PL204878B1 - Zastosowanie analogu autologicznego zwierzęcego Aβ albo polipeptydu APP lub sekwencji kodującej taki analog lub mikroorganizmu lub wirusa, który niesie nukleotydową sekwencję kodującą taki analog, analog polipeptydu amyloidogennego, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego kodujący analog, wektor, stransformowana komórka, kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał i stabilna linia komórkowa - Google Patents

Zastosowanie analogu autologicznego zwierzęcego Aβ albo polipeptydu APP lub sekwencji kodującej taki analog lub mikroorganizmu lub wirusa, który niesie nukleotydową sekwencję kodującą taki analog, analog polipeptydu amyloidogennego, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego kodujący analog, wektor, stransformowana komórka, kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał i stabilna linia komórkowa

Info

Publication number
PL204878B1
PL204878B1 PL362889A PL36288901A PL204878B1 PL 204878 B1 PL204878 B1 PL 204878B1 PL 362889 A PL362889 A PL 362889A PL 36288901 A PL36288901 A PL 36288901A PL 204878 B1 PL204878 B1 PL 204878B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cell
analog
epitope
nucleic acid
amino acid
Prior art date
Application number
PL362889A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362889A1 (pl
Inventor
Peter Birk
Martin Roland Jensen
Klaus Gregorius Nielsen
Original Assignee
Lundbeck & Co As H
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lundbeck & Co As H filed Critical Lundbeck & Co As H
Publication of PL362889A1 publication Critical patent/PL362889A1/pl
Publication of PL204878B1 publication Critical patent/PL204878B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie analogu autologicznego zwierzęcego Αβ albo polipeptydu APP lub sekwencji kodującej taki analog lub mikroorganizmu lub wirusa, który niesie nukleotydową sekwencję kodującą taki analog, analog polipeptydu amyloidogennego, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego kodujący analog, wektor, stransformowana komórka, kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał i stabilna linia komórkowa.
Niniejszy wynalazek dotyczy poprawy w leczeniu i zapobieganiu chorobie Alzheimera (AD) i innym chorobom, które charakteryzują się odkładaniem amyloidu, np. charakteryzują się odkładaniem amyloidu w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).
Konkretniej, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu obniżania poziomu (niepożądanych) złogów amyloidowych przez umożliwienie wytwarzania przeciwciał przeciwko stosownemu białku lub jego komponentom u osobników cierpiących na, lub zagrożonych cierpieniem z powodu choroby o patologii związanej z odkładaniem amyloidu.
Skrobiawica jest to zewnątrzkomórkowe odkładanie nierozpuszczalnych włókien białkowych prowadzące do uszkodzenia tkanki i choroby (Pepys, 1996; Tan i wsp., 1995; Kelly, 1996). Włókna tworzą się wówczas, gdy normalnie rozpuszczalne białka i peptydy samo-asocjują w nieprawidłowy sposób (Kelly, 1997).
Amyloid jest związany z poważnymi chorobami obejmującymi systemową skrobiawicę, AD, cukrzycę dorosłych, chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona, otępienie czołowo-skroniowe oraz przenoszoną przez cząsteczki typu prion encefalopatię gąbczastą (kuru i choroba Creutzfeldta-Jacoba u ludzi oraz trzęsawka (ang. Scrapie) i BSE odpowiednio u owiec i bydła), a tworzenie płytki amyloidowej przykładowo w Alzheimerze, wydaje się być ściśle związane z postępem ludzkiej choroby. Wykazano, w modelach zwierzęcych, że nadprodukcja czy wytwarzanie przez ekspresję zmodyfikowanych postaci białek znalezionych w złogach, jak białko β-amyloidowe, indukuje różne objawy choroby, np. objawy podobne do Alzheimera. Nie istnieje specyficzne leczenie złogów amyloidowych i choroby te są zazwyczaj śmiertelne.
Podjednostki włókien amyloidowych mogą być typu dzikiego, odmianą lub uciętą postacią białek, a podobne włókna można wytwarzać in vitro z oligopeptydów i białek zdenaturowanych (Bradbury i wsp., 1960; Filshie i wsp., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Charakter skrobiawicy określany jest przez naturę polipeptydowego składnika włókien. Pomimo dużych różnic w rozmiarze, strukturze natywnej i funkcji białek amyloidowych, wszystkie włókna amyloidowe mają nieokreśloną długość, są nierozgałęzione, o średnicy 0,007 μm do 0,012 μm i wykazują charakterystyczne barwienie czerwienią Kongo (Pepys, 1996). Charakteryzują się strukturą krzyża β (Pauling i Corey, 1951), w której łańcuch polipeptydowy jest zorganizowany w β-harmonijki. Chociaż białka amyloidowe mają bardzo różne struktury prekursorowe, wszystkie one mogą podlegać strukturalnej konwersji, prawdopodobnie na podobnej drodze, do źle sfałdowanej postaci, która jest budulcowym blokiem protofilamentalnej helisy β-harmonijki.
Ten zróżnicowany wzór włókien prowadzi do skrobiawic nazywanych β-fibrylozami (Glenner, 1980 a,b), a białko włókienkowe z AD nazwano białkiem β, zanim poznana została jego struktura drugorzędowa (Glenner i Wong, 1984). Charakterystyczny wzór dyfrakcji krzyża β, wraz z pojawieniem się włókien i właściwościami barwienia są obecnie zaakceptowaną próbą diagnostyczną dla amyloidu i sugeruje się, że włókna, chociaż tworzone z całkiem różnych prekursorów białkowych, mają wspólny stopień podobieństwa strukturalnego i obejmują strukturalną nadrodzinę niezależnie od natury ich białek prekursorowych (Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 1997 Oct 31; 273(3): 729-739).
Jedną z najbardziej rozpowszechnionych i najlepiej poznanych chorób, w której jak się sugeruje, złogi amyloidowe w ośrodkowym układzie nerwowym odgrywają kluczową rolę w postępowaniu choroby, jest AD.
AD
Choroba Alzheimera (AD) jest nieodwracalnym, postępującym zaburzeniem mózgu, które pojawia się stopniowo i w wyniku którego dochodzi do utraty pamięci, zmian behawioralnych i osobowościowych oraz utraty zdolności umysłowych. Utraty te związane są ze śmiercią komórek mózgu i przerwaniem połączeń pomiędzy nimi. Przebieg choroby różni się u różnych osób i różna jest szybkość zaniku. Średnio, pacjenci z AD żyją przez 8 do 10 lat od zdiagnozowania, chociaż choroba może trwać aż do 20 lat.
PL 204 878 B1
AD postępuje etapami, od wczesnego, łagodnego zaniku pamięci, do ostrej utraty funkcji umysłowych. Utrata ta jest znana jako otępienie. U większość ludzi z AD, symptomy po raz pierwszy pojawiają się w wieku po 60, lecz wcześniejsze początki nie są rzadkie. Najwcześniejsze objawy często obejmują utratę pamięci świeżej, nieprawidłowe rozumowanie oraz zmiany osobowościowe. Często, ludzie we wczesnym etapie AD myślą mniej klarownie i zapominają nazw bliskich osób i codziennych przedmiotów. W późniejszej chorobie mogą zapominać wykonywania prostych czynności. W końcu, ludzie z AD tracą wszelką zdolność rozumowania i stają się zależni w codziennej opiece od innych ludzi. Ostatecznie choroba tak osłabia, że pacjenci są przykuci do łóżka i podatni na rozwinięcie innych chorób i infekcji. Najczęściej ludzie z AD umierają na zapalenie płuc.
Chociaż ryzyko rozwoju AD wzrasta z wiekiem, AD i objawy otępienia nie są częścią normalnego starzenia się. AD i inne zaburzenia powodujące otępienie wywołane są chorobami, które działają na mózg. W normalnym procesie starzenia komórki nerwowe w mózgu nie giną w dużej liczbie. Dla kontrastu, AD uszkadza trzy procesy kluczowe: komunikację, metabolizm i naprawę komórek nerwowych. Uszkodzenie to ostatecznie powoduje zahamowanie działania wielu komórek nerwowych, utratę połączeń z innymi komórkami nerwowymi i śmierć.
Po pierwsze, AD niszczy neurony w częściach mózgu kontrolujących pamięć, w szczególności w hipokampie i w strukturach pokrewnych. Ponieważ komórki nerwowe hipokampa przestają wł a ściwie funkcjonować, zanika pamięć krótkoterminowa i często zaczyna zanikać zdolność osoby do wykonywania prostych i znanych zadań. AD atakuje także korę mózgową, w szczególności w obszarach odpowiedzialnych za mowę i rozumienie. W końcu dotkniętych jest wiele innych obszarów mózgu, wszystkie one zanikają (kurczą się) i pacjent z AD staje się przykuty do łóżka, nie trzymający moczu i stolca i całkowicie bezradny i nie reagujący na świat zewnętrzny (źródło: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Wpływ AD
AD jest najpowszechniejszą przyczyną otępienia wśród ludzi w wieku 65 lat i starszych. Przedstawia poważny problem zdrowotny ze względu na ogromny wpływ na pacjentów, rodziny, system opieki zdrowotnej i społeczeństwo jako całość. Naukowcy szacują, że do 4 milionów, ludzi cierpi obecnie na chorobę i liczba przypadków podwaja się co każde 5 lat w wieku powyżej 65 lat. Szacuje się także, że w przybliżeniu 360000 nowych przypadków (zapadalność) będzie pojawiać się każdego roku, chociaż liczba ta będzie wzrastać wraz ze starzeniem się populacji (Brookmeyer i wsp., 1998).
AD nakłada poważny ciężar ekonomiczny na społeczeństwo. W ostatnich badaniach przeprowadzonych w Stanach Zjednoczonych oszacowano, że coroczny koszt opieki ponoszony na jednego pacjenta z AD wynosi 18408$ dla pacjenta z łagodną AD, 30096$ dla pacjenta z umiarkowaną AD i 36132$ dla pacjenta z ostrą AD. Coroczny koszt narodowy ponoszony na opiekę nad pacjentami z AD w USA jest szacowany na nieco powyż ej 50 miliardów $ (Leon i wsp., 1998).
W przybliż eniu 4 miliony Amerykanów jest w wieku 85 lat lub w starszym i w wię kszoś ci krajów uprzemysłowionych ta grupa wiekowa jest najszybciej powiększającą się częścią populacji. Szacuje się, że w USA grupa ta będzie liczyła prawie 8,5 m.in. Do roku 2030; niektórzy eksperci, którzy badają trendy w populacji sugerują, że liczba ta będzie jeszcze większa. Ponieważ coraz więcej ludzi żyje dłużej, liczba ludzi dotkniętych chorobami wieku starczego, w tym AD, będzie ciągle wzrastała. Na przykład, badania pokazują, że prawa wszystkich ludzi w wieku 85 lat i starszych ma jakąś postać otępienia (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Główne cechy AD
Cechami charakterystycznymi dla AD są dwie nieprawidłowe struktury w mózgu: płytki amyloidowe i sploty neurofibrylarne (NTF). Płytki są gęstymi, w większości nierozpuszczalnymi złogami białka i materiału komórkowego na zewnątrz i wokół neuronów mózgu. Sploty są nierozpuszczalnymi skręconymi włóknami wytworzonymi wewnątrz neuronów.
Istnieją dwa typy AD: rodzinna (FAD), która przebiega według określonego wzoru dziedziczenia oraz rzadka AD, gdzie nie obserwuje się oczywistego wzoru dziedziczenia. Ze względu na różnice wieku, w którym zaczyna się choroba, AD jest dalej opisywana jako choroba wczesnego początku (pojawiająca się u ludzi młodszych, poniżej 65 lat) lub późnego początku (pojawiająca się u ludzi w wieku 65 lat i starszych). AD wczesnego począ tku jest rzadka (okoł o 10 procent przypadków) i na ogół dotyka ludzi w wieku 30 do 60 lat. Niektóre postacie AD wczesnego początku są dziedziczne i przebiegają rodzinnie. AD wczesnego początku często postępuje szybciej niż bardziej powszechna postać późnego początku.
PL 204 878 B1
Wszystkie znane do tej pory FAD mają wczesny początek i obecnie wiadomo, że aż 50 procent przypadków FAD jest wywołanych zaburzeniami w trzech genach położonych na trzech różnych chromosomach. Są to mutacje w genie APP na chromosomie 21; mutacje w genie na chromosomie 14, nazwanym preseniliną 1 i mutacje w genie na chromosomie 1, nazwanym preseniliną 2. Jednakże do tej pory nie ma dowodu, czy którakolwiek z tych mutacji odgrywa główną rolę w bardziej powszechnej, rzadkiej lub nierodzinnej postaci AD późnego początku (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Płytki amyloidowe
W AD, p ł ytki amyloidowe rozwijają się najpierw w obszarach mózgu uż ywanych do pamię ci i innych funkcji poznawczych. Składają się one w większości z nierozpuszczalnych złogów amyloidu beta (dalej oznaczanego tu jako Αβ) - fragmentu większego białka zwanego amyloidowym białkiem prekursorowym (APP, którego sekwencję aminokwasową przedstawiono na SEK. NR ID.: 2) - zmieszanych z częściami neuronów i z nienerwowymi komórkami, takimi jak mikroglej i astrocyty. Nie wiadomo czy płytki amyloidowe same stanowią główną przyczynę AD, czy są produktem ubocznym procesu AD. Z pewnością zmiany w białku APP mogą powodować AD, jak pokazano w dziedzicznej postaci AD wywoływanej przez mutacje w genie APP, a tworzenie płytki Ae wydaje się być ściśle związane z postępowaniem choroby ludzkiej (Lippa C.F. i wsp., 1998).
APP
APP jest jednym z wielu białek związanych z błonami komórkowymi. Po wytworzeniu, APP jest osadzone w błonie komórki nerwowej, częściowo wewnątrz, a częściowo na zewnątrz komórki. Ostatnie badania wykorzystujące myszy transgeniczne pokazały, że APP odgrywa ważną rolę we wzroście i przeżywaniu neuronów. Na przykład, pewne postacie i ilości APP mogą chronić neurony zarówno przed krótko- jak i długoterminowym uszkodzeniem oraz mogą sprawiać, że uszkodzone neurony są bardziej zdolne do samonaprawy i pomagają częściom neuronów wzrastać po uszkodzeniu mózgu.
Podczas gdy APP jest osadzone w błonie komórkowej, proteazy działają na określone miejsca w APP, tnąc je na fragmenty białkowe. Jedna proteaza pomaga ciąć APP do postaci Ae, a inna proteaza tnie APP w środku fragmentu amyloidowego tak, że nie może powstać Ae. Tworzony Ae ma dwie różne długości, krótszy 40 (lub 41) aminokwasowy Ae, który jest stosunkowo rozpuszczalny i agreguje powoli i niewiele dłuższy, 42- aminokwasowy, „lepki” Ae, który szybko tworzy nierozpuszczalne skupiska. Nie wiadomo jeszcze dokładnie, jak utworzony Ae przemieszcza się przez lub wokół komórek nerwowych. W końcowym etapie tego procesu, „lepki” Ae agreguje w długie włókna na zewnątrz komórki i wzdłuż fragmentów martwych lub umierających neuronów oraz mikrogleju i astrocytów tworząc płytki, które są charakterystyczne dla AD w tkance mózgowej.
Istnieją pewne dowody na to, że mutacje w APP zwiększają prawdopodobieństwo wycinania Ae z prekursora APP, co prowadzi do wytwarzania albo większej ilości całkowitego Ae lub stosunkowo więcej „lepkiej” postaci. Wydaje się także, że mutacje w genach preseniliny mogą przyczyniać się do degeneracji neuronów na co najmniej dwa sposoby: przez modyfikowanie wytwarzania Ae lub przez zapoczątkowanie śmierci komórek bardziej bezpośrednio. Inni badacze sugerują, że zmutowane preseniliny 1 i 2 mogą być włączone w przyspieszenie tempa apoptozy.
Oczekuje się, że wraz z postępem choroby będzie tworzyć się coraz więcej płytek, wypełniających coraz bardziej mózg. Badania sugerują, że może być tak, iż Ae agreguje i rozpada się w tym samym czasie w rodzaju równowagi dynamicznej. Zwiększa to nadzieję, że będzie możliwe zniszczenie płytek nawet po ich utworzeniu (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Przypuszcza się, że Ae jest toksyczny dla neuronów. W pracach na hodowlach tkankowych badacze zaobserwowali wzrost śmierci komórek neuronowych hipokampa przekonstruowanych do nadwyrażania zmutowanych form ludzkiego APP w porównaniu z neuronami nadwyrażającymi prawidłowy ludzki APP (Luo i wsp., 1999).
Ponadto, w modelach zwierzęcych pokazano, że nadwyrażanie lub wyrażanie zmodyfikowanych form białka Ae indukuje objawy typu Alzheimera (Hsiao K. i wsp., 1998).
Jeśli wzrost wytwarzania Ae, jego agregowanie w płytki i wynikająca z tego neurotoksyczność mogą prowadzić do AD, w wynalezienie warunków, w których agregowanie Ae w płytki może być spowolnione lub nawet zablokowane, ma znaczenie terapeutyczne.
Preseniliny
Liczba mutacji w presenilinie-1 (S-180) wynosi około 50% wszystkich przypadków rodzinnej AD o wczesnym początku (FAD). Zidentyfikowano około 30 mutacji, które są przyczyną AD. Początek AD
PL 204 878 B1 różni się w zależności od mutacji. Mutacje w presenilinie-2 stanowią znacznie mniejszą część przypadków FAD, lecz jest to ciągle znaczący czynnik. Nie wiadomo, czy preseniliny są włączone w rzadką nie rodzinną AD. Funkcja presenilin nie jest znana, lecz wydaje się, że są one włączone w obróbkę APP do Αβ-42 (dłuższej, lepkiej formy peptydu, SEK. NR ID.: 2, reszty 673-714), ponieważ pacjenci z AD z mutacjami w presenilinie mają podwyższone poziomy tego peptydu. Nie jest jasne, czy preseniliny odgrywają także rolę w wywoływaniu wytwarzania NFT. Niektórzy sugerują, że preseniliny mogą także odgrywać bardziej bezpośrednią rolę w degeneracji neuronów i w śmierci neuronów. Presenilina-1 leży na chromosomie 14, podczas gdy presenilina-2 jest związana z chromosomem 1. Jeżeli osoba niesie zmutowaną wersję tylko jednego z tych genów jest prawie pewne, że u niego lub u niej rozwinie się AD o wczesnym początku.
Istnieje pewna wątpliwość czy presenilina-1 nie jest identyczna z hipotetyczną gamma-sekretazą włączoną w obróbkę APP (Naruse i wsp., 1998).
Apolipoproteina E
Apolipoproteina E zazwyczaj towarzyszy cholesterolowi, lecz znaleziono ją także w płytkach i splątkach w mózgach z AD. Podczas gdy allele 1-3 nie wydają się być związane z AD, istnieje znacząca korelacja między obecnością allelu APOE-e4 i rozwojem późnej AD (Strittmatter i wsp., 1993). Jest to jednak czynnik ryzyka a nie bezpośrednia przyczyna, jak w przypadku mutacji preseniliny i APP i nie jest on ograniczony do rodzinnej AD.
Drogi, którymi białko ApoE e4 zwiększa prawdopodobieństwo rozwoju AD, nie są z pewnością znane, lecz jedną z możliwych teorii jest, że ułatwia ono narastanie Ae i to przyczynia się do obniżenia wieku początku AD, lub że obecność lub brak określonych alleli APOE może działać na drogę, którą neurony odpowiadają na uszkodzenie (Buttini i wsp., 1999).
Pokazano, że także Apo A1 jest amylogenna. Nieuszkodzona apo A1 może sama tworzyć włókienka typu amyloidowego in vitro, pozytywne w barwieniu czerwienią Kongo (Am J Pathol 147 (2): 238-244 (Aug 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B).
Wydaje się, że istnieją sprzeczne wyniki wskazujące na istnienie pozytywnego wpływu allelu APOE-e4 na zmniejszenie objawów utraty władz umysłowych, w porównaniu z innymi allelami (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
Splątki neurofibrylarne
Tą drugą cechą charakterystyczną AD są nieprawidłowe zbiory skręconych nitek znalezionych wewnątrz komórek nerwowych. Głównym składnikiem splątków jest jedna postać białka zwanego tau (t). W ośrodkowym układzie nerwowym, białka tau są najlepiej poznane ze względu na ich zdolność do wiązania i pomocy w stabilizacji mikrotubul, które są elementem wewnętrznej struktury podtrzymującej komórki lub szkieletu. Jednak w AD tau jest chemicznie zmienione i to zmienione tau nie może dłużej stabilizować mikrotubul prowadząc do ich dezintegracji. To załamanie systemu transportu może najpierw powodować wadliwą komunikację między komórkami nerwowymi, a później może prowadzić do śmierci neuronów.
W AD, chemicznie zmienione tau skręca się w sparowane helikalne filamenty - dwie nici tau, które są zwinięte wokół siebie. Filamenty te są główną substancją znalezioną w splątkach neurofibrylarnych. W ostatnich badaniach, naukowcy znaleźli zmiany neurofibrylarne w poniżej 6 procentach neuronów w określonej części hipokampów w mózgach zdrowych, w ponad 43 procentach tych neuronów u ludzi, którzy umarli na łagodną AD i w 71 procentach tych neuronów u ludzi, którzy umarli na ostrą AD. Gdy badano utratę neuronów, znaleziono podobną progresję. Dowody tego typu potwierdzają ideę, że tworzenie splątków i utrata neuronów postępują jednocześnie w czasie przebiegu AD (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Tauopatie i splątki
Agregowanie tau w nierozpuszczalne filamenty w neuronach i neurogleju, prowadzące do zaburzeń czynności i śmierci charakteryzuje szereg chorób neurodegeracyjnych, innych niż AD. Bardzo niedawno, szereg grup badaczy badających rodziny z różnorodnymi dziedzicznymi otępieniami innymi niż AD, znalazło pierwsze mutacje w genie tau na chromosomie 17 (Clark i wsp., 1998; Hutton i wsp., 1998; Poorkaj i wsp., 1998; Spillantini i wsp., 1998). W rodzinach tych mutacje w genie tau powodują śmierć komórek neuronów i otępienie. Zaburzenia te, mające niektóre cechy wspólne z AD lecz różniące się pod wieloma ważnymi względami, są wspólnie nazwane „otępieniem czołowo-skroniowym i parkinsonizmem sprzężonymi z chromosomem 17 (FTDP-17). Są to choroby, takie jak choroba Parkinsona, niektóre postacie stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), zwyrodnienie korowo-podstawne,
PL 204 878 B1 postępujące porażenie nadjądrowe oraz choroba Picka i wszystkie one charakteryzują się nieprawidłowym agregowaniem białka tau.
Inne choroby neurologiczne podobne do AD
Istnieją ważne analogie między AD i innymi chorobami neurologicznymi, w tym, choroby prionowe (jak kuru i choroba Creutzfelda-Jakoba oraz bydlęca encefalopatia gąbczasta), choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i otępienie czołowo-skroniowe. Wszystkie związane są ze złogami nieprawidłowych białek w mózgu. AD i choroby prionowe powodują otępienie oraz śmierć i obie są związane z tworzeniem nierozpuszczalnych włókienek amyloidowych, ale z białek błonowych, które różnią się od siebie.
Naukowcy badający chorobę Parkinsona, drugie najbardziej powszechne zaburzenie neurodegeneracyjne po AD, znaleźli pierwszy gen sprzężony z tą chorobą. Gen ten koduje białko nazwane synukleiną które, intrygująco, znaleziono także w płytkach amyloidowych z mózgów pacjentów z AD (Lavedan C, 1998, Genome Res. 8(9): 871-80). Badacze odkryli także, że defekty genetyczne w chorobie Huntingtona, innym postępującym zaburzeniu neurodegeneracyjnym powodującym otępienie, wywołuje białko Huntingtona tworzące nierozpuszczalne włókna bardzo podobne do włókienek Αβ z AD oraz włókienek białkowych w chorobie prionowej (Scherzinger E, i wsp., 1999, PNAS U.S.A. 96(8): 4604-9).
Naukowcy znaleźli także nowy gen, który, gdy jest zmutowany, odpowiada za rodzinne otępienie brytyjskie (FBD), rzadką chorobę dziedziczną wywołującą ciężkie zaburzenia ruchowe i postępujące otępienie podobne do tego widocznego w AD. W badaniu biochemicznym włókienek amyloidowych znalezionych w płytkach FBD znaleziono unikalny peptyd nazwany ABri (Vidal i wsp., 1999). Mutacja w określonym punkcie wzdłuż tego genu prowadzi do produkcji dłuższego niż normalne białka Bri. Peptyd ABri, który jest odcinany ze zmutowanego końca białka Bri, jest odkładany jako włókienka amyloidowe. Uważa się, że płytki te prowadzą do dysfunkcji neuronów i otępienia charakteryzującego FBD.
Immunizacja za pomocą Ae
Układ odpornościowy normalnie bierze udział w oczyszczaniu z obcego białka i cząstek białkopodobnych w organizmie, lecz złogi związane ze wspomnianymi powyżej chorobami składają się głównie z własnych białek, przez co rola układu odpornościowego w kontrolowaniu tych chorób jest mniej oczywista. Ponadto, złogi są umiejscowione w kompartmencie (OUN) normalnie oddzielonym od układu odpornościowego: oba fakty sugerują, że jakakolwiek szczepionka czy podejście immunoterapeutyczne mogą być niepomyślne.
Pomimo tego, naukowcy spróbowali ostatnio immunizowania myszy szczepionką składającą się z heterologicznego ludzkiego Ae i substancji, o której wiadomo, że pobudza układ odpornościowy (Schenk i wsp., 1999 i WO 99/27944). Szczepionkę testowano w częściowym modelu AD myszy transgenicznej ze zmutowanym ludzkim genem dla APP wprowadzonym do mysiego DNA. Myszy wytwarzały zmodyfikowane białko APP i rozwijały płytki amyloidowe w miarę starzenia się. Ten model mysi użyto do testowania, czy szczepienie przeciwko zmodyfikowanemu transgenicznemu ludzkiemu APP ma wpływ na budowanie płytek. W pierwszym doświadczeniu, grupie myszy transgenicznych podawano co miesiąc iniekcje szczepionki zaczynając od wieku 6 tygodni i kończąc na wieku 11 miesięcy. Druga grupa myszy transgenicznych nie otrzymała zastrzyków i stanowiła grupę kontrolną. W wieku 13 miesięcy myszy w grupie kontrolnej miały płytki pokrywające 2 do 6 procent ich mózgów. Dla kontrastu, myszy immunizowane praktycznie nie miały płytek.
W drugim doświadczeniu, badacze rozpoczęli podawanie iniekcji w wieku 11 miesięcy, kiedy niektóre płytki już były rozwinięte. Po okresie 7 miesięcy kontrolne myszy transgeniczne miały 17 razy podwyższoną liczbę płytek w swoich mózgach, podczas gdy te, które otrzymały szczepionkę, miały 99 procentowe obniżenie w porównaniu z 18 miesięcznymi kontrolnymi myszami transgenicznymi. Wydaje się, że u niektórych myszy, pewne istniejące wcześniej złogi płytek zostały usunięte przez leczenie. Stwierdzono również, że w wyniku immunizacji zmniejszyły się inne uszkodzenia towarzyszące płytkom, takie jak zapalenie i nieprawidłowe procesy komórek nerwowych.
Powyższe badanie jest badaniem wstępnym u myszy i przykładowo, naukowcy muszą stwierdzić czy szczepione myszy pozostaną zdrowe pod innymi względami oraz czy u tych zaszczepionych pozostanie normalna pamięć. Ponadto, ponieważ model mysi nie jest w pełni odwzorowaniem AD (zwierzęta nie rozwijają splątków neurofibrylarnych i nie umiera tak wiele ich neuronów), konieczne będą dodatkowe badania dla określenia, czy u ludzi występują reakcje takie same jak u myszy czy inne. Inną kwestią do rozważenia jest taka, że metoda być może może „leczyć” złogi, lecz nie hamować rozwoju otępienia.
PL 204 878 B1
Także kwestie techniczne nakładają poważne wyzwania. Przykładowo, nie rokuje nadziei, nawet gdyby było to możliwe, użycie tej technologii do wytworzenia szczepionki umożliwiającej ludziom wytwarzanie przeciwciał przeciwko ich własnym białkom. Dlatego szereg kwestii dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności trzeba będzie rozwiązać przed podjęciem jakichkolwiek testów na ludziach.
Praca Schenka i wsp. pokazuje zatem, że gdyby było możliwe wytworzenie silnej odpowiedzi odpornościowej skierowanej przeciwko własnym białkom w złogach białkopodobnych w ośrodkowym układzie nerwowym, takich jak płytki tworzone w AD, możliwe byłoby zarówno zapobieganie tworzeniu złogów jak i prawdopodobnie także usuwanie już utworzonych płytek.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków dla terapii przeciwko stanom charakteryzującym się odkładaniem amyloidu, takim jak AD. Ponadto celem jest wytworzenie autoszczepionki przeciwko amyloidowi, w celu uzyskania nowego leczenia AD i innych zaburzeń patologicznych, w których zachodzi odkładanie amyloidu.
Wynalazek obejmuje zastosowanie czynnika wybranego z:
a) co najmniej jednego zwierzęcego analogu autologicznego Αβ (beta amyloidu) albo polipeptydu APP (amyloidowego białka prekursorowego) u zwierzęcia, zmodyfikowanego przez wprowadzenie przynajmniej jednego izolowanego obcego epitopu T pomocniczego (epitop TH) na drodze insercji, addycji, delecji albo substytucji aminokwasu, przy czym obcy epitop TH jest wolny od aminokwasów-D i jest wprowadzony do autologicznego Ae lub APP jak schematycznie pokazano dla epitopów P2 i P30 na Fig. 1,
b) nukleotydowej sekwencji kodującej co najmniej jeden analog określony w a) i
c) niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego określonego w b do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania i/lub łagodzenia choroby Alzheimera lub innych chorób i stanów charakteryzujących się odkładaniem Ae u zwierzęcia.
Korzystnie w wyniku wprowadzenia obcego epitopu TH zasadnicza część epitopów komórki B Ae albo APP jest zachowana oraz,
- jest wprowadzone przynajmniej jedno pierwsze ugrupowanie, które powoduje kierowanie analogu do komórki prezentującej antygen (APC) albo do limfocytu B i/albo
- jest wprowadzone przynajmniej jedno drugie ugrupowanie, które stymuluje układ odpornościowy i/albo
- jest wprowadzone przynajmniej jedno trzecie ugrupowanie, które optymalizuje prezentowanie analogu układowi odpornościowemu.
Korzystnie analog jest modyfikowany przez wprowadzenie pierwszego i/albo drugiego i/lub trzeciego ugrupowania jako grup bocznych i przez kowalencyjne albo niekowalencyjne wiązanie z odpowiednimi grupami chemicznymi w Ae, APP albo w jego fragmencie.
Korzystnie analog zawiera podwojony co najmniej jeden epitop komórki B Ae lub APP i/lub wprowadzony hapten.
Korzystnie obcy epitop komórki T jest immunodominujący w zwierzęciu.
Korzystnie obcy epitop komórki T jest epitopem mieszanym, takim jak obcy epitop komórki T, który jest wybrany z naturalnego mieszanego epitopu komórki T oraz sztucznej sekwencji peptydu wiążącego MHC-II.
Korzystnie naturalny epitop komórki T jest wybrany spośród epitopu anatoksyny tężca, jak P2 albo P30, epitopu anatoksyny błonicy, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS z P. falciparum.
Korzystnie, pierwsze ugrupowanie, które jest wprowadzone do analogu, jest zasadniczo swoiście wiążącym partnerem dla specyficznego antygenu powierzchniowego limfocytu B albo dla specyficznego antygenu powierzchniowego APC, takiego jak hapten lub węglowodan, dla których istnieje receptor na limfocycie B lub na APC.
Korzystnie, drugie ugrupowanie jest wybrane spośród cytokin, takich jak interferon γ (IFN- γ) lub jego skuteczna część, Flt3L lub jego skuteczna część, interleukina 1 (IL-1) lub jej skuteczna część, interleukina 2 (IL-2) lub jej skuteczna część, interleukina 4 (IL-4) lub jej skuteczna część, interleukina 6 (IL-6) lub jej skuteczna część, interleukina 12 (IL-12) lub jej skuteczna część, interleukina 13 (IL-13) lub jej skuteczna część, interleukina 15 (IL-15) lub jej skuteczna część, oraz czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) lub jego skuteczna część; hormonu; oraz białek szoku cieplnego takich, jak HSP70 lub jego skuteczna część, HSP90 lub jego skuteczna część, HSC70 lub jego skuteczna część, GRP94 lub jego skuteczna część oraz kalretikulina (CRT) lub jej skuteczna część.
PL 204 878 B1
Korzystnie, trzecie ugrupowanie ma charakter lipidowy i jest takie, jak grupa palmitoilowa, grupa mirystylowa, grupa farnezylowa, grupa geranylo-geranylowa, kotwica GPI i grupa N-acylodiglicerydowa lub takie ugrupowanie jest polihydroksypolimerem, takim jak polisacharyd.
Korzystnie, autologiczny Αβ albo APP jest tak zmodyfikowany, że zachowuje epitopy komórki B, które nie są eksponowane na fazę zewnątrzkomórkową, gdy są obecne w postaci związanego z komórką autologicznego APP.
Korzystnie, Ae albo APP jest tak zmodyfikowany, że brakuje co najmniej jednego epitopu komórki B, który jest eksponowany na fazę zewnątrzkomórkową, gdy jest obecny w postaci związanego z komórką autologicznego APP.
Korzystnie, w analogu, z którego wytwarza się lek wytworzony zgodnie z zastosowaniem według wynalazku następuje substytucja przynajmniej jednej sekwencji aminokwasowej w obrębie autologicznego Ae albo APP sekwencją aminokwasową o równej lub różnej długości, która tworzy obcy epitop TH w analogu.
Korzystnie, analog obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 672-714 w SEK. NR ID.: 2, do której jest wprowadzona sekwencja aminokwasowa prowadząca do powstania obcego epitopu TH w analogu albo analog obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 672-714 w SEK. NR ID.: 2, w której przynajmniej jedna sekwencja aminokwasowa jest podstawiona sekwencją aminokwasową o równej lub różnej długości, co prowadzi do powstania obcego epitopu TH.
Korzystnie, analog od N-końca do C-końca składa się z reszt aminokwasowych 672-714 SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 4, po której następują reszty aminokwasowe 672-714 sekwencji SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 6 po których następują reszty aminokwasowe 672-714 z SEK. NR ID.: 2.
Korzystnie, analog od N-końca do C-końca składa się z reszt aminokwasowych 630-634 SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. Id. Nr: 6, po której następuje SEK. NR ID.: 4 po której następują reszty aminokwasowe 672-714 z SEK. NR ID.: 2.
Korzystnie, analog od N-końca do C-końca składa się z reszt aminokwasowych 672-713 z SEK. Id. Nr: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 6, po której następują reszty aminokwasowe 729-734 sekwencji z SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 4 po której następują reszty aminokwasowe 750-770 z SEK. NR ID.: 2.
Korzystnie, co najmniej dwie kopie analogu są kowalencyjnie lub niekowalencyjnie połączone z cząsteczką nośnika zdolną do skutecznej prezentacji wielu kopii determinant antygenowych.
Korzystnie, analog jest sformułowany z adiuwantem ułatwiającym przerwanie autotolerancji na autoantygeny.
Korzystnie, lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, zawierający skuteczną ilość analogu, jest podawany zwierzęciu na drodze wybranej spośród drogi pozajelitowej takiej jak śródskórna, podskórna i domięśniowa; dootrzewnowej; doustnej; dopoliczkowej, podjęzykowej; nadtwardówkowej; dokręgowej; doodbytniczej oraz wewnątrzczaszkowej.
Korzystnie, skuteczna ilość analogu jest w zakresie 0,5 μg - 2000 μg.
Korzystniej, analog jest zawarty w urządzeniu będącym wirtualnym węzłem chłonnym (VLN).
Korzystnie, lek jest przeznaczony do wprowadzenia kwasu(ów) nukleinowego(ych) kodującego analog do komórek zwierzęcych i tym samym uzyskania ekspresji in vivo w komórkach, do których wprowadzono kwas(y) nukleinowy(e).
Korzystnie, wprowadzany kwas(y) nukleinowy(e) jest/są wybrany(e) spośród nagiego DNA, DNA sformułowanego z lipidami z ładunkiem lub bez ładunku, DNA sformułowanego w liposomach, DNA zawartego w wektorze wirusowym, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem ułatwiającym transfekcję, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem naprowadzającym, DNA sformułowanego z czynnikami wytrącającymi wapń, DNA sprzężonego z obojętną cząsteczką nośnikową, DNA enkapsulowanego w chitynie albo chitozanie, oraz DNA sformułowanego z adiuwantem.
Bardziej korzystnie, kwas(y) nukleinowy(e) jest/są zawarty(e) w urządzeniu VLN.
Korzystnie, lek jest podawany/wprowadzany przynajmniej raz na rok, przykładowo przynajmniej 2, przynajmniej 3, przynajmniej 4, przynajmniej 6 i przynajmniej 12 podań/wprowadzeń.
Korzystnie lek do leczenia zapobiegania i/lub łagodzenia zawiera niepatogenny mikroorganizm lub wirus, który niesie fragment kwasu nukleinowego kodujący lub wyrażający analog.
W zakres wynalazku wchodzi również analog polipeptydu amyloidogennego pochodzący ze zwierzęcego Ae (beta amyloidu) albo APP (białka prekursorowego amyloidu), do którego wprowadzoPL 204 878 B1 no przynajmniej jeden izolowany obcy epitop TH jak pokazano schematycznie dla epitopów P2 i P30 na Fig. 1, w wyniku czego immunizacja zwierzęcia analogiem indukuje wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu.
Korzystnie modyfikacja jest zdefiniowana powyżej.
Wynalazek dotyczy również immunogennej kompozycji, obejmującej skuteczną immunogennie ilość analogu określonego powyżej, i farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę i ewentualnie adiuwant.
Ponadto wynalazek dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego kodującego analog według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również wektor niosący fragment kwasu nukleinowego według wynalazku zdolny do autonomicznej replikacji.
Korzystnie, wektor jest wybrany z grupy składającej się z plazmidu, faga, kosmidu, minichromosomu i wirusa.
Korzystnie wektor obejmuje, w kierunku 5' >3' funkcjonalnie połączone, promotor kierujący ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający wydzielanie lub integrację z błoną fragmentu polipeptydu, fragment kwasu nukleinowego według wynalazku i ewentualnie terminator.
Korzystnie, wektor wprowadzony do komórki gospodarza jest zdolny lub niezdolny do integracji z genomem komórki gospodarza, a promotor kieruje ekspresją w komórce eukariotycznej i/albo w komórce prokariotycznej.
Wynalazek dotyczy również stransformowanej komórki niosącej wektor według wynalazku, która jest zdolna do replikacji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku.
Korzystnie, stransformowana komórka jest mikroorganizmem wybranym z bakterii, drożdży, protozoa albo jest komórką pochodzącą z organizmu wielokomórkowego wybraną spośród komórki grzyba, komórki owadziej takiej, jak komórka S2 lub SF, komórki roślinnej i komórki ssaka.
Korzystnie, stransformowana komórka wyraża fragment kwasu nukleinowego według wynalazku, i jest taka jak stransformowana komórka, która wydziela lub niesie na swojej powierzchni analog według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał skierowanych przeciwko Ae albo APP u zwierzęcia obejmująca:
- fragment kwasu nukleinowego według wynalazku albo wektor według wynalazku oraz
- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/albo zaróbkę i/lub adiuwant.
Wynalazek dotyczy ponadto stabilnej linii komórkowej niosącej wektor według wynalazku i wyrażającej fragment kwasu nukleinowego według wynalazku i ewentualnie wydzielającej lub niosącej na swojej powierzchni analog według wynalazku.
Poniżej opisane jest wykorzystanie technologii autoszczepienia w celu wytworzenia silnej odpowiedzi odpornościowej przeciwko skądinąd nie immunogennym własnym białkom, zawartym w związanych z patologią złogach amyloidowych. Tym samym, wytwarzana jest silna odpowiedź odpornościowa przeciwko albo amyloidowi, przeciwko jednej lub większej liczbie komponent znajdujących się w złogach albo przeciwko jednemu lub większej liczbie białek odpowiedzialnych za tworzenie amyloidu. Także opisano wytwarzanie takich szczepionek do zapobiegania, leczenia i łagodzenia objawów takich chorób związanych ze złogami amyloidowymi.
Opis rysunków
Fig. 1: Schematyczne przedstawienie wariantów Autovac otrzymanych z białka prekursorowego amyloidu w celu wytworzenia odpowiedzi przeciwciała przeciwko białku Ae, Ae-43 (lub C-100). APP przedstawiono schematycznie na górze figury, pozostałe schematyczne konstrukty pokazują, że modelowe epitopy P2 i P30 są podstawiane lub wprowadzone do różnych obciętych form APP. Na figurze, czarny wzór wskazuje sygnałową sekwencję z APP, dwukierunkowe kreskowanie przekroju jest zewnątrzkomórkową częścią APP, ciemne pionowe kreskowanie jest transbłonową domeną APP, jasne pionowe kreskowanie jest wewnątrzkomórkową domeną APP, grube kreskowanie wskazuje epitop P30, a cienkie kreskowanie wskazuje epitop P2. Ramka o linii ciągłej wskazuje Ae-42/43, a ramka o linii ciągłej i ramka o kropkowanej linii razem wskazują C-100. „Abeta” oznacza Ae.
Definicje
Poniżej zostaną zdefiniowane i wyjaśnione w szczegółach liczne terminy stosowane w niniejszym opisie i w zastrzeżeniach, w celu wyraźnego określenia zakresu wynalazku.
Terminy „amyloid” i „białko amyloidowe”, które są tu stosowane wymiennie, oznaczają klasę nierozgałęzionych włókien białkopodobnych o nieokreślonej długości. Włókna amyloidowe wykazują
PL 204 878 B1 charakterystyczne barwienie czerwienią Kongo i mają wspólną strukturę krzyża β, w której łańcuch polipeptydowy jest zorganizowany w harmonijki-β. Amyloid zasadniczo pochodzi z białek amyloidogennych, które mają bardzo różne struktury prekursorowi, lecz z których wszystkie przechodzą przekształcenie strukturalne do nieprawidłowo sfałdowanej postaci, która jest budulcem protofilamentu helisy harmonijki β. Normalnie, średnica włókien amyloidowych waha się pomiędzy 0,007 μm a 0,012 μm.
Termin „białko amyloidogenne” ma określać polipeptyd, który jest włączony w tworzenie złogów amyloidowych, albo będąc częścią złogów jako takich albo będąc częścią szlaku biosyntetycznego prowadzącego do tworzenia złogów. Stąd, przykładami białek amyloidogennych są APP i Ae, ale również białka zaangażowane w ich metabolizm mogą być białkami amyloidogennymi. Wiele polipeptydów amyloidogennych jest tu szczegółowo omówionych.
„Polipeptyd amyloidowy” ma tu określać polipeptydy obejmujące sekwencję aminokwasową z omawianych powyżej białek amyloidogennych pochodzących od ludzi lub innych ssaków (lub ich postaci obciętych mających wspólną zasadniczą ilość epitopów dla komórki B z nienaruszonym białkiem amyloidogennym) - zatem polipeptyd amyloidogenny może np. obejmować zasadnicze części prekursora dla polipeptydu amyloidogennego (w przypadku Ae, jeden możliwy polipeptyd amyloidowy mógłby pochodzić od APP). W granicach tego terminu zawarte są także nie glikozylowane postacie polipeptydów amyloidogennych, które są wytwarzane w systemie prokariotycznym, jak również w granicach tego określenia są postacie o zmiennych wzorach glikozylacji ze względu na zastosowanie np. drożdżowych lub niessaczych eukariotycznych systemów ekspresji. Należy, jednakże, zaznaczyć, że użycie terminu „polipeptyd amyloidogenny” ma na celu określenie, że polipeptyd, o którym mowa, jest normalnie nieimmunogenny, gdy jest prezentowany zwierzęciu, które ma być leczone. Innymi słowy, polipeptyd amyloidogenny jest własnym białkiem lub jest analogiem takiego własnego białka, które nie będzie normalnie dawało odpowiedzi odpornościowej przeciwko amyloidogennemu polipeptydowi zwierzęcia, o którym mowa.
„Analog polipeptydu amyloidogennego” jest polipeptydem amyloidogennym, który poddano zmianom w jego strukturze pierwszorzędowej. Zmiana taka może być np. w postaci fuzji polipeptydu amyloidowego z odpowiednim partnerem fuzyjnym (tj. zmiana w strukturze pierwszorzędowej wyłącznie obejmują addycję reszt aminokwasowych na końcu C- i/lub N) i/lub może to być zmiana w postaci insercji i/lub delecji i/lub substytucji w sekwencji aminokwasowej polipeptydu amyloidogennego. Terminem tym objęte są także derywatyzowane cząsteczki amyloidogenne, porównaj dyskusja o modyfikacjach polipeptydów amyloidogennych, poniżej. W przypadku, gdy polipeptydem amyloidogennym jest amyloid lub jego prekursor, analog można tak skonstruować, aby był mniej zdolny lub nawet niezdolny do wywołania przeciwciał przeciwko normalnemu białku(kom) prekursorowemu amyloidu, w ten sposób unikając niepożądanego oddziaływania z (normalną fizjologicznie) niezagregowaną postacią polipeptydu będącego prekursorem białka amyloidowego.
Należy zauważyć, że można sobie wyobrazić użycie jako szczepionki u ludzi kseno-analogu (np. analogu psiego lub świńskiego) ludzkiego polipeptydu amyloidogennego do wytwarzania pożądanej odporności przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu. Takie użycie kseno-analogu do immunizacji jest także rozważaną w niniejszym wynalazku.
Termin „polipeptyd” w obecnym kontekście określa zarówno krótkie peptydy z 2 do 10 resztami aminokwasowymi, oligopeptydy zawierające 11 do 100 reszt aminokwasowych i polipeptydy zawierające powyżej 100 reszt aminokwasowych. Ponadto, termin obejmuje objęcie też białka, tzn. funkcjonalne biocząsteczki obejmujące przynajmniej jeden polipeptyd; gdy obejmują przynajmniej dwa polipeptydy, mogą one tworzyć kompleksy, mogą być połączone kowalencyjnie, lub mogą być połączone niekowalencyjnie. Polipeptyd(y) w białku może być glikozylowany i/lub lipidowany i/lub może obejmować grupy prostetyczne.
Terminy „limfocyt T” i „komórka T” są stosowane wymiennie dla limfocytów pochodzenia grasiczego, które są odpowiedzialne za różne odpowiedzi odpornościowe, w których pośredniczą komórki, jak również dla aktywności pomocniczej w humoralnej odpowiedzi odpornościowej. Podobnie, terminy „limfocyt B” i „komórka B”, będą stosowane wymiennie dla limfocytów produkujących przeciwciała.
Termin „subsekwencja” oznacza dowolny nie-przerwany ciąg przynajmniej 3 aminokwasów lub, odpowiednio, przynajmniej 3 nukleotydów, pochodzący, bezpośrednio z naturalnie występującej amyloidowej sekwencji aminokwasowej lub z sekwencji kwasu nukleinowego.
Termin „zwierzę” w obecnym kontekście ma ogólnie określać gatunki zwierząt (korzystnie ssaka), takie jak Homo sapiens, Canis domesticus, itp., a nie tylko pojedyncze zwierzę. Chociaż termin określa także populację takich gatunków zwierząt, ponieważ ważne jest aby wszystkie osobniki
PL 204 878 B1 immunizowane niosły zasadniczo ten sam polipeptyd amyloidogenny pozwalający na immunizację zwierząt tym samym immunogenem(ami). Jeśli dla przykładu, w różnych ludzkich populacjach istnieją odmiany genetyczne amyloidogenno polipeptydu może być konieczne użycie różnych immunogenów w tych różnych populacjach można było przerwać autotolerancję na polipeptyd amyloidogenny w każdej populacji w optymalny sposób. Będzie jasne dla specjalisty, że zwierzę w obecnym kontekście jest istotą żywą, która ma układ odpornościowy. Korzystne jest, jeśli zwierzę jest kręgowcem, takim jak ssak.
Przez termin „obniżanie poziomu amyloidu in vivo” rozumie się zmniejszenie w żyjącym organizmie całkowitej ilości odłożonego amyloidu stosownego typu. Obniżenie poziomu można uzyskać za pomocą kilku mechanizmów: najprostszym z nich jest proste oddziaływanie z amyloidem przez wiązanie przeciwciała, tak aby zapobiec nieprawidłowej agregacji. W wyniku związania przeciwciała może też następować usunięcie amyloidu przez komórki oczyszczające (jak makrofagi i inne komórki fagocytujące) i przeciwciała oddziałują z innymi polipeptydami amyloidogennymi, które prowadzą do tworzenia amyloidu.
Wyrażenie „skuteczna prezentacja ... układowi odpornościowemu” ma na celu określenie, że układ odpornościowy zwierzęcia jest wystawiony na wyzwanie immunogenu w sposób kontrolowany.
Jak będzie to zrozumiałe z ujawnienia poniżej, na takie wyzwanie układu odpornościowego można wpływać różnymi drogami, z których najważniejszą jest szczepienie polipeptydem zawierającym „farmacyny” (tj. szczepionką, która jest podawana w celu leczenia lub łagodzenia trwającej choroby) i szczepienie „farmacyną” kwasu nukleinowego. Ważne jest osiągnięcie takiego wyniku aby komórki kompetentne immunologicznie u zwierzęcia były skonfrontowane z antygenem w sposób skuteczny immunologicznie, natomiast dokładny sposób osiągnięcia tego wyniku jest mniej istotny dla wynalazczej idei stanowiącej podstawę niniejszego wynalazku.
Termin „immunogennie skuteczna ilość” ma swoje typowe znaczenie w dziedzinie, tj. oznacza ilość immunogenu, która jest zdolna do zaindukowania odpowiedzi odpornościowej, która znacząco angażuje czynniki patogenne mające wspólne z immunogenem cechy immunologiczne.
Gdy stosuje się wyrażenie, że polipeptyd amyloidogenny został „zmodyfikowany” to oznacza tu chemiczną modyfikację polipeptydu, stanowiącego szkielet polipeptydu amyloidogennego. Modyfikacją taką może być np. derywatyzacja (np. alkilacja) pewnych reszt aminokwasowych w sekwencji polipeptydu amyloidogennego, lecz jak będzie wynikało z ujawnienia poniżej, korzystne modyfikacje obejmują zmiany struktury pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej.
Omawiana „autotolerancja na polipeptyd amyloidogenny” jest rozumiana tak, że ponieważ polipeptyd amyloidogenny jest własnym białkiem w populacji do szczepienia, normalne osobniki w populacji nie wytworzą odpowiedzi odpornościowej przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu; chociaż nie można wykluczyć, że sporadyczne osobniki w populacji zwierzęcej mogą być zdolne do wytwarzania przeciwciał przeciwko natywnemu polipeptydowi amyloidogennemu, np. jako część zaburzenia autoodpornościowego. W każdym razie, zwierzę będzie normalnie jedynie autotolerancyjne w stosunku do własnego polipeptydu amyloidogennego, lecz nie można wykluczyć, że analogi pochodzące od innych gatunków zwierząt lub innej populacji mającej inny fenotyp, będą także tolerowane przez omawiane zwierzę.
„Obcy epitop komórki T” (lub „obcy epitop dla limfocytu T”) jest peptydem, który jest zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC i który stymuluje komórki T w gatunku zwierzęcia. Korzystnymi obcymi epitopami komórki T w zastosowaniach według wynalazku są epitopy „mieszane” tzn. epitopy, które wiążą się z konkretną frakcją określonej klasy cząsteczek MHC w gatunku zwierzęcym lub w populacji. Znana jest bardzo ograniczona liczba takich mieszanych epitopów komórki T i zostaną one omówione szczegółowo poniżej. Mieszane epitopy komórki T są także określane jako „uniwersalne” epitopy komórki T. Należy zauważyć, że aby immunogeny, które są wykorzystane zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, były skuteczne w możliwie dużej frakcji populacji zwierzęcej, może być konieczne 1) wstawienie kilku obcych epitopów dla komórki T do tego samego analogu lub 2) wytworzenie kilku analogów, gdzie każdy analog ma wstawiony inny epitop mieszany. Należy także zauważyć, że koncepcja obcych epitopów dla komórki T obejmuje także użycie kryptycznych epitopów dla komórki T, tzn. epitopów, które pochodzą z własnego białka, i które wykazują immunogenne zachowanie jedynie, gdy istnieją w formie wyizolowanej nie będąc częścią wspomnianego własnego białka.
„Obcy epitop dla limfocytu T pomocniczego” (obcy epitop TH) jest obcym epitopem dla komórki T, który wiąże się z cząsteczką MHC klasy II i może być prezentowany na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC) związanej z cząsteczką MHC klasy II.
PL 204 878 B1 „Funkcjonalna część” (bio)cząsteczki w obecnym kontekście określa część cząsteczki, która jest odpowiedzialna za przynajmniej jedno działanie biochemiczne lub fizjologiczne wywierane przez cząsteczkę. Jest dobrze znane w dziedzinie, że wiele enzymów i innych cząsteczek efektorowych posiada aktywne miejsce, które jest odpowiedzialne za działania wywierane przez wspomnianą cząsteczkę. Inne części cząsteczki mogą służyć celom wzmocnienia stabilizacji lub solubilizacji, a zatem mogą być odrzucone, o ile takie cele nie są istotne w kontekście określonego wykonania niniejszego wynalazku. Na przykład, możliwe jest użycie pewnych cytokin jako cząstek modyfikujących w polipeptydzie amyloidogennym (porównaj szczegółowa dyskusja poniżej) i w takim przypadku, uzyskanie stabilności może nie być wymagane, ponieważ sprzężenie z polipeptydem amyloidogennym może zapewniać konieczną stabilność.
Termin „adiuwant” ma swoje typowe znaczenie w dziedzinie technologii szczepionek, tj. jest to substancja lub kompozycja substancji, która 1) sama nie jest zdolna do wywoływania swoistej odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi szczepionki, lecz która 2) niemniej jednak jest zdolna do wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi. Lub, innymi słowy, szczepienie samym adiuwantem nie dostarcza odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi, szczepienie immunogenem może lub nie, dawać podniesienie odpowiedzi odpornościowej przeciwko immunogenowi, lecz połączone szczepienie immunogenem i adiuwantem indukuje odpowiedź odpornościową przeciwko immunogenowi, która jest silniejsza od tej indukowanej przez sam immunogen.
„Kierowanie” cząsteczki ma na celu w niniejszym kontekście określenie sytuacji, gdzie cząsteczka wprowadzana do zwierzęcia będzie pojawiała się w określonej tkance(ach) lub będzie korzystnie wiązać się z pewnymi komórkami lub typami komórek. Wynik taki można osiągnąć wieloma drogami obejmującymi formułowanie cząsteczki w kompozycji ułatwiającej kierowanie lub przez wprowadzenie do cząsteczki grup ułatwiających kierowanie. Takie rozwiązania będą szczegółowo omówione poniżej.
„Stymulacja układu odpornościowego” oznacza, że substancja lub kompozycja substancji wykazuje zasadniczo nie swoiste działanie immunostymulujące. Szereg adiuwantów i przypuszczalnych adiuwantów (jak pewne cytokiny) ma wspólną zdolność stymulowania układu odpornościowego. W wyniku uż ycia czynnika immunostymulują cego podniesiona zostaje „czujność” ukł adu odpornościowego, co oznacza, że jednoczesna lub późniejsza immunizacja immunogenem indukuje znacząco bardziej skuteczną odpowiedź immunologiczną w porównaniu z oddzielnym użyciem immunogenu.
Korzystne wykonania obniżania poziomu amyloidu
Polipeptyd amyloidogenny stosowany jako immunogen w zastosowaniu według wynalazku jest zmodyfikowaną cząsteczką, w której obecna jest przynajmniej jedna zmiana w sekwencji aminokwasowej polipeptydu amyloidogennego, ponieważ zmiany dające wszystkie ważne przełamania autotoleracji w stosunku do polipeptydu amyloidogennego są tą drogą ułatwione jest to np. oczywiste w świetle wyników przedstawionych tu w przykładzie 2, gdzie immunizacja za pomocą Αβ typu dzikiego jest porównana z immunizacją za pomocą cząsteczki będącej wariantem Ae. Należy zauważyć, że zastosowanie zmodyfikowanej cząsteczki nie wyklucza możliwości użycia takiego zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego w preparatach, które dodatkowo ułatwiają przełamanie autotolerancji przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu, np. w preparatach zawierających adiuwanty.
Wykazano (w Dalum I i wsp., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), że potencjalnie samoreaktywne limfocyty B rozpoznające własne białka są obecne fizjologicznie u zdrowych osobników. Jednakże w celu zaindukowania tych limfocytów B do faktycznej produkcji przeciwciał reagujących ze stosownymi własnymi białkami wymagana jest pomoc limfocytów T pomocniczych produkujących cytokinę (komórki TH lub limfocyty TH). Normalnie pomoc ta nie jest dostarczana, ponieważ limfocyty T generalnie nie rozpoznają epitopów dla komórki T pochodzących z własnych białek, gdy są prezentowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Jednakże, przez wprowadzenie elementu „obcości” do własnego białka (tzn. przez wprowadzenie immunologicznie znaczącej modyfikacji), aktywowane są komórki T rozpoznające obcy element po rozpoznaniu obcego epitopu na APC (takiej jak, wstępnie, komórka monojądzrasta). Limfocyty B poliklonalne (które także są APC) zdolne do rozpoznawania własnych epitopów na zmodyfikowanym własnym białku także internalizują antygen, a następnie prezentują jego obcy epitop(y) dla komórki T i aktywowane limfocyty T dostarczają następnie pomocy w postaci cytokiny tym samoreaktywnym poliklonalnym limfocytom B. Ponieważ przeciwciała produkowane przez te poliklonalne limfocyty B reagują z różnymi epitopami na zmodyfikowanym polipeptydzie, w tym z tymi, które są także obecne w natywnym polipeptydzie, indukowane jest przeciwciało reagujące krzyżowo z niezmodyfikowanym własnym białkiem. Podsumowując, można tak pokierować
PL 204 878 B1 działaniem limfocytów T, aby populacja poliklonalnych limfocytów B rozpoznawała zupełnie obcy antygen, podczas gdy faktycznie jedynie wprowadzony epitop(y) jest/są obcy(e) dla gospodarza. W ten sposób indukowane są przeciwciała zdolne do reakcji krzyżowej z niezmodyfikowanymi własnymi antygenami.
Specjalistom znane są liczne sposoby modyfikujące własny antygen peptydowy w celu uzyskania przerwania autotolerancji. Zatem, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, modyfikacje obejmują:
- wprowadzenie przynajmniej jednegon obcego epitopu dla komórki T i ewentualnie
- wprowadzenie przynajmniej jednego pierwszego ugrupowania, które wpływa na kierowanie zmodyfikowanej cząsteczki do komórki prezentującej antygen (APC) i ewentualnie
- wprowadzenia przynajmniej jednego drugiego ugrupowania, które stymuluje układ odpornościowy i ewentualnie
- wprowadzenie przynajmniej jednego trzeciego ugrupowania, które optymalizuje prezentację zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego układowi odpornościowemu.
Jednakże wszystkie te modyfikacje powinny być przeprowadzone z utrzymywaniem konkretnej frakcji pierwotnych epitopów dla limfocytu B w polipeptydzie amyloidogennym, ponieważ dzięki temu wzmocnione jest rozpoznawanie przez limfocyt B natywnej cząsteczki.
W korzystnym wykonaniu, grupy boczne (w formie obcych epitopów dla komórki T lub wspomnianych powyżej ugrupowań pierwszego, drugiego i trzeciego) są wprowadzone kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Oznacza to, że ciągi reszt aminokwasowych pochodzące z polipeptydu amyloidogennego są derywatyzowane bez zmiany pierwotnej sekwencji aminokwasowej, lub przynajmniej bez wprowadzania zmian w wiązaniach peptydowych pomiędzy poszczególnymi aminokwasami w łańcuchu.
Alternatywnie, i korzystnie, w wykonaniu wykorzystuje się substytucję aminokwasową i/lub delecję, i/lub inercję, i/lub addycję (które można uzyskać sposobami rekombinacji lub sposobami syntezy peptydu; modyfikacje dotyczące dłuższych ciągów aminokwasowych mogą prowadzić do powstania fuzji polipeptydowych). Jedną szczególnie korzystną wersją wykonania jest technika opisana w WO 95/05849, która ujawnia sposób obniżania poziomu własnych białek przez immunizowanie analogami własnych białek, przy czym kilka sekwencji aminokwasowych podstawiono odpowiednią liczbą sekwencji aminokwasowych, z których każda obejmująe obcy immunodominujący epitop dla komórki T, utrzymując w tym samym czasie ogólną strukturę trzeciorzędową własnego białka w analogu. Dla celów niniejszego wynalazku jest jednakże wystarczające, jeśli modyfikacja (niech to będzie insercja, addycja, delecja czy substytucja) prowadzi do powstania obcego epitopu dla komórki T i w tym samym czasie zachowuje zasadniczą ilość epitopów dla komórki B w polipeptydzie amyloidogennym. Jednakże w celu uzyskania maksymalnej skuteczności wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej korzystne jest utrzymanie ogólnej struktury trzeciorzędowej amyloidogennego polipeptydu w zmodyfikowanej cząsteczce. Następujący wzór opisuje konstrukty molekularne:
(MOD1)si (amyloidei)ni (MOD2)s2(amyloide2)n2. „.MODx)sx(amyloidex)nx (I) gdzie amyloide1-amyloidex są x epitopem dla komórek B zawierającym sekwencje polipeptydu amyloidogennego, które niezależnie są identyczne lub nie i które mogą lub nie zawierać obce grupy boczne, x jest liczbą całkowitą > 3, n1-nx są x liczb całkowitych > 0 (co najmniej jedna jest > 1), MOD1-MODx jest to x modyfikacji wprowadzonych między zachowanymi epitopami dla komórki B, a s1-sx są x liczb całkowitych > 0 (co najmniej jedna jest > 1 jeśli nie są wprowadzone grupy boczne do sekwencji amyloiduex). Zatem mając dane ogólne funkcjonalne ograniczenia dla immunogenności konstruktów, wynalazek pozwala na różnego rodzaju permutacje oryginalnej sekwencji polipeptydu amyloidogennego i rodzaje jego modyfikacji. Zatem, wynalazek obejmuje zmodyfikowane polipeptydy amyloidogenne wytworzone przez pominięcie części sekwencji polipeptydu amyloidogennego np. wykazujących przeciwne skutki in vivo lub pominięcie części, które są normalnie wewnątrzkomórkowe i tym samym mogą prowadzić do powstania niepożądanych reakcji immunologicznych.
Jedną korzystną wersją konstruktów opisanych powyżej są, gdy ma to zastosowanie, te, gdzie epitop dla komórki B zawierający subsekwencję białka amyloidowego nie jest eksponowany zewnątrzkomórkowo w polipeptydzie prekursorowym, z którego pochodzi amyloid. Wybór takich epitopów amyloidowych zapewnia, że nie są wytwarzane przeciwciała, które mogłyby oddziaływać z komórkami produkującymi prekursor amyloidowy, a tym samym odpowiedź odpornościowa, która jest wytwarzana, jest ograniczona do odpowiedzi odpornościowej przeciwko niepożądanym złogom amyloidowym. Podobnego wyboru można dokonać, gdy ma to zastosowanie, dla innych niż amyloid polipeptydów amyloidogennych. W tych przypadkach będzie, np. możliwe zaindukowanie odpowiedzi przeciwko
PL 204 878 B1 tylko tym epitopom polipeptydu amyloidogennego, które są eksponowane na fazę zewnątrzkomórkową, gdy są wolne od jakiegokolwiek sprzężenia z komórkami, w których są produkowane.
Utrzymanie konkretnej frakcji epitopów dla komórki B, czy nawet ogólnej struktury trzeciorzędowej białka, które jest poddane modyfikacji jak tu opisano, można osiągnąć wieloma drogami. Jedną jest poprostu łatwą jest przygotowanie poliklonalnej surowicy odpornościowej skierowanej przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu (np. surowica odpornościowa wytworzona w króliku), a następnie wykorzystanie tej surowicy odpornościowej jako czynnika testującego (np. w kompetycyjnym teście ELISA) przeciwko zmodyfikowanym białkom, które są produkowane. Zmodyfikowane wersje (analogi), które reagują w takim samym stopniu z surowicą odpornościową jak polipeptyd amyloidogenny trzeba uważać za mające taką samą ogólną strukturę trzeciorzędową jak polipeptyd amyloidogenny, podczas gdy analogi wykazujące ograniczoną (lecz ciągle znaczącą i swoistą) reaktywność z taką surowicą odpornościową są uważane za utrzymujące znaczną frakcję oryginalnych epitopów dla komórek B.
Alternatywnie, selekcję przeciwciał monoklonalnych reagujących z różnymi epitopami na polipeptydzie amyloidogennym można przygotować i użyć w postaci panelu testowego. Podejście to ma tę zaletę, że pozwala na 1) mapowanie epitopów polipeptydu amyloidogennego i 2) mapowanie epitopów, które są utrzymywane w przygotowanych analogach.
Oczywiście, trzecim podejściem byłoby poznanie trójwymiarowej struktury polipeptydu amyloidogennego lub jego biologicznie aktywnej obciętej postaci (porównaj powyżej) i porównanie jej z poznaną trójwymiarową strukturą przygotowanych analogów. Strukturę trójwymiarową można poznać za pomocą badań dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i spektroskopii NMR. Dodatkowe informacje dotyczące struktury trzeciorzędowej można do pewnego stopnia uzyskać z badań nad dichroizmem kołowym, który ma tę zaletę, że wymaga jedynie polipeptydu w czystej formie (podczas gdy dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego wymaga dostarczenia skrystalizowanego polipeptydu, a NMR wymaga dostarczenia izotopowych wariantów polipeptydu) w celu uzyskania przydatnych informacji o strukturze trzeciorzędowej danej cząsteczki. Jednakże, w końcu dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego i/lub NMR są konieczne do uzyskania roztrzygających danych, podczas gdy dichroizm kołowy dostarcza tylko pośredniego dowodu poprawnej struktury trójwymiarowej przez informację o elementach struktury drugorzędowej.
Korzystnie wykorzystuje się wielokrotne prezentacje epitopów dla limfocytu B z polipeptydu amyloidogennego (tj. wzór I, gdzie co najmniej jeden epitop dla komórki B jest obecny w dwóch pozycjach). Wynik taki można osiągnąć różnymi drogami, np. przez proste wytworzenie fuzji polipeptydowej obejmującej strukturę (polipeptyd amyloidogenny)m, gdzie m jest liczbą całkowitą > 2, a następnie wprowadzenie modyfikacji tu omówionych do przynajmniej jednej sekwencji amyloidowej. Korzystnie, jeśli wprowadzone modyfikacje obejmują przynajmniej jedną duplikację epitopu dla limfocytu B i/lub wprowadzenie haptenu. Wykonania obejmujące wielokrotne prezentacje wybranych epitopów są szczególnie korzystne w sytuacjach, gdzie jedynie mniejsze części polipeptydu amyloidogennego są przydatne jako składniki w czynniku szczepionkowym.
Jak wspomniano powyżej wprowadzenie obcego epitopu dla komórki T można osiągnąć przez wprowadzenie przynajmniej jedno-aminokwasowej insercji, addycji, delecji czy substytucji. Oczywiście normalną sytuacją będzie wprowadzenie więcej niż jednej zmiany do sekwencji aminokwasowej (np. insercja lub substytucja całego epitopu dla komórki T) lecz ważnym celem do osiągnięcia jest to, aby analog, po obróbce przez komórkę prezentującą antygen (APC) prowadził do powstania obcego immunodominującego epitopu dla komórki T prezentowanego w kontekście cząsteczki MHC klasy II na powierzchni APC. Zatem, jeśli sekwencja aminokwasowa polipeptydu amyloidogennego w odpowiednich pozycjach obejmuje szereg reszt aminokwasowych, które można także znaleźć w obcym epitopie TH, to wprowadzenie obcego epitopu TH można osiągnąć przez dostarczenie pozostałych aminokwasów obcego epitopu przez insercję, addycję, delecję i substytucję aminokwasową. Innymi słowy, nie jest konieczne wprowadzanie całego epitopu TH przez insercję lub substytucję dla spełnienia celu niniejszego wynalazku.
Korzystnie liczba aminokwasowych insercji, delecji, substytucji lub addycji wynosi przynajmniej 2 tak jak 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercji, substytucji, addycji lub delecji. Ponadto, korzystnie liczba aminokwasowych insercji, substytucji, addycji lub delecji nie przekracza 150, tak jak najwyżej 100, najwyżej 90, najwyżej 80 i najwyżej 70. Szczególnie korzystnie liczba substytucji, insercji, delecji lub addycji nie przekracza 60, a w szczególności liczba nie powinna przekraczać 50, a nawet 40. Najkorzystniejsza jest liczba nie większa niż 30. W odniesieniu do addycji
PL 204 878 B1 aminokwasowych, należy zauważyć że te, gdzie uzyskany konstrukt występuje w formie fuzji polipeptydowej, są często większe niż 150.
Korzystnie modyfikacje wprowadzenie przynajmniej jednego obcego, immunodominującego epitopu dla komórki T. Będzie zrozumiałe, że kwestia immunodominacji epitopu dla komórki T zależy od gatunku zwierzęcia, o którym mowa. Użyty tu termin „immunodominacja” odnosi się po prostu do epitopów, które w szczepionych osobnikach/populacjach prowadzą do powstania znaczącej odpowiedzi odpornościowej, lecz jest dobrze znany fakt, że epitop dla komórki T, który jest immunodominujący w jednym osobniku/populacji, nie jest koniecznie immunodominujący w innym osobniku tego samego gatunku, nawet jeśli jest w stanie wiązać cząsteczki MHC-II w tym osobniku. Zatem, dla celów niniejszego wynalazku, immunodominujący epitop dla komórki T jest epitopem dla komórki T, który będzie skuteczny w pomaganiu komórce T, gdy jest obecny w antygenie. Zazwyczaj, nieodłączną właściwością immunodominującą epitopów dla komórki T jest to, że zasadniczo zawsze są prezentowane jako związane z cząsteczką MHC klasy II, niezależnie od polipeptydu, na którym występują.
Innym ważnym punktem jest kwestia ograniczenia MHC dla epitopów dla komórki T. Zazwyczaj, naturalnie występujące epitopy dla komórki T są ograniczone do MHC, tj. pewne peptydy tworzące epitop dla komórki T będą tylko wiązać się skutecznie z podzbiorem cząsteczek MHC klasy II. To z kolei ma wpływ na to, że w większości przypadków użycie jednego swoistego epitopu dla komórki T będzie dawało w szczepionce składnik, który jest skuteczny tylko w części populacji i zależnie od rozmiaru takiej frakcji, może być konieczne włączenie większej liczby epitopów dla komórki T do tej samej cząsteczki lub alternatywnie przygotowanie wieloskładnikowej szczepionki, gdzie składniki są wariantami polipeptydu amyloidogennego, które różnią się między sobą charakterem wprowadzonych epitopów dla komórki T.
Jeśli ograniczenie MHC dla użytych komórek T jest całkowicie nieznane (przykładowo w sytuacji, gdzie zaszczepione zwierzę ma słabo zdefiniowany skład MHC), część populacji pokryta przez swoistą kompozycję szczepionkową może być określona za pomocą następującego wzoru:
n fpopulacji = 1 -Π(1 - Pi ) (II) i =1
- gdzie pi oznacza częstość odpowiedzi w populacji na i-ty obcy epitop dla komórki T obecny w kompozycji szczepionkowej, a n jest całkowitą liczbą obcych epitopów dla komórek T w kompozycji szczepionkowej. Zatem, kompozycja szczepionkowa zawierająca 3 obce epitopy dla komórki T, o częstości odpowiedzi w populacji odpowiednio 0,8, 0,7 i 0,6 dałaby
- 0,2 x 0,3 x 0,4 - 0, 976
- tj. 97,6 procent populacji będzie statystycznie dawać odpowiedź na szczepionkę za pośrednictwem MHC-II.
Powyższy wzór nie ma zastosowania w sytuacjach, gdzie znany jest mniej lub bardziej dokładny wzór ograniczenia MHC. Jeśli, na przykład, pewien peptyd wiąże się jedynie z ludzkimi cząsteczkami MHC-II kodowanymi przez allele HLA-DR-DR1, DR3, DR5 i DR7, to zastosowanie tego peptydu razem z innym peptydem, który wiąże się z pozostałymi cząsteczkami MHC-II kodowanymi przez allele HLA-DR będzie dawało 100% pokrycie w populacji, o której mowa. Podobnie, jeśli drugi peptyd wiąże się jedynie z DR3 i DR5, dodanie tego peptydu wcale nie zwiększy pokrycia. Jeśli jedyną podstawą obliczania odpowiedzi populacji jest wyłącznie ograniczenie MHC dla epitopów dla komórki T w szczepionce, część populacji pokrytej swoistą kompozycją szczepionkową może być określona za pomocą następującego wzoru:
fpopulacji = 1-Π(1-Κ>2 (III) j=1 gdzie φ] oznacza sumę częstości w populacji haplotypów allelicznych kodujących cząsteczki MHC, które wiążą się z dowolnymi epitopami dla komórki T w szczepionce i które należą do j-tych z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ); w praktyce najpierw określa się, które cząsteczki MHC będą rozpoznawały każdy epitop dla komórki T w szczepionce, a następnie przypisuje się je typowi (DP, DR i DQ) następnie, poszczególne częstości różnie przypisanych allelicznych haplotypów są sumowane dla każdego typu, dając tym samym φ1, φ2 i φ3.
PL 204 878 B1
Może się zdarzyć, że wartość pi we wzorze II przewyższa teoretyczną wartość pi:
32 π i = 1-Π(1-ν j) (IV) j=1 gdzie Vj jest sumą częstości w populacji haplotypów allelicznych kodujących cząsteczki MHC, które wiążą się z i-tym epitopem dla komórki T w szczepionce i które należą do j-tych z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ). Oznacza to, że 1-pi populacje jest częstością respondentów dla fpozostałych-i = (pi-pi)/(1-pi). Zatem, wzór III można tak dostosować,tak aby dał wzór V:
fpopulacji = 1-n(1-^j) +ί1-Π(1-fpozostało i)] (V j=1 k i=1 J
- gdzie składnik 1^ozosiaych-ii jest ustalony jako zero, jeśli jest ujemny. Należy zauważyć, że wzór V wymaga aby wszystkie epitopy były zmapowane haplotypowo przeciwko identycznym zestawom haplotypów.
Zatem, przy wyborze epitopów dla komórki T, które mają być wprowadzone do analogu ważne jest zawarcie całej dostępnej wiedzy o epitopach: 1) częstości respondentów dla każdego epitopu w populacji, 2) danych o ograniczeniu MHC oraz 3) częstości stosownych haplotypów w populacji.
Istnieje szereg naturalnie występujących „mieszanych” epitopów dla komórki T, które są aktywne u dużej części osobników gatunków zwierzęcych lub populacji zwierzęcych i te są korzystnie wprowadzane do szczepionki zmniejszając tym samym konieczność użycia dużej liczby różnych analogów w tej samej szczepionce.
Epitop mieszany może zgodnie z wynalazkiem być naturalnie występującym epitopem dla ludzkiej komórki T, takim jak epitopy z anatoksyny tężca (np. epitopy P2 i P30), anatoksyny błonicy, hemaglutyniny wirusa grypy (HA) oraz antygenu CS z P. falciparum.
Przez lata zidentyfikowano szereg innych mieszanych epitopów dla komórki T. Zwłaszcza zostały zidentyfikowane peptydy zdolne do wiązania dużej części cząsteczek HLA-DR kodowanych przez różne allele HLA-DR i wszystkie one mogą być epitopami dla komórki T, które można wprowadzić do analogów, których zastosowania dotyczy niniejszy wynalazek. Porównaj również epitopy omówione w następujących odnośnikach: WO 98/23635 (Frazer IH i wsp., przekazany do The University of Queensland); Southwood S i wsp, 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F i wsp., 1988, Nature 336:ł778-780; Chicz RM i wsp., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J i wsp., 1993, Cell 74: 197-203 i Falk Kł i wsp., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Ostatni odnośnik dotyczy także ligandów dla HLA-DQ i -DP. Wszystkie epitopy przedstawione w tych 5 odnośnikach są stosowne jako kandydaci epitopów naturalnych do wykorzystania w zastosowaniach według niniejszego wynalazku, ponieważ są epitopami, które mają wspólne z nimi motywy.
Alternatywnie, epitop może być sztucznym epitopem dla komórki T, który jest zdolny do wiązania się z dużą częścią cząsteczek MHC klasy II. W tym kontekście interesującymi kandydatami na epitopy do wykorzystania w zastosowaniach według niniejszego wynalazku są peptydy epitopu pan DR („PADRE”) opisane w WO 95/07707 oraz odpowiadającej publikacji Alexander J i wsp., 1994, Immunity 1: 751-761. Należy zauważyć, że najskuteczniejsze peptydy PADRE ujawnione w tych publikacjach niosą D-aminokwasy na końcach C i N w celu poprawienia stabilności przy podawaniu. Jednakże, niniejszy wynalazek głównie skierowany jest na wprowadzanie stosownych epitopów jako części zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego, który powinien być następnie przecięty enzymatycznie w lizosomie komórek APC, aby umożliwić następnie prezentację w kontekście cząsteczki MHC-II i tym samym nie jest wskazane wprowadzanie D-aminokwasów do epitopów stosowanych w modyfikacji analogów według niniejszego wynalazku.
Jednym szczególnie korzystnym peptydem PADRE jest taki, który ma sekwencję aminokwasową AKFVAAWTLKAAA lub jego skuteczną immunologicznie subsekwencję. Zatem, inne epitopy mające ten sam brak ograniczenia MHC są korzystnymi epitopami dla komórki T, które powinny być obecne w analogach według wynalazku. Takie bardzo mieszane epitopy pozwalają na najprostsze wykonania według wynalazku, gdzie tylko jeden pojedynczo zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny jest prezentowany układowi odpornościowemu zaszczepionego zwierzęcia.
PL 204 878 B1
Jak wspomniano powyżej, modyfikacja polipeptydu amyloidogennego może także obejmować wprowadzenie pierwszego ugrupowania, które kieruje zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny do APC lub limfocytu B. Na przykład, pierwsze ugrupowanie może być partnerem swoiście wiążącym swoisty antygen powierzchniowy z limfocytu B lub swoisty antygen powierzchniowy z APC. Znanych jest wiele takich swoistych antygenów powierzchniowych. Na przykład, ugrupowanie może być węglowodanem, dla którego istnieje receptor na limfocycie B czy na APC (np. mannan lub mannoza). Alternatywnie drugie ugrupowanie może być haptenem. Jako pierwsze ugrupowanie może także być użyty fragment przeciwciała, który swoiście rozpoznaje cząsteczkę powierzchniową na komórkach APC lub limfocytach (cząsteczką powierzchniową może być np. receptor FCy z makrofagów i monocytów, taki jak FCyRI lub alternatywnie dowolny inny swoisty marker powierzchniowy, jak CD40 lub CTLA-4). Należy zauważyć, że wszystkie te przykładowe cząsteczki kierujące można także zastosować jako część adiuwanta, porównaj poniżej.
Jako alternatywę lub uzupełnienie dla kierowania zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego do określonego typu komórek w celu uzyskania wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej, możliwe jest podniesienie poziomu odpowiedzi układu odpornościowego przez wprowadzenie wspomnianego powyżej drugiego ugrupowania, które stymuluje układ odpornościowy. Typowymi przykładami takich drugich ugrupowań są cytokiny oraz białka szoku cieplnego lub molekularne chaperony, jak również ich efektywne części.
Odpowiednie do zastosowania zgodnie z wynalazkiem są te cytokiny, które będą normalnie funkcjonować także jako adiuwanty w kompozycji szczepionkowej, tj. przykładowo interferon γ (IFN-γ), interleukina 1 (IL-1), interleukina 2 (IL-2), interleukina 4 (IL-4), interleukina 6 (IL-6), interleukina 12 (IL-12), interleukina 13 (IL-13), interleukina 15 (IL-15) i czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF); alternatywnie, funkcjonalna część cząsteczki cytokiny może wystarczyć jako drugie ugrupowanie. Odnośnie do użycia takich cytokin jako substancji adiuwanta porównaj dyskusję poniżej.
Zgodnie z wynalazkiem, stosownymi białkami szoku cieplnego lub molekularnymi chaperonami stosowanymi jako drugie ugrupowanie, mogą być HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (znane także jako gp96, porównaj Wearsch PA i wsp. 1998, Biochemistry 37: 5709-19) i CRT (kalretikulina).
Alternatywnie, drugim ugrupowaniem może być toksyna, taka jak listeriolicyna (LLO), lipid A oraz enterotoksyna wrażliwa na ciepło. Także interesującymi możliwościami są liczne pochodne mykobakteryjne, takie jak MDP (dipeptyd muramylowy), CFA (kompletny adiuwant Freunda) oraz diestry trehalozy TDM i TDE.
Także ważnym wykonaniem według wynalazku jest możliwość wprowadzenia trzeciego ugrupowania, które wzmacnia prezentację zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego układowi odpornościowemu. Przedstawiono szereg przykładów tego składnika. Przykładowo, wiadomo, że może być wykorzystana lipidowana kotwica palmitoilowa w białku OspA z Borrelia burgdorferi, co dostarcza samo-wspomagające się polipeptydy (porównaj WO 96/40718) - wydaje się, że lipidowane białka tworzą struktury typu micelli, z rdzeniem składającym się z części lipidowanej kotwicy polipeptydów i wystającymi pozostałymi częściami, w wyniku czego zachodzi wielokrotna prezentacja determinant antygenowych. Zatem, zastosowania takich i podobnych podejść przy użyciu różnie lipidowanych kotwic (np. z grupą mirystylową, grupą farnezylową, grupą geranylo-geranylową, kotwicą GPI i grupą N-acylodiglicerydową) są korzystnymi wykonaniami wynalazku, w szczególności, ponieważ dostarczenie takiej lipidowanej kotwicy w białku wytworzonym na drodze rekombinacji jest zupełnie bezpośrednie i wymaga jedynie użycia np. naturalnie występującej sekwencji sygnałowej jako partnera fuzji dla zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego. Inną możliwością jest użycie fragmentu C3d z czynnika komplementu C3 lub samego czynnika C3 (porównaj Dempsey i wsp., 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Alternatywnym wykonaniem według wynalazku, w wyniku którego również zachodzi korzystna prezentacja układowi odpornościowemu wielu (np. co najmniej 2) kopii ważnych regionów epitopowych z polipeptydu amyloidogennego, jest kowalencyjne sprzężenie polipeptydu amyloidogennego, jego części lub wariantów do określonych cząsteczek. Na przykład, można zastosować polimery np. węglowodany, takie jak dekstran, porównaj np. Lees A i wsp., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A i wsp., 1990, J Immunol. 145: 3594-3600, lecz także alternatywnie przydatne są mannoza i mannan. Białka zintegrowane z błoną z np. E. coli i innych bakterii są także przydatnymi partnerami koniugacji. Tradycyjne cząsteczki nośnikowe, takie jak hemocyjanina skałoczepu (KLH), anatoksyna tężca, anatoksyna błonicy oraz bydlęca albumina surowicza (BSA), są także korzystnymi i przydatnymi partnerami koniugacji.
PL 204 878 B1
Korzystne wykonania kowalencyjnego sprzężenia polipeptydu amyloidogennego z polihydroksypolimerami, takimi jak węglowodany, wymagają użycia przynajmniej jednego polipeptydu amyloidogennego i przynajmniej jednego obcego epitopu dla komórki T pomocniczej, który jest sprzężony oddzielnie z polihydroksypolimerem (tj. obcy epitop dla komórki T pomocniczej i polipeptyd amyloidogenny nie występują w fuzji ze sobą lecz są raczej związane z polihydroksypolimerem, który służy zatem za szkielet nośnikowy). Znowu, wykonanie takie jest najkorzystniejsze wówczas, gdy odpowiednie regiony z polipeptydu amyloidogennego niosące epitop dla komórki B są utworzone przez krótkie ciągi peptydowe - dlatego, że takie podejście jest bardzo dogodną drogą osiągnięcia wielokrotnych prezentacji wybranych epitopów w uzyskanym czynniku immunogennym.
Wyjątkowo korzystne jest sprzęgnięcie obcego epitopu dla komórki T pomocniczej z (poli)peptydem amyloidogennym przez wiązanie amidowe, które można przeciąć peptydazą. Strategia ta prowadzi do tego, że komórki APC będą w stanie pobrać koniugat i w tym samym czasie będą w stanie przetworzyć koniugat, a następnie zaprezentować obcy epitop dla komórek T w kontekście MHC klasy II.
Jedną drogą uzyskiwania sprzężenia peptydów (zarówno polipeptydu amyloidogennego jak i obcego epitopu) jest aktywowanie odpowiedniego polihydroksypolimeru grupami tresylowymi; jest np. możliwe wytworzenie polisacharydów tresylowanych, jak opisano w WO 00/05316 i w opisie patentowym USA 5874469 i sprzężenie ich z polipeptydami amyloidogennymi oraz epitopami dla komórki T wytworzonymi za pomocą tradycyjnych technik syntezy peptydu w fazie stałej lub ciekłej. Uzyskany produkt składa się ze szkieletu polihydroksypolimerowego (np. szkieletu dekstranowego), który ma podłączone do siebie, przez końce N lub przez inne dostępne ugrupowania azotowe, polipeptydy amyloidogenne i obce epitopy dla komórki T. Jeśli pożądane, możliwa jest synteza polipeptydów amyloidogennych, w której chroni się wszystkie dostępne grupy aminowe oprócz tej na końcu N, następnie sprzężenie uzyskanych chronionych peptydów z ugrupowaniem tresylowanego dekstranu i w końcu usunięcie ochrony z uzyskanego koniugatu. Specyficzny przykład tego podejścia opisano w przykładach poniżej.
Zamiast stosowania rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek polisacharydów jak wskazano w WO 00/05316 i w opisie patentowym USA 5874469, jest również możliwe wykorzystanie usieciowanych cząsteczek polisacharydowych, a tym samym uzyskanie złożonego z drobno rozdrobnionych cząsteczek koniugatu między polipeptydami i polisacharydem, co jak się uważa, prowadzi to do lepszej prezentacji polipeptydów układowi odpornościowemu, ponieważ osiągnięte są dwa cele, mianowicie uzyskanie po wstrzyknięciu koniugatu wpływu na miejscowy złóg oraz uzyskanie cząstek, które są celami przyciągającymi komórki APC. Podejście wykorzystujące takie drobno rozdrobnione systemy także opisano szczegółowo w przykładach.
Przy wyborze obszarów do wprowadzenia modyfikacji w polipeptydach amyloidogennych brane jest pod uwagę a) zachowanie znanych i przewidywanych epitopów dla komórki B, b) zachowanie struktury trzeciorzędowej, c) unikanie obecności epitopów dla komórki B na „komórkach producenta” itd. Za każdym razem, jak omówiono powyżej, jest zupełnie łatwe przeszukanie zestawu zmodyfikowanych cząsteczek amyloidogennych, do których wprowadzono epitop dla komórki T w różne miejsca.
Ponieważ najkorzystniejsze wykonania wynalazku wymagają obniżenia poziomu ludzkiego Ae, konsekwentnie korzystne jest, aby omówiony powyżej polipeptyd amyloidowy był ludzkim polipeptydem Ae. W tym wykonaniu, szczególnie korzystnie ludzki polipeptyd amyloidogenny jest zmodyfikowany przez substytucję przynajmniej jednej sekwencji aminokwasowej w SEK. NR ID.: 2 przez przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową o równej lub różnej długości i zawierającą obcy epitop TH. Korzystne przykłady zmodyfikowanych amyloidogennych APP i Ae przedstawiono schematycznie na Fig. 1 przy użyciu epitopów P2 i P30 jako przykładowych. Racje przemawiające za takimi konstruktami są omówione w szczegółach w przykładzie.
Bardziej konkretnie, TH zawierający (lub dopełniający) sekwencję aminokwasową wprowadzoną do SEK. NR ID.: 2 może być wprowadzony przy dowolnym aminokwasie w SEK. NR ID.: 2. To znaczy, wprowadzenie jest możliwe po dowolnym z aminokwasów 1-770, lecz korzystnie po dowolnym z aminokwasów 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708,
709, 710, 711, 712, 713, i 714 w SEK. NR ID.: 2. Może to być w kombinacji z delecją dowolnego lub wszystkich aminokwasów 1-671, lub dowolnego ze wszystkich aminokwasów 715-770. Ponadto, przy wykorzystaniu techniki substytucji, dowolny z aminokwasów 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678,
679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698,
PL 204 878 B1
699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 w SEK. NR ID.: 2 może być usunięty w połączeniu z wprowadzeniem.
Formulacje polipeptydu amyloidogennego oraz zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych
Formulacja polipeptydu spełnia zasady ogólnie uznane w dziedzinie, gdy po jej podaniu zwierzęciu wpływa na prezentację polipeptydu amyloidogennego lub zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego zwierzęcemu układowi odpornościowemu.
Wytworzenie szczepionek, które zawierają sekwencje peptydowe jako aktywne składniki, jest ogólnie dobrze znane w dziedzinie, jak przedstawiono w opisach patentowych USA 4608251, 4601903, 4599231, 4599230, 4596792 i 4578770. Zazwyczaj szczepionki takie są wytwarzane w postaci stosowanej do iniekcji albo jako ciekłe roztwory lub zawiesiny; można także przygotować postacie stałe dogodne do rozpuszczenia lub zawieszenia w cieczy przed iniekcją. Preparaty mogą mieć także postać emulsji. Aktywny składnik immunogenny jest często mieszany z zarobkami, które są dopuszczalne farmaceutycznie i zgodne z aktywnym składnikiem. Odpowiednimi zaróbkami są, przykładowo, woda, roztwór soli, dekstroza, glicerol, etanol i im podobne oraz ich kombinacje. Dodatkowo, jeśli konieczne, szczepionka może zawierać niewielkie ilości substancji pomocniczych, jak czynniki nawilżające i emulgujące, czynniki buforujące pH lub adiuwanty, które wzmacniają skuteczność szczepionek; porównaj szczegółowe omówienie adiuwantów poniżej.
Szczepionki są tradycyjnie podawane pozajelitowo, przez iniekcję, przykładowo, podskórną, doskórną, śródskórną, doskórną lub domięśniową. Dodatkowe preparaty, stosowne do podawania innymi sposobami obejmują czopki i, w niektórych przypadkach, preparaty do podawania doustnego, dopoliczkowego, podjęzykowego, dootrzewnowego, dowaginalnego, doodbytniczego, nadtwardówkowego, dokręgosłupowego, oraz wewnątrzczaszkowego. Czopki mogą zawierać tradycyjne substancje wiążące i nośniki, na przykład, glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki można wytworzać z mieszanin zawierających aktywny składnik w zakresie 0,5% do 10%, korzystnie 1-2%. Preparaty doustne obejmują takie normalnie stosowane zaróbki jak, na przykład, gatunki farmaceutyczne mannitolu, laktozy, skrobii, stearynianu magnezu, sacharynianu sodu, celulozy, węglanu magnezowego i im podobne. Kompozycje mogą przybierać postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10-95% substancji aktywnej, korzystnie 25-70%. Interesującym składnikiem preparatu (a także możliwym partnerem koniugacyjnym) do podawania doustnego jest toksyna cholery.
Polipeptydy mogą być formułowane do szczepionki w postaci naturalnej lub w postaci soli. Farmaceutycznie dopuszczane sole obejmują sole addycyjne z kwasami (utworzone z wolnymi grupami aminowymi peptydu), które są wytworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak, na przykład, kwasy chlorowodorowy lub fosforowy, lub takimi kwasami organicznymi, jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i im podobne. Sole wytworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą także pochodzić od zasad nieorganicznych, takich jak, na przykład, wodorotlenek sodu, potasu, amonu, wapnia czy żelaza oraz takich organicznych zasad, jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i im podobne.
Szczepionki podawane są w sposób zgodny z dawką preparatu i w takiej ilości, która będzie aktywna terapeutycznie i immunogenna. Podawana ilość zależy od leczonego osobnika, w tym np. od zdolności układu odpornościowego osobnika do wywołania odpowiedzi odpornościowej, oraz od stopnia żądanej ochrony. Stosowne zakresy dawki są rzędu kilkuset mikrogramów aktywnego składnika na szczepienie, z korzystnym zakresem od około 0,1 μg do 2000 μg (chociaż nawet rozpatrywane są wyższe ilości w zakresie 1-10 mg), takim jak zakres od około 0,5 μg do 1000 μg, korzystnie w zakresie od 1 μg do 500 μg, a zwłaszcza w zakresie od około 10 μg do 100 μg. Odpowiednie reżimy wstępnego podawania i przypominania są także zmienne, lecz przebiegają od wstępnego podania przez następujące po nim doszczepienie lub według innego podawania.
Sposób podawania może być znacznie zróżnicowany. Stosowane są dowolne tradycyjne sposoby podawania szczepionki. Obejmują one podawanie doustne na stałej fizjologicznie dopuszczanej bazie lub w fizjologicznie dopuszczalnych dyspersjach, pozajelitowe, przez iniekcję lub tym podobne. Dawka szczepionki będzie zależała od drogi podania i będzie różniła się w zależności od wieku osoby, która ma być zaszczepiona i preparatu antygenu.
Niektóre polipeptydy szczepionki są wystarczająco immunogenne w szczepionce lecz dla innych odpowiedź odpornościowa będzie wzmocniona, jeśli szczepionka dodatkowo zawiera substancję adiuwanta.
PL 204 878 B1
Znane są różne sposoby uzyskania wpływu adiuwanta na szczepionkę. Ogólne założenia i sposoby są szczegółowo przedstawione w „The Theory and Practical Application of Adjuvants”, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (wyd.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, a także w „Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants”, 1995, Gregoriadis G i wsp. (wyd.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9.
Szczególnie korzystne jest użycie adiuwanta, dla którego można wykazać, że ułatwia przerwanie autotolerancji na autoantygeny; faktycznie, jest to istotne w przypadkach, gdzie jako aktywny składnik w autoszczepionce stosowany jest niezmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny. Nie-ograniczające przykłady stosownych adiuwantów wybrano z grupy obejmującej: immunologiczny adiuwant kierujący; immunologiczny adiuwant modulujący, taki jak toksyna, cytokina i pochodne mykobakteryjne; preparat olejowy; polimer; adiuwant tworzący micele; saponina; macierz kompleksu immunostymulującego (ISCOM matrix); cząstka; DDA; adiuwanty glinowe; adiuwanty DNA; γ-inulina i adiuwant enkapsulujący. Na ogół należy zauważyć, że powyższe ujawnienia odnoszące się do związków i czynników przydatnych jako ugrupowania pierwsze, drugie i trzecie w analogach, także dotyczą mutatis mutandis (po dokonaniu niezbędnych zmian) dla ich użycia w adiuwancie szczepionki.
Zastosowanie adiuwantów obejmuje użycie czynników, takich jak wodorotlenek lub fosforan glinu (alum), powszechnie stosowany jako roztwór 0,05 do 0,1 procentowy w buforowanym roztworze soli, mieszanka z syntetycznymi polimerami cukrów (np. Carbopol®) stosowana, jako 0,25 % roztwór; możliwe jest także agregowanie białka w szczepionce przez traktowanie cieplne w temperaturach w zakresie omiędzy 70° do 101°C przez okres, odpowiednio, 30 sekund do 2 minut oraz agregowanie za pomocą czynników sieciujących. Można także zastosować agregowanie przez reaktywację przeciwciałami traktowanymi pepsyną (fragmenty Fab) do albuminy, mieszaniną komórek bakteryjnych, takich jak C.parvum lub endotoksyną lub składnikami lipopolisacharydowymi bakterii gram-ujemnych, emulsją w fizjologicznie akceptowanym nośniku olejowym, jak monooleinian mannidowy (Aracel A) lub emulsją z 20 procentowym roztworem perfluorowęgla (Fluosol-DA) stosowanego jako substytut blokowy. Korzystna jest także domieszka olejów jak skwalen i IFA.
Zgodnie z wynalazkiem interesującym kandydatem na adiuwant jest DDA (bromek dimetylodioktadecyloamoniowy) lub DNA i γ-inulina, lecz także kompletny i niekompletny adiuwant Freunda, jak również jako RIBI interesujące są saponiny kwilaja, takie jak QuilA i QS21. Ponadto możliwe są lipid A monofosforylowy (MPL) oraz wspomniane powyżej C3 i C3d i dipeptyd muramylowy (MDP).
Preparaty liposomowe są także znane jako nadające efekt adiuwanta i dlatego adiuwanty liposomowe są korzystne.
Także adiuwanty typu macierzy kompleksu immunostymulującego (ISCOM® matrix) są korzystne, w szczególności od kiedy wykazano, że ten typ adiuwantów jest zdolny do podniesienia poziomu ekspresji MHC klasy II w komórkach APC. ISCOM® matrix składa się z (ewentualnie frakcjonowanych) saponin (triterpenoidów) z Quillaja saponaria, cholesterolu i fosfolipidu. Po zmieszaniu z białkiem immunogennym, powstający, złożony z cząstek preparat jest znany jako cząstka ISCOM, gdzie saponina stanowi 60-70% wagowych cholesterol i fosfolipid 10-15% wagowych, a białko 10-15% wagowych. Szczegóły dotyczące kompozycji i stosowania kompleksu immunostymulującego, które można np. znaleźć we wspomnianych powyżej podręcznikach dotyczących adiuwantów, lecz także w Morein B i wsp., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 jak również w Barr IG and Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25, dostarczają przydatnych instrukcji do wytwarzania kompletnych kompleksów immunostymulujących.
Inną bardzo interesującą (a zatem korzystną) możliwością uzyskania działania adiuwanta jest wykorzystanie techniki opisanej w Gosselin i wsp. 1992. W skrócie, prezentacja stosownego antygenu, takiego jak antygen w zastosowaniu według wynalazku, może być wzmocniona przez skoniugowanie antygenu z przeciwciałami (lub z fragmentami przeciwciała wiążącymi antygen) skierowanymi przeciwko receptorom Fcy na monocytach/makrofagach. Wykazano, że szczególnie koniugaty pomiędzy antygenem i anty-FcYRI wzmacniają immunogenność na skutek szczepienia.
Inne możliwości wymagają użycia immunologicznych substancji kierujących i stymulujących (np. cytokiny), wspomnianych powyżej jako kandydatów na pierwsze i drugie ugrupowania w zmodyfikowanych wersjach polipeptydów amyloidogennych. W związku z tym możliwe są także syntetyczne induktory cytokin jak poli I:C.
Odpowiednie pochodne mykobakteryjne są wybrane z grupy składającej się z dipeptydu muramylowego, kompletnego adiuwantu Freunda, RIBI oraz diesteru trehalozy, takiego jak TDM i TDE.
PL 204 878 B1
Odpowiednie immunologiczne adiuwanty kierujące są wybrane z grupy składającej się z liganda CD40 i przeciwciała przeciwko CD40 lub ich swoiście wiążących fragmentów (porównaj dyskusja powyżej), mannozy, fragmentu Fab i CTLA-4.
Odpowiednie adiuwanty polimerowe są wybrane z grupy składającej się z węglowodanu, takiego jak dekstran, PEG, skrobia, mannan, mannoza; polimerów, takich jak lateks, jako kulki lateksowe.
Jeszcze inną interesującą drogą modulowania odpowiedzi immunologicznej jest włączenie immunogenu (ewentualnie wraz z adiuwantami i farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami i zaróbkami) do „sztucznego węzła chłonnego” (VLN) (opatentowanego urządzenia medycznego wykonanego przez ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (cienkie tubularne urządzenie) naśladuje strukturę i funkcję węzła chłonnego. Wprowadzenie VLN pod skórę tworzy miejsce sterylnego zapalenia, do którego napływają gwałtownie cytokiny i chemokiny. Komórki T i B, jak również komórki APC szybko odpowiadają na niebezpieczne sygnały, ogniskują się w miejscu zapalnym i gromadzą wewnątrz porowatej macierzy VLN. Wykazano, że konieczna dawka antygenu wymagana do wywołania odpowiedzi odpornościowej na antygen jest zmniejszona, gdy zastosowany jest VLN, a ochrona immunologiczna nadana przez szczepienie z zastosowaniem VLN przewyższa tradycyjną immunizację z zastosowaniem Ribi jako adiuwanta. Technologia jest np. opisana krótko w Gelber C i wsp., 1998, „Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node”, w: „From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, Kalifornia”.
Pokazano, że preparat mikroczastek ze szczepionkami w wielu przypadkach podnosi immunogenność antygenów białkowych i jest zatem innym korzystnym wykonaniem wynalazku. Mikrocząstki są wytworzone albo jako ko-preparaty antygenu i polimeru, lipidu, węglowodanu i innych cząsteczek odpowiednich do wytworzenia cząstek lub mikrocząstek mogą być homogennymi cząstkami składającymi się tylko z samego antygenu.
Przykładami mikrocząstek na bazie polimerów są cząstki oparte na PLGA i PVP (Gupta, R.K. i wsp., 1998), gdzie polimer i antygen są skondensowane w cząstkę stałą. Cząstki oparte na lipidach można wytworzyć jako micelle z lipidów (zwane liposomami) wychwytujące antygen w obrębie miceli (Pietrobon, P.J., 1995). Cząstki oparte na węglowodanach są zazwyczaj wykonane z odpowiedniego, podlegającego degradacji węglowodanu, takiego jak skrobia lub chitosan. Węglowodan i antygen są mieszane i kondensowane w cząstki w procesie podobnym do używanego dla cząstek polimerowych (Kas, H.S. i wsp., 1997).
Cząstki składające się wyłącznie z antygenu można wytwarzać różnymi technikami rozpylania i liofilizacji. Szczególnie odpowiednia do celów według niniejszego wynalazku jest nadkrytyczna technologia cieczowa, która jest stosowana do wytwarzania bardzo jednolitych cząstek o kontrolowanym rozmiarze (York, P. 1999 & Shekunov, B. i wsp. 1999).
Oczekuje się, że szczepionka powinna być podawana 1-6 razy w roku, tak jak 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 razy w roku osobnikowi, który jej potrzebuje. Wykazano wcześniej, że odporność zapamiętana wywołana przez zastosowanie korzystnych autoszczepionek nie jest permanentna i dlatego układ odpornościowy potrzebuje cyklicznego prowokowania polipeptydem amyloidogennym lub zmodyfikowanymi polipeptydami amyloidogennymi.
Z powodu zmienności genetycznej, różne osobniki mogą reagować odpowiedzią odpornościową o różnej sile na ten sam polipeptyd. Zatem, szczepionka może obejmować wiele różnych polipeptydów w celu podniesienia odpowiedzi odpornościowej, porównaj także dyskusję powyżej dotyczącą wyboru obcego epitopu dla komórki T. Szczepionka może obejmować dwa lub więcej polipeptydów, z których wszystkie są zdefiniowane powyżej.
Szczepionka może w konsekwencji obejmować 3-20 różnych zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych polipeptydów, jak 3-10 różnych polipeptydów.
Szczepienie kwasem nukleinowym
Alternatywna, do klasycznego podawania szczepionki na bazie peptydu, technologia szczepienia kwasem nukleinowym (znana także jako „immunizacja kwasem nukleinowym”, „immunizacja genetyczna” i „immunizacja genowa”) oferuje szereg atrakcyjnych właściwości.
Po pierwsze, dla kontrastu z tradycyjnym podejściem szczepionkowym, szczepienie kwasem nukleinowym nie wymaga produkcji na dużą skalę immunogennego antygenu (np. w formie fermentacji na skalę przemysłową mikroorganizmów produkujących zmodyfikowane polipeptydy amyloidogenne) zużywającej środki. Ponadto, nie ma potrzeby stosowania do oczyszczania urządzenia i schematów
PL 204 878 B1 ponownego fałdowania immunogenu. W końcu, ponieważ szczepienie kwasem nukleinowym opiera się na aparacie biochemicznym szczepionego osobnika w celu wytworzenia ekspresji produktu dla wprowadzonego kwasu nukleinowego, oczekuje się, że nastąpi optymalna obróbka post-translacyjna wytworzonego produktu; jest to szczególnie ważne w przypadku autoszczepienia, ponieważ jak wspomniano powyżej, istotna frakcja oryginalnych epitopów dla komórki B powinna być chroniona w zmodyfikowanej cząsteczce oraz dlatego, że epitopy dla komórki B w szczególności mogą być tworzone przez części dowolnej (bio)cząsteczki (np. węglowodanu, lipidu, białka itd.). Zatem, natywny wzór glikozylacji i lipidacji w immunogenie może być bardzo ważny dla ogólnej immunogenności i jest to najlepiej zapewnione przez produkowanie immunogenu w gospodarzu.
Zatem, korzystne wykonanie wynalazku obejmuje skuteczną prezentację zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego układowi odpornościowemu przez wprowadzenie kwasu(ów) nukleinowego(ych) kodującego zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny do komórek zwierzęcych i tym samym uzyskanie ekspresji in vivo kwasu(ów) nukleinowego(ych) wprowadzonego do komórek.
W wykonaniu tym, wprowadzanym kwasem nukleinowym jest korzystnie DNA, który może być w postaci nagiego DNA, DNA sformułowanego z naładowanymi lub nie naładowanymi lipidami, DNA sformułowanego w liposomach, DNA zawartego w wektorze wirusowym, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem ułatwiającym transfekcję, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem kierującym, DNA sformułowanego z czynnikami wytrącającymi wapń, DNA sprzężonego z nieczynną cząsteczką nośnikową, DNA enkapsulowanego w polimerze, np. w PLGA (porównaj technologia mikroenkapsulacji opisana w WO 98/31398) lub w chitynie czy chitozanie oraz DNA sformułowanego z adiuwantem. W tym kontekście ważne jest, że praktycznie wszystkie uwagi odnoszące się do użycia adiuwantów w preparacie tradycyjnej szczepionki, mają zastosowanie do preparatów szczepionek DNA. Zatem, wszystkie przedstawione tu ujawnienia odnoszące się do zastosowania adiuwantów w kontekście szczepionek na bazie peptydu mają zastosowanie, z koniecznymi odmianami i zmianami, przy ich użyciu w technologii szczepienia kwasem nukleinowym.
Drogi podawania i schematy podawania szczepionek na bazie polipeptydu, które wyszczególniono powyżej, mają także zastosowanie do szczepionek z kwasów nukleinowych i wszystkie powyższe dyskusje odnoszące się do dróg podawania i schematów podawania polipeptydów mają zastosowanie z koniecznymi zmianami i odmianami do kwasów nukleinowych. Powinno się do tego dodać, że szczepionki z kwasów nukleinowych mogą być odpowiednio podawane dożylnie i dotętniczo. Ponadto, dobrze wiadomo specjalistom, że szczepionki z kwasu nukleinowego można podawać stosując tak zwaną. W końcu, informowano także, że użycie VLN w podawaniu kwasów nukleinowych daje dobre wyniki, a zatem ten specyficzny sposób podawania jest szczególnie korzystny.
Ponadto, kwas(y) nukleinowy stosowany jako czynnik immunizujący może zawierać regiony kodujące 1-wszą, 2-gą i/lub 3-cią cząstkę, np. w formie substancji immunostymulujących substancji opisanych powyżej, takich jak cytokiny omawiane jako przydatne adiuwanty. Korzystna wersja tego wykonania obejmuje posiadanie regionu kodującego analog i regionu kodującego immunomodulator w różnych ramkach odczytu lub przynajmniej pod kontrolą różnych promotorów. Tym samym unika się tego, że analog lub epitop jest wytwarzany jako partner w fuzji z immunomodulatorem. Alternatywnie, można użyć dwóch różnych fragmentów nukleotydowów, lecz jest to mniej korzystne ze względu na lepsze zapewnienie jednoczesnej ekspresji, gdy oba regiony kodujące zawarte są w tej samej cząsteczce.
Zgodnie zatem, wynalazek także dotyczy kompozycji indukującej produkcję przeciwciał skierowanych przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu, która obejmuje:
- fragment kwasu nukleinowego lub wektor według wynalazku (porównaj dyskusja o wektorach poniżej) oraz
- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalną zaróbkę i/lub nośnik, i/lub adiuwant, jak omówiono powyżej.
W normalnych warunkach, kwas nukleinowy kodujący wariant jest wprowadzany w postaci wektora, w którym ekspresja znajduje się pod kontrolą promotora wirusowego. Dla bardziej szczegółowych informacji o wektorach według wynalazku porównaj dyskusję poniżej. Także dostępne są szczegółowe ujawnienia odnoszące się do wytwarzania i stosowania szczepionek z kwasu nukleinowego, porównaj Donnelly JJ i wsp, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 oraz Donnelly JJ i wsp., 1997, Life Sciences 60: 163-172.
Żywe szczepionki
Trzecią alternatywą skutecznej prezentacji zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego układowi odpornościowemu jest użycie technologii żywej szczepionki. W szczepieniu żywą szczepionką,
PL 204 878 B1 prezentacja układowi odpornościowemu jest wywołana przez podanie zwierzęciu niepatogennego mikroorganizmu, który został stransformowany fragmentem kwasu nukleinowego kodującym zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny lub wektorem wprowadzającym taki fragment kwasu nukleinowego. Niepatogennym mikroorganizmem może być dowolny odpowiedni atenuowany szczep bakteryjny (atenuowany przez pasażowanie lub przez usunięcie za pomocą technik rekombinacji DNA patogennych produktów ekspresji), np. Mycobacterium bovis BCG., niepatogenny Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, itd. Prace przeglądowe dotyczące wytwarzania przez specjalistów żywych szczepionek można np. znaleźć w Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990. Szczegóły na temat fragmentów kwasu nukleinowego i stosowanych w żywych szczepionkach wektorów patrz omówienie poniżej.
Jako alternatywę dla żywych szczepionek bakteryjnych, fragment kwasu nukleinowego według wynalazku omówiony poniżej można wprowadzić do niewirulentnego wirusowego wektora szczepionkowego, takiego jak szczep krowianki lub inne odpowiednie wirusy ospy.
Normalnie, niepatogenny mikroorganizm lub wirus jest podawany zwierzęciu tylko raz, lecz w pewnych przypadkach może zajść konieczność podania mikroorganizmu więcej niż raz w czasie życia, w celu podtrzymania odporności ochronnej. Jest nawet rozważane, czy schematy immunizacji, jak te przedstawione szczegółowo powyżej, dla szczepienia polipeptydem, będą przydatne przy stosowaniu szczepionek żywych lub wirusowych.
Alternatywnie szczepienie szczepionką żywą lub wirusową można prowadzić w kombinacji z wcześniejszym lub następującym później szczepieniem polipeptydem i/lub kwasem nukleinowym. Na przykład, można przeprowadzić główną immunizację za pomocą szczepionki żywej lub wirusowej, a następnie wzmocnienie immunizacji przy użyciu polipeptydu lub kwasu nukleinowego.
Mikroorganizm lub wirus może być stransformowany kwasem(ami) nukleinowym(i) zawierającym regiony kodujące 1-wsze, 2-gie i/lub 3-cie ugrupowanie, np. w formie substancji immunomodulujących opisanych powyżej, takich jak cytokiny omawiane jako przydatne adiuwanty. Korzystna wersja tego wykonania obejmuje posiadanie regionu kodującego analog i regionu kodującego immunomodulator w różnych ramkach odczytu lub przynajmniej pod kontrolą różnych promotorów. Tym samym unika się tego, że analog lub epitopy są wytwarzane jako partnerzy w fuzji z, immunomodulatorem. Alternatywnie, jako czynników transformujących można użyć dwóch różnych fragmentów nukleotydowych. Oczywiście posiadając 1-wsze, 2-gie i/lub 3-cie ugrupowanie w tej samej ramce odczytu, analog według wynalazku, można dostarczyć jako produkt ekspresji i takie wykonanie jest szczególnie korzystne według niniejszego wynalazku.
Wykorzystanie wynalazku w leczeniu choroby
Jak wynika z dyskusji powyżej, wynalazek umożliwia kontrolowanie chorób charakteryzujących się złogami amyloidowymi. W tym kontekście, AD jest kluczowym celem dla wynalazku, lecz możliwymi celami są także inne choroby charakteryzujące się złogami amyloidowymi. Zatem, zastosowanie i inne przedmioty wynalazku umożliwiają obniżanie poziomu aktywności amyloidowej i leczenie i/lub zapobieganie, i/lub łagodzenie AD i innych chorób charakteryzujących się złogami amyloidowymi. Wynalazek umożliwia obniżenie poziomu amyloidu do takiego stopnia, że ilość amyloidu jest znacząco zmniejszona.
Szczególnie korzystne jest to, że zmniejszenie ilości amyloidu daje w efekcie odwrócenie równowagi między tworzeniem amyloidu a degradacją/usuwaniem amyloidu, tj. że szybkość degradacji/usuwania amyloidu przewyższa szybkość tworzenia amyloidu. Przez uważne kontrolowanie ilości i immunologicznej siły immunizacji osobnika będącego w potrzebie, będzie możliwe uzyskanie równowagi w czasie, która spowoduje wypadkowe zmniejszenie złogów amyloidowych bez zbytniego szkodliwego działania ubocznego.
Alternatywnie, jeśli u osobnika nie można usunąć lub zmniejszyć istniejących złogów amyloidowych, wynalazek można wykorzystać do uzyskania klinicznie znaczącej redukcji tworzenia nowego amyloidu, tym samym znacząco przedłużyć czas, w którym choroba nie jest wyniszczająca. Powinno być możliwe monitorowanie odkładania amyloidu albo przez pomiar stężenia amyloidu w surowicy (który uważa się za równoważny z materiałem odkładanym) lub przez użycie skanowania pozytronową emisyjną tomografią (PET), porównaj Small GW, i wsp., 1996, Ann N Y Acad Sci 802: 70-78.
Inne choroby i stany, w których leczeniu i łagodzeniu można zastosować środki według wynalazku analogicznymi drogami, wymieniono: powyżej. Skrobiawica układowa, AD, cukrzyca dorosłych, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona, otępienie czołowo-skroniowe oraz przenoszona przez
PL 204 878 B1 cząsteczki typu prion encefalopatia gąbczasta) lub są przedstawione poniżej w sekcji zatytułowanej „Inne choroby amyloidowe i związane z nimi białka”.
Peptydy, polipeptydy i kompozycje
Jak wynika z powyższego, niniejszy wynalazek opiera się na koncepcji immunizacji osobników przeciwko antygenowi amyloidogennemu w celu uzyskania zmniejszonej ilości złogów amyloidowych związanych z patologią. Korzystną drogą uzyskania takiej immunizacji jest zastosowanie zmodyfikowanych wersji polipeptydu amyloidogennego, a tym samym dostarczenie cząsteczek, które wcześniej nie były ujawnione w stanie techniki.
Należy zauważyć, że korzystnie zmodyfikowane cząsteczki amyloidogenne obejmują modyfikacje dające polipeptyd mający przynajmniej 70% identyczności sekwencji z białkiem amyloidogennym lub jego częścią o długości przynajmniej 10 aminokwasów. Korzystne są wyższe identyczności sekwencji, np. przynajmniej 75% lub nawet przynajmniej 80, 85, 90 czy 95%. Identyczność sekwencji białek i kwasów nukleinowych można obliczyć jako (Nref - Ndif) · 100/Nref, gdzie Ndif jest liczbą wszystkich nieidentycznych reszt w dwóch przyrównywanych sekwencjach, a Nref jest liczbą reszt w jednej z sekwencji. Zatem sekwencja DNA, AGTCAGTC będzie miała 75% identyczności z sekwencją AATCAATC (Ndif=2 i Nref=8).
Wynalazek dotyczy także kompozycji immunogennej zawierającej skuteczną immunogennie ilość analogu amyloidowego zdefiniowanego powyżej, oraz farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny rozcieńczalnik i/lub podłoże, i/lub nośnik, i/lub zaróbkę i ewentualnie adiuwant. Innymi słowy, ta część wynalazku odnosi się do preparatów zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego, zasadniczo jak opisano powyżej. Wybór adiuwantów, nośników, podłoży jest zgodny z linią omówioną powyżej w odniesieniu do wytwarzania zmodyfikowanego i niezmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego do zastosowania w obniżaniu poziomu amyloidu.
Polipeptydy są wytwarzane zgodnie z metodami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie. Dłuższe polipeptydy są zwykle wytworzone sposobami technologii rekombinacji genów, w tym wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej analog do odpowiedniego wektora, transformacja odpowiedniej komórki gospodarza tym wektorem, ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego przez komórkę gospodarza, odzyskanie wytworzonego produktu ekspresji z komórek gospodarza lub z supernatantu z ich hodowli, a następnie oczyszczenie i ewentualnie dalsza modyfikacja, np. ponowne fałdowanie lub derywatyzacja.
Krótsze peptydy są korzystnie wytworzone dobrze znanymi sposobami syntezy peptydów w fazie stałej i ciekłej. Jednakże, ostatnie ulepszenia tej technologii dają możliwość produkcji tymi sposobami polipeptydów i białek o pełnej długości, a zatem według wynalazku mogą być wytwarzane długie konstrukty sposobami syntezy.
Fragmenty kwasów nukleinowych i wektory według wynalazku
Z powyższego ujawnienia wynika, że zmodyfikowane polipeptydy amyloidogenne można wytwarzać sposobami technologii rekombinacji genów, a także sposobami chemicznej syntezy lub semisyntezy: dwie ostatnie możliwości są szczególnie odpowiednie, gdy modyfikacja polega na sprzęganiu z nośnikami białkowymi (taki jak KHL, anatoksyna błonicy, anatoksyna tężca i BSA) i cząsteczkami, które nie są białkopodobne, jak polimery węglowodanowe i oczywiście także wtedy, gdy modyfikacja obejmuje dodanie łańcuchów bocznych lub grup bocznych do łańcucha peptydowego będącego pochodną polipeptydu amyloidogennego.
Dla technologii rekombinacji genów, oraz oczywiście także dla immunizacji kwasem nukleinowym, istotnymi produktami chemicznymi są fragmenty kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny. Zatem, ważna część wynalazku odnosi się do fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje analog polipeptydu amyloidogennego np. polipeptyd będący pochodną polipeptydu amyloidogennego, który albo zawiera naturalną sekwencję, do której został dodany albo wprowadzony partner fuzji, albo korzystnie polipeptyd będący pochodną polipeptydu amyloidogennego ma wprowadzony obcy epitop dla komórki T przez insercję i/lub addycję, korzystnie przez substytucję i/lub delecję. Fragmenty kwasów nukleinowych według wynalazku są fragmentami DNA lub RNA.
Fragmenty kwasów nukleinowych według wynalazku będą normalnie wprowadzane do odpowiednich wektorów tworząc wektory do klonowania i ekspresji niosące fragmenty kwasów nukleinowych według wynalazku; takie nowe wektory także są częścią wynalazku. Szczegóły dotyczące konstrukcji tych wektorów według wynalazku będą omówione poniżej, w odniesieniu do transformowanych
PL 204 878 B1 komórek i mikroorganizmów. Wektory, w zależności od celu i typu zastosowania, mogą być w postaci plazmidów, fagów, kosmidów, mini-chromosomów lub wirusów lecz także nagi DNA, który ulega tylko przejściowej ekspresji w określonych komórkach, jest ważnym wektorem. Korzystne wektory do klonowania i ekspresji według wynalazku są zdolne do autonomicznej replikacji, co umożliwia występowanie w wysokiej liczbie kopii istotne dla wysokowydajnej ekspresji lub wysokowydajnej replikacji umożliwiającej dalsze klonowanie.
Ogólny szkic wektora według wynalazku obejmuje następujące cechy w kierunku 5' >3' i funkcjonalne połączenie: promotor kierujący ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, ewentualnie sekwencja kwasu nukleinowego kodująca peptyd liderowy umożliwiający sekrecję (do fazy zewnątrzkomórkowej lub, gdzie stosowne, do periplazmy) lub integrację fragmentu polipeptydu z błoną, fragment kwasu nukleinowego według wynalazku i ewentualnie sekwencja kwasu nukleinowego kodująca terminator. Gdy operuje się wektorami ekspresyjnymi w szczepach lub liniach komórkowych producenta w celu uzyskania stabilności genetycznej stransformowanych komórek, korzystnie wektor po wprowadzeniu do komórki gospodarza integruje do jej genomu. Dla kontrastu, gdy pracuje się z wektorami stosowanymi do skutecznej ekspresji in vivo u zwierzęcia (tj. gdy stosuje się wektory w szczepieniach z DNA), z powodów bezpieczeństwa korzystne, jest aby wektory nie były w stanie integrować do genomu komórki gospodarza; zazwyczaj stosuje się nagi DNA i nieintegrujące wektory wirusowe, których wybór jest dobrze znany specjaliście.
Wektory według wynalazku są stosowane do transformacji komórek gospodarza w celu produkowania zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego według wynalazku. Takie stransformowane komórki, które także są częścią wynalazku, mogą być hodowlami komórkowymi lub liniami komórkowymi stosowanymi do namnażania fragmentów kwasów nukleinowych i wektorów według wynalazku lub mogą być stosowane do rekombinacyjnej produkcji zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych. Alternatywnie stransformowane komórki mogą być odpowiednimi szczepami żywych szczepionek, do których wprowadzono fragment kwasu nukleinowego (w jednej lub w wielu kopiach), aby uzyskać sekrecję lub integrację zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego z błoną bakteryjną lub ścianą komórkową.
Korzystnymi stransformowanymi komórkami według wynalazku są mikroorganizmy, takie jak bakterie (jak gatunki Escherichia [np. E. coli], Bacillus [np. Bacillus subtilis], Salmonella lub Mycobacterium [korzystnie niepatogenne, np. M. bovis BCG]), drożdże (takie jak Saccharomyces cerevisiae) i protozoa. Alternatywnie, stransformowane komórki pochodzą z organizmu wielokomórkowego, takiego jak grzyb, komórka owadzia, komórka roślinna lub komórka ssacza. Najbardziej korzystne są komórki pochodzące od ludzi, porównaj omówienie linii komórkowych i wektorów poniżej. Bardzo obiecujące są ostatnie wyniki uzyskane dla handlowo dostępnej linii komórkowej Drosophila melanogaster (system linii komórkowej Schneider 2 (S2) i wektora, udostępniony przez Invitrogen) do rekombinacyjnej produkcji polipeptydów w laboratorium zgłaszających, zatem ten system ekspresji jest szczególnie korzystny.
W celu klonowania i/lub optymalizacji ekspresji korzystnie stransformowana komórka jest zdolna do replikacji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku. Komórki, w których zachodzi ekspresja fragmentu nukleinowego, są korzystnymi przydatnymi wykonaniami według wynalazku; można je stosować do produkcji na małą i dużą skalę zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego lub w przypadku bakterii niepatogennych jako składniki żywej szczepionki.
Gdy produkowane są zmodyfikowane cząsteczki przy użyciu stransformowanych komórek, wygodne jest, choć dalekie od koniecznego, aby wytwarzany produkt albo był eksportowany do pożywki hodowlanej albo był niesiony na powierzchni stransformowanej komórki.
Po zidentyfikowaniu komórki wydajnego producenta korzystnie, na jej podstawie ustala się stabilną linię komórkową, która niesie wektor według wynalazku, i w której zachodzi ekspresja fragmentu kwasu nukleinowego kodującego zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny. Korzystnie, stabilna linia komórkowa będzie wydzielać lub nieść analog według wynalazku, ułatwiając tym samym jego oczyszczenie.
Zasadniczo, wektory plazmidowe zawierające replikon i sekwencje kontrolne, które pochodzą z gatunku zgodnego z komórką gospodarza, są stosowane w połączeniu z gospodarzami. Wektor zwykle niesie miejsce startu replikacji, jak również sekwencje markerowe, które umożliwiają fenotypową selekcję w stransformowanych komórkach. Na przykład, E. coli jest zazwyczaj transformowana przy użyciu pBR322, plazmidu pochodzącego z gatunku E. coli (patrz, np., Bolivar i wsp., 1977). Plazmid pBR322 zawiera geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę i w ten sposób dostarcza łatwego sposobu identyfikacji stransformowanych komórek. Plazmid pBR lub inny plazmid mikrobiologiczny lub
PL 204 878 B1 fag muszą także zawierać, lub być zmodyfikowane, aby zawierać, promotory, które mogą być użyte do ekspresji przez mikroorganizm prokariotyczny.
Takie powszechnie stosowane promotory w konstruktach z rekombinowanym DNA obejmują systemy promotorów e-laktamazowego (penicylinazowego) laktozowego (Chang i wsp., 1978; Itakura i wsp., 1977; Goeddel i wsp., 1979) i system promotora tryptofanowego (trp) (Goeddel i wsp., 1979; EP-A-0 036 776). Pomimo, że promotory te są powszechnie stosowane inne promotory z mikroorganizmów są odkryte i stosowane, a szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowych zostały opublikowane, co umożliwia specjalistom łączyć je funkcjonalnie z wektorami plazmidowymi (Siebwenlist i wsp., 1980). Pewne geny prokariotyczne mogą ulegać wydajnej ekspresji w E. coli ze swoich własnych sekwencji promotorowych, co wyklucza konieczność dodawania innego promotora w sposób sztuczny.
Dodatkowo do prokariontów, można także zastosować mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak hodowle drożdży i tu promotor powinien być w stanie kierować ekspresją. Saccharomyces cerevisiae lub powszechne drożdże piekarnicze, są najczęściej stosowanym organizmem wśród mikroorganizmów eukariotycznych, chociaż powszechnie dostępne są liczne inne szczepy. Do ekspresji w Saccharomyces powszechnie stosowanym plazmidem jest, przykładowo, plazmid YRp7, (Stinchcomb i wsp., 1979; Kingsman i wsp., 1979; Tschemper i wsp., 1980). Plazmid ten zawiera już gen trpl, który dostarcza markera selekcyjnego dla szczepu mutanta drożdży, który utracił zdolność wzrostu bez tryptofanu, przykładowo ATCC Nr 44076 lub PEP4-1 (Jones, 1977). Obecność uszkodzenia w trpl jest charakterystyczna dla genomu drożdżowej komórki gospodarza i dlatego dostarcza użytecznego środowiska dla wykrywania transformacji przez wzrost w nieobecności tryptofanu.
Stosowne sekwencje pobudzające w wektorach drożdżowych obejmują promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej (Hitzman i wsp., 1980) lub innych enzymów glikolitycznych (Hess i wsp., 1968; Holland i wsp., 1978), takich jak enolaza, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanu, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza. Przy konstruowaniu odpowiednich plazmidów ekspresyjnych, sekwencje terminacyjne związane z tymi genami są także włączane za pomocą reakcji ligacji do wektora ekspresyjnego na końcu 3' sekwencji, której ekspresja jest żądana, w celu poliadenylacji mRNA i terminacji.
Innymi promotorami, które mają dodatkową przewagę w kontrolowaniu transkrypcji za pomocą warunków wzrostowych, są regiony promotorowe dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, fosfatazy kwaśnej, enzymów rozkładających związanych z metabolizmem azotu oraz wspomnianej wcześniej dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiedni jest każdy wektor plazmidowy zawierający promotor zgodny dla drożdży, miejsce startu replikacji i sekwencje terminacyjne.
Dodatkowo do mikroorganizmów jako gospodarzy można także stosować hodowle komórek pochodzących z organizmów wielokomórkowych. W zasadzie, każdą z takich hodowli można przeprowadzić, zarówno hodowlę komórek kręgowców jak i bezkręgowców. Chociaż bardziej interesujące są komórki kręgowców, a namnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowle tkankowe) stało się rutynową procedurą w ostatnich latach (Tissue Culture, 1973). Przykładami takich przydatnych linii komórkowych gospodarzy są komórki VERO i HeLa, linie komórkowe z jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórki W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) (handlowo dostępne w postaci całych systemów do ekspresji z np. Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. i z Invitrogen) oraz linie komórkowe MDCK. W niniejszym wynalazku szczególnie korzystna jest linia komórkowa S2, dostępna w Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandia.
Wektory ekspresyjne do takich komórek zwykle zawierają (jeśli konieczne) miejsce startu replikacji, promotor położony przed genem, który ma ulec ekspresji, wraz z koniecznymi miejscami wiązania rybosomu, miejsca splicingu RNA, miejsce poliadenylacji i sekwencje terminatora transkrypcji.
Funkcje kontrolne w wektorach ekspresyjnych stosowanych w komórkach ssaczych są często dostarczane przez materiał wirusowy. Na przykład, powszechnie stosowanymi promotorami są pochodzące z wirusa Polyoma, Adenowirusa 2 oraz najczęściej z małpiego wirusa 40 (SV40). Wczesny i późny promotor wirusa SV40 są szczególnie przydatne, ponieważ oba są z łatwością uzyskiwane z wirusa w postaci fragmentu zawierającego także miejsce startu replikacji dla wirusa SV40 (Fiers i wsp., 1978). Można także zastosować mniejsze i większe fragmenty SV40, dostarczające zawartą sekwencję około 250 bp, rozciągającą się od miejsca Hindlll do miejsca Bgll w wirusowym miejscu startu replikacji. Ponadto możliwe jest także, i często pożądane, wykorzystanie promotora lub sekwencji
PL 204 878 B1 kontrolnych normalnie związanych z sekwencją żądanego genu, pod warunkiem, że takie sekwencje kontrolne są zgodne z systemami komórki gospodarza.
Miejsce startu replikacji można dostarczyć albo przez skonstruowanie wektora zawierającego egzogenne miejsce startu, jakim może być pochodzące z SV40 lub innego wirusa (np., Polyoma, Adeno, VSV, BPV) lub miejsce startu replikacji może być dostarczone przez mechanizm replikacji chromosomu w komórce gospodarza. Ten ostatni sposób jest często wystarczający, o ile wektor integruje się z chromosomem komórki gospodarza.
Identyfikacja przydatnych analogów
Będzie jasne dla specjalistów, że nie wszystkie możliwe warianty lub modyfikacje naturalnie występujących polipeptydów amyloidogennych będą miały zdolność wywoływania w zwierzęciu przeciwciał, które będą reagowały krzyżowo z formą naturalną. Nie jest jednakże trudne ustalenie wydajnego standardowego przeszukiwania zmodyfikowanych cząsteczek amyloidogennych, które spełniają minimalne wymagania omawianej tu reaktywności immunologicznej. Sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu amyloidogennego, który może indukować przeciwciała skierowane przeciwko niezmodyfikowanemu polipeptydowi amyloidogennemu w gatunku zwierzęcym, gdzie niezmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny jest (nie-immunogennym) własnym białkiem obejmuje:
- wytworzenie, sposobami syntezy peptydów lub technikami inżynierii genetycznej, zestawu różniących się wzajemnie zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych, w których dodano, wstawiono, usunięto lub podstawiono aminokwasy w sekwencji aminokwasowej polipeptydu amyloidogennego gatunku zwierzęcego, co prowadzi do powstania sekwencji aminokwasowych w zestawie, które obejmują epitopy dla komórki T, obce dla gatunku zwierzęcego lub wytworzenie zestawu fragmentów kwasów nukleinowych kodujących zestaw różniących się wzajemnie zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych,
- testowanie przedstawicieli zestawu zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych lub fragmentów kwasów nukleinowych pod kątem ich zdolności do indukowania produkcji przeciwciał przez gatunek zwierzęcy skierowanych przeciwko niezmodyfikowanemu polipeptydowi amyloidogennemu, oraz
- identyfikowanie i ewentualnie izolowanie przedstawiciela(i) zestawu zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych, który znacząco indukuje produkcję przeciwciała skierowanego przeciwko niezmodyfikowanemu polipeptydowi amyloidogennemu w gatunku lub identyfikowanie i ewentualnie izolowanie polipeptydowych produktów ekspresji, kodowanych przez przedstawicieli zestawu fragmentów kwasów nukleinowych, które znacząco indukują produkcję przeciwciała skierowanego przeciwko niezmodyfikowanemu polipeptydowi amyloidogennemu w gatunku zwierzęcym.
W tym kontekście, „zestaw różniących się wzajemnie zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych” jest zbiorem nieidentycznych zmodyfikowanych polipeptydów amyloidogennych, które zostały np. wyselekcjonowane na podstawie kryteriów omówionych powyżej (np. w połączeniu z badaniem dichroizmu kołowego, spektroskopii NMR i/lub wzorów dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego). Zestaw może składać się tylko z kilku przedstawicieli, lecz może też zawierając kilkaset przedstawicieli.
Testowanie członków zestawu można ostatecznie przeprowadzić in vivo, lecz można zastosować szereg testów in vitro, które zawężą ilość zmodyfikowanych cząsteczek.
Ponieważ celem wprowadzenia obcych epitopów dla komórki T jest podtrzymanie odpowiedzi komórki B przez komórkę T pomocniczą, wstępnym warunkiem jest, że proliferacja komórki T jest indukowana przez zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny. Proliferację komórki T można badać przez standaryzowane testy proliferacji in vitro. Pokrótce, od osobnika pobiera się próbkę wzbogaconą w komórki T, a następnie utrzymuje się w hodowli. Hodowane komórki T kontaktuje się z pochodzącymi od osobnika komórkami APC, które wcześniej pobrały zmodyfikowaną cząsteczkę i obrobiły ją tak, że prezentują jej epitopy dla komórki T. Proliferacja komórek T jest monitorowana i porównywana z odpowiednią kontrolą (np. komórkami T w hodowli kontaktowanymi z komórkami APC, które przeprocesowały cały, natywny polipeptyd amyloidogenny). Alternatywnie, proliferację można zmierzyć przez określenie stężenia stosownych cytokin uwalnianych przez komórki T w odpowiedzi na ich rozpoznawanie obcych komórek T.
Po wykazaniu z wysokim prawdopodobieństwem, że przynajmniej jeden zmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny z każdego typu zestawu jest zdolny do indukowania produkcji przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu, możliwe jest wytworzenie kompozycji immunogennej, obejmującej przynajmniej jeden zmodyfikowany polipeptyd amyloidowy, która jest zdolna
PL 204 878 B1 do indukowania przeciwciał skierowanych przeciwko niezmodyfikowanemu polipeptydowi amyloidogennemu w gatunku zwierzęcym, gdzie niezmodyfikowany polipeptyd amyloidogenny jest własnym białkiem. Sposób wytwarzania takiej kompozycji obejmuje zmieszanie członka(ów) zestawu, który znacząco indukuje produkcję w gatunku zwierzęcym przeciwciał, które reagują z polipeptydem amyloidogennym, farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalnego nośnika i/lub podłoża, i/lub rozcieńczalnika, i/lub zaróbki, ewentualnie w kombinacji z przynajmniej jednym farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalnym adiuwantem.
Testowanie zestawów polipeptydowych dogodnie prowadzi się przez wstępne przygotowanie pewnej ilości różniących się wzajemnie sekwencji kwasów nukleinowych lub wektorów według wynalazku, wprowadzenie ich do odpowiednich wektorów ekspresyjnych, transformowanie odpowiednich komórek gospodarza (lub gospodarzy zwierzęcych) wektorami i uzyskiwanie ekspresji sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku. Po tych etapach można przeprowadzić izolację wyrażanych produktów. Korzystnie, sekwencje kwasów nukleinowych i/lub wektory są wytwarzane sposobami obejmującymi stosowanie techniki amplifikacji molekularnej, takiej jak PCR lub sposobami syntezy kwasów nukleinowych.
Specyficzne cele amyloidogenne
Oprócz białek najczęściej związanych z alzheimerowymi APP, ApoE4 i Tau, istnieje długa lista innych białek, powiązanych w pewien sposób z AD, albo przez ich bezpośrednią obecność w płytkach lub splątkach w mózgach AD albo przez ich widoczne powiązanie genetyczne podnoszące ryzyko wystąpienia AD. Większość, o ile nie wszystkie, z tych antygenów, wraz z omówionymi powyżej Ae, APP, preseniliną i ApoE4 są przypuszczalnymi białkami docelowymi.
Alfa1-antychymotrypsyna (ACT) jest głównym składnikiem SP i sugeruje się, że odgrywa ważną rolę w patogenezie zmian chorobowych w AD i amyloidozie naczyniowo-mózgowej (CA) (Acta Neuropathol, 1998, 96: 628-36). Oddziałuje z Ae in vitro i stymuluje zarówno tworzenie jak i przerwanie włókienek Ae-42 (JBC, 1998, 273: 28360-4).
Alfa2-makroglobulinę znaleziono przez immunobarwienie rdzeni płytkowych w mózgach AD. Fragment transbłonowy z podjednostki beta znaleziono w rdzeniach płytkowych, podczas gdy rozpuszczalny fragment alfa znaleziono na zewnątrz komórek w płytkach. Acta Neuropathol, 1998, 96: 628-36 i Brain Res., 1997, 777: 223-227.
ABAD (peptyd Αβ wiążący dehydrogenazę alkoholową) wiąże się z Ae wewnątrz komórki. Jest enzymem neuronalnym obecnym w normalnych komórkach, lecz jest nadwyrażany w neuronach dotkniętych AD. Ae jest bardziej toksyczny dla komórek, które nadwyrażają ABAD. ABAD jest sprzężony z chromosomem X. Yan, 1997, Nature 389.
APLP1 i -2 (białko 1 i -2 podobne do prekursora amyloidu): Oba białka należą do nadrodziny białek homologów APP, lecz utraciły region peptydowy Ae. Pomimo tego, zachodzi znaczące barwienie APLP w płytkach neurytowych. Acta Neuropathol, 1997, 94: 519-524.
AMY117 jest nowym białkiem znalezionym w zmianach chorobowych podobnych do płytek w mózgach ludzi z AD, które wydają się być obfite, rozległe i „ wysoce specyficzne” dla choroby. Podejrzewa się, że białko AMY117 może odgrywać decydującą rolę w rozwoju i postępowaniu AD, przez tworzenie tych płytek. Interesujące, że płytki zawierające AMY117 nie mają wspólnej lokalizacji z płytkami zawierającymi Ae, zatem określają nowy charakterystyczny objaw AD, oprócz dobrze poznanych płytek zawierających Ae i splątków zawierających Tau. Płytki pozytywne pod względem AMY117 znaleziono w dużej ilości w mózgach sporadycznych przypadków AD i w mózgach pochodzących od ludzi z zespołem Downa, lecz są one „rzadkie lub nieobecne” w mózgach od osobników kontrolnych i od osobników z innymi chorobami neurodegeneracyjnymi (Am J Pathol 1997; 151: 69,80).
Bax: Przeciwciała monoklonalne wykryły Bax jako składnik płytek starczych w mózgach AD. Jest ono także nadwyrażane w neurytach dystroficznych. Acta Neuropathol. 1998, 95: 407-412.
Bcl-2 pełni niejasną rolę. Jest nadwyrażane w komórkach glejowych otaczających płytki. Acta Neuropathol. 1998, 95: 407-412.
Hydrolaza bleomycynowa jest prawdopodobnie sekretazą-beta. Stwierdzono immunoreaktywność skierowaną przeciwko hydrolazie bleomycynowej w SP w AD (Brain Res. 1999, 830: 200-202). Pewne genotypy hydrolazy bleomycynowej towarzyszą podniesionemu ryzyku wystąpienia AD w niektórych przypadkach, podczas gdy w innych nie znaleziono korelacji. (Ann Neurol, 1998, 44: 808-811 i Ann Neurol, 1999, 46: 136-137).
BRI/ABRI: ABRI jest fragmentem 4 000u z przypuszczalnego transbłonowego białka, kodowanego przez gen BRI z chromosomu 13, znalezionym w płytkach amyloidowych osób z rodzinnym otępieniem
PL 204 878 B1 brytyjskim (FBD). Pacjenci ci mają mutację w kodonie stop genu BRI, która powoduje powstanie dłuższej otwartej ramki odczytu. Uwolnienie 34 aminokwasów z końca karboksylowego zmienionego białka generuje powstanie podjednostki amyloidowej ABRI. Przeciwciała skierowane przeciwko ABRI rozpoznają zarówno miąższowe jak i naczyniowe zmiany chorobowe w mózgach pacjentów z FBD. Peptyd ABri jest odkładany jako włókienka amyloidowe i uważa się, że powstające płytki prowadzą do dysfunkcji neuronów otępienia charakteryzującego FBD (Vidal, R i wsp., 1999, Nature 399).
Chromogranina A została wykryta w niektórych rozproszonych złogach amyloidowych i w otaczających je neurytach dystroficznych (Brain Res, 1991, 539: 143-50).
Klusteryna/apoJ: Jest to gen często izolowany za pomocą przeszukiwania różnicowego w laboratoriach z różnych dziedzin biologii molekularnej, ponieważ ulega on nadekspresji w wielu przypadkach chorób degeneracyjnych, takich jak AD i chorobie szalonych krów (gąbczastej encefalopatii bydła) (Biochem J 1997 Nov 15; 328(1): 45-50 Michel D, Chatelain G, North S, Brun G).
Białko wiążące CRF (czynnik uwalniający kortykotropinę) wiąże się z 41 aminokwasowym peptydem CRF, który jest w mózgu ważnym czynnikiem regulatorowym w odpowiedzi na stres. Ponieważ większość CRF jest związana z białkiem wiążącym CRF, usunięcie białka wiążącego CRF (przez immunoterapię) mogłoby prowadzić do wzrostu poziomu wolnego CRF, co przypuszczalnie może mieć korzystny wpływ na AD. Behan, 1997, J. Neurochemistry, 68: 2053-2060.
EDTF (czynnik toksyczny pochodzenia śródbłonkowego): Białko wytwarzane przez mikronaczynia u pacjentów z AD. Jest swoiście toksyczny dla neuronów. WO 99/24468.
Proteoglikany siarczanu heparanu wykazują wspólną lokalizację z Ae w SP. Badania na szczurach pokazują, że glikozoaminoglikan siarczanu heparanu jest wymagany do tworzenia amyloidu (Neuron, 1994, 12: 219-234 i Acta Neuropathol, 1998, 96: 628-36).
Ludzkie mediatorowe białko-2 odpowiedzi na kolapsynę jest białkiem o 65 kDa rozpoznawanym w splątkach neurofibrylarnych przez monoklonalne przeciwciało. Wprowadzenie do splątków może usuwać rozpuszczalne białko i prowadzić do powstawania nieprawidłowych wypustek neurytów, zatem przyspieszać degradację neuronalną. JBC, 1998, 273: 9761-8.
Huntingtina (białko choroby Huntingtona): W HD, białko huntingtina jest powiększone na końcu N o poliiglutaminę. Taką formę huntingtiny znaleziono również w NFT w mózgach z AD i w chorobie Picka (Exp. Neurol, 1998, 150: 213-222).
ICAM-I jest gromadzone w SP. Acta Neuropathol, 1998, 96: 628-36 i Am. J Pathol. 1994, 144: 104-16.
IL-6 jest związane ze zmianami neurofibrylarnymi i zostało znalezione w środku płytek. Zaproponowano, że jest czynnikiem wyzwalającym zdarzenia w AD. Jest silnie amplifikowane w astrocytach przez aktywny peptyd 25-35 z Ae. Brain Res., 1997, 777: 223-227 i Behav Brain Res, 1996, 78: 37-41.
Antygen CD68 związany z lizosomem jest rozpoznawany przez przeciwciało KP-1 w NFT i SP. Zatem, lizosomy mogą odgrywać rolę w tworzeniu splątków i płytek. Dement Geriatr Cogn Disord, 1998, 9: 13-19.
P21 ras jest wymagany w pierwszym etapie podnoszenia ilości czynników wzrostowych i mitogenów obserwowanych we wstępnych stadiach rozwoju AD. Neuroscience, 1999, 91: 1-5.
PLC-delta 1 (izoenzym delta 1 fospholipazy C) jest nieprawidłowo akumulowany w NFT I i neurytach otaczających rdzenie płytek. Jest wewnątrzkomórkowy. Alzheimer Dis Assoc Disord, 1995,
9: 15-22.
Składnik surowiczego amyloidu P (SAP) jest normalnym składnikiem osocza obecnym we wszystkich typach złogów amyloidowych, włączając te występujące w AD (JBC, 1995, 270: 26041-4). Jest obserwowany zarówno w SP jak i w NFT. W niektórych badaniach wykazano, że pobudza agregowanie AP i zapobiega proteolizie włókienek (Biochem Biophys Res commun, 1995, 211: 349v-53 i PNAS, 1995, 92: 4299-4303), podczas gdy inne badania wykazują, że SAP hamuje tworzenie włókienek Ae (JBC, 1995, 270: 26041-4).
Synaptofizynę wykryto w niektórych rozproszonych złogach amyloidowych i w otaczających je neurytach dystroficznych. (Brain Res, 1991, 539: 143-50).
Synukleina (alfa-synukleina lub NACP): Składnik amyloidu AD nie będący składnikiem A- beta (NAC) zidentyfikowano biochemicznie jako drugi główny składnik amyloidu oczyszczonego z tkanki mózgowej pacjentów z AD. NAC, pochodzący od swojego prekursora, NACP, o długości 140 aminokwasów, ma długość przynajmniej 35 aminokwasów (NAC35)/chociaż jego koniec aminowy nie jest ściśle określony. Monoklonalne przeciwciało dla NAC barwi immunologicznie SP w mózgachz AD, lecz nie reaguje z NACP (Biochemistry 34 (32): 10139-10145 (Aug 15 1995) Iwai A, Yoshimoto M, Masliah E, Saitoh T). NAC oligomeryzuje ze sobą w obecności Ae. Nowy dowód wskazuje na potencjalną
PL 204 878 B1 rolę tej cząsteczki w niszczeniu synaps i w neurotoksyczności przez tworzenie włókienek podobnych do amyloidu i zaburzanie funkcji. Brain Pathol 1999 Oct; 9 (4): 707-20. FEBS Lett, 1998, 421: 73-76. Część NACP ma wysoką homologię z końcem C fragmentu amyloidowego z APP i z regionem białka prionu w chorobie szalonych krów (PrPSc). Synukleina jest głównym czynnikiem przyczynowym Parkinsona (Chem Biol, 1995, 2: 163-9).
TGF-b1 (transformujący czynnik wzrostu b1): Nadekspresja TGF-b1 ze zmutowanym APP w myszach TG przyspiesza odkładanie Ae. Zatem uważa się, że TGF-b1 jest wymagany w rozpoczynaniu lub pobudzaniu tworzenia płytki amyloidowej. (Wyss-Coray, 1997, Nature 389).
Inne choroby amyloidowe i związane z nimi białka
Oprócz wymienionych powyżej białek, które mogą być potencjalnie zaangażowane w AD i chorobach podobnych do AD (Huntington, Parkinson, FBD i inne formy otępienia), istnieje stosunkowo duża liczba chorób innych niż AD, w których tworzenie amyloidu wyzwala chorobę lub wywołuje objawy choroby. Chociaż, białka związane z tymi chorobami różnią się naturą, mają te same cechy określające amyloid, porównaj powyżej. W poniższej tabeli przedstawiono listę szeregu tych zaburzeń amyloidowych i wywołujących je białek.
Różnorodność białek włókienek amyloidowych
Zespół kliniczny Podjednostka włókienka Struktura prekursora
Mózgowa angiopatia amyloidowa (CAA) Ae Cała β
Układowa skrobiawica z białkiem monoklonalnym (AL) Domena V o pełnej długości lub jej fragment z lekkiego łańcucha IG Cała β
Układowa skrobiawica reaktywna (AA) Fragment z 76 reszt N-końca białka amyloidu A α/β
Rodzinna polineuropatia amyloidozowa pełnej długości lub fragmenty wariantów transtyretyny Cała β
Dziedziczna skrobiawica z ApoA1 N-końcowe fragmenty (~90 reszt) wariantów ApoA1 (α/β)
Dziedziczna skrobiawica lizozymowa pełnej długości warianty lizozymu α + β
Typ II diabetes mellitus Fragment z 37 reszt polipeptydu amyloidu wysepkowego Nieznana
Amyloid pokrewny insulinie Insulina dzikiego typu o pełnej długości α + β
Przenoszona encefalopatia gąbczasta Białko prionowe o pełnej długości lub jego fragmenty α + β
Rak rdzeniasty tarczycy Fragmenty kalcytoniny Nieznana
Starcza skrobiawica układowa Transtyretyna o pełnej długości lub jej fragmenty Cała β
Skrobiawica związana z hemodializą e-2 mikroglobulina dzikiego typu o pełnej długości Cała β
Izolowana skrobiawica przedsionkowa Przedsionkowy czynnik powodujący wydalanie sodu z moczem Nieznana
Dziedziczna mózgowa angiopatia amyloidowa Fragment 110 reszt z wariantu cystatyny α + β
Dziedziczna skrobiawica fińska Fragment 71 reszt z wariantów gelsoliny α/β
Dziedziczna skrobiawica z łańcuchem α Fragmenty wariantów łańcucha α fibrynogenu Nieznana
Wszystkie te białka są, podobnie jak białka wymagane w AD, potencjalnymi celami dla proponowanej tu strategii immunizacji.
Rozważa się, że większość sposobów immunizowania przeciwko polipeptydom amyloidogennym powinna być ograniczona do immunizacji prowadzącej do powstawania przeciwciał reagujących krzyżowo z natywnym polipeptydem amyloidogennym. Niemniej jednak, w niektórych przypadkach będzie korzystne zaindukowanie odpowiedzi komórkowej w formie odpowiedzi CTL skierowanych przeciwko komórkom, które prezentują epitopy MHC Klasy I z polipeptydów amyloidowych - będzie to
PL 204 878 B1 wskazane w tych przypadkach, gdzie zmniejszenie liczby komórek wytwarzających polipeptydy amyloidogenne nie stanowi poważnego szkodliwego efektu ubocznego. W takich przypadkach, gdzie pożądane są odpowiedzi CTL, korzystne jest wykorzystanie technik ze zgłoszenia PCT/DK99/00525 (odpowiadającego zgłoszeniu USSN 09/413186).
W następujących nie ograniczających przykładach, skupiono się na wytworzeniu autoszczepionki na bazie Ae przeciwko AD. Jednak, przytoczone tu zasady mają takie samo zastosowanie do dowolnego białka amyloidowego.
P r z y k ł a d 1
Autoszczepienie w celu immunizacji przeciwko AD
Fakt, że myszy o znokautowanym białku Ae nie wykazują żadnych nieprawidłowości lub szkodliwych działań ubocznych sugeruje, że usunięcie lub obniżenie ilości Ae będzie bezpieczne, Zheng H. (1996).
Opublikowane doświadczenia, w których transgeniczne myszy są immunizowane przeciwko transgenicznemu ludzkiemu białku Ae sugerują, że gdyby było możliwe przerwanie własnej tolerancji, możliwe byłoby obniżenie poziomu Ae dzięki autoreaktywnym przeciwciałom. Doświadczenia te dodatkowo sugerują, że takie obniżenie poziomu Ae potencjalnie mogłoby zapobiegać tworzeniu płytek, a nawet usuwać już wytworzone płytki Ae z mózgu, porównaj Schenk i wsp. (1999). Lecz tradycyjnie jest możliwe wywołanie przeciwciał skierowanych przeciwko własnym białkom.
Opublikowane wyniki nie dostarczają zatem środków do przełamania naturalnej własnej tolerancji przeciwko naturalnym własnym białkom. Dane te nie dostarczają też informacji jak zapewnić, aby reakcja odpornościowa była skierowana wyłącznie lub w głównej mierze przeciwko złogom Ae, a nie przeciwko błonie komórkowej wiążącej białko prekursorowego Ae (APP), jeśli uważa się to za konieczne. Odpowiedź immunologiczna wytwarzana przy użyciu istniejących technologii mogłaby wywoływać przypuszczalnie odpowiedź immunologiczną przeciwko własnym białkom w sposób nie podlegający regulacji, zatem mogłaby być wytwarzana niechciana i nadmierna autoreaktywność przeciwko częściom białka Ae. Zatem, użycie istniejących strategii immunizacji najprawdopodobniej nie będzie w stanie wytwarzać silnych odpowiedzi odpornościowych przeciwko własnym białkom i będzie ponadto niebezpieczne ze względu na potencjalną silną reakcję krzyżową przeciwko błonie związanej z APP, które jest obecne na dużej liczbie komórek w OUN.
Niniejszy wynalazek dostarcza środków do skutecznego wytwarzania silnie regulowanej odpowiedzi odpornościowej przeciwko prawdziwym własnym białkom, które potencjalnie mogłyby tworzyć płytki i wywoływać poważne choroby w OUN lub w innych kompartmentach ciała. Przy użyciu tej technologii z ludzkiego białka Ae będzie wytworzona bezpieczna i skuteczna szczepionka terapeutyczna do leczenia AD.
W świetle tego, można oczekiwać, że AD, choroba przewidywana jako paraliżująca system opieki zdrowotnej w następnym wieku będzie uleczalna lub, że szczepionki, jak opisano, będą przynajmniej stanowić skuteczne podejście terapeutyczne w leczeniu objawów i postępowania choroby.
Technika ta stanowi w całości nowe podejście immunologiczne blokowania odkładania amyloidu w AD i również w innych chorobach neurologicznych.
W poniższej tabeli, przedstawiono 35 rozpatrywanych konstruktów. Wszystkie pozycje w tabeli podane są w stosunku do metioniny startu APP (pierwszy aminokwas w SEK. NR ID.: 2) i obejmują zarówno aminokwasy startu jak i końca, np. fragment 672-714 obejmuje zarówno aminokwas 672 jak i 714. Pozycje startu i końca dla P2 i P30 wskazują, że epitop zastępuje część fragmentu APP we wskazanych pozycjach (obie pozycje włączone do podstawienia) - w większości konstruktów wprowadzone epitopy podstawiają fragment długości epitopu. Gwiazdki w tabeli mają następujące znaczenie:
*) Tylko jedna pozycja dla P2 i P30 oznacza, że epitop został wprowadzony do pochodnej APP we wskazanej pozycji (epitop rozpoczyna się przy aminokwasie przylegającym po stronie C końca do danej pozycji).
**) Konstrukcja 34 zawiera trzy identyczne fragmenty APP rozdzielone odpowiednio przez P30 i P2.
***) Konstrukcja 35 zawiera dziewięć identycznych fragmentów APP rozdzielonych naprzemiennie przez epitopy P30 i P2.
PL 204 878 B1
Nr War Start segmentu APP względem 1 aa z APP Koniec segmentu APP względem 1 aa z APP Pozycja epitopu P2 względem 1 aa z APP Pozycja epitopu P30 względem 1 aa z APP Długość cząsteczki
1 630 770 656 - 670 635 - 655 141
2 630 714 656 - 670 635 - 655 85
3 672 770 735 - 749 714 - 728 99
4 672 770 714 - 728 99
5 672 770 714 - 728 99
6 672 770 723* 723* 135
7 672 770 723* 120
8 672 770 723* 114
9 672 714 672* 64
10 672 714 714* 64
11 672 714 672* 58
12 672 714 714* 58
13 672 714 714* 672* 79
14 672 714 680 - 694 43
15 672 714 685 - 799 43
16 672 714 690 - 704 43
17 672 714 695 - 709 43
18 672 714 675 - 695 43
19 672 714 680 - 700 43
20 672 714 685 - 705 43
21 672 714 690 - 710 43
22 672 714 680* 680* 79
23 672 714 690* 690* 79
24 672 714 700* 700* 79
25 672 714 710* 710* 79
26 672 714 680* 64
27 672 714 690* 64
28 672 714 700* 64
29 672 714 710* 64
30 672 714 680* 58
31 672 714 690* 58
32 672 714 700* 58
33 672 714 710* 58
34 672 714 Po rep. 1** Po rep. 2** 165
35 67 2 714 34 x 3* 34 x 3*** 165
PL 204 878 B1
Część APP, przeciwko której wytworzenie odpowiedzi jest najbardziej interesujące, stanowi 43 aminokwasowy peptyd rdzeniowy Ae (Ae-43, odpowiadający resztom 672-714 w SEK. NR ID.: 2,), który jest głównym składnikiem płytek amyloidowych w mózgach AD. Ten fragment APP jest częścią wszystkich przedstawionych powyżej konstruktów.
Warianty 1 i 2 obejmują część APP położoną powyżej Ae-43, gdzie umieszczono epitopy modelowe P2 i P30. Wszystkie warianty 1 i 3-8 obejmują fragment C-100, który, jak wykazano, jest neurotoksyczny - fragment C-100 odpowiada resztom aminokwasowym 714-770 z SEK. NR ID.: 2. W wariantach 3-5 epitopy zastępują część fragmentu C-100, podczas gdy w wariantach 6-8 są wprowadzone do C-100.
Warianty 9-35 zawierają tylko białko rdzeniowe Ae-43. W wariantach 9-13, P2 i P30 są sfuzowane z dowolnym końcem z Ae-43; w 14-21 P2 i P30 zastępują część Ae-43; w 22-33 P2 i P30 są wprowadzone do Ae-43; 34 zawiera trzy identyczne fragmenty Ae-43 rozdzielone odpowiednio przez P30 i P2; 35 zawiera 9 powtórzeń Ae-43 rozdzielonych naprzemiennie przez epitopy P30 i P2.
Szczegóły patrz Fig. 1 i tabela powyżej.
Jeden dodatkowy typ konstruktu jest szczególnie korzystny. Ponieważ jednym z celów niniejszego wynalazku jest uniknięcie destrukcji komórek produkujących APP, podczas gdy pożądane jest usunięcie Ae, wydaje się wykonalne przygotowanie konstruktów autoszczepionki obejmujących jedynie te części Ae, które nie są wystawione na fazę zewnątrzkomórkową, gdy są obecne w APP. Zatem, konstrukty takie będą wymagały obecności przynajmniej jednego epitopu dla komórki B pochodzącego z fragmentu aminokwasowego zdefiniowanego przez aminokwasy 700-714 w SEK. NR ID.: 2. Ponieważ wydaje się, że taki krótki polipeptyd będzie słabo immunogenny, wobec tego korzystnie taki konstrukt autoszczepionki składa się z wielu kopii epitopu dla komórki B, np. w formie konstruktu mającego strukturę przedstawioną we wzorze I w szczegółowym ujawnieniu wynalazku, porównaj powyżej. W tej wersji wzoru I termin amyloide1-amyloidex są x epitopem dla komórki B zawierającym sekwencje aminokwasowe pochodzące z aminokwasów 700-714 z SEK. NR ID.: 2. Korzystną alternatywą jest, wyszczególniona powyżej, możliwość sprzęgnięcia (poli)peptydu amyloidogennego i wyselekcjonowanego obcego epitopu dla komórki T pomocniczej przez wiązanie amidowe z cząsteczką nośnika polisacharydowego - w ten sposób będzie możliwe zwielokrotnienie prezentacji „słabego” epitopu utworzonego przez aminokwasy 700-714 z SEK. NR ID.: 2, a także będzie możliwe wyselekcjonowanie optymalnej proporcji pomiędzy epitopami dla komórki B i dla komórki T.
P r z y k ł a d 2
Immunizacja myszy transgenicznych za pomocą Ae i białek zmodyfikowanych według wynalazku
Konstrukcja DNA kodującego hAB43+-34. Gen hAB43+-34 skonstruowano w kilku etapach. W pierwszym wytworzono fragment PCR ze starterami ME#801 (SEK. NR ID.: 10) i ME#802 (SEK. NR ID.: 11) stosując jako matrycę starter ME#800 (SEK. NR ID.: 9). ME#800 koduje ludzki fragment abeta-43 ze zoptymalizowanymi kodonami dla E. coli. ME#801 i 802 dodaje do fragmentu odpowiednie miejsca restrykcyjne.
Fragment PCR oczyszczono, strawiono Ncol i Hindlll, oczyszczono ponownie i sklonowano w strawionym Ncol-Hindlll i oczyszczonym wektorze ekspresyjnym pET28b+ dla E. coli. Uzyskano plazmid kodujący ludzki Ae-43 dzikiego typu, nazwany pAB1.
W następnym etapie do końca C cząsteczki dodano epitop P2 dla komórki T pomocniczej. Starter ME#806 (SEK. NR ID.: 12) zawiera sekwencję kodującą epitop P2, zatem wytwarza fuzję P2 z Abeta-43 w reakcji PCR.
Klonowanie przeprowadzono przez wytworzenie fragmentu PCR ze starterami ME#178 (SEK. NR ID.: 8) i ME#806 przy użyciu pAB1 jako matrycy. Fragment oczyszczono, strawiono Ncol i Hindlll, oczyszczono ponownie i sklonowano w strawionym Ncol-Hindlll i oczyszczonym wektorze pET28b+. Uzyskany plazmid nazwano pAB2.
W analogiczny sposób wytworzono inny plazmid niosący Ae-43, kodujący sekwencję z innym epitopem dla komórki T pomocniczej, P30, dodanym do końca N. Wykonano go przez wytworzenie fragmentu PCR ze starterami ME#105 (SEK. NR ID.: 7) i ME#807 (SEK. NR ID.: 13) przy użyciu jako matrycy pAB1.
Fragment oczyszczono, strawiono Ncol i Hindlll, oczyszczono ponownie i sklonowano w strawionym Ncol-Hindlll i oczyszczonym wektorze pET28b+. Uzyskany plazmid nazwano pAB3.
W trzecim etapie, na końcu C epitopu P2 z plazmidu pAB2 dodawane jest drugie powtórzenie Ae-43 za pomocą startera ME#809 (SEK. NR ID.: 14). W tym samym czasie ME#809 tworzy miejsce BamHI bezpośrednio za powtórzeniem Ae-43. Fragment PCR wytworzono ze starterami ME#178
PL 204 878 B1 i ME#809 przy użyciu pAB2 jako matrycy. Fragment strawiono Ncol i Hindlll, oczyszczono i sklonowano w strawionym Ncol-Hindlll i oczyszczonym wektorze pET28b+. Uzyskany plazmid nazwano pAB4.
W końcu, epitop 30 - sekwencja powtórzenia Ae-43 z pAB3 sklonowano w plazmidzie pAB4. Przeprowadzono to przez wytworzenie fragmentu PCR ze starterami ME#811 (SEK. NR ID.: 16) i ME#105 przy użyciu pAB3 jako matrycy. Fragment oczyszczono i zastosowano jako starter w następnej reakcji PCR z ME#810 (SEK. NR ID.: 15) przy użyciu pAB3 jako matrycy. Uzyskany fragment oczyszczono, strawiono BamHI i Hindlll, sklonowano w strawionym BamHI-Hindlll i oczyszczonym plazmidzie pAB4. Uzyskany plazmid, pAB5, koduje cząsteczkę hAB43+-34.
Wszystkie procedury reakcji PCR i klonowania przeprowadzono zasadniczo jak opisano w Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. 1989 „Molecular cloning: a laboratory manual”. Wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
Do procedur klonowania użyto komórki E. coli K-12, szczepu Top-10 F' (Stratagene, USA). Wektor pET28b+ nabyto z Novagen, USA. Wszystkie startery zsyntetyzowano w DNA Technology, Dania.
Wyrażanie i oczyszczanie hAB43+-34. Białko hAB43+-34 kodowane przez pAB5 wyrażono w komórkach E. coli BL21-Gold (Novagen), jak opisane przez dostawców systemu pET28b+ (Novagen).
Wyrażone białko hAB43+-34 oczyszczano do ponad 85% czystości przez wymycie ciał inkluzyjnych, a następnie chromatografię kationowymienną, przy użyciu zestawu do oczyszczania BioCad (PerSeptive Biosystems, USA) w obecności 6 M mocznika. Następnie mocznik usuwano za pomocą stopniowej dializy wobec roztworu zawierającego zmniejszającą się ilość mocznika. Buforem końcowym był 10 mM Tris, pH 8,5.
Badanie immunizacji. W badaniach stosowano myszy transgeniczne dla ludzkiego APP (białko prekursorowe Alzheimera). Myszy te, nazwane TgRND8+, wyrażają zmutowaną formę APP, która daje wysokie stężenie Ae-40 i Ae-42 w mysich mózgach (Janus, C. i wsp.).
Myszy (8-10 myszy na grupę) immunizowano albo Abeta-42 (SEK. NR ID.: 2, reszty 673-714, zsyntetyzowany środkami standardowej strategii Fmoc) albo wariantem hAB43+-34 (konstrukt 34 w tabeli w Przykładzie 1, wytworzony rekombinacyjnie) cztery razy w dwutygodniowych odstępach. Dawki wynosiły 100 mg dla Ae lub 50 mg dla hAB43+-34. Myszy skrwawiono w 43 dniu (po trzeciej iniekcji) i po 52 dniu (po czwartej iniekcji) i surowice stosowano do określenia poziomu mian swoistego anty-Ae-42 stosując bezpośredni test ELISA z Ae-42.
Tabela poniżej pokazuje średnie dotyczące mian anty-Abeta-42.
Immunogen 43 dzień (po 3 immunizacjach) 52 dzień (po 4 immunizacjach)
Ae-42 4000 3000
hAB43+-34 16000 23000
Jak jasno wynika, miana przeciwciała uzyskanego, gdy immunizowano stosując wariant hAB43+-34 Ae, są 4-razy i 7,5-raza wyższe po, odpowiednio, 3 i 4 immunizacjach, niż miana uzyskane, gdy jako immunogen stosowano niezmieniony Ae-42 dzikiego typu. Fakt ten ma dalsze perspektywy, gdy weźmie się pod uwagę, iż ilość wariantu zastosowanego do immunizacji wynosiła tylko 50% ilości sekwencji dzikiego typu użytej do immunizacji.
P r z y k ł a d 3
Synteza szczepionki z kopolimeru peptydu Ae przy użyciu aktywowanego polihydroksypolimeru jako czynnika sieciującego
Wprowadzenie. Tradycyjna szczepionka sprzężona składa się z (poli)peptydu kowalencyjnie sprzężonego z białkiem nośnikowym. Peptyd zawiera epitop(y) dla komórki B i białko nośnikowe dostarczające epitopy dla komórki T pomocniczej. Jednakże, większość białka nośnikowego będzie zwykle nieodpowiednia jako źródło epitopów dla komórki T pomocniczej, ponieważ tylko niewielka część całej sekwencji zawiera stosowne epitopy dla komórki T pomocniczej. Epitopy takie można określić i zsyntetyzować jako peptydy składające się z np. 12-15 aminokwasów. Jeśli peptydy takie są kowalencyjnie połączone z peptydami zawierającymi epitopy dla komórki B, np. przez multiwalentny aktywowany polihydroksypolimer, można uzyskać cząsteczkę szczepionkową, która zawiera tylko stosowne części. Jest dalej możliwe dostarczenie koniugatu szczepionkowego, który zawiera zoptymalizowany stosunek epitopów dla komórki B do epitopów dla komórki T.
PL 204 878 B1
Synteza aktywowanego polihydroksypolimeru
Polihydroksypolimery, takie jak dekstran, skrobia, agaroza itd. można aktywować chlorkiem 2,2,2-trifluoroetanosulfonylu (chlorek tresylu) albo sposobami syntezy homogennej (dekstran) rozpuszczony w N-metylopirolidynonie (NMP) lub środkami syntezy heterogennej (skrobia, agaroza, usieciowany dekstran) w np. acetonie.
225 ml suchego N-metylopirolidynonu (NMP) dodaje się w suchych warunkach do zliofilizowanego, rozpuszczalnego w wodzie dekstranu (4,5 g, 83 mmol, klasa kliniczna, średni Mw 78000) w 500 ml kolbie okrągłodennej zaopatrzonej w magnez do mieszania. Kolbę umieszcza się w łaźni olejowej w 60°C z mieszaniem magnetycznym. Temperaturę podnosi się do 92°C przez okres 20 minut. Gdy dekstran jest rozpuszczony, kolbę natychmiast wyjmuje się z łaźni olejowej i obniża się temperaturę w łaźni do 40°C. Kolbę ponownie umieszcza się w łaźni olejowej, wciąż z mieszaniem magnetycznym i dodaje się kroplami chlorek tresylu (2,764 ml, 25 mmol). Po 15 minutach, dodaje się kroplami suchą pirydynę (bezwodna, 2,020 ml, 25 mmol). Kolbę wyjmuje się z łaźni olejowej i miesza przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Produkt (dekstran aktywowany tresylem, TAD) wytrąca się 1200 ml zimnego etanolu (99,9%). Supernatant zlewa się, a precypitat zbiera w 50 ml probówkach polipropylenowych i wiruje przy 2000 obr./min. Precypitat rozpuszcza się w 50 ml 0,5% kwasu octowego, dializuje dwa razy wobec 5000 ml 0,5% kwasu octowego i liofilizuje. TAD można przechowywać jako zliofilizowany proszek w -20°C.
Nierozpuszczalny polihydroksypolimer, taki jak agaroza lub usieciowany dekstran, można poddawać aktywacji tresylem przez wytworzenie zawiesiny polihydroksypolimeru w np. acetonie i przeprowadzenie syntezy w postaci syntezy na fazie stałej. Aktywowany polihydroksypolimer można także zbierać przez filtrowanie. Dogodne sposoby opisano w np. Nilsson K i Mosbach K (1987), Methods in Enzymology 135, str. 67 oraz w Hermansson GT i wsp. (1992), w „Immobilized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, Inc., str. 87.
Synteza szczepionek z kopolimerów peptydu A Beta. TAD (10 mg) rozpuszcza się w 100 μl H2O i dodaje się 1000 μl buforu węglanowego, pH 9,6, zawierającego 5 mg Ae-42 (SEK. NR ID.: 2, reszty 673-714), 2,5 mg P2 (SEK. NR ID.: 4) i 2,5 mg P30 (SEK. NR ID.: 6). Wszystkie peptydy Ae-42 oraz P2 i P30 zawierają chronione grupy lizynowe: są one w formie grup lizynowych chronionych 1-(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylem (Dde). Peptydy są produkowane sposobami standardowej strategii Fmoc, gdzie tradycyjny Fmoc-Lys(Boc)-OH został zamieniony przez Fmoc-Lys(Dde)OH (uzyskany z Novabiochem, nr kat. 04-12-1121), tj grupa ε-aminowa w lizynie jest chroniona przez Dde zamiast Boc.
Mierzy się wartość pH i doprowadza do 9,6 przy użyciu 1 M HCl. Po 2,5 godzinach w temperaturze pokojowej, dodaje się hydrazynę z roztworu 80% do końcowego stężenia 8% i roztwór inkubuje się przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej i natychmiast po tym liofilizuje. Zliofilizowany produkt rozpuszcza siew H2O i dializuje ekstensywnie wobec H2O przed końcową liofilizacją.
Stosunek epitopów dla komórki B (Ae) i epitopów dla komórki T pomocniczej (P2 i P30) w produkcie końcowym może być różny, w związku z użyciem różnych stężeń tych peptydów w etapie syntezy. Ponadto, produkt końcowy można wyznakować np. mannozą (tak aby kierowany był do komórek APC) przez dodanie aminowanej mannozy do buforu węglanowego w etapie syntezy.
Jeśli do łączenia polipeptydów zawierających epitop dla komórki B i epitopy dla komórki T pomocniczej stosowany jest nierozpuszczalny aktywowany polihydroksypolimer sprzęganie z polimerem można przeprowadzać jako syntezę na fazie stałej, a produkt końcowy zbiera się i oczyszcza przez płukanie i filtrację.
Literatura
Brookmeyer, R.; Gray, S.; Kawas, C. (1998). Projections of Alzheimer's Disease in the United States and the Public Health Impact of Delaying Disease Onset. American Journal of Public Health, 88(9), 1337-1342.
Buttini, M.; Orth, M.; Bellosta, S.; Akeefe, H.; Pitas, R.E.; Wyss-Coray, T.; Mucke, L.; Mahley, R.W. (1999). Expression of Human Apolipoprotein E3 or E4 in the Brains of Apoe-/-Mice: Isoform-Specific Effects on Neurodegeneration. Journal of Neuroscience, 19, 4867-4880.
Clark, L.N.; Poorkaj, P.; Wszolek, Z.; Geschwind, D.H.; Nasreddine, Z.S.; Miller, B.; Li, D.; Payami, H.; Awert, F.; Markopoulou, K.; Andreadis, A.; D'Souza, I.; Lee, V.M.; Reed, L.; Trojanowski, J.Q.; Zhukareva, V.; Bird, T.; Schellenberg, G.; Wilhelmsen, K.C. (1998). Pathogenic Implications of Mutations in the Tau Gene in Pallido-Ponto-Nigral Degeneration and Related Neurodegenerative Disorders Linked to Chromosome 17. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(22), 13103-13107.
PL 204 878 B1
Gupta, R. K. i wsp. (1998), Dev Biol Stand. 92: 63-78.
Hsiao K. i wsp. (1998) Transgenic mice expressing Alzheimer amyloid precursor proteins”, Exp. Gerontol. 33 (7-8), 883-889 Hutton, M.; Lendon, C.L.; Rizzu, P.; Baker, M.; Froelich, S.; Houlden, H.; Pickering-Brown, S.; Chakraverty, S.; Isaacs, A.; Grover, A.; Hackett, J.; Adamson, J.; Lincoln, S.; Dickson, D.; Davies, P.; Petersen, R.C.; Stevens, M.; de Graaff, E.; Wauters, E.; van Baren, J.; Hillebrand, M.; Joosse, M.; Kwon, J.M.; Nowotny, P.; Che, L.K.; Norton, J.; Morris, J.C.; Reed, L.E.; Trojanowski, J.; Basun, H.; Lannfelt, L.; Neystat, M.; Fahn, S.; Dark, F.; Tannenberg, T.; Dodd, P.; Hayward, N.; Kwok, J.B.J.; Schofield, P.R.; Andreadis, A.; Snowden, J.; Craufurd, D.; Neary, D.; Owen, F.; Oostra, B.A.; Hardy, J.; Goate, A.; van Swieten, J.; Mann, D.; Lynch, T.; Heutink, P. (1998). Association of Missense and 5'-Splice-Site Mutations in Tau with the Inherited Dementia FTDP-17. Nature, 393, 702-705.
Janus, C. i wsp. (2000), Nature 408: 979-982.
Kas, H.S. (1997) J Microencapsul 14: 689-711
Leon, J.; Cheng, C.K.; Neumann, P.J. (1998). Alzheimer's Disease Care: Costs and Potential Savings. Health Affairs, 17(6), 206-216.
Lippa C. F. i wsp. (1998) Ab-42 deposition precedes other changes in PS-1 Alzheimer's disease. Lancet 352, 1117-1118 Luo, J.-J.; Wallace, W.; Riccioni, T.; Ingram, D.K.; Roth, G.S.; Kusiak, J.W. (1999). Death of PC12 Cells and Hippocampal Neurons Induced by Adenoviral-Mediated FAD Human Amyloid Precursor Protein Gene Expression. Journal of Neuroscience Research, 55(5), 629-642.
Naruse, S.; Thinakaran, G.; Luo, J.-J.; Kusiak, J.W.; Tomita, T.; Iwatsubo, T.; Qian, X.; Ginty, D.D.; Price, D.L.; Borchelt, D.R.; Wong, P.C.; Sisodia, S.S. (1998). Effects of PS1 Deficiency on Membrane Protein Trafficking in Neurons. Neuron, 21(5), 1213-1231.
National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999, NIH Publication No. 99-4664.
Pietrobon, P.J. (1995), Pharm Biotechnol. 6: 347-61 Poorkaj, P.; Bird, T.D.; Wijsman, E.; Nemens, E.; Garruto, R.M.; Anderson, L.; Andreadis, A.; Wiederhold, W.C.; Raskind, M.; Schellenberg, G.D. (1998). Tau Is a Candidate Gene for Chromosome 17 Frontotemporal Dementia. Annals of Neurology, 43, 815-825.
Schenk, D.; Barbour, R.; Dunn, W.; Gordon, G.; Grajeda, H.; Guido, T.; Hu, K.; Huang, J.; Johnson-Wood, K.; Khan, K.; Kholodenko, D.; Lee, M.; Liao, Z.; Lieberburg, I.; Motter, R.; Mutter, L.; Soriano, F.; Shopp, G.; Vasquez, N.; Vandevert, C; Walker, S.; Wogulis, M.; Yednock, T.; Games, D.; Seubert, P. (1999). Immunization with A-beta Attenuates Alzheimer's Disease-Like Pathology in the PDAPP Mouse. Nature, 400(6740), 173-177.
Shekunov, B. i wsp. (1999), J. Crystal Growth 198/199: 1345 -1351.
Spillantini, M.G.; Murrell, J.R.; Goedert, M.; Farlow, M.R.; Klug, A.; Ghetti, B. (1998). Mutation in the Tau Gene in Familial Multiple System Tauopathy with Presenile Dementia. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(13), 7737-7741.
Strittmatter, W.J.; Saunders, A.M.; Schmechel, D.; Pericak-Vance, M.; Enghild, J.; Salvesen, G.S.; Roses, A.D. (1993). Apolipoprotein E: High-Avidity Binding to Ae and Increased Frequency of Type 4 Allele in Late-Onset Familial Alzheimer Disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 90, 1977-1981.
Vidal, R.; Frangione, B.; Rostagno, A.; Mead, S.; Revesz, T.; Plant, G.; Ghiso, J. (1999). A Stop-Codon Mutation in the BRI Gene Associated with Familial British Dementia. Nature, 399: 776-781.
Zheng H. (1996) Mice deficient for the amyloid precursor protein gene. Ann. N Y Acad. Sci.,
777, 421-426.
York, P. (1999), PSTT 11: 430-440.
PL 204 878 B1
Lista sekwencji <110> M&E Biotech A/S <120> Nowy sposób obniżania poziomu amyloidu <130> P1009PC1 <140>
<141>
<160> 16 <170> Patentln wer. 3.0 <210> 1 <211> 2313 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1) . . (2313) <220>
<221> cecha_dowolna <222> (2098) . . (2169) <223> nukleotydy kodujące region transbłonowy <220>
<221> cecha_dowolna <222> (2014) . . (2313) <223> nukleotydy kodujące C-100 <220>
<221> cecha_dowolna <222> (2016) . . (2144) <223> Abeta 42/43 <220>
<221> cecha_dowolna
PL 204 878 B1 <222> (2014) . . (2142) <223> Abeta 42/43 <400> 1
atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg gct cgg
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
1 5 10 15
gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag
Gin Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
35 40 45
144
aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
50 55 60
192
acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65 70 75 80
240
cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac
Gin Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr Ile Gin Asn
85 90 95
288
tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
100 105 110
336
att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc
Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
384
gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys
130 135 140
gaa act cat ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu
432
480
PL 204 878 B1
PL 204 878 B1
tac Tyr ggc Gly gga Gly tgt Cys ggc Gly 325 ggc Gly aac Asn cgg Arg aac Asn aac Asn 330 ttt Phe gac Asp aca Thr gaa Glu gag Glu 335 tac Tyr 1008
tgc atg gcc gtg tgt ggc agc gcc atg tcc caa agt tta ctc aag act 1056
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
acc cag gaa cct ctt gcc ega gat cct gtt aaa ctt cct aca aca gca 1104
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 365
gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat etc gag aca cct ggg gat 1152
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc 1200
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala
385 390 395 400
aag cac ega gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gaa gag gca 1248
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410 415
gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa get gat aag aag gca gtt atc 1296
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
420 425 430
cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tet ttg gaa cag gaa gca gcc aac 1344
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn
435 440 445
gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg 1392
Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450 455 460
ctc aat gac ege ege ege ctg gcc ctg gag aac tac atc acc get ctg 1440
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu
465 470 475 480
PL 204 878 B1
cag Gin gct Ala gtt Val cct Pro cct Pro 485 cgg Arg cct Pro cgt Arg cac His gtg Val 490 ttc Phe aat Asn atg Met eta Leu aag Lys 495 aag Lys 1488
tat gtc cgc gca gaa cag aag gac aga cag cac acc eta aag cat ttc 1536
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc gct cag atc cgg tcc 1584
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin Ile Arg Ser
515 520 525
cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag cgc atg aat cag tct 1632
Gin Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser
530 535 540
ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc gag gag att cag gat 1680
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gin Asp
545 550 555 560
gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tea gat gac gtc 1728
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat gct 1776
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
580 585 590
ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg gag ctc ctt ccc 1824
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
595 600 605
gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag ccg tgg cat tct ttt 1872
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 620
ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag cct gtt 1920
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
gat gcc cgc cct gct gcc gac ega gga ctg acc act ega cca ggt tct 1968
PL 204 878 B1
2016
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp 645 Arg Gly Leu Thr Thr 650 Arg Pro Gly 655 Ser
ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tet gaa gtg aag atg gat
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 670
gca gaa ttc ega cat gac tea gga tat gaa gtt cat cat caa aaa ttg
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu
675 680 685
gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tea aac aaa ggt gca atc att gga
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690 695 700
ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705 710 715 720
gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
725 730 735
gag gtt gac gee get gtc acc cca gag gag ege cac ctg tcc aag atg
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg
Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met
755 760 765
2064
2112
2160
2208
2256
2304 cag aac tag Gin Asn
770
2313
<210> 2
<211> 770
<212> PRT
<213> Homo sapiens
PL 204 878 B1 <400> 2
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu 1 5
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly 20
Gin Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg 35 40
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro 50 55
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gin Tyr 65 70
Gin Ile Thr Asn Val Val Glu Ala
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin 100
Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly 115 120
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu 130 135
Glu Thr His Leu His Trp His Thr 145 150
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr 165
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe 180
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp 195 200
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp
Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 10 15
Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 25 30
Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 60
Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 75 80
Asn Gin Pro Val Thr Ile Gin Asn
95
Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 105 110
Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 125
His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 140
Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 155 160
Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 170 175
Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 185 190
Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 205
Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
PL 204 878 B1
PL 204 878 B1
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn 435 440 445
Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu
465 470 475 480
Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
485 490 495
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin Ile Arg Ser 515 520 525
Gin Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser 530 535 540
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gin Asp
545 550 ' 555 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe 610 615 620
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
PL 204 878 B1
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu 665 Ile Ser Glu Val Lys 670 Met Asp
660
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu
675 680 685
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690 695 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705 710 715 720
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
725 730 735
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met
Ί55 760 765
Gin Asn
770 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Clostridium tetani
<220>
<221> CDS
<222> (1)··(45)
<223> DNA kodujący epitop P2
<400> 3
cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg 45
Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
PL 204 878 B1 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 4
Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 15 10 15 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> Clostridium tetani <220>
<221> CDS <222> (1) . . (63) <223> DNA kodujący epitop P30 <400> 5
ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
gct agc cac ctg gaa 63
Ala Ser His Leu Glu
20
<210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 6
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15
Ala Ser His Leu Glu
PL 204 878 B1
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> syntetyczny
<400> 7 caactcagct tcctttcggg c
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> syntetyczny
<400> 8
agatctcgat cccgcgaaat t
<210> 9
<211> 135
<212> DNA
<213> syntetyczny
<400> 9 atggatgcag ttcgcagaag gttatcgcga aattccgtca cgactccggt atgttggttc caacaaaggt cctag tacgaagttc accaccagaa actggttttc gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt
120
135
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> syntetyczny
<400> 10 gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
PL 204 878 B1 <213> syntetyczny <400> 11 gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc
<210> 12
<211> 84
<212> DNA
<213> syntetyczny
<400> 12 ccggcaagct tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg 60 gtcgcgataa caacaccgcc aacc 84 <210> 13 <211> 101 <212> DNA <213> syntetyczny <400> 13 gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgaaagttag 60 cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g 101 <210> 14 <211> 172 <212> DNA <213> syntetyczny
<400> 14
gggccaagct tggatccggt cgcgataaca acaccgccaa ccatcagacc gatgattgca 60
cctttgttgg aaccaacatc ttctgcgaag aaaaccagtt tctggtggtg aacttcgtaa 120
ccggagtcgt gacggaactc tgcatccagc tcggtgatac cgatgaattt 99 172
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> syntetyczny
PL 204 878 B1 <400> 15 ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc 30 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> syntetyczny <400> 16 gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc 35

Claims (41)

1. Zastosowanie czynnika wybranego spośród:
a) co najmniej jednego analogu zwierzęcego autologicznego Ae (beta amyloidu) albo polipeptydu APP (amyloidowego białka prekursorowego), zmodyfikowanego przez wprowadzenie przynajmniej jednego izolowanego obcego epitopu dla limfocytu pomocniczego T (epitop TH) na drodze insercji, addycji, delecji albo substytucji aminokwasu, przy czym obcy epitop TH jest wolny od aminokwasów-D i jest wprowadzony do autologicznego Ae lub APP jak schematycznie pokazano dla epitopów P2 i P30 na Fig. 1,
b) nukleotydowej sekwencji kodującej co najmniej jeden analog określony w a) i
c) niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego określonego w b) do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania, i/lub łagodzenia choroby Alzheimera lub innych chorób i stanów charakteryzujących się odkładaniem Ae u zwierzęcia.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wyniku wprowadzenia obcego epitopu TH zasadnicza część epitopów komórki B Ae albo APP jest zachowana oraz, że
- jest wprowadzone przynajmniej jedno pierwsze ugrupowanie, które powoduje kierowanie analogu do komórki prezentującej antygen (APC) albo do limfocytu B i/albo
- jest wprowadzone przynajmniej jedno drugie ugrupowanie, które stymuluje układ odpornościowy i/albo
- jest wprowadzone przynajmniej jedno trzecie ugrupowanie, które optymalizuje prezentowanie analogu układowi odpornościowemu.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że analog jest modyfikowany przez wprowadzenie pierwszego i/albo drugiego i/lub trzeciego ugrupowania jako grup bocznych i kowalencyjne albo niekowalencyjne wiązanie z odpowiednimi grupami chemicznymi w Ae, APP albo w jego fragmencie.
4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że analog zawiera co najmniej jeden epitop komórki B Ae lub APP podwojony i/lub wprowadzony hapten.
5. Zastosowanie według zastrz. 1-4, znamienne tym, że obcy epitop komórki T jest immunodominujący w zwierzęciu.
6. Zastosowanie według zastrz. 1-5, znamienne tym, że obcy epitop komórki T jest epitopem mieszanym, takim jak obcy epitop komórki T, który jest wybrany z naturalnego mieszanego epitopu komórki T oraz sztucznej sekwencji peptydu wiążącego MHC-II.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że naturalny epitop komórki T jest wybrany spośród epitopu anatoksyny tężca, jak P2 albo P30, epitopu anatoksyny błonicy, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy i epitopu CS z P. falciparum.
8. Zastosowanie według z zastrz. 2-7, znamienne tym, że pierwsze ugrupowanie jest zasadniczo swoiście wiążącym partnerem dla specyficznego antygenu powierzchniowego limfocytu B albo dla specyficznego antygenu powierzchniowego APC, takiego jak hapten lub węglowodan, dla których istnieje receptor na limfocycie B lub na APC.
PL 204 878 B1
9. Zastosowanie według zastrz. 2-8, znamienne tym, że drugie ugrupowanie jest wybrane spośród cytokin, takich jak interferon γ (IFN-γ) lub jego skuteczna część, Flt3L lub jego skuteczna część, interleukina 1 (IL-1) lub jej skuteczna część, interleukina 2 (IL-2) lub jej skuteczna część, interleukina 4 (IL-4) lub jej skuteczna część, interleukina 6 (IL-6) lub jej skuteczna część, interleukina 12 (IL-12) lub jej skuteczna część, interleukina 13 (IL-13) lub jej skuteczna część, interleukina 15 (IL-15) lub jej skuteczna część, oraz czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) lub jego skuteczna część; hormonu; oraz białek szoku cieplnego takich, jak HSP70 lub jego skuteczna część, HSP90 lub jego skuteczna część, HSC70 lub jego skuteczna część, GRP94 lub jego skuteczna część oraz kalretikulina (CRT) lub jej skuteczna część.
10. Zastosowanie według zastrz. 2-9, znamienne tym, że trzecie ugrupowanie ma charakter lipidowy i jest takie, jak grupa palmitoilowa, grupa mirystylowa, grupa farnezylowa, grupa geranylo-geranylowa, kotwica GPI i grupa N-acylodiglicerydowa lub takie ugrupowanie jest polihydroksypolimerem, takim jak polisacharyd.
11. Zastosowanie według zastrz. 1-10, znamienne tym, że autologiczny Ae albo APP jest tak zmodyfikowany, że zachowuje epitopy komórki B, które nie są eksponowane na fazę zewnątrzkomórkową, gdy są obecne w postaci związanego z komórką autologicznego APP.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że Ae albo APP jest tak zmodyfikowany, że brakuje co najmniej jednego epitopu komórki B, który jest eksponowany na fazę zewnątrzkomórkową, gdy jest obecny w postaci związanego z komórką autologicznego APP.
13. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że obejmuje substytucję przynajmniej jednej sekwencji aminokwasowej w obrębie autologicznego Ae albo APP sekwencją aminokwasową o równej lub różnej długości, która tworzy obcy epitop TH w analogu.
14. Zastosowanie według zastrz. 1-13, znamienne tym, że analog obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 672-714 w SEK. NR ID.: 2, do której jest wprowadzona sekwencja aminokwasowa prowadząca do powstania obcego epitopu TH w analogu albo analog obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 672-714 w SEK. NR ID.: 2, w której przynajmniej jedna sekwencja aminokwasowa jest podstawiona sekwencją aminokwasową o równej lub różnej długości, co prowadzi do powstania obcego epitopu TH.
15. Zastosowanie według zastrz.1-13, znamienne tym, że analog od N-końca do C-końca składa się z reszt aminokwasowych 672-714 SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 4, po której następują reszty aminokwasowe 672-714 sekwencji SEK. NR ID.: 2, po których następuje Sek. NR ID.: 6 po których następują reszty aminokwasowe 672-714 z SEK. NR ID.: 2.
16. Zastosowanie zastrz. 1-13, znamienne tym, że analog od N-końca do C-końca składa się z reszt aminokwasowych 630-634 SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. Id. Nr: 6, po której następuje SEK. NR ID.: 4 po której następują reszty aminokwasowe 672-714 z SEK. NR ID.: 2.
17. Zastosowanie zastrz. 1-13, znamienne tym, że analog od N-końca do C-końca składa się z reszt aminokwasowych 672-713 z SEK. Id. Nr: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 6, po której następują reszty aminokwasowe 729-734 sekwencji z SEK. NR ID.: 2, po których następuje SEK. NR ID.: 4 po której następują reszty aminokwasowe 750-770 z SEK. NR ID.: 2.
18. Zastosowanie według zastrz. 1-17, znamienne tym, że co najmniej dwie kopie analogu są kowalencyjnie lub niekowalencyjnie połączone z cząsteczką nośnika zdolną do skutecznej prezentacji wielu kopii determinant antygenowych.
19. Zastosowanie według zastrz. 1-18, znamienne tym, że analog jest sformułowany z adiuwantem ułatwiającym przerwanie autotolerancji na autoantygeny.
20. Zastosowanie według zastrz. 1-19, znamienne tym, że lek zawierający skuteczną ilość analogu jest podawany zwierzęciu na drodze wybranej spośród drogi pozajelitowej, takiej jak śródskórna, podskórna i domięśniowa; dootrzewnowej; doustnej; dopoliczkowej, podjęzykowej; nadtwardówkowej; dokręgowej; doodbytniczej oraz wewnątrzczaszkowej.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że skuteczna ilość analogu jest w zakresie 0,5 μg - 2000 μg.
22. Zastosowanie według zastrz. 20 albo 21, znamienne tym, że analog jest zawarty w urządzeniu będącym wirtualnym węzłem chłonnym (VLN).
23. Zastosowanie według zastrz. 1-17, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do wprowadzenia kwasu(ów) nukleinowego(ych) kodującego analog do komórek zwierzęcych i tym samym uzyskania ekspresji in vivo w komórkach, do których wprowadzono kwas(y) nukleinowy(e).
PL 204 878 B1
24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że wprowadzany kwas(y) nukleinowy(e) jest/są wybrany(e) spośród nagiego DNA, DNA sformułowanego z lipidami z ładunkiem lub bez ładunku, DNA sformułowanego w liposomach, DNA zawartego w wektorze wirusowym, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem ułatwiającym transfekcję, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem naprowadzającym, DNA sformułowanego z czynnikami wytrącającymi wapń, DNA sprzężonego z obojętną cząsteczką nośnikową, DNA enkapsulowanego w chitynie albo chitozanie, oraz DNA sformułowanego z adiuwantem.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że kwas(y) nukleinowy(e) jest/są zawarty(e) w urządzeniu VLN.
26. Zastosowanie według zastrz. 21-25, znamienne tym, że lek jest podawany/wprowadzany przynajmniej raz na rok, przykładowo przynajmniej 2, przynajmniej 3, przynajmniej 4, przynajmniej 6 i przynajmniej 12 podań/wprowadzeń.
27. Zastosowanie według zastrz. 1-17, znamienne tym, że lek do zapobiegania i/lub łagodzenia zawiera niepatogenny mikroorganizm lub wirus, który niesie fragment kwasu nukleinowego kodujący lub wyrażający analog.
28. Analog polipeptydu amyloidogennego pochodzący ze zwierzęcego Ae (beta amyloidu) albo APP (białka prekursorowego amyloidu), do którego wprowadzono przynajmniej jeden izolowany obcy epitop TH jak pokazano schematycznie dla epitopów P2 i P30 na Fig. 1, w wyniku czego immunizacja zwierzęcia analogiem indukuje wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciwko polipeptydowi amyloidogennemu.
29. Analog według zastrz. 28, znamienny tym, że modyfikacja jest określona w zastrz. 2-17.
30. Immunogenna kompozycja, znamienna tym, że obejmuje skuteczną immunogennie ilość analogu określonego w zastrz. 28 albo 29 i farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę i ewentualnie adiuwant.
31. Fragment kwasu nukleinowego kodujący analog określony w zastrz. 28 albo 29.
32. Wektor niosący fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 31 zdolny do autonomicznej replikacji.
33. Wektor według zastrz. 32, znamienny tym, że jest wybrany z grupy składającej się z plazmidu, faga, kosmidu, minichromosomu i wirusa.
34. Wektor według zastrz. 32 albo 33, znamienny tym, że obejmuje, w kierunku 5' >3' funkcjonalnie połączone, promotor kierujący ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 31, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający wydzielanie lub integrację z błoną fragmentu polipeptydu, fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 31 i ewentualnie terminator.
35. Wektor według zastrz. 32-34, znamienny tym, że wprowadzony do komórki gospodarza jest zdolny lub niezdolny do integracji z genomem komórki gospodarza.
36. Wektor według zastrz. 34 albo 35, znamienny tym, że promotor kieruje ekspresją w komórce eukariotycznej i/albo w komórce prokariotycznej.
37. Stransformowana komórka niosąca wektor określony w zastrz. 32-36, znamienna tym, że jest zdolna do replikacji fragmentu kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 31.
38. Stransformowana komórka według zastrz. 37, znamienna tym, że jest mikroorganizmem wybranym z bakterii, drożdży, protozoa albo jest komórką pochodzącą z organizmu wielokomórkowego wybraną spośród komórki grzyba, komórki owadziej takiej, jak komórka S2 lub SF, komórki roślinnej i komórki ssaka.
39. Stransformowana komórka według zastrz. 37 albo 38, znamienna tym, że wyraża fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 31, i jest taka jak stransformowana komórka, która wydziela lub niesie na swojej powierzchni analog określony w zastrz. 28 albo 29.
40. Kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał skierowanych przeciwko Ae albo APP u zwierzęcia, znamienna tym, że obejmuje:
- fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 31 albo wektor określony w zastrz. 32-36 oraz
- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/albo zaróbkę i/lub adiuwant.
41. Stabilna linia komórkowa niosąca wektor określony w zastrz. 32-36 i wyrażająca fragment kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 31 i ewentualnie wydzielająca lub niosąca na swojej powierzchni analog określony w zastrz. 28 albo 29.
PL362889A 2000-02-21 2001-02-19 Zastosowanie analogu autologicznego zwierzęcego Aβ albo polipeptydu APP lub sekwencji kodującej taki analog lub mikroorganizmu lub wirusa, który niesie nukleotydową sekwencję kodującą taki analog, analog polipeptydu amyloidogennego, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego kodujący analog, wektor, stransformowana komórka, kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał i stabilna linia komórkowa PL204878B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000265 2000-02-21
PCT/DK2001/000113 WO2001062284A2 (en) 2000-02-21 2001-02-19 Novel method for down-regulation of amyloid

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362889A1 PL362889A1 (pl) 2004-11-02
PL204878B1 true PL204878B1 (pl) 2010-02-26

Family

ID=8159174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362889A PL204878B1 (pl) 2000-02-21 2001-02-19 Zastosowanie analogu autologicznego zwierzęcego Aβ albo polipeptydu APP lub sekwencji kodującej taki analog lub mikroorganizmu lub wirusa, który niesie nukleotydową sekwencję kodującą taki analog, analog polipeptydu amyloidogennego, immunogenna kompozycja, fragment kwasu nukleinowego kodujący analog, wektor, stransformowana komórka, kompozycja do indukowania produkcji przeciwciał i stabilna linia komórkowa

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20030086938A1 (pl)
EP (2) EP1632242A3 (pl)
JP (1) JP5025871B2 (pl)
CN (1) CN1279971C (pl)
AR (1) AR027947A1 (pl)
AT (1) ATE306933T1 (pl)
BR (1) BR0108566A (pl)
CO (1) CO5280094A1 (pl)
DE (1) DE60114157T2 (pl)
DK (1) DK1259251T3 (pl)
EA (1) EA008762B1 (pl)
EE (1) EE200200444A (pl)
EG (1) EG25830A (pl)
ES (1) ES2248283T3 (pl)
GC (1) GC0000355A (pl)
HK (1) HK1054865B (pl)
HU (1) HUP0300067A3 (pl)
IL (3) IL150066A0 (pl)
IS (1) IS6446A (pl)
ME (2) ME00183B (pl)
MY (1) MY131826A (pl)
NO (1) NO20023961L (pl)
NZ (1) NZ521442A (pl)
PL (1) PL204878B1 (pl)
RS (1) RS51164B (pl)
SI (1) SI1259251T1 (pl)
SK (1) SK287468B6 (pl)
WO (1) WO2001062284A2 (pl)
ZA (1) ZA200204830B (pl)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6905686B1 (en) 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
US6689753B1 (en) * 1999-11-05 2004-02-10 Axonyx, Inc. β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide
KR20080017471A (ko) * 2000-02-21 2008-02-26 파멕사 에이/에스 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
DE60114157T2 (de) * 2000-02-21 2006-06-29 Pharmexa A/S Verfahren zur herabregulierung von amyloid
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
EP1251138B1 (en) * 2001-04-19 2006-07-26 Hermann Dr. Schätzl Prion protein dimers useful for vaccination
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
EP1820806A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-22 Crossbeta Biosciences B.V. Affinity regions
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
EP1380290A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-14 Universitair Medisch Centrum Utrecht Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
AU2003246690B2 (en) 2002-07-17 2010-03-11 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein
NZ537003A (en) 2002-07-18 2008-03-28 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
BR0312792A (pt) 2002-07-19 2005-05-03 Cytos Biotechnology Ag Composições de vacinas contendo séries antigênicas de amilóide beta1-6
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
PE20050627A1 (es) 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
WO2005047860A2 (en) * 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
MY144231A (en) 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
JP2008523815A (ja) 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのヒト化アミロイドβ抗体
JP4903159B2 (ja) * 2005-04-20 2012-03-28 ディナベック株式会社 アルツハイマー病の治療のための安全性に優れた鼻腔内投与可能遺伝子ワクチン
US20070015133A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Umc Utrecht Holding B.V. Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein
CA2615028A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Cross-.beta. structure binding compounds
CA2615020A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Adjuvation through cross-.beta. structure
US8114832B2 (en) 2005-07-13 2012-02-14 Crossbeta Biosciences B.V. Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition
CA2631195C (en) 2005-11-30 2016-04-05 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
CN101432302A (zh) 2005-11-30 2009-05-13 艾博特公司 抗－Aβ球聚体抗体，其抗原结合部分，相应的杂交瘤、核酸、载体、宿主细胞，生产所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP2007300856A (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Hiroshi Mori アミロイドタンパク質模倣物
WO2008040759A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Pharmexa A/S Method for down-regulation of cripto
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2118300B1 (en) * 2007-02-23 2015-05-27 Prothena Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
WO2008106657A2 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2182983B1 (en) 2007-07-27 2014-05-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases with humanised anti-abeta antibodies
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2058000A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Immunogenic compositions capable of activating T cells
EP2058001A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Enhancement of immunogenicity of antigens
HUE028921T2 (en) 2008-06-27 2017-01-30 Zoetis Services Llc New adjuvant preparations
US8491890B2 (en) 2008-07-09 2013-07-23 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for inhibiting diseases of the central nervous system
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
EP2258398A1 (en) 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
CN101858910B (zh) * 2010-03-25 2013-03-27 辽宁大学 一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US9289488B2 (en) 2010-08-12 2016-03-22 Ac Immune Sa Vaccine engineering
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
TW201223561A (en) 2010-10-26 2012-06-16 Ac Immune Sa Preparation of an antigenic construct
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
CN109846862A (zh) * 2012-10-25 2019-06-07 通用医疗公司 治疗阿尔茨海默病及相关疾病的组合疗法
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
EP3046580A2 (en) 2013-09-19 2016-07-27 Zoetis Services LLC Oil-based adjuvants
AU2014340182B2 (en) 2013-10-22 2019-05-23 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
KR20230097209A (ko) * 2014-03-12 2023-06-30 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드 Cns의 질환 및 손상을 치료하기 위한 전신적 조절 t 세포 수준 또는 활성의 감소
US10478487B2 (en) 2015-01-16 2019-11-19 Zoetis Services Llc Foot-and-mouth disease vaccine
EP3454885A4 (en) * 2016-05-12 2019-12-25 Ohio State Innovation Foundation PEPTIDES AND METHODS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISORDERS
CN116889562A (zh) 2016-08-31 2023-10-17 通用医疗公司 与神经退行性疾病相关的神经炎症中的巨噬细胞/小胶质细胞
CN106854233B (zh) * 2017-03-03 2020-07-17 国家纳米科学中心 一种类肽及其制备方法和应用
CN107412782B (zh) * 2017-04-27 2020-09-08 国家纳米科学中心 一种多肽聚合物纳米材料及其制备方法和应用
EP3424524A3 (en) 2017-07-04 2019-02-27 CureVac AG Cancer rna-vaccine
WO2019017995A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Aztherapies, Inc. FORMULATIONS OF CROMOLYNE SODIUM POWDER AND IBUPROFEN
CA3095983A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Ac Immune Sa Anti-abeta therapeutic vaccines
KR20210071943A (ko) 2018-07-02 2021-06-16 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 크로몰린 소듐 및 α-락토스의 분말화된 제형
CN112210003A (zh) * 2019-07-09 2021-01-12 厦门德馨尚品医疗科技有限公司 一种重组载脂蛋白j及其类似物的晶体结构及应用

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596792A (en) * 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) * 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) * 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) * 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
DK96493D0 (da) * 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
WO1995007707A1 (en) * 1993-09-14 1995-03-23 Cytel Corporation Alteration of immune response using pan dr-binding peptides
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5854204A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Aβ peptides that modulate β-amyloid aggregation
US5874469A (en) * 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
US5854469A (en) * 1996-06-28 1998-12-29 Gabay; David Heating unit for therapeutic instrument
US5985581A (en) * 1996-07-25 1999-11-16 The Mclean Hospital Corporation Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease
IT1293511B1 (it) * 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20040062802A1 (en) * 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
IL141588A0 (en) * 1998-09-15 2002-03-10 M & E Biotech As Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity
EA003634B1 (ru) * 1998-10-05 2003-08-28 Фармэкса А/С Новые способы терапевтической вакцинации
IL145982A0 (en) * 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
EP1237930B1 (en) * 1999-12-08 2006-11-08 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
KR20080017471A (ko) * 2000-02-21 2008-02-26 파멕사 에이/에스 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
DE60114157T2 (de) * 2000-02-21 2006-06-29 Pharmexa A/S Verfahren zur herabregulierung von amyloid
WO2001090182A2 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 New York University Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
AU2003208314A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-22 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
AU2003256578A1 (en) * 2002-07-17 2004-02-02 Intellect Neurosciences, Inc. Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease

Also Published As

Publication number Publication date
GC0000355A (en) 2007-03-31
HUP0300067A3 (en) 2010-03-29
US20030086938A1 (en) 2003-05-08
MEP30408A (en) 2010-10-10
IS6446A (is) 2002-06-26
SK11782002A3 (sk) 2004-02-03
JP5025871B2 (ja) 2012-09-12
EA008762B1 (ru) 2007-08-31
DE60114157D1 (de) 2006-03-02
HUP0300067A2 (en) 2003-05-28
DK1259251T3 (da) 2006-03-06
DE60114157T2 (de) 2006-06-29
SK287468B6 (sk) 2010-10-07
US20090311281A1 (en) 2009-12-17
EG25830A (en) 2012-09-02
CN1279971C (zh) 2006-10-18
IL150066A0 (en) 2002-12-01
NZ521442A (en) 2003-09-26
IL150066A (en) 2009-02-11
ES2248283T3 (es) 2006-03-16
BR0108566A (pt) 2002-11-19
US20070041945A1 (en) 2007-02-22
CO5280094A1 (es) 2003-05-30
WO2001062284A3 (en) 2001-11-29
IL189646A0 (en) 2011-07-31
JP2003523402A (ja) 2003-08-05
WO2001062284A2 (en) 2001-08-30
CN1416350A (zh) 2003-05-07
PL362889A1 (pl) 2004-11-02
ZA200204830B (en) 2003-11-26
NO20023961D0 (no) 2002-08-20
AR027947A1 (es) 2003-04-16
ATE306933T1 (de) 2005-11-15
HK1054865A1 (en) 2003-12-19
EP1632242A2 (en) 2006-03-08
EP1632242A3 (en) 2011-08-31
EP1259251A2 (en) 2002-11-27
MY131826A (en) 2007-09-28
ME00183B (me) 2011-02-10
YU57702A (sh) 2005-09-19
SI1259251T1 (sl) 2006-04-30
HK1054865B (zh) 2007-06-01
NO20023961L (no) 2002-08-20
EE200200444A (et) 2003-12-15
EP1259251B1 (en) 2005-10-19
RS51164B (sr) 2010-10-31
EA200200889A1 (ru) 2003-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2400838C (en) Novel method for down-regulation of amyloid
JP5025871B2 (ja) アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
EP1420815B1 (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140219