EA008762B1 - АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Download PDF

Info

Publication number
EA008762B1
EA008762B1 EA200200889A EA200200889A EA008762B1 EA 008762 B1 EA008762 B1 EA 008762B1 EA 200200889 A EA200200889 A EA 200200889A EA 200200889 A EA200200889 A EA 200200889A EA 008762 B1 EA008762 B1 EA 008762B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cell
analogue
app
autologous
epitope
Prior art date
Application number
EA200200889A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200200889A1 (ru
Inventor
Петер Бирк
Мартин Роланд Енсен
Клаус Грегориус Нильсен
Original Assignee
Фармекса А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фармекса А/С filed Critical Фармекса А/С
Publication of EA200200889A1 publication Critical patent/EA200200889A1/ru
Publication of EA008762B1 publication Critical patent/EA008762B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Описаны новые способы лечения заболеваний, характеризующихся отложением амилоида. Указанные способы обычно основаны на иммунизации против амилоидогенных белков (белков, способствующих образованию амилоида), таких как бета-амилоид (Аβ). Иммунизацию предпочтительно выполняют путем введения аналогов аутологичных амилоидогенных полипептидов, причем указанные аналоги способны вызывать продуцирование антител против аутологичных амилоидогенных полипептидов. Особенно предпочтительным в качестве иммуногена является аутологичный Аβ, который модифицирован путем введения одного или нескольких чужеродных, иммунодоминантных и смешанных Т-клеточных эпитопов, с сохранением в то же время, по существу, большей части В-клеточных эпитопов Аβ. Описаны также вакцинация нуклеиновыми кислотами против амилоидогенных полипептидов и вакцинация с использованием живых вакцин, а также способы и средства, применимые для вакцинации. Такие способы и средства включают в себя способы идентификации аналогов амилоидогенных белков, способы получения аналогов и фармацевтических композиций, а также фрагменты нуклеиновых кислот, векторы, трансформированные клетки, полипептиды и фармацевтические композиции.

Description

Данное изобретение относится к улучшению терапии и профилактики болезни Альцгеймера (БА) и других заболеваний, характеризующихся отложением амилоида, например характеризующихся отложениями амилоида в центральной нервной системе (ЦНС). Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способ супрессии (нежелательных) отложений амилоида путем обеспечения возможности продуцирования антител против соответствующего белка или его компонентов у субъектов, имеющих риск или страдающих заболеваниями, патология которых включает в себя отложение амилоида. Данное изобретение обеспечивает также способы получения полипептидов, применимых в данном способе, а также сами модифицированные полипептиды. Данное изобретение обеспечивает также фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие эти модифицированные полипептиды, а также векторы, включающие в себя эти фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации аналогов депонированных полипептидов, которые применимы в способе данного изобретения, а также композиции, содержащие модифицированные полипептиды или содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды.
Предпосылки изобретения
Амилоидоз представляет собой внеклеточное отложение нерастворимых белковых фибрилл, приводящее к разрушению ткани и заболеванию (Реруз, 1966; Тап с1 а1., 1995; Ке11у, 1996). Эти фибриллы образуются, когда нормально растворимые белки и пептиды аномальным образом ассоциируются друг с другом (Ке11у, 1997).
Амилоид ассоциирован с серьезными заболеваниями, в том числе системным амилоидозом, БА, диабетом взрослых, болезнью Паркинсона, болезнью Хангтингтона, лобно-височной деменцией и связанными с прионами трансмиссивными энцефалопатиями (куру и болезнью Крейтцфельдта-Якоба у человека и скрепи (почесухой) и В8Е у овец и крупного рогатого скота соответственно), и образование амилоидных бляшек, например, в случае болезни Альцгеймера, по-видимому, тесно связано с прогрессированием этого заболевания у человека. На моделях животных было показано, что сверхэкспрессия или экспрессия, обнаруживаемых в отложениях модифицированных форм белков, наподобие β-амилоидного белка, индуцирует различные симптомы заболевания, например симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера. Не существует специального лечения отложений амилоида, и эти заболевания являются обычно фатальными.
Субъединицы амилоидных фибрилл могут быть белками дикого типа, вариантными или укороченными белками, и сходные фибриллы могут быть образованы ΐη νίίτο из олигопептидов и денатурированных белков (ВгаОЬшу е1 а1., 1960; РИзЫе е1 а1., 1964; Вигке апб Вои^те, 1972). Природа полипептидного компонента фибрилл определяет характер амилоидоза. Несмотря на большие различия в размере, природной структуре и функции амилоидных белков, все амилоидные фибриллы имеют неопределенную длину, являются неразветвленными, имеют в диаметре 70-120 А и проявляют характерное окрашивание Конго красным (Реруз, 1996). Они являются типичной поперечной β-складчатой структурой (Раийпд апб Согеу, 1951), в которой полипептидная цепь организована в β-складки. Хотя амилоидные белки имеют очень различные структуры-предшественники, они все могут подвергаться структурной конверсии, возможно, по сходному пути, в неправильно упакованную форму, которая является элементом структуры протофиламента β-складчатой спирали.
Этот отчетливо выраженный волокнистый характер привел к тому, что амилоидоз называли βфибриллезом (О1еппег, 1980а,Ь), а фибриллярный белок БА был назван β-белком прежде, чем была выяснена его вторичная структура (О1еппег апб \Уопд. 1984). Характеристическая поперечная βдифрактограмма вместе с фибриллярным видом и свойствами окрашивания являются в настоящее время общепринятыми диагностическими отличительными признаками амилоида и предполагается, что эти фибриллы, хотя они и образованы из совершенно различных белков-предшественников, имеют общее структурное сходство и составляют структурное суперсемейство, независимо от природы их белковпредшественников (Зипбе М., 8егре1 Ь.С., ВагИап М., Ргазег Р.Е., Реруз М.В., В1аке ССР1 Мо1. Вю1. 1997, Ос1. 31; 273 (3): 729-739).
Одним из наиболее широко распространенных и хорошо известных заболеваний, где отложения амилоида в центральной нервной системе, как предполагается, играют центральную роль в прогрессировании этого заболевания, является болезнь Альцгеймера (БА).
БА
Болезнь Альцгеймера (БА) является необратимым прогрессирующим нарушением головного мозга, которое происходит постепенно и приводит к потере памяти, поведенческим изменениям и изменениям личности и ухудшению умственных способностей. Эти утраты связаны с гибелью клеток головного мозга и разрушением связей между ними. Ход этого заболевания, как и скорость его прогрессирования, варьирует от пациента к пациенту. В среднем, пациенты с БА живут в течение 8-10 лет после установления диагноза, хотя это заболевание может длиться и до 20 лет.
БА прогрессирует в виде стадий, от ранней, небольшой забывчивости, до тяжелой потери умственной функции. Эта потеря умственной функции известна как деменция (приобретенное слабоумие). У
- 1 008762 большинства людей с БА симптомы появляются впервые после возраста 60 лет, но нередкими являются и более ранние проявления. Самые ранние симптомы часто включают в себя потерю памяти на недавние события, ошибочное суждение и изменения личности. Часто люди в начальных стадиях БА думают менее ясно и забывают имена знакомых людей и названия обычных объектов. Позднее в данном заболевании они могут забыть, как выполнять даже простые задачи. В конце концов, люди с БА утрачивают полностью способность логического мышления и становятся зависимыми от других людей в повседневном уходе. В конце концов, заболевание становится настолько ослабляющим, что пациенты становятся прикованными к постели, и у них могут развиваться другие болезни и инфекции. Наиболее часто люди с БА умирают от пневмонии.
Хотя риск развития БА увеличивается с возрастом, БА и симптомы деменции не являются частью нормального старения. БА и другие связанные со слабоумием нарушения обусловлены заболеваниями, которые влияют на головной мозг. При нормальном старении нервные клетки в головном мозге в больших количествах не утрачиваются. В противоположность этому, при БА нарушаются три ключевых процесса: коммуникация, метаболизм и восстановление нервных клеток. Это разрушение в конечном счете заставляет многие нервные клетки прекращать функционирование, утрачивать связи с другими нервными клетками и умирать.
Сначала при БА разрушаются нейроны в частях головного мозга, которые контролируют память, в частности, в гиппокампе и родственных структурах. Поскольку нервные клетки в гиппокампе перестают правильно функционировать, отказывает кратковременная память, и часто способность человека исполнять простые и знакомые задачи начинает ухудшаться. БА атакует также кору головного мозга, в частности, области, ответственные за язык и рассуждение. В конечном счете, вовлекаются многие другие области головного мозга, все эти зоны головного мозга атрофируются (сморщиваются), и пациент с БА становится прикованным к постели, с недержанием, полностью беспомощный и не реагирующий на внешний мир (источник Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙυΙο оп Адтд Ргодгекк Верой оп Л1х11сппсг'5 Эйса^с. 1999).
Влияние БА
БА является наиболее частой причиной деменции (слабоумия) среди людей в возрасте 65 или более лет. Она представляет собой основную проблему здравоохранения вследствие ее огромного влияния на индивидуумов, семьи, систему медико-санитарной помощи и общество в целом. Ученые оценивают приблизительно, что до 4 млн людей страдают в настоящее время от этого заболевания, и частота случаев БА удваивается каждые 5 лет после возраста 65 лет. Приблизительно также подсчитано, что около 360000 новых случаев (появлений) будут возникать каждый год, хотя это число будет увеличиваться по мере старения популяции (Вгооктсусг с! а1., 1998).
БА налагает тяжелое экономическое бремя на общество. В недавнем исследовании в Соединенных Штатах было подсчитано, что ежегодный расход по уходу за одним пациентом с БА составляет 18408 долларов для пациента со слабо развитой БА, 30096 долларов для пациента с умеренной БА и 36132 доллара для пациента с тяжелой БА. Подсчитано, что ежегодные национальные расходы по уходу за пациентами с БА в Соединенных Штатах составляют более 50 биллионов долларов (Ьсоп с! а1., 1998).
Приблизительно 4 млн американцев имеют возраст 85 или более лет, а в большинстве индустриально развитых стран эта возрастная группа является одной из наиболее быстро растущих частей населения. Приблизительно подсчитано, что эта группа будет насчитывать почти 8,5 млн к 2030 г. в США; некоторые эксперты, исследующие тенденции популяции, предполагают, что это число может быть даже более высоким. Поскольку все больше и больше людей живут дольше, число людей, пораженных болезнями старения, в том числе БА, будет продолжать расти. Например, некоторые исследования показывают, что почти половина всех людей в возрасте 85 и более лет имеют какую-нибудь форму деменции (№Оопа1 1п81йи1с оп Лщпд Ргодгскк Всрой оп ЛМюппсгЕ Эйса^с, 1999).
Основные характеристики БА
Наличие двух аномальных структур в головном мозге являются отличительным признаком БА: амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (ΝΡΤ). Бляшки являются плотными, в значительной степени нерастворимыми отложениями белка и клеточного материала снаружи и вокруг нейронов головного мозга. Клубки являются нерастворимыми скрученными волокнами, которые накапливаются внутри нейронов.
Существует два типа БА: семейная БА (РАО), которая носит явно наследственный характер, и спорадическая БА, где не обнаруживается явного характера наследования. Вследствие различий в возрасте проявления БА дополнительно описана как ранняя (встречающаяся у людей моложе 65 лет) или поздняя (встречающаяся у людей 65 лет или старше). Ранняя БА является редкой (приблизительно 10% случаев) и обычно поражает людей в возрасте 30-60 лет. Некоторые формы ранней БА являются наследуемыми и повторяются в семьях. Ранняя БА часто прогрессирует быстрее, чем более обычная поздняя форма.
Все семейные болезни Альцгеймера (РАО), известные до сих пор, имеют раннее проявление, и в настоящее время известно, что 50% случаев РАО вызваны дефектами в трех генах, расположенных на трех различных хромосомах. Имеются мутации в гене АРР на хромосоме 21; мутации в гене на хромосоме 14, называемом пресенилином 1; и мутации в гене на хромосоме 1, называемом пресенилином 2. Однако пока еще нет данных о том, что какая-либо из этих мутаций играет главную роль в более обычной
- 2 008762 спорадической, или несемейной, форме поздней БА (Ναΐίοηαΐ ПткШгНе οη Адшд Ргодгекк Керой οη Αΐζйе1тег'8 ОЦеаке, 1999).
Амилоидные бляшки
При БА амилоидные бляшки развиваются сначала в областях головного мозга, используемых для памяти и других когнитивных функций. Они состоят в значительной степени из нерастворимых отложений бета-амилоида (далее называемого Ав) - белкового фрагмента более крупного белка, называемого белком-предшественником амилоида (АРР, аминокислотная последовательность которого представлена в 8ЕО ΙΌ N0:2), смешанного с частями нейронов и с клетками, не являющимися нервными клетками, такими как микроглии и астроциты. Неизвестно, составляют ли сами амилоидные бляшки основную причину БА или они являются побочными продуктами процесса БА. Определенно, изменения в белке АРР могут вызывать БА, как показано при наследуемой форме БА, вызываемой мутациями в гене АРР, и образование бляшек Ав, по-видимому, тесно связано с прогрессированием данного заболевания у человека (Ырра С.Р. е1 а1., 1998).
АРР
АРР является одним из многих белков, которые связаны с клеточными мембранами. После его образования АРР становится погруженным в мембрану нервной клетки, частично внутри и частично снаружи этой клетки. Недавние исследования с использованием трансгенных мышей показывают, что АРР, по-видимому, играет важную роль в росте и выживании нейронов. Например, определенные формы и количества АРР могут защищать нейроны против как кратковременного, так и долгосрочного повреждения и могут делать поврежденные нейроны более способными к собственной репарации и помогать частям нейронов расти после повреждения головного мозга.
Хотя АРР погружен в клеточную мембрану, протеазы действуют на конкретные сайты в АРР, расщепляя его на белковые фрагменты.
Одна протеаза помогает расщеплять АРР с образованием Ав, а другая протеаза расщепляет АРР в середине амилоидного фрагмента, так что Ав не может образоваться. Образовавшийся Ав имеет две различные длины, более короткий Ав из 40 (или 41) аминокислот, который являются относительно растворимым и агрегирует медленно, и слегка более длинный «липкий» Ав из 42 аминокислот, который быстро образует нерастворимые клубки. При образовании Ав еще неизвестно точно, как он перемещается через нервные клетки или вокруг нервных клеток. В конечных стадиях этого процесса липкий Ав агрегирует в длинные филаменты снаружи клетки, вместе с фрагментами мертвых или умирающих нейронов и микроглиями и астроцитами, образует бляшки, которые являются отличительным признаком БА, в ткани головного мозга.
Существуют некоторые данные о том, что мутации в АРР делают более вероятным, что Ав будет вырезаться из предшественника АРР, что вызывает образование либо большего количества общего Ав, либо относительно большего количества липкой формы. Вероятно также, что мутации в генах пресенилина могут способствовать дегенерации нейронов по меньшей мере двумя путями: путем модификации образования Ав или путем запуска гибели клеток более прямым путем. Другие исследователи предполагают, что мутированные пресенилины 1 и 2 могут участвовать в ускорении темпа апоптоза.
Следует ожидать, что по мере прогрессирования заболевания будет образовываться все больше и больше бляшек, заполняя все более и более областей головного мозга. В исследованиях предполагается, что возможно в одно и то же время происходит агрегация и дезагрегация Ав по типу динамического равновесия. Это дает надежду на то, что может существовать возможность разрушения бляшек даже после их образования (Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙιιΚ οη Адтд Ргодгекк Керой οη АНйетег'к Эйеаке. 1999).
Считается, что Ав является токсичным для нейронов. В исследованиях на культуре ткани исследователи наблюдали увеличение гибели нейронов гиппокампа, сконструированных для сверхэкспрессии мутированных форм АРР человека, в сравнении с нейронами, сверхэкспрессирующими нормальный АРР человека (Баю е1 а1., 1999).
Кроме того, в моделях на животных было продемонстрировано, что сверхэкспрессия или экспрессия модифицированных форм белка Ав индуцирует симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера (НкТю К. е1 а1., 1998).
Если исходить из того, что повышенное образование Ав, его агрегация в бляшки и полученная в результате нейротоксичность могут приводить к БА, представляет терапевтический интерес исследование условий, при которых агрегация в бляшки может быть ослаблена или даже блокирована.
Пресенилины
Мутации в пресенилине-1 (8-180) ответственны почти за 50% всех случаев ранней семейной БА (РАО). Были идентифицированы около 30 мутаций, которые приводят к появлению БА. Начало БА варьирует в зависимости от мутаций. Мутации в пресенилине-2 ответственны за гораздо меньшую часть случаев РАО, но все же являются значимым фактором. Неизвестно, участвуют ли пресенилины в спорадической несемейной БА. Функция пресенилинов неизвестна, но они, по-видимому, участвуют в процессинге АРР до Ав-42 (более длинной, более липкой формы этого пептида, 8ЕО ΙΌ N0:2, остатки 673-714), так как пациенты с БА с мутациями пресенилина имеют повышенные уровни этого пептида. Неясно, играют
- 3 008762 ли пресенилины роль в индукции выработки ΝΓΤ. Некоторые данные предполагают, что пресенилины могут также играть более прямую роль в дегенерации нейронов и гибели нейронов. Пресенилин-1 находится в хромосоме 14, тогда как пресенилин-2 сцеплен с хромосомой 1. Если человек получает мутированную версию хотя бы одного их этих генов, почти определенно, что у него или у нее будет развиваться раннее начало БА.
Есть некоторая неопределенность в том, является ли пресенилин идентичным гипотетической гамма-секретазе, участвующей в процессинге АРР (№1ги5е с1 а1., 1998).
Аполипопротеин Е
Аполипопротеин Е обычно связан с холестерином, но также обнаруживается в бляшках и клубках головного мозга пациентов с БА. Хотя кажется, что аллели 1-3 не принимают участия в БА, имеется значимая корреляция между присутствием аллеля АРОЕ-е4 и развитием поздней БА (81пйтайег с1 а1., 1993). Однако он является фактором риска, а не прямой причиной, как мутации пресенилина и АРР, и не ограничивается семейной БА.
Пути, в которых белок АРОЕ-е4 способствует увеличению вероятности развития БА, точно не выяснены, но одна возможная теория заключается в том, что он облегчает накопление Ав и это способствует снижению возраста появления БА, или присутствие или отсутствие конкретных аллелей АРОЕ может влиять на способ, при помощи которого нейроны отвечают на повреждение (ΒυΙΙίηί с1 а1., 1999).
Было показано, что Аро А1 также является амилоидогенным. Интактный аро А1 может сам образовывать амилоидоподобные фибриллы ίη νίίτο, которые являются положительными при окрашивании красителем Конго красным (Ат I Ра11ю1 147 (2): 238-244 (Аид 1995), \У15ше\\'5к| Τ., Оо1аЬек А.А., КИа Е., \У15ше\\'5к| К.Е., Ггалдюпе В.).
Несколько противоречивы результаты, указывающие на существование положительного действия аллеля АРОЕ-е4 в снижении симптомов потери умственной способности, в сравнении с другими аллелями (81ет, Вгапб!, 1997, АплаН ок №иго1оду 41).
Нейрофибриллярные клубки
Этот второй отличительный признак БА состоит из аномальных скоплений скрученных нитей, обнаруживаемых в нервных клетках. Главным компонентом клубков является одна форма белка, называемая тау (τ). В центральной нервной системе тау-белки являются наиболее известными из-за их способности связывать микротрубочки и способствовать стабилизации микротрубочек, которые являются одним из компонентов внутренней поддерживающей структуры или скелета клетки. Однако в случае БА таубелок изменяется химически и этот измененный тау не может более стабилизировать микротрубочки, вызывая их дезинтеграцию. Этот коллапс транспортной системы может сначала приводить к дисфункции коммуникации между нервными клетками, а позднее может приводить к гибели нейронов.
При БА химически измененный тау скручивается в парные спиральные филаменты - две нити тау, которые скручены одна вокруг другой. Эти филаменты являются основным веществом, обнаруживаемым в нейрофибриллярных клубках. В одном из недавних исследований были обнаружены нейрофибриллярные изменения менее чем у 6% нейронов в конкретной части гиппокампа в здоровом головном мозге, более чем 43% этих нейронов у людей, которые умерли от легкой БА, и в 71% нейронов у людей, которые умерли от тяжелой БА. При исследовании потери нейронов было обнаружено сходное прогрессирование. Данные этого типа подтверждают идею о том, что образование клубков и потеря нейронов прогрессируют вместе на протяжении развития БА (№Шопа1 [пкШгйе оп Адтд Ргодгекк Верой оп АНйетег'к ОЦеаке, 1999).
Таупатии и клубки
Несколько нейродегенеративных заболеваний, отличных от БА, характеризуются тау-агрегацией в нерастворимые филаменты в нейронах и глии, приводящей к дисфункции и смерти. Совсем недавно несколько групп исследователей, которые изучали семьи с различными наследственными деменциями, отличными от БА, обнаружили первые мутации в гене тау на хромосоме 17 (С1агк е1 а1., 1998; Нийоп е1 а1., 1998; Роогка.) е1 а1., 1998; БрШапйш е1 а1., 1998). В этих семьях мутации в гене тау вызывают гибель нервных клеток и деменцию. Эти нарушения, которые имеют некоторые общие признаки с БА, но отличаются в некоторых важных аспектах, совокупно называют «лобно-височной деменцией и паркинсонизмом, связанными с хромосомой 17» (ΓΤΌΡ-17). Они являются заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, некоторые формы бокового амиотрофического склероза (АБ8), кортикобазальная дегенерация, прогрессирующий супрануклеарный паралич и болезнь Пика, и все они характеризуются аномальной агрегацией тау-белка.
Другие БА-подобные неврологические заболевания
Существуют важные параллели между БА и другими неврологическими заболеваниями, в том числе вызываемыми прионами заболеваниями (такими как куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба и бычий губчатый энцефалит), болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона и лобно-височной деменцией. При всех этих заболеваниях происходит отложение аномальных белков в головном мозге. БА и прионовые заболевания вызывают деменцию и смерть, и оба эти заболевания связаны с образованием нерастворимых амилоидных фибрилл, но из мембранных белков, которые отличаются друг от друга.
- 4 008762
Ученые, изучающие болезнь Паркинсона, второе наиболее распространенное нейродегенеративное нарушение после БА, обнаружили первый ген, сцепленный с этим заболеванием. Этот ген кодирует белок, названный синуклеином, который, интригующим образом, обнаружен также в амилоидных бляшках головного мозга пациентов с БА (Ьауебаи С., 1998, Сепоте Кек. 8(9): 871-80). Исследователи обнаружили также, что генетические дефекты при болезни Хантингтона, другом прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, которое вызывет деменцию, заставляют белок Хантингтона образовывать нерастворимые фибриллы, очень сходные с Ав-фибриллами БА и белковыми фибриллами прионового заболевания (Бсйегапдег Е., е! а1., 1999, ΡΝΑ8 И.8.А. 86(8):4604-9).
Ученые обнаружили также новый ген, который при мутировании является ответственным за семейную Британскую деменцию (ΕΒΌ), редкую наследственную болезнь, которая вызывает тяжелые нарушения движения и прогрессирующую деменцию, сходную с наблюдаемой при БА. При биохимическом анализе амилоидных фибрилл, обнаруженных в бляшках ΕΒΌ, был обнаружен уникальный пептид, названный ΑΒη (У1ба1 е! а1., 1999). Мутация в конкретной точке вдоль этого гена приводит к продуцированию более длинного, чем нормальный, Βη-белка. Пептид ΑΒτί, который вырезается из мутированного конца этого Βη-белка, откладывается в виде амилоидных фибрилл. Считают, что эти бляшки приводят к дисфункции нейронов и деменции, которые характеризуют ΕΒΌ.
Иммунизация с использованием Ав
Иммунная система будет нормально участвовать в клиренсе чужеродных белка и белковых частиц в организме, но отложения, связанные с вышеуказанными заболеваниями, состоят в основном из собственных белков, что делает роль иммунной системы в контроле этих заболеваний менее очевидной. Кроме того, отложения локализованы в компартменте (ЦНС), в норме отделенном от иммунной системы, причем оба факта предполагают, что любая вакцина или иммунотерапевтический подход были бы безуспешными.
Тем не менее, ученые недавно пытались иммунизировать мышей вакциной, составленной из гетерологичного Ав человека и вещества, которое, как известно, возбуждает иммунную систему (8сйепк е! а1., 1999 и \УО 99/27944). Эту вакцину испытывали в частичной модели БА трансгенной мыши с мутированным геном АРР человека, встроенным в ДНК мыши. Мыши, по мере роста, продуцировали модифицированный белок АРР и развитые амилоидные бляшки. Эту мышиную модель использовали для испытания того, действует ли вакцинация против модифицированного трансгенного АРР человека на процесс накопления бляшек. В первом эксперименте одной группе трансгенных мышей инъецировали ежемесячно вакцину, начиная с 6-недельного возраста и заканчивая в 11-месячном. Вторая группа трансгенных мышей не получала инъекций и служила в качестве контрольной группы. В 13-месячном возрасте мыши в контрольной группе имели бляшки, охватывающие 2-6% их головного мозга. В противоположность этому, иммунизированные мыши бляшек практически не имели.
Во втором эксперименте исследователи начинали инъекции в 11 месяцев, когда уже развивалось некоторое количество бляшек. При прошествии 7-месячного периода у контрольных трансгенных мышей наблюдали 17-кратное увеличение количества бляшек в головном мозге, тогда как у мышей, которые получали вакцину, наблюдалось 99%-ное уменьшение в сравнении с 18-месячными контрольными трансгенными мышами. У некоторых мышей, некоторая часть предсуществующих отложений в виде бляшек, по-видимому, в результате такой обработки удалялась. Было обнаружено, что другое связанное с бляшками повреждение, такое как воспаление и аномальные процессы в нервных клетках, ослаблялись в результате иммунизации.
Таким образом, выше описано предварительное исследование на мышах, и ученым нужно определить, к примеру, остаются ли вакцинированные мыши здоровыми в других отношениях и остается ли память этих вакцинированных животных нормальной. Кроме того, поскольку мышиная модель не является полным воспроизведением БА (у животных не развиваются нейрофибриллярные клубки и у них не наблюдается гибель многих нейронов), необходимы дополнительные исследования для определения того, воспроизводится ли у человека такая же реакция, как у мышей, или она отличается от мышиной. Другим предметом рассмотрения является то, что этот способ, возможно, лечит амилоидное отложение, но не может остановить развитие деменции.
Технические вопросы также представляют собой основные проблемы. Например, мало вероятно, что можно, с использованием этой технологии, создать вакцину, которая позволит людям индуцировать антитела против их собственных (аутологичных) белков. Так, потребуется разрешить многочисленные проблемы безопасности и эффективности, прежде чем можно будет рассматривать вопрос об испытаниях на человеке.
Так, в работе 8сйепк е! а1. показано, что если бы было возможно генерировать сильную иммунную реакцию в отношении аутологичных белков в белковых отложениях в центральной нервной системе, таких как бляшки, образуемые при БА, то можно как предупреждать образование этих отложений, так и возможно также осуществлять клиренс образованных бляшек.
- 5 008762
Цель изобретения
Целью данного изобретения является обеспечение новой терапии против состояний, отличающихся отложением амилоида, таких как БА. Следующей целью данного изобретения является развитие аутовакцины (вакцины против аутологичных белков) против амилоида, чтобы получить новый способ лечения БА и других патологических нарушений, включающих в себя отложение амилоида.
Сущность изобретения
Здесь описано применение технологии аутовакцинации для генерирования сильных иммунных ответов против в ином случае неиммуногенных аутологичных белков, включенных в связанные с патологией амилоидные отложения. Посредством этого, генерируют сильную иммунную реакцию против амилоида, против одного или нескольких компонентов, включенных в эти отложения, или против одного или нескольких белков, ответственных за образование амилоида. Описано также приготовление таких вакцин для предупреждения, возможного лечения или ослабления симптомов таких заболеваниий, связанных с отложениями амилоидов.
Таким образом, в его самом широком и наиболее общем объеме, данное изобретение относится к способу супресси ίη νίνο амилоида у животного, в том числе человека, причем этот способ предусматривает осуществление представления (презентации) иммунной системе этого животного иммунологически эффективного количества по меньшей мере одного амилоидогенного полипептида или его субпоследовательности, которые были приготовлены таким образом, что иммунизация животного амилоидогенным полипептидом или его субпоследовательностью индуцирует продуцирование антител против амилоидогенного полипептида, и/или по меньшей мере одного аналога амилоида, причем в амилоидогенный полипептид введена модификация, что в результате приводит к тому, что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против амилоидогенного полипептида.
Таким образом, в данное изобретение включено применение: 1) природно встречающихся антигенов и их фрагментов, приготовленных таким образом, что они запускают иммунную реакцию, а также 2) аналогов таких природно встречающихся антигенов, причем эти аналоги способны индуцировать перекрестно-реактивные иммунные реакции.
Данное изобретение относится также к аналогам амилоидогенных полипептидов, а также к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующим их субпопуляцию. Иммуногенные композиции, содержащие эти аналоги или эти фрагменты нуклеиновых кислот, являются частью данного изобретения.
Данное изобретение относится также к способу идентификации иммуногенно эффективных аналогов амилоидогенных полипептидов, а также к способу получения композиции, содержащей эти аналоги.
Подпись к чертежу
На чертеже представлено схематическое изображение вариантов аутовакцины (ΛιιΙοναο). полученных из белка-предшественника амилоида с целью генерирования реакций в виде антител против А[1белка Ав-43 (или С-100). АРР показан схематически в верхней части фигуры, а остальные схематические конструкции показывают, что модельные эпитопы Р2 и Р30 заменены или встроены в различные укороченные формы АРР. На этой фигуре черным обозначена сигнальная последовательность АРР, двусторонняя поперечная штриховка соответствует внеклеточной части АРР, темными вертикальными штрихами обозначен трансмембранный домен АРР, светлыми вертикальными штрихами обозначен внутриклеточный домен АРР, грубой поперечной штриховкой обозначен эпитоп Р30, а тонкое поперечное штрихование указывает на эпитоп Р2. Обведенным сплошной линией блоком показан Λβ-42/43, а обведенным сплошной линией блоком и обведенным сплошной линией и пунктирной линией блоком вместе показан С-100. АЬе1а означает Ав.
Подробное описание изобретения
Определения.
Далее будут определены и подробно объяснены ряд терминов, используемых в данном описании и формуле изобретения, для прояснения размеров и границ данного изобретения.
Термины «амилоид» и «амилоидный белок», которые используются здесь взаимозаменяемо, означают класс белковых неразветвленных фибрилл неопределенной длины. Амилоидные фибриллы характерно окрашиваются Конго красным и имеют общую поперечную β-структуру, в которой полипептидная цепь организована в виде β-складок. Амилоид обычно происходит из амилоидогенных белков, которые имеют различные структуры предшественников, но которые могут все подвергаться структурному превращению в неправильно уложенную форму, которая является элементом структуры β-складчатого спирального протофиламента. Обычно диаметр амилоидных фибрилл варьирует примерно между около 70 и 120 А.
Термин «амилоидогенный белок» предназначен для обозначения полипептида, который участвует в образовании амилоидных отложений, является либо частью отложений как таковых, либо частью биосинтетического пути, приводящего к образованию этих отложений. Таким образом, примерами амилоидогенных белков являются АРР и Ав, но также и белки, участвующие в метаболизме этих белков, могут быть амилоидогенными белками. Ряд амилоидогенных полипептидов обсуждается подробно ниже.
«Амилоидный полипептид» предназначен здесь для обозначения полипептидов, содержащих ами
- 6 008762 нокислотную последовательность обсуждаемых выше амилоидогенных белков, полученных у человека или других животных (или их укороченных форм, имеющих существенное количество общих Вклеточных эпитопов с интактным амилоидогенным белком), амилоидогенный полипептид может, следовательно, содержать, например, существенные части предшественника амилоидогенного полипептида (в случае Άβ одним из возможных амилоидных полипептидов мог бы быть АРР). Негликозилированные формы амилоидогенных полипептидов, которые получают в прокариотической системе, также охватываются данным термином, как и формы, имеющие варьирующие картины гликозилирования вследствие применения, например, дрожжей или других эукариотических экспрессионных систем не млекопитающих. Однако следует отметить, что когда применяется термин «амилоидогенный полипептид», подразумевается, что рассматриваемый полипептид является обычно неиммуногенным при представлении его подлежащему обработке животному. Другими словами, амилоидогенный полипептид является аутологичным белком или является аналогом такого аутологичного белка, который в норме не будет индуцировать иммунную ответную реакцию против амилоидогенного белка рассматриваемого животного.
«Аналог амилоидогенного полипептида» означает амилоидогенный полипептид, который был подвергнут изменениям в своей первичной структуре. Такое изменение может, например, быть в виде слияния амилоидного полипептида с подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре, включающее в себя исключительно С- и/или Ν-добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида. Этот термин относится также к дериватизованным амилоидогенный молекулам (см. обсуждение ниже модификаций амилоидогенных полипептидов). В случае, когда амилоидогенный полипептид является амилоидом или его предшественником, этот аналог может быть сконструирован таким образом, что он менее способен или даже неспособен индуцировать антитела против нормального белка-предшественника (белков-предшественников) амилоида, для исключения посредством этого нежелательного взаимодействия с (физиологически нормальной) неагрегированной формой этого полипептида, являющегося предшественником амилоидного белка.
Следует отметить, что применение в качестве вакцины у человека ксеноаналога (например, собачьего или свиного аналога) амилоидогенного полипептида человека может рассматриваться для получения желаемого иммунитета против амилоидогенного полипептида. Такое применение ксеноаналога для иммунизации также рассматривается как часть данного изобретения.
Термин «полипептид» предназначен в данном контексте для обозначения как коротких пептидов с 2-10 аминокислотными остатками, олигопептидов с 11-100 аминокислотными остатками и полипептидов с более чем 100 аминокислотными остатками. Кроме того, этот термин также предназначен для включения белков, т.е. функциональных биомолекул, содержащих по меньшей мере один полипептид; при наличии по меньшей мере двух полипептидов они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть нековалентно связанными. Полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными, и/или липидизированными, и/или содержат простетические группы.
Термин «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» будут использоваться взаимозаменяемо для обозначения лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные клеточно-опосредованные иммунные реакции, а также за хелперную активность в гуморальной иммунной реакции. Подобным образом, термины «В-лимфоцит» и «В-клетка» будут использоваться взаимозаменяемо в отношении продуцирующих антитела лимфоцитов.
Термин «субпоследовательность» означает любой отрезок последовательности по меньшей мере из 3 аминокислот или, соответственно, по меньшей мере 3 нуклеотидов, полученный непосредственно из природно встречающейся аминокислотной последовательности амилоида или последовательности нуклеиновой кислоты амилоида соответственно.
Термин животное в данном контексте обычно означает вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Ното 8ар1еи8, Саше ботезДсиз и т.д., а не только единственное животное. Однако этот термин означает также популяцию животных этих видов, так как существенно, что у всех индивидуумов, иммунизированных в соответствии со способом данного изобретения одним и тем же амилоидогенным полипептидом, распознается, по существу, один и тот же амилоидогенный полипептид, что позволяет иммунизацию этих животных тем же самым иммуногеном (иммуногенами). Если, например, в разных популяциях людей существуют генетические варианты данного амилоидогенного полипептида, может быть необходимым использование различных иммуногенов в этих отличающихся популяциях, чтобы добиться разрушения аутотолерантности в отношении амилоидогенного полипептида в каждой популяции оптимальным образом. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что животное в данном контексте является живым существом, которое имеет иммунную систему. Предпочтительно, чтобы это животное являлось позвоночным животным, таким как млекопитающее.
Термин супрессия амилоида ίη νίνο означает здесь уменьшение в живом организме общего количества отложенного амилоида соответствующего типа. Супрессия может быть получена посредством нескольких механизмов, из них наиболее простым является простое взаимодействие с амилоидом посредством связывания с антителами для предотвращения ошибочной агрегации. Однако в объем данного изобретения входит также то, что связывание антител приводит к удалению амилоида клетками
- 7 008762 акцепторами (такими как макрофаги и другие фагоцитарные клетки) и что эти антитела взаимодействуют с другими амилоидогенными полипептидами, которые приводят к образованию амилоида.
Выражение осуществление представления ... иммунной системе означает, что иммунная система животного подвергается иммуногенной стимуляции регулируемым образом. Как будет видно из приведенного ниже описания, такая стимуляция иммунной системы может быть выполнена рядом способов, из которых наиболее важным является вакцинация содержащими полипептид фармакцинами (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления имеющегося заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту фармакцинами. Важным результатом, который должен быть получен, является то, что иммунокомпетентные клетки сталкиваются с антигеном иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата менее важен для идеи, лежащей в основе данного изобретения.
Термин иммуногенно эффективное количество имеет свое обычное значение в данной области, т.е. количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунную реакцию, которая в значительной мере связывает патогенные агенты, имеющие общие иммуногенные признаки с данным иммуногеном.
При использовании выражения, что амилоидогенный полипептид был модифицирован, имеется в виду химическая модификация полипептида, который составляет скелет амилоидогенного полипептида. Такая модификация может, например, быть дериватизацией (например, алкилированием) определенных аминокислотных остатков в последовательности амилоидогенного полипептида, но, как будет понятно из приведенного ниже описания, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности.
При обсуждении аутотолерантности в отношении амилоидогенного полипептида понятно, что поскольку амилоидогенный полипептид является аутологичным (своим) белком в подлежащей вакцинации популяции, у нормальных индивидуумов в этой популяции не возникает иммунной реакции против этого амилоидогенного полипептида; хотя и нельзя исключить, что случайные индивидуумы в популяции животных могут быть способными продуцировать антитела против природного амилоидогенного полипептида, например, в виде части аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, животное будет обычно аутотолерантным только в отношении его собственного амилоидогенного полипептида, но нельзя исключить, что аналоги, полученные у других видов животных или у популяции, имеющей отличающийся фенотип, будут также переноситься указанным животным.
Чужеродный Т-клеточный эпитоп (или чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп) является пептидом, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки у видов животных. Предпочтительными чужеродными Т-клеточными эпитопами в данном изобретении являются смешанные эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с существенной фракцией конкретного класса молекул МНС у вида или популяции животного. Известно только очень ограниченное количество таких Т-клеточных эпитопов, и они будут подробно обсуждаться ниже. Смешанные Т-клеточные эпитопы называют также универсальными Т-клеточными эпитопами. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с данным изобретением, были эффективными по возможности в большей части популяции животного, может быть необходимым: 1) встроить несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) получить несколько аналогов, где каждый аналог имеет отличающийся встроенный случайный эпитоп. Следует также отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов включает в себя также использование скрытых (критических) Тклеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые происходят из аутологичного белка и которые проявляют их иммуногенное поведение только в том случае, когда они существуют в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого аутологичного белка.
Чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита (чужеродный Тн-эпитоп) является чужеродным Тклеточным эпитопом, который связывается с молекулой МНС Класса II и может быть представлен на поверхности антигенпредставляющей клетки (АРС), связанной с молекулой МНС Класса II.
«Функциональная часть» (био)молекулы означает в данном контексте часть молекулы, которая является ответственной по меньшей мере за одно из биохимических или физиологических действий, проявляемых этой молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за действия, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут служить цели стабилизации или усиления растворимости и, следовательно, могут быть опущены, если эти цели не являются важными в контексте определенного варианта данного изобретения. Например, можно использовать некоторые цитокины в качестве модифицирующей части молекулы в амилоидогенном полипептиде (см. подробное обсуждение ниже), и в таком случае, вопрос стабильности может быть не важен, так как связывание с амилоидогенным полипептидом может обеспечивать необходимую стабильность.
Термин «адъювант» имеет его обычное значение в области технологии вакцин, т.е. означает вещество или композицию, которая: 1) сама не способна вызывать специфическую иммунную реакцию против иммуногена вакцины, но которая 2) тем не менее способна усиливать иммунную реакцию против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только адъювантом не обеспечивает иммунную реак
- 8 008762 цию против иммуногена, вакцинация иммуногеном может индуцировать или может не индуцировать иммунную реакцию против иммуногена, но объединенная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунную реакцию против иммуногена, которая является более сильной, чем иммунная реакция, индуцируемая одним иммуногеном.
«Нацеливание» молекулы означает в данном контексте ситуацию, в которой молекула при введении животному будет появляться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связана с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может достигаться рядом путей, в том числе включением этой молекулы в состав композиции, облегчающей нацеливание, или введением в эту молекулу групп, которые облегчают нацеливание. Эти вопросы будут подробно обсуждаться ниже.
«Стимуляция иммунной системы» означает, что рассматриваемые вещество или композиция проявляют общее, неспецифическое иммуностимулирующее действие. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является увеличенная «бдительность» иммунной системы, т. е. одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном индуцирует значимо более эффективную реакцию в сравнении с отдельным использованием данного иммуногена.
Предпочтительные варианты супрессии амилоида
Предпочтительно амилоидогенный полипептид, используемый в качестве иммуногена в способе данного изобретения, является модифицированной молекулой, в которой по меньшей мере присутствует одно изменение в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида, так как шансы получения общего разрушения аутотолерантности в отношении данного амилоидогенного полипептида в этом случае сильно увеличиваются таким путем - это, например, очевидно из результатов, приведенных здесь в примере 2, где иммунизация Άβ дикого типа сравнивается с иммунизацией вариантной молекулой Άβ. Следует отметить, что применение модифицированной молекулы не исключает возможности использования такого модифицированного амилоидогенного полипептида в композициях, которые дополнительно облегчают разрушение аутотолерантности против амилоидогенного полипептида, например, в композициях, содержащих адъюванты.
Было показано (в Па1иш I. с! а1., 1996, 1. 1ттипо1. 157: 4796-4804), что потенциально самореактивные В-лимфоциты, узнающие аутологичные белки, физиологически присутствуют у нормальных индивидуумов. Однако для того, чтобы эти В-лимфоциты были индуцированы для фактического продуцирования антител, реактивных с соответствующими аутологичными белками, требуется помощь со стороны продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов (Тн-клеток или Тн-лимфоцитов). Обычно эта помощь не обеспечивается, так как Т-лимфоциты обычно не узнают Т-клеточные эпитопы, полученные из аутологичных белков при презентации антигенпредставляющими клетками (АРС). Однако посредством обеспечения элемента «чужеродности» в аутологичном белке (т.е. введением иммунологически значимой модификации) Т-клетки, узнающие этот чужеродный элемент, активируются при узнавании этого чужеродного эпитопа на АРС (такой как, первоначально, мононуклеарная клетка). Поликлональные Влимфоциты (которые являются также АРС), способные узнавать аутологичные эпитопы на модифицированном аутологичном белке, также интернализируют этот антиген, и затем представляют его чужеродный Т-клеточный эпитоп (эпитопы), и эти активированные Т-лимфоциты затем обеспечивают помощь цитокинов для данных самореактивных поликлональных В-лимфоцитов. Поскольку антитела, продуцируемые этими поликлональными В-лимфоцитами, являются реактивными в отношении различных эпитопов на модифицированном полипептиде, в том числе тех из них, которые присутствуют также в нативном полипептиде, индуцируется антитело, перекрестно-реактивное с немодифицированным аутологичным белком. В результате Т-лимфоциты можно заставить действовать так, как если бы популяция поликлональных В-лимфоцитов узнавала полностью чужеродный антиген, тогда как в действительности только встроенный эпитоп (эпитопы) является (являются) чужеродным для данного хозяина. Таким путем индуцируются антитела, способные перекрестно реагировать с немодифицированными аутологичными антигенами.
Несколько путей модификации пептидного аутологичного антигена для достижения разрушения аутотолерантности известны в данной области. Таким образом, согласно данному изобретению модификация может включать в себя следующее:
вводят по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный эпитоп, и/или вводят по меньшей мере только первую часть, которая выполняет нацеливание модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АРС), и/или вводят по меньшей мере только вторую часть, которая стимулирует иммунную систему, и/или вводят по меньшей мере только третью часть, которая оптимизирует представление модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе.
Однако все эти модификации должны проводиться при сохранении существенной фракции исходных эпитопов В-лимфоцитов в амилоидогенном полипептиде, так как посредством этого усиливается
- 9 008762 узнавание В-лимфоцитами нативной молекулы.
В одном предпочтительном варианте вводят ковалентно или нековалентно боковые группы (в виде чужеродных Т-клеточных эпитопов или вышеупомянутых первой, второй или третьей частей молекулы). Это должно означать, что отрезки аминокислотных остатков, происходящие из амилоидогенного полипептида, дериватизируют без изменения первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без введения изменений в пептидные связи между индивидуальными аминокислотами в данной цепи.
В альтернативном - и предпочтительном - варианте используют замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавку аминокислот (которые могут выполняться рекомбинантными способами или с использованием пептидного синтеза; модификации, которые включают в себя более длинные отрезки аминокислот, могут приводить к образованию слитых полипептидов). Одной особенно предпочтительной версией этого варианта является способ, описанный в ^О 95/05849, где описан способ супрессии аутологичных белков путем иммунизации аналогами аутологичных белков, где ряд аминокислотных последовательностей был заменен соответствующим рядом аминокислотных последовательностей, каждая из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, при сохранении в то же самое время в целом третичной структуры аутологичного белка в данном аналоге.
Однако для целей данного изобретения достаточно, если модификация (инсерция, добавка, делеция или замена) приводит к образованию чужеродного Т-клеточного эпитопа и в то же самое время сохраняет значительное число В-клеточных эпитопов в амилоидогенном полипептиде. Однако для получения максимальной эффективности индуцируемой иммунной реакции предпочтительно, чтобы вся третичная структура амилоидогенного полипептида сохранялась в модифицированной молекуле.
Следующая формула описывает молекулярные конструкции, включенные в общем виде в данное изобретение:
(М001)81(аМИЛОИДе1)п1(М002)82(аМИЛОИДе2)п2.-.(МООх)5х(аМИЛОИДех)пх (I) где амилоиде1-амилоидех являются х В-клеточными эпитопами, содержащими субпоследовательности амилоидогенного полипептида, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродные боковые группы, х равно целому числу > 3, п1-пх равны х целым числам > 0 (по меньшей мере один из них > 1), ΜΟΌ1-ΜΟΌΧ являются х модификациями, вводимыми между сохраненными В-клеточными эпитопами, а 81-8х являются х целыми числами > 0 (по меньшей мере один из них > 1, если в последовательности амилоидаех не введены боковые группы). Таким образом, при условии общих функциональных ограничений в отношении иммуногенности этих конструкций, данное изобретение делает возможными все типы пермутаций первоначальной последовательности амилоидогенного полипептида и все типы модификаций в ней. Таким образом, в данное изобретение включены модифицированные амилоидогенные полипептиды, полученные опущением частей последовательности амилоидогенного полипептида, которые проявляют неблагоприятные эффекты ш νίνο, или опущением частей, которые могли бы вызвать нежелательные иммунологические реакции.
Предпочтительными версиями конструкций, описанных выше, являются, если это применимо, конструкции, в которых содержащая В-клеточный эпитоп субпоследовательность амилоидного белка не является экспонированной внеклеточно в полипептиде-предшественнике, из которого произведен этот амилоид. При таком выборе амилоидных эпитопов гарантируется, что не вырабатываются антитела, которые могли бы быть реактивными в отношении клеток, продуцирующих предшественник амилоида, и посредством этого иммунная реакция, которая генерируется, становится ограниченной иммунной реакцией против нежелательных амилоидных отложений. Когда это применимо, подобный выбор может быть сделан для других амилоидогенных полипептидов, которые не являются амилоидом. В этих случаях будет, например, легко индуцировать иммунитет против эпитопов амилоидогенного полипептида, которые являются экспонированными во внеклеточной фазе только в том случае, когда они свободны от какого-либо связывания с клетками, из которых они получены.
Сохранение существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, который подвергают модификации, как описано здесь, может быть достигнуто несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против амилоидогенного полипептида (например, антисыворотки, полученной у кролика), и после этого применение этой антисывороки в качестве тест-реагента (например, в конкурентном методе ЕЫ8А) против модифицированных белков, которые продуцируются. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в той же самой степени с этой антисывороткой, что и амилоидогенный полипептид, должны рассматриваться как имеющие общую третичную структуру, какую имеет амилоидогенный полипептид, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность в отношении такой антисыворотки, рассматриваются как имеющие сохраненную существенную фракцию первоначальных эпитопов В-клеток.
Альтернативно, может быть приготовлен набор моноклональных антител, реагирующих с отдельными эпитопами на амилоидогенном полипептиде, и использован в качестве тест-панели. Этот подход имеет следующие преимущества: 1) позволяет картировать эпитопы амилоидогенного полипептида и 2)
- 10 008762 позволяет картировать эпитопы, которые сохраняются в полученных аналогах.
Конечно, третий подход мог бы раскрыть трехмерную структуру амилоидогенного полипептида или его биологически активного укороченного фрагмента (см. выше) и сравнить ее с раскрытой трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть выяснена при помощи исследований дифракции рентгеновских лучей и ЯМР-спектроскопии. Дополнительная информация о третичной структуре может быть до некоторой степени получена из исследований кругового дихроизма, которые имеют преимущество, заключающееся в том, что требуется лишь полипептид в чистом виде (тогда как дифракция ренгеновских лучей требует обеспечения кристаллического полипептида, а ЯМР требует обеспечения изотопных вариантов этого полипептида) для получения ценной информации о третичной структуре конкретной молекулы. Однако в конечном счете дифракция рентгеновских лучей и/или ЯМР являются необходимыми для получения окончательных данных, так как круговой дихроизм обеспечивает лишь косвенное доказательство правильной трехмерной структуры через информацию об элементах вторичной структуры.
В одном из предпочтительных вариантов данного изобретения используются множественные представления В-лимфоцитарных эпитопов амилоидогенного полипептида (т.е. формулы I, где присутствует по меньшей мере один В-клеточный эпитоп в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными путями, например путем простого получения слитых полипептидов, содержащих структуру (амилоидогеннный полипептид)т, где т равно целому числу > 2, и затем путем введения обсуждаемых здесь модификаций по меньшей мере в одну из последовательностей амилоида. Предпочтительно вводимые модификации включают в себя по меньшей мере одну дупликацию эпитопа В-лимфоцитов и/или введение гаптена. Эти варианты, включающие в себя множественное представление выбранных эпитопов, особенно предпочтительны в ситуациях, когда лишь небольшие части амилоидогенного полипептида применимы в качестве компонентов в вакцинном агенте.
Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено введением по меньшей мере одной инсерции, одной добавки, одной делеции или замены аминокислоты. Конечно, нормальной ситуацией будет введение более чем одного изменения в аминокислотной последовательности (например, инсерции или замены полным Т-клеточным эпитопом), но важной задачей, которая должна быть достигнута, является то, что этот аналог при процессировании антигенпредставляющей клеткой (АРС) будет приводить к появлению такого чужеродного Т-клеточного эпитопа, представленного в контексте молекулы МНС Класса II, на поверхности АРС. Таким образом, если аминокислотная последовательность амилоидогенного полипептида в подходящем положении содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также обнаружены в чужеродном Тн-эпитопе, то введение чужеродного Тн-эпитопа может быть выполнено обеспечением остальных аминокислот чужеродного эпитопа посредством аминокислотных инсерции, добавок, делеций и замен. Другими словами, введение полного Тн-эпитопа путем инсерции или замены не является обязательным для удовлетворения цели данного изобретения.
Предпочтительно число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавок равно по меньшей мере 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 инсерциям, заменам, добавкам или делециям. Кроме того, предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавок не превышало 150, например было не более 100, не более 90, не более 80 и не более 70. Особенно предпочтительно, чтобы число инсерций, делеций, замен или добавок не превышало 60, и в частности, это число не должно превышать 50 или даже 40. Более предпочтительно это число не должно быть более 30. Что касается добавок аминокислот, следует отметить, что они, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, часто составляют число более 150.
Предпочтительные варианты данного изобретения включают в себя модификацию путем введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Должно быть понятно, что иммунодоминирование Т-клеточного эпитопа зависит от рассматриваемого вида животного. В применении здесь, «иммунодоминирование» означает просто эпитопы, которые в вакцинированном животном/популяции индуцируют значимую иммунную реакцию, но хорошо известным фактом является то, что Т-клеточный эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме/одной популяции, не обязательно является иммунодоминантным в другом индивидууме того же самого вида, даже хотя он может быть способным связывать молекулы МНС-11 в последнем индивидууме. Таким образом, для целей данного изобретения, иммунодоминантным Т-клеточным эпитопом является Т-клеточный эпитоп, который будет эффективным в обеспечении помощи Т-клеток в случае присутствия его в антигене. Обычно иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы имеют в качестве неотъемлемого признака то, что они будут, по существу, всегда представляться в связанном с молекулой МНС Класса II виде, независимо от полипептида, в котором они присутствуют.
Другим важным моментом является вопрос о МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов. Обычно природно встречающиеся Т-клеточные эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенные пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с субпопуляцией молекул МНС Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев применение одного специфического Т-клеточного эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который яв- 11 008762 ляется эффективным только во фракции этой популяции, и в зависимости от размера этой фракции может быть необходимым включать больше Т-клеточных эпитопов в одну и ту же молекулу или альтернативно готовить многокомпонентную вакцину, в которой эти компоненты являются вариантами амилоидогенного полипептида, которые отличаются друг от друга характером введенного Т-клсточного эпитопа.
Если МНС-рестрикция используемых Т-клеток является полностью неизвестной (например, в ситуации, где вакцинированное животное имеет слабо определенный состав МНС), фракция этой популяции, включаемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы:
п /мрикШоп = 1 -П0 ~Р/) (II) /-1 где р; означает частоту встречаемости в популяции респондеров на ΐ-тый чужеродный Т-клеточный эпитоп, присутствующий в вакцинной композиции, а η означает общее число чужеродных Т-клеточных эпитопов в этой вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющих частоты встречаемости в популяции 0,8, 0,7 и 0,6 соответственно, будет иметь 1-0,2x0,3x0,4=0,976, т.е. 97,6% этой популяции будет статистически формировать МНС-Попосредованную реакцию на эту вакцину.
Приведенная выше формула неприменима в ситуациях, где известна более или менее точная картина МНС-рестрикции пептидов. Если, например, определенный пептид связывает только молекулы МНС11 человека, кодируемые ΗΕΑ-ϋΚ-аллелями ΌΚ1, ΌΚ3, ΌΚ5 и ΌΚ7, то использование этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы МНС-П, кодируемые ΗΕΑ-ΌΚаллелями, будет охватывать 100% в рассматриваемой популяции. Подобным образом, если второй пептид связывает только ΌΚ3 и ΌΚ5, добавление этого пептида вообще не будет увеличивать этот охват. Если основывать расчет реакции популяции только на МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов в вакцине, фракция популяции, охватываемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей формулы:
з /рорт/ЙМи! = 1 “71(1 (III) где (¾ является суммой частот встречаемости в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к ΐ-тому из 3 известных НЬА-локусов (ΌΡ, ΌΚ и ЭР); на практике сначала определяют, какие молекулы МНС будут узнавать каждый Т-клеточный эпитоп в данной вакцине, а после этого их вносят в списки по типу (ЭР, ΌΚ и ЭР), затем индивидуальные частоты встречаемости этих находящихся в различных списках аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, получая посредством этого цц, φ2 и φ3.
Может быть случай, когда величина р; в формуле II превышает соответствующую теоретическую величину р;
^=1“По~у?2 <ιν>
7=1 где V) является суммой частот встречаемости в популяции аллельного гаплотипа, кодирующего молекулы МНС, которые связывают Т-клеточный эпитоп с ΐ-тым в данной вакцине и которые принадлежат к ΐтому из 3 известных НЕА-локусов (ЭР, ΌΚ и ΌΡ). Это означает, что в 1-р; этой популяции частота встречаемости респондеров Γ0οτ3τοκ-ί=(Ρί-Ρί)/(1-Ρί)· Таким образом, формула III может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу V /^«,»=1-110-^+(1-11(1-/-^)] <у) где термин Ι-φ(Κ·ΙίΠοΚ-ί устанавливается на нуль, если он является отрицательным. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все элитопы были гаплотипами, картированными относительно идентичного набора гаплотипов.
Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог важно включить все знание об этих эпитопах, которое является доступным: 1) частоту встречаемости респондеров в популяции относительно каждого эпитопа, 2) данные МНС-рестрикции и 3) частоту встречаемости в популяции релевантных гаплотипов.
Существует ряд природно встречающихся «смешанных» Т-клеточных эпитопов, которые являются активными у большей части индивидуумов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в вакцину, уменьшая посредством этого необходимость в очень большом числе различных аналогов в одной и той же вакцине.
Смешанным эпитопом может быть, в соответствии с данным изобретением, природно встречающийся Т-клеточный эпитоп человека, такой как эпитопы из столбнячного токсоида (например, эпитопы Р2 и РЗО), дифтерийный токсоид, гемагглютинин вируса гриппа (НА) и антиген С8 Р. 1а1с1рагит.
На протяжении ряда лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В
- 12008762 частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую фракцию молекул НЬАНК, кодируемых различными аллелялми НЬА-НК, и они все являются Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги, используемые в соответствии с данным изобретением. См. также эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, которые включены тем самым в качестве ссылки здесь: νθ 98/23635 (Ггахсг 1.Н. е! а1., а881диеб !о Тйе Ишуегвйу о£ ОнеепЧапб); δοιι11ι\νοοά δ. е! а1., 1998, 1. 1ттипо1. 160: 3363-3373/ 81П1дад11а Р. е! а1., 1988, Ыа1иге 336: 778-780; ΟΗίοζ К.М. е! а1., 1993, 1. Ехр. Меб. 178: 27-47; Наттег 1. е! а1., 1993, Се11 74: 197-203; и Ра1к К. е! а1., 1994, 1ттиподепебс5 39: 230-242. В последней ссылке также рассматриваются лиганды НЬА-ОЦ и -ЭР. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, уместны в качестве природных эпитопов-кандидатов для использования в данном изобретении, как и эпитопы, которые имеют с ними общие мотивы.
Альтернативно, этим эпитопом может быть любой синтетический Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую часть молекул МНС Класса II. В этом контексте, паи-НК-эпитопные пептиды (РАОКЕ), описанные в νθ 95/07707 и в соответствующей статье А1ехаибег 1. е! а1., 1994, 1ттиш!у 1: 751-761 (оба описания включены здесь в качестве ссылки), являются представляющими интерес кандидатами для эпитопов для применения в соответствии с данным изобретением. Следует отметить, что большинство эффективных пептидов РАНКЕ, описанных в этих статьях, несут Ό-аминокислоты на С- и Ν-концах для улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение прежде всего нацелено на включение подходящих эпитопов в качестве части модифицированного амилоидогенного полипептида, которая должна быть затем отщеплена ферментативно в лизосомном компартменте АРС для возможности презентации в контексте молекулы МНС-ΙΙ, и, следовательно, нецелесообразно включать Ό-аминокислоты в эпитопы, используемые в данном изобретении.
Одним особенно предпочтительным пептидом РАНКЕ является пептид, имеющий аминокислотную последовательность ΛΚΡνΛΛνΤΡΚΛΛΛ или ее иммунологически эффективную субпоследовательность. Этот эпитоп и другие эпитопы, имеющие то же самое отсутствие МНС-рестрикции, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах, используемых в способе данного изобретения. Такие суперсмешанные эпитопы сделают возможными наиболее простые варианты данного изобретения, в которых только единственный модифицированный амилоидогенный полипептид представляется иммунной системе вакцинированного животного.
Как упоминалось выше, модификация амилоидогенного полипептида может также включать в себя введение первой части молекулы, которая нацеливает модифицированный амилоидогенный полипептид на АРС или В-лимфоцит. Например, первой частью молекулы может быть партнер специфического связывания для специфического поверхностного антигена В-лимфоцитов или АРС-специфического поверхностного антигена. Многие такие специфические поверхностные антигены известны в данной области. Например, эта часть молекулы может быть углеводом, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или АРС (например, маннаном или маннозой). Альтернативно, вторая часть молекулы может быть гаптеном. Фрагмент антитела, который специфически узнает поверхностную молекулу на АРС или лимфоцитах, может быть использован в качестве первой части молекулы (поверхностной молекулой может, например, быть РСу-рецептор макрофагов и моноцитов, такой как РСуК1, или, альтернативно любой другой специфический поверхностный маркер, такой как С.Н40 или СТЬА-4). Следует отметить, что все приводимые в качестве примеров нацеливающие молекулы могут быть использованы в виде части адъюванта, см. ниже.
В качестве альтернативы или дополнения к нацеливанию модифицированного амилоидогенного полипептида на определенный тип клеток для получения усиленной иммунной реакции, можно увеличить уровень отвечаемости иммунной системы путем включения вышеуказанной второй части молекулы, которая стимулирует иммунную систему. Типичными примерами таких вторых частей молекулы являются цитокины и белки теплового шока или молекулярные шапероны, а также их эффективные части.
Подходящими цитокинами для применения в соответствии с данным изобретением являются цитокины, которые будут обычно также функционировать в качестве адъювантов в вакцинной композиции, т.е., например, интерферон γ (ΙΡΝ-γ), интерлейкин 1 (ΙΗ-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь-4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Б-12). интерлейкин 13 (1Б-13), интерлейкин 15 (1Б-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р); альтернативно, функциональная часть молекулы цитокина может быть достаточной в качестве второй части молекулы. В отношении применения таких цитокинов в качестве адъювантных веществ см. обсуждение ниже.
Согласно данному изобретению подходящими белками теплового шока или молекулярными шаперонами, используемыми в качестве второй части молекулы, могут быть Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, ОКР94 (также известный как др96, см. ’№еаг8сй Р.А. е! а1., 1998, ВюсйетМгу 37: 5709-19) и СКТ (кальретикулин).
Альтернативно, второй частью может быть токсин, такой как листериолицин (ЬЬО), липид А и термолабильный энтеротоксин. Ряд микобактериальных производных, таких как МЭР (мурамилдипелтид), СРА (полный адъювант Фрейнда) и диэфиры трегалозы ТНМ и ТНЕ, также являются представляющими интерес возможностями.
- 13 008762
Возможность введения также третьей части молекулы, которая усиливает представление модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе, является важным вариантом данного изобретения. В данной области было показано несколько примеров этого принципа. Например, известно, что якорь пальмитоиллипидирования в белке ОкрА Воггейа ЬигцбогГеп может быть использован таким образом, чтобы обеспечить самоадъювантные полипептиды (см., например, \¥О 96/40718), по-видимому, липидированные белки образуют мицеллоподобные структуры с центральной частью, состоящей из якорных частей липидирования полипептидов, и остальными частями молекулы, выступающими из нее, что приводит к множественным представлениям антигенных детерминант. Таким образом, применение этого и родственных подходов с использованием различных якорей липидирования (например, миристильной группы, миристильной группы, фарнезильной группы, геранил-геранильной группы, СР1-якоря и Ν-ацилдиглицеридной группы) являются предпочтительными вариантами данного изобретения, в частности, поскольку обеспечение такого якоря липидирования в рекомбинантно полученном белке является довольно простым и требует лишь применения, например, природно встречающейся сигнальной последовательности в качестве партнера слияния для модифицированного амилоидогенного полипептида. Другой возможностью является применение С3б-фрагмента фактора комплемента С3 или самого фактора С3 (см. Эетр^еу е! а1., 1996, Баеисе 271, 348-350 и Ьои апб КоЫег, 1998, №1Шге Вю!есйпо1оду 16, 458-462).
Альтернативным вариантом данного изобретения, который также приводит к предпочтительной презентации множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных районов эпитопов амилоидогенного полипептида иммунной системе, является ковалентное связывание амилоидогенного полипептида, его субпоследовательности или вариантов с определенными молекулами. Например, могут быть использованы полимеры, например углеводы, такие как декстран, см., например, Ьеек А. е! а1., 1994, Уассте 12: 1160-1166; Ьеек А. е! а1., 1990, 1 1ттипо1. 145: 3594-3600, но применимой альтернативой являются также манноза и маннан. Интегральные мембранные белки, например, из Е. сой и других бактерий, также являются применимыми партнерами конъюгации. Обычные молекулы-носители, такие как гемоцианин фиссуреллы (КЕН), столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид и бычий сывороточный альбумин (БСА) также являются предпочтительными и применимыми партнерами конъюгации.
Предпочтительные варианты ковалентного связывания амилоидогенного полипептида с полигидроксиполимерами, такими как углеводы, включают в себя применение по меньшей мере одного амилоидогенного полипептида и по меньшей мере одного чужеродного Т-хелперного эпитопа, которые связывают по отдельности с полигидроксиполимером (т. е. чужеродный Т-хелперный эпитоп и амилоидогенный полипептид не сливают друг с другом, а связывают с полигидроксиполимером, который затем служит в качестве остова-носителя). Опять же, такой вариант является наиболее предпочтительным, когда подходящие несущие В-клеточные эпитопы районы амилоидогенного полипептида состоят из коротких пептидных отрезков, это связано с тем, что такой подход очень удобен для получения множественных представлений выбранных эпитопов в полученном иммуногенном агенте.
Особенно предпочтительно, что связывание чужеродного Т-хелперного эпитопа и амилоидогенного (поли)пептида осуществляется посредством амидной связи, которая может расщепляться пептидазой. Эта стратегия имеет такой результат, что АРС будут способны поглощать этот конъюгат и одновременно будут способны процессировать конъюгат и затем представлять чужеродный Т-клеточный эпитоп в контексте МНС Класса II.
Одним из способов достижения связывания пептидов (как амилоидогенного полипептида, так и чужеродного эпитопа) является активация подходящего полигидроксиполимера трезильными группами; можно, например, приготовить трезилированные полисахариды, как описано в \УО 00/05316 и в патенте США И8 5874469 (оба включены в качестве ссылки здесь), и связать их с амилоидогенными пептидами и Т-клеточными эпитопами, полученными посредством способов общепринятого твердофазного пептидного синтеза или синтеза пептидов в жидкой фазе. Полученный продукт состоит из полигидроксиполимерного остова (например, декстранового остова), который имеет прикрепленные к нему их Ν-концами или другими доступными азотсодержащими частями молекул амилоидогенные полипептиды и чужеродные Т-клеточные эпитопы. Если желательно, можно синтезировать амилоидогенные полипептиды таким образом, чтобы защитить все доступные аминогруппы, кроме одной на Ν-конце, затем связать полученные защищенные пептиды с трезилированной декстрановой частью и, наконец, удалить защитные группы полученного конъюгата. Конкретный пример этого подхода описан в примерах ниже.
Вместо применения водорастворимых полисахаридных молекул, как описано в \УО 00/05316 и патенте США И8 5874469, равным образом можно использовать поперечносшитые полисахаридные молекулы, получая тем самым состоящий из частиц конъюгат между полипептидами и полисахаридом, считается, что это приводит к улучшенной презентации иммунной системе полипептидов, так как достигаются две задачи, а именно, получение эффекта локального депонирования при инъекции этого конъюгата и получение частиц, которые являются притягательными мишенями для АРС. Подход использования такой состоящей из частиц системы также подробно описан в примерах.
Рассмотрениями, лежащими в основе выбранных областей введения модификаций в амилоидогенных полипептидах, являются: а) сохранение известных и прогнозируемых В-клеточных эпитопов, Ь) со
- 14 008762 хранение третичной структуры, с) избегание В-клеточных эпитопов, присутствующих на «клеткахпродуцентах» и т.д. Во всяком случае, как обсуждалось выше, довольно легко подвергнуть скринингу набор модифицированных амилоидогенных молекул, все из которых были подвергнуты введению Тклеточного эпитопа в различных положениях.
Поскольку наиболее предпочтительные варианты данного изобретения включают в себя супрессию Ав человека, следовательно, предпочтительно, чтобы обсуждаемый выше амилоидный полипептид был полипептидом Ав человека. В этом варианте особенно предпочтительно, чтобы амилоидогенный полипептид человека был модифицирован заменой по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в 8ЕО ΙΌ N0:2 по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины и содержащей Тн-эпитоп. Предпочтительные примеры модифицированных амилоидогенных АРР и Ав показаны схематически на чертеже с использованием эпитопов Р2 и Р30 в качестве примеров. Обоснование таких конструкциий обсуждается подробно в этом примере.
Более конкретно, Тн, содержащий (или дополняющий) аминокислотную последовательность, которую вводят в 8Е0 ΙΌ N0:2, может быть введен в положении любой аминокислоты в 8Е0 ΙΌ N0:2. То есть введение возможно после любой из аминокислот 1-770, но предпочтительно после любой из аминокислот 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8ЕО ΙΌ N0:2. Это может комбинироваться с делецией любой из или всех аминокислот 1-671 или любой из или всех аминокислот 715-770. Кроме того, при использовании способа замены, любая из аминокислот 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8Е0 ΙΌ N0:2 может быть делетирована в комбинации с этим введением.
Приготовление амилоидогенного полипептида и модифицированных амилоидогенных полипептидов
При выполнении представления амилоидогенного полипептида или модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе животного посредством его введения животному приготовление этого полипептида соответствует принципам, обычно признаваемым в данной области.
Приготовление вакцин, которые содержат пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как иллюстрируется приведенными в качестве примеров патентами США 4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, которые включены здесь в качестве ссылки. Обычно такие вакцины готовят в виде инъекционных материалов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т. п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поддерживающие рН агенты или адъюванты, которые усиливают эффективность вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов ниже.
Вакцины обычно вводят парентерально, путем инъекции, например подкожно, внутрикожно, интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые пригодны для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, подъязычные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные композиции. Для суппозиториев обычные связывающие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно применяемые наполнители, как, например, фармацевтически чистый маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для пероральных композиций представляющим интерес партнером композиции является холерный токсин (он является также возможным партнером конъюгации).
Полипептиды могут быть приготовлены в форме вакцины в виде нейтральной или солевой форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами пептида), которые образованы с неорганическими кислотами, такими, например, как хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или с такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть также получены из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа (ΙΙΙ), и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.
Вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от субъекта,
- 15 008762 проходящего лечение, в том числе, например, способности иммунной системы индивидуума осуществлять иммунную реакцию и степени желаемой защиты. Подходящими диапазонами доз являются дозы порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на одну вакцинацию с предпочтительным диапазоном приблизительно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматриваются даже более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне приблизительно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг, и в частности в диапазоне приблизительно от 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для первоначального введения и бустерных инъекций также являются вариабельными, но обычно предусматривают первоначальное введение с последующими инокуляциями или иными введениями.
Способ введения может широко варьироваться. Любые из общепринятых способов введения вакцины являются применимыми. Они включают в себя пероральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, посредством инъекции или т. п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет меняться в соответствии с возрастом лица, которое должно вакцинироваться, и композиции антигена.
Некоторые полипептиды данной вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунная реакция усиливается, если вакцина дополнительно содержит адъювантное вещество.
Различные способы получения адъювантного действия этой вакцины являются известными. Общие принципы и способы подробно описаны в Т11е Тйеогу апй Ргасйса1 АррйсаИоп о£ Ай^апГз, 1995, Эппсам Е.8. 81е\уаг(-Ти11 (ей.), 1ойп ^Неу апй 8опз ЬГй, 18ВЫ 0-471-95170-6, а также в Уасстез: №\ν СепегаПоп 1ттипо1одюа1 Ай)^апГз, 1995, СгедопаФз С. еГ а1. (ейз.), Р1епит Ргезз, №\ν Уогк, 18ВЫ 0-30645283-9, включенных здесь в качестве ссылки.
Особенно предпочтительно использование адъюванта, который, как можно продемонстрировать, облегчает разрушение аутотолерантности к аутологичным антигенам; действительно, это является существенным в случаях, когда немодифицированный амилоидогенный полипептид используют в качестве активного ингредиента в аутовакцине. Неограничительные примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из иммунонацеливающего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллы адъюванта; сапонина; матрикса иммуностимулирующего комплекса (матрикса 18СОМ); частицы; ΌΌΑ; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина; и инкапсулирующего адъюванта. В общем следует отметить, что приведенное выше описание, относящееся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в аналогах, относится также, при соответствующих изменениях, к их применению в адъюванте вакцины согласно изобретению.
Применения адъювантов включают в себя применение таких агентов, как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1% раствора в забуференном солевом растворе, смесей с синтетическими полимерами сахаров (например, Карбопол®), применяемых в виде 0,25% раствора, возможными являются агрегирование белка в вакцине путем тепловой обработки при температурах между 70 и 101°С в течение периода 30 с-2 мин соответственно, а также агрегации с использованием сшивающих агентов. Могут также использоваться агрегация посредством повторной активации обработанными пепсином антителами (РаЬ-фрагментами) с альбумином, смесь с бактериальными клетками, такими как С. рагуит, или эндотоксинами, или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульсия в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как маннидмоноолеат (Агасе1 А), или эмульсия с 20% раствором перфторуглерода (Р1иозо1-ОА), используемого в качестве заменителя блока. Смесь с маслами, такими как аквален и 1РА, также является предпочтительной.
Согласно изобретению ЭВА (диметилдиоктадециламмонийбромид) является перспективным кандидатом в качестве адъюванта, так же как ДНК и γ-инулин, но также большой интерес представляют полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины ОиШага, такие как ЦиНА и Ц821, а также К1В1. Возможно также применение монофосфориллипида А (МРЬ), вышеупомянутых С3 и С3й и мурамилдипептида (МБР).
Известно также, что липосомные композиции придают адъювантные свойства, и, следовательно, липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением.
Согласно данному изобретению предпочтительными являются также адъюванты типа матрикса иммуностимулирующего комплекса (матрикс 18СОМ®), в частности, потому, что было показано, что этот тип адъювантов способен положительно регулировать экспрессию МНС Класса II клетками АРС. Матрикс 18СОМ® состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) из Цш11а_)а заропапа, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная состоящая из частиц композиция представляет собой то, что называют частицей 18СОМ, где сапонин составляет 60-70% (масса/масса), холестерин и фосфолипид 10-15% (масса/масса) и белок 10-15% (масса/масса).
Подробности, касающиеся состава и применения иммуностимулирующих комплексов, могут быть, например, найдены в вышеупомянутых руководствах по адъювантам, но также Могет В. е1 а1., 1995,
- 16 008762
С1ш. ΙιηιηιιηοΙΙκΓ. 3: 461-475, а также Вагг Ι.6. ;·ιηά Мйсйе11 6.Р., 1996, ^тию^ ;·ιηά Се11 Βίο1. 74: 8-25 (включенных здесь в качестве ссылки) обеспечивают полезные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов.
Другой крайне интересной (и, следовательно, предпочтительной) возможностью получения адъювантного действия является применение способа, описанного в Οο8!^1ίη е! а1., 1992 (включенной здесь в качестве ссылки). Вкратце, представление подходящего антигена, такого как антиген согласно изобретению, может быть усилено путем конъюгации этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Рсу-рецепторов на моноцитах/макрофагах. Было показано, в частности, что конъюгаты между антигеном и анти- РсуК1 усиливают иммуногенность для целей вакцинации.
Другие возможности включают в себя применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (кроме прочего, цитокинов), упомянутых выше в качестве кандидатов для первой, второй и третьей частей в модифицированных версиях амилоидогенных полипептидов. В этой связи, синтетические индукторы цитокинов, такие как поли 1:С, также являются возможными вариантами.
Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, ΚΙΒΙ и диэфира трегалозы, такого как ТОМ и ΤΌΕ.
Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбраны из группы, состоящей из лиганда ί.Ό40 и антител ί.Ό40 или их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, РаЬфрагмента и СТЬА-4.
Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера, такого как латекс, например латексные гранулы.
Еще одним интересным способом модуляции иммунной реакции является включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в «виртуальный лимфатический узел» (ΥΣΝ) (запатентованное медицинское устройство, разработанное IттиποΤйе^ару, Шс., 360 ΕΌ.χίηβΙοη Ауегше, Νο\ν ΥοιΈ ΝΥ 10017-6501). УБ-Ν (тонкотрубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Путем введения ΥΈΝ под кожу создается сайт стерильного воспаления с увеличением количества цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АРС быстро отвечают на сигналы опасности, перемещаются в сайт воспаления и накапливаются в пористом матриксе ΥΈΝ. Было показано, что необходимая доза антигена, требующаяся для осуществления иммунной реакции на антиген, снижается с использованием ΥΈΝ и что иммунная защита, сообщаемая вакцинацией с использованием ΥΈΝ, превосходит общепринятую иммунизацию с использованием ΚΙΒΙ в качестве адъюванта. Способ, помимо прочего, описан вкратце у Се1Ьег С. е! а1., 1998, ΕΗαΕιΙίοη οί ΚοЬик! Се11и1аг ;·ιηά Нитο^а1 Ептине Κекрοπкек Ю Зта11 Αтοиπΐк οί Iттиποдеπ Иктд а Νο\ό1 МеШса1 Эеу1се ^ек^дπаΐеά Изе У1г1иа1 Ьутрй Νοώ;, ίη: Ргот 1йе ^аЬο^аΐο^у Ю 1йе СНщк, ΒοοΕ οί АЬЧгасК ОсЮЬег 124Ь-154Ь 1998, Зеаксаре Кебюй, АрЮк, Са1ИЬгша.
Было показано, что состоящая из микрочастиц композиция во многих случаях увеличивает иммуногенность белковых антигенов и является, следовательно, следующим предпочтительным вариантом данного изобретения. Микрочастицы либо готовят в виде совместных композиций антигенов с полимером, липидом, углеводом или другими молекулами, пригодными для приготовления частиц, либо микрочастицы могут быть гомогенными частицами, состоящими только из самого антигена.
Примерами микрочастиц на основе полимеров являются частицы на основе РБСА и РУР (Сир1а, К.К. е! а1. 1998), где полимер и антиген конденсированы в твердую частицу. Частицы на основе липидов могут быть приготовлены в виде мицелл липида (так называемых липосом), заключающих антиген в мицелле (Р^еί^οЬοπ, Р.1. 1995). Частицы на основе углеводов обычно готовят из подходящего деградируемого углевода, такого как крахмал или хитозан. Углевод и антиген смешивают и конденсируют в частицы в способе, сходном со способом, используемым для полимерных частиц (Как Н.З. е! а1. 1997).
Частицы, состоящие только из антигена, могут быть приготовлены различными способами распыления и лиофилизации. В частности, для целей данного изобретения пригоден способ с жидкостью в надкритическом состоянии, который используют для получения очень однородных частиц контролируемого размера (ΥοΑ, Р. 1999 амй δΙκΕί-Πίον, В. е! а1. 1999).
Ожидается, что вакцина должна вводиться 1-6 раз в год, например 1, 3, 3, 4, 6 или 6 раз в год, индивидууму, нуждающемуся в этом. Ранее было показано, что иммунная память, индуцированная применением предпочтительных аутологичных вакцин в соответствии с данным изобретением, не является перманентной, и следовательно, иммунная система нуждается в периодической стимуляции амилоидогенным полипептидом или модифицированными амилоидогенными полипептидами.
Вследствие генетической изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать посредством иммунных реакций различной силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина в соответствии с данным изобретением может содержать несколько различных полипептидов, для того чтобы усиливать иммунную реакцию, см. также обсуждение, приведенное выше, касающееся выбора введения чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцина может содержать два или несколько полипептидов, где все эти полипептиды являются такими, как описанные выше.
- 17 008762
Вакцина может, следовательно, содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных полипептидов.
Вакцинация нуклеиновыми кислотами
В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе пептидов, технология вакцинации нуклеиновыми кислотами (также известная как «иммунизация нуклеиновыми кислотами», «генетическая иммунизация» и «генная иммунизация») предоставляет ряд привлекательных признаков.
Во-первых, в противоположность традиционному подходу к вакцинам, вакцинация нуклеиновыми кислотами не требует ресурсопотребляющего крупномасштабного производства иммуногенного агента (например, в форме ферментации промышленного масштаба микроорганизмов, продуцирующих модифицированные амилоидогенные полипептиды). Кроме того, нет необходимости очистки устройства и схем повторной упаковки (рефолдинга) иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основана на биохимическом аппарате вакцинированного индивидума для продуцирования продукта экспрессии введенной нуклеиновой кислоты, ожидается, что происходит оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, так как, как упоминалось выше, значительная фракция оригинальных В-клеточных эпитопов должна быть сохранена в модифицированной молекуле и так как В-клеточные эпитопы в принципе могут быть составлены частями любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, природные картины гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть очень важны для общей иммуногенности, и это наилучшим образом обеспечивается наличием хозяина, продуцирующего иммуноген.
Таким образом, предпочтительный вариант данного изобретения предусматривает осуществление представления модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе путем введения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей модифицированный амилоидогенный полипептид, в клетки животного и получения посредством этого экспрессии ίη νίνο клетками введенной нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
В этом варианте введенной нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК, которая может быть в форме голой ДНК, ДНК, приготовленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, приготовленной в липосомах, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, приготовленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, приготовленной с осаждающими кальций агентами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимере, например, в РЬСЛ (см. способ микроинкапсулирования, описанный в νΟ 98/31398), или в хитине или хитозане, и ДНК, приготовленной с адъювантом. В этом контексте, следует отметить, что практически все соображения, относящиеся к применению адъювантов в традиционной вакцинной композиции, применимы также в отношении композиции ДНК-вакцин. Таким образом, все описания здесь, которые относятся к применению адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, применимы, при соответствующих изменениях, к их использованию в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами.
Что касается способов введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые были подробно описаны выше, они применимы также для вакцин на основе нуклеиновых кислот данного изобретения, и все обсуждения, приведенные выше, относящиеся к способам введения и схемам введения для полипептидов, применимы, с соответствующими изменениями, к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть удобным образом введены внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что вакцины нуклеиновых кислот могут вводиться с использованием так называемого генного пистолета, и следовательно, также и этот, и эквивалентные варианты введения рассматриваются как часть данного изобретения. Наконец, сообщалось также, что применение УБЫ при введении нуклеиновых кислот дает хорошие результаты, и, следовательно, этот конкретный вариант введения является особенно предпочтительным. Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать районы, кодирующие первую, вторую и/или третью части молекулы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или по меньшей мере под контролем различных промоторов. Тем самым избегается то, что аналог или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента, но это является менее предпочтительным вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии при наличии обоих кодирующих районов, включенных в одну и ту же молекулу.
Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования антител против амилоидогенного полипептида, причем эта композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор данного изобретения (см. обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант, обсуждаемые выше.
При обычных обстоятельствах кодирующую вариант нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора,
- 18 008762 в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробных обсуждений векторов данного изобретения см. обсуждение ниже. Подробные описания, относящиеся к приготовлению и применению вакцин на основе нуклеиновых кислот, являются также доступными, см. ЭопсПу 1.1. с! а1. 1997, Аппи. Всу. 1ттипо1. 15: 617-648 и ЭопсПу 1.1. с! а1., 1997, ЬИс 8с1спсс8 60: 163-172. Обе эти работы включены здесь в качестве ссылки.
Живые вакцины
Третьей альтернативой для выполнения представления модифицированного амилоидогенного полипептида иммунной системе является применение технологии живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами представление иммунной системе выполняют путем введения животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим амилоидогенный полипептид, или вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим аттенюированным бактериальным штаммом (аттенюированным посредством пассирования или посредством удаления продуктов экспрессии патогена технологией рекомбинантных ДНК), например, МусоЬас!сгшт Ьоу18 ВСС., непатогенными 81гср1ососси5 крр., Е. сой, 8а1топс11а зрр., У1Ьгю сМсгас, 8Ыдс11а, и т.д. Обзоры, рассматривающие приготовление живых вакцин существующего уровня техники, могут быть найдены, например, в 8а1юи Р., 1995, Всу. Рга!. 45: 1492-1496 и \Уа1ксг Ρ.Ό., 1992, Уасстс 10: 977-990, обе работы включены здесь в качестве ссылки. В отношении подробностей о фрагментах нуклеиновых кислот и векторах, используемых в таких живых вакцинах, см. обсуждение ниже.
В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения, обсуждаемый ниже, может быть включен в содержащую невирулентный вирус вакцину, например штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус (вирус оспы).
Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному только один раз, но в некоторых случаях может быть необходимым введение этого микроорганизма более одного раза, в течение жизни для поддержания защитного иммунитета. Предполагается даже, что при использовании живой или вирусной вакцин будут применимы схемы иммунизации, аналогичные описанным подробно выше для полипептидной вакцинации.
Альтернативно, живую или вирусную вакцинацию комбинируют с предварительной или последующей вакцинацией полипептидом и/или нуклеиновыми кислотами. Например, можно выполнять первичную вакцинацию живой или вирусной вакциной с последующими бустерными иммунизациями с использованием такого же подхода, как с полипептидом или нуклеиновой кислотой.
Микроорганизм или вирус может быть трансформирован нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами), содержащей районы, кодирующие первую, вторую или третью части молекулы, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта включает в себя наличие кодирующего района для аналога и кодирующего района для иммуномодулятора в разных рамках считывания или по меньшей мере под контролем различных промоторов. Тем самым избегают того, что аналог или эпитопы продуцируются в виде партнеров слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно, наличие первой, и/или второй, и/или третьей частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечивать в качестве продукта экспрессии аналог данного изобретения, и такой вариант является особенно предпочтительным в соответствии с данным изобретением.
Применение способа данного изобретения в лечении заболеваний
Как должно быть понятно из приведенного выше обсуждения, обеспечение способов данного изобретения позволяет осуществлять контроль над заболеваниями, характеризующимися амилодными отложениями. В данном контексте, БА является ключевой мишенью для способа данного изобретения, но также и другие болезни, характеризующиеся отложениями амилоида, являются возможными мишенями. Таким образом, важный вариант способа данного изобретения для супрессии активности амилоида предусматривает лечение, и/или предупреждение, и/или ослабление БА или других заболеваний, характеризующихся отложениями амилоида, причем данный способ предусматривает супрессию данного изобретения до такой степени, чтобы количество амилоида значимо уменьшалось.
Особенно предпочтительно, чтобы уменьшение амилоида приводило к инверсии баланса между образованием амилоида и деградацией/удалением амилоида, т.е. чтобы скорость деградации/удаления амилоида была доведена до скорости, превышающей скорость образования амилоида. Посредством тщательной регуляции числа и иммунологического влияния иммунизации индивидуума, нуждающегося в этом, можно будет получить баланс во времени, что приводит к уменьшению амилоидных отложений без избыточных вредных эффектов.
Альтернативно, если у индивидуума способ данного изобретения не может удалять или уменьшать существующие отложения амилоида, способ данного изобретения может быть использован для получения клинически значимого уменьшения образования новых амилоидных отложений, с пролонгированием тем самым периода, в течение которого состояние болезни не ухудшается. Можно было бы осуществлять мониторинг скорости отложения амилоида либо путем измерения концентрации амилоида в сыворотке
- 19 008762 (которая, как считается, находится в равновесии с депонируемым материалом), либо путем применения сканирования с использованием позитронной эмиссионной томографии (РЕТ), см. 8та11 С.XV.. е1 а1., 1996, Αηη Ν. Υ. Асаб 8с1 802: 70-78.
Другие заболевания и состояния, где средства и способы данного изобретения могут быть использованы в лечении или ослаблении заболевания аналогичным образом, были упомянуты выше в «Предпосылках изобретения» (системный амилоидоз, диабет взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, лобно-височная деменция и связанные с прионами трансмиссивные губчатые энцефалопатии) или перечислены ниже в разделе, озаглавленном «другие связанные с амилоидом заболевания и белки, ассоциированные с ними».
Пептиды, полипептиды и композиции данного изобретения
Как будет очевидно из приведенной выше информации, данное изобретение основано на концепции иммунизации индивидуумов против амилоидогенного антигена для получения уменьшенного количества связанных с патологией отложений амилоида. Предпочтительным путем получения такой иммунизации является применение модифицированных версий амилоидогенного полипептида, с получением тем самым молекул, которые не были описаны ранее в данной области.
Считается, что модифицированные молекулы, обсуждаемые здесь, являются патентноспособными сами по себе, и, следовательно, важная часть данного изобретения относится к аналогу, который получен из амилоидогенного полипептида животного, в который введена модификация, что приводит к тому, что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител, специфически реагирующих с немодифицированным амилоидогенным полипептидом. Предпочтительно, характер этой модификации соответствует типам модификаций, описанных выше при обсуждении различных вариантов способа данного изобретения с использованием модифицированного амилоидогенного полипептида. Таким образом, любое описание, представленное здесь, относится к амилоидогенным молекулам, имеющим отношение к цели описания амилоидогенных аналогов данного изобретения, и любое из таких описаний относится, с соответствующими изменениями, к описанию этих аналогов.
Следует отметить, что предпочтительные модифицированные амилоидогенные молекулы содержат модификации, которые приводят к образованию полипептида, имеющего идентичность последовательности по меньшей мере 70% с амилоидогенным белком или с его субпоследовательностью длиной по меньшей мере в 10 аминокислот. Более высокая степень идентичности последовательностей является предпочтительной, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%.
Идентичность последовательностей белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как (\.е,· - ΝΗ|[)· 100/Νιν[: где Ν,|ι(- означает общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при их сопоставлении и где Ни означает число остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК АСТСАСТС будет на 75% идентична последовательности ААТСААТС (Ни = 2 и V., = 8).
Данное изобретение относится также к композициям, применимым в использовании на практике способа данного изобретения. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество амилоидогенного полипептида, который является аутологичным белком у животного, причем указанный амилоидогенный полипептид готовят вместе с иммунологически приемлемым адъювантом таким образом, чтобы разрушить аутотолерантность животного в отношении этого амилоидогенного полипептида, причем эта композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель, и/или формообразующий агент. Другими словами, эта часть данного изобретения относится к композициям природно встречающихся амилоидогенных полипептидов, которые описаны в связи с вариантами способа данного изобретения.
Данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель, и/или формообразующий агент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть изобретения относится к композициям модифицированного амилоидогенного полипептида, по существу, описанного выше. Выбор адъювантов, носителей и наполнителей находится в соответствии с тем, что обсуждалось выше при описании композиции модифицированного и немодифицированного амилоидогенного полипептида для применения в способе данного изобретения для супрессии амилоида.
Полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных генов, включающей в себя введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессию клеткой-хозяином этой последовательности нуклеиновой кислоты, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующую очистку и необязательную дополнительную модификацию, например, повторную упаковку (рефолдинг) или дериватизацию.
Более короткие пептиды предпочтительно получают с использованием хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. Однако недавний прогресс в этой технологии дал
- 20 008762 возможность получения полноразмерных полипептидов и белков при помощи этих способов, и, следовательно, получение более длинных конструкций синтетическими способами находится в рамках данного изобретения.
Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы согласно изобретению
Из приведенного выше описания должно быть понятно, что модифицированные амилоидогенные полипептиды могут быть получены при помощи технологии рекомбинантных генов, но также при помощи химического синтеза или полухимического синтеза; две последние возможности особенно уместны, когда модификация состоит в связывании белковых носителей (таких как КЬН, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и БСА) и небелковых молекул, таких как углеводные полимеры, и, конечно, также тогда, когда модификация предусматривает добавление боковых цепей или боковых групп к произведенной из амилоидогенного полипептида-пептидной цепи.
Для цели технологии рекомбинантных генов и, конечно, также для цели иммунизации нуклеиновыми кислотами, фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный амилоидогенный полипептид, являются важными химическими продуктами. Таким образом, важная часть данного изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует аналог амилоидогенного полипептида, т. е. произведенный из амилоидогенного полипептида полипептид, который либо содержит природную последовательность, к которой был добавлен или в которую был вставлен партнер слияния, либо, предпочтительно, произведенный из амилоидогенного полипептида полипептид, где чужеродный Тклеточный эпитоп был введен посредством инсерции и/или добавки, предпочтительно посредством замены и/или делеции. Фрагментами нуклеиновых кислот согласно изобретению являются либо ДНК-, либо РНК-фрагменты.
Фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению обычно должны встраиваться в подходящие векторы с образованием клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот согласно изобретению; такие новые векторы также являются частью данного изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов согласно изобретению, будут обсуждаться в контексте трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Векторы в зависимости от цели и типа применения могут быть представлены в виде плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но также и «голая» ДНК, которая экспрессируется только временно в некоторых клетках, является важным вектором. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, делая таким образом возможным получение большого числа копий для целей экспрессии высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования.
В общих чертах вектор согласно изобретению содержит следующие признаки в направлении 5'^3' и в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, делающий возможной секрецию (во внеклеточную фазу или, где это применимо, в периплазму) из мембраны или интеграцию в мембрану фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы этот вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами, которые должны использоваться для осуществления экспрессии ш νίνο у животного (т.е. при применении вектора в ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы вектор был неспособен интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых является хорошо известным специалистам в данной области.
Векторы согласно изобретению используют для трансформации клеток-хозяев для получения модифицированного амилоидогенного полипептида согласно изобретению. Такими трансформированными клетками, которые являются также частью согласно изобретению, могут быть культивируемые клетки или клеточные линии, используемые для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов согласно изобретению или используемые для рекомбинантного получения модифицированных амилоидогенных полипептидов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированными клетками могут быть живые вакцинные штаммы, в которых фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная копия или множественные копии) был встроен таким образом, чтобы производить секрецию из бактериальной мембраны или клеточной стенки или интеграцию в бактериальную мембрану или клеточную стенку модифицированного амилоидогенного полипептида.
Предпочтительными трансформированными клетками согласно изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (например, вида Екс11епс1па [например, Е. сой], ЕасШик [например, ЕасШик киЫШк], 8а1топе11а или МусоЬас!егшт [предпочтительно непатогенная, например, М. ϋονίκ Βί.Ό|). дрожжи (такие как 8ассйаготусек сегеуыае) и простейшие.
Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, такого как гриб, клетка насекомого, клетка растения или клетка млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные у человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты показали большую перспективность применения коммерчески доступной линии клеток Бго
- 21 008762 корййа те1апода§!ег (линии клеток Шнайдера 2 (82) и векторной системы, доступной из 1пуйтодеп) для рекомбинантного продуцирования полипептидов в лаборатории заявителей, и, следовательно, эта экспрессионная система является особенно предпочтительной.
Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительно полезными вариантами согласно изобретению; они могут быть использованы для получения малого масштаба или крупномасштабного получения модифицированного амилоидогенного полипептида или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине.
При получении модифицированных молекул согласно изобретению с использованием трансформированных клеток удобно, хотя и совершенно необязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо переносился на поверхность трансформированной клетки.
После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно создать на ее основе стабильную клеточную линию, которая несет вектор согласно изобретению и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный амилоидогенный полипептид. Предпочтительно, когда эта стабильная линия секретирует или несет аналог согласно изобретению, что облегчает его очистку.
Обычно плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые были получены из видов, совместимых с клеткой-хозяином, используют в комбинации с этими хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, Е. сой обычно трансформируют с использованием рВР322, плазмиды, полученной из вида Е. сой (см., например, Войуат е! а1., 1977). Плазмида рВР322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает легкий способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВР, или другая микробная плазмида или фаг, должны содержать также - или должны быть модифицированы, чтобы содержать - промоторы, которые могут быть использованы прокариотическим микроорганизмом для экспрессии.
Эти промоторы, наиболее часто используемые в конструировании рекомбинантных ДНК, включают в себя промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Сйапд е! а1., 1978; Йакита е! а1., 1977; Соеййе1 е! а1., 1979) и промоторную систему триптофана (!гр) (Соеййе1 е! а1., 1979; ЕР-А-0 036 776). Хотя эти системы являются наиболее часто используемыми, другие микробные промоторы были обнаружены и использованы, и подробности их нуклеотидных последовательностей были опубликованы, что позволяет специалисту в данной области лигировать их функционально с плазмидными векторами (31еЬ^епЙ8! е! а1., 1980). Некоторые гены из прокариот могут быть экспрессированы эффективно в Е. сой от их собственных промоторных последовательностей, что устраняет необходимость добавления другого промотора искусственными способами.
Кроме прокариот могут быть также использованы эукариотические микробы, такие как дрожжевые культуры, и здесь промотор должен быть способен запускать экспрессию. Зассйатотусек сетеу1Дае, или обычные хлебопекарные дрожжи, является наиболее часто используемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя доступными обычно являются ряд других штаммов. Для экспрессии в Зассйатотусек обычно используют, например, плазмиду УКр7 (ЗйпсйсотЬ е! а1., 1979; Кшдктап е! а1., 1979; Тксйетрег е! а1., 1980). Эта плазмида уже содержит ген !гр1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, не способного расти в триптофане, например, АЕСС Ыо. 44076 или РЕР4-1 Допек, 1977). Присутствие повреждения !гр1 в качестве характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает затем эффективную среду для обнаружения трансформации по росту в отсутствие триптофана.
Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (ΗίΙ/тап е! а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Не§8 е! а1., 1968; Нойапй е! а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид, последовательности терминации связывают с этими генами и также лигируют в экспрессирующий вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.
Другими промоторами, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями выращивания, являются промоторный район для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, связанных с азотным метаболизмом, и вышеупомянутой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, точку начала репликации и последовательности терминации, является подходящим.
Кроме микроорганизмов, культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов, могут также использоваться в качестве хозяев. В принципе, любая такая культура является работающей, является
- 22 008762 ли она культурой клеток из позвоночных животных или культурой клеток беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой в последние годы (Пккие СиИиге, 1973). Примерами таких применимых линий клеток-хозяев являются клетки УЕКО и НеЬа, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и ^138, ВНК, СО8-7 293, клетки 8робор1ега ГгиДрегба (8Е) (коммерчески доступные в виде полных экспрессионных систем из 1п1ег айа Рго1ет 8с1епсек, 1000 Векеагсй Рагк^ау, Мепбеп, СТ 06450, И.8.А. и из 1№Йгодеп), и линии клеток МОСК. В данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является 82, доступная из 1№Йгодеп, РО Вох 2312, 9704 СН Сгошпдеп, Тйе №1йег1апбк.
Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если это необходимо) начало репликации, промотор, расположенный перед экспрессируемым геном, вместе с любыми необходимыми сайтами связывания рибосом, сайтами сплайсинга РНК, сайтом полиаденилирования и последовательностью терминатора транскрипции.
Для применения в клетках млекопитающих регуляторные функции на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы получают из полиомы, Аденовируса 2, и наиболее часто - из обезьяньего вируса 40 (8У40). Ранний и поздний промоторы вируса 8У40 являются особенно применимыми, так как оба их можно получить легко из вируса в виде фрагмента, который содержит также начало репликации из вируса 8У40 (Иегк е! а1., 1978). Могут быть также использованы меньшие или большие фрагменты 8У40, при условии, что включена последовательность длиной приблизительно 250 п.н., простирающаяся от сайта НшбШ в направлении сайта Вд11, локализованного в вирусном начале репликации (ориджин). Кроме того, можно также, и часто желательно, использовать промотор или регуляторные последовательности, обычно связанные с желаемой последовательностью гена, при условии, что такие регуляторные последовательности являются совместимыми с системой клеток-хозяев.
Начало репликации может быть обеспечено либо конструкцией вектора для включения экзогенного начала репликации, которое, например, может быть получено из 8У40 или другого вируса (например, полиомы, аденовируса, У8У, ВРУ) или может быть обеспечено механизмом репликации хромосом клетки-хозяина. Если вектор интегрируется в хромосому клетки-хозяина, последний механизм часто является достаточным.
Идентификация применимых аналогов
Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что не все возможные варианты или модификации природно встречающихся амилоидогенных полипептидов будут способны индуцировать антитела у животного, которые являются перекрестно-реактивными с природной формой. Однако трудно создать эффективный стандартный скрининг для модифицированных амилоидогенных молекул, которые удовлетворяют минимальным требованиям для обсуждаемой здесь иммунологической реактивности. Таким образом, другая часть согласно изобретению относится к способу идентификации модифицированного амилоидогенного полипептида, который способен индуцировать антитела против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированным амилоидогенным полипептидом является (неиммуногенный) аутологичный белок, причем этот способ предусматривает получение при помощи пептидного синтеза или способов генной инженерии набора взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов, в которых аминокислоты были добавлены к аминокислотной последовательности, вставлены в аминокислотную последовательность, делетированы из аминокислотной последовательности или заменены в аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида вида животного, что приводит к появлению аминокислотных последовательностей в этом наборе, которые содержат Т-клеточные эпитопы, которые являются чужеродными для данного вида животного, или получение набора фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих этот набор взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов, тестирование членов этого набора модифицированных амилоидогеных полипептидов или фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать продуцирование антител животным данного вида против немодифицированного амилоидогенного полипептида, и идентификацию и необязательно выделение члена (членов) набора модифицированных амилоидогенных полипептидов, который (которые) значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у данного вида, или идентификацию и необязательно выделение продуктов экспрессии, кодируемых членами набора фрагментов нуклеиновых кислот, которые значимо индуцируют продуцирование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у животного данного вида.
В этом контексте, набор взаимно отличающихся модифицированных амилоидогенных полипептидов является коллекцией неидентичных модифицированных амилоидогенных полипептидов, которые были, например, отобраны на основе обсуждаемых выше критериев (например, в сочетании с исследованиями кругового дихроизма, ЯМР-спектров и/или картин дифракции рентгеновских лучей (порошковых рентгенограмм)). Этот набор может состоять лишь из небольшого числа членов, но предполагается, что этот набор может содержать несколько сотен членов.
- 23 008762
Тестирование членов набора может выполняться в конечном счете ίη νίνΌ, но может быть применен ряд тестов ίη νίΟΌ, которые сузят число модифицированных молекул, которые будут служить цели согласно изобретению.
Поскольку задачей введения чужеродных Т-клеточных эпитопов является поддержание Вклеточного ответа при помощи Т-клеток, необходимым требованием является, что пролиферация Тклеток индуцируется модифицированным амилоидогенным полипептидом. Пролиферация Т-клеток может тестироваться стандартизированными тестами пролиферации ίη νίίΐΌ. Вкратце, пробу, обогащенную Т-клетками, получают у субъекта и затем поддерживают в культуре. Культивируемые Т-клетки контактируют с АРС субъекта, которые предварительно поглощали модифицированную молекулу и процессировали ее для представления ее Т-клеточным эпитопам. Пролиферацию Т-клеток подвергают мониторингу и сравнивают с подходящим контролем (например, Т-клетками в культуре, контактированной с АРС, которая процессировала интактный, нативный амилоидогенный полипептид). Альтернативно, пролиферация может быть измерена путем определения концентрации релевантных цитокинов, высвобождаемых Т-клетками в ответ на узнавание или чужеродных Т-клеток.
После создания высокой вероятности того, что по меньшей мере один амилоидогенный полипептид набора каждого типа способен индуцировать продуцирование антител против амилоидогенного полипептида, можно приготовить иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один модифицированный амилоидный полипептид, который способен индуцировать антитела против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированный амилоидогенный полипептид является аутологичным белком, причем этот способ предусматривает смешивание члена (членов) набора, который значимо индуцирует продуцирование антител у вида животного, которые являются реактивными с амилоидогенным полипептидом, с фармацевтически или иммунологически приемлемым носителем, и/или наполнителем, и/или разбавителем, и/или формообразующим агентом (эксципиентом) необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.
Описанные выше аспекты согласно изобретению, относящиеся к наборам полипептидов, удобно использовать с первоначальным приготовлением ряда взаимно отличающихся последовательностей нуклеиновых кислот или векторов согласно изобретению, встраиванием их в подходящие экспрессирующие векторы, трансформацией подходящих клеток-хозяев (или животных-хозяев) этими векторами и выполнением экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот согласно изобретению. Эти стадии могут сопровождаться выделением продуктов экспрессии. Предпочтительно получать последовательности нуклеиновых кислот и/или векторы способами, включающими в себя использование способа молекулярной амплификации, такого как ПЦР, или использование синтеза нуклеиновых кислот.
Специфические амилоидогенные мишени
Кроме белков, наиболее часто ассоциированных с болезнью Альцгеймера, АРР, АроЕ4 и Таи, имеется длинный перечень других белков, которые так или иначе были связаны с БА, либо по их прямому присутствию в бляшках и клубках головного мозга пациентов с БА, либо по их очевидной генетической ассоциации с увеличенным риском развития БА. Большинство, если не все, из этих антигенов являются, наряду с обсуждаемыми выше Ав, АРР, пресенилином и АроЕ, возможными белками-мишенями согласно изобретению.
Альфа1-антихимотрипсин (АСТ) является основным компонентом 8Р, и предполагается, что он играет важную роль в патогенезе повреждений при БА и цереброваскулярном амилоидозе (СА) (Ас1а неигораШо1, 1998, 96: 628-36). Он взаимодействует с Ав ίη νίίΐΌ и стимулирует как образование, так и разрушени фибрилл Ав-42 (ДВС, 1998, 273: 28360-4).
Альфа2-макроглобулин был обнаружен по иммуноокрашиванию в центральных частях бляшек в головном мозге пациентов с БА. Трансмембранный фрагмент из бета-субъединицы был обнаружен в центральных частях бляшек, тогда как растворимый альфа-фрагмент был обнаружен внеклеточно в бляшках. Ас1а ηеи^οраΐЬο1, 1998, 96: 628-36 и Вгат Век., 1997, 777: 223-227.
АВАЭ (Ав-пептидсвязывающая алкогольдегидрогеназа) связывается с Ав в клетке. Она является нейронным ферментом, присутствующим в нормальных клетках, но сверхэкспрессирующимся в нейронах, пораженных БА. Ав является более токсичным в отношении клеток, которые сверхэкспрессируют АВАЭ. АВАЭ сцеплен с хромосомой X. Уаи, 1997, №11иге 389.
АРБР1 и -2 (предшественник амилоида, подобный белку 1 и 2): оба белка принадлежат к белкам суперсемейства гомологов АРР, но не содержат пептидного района Ав. Тем не менее имеется значимое окрашивание АРЬР в невритных бляшках. Ас1а №игора11ю1. 1997, 94: 519-524.
АМУ117 является новым белком, обнаруженным в бляшкоподобных повреждениях в мозге людей с БА, который, по-видимому, имеется в изобилии, широко распространен и является «высоко специфическим» для этого заболевания.
Предполагается, что этот белок, АМУ117 может играть критическую роль в развитии и прогрессии БА посредством образования этих бляшек. Интересно, что содержащие АМУ117 бляшки не локализуются совместно с бляшками, содержащими Ав, что определяет новую характерную манифестацию БА,
- 24 008762 кроме хорошо известных содержащих Αβ бляшек и содержащих Таи клубков. Было обнаружено, что АМ¥117-позитивные бляшки являются обильными в головном мозге в спорадических случаях БА и в головном мозге людей с синдромом Дауна, но «редкими или отсутствующими» в головном мозге в контроле и в случае других нейродегенеративных заболеваний (Ат 1 Ра1йо1 1997; 151: 69-80).
Вах. Моноклональные антитела детектировали Вах в качестве компонента сенильных бляшек в головном мозге пациентов с БА. Он также сверхэкспрессируется в дистрофических невритах. Ас1а Ыеигора!йо1. 1998, 95: 407-412.
Вс1-2 имеет неясную роль. Сверхэкспрессируется в окружающих глиальные клетки бляшках. Ас1а №игора1йо1. 1998, 95: 407-412.
Блеомицингидролаза является, возможно, бета-секретазой. Иммунореактивность против блеомицингидролазы была обнаружена в БР в БА (Вгат Век. 1999, 830: 200-202). Определенный генотип блеомицингидролазы был ассоциирован с увеличенным риском развития БА в некоторых случаях, тогда как в других случаях не обнаруживали корреляции (Апп Ыеиго1, 1998, 44: 808-811 и Апп Ыеиго1, 1999, 46: 136137).
ВВ1/АВВ1. АВВ1 представляет собой фрагмент в 4 кД предполагаемого трансмембранного белка, кодируемого геном ВВ1 на хромосоме 13, обнаруживаемый в амилоидных бляшках людей с семейной Британской деменцией (РВИ). Эти пациенты имеют мутацию в стоп-кодоне гена ВК1, которая создает более длинную открытую рамку считывания. Высвобождение 34 карбокси-концевых аминокислот измененного белка генерирует субъединицу амилоида АВВ1. Антитела против АВК1 узнают как паренхимные, так и сосудистые повреждения в головном мозге пациентов с РВЭ. АВК1-пептид депонируется в виде амилоидных фибрилл, и предполагается, что образующиеся бляшки приводят к дисфункции нейронов и деменции, которая характеризует РВЭ (У1ба1, К. е1 а1., 1999, №Шге 399).
Хромогранин А был обнаружен в некоторых диффузных амилоидных отложениях и в окружающих их дистрофических невритах (Вгат Век, 1991, 539: 143-50).
Клустерин/ароР Этот ген часто выделяется путем дифференциального скрининга в лабораториях различных областей молекулярной биологии, так как он сверхэкспрессируется в многочисленных случаях дегенеративных заболеваний, таких как БА и скрепи (Вюсйет 1 1997 Ыоу 15; 328(1): 45-50 Мюйе1 Ό., Сйа!е1ат О., №г1й Б., Вгип О.).
Белок, связывающий СВР (высвобождающий кортикопин фактор), связывает пептид СВР из 41 аминокислоты, который является важным регуляторным фактором в стрессовых реакциях в головном мозге. Поскольку большая часть СВР связана СВР-связывающим белком, удаление СВР-связывающего белка могла бы приводить к увеличению уровня свободного СВР, что, как полагают, имеет позитивное действие против БА. Вейап, 1997, I. №игосйет1кйу, 68: 2053-2060.
ЕЭТР (токсичный фактор, полученный из эндотелия). Белок, продуцируемый микрососудами пациентов БА. Он является специфически токсичным в отношении нервных клеток. \УО 99/24468.
Было показано, что гепарансульфат-протеогликаны локализуются совместно с Ав в БР. Исследования на крысах показывают, что гепарансульфат-гликозаминогликан необходим для образования амилоидных волокон (Иеигоп, 1994, 12: 219-234 и Ас1а пеигора1йо1, 1998, 96: 628-36).
Медиаторный белок-2 коллапсиновой реакции человека представляет собой белок 65 кДа, распознаваемый в нейрофибриллярных клубках моноклональным антителом. Включение в клубки может истощать растворимый белок и приводит к аномальному разрастанию невритов, ускоряя тем самым дегенерацию нейронов. 1ВС, 1998, 273: 9761-8.
Хантингтин (белок болезни Хантингтона). В БХ (болезни Хантингтона), белок Хантингтина удлинен на Ν-конце полиглутамином. Эта форма белка Хантингтина обнаруживается также в ΝΕΤ в головном мозге пациентов БА и при заболевании Пика (Ехр. №иго1, 1998, 150: 213-222).
1САМ-1 накапливается в БР. Ас1а пеигора!йо1, 1998, 96: 628-36 и Ат. I Ра1йо1. 1994, 144: 104-16.
1Ь-6 связан с нейрофибриллярными изменениями и был обнаружен в центральной части бляшек. Предполагалось, что он является запускающим событием при БА. Он сильно размножается в астроцитах посредством активного пептида 25-35 Ав. Вгат Век., 1997, 777: 223-227 и Вейау Вгат Век, 1996, 78: 3741.
Ассоциированный с лизосомами антиген С.П68 узнается антителом КР-1 при №Т и БР. Таким образом, лизосомы могут играть роль в образовании клубков и бляшек. Эетеп1 Сепа1г Содп Э|когй. 1998, 9: 13-19.
Р21 гак участвует в качестве первой стадии в повышении факторов роста и митогенов, наблюдаемом на ранних стадиях развития БА. №игокс1епсе, 1999, 91: 1-5.
РЬС-дельта 1 (изофермент дельта 1 фосфолипазы С) накапливается аномальным образом при №Т и невритах, окружающих центральные части бляшек. Он является внутриклеточным. АПйешег Όίκ Аккос Э^оМ, 1995, 9: 15-22.
Компонент Р сывороточного амилоида (БАР) является компонентом нормальной плазмы, который присутствует во всех типах амилоидных отложений, в том числе амилоидных отложениях при БА (РВС, 1995, 270: 26041-4). Он обнаруживается как в БР, так и в №Т. В некоторых исследованиях было показа
- 25 008762 но, что он усиливает агрегацию Αβ и предотвращает протеолиз фибрилл (Вюсйега ЕИорйун Век соппнип, 1995, 211: 349ν-53 и ΡΝΑ8, 1995, 92: 4299-4303), тогда как другое исследование указывает на то, что 8АР ингибирует образование фибрилл Αβ (1ВС, 1995, 270: 26041-4).
Синаптофизин был обнаружен в некоторых диффузных амилоидных отложениях и в окружающих их дистрофических невритах. (ВгатВек, 1991, 539: 143-50).
Синуклеин (альфа-синуклеин или ΝΑΟΡ). Не-А бета-компонент амилоида БА (ΝΑΟ) идентифицировали биохимически в качестве второго основного компонента в амилоиде, очищенном из ткани головного мозга пациентов БА. ΝΑΟ, происходящий из предшественника длиной 140 аминокислот, ΝΑΟΡ, имеет длину по меньшей мере 35 аминокислот (ΝΑΟ35), хотя его амино-конец не установлен окончательно. ΝΑΟ-моноклональное антитело иммуноокрашивает 8Р в головном мозге БА, но не реагирует с ΝΑΟΡ (ВюсЬепйкйу 34 (32): 10139-10145 (Аид 15 1995) 1\уа1 А., УокЫшоЮ М., МазИаЬЕ., ЗаНоЬТ.). ΝΑΟ самоолигомеризуется в присутствии Αβ. Новые данные указывают на потенциальную роль этой молекулы в синаптическом повреждении и нейротоксичности через образование амилоидоподобных фибрилл и митохондриальную дисфункцию. Вгаш РаИю1 1999 Ос1; 9(4): 707-20. БЕВ8 Бей. 1998, 421:73-76. Часть ΝΑΟΡ имеет высокую гомологию с С-концевым фрагментом амилоида АРР и района прионового белка скрепи (РгР8с). Синуклеин является основным причинным фактором болезни Паркинсона (Сйеш. ΒίοΙ, 1995, 2: 163-9).
ТСЕ-Ы (трансформирующий фактор роста Ы). Сверхэкспрессия ТСБ-Ы мутантным АРР у мышей ТС ускоряет отложение Αβ. Таким образом, считается, что ТСБ-Ы участвует в инициации или стимуляции образования амилоидных бляшек (ХУунн-Согау. 1997, №11игс 389).
Другие амилоидные заболевания и связанные с ними белки
Кроме вышеупомянутых белков, которые потенциально участвуют в БА и заболеваниях, подобных БА (болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, ΡΒΌ и другие формы деменции), имеется относительно большое число заболеваний, иных, чем БА, где образование амилоида участвует в запуске заболевания или является причиной симптомов данного заболевания. Хотя природа белков, участвующих в этих заболеваниях, варьирует, они имеют одни и те же общие признаки, которые определяют амилоид (см. выше). В следующей таблице дан список ряда этих амилоидных нарушений и вызывающих их белков.
Разнообразие амилоидных фибриллярных белков
Клинический синдром Субъединица фибрилл Структура предшественника
Церебральная амилоидная ангиопатия (САА) Αβ Полностью β
Моноклональный белковый системный (АЦ амилоидоз Полноразмерный У-домен или фрагменты У-домена легкой цепи !д Полностью β
Реактивный системный (АА) амилоцдоз Ν-концевоЙ фрагмент из 75 аминокислотных остатков амилоидного белка А α/β
Семейная амилоидная полиневропатия Полноразмерные варианты или фрагменты вариантов транстиретина Полностью β
Наследственный АроА1 амилоидоз Ν-концевые фрагменты (-90 остатков) вариантов Аро А1 (α/β)
Наследственный лизоцимный амилоцдоэ Полноразмерные варианты лизоцима α + β
Сахарный диабет типа II Фрагмент из 37 остатков островкового амилоидного полипептида Неизвестна
-26008762
Связанный с инсулином амилоидоз Полноразмерный инсулин дикого типа α+ β
Трансмиссивные губчатые энцефалопатии Полноразмерный прионовый белок или фрагменты прионового белка α + β
Медулярная карцинома тиреоида Фрагменты кальцитонина Неизвестна
Сенильный системный амилоидоз Полноразмерный транстиретин или фрагменты транстиретина Полностью β
Связанный с гемодиализом амилоидоз Полноразмерный микроглобулин β-2 дикого типа Полностью β
Выделенный атриальный амилоидоз Атриальный натриуретический фактор Неизвестна
Наследственная церебральная амилоидная ангиопатия Фрагмент из 110 остатков варианта цистатина α + β
Финский наследственный амилоидоз Фрагмент из 71 остатка вариантов гельсолина α/β
Наследственный амилоидоз α-цепи фибриногена Фрагменты вариантов α-цепи фибриногена Неизвестна
Все эти белки являются, подобно белкам, участвующим в БА, потенциальными мишенями в предлагаемой здесь стратегии иммунизации.
Предполагается, что большинство способов иммунизации против амилоидогенных полипептидов должны быть рестриктированы иммунизацией, индуцирующей образование антител, перекрестнореактивных с нативным амилоидогенным полипептидом. Тем не менее, в некоторых случаях будет представлять интерес индукция клеточного иммунитета в форме СТЬ-реакций против клеток, на которых представлены эпитопы МНС Класса I из амилоидогенных полипептидов, это может оказаться целесообразным в тех случаях, когда уменьшение в числе клеток, продуцирующих амилоидогенные полипептиды, не оказывает серьезного вредного воздействия. В таких случаях, где желательными являются СТЬ-реакции, предпочтительно использовать способы заявителя РСТ/ЭК99/00525 (соответствует υ88Ν 09/413 186). Описания этих двух документов включены тем самым в качестве ссылки.
В следующем далее неограничительном примере авторы сосредоточиваются на развитии аутовакцины на основе Ав против БА. Однако принципы, изложенные здесь, применимы в равной степени к любому амилоидному белку.
Пример 1. Подход аутовакцинации для иммунизации против БА.
Тот факт, что белок Ав мышей кпоск оиГ' не вызывает каких-либо аномалий или вредных побочных действий, предполагает, что удаление или снижение количества Ав будет безопасным, ΖΙιοημ Н. (1996).
Опубликованные эксперименты, в которых трансгенных животных иммунизировали против трансгенного белка Ав человека, предполагает, что, если бы было возможно разрушить аутотолерантность, супрессия Ав могла бы быть получена с использованием аутореактивных антител. Эти эксперименты дополнительно предполагают, что такая супрессия Ав потенциально могла бы как предотвращать образование бляшек, так и способствовать выведению уже образованных бляшек Ав из головного мозга, срав. 8сБепк е! а1. (1999). Однако традиционно невозможно индуцировать антитела против аутологичных белков.
Таким образом, опубликованные данные не обеспечивают средства для разрушения аутотолерантности в отношении истинных аутологичных белков. Также эти данные не дают информации о том, каким образом гарантировать, что иммунная реакция будет направлена только и преимущественно на отложения Ав, а не на белок-предшественник Ав, связанный с клеточной мембраной (АРР), если это считается необходимым. Иммунная реакция, генерируемая с использованием существующей технологии, предпочтительно генерировала бы иммунную реакцию против аутологичных белков нерегулируемым образом, так что может генерироваться нежелательная и избыточная аутореактивность против частей белка Ав. Таким образом, использование существующих стратегий иммунизации будет, наиболее вероятно, не способно генерировать сильные иммунные реакции против собственных (аутологичных) белков и, следовательно, будет небезопасным вследствие потенциально сильной перекрестной реактивности в отно
- 27 008762 шении мембраносвязанного АРР, который присутствует на большом числе клеток в ЦНС.
Данное изобретение обеспечивает средства эффективного генерирования сильной регулируемой иммунной реакции против истинных аутологичных белков, которые потенциально могли бы образовывать бляшки и вызывать серьезное заболевание в ЦНС или в других компартментах тела. Безопасная и эффективная терапевтическая вакцина, содержащая белок Αβ человека, будет создана с использованием этой технологии для лечения БА.
В свете этого, можно понять, что БА, заболевание, которое, как прогнозируется, парализует систему здравоохранения в следующем столетии, могло бы излечиваться, или же описанные вакцины могли бы, по меньшей мере, составлять эффективный терапевтический подход к лечению симптомов и прогрессирования этого заболевания.
Этот способ представляет собой совершенно новый иммунологический подход к блокированию отложения амилоида при БА, а также при других неврологических заболеваниях.
В следующей таблице показано 35 рассматриваемых конструкций. Все положения, указанные в таблице, даны относительно стартового метионина АРР (первой аминокислоты в §Εζ) ГО N0:2) и включают в себя как начальную, так и конечную аминокислоту, например фрагмент 672-714 включает в себя как аминокислоту 672, так и аминокислоту 714. Начальное и конечное положения для Р2 и РЗО указывают, что этот эпитоп заменяет часть фрагмента АРР в указанных положениях (оба положения включены в замену) - в большинстве конструкций, введенные эпитопы заменяют фрагмент длиной с данный эпитоп. Звездочки в таблице имеют следующие значения:
*) Только одно положение для Р2 и РЗО указывает на то, что этот эпитоп был вставлен в данное производное АРР в указанном положении (эпитоп начинается с аминокислоты, С-терминально смежной с указанным положением).
**) Конструкция 34 содержит три идентичных фрагмента АРР, разделенных РЗО и Р2, соответственно.
***) Конструкция 35 содержит девять идентичных фрагментов АРР, разделенных чередующимися эпитопами РЗО и Р2.
Конструкции аутовакцины АРР
Номер вар. Немало сегмента АРР относительно аминокислоты 1 АРР Конец сегмента АРР относительно аминокислоты 1 АРР Положение злитопа Р2 относительно амиюнивлаты 1 АРР Положение эпитопа РЗО относительно аминокислоты 1 АРР Длина молекулы
1 630 770 656 - 670 635 - 655 141
2 630 714 656 - 670 635 - 655 05
3 612 770 735 - 749 714 - 728 99
4 672 770 714 728 99
5 672 770 714 - 728 99
6 612 770 723· 723* 135
7 672 770 723* 120
а 672 770 723* 114
9 672 714 672* 64
10 672 714 714* 64
11 672 714 672* 58
12 672 714 714* 58
13 672 714 714* 672* 79
14 672 714 660 - 694 43
14 672 714 685 ”799 43
16 672 714 690 - 704 43
17 672 714 695 - 709 43
16 672 714 675 - 695 43
19 672 714 6ВО - 700 43
20 672 714 685 - 705 43
21 672 714 690 - 710 43
22 672 714 600* 600* 79
23 672 714 690* 690* 79
24 672 714 700* 700· 79
25 672 714 710* 710‘ 79
26 672 714 600* 64
27 672 714 690· 64
29 672 714 700* 64
29 672 714 710* 64
30 672 714 600* 5Θ
31 672 714 630· 58
32 672 714 700* 58
33 672 714 710* 58
34 672 714 Поспешит. 1»* После пою. 2** 165
35 672 714 34 х 3' 34 х 3*** 165
Частью АРР, против которой наиболее интересно генерировать реакцию, является центральный пептид Αβ из 43 аминокислот (Αβ-43, соответствующий §Εζ) ГО N0:2, остаткам 672-714), который является основным компонентом амилоидных бляшек в головном мозге пациентов с БА. Этот фрагмент АРР является частью всех конструкций, перечисленных выше.
Варианты 1 и 2 включают в себя часть АРР против хода транскрипции (слева) от Αβ-43, где помещены модельные эпитопы Р2 и РЗО. Все варианты 1 и 3-8 содержат фрагмент С-100, который, как было показано, является нейротоксичным, этот фрагмент С-100 соответствует аминокислотным остаткам 714770 §Εζ) ГО N0:2. В вариантах 3-5 эти эпитопы заменяют часть фрагмента С-100, тогда как в вариантах
-28008762
6-8 они были вставлены в С-100.
Варианты 9-35 содержат только коровый белок Λβ-43. В вариантах 9-13, Р2 и Р30 слиты с каждым концом Ав-43; в вариантах 14-21 Р2 и Р30 заменяют часть Ав-43; в 22-33 Р2 и Р30 вставлены в Ав-43; 34 содержит три идентичных фрагмента Ав-43, разделенных Р30 и Р2, соответственно; 35 содержит 9 повторов Ав-43, разделенных чередующимися эпитопами Р2 и Р30.
См. чертеж и таблицу, приведенную выше, в отношении подробностей.
Еще один тип конструкции является особенно предпочтительным. Поскольку одна из задач согласно изобретению связана с тем, чтобы избежать деструкции клеток, продуцирующих АРР, тогда как удаление Ав является желательным, по-видимому можно получить аутовакцинные конструкции, содержащие только части Ав, которые не экспонированы во внеклеточной фазе, когда они присутствуют в АРР. Таким образом, такие конструкции должны будут содержать по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, полученный из аминокислотного фрагмента, определяемого аминокислотами 700-714 в 8ЕО ΙΌ N0:2. Поскольку прогнозируется, что такой короткий полипептидный фрагмент является лишь слабо иммуногенным, предпочтительно, чтобы такая аутовакцинная конструкция состояла из нескольких копий Вклеточного эпитопа, например, в виде конструкции, имеющей структуру, показанную в формуле I в подробном описании согласно изобретению, см. выше. В этой версии формулы I термины амилоиде1амилоидех = х В- клеточным эпитопам, содержащим аминокислотные последовательности, происходящие из аминокислот 700-714 8Е0 ΙΌ N0:2. Предпочтительной альтернативой является описанная подробно выше возможность связывания амилоидогенного (поли)пептида и выбранного чужеродного Тхелперного эпитопа через амидную связь с молекулой полисахаридного носителя, таким путем становятся возможными множественные представления слабого эпитопа, составленного аминокислотами 700714 8Е0 ΙΌ N0:2, а также становится возможным выбор оптимального соотношения между Вклеточными и Т-клеточными эпитопами.
Пример 2. Иммунизация трансгенных мышей Ав и модифицированными белками в соответствии с данным изобретением.
Конструирование ДНК, кодирующей 11АВ43+-34. Ген 11АВ43+-34 конструировали в несколько стадий. Сначала генерировали ПЦР-фрагмент с праймерами МЕ#801 (8Е0 ΙΌ N0:10) и МЕ#802 (8Е0 ΙΌ N0:11) с использованием праймера МЕ#800 (8Е0 ΙΌ N0:9) в качестве матрицы. МЕ#800 кодирует фрагмент аЬс!а-43 человека с оптимизированными для Е. сой кодонами. МЕ#801 и 802 добавляют подходящие сайты рестрикции к этому фрагменту.
ПЦР-фрагмент очищали, расщепляли №о1 и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный №о1-НтЛП и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ28Ь+ Е. со11. Полученная плазмида, кодирующая Ав-43 дикого типа человека, была названа рАВ1.
В следующей стадии Т-хелперный эпитоп Р2 добавляют к С-концу этой молекулы. Праймер МЕ#806 (8Е0 ΙΌ N0:12) содержит последовательность, кодирующую эпитоп Р2, так что генерируется слияние Р2 и АЬс!а-43 посредством этой ПЦР-реакции.
Клонирование выполняли путем получения ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ#178 (8Е0 ΙΌ N0:8) и МЕ#806 с использованием рАВ1 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ЖоГНтйШ и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ28Ь+. Полученная плазмида была названа рАВ2.
Аналогичным образом, другую плазмиду делали улавливающей Ав-43-кодирующую последовательность с другим Т-хелперным эпитопом, Р30, добавленным к Кконцу. Это выполняли путем получения ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ#105 (8Е0 ΙΌ N0:7) и МЕ#807 (8Е0 ΙΌ N0:13) с использованием праймера рАВ1 в качестве матрицы.
Этот фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ^оГНтйШ и очищенный вектор рЕТ28Ь+. Полученная плазмида была названа рАВ3.
В третьей стадии второй повтор Ав-43 добавляли С-терминально к эпитопу Р2 плазмиды рАВ2 при помощи праймера МЕ#809 (8Е0 ΙΌ N0:14). МЕ#809 в то же самое время создает сайт ВатШ непосредственно после повтора Ав-43. ПЦР-фрагмент получали с праймерами МЕ#178 и МЕ#809 с использованием рАВ2 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ^оГНтйШ и очищенный экспрессирующий вектор рЕТ28Ь+. Полученная плазмида была названа рАВ4.
Наконец, повторяющуюся последовательность эпитоп Р30-повтор Ав-43 из рАВ3 клонировали в плазмиду рАВ4. Это выполняли получением ПЦР-фрагмента с праймерами МЕ#811 (8Е0 ΙΌ N0:16) и МЕ#105 с использованием рАВ3 в качестве матрицы. Этот фрагмент очищали и использовали в качестве праймера в последующей ПЦР с использованием МЕ#810 (8Е0 ΙΌ N0:15) с применением рАВ3 в качестве матрицы. Полученный фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленный ^оГНшйШ и очищенный экспрессирующий вектор рАВ4. Полученная плазмида рАВ5 кодирует молекулу 11АВ43+-34.
Все ПЦР и процедуры клонирования выполняли, по существу, как описано 8атЬгоок 1., Ргйкй, Е.Р., апй Мап1аЙ8, Т. 1989 Мо1сси1аг С1опт§: А ЬаЬога!огу Мапиа1. 2'1 Ей., Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!огу, КУ.
- 29 008762
Для всех процедур клонирования использовали клетки Е. сой К-12, штамм Тор-10 Г' (81га1адепе, И8А). Вектор рЕТ28Ь+ покупали у ^уадеп, И8А. Все праймеры синтезировали в ΌΝΑ Тесйпо1оду, Оептагк.
Экспрессия и очистка ЙАВ43+-34. Белок ЙАВ43+-34, кодируемый рАВ5, экспрессировали в клетках Е. сой ВЬ21-Оо1б ^оуадеп), как описано поставщиками системы рЕТ28Ь+^оуадеп).
Экспрессированный белок ЙАВ43+-34 очищали до чистоты более 85% промыванием тел включения с последующей катионообменной хроматографией с использованием рабочей станции для очистки ВюСаб (Рег8ерйуе Вю8у81ет8, И8А) в присутствии 6 М мочевины. Мочевину после этого удаляли ступенчатым диализом против раствора, содержащего уменьшающиеся количества мочевины. Конечным буфером был 10 мМ Трис, рН 8,5.
Исследование иммунизации. Мышей, трансгенных в отношении АРР человека (белкапредшественника Ав-белка (белка Альцгеймера)), использовали для этого исследования. Эти мыши, названные ТдΚN^8+, экспрессируют мутированную форму АРР, что приводит к высокой концентрации Ав-40 и Ав-42 в головном мозге мыши (1апи8, С. е! а1.).
Мышей (8-10 мышей на одну группу) иммунизировали либо АЬе!а-42 (8Е^ Ю NО:2, остатки 673714, синтезированная с использованием стандартной Гтос-стратегии), либо вариантом ЙАВ43+-34 (конструкцией 34 в таблице в примере 1, полученной рекомбинантно) четыре раза в неделю с двухнедельными интервалами. Дозы были 100 мг для Ав или 50 мг для ЙАВ43+-34. Мышам делали кровопускание в день 43 (после трех инъекций) и после дня 52 (после четырех инъекций) и сыворотки использовали для определения уровня анти-Ав-42-специфических титров с использованием прямого ЕЙ18А Ав-42.
В следующей таблице показаны средние относительные титры анти-АЬе!а-42.
Иммуноген День 43 (после 3 иммунизаций) День 52 (после 4 иммунизаций)
Αβ-42 4000 3000
Ϊ1ΑΒ43+-34 16000 23000
Как будет видно, титры антител, полученные при иммунизации вариантом ЙАВ43+-34 Ав, приблизительно в 4 раза и в 7,5 раз выше после 3 и 4 иммунизации, соответственно, чем титры, полученные при использовании неизмененного Ав-42 в качестве иммуногена. Этот факт представляется, кроме того, перспективным при рассмотрении того факта, что количество варианта, используемого для иммунизации, было только 50% от количества последовательности дикого типа, используемого для иммунизации.
Пример 3. Синтез содержащей пептид Ав-сополимер вакцины с использованием полигидроксиполимера в качестве сшивающего агента.
Введение. Традиционная конъюгатная вакцина состоит из (поли)пептида, связанного ковалентно с белком-носителем. Пептид содержит В-клеточный эпитоп (эпитопы), а белок-носитель обеспечивает Тхелперные эпитопы. Однако большая часть белка-носителя обычно будет не относящейся к источнику Тхелперных эпитопов, так как только минорная часть общей последовательности содержит соответствующие Т-хелпэрные эпитопы. Такие эпитопы могут быть определены и синтезированы в виде пептидов, например, из 12-15 аминокислот. Если эти пептиды связаны ковалентно с пептидами, содержащими Вклеточные эпитопы, например, через многовалентный активированный полигидроксиполимер, может быть получена вакцинная молекула, которая содержит только уместные части. Кроме того, можно обеспечить вакцинный конъюгат, который содержит оптимизированное соотношение между В-клеточными и Т-клеточными эпитопами.
Синтез активированного полигидроксиполимера. Полигидроксиполимеры, такие как декстран, крахмал, агароза и т.д., могут быть активированы 2,2,2-трифторэтансульфонилхлоридом (трезилхлоридом), либо посредством гомогенного синтеза (декстран), при растворении в Ν-метилпирролидиноне (ΝΜΡ), либо посредством гетерогенного синтеза (крахмал, агароза, сшитый декстран), например, в ацетоне.
225 мл сухого Ν-метилпирролидинона (ΝΜΡ) добавляют в сухих условиях к лиофилизированному водорастворимому декстрану (4,5 г, 83 ммоль, клинической чистоты, Мм (сред.) 78000) в круглодонной колбе на 500 мл, снабженной магнитной мешалкой для перемешивания. Колбу помещают в масляную баню на 60°С с перемешиванием при помощи магнитной мешалки. Температуру повышают до 92°С и перемешивают в течение периода 20 мин. Когда декстран растворяется, колбу сразу же вынимают из масляной бани и температуру в бане снижают до 40°С. Колбу снова помещают в масляную баню, все еще при перемешивании магнитной мешалкой, и добавляют по каплям трезилхлорид (2,764 мл, 25 ммоль). Через 15 мин добавляют по каплям сухой пиридин (безводный, 2,020 мл, 25 ммоль). Колбу вынимают из масляной бани и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт (активированный трезилом декстран, ТАГ)) осаждают в 1200 мл холодного этанола (99,9%). Супернатант декантируют и осадок собирают в полипропиленовые пробирки на 50 мл в центрифуге при 2000 об./мин. Осадок растворяют в 50 мл 0,5% уксусной кислоты, диализуют 2 раза против 5000 мл 0,5% уксусной кислоты и лиофилизируют. ТАГ) может храниться в виде лиофилизированного порошка при -20°С.
Нерастворимый полигидроксиполимер, такой как агароза или сшитый декстран, может быть акти
- 30 008762 вирован трезилом путем получения суспензии полигидроксиполимера, например, в ацетоне, и выполнения синтеза в виде твердофазного синтеза. Активированный полигидроксиполимер может быть собран фильтрованием. Подходящие способы сообщаются, например, в №1ккоп К. апб МокЬасЬ К. (1987), МеНобк ίη Еηζутο1οду 135, р. 67 и в Негтапккоп СТ е! а1. (1992), ίη ЛттоЫПеб Айшйу Бщапб ТесЬшдиек, Асабетю Ргекк, 1пс., р. 87.
Синтез содержащих АЬе!а-пептид-сополимеры вакцин. ТАЭ (10 мг) растворяют в 100 мкл Н2О и 1000 мкг карбонатного буфера, рН 9,6, содержащего 5 мг Ав-42 (8ЕЦ ΙΌ N0:2, остатки 673-714), и добавляют 2,5 мг Р2 (8ЕЦ ΙΌ N0:4) и 2,5 мг Р30 (8ЕЦ ΙΌ N0:6). Ав-42 и Р2 и Р30 содержат все защищенные группы лизина, они находятся в форме 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил (Эбе)защищенных групп лизина. Эти пептиды готовят посредством стандартной Етос-стратегии, где обычный Етос-Бук(Вос)ОН был замещен Етос-Бук(Эбе)-ОН (полученный из NονаЬ^οсЬет кат. номер 04-121121), т.е. ε-аминогруппа в лизине защищена Обе вместо Вос.
Величину рН измеряют и доводят до 9,6 при помощи 1 М НС1. Через 2,5 ч при комнатной температуре гидразин из 80% раствора добавляют до конечной концентрации гидразина 8%, и раствор инкубируют еще в течение 30 мин при комнатной температуре и сразу же после этого лиофилизируют. Лиофилизированный продукт растворяют в Н20 и диализуют интенсивно против Н2О перед конечной лиофилизацией.
Соотношение между В-клеточными эпитопами (Ав) и Т-хелперными эпитопами (Р2 и Р30) в конечном продукте может варьироваться с использованием различных концентраций этих пептидов в стадии синтеза. Кроме того, конечный продукт может быть помечен, например, маннозой (чтобы нацелить таким образом этот конъюгат на АРС) добавлением аминированной маннозы к карбонатному буферу на стадии синтеза.
Если нерастворимый активированный полигидроксиполимер используют для комбинирования пептидов, содержащих В-клеточный эпитоп и Т-хелперные эпитопы, связывание с этим полимером может выполняться в виде твердофазного синтеза, и конечный продукт собирают и очищают путем промывания и фильтрования.
Список ссылок
Вгооктеуег, В.; Сгау, 8.; Кахак, С. (1998). Рго)есНопк о, АНЬетег'к Эйеаке ίη !Ье Ипйеб 8!а!ек апб !Ье РиЫс Неа1!Ь 1трас! о, Ое1аут§ Э|кеаке Опке! Атепсап 1оигпа1 о, РиЬНс НеаНЬ, 88(9), 1337-1342.
ВиНш, М.; ОйЬ, М.; Ве11ок!а, 8.; Акее,е, Н.; Рйак, В.К.; Vукк-Сο^ау, Т.; Миске, Ь.; МаЬ1еу, Β.ν. (1999). Ехргеккюп о, Нитап АроНрорго1ет Е3 ог Е4 ίη Не Вгашк о, Арое-/- М1се: 1коГогт-8рес|Пс ЕГГес1к оп Nеи^οбедеηе^аΐ^οη. 1оита1 о, №игокаепсе, 19, 4867-4880.
С1агк, Б.Н; Роогка.), Р.; ν^Η^ Ζ.; СексЬМпб, Э.Н.; №кгеббше, Ζ.8.; МП1ег, В.; Б1, Ό.; Рауатц Н.; Ахей, Е.; Магкорои1ои, К.; Апбгеабщ, А.; Э^ои/а, I.; Бее, У.М.; Вееб, Б.; Тго_)апохкк1, 1.Ц.; ΖЬика^еνа, V.; В1гб, Т.; 8сЬе11епЬегд, С.; νί^^^η, К.С. (1998). РаНодетс ЕпрНсаЕопк о, МШаЕопк ίη Не Таи Сене ίη РаНбо-Роп1о-№дга1 ОедепегаНоп апб Ве1а!еб Nеи^οбедеηе^аι^νе Ощогбегк Бапкеб !о СЬготокоте 17. Ргосеебтдк о, Не №11юпа1 Асабету о, 8с1епсек И.8.А., 95(22), 13103-13107.
Сир!а, В. К. е!. а1. (1998), Вех Бю1 8!апб. 92: 63-78.
Нк1ао К. е! а1. (1998) Тгапкдешс тюе ехргекктд АНЬетег ату1о1б ргесигког рго1ешк, Ехр. СегоШоБ 33 (7-8), 883-889.
Нийоп, М.; Бепбоп, С.Б.; Βίζζυ, Р.; Вакег, М.; ЕгоеНсЬ, 8.; Нои1беп, Н.; Рккеппд-Вгохп, 8.; СЬакгахеПу, 8.; 1кааск, А.; Сгох'ег А.; Наскей, Е; Абаткоп, Б; БтсоН, 8.; Оюккоп, Ό.; Оах/ек, Р.; Ре!егкеп, В.С.; 8ΐеνеηк, М.; бе СгааЕБ, Е.; Vаиΐе^к, Е.; νаπ Вагеп, Б; ННеЬгапб, М.; 1оокке, М.; Кхоп, ЕМ.; №хоНу, Р.; СЬе, Б.К.; Нойоп, 1.; Мотк, ЕС.; Вееб, Б.Е.; Тго_)апохкк1, 1.; Вакип, Н.; БаппЕек, Б.; №ук1аР М.; ЕаЬп, 8.; Оагк, Е.; ТаппепЬегд, Т./ Эобб, Р.; Наухагб, Ν.; Кхок, 1.В.Е; 8сЬойе1б, Р.В.; Апбгеаб1к, А.; 8нохбен, 1.; СгаиНгб, Ό.; №агу, Ό.; Охеп, Е.; ОокЧа, В.А.; Нагбу, 1.; Соа!е, А.; νаη 8х1е1ен, 1.; Маππ, Ό.; Бупск Т.; НеНшк, Р. (1998). АккоааИоп о, М1ккепке апб 5'-8р11се-811е МшаЕопк ίη Таи \\Н1 Не 1нЬег11еб ОетепРа ЕТОР-17. №Нге, 393, 702-705.
1апик, С. е! а1. (2000), №11иге 408: 979 - 982.
Как, Н.8. (1997) 1 М1сгоепсарки1 14: 689-711.
Беоп, Б; СЬепд, С.К.; №итапп, Р.1. (1998). АНЬешег'к Э|кеаке Саге: Сок!к апб Ро(ен11а1 8ахап§к. НеаЙЬ АЙшгк, 17(6), 206-216.
Б1рра С. Е. е! а1. (1998) АЬ-42 бероккюп ргесебек оИег сЬапдек ίη Р8-1 АНЬетег'к б1кеаке. Бансе! 352, 1117-1118.
Био, 1.-1.; νΗ^., V.; Вюсюш, Т.; 1пдгат, О.К.; ВоИ, С.8.; Кик1ак, IV. (1999). ЭеаН о, РС12 Се11к апб Н1рросатра1 №игопк 1пбисеб Ьу Абепохага1-Меб1а1еб ЕАЭ Нитап Ату1о1б Ргесигког Рго1ет Сепе Ехргеккюп. 1оита1 о, №игокаепсе ВекеагсЬ, 55(5), 629-642.
Хатке, 8.; ТНпакагап, С.; Био, 1.-1.; Кик1ак, IV.; Тотйа, Т.; 1ха!киЬо, Т.; Ц1ап, X.; Ст!у, Ό.Ό.; Расе, О.Б.; ВогсЬеИ, О.В.; Vοηд, Р.С.; 81коб1а, 8.8. (1998). ЕПсс1к о, Р81 Оейаепсу оп МетЬгапе Рго1ет ТгаЕйскшд ίη №игопк. №игоп, 21(5), 1213-1231.
№Еопа1 !нк11(и(е оп Адшд Ргодгекк Верой оп АРЕеппег'к Э^еаке, 1999, ΝΙ4 РиЬНсаЕоп №. 99-4 664.
- 31 008762
Р1е1гоЬоп, Р.1. (1995), РИагт Β^Ι^Η^Ε 6: 347-61Роогка], Р.; Βίτά, Т.Э.; Шцктап, Е.; №тепк, Е.; Оагги!о, К.М.; Апдегкоп, Ь.; Апдгеадк, А.; ШЫегкоН, ЭД'.С.; Какктд, М.; 8сИе11епЬегд, О.Э. (1998). Таи 1к а Сапд1да1е Оепе Гог СИготокоте 17 Ргоп1о1етрога1 Эетепка. Аппа1к оГ №иго1оду, 43, 815-825.
8сИепк, Ώ.; НагЬоиг, К.; к)ипп, ^.; Оогдоп, О.; 6га]еда, Н.; Ошдо, Т.; Ни, К.; Ниапд, I.; 1оИпкопШоод, К.; КИап, К.; КИо1одепко, Ώ.; Ьее, М.; Ь1ао, Ζ.; ЫеЬегЬигд, I.; МоИег, К.; МиНег, Ь.; 8опапо, Р.; 8Иорр, О.; Уакдие/, Ν.; Уапдеνе^ΐ, С; Ша!кег, 8.; ШодиНк, М.; Уедпоск, Т.; Оатек, Ώ.; 8еиЬек, р. (1999). 1ттипка1юп мИИ А-Ье1а АИепиа1ек АкИе1тег'к Г)1кеаке-Р1ке Ра1Ио1оду т !Ке РЭАРР Мойке. №1иге, 400(6740), 173-177.
8Ьеки^, Β. е!. а1. (1999), I. Сгук1а1 Огом1И 198/199: 1345 - 1351.
8рШап!1т, М.О.; МиггеП, 1.К.; Ооедегр М.; Раг1ом, М.К.; К1ид, А.; ОИеШ, Β. (1998). Ми1аИоп т !Ке Таи Оепе т РатШа1 Ми1Ир1е 8ук1ет Таиора1Иу миИ РгекепПе Эетепка. Ргосеедтдк оГ 1Ие №Иопа! Асадету оГ 8с1епсек И.8.А., 95(13), 7737-7741.
81пИта11ег, ^.Р; 8аипдегк, А.М.; 8сИтесИе1, Ώ.; Репсак-Уапсе, М.; ЕпдИПд, I.; 8акекеп, О.8.; Кокек, А.Э. (1993). АроИрорго1ет Е: Н^дИ-Αν^д^ίу Нтдтд !о Ав апд 1псгеакед Ргециепсу оГ Туре 4 А11е1е т Ра1еОпке! РатШа1 АкИе1тег Экеаке. Ргосеедтдк оГ !Ке №1юпа1 Асадету оГ 8с1епсек И.8.А., 90, 1977-1981.
У1да1, К.; Ргапдюпе, В.; Кок1адпо, А.; Меад, 8.; Кеνекζ, Т.; Р1апр О.; ОИко, I. (1999). А 81ор-Содоп МиШюп т 1Ие ΒΡΙ Оепе Аккос1а1ед мИИ РатШа1 НиикИ Эетепка. №1иге, 399: 776-781.
ΖΗβ^ Н. (1996) М1се дейс1еп! Гог !Ке атуЫд ргесигког рго!ет депе. Апп. N Υ Асад. 8сг, 777, 421426.
^огк, Р. (1999), Р8ТТ 11: 430-440.
Список последовательностей <110> М&Е ВбоЪесН А/8 <120> Новый способ супрессии амилоида <130> Р1009РС1 <140>
<141>
<160> 16 <170> РабепЫп Уег. 3.0 <210> 1 <211> 2313 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(2313) <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (2098)..(2169) <223> нуклеотиды, кодирующие трансмембранный район <220>
<221> т1зс_£еа-(:иге <222> (2014)..(2313) < 2 2 3 > нуклеотиды, коди рующие С-100 <220>
<221> т1зс_£еаЪиге <222> (2016)..(2144) <223> АЬеСа 42/43 <220>
- 32 008762 <221> ш1зс_£еакиге <222> (2014)..(2142) <223> АЬека 42/43 <400> 1
акд Мек 1 сед ссс ддБ С1у ББд дса сБд сБс сБд сБд дсс дсс Бдд асд ТЬг дек А1а 15 едд Агд 48
Ьеи Рго Ьеи 5 А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 10 А1а А1а Тгр
дед скд дад дБ а ссс асБ даБ ддБ ааБ дсБ ддс сБд сБд дсБ даа ссс 96
А1а Беи С1и Уа1 Рго ТЬг Азр С1у Азп А1а С1у Ьеи Ьеи А1а С1и Рго
20 25 30
сад акк дсс акд ББс Б дБ ддс ада сБд аас аБд сас аБд ааБ дке сад 144
С1п Не А1а Мек РЬе Суз С1у Агд Ьеи Азп МеБ ΗΪ3 Мек А5П Уа1 С1п
35 40 45
аак ддд аад Бдд да Б Беа даБ сса Беа ддд асе ааа асе Бдс акк дак 192
Азп С1у Ьуз Тгр Азр Зег Азр Рго Зег С1у ТЬг Ьуз ТЬг Суз Не Азр
50 55 60
асе аад даа ддс акс сБд сад БаБ Бдс саа даа дБ с Бас ссБ даа скд 240
ТЬг Ьуз С1и С1у 11е Ьеи С1п Туг Суз С1п С1и Уа1 Туг Рго С1и Ьеи
65 70 75 80
сад акс асе аак дБд дБ а даа дсс аас саа сса дБд асе аБс сад аас 288
С1п 11е ТЬг Азп Уа1 Уа1 С1и А1а Азп С1п Рго Уа1 ТЬг 11е С1п Азп
85 90 95
Бдд Бдс аад едд ддс сдс аад сад Бдс аад асе сак ссс сас БкЬ дБд 336
Тгр Суз Ьуз Агд С1у Агд Ьуз С1п Суз Ьуз ТЬг ΗΪ3 Рго ΗΪ3 РЬе Уа1
100 105 110
акк ссс Бас еде Бдс ББа дББ ддБ дад БББ дБа адк даБ дсс скБ скс 384
Не Рго Туг Агд Суз Ьеи Уа1 С1у 61и РЬе Уа1 Зег Азр А1а Ьеи Ьеи
115 120 125
дБ к сек да с аад Бдс ааа ББс ББа сас сад дад адд аБд даБ дББ к де 432
Уа1 Рго Азр Ьуз Суз Ьуз РЬе Ьеи ΗΪ3 С1п С1и Агд МеБ Азр Уа1 Суз
130 135 140
даа асЕ саЕ С1и ТЬг ΗΪ3 145 сЕЕ Ьеи сас Едд сас асе дЕс дсс ааа дад аса ТЬг Еде Суз адЕ Зег дад 61и 160 480
Н1з Тгр 150 Нхз ТЬг Уа1 А1а Ьуз 155 61и
аад а дБ асе аас ЕЕд саЕ дас Еас ддс аЕд ЕЕд сЕд ссс Еде дда аЕЕ 528
Ьуз Зег ТЬг Аэп Ьеи Н1з Азр Туг 61у МеЕ Ьеи Ьеи Рго Суз 61у Не
165 170 175
дас аад ЕЕс еда ддд дБ а дад еее дьд ЕдЕ Еде сса сЕд дсЕ даа даа 576
Азр Ьуз РЬе Агд С1у Уа1 61и РЬе Уа1 Суз Суз Рго Ьеи А1а 61и 61и
180 185 190
адЕ дас ааЕ дкд да 5 Бек дсЕ даЕ дед дад дад даЕ дас Бед даЕ дЕс 624
Бег Азр Аэп Уа1 Азр Зег А1а Азр А1а С1и С1и Азр Азр Зег Азр Уа1
195 200 205
Ьдд Ьдд ддс дда дса дас аса дас Бак дса даЕ ддд адЕ даа дас ааа 672
Тгр Тгр С1у 61у А1а Азр ТЬг Азр Туг А1а Азр С1у Зег С1и Азр Ьуз
210 215 220
дЕа дЕа даа дЕа дса дад дад даа даа д5д дсЕ дад дкд даа даа даа 720
Уа1 Уа1 <31 и Уа1 А1а 61и С1и 61и С1и Уа1 А1а С1и Уа1 61и С1и 61и
225 230 235 240
даа дсс даЕ даЕ дас дад дас даЕ дад даЕ ддЕ даЕ дад дЕа дад даа 768
С1и А1а Азр Азр Азр С1и Азр Азр 61и Азр 61у Азр 61и Уа1 С1и С1и
245 250 255
дад дсЕ дад даа ссс Сае даа даа дсс аса дад ада асе асе аде аЕЕ 816
61и А1а 61и ’61и Рго Туг 61и 61 и А1а ТЬг б1и Агд ТЬг ТЬг Зег 11е
260 265 270
дсс асе асе асе асе асе асе аса дад Бек дЪд даа дад дкд дЕЕ еда 864
А1а ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг 61и Зег Уа1 61и 61и Уа1 Уа1 Агд
275 280 285
дад дкд Еде ЕсЕ даа саа дсс дад асд ддд сед Еде еда дса аЕд аЕс 912
С1и Уа1 Суз Зег С1и 61П А1а 61и ТЬг 61у Рго Суз Агд А1а МеЕ 11е
290 295 300
Есс еде Едд Еас ЕЕЕ Туг РЬе даЕ дЕд асЕ даа ддд аад ЕдЕ дес сса ЕЕс ЕЕЕ РЬе 320 960
Зег 305 Агд Тгр Азр Уа1 ТЬг 310 61и 61у Ьуз 315 Суз А1а Рго РЬе
Еас ддс дда ЕдЕ ддс ддс аас едд аас аас ЕЕЕ дас аса даа дад Еас 1008
Туг 61у 61 у Суз 51у 61у Азп Агд Азп Азп РЬе Азр ТЬг 61 и 51и Туг
325 330 335
Еде аЕд дес дЕд ЕдЕ ддс аде дес аЕд Есс саа адЕ ЕЕа сЕс аад асЕ 1056
Суз МеЕ А1а Уа1 Суз 61у Зег А1а МеЕ Зег 61п Зег Ьеи Ьеи Ьуз ТЬг
340 345 350
асе сад даа ссЕ сЕЕ дсс еда даЕ ссЕ дЕЕ ааа сЕЕ ссЕ аса аса дса 1104
ТЬг С1п 51и Рго Ьеи А1а Агд Азр Рго Уа1 Ьуз Ьеи Рго ТЬг ТЬг А1а
355 360 365
дес адЕ асе ссЕ даЕ дес дЕЕ дас аад ЕаЕ сЕс дад аса ссЕ ддд даЕ 1152
А1а Зег ТЬг Рго Азр А1а Уа1 Азр Ьуз Туг Ьеи С1и ТЬг Рго 61у Азр
370 375 380
дад ааЕ даа саЕ дес саЕ ЕЕс сад ааа дес ааа дад адд сЕЕ дад дсс 1200
61и Азп 61и ΗΪ3 А1а Н13 РЬе 61п Ьуз А1а Ьуз С1и Агд Ьеи 61и А1а
385 390 395 400
аад сас еда дад ада аЕд Есс сад дЕс аЕд ада даа Едд даа дад дса 1248
Ьуз ΗΪ3 Агд 51 и Агд МеЕ Зег 61п Уа1 МеЕ Агд 51 и Тгр 61и 61 и А1а
4 05 410 415
даа сдЕ саа дса аад аас ЕЕд ссЕ ааа дсЕ даЕ аад аад дса дЕЕ аЕс 1296
61и Агд 61п А1а Ьуз Азп Ьеи Рго Ьуз А1а Азр Ьуз Ьуз А1а Уа1 Не
420 425 430
сад саЕ ЕЕс сад дад ааа дЕд даа ЕсЕ ЕЕд даа сад даа дса дсс аас 1344
61п ΗΪ3 РЬе 61п 61и Ьуз Уа1 51и Зег Ьеи 61и 51п 51и А1а А1а Азп
435 440 445
дад ада сад сад сЕд дЕд дад аса сас аЕд дес ада дЕд даа дсс аЕд 1392
61и Агд 61п С1п Ьеи Уа1 61и ТЬг ΗΪ3 МеЕ А1а Агд Уа1 С1и А1а МеЕ
450 455 460
- 35 008762
скс аак дас сдс Азр Агд сдс Агд сдс Агд 470 скд дсс скд Ьеи дад аас кас акс 11е асе Ткг дек А1а скд Ьеи 480 1440
Ьеи 465 Азп Ьеи А1а 61 и Азп 475 Туг
сад дек дкк сск сск едд сск едк сас дкд ккс аак акд ска аад аад 1488
61п А1а Уа1 Рго Рго Агд Рго Агд Нхз Уа1 Рке Азп Мек Ьеи Ьуз Ьуз
485 4 90 495
как: дке сдс дса даа сад аад дас ада сад сас асе ска аад сак ккс 1536
Туг Уа1 Агд А1а 61и 61п Ьуз Азр Агд 61 п ΗΪ3 Ткг Ьеи Ьуз ΗΪ3 Рке
500 505 510
дад сак дкд сдс акд дкд дак ссс аад ааа дсс дек сад акс едд ксс 1584
61и ΗΪ3 Уа2 Агд Мек Уа1 Азр Рго Ьуз Ьуз А1а А1а 61 п Не Агд Зег
515 520 525
сад дкк акд аса сас скс едк дъд акк как дад сдс акд аак сад кек ,1632
01 η Уа1 Мек Ткг Н1з Ьеи Агд Уа1 11е Туг 61и Агд Мек Азп 61п Зег
530 535 540
скс ксс скд скс кас аас дкд сск дса д*д дсс дад дад акк сад дак 1680
Ьеи 5ег Ьеи Ьеи Туг Азп Уа1 Рго А1а Уа1 А1а 61и 61и 11е 61п Азр
545 550 555 560
даа дкк дак дад скд екк сад ааа дад саа аас как кса дак дас дке 1728
С1и Уа1 Азр С1и Ьеи Ьеи 61п Ьуз 61и 61п Азп Туг Зег Азр Азр Уа1
565 570 575
Ыд дсс аас акд акк адк даа сса адд акс адк кас дда аас дак дек 1776
Ьеи А1а Азп Мек Не Зег 61и Рго Агд 11е Зег Туг 61у Азп Азр А1а
580 585 590
скс акд сса кек ккд асе даа асд ааа асе асе дкд дад скс екк ссс 1824
Ьеи Мек Рго Зег Ьеи Ткг 61и Ткг Ьуз Ткг Ткг Уа1 61и Ьеи Ьеи Рго
595 600 605
дкд аак дда дад ккс аде скд дас дак скс сад ссд кдд сак кек ккк 1872
Уа1 Аз η 61у 61 и Рке Зег Ьеи Азр Азр Ьеи С1П Рго Тгр Н1з Зег Рке
610 615 620
- 36 008762
ддд дек дас кек Зег дкд сса дсс аас аса даа аас даа дкк дад сск Рго дкк Уа1 640 1920
б1у 625 А1а Азр Уа1 Рго 630 А1а Азп ТЬг 61и Азп 635 61и Уа1 61и
дак дсс сдс сск дек дсс дас еда дда скд асе аск еда сса ддк кек 1968
Аар А1а Агд Рго А1а А1а Азр Агд 61у Ьеи ТЬг ТЬг Агд Рго 61 у Зег
645 650 655
ддд ккд аса аак акс аад асд дад дад акс кек даа дкд аад акд дак 2016
61у Ьеи ТЬг Азп Не Ьуз ТЬг 61и 61и 11е Зег 61и Уа1 Ьуз Мек Азр
660 665 670
дса да а ккс еда сак дас кса дда как даа дкк сак сак саа ааа ккд 2064
А1а 61и РЬе Агд Н±з Азр Зег 61у Туг 61и Уа1 ΗΪ3 Н1з 61п Ьуз Ьеи
675 680 685
дкд ккс ккк дса да а дак дкд ддЬ кса аас ааа ддк дса акс акк дда 2112
Уа1 РЬе РЬе А1а 61и Азр Уа1 61у Зег Азп Ьуз 61у А1а 11е 11е С1у
690 695 700
скс акд дкд ддс ддк дкк дке ака дед аса дкд акс дке акс асе ккд 2160
Ьеи Мек Уа1 61у 61у Уа1 Уа1 11е А1а ТЬг Уа1 11е Уа1 Не ТЬг Ьеи
705 710 715 720
дйд акд скд аад аад ааа сад кас аса ксс сак. сак ддк дкд дкд 2208
Уа1 Мек Ьеи Ьуз Ьуз Ьуз 61п Туг ТЬг Зег 11е Н13 Нйз 61у Уа1 Уа1
725 730 735
дад дьс дас дсс дек дке асе сса дад дад сдс сас скд ксс аад акд 2256
С1и Уа1 Азр А1а А1а Уа1 ТЬг Рго 61и 61 и Агд Н13 Ьеи Зег Ьуз Мек
740 745 750
сад сад аас ддс Рас даа аак сса асе кас аад ккс ккк дад сад акд 2304
61п 61п Азп 61 у Туг 61 и Азп Рго ТЬг Туг Ьуз РЬе РЬе 61 и 61п Мек
755 760 765
сад аас кад
61п Азп
770
2313
- 37 008762 <210> 2 <211> 770 <212> Белок <213> Ното зариепз <400> 2
Мей 1 Беи Рго С1у Беи А1а Беи Ьеи Ьеи Беи А1а А1а Тгр ТЬг А1а Агд
5 10 15
А1а Ьеи С1и Уа1 Рго ТЬг Азр С1у Азп А1а 61у Ьеи Беи А1а 61и Рго
20 25 30
51п 11е А1а Мек РЬе Суз С1у Агд Ьеи Азп МеБ ΗΪ5 МеЬ Азп Уа1 61п
35 40 45
Азп 61у Ьуз Тгр Азр Зег Азр Рго Зег 61у ТЬг Ьуз ТЬг Суз 11е Азр
50 55 60
ТЬг Ьуз 61и 61у 11е Беи 61п Туг Суз 61п С1и 17а 1 Туг Рго 61и Ьеи
65 70 75 80
С1п 11е ТЬг Азп Уа1 Уа1 61и А1а Азп С1п Рго Уа1 ТЬг 11е С1п Азп
85 90 95
Тгр Суз Ьуз Агд 61у Агд Ьуз С1п Суз Ьуз ТЬг Низ Рго Низ РЬе Уа2
100 105 110
Не Рго Туг Агд Суз Беи Уа1 С1у С1и РЬе Уа1 Зег Азр А1а Ьеи Ьеи
115 120 125
Уа1 Рго Азр Ьуз Суз Буз РЬе Ьеи ΗΪ3 61п 61и Агд МеЬ Азр 17а 1 Суз
130 135 140
С1и ТЬг ΗΪ3 Ьеи ΗΪ5 Тгр Низ ТЬг Уа1 А1а Ьуз 61и ТЬг Суз Зег 61и
145 150 155 160
Ьуз Зег ТЬг Азп Беи Низ Азр Туг 61 у МеЬ Ьеи Ьеи Рго Суз 61 у 11е
165 170 175
- 38 008762
Азр Ъуз •РЬе Агд 61у 180 Уа1 61и РЬе Уа1 Суз Суз 185 Рго Ъеи А1а 190 61и 61и
Зег Азр Азп Уа1 Азр Зег А1а Азр А1а С1и 61и Азр Азр Зег Азр Уа1
195 200 205
Тгр Тгр 61у 61у А1а Азр ТЬг Азр Туг А1а Азр 61 у Зег 61и Азр Ъуз
210 215 220
Уа1 Уа1 С1и Уа1 А1а С1и 61 и 61 и 61и Уа1 А1а 61и Уа1 С1и 61и 61и
225 230 235 240
С1и А1а Азр Азр Азр С1и Азр Азр 61и Азр 61у Азр 61 и Уа1 61и 61и
245 250 255
61и А1а 61и 61и Рго Туг 61и 61и А1а ТЬг 61и Агд ТЬг ТЬг Зег Не
260 265 270
А1а ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг 61 и Зег Уа1 61и 61 и Уа1 Уа1 Агд
275 280 285
С1и Уа1 Суз Зег 61и С1п А1а 61и ТЫ 61 у Рго Суз Агд А1а Мек 11е
290 295 300
Зег Агд Тгр Туг РЬе Азр Уа1 ТЬг 61 и 61у Ъуз Суз А1а Рго РЬе РЬе
305 310 315 320
Туг 61у С1у Суз С1у С1у Азп Агд Азп Азп РЬе Азр ТЬг 61и 61и Туг
325 330 335
Суз МеЬ А1а Уа1 Суз 61 у Зег А1а МеЬ Зег 61п Зег Ъеи Ъеи Ъуз ТЬг
340 345 350
ТЬг С1п С1и Рго Ъеи А1а Агд Азр Рго Уа1 Ъуз Ъеи Рго ТЬг ТЬг А1а
355 360 365
А1а Зег ТЬг Рго Азр А1а Уа1 Азр Ъуз Туг Ъеи 61и ТЬг Рго 61у Азр
370 375 380
- 39 008762
61и 385 Азп 61и Нхз А1а ΗΪ3 390 РЬе 61п Ьуз А1а Ьуз 61и Агд Ьеи 61и А1а
395 400
Ьуз Ηίδ Агд 61и Агд Мей Зег 51п Уа1 Мей Агд 61и Тгр 61и 61и А1а
405 410 415
61и Агд 61п А1а Ьуз Азп Ьеи Рго Ьуз А1а Азр Ьуз Ьуз А1а Уа1 11е
420 425 430
61п Ηίδ РЬе 61п 61и Ьуз Уа1 61 и Зег Ьеи С1и 61п 61и А1а А1а Азп
435 440 445
61и Агд 61п 61п Ьеи Уа1 61и ТЬг Ηίδ Мей А1а Агд Уа1 61и А1а Мей
450 455 4 60
Ьеи Азп Азр Агд Агд Агд Ьеи А1а Ьеи 61и Азп Туг Не ТЬг А1а Ьеи
465 470 475 480
61 η А1а Уа1 Рго Рго Агд Рго Агд Ηίδ Уа1 РЬе Азп Мей Ьеи Ьуз Ьуз
485 4 90 495
Туг Уа1 Агд А1а 61и 61п Ьуз Азр Агд 61п Ηί3 ТЬг Ьеи Ьуз Ηίδ РЬе
500 505 510
61и Нйз Уа1 Агд МеЬ Уа1 Азр Рго Ьуз Ьуз А1а А1а 61 п 11е Агд Зег
515 520 525
61 η Уа1 МеЕ ТЬг НЬз Ьеи Агд Уа1 Не Туг 61и Агд Мей Азп 61 п Зег
530 535 540
Ьеи 5ег Ьеи Ьеи Туг Азп Уа1 Рго А1а Уа1 А1а 61и 61и 11е 61п Азр
545 550 555 560
61и Уа1 Азр 61и Ьеи Ьеи 61п Ьуз 61и 61п Азп Туг Зег Азр Азр Уа1
565 570 575
Ьеи А1а Азп МеЬ Не Зег 61и Рго Агд 11е Зег Туг б1у Азп Азр А1а
580 585 590
- 40 008762
Беи МеЪ Рго Зег Беи ТЬг С1и ТЬг 600 Буз ТЬг ТЬг Уа1 01и 605 Беи Беи Рго
595
Уа1 Азп 01у С1и РЬе Зег Беи Азр Азр Беи 01п Рго Тгр Н1з Зег РЬе
610 615 620
61у А1а Азр Зег Уа1 Рго А1а Азп ТЬг 01 и Азп 01 и Уа1 С1и Рго Уа1
625 630 635 640
Азр А1а Агд Рго А1а А1а Азр Агд 61у Беи ТЬг ТЬг Агд Рго С1у Зег
645 650 655
С1у Беи ТЬг Азп Не Буз ТЬг О1и 61и 11е Зег 01 и Уа1 Буз Мек Азр
660 665 670
А1а 01 и РЬе Агд Н1з Азр Зег О1у Туг С1и Уа1 Н1з ΗΪ3 С1п Буз Беи
675 680 685
Уа1 РЬе РЬе А1а О1и Азр Уа1 С1у Зег Азп Буз С1у А1а 11е 11е С1у
690 695 700
Беи МеЬ Уа1 С1у С1у Уа1 Уа1 11е А1а ТЬг Уа1 11е Уа1 11е ТЬг Беи
705 710 715 720
Уа1 Мек Беи Буз Буз Буз 61п Туг ТЬг Зег 11е Ηίδ НБз С1у Уа1 Уа1
725 730 735
С1и Ца1 Азр А1а А1а Уа1 ТЬг Рго О1и О1и Агд Ηίδ Беи Зег Буз Мек
740 745 750
С1п С1п Азп С1у Туг б1и Азп Рго ТЬг Туг Буз РЬе РЬе 01 и С1п Мек
755 7 60 7 65
51η Азп
770 <210> 3 <211> 45 <212> ДНК <213> ΟΙοδΕΓϊάϊυτη ЪеЬап!
- 41 008762 <220>
<221> СОЗ <222> (1) . . (45) <223> ДНК, кодирующая эпитоп Р2 <400> 3
сад Ьас аЬс ааа дсЬ аас Ьсс ааа ЬЬс аЬс ддЬ аЬс асе дад сЬд 45
С1п Туг Не Ъуз А1а Азп Зег Ъуз РЬе Не 61у Не ТЬг С1и Ъеи
1 5 10 15
<210> 4 <211> 15 <212> Белок <213> СЪозЬгбсЦит ееЬап!
<400> 4
С1п Туг Не Ъуз А1а Азп Зег Ъуз РЬе Не С1у Не ТЬг С1и Ьеи
Ю 15 <210> 5 <211> 63 <212> ДНК <213> С1озег1с11и1П йеЪапх <220>
<221> СОЗ <222> (1)..(63) <22 3> ДНК, кодирующая эпитоп РЗО <400> 5
ЬЬс аас аас ЬЬс асе дЬа аде ЬЪс сед сдЬ деь ссд ааа д-ее аде 48
РЬе Азп Азп РЬе ТЬг Уа1 Зег РЬе Тгр Ъеи Агд Уа1 Рго Ъуз Уа1 Зег
1 5 10 15
- 42 008762 дсй аде сас сЪд даа ®-’
А1а Зег Нлэ Беи С1и <210> 6 <211> 21 <212> Белок <213> С1озЪг101ит йейап!
<400> б
Рйе Азп Азп Рйе Тйг Уа1 Зег Рйе Тгр Беи Агд Уа1 Рго Буз Уа1 Зег 15 Ю15
А1а Зег Нлз Беи С1и <210>7 <211> 21 <212> ДНК <213> синтетическая <400>7 саасЕсадсЕ РссйЕЕсддд с21 <210> 8 <211> 21 <212> ДНК <213> синтетическая <400>8 адаЕсйсдай сссдсдааай ί21 <210>9 <211>135 <212> ДНК <213> синтетическая <400>9 айддаЕдсад аа±1:ссд1:са сдасЬссддЪ Ъасдаадййс ассассадаа асЕддрЫтЕс60
- 43 008762
ЕЕсдсадаад аЪдЕЪддБСс саасааадд-Ь дсааБсаСсд дЪсЬдаЪдд·!: Бддсдд'ЬдЕЪ 120
дЬБаксдсда сскад 135
<210> 10
<211> 31
<212> ДНК
<213> синтетическая
<400> 10
дссддссаБд дакдсадаак ЕссдЕсасда с 31
<210> 11
<211> 39
<212> ДНК
<213> синтетическая
<400> 11
дссддаадсЕ БскаддЕсдс даБаасааса ссдссаасс 39
<210> 12
<211> 84
<212> ДНК
<213> синтетическая
<400> 12
ссддсаадсЕ ЕсСасадскс ддЕдаЕассд аБдааЕСЕдд ад'ЕЕадсЕС'Ь даЕдЪасЕдд 60
дксдсдаЕаа саасассдсс аасс 84
<210> 13
<211> 101
<212> ДНК
<213> синтетическая
<400> 13
дссддссакд ддЕСЕсааса асЕИсассдЕ ЕадсББсЕдд сЪдсдЕд-СЕс сдааадЪЪад 60
сдсдадссас сЬддаадаЕд садааБЪссд СсасдасЪсс 9 101
<210> 14 <211> 172
- 44 008762 <212> ДНК < 213 > синтетическая <400> 14
дддссаадсЕ ЕддаЕссддЕ ссЕЕЕдрЕдд аассаасаЕс ссддадксдк дасддааскс сдсдаЕааса ЪСсЕдсдаад ЕдсаЪссадс асассдссаа аааассад-Ы: ЕсддЪдаЕас ссаЕсадасс даЕдаЕЕдса кскддСддЕд аасЕксдкаа 60 120 172
сдаТдааЩЕ дд
<210> 15
<211> 30
<212> ДНК
<213> синтетическая
<400> 15
сЬддаадайд сададЕЪссд ЕсасдасРсс 30
<210> 16
<211> 35
<212> ДНК
<213> синтетическая
<400> 16
дсдссддаЕс сЕЕсаасаас СЕсассдМа дсЪЕс 35
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (46)

1. Способ ш у1уо понижающей регуляции аутологичного бета-амилоидного (Ав) белка или аутологичного белка-предшественника амилоида (АРР) у животного, в том числе человека, предусматривающий осуществление представления иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного аналога аутологичного Ав или аутологичного АРР животного, полученного путем введения в них по меньшей мере одного выделенного чужеродного Т-хелперного эпитопа (Тнэпитопа) посредством инсерции, добавки, делеции или замены, с сохранением существенной фракции Вклеточных эпитопов Ав и АРР, так что иммунизация данного животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против аутологичного Ав или аутологичного АРР у животного, причем чужеродный Тн-эпитоп вводят в Ав или АРР, как схематически показано для эпитопов Р2 и Р30 на чертеже и раскрыто в описании.
2. Способ по п.1, согласно которому в аутологичный Ав или АРР дополнительно вводят по меньшей мере одну первую структуру, которая нацеливает аналог на антигенпредставляющую клетку (АРС) или В-лимфоцит, и/или дополнительно вводят по меньшей мере одну вторую структуру, которая стимулирует иммунную систему, и/или дополнительно вводят по меньшей мере одну третью структуру, которая оптимизирует представление аналога иммунной системе.
3. Способ по п.2, согласно которому аналог модифицирован путем введения в качестве боковых групп, ковалентно или нековалентно прикрепленных к Ав, АРР или их фрагментам, первой, и/или второй, и/или третьей структур.
4. Способ по любому из пп.1-3, согласно которому дополнительно осуществляют дупликацию по меньшей мере одного В-клеточного эпитопа аналога Ав или АРР и/или введение гаптена.
5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому чужеродный Тн-эпитоп является иммунодоминантным у животного.
6. Способ по любому из пп.1-5, согласно которому чужеродный Т-клеточный эпитоп является смешанным, таким как чужеродный Т-клеточный эпитоп, который выбран из природно встречающейся и неприродной пептидной последовательности, связывающейся с МНС класса ΙΙ.
7. Способ по п.6, согласно которому природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного токсоида, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного токсоида, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р. Га1с1рагит.
8. Способ по любому из пп.2-7, согласно которому первая структура является партнером специфического связывания для В-лимфоцит-специфического поверхностного антигена или для АРСспецифического поверхностного антигена, таким как гаптен или углевод, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или АРС.
- 45 008762
9. Способ по любому из пп.2-8, согласно которому вторая структура представляет собой цитокин, такой как интерферон у(1Р№у), Р113Ь, интерлейкин 1 (1Ь-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь-4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Ь-12), интерлейкин 13 (ΣΠ-13), интерлейкин 15 (ΣΠ-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-СБР), гормон, или белок теплового шока, такой как НБР70, НБР90, НБС70, ОВР94 и кальретикулин (СВТ).
10. Способ по любому из пп.2-9, согласно которому третья структура имеет липидную природу и является пальмитоильной группой, миристильной группой, фарнезильной группой, геранил-геранильной группой, ОР1-якорем и Ν-ацилдиглицеридной группой.
11. Способ по любому из пп.2-9, согласно которому третья структура является полигидроксиполимером, таким как полисахарид.
12. Способ по любому из пп.1-11, согласно которому аутологичный Ав или АРР модифицируют таким образом, чтобы сохранить В-клеточные эпитопы, которые не экспонированы во внеклеточной фазе, когда аутологичный АРР связан с клеткой.
13. Способ по п.12, согласно которому Ав или АРР модифицируют таким образом, чтобы в нем отсутствовал по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, который экспонирован во внеклеточной фазе, когда аутологичный АРР связан с клеткой.
14. Способ по любому из пп.1-13, согласно которому для введения чужеродного Тн-эпитопа в аутологичный Ав или АРР осуществляют замену по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в аутологичном Ав или АРР аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины.
15. Способ по п.1, согласно которому указанный аналог от Ν- до С-конца состоит из аминокислотных остатков 672-714 последовательности БЕО ΣΟ N0:2, за которыми следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:4, затем следуют аминокислотные остатки 672-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, затем аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:6, а затем аминокислотные остатки 672-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2.
16. Способ по п.1, согласно которому указанный аналог от N до С-конца состоит из аминокислотных остатков 630-634 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, за которыми следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:6, затем следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:4, а затем аминокислотные остатки 671-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2.
17. Способ по п.1, согласно которому указанный аналог от N до С-конца состоит из аминокислотных остатков 672-713 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, за которыми следует аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:6, затем следуют аминокислотные остатки 729-734 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, затем аминокислотная последовательность БЕО ΣΌ N0:4, а затем аминокислотные остатки 750-770 последовательности БЕО ΣΌ N0:2.
18. Способ по любому из пп.1-13, согласно которому указанный аналог содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 672-714 последовательности БЕО ΣΌ N0:2, в которую встроена аминокислотная последовательность, которая приводит к появлению чужеродного Тнэпитопа или в которой по меньшей мере один участок заменен участком равной или отличающейся длины, что приводит к появлению чужеродного Тн-эпитопа.
19. Способ по любому из пп.1-18, согласно которому в организм животного вводят по меньшей мере две копии аналога, ковалентно или нековалентно связанные с молекулой-носителем, способной осуществлять представление иммунной системе множественных копий антигенных детерминант.
20. Способ по любому из пп.1-19, согласно которому аналог смешивают с адъювантом, который облегчает разрушение аутотолерантности в отношении аутоантигенов.
21. Способ по любому из пп.1-20, согласно которому эффективное количество аналога вводят животному парентеральным способом, таким как внутрикожный, подкожный и внутримышечный; перитонеальным способом; пероральным способом; буккальным способом; подъязычным способом; эпидуральным способом; спинальным способом; анальным способом или интракраниальным способом.
22. Способ по п.21, согласно которому эффективное количество аналога составляет от 0,5 до 2000 мкг.
23. Способ по п.21 или 22, согласно которому аналог заключают в устройство виртуального лимфатического узла (УЪ№), раскрытое в описании.
24. Способ по любому из пп.1-18, согласно которому указанный аналог вводят в организм животного путем встраивания нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей (кодирующих) аналог, в клетки животного с последующей экспрессией ш у1уо в этих клетках нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
25. Способ по п.24, согласно которому нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) выбирают из голой ДНК; ДНК, связанной с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, заключенной в липосомы; ДНК, встроенной в вирусный вектор; ДНК, связанной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом; ДНК, связанной с нацеливающим белком или полипептидом; ДНК, находящейся в комплексе с кальций-осаждающими агентами; ДНК, связанной с молекулой инертного носителя; ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан; и ДНК в смеси с адъювантом.
26. Способ по п.25, согласно которому нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) заключают в
- 46 008762 устройство νΣΝ, раскрытое в описании.
27. Способ по любому из пп.23-26, предусматривающий по меньшей мере одно введение аналога в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений.
28. Способ по любому из пп.1-18, согласно которому указанный аналог вводят в организм животного с помощью непатогенного микроорганизма или вируса, который содержит фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий и экспрессирующий указанный аналог.
29. Способ лечения, и/или предупреждения, и/или ослабления болезни Альцгеймера или других заболеваний и состояний, характеризующихся отложениями Ав, предусматривающий понижающую регуляцию аутологичного Ав или АРР в соответствии со способом по любому из пп. 1-27 в такой степени, чтобы общее количество амилоида уменьшалось или чтобы скорость образования амилоида снижалась с клинической значимостью.
30. Аналог аутологичного Ав или АРР животного, в который введен по меньшей мере один выделенный чужеродный Тн-эпитоп, как схематически показано для эпитопов Р2 и Р30 на чертеже и раскрыто в описании, так что иммунизация животного этим аналогом вызывает продуцирование антител против аутологичного Ав или аутологичного АРР у животного.
31. Аналог по п.30, модифицированный, как раскрыто в пп.2-18.
32. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенно эффективное количество аналога по п.30 или 31, причем композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель и необязательно адъювант.
33. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог по п.30 или 31.
34. Вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33, например вектор, который способен к автономной репликации.
35. Вектор по п.34, который выбран из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, минихромосомы и вируса.
36. Вектор по любому из пп.34 или 35, дополнительно содержащий в направлении 5%3' в функциональной взаимосвязи промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты по п.33, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию полипептидного фрагмента или его интеграцию в мембрану, фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33 и необязательно терминатор.
37. Вектор по любому из пп.34-36, который при введении в клетку-хозяина способен или не способен к интеграции в геном клетки-хозяина.
38. Вектор по п.36 или 37, где промотор запускает экспрессию в эукариотической клетке и/или в прокариотической клетке.
39. Трансформированная клетка, содержащая вектор по любому из пп.34-38, например трансформированная клетка, которая способна к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по п.33.
40. Трансформированная клетка по п.39, которая является клеткой микроорганизма, выбранного из бактерий, дрожжей, простейших, или клеткой, полученной из многоклеточного организма, выбранного из грибов, насекомых, такой как клетка 82 или клетка 8Г, растениий и млекопитающих.
41. Трансформированная клетка по п.39 или 40, которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33, например трансформированная клетка, которая секретирует или экспонирует на своей поверхности аналог по п.30 или 31.
42. Композиция для индукции продуцирования антител против Ав или АРР, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33 или вектор по любому из пп.34-38 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.
43. Стабильная клеточная линия, содержащая вектор по любому из пп.34-38 и экспрессирующая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.33, которая необязательно секретирует или экспонирует на своей поверхности аналог по п.30 или 31.
44. Способ получения клетки по любому из пп.39-40, предусматривающий трансформацию клеткихозяина вектором по любому из пп.34-38.
45. Применение аналога по п.30 или 31 для получения иммуногенной композиции, необязательно содержащей адъювант, для понижающей регуляции аутологичного Ав или АРР у животного.
46. Применение аналога по п.30 или 31 для получения иммуногенной композиции, необязательно содержащей адъювант, для лечения, профилактики или ослабления болезни Альцгеймера или других состояний, характеризующихся отложениями амилоида.
EA200200889A 2000-02-21 2001-02-19 АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ EA008762B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000265 2000-02-21
PCT/DK2001/000113 WO2001062284A2 (en) 2000-02-21 2001-02-19 Novel method for down-regulation of amyloid

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200200889A1 EA200200889A1 (ru) 2003-02-27
EA008762B1 true EA008762B1 (ru) 2007-08-31

Family

ID=8159174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200200889A EA008762B1 (ru) 2000-02-21 2001-02-19 АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20030086938A1 (ru)
EP (2) EP1259251B1 (ru)
JP (1) JP5025871B2 (ru)
CN (1) CN1279971C (ru)
AR (1) AR027947A1 (ru)
AT (1) ATE306933T1 (ru)
BR (1) BR0108566A (ru)
CO (1) CO5280094A1 (ru)
DE (1) DE60114157T2 (ru)
DK (1) DK1259251T3 (ru)
EA (1) EA008762B1 (ru)
EE (1) EE200200444A (ru)
EG (1) EG25830A (ru)
ES (1) ES2248283T3 (ru)
GC (1) GC0000355A (ru)
HK (1) HK1054865B (ru)
HU (1) HUP0300067A3 (ru)
IL (3) IL150066A0 (ru)
IS (1) IS6446A (ru)
ME (2) MEP30408A (ru)
MY (1) MY131826A (ru)
NO (1) NO20023961L (ru)
NZ (1) NZ521442A (ru)
PL (1) PL204878B1 (ru)
RS (1) RS51164B (ru)
SI (1) SI1259251T1 (ru)
SK (1) SK287468B6 (ru)
WO (1) WO2001062284A2 (ru)
ZA (1) ZA200204830B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2741366C2 (ru) * 2014-03-12 2021-01-25 Еда Рисерч Энд Девелопмент Ко., Лтд Снижение системного уровня регуляторных т-клеток или их активности для лечения заболеваний и трамв цнс

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
US6689753B1 (en) * 1999-11-05 2004-02-10 Axonyx, Inc. β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide
KR20080017471A (ko) * 2000-02-21 2008-02-26 파멕사 에이/에스 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
HUP0300067A3 (en) * 2000-02-21 2010-03-29 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
DE60121729T2 (de) * 2001-04-19 2007-11-29 Dr. Hermann Schätzl Prion Proteindimere für Impfungen
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
EP1820806A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-22 Crossbeta Biosciences B.V. Affinity regions
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
EP1380290A1 (en) 2002-07-09 2004-01-14 Universitair Medisch Centrum Utrecht Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance
AU2003246690B2 (en) 2002-07-17 2010-03-11 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein
US6932971B2 (en) 2002-07-18 2005-08-23 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates and uses thereof
CA2492930C (en) 2002-07-19 2013-01-08 Cytos Biotechnology Ag Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
WO2008103472A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
TWI374893B (en) 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
AR047062A1 (es) 2003-12-17 2006-01-04 Wyeth Corp Conjugados portadores de peptidos inmunogenicos a beta y metodos para producirlos
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
JP4903159B2 (ja) * 2005-04-20 2012-03-28 ディナベック株式会社 アルツハイマー病の治療のための安全性に優れた鼻腔内投与可能遺伝子ワクチン
AU2006267174A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Adjuvation through cross-beta structure
ATE554394T1 (de) 2005-07-13 2012-05-15 Crossbeta Biosciences Bv Cross-beta-struktur-bindende verbindungen
US20070015133A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Umc Utrecht Holding B.V. Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein
US8114832B2 (en) 2005-07-13 2012-02-14 Crossbeta Biosciences B.V. Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition
ES2524984T3 (es) 2005-11-30 2014-12-16 Abbvie Inc. Anticuerpos anti-globulómero a?, porciones de unión a antígeno de estos, hibridomas correspondientes, ácidos nucleicos, vectores, células huésped, métodos para producir dichos anticuerpos, composiciones que comprenden dichos anticuerpos, usos de dichos anticuerpos, y métodos para usar dichos anticuerpos
WO2007064972A2 (en) 2005-11-30 2007-06-07 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
JP2007300856A (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Hiroshi Mori アミロイドタンパク質模倣物
WO2008040759A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Pharmexa A/S Method for down-regulation of cripto
WO2008070284A2 (en) 2006-10-16 2008-06-12 Johnnie B. Byrd, Sr. Alzheimer's Center And Research Institute Amyloid beta peptides and methods of uses thereof
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8895004B2 (en) 2007-02-27 2014-11-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008106657A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2058000A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Immunogenic compositions capable of activating T cells
EP2058001A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Enhancement of immunogenicity of antigens
CA2960734C (en) 2008-06-27 2021-08-24 Zoetis Services Llc Adjuvants containing saponins, sterols and quaternary amines
US8491890B2 (en) 2008-07-09 2013-07-23 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for inhibiting diseases of the central nervous system
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
EP2258398A1 (en) 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
CN101858910B (zh) * 2010-03-25 2013-03-27 辽宁大学 一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法
JP2013523182A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アボット・ラボラトリーズ アミロイドベータ結合タンパク質
EP2603233A1 (en) 2010-08-12 2013-06-19 AC Immune S.A. Vaccine engineering
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
AR083561A1 (es) 2010-10-26 2013-03-06 Ac Immune Sa Preparacion de una construccion antigenica
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
CN109846862A (zh) * 2012-10-25 2019-06-07 通用医疗公司 治疗阿尔茨海默病及相关疾病的组合疗法
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
US10117921B2 (en) 2013-09-19 2018-11-06 Zoetis Services Llc Oil-based adjuvants
CN106102737B (zh) 2013-10-22 2019-06-14 综合医院公司 色甘酸衍生物以及成像和治疗的相关方法
EP4248992A3 (en) 2015-01-16 2023-12-27 Zoetis Services LLC Foot-and-mouth disease vaccine
US20190160146A1 (en) * 2016-05-12 2019-05-30 Ohio State Innovation Foundation Peptides and methods for treating neurodegenerative disorders
WO2018045217A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 The General Hospital Corporation Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases
CN106854233B (zh) * 2017-03-03 2020-07-17 国家纳米科学中心 一种类肽及其制备方法和应用
CN107412782B (zh) * 2017-04-27 2020-09-08 国家纳米科学中心 一种多肽聚合物纳米材料及其制备方法和应用
EP3648791A1 (en) 2017-07-04 2020-05-13 CureVac AG Novel nucleic acid molecules
US10561612B2 (en) 2017-07-20 2020-02-18 The General Hospital Corporation Powdered formulations of cromolyn sodium and ibuprofen
WO2020010049A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 The General Hospital Corporation POWDERED FORMULATIONS OF CROMOLYN SODIUM AND α-LACTOSE
CN112210003A (zh) * 2019-07-09 2021-01-12 厦门德馨尚品医疗科技有限公司 一种重组载脂蛋白j及其类似物的晶体结构及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995005849A1 (en) * 1993-08-26 1995-03-02 Mouritsen & Elsner A/S Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign t-cell epitopes
WO1995023166A1 (en) * 1994-02-25 1995-08-31 Deakin Research Limited Synthetic inverso or retro-inverso t-cell epitopes
WO1999027944A1 (en) * 1997-12-02 1999-06-10 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596792A (en) * 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) * 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) * 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) * 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
JP3926839B2 (ja) * 1993-09-14 2007-06-06 エピミューン，インコーポレイティド 万能ｄｒ−結合性ペプチドを用いる免疫応答の改変
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
ES2175083T3 (es) * 1995-03-14 2002-11-16 Praecis Pharm Inc Moduladores de la agregacion de amiloides.
US5874469A (en) * 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
US5854469A (en) * 1996-06-28 1998-12-29 Gabay; David Heating unit for therapeutic instrument
US5985581A (en) * 1996-07-25 1999-11-16 The Mclean Hospital Corporation Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease
IT1293511B1 (it) * 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20040062802A1 (en) * 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
DE69924392T2 (de) * 1998-09-15 2006-03-09 Pharmexa A/S Verfahren zur hemmung der aktivität von osteoprotegerin-liganden
US7005498B1 (en) * 1998-10-05 2006-02-28 Pharmexa A/S Methods for therapeutic vaccination
AU764969B2 (en) * 1999-04-19 2003-09-04 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
DE60031792T2 (de) * 1999-12-08 2007-02-22 Intellect Neurosciences, Inc. Schimärische amyloid-beta peptide
KR20080017471A (ko) * 2000-02-21 2008-02-26 파멕사 에이/에스 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
HUP0300067A3 (en) * 2000-02-21 2010-03-29 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
ES2238049T3 (es) * 2000-05-22 2005-08-16 New York University Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides.
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
EP1485122A2 (en) * 2002-03-11 2004-12-15 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
WO2004006861A2 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Mindset Biopharmaceuticals Usa Inc. Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995005849A1 (en) * 1993-08-26 1995-03-02 Mouritsen & Elsner A/S Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign t-cell epitopes
WO1995023166A1 (en) * 1994-02-25 1995-08-31 Deakin Research Limited Synthetic inverso or retro-inverso t-cell epitopes
WO1999027944A1 (en) * 1997-12-02 1999-06-10 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2741366C2 (ru) * 2014-03-12 2021-01-25 Еда Рисерч Энд Девелопмент Ко., Лтд Снижение системного уровня регуляторных т-клеток или их активности для лечения заболеваний и трамв цнс

Also Published As

Publication number Publication date
NZ521442A (en) 2003-09-26
HUP0300067A2 (en) 2003-05-28
IL150066A (en) 2009-02-11
BR0108566A (pt) 2002-11-19
EG25830A (en) 2012-09-02
PL204878B1 (pl) 2010-02-26
WO2001062284A3 (en) 2001-11-29
RS51164B (sr) 2010-10-31
EP1632242A2 (en) 2006-03-08
US20070041945A1 (en) 2007-02-22
EP1632242A3 (en) 2011-08-31
IL150066A0 (en) 2002-12-01
ME00183B (me) 2011-02-10
JP2003523402A (ja) 2003-08-05
PL362889A1 (en) 2004-11-02
IS6446A (is) 2002-06-26
DK1259251T3 (da) 2006-03-06
AR027947A1 (es) 2003-04-16
MY131826A (en) 2007-09-28
CN1279971C (zh) 2006-10-18
ATE306933T1 (de) 2005-11-15
CN1416350A (zh) 2003-05-07
NO20023961D0 (no) 2002-08-20
ES2248283T3 (es) 2006-03-16
ZA200204830B (en) 2003-11-26
IL189646A0 (en) 2011-07-31
MEP30408A (en) 2010-10-10
DE60114157D1 (de) 2006-03-02
WO2001062284A2 (en) 2001-08-30
GC0000355A (en) 2007-03-31
SK287468B6 (sk) 2010-10-07
NO20023961L (no) 2002-08-20
EP1259251A2 (en) 2002-11-27
HK1054865B (zh) 2007-06-01
US20090311281A1 (en) 2009-12-17
SI1259251T1 (sl) 2006-04-30
HUP0300067A3 (en) 2010-03-29
JP5025871B2 (ja) 2012-09-12
EP1259251B1 (en) 2005-10-19
EA200200889A1 (ru) 2003-02-27
CO5280094A1 (es) 2003-05-30
US20030086938A1 (en) 2003-05-08
EE200200444A (et) 2003-12-15
DE60114157T2 (de) 2006-06-29
SK11782002A3 (sk) 2004-02-03
HK1054865A1 (en) 2003-12-19
YU57702A (sh) 2005-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA008762B1 (ru) АНАЛОГ АУТОЛОГИЧНОГО Аβ ИЛИ АРР ЖИВОТНОГО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
KR101057488B1 (ko) 베타-아밀로이드-유사체 - ｔ-세포 에피토프 백신
AU783144B2 (en) Novel method for down-regulation of amyloid
KR101236611B1 (ko) 치료 백신
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine
NO335602B1 (no) Farmasøytisk sammensetning for nedregulering av amyloid inneholdende et immunogen omfattende en polyaminosyre som induserer produksjon av antistoff mot dyrets autologe amyloid forløperprotein (APP) eller amyloid-beta (A-beta), nukleinsyrefragment kodende for polyaminosyren, vektor og transformert celle.
UA85815C2 (ru) Применение иммуногена для профилактики или лечения болезни альцгеймера или других заболеваний, связанных с отложением амилоида

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU