 31; 273 (3): 729-739).
Одним из наиболее широко распространенных и хорошо известных заболеваний, где отложения амилоида в центральной нервной системе, как предполагается, играют центральную роль в прогрессировании этого заболевания, является болезнь Альцгеймера (БА).
БА
Болезнь Альцгеймера (БА) является необратимым прогрессирующим нарушением головного мозга, которое происходит постепенно и приводит к потере памяти, поведенческим изменениям и изменениям личности и ухудшению умственных способностей. Эти утраты связаны с гибелью клеток головного мозга и разрушением связей между ними. Ход этого заболевания, как и скорость его прогрессирования, варьирует от пациента к пациенту. В среднем, пациенты с БА живут в течение 8-10 лет после установления диагноза, хотя это заболевание может длиться и до 20 лет.
БА прогрессирует в виде стадий, от ранней, небольшой забывчивости, до тяжелой потери умственной функции. Эта потеря умственной функции известна как деменция (приобретенное слабоумие). У
- 1 008762 большинства людей с БА симптомы появляются впервые после возраста 60 лет, но нередкими являются и более ранние проявления. Самые ранние симптомы часто включают в себя потерю памяти на недавние события, ошибочное суждение и изменения личности. Часто люди в начальных стадиях БА думают менее ясно и забывают имена знакомых людей и названия обычных объектов. Позднее в данном заболевании они могут забыть, как выполнять даже простые задачи. В конце концов, люди с БА утрачивают полностью способность логического мышления и становятся зависимыми от других людей в повседневном уходе. В конце концов, заболевание становится настолько ослабляющим, что пациенты становятся прикованными к постели, и у них могут развиваться другие болезни и инфекции. Наиболее часто люди с БА умирают от пневмонии.
Хотя риск развития БА увеличивается с возрастом, БА и симптомы деменции не являются частью нормального старения. БА и другие связанные со слабоумием нарушения обусловлены заболеваниями, которые влияют на головной мозг. При нормальном старении нервные клетки в головном мозге в больших количествах не утрачиваются. В противоположность этому, при БА нарушаются три ключевых процесса: коммуникация, метаболизм и восстановление нервных клеток. Это разрушение в конечном счете заставляет многие нервные клетки прекращать функционирование, утрачивать связи с другими нервными клетками и умирать.
Сначала при БА разрушаются нейроны в частях головного мозга, которые контролируют память, в частности, в гиппокампе и родственных структурах. Поскольку нервные клетки в гиппокампе перестают правильно функционировать, отказывает кратковременная память, и часто способность человека исполнять простые и знакомые задачи начинает ухудшаться. БА атакует также кору головного мозга, в частности, области, ответственные за язык и рассуждение. В конечном счете, вовлекаются многие другие области головного мозга, все эти зоны головного мозга атрофируются (сморщиваются), и пациент с БА становится прикованным к постели, с недержанием, полностью беспомощный и не реагирующий на внешний мир (источник Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙυΙο оп Адтд Ргодгекк Верой оп Л1х11сппсг'5 Эйса^с. 1999).
Влияние БА
БА является наиболее частой причиной деменции (слабоумия) среди людей в возрасте 65 или более лет. Она представляет собой основную проблему здравоохранения вследствие ее огромного влияния на индивидуумов, семьи, систему медико-санитарной помощи и общество в целом. Ученые оценивают приблизительно, что до 4 млн людей страдают в настоящее время от этого заболевания, и частота случаев БА удваивается каждые 5 лет после возраста 65 лет. Приблизительно также подсчитано, что около 360000 новых случаев (появлений) будут возникать каждый год, хотя это число будет увеличиваться по мере старения популяции (Вгооктсусг с! а1., 1998).
БА налагает тяжелое экономическое бремя на общество. В недавнем исследовании в Соединенных Штатах было подсчитано, что ежегодный расход по уходу за одним пациентом с БА составляет 18408 долларов для пациента со слабо развитой БА, 30096 долларов для пациента с умеренной БА и 36132 доллара для пациента с тяжелой БА. Подсчитано, что ежегодные национальные расходы по уходу за пациентами с БА в Соединенных Штатах составляют более 50 биллионов долларов (Ьсоп с! а1., 1998).
Приблизительно 4 млн американцев имеют возраст 85 или более лет, а в большинстве индустриально развитых стран эта возрастная группа является одной из наиболее быстро растущих частей населения. Приблизительно подсчитано, что эта группа будет насчитывать почти 8,5 млн к 2030 г. в США; некоторые эксперты, исследующие тенденции популяции, предполагают, что это число может быть даже более высоким. Поскольку все больше и больше людей живут дольше, число людей, пораженных болезнями старения, в том числе БА, будет продолжать расти. Например, некоторые исследования показывают, что почти половина всех людей в возрасте 85 и более лет имеют какую-нибудь форму деменции (№Оопа1 1п81йи1с оп Лщпд Ргодгскк Всрой оп ЛМюппсгЕ Эйса^с, 1999).
Основные характеристики БА
Наличие двух аномальных структур в головном мозге являются отличительным признаком БА: амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (ΝΡΤ). Бляшки являются плотными, в значительной степени нерастворимыми отложениями белка и клеточного материала снаружи и вокруг нейронов головного мозга. Клубки являются нерастворимыми скрученными волокнами, которые накапливаются внутри нейронов.
Существует два типа БА: семейная БА (РАО), которая носит явно наследственный характер, и спорадическая БА, где не обнаруживается явного характера наследования. Вследствие различий в возрасте проявления БА дополнительно описана как ранняя (встречающаяся у людей моложе 65 лет) или поздняя (встречающаяся у людей 65 лет или старше). Ранняя БА является редкой (приблизительно 10% случаев) и обычно поражает людей в возрасте 30-60 лет. Некоторые формы ранней БА являются наследуемыми и повторяются в семьях. Ранняя БА часто прогрессирует быстрее, чем более обычная поздняя форма.
Все семейные болезни Альцгеймера (РАО), известные до сих пор, имеют раннее проявление, и в настоящее время известно, что 50% случаев РАО вызваны дефектами в трех генах, расположенных на трех различных хромосомах. Имеются мутации в гене АРР на хромосоме 21; мутации в гене на хромосоме 14, называемом пресенилином 1; и мутации в гене на хромосоме 1, называемом пресенилином 2. Однако пока еще нет данных о том, что какая-либо из этих мутаций играет главную роль в более обычной
- 2 008762 спорадической, или несемейной, форме поздней БА (Ναΐίοηαΐ ПткШгНе οη Адшд Ргодгекк Керой οη Αΐζйе1тег'8 ОЦеаке, 1999).
Амилоидные бляшки
При БА амилоидные бляшки развиваются сначала в областях головного мозга, используемых для памяти и других когнитивных функций. Они состоят в значительной степени из нерастворимых отложений бета-амилоида (далее называемого Ав) - белкового фрагмента более крупного белка, называемого белком-предшественником амилоида (АРР, аминокислотная последовательность которого представлена в 8ЕО ΙΌ N0:2), смешанного с частями нейронов и с клетками, не являющимися нервными клетками, такими как микроглии и астроциты. Неизвестно, составляют ли сами амилоидные бляшки основную причину БА или они являются побочными продуктами процесса БА. Определенно, изменения в белке АРР могут вызывать БА, как показано при наследуемой форме БА, вызываемой мутациями в гене АРР, и образование бляшек Ав, по-видимому, тесно связано с прогрессированием данного заболевания у человека (Ырра С.Р. е1 а1., 1998).
АРР
АРР является одним из многих белков, которые связаны с клеточными мембранами. После его образования АРР становится погруженным в мембрану нервной клетки, частично внутри и частично снаружи этой клетки. Недавние исследования с использованием трансгенных мышей показывают, что АРР, по-видимому, играет важную роль в росте и выживании нейронов. Например, определенные формы и количества АРР могут защищать нейроны против как кратковременного, так и долгосрочного повреждения и могут делать поврежденные нейроны более способными к собственной репарации и помогать частям нейронов расти после повреждения головного мозга.
Хотя АРР погружен в клеточную мембрану, протеазы действуют на конкретные сайты в АРР, расщепляя его на белковые фрагменты.
Одна протеаза помогает расщеплять АРР с образованием Ав, а другая протеаза расщепляет АРР в середине амилоидного фрагмента, так что Ав не может образоваться. Образовавшийся Ав имеет две различные длины, более короткий Ав из 40 (или 41) аминокислот, который являются относительно растворимым и агрегирует медленно, и слегка более длинный «липкий» Ав из 42 аминокислот, который быстро образует нерастворимые клубки. При образовании Ав еще неизвестно точно, как он перемещается через нервные клетки или вокруг нервных клеток. В конечных стадиях этого процесса липкий Ав агрегирует в длинные филаменты снаружи клетки, вместе с фрагментами мертвых или умирающих нейронов и микроглиями и астроцитами, образует бляшки, которые являются отличительным признаком БА, в ткани головного мозга.
Существуют некоторые данные о том, что мутации в АРР делают более вероятным, что Ав будет вырезаться из предшественника АРР, что вызывает образование либо большего количества общего Ав, либо относительно большего количества липкой формы. Вероятно также, что мутации в генах пресенилина могут способствовать дегенерации нейронов по меньшей мере двумя путями: путем модификации образования Ав или путем запуска гибели клеток более прямым путем. Другие исследователи предполагают, что мутированные пресенилины 1 и 2 могут участвовать в ускорении темпа апоптоза.
Следует ожидать, что по мере прогрессирования заболевания будет образовываться все больше и больше бляшек, заполняя все более и более областей головного мозга. В исследованиях предполагается, что возможно в одно и то же время происходит агрегация и дезагрегация Ав по типу динамического равновесия. Это дает надежду на то, что может существовать возможность разрушения бляшек даже после их образования (Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙιιΚ οη Адтд Ргодгекк Керой οη АНйетег'к Эйеаке. 1999).
Считается, что Ав является токсичным для нейронов. В исследованиях на культуре ткани исследователи наблюдали увеличение гибели нейронов гиппокампа, сконструированных для сверхэкспрессии мутированных форм АРР человека, в сравнении с нейронами, сверхэкспрессирующими нормальный АРР человека (Баю е1 а1., 1999).
Кроме того, в моделях на животных было продемонстрировано, что сверхэкспрессия или экспрессия модифицированных форм белка Ав индуцирует симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера (НкТю К. е1 а1., 1998).
Если исходить из того, что повышенное образование Ав, его агрегация в бляшки и полученная в результате нейротоксичность могут приводить к БА, представляет терапевтический интерес исследование условий, при которых агрегация в бляшки может быть ослаблена или даже блокирована.
Пресенилины
Мутации в пресенилине-1 (8-180) ответственны почти за 50% всех случаев ранней семейной БА (РАО). Были идентифицированы около 30 мутаций, которые приводят к появлению БА. Начало БА варьирует в зависимости от мутаций. Мутации в пресенилине-2 ответственны за гораздо меньшую часть случаев РАО, но все же являются значимым фактором. Неизвестно, участвуют ли пресенилины в спорадической несемейной БА. Функция пресенилинов неизвестна, но они, по-видимому, участвуют в процессинге АРР до Ав-42 (более длинной, более липкой формы этого пептида, 8ЕО ΙΌ N0:2, остатки 673-714), так как пациенты с БА с мутациями пресенилина имеют повышенные уровни этого пептида. Неясно, играют
- 3 008762 ли пресенилины роль в индукции выработки ΝΓΤ. Некоторые данные предполагают, что пресенилины могут также играть более прямую роль в дегенерации нейронов и гибели нейронов. Пресенилин-1 находится в хромосоме 14, тогда как пресенилин-2 сцеплен с хромосомой 1. Если человек получает мутированную версию хотя бы одного их этих генов, почти определенно, что у него или у нее будет развиваться раннее начало БА.
Есть некоторая неопределенность в том, является ли пресенилин идентичным гипотетической гамма-секретазе, участвующей в процессинге АРР (№1ги5е с1 а1., 1998).
Аполипопротеин Е
Аполипопротеин Е обычно связан с холестерином, но также обнаруживается в бляшках и клубках головного мозга пациентов с БА. Хотя кажется, что аллели 1-3 не принимают участия в БА, имеется значимая корреляция между присутствием аллеля АРОЕ-е4 и развитием поздней БА (81пйтайег с1 а1., 1993). Однако он является фактором риска, а не прямой причиной, как мутации пресенилина и АРР, и не ограничивается семейной БА.
Пути, в которых белок АРОЕ-е4 способствует увеличению вероятности развития БА, точно не выяснены, но одна возможная теория заключается в том, что он облегчает накопление Ав и это способствует снижению возраста появления БА, или присутствие или отсутствие конкретных аллелей АРОЕ может влиять на способ, при помощи которого нейроны отвечают на повреждение (ΒυΙΙίηί с1 а1., 1999).
Было показано, что Аро А1 также является амилоидогенным. Интактный аро А1 может сам образовывать амилоидоподобные фибриллы ίη νίίτο, которые являются положительными при окрашивании красителем Конго красным (Ат I Ра11ю1 147 (2): 238-244 (Аид 1995), \У15ше\\'5к| Τ., Оо1аЬек А.А., КИа Е., \У15ше\\'5к| К.Е., Ггалдюпе В.).
Несколько противоречивы результаты, указывающие на существование положительного действия аллеля АРОЕ-е4 в снижении симптомов потери умственной способности, в сравнении с другими аллелями (81ет, Вгапб!, 1997, АплаН ок №иго1оду 41).
Нейрофибриллярные клубки
Этот второй отличительный признак БА состоит из аномальных скоплений скрученных нитей, обнаруживаемых в нервных клетках. Главным компонентом клубков является одна форма белка, называемая тау (τ). В центральной нервной системе тау-белки являются наиболее известными из-за их способности связывать микротрубочки и способствовать стабилизации микротрубочек, которые являются одним из компонентов внутренней поддерживающей структуры или скелета клетки. Однако в случае БА таубелок изменяется химически и этот измененный тау не может более стабилизировать микротрубочки, вызывая их дезинтеграцию. Этот коллапс транспортной системы может сначала приводить к дисфункции коммуникации между нервными клетками, а позднее может приводить к гибели нейронов.
При БА химически измененный тау скручивается в парные спиральные филаменты - две нити тау, которые скручены одна вокруг другой. Эти филаменты являются основным веществом, обнаруживаемым в нейрофибриллярных клубках. В одном из недавних исследований были обнаружены нейрофибриллярные изменения менее чем у 6% нейронов в конкретной части гиппокампа в здоровом головном мозге, более чем 43% этих нейронов у людей, которые умерли от легкой БА, и в 71% нейронов у людей, которые умерли от тяжелой БА. При исследовании потери нейронов было обнаружено сходное прогрессирование. Данные этого типа подтверждают идею о том, что образование клубков и потеря нейронов прогрессируют вместе на протяжении развития БА (№Шопа1 [пкШгйе оп Адтд Ргодгекк Верой оп АНйетег'к ОЦеаке, 1999).
Таупатии и клубки
Несколько нейродегенеративных заболеваний, отличных от БА, характеризуются тау-агрегацией в нерастворимые филаменты в нейронах и глии, приводящей к дисфункции и смерти. Совсем недавно несколько групп исследователей, которые изучали семьи с различными наследственными деменциями, отличными от БА, обнаружили первые мутации в гене тау на хромосоме 17 (С1агк е1 а1., 1998; Нийоп е1 а1., 1998; Роогка.) е1 а1., 1998; БрШапйш е1 а1., 1998). В этих семьях мутации в гене тау вызывают гибель нервных клеток и деменцию. Эти нарушения, которые имеют некоторые общие признаки с БА, но отличаются в некоторых важных аспектах, совокупно называют «лобно-височной деменцией и паркинсонизмом, связанными с хромосомой 17» (ΓΤΌΡ-17). Они являются заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, некоторые формы бокового амиотрофического склероза (АБ8), кортикобазальная дегенерация, прогрессирующий супрануклеарный паралич и болезнь Пика, и все они характеризуются аномальной агрегацией тау-белка.
Другие БА-подобные неврологические заболевания
Существуют важные параллели между БА и другими неврологическими заболеваниями, в том числе вызываемыми прионами заболеваниями (такими как куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба и бычий губчатый энцефалит), болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона и лобно-височной деменцией. При всех этих заболеваниях происходит отложение аномальных белков в головном мозге. БА и прионовые заболевания вызывают деменцию и смерть, и оба эти заболевания связаны с образованием нерастворимых амилоидных фибрилл, но из мембранных белков, которые отличаются друг от друга.
- 4 008762
Ученые, изучающие болезнь Паркинсона, второе наиболее распространенное нейродегенеративное нарушение после БА, обнаружили первый ген, сцепленный с этим заболеванием. Этот ген кодирует белок, названный синуклеином, который, интригующим образом, обнаружен также в амилоидных бляшках головного мозга пациентов с БА (Ьауебаи С., 1998, Сепоте Кек. 8(9): 871-80). Исследователи обнаружили также, что генетические дефекты при болезни Хантингтона, другом прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, которое вызывет деменцию, заставляют белок Хантингтона образовывать нерастворимые фибриллы, очень сходные с Ав-фибриллами БА и белковыми фибриллами прионового заболевания (Бсйегапдег Е., е! а1., 1999, ΡΝΑ8 И.8.А. 86(8):4604-9).
Ученые обнаружили также новый ген, который при мутировании является ответственным за семейную Британскую деменцию (ΕΒΌ), редкую наследственную болезнь, которая вызывает тяжелые нарушения движения и прогрессирующую деменцию, сходную с наблюдаемой при БА. При биохимическом анализе амилоидных фибрилл, обнаруженных в бляшках ΕΒΌ, был обнаружен уникальный пептид, названный ΑΒη (У1ба1 е! а1., 1999). Мутация в конкретной точке вдоль этого гена приводит к продуцированию более длинного, чем нормальный, Βη-белка. Пептид ΑΒτί, который вырезается из мутированного конца этого Βη-белка, откладывается в виде амилоидных фибрилл. Считают, что эти бляшки приводят к дисфункции нейронов и деменции, которые характеризуют ΕΒΌ.
Иммунизация с использованием Ав
Иммунная система будет нормально участвовать в клиренсе чужеродных белка и белковых частиц в организме, но отложения, связанные с вышеуказанными заболеваниями, состоят в основном из собственных белков, что делает роль иммунной системы в контроле этих заболеваний менее очевидной. Кроме того, отложения локализованы в компартменте (ЦНС), в норме отделенном от иммунной системы, причем оба факта предполагают, что любая вакцина или иммунотерапевтический подход были бы безуспешными.
Тем не менее, ученые недавно пытались иммунизировать мышей вакциной, составленной из гетерологичного Ав человека и вещества, которое, как известно, возбуждает иммунную систему (8сйепк е! а1., 1999 и \УО 99/27944). Эту вакцину испытывали в частичной модели БА трансгенной мыши с мутированным геном АРР человека, встроенным в ДНК мыши. Мыши, по мере роста, продуцировали модифицированный белок АРР и развитые амилоидные бляшки. Эту мышиную модель использовали для испытания того, действует ли вакцинация против модифицированного трансгенного АРР человека на процесс накопления бляшек. В первом эксперименте одной группе трансгенных мышей инъецировали ежемесячно вакцину, начиная с 6-недельного возраста и заканчивая в 11-месячном. Вторая группа трансгенных мышей не получала инъекций и служила в качестве контрольной группы. В 13-месячном возрасте мыши в контрольной группе имели бляшки, охватывающие 2-6% их головного мозга. В противоположность этому, иммунизированные мыши бляшек практически не имели.
Во втором эксперименте исследователи начинали инъекции в 11 месяцев, когда уже развивалось некоторое количество бляшек. При прошествии 7-месячного периода у контрольных трансгенных мышей наблюдали 17-кратное увеличение количества бляшек в головном мозге, тогда как у мышей, которые получали вакцину, наблюдалось 99%-ное уменьшение в сравнении с 18-месячными контрольными трансгенными мышами. У некоторых мышей, некоторая часть предсуществующих отложений в виде бляшек, по-видимому, в результате такой обработки удалялась. Было обнаружено, что другое связанное с бляшками повреждение, такое как воспаление и аномальные процессы в нервных клетках, ослаблялись в результате иммунизации.
Таким образом, выше описано предварительное исследование на мышах, и ученым нужно определить, к примеру, остаются ли вакцинированные мыши здоровыми в других отношениях и остается ли память этих вакцинированных животных нормальной. Кроме того, поскольку мышиная модель не является полным воспроизведением БА (у животных не развиваются нейрофибриллярные клубки и у них не наблюдается гибель многих нейронов), необходимы дополнительные исследования для определения того, воспроизводится ли у человека такая же реакция, как у мышей, или она отличается от мышиной. Другим предметом рассмотрения является то, что этот способ, возможно, лечит амилоидное отложение, но не может остановить развитие деменции.
Технические вопросы также представляют собой основные проблемы. Например, мало вероятно, что можно, с использованием этой технологии, создать вакцину, которая позволит людям индуцировать антитела против их собственных (аутологичных) белков. Так, потребуется разрешить многочисленные проблемы безопасности и эффективности, прежде чем можно будет рассматривать вопрос об испытаниях на человеке.
Так, в работе 8сйепк е! а1. показано, что если бы было возможно генерировать сильную иммунную реакцию в отношении аутологичных белков в белковых отложениях в центральной нервной системе, таких как бляшки, образуемые при БА, то можно как предупреждать образование этих отложений, так и возможно также осуществлять клиренс образованных бляшек.
- 5 008762
Цель изобретения
Целью данного изобретения является обеспечение новой терапии против состояний, отличающихся отложением амилоида, таких как БА. Следующей целью данного изобретения является развитие аутовакцины (вакцины против аутологичных белков) против амилоида, чтобы получить новый способ лечения БА и других патологических нарушений, включающих в себя отложение амилоида.
Сущность изобретения
Здесь описано применение технологии аутовакцинации для генерирования сильных иммунных ответов против в ином случае неиммуногенных аутологичных белков, включенных в связанные с патологией амилоидные отложения. Посредством этого, генерируют сильную иммунную реакцию против амилоида, против одного или нескольких компонентов, включенных в эти отложения, или против одного или нескольких белков, ответственных за образование амилоида. Описано также приготовление таких вакцин для предупреждения, возможного лечения или ослабления симптомов таких заболеваниий, связанных с отложениями амилоидов.
Таким образом, в его самом широком и наиболее общем объеме, данное изобретение относится к способу супресси ίη νίνο амилоида у животного, в том числе человека, причем этот способ предусматривает осуществление представления (презентации) иммунной системе этого животного иммунологически эффективного количества по меньшей мере одного амилоидогенного полипептида или его субпоследовательности, которые были приготовлены таким образом, что иммунизация животного амилоидогенным полипептидом или его субпоследовательностью индуцирует продуцирование антител против амилоидогенного полипептида, и/или по меньшей мере одного аналога амилоида, причем в амилоидогенный полипептид введена модификация, что в результате приводит к тому, что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против амилоидогенного полипептида.
Таким образом, в данное изобретение включено применение: 1) природно встречающихся антигенов и их фрагментов, приготовленных таким образом, что они запускают иммунную реакцию, а также 2) аналогов таких природно встречающихся антигенов, причем эти аналоги способны индуцировать перекрестно-реактивные иммунные реакции.
Данное изобретение относится также к аналогам амилоидогенных полипептидов, а также к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующим их субпопуляцию. Иммуногенные композиции, содержащие эти аналоги или эти фрагменты нуклеиновых кислот, являются частью данного изобретения.
Данное изобретение относится также к способу идентификации иммуногенно эффективных аналогов амилоидогенных полипептидов, а также к способу получения композиции, содержащей эти аналоги.
Подпись к чертежу
На чертеже представлено схематическое изображение вариантов аутовакцины (ΛιιΙοναο). полученных из белка-предшественника амилоида с целью генерирования реакций в виде антител против А[1белка Ав-43 (или С-100). АРР показан схематически в верхней части фигуры, а остальные схематические конструкции показывают, что модельные эпитопы Р2 и Р30 заменены или встроены в различные укороченные формы АРР. На этой фигуре черным обозначена сигнальная последовательность АРР, двусторонняя поперечная штриховка соответствует внеклеточной части АРР, темными вертикальными штрихами обозначен трансмембранный домен АРР, светлыми вертикальными штрихами обозначен внутриклеточный домен АРР, грубой поперечной штриховкой обозначен эпитоп Р30, а тонкое поперечное штрихование указывает на эпитоп Р2. Обведенным сплошной линией блоком показан Λβ-42/43, а обведенным сплошной линией блоком и обведенным сплошной линией и пунктирной линией блоком вместе показан С-100. АЬе1а означает Ав.
Подробное описание изобретения
Определения.
Далее будут определены и подробно объяснены ряд терминов, используемых в данном описании и формуле изобретения, для прояснения размеров и границ данного изобретения.
Термины «амилоид» и «амилоидный белок», которые используются здесь взаимозаменяемо, означают класс белковых неразветвленных фибрилл неопределенной длины. Амилоидные фибриллы характерно окрашиваются Конго красным и имеют общую поперечную β-структуру, в которой полипептидная цепь организована в виде β-складок. Амилоид обычно происходит из амилоидогенных белков, которые имеют различные структуры предшественников, но которые могут все подвергаться структурному превращению в неправильно уложенную форму, которая является элементом структуры β-складчатого спирального протофиламента. Обычно диаметр амилоидных фибрилл варьирует примерно между около 70 и 120 А.
Термин «амилоидогенный белок» предназначен для обозначения полипептида, который участвует в образовании амилоидных отложений, является либо частью отложений как таковых, либо частью биосинтетического пути, приводящего к образованию этих отложений. Таким образом, примерами амилоидогенных белков являются АРР и Ав, но также и белки, участвующие в метаболизме этих белков, могут быть амилоидогенными белками. Ряд амилоидогенных полипептидов обсуждается подробно ниже.
«Амилоидный полипептид» предназначен здесь для обозначения полипептидов, содержащих ами
- 6 008762 нокислотную последовательность обсуждаемых выше амилоидогенных белков, полученных у человека или других животных (или их укороченных форм, имеющих существенное количество общих Вклеточных эпитопов с интактным амилоидогенным белком), амилоидогенный полипептид может, следовательно, содержать, например, существенные части предшественника амилоидогенного полипептида (в случае Άβ одним из возможных амилоидных полипептидов мог бы быть АРР). Негликозилированные формы амилоидогенных полипептидов, которые получают в прокариотической системе, также охватываются данным термином, как и формы, имеющие варьирующие картины гликозилирования вследствие применения, например, дрожжей или других эукариотических экспрессионных систем не млекопитающих. Однако следует отметить, что когда применяется термин «амилоидогенный полипептид», подразумевается, что рассматриваемый полипептид является обычно неиммуногенным при представлении его подлежащему обработке животному. Другими словами, амилоидогенный полипептид является аутологичным белком или является аналогом такого аутологичного белка, который в норме не будет индуцировать иммунную ответную реакцию против амилоидогенного белка рассматриваемого животного.
«Аналог амилоидогенного полипептида» означает амилоидогенный полипептид, который был подвергнут изменениям в своей первичной структуре. Такое изменение может, например, быть в виде слияния амилоидного полипептида с подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре, включающее в себя исключительно С- и/или Ν-добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида. Этот термин относится также к дериватизованным амилоидогенный молекулам (см. обсуждение ниже модификаций амилоидогенных полипептидов). В случае, когда амилоидогенный полипептид является амилоидом или его предшественником, этот аналог может быть сконструирован таким образом, что он менее способен или даже неспособен индуцировать антитела против нормального белка-предшественника (белков-предшественников) амилоида, для исключения посредством этого нежелательного взаимодействия с (физиологически нормальной) неагрегированной формой этого полипептида, являющегося предшественником амилоидного белка.
Следует отметить, что применение в качестве вакцины у человека ксеноаналога (например, собачьего или свиного аналога) амилоидогенного полипептида человека может рассматриваться для получения желаемого иммунитета против амилоидогенного полипептида. Такое применение ксеноаналога для иммунизации также рассматривается как часть данного изобретения.
Термин «полипептид» предназначен в данном контексте для обозначения как коротких пептидов с 2-10 аминокислотными остатками, олигопептидов с 11-100 аминокислотными остатками и полипептидов с более чем 100 аминокислотными остатками. Кроме того, этот термин также предназначен для включения белков, т.е. функциональных биомолекул, содержащих по меньшей мере один полипептид; при наличии по меньшей мере двух полипептидов они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть нековалентно связанными. Полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными, и/или липидизированными, и/или содержат простетические группы.
Термин «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» будут использоваться взаимозаменяемо для обозначения лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные клеточно-опосредованные иммунные реакции, а также за хелперную активность в гуморальной иммунной реакции. Подобным образом, термины «В-лимфоцит» и «В-клетка» будут использоваться взаимозаменяемо в отношении продуцирующих антитела лимфоцитов.
Термин «субпоследовательность» означает любой отрезок последовательности по меньшей мере из 3 аминокислот или, соответственно, по меньшей мере 3 нуклеотидов, полученный непосредственно из природно встречающейся аминокислотной последовательности амилоида или последовательности нуклеиновой кислоты амилоида соответственно.
Термин животное в данном контексте обычно означает вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Ното 8ар1еи8, Саше ботезДсиз и т.д., а не только единственное животное. Однако этот термин означает также популяцию животных этих видов, так как существенно, что у всех индивидуумов, иммунизированных в соответствии со способом данного изобретения одним и тем же амилоидогенным полипептидом, распознается, по существу, один и тот же амилоидогенный полипептид, что позволяет иммунизацию этих животных тем же самым иммуногеном (иммуногенами). Если, например, в разных популяциях людей существуют генетические варианты данного амилоидогенного полипептида, может быть необходимым использование различных иммуногенов в этих отличающихся популяциях, чтобы добиться разрушения аутотолерантности в отношении амилоидогенного полипептида в каждой популяции оптимальным образом. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что животное в данном контексте является живым существом, которое имеет иммунную систему. Предпочтительно, чтобы это животное являлось позвоночным животным, таким как млекопитающее.
Термин супрессия амилоида ίη νίνο означает здесь уменьшение в живом организме общего количества отложенного амилоида соответствующего типа. Супрессия может быть получена посредством нескольких механизмов, из них наиболее простым является простое взаимодействие с амилоидом посредством связывания с антителами для предотвращения ошибочной агрегации. Однако в объем данного изобретения входит также то, что связывание антител приводит к удалению амилоида клетками
- 7 008762 акцепторами (такими как макрофаги и другие фагоцитарные клетки) и что эти антитела взаимодействуют с другими амилоидогенными полипептидами, которые приводят к образованию амилоида.
Выражение осуществление представления ... иммунной системе означает, что иммунная система животного подвергается иммуногенной стимуляции регулируемым образом. Как будет видно из приведенного ниже описания, такая стимуляция иммунной системы может быть выполнена рядом способов, из которых наиболее важным является вакцинация содержащими полипептид фармакцинами (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления имеющегося заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту фармакцинами. Важным результатом, который должен быть получен, является то, что иммунокомпетентные клетки сталкиваются с антигеном иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата менее важен для идеи, лежащей в основе данного изобретения.
Термин иммуногенно эффективное количество имеет свое обычное значение в данной области, т.е. количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунную реакцию, которая в значительной мере связывает патогенные агенты, имеющие общие иммуногенные признаки с данным иммуногеном.
При использовании выражения, что амилоидогенный полипептид был модифицирован, имеется в виду химическая модификация полипептида, который составляет скелет амилоидогенного полипептида. Такая модификация может, например, быть дериватизацией (например, алкилированием) определенных аминокислотных остатков в последовательности амилоидогенного полипептида, но, как будет понятно из приведенного ниже описания, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности.
При обсуждении аутотолерантности в отношении амилоидогенного полипептида понятно, что поскольку амилоидогенный полипептид является аутологичным (своим) белком в подлежащей вакцинации популяции, у нормальных индивидуумов в этой популяции не возникает иммунной реакции против этого амилоидогенного полипептида; хотя и нельзя исключить, что случайные индивидуумы в популяции животных могут быть способными продуцировать антитела против природного амилоидогенного полипептида, например, в виде части аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, животное будет обычно аутотолерантным только в отношении его собственного амилоидогенного полипептида, но нельзя исключить, что аналоги, полученные у других видов животных или у популяции, имеющей отличающийся фенотип, будут также переноситься указанным животным.
Чужеродный Т-клеточный эпитоп (или чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп) является пептидом, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки у видов животных. Предпочтительными чужеродными Т-клеточными эпитопами в данном изобретении являются смешанные эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с существенной фракцией конкретного класса молекул МНС у вида или популяции животного. Известно только очень ограниченное количество таких Т-клеточных эпитопов, и они будут подробно обсуждаться ниже. Смешанные Т-клеточные эпитопы называют также универсальными Т-клеточными эпитопами. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с данным изобретением, были эффективными по возможности в большей части популяции животного, может быть необходимым: 1) встроить несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) получить несколько аналогов, где каждый аналог имеет отличающийся встроенный случайный эпитоп. Следует также отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов включает в себя также использование скрытых (критических) Тклеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые происходят из аутологичного белка и которые проявляют их иммуногенное поведение только в том случае, когда они существуют в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого аутологичного белка.
Чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита (чужеродный Тн-эпитоп) является чужеродным Тклеточным эпитопом, который связывается с молекулой МНС Класса II и может быть представлен на поверхности антигенпредставляющей клетки (АРС), связанной с молекулой МНС Класса II.
«Функциональная часть» (био)молекулы означает в данном контексте часть молекулы, которая является ответственной по меньшей мере за одно из биохимических или физиологических действий, проявляемых этой молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за действия, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут служить цели стабилизации или усиления растворимости и, следовательно, могут быть опущены, если эти цели не являются важными в контексте определенного варианта данного изобретения. Например, можно использовать некоторые цитокины в качестве модифицирующей части молекулы в амилоидогенном полипептиде (см. подробное обсуждение ниже), и в таком случае, вопрос стабильности может быть не важен, так как связывание с амилоидогенным полипептидом может обеспечивать необходимую стабильность.
Термин «адъювант» имеет его обычное значение в области технологии вакцин, т.е. означает вещество или композицию, которая: 1) сама не способна вызывать специфическую иммунную реакцию против иммуногена вакцины, но которая 2) тем не менее способна усиливать иммунную реакцию против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только адъювантом не обеспечивает иммунную реак
- 8 008762 цию против иммуногена, вакцинация иммуногеном может индуцировать или может не индуцировать иммунную реакцию против иммуногена, но объединенная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунную реакцию против иммуногена, которая является более сильной, чем иммунная реакция, индуцируемая одним иммуногеном.
«Нацеливание» молекулы означает в данном контексте ситуацию, в которой молекула при введении животному будет появляться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связана с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может достигаться рядом путей, в том числе включением этой молекулы в состав композиции, облегчающей нацеливание, или введением в эту молекулу групп, которые облегчают нацеливание. Эти вопросы будут подробно обсуждаться ниже.
«Стимуляция иммунной системы» означает, что рассматриваемые вещество или композиция проявляют общее, неспецифическое иммуностимулирующее действие. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является увеличенная «бдительность» иммунной системы, т. е. одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном индуцирует значимо более эффективную реакцию в сравнении с отдельным использованием данного иммуногена.
Предпочтительные варианты супрессии амилоида
Предпочтительно амилоидогенный полипептид, используемый в качестве иммуногена в способе данного изобретения, является модифицированной молекулой, в которой по меньшей мере присутствует одно изменение в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида, так как шансы получения общего разрушения аутотолерантности в отношении данного амилоидогенного полипептида в этом случае сильно увеличиваются таким путем - это, например, очевидно из результатов, приведенных здесь в примере 2, где иммунизация Άβ дикого типа сравнивается с иммунизацией вариантной молекулой Άβ. Следует отметить, что применение модифицированной молекулы не исключает возможности использования такого модифицированного амилоидогенного полипептида в композициях, которые дополнительно облегчают разрушение аутотолерантности против амилоидогенного полипептида, например, в композициях, содержащих адъюванты.
Было показано (в Па1иш I. с! а1., 1996, 1. 1ттипо1. 157: 4796-4804), что потенциально самореактивные В-лимфоциты, узнающие аутологичные белки, физиологически присутствуют у нормальных индивидуумов. Однако для того, чтобы эти В-лимфоциты были индуцированы для фактического продуцирования антител, реактивных с соответствующими аутологичными белками, требуется помощь со стороны продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов (Тн-клеток или Тн-лимфоцитов). Обычно эта помощь не обеспечивается, так как Т-лимфоциты обычно не узнают Т-клеточные эпитопы, полученные из аутологичных белков при презентации антигенпредставляющими клетками (АРС). Однако посредством обеспечения элемента «чужеродности» в аутологичном белке (т.е. введением иммунологически значимой модификации) Т-клетки, узнающие этот чужеродный элемент, активируются при узнавании этого чужеродного эпитопа на АРС (такой как, первоначально, мононуклеарная клетка). Поликлональные Влимфоциты (которые являются также АРС), способные узнавать аутологичные эпитопы на модифицированном аутологичном белке, также интернализируют этот антиген, и затем представляют его чужеродный Т-клеточный эпитоп (эпитопы), и эти активированные Т-лимфоциты затем обеспечивают помощь цитокинов для данных самореактивных поликлональных В-лимфоцитов. Поскольку антитела, продуцируемые этими поликлональными В-лимфоцитами, являются реактивными в отношении различных эпитопов на модифицированном полипептиде, в том числе тех из них, которые присутствуют также в нативном полипептиде, индуцируется антитело, перекрестно-реактивное с немодифицированным аутологичным белком. В результате Т-лимфоциты можно заставить действовать так, как если бы популяция поликлональных В-лимфоцитов узнавала полностью чужеродный антиген, тогда как в действительности только встроенный эпитоп (эпитопы) является (являются) чужеродным для данного хозяина. Таким путем индуцируются антитела, способные перекрестно реагировать с немодифицированными аутологичными антигенами.
Несколько путей модификации пептидного аутологичного антигена для достижения разрушения аутотолерантности известны в данной области. Таким образом, согласно данному изобретению модификация может включать в себя следующее:
вводят по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный эпитоп, и/или вводят по меньшей мере только первую часть, которая выполняет нацеливание модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АРС), и/или вводят по меньшей мере только вторую часть, которая стимулирует иммунную систему, и/или вводят по меньшей мере только третью часть, которая оптимизирует представление модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе.
Однако все эти модификации должны проводиться при сохранении существенной фракции исходных эпитопов В-лимфоцитов в амилоидогенном полипептиде, так как посредством этого усиливается
- 9 008762 узнавание В-лимфоцитами нативной молекулы.
В одном предпочтительном варианте вводят ковалентно или нековалентно боковые группы (в виде чужеродных Т-клеточных эпитопов или вышеупомянутых первой, второй или третьей частей молекулы). Это должно означать, что отрезки аминокислотных остатков, происходящие из амилоидогенного полипептида, дериватизируют без изменения первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без введения изменений в пептидные связи между индивидуальными аминокислотами в данной цепи.
В альтернативном - и предпочтительном - варианте используют замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавку аминокислот (которые могут выполняться рекомбинантными способами или с использованием пептидного синтеза; модификации, которые включают в себя более длинные отрезки аминокислот, могут приводить к образованию слитых полипептидов). Одной особенно предпочтительной версией этого варианта является способ, описанный в ^О 95/05849, где описан способ супрессии аутологичных белков путем иммунизации аналогами аутологичных белков, где ряд аминокислотных последовательностей был заменен соответствующим рядом аминокислотных последовательностей, каждая из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, при сохранении в то же самое время в целом третичной структуры аутологичного белка в данном аналоге.
Однако для целей данного изобретения достаточно, если модификация (инсерция, добавка, делеция или замена) приводит к образованию чужеродного Т-клеточного эпитопа и в то же самое время сохраняет значительное число В-клеточных эпитопов в амилоидогенном полипептиде. Однако для получения максимальной эффективности индуцируемой иммунной реакции предпочтительно, чтобы вся третичная структура амилоидогенного полипептида сохранялась в модифицированной молекуле.
Следующая формула описывает молекулярные конструкции, включенные в общем виде в данное изобретение:
(М001)81(аМИЛОИДе1)п1(М002)82(аМИЛОИДе2)п2.-.(МООх)5х(аМИЛОИДех)пх (I) где амилоиде1-амилоидех являются х В-клеточными эпитопами, содержащими субпоследовательности амилоидогенного полипептида, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродные боковые группы, х равно целому числу > 3, п1-пх равны х целым числам > 0 (по меньшей мере один из них > 1), ΜΟΌ1-ΜΟΌΧ являются х модификациями, вводимыми между сохраненными В-клеточными эпитопами, а 81-8х являются х целыми числами > 0 (по меньшей мере один из них > 1, если в последовательности амилоидаех не введены боковые группы). Таким образом, при условии общих функциональных ограничений в отношении иммуногенности этих конструкций, данное изобретение делает возможными все типы пермутаций первоначальной последовательности амилоидогенного полипептида и все типы модификаций в ней. Таким образом, в данное изобретение включены модифицированные амилоидогенные полипептиды, полученные опущением частей последовательности амилоидогенного полипептида, которые проявляют неблагоприятные эффекты ш νίνο, или опущением частей, которые могли бы вызвать нежелательные иммунологические реакции.
Предпочтительными версиями конструкций, описанных выше, являются, если это применимо, конструкции, в которых содержащая В-клеточный эпитоп субпоследовательность амилоидного белка не является экспонированной внеклеточно в полипептиде-предшественнике, из которого произведен этот амилоид. При таком выборе амилоидных эпитопов гарантируется, что не вырабатываются антитела, которые могли бы быть реактивными в отношении клеток, продуцирующих предшественник амилоида, и посредством этого иммунная реакция, которая генерируется, становится ограниченной иммунной реакцией против нежелательных амилоидных отложений. Когда это применимо, подобный выбор может быть сделан для других амилоидогенных полипептидов, которые не являются амилоидом. В этих случаях будет, например, легко индуцировать иммунитет против эпитопов амилоидогенного полипептида, которые являются экспонированными во внеклеточной фазе только в том случае, когда они свободны от какого-либо связывания с клетками, из которых они получены.
Сохранение существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, который подвергают модификации, как описано здесь, может быть достигнуто несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против амилоидогенного полипептида (например, антисыворотки, полученной у кролика), и после этого применение этой антисывороки в качестве тест-реагента (например, в конкурентном методе ЕЫ8А) против модифицированных белков, которые продуцируются. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в той же самой степени с этой антисывороткой, что и амилоидогенный полипептид, должны рассматриваться как имеющие общую третичную структуру, какую имеет амилоидогенный полипептид, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность в отношении такой антисыворотки, рассматриваются как имеющие сохраненную существенную фракцию первоначальных эпитопов В-клеток.
Альтернативно, может быть приготовлен набор моноклональных антител, реагирующих с отдельными эпитопами на амилоидогенном полипептиде, и использован в качестве тест-панели. Этот подход имеет следующие преимущества: 1) позволяет картировать эпитопы амилоидогенного полипептида и 2)
- 10 008762 позволяет картировать эпитопы, которые сохраняются в полученных аналогах.
Конечно, третий подход мог бы раскрыть трехмерную структуру амилоидогенного полипептида или его биологически активного укороченного фрагмента (см. выше) и сравнить ее с раскрытой трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть выяснена при помощи исследований дифракции рентгеновских лучей и ЯМР-спектроскопии. Дополнительная информация о третичной структуре может быть до некоторой степени получена из исследований кругового дихроизма, которые имеют преимущество, заключающееся в том, что требуется лишь полипептид в чистом виде (тогда как дифракция ренгеновских лучей требует обеспечения кристаллического полипептида, а ЯМР требует обеспечения изотопных вариантов этого полипептида) для получения ценной информации о третичной структуре конкретной молекулы. Однако в конечном счете дифракция рентгеновских лучей и/или ЯМР являются необходимыми для получения окончательных данных, так как круговой дихроизм обеспечивает лишь косвенное доказательство правильной трехмерной структуры через информацию об элементах вторичной структуры.
В одном из предпочтительных вариантов данного изобретения используются множественные представления В-лимфоцитарных эпитопов амилоидогенного полипептида (т.е. формулы I, где присутствует по меньшей мере один В-клеточный эпитоп в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными путями, например путем простого получения слитых полипептидов, содержащих структуру (амилоидогеннный полипептид)т, где т равно целому числу > 2, и затем путем введения обсуждаемых здесь модификаций по меньшей мере в одну из последовательностей амилоида. Предпочтительно вводимые модификации включают в себя по меньшей мере одну дупликацию эпитопа В-лимфоцитов и/или введение гаптена. Эти варианты, включающие в себя множественное представление выбранных эпитопов, особенно предпочтительны в ситуациях, когда лишь небольшие части амилоидогенного полипептида применимы в качестве компонентов в вакцинном агенте.
Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено введением по меньшей мере одной инсерции, одной добавки, одной делеции или замены аминокислоты. Конечно, нормальной ситуацией будет введение более чем одного изменения в аминокислотной последовательности (например, инсерции или замены полным Т-клеточным эпитопом), но важной задачей, которая должна быть достигнута, является то, что этот аналог при процессировании антигенпредставляющей клеткой (АРС) будет приводить к появлению такого чужеродного Т-клеточного эпитопа, представленного в контексте молекулы МНС Класса II, на поверхности АРС. Таким образом, если аминокислотная последовательность амилоидогенного полипептида в подходящем положении содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также обнаружены в чужеродном Тн-эпитопе, то введение чужеродного Тн-эпитопа может быть выполнено обеспечением остальных аминокислот чужеродного эпитопа посредством аминокислотных инсерции, добавок, делеций и замен. Другими словами, введение полного Тн-эпитопа путем инсерции или замены не является обязательным для удовлетворения цели данного изобретения.
Предпочтительно число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавок равно по меньшей мере 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 инсерциям, заменам, добавкам или делециям. Кроме того, предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавок не превышало 150, например было не более 100, не более 90, не более 80 и не более 70. Особенно предпочтительно, чтобы число инсерций, делеций, замен или добавок не превышало 60, и в частности, это число не должно превышать 50 или даже 40. Более предпочтительно это число не должно быть более 30. Что касается добавок аминокислот, следует отметить, что они, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, часто составляют число более 150.
Предпочтительные варианты данного изобретения включают в себя модификацию путем введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Должно быть понятно, что иммунодоминирование Т-клеточного эпитопа зависит от рассматриваемого вида животного. В применении здесь, «иммунодоминирование» означает просто эпитопы, которые в вакцинированном животном/популяции индуцируют значимую иммунную реакцию, но хорошо известным фактом является то, что Т-клеточный эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме/одной популяции, не обязательно является иммунодоминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже хотя он может быть способным связывать молекулы МНС-11 в последнем индивидууме. Таким образом, для целей данного изобретения, иммунодоминантным Т-клеточным эпитопом является Т-клеточный эпитоп, который будет эффективным в обеспечении помощи Т-клеток в случае присутствия его в антигене. Обычно иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы имеют в качестве неотъемлемого признака то, что они будут, по существу, всегда представляться в связанном с молекулой МНС Класса II виде, независимо от полипептида, в котором они присутствуют.
Другим важным моментом является вопрос о МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов. Обычно природно встречающиеся Т-клеточные эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенные пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с субпопуляцией молекул МНС Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев применение одного специфического Т-клеточного эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который яв- 11 008762 ляется эффективным только во фракции этой популяции, и в зависимости от размера этой фракции может быть необходимым включать больше Т-клеточных эпитопов в одну и ту же молекулу или альтернативно готовить многокомпонентную вакцину, в которой эти компоненты являются вариантами амилоидогенного полипептида, которые отличаются друг от друга характером введенного Т-клсточного эпитопа.
Если МНС-рестрикция используемых Т-клеток является полностью неизвестной (например, в ситуации, где вакцинированное животное имеет слабо определенный состав МНС), фракция этой популяции, включаемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы:
п /мрикШоп = 1 -П0 ~Р/) (II) /-1 где р; означает частоту встречаемости в популяции респондеров на ΐ-тый чужеродный Т-клеточный эпитоп, присутствующий в вакцинной композиции, а η означает общее число чужеродных Т-клеточных эпитопов в этой вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющих частоты встречаемости в популяции 0,8, 0,7 и 0,6 соответственно, будет иметь 1-0,2x0,3x0,4=0,976, т.е. 97,6% этой популяции будет статистически формировать МНС-Попосредованную реакцию на эту вакцину.
Приведенная выше формула неприменима в ситуациях, где известна более или менее точная картина МНС-рестрикции пептидов. Если, например, определенный пептид связывает только молекулы МНС11 человека, кодируемые ΗΕΑ-ϋΚ-аллелями ΌΚ1, ΌΚ3, ΌΚ5 и ΌΚ7, то использование этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы МНС-П, кодируемые ΗΕΑ-ΌΚаллелями, будет охватывать 100% в рассматриваемой популяции. Подобным образом, если второй пептид связывает только ΌΚ3 и ΌΚ5, добавление этого пептида вообще не будет увеличивать этот охват. Если основывать расчет реакции популяции только на МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов в вакцине, фракция популяции, охватываемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы:
з /рорт/ЙМи! = 1 “71(1 (III) где (¾ является суммой частот встречаемости в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к ΐ-тому из 3 известных НЬА-локусов (ΌΡ, ΌΚ и ЭР); на практике сначала определяют, какие молекулы МНС будут узнавать каждый Т-клеточный эпитоп в данной вакцине, а после этого их вносят в списки по типу (ЭР, ΌΚ и ЭР), затем индивидуальные частоты встречаемости этих находящихся в различных списках аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, получая посредством этого цц, φ2 и φ3.
Может быть случай, когда величина р; в формуле II превышает соответствующую теоретическую величину р;
^=1“По~у?2 <ιν>
7=1 где V) является суммой частот встречаемости в популяции аллельного гаплотипа, кодирующего молекулы МНС, которые связывают Т-клеточный эпитоп с ΐ-тым в данной вакцине и которые принадлежат к ΐтому из 3 известных НЕА-локусов (ЭР, ΌΚ и ΌΡ). Это означает, что в 1-р; этой популяции частота встречаемости респондеров Γ0οτ3τοκ-ί=(Ρί-Ρί)/(1-Ρί)· Таким образом, формула III может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу V /^«,»=1-110-^+(1-11(1-/-^)] <у) где термин Ι-φ(Κ·ΙίΠοΚ-ί устанавливается на нуль, если он является отрицательным. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все элитопы были гаплотипами, картированными относительно идентичного набора гаплотипов.
Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог важно включить все знание об этих эпитопах, которое является доступным: 1) частоту встречаемости респондеров в популяции относительно каждого эпитопа, 2) данные МНС-рестрикции и 3) частоту встречаемости в популяции релевантных гаплотипов.
Существует ряд природно встречающихся «смешанных» Т-клеточных эпитопов, которые являются активными у большей части индивидуумов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в вакцину, уменьшая посредством этого необходимость в очень большом числе различных аналогов в одной и той же вакцине.
Смешанным эпитопом может быть, в соответствии с данным изобретением, природно встречающийся Т-клеточный эпитоп человека, такой как эпитопы из столбнячного токсоида (например, эпитопы Р2 и РЗО), дифтерийный токсоид, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и антиген С8 Р. 1а1с1рагит.
На протяжении ряда лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В
- 12008762 частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую фракцию молекул НЬАНК, кодируемых различными аллелялми НЬА-НК, и они все являются Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги, используемые в соответствии с данным изобретением. См. также эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, которые включены тем самым в качестве ссылки здесь: νθ 98/23635 (Ггахсг 1.Н. е! а1., а881диеб !о Тйе Ишуегвйу о£ ОнеепЧапб); δοιι11ι\νοοά δ. е! а1., 1998, 1. 1ттипо1. 160: 3363-3373/ 81П1дад11а Р. е! а1., 1988, Ыа1иге 336: 778-780; ΟΗίοζ К.М. е! а1., 1993, 1. Ехр. Меб. 178: 27-47; Наттег 1. е! а1., 1993, Се11 74: 197-203; и Ра1к К. е! а1., 1994, 1ттиподепебс5 39: 230-242. В последней ссылке также рассматриваются лиганды НЬА-ОЦ и -ЭР. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, уместны в качестве природных эпитопов-кандидатов для использования в данном изобретении, как и эпитопы, которые имеют с ними общие мотивы.
Альтернативно, этим эпитопом может быть любой синтетический Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую часть молекул МНС Класса II. В этом контексте, паи-НК-эпитопные пептиды (РАОКЕ), описанные в νθ 95/07707 и в соответствующей статье А1ехаибег 1. е! а1., 1994, 1ттиш!у 1: 751-761 (оба описания включены здесь в качестве ссылки), являются представляющими интерес кандидатами для эпитопов для применения в соответствии с данным изобретением. Следует отметить, что большинство эффективных пептидов РАНКЕ, описанных в этих статьях, несут Ό-аминокислоты на С- и Ν-концах для улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение прежде всего нацелено на включение подходящих эпитопов в качестве части модифицированного амилоидогенного полипептида, которая должна быть затем отщеплена ферментативно в лизосомном компартменте АРС для возможности презентации в контексте молекулы МНС-ΙΙ, и, следовательно, нецелесообразно включать Ό-аминокислоты в эпитопы, используемые в данном изобретении.
Одним особенно предпочтительным пептидом РАНКЕ является пептид, имеющий аминокислотную последовательность ΛΚΡνΛΛνΤΡΚΛΛΛ или ее иммунологически эффективную субпоследовательность. Этот эпитоп и другие эпитопы, имеющие то же самое отсутствие МНС-рестрикции, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах, используемых в способе данного изобретения. Такие суперсмешанные эпитопы сделают возможными наиболее простые варианты данного изобретения, в которых только единственный модифицированный амилоидогенный полипептид представляется иммунной системе вакцинированного животного.
Как упоминалось выше, модификация амилоидогенного полипептида может также включать в себя введение первой части молекулы, которая нацеливает модифицированный амилоидогенный полипептид на АРС или В-лимфоцит. Например, первой частью молекулы может быть партнер специфического связывания для специфического поверхностного антигена В-лимфоцитов или АРС-специфического поверхностного антигена. Многие такие специфические поверхностные антигены известны в данной области. Например, эта часть молекулы может быть углеводом, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или АРС (например, маннаном или маннозой). Альтернативно, вторая часть молекулы может быть гаптеном. Фрагмент антитела, который специфически узнает поверхностную молекулу на АРС или лимфоцитах, может быть использован в качестве первой части молекулы (поверхностной молекулой может, например, быть РСу-рецептор макрофагов и моноцитов, такой как РСуК1, или, альтернативно любой другой специфический поверхностный маркер, такой как С.Н40 или СТЬА-4). Следует отметить, что все приводимые в качестве примеров нацеливающие молекулы могут быть использованы в виде части адъюванта, см. ниже.
В качестве альтернативы или дополнения к нацеливанию модифицированного амилоидогенного полипептида на определенный тип клеток для получения усиленной иммунной реакции, можно увеличить уровень отвечаемости иммунной системы путем включения вышеуказанной второй части молекулы, которая стимулирует иммунную систему. Типичными примерами таких вторых частей молекулы являются цитокины и белки теплового шока или молекулярные шапероны, а также их эффективные части.
Подходящими цитокинами для применения в соответствии с данным изобретением являются цитокины, которые будут обычно также функционировать в качестве адъювантов в вакцинной композиции, т.е., например, интерферон γ (ΙΡΝ-γ), интерлейкин 1 (ΙΗ-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь-4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Б-12). интерлейкин 13 (1Б-13), интерлейкин 15 (1Б-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р); альтернативно, функциональная часть молекулы цитокина может быть достаточной в качестве второй части молекулы. В отношении применения таких цитокинов в качестве адъювантных веществ см. обсуждение ниже.
Согласно данному изобретению подходящими белками теплового шока или молекулярными шаперонами, используемыми в качестве второй части молекулы, могут быть Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, ОКР94 (также известный как др96, см. ’№еаг8сй Р.А. е! а1., 1998, ВюсйетМгу 37: 5709-19) и СКТ (кальретикулин).
Альтернативно, второй частью может быть токсин, такой как листериолицин (ЬЬО), липид А и термолабильный энтеротоксин. Ряд микобактериальных производных, таких как МЭР (мурамилдипелтид), СРА (полный адъювант Фрейнда) и диэфиры трегалозы ТНМ и ТНЕ, также являются представляющими интерес возможностями.
- 13 008762
Возможность введения также третьей части молекулы, которая усиливает представление модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе, является важным вариантом данного изобретения. В данной области было показано несколько примеров этого принципа. Например, известно, что якорь пальмитоиллипидирования в белке ОкрА Воггейа ЬигцбогГеп может быть использован таким образом, чтобы обеспечить самоадъювантные полипептиды (см., например, \¥О 96/40718), по-видимому, липидированные белки образуют мицеллоподобные структуры с центральной частью, состоящей из якорных частей липидирования полипептидов, и остальными частями молекулы, выступающими из нее, что приводит к множественным представлениям антигенных детерминант. Таким образом, применение этого и родственных подходов с использованием различных якорей липидирования (например, миристильной группы, миристильной группы, фарнезильной группы, геранил-геранильной группы, СР1-якоря и Ν-ацилдиглицеридной группы) являются предпочтительными вариантами данного изобретения, в частности, поскольку обеспечение такого якоря липидирования в рекомбинантно полученном белке является довольно простым и требует лишь применения, например, природно встречающейся сигнальной последовательности в качестве партнера слияния для модифицированного амилоидогенного полипептида. Другой возможностью является применение С3б-фрагмента фактора комплемента С3 или самого фактора С3 (см. Эетр^еу е! а1., 1996, Баеисе 271, 348-350 и Ьои апб КоЫег, 1998, №1Шге Вю!есйпо1оду 16, 458-462).
Альтернативным вариантом данного изобретения, который также приводит к предпочтительной презентации множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных районов эпитопов амилоидогенного полипептида иммунной системе, является ковалентное связывание амилоидогенного полипептида, его субпоследовательности или вариантов с определенными молекулами. Например, могут быть использованы полимеры, например углеводы, такие как декстран, см., например, Ьеек А. е! а1., 1994, Уассте 12: 1160-1166; Ьеек А. е! а1., 1990, 1 1ттипо1. 145: 3594-3600, но применимой альтернативой являются также манноза и маннан. Интегральные мембранные белки, например, из Е. сой и других бактерий, также являются применимыми партнерами конъюгации. Обычные молекулы-носители, такие как гемоцианин фиссуреллы (КЕН), столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид и бычий сывороточный альбумин (БСА) также являются предпочтительными и применимыми партнерами конъюгации.
Предпочтительные варианты ковалентного связывания амилоидогенного полипептида с полигидроксиполимерами, такими как углеводы, включают в себя применение по меньшей мере одного амилоидогенного полипептида и по меньшей мере одного чужеродного Т-хелперного эпитопа, которые связывают по отдельности с полигидроксиполимером (т. е. чужеродный Т-хелперный эпитоп и амилоидогенный полипептид не сливают друг с другом, а связывают с полигидроксиполимером, который затем служит в качестве остова-носителя). Опять же, такой вариант является наиболее предпочтительным, когда подходящие несущие В-клеточные эпитопы районы амилоидогенного полипептида состоят из коротких пептидных отрезков, это связано с тем, что такой подход очень удобен для получения множественных представлений выбранных эпитопов в полученном иммуногенном агенте.
Особенно предпочтительно, что связывание чужеродного Т-хелперного эпитопа и амилоидогенного (поли)пептида осуществляется посредством амидной связи, которая может расщепляться пептидазой. Эта стратегия имеет такой результат, что АРС будут способны поглощать этот конъюгат и одновременно будут способны процессировать конъюгат и затем представлять чужеродный Т-клеточный эпитоп в контексте МНС Класса II.
Одним из способов достижения связывания пептидов (как амилоидогенного полипептида, так и чужеродного эпитопа) является активация подходящего полигидроксиполимера трезильными группами; можно, например, приготовить трезилированные полисахариды, как описано в \УО 00/05316 и в патенте США И8 5874469 (оба включены в качестве ссылки здесь), и связать их с амилоидогенными пептидами и Т-клеточными эпитопами, полученными посредством способов общепринятого твердофазного пептидного синтеза или синтеза пептидов в жидкой фазе. Полученный продукт состоит из полигидроксиполимерного остова (например, декстранового остова), который имеет прикрепленные к нему их Ν-концами или другими доступными азотсодержащими частями молекул амилоидогенные полипептиды и чужеродные Т-клеточные эпитопы. Если желательно, можно синтезировать амилоидогенные полипептиды таким образом, чтобы защитить все доступные аминогруппы, кроме одной на Ν-конце, затем связать полученные защищенные пептиды с трезилированной декстрановой частью и, наконец, удалить защитные группы полученного конъюгата. Конкретный пример этого подхода описан в примерах ниже.
Вместо применения водорастворимых полисахаридных молекул, как описано в \УО 00/05316 и патенте США И8 5874469, равным образом можно использовать поперечносшитые полисахаридные молекулы, получая тем самым состоящий из частиц конъюгат между полипептидами и полисахаридом, считается, что это приводит к улучшенной презентации иммунной системе полипептидов, так как достигаются две задачи, а именно, получение эффекта локального депонирования при инъекции этого конъюгата и получение частиц, которые являются притягательными мишенями для АРС. Подход использования такой состоящей из частиц системы также подробно описан в примерах.
Рассмотрениями, лежащими в основе выбранных областей введения модификаций в амилоидогенных полипептидах, являются: а) сохранение известных и прогнозируемых В-клеточных эпитопов, Ь) со
- 14 008762 хранение третичной структуры, с) избегание В-клеточных эпитопов, присутствующих на «клеткахпродуцентах» и т.д. Во всяком случае, как обсуждалось выше, довольно легко подвергнуть скринингу набор модифицированных амилоидогенных молекул, все из которых были подвергнуты введению Тклеточного эпитопа в различных положениях.
Поскольку наиболее предпочтительные варианты данного изобретения включают в себя супрессию Ав человека, следовательно, предпочтительно, чтобы обсуждаемый выше амилоидный полипептид был полипептидом Ав человека. В этом варианте особенно предпочтительно, чтобы амилоидогенный полипептид человека был модифицирован заменой по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в 8ЕО ΙΌ N0:2 по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины и содержащей Тн-эпитоп. Предпочтительные примеры модифицированных амилоидогенных АРР и Ав показаны схематически на чертеже с использованием эпитопов Р2 и Р30 в качестве примеров. Обоснование таких конструкциий обсуждается подробно в этом примере.
Более конкретно, Тн, содержащий (или дополняющий) аминокислотную последовательность, которую вводят в 8Е0 ΙΌ N0:2, может быть введен в положении любой аминокислоты в 8Е0 ΙΌ N0:2. То есть введение возможно после любой из аминокислот 1-770, но предпочтительно после любой из аминокислот 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8ЕО ΙΌ N0:2. Это может комбинироваться с делецией любой из или всех аминокислот 1-671 или любой из или всех аминокислот 715-770. Кроме того, при использовании способа замены, любая из аминокислот 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8Е0 ΙΌ N0:2 может быть делетирована в комбинации с этим введением.
Приготовление амилоидогенного полипептида и модифицированных амилоидогенных полипептидов
При выполнении представления амилоидогенного полипептида или модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе животного посредством его введения животному приготовление этого полипептида соответствует принципам, обычно признаваемым в данной области.
Приготовление вакцин, которые содержат пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как иллюстрируется приведенными в качестве примеров патентами США 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, которые включены здесь в качестве ссылки. Обычно такие вакцины готовят в виде инъекционных материалов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т. п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поддерживающие рН агенты или адъюванты, которые усиливают эффективность вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов ниже.
Вакцины обычно вводят парентерально, путем инъекции, например подкожно, внутрикожно, интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые пригодны для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, подъязычные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные композиции. Для суппозиториев обычные связывающие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно применяемые наполнители, как, например, фармацевтически чистый маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для пероральных композиций представляющим интерес партнером композиции является холерный токсин (он является также возможным партнером конъюгации).
Полипептиды могут быть приготовлены в форме вакцины в виде нейтральной или солевой форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами пептида), которые образованы с неорганическими кислотами, такими, например, как хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или с такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа (ΙΙΙ), и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.
Вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от субъекта,
- 15 008762 проходящего лечение, в том числе, например, способности иммунной системы индивидуума осуществлять иммунную реакцию и степени желаемой защиты. Подходящими диапазонами доз являются дозы порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на одну вакцинацию с предпочтительным диапазоном приблизительно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматриваются даже более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне приблизительно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг, и в частности в диапазоне приблизительно от 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для первоначального введения и бустерных инъекций также являются вариабельными, но обычно предусматривают первоначальное введение с последующими инокуляциями или иными введениями.
Способ введения может широко варьироваться. Любые из общепринятых способов введения вакцины являются применимыми. Они включают в себя пероральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, посредством инъекции или т. п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет меняться в соответствии с возрастом лица, которое должно вакцинироваться, и композиции антигена.
Некоторые полипептиды данной вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунная реакция усиливается, если вакцина дополнительно содержит адъювантное вещество.
Различные способы получения адъювантного действия этой вакцины являются известными. Общие принципы и способы подробно описаны в Т11е Тйеогу апй Ргасйса1 АррйсаИоп о£ Ай^апГз, 1995, Эппсам Е.8. 81е\уаг(-Ти11 (ей.), 1ойп ^Неу апй 8опз ЬГй, 18ВЫ 0-471-95170-6, а также в Уасстез: №\ν СепегаПоп 1ттипо1одюа1 Ай)^апГз, 1995, СгедопаФз С. еГ а1. (ейз.), Р1епит Ргезз, №\ν Уогк, 18ВЫ 0-30645283-9, включенных здесь в качестве ссылки.
Особенно предпочтительно использование адъюванта, который, как можно продемонстрировать, облегчает разрушение аутотолерантности к аутологичным антигенам; действительно, это является существенным в случаях, когда немодифицированный амилоидогенный полипептид используют в качестве активного ингредиента в аутовакцине. Неограничительные примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из иммунонацеливающего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллы адъюванта; сапонина; матрикса иммуностимулирующего комплекса (матрикса 18СОМ); частицы; ΌΌΑ; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина; и инкапсулирующего адъюванта. В общем следует отметить, что приведенное выше описание, относящееся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в аналогах, относится также, при соответствующих изменениях, к их применению в адъюванте вакцины согласно изобретению.
Применения адъювантов включают в себя применение таких агентов, как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1% раствора в забуференном солевом растворе, смесей с синтетическими полимерами сахаров (например, Карбопол®), применяемых в виде 0,25% раствора, возможными являются агрегирование белка в вакцине путем тепловой обработки при температурах между 70 и 101°С в течение периода 30 с-2 мин соответственно, а также агрегации с использованием сшивающих агентов. Могут также использоваться агрегация посредством повторной активации обработанными пепсином антителами (РаЬ-фрагментами) с альбумином, смесь с бактериальными клетками, такими как С. рагуит, или эндотоксинами, или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульсия в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как маннидмоноолеат (Агасе1 А), или эмульсия с 20% раствором перфторуглерода (Р1иозо1-ОА), используемого в качестве заменителя блока. Смесь с маслами, такими как аквален и 1РА, также является предпочтительной.
Согласно изобретению ЭВА (диметилдиоктадециламмонийбромид) является перспективным кандидатом в качестве адъюванта, так же как ДНК и γ-инулин, но также большой интерес представляют полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины ОиШага, такие как ЦиНА и Ц821, а также К1В1. Возможно также применение монофосфориллипида А (МРЬ), вышеупомянутых С3 и С3й и мурамилдипептида (МБР).
Известно также, что липосомные композиции придают адъювантные свойства, и, следовательно, липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением.
Согласно данному изобретению предпочтительными являются также адъюванты типа матрикса иммуностимулирующего комплекса (матрикс 18СОМ®), в частности, потому, что было показано, что этот тип адъювантов способен положительно регулировать экспрессию МНС Класса II клетками АРС. Матрикс 18СОМ® состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) из Цш11а_)а заропапа, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная состоящая из частиц композиция представляет собой то, что называют частицей 18СОМ, где сапонин составляет 60-70% (масса/масса), холестерин и фосфолипид 10-15% (масса/масса) и белок 10-15% (масса/масса).
Подробности, касающиеся состава и применения иммуностимулирующих комплексов, могут быть, например, найдены в вышеупомянутых руководствах по адъювантам, но также Могет В. е1 а1., 1995,
- 16 008762
С1ш. ΙιηιηιιηοΙΙκΓ. 3: 461-475, а также Вагг Ι.6. ;·ιηά Мйсйе11 6.Р., 1996, ^тию^ ;·ιηά Се11 Βίο1. 74: 8-25 (включенных здесь в качестве ссылки) обеспечивают полезные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов.
Другой крайне интересной (и, следовательно, предпочтительной) возможностью получения адъювантного действия является применение способа, описанного в Οο8!^1ίη е! а1., 1992 (включенной здесь в качестве ссылки). Вкратце, представление подходящего антигена, такого как антиген согласно изобретению, может быть усилено путем конъюгации этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Рсу-рецепторов на моноцитах/макрофагах. Было показано, в частности, что конъюгаты между антигеном и анти- РсуК1 усиливают иммуногенность для целей вакцинации.
Другие возможности включают в себя применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (кроме прочего, цитокинов), упомянутых выше в качестве кандидатов для первой, второй и третьей частей в модифицированных версиях амилоидогенных полипептидов. В этой связи, синтетические индукторы цитокинов, такие как поли 1:С, также являются возможными вариантами.
Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, ΚΙΒΙ и диэфира трегалозы, такого как ТОМ и ΤΌΕ.
Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбраны из группы, состоящей из лиганда ί.Ό40 и антител ί.Ό40 или их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, РаЬфрагмента и СТЬА-4.
Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера, такого как латекс, например латексные гранулы.
Еще одним интересным способом модуляции иммунной реакции является включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в «виртуальный лимфатический узел» (ΥΣΝ) (запатентованное медицинское устройство, разработанное IттиποΤйе^ару, Шс., 360 ΕΌ.χίηβΙοη Ауегше, Νο\ν ΥοιΈ ΝΥ 10017-6501). УБ-Ν (тонкотрубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Путем введения ΥΈΝ под кожу создается сайт стерильного воспаления с увеличением количества цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АРС быстро отвечают на сигналы опасности, перемещаются в сайт воспаления и накапливаются в пористом матриксе ΥΈΝ. Было показано, что необходимая доза антигена, требующаяся для осуществления иммунной реакции на антиген, снижается с использованием ΥΈΝ и что иммунная защита, сообщаемая вакцинацией с использованием ΥΈΝ, превосходит общепринятую иммунизацию с использованием ΚΙΒΙ в качестве адъюванта. Способ, помимо прочего, описан вкратце у Се1Ьег С. е! а1., 1998, ΕΗαΕιΙίοη οί ΚοЬик! Се11и1аг ;·ιηά Нитο^а1 Ептине Κекрοπкек Ю Зта11 Αтοиπΐк οί Iттиποдеπ Иктд а Νο\ό1 МеШса1 Эеу1се ^ек^дπаΐеά Изе У1г1иа1 Ьутрй Νοώ;, ίη: Ргот 1йе ^аЬο^аΐο^у Ю 1йе СНщк, ΒοοΕ οί АЬЧгасК ОсЮЬег 124Ь-154Ь 1998, Зеаксаре Кебюй, АрЮк, Са1ИЬгша.
Было показано, что состоящая из микрочастиц композиция во многих случаях увеличивает иммуногенность белковых антигенов и является, следовательно, следующим предпочтительным вариантом данного изобретения. Микрочастицы либо готовят в виде совместных композиций антигенов с полимером, липидом, углеводом или другими молекулами, пригодными для приготовления частиц, либо микрочастицы могут быть гомогенными частицами, состоящими только из самого антигена.
Примерами микрочастиц на основе полимеров являются частицы на основе РБСА и РУР (Сир1а, К.К. е! а1. 1998), где полимер и антиген конденсированы в твердую частицу. Частицы на основе липидов могут быть приготовлены в виде мицелл липида (так называемых липосом), заключающих антиген в мицелле (Р^еί^οЬοπ, Р.1. 1995). Частицы на основе углеводов обычно готовят из подходящего деградируемого углевода, такого как крахмал или хитозан. Углевод и антиген смешивают и конденсируют в частицы в способе, сходном со способом, используемым для полимерных частиц (Как Н.З. е! а1. 1997).
Частицы, состоящие только из антигена, могут быть приготовлены различными способами распыления и лиофилизации. В частности, для целей данного изобретения пригоден способ с жидкостью в надкритическом состоянии, который используют для получения очень однородных частиц контролируемого размера (ΥοΑ, Р. 1999 амй δΙκΕί-Πίον, В. е! а1. 1999).
Ожидается, что вакцина должна вводиться 1-6 раз в год, например 1, 3, 3, 4, 6 или 6 раз в год, индивидууму, нуждающемуся в этом. Ранее было показано, что иммунная память, индуцированная применением предпочтительных аутологичных вакцин в соответствии с данным изобретением, не является перманентной, и следовательно, иммунная система нуждается в периодической стимуляции амилоидогенным полипептидом или модифицированными амилоидогенными полипептидами.
Вследствие генетической изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать посредством иммунных реакций различной силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина в соответствии с данным изобретением может содержать несколько различных полипептидов, для того чтобы усиливать иммунную реакцию, см. также обсуждение, приведенное выше, касающееся выбора введения чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцина может содержать два или несколько полипептидов, где все эти полипептиды являются такими, как описанные выше.
- 17 008762
Вакцина может, следовательно, содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных полипептидов.
Вакцинация нуклеиновыми кислотами
В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе пептидов, технология вакцинации нуклеиновыми кислотами (также известная как «иммунизация нуклеиновыми кислотами», «генетическая иммунизация» и «генная иммунизация») предоставляет ряд привлекательных признаков.
Во-первых, в противоположность традиционному подходу к вакцинам, вакцинация нуклеиновыми кислотами не требует ресурсопотребляющего крупномасштабного производства иммуногенного агента (например, в форме ферментации промышленного масштаба микроорганизмов, продуцирующих модифицированные амилоидогенные полипептиды). Кроме того, нет необходимости очистки устройства и схем повторной упаковки (рефолдинга) иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основана на биохимическом аппарате вакцинированного индивидума для продуцирования продукта экспрессии введенной нуклеиновой кислоты, ожидается, что происходит оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, так как, как упоминалось выше, значительная фракция оригинальных В-клеточных эпитопов должна быть сохранена в модифицированной молекуле и так как В-клеточные эпитопы в принципе могут быть составлены частями любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, природные картины гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть очень важны для общей иммуногенности, и это наилучшим образом обеспечивается наличием хозяина, продуцирующего иммуноген.
Таким образом, предпочтительный вариант данного изобретения предусматривает осуществление представления модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе путем введения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей модифицированный амилоидогенный полипептид, в клетки животного и получения посредством этого экспрессии ίη νίνο клетками введенной нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
В этом варианте введенной нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК, которая может быть в форме голой ДНК, ДНК, приготовленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, приготовленной в липосомах, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, приготовленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, приготовленной с осаждающими кальций агентами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимере, например, в РЬСЛ (см. способ микроинкапсулирования, описанный в νΟ 98/31398), или в хитине или хитозане, и ДНК, приготовленной с адъювантом. В этом контексте, следует отметить, что практически все соображения, относящиеся к применению адъювантов в традиционной вакцинной композиции, применимы также в отношении композиции ДНК-вакцин. Таким образом, все описания здесь, которые относятся к применению адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, применимы, при соответствующих изменениях, к их использованию в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами.
Что касается способов введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые были подробно описаны выше, они применимы также для вакцин на основе нуклеиновых кислот данного изобретения, и все обсуждения, приведенные выше, относящиеся к способам введения и схемам введения для полипептидов, применимы, с соответствующими изменениями, к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть удобным образом введены внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что вакцины нуклеиновых кислот могут вводиться с использованием так называемого генного пистолета, и следовательно, также и этот, и эквивалентные варианты введения рассматриваются как часть данного изобретения. Наконец, сообщалось также, что применение УБЫ при введении нуклеиновых кислот дает хорошие результаты, и, следовательно, этот конкретный вариант введения является особенно предпочтительным. Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать районы, кодирующие первую, вторую и/или третью части молекулы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или по меньшей мере под контролем различных промоторов. Тем самым избегается то, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента, но это является менее предпочтительным вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии при наличии обоих кодирующих районов, включенных в одну и ту же молекулу.
Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования антител против амилоидогенного полипептида, причем эта композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор данного изобретения (см. обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант, обсуждаемые выше.
При обычных обстоятельствах кодирующую вариант нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора,
- 18 008762 в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробных обсуждений векторов данного изобретения см. обсуждение ниже. Подробные описания, относящиеся к приготовлению и применению вакцин на основе нуклеиновых кислот, являются также доступными, см. ЭопсПу 1.1. с! а1. 1997, Аппи. Всу. 1ттипо1. 15: 617-648 и ЭопсПу 1.1. с! а1., 1997, ЬИс 8с1спсс8 60: 163-172. Обе эти работы включены здесь в качестве ссылки.
Живые вакцины
Третьей альтернативой для выполнения представления модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе является применение технологии живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами представление иммунной системе выполняют путем введения животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим амилоидогенный полипептид, или вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим аттенюированным бактериальным штаммом (аттенюированным посредством пассирования или посредством удаления продуктов экспрессии патогена технологией рекомбинантных ДНК), например, МусоЬас!сгшт Ьоу18 ВСС., непатогенными 81гср1ососси5 крр., Е. сой, 8а1топс11а зрр., У1Ьгю сМсгас, 8Ыдс11а, и т.д. Обзоры, рассматривающие приготовление живых вакцин существующего уровня техники, могут быть найдены, например, в 8а1юи Р., 1995, Всу. Рга!. 45: 1492-1496 и \Уа1ксг Ρ.Ό., 1992, Уасстс 10: 977-990, обе работы включены здесь в качестве ссылки. В отношении подробностей о фрагментах нуклеиновых кислот и векторах, используемых в таких живых вакцинах, см. обсуждение ниже.
В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения, обсуждаемый ниже, может быть включен в содержащую невирулентный вирус вакцину, например штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус (вирус оспы).
Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному только один раз, но в некоторых случаях может быть необходимым введение этого микроорганизма более одного раза, в течение жизни для поддержания защитного иммунитета. Предполагается даже, что при использовании живой или вирусной вакцин будут применимы схемы иммунизации, аналогичные описанным подробно выше для полипептидной вакцинации.
Альтернативно, живую или вирусную вакцинацию комбинируют с предварительной или последующей вакцинацией полипептидом и/или нуклеиновыми кислотами. Например, можно выполнять первичную вакцинацию живой или вирусной вакциной с последующими бустерными иммунизациями с использованием такого же подхода, как с полипептидом или нуклеиновой кислотой.
Микроорганизм или вирус может быть трансформирован нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами), содержащей районы, кодирующие первую, вторую или третью части молекулы, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или по меньшей мере под контролем различных промоторов. Тем самым избегают того, что аналог или эпитопы продуцируются в виде партнеров слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно, наличие первой, и/или второй, и/или третьей частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечивать в качестве продукта экспрессии аналог данного изобретения, и такой вариант является особенно предпочтительным в соответствии с данным изобретением.
Применение способа данного изобретения в лечении заболеваний
Как должно быть понятно из приведенного выше обсуждения, обеспечение способов данного изобретения позволяет осуществлять контроль над заболеваниями, характеризующимися амилодными отложениями. В данном контексте, БА является ключевой мишенью для способа данного изобретения, но также и другие болезни, характеризующиеся отложениями амилоида, являются возможными мишенями. Таким образом, важный вариант способа данного изобретения для супрессии активности амилоида предусматривает лечение, и/или предупреждение, и/или ослабление БА или других заболеваний, характеризующихся отложениями амилоида, причем данный способ предусматривает супрессию данного изобретения до такой степени, чтобы количество амилоида значимо уменьшалось.
Особенно предпочтительно, чтобы уменьшение амилоида приводило к инверсии баланса между образованием амилоида и деградацией/удалением амилоида, т.е. чтобы скорость деградации/удаления амилоида была доведена до скорости, превышающей скорость образования амилоида. Посредством тщательной регуляции числа и иммунологического влияния иммунизации индивидуума, нуждающегося в этом, можно будет получить баланс во времени, что приводит к уменьшению амилоидных отложений без избыточных вредных эффектов.
Альтернативно, если у индивидуума способ данного изобретения не может удалять или уменьшать существующие отложения амилоида, способ данного изобретения может быть использован для получения клинически значимого уменьшения образования новых амилоидных отложений, с пролонгированием тем самым периода, в течение которого состояние болезни не ухудшается. Можно было бы осуществлять мониторинг скорости отложения амилоида либо путем измерения концентрации амилоида в сыворотке
- 19 008762 (которая, как считается, находится в равновесии с депонируемым материалом), либо путем применения сканирования с использованием позитронной эмиссионной томографии (РЕТ), см. 8та11 С.XV.. е1 а1., 1996, Αηη Ν. Υ. Асаб 8с1 802: 70-78.
Другие заболевания и состояния, где средства и способы данного изобретения могут быть использованы в лечении или ослаблении заболевания аналогичным образом, были упомянуты выше в «Предпосылках изобретения» (системный амилоидоз, диабет взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, лобно-височная деменция и связанные с прионами трансмиссивные губчатые энцефалопатии) или перечислены ниже в разделе, озаглавленном «другие связанные с амилоидом заболевания и белки, ассоциированные с ними».
Пептиды, полипептиды и композиции данного изобретения
Как будет очевидно из приведенной выше информации, данное изобретение основано на концепции иммунизации индивидуумов против амилоидогенного антигена для получения уменьшенного количества связанных с патологией отложений амилоида. Предпочтительным путем получения такой иммунизации является применение модифицированных версий амилоидогенного полипептида, с получением тем самым молекул, которые не были описаны ранее в данной области.
Считается, что модифицированные молекулы, обсуждаемые здесь, являются патентноспособными сами по себе, и, следовательно, важная часть данного изобретения относится к аналогу, который получен из амилоидогенного полипептида животного, в который введена модификация, что приводит к тому, что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител, специфически реагирующих с немодифицированным амилоидогенным полипептидом. Предпочтительно, характер этой модификации соответствует типам модификаций, описанных выше при обсуждении различных вариантов способа данного изобретения с использованием модифицированного амилоидогенного полипептида. Таким образом, любое описание, представленное здесь, относится к амилоидогенным молекулам, имеющим отношение к цели описания амилоидогенных аналогов данного изобретения, и любое из таких описаний относится, с соответствующими изменениями, к описанию этих аналогов.
Следует отметить, что предпочтительные модифицированные амилоидогенные молекулы содержат модификации, которые приводят к образованию полипептида, имеющего идентичность последовательности по меньшей мере 70% с амилоидогенным белком или с его субпоследовательностью длиной по меньшей мере в 10 аминокислот. Более высокая степень идентичности последовательностей является предпочтительной, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%.
Идентичность последовательностей белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как (\.е,· - ΝΗ|[)· 100/Νιν[: где Ν,|ι(- означает общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при их сопоставлении и где Ни означает число остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК АСТСАСТС будет на 75% идентична последовательности ААТСААТС (Ни = 2 и V., = 8).
Данное изобретение относится также к композициям, применимым в использовании на практике способа данного изобретения. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество амилоидогенного полипептида, который является аутологичным белком у животного, причем указанный амилоидогенный полипептид готовят вместе с иммунологически приемлемым адъювантом таким образом, чтобы разрушить аутотолерантность животного в отношении этого амилоидогенного полипептида, причем эта композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель, и/или формообразующий агент. Другими словами, эта часть данного изобретения относится к композициям природно встречающихся амилоидогенных полипептидов, которые описаны в связи с вариантами способа данного изобретения.
Данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель, и/или формообразующий агент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть изобретения относится к композициям модифицированного амилоидогенного полипептида, по существу, описанного выше. Выбор адъювантов, носителей и наполнителей находится в соответствии с тем, что обсуждалось выше при описании композиции модифицированного и немодифицированного амилоидогенного полипептида для применения в способе данного изобретения для супрессии амилоида.
Полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных генов, включающей в себя введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессию клеткой-хозяином этой последовательности нуклеиновой кислоты, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующую очистку и необязательную дополнительную модификацию, например, повторную упаковку (рефолдинг) или дериватизацию.
Более короткие пептиды предпочтительно получают с использованием хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. Однако недавний прогресс в этой технологии дал
- 20 008762 возможность получения полноразмерных полипептидов и белков при помощи этих способов, и, следовательно, получение более длинных конструкций синтетическими способами находится в рамках данного изобретения.
Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению
Из приведенного выше описания должно быть понятно, что модифицированные амилоидогенные полипептиды могут быть получены при помощи технологии рекомбинантных генов, но также при помощи химического синтеза или полухимического синтеза; две последние возможности особенно уместны, когда модификация состоит в связывании белковых носителей (таких как КЬН, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и БСА) и небелковых молекул, таких как углеводные полимеры, и, конечно, также тогда, когда модификация предусматривает добавление боковых цепей или боковых групп к произведенной из амилоидогенного полипептида-пептидной цепи.
Для цели технологии рекомбинантных генов и, конечно, также для цели иммунизации нуклеиновыми кислотами, фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный амилоидогенный полипептид, являются важными химическими продуктами. Таким образом, важная часть данного изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует аналог амилоидогенного полипептида, т. е. произведенный из амилоидогенного полипептида полипептид, который либо содержит природную последовательность, к которой был добавлен или в которую был вставлен партнер слияния, либо, предпочтительно, произведенный из амилоидогенного полипептида полипептид, где чужеродный Тклеточный эпитоп был введен посредством инсерции и/или добавки, предпочтительно посредством замены и/или делеции. Фрагментами нуклеиновых кислот согласно изобретению являются либо ДНК-, либо РНК-фрагменты.
Фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению обычно должны встраиваться в подходящие векторы с образованием клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению; такие новые векторы также являются частью данного изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов согласно изобретению, будут обсуждаться в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Векторы в зависимости от цели и типа применения могут быть представлены в виде плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но также и «голая» ДНК, которая экспрессируется только временно в некоторых клетках, является важным вектором. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, делая таким образом возможным получение большого числа копий для целей экспрессии высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования.
В общих чертах вектор согласно изобретению содержит следующие признаки в направлении 5'^3' и в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, делающий возможной секрецию (во внеклеточную фазу или, где это применимо, в периплазму) из мембраны или интеграцию в мембрану фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы этот вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами, которые должны использоваться для осуществления экспрессии ш νίνο у животного (т.е. при применении вектора в ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы вектор был неспособен интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых является хорошо известным специалистам в данной области.
Векторы согласно изобретению используют для трансформации клеток-хозяев для получения модифицированного амилоидогенного полипептида согласно изобретению. Такими трансформированными клетками, которые являются также частью согласно изобретению, могут быть культивируемые клетки или клеточные линии, используемые для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов согласно изобретению или используемые для рекомбинантного получения модифицированных амилоидогенных полипептидов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированными клетками могут быть живые вакцинные штаммы, в которых фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная копия или множественные копии) был встроен таким образом, чтобы производить секрецию из бактериальной мембраны или клеточной стенки или интеграцию в бактериальную мембрану или клеточную стенку модифицированного амилоидогенного полипептида.
Предпочтительными трансформированными клетками согласно изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (например, вида Екс11епс1па [например, Е. сой], ЕасШик [например, ЕасШик киЫШк], 8а1топе11а или МусоЬас!егшт [предпочтительно непатогенная, например, М. ϋονίκ Βί.Ό|). дрожжи (такие как 8ассйаготусек сегеуыае) и простейшие.
Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, такого как гриб, клетка насекомого, клетка растения или клетка млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные у человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты показали большую перспективность применения коммерчески доступной линии клеток Бго
- 21 008762 корййа те1апода§!ег (линии клеток Шнайдера 2 (82) и векторной системы, доступной из 1пуйтодеп) для рекомбинантного продуцирования полипептидов в лаборатории заявителей, и, следовательно, эта экспрессионная система является особенно предпочтительной.
Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительно полезными вариантами согласно изобретению; они могут быть использованы для получения малого масштаба или крупномасштабного получения модифицированного амилоидогенного полипептида или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине.
При получении модифицированных молекул согласно изобретению с использованием трансформированных клеток удобно, хотя и совершенно необязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо переносился на поверхность трансформированной клетки.
После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно создать на ее основе стабильную клеточную линию, которая несет вектор согласно изобретению и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный амилоидогенный полипептид. Предпочтительно, когда эта стабильная линия секретирует или несет аналог согласно изобретению, что облегчает его очистку.
Обычно плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые были получены из видов, совместимых с клеткой-хозяином, используют в комбинации с этими хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, Е. сой обычно трансформируют с использованием рВР322, плазмиды, полученной из вида Е. сой (см., например, Войуат е! а1., 1977). Плазмида рВР322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает легкий способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВР, или другая микробная плазмида или фаг, должны содержать также - или должны быть модифицированы, чтобы содержать - промоторы, которые могут быть использованы прокариотическим микроорганизмом для экспрессии.
Эти промоторы, наиболее часто используемые в конструировании рекомбинантных ДНК, включают в себя промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Сйапд е! а1., 1978; Йакита е! а1., 1977; Соеййе1 е! а1., 1979) и промоторную систему триптофана (!гр) (Соеййе1 е! а1., 1979; ЕР-А-0 036 776). Хотя эти системы являются наиболее часто используемыми, другие микробные промоторы были обнаружены и использованы, и подробности их нуклеотидных последовательностей были опубликованы, что позволяет специалисту в данной области лигировать их функционально с плазмидными векторами (31еЬ^епЙ8! е! а1., 1980). Некоторые гены из прокариот могут быть экспрессированы эффективно в Е. сой от их собственных промоторных последовательностей, что устраняет необходимость добавления другого промотора искусственными способами.
Кроме прокариот могут быть также использованы эукариотические микробы, такие как дрожжевые культуры, и здесь промотор должен быть способен запускать экспрессию. Зассйатотусек сетеу1Дае, или обычные хлебопекарные дрожжи, является наиболее часто используемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя доступными обычно являются ряд других штаммов. Для экспрессии в Зассйатотусек обычно используют, например, плазмиду УКр7 (ЗйпсйсотЬ е! а1., 1979; Кшдктап е! а1., 1979; Тксйетрег е! а1., 1980). Эта плазмида уже содержит ген !гр1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, не способного расти в триптофане, например, АЕСС Ыо. 44076 или РЕР4-1 Допек, 1977). Присутствие повреждения !гр1 в качестве характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает затем эффективную среду для обнаружения трансформации по росту в отсутствие триптофана.
Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (ΗίΙ/тап е! а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Не§8 е! а1., 1968; Нойапй е! а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид, последовательности терминации связывают с этими генами и также лигируют в экспрессирующий вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.
Другими промоторами, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями выращивания, являются промоторный район для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, связанных с азотным метаболизмом, и вышеупомянутой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, точку начала репликации и последовательности терминации, является подходящим.
Кроме микроорганизмов, культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов, могут также использоваться в качестве хозяев. В принципе, любая такая культура является работающей, является
- 22 008762 ли она культурой клеток из позвоночных животных или культурой клеток беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой в последние годы (Пккие СиИиге, 1973). Примерами таких применимых линий клеток-хозяев являются клетки УЕКО и НеЬа, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и ^138, ВНК, СО8-7 293, клетки 8робор1ега ГгиДрегба (8Е) (коммерчески доступные в виде полных экспрессионных систем из 1п1ег айа Рго1ет 8с1епсек, 1000 Векеагсй Рагк^ау, Мепбеп, СТ 06450, И.8.А. и из 1№Йгодеп), и линии клеток МОСК. В данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является 82, доступная из 1№Йгодеп, РО Вох 2312, 9704 СН Сгошпдеп, Тйе №1йег1апбк.
Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если это необходимо) начало репликации, промотор, расположенный перед экспрессируемым геном, вместе с любыми необходимыми сайтами связывания рибосом, сайтами сплайсинга РНК, сайтом полиаденилирования и последовательностью терминатора транскрипции.
Для применения в клетках млекопитающих регуляторные функции на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы получают из полиомы, Аденовируса 2, и наиболее часто - из обезьяньего вируса 40 (8У40). Ранний и поздний промоторы вируса 8У40 являются особенно применимыми, так как оба их можно получить легко из вируса в виде фрагмента, который содержит также начало репликации из вируса 8У40 (Иегк е! а1., 1978). Могут быть также использованы меньшие или большие фрагменты 8У40, при условии, что включена последовательность длиной приблизительно 250 п.н., простирающаяся от сайта НшбШ в направлении сайта Вд11, локализованного в вирусном начале репликации (ориджин). Кроме того, можно также, и часто желательно, использовать промотор или регуляторные последовательности, обычно связанные с желаемой последовательностью гена, при условии, что такие регуляторные последовательности являются совместимыми с системой клеток-хозяев.
Начало репликации может быть обеспечено либо конструкцией вектора для включения экзогенного начала репликации, которое, например, может быть получено из 8У40 или другого вируса (например, полиомы, аденовируса, У8У, ВРУ) или может быть обеспечено механизмом репликации хромосом клетки-хозяина. Если вектор интегрируется в хромосому клетки-хозяина, последний механизм часто является достаточным.
Идентификация применимых аналогов
Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что не все возможные варианты или модификации природно встречающихся амилоидогенных полипептидов будут способны индуцировать антитела у животного, которые являются перекрестно-реактивными с природной формой. Однако трудно создать эффективный стандартный скрининг для модифицированных амилоидогенных молекул, которые удовлетворяют минимальным требованиям для обсуждаемой здесь иммунологической реактивности. Таким образом, другая часть согласно изобретению относится к способу идентификации модифицированного амилоидогенного полипептида, который способен индуцировать антитела против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированным амилоидогенным полипептидом является (неиммуногенный) аутологичный белок, причем этот способ предусматривает получение при помощи пептидного синтеза или способов генной инженерии набора взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов, в которых аминокислоты были добавлены к аминокислотной последовательности, вставлены в аминокислотную последовательность, делетированы из аминокислотной последовательности или заменены в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида вида животного, что приводит к появлению аминокислотных последовательностей в этом наборе, которые содержат Т-клеточные эпитопы, которые являются чужеродными для данного вида животного, или получение набора фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих этот набор взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов, тестирование членов этого набора модифицированных амилоидогеных полипептидов или фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать продуцирование антител животным данного вида против немодифицированного амилоидогенного полипептида, и идентификацию и необязательно выделение члена (членов) набора модифицированных амилоидогенных полипептидов, который (которые) значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у данного вида, или идентификацию и необязательно выделение продуктов экспрессии, кодируемых членами набора фрагментов нуклеиновых кислот, которые значимо индуцируют продуцирование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у животного данного вида.
В этом контексте, набор взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов является коллекцией неидентичных модифицированных амилоидогенных полипептидов, которые были, например, отобраны на основе обсуждаемых выше критериев (например, в сочетании с исследованиями кругового дихроизма, ЯМР-спектров и/или картин дифракции рентгеновских лучей (порошковых рентгенограмм)). Этот набор может состоять лишь из небольшого числа членов, но предполагается, что этот набор может содержать несколько сотен членов.
- 23 008762
Тестирование членов набора может выполняться в конечном счете ίη νίνΌ, но может быть применен ряд тестов ίη νίΟΌ, которые сузят число модифицированных молекул, которые будут служить цели согласно изобретению.
Поскольку задачей введения чужеродных Т-клеточных эпитопов является поддержание Вклеточного ответа при помощи Т-клеток, необходимым требованием является, что пролиферация Тклеток индуцируется модифицированным амилоидогенным полипептидом. Пролиферация Т-клеток может тестироваться стандартизированными тестами пролиферации ίη νίίΐΌ. Вкратце, пробу, обогащенную Т-клетками, получают у субъекта и затем поддерживают в культуре. Культивируемые Т-клетки контактируют с АРС субъекта, которые предварительно поглощали модифицированную молекулу и процессировали ее для представления ее Т-клеточным эпитопам. Пролиферацию Т-клеток подвергают мониторингу и сравнивают с подходящим контролем (например, Т-клетками в культуре, контактированной с АРС, которая процессировала интактный, нативный амилоидогенный полипептид). Альтернативно, пролиферация может быть измерена путем определения концентрации релевантных цитокинов, высвобождаемых Т-клетками в ответ на узнавание или чужеродных Т-клеток.
После создания высокой вероятности того, что по меньшей мере один амилоидогенный полипептид набора каждого типа способен индуцировать продуцирование антител против амилоидогенного полипептида, можно приготовить иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один модифицированный амилоидный полипептид, который способен индуцировать антитела против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированный амилоидогенный полипептид является аутологичным белком, причем этот способ предусматривает смешивание члена (членов) набора, который значимо индуцирует продуцирование антител у вида животного, которые являются реактивными с амилоидогенным полипептидом, с фармацевтически или иммунологически приемлемым носителем, и/или наполнителем, и/или разбавителем, и/или формообразующим агентом (эксципиентом) необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.
Описанные выше аспекты согласно изобретению, относящиеся к наборам полипептидов, удобно использовать с первоначальным приготовлением ряда взаимно отличающихся последовательностей нуклеиновых кислот или векторов согласно изобретению, встраиванием их в подходящие экспрессирующие векторы, трансформацией подходящих клеток-хозяев (или животных-хозяев) этими векторами и выполнением экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот согласно изобретению. Эти стадии могут сопровождаться выделением продуктов экспрессии. Предпочтительно получать последовательности нуклеиновых кислот и/или векторы способами, включающими в себя использование способа молекулярной амплификации, такого как ПЦР, или использование синтеза нуклеиновых кислот.
Специфические амилоидогенные мишени
Кроме белков, наиболее часто ассоциированных с болезнью Альцгеймера, АРР, АроЕ4 и Таи, имеется длинный перечень других белков, которые так или иначе были связаны с БА, либо по их прямому присутствию в бляшках и клубках головного мозга пациентов с БА, либо по их очевидной генетической ассоциации с увеличенным риском развития БА. Большинство, если не все, из этих антигенов являются, наряду с обсуждаемыми выше Ав, АРР, пресенилином и АроЕ, возможными белками-мишенями согласно изобретению.
Альфа1-антихимотрипсин (АСТ) является основным компонентом 8Р, и предполагается, что он играет важную роль в патогенезе повреждений при БА и цереброваскулярном амилоидозе (СА) (Ас1а неигораШо1, 1998, 96: 628-36). Он взаимодействует с Ав ίη νίίΐΌ и стимулирует как образование, так и разрушени фибрилл Ав-42 (ДВС, 1998, 273: 28360-4).
Альфа2-макроглобулин был обнаружен по иммуноокрашиванию в центральных частях бляшек в головном мозге пациентов с БА. Трансмембранный фрагмент из бета-субъединицы был обнаружен в центральных частях бляшек, тогда как растворимый альфа-фрагмент был обнаружен внеклеточно в бляшках. Ас1а ηеи^οраΐЬο1, 1998, 96: 628-36 и Вгат Век., 1997, 777: 223-227.
АВАЭ (Ав-пептидсвязывающая алкогольдегидрогеназа) связывается с Ав в клетке. Она является нейронным ферментом, присутствующим в нормальных клетках, но сверхэкспрессирующимся в нейронах, пораженных БА. Ав является более токсичным в отношении клеток, которые сверхэкспрессируют АВАЭ. АВАЭ сцеплен с хромосомой X. Уаи, 1997, №11иге 389.
АРБР1 и -2 (предшественник амилоида, подобный белку 1 и 2): оба белка принадлежат к белкам суперсемейства гомологов АРР, но не содержат пептидного района Ав. Тем не менее имеется значимое окрашивание АРЬР в невритных бляшках. Ас1а №игора11ю1. 1997, 94: 519-524.
АМУ117 является новым белком, обнаруженным в бляшкоподобных повреждениях в мозге людей с БА, который, по-видимому, имеется в изобилии, широко распространен и является «высоко специфическим» для этого заболевания.
Предполагается, что этот белок, АМУ117 может играть критическую роль в развитии и прогрессии БА посредством образования этих бляшек. Интересно, что содержащие АМУ117 бляшки не локализуются совместно с бляшками, содержащими Ав, что определяет новую характерную манифестацию БА,
- 24 008762 кроме хорошо известных содержащих Αβ бляшек и содержащих Таи клубков. Было обнаружено, что АМ¥117-позитивные бляшки являются обильными в головном мозге в спорадических случаях БА и в головном мозге людей с синдромом Дауна, но «редкими или отсутствующими» в головном мозге в контроле и в случае других нейродегенеративных заболеваний (Ат 1 Ра1йо1 1997; 151: 69-80).
Вах. Моноклональные антитела детектировали Вах в качестве компонента сенильных бляшек в головном мозге пациентов с БА. Он также сверхэкспрессируется в дистрофических невритах. Ас1а Ыеигора!йо1. 1998, 95: 407-412.
Вс1-2 имеет неясную роль. Сверхэкспрессируется в окружающих глиальные клетки бляшках. Ас1а №игора1йо1. 1998, 95: 407-412.
Блеомицингидролаза является, возможно, бета-секретазой. Иммунореактивность против блеомицингидролазы была обнаружена в БР в БА (Вгат Век. 1999, 830: 200-202). Определенный генотип блеомицингидролазы был ассоциирован с увеличенным риском развития БА в некоторых случаях, тогда как в других случаях не обнаруживали корреляции (Апп Ыеиго1, 1998, 44: 808-811 и Апп Ыеиго1, 1999, 46: 136137).
ВВ1/АВВ1. АВВ1 представляет собой фрагмент в 4 кД предполагаемого трансмембранного белка, кодируемого геном ВВ1 на хромосоме 13, обнаруживаемый в амилоидных бляшках людей с семейной Британской деменцией (РВИ). Эти пациенты имеют мутацию в стоп-кодоне гена ВК1, которая создает более длинную открытую рамку считывания. Высвобождение 34 карбокси-концевых аминокислот измененного белка генерирует субъединицу амилоида АВВ1. Антитела против АВК1 узнают как паренхимные, так и сосудистые повреждения в головном мозге пациентов с РВЭ. АВК1-пептид депонируется в виде амилоидных фибрилл, и предполагается, что образующиеся бляшки приводят к дисфункции нейронов и деменции, которая характеризует РВЭ (У1ба1, К. е1 а1., 1999, №Шге 399).
Хромогранин А был обнаружен в некоторых диффузных амилоидных отложениях и в окружающих их дистрофических невритах (Вгат Век, 1991, 539: 143-50).
Клустерин/ароР Этот ген часто выделяется путем дифференциального скрининга в лабораториях различных областей молекулярной биологии, так как он сверхэкспрессируется в многочисленных случаях дегенеративных заболеваний, таких как БА и скрепи (Вюсйет 1 1997 Ыоу 15; 328(1): 45-50 Мюйе1 Ό., Сйа!е1ат О., №г1й Б., Вгип О.).
Белок, связывающий СВР (высвобождающий кортикопин фактор), связывает пептид СВР из 41 аминокислоты, который является важным регуляторным фактором в стрессовых реакциях в головном мозге. Поскольку большая часть СВР связана СВР-связывающим белком, удаление СВР-связывающего белка могла бы приводить к увеличению уровня свободного СВР, что, как полагают, имеет позитивное действие против БА. Вейап, 1997, I. №игосйет1кйу, 68: 2053-2060.
ЕЭТР (токсичный фактор, полученный из эндотелия). Белок, продуцируемый микрососудами пациентов БА. Он является специфически токсичным в отношении нервных клеток. \УО 99/24468.
Было показано, что гепарансульфат-протеогликаны локализуются совместно с Ав в БР. Исследования на крысах показывают, что гепарансульфат-гликозаминогликан необходим для образования амилоидных волокон (Иеигоп, 1994, 12: 219-234 и Ас1а пеигора1йо1, 1998, 96: 628-36).
Медиаторный белок-2 коллапсиновой реакции человека представляет собой белок 65 кДа, распознаваемый в нейрофибриллярных клубках моноклональным антителом. Включение в клубки может истощать растворимый белок и приводит к аномальному разрастанию невритов, ускоряя тем самым дегенерацию нейронов. 1ВС, 1998, 273: 9761-8.
Хантингтин (белок болезни Хантингтона). В БХ (болезни Хантингтона), белок Хантингтина удлинен на Ν-конце полиглутамином. Эта форма белка Хантингтина обнаруживается также в ΝΕΤ в головном мозге пациентов БА и при заболевании Пика (Ехр. №иго1, 1998, 150: 213-222).
1САМ-1 накапливается в БР. Ас1а пеигора!йо1, 1998, 96: 628-36 и Ат. I Ра1йо1. 1994, 144: 104-16.
1Ь-6 связан с нейрофибриллярными изменениями и был обнаружен в центральной части бляшек. Предполагалось, что он является запускающим событием при БА. Он сильно размножается в астроцитах посредством активного пептида 25-35 Ав. Вгат Век., 1997, 777: 223-227 и Вейау Вгат Век, 1996, 78: 3741.
Ассоциированный с лизосомами антиген С.П68 узнается антителом КР-1 при №Т и БР. Таким образом, лизосомы могут играть роль в образовании клубков и бляшек. Эетеп1 Сепа1г Содп Э|когй. 1998, 9: 13-19.
Р21 гак участвует в качестве первой стадии в повышении факторов роста и митогенов, наблюдаемом на ранних стадиях развития БА. №игокс1епсе, 1999, 91: 1-5.
РЬС-дельта 1 (изофермент дельта 1 фосфолипазы С) накапливается аномальным образом при №Т и невритах, окружающих центральные части бляшек. Он является внутриклеточным. АПйешег Όίκ Аккос Э^оМ, 1995, 9: 15-22.
Компонент Р сывороточного амилоида (БАР) является компонентом нормальной плазмы, который присутствует во всех типах амилоидных отложений, в том числе амилоидных отложениях при БА (РВС, 1995, 270: 26041-4). Он обнаруживается как в БР, так и в №Т. В некоторых исследованиях было показа
- 25 008762 но, что он усиливает агрегацию Αβ и предотвращает протеолиз фибрилл (Вюсйега ЕИорйун Век соппнип, 1995, 211: 349ν-53 и ΡΝΑ8, 1995, 92: 4299-4303), тогда как другое исследование указывает на то, что 8АР ингибирует образование фибрилл Αβ (1ВС, 1995, 270: 26041-4).
Синаптофизин был обнаружен в некоторых диффузных амилоидных отложениях и в окружающих их дистрофических невритах. (ВгатВек, 1991, 539: 143-50).
Синуклеин (альфа-синуклеин или ΝΑΟΡ). Не-А бета-компонент амилоида БА (ΝΑΟ) идентифицировали биохимически в качестве второго основного компонента в амилоиде, очищенном из ткани головного мозга пациентов БА. ΝΑΟ, происходящий из предшественника длиной 140 аминокислот, ΝΑΟΡ, имеет длину по меньшей мере 35 аминокислот (ΝΑΟ35), хотя его амино-конец не установлен окончательно. ΝΑΟ-моноклональное антитело иммуноокрашивает 8Р в головном мозге БА, но не реагирует с ΝΑΟΡ (ВюсЬепйкйу 34 (32): 10139-10145 (Аид 15 1995) 1\уа1 А., УокЫшоЮ М., МазИаЬЕ., ЗаНоЬТ.). ΝΑΟ самоолигомеризуется в присутствии Αβ. Новые данные указывают на потенциальную роль этой молекулы в синаптическом повреждении и нейротоксичности через образование амилоидоподобных фибрилл и митохондриальную дисфункцию. Вгаш РаИю1 1999 Ос1; 9(4): 707-20. БЕВ8 Бей. 1998, 421:73-76. Часть ΝΑΟΡ имеет высокую гомологию с С-концевым фрагментом амилоида АРР и района прионового белка скрепи (РгР8с). Синуклеин является основным причинным фактором болезни Паркинсона (Сйеш. ΒίοΙ, 1995, 2: 163-9).
ТСЕ-Ы (трансформирующий фактор роста Ы). Сверхэкспрессия ТСБ-Ы мутантным АРР у мышей ТС ускоряет отложение Αβ. Таким образом, считается, что ТСБ-Ы участвует в инициации или стимуляции образования амилоидных бляшек (ХУунн-Согау. 1997, №11игс 389).
Другие амилоидные заболевания и связанные с ними белки
Кроме вышеупомянутых белков, которые потенциально участвуют в БА и заболеваниях, подобных БА (болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, ΡΒΌ и другие формы деменции), имеется относительно большое число заболеваний, иных, чем БА, где образование амилоида участвует в запуске заболевания или является причиной симптомов данного заболевания. Хотя природа белков, участвующих в этих заболеваниях, варьирует, они имеют одни и те же общие признаки, которые определяют амилоид (см. выше). В следующей таблице дан список ряда этих амилоидных нарушений и вызывающих их белков.
Разнообразие амилоидных фибриллярных белков
Клинический синдром | Субъединица фибрилл | Структура предшественника |
Церебральная амилоидная ангиопатия (САА) | Αβ | Полностью β |
Моноклональный белковый системный (АЦ амилоидоз | Полноразмерный У-домен или фрагменты У-домена легкой цепи !д | Полностью β |
Реактивный системный (АА) амилоцдоз | Ν-концевоЙ фрагмент из 75 аминокислотных остатков амилоидного белка А | α/β |
Семейная амилоидная полиневропатия | Полноразмерные варианты или фрагменты вариантов транстиретина | Полностью β |
Наследственный АроА1 амилоидоз | Ν-концевые фрагменты (-90 остатков) вариантов Аро А1 | (α/β) |
Наследственный лизоцимный амилоцдоэ | Полноразмерные варианты лизоцима | α + β |
Сахарный диабет типа II | Фрагмент из 37 остатков островкового амилоидного полипептида | Неизвестна |
-26008762
Связанный с инсулином амилоидоз | Полноразмерный инсулин дикого типа | α+ β |
Трансмиссивные губчатые энцефалопатии | Полноразмерный прионовый белок или фрагменты прионового белка | α + β |
Медулярная карцинома тиреоида | Фрагменты кальцитонина | Неизвестна |
Сенильный системный амилоидоз | Полноразмерный транстиретин или фрагменты транстиретина | Полностью β |
Связанный с гемодиализом амилоидоз | Полноразмерный микроглобулин β-2 дикого типа | Полностью β |
Выделенный атриальный амилоидоз | Атриальный натриуретический фактор | Неизвестна |
Наследственная церебральная амилоидная ангиопатия | Фрагмент из 110 остатков варианта цистатина | α + β |
Финский наследственный амилоидоз | Фрагмент из 71 остатка вариантов гельсолина | α/β |
Наследственный амилоидоз α-цепи фибриногена | Фрагменты вариантов α-цепи фибриногена | Неизвестна |
Все эти белки являются, подобно белкам, участвующим в БА, потенциальными мишенями в предлагаемой здесь стратегии иммунизации.
Предполагается, что большинство способов иммунизации против амилоидогенных полипептидов должны быть рестриктированы иммунизацией, индуцирующей образование антител, перекрестнореактивных с нативным амилоидогенным полипептидом. Тем не менее, в некоторых случаях будет представлять интерес индукция клеточного иммунитета в форме СТЬ-реакций против клеток, на которых представлены эпитопы МНС Класса I из амилоидогенных полипептидов, это может оказаться целесообразным в тех случаях, когда уменьшение в числе клеток, продуцирующих амилоидогенные полипептиды, не оказывает серьезного вредного воздействия. В таких случаях, где желательными являются СТЬ-реакции, предпочтительно использовать способы заявителя РСТ/ЭК99/00525 (соответствует υ88Ν 09/413 186). Описания этих двух документов включены тем самым в качестве ссылки.
В следующем далее неограничительном примере авторы сосредоточиваются на развитии аутовакцины на основе Ав против БА. Однако принципы, изложенные здесь, применимы в равной степени к любому амилоидному белку.
Пример 1. Подход аутовакцинации для иммунизации против БА.
Тот факт, что белок Ав мышей кпоск оиГ' не вызывает каких-либо аномалий или вредных побочных действий, предполагает, что удаление или снижение количества Ав будет безопасным, ΖΙιοημ Н. (1996).
Опубликованные эксперименты, в которых трансгенных животных иммунизировали против трансгенного белка Ав человека, предполагает, что, если бы было возможно разрушить аутотолерантность, супрессия Ав могла бы быть получена с использованием аутореактивных антител. Эти эксперименты дополнительно предполагают, что такая супрессия Ав потенциально могла бы как предотвращать образование бляшек, так и способствовать выведению уже образованных бляшек Ав из головного мозга, срав. 8сБепк е! а1. (1999). Однако традиционно невозможно индуцировать антитела против аутологичных белков.
Таким образом, опубликованные данные не обеспечивают средства для разрушения аутотолерантности в отношении истинных аутологичных белков. Также эти данные не дают информации о том, каким образом гарантировать, что иммунная реакция будет направлена только и преимущественно на отложения Ав, а не на белок-предшественник Ав, связанный с клеточной мембраной (АРР), если это считается необходимым. Иммунная реакция, генерируемая с использованием существующей технологии, предпочтительно генерировала бы иммунную реакцию против аутологичных белков нерегулируемым образом, так что может генерироваться нежелательная и избыточная аутореактивность против частей белка Ав. Таким образом, использование существующих стратегий иммунизации будет, наиболее вероятно, не способно генерировать сильные иммунные реакции против собственных (аутологичных) белков и, следовательно, будет небезопасным вследствие потенциально сильной перекрестной реактивности в отно
- 27 008762 шении мембраносвязанного АРР, который присутствует на большом числе клеток в ЦНС.
Данное изобретение обеспечивает средства эффективного генерирования сильной регулируемой иммунной реакции против истинных аутологичных белков, которые потенциально могли бы образовывать бляшки и вызывать серьезное заболевание в ЦНС или в других компартментах тела. Безопасная и эффективная терапевтическая вакцина, содержащая белок Αβ человека, будет создана с использованием этой технологии для лечения БА.
В свете этого, можно понять, что БА, заболевание, которое, как прогнозируется, парализует систему здравоохранения в следующем столетии, могло бы излечиваться, или же описанные вакцины могли бы, по меньшей мере, составлять эффективный терапевтический подход к лечению симптомов и прогрессирования этого заболевания.
Этот способ представляет собой совершенно новый иммунологический подход к блокированию отложения амилоида при БА, а также при других неврологических заболеваниях.
В следующей таблице показано 35 рассматриваемых конструкций. Все положения, указанные в таблице, даны относительно стартового метионина АРР (первой аминокислоты в §Εζ) ГО N0:2) и включают в себя как начальную, так и конечную аминокислоту, например фрагмент 672-714 включает в себя как аминокислоту 672, так и аминокислоту 714. Начальное и конечное положения для Р2 и РЗО указывают, что этот эпитоп заменяет часть фрагмента АРР в указанных положениях (оба положения включены в замену) - в большинстве конструкций, введенные эпитопы заменяют фрагмент длиной с данный эпитоп. Звездочки в таблице имеют следующие значения:
*) Только одно положение для Р2 и РЗО указывает на то, что этот эпитоп был вставлен в данное производное АРР в указанном положении (эпитоп начинается с аминокислоты, С-терминально смежной с указанным положением).
**) Конструкция 34 содержит три идентичных фрагмента АРР, разделенных РЗО и Р2, соответственно.
***) Конструкция 35 содержит девять идентичных фрагментов АРР, разделенных чередующимися эпитопами РЗО и Р2.
Конструкции аутовакцины АРР
Номер вар. | Немало сегмента АРР относительно аминокислоты 1 АРР | Конец сегмента АРР относительно аминокислоты 1 АРР | Положение злитопа Р2 относительно амиюнивлаты 1 АРР | Положение эпитопа РЗО относительно аминокислоты 1 АРР | Длина молекулы |
1 | 630 | 770 | 656 - 670 | 635 - 655 | 141 |
2 | 630 | 714 | 656 - 670 | 635 - 655 | 05 |
3 | 612 | 770 | 735 - 749 | 714 - 728 | 99 |
4 | 672 | 770 | 714 728 | 99 | |
5 | 672 | 770 | 714 - 728 | 99 | |
6 | 612 | 770 | 723· | 723* | 135 |
7 | 672 | 770 | 723* | 120 | |
а | 672 | 770 | 723* | 114 | |
9 | 672 | 714 | 672* | 64 | |
10 | 672 | 714 | 714* | 64 | |
11 | 672 | 714 | 672* | 58 | |
12 | 672 | 714 | 714* | 58 | |
13 | 672 | 714 | 714* | 672* | 79 |
14 | 672 | 714 | 660 - 694 | 43 | |
14 | 672 | 714 | 685 ”799 | 43 | |
16 | 672 | 714 | 690 - 704 | 43 | |
17 | 672 | 714 | 695 - 709 | 43 | |
16 | 672 | 714 | 675 - 695 | 43 | |
19 | 672 | 714 | 6ВО - 700 | 43 | |
20 | 672 | 714 | 685 - 705 | 43 | |
21 | 672 | 714 | 690 - 710 | 43 | |
22 | 672 | 714 | 600* | 600* | 79 |
23 | 672 | 714 | 690* | 690* | 79 |
24 | 672 | 714 | 700* | 700· | 79 |
25 | 672 | 714 | 710* | 710‘ | 79 |
26 | 672 | 714 | 600* | 64 | |
27 | 672 | 714 | 690· | 64 | |
29 | 672 | 714 | 700* | 64 | |
29 | 672 | 714 | 710* | 64 | |
30 | 672 | 714 | 600* | 5Θ | |
31 | 672 | 714 | 630· | 58 | |
32 | 672 | 714 | 700* | 58 | |
33 | 672 | 714 | 710* | 58 | |
34 | 672 | 714 | Поспешит. 1»* | После пою. 2** | 165 |
35 | 672 | 714 | 34 х 3' | 34 х 3*** | 165 |
Частью АРР, против которой наиболее интересно генерировать реакцию, является центральный пептид Αβ из 43 аминокислот (Αβ-43, соответствующий §Εζ) ГО N0:2, остаткам 672-714), который является основным компонентом амилоидных бляшек в головном мозге пациентов с БА. Этот фрагмент АРР является частью всех конструкций, перечисленных выше.
Варианты 1 и 2 включают в себя часть АРР против хода транскрипции (слева) от Αβ-43, где помещены модельные эпитопы Р2 и РЗО. Все варианты 1 и 3-8 содержат фрагмент С-100, который, как было показано, является нейротоксичным, этот фрагмент С-100 соответствует аминокислотным остаткам 714770 §Εζ) ГО N0:2. В вариантах 3-5 эти эпитопы заменяют часть фрагмента С-100, тогда как в вариантах
-28008762
6-8 они были вставлены в С-100.
Варианты 9-35 содержат только коровый белок Λβ-43. В вариантах 9-13, Р2 и Р30 слиты с каждым концом Ав-43; в вариантах 14-21 Р2 и Р30 заменяют часть Ав-43; в 22-33 Р2 и Р30 вставлены в Ав-43; 34 содержит три идентичных фрагмента Ав-43, разделенных Р30 и Р2, соответственно; 35 содержит 9 повторов Ав-43, разделенных чередующимися эпитопами Р2 и Р30.
См. чертеж и таблицу, приведенную выше, в отношении подробностей.
Еще один тип конструкции является особенно предпочтительным. Поскольку одна из задач согласно изобретению связана с тем, чтобы избежать деструкции клеток, продуцирующих АРР, тогда как удаление Ав является желательным, по-видимому можно получить аутовакцинные конструкции, содержащие только части Ав, которые не экспонированы во внеклеточной фазе, когда они присутствуют в АРР. Таким образом, такие конструкции должны будут содержать по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, полученный из аминокислотного фрагмента, определяемого аминокислотами 700-714 в 8ЕО ΙΌ N0:2. Поскольку прогнозируется, что такой короткий полипептидный фрагмент является лишь слабо иммуногенным, предпочтительно, чтобы такая аутовакцинная конструкция состояла из нескольких копий Вклеточного эпитопа, например, в виде конструкции, имеющей структуру, показанную в формуле I в подробном описании согласно изобретению, см. выше. В этой версии формулы I термины амилоиде1амилоидех = х В- клеточным эпитопам, содержащим аминокислотные последовательности, происходящие из аминокислот 700-714 8Е0 ΙΌ N0:2. Предпочтительной альтернативой является описанная подробно выше возможность связывания амилоидогенного (поли)пептида и выбранного чужеродного Тхелперного эпитопа через амидную связь с молекулой полисахаридного носителя, таким путем становятся возможными множественные представления слабого эпитопа, составленного аминокислотами 700714 8Е0 ΙΌ N0:2, а также становится возможным выбор оптимального соотношения между Вклеточными и Т-клеточными эпитопами.
Пример 2. Иммунизация трансгенных мышей Ав и модифицированными белками в соответствии с данным изобретением.
Конструирование ДНК, кодирующей 11АВ43+-34. Ген 11АВ43+-34 конструировали в несколько стадий. Сначала генерировали ПЦР-фрагмент с праймерами МЕ#801 (8Е0 ΙΌ N0:10) и МЕ#802 (8Е0 ΙΌ N0:11) с использованием праймера МЕ#800 (8Е0 ΙΌ N0:9) в качестве матрицы. МЕ#800 кодирует фрагмент аЬс!а-43 человека с оптимизированными для Е. сой кодонами. МЕ#801 и 802 добавляют подходящие сайты рестрикции к этому фрагменту.
ПЦР-фрагмент очищали, расщепляли №о1 и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный №о1-НтЛП и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ28Ь+ Е. со11. Полученная плазмида, кодирующая Ав-43 дикого типа человека, была названа рАВ1.
В следующей стадии Т-хелперный эпитоп Р2 добавляют к С-концу этой молекулы. Праймер МЕ#806 (8Е0 ΙΌ N0:12) содержит последовательность, кодирующую эпитоп Р2, так что генерируется слияние Р2 и АЬс!а-43 посредством этой ПЦР-реакции.
Клонирование выполняли путем получения ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ#178 (8Е0 ΙΌ N0:8) и МЕ#806 с использованием рАВ1 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ЖоГНтйШ и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ28Ь+. Полученная плазмида была названа рАВ2.
Аналогичным образом, другую плазмиду делали улавливающей Ав-43-кодирующую последовательность с другим Т-хелперным эпитопом, Р30, добавленным к Кконцу. Это выполняли путем получения ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ#105 (8Е0 ΙΌ N0:7) и МЕ#807 (8Е0 ΙΌ N0:13) с использованием праймера рАВ1 в качестве матрицы.
Этот фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ^оГНтйШ и очищенный вектор рЕТ28Ь+. Полученная плазмида была названа рАВ3.
В третьей стадии второй повтор Ав-43 добавляли С-терминально к эпитопу Р2 плазмиды рАВ2 при помощи праймера МЕ#809 (8Е0 ΙΌ N0:14). МЕ#809 в то же самое время создает сайт ВатШ непосредственно после повтора Ав-43. ПЦР-фрагмент получали с праймерами МЕ#178 и МЕ#809 с использованием рАВ2 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ^оГНтйШ и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ28Ь+. Полученная плазмида была названа рАВ4.
Наконец, повторяющуюся последовательность эпитоп Р30-повтор Ав-43 из рАВ3 клонировали в плазмиду рАВ4. Это выполняли получением ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ#811 (8Е0 ΙΌ N0:16) и МЕ#105 с использованием рАВ3 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали и использовали в качестве праймера в последующей ПЦР с использованием МЕ#810 (8Е0 ΙΌ N0:15) с применением рАВ3 в качестве матрицы. Полученный фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ^оГНшйШ и очищенный экспрессирующий вектор рАВ4. Полученная плазмида рАВ5 кодирует молекулу 11АВ43+-34.
Все ПЦР и процедуры клонирования выполняли, по существу, как описано 8атЬгоок 1., Ргйкй, Е.Р., апй Мап1аЙ8, Т. 1989 Мо1сси1аг С1опт§: А ЬаЬога!огу Мапиа1. 2'1 Ей., Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!огу, КУ.
- 29 008762
Для всех процедур клонирования использовали клетки Е. сой К-12, штамм Тор-10 Г' (81га1адепе, И8А). Вектор рЕТ28Ь+ покупали у ^уадеп, И8А. Все праймеры синтезировали в ΌΝΑ Тесйпо1оду, Оептагк.
Экспрессия и очистка ЙАВ43+-34. Белок ЙАВ43+-34, кодируемый рАВ5, экспрессировали в клетках Е. сой ВЬ21-Оо1б ^оуадеп), как описано поставщиками системы рЕТ28Ь+^оуадеп).
Экспрессированный белок ЙАВ43+-34 очищали до чистоты более 85% промыванием тел включения с последующей катионообменной хроматографией с использованием рабочей станции для очистки ВюСаб (Рег8ерйуе Вю8у81ет8, И8А) в присутствии 6 М мочевины. Мочевину после этого удаляли ступенчатым диализом против раствора, содержащего уменьшающиеся количества мочевины. Конечным буфером был 10 мМ Трис, рН 8,5.
Исследование иммунизации. Мышей, трансгенных в отношении АРР человека (белкапредшественника Ав-белка (белка Альцгеймера)), использовали для этого исследования. Эти мыши, названные ТдΚN^8+, экспрессируют мутированную форму АРР, что приводит к высокой концентрации Ав-40 и Ав-42 в головном мозге мыши (1апи8, С. е! а1.).
Мышей (8-10 мышей на одну группу) иммунизировали либо АЬе!а-42 (8Е^ Ю NО:2, остатки 673714, синтезированная с использованием стандартной Гтос-стратегии), либо вариантом ЙАВ43+-34 (конструкцией 34 в таблице в примере 1, полученной рекомбинантно) четыре раза в неделю с двухнедельными интервалами. Дозы были 100 мг для Ав или 50 мг для ЙАВ43+-34. Мышам делали кровопускание в день 43 (после трех инъекций) и после дня 52 (после четырех инъекций) и сыворотки использовали для определения уровня анти-Ав-42-специфических титров с использованием прямого ЕЙ18А Ав-42.
В следующей таблице показаны средние относительные титры анти-АЬе!а-42.
Иммуноген | День 43 (после 3 иммунизаций) | День 52 (после 4 иммунизаций) |
Αβ-42 | 4000 | 3000 |
Ϊ1ΑΒ43+-34 | 16000 | 23000 |
Как будет видно, титры антител, полученные при иммунизации вариантом ЙАВ43+-34 Ав, приблизительно в 4 раза и в 7,5 раз выше после 3 и 4 иммунизации, соответственно, чем титры, полученные при использовании неизмененного Ав-42 в качестве иммуногена. Этот факт представляется, кроме того, перспективным при рассмотрении того факта, что количество варианта, используемого для иммунизации, было только 50% от количества последовательности дикого типа, используемого для иммунизации.
Пример 3. Синтез содержащей пептид Ав-сополимер вакцины с использованием полигидроксиполимера в качестве сшивающего агента.
Введение. Традиционная конъюгатная вакцина состоит из (поли)пептида, связанного ковалентно с белком-носителем. Пептид содержит В-клеточный эпитоп (эпитопы), а белок-носитель обеспечивает Тхелперные эпитопы. Однако большая часть белка-носителя обычно будет не относящейся к источнику Тхелперных эпитопов, так как только минорная часть общей последовательности содержит соответствующие Т-хелпэрные эпитопы. Такие эпитопы могут быть определены и синтезированы в виде пептидов, например, из 12-15 аминокислот. Если эти пептиды связаны ковалентно с пептидами, содержащими Вклеточные эпитопы, например, через многовалентный активированный полигидроксиполимер, может быть получена вакцинная молекула, которая содержит только уместные части. Кроме того, можно обеспечить вакцинный конъюгат, который содержит оптимизированное соотношение между В-клеточными и Т-клеточными эпитопами.
Синтез активированного полигидроксиполимера. Полигидроксиполимеры, такие как декстран, крахмал, агароза и т.д., могут быть активированы 2,2,2-трифторэтансульфонилхлоридом (трезилхлоридом), либо посредством гомогенного синтеза (декстран), при растворении в Ν-метилпирролидиноне (ΝΜΡ), либо посредством гетерогенного синтеза (крахмал, агароза, сшитый декстран), например, в ацетоне.
225 мл сухого Ν-метилпирролидинона (ΝΜΡ) добавляют в сухих условиях к лиофилизированному водорастворимому декстрану (4,5 г, 83 ммоль, клинической чистоты, Мм (сред.) 78000) в круглодонной колбе на 500 мл, снабженной магнитной мешалкой для перемешивания. Колбу помещают в масляную баню на 60°С с перемешиванием при помощи магнитной мешалки. Температуру повышают до 92°С и перемешивают в течение периода 20 мин. Когда декстран растворяется, колбу сразу же вынимают из масляной бани и температуру в бане снижают до 40°С. Колбу снова помещают в масляную баню, все еще при перемешивании магнитной мешалкой, и добавляют по каплям трезилхлорид (2,764 мл, 25 ммоль). Через 15 мин добавляют по каплям сухой пиридин (безводный, 2,020 мл, 25 ммоль). Колбу вынимают из масляной бани и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт (активированный трезилом декстран, ТАГ)) осаждают в 1200 мл холодного этанола (99,9%). Супернатант декантируют и осадок собирают в полипропиленовые пробирки на 50 мл в центрифуге при 2000 об./мин. Осадок растворяют в 50 мл 0,5% уксусной кислоты, диализуют 2 раза против 5000 мл 0,5% уксусной кислоты и лиофилизируют. ТАГ) может храниться в виде лиофилизированного порошка при -20°С.
Нерастворимый полигидроксиполимер, такой как агароза или сшитый декстран, может быть акти
- 30 008762 вирован трезилом путем получения суспензии полигидроксиполимера, например, в ацетоне, и выполнения синтеза в виде твердофазного синтеза. Активированный полигидроксиполимер может быть собран фильтрованием. Подходящие способы сообщаются, например, в №1ккоп К. апб МокЬасЬ К. (1987), МеНобк ίη Еηζутο1οду 135, р. 67 и в Негтапккоп СТ е! а1. (1992), ίη ЛттоЫПеб Айшйу Бщапб ТесЬшдиек, Асабетю Ргекк, 1пс., р. 87.
Синтез содержащих АЬе!а-пептид-сополимеры вакцин. ТАЭ (10 мг) растворяют в 100 мкл Н2О и 1000 мкг карбонатного буфера, рН 9,6, содержащего 5 мг Ав-42 (8ЕЦ ΙΌ N0:2, остатки 673-714), и добавляют 2,5 мг Р2 (8ЕЦ ΙΌ N0:4) и 2,5 мг Р30 (8ЕЦ ΙΌ N0:6). Ав-42 и Р2 и Р30 содержат все защищенные группы лизина, они находятся в форме 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил (Эбе)защищенных групп лизина. Эти пептиды готовят посредством стандартной Етос-стратегии, где обычный Етос-Бук(Вос)ОН был замещен Етос-Бук(Эбе)-ОН (полученный из NονаЬ^οсЬет кат. номер 04-121121), т.е. ε-аминогруппа в лизине защищена Обе вместо Вос.
Величину рН измеряют и доводят до 9,6 при помощи 1 М НС1. Через 2,5 ч при комнатной температуре гидразин из 80% раствора добавляют до конечной концентрации гидразина 8%, и раствор инкубируют еще в течение 30 мин при комнатной температуре и сразу же после этого лиофилизируют. Лиофилизированный продукт растворяют в Н20 и диализуют интенсивно против Н2О перед конечной лиофилизацией.
Соотношение между В-клеточными эпитопами (Ав) и Т-хелперными эпитопами (Р2 и Р30) в конечном продукте может варьироваться с использованием различных концентраций этих пептидов в стадии синтеза. Кроме того, конечный продукт может быть помечен, например, маннозой (чтобы нацелить таким образом этот конъюгат на АРС) добавлением аминированной маннозы к карбонатному буферу на стадии синтеза.
Если нерастворимый активированный полигидроксиполимер используют для комбинирования пептидов, содержащих В-клеточный эпитоп и Т-хелперные эпитопы, связывание с этим полимером может выполняться в виде твердофазного синтеза, и конечный продукт собирают и очищают путем промывания и фильтрования.
Список ссылок
Вгооктеуег, В.; Сгау, 8.; Кахак, С. (1998). Рго)есНопк о, АНЬетег'к Эйеаке ίη !Ье Ипйеб 8!а!ек апб !Ье РиЫс Неа1!Ь 1трас! о, Ое1аут§ Э|кеаке Опке! Атепсап 1оигпа1 о, РиЬНс НеаНЬ, 88(9), 1337-1342.
ВиНш, М.; ОйЬ, М.; Ве11ок!а, 8.; Акее,е, Н.; Рйак, В.К.; Vукк-Сο^ау, Т.; Миске, Ь.; МаЬ1еу, Β.ν. (1999). Ехргеккюп о, Нитап АроНрорго1ет Е3 ог Е4 ίη Не Вгашк о, Арое-/- М1се: 1коГогт-8рес|Пс ЕГГес1к оп Nеи^οбедеηе^аΐ^οη. 1оита1 о, №игокаепсе, 19, 4867-4880.
С1агк, Б.Н; Роогка.), Р.; ν^Η^ Ζ.; СексЬМпб, Э.Н.; №кгеббше, Ζ.8.; МП1ег, В.; Б1, Ό.; Рауатц Н.; Ахей, Е.; Магкорои1ои, К.; Апбгеабщ, А.; Э^ои/а, I.; Бее, У.М.; Вееб, Б.; Тго_)апохкк1, 1.Ц.; ΖЬика^еνа, V.; В1гб, Т.; 8сЬе11епЬегд, С.; νί^^^η, К.С. (1998). РаНодетс ЕпрНсаЕопк о, МШаЕопк ίη Не Таи Сене ίη РаНбо-Роп1о-№дга1 ОедепегаНоп апб Ве1а!еб Nеи^οбедеηе^аι^νе Ощогбегк Бапкеб !о СЬготокоте 17. Ргосеебтдк о, Не №11юпа1 Асабету о, 8с1епсек И.8.А., 95(22), 13103-13107.
Сир!а, В. К. е!. а1. (1998), Вех Бю1 8!апб. 92: 63-78.
Нк1ао К. е! а1. (1998) Тгапкдешс тюе ехргекктд АНЬетег ату1о1б ргесигког рго1ешк, Ехр. СегоШоБ 33 (7-8), 883-889.
Нийоп, М.; Бепбоп, С.Б.; Βίζζυ, Р.; Вакег, М.; ЕгоеНсЬ, 8.; Нои1беп, Н.; Рккеппд-Вгохп, 8.; СЬакгахеПу, 8.; 1кааск, А.; Сгох'ег А.; Наскей, Е; Абаткоп, Б; БтсоН, 8.; Оюккоп, Ό.; Оах/ек, Р.; Ре!егкеп, В.С.; 8ΐеνеηк, М.; бе СгааЕБ, Е.; Vаиΐе^к, Е.; νаπ Вагеп, Б; ННеЬгапб, М.; 1оокке, М.; Кхоп, ЕМ.; №хоНу, Р.; СЬе, Б.К.; Нойоп, 1.; Мотк, ЕС.; Вееб, Б.Е.; Тго_)апохкк1, 1.; Вакип, Н.; БаппЕек, Б.; №ук1аР М.; ЕаЬп, 8.; Оагк, Е.; ТаппепЬегд, Т./ Эобб, Р.; Наухагб, Ν.; Кхок, 1.В.Е; 8сЬойе1б, Р.В.; Апбгеаб1к, А.; 8нохбен, 1.; СгаиНгб, Ό.; №агу, Ό.; Охеп, Е.; ОокЧа, В.А.; Нагбу, 1.; Соа!е, А.; νаη 8х1е1ен, 1.; Маππ, Ό.; Бупск Т.; НеНшк, Р. (1998). АккоааИоп о, М1ккепке апб 5'-8р11се-811е МшаЕопк ίη Таи \\Н1 Не 1нЬег11еб ОетепРа ЕТОР-17. №Нге, 393, 702-705.
1апик, С. е! а1. (2000), №11иге 408: 979 - 982.
Как, Н.8. (1997) 1 М1сгоепсарки1 14: 689-711.
Беоп, Б; СЬепд, С.К.; №итапп, Р.1. (1998). АНЬешег'к Э|кеаке Саге: Сок!к апб Ро(ен11а1 8ахап§к. НеаЙЬ АЙшгк, 17(6), 206-216.
Б1рра С. Е. е! а1. (1998) АЬ-42 бероккюп ргесебек оИег сЬапдек ίη Р8-1 АНЬетег'к б1кеаке. Бансе! 352, 1117-1118.
Био, 1.-1.; νΗ^., V.; Вюсюш, Т.; 1пдгат, О.К.; ВоИ, С.8.; Кик1ак, IV. (1999). ЭеаН о, РС12 Се11к апб Н1рросатра1 №игопк 1пбисеб Ьу Абепохага1-Меб1а1еб ЕАЭ Нитап Ату1о1б Ргесигког Рго1ет Сепе Ехргеккюп. 1оита1 о, №игокаепсе ВекеагсЬ, 55(5), 629-642.
Хатке, 8.; ТНпакагап, С.; Био, 1.-1.; Кик1ак, IV.; Тотйа, Т.; 1ха!киЬо, Т.; Ц1ап, X.; Ст!у, Ό.Ό.; Расе, О.Б.; ВогсЬеИ, О.В.; Vοηд, Р.С.; 81коб1а, 8.8. (1998). ЕПсс1к о, Р81 Оейаепсу оп МетЬгапе Рго1ет ТгаЕйскшд ίη №игопк. №игоп, 21(5), 1213-1231.
№Еопа1 !нк11(и(е оп Адшд Ргодгекк Верой оп АРЕеппег'к Э^еаке, 1999, ΝΙ4 РиЬНсаЕоп №. 99-4 664.
- 31 008762
Р1е1гоЬоп, Р.1. (1995), РИагт Β^Ι^Η^Ε 6: 347-61Роогка], Р.; Βίτά, Т.Э.; Шцктап, Е.; №тепк, Е.; Оагги!о, К.М.; Апдегкоп, Ь.; Апдгеадк, А.; ШЫегкоН, ЭД'.С.; Какктд, М.; 8сИе11епЬегд, О.Э. (1998). Таи 1к а Сапд1да1е Оепе Гог СИготокоте 17 Ргоп1о1етрога1 Эетепка. Аппа1к оГ №иго1оду, 43, 815-825.
8сИепк, Ώ.; НагЬоиг, К.; к)ипп, ^.; Оогдоп, О.; 6га]еда, Н.; Ошдо, Т.; Ни, К.; Ниапд, I.; 1оИпкопШоод, К.; КИап, К.; КИо1одепко, Ώ.; Ьее, М.; Ь1ао, Ζ.; ЫеЬегЬигд, I.; МоИег, К.; МиНег, Ь.; 8опапо, Р.; 8Иорр, О.; Уакдие/, Ν.; Уапдеνе^ΐ, С; Ша!кег, 8.; ШодиНк, М.; Уедпоск, Т.; Оатек, Ώ.; 8еиЬек, р. (1999). 1ттипка1юп мИИ А-Ье1а АИепиа1ек АкИе1тег'к Г)1кеаке-Р1ке Ра1Ио1оду т !Ке РЭАРР Мойке. №1иге, 400(6740), 173-177.
8Ьеки^, Β. е!. а1. (1999), I. Сгук1а1 Огом1И 198/199: 1345 - 1351.
8рШап!1т, М.О.; МиггеП, 1.К.; Ооедегр М.; Раг1ом, М.К.; К1ид, А.; ОИеШ, Β. (1998). Ми1аИоп т !Ке Таи Оепе т РатШа1 Ми1Ир1е 8ук1ет Таиора1Иу миИ РгекепПе Эетепка. Ргосеедтдк оГ 1Ие №Иопа! Асадету оГ 8с1епсек И.8.А., 95(13), 7737-7741.
81пИта11ег, ^.Р; 8аипдегк, А.М.; 8сИтесИе1, Ώ.; Репсак-Уапсе, М.; ЕпдИПд, I.; 8акекеп, О.8.; Кокек, А.Э. (1993). АроИрорго1ет Е: Н^дИ-Αν^д^ίу Нтдтд !о Ав апд 1псгеакед Ргециепсу оГ Туре 4 А11е1е т Ра1еОпке! РатШа1 АкИе1тег Экеаке. Ргосеедтдк оГ !Ке №1юпа1 Асадету оГ 8с1епсек И.8.А., 90, 1977-1981.
У1да1, К.; Ргапдюпе, В.; Кок1адпо, А.; Меад, 8.; Кеνекζ, Т.; Р1апр О.; ОИко, I. (1999). А 81ор-Содоп МиШюп т 1Ие ΒΡΙ Оепе Аккос1а1ед мИИ РатШа1 НиикИ Эетепка. №1иге, 399: 776-781.
ΖΗβ^ Н. (1996) М1се дейс1еп! Гог !Ке атуЫд ргесигког рго!ет депе. Апп. N Υ Асад. 8сг, 777, 421426.
^огк, Р. (1999), Р8ТТ 11: 430-440.
Список последовательностей <110> М&Е ВбоЪесН А/8 <120> Новый способ супрессии амилоида <130> Р1009РС1 <140>
<141>
<160> 16 <170> РабепЫп Уег. 3.0 <210> 1 <211> 2313 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(2313) <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (2098)..(2169) <223> нуклеотиды, кодирующие трансмембранный район <220>
<221> т1зс_£еа-(:иге <222> (2014)..(2313) < 2 2 3 > нуклеотиды, коди рующие С-100 <220>
<221> т1зс_£еаЪиге <222> (2016)..(2144) <223> АЬеСа 42/43 <220>
- 32 008762 <221> ш1зс_£еакиге <222> (2014)..(2142) <223> АЬека 42/43 <400> 1
акд Мек 1 | сед ссс | ддБ С1у | ББд дса | сБд сБс сБд сБд дсс дсс Бдд | асд ТЬг | дек А1а 15 | едд Агд | 48 | ||||||||
Ьеи | Рго | Ьеи 5 | А1а | Ьеи Ьеи Ьеи | Ьеи 10 | А1а | А1а | Тгр | ||||||||
дед | скд | дад | дБ а | ссс | асБ | даБ | ддБ | ааБ | дсБ | ддс | сБд | сБд | дсБ | даа | ссс | 96 |
А1а | Беи | С1и | Уа1 | Рго | ТЬг | Азр | С1у | Азп | А1а | С1у | Ьеи | Ьеи | А1а | С1и | Рго | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
сад | акк | дсс | акд | ББс | Б дБ | ддс | ада | сБд | аас | аБд | сас | аБд | ааБ | дке | сад | 144 |
С1п | Не | А1а | Мек | РЬе | Суз | С1у | Агд | Ьеи | Азп | МеБ | ΗΪ3 | Мек | А5П | Уа1 | С1п | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
аак | ддд | аад | Бдд | да Б | Беа | даБ | сса | Беа | ддд | асе | ааа | асе | Бдс | акк | дак | 192 |
Азп | С1у | Ьуз | Тгр | Азр | Зег | Азр | Рго | Зег | С1у | ТЬг | Ьуз | ТЬг | Суз | Не | Азр | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
асе | аад | даа | ддс | акс | сБд | сад | БаБ | Бдс | саа | даа | дБ с | Бас | ссБ | даа | скд | 240 |
ТЬг | Ьуз | С1и | С1у | 11е | Ьеи | С1п | Туг | Суз | С1п | С1и | Уа1 | Туг | Рго | С1и | Ьеи | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
сад | акс | асе | аак | дБд | дБ а | даа | дсс | аас | саа | сса | дБд | асе | аБс | сад | аас | 288 |
С1п | 11е | ТЬг | Азп | Уа1 | Уа1 | С1и | А1а | Азп | С1п | Рго | Уа1 | ТЬг | 11е | С1п | Азп | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
Бдд | Бдс | аад | едд | ддс | сдс | аад | сад | Бдс | аад | асе | сак | ссс | сас | БкЬ | дБд | 336 |
Тгр | Суз | Ьуз | Агд | С1у | Агд | Ьуз | С1п | Суз | Ьуз | ТЬг | ΗΪ3 | Рго | ΗΪ3 | РЬе | Уа1 | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
акк | ссс | Бас | еде | Бдс | ББа | дББ | ддБ | дад | БББ | дБа | адк | даБ | дсс | скБ | скс | 384 |
Не | Рго | Туг | Агд | Суз | Ьеи | Уа1 | С1у | 61и | РЬе | Уа1 | Зег | Азр | А1а | Ьеи | Ьеи | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
дБ к | сек | да с | аад | Бдс | ааа | ББс | ББа | сас | сад | дад | адд | аБд | даБ | дББ | к де | 432 |
Уа1 | Рго | Азр | Ьуз | Суз | Ьуз | РЬе | Ьеи | ΗΪ3 | С1п | С1и | Агд | МеБ | Азр | Уа1 | Суз | |
130 | 135 | 140 |
даа асЕ саЕ С1и ТЬг ΗΪ3 145 | сЕЕ Ьеи | сас Едд | сас асе дЕс дсс ааа дад | аса ТЬг | Еде Суз | адЕ Зег | дад 61и 160 | 480 | ||||||||
Н1з | Тгр 150 | Нхз | ТЬг Уа1 | А1а | Ьуз 155 | 61и | ||||||||||
аад | а дБ | асе | аас | ЕЕд | саЕ | дас | Еас | ддс | аЕд | ЕЕд | сЕд | ссс | Еде | дда | аЕЕ | 528 |
Ьуз | Зег | ТЬг | Аэп | Ьеи | Н1з | Азр | Туг | 61у | МеЕ | Ьеи | Ьеи | Рго | Суз | 61у | Не | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
дас | аад | ЕЕс | еда | ддд | дБ а | дад | еее | дьд | ЕдЕ | Еде | сса | сЕд | дсЕ | даа | даа | 576 |
Азр | Ьуз | РЬе | Агд | С1у | Уа1 | 61и | РЬе | Уа1 | Суз | Суз | Рго | Ьеи | А1а | 61и | 61и | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
адЕ | дас | ааЕ | дкд | да 5 | Бек | дсЕ | даЕ | дед | дад | дад | даЕ | дас | Бед | даЕ | дЕс | 624 |
Бег | Азр | Аэп | Уа1 | Азр | Зег | А1а | Азр | А1а | С1и | С1и | Азр | Азр | Зег | Азр | Уа1 | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
Ьдд | Ьдд | ддс | дда | дса | дас | аса | дас | Бак | дса | даЕ | ддд | адЕ | даа | дас | ааа | 672 |
Тгр | Тгр | С1у | 61у | А1а | Азр | ТЬг | Азр | Туг | А1а | Азр | С1у | Зег | С1и | Азр | Ьуз | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
дЕа | дЕа | даа | дЕа | дса | дад | дад | даа | даа | д5д | дсЕ | дад | дкд | даа | даа | даа | 720 |
Уа1 | Уа1 | <31 и | Уа1 | А1а | 61и | С1и | 61и | С1и | Уа1 | А1а | С1и | Уа1 | 61и | С1и | 61и | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
даа | дсс | даЕ | даЕ | дас | дад | дас | даЕ | дад | даЕ | ддЕ | даЕ | дад | дЕа | дад | даа | 768 |
С1и | А1а | Азр | Азр | Азр | С1и | Азр | Азр | 61и | Азр | 61у | Азр | 61и | Уа1 | С1и | С1и | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
дад | дсЕ | дад | даа | ссс | Сае | даа | даа | дсс | аса | дад | ада | асе | асе | аде | аЕЕ | 816 |
61и | А1а | 61и ’61и | Рго | Туг | 61и | 61 и | А1а | ТЬг | б1и | Агд | ТЬг | ТЬг | Зег | 11е | ||
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
дсс | асе | асе | асе | асе | асе | асе | аса | дад | Бек | дЪд | даа | дад | дкд | дЕЕ | еда | 864 |
А1а | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | 61и | Зег | Уа1 | 61и | 61и | Уа1 | Уа1 | Агд | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
дад | дкд | Еде | ЕсЕ | даа | саа | дсс | дад | асд | ддд | сед | Еде | еда | дса | аЕд | аЕс | 912 |
С1и | Уа1 | Суз | Зег | С1и | 61П | А1а | 61и | ТЬг | 61у | Рго | Суз | Агд | А1а | МеЕ | 11е |
290 295 300
Есс еде Едд | Еас ЕЕЕ Туг РЬе | даЕ дЕд асЕ даа ддд аад ЕдЕ дес | сса ЕЕс | ЕЕЕ РЬе 320 | 960 | |||||||||||
Зег 305 | Агд | Тгр | Азр Уа1 ТЬг 310 | 61и | 61у | Ьуз 315 | Суз | А1а | Рго | РЬе | ||||||
Еас | ддс | дда | ЕдЕ | ддс | ддс | аас | едд | аас | аас | ЕЕЕ | дас | аса | даа | дад | Еас | 1008 |
Туг | 61у | 61 у | Суз | 51у | 61у | Азп | Агд | Азп | Азп | РЬе | Азр | ТЬг | 61 и | 51и | Туг | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
Еде | аЕд | дес | дЕд | ЕдЕ | ддс | аде | дес | аЕд | Есс | саа | адЕ | ЕЕа | сЕс | аад | асЕ | 1056 |
Суз | МеЕ | А1а | Уа1 | Суз | 61у | Зег | А1а | МеЕ | Зег | 61п | Зег | Ьеи | Ьеи | Ьуз | ТЬг | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
асе | сад | даа | ссЕ | сЕЕ | дсс | еда | даЕ | ссЕ | дЕЕ | ааа | сЕЕ | ссЕ | аса | аса | дса | 1104 |
ТЬг | С1п | 51и | Рго | Ьеи | А1а | Агд | Азр | Рго | Уа1 | Ьуз | Ьеи | Рго | ТЬг | ТЬг | А1а | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
дес | адЕ | асе | ссЕ | даЕ | дес | дЕЕ | дас | аад | ЕаЕ | сЕс | дад | аса | ссЕ | ддд | даЕ | 1152 |
А1а | Зег | ТЬг | Рго | Азр | А1а | Уа1 | Азр | Ьуз | Туг | Ьеи | С1и | ТЬг | Рго | 61у | Азр | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
дад | ааЕ | даа | саЕ | дес | саЕ | ЕЕс | сад | ааа | дес | ааа | дад | адд | сЕЕ | дад | дсс | 1200 |
61и | Азп | 61и | ΗΪ3 | А1а | Н13 | РЬе | 61п | Ьуз | А1а | Ьуз | С1и | Агд | Ьеи | 61и | А1а | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
аад | сас | еда | дад | ада | аЕд | Есс | сад | дЕс | аЕд | ада | даа | Едд | даа | дад | дса | 1248 |
Ьуз | ΗΪ3 | Агд | 51 и | Агд | МеЕ | Зег | 61п | Уа1 | МеЕ | Агд | 51 и | Тгр | 61и | 61 и | А1а | |
4 05 | 410 | 415 | ||||||||||||||
даа | сдЕ | саа | дса | аад | аас | ЕЕд | ссЕ | ааа | дсЕ | даЕ | аад | аад | дса | дЕЕ | аЕс | 1296 |
61и | Агд | 61п | А1а | Ьуз | Азп | Ьеи | Рго | Ьуз | А1а | Азр | Ьуз | Ьуз | А1а | Уа1 | Не | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
сад | саЕ | ЕЕс | сад | дад | ааа | дЕд | даа | ЕсЕ | ЕЕд | даа | сад | даа | дса | дсс | аас | 1344 |
61п | ΗΪ3 | РЬе | 61п | 61и | Ьуз | Уа1 | 51и | Зег | Ьеи | 61и | 51п | 51и | А1а | А1а | Азп | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
дад | ада | сад | сад | сЕд | дЕд | дад | аса | сас | аЕд | дес | ада | дЕд | даа | дсс | аЕд | 1392 |
61и | Агд | 61п | С1п | Ьеи | Уа1 | 61и | ТЬг | ΗΪ3 | МеЕ | А1а | Агд | Уа1 | С1и | А1а | МеЕ | |
450 | 455 | 460 |
- 35 008762
скс аак | дас сдс Азр Агд | сдс Агд | сдс Агд 470 | скд дсс | скд Ьеи | дад аас кас | акс 11е | асе Ткг | дек А1а | скд Ьеи 480 | 1440 | |||||
Ьеи 465 | Азп | Ьеи | А1а | 61 и | Азп 475 | Туг | ||||||||||
сад | дек | дкк | сск | сск | едд | сск | едк | сас | дкд | ккс | аак | акд | ска | аад | аад | 1488 |
61п | А1а | Уа1 | Рго | Рго | Агд | Рго | Агд | Нхз | Уа1 | Рке | Азп | Мек | Ьеи | Ьуз | Ьуз | |
485 | 4 90 | 495 | ||||||||||||||
как: | дке | сдс | дса | даа | сад | аад | дас | ада | сад | сас | асе | ска | аад | сак | ккс | 1536 |
Туг | Уа1 | Агд | А1а | 61и | 61п | Ьуз | Азр | Агд | 61 п | ΗΪ3 | Ткг | Ьеи | Ьуз | ΗΪ3 | Рке | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
дад | сак | дкд | сдс | акд | дкд | дак | ссс | аад | ааа | дсс | дек | сад | акс | едд | ксс | 1584 |
61и | ΗΪ3 | Уа2 | Агд | Мек | Уа1 | Азр | Рго | Ьуз | Ьуз | А1а | А1а | 61 п | Не | Агд | Зег | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
сад | дкк | акд | аса | сас | скс | едк | дъд | акк | как | дад | сдс | акд | аак | сад | кек | ,1632 |
01 η | Уа1 | Мек | Ткг | Н1з | Ьеи | Агд | Уа1 | 11е | Туг | 61и | Агд | Мек | Азп | 61п | Зег | |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
скс | ксс | скд | скс | кас | аас | дкд | сск | дса | д*д | дсс | дад | дад | акк | сад | дак | 1680 |
Ьеи | 5ег | Ьеи | Ьеи | Туг | Азп | Уа1 | Рго | А1а | Уа1 | А1а | 61и | 61и | 11е | 61п | Азр | |
545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
даа | дкк | дак | дад | скд | екк | сад | ааа | дад | саа | аас | как | кса | дак | дас | дке | 1728 |
С1и | Уа1 | Азр | С1и | Ьеи | Ьеи | 61п | Ьуз | 61и | 61п | Азп | Туг | Зег | Азр | Азр | Уа1 | |
565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
Ыд | дсс | аас | акд | акк | адк | даа | сса | адд | акс | адк | кас | дда | аас | дак | дек | 1776 |
Ьеи | А1а | Азп | Мек | Не | Зег | 61и | Рго | Агд | 11е | Зег | Туг | 61у | Азп | Азр | А1а | |
580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
скс | акд | сса | кек | ккд | асе | даа | асд | ааа | асе | асе | дкд | дад | скс | екк | ссс | 1824 |
Ьеи | Мек | Рго | Зег | Ьеи | Ткг | 61и | Ткг | Ьуз | Ткг | Ткг | Уа1 | 61и | Ьеи | Ьеи | Рго | |
595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
дкд | аак | дда | дад | ккс | аде | скд | дас | дак | скс | сад | ссд | кдд | сак | кек | ккк | 1872 |
Уа1 | Аз η | 61у | 61 и | Рке | Зег | Ьеи | Азр | Азр | Ьеи | С1П | Рго | Тгр | Н1з | Зег | Рке | |
610 | 615 | 620 |
- 36 008762
ддд дек дас | кек Зег | дкд сса | дсс аас аса даа аас даа | дкк дад | сск Рго | дкк Уа1 640 | 1920 | |||||||||
б1у 625 | А1а | Азр | Уа1 | Рго 630 | А1а | Азп | ТЬг | 61и | Азп 635 | 61и | Уа1 | 61и | ||||
дак | дсс | сдс | сск | дек | дсс | дас | еда | дда | скд | асе | аск | еда | сса | ддк | кек | 1968 |
Аар | А1а | Агд | Рго | А1а | А1а | Азр | Агд | 61у | Ьеи | ТЬг | ТЬг | Агд | Рго | 61 у | Зег | |
645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
ддд | ккд | аса | аак | акс | аад | асд | дад | дад | акс | кек | даа | дкд | аад | акд | дак | 2016 |
61у | Ьеи | ТЬг | Азп | Не | Ьуз | ТЬг | 61и | 61и | 11е | Зег | 61и | Уа1 | Ьуз | Мек | Азр | |
660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
дса | да а | ккс | еда | сак | дас | кса | дда | как | даа | дкк | сак | сак | саа | ааа | ккд | 2064 |
А1а | 61и | РЬе | Агд | Н±з | Азр | Зег | 61у | Туг | 61и | Уа1 | ΗΪ3 | Н1з | 61п | Ьуз | Ьеи | |
675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
дкд | ккс | ккк | дса | да а | дак | дкд | ддЬ | кса | аас | ааа | ддк | дса | акс | акк | дда | 2112 |
Уа1 | РЬе | РЬе | А1а | 61и | Азр | Уа1 | 61у | Зег | Азп | Ьуз | 61у | А1а | 11е | 11е | С1у | |
690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
скс | акд | дкд | ддс | ддк | дкк | дке | ака | дед | аса | дкд | акс | дке | акс | асе | ккд | 2160 |
Ьеи | Мек | Уа1 | 61у | 61у | Уа1 | Уа1 | 11е | А1а | ТЬг | Уа1 | 11е | Уа1 | Не | ТЬг | Ьеи | |
705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
дйд | акд | скд | аад | аад | ааа | сад | кас | аса | ксс | сак. | сак | ддк | дкд | дкд | 2208 | |
Уа1 | Мек | Ьеи | Ьуз | Ьуз | Ьуз | 61п | Туг | ТЬг | Зег | 11е | Н13 | Нйз | 61у | Уа1 | Уа1 | |
725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
дад | дьс | дас | дсс | дек | дке | асе | сса | дад | дад | сдс | сас | скд | ксс | аад | акд | 2256 |
С1и | Уа1 | Азр | А1а | А1а | Уа1 | ТЬг | Рго | 61и | 61 и | Агд | Н13 | Ьеи | Зег | Ьуз | Мек | |
740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
сад | сад | аас | ддс | Рас | даа | аак | сса | асе | кас | аад | ккс | ккк | дад | сад | акд | 2304 |
61п | 61п | Азп | 61 у | Туг | 61 и | Азп | Рго | ТЬг | Туг | Ьуз | РЬе | РЬе | 61 и | 61п | Мек | |
755 | 760 | 765 |
сад аас кад
61п Азп
770
2313
- 37 008762 <210> 2 <211> 770 <212> Белок <213> Ното зариепз <400> 2
Мей 1 | Беи Рго | С1у | Беи А1а Беи Ьеи Ьеи Беи А1а А1а Тгр ТЬг А1а | Агд | |||||||||||
5 | 10 | 15 | |||||||||||||
А1а | Ьеи | С1и | Уа1 | Рго | ТЬг | Азр | С1у | Азп | А1а | 61у | Ьеи | Беи | А1а | 61и | Рго |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
51п | 11е | А1а | Мек | РЬе | Суз | С1у | Агд | Ьеи | Азп | МеБ | ΗΪ5 | МеЬ | Азп | Уа1 | 61п |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Азп | 61у | Ьуз | Тгр | Азр | Зег | Азр | Рго | Зег | 61у | ТЬг | Ьуз | ТЬг | Суз | 11е | Азр |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
ТЬг | Ьуз | 61и | 61у | 11е | Беи | 61п | Туг | Суз | 61п | С1и | 17а 1 | Туг | Рго | 61и | Ьеи |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
С1п | 11е | ТЬг | Азп | Уа1 | Уа1 | 61и | А1а | Азп | С1п | Рго | Уа1 | ТЬг | 11е | С1п | Азп |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Тгр | Суз | Ьуз | Агд | 61у | Агд | Ьуз | С1п | Суз | Ьуз | ТЬг | Низ | Рго | Низ | РЬе | Уа2 |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Не | Рго | Туг | Агд | Суз | Беи | Уа1 | С1у | С1и | РЬе | Уа1 | Зег | Азр | А1а | Ьеи | Ьеи |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Уа1 | Рго | Азр | Ьуз | Суз | Буз | РЬе | Ьеи | ΗΪ3 | 61п | 61и | Агд | МеЬ | Азр | 17а 1 | Суз |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
С1и | ТЬг | ΗΪ3 | Ьеи | ΗΪ5 | Тгр | Низ | ТЬг | Уа1 | А1а | Ьуз | 61и | ТЬг | Суз | Зег | 61и |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ьуз | Зег | ТЬг | Азп | Беи | Низ | Азр | Туг | 61 у | МеЬ | Ьеи | Ьеи | Рго | Суз | 61 у | 11е |
165 | 170 | 175 |
- 38 008762
Азр | Ъуз | •РЬе Агд 61у 180 | Уа1 | 61и РЬе Уа1 Суз Суз 185 | Рго | Ъеи | А1а 190 | 61и | 61и | ||||||
Зег | Азр | Азп | Уа1 | Азр | Зег | А1а | Азр | А1а | С1и | 61и | Азр | Азр | Зег | Азр | Уа1 |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Тгр | Тгр | 61у | 61у | А1а | Азр | ТЬг | Азр | Туг | А1а | Азр | 61 у | Зег | 61и | Азр | Ъуз |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Уа1 | Уа1 | С1и | Уа1 | А1а | С1и | 61 и | 61 и | 61и | Уа1 | А1а | 61и | Уа1 | С1и | 61и | 61и |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
С1и | А1а | Азр | Азр | Азр | С1и | Азр | Азр | 61и | Азр | 61у | Азр | 61 и | Уа1 | 61и | 61и |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
61и | А1а | 61и | 61и | Рго | Туг | 61и | 61и | А1а | ТЬг | 61и | Агд | ТЬг | ТЬг | Зег | Не |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
А1а | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | ТЬг | 61 и | Зег | Уа1 | 61и | 61 и | Уа1 | Уа1 | Агд |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
С1и | Уа1 | Суз | Зег | 61и | С1п | А1а | 61и | ТЫ | 61 у | Рго | Суз | Агд | А1а | Мек | 11е |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Зег | Агд | Тгр | Туг | РЬе | Азр | Уа1 | ТЬг | 61 и | 61у | Ъуз | Суз | А1а | Рго | РЬе | РЬе |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Туг | 61у | С1у | Суз | С1у | С1у | Азп | Агд | Азп | Азп | РЬе | Азр | ТЬг | 61и | 61и | Туг |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Суз | МеЬ | А1а | Уа1 | Суз | 61 у | Зег | А1а | МеЬ | Зег | 61п | Зег | Ъеи | Ъеи | Ъуз | ТЬг |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
ТЬг | С1п | С1и | Рго | Ъеи | А1а | Агд | Азр | Рго | Уа1 | Ъуз | Ъеи | Рго | ТЬг | ТЬг | А1а |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
А1а | Зег | ТЬг | Рго | Азр | А1а | Уа1 | Азр | Ъуз | Туг | Ъеи | 61и | ТЬг | Рго | 61у | Азр |
370 | 375 | 380 |
- 39 008762
61и 385 | Азп | 61и Нхз А1а | ΗΪ3 390 | РЬе | 61п | Ьуз | А1а | Ьуз 61и Агд Ьеи 61и А1а | |||||||
395 | 400 | ||||||||||||||
Ьуз | Ηίδ | Агд | 61и | Агд | Мей | Зег | 51п | Уа1 | Мей | Агд | 61и | Тгр | 61и | 61и | А1а |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
61и | Агд | 61п | А1а | Ьуз | Азп | Ьеи | Рго | Ьуз | А1а | Азр | Ьуз | Ьуз | А1а | Уа1 | 11е |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
61п | Ηίδ | РЬе | 61п | 61и | Ьуз | Уа1 | 61 и | Зег | Ьеи | С1и | 61п | 61и | А1а | А1а | Азп |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
61и | Агд | 61п | 61п | Ьеи | Уа1 | 61и | ТЬг | Ηίδ | Мей | А1а | Агд | Уа1 | 61и | А1а | Мей |
450 | 455 | 4 60 | |||||||||||||
Ьеи | Азп | Азр | Агд | Агд | Агд | Ьеи | А1а | Ьеи | 61и | Азп | Туг | Не | ТЬг | А1а | Ьеи |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
61 η | А1а | Уа1 | Рго | Рго | Агд | Рго | Агд | Ηίδ | Уа1 | РЬе | Азп | Мей | Ьеи | Ьуз | Ьуз |
485 | 4 90 | 495 | |||||||||||||
Туг | Уа1 | Агд | А1а | 61и | 61п | Ьуз | Азр | Агд | 61п | Ηί3 | ТЬг | Ьеи | Ьуз | Ηίδ | РЬе |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
61и | Нйз | Уа1 | Агд | МеЬ | Уа1 | Азр | Рго | Ьуз | Ьуз | А1а | А1а | 61 п | 11е | Агд | Зег |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
61 η | Уа1 | МеЕ | ТЬг | НЬз | Ьеи | Агд | Уа1 | Не | Туг | 61и | Агд | Мей | Азп | 61 п | Зег |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Ьеи | 5ег | Ьеи | Ьеи | Туг | Азп | Уа1 | Рго | А1а | Уа1 | А1а | 61и | 61и | 11е | 61п | Азр |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
61и | Уа1 | Азр | 61и | Ьеи | Ьеи | 61п | Ьуз | 61и | 61п | Азп | Туг | Зег | Азр | Азр | Уа1 |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ьеи | А1а | Азп | МеЬ | Не | Зег | 61и | Рго | Агд | 11е | Зег | Туг | б1у | Азп | Азр | А1а |
580 585 590
- 40 008762
Беи МеЪ Рго | Зег Беи ТЬг | С1и | ТЬг 600 | Буз ТЬг ТЬг | Уа1 | 01и 605 | Беи | Беи | Рго | ||||||
595 | |||||||||||||||
Уа1 | Азп | 01у | С1и | РЬе | Зег | Беи | Азр | Азр | Беи | 01п | Рго | Тгр | Н1з | Зег | РЬе |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
61у | А1а | Азр | Зег | Уа1 | Рго | А1а | Азп | ТЬг | 01 и | Азп | 01 и | Уа1 | С1и | Рго | Уа1 |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Азр | А1а | Агд | Рго | А1а | А1а | Азр | Агд | 61у | Беи | ТЬг | ТЬг | Агд | Рго | С1у | Зег |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
С1у | Беи | ТЬг | Азп | Не | Буз | ТЬг | О1и | 61и | 11е | Зег | 01 и | Уа1 | Буз | Мек | Азр |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
А1а | 01 и | РЬе | Агд | Н1з | Азр | Зег | О1у | Туг | С1и | Уа1 | Н1з | ΗΪ3 | С1п | Буз | Беи |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Уа1 | РЬе | РЬе | А1а | О1и | Азр | Уа1 | С1у | Зег | Азп | Буз | С1у | А1а | 11е | 11е | С1у |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Беи | МеЬ | Уа1 | С1у | С1у | Уа1 | Уа1 | 11е | А1а | ТЬг | Уа1 | 11е | Уа1 | 11е | ТЬг | Беи |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Уа1 | Мек | Беи | Буз | Буз | Буз | 61п | Туг | ТЬг | Зег | 11е | Ηίδ | НБз | С1у | Уа1 | Уа1 |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
С1и | Ца1 | Азр | А1а | А1а | Уа1 | ТЬг | Рго | О1и | О1и | Агд | Ηίδ | Беи | Зег | Буз | Мек |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
С1п | С1п | Азп | С1у | Туг | б1и | Азп | Рго | ТЬг | Туг | Буз | РЬе | РЬе | 01 и | С1п | Мек |
755 | 7 60 | 7 65 |
51η Азп
770 <210> 3 <211> 45 <212> ДНК <213> ΟΙοδΕΓϊάϊυτη ЪеЬап!
- 41 008762 <220>
<221> СОЗ <222> (1) . . (45) <223> ДНК, кодирующая эпитоп Р2 <400> 3
сад | Ьас | аЬс | ааа | дсЬ | аас | Ьсс | ааа | ЬЬс | аЬс | ддЬ | аЬс | асе | дад | сЬд | 45 |
С1п | Туг | Не | Ъуз | А1а | Азп | Зег | Ъуз | РЬе | Не | 61у | Не | ТЬг | С1и | Ъеи | |
1 | 5 | 10 | 15 |
<210> 4 <211> 15 <212> Белок <213> СЪозЬгбсЦит ееЬап!
<400> 4
С1п Туг Не Ъуз А1а Азп Зег Ъуз РЬе Не С1у Не ТЬг С1и Ьеи
Ю 15 <210> 5 <211> 63 <212> ДНК <213> С1озег1с11и1П йеЪапх <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(63) <22 3> ДНК, кодирующая эпитоп РЗО <400> 5
ЬЬс аас | аас | ЬЬс | асе | дЬа | аде | ЬЪс | сед | сдЬ | деь | ссд | ааа | д-ее | аде | 48 | |
РЬе Азп | Азп | РЬе | ТЬг | Уа1 | Зег | РЬе | Тгр | Ъеи | Агд | Уа1 | Рго | Ъуз | Уа1 | Зег | |
1 | 5 | 10 | 15 |
- 42 008762 дсй аде сас сЪд даа ®-’
А1а Зег Нлэ Беи С1и <210> 6 <211> 21 <212> Белок <213> С1озЪг101ит йейап!
<400> б
Рйе Азп Азп Рйе Тйг Уа1 Зег Рйе Тгр Беи Агд Уа1 Рго Буз Уа1 Зег 15 Ю15
А1а Зег Нлз Беи С1и <210>7 <211> 21 <212> ДНК <213> синтетическая <400>7 саасЕсадсЕ РссйЕЕсддд с21 <210> 8 <211> 21 <212> ДНК <213> синтетическая <400>8 адаЕсйсдай сссдсдааай ί21 <210>9 <211>135 <212> ДНК <213> синтетическая <400>9 айддаЕдсад аа±1:ссд1:са сдасЬссддЪ Ъасдаадййс ассассадаа асЕддрЫтЕс60
- 43 008762
ЕЕсдсадаад аЪдЕЪддБСс | саасааадд-Ь | дсааБсаСсд | дЪсЬдаЪдд·!: | Бддсдд'ЬдЕЪ | 120 | |
дЬБаксдсда сскад | 135 | |||||
<210> | 10 | |||||
<211> | 31 | |||||
<212> | ДНК | |||||
<213> | синтетическая | |||||
<400> | 10 | |||||
дссддссаБд дакдсадаак | ЕссдЕсасда | с | 31 | |||
<210> | 11 | |||||
<211> | 39 | |||||
<212> | ДНК | |||||
<213> | синтетическая | |||||
<400> | 11 | |||||
дссддаадсЕ БскаддЕсдс | даБаасааса | ссдссаасс | 39 | |||
<210> | 12 | |||||
<211> | 84 | |||||
<212> | ДНК | |||||
<213> | синтетическая | |||||
<400> | 12 | |||||
ссддсаадсЕ ЕсСасадскс | ддЕдаЕассд | аБдааЕСЕдд | ад'ЕЕадсЕС'Ь | даЕдЪасЕдд | 60 | |
дксдсдаЕаа саасассдсс | аасс | 84 | ||||
<210> | 13 | |||||
<211> | 101 | |||||
<212> | ДНК | |||||
<213> | синтетическая | |||||
<400> | 13 | |||||
дссддссакд ддЕСЕсааса | асЕИсассдЕ | ЕадсББсЕдд | сЪдсдЕд-СЕс | сдааадЪЪад | 60 | |
сдсдадссас сЬддаадаЕд | садааБЪссд | СсасдасЪсс | 9 | 101 |
<210> 14 <211> 172
- 44 008762 <212> ДНК < 213 > синтетическая <400> 14
дддссаадсЕ ЕддаЕссддЕ ссЕЕЕдрЕдд аассаасаЕс ссддадксдк дасддааскс | сдсдаЕааса ЪСсЕдсдаад ЕдсаЪссадс | асассдссаа аааассад-Ы: ЕсддЪдаЕас | ссаЕсадасс даЕдаЕЕдса кскддСддЕд аасЕксдкаа | 60 120 172 | ||
сдаТдааЩЕ | дд | |||||
<210> | 15 | |||||
<211> | 30 | |||||
<212> | ДНК | |||||
<213> | синтетическая | |||||
<400> | 15 | |||||
сЬддаадайд сададЕЪссд | ЕсасдасРсс | 30 | ||||
<210> | 16 | |||||
<211> | 35 | |||||
<212> | ДНК | |||||
<213> | синтетическая | |||||
<400> | 16 | |||||
дсдссддаЕс сЕЕсаасаас | СЕсассдМа | дсЪЕс | 35 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (46)
1. Способ ш у1уо понижающей регуляции аутологичного бета-амилоидного (Ав) белка или аутологичного белка-предшественника амилоида (АРР) у животного, в том числе человека, предусматривающий осуществление представления иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного аналога аутологичного Ав или аутологичного АРР животного, полученного путем введения в них по меньшей мере одного выделенного чужеродного Т-хелперного эпитопа (Тнэпитопа) посредством инсерции, добавки, делеции или замены, с сохранением существенной фракции Вклеточных эпитопов Ав и АРР, так что иммунизация данного животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против аутологичного Ав или аутологичного АРР у животного, причем чужеродный Тн-эпитоп вводят в Ав или АРР, как схематически показано для эпитопов Р2 и Р30 на чертеже и раскрыто в описании.
2. Способ по п.1, согласно которому в аутологичный Ав или АРР дополнительно вводят по меньшей мере одну первую структуру, которая нацеливает аналог на антигенпредставляющую клетку (АРС) или В-лимфоцит, и/или дополнительно вводят по меньшей мере одну вторую структуру, которая стимулирует иммунную систему, и/или дополнительно вводят по меньшей мере одну третью структуру, которая оптимизирует представление аналога иммунной системе.
3. Способ по п.2, согласно которому аналог модифицирован путем введения в качестве боковых групп, ковалентно или нековалентно прикрепленных к Ав, АРР или их фрагментам, первой, и/или второй, и/или третьей структур.
4. Способ по любому из пп.1-3, согласно которому дополнительно осуществляют дупликацию по меньшей мере одного В-клеточного эпитопа аналога Ав или АРР и/или введение гаптена.
5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому чужеродный Тн-эпитоп является иммунодоминантным у животного.
6. Способ по любому из пп.1-5, согласно которому чужеродный Т-клеточный эпитоп является смешанным, таким как чужеродный Т-клеточный эпитоп, который выбран из природно встречающейся и неприродной пептидной последовательности, связывающейся с МНС класса ΙΙ.
7. Способ по п.6, согласно которому природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного токсоида, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного токсоида, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р. Га1с1рагит.
8. Способ по любому из пп.2-7, согласно которому первая структура является партнером специфического связывания для В-лимфоцит-специфического поверхностного антигена или для АРСспецифического поверхностного антигена, таким как гаптен или углевод, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или АРС.
- 45 008762
9. Способ по любому из пп.2-8, согласно которому вторая структура представляет собой цитокин, такой как интерферон у(1Р№у), Р113Ь, интерлейкин 1 (1Ь-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь-4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Ь-12), интерлейкин 13 (ΣΠ-13), интерлейкин 15 (ΣΠ-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-СБР), гормон, или белок теплового шока, такой как НБР70, НБР90, НБС70, ОВР94 и кальретикулин (СВТ).
10. Способ по любому из пп.2-9, согласно которому третья структура имеет липидную природу и является пальмитоильной группой, миристильной группой, фарнезильной группой, геранил-геранильной группой, ОР1-якорем и Ν-ацилдиглицеридной группой.
11. Способ по любому из пп.2-9, согласно которому третья структура является полигидроксиполимером, таким как полисахарид.
12. Способ по любому из пп.1-11, согласно которому аутологичный Ав или АРР модифицируют таким образом, чтобы сохранить В-клеточные эпитопы, которые не экспонированы во внеклеточной фазе, когда аутологичный АРР связан с клеткой.
13. Способ по п.12, согласно которому Ав или АРР модифицируют таким образом, чтобы в нем отсутствовал по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, который экспонирован во внеклеточной фазе, когда аутологичный АРР связан с клеткой.
14. Способ по любому из пп.1-13, согласно которому для введения чужеродного Тн-эпитопа в аутологичный Ав или АРР осуществляют замену по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в аутологичном Ав или АРР аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины.
15. Способ по п.1, согласно которому указанный аналог от Ν- до С-конца состоит из аминокислотных остатков 672-714 последовательности БЕО ΣΟ N0:2, за которыми следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:4, затем следуют аминокислотные остатки 672-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, затем аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:6, а затем аминокислотные остатки 672-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2.
16. Способ по п.1, согласно которому указанный аналог от N до С-конца состоит из аминокислотных остатков 630-634 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, за которыми следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:6, затем следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:4, а затем аминокислотные остатки 671-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2.
17. Способ по п.1, согласно которому указанный аналог от N до С-конца состоит из аминокислотных остатков 672-713 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, за которыми следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:6, затем следуют аминокислотные остатки 729-734 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, затем аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:4, а затем аминокислотные остатки 750-770 последовательности БЕО ΣΌ N0:2.
18. Способ по любому из пп.1-13, согласно которому указанный аналог содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 672-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, в которую встроена аминокислотная последовательность, которая приводит к появлению чужеродного Тнэпитопа или в которой по меньшей мере один участок заменен участком равной или отличающейся длины, что приводит к появлению чужеродного Тн-эпитопа.
19. Способ по любому из пп.1-18, согласно которому в организм животного вводят по меньшей мере две копии аналога, ковалентно или нековалентно связанные с молекулой-носителем, способной осуществлять представление иммунной системе множественных копий антигенных детерминант.
20. Способ по любому из пп.1-19, согласно которому аналог смешивают с адъювантом, который облегчает разрушение аутотолерантности в отношении аутоантигенов.
21. Способ по любому из пп.1-20, согласно которому эффективное количество аналога вводят животному парентеральным способом, таким как внутрикожный, подкожный и внутримышечный; перитонеальным способом; пероральным способом; буккальным способом; подъязычным способом; эпидуральным способом; спинальным способом; анальным способом или интракраниальным способом.
22. Способ по п.21, согласно которому эффективное количество аналога составляет от 0,5 до 2000 мкг.
23. Способ по п.21 или 22, согласно которому аналог заключают в устройство виртуального лимфатического узла (УЪ№), раскрытое в описании.
24. Способ по любому из пп.1-18, согласно которому указанный аналог вводят в организм животного путем встраивания нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей (кодирующих) аналог, в клетки животного с последующей экспрессией ш у1уо в этих клетках нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
25. Способ по п.24, согласно которому нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) выбирают из голой ДНК; ДНК, связанной с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, заключенной в липосомы; ДНК, встроенной в вирусный вектор; ДНК, связанной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом; ДНК, связанной с нацеливающим белком или полипептидом; ДНК, находящейся в комплексе с кальций-осаждающими агентами; ДНК, связанной с молекулой инертного носителя; ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан; и ДНК в смеси с адъювантом.
26. Способ по п.25, согласно которому нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) заключают в
- 46 008762 устройство νΣΝ, раскрытое в описании.
27. Способ по любому из пп.23-26, предусматривающий по меньшей мере одно введение аналога в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений.
28. Способ по любому из пп.1-18, согласно которому указанный аналог вводят в организм животного с помощью непатогенного микроорганизма или вируса, который содержит фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий и экспрессирующий указанный аналог.
29. Способ лечения, и/или предупреждения, и/или ослабления болезни Альцгеймера или других заболеваний и состояний, характеризующихся отложениями Ав, предусматривающий понижающую регуляцию аутологичного Ав или АРР в соответствии со способом по любому из пп. 1-27 в такой степени, чтобы общее количество амилоида уменьшалось или чтобы скорость образования амилоида снижалась с клинической значимостью.
30. Аналог аутологичного Ав или АРР животного, в который введен по меньшей мере один выделенный чужеродный Тн-эпитоп, как схематически показано для эпитопов Р2 и Р30 на чертеже и раскрыто в описании, так что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против аутологичного Ав или аутологичного АРР у животного.
31. Аналог по п.30, модифицированный, как раскрыто в пп.2-18.
32. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенно эффективное количество аналога по п.30 или 31, причем композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель и необязательно адъювант.
33. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог по п.30 или 31.
34. Вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33, например вектор, который способен к автономной репликации.
35. Вектор по п.34, который выбран из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, минихромосомы и вируса.
36. Вектор по любому из пп.34 или 35, дополнительно содержащий в направлении 5%3' в функциональной взаимосвязи промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты по п.33, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию полипептидного фрагмента или его интеграцию в мембрану, фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33 и необязательно терминатор.
37. Вектор по любому из пп.34-36, который при введении в клетку-хозяина способен или не способен к интеграции в геном клетки-хозяина.
38. Вектор по п.36 или 37, где промотор запускает экспрессию в эукариотической клетке и/или в прокариотической клетке.
39. Трансформированная клетка, содержащая вектор по любому из пп.34-38, например трансформированная клетка, которая способна к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по п.33.
40. Трансформированная клетка по п.39, которая является клеткой микроорганизма, выбранного из бактерий, дрожжей, простейших, или клеткой, полученной из многоклеточного организма, выбранного из грибов, насекомых, такой как клетка 82 или клетка 8Г, растениий и млекопитающих.
41. Трансформированная клетка по п.39 или 40, которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33, например трансформированная клетка, которая секретирует или экспонирует на своей поверхности аналог по п.30 или 31.
42. Композиция для индукции продуцирования антител против Ав или АРР, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33 или вектор по любому из пп.34-38 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.
43. Стабильная клеточная линия, содержащая вектор по любому из пп.34-38 и экспрессирующая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33, которая необязательно секретирует или экспонирует на своей поверхности аналог по п.30 или 31.
44. Способ получения клетки по любому из пп.39-40, предусматривающий трансформацию клеткихозяина вектором по любому из пп.34-38.
45. Применение аналога по п.30 или 31 для получения иммуногенной композиции, необязательно содержащей адъювант, для понижающей регуляции аутологичного Ав или АРР у животного.
46. Применение аналога по п.30 или 31 для получения иммуногенной композиции, необязательно содержащей адъювант, для лечения, профилактики или ослабления болезни Альцгеймера или других состояний, характеризующихся отложениями амилоида.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200000265 | 2000-02-21 | ||
PCT/DK2001/000113 WO2001062284A2 (en) | 2000-02-21 | 2001-02-19 | Novel method for down-regulation of amyloid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200200889A1 EA200200889A1 (ru) | 2003-02-27 |
EA008762B1 true EA008762B1 (ru) | 2007-08-31 |
Family
ID=8159174
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200200889A EA008762B1 (ru) | 2000-02-21 | 2001-02-19 | АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20030086938A1 (ru) |
EP (2) | EP1632242A3 (ru) |
JP (1) | JP5025871B2 (ru) |
CN (1) | CN1279971C (ru) |
AR (1) | AR027947A1 (ru) |
AT (1) | ATE306933T1 (ru) |
BR (1) | BR0108566A (ru) |
CO (1) | CO5280094A1 (ru) |
DE (1) | DE60114157T2 (ru) |
DK (1) | DK1259251T3 (ru) |
EA (1) | EA008762B1 (ru) |
EE (1) | EE200200444A (ru) |
EG (1) | EG25830A (ru) |
ES (1) | ES2248283T3 (ru) |
GC (1) | GC0000355A (ru) |
HK (1) | HK1054865B (ru) |
HU (1) | HUP0300067A3 (ru) |
IL (3) | IL150066A0 (ru) |
IS (1) | IS6446A (ru) |
ME (2) | ME00183B (ru) |
MY (1) | MY131826A (ru) |
NO (1) | NO20023961D0 (ru) |
NZ (1) | NZ521442A (ru) |
PL (1) | PL204878B1 (ru) |
RS (1) | RS51164B (ru) |
SI (1) | SI1259251T1 (ru) |
SK (1) | SK287468B6 (ru) |
WO (1) | WO2001062284A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200204830B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2741366C2 (ru) * | 2014-03-12 | 2021-01-25 | Еда Рисерч Энд Девелопмент Ко., Лтд | Снижение системного уровня регуляторных т-клеток или их активности для лечения заболеваний и трамв цнс |
Families Citing this family (90)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7427392B1 (en) | 1994-11-14 | 2008-09-23 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau |
US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US6750324B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-15 | Neuralab Limited | Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies |
US6761888B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
US6905686B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-06-14 | Neuralab Limited | Active immunization for treatment of alzheimer's disease |
US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US20030147882A1 (en) | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
UA81216C2 (en) | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
US6689753B1 (en) * | 1999-11-05 | 2004-02-10 | Axonyx, Inc. | β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide |
BR0108566A (pt) * | 2000-02-21 | 2002-11-19 | Pharmexa As | Método para a regulação negativa in vivo de proteìna amilóide em um animal, incluindo um ser humano e para o tratamento e/ou prevenção e/ou melhora da doença de alzheimer ou outras doenças e condições cartacterizadas por depósitos de amilóide, análogo de um polipeptìdeo amiloidogênico,composição imunogênica, fragmento de ácido nucleico, vetor, célula transformada, composição para induzir a produção de anticorpos contra um polipeptìdeo amiloidogênico, linhagem celular estável, métodos para a preparação de uma célula, para a identificação de um polipeptìdeo amiloidogênico modificado, e para preparação de uma composição imunogênica, uso de um polipeptìdeo amiloidogênico ou de uma subsequência do mesmo, e, uso de um análogo de um polipeptìdeo amiloidogênico |
KR100879810B1 (ko) | 2000-02-21 | 2009-01-22 | 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 | 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법 |
US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
US7264810B2 (en) | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
DE60121729T2 (de) * | 2001-04-19 | 2007-11-29 | Dr. Hermann Schätzl | Prion Proteindimere für Impfungen |
MY144532A (en) * | 2001-08-20 | 2011-09-30 | Lundbeck & Co As H | Novel method for down-regulation of amyloid |
US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
EP1820806A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-08-22 | Crossbeta Biosciences B.V. | Affinity regions |
MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
EP1380290A1 (en) * | 2002-07-09 | 2004-01-14 | Universitair Medisch Centrum Utrecht | Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance |
US20070003552A1 (en) * | 2002-07-09 | 2007-01-04 | Gebbink Martijn F B | Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation |
CN1668637B (zh) | 2002-07-17 | 2010-05-26 | 希托斯生物技术股份公司 | 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列 |
PL375598A1 (en) | 2002-07-18 | 2005-12-12 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates and uses thereof |
PL217409B1 (pl) | 2002-07-19 | 2014-07-31 | Cytos Biotechnology Ag | Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna i kompozycje szczepionki zawierające układ antygenowy amyloidu beta 1-6 oraz sposób ich wytwarzania i zastosowanie |
US20080014194A1 (en) * | 2003-10-31 | 2008-01-17 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease |
US9034337B2 (en) * | 2003-10-31 | 2015-05-19 | Prothena Biosciences Limited | Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US8506959B2 (en) * | 2002-11-01 | 2013-08-13 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
US8697082B2 (en) * | 2002-11-01 | 2014-04-15 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
TW200509968A (en) * | 2002-11-01 | 2005-03-16 | Elan Pharm Inc | Prevention and treatment of synucleinopathic disease |
WO2008103472A2 (en) * | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
US8663650B2 (en) | 2003-02-21 | 2014-03-04 | Ac Immune Sa | Methods and compositions comprising supramolecular constructs |
US7358331B2 (en) | 2003-05-19 | 2008-04-15 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease |
TWI306458B (en) | 2003-05-30 | 2009-02-21 | Elan Pharma Int Ltd | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
US7807171B2 (en) | 2003-07-25 | 2010-10-05 | Ac Immune Sa | Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers |
WO2005047860A2 (en) * | 2003-11-08 | 2005-05-26 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies to alpha-synuclein |
UA84728C2 (ru) | 2003-12-17 | 2008-11-25 | Вайет | ПРОЦЕСС ОБРАЗОВАНИЯ ИММУНОГЕННОГО КОНЪЮГАТА, ИММУНОГЕННЫЙ КОНЪЮГАТ БЕЛКА Aβ С БЕЛКОМ-НОСИТЕЛЕМ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, КОТОРАЯ ЕГО СОДЕРЖИТ |
GB0424563D0 (en) | 2004-11-05 | 2004-12-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
TW200635607A (en) | 2004-12-15 | 2006-10-16 | Elan Pharm Inc | Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition |
CN101228272A (zh) * | 2005-04-20 | 2008-07-23 | 生物载体株式会社 | 用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗 |
US8114832B2 (en) * | 2005-07-13 | 2012-02-14 | Crossbeta Biosciences B.V. | Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition |
CN101262881A (zh) * | 2005-07-13 | 2008-09-10 | 交叉β生物科学有限公司 | 通过交叉β结构的佐剂化 |
US20070015133A1 (en) * | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Umc Utrecht Holding B.V. | Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein |
WO2007008072A2 (en) | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Crossbeta Biosciences B.V. | CROSS-ß STRUCTURE BINDING COMPOUNDS |
PL2289909T3 (pl) | 2005-11-30 | 2015-04-30 | Abbvie Inc | Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał |
RU2432362C2 (ru) | 2005-11-30 | 2011-10-27 | Эбботт Лэборетриз | Моноклональные антитела и их применения |
US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
JP2007300856A (ja) * | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Hiroshi Mori | アミロイドタンパク質模倣物 |
WO2008040759A1 (en) * | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Pharmexa A/S | Method for down-regulation of cripto |
WO2008070284A2 (en) | 2006-10-16 | 2008-06-12 | Johnnie B. Byrd, Sr. Alzheimer's Center And Research Institute | Amyloid beta peptides and methods of uses thereof |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
US8147833B2 (en) * | 2007-02-23 | 2012-04-03 | Neotope Biosciences Limited | Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease |
EP2486928A1 (en) | 2007-02-27 | 2012-08-15 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
US7618944B2 (en) | 2007-03-01 | 2009-11-17 | Intezyne Technologies, Inc. | Encapsulated amyloid-beta peptides |
US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
ES2498040T3 (es) | 2007-07-27 | 2014-09-24 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
EP2058001A1 (en) * | 2007-11-08 | 2009-05-13 | Crossbeta Biosciences B.V. | Enhancement of immunogenicity of antigens |
EP2058000A1 (en) * | 2007-11-08 | 2009-05-13 | Crossbeta Biosciences B.V. | Immunogenic compositions capable of activating T cells |
PT3056214T (pt) | 2008-06-27 | 2019-06-12 | Zoetis Services Llc | Novas composições adjuvantes |
US8491890B2 (en) | 2008-07-09 | 2013-07-23 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Methods and compositions for inhibiting diseases of the central nervous system |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
US9925282B2 (en) | 2009-01-29 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment |
EP2258398A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-08 | Araclón Biotech, S. L. | Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof |
CN101858910B (zh) * | 2010-03-25 | 2013-03-27 | 辽宁大学 | 一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法 |
EP2558494B1 (en) | 2010-04-15 | 2018-05-23 | AbbVie Inc. | Amyloid-beta binding proteins |
EP2603233A1 (en) | 2010-08-12 | 2013-06-19 | AC Immune S.A. | Vaccine engineering |
CN103298833B (zh) | 2010-08-14 | 2015-12-16 | Abbvie公司 | β淀粉样蛋白结合蛋白 |
JP6027011B2 (ja) | 2010-10-26 | 2016-11-16 | エーシー イミューン ソシエテ アノニム | 疎水性部分によって修飾されたペプチドを含むリポソームベースの構築物 |
US20120321694A1 (en) * | 2010-10-27 | 2012-12-20 | Daniel Larocque | Compositions and uses |
US9855276B2 (en) | 2012-10-25 | 2018-01-02 | The General Hospital Corporation | Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders |
US10058530B2 (en) | 2012-10-25 | 2018-08-28 | The General Hospital Corporation | Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders |
US10525005B2 (en) | 2013-05-23 | 2020-01-07 | The General Hospital Corporation | Cromolyn compositions and methods thereof |
NZ733383A (en) | 2013-09-19 | 2022-12-23 | Zoetis Services Llc | Oil-based adjuvants |
AU2014340182B2 (en) | 2013-10-22 | 2019-05-23 | The General Hospital Corporation | Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment |
AR103427A1 (es) | 2015-01-16 | 2017-05-10 | Zoetis Services Llc | Vacuna contra la fiebre aftosa |
EP3454885A4 (en) * | 2016-05-12 | 2019-12-25 | Ohio State Innovation Foundation | PEPTIDES AND METHODS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISORDERS |
WO2018045217A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | The General Hospital Corporation | Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases |
CN106854233B (zh) * | 2017-03-03 | 2020-07-17 | 国家纳米科学中心 | 一种类肽及其制备方法和应用 |
CN107412782B (zh) * | 2017-04-27 | 2020-09-08 | 国家纳米科学中心 | 一种多肽聚合物纳米材料及其制备方法和应用 |
CA3066932A1 (en) | 2017-07-04 | 2019-01-10 | Curevac Ag | Novel nucleic acid molecules |
KR20210070232A (ko) | 2017-07-20 | 2021-06-14 | 아즈테라피즈 인코포레이티드 | 크로몰린 나트륨 및 이부프로펜의 분말화된 제형 |
BR112020020660A2 (pt) | 2018-04-10 | 2021-03-02 | Ac Immune Sa | vacinas terapêuticas anti-abeta |
AU2019299347A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-01-21 | Aztherapies, Inc. | Powdered formulations of cromolyn sodium and alpha-lactose |
CN112210003A (zh) * | 2019-07-09 | 2021-01-12 | 厦门德馨尚品医疗科技有限公司 | 一种重组载脂蛋白j及其类似物的晶体结构及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995005849A1 (en) * | 1993-08-26 | 1995-03-02 | Mouritsen & Elsner A/S | Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign t-cell epitopes |
WO1995023166A1 (en) * | 1994-02-25 | 1995-08-31 | Deakin Research Limited | Synthetic inverso or retro-inverso t-cell epitopes |
WO1999027944A1 (en) * | 1997-12-02 | 1999-06-10 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4596792A (en) * | 1981-09-04 | 1986-06-24 | The Regents Of The University Of California | Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin |
JPS5938877A (ja) * | 1982-08-30 | 1984-03-02 | Musashi Eng Kk | 紙葉判別方法 |
US4599231A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4599230A (en) * | 1984-03-09 | 1986-07-08 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants |
US4608251A (en) * | 1984-11-09 | 1986-08-26 | Pitman-Moore, Inc. | LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues |
US4601903A (en) * | 1985-05-01 | 1986-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease |
US5223482A (en) * | 1986-11-17 | 1993-06-29 | Scios Nova Inc. | Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use |
US5278056A (en) * | 1988-02-05 | 1994-01-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Retroviral packaging cell lines and process of using same |
US5192688A (en) * | 1988-08-15 | 1993-03-09 | Switzer Iii Robert C | Histological analysis method |
US5753624A (en) * | 1990-04-27 | 1998-05-19 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Materials and methods for treatment of plaquing disease |
US5200339A (en) * | 1990-08-17 | 1993-04-06 | Abraham Carmela R | Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor |
US5780587A (en) * | 1990-08-24 | 1998-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity |
US5780036A (en) * | 1991-08-26 | 1998-07-14 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus |
US5851787A (en) * | 1992-04-20 | 1998-12-22 | The General Hospital Corporation | Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof |
US5958883A (en) * | 1992-09-23 | 1999-09-28 | Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology | Animal models of human amyloidoses |
US5747323A (en) * | 1992-12-31 | 1998-05-05 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region |
DE69435171D1 (de) * | 1993-09-14 | 2009-01-08 | Pharmexa Inc | Pan dr-bindeproteinen zur erhöhung der immunantwort |
US5709995A (en) * | 1994-03-17 | 1998-01-20 | The Scripps Research Institute | Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses |
US5573916A (en) * | 1994-05-19 | 1996-11-12 | Coretech, Inc. | Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier |
US5589154A (en) * | 1994-11-22 | 1996-12-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease |
US5854204A (en) * | 1995-03-14 | 1998-12-29 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Aβ peptides that modulate β-amyloid aggregation |
US5874469A (en) * | 1996-01-05 | 1999-02-23 | Alcon Laboratories, Inc. | Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs |
US5854469A (en) * | 1996-06-28 | 1998-12-29 | Gabay; David | Heating unit for therapeutic instrument |
US5985581A (en) * | 1996-07-25 | 1999-11-16 | The Mclean Hospital Corporation | Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease |
IT1293511B1 (it) * | 1997-07-30 | 1999-03-01 | Gentili Ist Spa | Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati |
US7964192B1 (en) * | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
US6787523B1 (en) * | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
US6761888B1 (en) * | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
US20040062802A1 (en) * | 1998-04-02 | 2004-04-01 | Hermelin Victor M. | Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being |
US20050059802A1 (en) * | 1998-04-07 | 2005-03-17 | Neuralab Ltd | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
EP1114166B1 (en) * | 1998-09-15 | 2005-03-23 | Pharmexa A/S | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
CA2345817C (en) * | 1998-10-05 | 2013-02-12 | M&E Biotech A/S | Novel methods for therapeutic vaccination |
EP2322210A1 (en) * | 1999-04-19 | 2011-05-18 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide |
US6787637B1 (en) * | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
CN101935352A (zh) * | 1999-12-08 | 2011-01-05 | 智力神经系统学公司 | 作为免疫原的嵌合肽及其抗体,以及利用嵌合肽或抗体进行免疫的方法 |
BR0108566A (pt) * | 2000-02-21 | 2002-11-19 | Pharmexa As | Método para a regulação negativa in vivo de proteìna amilóide em um animal, incluindo um ser humano e para o tratamento e/ou prevenção e/ou melhora da doença de alzheimer ou outras doenças e condições cartacterizadas por depósitos de amilóide, análogo de um polipeptìdeo amiloidogênico,composição imunogênica, fragmento de ácido nucleico, vetor, célula transformada, composição para induzir a produção de anticorpos contra um polipeptìdeo amiloidogênico, linhagem celular estável, métodos para a preparação de uma célula, para a identificação de um polipeptìdeo amiloidogênico modificado, e para preparação de uma composição imunogênica, uso de um polipeptìdeo amiloidogênico ou de uma subsequência do mesmo, e, uso de um análogo de um polipeptìdeo amiloidogênico |
KR100879810B1 (ko) * | 2000-02-21 | 2009-01-22 | 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 | 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법 |
ES2238049T3 (es) * | 2000-05-22 | 2005-08-16 | New York University | Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides. |
US7097837B2 (en) * | 2001-02-19 | 2006-08-29 | Pharmexa A/S | Synthetic vaccine agents |
US6906169B2 (en) * | 2001-05-25 | 2005-06-14 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide |
MY144532A (en) * | 2001-08-20 | 2011-09-30 | Lundbeck & Co As H | Novel method for down-regulation of amyloid |
US20030185845A1 (en) * | 2001-11-16 | 2003-10-02 | Steen Klysner | Novel immunogenic mimetics of multimer proteins |
WO2003075951A2 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-18 | Pharmexa A/S | Novel application of vaccination against tnf-alpha |
AU2003256578A1 (en) * | 2002-07-17 | 2004-02-02 | Intellect Neurosciences, Inc. | Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease |
-
2001
- 2001-02-19 BR BR0108566-2A patent/BR0108566A/pt not_active Withdrawn
- 2001-02-19 ES ES01905632T patent/ES2248283T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-19 EE EEP200200444A patent/EE200200444A/xx unknown
- 2001-02-19 EP EP05021931A patent/EP1632242A3/en not_active Withdrawn
- 2001-02-19 US US10/204,362 patent/US20030086938A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-19 SI SI200130471T patent/SI1259251T1/sl unknown
- 2001-02-19 ME MEP-2008-304A patent/ME00183B/me unknown
- 2001-02-19 JP JP2001561348A patent/JP5025871B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-19 CN CNB018053602A patent/CN1279971C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-19 PL PL362889A patent/PL204878B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-02-19 SK SK1178-2002A patent/SK287468B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-02-19 NZ NZ521442A patent/NZ521442A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-02-19 RS YUP-577/02A patent/RS51164B/sr unknown
- 2001-02-19 DK DK01905632T patent/DK1259251T3/da active
- 2001-02-19 EA EA200200889A patent/EA008762B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-02-19 IL IL15006601A patent/IL150066A0/xx active IP Right Grant
- 2001-02-19 WO PCT/DK2001/000113 patent/WO2001062284A2/en active Application Filing
- 2001-02-19 EP EP01905632A patent/EP1259251B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-19 HU HU0300067A patent/HUP0300067A3/hu unknown
- 2001-02-19 DE DE60114157T patent/DE60114157T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-19 AT AT01905632T patent/ATE306933T1/de active
- 2001-02-19 ME MEP-304/08A patent/MEP30408A/xx unknown
- 2001-02-21 EG EG2001020170A patent/EG25830A/xx active
- 2001-02-21 AR ARP010100765A patent/AR027947A1/es unknown
- 2001-02-21 MY MYPI20010770A patent/MY131826A/en unknown
- 2001-02-21 CO CO01013743A patent/CO5280094A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-02-21 GC GCP20011189 patent/GC0000355A/en active
-
2002
- 2002-06-06 IL IL150066A patent/IL150066A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-14 ZA ZA200204830A patent/ZA200204830B/xx unknown
- 2002-06-26 IS IS6446A patent/IS6446A/is unknown
- 2002-08-20 NO NO20023961A patent/NO20023961D0/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-09-20 HK HK03106763.9A patent/HK1054865B/zh not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-29 US US11/537,566 patent/US20070041945A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-02-21 IL IL189646A patent/IL189646A0/en unknown
-
2009
- 2009-01-28 US US12/360,962 patent/US20090311281A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995005849A1 (en) * | 1993-08-26 | 1995-03-02 | Mouritsen & Elsner A/S | Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign t-cell epitopes |
WO1995023166A1 (en) * | 1994-02-25 | 1995-08-31 | Deakin Research Limited | Synthetic inverso or retro-inverso t-cell epitopes |
WO1999027944A1 (en) * | 1997-12-02 | 1999-06-10 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2741366C2 (ru) * | 2014-03-12 | 2021-01-25 | Еда Рисерч Энд Девелопмент Ко., Лтд | Снижение системного уровня регуляторных т-клеток или их активности для лечения заболеваний и трамв цнс |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA008762B1 (ru) | АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | |
KR101057488B1 (ko) | 베타-아밀로이드-유사체 - t-세포 에피토프 백신 | |
AU783144B2 (en) | Novel method for down-regulation of amyloid | |
AU2002325199A1 (en) | Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine | |
CN100562338C (zh) | β-淀粉样蛋白-类似物-T-细胞表位疫苗 | |
UA85815C2 (ru) | Применение иммуногена для профилактики или лечения болезни альцгеймера или других заболеваний, связанных с отложением амилоида |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |