ES2248283T3 - Nuevo procedimiento para reducir los niveles de amiloide. - Google Patents

Nuevo procedimiento para reducir los niveles de amiloide.

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ES2248283T3
ES2248283T3 ES01905632T ES01905632T ES2248283T3 ES 2248283 T3 ES2248283 T3 ES 2248283T3 ES 01905632 T ES01905632 T ES 01905632T ES 01905632 T ES01905632 T ES 01905632T ES 2248283 T3 ES2248283 T3 ES 2248283T3
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Abstract

Uso de un agente seleccionado entre a) al menos un análogo de un péptido de Aâ (beta amiloide) o APP (proteína precursora amiloide) autólogo de animal en el que se introduce al menos un epítope de auxiliares T extraño aislado (epítope TH) por medio de inserción, adición, supresión, o sustitución de aminoácidos, en el que el epítope TH extraño está libre de aminoácidos D y se introduce en Aâ o APP autólogo como se muestra esquemáticamente para los epítopes P2 y P30 en la figura 1, b) una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un análogo definido en a), y c) un microorganismo o virus no patógeno que lleva el fragmento de ácido nucleico definido en b) para la preparación de un medicamento que contiene el agente para tratar y/o prevenir y/o mejorar de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades y afecciones caracterizadas por depósitos de Aâ en dicho animal.

Description

Nuevo procedimiento para reducir los niveles de amiloide.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a mejoras en terapia y prevención de la enfermedad de Alzheimer (AD) y otras enfermedades caracterizadas por deposición de amiloides, por ejemplo caracterizadas por depósitos de amiloides en el sistema nervioso central (SNC). Más específicamente, la presente invención permite un procedimiento para regular hacia abajo (no deseado) depósitos de amiloide permitiendo la producción de anticuerpos contra la proteína relevante o componentes de la misma en sujetos que sufren de o en peligro de sufrir enfermedades que tienen una patología que implica deposición de amiloides. La invención también proporciona procedimientos para producir polipéptidos útiles en este procedimiento así como para los polipéptidos modificados como tal. También comprendida por la presente invención están fragmentos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos modificados así como vectores que incorporan estos fragmentos de ácidos nucleicos y células hospedadoras y líneas celulares transformadas con ellos. La invención también proporciona composiciones que comprenden polipéptidos modificados o que comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptidos modificados.
Antecedentes de la invención
La amiloidosis es la deposición extracelular de fibrilas proteicas insolubles que conduce a daño y enfermedad del tejido (Pepys, 1996; Tan y col., 1995; Kelly, 1996). Las fibrilas se forman cuando las proteínas y péptidos normalmente solubles se autosocian de una manera anormal (Kelly, 1997).
El amiloide está asociado a enfermedades graves que incluyen amiloidosis sistémica, AD, diabetes de comienzo en la madurez, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia frontotemporal y las encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas con priones (enfermedad de kuru y Creutzfeldt - Jacob en seres humanos y cenurosis ovina y BSE en ovejas y ganado vacuno, respectivamente) y la formación de placa amiloide en por ejemplo enfermedad de Alzheimer parece estar estrechamente asociada a la progresión de enfermedad humana. En modelos animales la sobreexpresión, o la expresión de formas modificadas, de proteínas encontradas en depósitos, como la proteína \beta-amiloide, se ha mostrado que induce diversos síntomas de enfermedad, por ejemplo, síntomas de tipo Alzheimer.
No existe ningún tratamiento específico para la deposición de amiloide y estas enfermedades son usualmente fatales.
Las subunidades de fibrilas amiloides pueden ser de tipo salvaje, proteínas variantes o truncadas, y fibrilas similares se pueden formar in vitro a partir de oligopéptidos y proteínas desnaturalizadas (Bradbury y col., 1960; Filshie y col., 1964; Burke y Rougvie, 1972). La naturaleza del componente polipeptídico de las fibrilas define el carácter de la amiloidosis. A pesar de las grandes diferencias en tamaño, la estructura y función nativa de las proteínas amiloides, todas las fibrilas amiloides son de longitud indeterminada, no ramificadas, de 70 a 120\ring{A} de diámetro, y muestran tinción característica con Rojo Congo (Pepys, 1996). Son características de una estructura \beta transversal (Pauling y Corey, 1951) en al que la cadena polipeptídica está organizada en hojas \beta. Aunque las proteínas amiloides tienen estructuras precursoras muy diferentes, todas pueden experimentar una conversión estructural, quizás junto con una ruta similar, a una forma que es el bloque de construcción del protofilamento de la hélice de las hojas \beta.
Este patrón de fibra distintivo condujo a las amiloidosis que se llaman las \beta-fibrilosis (Glenner, 1980a, b), y la proteína de fibrilas de la AD se denominó la proteína \beta antes de que se conociera su estructura secundaria (Glener y Wong, 1984). El patrón de difracción transversal \beta característico, junto con la apariencia de las fibrilas y las propiedades de tinción son ahora los sellos diagnósticos aceptados de amiloide, y sugieren que las fibrilas, aunque formadas a partir de precursores proteicos completamente diferentes, comparten un grado de similitud estructural y comprenden una superfamilia estructural, independientemente de la naturaleza de sus proteínas precursoras (Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 31 de octubre de 1997; 273 (3): 729 - 739).
Una de las enfermedades más extendidas y bien conocidas en las que los depósitos de amiloides en el sistema nervioso central se sugieren que tienen un papel central en la progresión de la enfermedad es la AD.
AD
La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno cerebral irreversible, progresivo que se produce gradualmente y da como resultado pérdida de memoria, cambios conductuales y de personalidad, y deterioro de las capacidades mentales. Estas pérdidas están relacionadas con la muerte de las células del cerebro y la interrupción de las conexiones entre ellas. El curso de esta enfermedad varía entre personas, como hace la velocidad de deterioro. De promedio, las pacientes de AD viven 8 a 10 años después de que se diagnostican, aunque la enfermedad puede durar hasta 20 años.
La AD avanza por fases, desde falta de memoria temprana, suave hasta una pérdida grave de función mental. Esta pérdida se conoce como demencia. En la mayoría de las personas con AD, los primeros síntomas aparecen después de la edad de los 60, pero comienzos más tempranos no son infrecuentes. Los síntomas más tempranos a menudo incluyen pérdida de memoria reciente, juicio defectuoso, y cambios en personalidad. A menudo, las personas en las fases iniciales de AD piensan menos claramente y olvidan los nombres de personas familiares y objetos comunes. Más tarde en al enfermedad, pueden olvidar cómo hacer incluso tareas sencillas. Eventualmente, las personas con AD pierden toda la capacidad de razonar y se hacen dependientes de otra persona para su cuidado cada día. Por último, la enfermedad se hace tan debilitante que los pacientes están postrados y probablemente desarrollan otra enfermedad e infecciones. Lo más común, las personas con AD mueren de neumonía.
Aunque el riesgo de desarrollar AD aumenta con la edad, los síntomas de AD y demencia no son una parte del envejecimiento normal. La AD y otros trastornos de demencia están provocados por enfermedades que afectan al cerebro. En el envejecimiento normal, las células nerviosas en el cerebro no se pierden es grandes números. Por el contrario, la AD, altera sus procesos claves: comunicación de células nerviosas, metabolismo, y reparación. Esta alteración por último provoca que muchas células nerviosas paren de funcionar, pierden conexiones con otras células nerviosas, y mueren.
Al principio, la AD destruye neuronas en partes del cerebro que controlan la memoria, especialmente en el hipocampo y estructuras relacionadas. Como las células nerviosas en el hipocampo dejan de funcionar correctamente, la memoria a corto plazo falla, y a menudo, una capacidad de la persona que hace tareas fáciles y familiares comienza a decaer. La AD también ataca al cortex cerebral, particularmente las áreas responsables de lenguaje y razonamiento. Eventualmente, están implicadas muchas otras áreas del cerebro, todas estas regiones del cerebro se atrofian (contracción), y el paciente de AD llega a estar postrado, abandonado, totalmente imposibilitado, e insensible al mundo exterior (fuente; National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
El impacto de la AD
La AD es la causa más común de demencia entre personas de 65 años de edad y mayor. Presenta un problema de salud importante debido a su enorme impacto sobre individuos, familias, el sistema de cuidado de salud, y sociedad como un conjunto. Los científicos estiman que hasta 4 millones de personas actualmente padecen la enfermedad, y la frecuencia se dobla cada 5 años por encima de los 65 años de edad. También se estima que aproximadamente 360.000 nuevos casos (incidencia) se producirán cada año, aunque este número se incrementará a medida que la población envejece (Brookmeyer y col., 1998).
La AD supone un gravamen económico pesado en la sociedad. Un estudio reciente en Leo Estados Unidos estimaba que el coste anual de cuidado para un paciente es 18.418 dólares para un paciente con la AD suave, 30.096 dólares para un paciente con AD moderada, y 36.132 dólares para un paciente con Ad grave. El coste nacional anual de cuidado para los pacientes con la AD en los Estados Unidos se estima que es ligeramente superior a los 50.000 millones de dólares (Leon y col., 1998).
Aproximadamente 4 millones de americanos son mayores de 85 años, y en la mayoría de los países industrializados, este grupo de edad es uno de los segmentos de crecimiento más rápido de la población. Se estima que este grupo ascenderá a cerca de 8,5 millones el año 2030 en los Estados Unidos; algunos expertos que estudian las tendencias de población sugieren que el número podría ser incluso mayor. Cuanto más viven las personas, el número de personas afectadas por estas enfermedades de envejecimiento, incluyendo la AD, continuarán creciendo. Por ejemplo, algunos estudios muestran cerca de la mitad de todas las personas de 85 años y mayores tienen alguna forma de demencia. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Las características principales de la AD
Las estructuras anormales en el cerebro son los sellos de la AD: placas amiloides de ovillos neurofibrilares (NFT). Las placas son depósitos densos, insolubles en gran medida de material proteico y celular fuera y alrededor de las neuronas del cerebro. Los ovillos son fibras retorcidas insolubles que se acumulan en las neuronas interiores.
Existen dos tipos de AD: AD familiar (FAD), que sigue un cierto patrón de herencia, y AD esporádica, donde no se observa ningún patrón obvio de herencia. Debido a las diferencias en al edad de comienzo, la AD se describe adicionalmente como comienzo temprano (produciéndose en personas menores de 65 años) o de comienzo tardío (produciéndose en los de 65 años o mayores). La AD de comienzo temprano es raro (aproximadamente 10 por ciento de los casos) y generalmente afecta a personas con edades entre 30 y 60. Algunas formas de AD de comienzo temprano son hereditarias y se desarrollan en familias. La AD de comienzo temprano también a menudo progresa más rápido que la forma más común, de comienzo tardío.
Todas las FAD hasta ahora tienen un comienzo temprano, y como mucho el 50 por ciento de los casos de FAD se sabe ahora que están provocadas por defectos en tres genes localizados en tres cromosomas diferentes. Éstos son mutaciones en el gen APP sobre el cromosoma 21; mutaciones en un gen sobre el cromosoma 14, llamado presenilina 1; y mutaciones en un gen sobre el cromosoma 1, llamado presenilina 2. Sin embargo, todavía no existe evidencia de que cualquiera de estas mutaciones juegan un papel importante en la forma más común, esporádica o no familiar de la AD de comienzo tardío. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Placas amiloides
En la AD, las placas amiloides se desarrollan primero en áreas del cerebro usadas para memoria y otras funciones cognitivas. Constan de depósitos insolubles en gran medida de amiloide beta (de aquí en adelante denominado A \beta) - un fragmento de proteína precursora amiloide (APP, la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC ID Nº 2) - entremezclado con partes de neuronas y con células no nerviosas tales como microglía y astrositos. No se sabe si las propias placas amiloides constituyen la causa principal de la AD o si son un subproducto del proceso de la AD. Ciertamente, cambios en la proteína APP puede provocar la AD, como se muestra en la forma heredada de la AD provocada por mutaciones en el gen APP, y la formación de la placa A\beta parece que está estrechamente asociada a la progresión de la enfermedad humana (Lippa C. F. y col., 1998).
APP
La APP es una de las muchas proteínas que están asociadas con las membranas celulares. Después de que está hecha, la APP se llega a embeber en las membranas celulares nerviosas, parcialmente en el interior y parcialmente en el exterior de la célula. Recientes estudios que usan ratones transgénicos demuestran que al APP parece que juega un papel importante en el crecimiento y supervivencia de neuronas. Por ejemplo, ciertas formas y cantidades de la APP pueden proteger neuronas contra tanto daño a corto como largo plazo y pueden hacer que las neuronas dañadas sean capaces de repararse mejor ellas mismas y ayudar a partes de neuronas a crecer después de la lesión cerebral.
Mientras que la APP está embebida en al membrana celular, las proteasas actúan en sitios particulares en la APP, escindiéndose en fragmentos de proteínas. Otra proteasa ayuda a escindir la APP para formar A\beta, y otra proteasa escinde la APP en la mitad del fragmento amiloide de manera que no se pueda formar A\beta. La A \beta formada es de dos longitudes diferentes, una más corta de 40 (ó 41) aminoácidos A\beta que es relativamente soluble y se agrega lentamente, y una ligeramente más larga, de 42 aminoácidos A\beta "pegajosa" que rápidamente forma grumos insolubles. Mientras que la A\beta se está formando, no se sabe exactamente cómo se mueve a través o alrededor de células nerviosas. En las fases finales de este proceso, la A\beta "pegajosa" se agrega en largos filamentos en el exterior de al célula, junto con fragmentos de neuronas muertas y moribundas y la microglía y astrositos, forma las placas que son características de la AD en el tejido cerebral.
Existe alguna evidencia de que las mutaciones en la APP se obtienen más probablemente que la A\beta se recortarán fuera del precursor de la APP, de este modo provocando o bien más A\beta total o relativamente más de la forma "pegajosa" a preparar. También parece que las mutaciones en al presenilina puede contribuir a la degeneración de neuronas en al menos dos formas: modificando la producción de más o desencadenando la muerte de células más directamente. Otros investigadores sugieren que las presenilinas 1 y 2 pueden estar implicadas en al aceleración de la marcha de la apoptosis.
Se espera que a medida que la enfermedad progresa, se formarán más y más placas, llenando más y más el cerebro. Los estudios sugieren que puede ser que la A\beta se agregue y desagregue al mismo tiempo, de un modo de equilibrio dinámico. Esto eleva la esperanza de que pueda ser posible romper las placas incluso después de que se formen. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Se cree que la A\beta es tóxica para las neuronas. En estudios de cultivos de tejidos, los investigadores observaron un incremento en la muerte de células neuronales del hipocampo modificadas por ingeniería genética para sobreexpresan formas mutadas de APP humana comparadas con neuronas que sobreexpresan la APP humana normal (Luo y col., 1999).
Además, la sobreexpresión o la expresión de formas modificadas de la proteína A\beta se ha demostrado en modelos animales que induce síntomas de tipo Alzheimer, (Hsiao K. y col., 1998).
Dado que la generación de A\beta se incrementa, su agregación en placas, y la neurotoxicidad resultante puede conducir a la AD, es de interés terapéutico investigar condiciones bajo las que la agregación de A\beta en placas podría ralentizarse o incluso bloquearse.
Presenilinas
La mutaciones en la presenilina 1 (S-180) son responsables de casi el 50% de todos los casos de AD familiar de comienzo temprano (FAD). Alrededor de 30 mutaciones se han identificado que dan lugar a la AD. El comienzo de la AD varía con las mutaciones. Las mutaciones en la presenilina 2 son responsables de una parte mucho más pequeña de los casos de FAD, pero es todavía un factor significante. Se sabe ahora si las presenilinas están implicadas en AD no familiar esporádica. La función de las presenilinas no se conoce, pero parece que están implicadas en el procesamiento de APP para proporcionar A\beta-42 (la forma más pegajosa más larga del péptido, SEC ID Nº 2, residuos 673 - 714), ya que los pacientes de AD con mutaciones de presenilina tienen niveles incrementados de este péptido. No está claro si la presenilinas también tienen un papel en la provocación de la generación de NFT. Algo sugiere que las presenilinas podrían tener un papel más directo en la degeneración de neuronas y muerte de neuronas. La presenilina 1 se localiza en el cromosoma 14 mientras que la presenilina 2 esta ligada al cromosoma 1. Si una persona alberga una versión mutada de solo uno de estos genes él o ella es casi cierto que desarrolla la AD de comienzo temprano.
Existe cierta incertidumbre de si la presenilina 1 es idéntica a la secretasa gama hipotética implicada en el procesamiento de APP (Naruse y col., 1998).
Apolipoproteína E
La apolipoproteína E está usualmente asociada a colesterol, pero también se encuentra en placas y ovillos de los cerebros de la AD. Mientras que los alelos 1 - 3 no parece que estén implicadas en la AD existe una correlación significativa entre la presencia del alelo APOE-e4 y desarrollo de la AD tardía (Strittmatter y col., 1993). Es, sin embargo, un factor de riesgo y no una causa directa como es el caso para la presenilina y las mutaciones de APP y no se limita a la AD familiar.
Las formas en los que la proteína de ApoE e4 de aumentar la probabilidad de desarrollar la AD no se conocen con certeza, pero una posible teoría es que facilita la acumulación de A\beta y esto contribuye a ralentizar la edad de aparición de la AD, o la presencia o ausencia de alelos de APOE particular puede afectar la forma en que las neuronas responden a la lesión. (Buttini y col., 1999).
También la Apo A1 se ha mostrado que es amiloigénica. La apo A1 intacta puede ella misma formar fibrilas de tipo amiloide in vitro que son rojo congo positivas (Am J. Pathol 147 (2): 238 - 244 (agosto de 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewiski KE, Frangione B).
Parecen existir resultados contradictorios que indican que existe un efecto positivo del alelo APOE-34 en la disminución de síntomas de pérdida mental, comparado con otros alelos (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
Ovillos neurofibrilares
Este segundo sello de la AD consta de colecciones anormales de hebras retorcidas encontradas en el interior de las células nerviosas. El componente principal de los ovillos es una forma de una proteína llamada tau (t). En el sistema nervioso central, las proteínas tau se conocen mejor por su capacidad de unirse y ayudar a estabilizar los microtúbulos, que son un constituyente de la estructura de soporte interno, o esqueleto de las células. Sin embargo, en la AD la tau se cambia químicamente, y esta tau alterada no puede estabilizar más los microtúbulos, provocando que se desintegren. Este colapso del sistema de transporte puede al principio dar como resultado malfunciones en la comunicación entre células nerviosas y puede más tarde conducir a la muerte de neuronas.
En la AD, la tau químicamente alterada se retuerce en dos hebras de filamentos helicoidales apareados de tau que se enrollan entre sí. Estos filamentos son la principal sustancia encontrada en los ovillos neurofibrilares. En un estudio reciente, los investigadores encontraron cambios neurofibrilares en menos de 6% de las neuronas en una parte particular del hipocampo en cerebros sanos, en más del 43 por ciento de estas neuronas de las personas que murieron con AD suave, y en 71 por ciento de estas neuronas de personas que murieron con AD grave. Cuando se estudió la pérdida de neuronas, se encontró una progresión similar. Evidencia de este tipo soporta la idea de que la formación de ovillos y al pérdida de neuronas progresa junto con el curso de la AD. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Tauopatías y ovillos
Varias enfermedades neurodegenerativas, distintas de la AD, se caracterizan por la agregación de tau en filamentos insolubles en neuronas y glia, conduciendo a disfunción y muerte. Muy recientemente, varios grupos de investigadores, que estuvieron estudiando familias con una variedad de demencias hereditarias distintas de AD, encontraron las primeras mutaciones en el gen tau sobre el cromosoma 17 (Clark y col., 1998; Hutton y col., 1998; Poorkaj y col., 1998; Spillantini y col., 1998). En estas familias, las mutaciones en el gen tau provocan muerte celular neuronal y demencia. Estos trastornos que comparten algunas características con la AD pero difieren en varios respectos importantes, se llaman colectivamente "demencia frontotemporal y parkinsonismo ligado al cromosoma 17" (FTDP-17). Son enfermedades tales como enfermedad de Parkinson, algunas formas de esclerosis lateral amiotrófica (ALS), degeneración corticobasal, parálisis supranuclear progresiva, y enfermedad de Pick, y todas están caracterizadas por la agregación anormal de la proteína tau.
Otras enfermedades neurológicas de tipo AD
Existen importantes paralelismos entre la AD y otras enfermedades neurológicas, incluyendo enfermedades de priones (tales como kuru, enfermedad de Creutzfeld - Jacob y encefalitis espongiforme bovina), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, y demencia frontotemporal. Todo implica depósitos de proteínas anormales en el cerebro. La AD y enfermedades de priones provocan demencia y muerte, y ambas están asociadas con la formación de fibrilas amiloides insolubles, pero de proteínas de membrana que son diferentes entre sí.
Los científicos que estudian la enfermedad de Parkinson, el segundo trastorno neurodegenerativo más común después de AD, descubrieron el primer gen ligado a la enfermedad. Este gen codifica una proteína llamada sinucleína, que, de manera desconcertante, también se encontró en las placas amiloides de los cerebros de pacientes de AD (Lavedan C, 1998, Genome Res. 8 (9): 871 - 80). Los investigadores también descubrieron que defectos genéticos en la enfermedad de Huntington, otro trastorno neurodegenerativo progresivo que provoca demencia, provocan que la proteína de Huntington forme fibrilas insolubles muy similares a las fibrilas A\beta de la AD y las fibrilas proteicas de la enfermedad de priones, (Scherzinger E, y col., 1999, PNAS Estados Unidos 96 (8): 4604 - 9):
Los científicos también han descubierto un gen novedoso, que cuando muta, es responsable de la demencia familiar británica (FBD), una enfermedad heredada rara que provoca trastornos de movimiento graves y demencia progresiva similar a la observada en la AD. En un análisis bioquímico de las fibrilas amiloides encontradas en las placas de FBD, se encontró un único péptido llamado ABri (Vidal y col., 1999). Una mutación en un punto particular junto con este gen da como resultado la producción de una proteína Bri más larga que la normal. El péptido ABri, que es una forma recortada del extremo mutado de la proteína Bri se deposita como fibrilas amiloides. Estas placas se piensa que conducen a la disfunción neuronal y demencia que caracteriza FBD.
Inmunización con A\beta
El sistema inmune normalmente tomará parte en la eliminación de proteína extraña y partículas proteináceas en el organismo pero los depósitos asociados a las enfermedades anteriormente mencionadas constaban principalmente de auto - proteínas, por lo tanto haciendo que el papel del sistema inmune en el control de estas enfermedades sea menos obvio. Además, los depósitos se localizan en un compartimiento (el SNC) separado normalmente del sistema inmune, sugiriendo ambos hechos que cualquier vacuna o planteamiento inmunoterapéutico sea ineficaz.
Sin embargo, los científicos recientemente han intentado inmunizar ratones con una vacuna compuesta de A\beta humana heteróloga y una sustancia conocida que excita el sistema inmune (Schenk y col., 1999 y el documento WO 99/27944). La vacuna se ensayó en un modelo de ratón transgénico parcial de la AD con un gen mutado humano para la APP insertada en el ADN del ratón. El ratón produjo la proteína APP modificada y desarrolló placas amiloides a medida que envejecían. Este modelo de ratón se usó para ensayar si la vacunación contra la APP humana transgénica modificada tenía un efecto en la aparición de placas. En un primer experimento, a un grupo de ratones transgénicos se proporcionaron inyecciones mensuales de la vacuna comenzando a las 6 semanas de edad y terminando a los 11 meses. Un segundo grupo de ratones transgénicos no recibió ninguna inyección y sirvió como grupo control. A los 13 meses de edad, los ratones en el grupo control tenían placas que cubren el 2 a 6 por ciento de sus cerebros. Por el contrario, los ratones inmunizados no tenían virtualmente placas.
En un segundo experimento, los investigadores comenzaron las inyecciones a los 11 meses, cuando algunas placas ya se habían desarrollado. Durante un período de 7 meses, los ratones transgénicos control tenían un incremento de 17 veces en la cantidad de placa en sus cerebros, mientras que los que recibieron la vacuna tenían un 99 por ciento de disminución comparado con los ratones transgénicos control de 18 meses. En algunos ratones, alguno de los depósitos de placas preexistentes parecían haberse eliminado por el tratamiento. También se encontró otro daño asociado a placas, tal como inflamación y procesos de células nerviosas anormales, disminuyendo como resultado de la inmunización.
Lo mencionado anteriormente es de esta manera un estudio preliminar en ratones y por ejemplo, los científicos necesitan encontrar si los ratones vacunados permanecen sanos en otros respectos y si la memoria de los vacunados permanece normal. Además, debido a que el modelo de ratón no es una representación completa de la AD (los animales no desarrollan ovillos neurofibrilares ni ninguna de sus neuronas muere), estudios adicionales serán necesarios para determinar si los seres humanos tienen una reacción similar o diferente de los ratones. Otra cuestión a considerar es que el procedimiento puede quizás "curar" la deposición amiloide pero no detiene el desarrollo de la demencia.
Cuestiones técnicas presentan también desafíos importantes. Por ejemplo, es improbable que sea incluso imposible, usando esta tecnología, crear una vacuna que permita que los seres humanos induzca anticuerpos contra sus propias proteínas. Así numerosas cuestiones de seguridad y eficacia necesitarán ser resueltos antes de que se pueda considerar cualquier ensayo en seres humanos.
El trabajo de Schenk y col., muestra de esta manera que si era posible generar una respuesta inmune fuerte hacia las auto - proteínas en los depósitos proteináceos en el sistema nervioso central tal como las placas formadas en la AD, es posible prevenir tanto la formación de los depósitos como posiblemente también eliminar las placas ya formadas.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar terapias novedosas contra afecciones caracterizadas por la deposición de amiloide, tal como la AD. Un objeto adicional de la presente invención es desarrollar una autovacuna contra amiloide, con el fin de obtener un tratamiento novedoso para la AD y para otros trastornos patológicos que implican deposición de amiloide.
Sumario de la invención
En esta memoria descriptiva se describe el uso de una tecnología de autovacunación para generar respuestas inmunes contra otras auto - proteínas no inmunogénicas incluidas en los depósitos amiloides relacionados con patología. Por lo tanto, una fuerte respuesta inmune se genera contra o bien el amiloide, contra uno o más de los componentes incluidos en los depósitos, o contra una o más de las proteínas responsables de la formación de amiloide. También se describe la posible cura o alivio de los síntomas de tales enfermedades asociados con depósitos de amiloide.
De este modo, en su alcance más amplio y más general, la presente invención se refiere al uso de un agente seleccionado entre
a)
al menos un análogo de una A\beta autóloga de animal o polipéptido de APP en los que se introduce al menos un epítope auxiliar T extraño aislado (epítope T_{H}) por medio de inserción, adición, supresión, o sustitución de aminoácido, en el que el epítope T_{H} extraño está libre de los aminoácidos D y se introduce en la A\beta o APP antóloga como se muestra esquemáticamente para los epítopes P2 y P30 en la figura 1,
b)
una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un análogo definido en a), y
c)
un microorganismo no patógeno o virus que lleva el fragmento de ácido nucleico definido en b)
para la preparación de un medicamento que contiene el agente para tratar y/o prevenir y/o mejorar la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades y afecciones caracterizadas por depósitos de A\beta en dicho animal.
Por lo tanto, comprendido dentro de la presente invención está el uso de análogos de antígenos de origen natural, siendo los análogos capaces de inducir respuestas inmunes de reacción cruzada.
La invención también se refiere a análogos de los polipéptidos de A\beta y APP así como a fragmentos de ácidos nucleicos que codifican un subconjunto de éstos. También las composiciones inmunógenas que comprenden los análogos o fragmentos de ácidos nucleicos son parte de la invención.
Leyenda de la figura
Fig. 1: Muestra esquemática de variantes Autovac derivadas de la proteína precursora amiloide con el propósito de generar respuestas de anticuerpo contra la proteína A\beta A\beta-43 (o C-100). La APP se muestra esquemáticamente en la parte superior de las figuras y las construcciones esquemáticas restantes muestran que los epítopes P2 y P30 de modelo están sustituidos o insertados en diversos truncamientos de la APP. En la figura, el patrón negro indica la secuencia señal de APP, los rasgos verticales oscuros son el dominio transmembrana de la APP, los rasgos verticales claros son el dominio intracelular de la APP, los rasgos de trazo grueso cruzado indican el epítope P30, y los rasgos de trazo cruzado fino indican el epítope P2. La casilla de línea rellena indica A\beta-42/43 y la casilla de línea rellena y la casilla de línea de puntos juntas indican C-100. "Abeta" designa A\beta.
Descripción detallada de la invención Definiciones
En lo que se describe a continuación un número de términos usados en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones se definirán y explicarán en detalle con el fin de clarificar los límites y confines de la invención.
Los términos "amiloide" y "proteína amiloide" que se usan indistintamente en esta memoria descriptiva denotan una clase de fibrilas no ramificadas proteináceas de longitud indeterminada. Las fibrilas amiloides muestran tinción característica con rojo Congo y comparten una estructura transversal \beta en la que la cadena polipeptídica está organizada en hojas \beta. El amiloide generalmente se deriva de proteínas amiloidogénicas que tienen estructuras precursoras muy diferentes pero que todas pueden experimentar una conversión estructural a una forma mal plegada que es el bloque de construcción del protofilamento de hélice de hoja \beta. Normalmente, el diámetro de las fibrilas amiloides varía entre aproximadamente 70 y aproximadamente 120 \ring{A}.
El término "proteína amiloidogénica" pretende indicar un polipéptido que está implicado en al formación de depósitos de amiloides, siendo o bien parte de los depósitos como tal c siendo parte de la ruta biosintética que conduce a la formación de los depósitos. Por lo tanto, los ejemplos de proteínas amiloidogénicas son APP y A\beta, pero también las proteínas implicadas en el metabolismo de éstas pueden ser proteínas amiloidogénicas. En esta memoria descriptiva se describen en detalle un número de polipéptidos amiloidogénicos.
Un "polipéptido amiloide" en esta memoria descriptiva pretende indicar polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de las proteínas amiloidogénicas descritas ene esta memoria descriptiva derivadas de mamíferos humanos u otros (o truncamientos de los mismos que comparten una cantidad sustanciadle epítopes de células B con una proteína amiloidogénica intacta) - por lo tanto un polipéptido amiloidogénico puede por ejemplo, comprender partes sustanciales de un precursor para el polipéptido amiloidogénico (en el caso de A\beta, un posible polipéptido amiloide podría ser derivado de la APP). También las formas no glucosiladas de polipéptidos amiloidogénicos que se preparan en el sistema procariótico están incluidas dentro de los límites del término como son las formas que tienen patrones de glucosilación debido al uso de por ejemplo, levaduras u otros sistemas de expresión eucarióticos no mamíferos. Sin embargo, se debe observar que cuando se usa el término "un polipéptido amiloidogénico" se pretende que el polipéptido en cuestión sea normalmente no inmunógeno cuando se presenta al animal a tratar. En otras palabras, el polipéptido amiloidogénico es una auto - proteína o es un análogo de tal auto - proteína que normalmente no dará lugar a una respuesta inmune contra el amiloidogénico del animal en cuestión.
Un "análogo de un polipéptido amiloidogénico" es un polipéptido amiloidogénico, que se ha sometido a cambios en su estructura primaria. Tal cambio puede estar en la forma de inserciones y/o supresiones y/o sustituciones en las moléculas amiloidogénicas del aminoácido del polipéptido amiloidogénico, véase. la descripción más delante de modificaciones de polipéptidos amiloidogénicos. En caso de que el polipéptido amiloidogénico sea un amiloide o un precursor del mismo, el análogo se puede construir de manera que sea menos capaz o incluso incapaz de generar anticuerpos contra la proteína (s) precursora (s) del amiloide normal (es).
Se debe observar que el uso como una vacuna en un ser humano de un xeno - análogo (por ejemplo, un análogo canino o porcino) de un polipéptido amiloidogénico humano se puede imaginar que produce la inmunidad deseada contra el polipéptido amiloidogénico. Tal uso de un xeno - análogo para inmunización también se considera parte de la invención.
El término "polipéptido" en el presente contexto pretende significar tanto péptidos cortos de entre 2 y 10 restos de aminoácidos, oligopéptidos de entre 11 y 100 restos de aminoácidos, como polipéptidos de más de 100 restos de aminoácidos. Además el término también pretende incluir proteínas, es decir biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprendiendo al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar unidos covalentemente, o pueden estar unidos no covalentemente. El (los) polipéptido (s) en una proteína se puede glucosilar y/o lapidar y/o comprender grupos prostéticos.
Los términos "linfocito T" y "célula T" se usarán indistintamente para linfocitos de origen tímico que son responsables de diversas respuestas inmunes mediadas por células así como para ayuda auxiliar en la respuesta inmune humoral. Del mismo modo, los términos "linfocito B" y "célula B" se usarán indistintamente para linfocitos que producen anticuerpos.
El término "subsecuencia" significa cualquier tramo de al menos 3 aminoácidos o, cuando sea relevante, de al menos 3 nucleótidos, derivados directamente de una secuencia de aminoácidos amiloide de origen natural, respectivamente.
El término "animal" en el presente contexto en general propone denotar una especie animal (preferiblemente mamífero), tal como Homo sapiens, Canis domesticus, etc, y no un único animal. Sin embargo, el término también denota una población de tal especie animal, ya que es importante que los individuos inmunizados de acuerdo con el procedimiento de la invención alberguen todos sustancialmente el mismo polipéptido amiloidogénico que permite inmunización de los animales con el (los) mismo (s) inmunógeno (s). Si, por ejemplo, existen variantes del polipéptido amiloidogénico en diferente población humana puede ser necesaria usar imunógenos diferentes en estas poblaciones diferentes con el fin de ser capaz de romper la autotolerancia hacia el polipéptido amiloidogénico en cada población de una manera óptima. Será evidente para la persona experta que un animal en el presente contexto es un ser vivo que tiene un sistema inmune. Se prefiere que el animal sea un vertebrado tal como un animal.
Por el término "regulación hacia abajo in vivo de amiloide" se entiende en esta memoria descriptiva la reducción en el organismo vivo de la cantidad total de amiloide depositado del tipo relevante. La regulación hacia abajo se puede obtener por medio de varios mecanismos: de éstos, la simple interferencia con amiloide mediante la unión de anticuerpo para prevenir la falsa agregación es la más sencilla. Sin embargo, también está dentro del alcance de la presente invención que el la unión a anticuerpo de cómo resultado la eliminación del amiloide por células depuradoras (tal como macrofágos y otras células fagocíticas) y y que los anticuerpos interfieren con otros polipéptidos amiloidogénicos que conducen a la formación de amiloide.
La expresión "efectuando la presentación... al sistema inmune" pretende denotar que el sistema inmune del animal se somete a una estimulación inmunógena de una manera controlada. Como será evidente a partir de la descripción a continuación, tal estimulación del sistema inmune se poseed efectuar en un número de formas de las que la más importante son vacunación con "farmacinas" (es decir, una vacuna que se administra para tratar o mejorar una enfermedad en curso) o vacunación de "farmacina" de ácido nucleico. El resultado importante para lograrlo es que las células competentes inmunes en el animal se confronten con el antígeno de una manera inmunológicamente eficaz, mientras que el modo preciso de lograr este resultado es de menos importancia para la idea de invención que subyace la presente invención.
El término "cantidad inmunológicamente eficaz" tiene su significado usual en la técnica, es decir, una cantidad de un inmunógeno, que es capaz de inducir una respuesta inmune que engrana agentes patógenos que comparten características inmunológicas con el inmunógeno.
Cuando se usa la expresión de que el polipéptido amiloidogénico se ha "modificado" quiere significar en esta memoria descriptiva una modificación química del polipéptido, que constituye la estructura central del polipéptido amiloidogénico. Tal modificación puede, por ejemplo, ser la derivatización por ejemplo, alquilación) de ciertos restos de aminoácidos en la secuencia del polipéptido amiloidogénico, pero como se apreciará a partir de la descripción más adelante, las modificaciones preferidas comprenden cambios de la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos.
Cuando se describe "autotolerancia hacia un polipéptido amiloidogénico" se entiende que ya que el polipéptido amiloidogénico es una auto - proteína en la población a vacunar, individuos normales en la población no montan una respuesta inmune contra el polipéptido amiloidogénico; sin embargo, no se puede excluir que los individuos ocasionales en una población animal podría ser capaz de producir anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico nativo, por ejemplo, como parte de un trastorno autoinmune. De cualquier forma, un animal no solamente será autotolerante hacia su propio polipéptido amiloidogénico, pero no se puede excluir que los análogos derivados de otra especie animal o de una población que tiene un fenotipo diferente también se toleraría por dicho animal.
Un "epítope de células T extraño" (o: "epítope de linfocitos T extraño") es un péptido que es capaz de unirse a una molécula de MHC y que estimula las células T en una especie animal. Los epítopes de células T extraños en la invención son epítopes "promiscuos", es decir que se unen a una fracción sustanciadle una clase particular de moléculas de MHC en una especie o población animal. Solamente se conocen un número muy limitado de tales epítopes de células T promiscuos, y se describirán en detalle más adelante. Los epítopes de células T promiscuos también se denominan epítopes de células "universales". Se debe observar que con el fin de que los inmunógenos que se usan de acuerdo con la presente invención sean eficaces en una fracción de de una población animal tanto como sea posible, puede ser necesario 1) insertar varios epítopes de las células T extraños en el mismo análogo o 2) preparar varios análogos en los que cada análogo tiene insertado un epítope promiscuo diferente. Se debe observar que el concepto de epítopes de células T extraños también abarca el uso de epítopes de células T crípticos, es decir epítopes que se derivan de una auto - proteína y que solamente ejerce un comportamiento inmunógeno cuando existe en forma aislada sin ser parte de la auto - proteína en cuestión.
Un "epítope de linfocitos auxiliares T extraño" (un epítope T_{H} extraño) es un epítope de células T extraño, que une una molécula de clase II de MHC y se puede presentar sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC) unida a la molécula de clase II de MHC.
Una "parte funcional" de una (bio)molécula en el presente contexto pretende significar la parte de la molécula que es responsable de al menos uno de los efectos bioquímicos o fisiológicos ejercidos por la molécula. Se sabe bien en la técnica que muchas enzimas y otras moléculas efectoras tienen un sitio activo que es responsable de los efectos ejercidos por la molécula en cuestión. Otras partes de la molécula pueden servir como un propósito estabilizador o potenciador de solubilidad y por lo tanto puede excluirse si estos propósitos no son de relevancia en el contexto de una cierta realización de la presente invención. Por ejemplo es posible usar ciertas citoquinas como un resto modificador en un polipéptido amiloidogénico (véase la descripción detallada más adelante), y en tal caso, la cuestión de estabilidad puede ser irrelevante ya que el acoplamiento amiloidogénico puede proporcionar la estabilidad necesaria.
El término "adyuvante" tiene su significado usual en al técnica de la tecnología de vacuna, es decir, una sustancia o una composición de material que es 1) no en sí mismo capaz de montar una respuesta inmune específica contra el inmunógeno de la vacuna, pero que es 2) no obstante capaz de potenciar la respuesta inmune contra el inmunógeno. O en otras palabras, vacunación con el adyuvante solo no proporciona una respuesta inmune o puede no dar lugar a una respuesta inmune contra el inmunógeno, pero la vacunación combinada con inmunógeno y adyuvante induce una respuesta inmune contra el inmunógeno que es más fuerte que el inducido por el inmunógeno solo.
"Dirección" de una molécula pretende denotar en el presente contexto la situación en la que una molécula tras la introducción en el animal aparece preferentemente en cierto (s) tejido (s) o estará preferiblemente asociada a ciertas células o tipos de células. El efecto se puede lograr de un número de formas que incluye formulación de la molécula en composición que facilita la dirección o mediante la introducción en la molécula de grupos, que facilitan la dirección. Estos asuntos se discutirán en detalle más adelante.
"Estimulación del sistema inmune" significa que una sustancia o composición de material muestra un efecto general, no específico inmunoestimulador. Un número de adyuvantes y adyuvantes supuestos (tal como ciertas citoquinas) comparten la capacidad de estimular el sistema inmune. El resultado de usar un agente inmunoestimulador es un aumento de "vigilancia" del sistema inmune que significa que la inmunización simultánea o posterior con un inmunógeno induce una respuesta inmune significativamente más eficaz comparada con el uso aislado del inmunógeno.
Realizaciones preferidas de regulación hacia debajo de amiloide
Se prefiere que el polipéptido amiloidogénico usado como inmunógeno en el procedimiento de la invención sea una molécula modificada en la que esté presente al menos un cambio en al secuencia de aminoácidos del polipéptido amiloidogénico, ya que las posibilidades de obtener la ruptura importante total de autotolerancia hacia el polipéptido amiloidogénico se facilita en gran medida de esa forma - es decir, por ejemplo, evidente a partir de los resultados presentados en el ejemplo 2 en esta memoria descriptiva, cuando la inmunización con la A\beta de tipo salvaje se compara con la inmunización con una molécula variante de A\beta. Se debe observar que el uso de una molécula modificada no excluye la posibilidad de usar tal polipéptido amiloidogénico modificado en las formulaciones que facilitan adicionalmente la
ruptura de autotolerancia contra el polipéptido amiloidogénico, por ejemplo, formulaciones que contienen adyuvantes.
Se ha mostrado (en Dalum I y col., 1996, J. Immunol. 157: 4796 - 4804) que los linfocitos B potencialmente auto - reactivos que reconocen las auto - proteínas están fisiológicamente presentes en individuos normales. Sin embargo, con el fin de que estos linfocitos B se induzcan para que se produzcan realmente anticuerpos reactivos con las auto - proteínas relevantes, se necesita asistencia de los linfocitos auxiliares T que producen citoquinas (células T_{H} o linfocitos T_{H}). Normalmente esta ayuda no se proporciona debido a que los linfocitos T en general no reconocen los epítopes de las células T derivadas de auto proteínas cuando se presentan por las células presentadoras de antígeno (APCs). Sin embargo, proporcionando un elemento de "extrañeza" en una auto - proteína (es decir, introduciendo una modificación inmunológicamente significativa), las células T que reconocen el elemento extraño se activan tras reconocer el epítope extraño sobre un APC (tal como, inicialmente, una célula mononuclear). Los linfocitos B policlonales (que también son APCs) capaces de reconocer auto - epítopes sobre la auto - proteína modificada también internaliza el antígeno y posteriormente presenta el (los) epítope (s) de las células T extraño (s) de los mismos, y los linfocitos T activados posteriormente proporcionan ayuda de las citoquinas a estos linfocitos B policlonales auto - reactivos. Ya que los anticuerpos producidos por estos linfocitos B policlonales son reactivos con diferentes epítopes sobre el polipéptido modificado, incluyendo aquellos que también están presentes en el polipéptido nativo, se induce una reacción cruzada de anticuerpo con la auto - proteína no modificada. En conclusión, los linfocitos T pueden conducir a actuar como si la población de los linfocitos B policlonales hayan reconocido un antígeno extraño enteramente, mientras que de hecho solamente el (los) epítope (s) insertado (s) es / son extraño (s) para el huésped. De esta forma, se inducen los anticuerpos capaces de reaccionar de manera cruzada con los auto - antígenos no modificados.
Se conocen en la técnica varias formas de modificar un auto - antígeno peptídico con el fin de obtener la rotura de autotolerancia. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la modificación puede incluir que
-
al menos un primer resto se introduce que efectúa la dirección de la molécula modificada a una célula presentadora de antígenos (APC), y/o
-
al menos un segundo resto se introduce que estimula el sistema inmune, y/o
-
al menos un tercer resto se introduce que optimiza la presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al sistema inmune.
Sin embargo, todas estas modificaciones se deben llevar a cabo mientras se mantiene una fracción sustancial de los epítopes de los linfocitos B originales en el polipéptido amiloidogénico, ya que por lo tanto se potencia el reconocimiento de los linfocitos B de la molécula nativa.
En una realización preferida, los grupos secundarios (en la forma de epítopes de las células T extraños o el primer, segundo y tercer resto mencionado anteriormente) están covalente o no covalentemente introducidos. Esto significa que los tramos de los residuos de aminoácidos derivados del polipéptido amiloidogénico se derivaticen sin alterar la secuencia primaria de aminoácidos, o al menos sin introducir cambios en los enlaces peptídicos entre los aminoácidos individuales en la cadena.
Una realización alternativa, y preferida utiliza la sustitución de aminoácidos y/o supresión y/o adición (que se puede efectuar por medios recombinantes o por medio de síntesis de péptidos. Una versión especialmente preferida se esta realización es la técnica descrita en el documento WO 95/05849, que describe un procedimiento para regular hacia abajo las auto - proteínas inmunizando con análogos de las auto - proteínas en las que un número de secuencias de aminoácidos se ha sustituido con un número correspondiente de secuencia (s) de aminoácidos que comprende cada una un epítope de células T inmunoidominante extraño, mientras que al mismo tiempo mantiene la estructura terciaria global de la auto - proteína en el análogo. Para los propósitos de la presente invención, es sin embargo suficiente si la modificación (sea una inserción, adición, supersigno sustitución) da lugar a un epítope de células T extraño y al mismo tiempo preserva un número sustancial de epítopes de células B en el polipéptido amiloidogénico. Sin embargo, con el fin de obtener máxima eficacia de la respuesta inmune inducida, se prefiere que la estructura terciaria global del polipéptido amiloidogénico se mantenga en la molécula modificada.
De esta manera, se incluyen en la invención polipéptidos amiloidogénicos modificados obtenidos por omisión de partes de la secuencia del polipéptido amiloidogénico que, por ejemplo, muestran efectos adversos in vivo u omisión de partes que son normalmente intracelulares y de este modo podría dar lugar a reacciones inmunológicas no deseadas.
Una versión preferida de las construcciones esquematizadas anteriormente son, cuando son aplicables, aquellas en las que el epítope de las células B que contiene la subsecuencia de una proteína amiloide no se expone extracelularmente en el polipéptido precursor de la que se deriva el amiloide. Realizando tal elección de los epítopes amiloides, se asegura que los anticuerpos no se generan de manera que fueran reactivos con las células que producen el precursor amiloide y por lo tanto la respuesta inmune que se genera se limita a una respuesta inmune contra los depósitos amiloides no deseados. Una selección similar puede, cuando es aplicable, hacerse para otros polipéptidos amiloidogénicos aparte de amiloide. Por ejemplo, en estos casos, será factible inducir inmunidad contra epítopes del polipéptido amiloidogénico que solamente están expuestos a la fase extracelular cuando están libres de cualquier acoplamiento a las células a partir de las que se producen.
El mantenimiento de una fracción sustancial de los epítopes de las células B o incluso la estructura terciaria global de una proteína que se somete a modificación como se describe en esta memoria descriptiva se puede lograr de varias formas. Una es simplemente preparar un antisuero policlonal dirigido contra el polipéptido amiloidogénico (por ejemplo, un antisuero preparado en un conejo) y después de esto usar este antisuero como un reactivo de ensayo (por ejemplo, en un ELISA competitivo) contra las proteínas modificadas que se producen. Las versiones modificadas (análogos) que reaccionan en la misma medida con el antisuero como lo hace el polipéptido amiloidogénico se debe considerar que tiene la misma estructura terciaria global que el polipéptido amiloidogénico mientras que los análogos que muestran una reactividad limitada (pero todavía significativa y específica) con tal antisuero se consideran que tienen mantenida una fracción sustancial de los epítopes de células B.
Como alternativa, una selección de anticuerpos monoclonales reactivos con distintos epítopes sobre el polipéptido amiloidogénico se puede preparar y usar como un panel de ensayo. Este planteamiento tiene la ventaja de permitir 1) un mapeo de los epítopes del polipéptido amiloidogénico y 2) un mapeo de los epítopes que se mantienen en los análogos preparados.
Por supuesto, un tercer planteamiento sería resolver la estructura tridimensional del polipéptido amiloidogénico o de un truncamiento biológicamente activo del mismo (véase anteriormente) y comparar ésta con la estructura tridimensional resuelta de los análogos preparados. La estructura tridimensional se puede resolver mediante la ayuda de estudios de difracción de rayos X y espectroscopia de RMN. Información adicional con relación a la estructura terciaria se puede en alguna medida obtener a partir de estudios de dicroísmo circular que tienen la ventaja de requerir solamente el polipéptido en forma pura (mientras que la difracción de rayos X requiere la provisión de polipéptido cristalizado y RMN requiere la provisión de variantes isotópicas del polipéptido) con el fin de proporcionar información útil sobre la estructura terciaria de una molécula dada. Sin embargo, últimamente la difracción de rayos X y/o RMN son necesarias para obtener datos concluyentes ya que el dicroísmo circular solamente puede proporcionar evidencia de estructura tridimensional correcta mediante la información de elementos de estructura secundaria.
Una realización preferida de la invención utiliza presentaciones múltiples de epítopes de linfocitos B del polipéptido amiloidogénico (es decir, la fórmula I en la que al menos un epítope de células B está presente en dos posiciones). Este efecto se puede lograr de formas diversas, por ejemplo, simplemente preparando la fusión de polipéptidos que comprende la estructura (polipéptido amiloidogénico)_{m}, en la que m es un número entero \geq 2 y después introducir las modificaciones descritas en esta memoria descriptiva en al menos una de las secuencias amiloides. Se prefiere que las modificaciones introducidas incluyan al menos una duplicación de un epítope de linfocitos B y/o la introducción de un hapteno. Estas realizaciones que incluyen presentaciones múltiples se epítopes seleccionados se prefieren especialmente en situaciones en las que solamente partes secundarias del polipéptido amiloidogénico son útiles como constituyentes en un agente de vacuna.
Como se ha mencionado anteriormente, la introducción de un epítope de células T extraño se puede lograr mediante la introducción de al menos una inserción, adición, supresión, o sustitución de aminoácidos. Por supuesto, la situación normal será la introducción de más de un cambio en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, inserción de o sustitución por un epítope de células T) pero el objetivo importante a alcanzar es que el análogo, cuando se procese por una célula presentadora de antígenos (APC), dará lugar a tal epítope de células T extraño inmunodominantes que se presenta en el contexto de una molécula de clase II de MCH sobre la superficie de la APC. De este modo, si la secuencia de aminoácidos del polipéptido amiloidogénico en posiciones apropiadas comprende un número de restos de aminoácidos que se pueden encontrar en un epítope T_{H} extraño se puede lograr proporcionando los restantes aminoácidos del epítope extraño por medio de inserción, adición, supresión y sustitución de aminoácidos. En otras palabras, no es necesario introducir un epítope T_{H} completo mediante inserción o sustitución con el fin de realizar el propósito de la presente invención.
Se prefiere que el número de inserciones, supresiones, sustituciones o adiciones de aminoácidos sea al menos 2, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, y 25 inserciones, sustituciones, adiciones o supresiones. Se prefiere además que el número de inserciones, sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos no exceda de 150, tal como mucho 100, como mucho 90, como mucho 80, y como mucho 70. Se prefriere especialmente que el número de sustituciones, inserciones, supresiones, o adiciones no exceda de 60, y en particular el número no exceda de 50 o incluso 40. Lo más preferido es un número de no más de 30. Con respecto a las adiciones de aminoácidos, se debe observar que ésta, cuando la construcción resultante está en la forma de un polipéptido de fusión, es a menudo considerablemente mayor que 150.
Las realizaciones preferidas de la invención incluyen modificación introduciendo al menos un epítope de células T inmunodominantes extraño. Se entenderá que la cuestión de dominancia inmune de un epítope de células T depende de la especie animal en cuestión. Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "inmunodominancia" simplemente se refiere a epítopes que en el individuo/población vacunado o/a da lugar a una respuesta inmune significativa, pero es un hecho bien conocido que un epítope de células T que es inmunodominante en un individuo/población no es necesariamente inmunodominante en otro individuo de la misma especie, incluso aunque pueda ser capaz de unir las moléculas MHC-II en el último individuo. Por lo tanto, para los propósitos de la presente invención, un epítope de células T dominante inmune es un epítope de células T que será eficaz proporcionando ayuda de células T cuando está presente en un antígeno. Típicamente, los epítopes de células T dominantes inmunes tienen como característica inherente que sustancialmente siempre se presentarán unidas a una molécula de clase II de MHC, independientemente del polipéptido en el que aparecen.
Otro punto importante es el asunto de restricción de MHC de epítopes de células T. En general, los epítopes de células T de origen natural son MCH restringidos, es decir, ciertos péptidos que constituyen un epítope de células T se unirán eficazmente a un subconjunto de moléculas de clase II de MHC. Esto a su vez tiene el efecto de que en la mayoría de los casos el uso de un epítope de células T específico dará como resultado un componente de vacuna que solamente es eficaz en una fracción de la población, y dependiendo del tamaño de esa fracción, puede ser necesario incluir más epítopes de células T en la misma molécula, o como alternativa preparar una vacuna de componentes múltiples en la que los componentes son variantes del polipéptido amiloidogénico que se distinguen entre sí por la naturaleza del epítope de células T introducido.
Si la restricción de MHC de las células T usadas es completamente desconocida (por ejemplo en una situación en al que el animal vacunado tiene una composición de MHC poco definida), la fracción de la población cubierta por una composición de vacuna específica se puede determinar mediante la siguiente fórmula
(II)f_{población}= 1- \prod\limits^{n}_{i=1}(1-p_{i})
en la que p_{i} es la frecuencia en la población de contestadores al epítope de células T extraño presentes en al composición de vacuna, y n es el número total de epítopes de células T extraños en la composición e vacuna. De este modo, una composición de vacuna que contiene 3 epítopes de células T extraños que tienen frecuencias de respuesta en la población de 0,8, 0,7, y 0,6 respectivamente, proporcionaría
1 - 0.2 x 0,3 x 0,4 = 0,976
es decir 97,6 por ciento de la población montará estadísticamente una respuesta mediada por MHC-II a la vacuna.
La fórmula anterior no se aplica en situaciones en las que se conoce un patrón de restricción de MHC más o menos preciso de los péptidos usados. Si, por ejemplo, un cierto péptido solamente se une a las moléculas de MHC - II humanas codificadas por alelos de HLA - DR DR1, DR3, DR5, y DR7, después el uso de este péptido junto con otro péptido que une las moléculas de MHC - II restantes codificadas por los alelos HLA - DR realizarán el 100% de cobertura en al población en cuestión. De manera similar, si el segundo péptido solamente une DR3 y DR5, la adición de este péptido no incrementará la cobertura en todos. Si se basa el cálculo de respuesta de población puramente sobre restricción de MHC de epítopes de células T en la vacuna, la fracción de la población cubierta por una composición de vacuna específica se puede determinar mediante la fórmula siguiente:
(III)f_{población} = 1-\prod\limits^{3}_{j=1}(1-\varphi_{j})^{2}
en la que \varphi_{j} es la suma de frecuencias en la población de haplotipos alélicos que codifican las moléculas de MHC que unen cualquiera de los epítopes de las células T en la vacuna y que pertenecen al jº de los 3 loci de HLA (DP, DR y DQ); en la práctica, primero se determina las moléculas que reconocerán cada epítope de las células T en la vacuna y después de esto se enumeran por tipo (DR, DR y DQ) - después, las frecuencias individuales de los diferentes haplotipos alélicos enumerados se suman para cada tipo, produciendo por lo tanto \varphi_{1}, \varphi_{2}, y \varphi_{3}.
Puede ocurrir que el valor de p_{i} en la fórmula (II) exceda el valor teórico correspondiente p_{i}:
(IV)\pi_{1} = 1-\prod\limits^{3}_{j=1}(1-\nu_{j})^{2}
en la que \nu_{j} es la suma de frecuencias en la población de haplotipo alélico que codifica las moléculas de MHC que unen el iº epítope de células T en la vacuna y que pertenecen al jº de los 3 loci de HLA (DP, DR y DQ). Esto significa que en 1-p_{i} de la población es una frecuencia de contestadores de f_{residual\_i}= (i - p_{i}) / (1 - p_{i}). Por lo tanto, la fórmula III se puede ajustar de manera que produzca la fórmula V:
(V)f_{población} = 1-\prod\limits^{3}_{j=1}(1-\varphi_{j})^{2}+\left(1-\prod\limits^{n}_{i=1}(1-f_{residual\_i})\right)
en la que el término 1 - \varphi _{residual-i} se fija en cero si es negativo. Se debe observar que la fórmula V requiere que todos los epítopes se hayan mapeado para haplotipos contra conjuntos idénticos de haplotipos.
Por lo tanto, cuando se seleccionan epítopes de células T a introducir en el análogo, es importante incluir todo el conocimiento de los epítopes que sea disponible: 1) la frecuencia de contestadores en al población de cada epítope, 2) datos de restricción de MHC, y 3) frecuencia en la población de los haplotipos relevantes.
Existe un número de epítopes de células T "promiscuos" de origen natural que son activos en una gran proporción de individuos de una especie animal o una población animal y éstos de introducen preferiblemente en la vacuna reduciendo por lo tanto la necesidad de un número muy grande de análogos diferentes en la misma vacuna.
El epítope promiscuo puede de acuerdo con la invención ser un epítope de células T humano de origen natural tal como epítopes de toxoide de tétanos (por ejemplo, los epítopes P2 y P30), toxoide de difteria, hemaglutinina de virus de influenza (HA), y antígeno CS de P. falciparum.
Con los años, se han identificado un número de otros epítopes de células T promiscuos. Especialmente péptidos capaces de unir una gran proporción de moléculas de HLA - DR codificadas por los alelos diferentes HLA - DR se han identificado y éstos son todos los epítopes de células T posibles a introducir en los análogos usados de acuerdo con la presente invención. Véanse también los epítopes descritos en las siguientes referencias que por la presente se incorporan todas en esta memoria descriptiva como referencia: documento WO 98/23635 (Frazer IH y col., de cesión común a la Universidad de Queensland); Southwood S y col., 1998, J. Immunol. 160: 3363 - 3373; Sinigaglia F y col., 1988, Nature 336: 778 - 780; Chicz RM y col., 1993, J. Exp. Med 178: 27 - 47; Hammer J y col., 1993, Cell 74: 197 -
203; y Falk K y col., 1994, Immunogenetics 39: 239 - 242. La última referencia también se refiere a ligandos de
HLA - DQ y DP. Todos los epítopes enumerados en estas 5 referencias son relevantes como epítopes naturales candidatos a usar en la presente invención, como son epítopes que comparten motivos comunes con éstos.
Como alternativa, el epítope puede ser un epítope de células T que es capaz de unir una gran proporción de moléculas de clase II de MHC. En este contexto los péptidos de epítopes DR pan ("PADRE") descritos en el documento WO 95/07707 y en el artículo correspondiente de Alexander J y col., 1994, Immunity 1: 751 - 761 (ambas descripciones se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia) son candidatos interesantes para epítopes a usar de acuerdo con la presente invención. Se debe observar que los péptidos PADRE más eficaces descritos en estos artículos llevan aminoácidos D en los extremos C y N con el fin de mejorar la estabilidad cuando se administran. Sin embargo, la presente invención principalmente ayuda a la incorporación de los epítopes relevantes como parte del polipéptido amiloidogénico que después de deben descomponer enzimáticamente en el interior del compartimiento lisosomal de los APCs para permitir la presentación posterior en el contexto de una molécula de MHC - II y por lo tanto no es conveniente incorporar aminoácidos D en los epítopes usados en al presente invención.
Un péptido PADRE especialmente preferido es el que tiene la secuencia de aminoácidos AKFVAAWTLKAAA o una subsecuencia inmunológicamente eficaz de la misma. Éste, y otros epítopes que tienen la misma falta de restricción de MHC son epítopes de células T preferidos que deberían estar presente en los análogos usados en el procedimiento de la invención. Tales epítopes super promiscuos permitirán las realizaciones más sencillas de la invención en las que solamente un único polipéptido amiloidogénico modificado se presenta al sistema inmune de animal vacunado.
Como se ha mencionado anteriormente, la modificación del polipéptido amiloidogénico también puede incluir la introducción de un primer resto que dirige el polipéptido amiloidogénico modificado a una APC o un linfocito B. Por ejemplo, el primer resto puede ser un agente de unión específica para un antígeno de superficie específico de APC. Muchos de tales antígenos de superficie específico se conocen en la técnica. Por ejemplo,, el resto puede ser un carbohidrato para el que existe un receptor del linfocito B o la APC (por ejemplo, manan o manosa). Como alternativa, el segundo resto puede ser un hapteno. También se puede usar un fragmento de anticuerpo que reconoce específicamente una molécula de superficie sobre las APC o linfocitos como un primer resto (la molécula de superficie puede por ejemplo ser un receptor FC\gamma de macrófagos y monocitos, tales como FC\gammaRIo, como alternativa cualquier otro marcador específico de superficie tal como CD40 o CTLA-4). Se debe observar que todos estoas moléculas de dirección ejemplar se pueden usar como parte de un adyuvante también, véase más adelante.
Como alternativa o suplemento a a la dirección del polipéptido amiloidogénico modificado a un cierto tipo de célula con el fin de lograr una respuesta inmune potenciada, es posible incrementar el nivel de sensibilidad del sistema inmune incluyendo el segundo resto anteriormente mencionado que estimula el sistema inmune. Los ejemplos típicos de tales segundos restos son citoquinas, y proteínas de choque térmico o chaperonas moleculares, así como partes eficaces de las mismas.
Las citoquinas adecuadas a usar de acuerdo con la invención son aquellas que normalmente también funcionan como adyuvantes en una composición de vacuna, es decir, por ejemplo, interferón \gamma (IFN-\gamma), interleuquina 1 (IL - 1), interleuquina 2 (IL - 2), interleuquina 4 (IL - 4), interleuquina 6 (IL - 6), interleuquina 12 (IL - 12), interleuquina 13 (IL - 13), interleuquina 15 (IL - 15), y factor estimulante de colonia de granulocitos - macrófagos (GM - CSF); como alternativa, la parte funcional de la molécula de citoquinas puede ser suficiente como el segundo resto. Con respecto al uso de tales citoquinas como sustancias adyuvantes, véase, la descripción más adelante.
De acuerdo con la invención, las proteínas de choque térmico adecuadas o chaperonas usadas como el segundo resto pueden ser HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (también conocida como gp96, véase Wearsch, PA y col., 1998, Biochemistry 37: 5709 - 19), y CRT (calrreticuina).
Como alternativa, el segundo resto puede ser una toxina, tal como listeriolicina (LLO), lípido A y enterotoxina lábil al calor. También, un número de derivados micobacterianos tales como MDP (muramil dipéptido), CFA (adyuvante de Freund completo) y los diésteres de trehalosa TDM y TDE son posibilidades interesantes.
También la posibilidad de introducir un tercer resto que potencia la presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al sistema inmune es una realización importante de la invención. La técnica ha mostrado varios ejemplos de este principio. Por ejemplo, se sabe que el anclaje de lipidación de palmitoílo en la proteína de Borrelia burgdorferi OspA se puede utilizar para proporcionar polipéptidos auto - adyuvantes (véase, por ejemplo, el documento WO 96/40718) parece que las proteínas lipidadas forman estructuras de tipo micela con un núcleo que consta de las partes de anclaje de lipidación de los polipéptidos y las partes restantes de la molécula saliente de los mismos, dando como resultado múltiples presentaciones de los determinantes antigénicos. Por lo tanto, el uso de éste y planteamientos relacionados que usan anclajes de lipidación diferentes (por ejemplo, un grupo miristilo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranilo - geranilo, un anclaje de GPI, y un grupo N-acil diglicérido) son realizaciones preferidas de la invención, ya que especialmente la provisión de tal anclaje de lipidación en una proteína producida recombinantemente es justamente sencilla y solamente requiere el uso de por ejemplo, una secuencia de señal de origen natural como un agente de fusión para el polipéptido amiloidogénico modificado. Otra posibilidad es el uso del fragmento C3d de factor C3 complementario o el propio Ce (véase Dempsey y col., 1996, Science 271, 348 - 350 y Lou y Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458 - 462).
Una realización alternativa de la invención que también da como resultado la presentación preferida de copias múltiples (por ejemplo al menos 2) de las regiones epitópicas importantes del polipéptido amiloidogénico al sistema inmune es el acoplamiento covalente del v, subsecuencia o variantes del mismo a ciertas moléculas. Por ejemplo, se pueden usar polímeros, por ejemplo, carbohidratos tales como dextrano, véase, por ejemplo, Lees A y col., 1994, Vaccine 12: 1160 - 1166; Lees A y col, 1990, J. Immunol. 145: 3594 - 3600, pro también manosa y manan son alternativas útiles. Las proteína de membrana integral se por ejemplo E. coli. y otras bacterias son también útiles agentes de conjugación. Las moléculas vehículo tradicionales tales como hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), toxoide de tétanos, toxoide de difteria, y albúmina sérica bovina (BSA) también se prefieren y son útiles agentes de conjugación.
Las consideraciones que son la base de áreas elegidas de introducción de modificaciones en polipéptidos amiloidogénicos son a) preservación de epítopes de células T conocidos y predichos, b) preservación reestructura terciaria, c) anulación de epítopes de células B presentes en las "células productoras" etc. De cualquier forma, como se ha descrito anteriormente, es medianamente fácil seleccionar un conjunto de moléculas amiliodogénicas modificadas que se han sometido todas a la introducción de un epítope de células T en diferentes localizaciones.
Ya que la presente invención implica la regulación hacia debajo de A\beta humana, por lo tanto de prefiere que el polipéptido amiloide descrito anteriormente es un polipéptido A\beta humano. En esta realización, se se prefiere esepcialmente que el polipéptido amiloidogénico humano se haya modificado sustituyendo al menos una secuencia de aminoácidos en al SEC ID Nº 2 con al menos una secuencia de aminoácidos de igual o diferente longitud y que contiene un epítope T_{H} extraño. Los ejemplos de APP y A\beta amiloidogénicas modificadas se muestran esquemáticamente en la figura 1 que usa los epítopes P2 y P30 como ejemplos. La razón fundamental de tales construcciones se describe en detalle en el ejemplo.
Formulación de los polipéptidos amiloidogénicos modificados
Cuando se efectúa la presentación del polipéptido amiloidogénico o el v modificado a un sistema inmune de animales por medio de la administración del mismo al animal, la formulación del polipéptido sigue los principios generalmente reconocidos en la técnica.
La preparación de vacunas que contienen secuencias de péptidos como ingredientes activos se entiende bien generalmente en al técnica, como se ejemplifica por las patentes de estados unidos 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770, todas incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia. Típicamente, tales vacunas se preparan como inyectables o bien como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas adecuadas sólidas para solución en, o suspensión en, líquido antes de inyección. La preparación también puede estar emulsionada. El ingrediente inmunogénico activo a menudo se mezcla con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con e ingrediente activo. Tales excipientes son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y las combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, ahentes de tamponación de pH, o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas, véase la descripción detallada de adyuvantes más adelante.
Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, por inyección, por ejemplo, o bien por vía subcutánea, por vía intracutánea, por vía intradérmica, por vía subdérmica o por vía intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales, bucales, sublinguales, intraperitoneales, intravaginales, anales, epidurales, espinales, e intracraneales. Para supositorios, los ligantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1 - 2%. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10 - 95% de ingrediente activo, preferiblemente 25 - 70%. Para las formulaciones orales, la toxina de cólera es un agente de formulación interesante (y también un posible agente de conjugación).
Los polipéptidos se pueden formular en la vacuna como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y similares.
Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y de tal manera como será terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo para montar una respuesta inmune, y el grado de protección deseado. Los intervalos de dosificación adecuados son del orden varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacunación con un intervalo preferido de entre 0,1 \mug a 2.000 \mug (incluso no obstante se contemplan cantidades mayores en el intervalo 1 - 10 mg), tales como en el intervalo de entre aproximadamente 0,5 \mug y 1000 \mug, preferiblemente en el intervalo de entre 1 \mug y 500 y especialmente en el intervalo de entre aproximadamente 10 \mug y 100 \mug. Los regímenes adecuados para la administración adicional e inyecciones de dosis de recuerdo están también disponibles pero de tipifican mediante la administración inicial seguida de inoculaciones posteriores u otras administraciones.
La manera de aplicación puede variar ampliamente. Cualquiera de los procedimientos convencionales para la administración de una vacuna son aplicables. Éstos incluyen aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, por inyección o similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a vacunar y la formulación del antígeno.
Algunos de los polipéptidos de la vacuna son suficientemente inmunogénicos en una vacuna, pero para alguno de los otros la respuesta inmune se potenciará si la vacuna además comprende una sustancia adyuvante.
Se conocen diversos procedimientos de lograr efecto adyuvante para la vacuna. Los principios y procedimientos generales se detallan en "The Theory and Practical Application of Adyuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart - Tull (ed.), John Wiley & sons Ltd, ISBN 0 - 471 - 95170 - 6, y también en "Vaccines: New Generation Immunological Adyuvants", 1995, Gregoriadis G y col., (eds), Plenum Press, Nueva York, ISBN 0 - 306 - 45283 - 9, que se incorporan ambos en esta memoria descriptiva como referencia.
Se prefiere especialmente usar un adyuvante que se pueda demostrar que facilita la rotura de la autotolerancia a autoantígenos; de hecho, es esencial en los casos en los que se usa el polipéptido amiloidogénico no modificado como el ingrediente activo en la autovacuna. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes adecuados se seleccionan entre el grupo constituido por adyuvante de dirección inmune; un adyuvante modulador inmune tal como una toxina, y un derivado micobacteriano; una formulación oleosa; una matriz de complejo inmunoestimulante (matriz ISCOM); una partícula; DDA; adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN; \gamma-inulina; y un adyuvante de encapsulación. En general se debe observarque als descripciones anteriores que se refieren a los compuestos y agentes útiles como primer, segundo y tercer restos en los análogos también se refieren mutatis mutandi a su uso en el adyuvante de una vacuna de la invención.
La aplicación de adyuvantes incluyen el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alud), usado comúnmente como solución al 0,05 a 0,1 por ciento en solución salina tamponada, mezcal con polímeros sintéticos de azúcares (por ejemplo Carbopol ®) usado como solución al 0,25 por ciento, agregación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento por calor con temperaturas que varían entre 70ºC y 101ºC durante períodos de 30 segundos a 2 minutos respectivamente y también son posibles agregación por medio de agentes de reticulación. La agregación mediante reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (fragmentos Fab) a albúmina, mezcla con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias gram - negativas, también se pueden usar emulsión en vehículos oleosos fisiológicamente aceptables tal como monooletato de manida (Aracel A) o emulsión con solución al 20 por ciento de un perfluorocarbono (Fluosol - DA) usado como sustituto de bloque. También se prefiere la mezcla con aceites tales como escualeno e IFA.
De acuerdo con la invención el DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) es un candidato interesante para un adyuvante como es ADN y \gamma-inulina, pero también adyuvantes completo e incompleto de freund así como saponinas de quillaja tal como QuilA y QS21 son interesantes como RIBI. Las posibilidades adicionales son monofosforil lípido A (MPL), los anteriormente mencionados C3 y C3d, muramil dipéptido (MDP).
Las formulaciones de liposomas también se sabe que confieren efectos adyuvantes, y por lo tanto se prefieren adyuvantes de liposomas de acuerdo con la invención.
También los adyuvantes de tipo de matriz de complejo inmunoestimulante (matriz ISCOM®) son elecciones preferidas de acuerdo con la invención, especialmente ya que se ha mostrado que este tipo de adyuvantes son capaces de regular hacia arriba la expresión de clase II de MHC por APCs. La matriz ISCOM ® consta de (fraccionada opcionalmente) saponinas (triterpenoides) de Quillaja saponaria, colesterol, y fosfolípido. Cuando se mezcla con la proteína inmunogénica, la formulación particulada resultante es la que se conoce como una partícula de ISCOM donde la saponina construye 60 - 70% p/p, el colesterol y fosfolípido 10 - 15% p/p, y la proteína 10 - 15% p/p. Los detalles relativos a la composición y uso de complejos inmunoestimulantes se pueden, por ejemplo, encontrar en los libros de texto anteriormente mencionados que tratan de adyuvantes, pero también Morein B y col., 1995, Clin. Immunother. 3: 461 - 475 así como Barr IG y Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8 - 25 (ambas se incorporan como referencia en esta memoria descriptiva) proporcionan instrucciones útiles para la preparación de complejos inmunoestimulantes completos.
Otra posibilidad altamente interesante (y así, preferida) de lograr efecto adyuvante es emplear la técnica descrita en Gosselin y col., 1992, (que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia). En resumen, la presentación de un antígeno relevante tal como un antígeno de la presente invención se puede potenciar conjugando el antígeno de anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno) contra los receptores de Fc\gamma sobre monocitos/macrófagos. Específicamente conjugados entre antígeno y anti-Fc\gammaRI se han demostrado que potencian la inmunogenicidad para los propósitos de vacunación.
Otras posibilidades implican el uso de las moléculas de dirección y modulación inmune /entre otros citoquinas) mencionadas anteriormente como candidatos para el primer y segundo restos en las versiones modificaciones de polipéptidos amiloidogénicos. A este respecto, también son posibilidades inductores sintéticos de citoquinas como poli I:C.
Los derivados micobacterianos adecuados se seleccionan entre el grupo constituido por muramil dipéptido, adyuvante completo de Freund, RIBI, y un diéster de trehalosa tal como TMD y TDE.
Los adyuvantes de dirección inmunes adecuados se seleccionan entre el grupo constituido por ligando CD40 y anticuerpos CD40 o específicamente fragmentos de unión de los mismos (véase la descripción anterior), manosa, un fragmento Fab, y CTLA-4.
Todavía otra forma interesante de modulación de una respuesta inmune es incluir el inmunógeno (opcionalmente junto con adyuvantes y portadores y vehículos farmacéuticamente aceptables) en un "nódulo linfático virtual" (VLN) (un dispositivo patentado médico desarrollado por ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, Nueva York, NY 10017 - 6501). El VLN (en un dispositivo tubular delgado) imita la estructura y función de un nódulo linfático. La inserción de un VLN bajo la piel crea un sitio de inflamación estéril con un gran aumento de citoquinas y quimioquinas. Las células T y B así como las APC responden rápidamente a las señales de peligro, se dirigen al sitio inflamado y se acumulan en el interior de la matriz porosa del VLN. Se sabe que la dosis de antígeno necesaria requiere montar una respuesta inmune a un antígeno se reduce cuando se usa el VLN y esa protección inmune conferida por la vacunación usando una inmunización convencional superior usando Ribi como un adyuvante. La tecnología, se describe entre otros brevemente en Gelber C y col., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Devide Designated the Virtual Lymph Node", en "From the laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12 - 15 de octubre de 1998, Seascape Resort, Aptos, California".
La formulación en micropartículas de vacunas se ha mostrado en muchos casos que incrementa la inmunogenicidad de antígenos proteicos y por lo tanto es otra realización preferida de la invención. Las micropartículas están hechas o bien como co - formulaciones de antígeno con un polímero, un lípido, un carbohidrato u otras moléculas adecuadas para fabricar las partículas, o las micropartículas pueden ser partículas homogéneas constituidas solamente por el propio antígeno.
Los ejemplos de micropartículas a base de polímero son partículas a base de PLGA y PVP (Gupta, R. K. y col., 1998) donde el polímero y el antígeno se condensan en una partícula sólida. Las partículas a base de lípidos se pueden fabricar como micelas del lípido (también llamados liposomas) que atrapan el antígeno dentro de la micela (Pietrobon, P. J. 1995). Las partículas a base de carbohidratos se fabrican típicamente de un carbohidrato degradable adecuado tal como almidón o quitosan. El carbohidrato y el antígeno se mezclan y condensan en partículas en un proceso similar al usado para partículas de polímero (Kas, H. S. y col., 1997).
Las partículas constituidas solamente por el antígeno se pueden fabricar mediante diversas técnicas de pulverización y secado por congelación. Especialmente adecuadas para los propósitos de la presente invención es la tecnología de fluido super crítico que se usa para fabricar partículas muy uniformes de tamaño controlado (York, P. 1999 y Shekunov, B. y col., 1999).
Se espera que la vacuna se puede administrar 1 - 6 veces al año, al como 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 6 veces al año a un individuo en necesidad del mismo. Se ha mostrado previamente que la inmunidad de memoria inducida por el uso de las autovacunas preferidas de acuerdo con la invención no es permanente, y por lo tanto el sistema inmune necesita ser periódicamente estimulado con el polipéptido amiloidogénico o polipéptidos amiloidogénicos modificados.
Debido a la variación genética, individuos diferentes pueden reaccionar con respuestas inmunes de intensidad variable al mismo polipéptido. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender varios polipéptidos diferentes con el fin de incrementar la respuesta inmune, véase también la descripción anterior referente a la elección de introducciones de epítopes de células TR extraños. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos, donde todos los polipéptidos son como se han definido anteriormente
La vacuna puede por lo tanto comprender 3 - 20 polipéptidos diferentes modificados o no modificados, tales como 3 - 10 polipéptidos diferentes.
Vacunación de ácidos nucleicos
Como una alternativa a la administración clásica de una vacuna a base de péptidos, la tecnología de vacunación de ácidos nucleicos (también conocida como "inmunización de ácidos nucleicos", "inmunización genética", e "inmunización génica") ofrece un número de características atractivas.
Primero, en contraste con el planteamiento fr vacuna tradicional, la vacunación de ácido nucleico no requiere producción a gran escala consumidora de recursos del agente inmunogénico (por ejemplo, en la forma de fermentación a escala industrial de microorganismos que producen polipéptidos amiloidogénicos modificados). Además, no existe necesidad de purificación por dispositivo y esquemas de replegamiento para el inmunógeno. Y finalmente, ya que la vacunación de ácidos nucleicos se basa en el aparato bioquímica del individuo vacunado con el fin de producir el producto de expresión del ácido nucleico introducido, el procedimiento post - traduccional óptimo del producto de expresión se espera que se produzca, esto es especialmente importante en el caso de autovacunación, ya que, como se ha mencionado anteriormente, una fracción significativa de los epítopes de células B originales se debe preservar en la molécula modificada, y ya que los epítopes de células B en principio se pueden constituir por partes de cualquier (bio)molécula (por ejemplo, carbohidrato, lípido, proteína, etc.). Por lo tanto, los patrones de glucosilación y lipidación nativa del inmunógeno puede muy bien ser de importancia para la inmunización global y esto se asegura mejor teniendo el huésped que produce el inmunógeno.
Por lo tanto, una realización preferida de la invención comprende efectuar la presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al sistema inmune introduciendo ácido (s) nucleico (s) que codifica (n) el polipéptido amiloidogénico modificado e las células del animal y obteniendo por lo tanto la expresión in vivo por las células de (de los) ácido (s) nucleico (s) introducido (s).
En esta realización, el ácido nucleico introducido es preferiblemente ADN que puede estar en la forma de ADN desnudo, ADN formulado con lípidos cargados o no cargados, ADN formulados en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido de dirección, ADN formulado con agentes que precipitan calcio, ADN acoplado a una molécula vehículo inerte, ADN encapsulado en un polímero, por ejemplo, en PLGA (véase, la tecnología de microencapsulación descrita en el documento 98/31398) o en quitina o quitosan, y ADN formulado con un adyuvante. En el contexto se observa que prácticamente todas las consideraciones que pertenecen al uso de adyuvante en la formulación de vacuna tradicional se aplican para la formulación de vacunas de ADN. Por lo tanto, todas las descripciones en esta memoria descriptiva que se refieren al uso de adyuvantes en el contexto de las vacunas a base de polipéptidos se aplican mutatis mutandi a su uso en la tecnología de vacunación de ácidos nucleicos.
Como para las vías de administración y esquemas de administración de las vacunas a base de polipéptido que se han detallado anteriormente, éstas son también aplicables a las vacunas de de ácido nucleico de la invención y todas las descripciones anteriores pertenecen a vías de administración y esquemas de administración para aplicar mutatis mutandis a ácidos nucleicos. A esto se debe añadir que las vacunas de ácidos nucleicos se pueden administrar adecuadamente por vía intravenosa y por vía intraarterial. Además, se sabe bien en la técnica que las vacunas de ácido nucleico se pueden administrar mediante el uso de una llamada pistola de genes, y por lo tanto éste y modos equivalentes de administración se consideran como parte de la presente invención. Finalmente, también el uso de un VLN en la administración de ácidos nucleicos se ha reseñado que produce buenos resultados, y por lo tanto este modo particular de administración se prefiere de modo particular.
Además el (los) ácido (s) nucleico (s) usado (s) como agente de inmunización pueden contener regiones que codifican el 1º, 2º y/o 3º resto, por ejemplo, en la forma de sustancias inmunomoduladoras descritas anteriormente tales como las citoquinas descritas como adyuvantes útiles. Una versión preferida se esta realización comprende el tener al región codificadora para el análogo y al región codificadora para el inmunomodulador en diferentes marcos de lectura o al menos bajo el control de promotores diferentes. Por lo tanto se evita que el análogo o epítope se produzca como un agente de fusión para el modulador. Como alternativa, se pueden usar dos fragmentos de nucleótidos distintos, pero éste se prefiere menos debido a la ventaja de asegurar la co - expresión cuando tienen ambas regiones codificadoras incluidas en la misma molécula.
De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere a una composición para inducir la producción de anticuerpos contra un polipéptido amiloidogénico, comprendiendo al composición
-
un fragmento de ácido nucleico o un vector de la invención (véase la descripción de vectores más adelante), y
-
un vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable y/o vehículo y/o adyuvante como se ha descrito anteriormente.
En circunstancias normales, el ácido nucleico que codifica variantes en la forma de un vector en el que la expresión está bajo el control de un promotor viral. Para descripciones más detalladas de vectores de acuerdo con la invención, véase, la descripción más adelante. También, descripciones detalladas con relación a la formulación y uso de vacunas de ácido nucleico están disponibles, véase Donnelly JJ y col., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617 - 648 y Donnelly JJ y col., 1997, Life Sciences 60: 163 - 172. Estas referencias se incorporan ambas en esta memoria descriptiva como referencia.
Vacunas vivas
Una tercera alternativa para efectuar la presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al sistema inmune es el uso de tecnología de vacuna viva. En la vacunación viva, la presentación al sistema inmune se efectúa mediante la administración, al animal, de un microorganismo no patogénico que se ha transformado con un fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido amiloidogénico modificado o con un vector que incorpora tal fragmento de ácido nucleico. El fragmento no patogénico puede ser cualquier cepa bacteriana atenuada adecuada (atenuada por medio de subcultivo o por medio de la eliminación de productos de expresión patogénica mediante tecnología de ADN recombinante9, por ejemplo, Mycobacteriun bovis BCG., Streptococcus spp. no patogénico., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, etc. Las revisiones con relación a la preparación de vacunas vivas establecidas en la técnica se pueden, por ejemplo, encontrar en Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492 - 1496 y Walter PD, 1992, Vaccine 10:
977 - 990, ambas incorporadas en esta memoria descriptiva como referencia. Para detalles acerca de los fragmentos de ácidos nucleicos y vectores usados en tales vacunas vivas, véase la descripción más adelante.
Como una alternativa a las vacunas vivas bacterianas, el fragmento de ácido nucleico de la invención descrita más adelante se pueden un vector de vacuna viral no virulento tal como una cepa de vaccinia o cualquier otro pox virus adecuado.
Normalmente, el microorganismo o virus no patogénico, se administra solamente una vez al animal, pero en ciertos casos, puede ser necesario administrar el microorganismo más de una vez en toda la vida con el fin de mantener inmunidad protectora. Incluso se contempla que los esquemas de inmunización como los detallados anteriormente para la vacunación de polipéptidos será útil cuando se usan vacunas de virus o vivas.
Como alternativa, la vacunación viva o de virus se vacuna con la vacunación previa o posterior de polipéptidos y/o ácidos nucleicos. Por ejemplo, es posible efectuar inmunización primaria con una vacuna viva o de virus seguida de inmunizaciones de recuerdo posteriores usando el planteamiento de polipéptidos o de ácidos nucleicos.
Los microorganismos o virus se pueden transformar con ácido (s) nucleicos (s) que contienen regiones que codifican el 1º, 2º y/o 3º restos, por ejemplo, en la forma de las sustancias inmunomoduladoras descritas anteriormente tales como las citoquinas descritas como adyuvantes útiles. Una versión preferida de esta realización abarca el tener la región codificadora para el análogo y la región codificadora para el inmunomodulador en diferentes fases de lectura o al menos bajo el control de diferentes promotores. Por lo tanto se evita que el análogo o epítopes se produzcan como agentes de fusión al inmunomodulador. Como alternativa, se pueden usar dos fragmentos de nucleótidos distintos como agentes de transformación. De hecho, el tener el 1º y/o 2º y/o 3º restos en la misma fase de lectura puede proporcionar como tal producto de expresión, un análogo de la invención, y tal realización se prefiere especialmente de acuerdo con la presente invención.
Uso del procedimiento de la invención en tratamiento de enfermedades
Como se apreciará a partir de la descripción anterior, la provisión del procedimiento de la invención permite el control de las enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides. En este contexto, la AD es la diana clave para el procedimiento de la invención pero también otras enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides son posibles dianas. Por lo tanto, una realización importante del procedimiento de la invención para regular hacia abajo la actividad amiloide comprende tratar y/o prevenir y/o mejorar la AD u otras enfermedades caracterizadas por deposición de amiloides, el procedimiento comprende la regulación hacia debajo de amiloide de acuerdo con el procedimiento de la invención a tal grado que la cantidad de amiloide disminuye significativamente.
Se prefiere especialmente que la reducción en amiloide de cómo resultado una inversión del equilibrio entre formación amiloide y degradación/eliminación amiloide, es decir, que la velocidad de degradación/eliminación de amiloide lleve a exceder la velocidad de formación de amiloide. Controlando cuidadosamente el número e impacto inmunológico de inmunizaciones del individuo en necesidad de las mismas y será posible obtener un equilibrio con el tiempo que da como resultado una reducción neta de depósitos de amiloide sin tener excesivos efectos adversos.
Como alternativa, si en un individuo el procedimiento de la invención no puede eliminar o reducir la existencia de depósitos de amiloide, el procedimiento de la invención se puede usar para obtener una reducción clínicamente significativa en la formación de nuevo amiloide, por lo tanto prolongando significativamente el tiempo donde la afección patológica no es debilitante. Debe ser posible controlar la velocidad de depósito de amiloide o bien midiendo la concentración en suero de amiloide (que se cree que está en equilibrio con el material depositado)), o usando barrido por tomografía de emisión de positrones (PET), véase Small GW, y col., 1996, Ann N Y Acad Sci 802: 70 - 78.
Otras enfermedades y afecciones en las que los medios y procedimientos actuales se pueden usar en el tratamiento o mejoría de una forma análoga se han mencionado anteriormente en los "antecedentes de la invención" (amiloidosis sistémica, diabetes de comienzo en la madurez, enfermedad de parkinson, enfermedad de Huntington, demencia frontotemporal y las encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas con priones) o se enumeran más adelante en la sección de encabezamiento "otras enfermedades causadas por amiloides y proteínas asociadas a ellas".
Péptidos, polipéptidos, y composiciones de la invención
Como será evidente a partir de lo anterior, la presente invención se basa en el concepto de inmunizar individuos contra el antígeno amiloidogénico con el fin de obtener una cantidad reducida de depósitos de de amiloides relacionados con la patología. La forma preferida de obtener tal inmunización es usar versiones modificadas del polipéptido amiloidogénico, proporcionando por lo tanto moléculas que no se han descrito previamente en la técnica.
Se cree que las moléculas descritas en esta memoria descriptiva son inventivas por derecho propio, y por lo tanto una parte importante de la invención pertenece a un análogo de un polipéptido amiloidogénico que se deriva de un A\beta o APP autólogo de animal en el que se introduce al menos un epítope TH extraño aislado como se muestra esquemáticamente por los epítopes P2 y P30 en la figura 1, de manera que la inmunización del animal con el análogo induzca la producción de anticuerpos contra el polipéptido amiloidogénico. Preferiblemente, la naturaleza de al modificación coincide con los tipos de modificaciones descritas anteriormente cuando se describen diversas realizaciones del procedimiento de la invención cuando se usa polipéptido amiloidogénico modificado. Por lo tanto, cualquier descripción presentada en esta memoria descriptiva que pertenece a moléculas amiloidogénicas modificadas son relevantes para los propósitos de descripción de análogos amiloidogénicos de la invención, y cualquiera de tales descripciones se aplica mutatis mutandi a la descripción de estos análogos.
Se debe observar que las moléculas amiloidogénicas modificadas comprenden modificaciones que dan como resultado un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una proteína amiloidogénica o con una subsecuencia de la misma de al menos 10 aminoácidos de longitud. Se prefieren identidades de secuencia mayores, por ejemplo, al menos 75% o incluso al menos 80, 85, 90, 0 95%. La identidad de secuencia para proteínas y ácidos nucleicos se pueden calcular como N_{ref} - N_{dif}). 100/N_{ref}, en la que N_{dif} es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando están alineadas y en la que N_{ref} es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (N_{dif} = 2 y N_{ref}= 8).
La invención también pertenece a composiciones útiles en ejercitar el procedimiento de la invención.
Por lo tanto la invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un análogo definido anteriormente, dicha composición comprende adicionalmente un diluyente y/o vehículo y/o excipiente farmacéutica e inmunológicamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. En otras palabras, esta parte de la invención se refiere a formulaciones de polipéptido amiloidogénico modificado, esencialmente como se ha descrito anteriormente. La elección de adyuvantes, portadores y vehículos, está de acuerdo con la línea que se ha descrito anteriormente cuando se menciona la formulación de polipéptido amiloidogénico modificado y no modificado para uso en el procedimiento de la invención para la regulación hacia debajo de amiloide.
Los polipéptidos se preparan de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos más largos se preparan normalmente por medio de la tecnología génica recombinante que incluye la introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica el análogo en un vector adecuado, transformación de una célula hospedadora adecuada con el vector, expresión por la célula hospedadora de la secuencia de ácido nucleico, recuperación del producto de expresión de las células hospedadoras o su sobrenadante en cultivo, y posterior purificación y modificación adicional opcional, por ejemplo, replegamiento o derivación.
Se preparan preferiblemente péptidos más cortos por medio de técnicas bien conocidas de síntesis de péptidos en fase líquida. Sin embargo, recientes avances en esta tecnología han hecho posible la producción de polipéptidos de longitud completa y proteínas por estos medios, y por lo tanto está también dentro del alcance de la presente invención para preparar las construcciones largas por medios sintéticos.
Fragmentos de ácidos nucleicos y vectores de la invención
Se apreciará a partir de la descripción anterior que los polipéptidos amiloidogénicos modificados se pueden preparar mediante tecnología génica recombinante pero también por medio de síntesis o semisíntesis química; las últimas dos opciones son especialmente relevantes cuando la modificación consiste en acoplamiento a moléculas no proteináceas tales como polímeros de carbohidrato y de hecho también cuando la modificación comprende la adición de cadenas laterales o grupos laterales a una cadena de péptidos derivada de polipéptido amiloidogénico.
Para el propósito de tecnología génica recombinante, y de hecho también para el propósito de inmunización de ácido nucleico, los fragmentos de ácido nucleico que codifican polipéptido amiloidogénico modificado son productos químicos importantes. Por lo tanto, una parte importante de la invención pertenece a un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo de polipéptido amiloidogénico, es decir un polipéptido derivado de polipéptido amiloidogénico que o bien comprende la secuencia natural a la que se ha añadido o insertado una gente de fusión o, preferiblemente un polipéptido derivado de polipéptido amiloidogénico en el que se ha introducido un epítope de células T extraño mediante la inserción y/o adición, preferiblemente mediante sustitución y/o supresión. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención son o bien fragmentos de ADN o ARN.
Los fragmentos de ácido nucleico de la invención normalmente se insertarán en vectores adecuados para formar vectores de clonación o expresión que llevan fragmentos de ácido nucleico de la invención; tales vectores novedosos son también parte de la invención. Detalles concernientes a la construcción de estos vectores de la invención se describirán en el contexto de células y microorganismos transformadas más adelante. Los vectores, pueden, dependiendo del propósito y tipo de aplicación, estar en la forma de plásmidos, fagos, cósmicos, minicromosomas, o virus, sino también ADN desnudo que solamente se expresa transitoriamente en ciertas células en un vector importante. Los vectores de clonación y expresión preferidos de la invención son capaces de replicación autónoma, permitiendo por lo tanto altos números de copias para el propósito de expresión de alto nivel o replicación de alto nivel para la clonación superior.
El esquema general de un vector de la invención comprende las siguientes características en la dirección 5' \rightarrow 3'
y en enlace operable: un promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido guía que permite la secreción (a la fase extracelular o, cuando sea aplicable, en el periplasma) de o integración en la membrana del fragmento polipeptídico, el fragmento de ácido nucleico de la invención, y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador. Cuando se opera con vectores de expresión en cepas productoras de líneas celulares es para el propósitos de estabilidad genética de la célula transformada preferida que el vector cuando se introduce en una célula hospedadora se integre en el genoma de la célula hospedadora. En contraste, cuando se trabaja con vectores a usar para efectuar la expresión in vivo en un animal (es decir, cuando se usa el vector en vacunación de ADN) es por razones de seguridad preferidas que el vector es incapaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora; típicamente, se usan ADN desnudo o vectores virales no integrantes, cuyas elecciones se conocen por los expertos en la
técnica.
Los vectores de la invención se usan para transformar células hospedadoras para que produzcan el polipéptido amiloidogénico modificado de la invención. Tales células transformadas, que también son parte de la invención, pueden ser células o líneas celulares cultivadas usadas para la propagación de fragmentos y vectores de ácidos nucleicos de la invención, o se usan para producción recombinante de los polipéptidos amiloidogénicos de la invención. Como alternativa, las células transformadas pueden ser cepas de vacuna viva en las que el fragmento de ácido nucleico (una copia única o múltiple) se han insertado de manera que efectúa la secreción o integración en la membrana bacteriana o pared celular del polipéptido amiloidogénico modificado.
Las células transformadas preferidas de la invención son microorganismos tales como bacterias (tales como las especies Escherichia [por ejemplo E. coli], Bacillus, por ejemplo, Bacillus subtilis], Salmonella, o Mycobacterium [preferiblemente no patogénico, por ejemplo, M. bovis BCG]), levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae), y protozoos. Como alternativa, las células transformadas se derivan de un organismo multicelular tal como hongo, una célula de insecto, un célula vegetal, o una célula de mamífero. Las más preferidas son células derivadas de un ser humano, véase, la descripción de líneas celulares y vectores más adelante. Recientes resultados han mostrado gran promesa en el uso de una línea celular de Drosophila melanogaster comercialmente disponible (la línea celular Schneider 2 (S_{2}) y sistema de vector disponible de Invitrogen) para la producción recombinante de polipéptidos en el laboratorios de los solicitantes, y por lo tanto este sistema de expresión se prefiere particular-
mente.
Para los propósitos de clonación y/o expresión optimizada se prefiere que la célula transformada sea capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células que expresan el fragmento de ácido nucleico son realizaciones útiles preferidas de la invención; se pueden usar para la preparación a pequeña escala o gran escala del polipéptido amiloidogénico modificado o, en el caso de bacterias no patogénicas, como constituyentes de vacuna en una vacuna viva.
Cuando se producen las moléculas de la invención por medio de células transformadas, es conveniente, aunque lejos de los esencial, que el producto de expresión o bien se exporte en el medio de cultivo o se lleve sobre la superficie de la célula transformada.
Cuando una célula productora eficaz se ha identificado, se prefiere, en su propia base, establecer una línea celular estable que lleva el vector de la invención y que expresa el fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido amiloidogénico modificado. Preferiblemente, esta línea celular estable secreta o lleva el análogo de la invención, facilitando por lo tanto la purificación del mismo.
En general, los vectores plásmidos que contienen replicón y secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedadora se usan junto con los hospedadores. El vector ordinariamente lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un derivado plásmido de la especie E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar y col., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y se este modo proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido pBR, u otros plásmido o fago microbiano también debe contener, o estar modificado para contener, promotores que se pueden usar por los microorganismos procarióticos para expresión.
Los promotores más comúnmente usados en construcciones de ADN recombinante incluyen la B-lactamasa (penicilinasa) y sistemas de promoción de lactosa (Chang y col., 1978; Itakura y col., 1977; Goeddel y col., 1979; EP-A-0 036 776). Mientras éstos son los más comúnmente usados, otros promotores microbianos se han descubierto y utilizado, y se han publicado los detalles relativos a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo que un trabajador experto les ligue funcionalmente con vectores de plásmidos (Siebwenlist y col., 1980). Ciertos genes de procariotas se pueden expresar eficazmente en E. coli a partir de sus propias secuencias promotoras, evitando la necesidad de adición de otro promotor mediante medios artificiales.
Además de procariotas, también se pueden usar microbios eucarióticos, tales como cultivos de levaduras, y por lo tanto el promotor debe ser capaz de dirigir la expresión. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero es el microorganismo más comúnmente usado entre los microorganismos eucarióticos, aunque numerosas otras cepa están comercialmente disponibles. Para la expresión en Saccharomyces, se usa, por ejemplo, comúnmente el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., 1979; Kingsman y col., 1979; Tschemper y col., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras que carece de la capacidad de desarrollarse en triptófano por ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión de trpl como una característica del genoma de la célula hospedadora de levadura entonces proporciona un ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzman y col., 1980) u otras enzimas glucolíticas(Hess y col., 1968; Holland y col., 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructo quinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3- fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. En la construcción de plás midos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas a estos genes también están ligados en el extremo 3' del vector de expresión de la secuencia deseada a expresar que proporciona poliadenilación del ARNm y terminación.
Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento son la región promotora para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al metabolismo de nitrógeno, y la gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa anteriormente mencionada, y las enzimas responsables para la utilización maltosa y galactosa. Es adecuado cualquier vector plásmido que contiene un promotor compatible de levadura, origen de secuencias de replicación y terminación.
Además de los microorganismos, también se pueden usar como huéspedes cultivos de células derivados de organismos multicelulares. En principio, cualquiera de tales cultivos celulares es operativo, si es de cultivo vertebrado o invertebrado. Sin embargo, ha sido de mayor interés en células de vertebrados, y la propagación de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) ha llegado a ser un procedimiento rutinario en los años recientes (Tissue Culture, 1973). Los ejemplos de tales líneas de células hospedadoras útiles son las células VERO y HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino, y células W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) (comercialmente disponibles como sistemas de expresión completa a partir de, entre otros, Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, Estados Unidos y de Invitrogen), y líneas de células MDCK. En la presente invención, una línea celular especialmente preferida es S_{2} disponible de Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The
Netherlands.
Los vectores de expresión para tales células incluyen ordinariamente (si es necesario) un origen de replicación, un promotor localizado en frente del gen a expresar, junto con cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitios de ayuste de ARN, sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras transcripcionales.
Para uso en células de mamíferos, las funciones de control sobre lso vectores de expresión se proporcionan a menudo por material viral. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de polioma, Adenovirus 2, y los más frecuentemente Virus de simio 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen viral SV40 de replicación (Fiers y col., 1978). También se pueden usar fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pared de bases que se extiende entre el sitio HindIII hacia el sitio BglI localizado en el origen viral de replicación. Además, también es posible, y a menudo deseable, utilizar secuencias promotoras o de control, con tal que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.
Un origen de replicaciones puede proporcionar o bien mediante construcción del vector que incluye un Orión exógeno, tal como se puede derivar de SV40 u otro virus (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) o se puede proporcionar por el mecanismo de replicación cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector está integrado en el cromosoma de la célula hospedadora, lo último es a menudo suficiente.
Identificación de análogos útiles
Será evidente para los expertos en la técnica que no todas las variantes o modificaciones posibles de polipéptidos amiloidogénicos de origen natural tendrán la capacidad de generar anticuerpos en un animal que son de reacción cruzada con la forma natural. Sin embargo, no es difícil establecer un rastreo convencional eficaz para moléculas amiloidogénicas que cumplirán los requerimientos mínimos para la reactividad inmunológica descrita en esta memoria descriptiva. Por lo tanto, un procedimiento para la identificación de un polipéptido amiloidogénico modificado que es capaz de incluir anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico no modificado en una especie animal en la que el polipéptido amiloidogénico no modificado es una autoproteína (no inmunogénica), comprende
-
preparar, mediante las técnicas de síntesis de péptidos o de ingeniería genética, un conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados en los que los aminoácidos se han añadido a, insertados en, suprimidos de, o sustituidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido amiloidogénico de la especie animal dando lugar por lo tanto a secuencias de aminoácidos en el conjunto que comprende epítopes de células T que son extraños a la especie animal, o preparando un conjunto de fragmentos de ácidos nucleicos que codifican el conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados mutuamente distintos,
\newpage
-
ensayar miembros del conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados o fragmentos de ácidos nucleicos por su capacidad de inducir la producción de anticuerpos por la especie animal contra el polipéptido amiloidogénico no modificado, e
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identificar y opcionalmente aislar el (los) miembro (s) del conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados que significativamente induce la producción de anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico no modificado en la especie o identificar y opcionalmente aislar los productos de expresión de polipéptidos codificados por miembros del conjunto de fragmentos de ácidos nucleicos que significativamente induce la producción de anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico no modificado en la especie animal.
En este contexto, el "conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados mutuamente distintos"es una colección de polipéptidos amiloidogénicos modificados no idénticos que, por ejemplo, se han seleccionado en base de los criterios descritos anteriormente (por ejemplo, en combinación con estudios de patrones de dicroísmo circular, espectro de RMN, y/o de difracción de rayos X). El conjunto puede consistir en solamente unos pocos miembros pero se contempla que el conjunto pueda contener varios cientos de miembros.
El ensayo de miembros del conjunto se puede por último realizar in vivo, pero se pueden aplicar numerosos ensayos in vitro que estrechan el número de moléculas modificadas que servirán el propósito de la invención.
Ya que el objetivo de introducción de los epítopes de células T extraños es soportar la respuesta de células B por el auxiliar de las células T, un prerrequisito es que la proliferación de las células T esté inducido por el polipéptido amiloidogénico modificado. La proliferación de las células T se puede ensayar mediante ensayos de proliferación normalizados in vitro. En resumen, una muestra enriquecida por células T se obtiene a partir de un sujeto y posteriormente se mantiene en cultivo. El cultivo de las células T se pone en contacto con las APC del sujeto que han tomado previamente la molécula modificada y procesado para presentar sus epítopes de células T. La proliferación de células T se controla y se compara con un control adecuado (por ejemplo, células T en cultivo puestas en contacto con las APC que se han procesado intactas, polipéptido amiloidogénico nativo). Como alternativa, la proliferación se puede medir determinando la concentración de citoquinas relevantes liberadas por las células T en respuesta a su reconocimiento de células T extrañas.
Habiendo hecho altamente probable que al menos un polipéptido amiloidogénico modificado es cualquier tipo de conjunto capaz de inducir la producción de anticuerpo contra polipéptido amiloidogénico, es posible preparar una composición inmunogénica que comprende al menos un polipéptido amiloidogénico modificado que es capaz de de inducir anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico no modificado en una especie animal en la que el polipéptido amiloidogénico no modificado es una autoproteína, comprendiendo el procedimiento la mezcla del (de los) miembro (s) del conjunto que induce significativamente la producción de anticuerpos en la especie animal que son reactivos con el polipéptido amiloidogénico con un vehículo y/o diluyente y/o excipiente farmacéutica o inmunológicamente aceptable, opcionalmente en combinación con al menos un adyuvante farmacéutica e inmunológicamente
aceptable.
El procedimiento anterior pertenece a ensayo de conjuntos de polipéptidos se llevan convencionalmente a cabo inicialmente preparando un número de secuencias de vectores o de ácidos nucleicos mutuamente distintos de la invención, insertando éstos en vectores de expresión, transformando células hospedadoras adecuadas (o animales hospedadores) con los vectores, y efectuando la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención. A estas etapas pueden seguir el aislamiento de los productos de expresión. Se prefiere que las secuencias de ácido nucleico y/o vectores se preparen mediante procedimientos que comprenden ejercitar una técnica de amplificación molecular tal como PCR o mediante la síntesis de ácidos nucleicos.
Otras enfermedades amiloídicas y proteínas asociadas a ellas
Existe un número relativamente grande de enfermedades diferentes de la AD en al que la formación de amiloide está implicada en el desencadenamiento de la enfermedad o en la provocación de los síntomas de la enfermedad. Aunque las proteínas implicadas en estas enfermedades varían en naturaleza comparten las mismas características que definen amiloide, véase lo mencionado anteriormente. La siguiente tabla enumera un número de trastornos causados por amiloides y las proteínas que los provocan.
Diversidad de proteínas fibrilares amiloides
Síndrome clínico Subunidad de fibrila Estructura
precursora
Angiopatía amiloide cerebral A\beta Todas \beta
Amiloidosis sistémica proteica monoclonal \begin{minipage}[t]{70mm} Longitud completa o fragmentos del dominio V de la cadena ligera de IG\end{minipage} Todas \beta
Amiloidosis sistémica reactiva (AA) \begin{minipage}[t]{70mm} Fragmento de 76 residuos N - terminal de proteína A amiloide\end{minipage} \alpha/\beta
Polineuropatía amiloidótica familiar \begin{minipage}[t]{70mm} longitud completa o variantes de fragmentos de transtiretina\end{minipage} Todas \beta
Amiloidosis Apo A1 hereditaria \begin{minipage}[t]{70mm} Fragmentos N - terminal (aproximadamente 90 residuos) de variantes de ApoA1\end{minipage} (\alpha/\beta)
Amiloidosis de lisozima hereditaria Variantes de longitud completa de Lisozima \alpha + \beta
Diabetes mellitus de tipo II \begin{minipage}[t]{70mm} Fragmento de 37 residuos de polipéptido amiloide de islotes\end{minipage} Desconocida
Amiloide relacionado con insulina Insulina de tipo salvaje de longitud Completa \alpha + \beta
Encefalopatía espongiforme transmisible \begin{minipage}[t]{70mm} Longitud completa o fragmentos de proteína de priones\end{minipage} \alpha + \beta
Carcinoma medular del tiroides Fragmentos de calcitonina Desconocida
Amiloidosis sistémica senil Longitud completa o fragmentos de Transtiretina Todas \beta
Amiloidosis relacionada con hemodiálisis \begin{minipage}[t]{70mm} Microglobulina de longitud completa, de tipo salvaje \beta - 2\end{minipage} Todas \beta
Amiloidosis atrial aislada Factor natriurético atrial Desconocida
Angiopatía amiloide cerebral hereditaria Fragmento de 110 residuos de citastina Variante A + \beta
Amiloidosis hereditaria finlandesa \begin{minipage}[t]{70mm} Fragmento de 71 residuos de variantes de gelsolina\end{minipage} \alpha/\beta
\begin{minipage}[t]{60mm} Amiloidosis de la cadena a de fibrinógeno hereditaria\end{minipage} \begin{minipage}[t]{70mm} Fragmentos de variantes de la cadena a de fibrinógeno\end{minipage} Desconocida 
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Se contempla que la mayoría de los procedimientos para inmunizar contra polipéptidos amiloidogénicos se debe restringir a la inmunización que da lugar a anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con el polipéptido amiloidogénico nativo. Sin embargo, en algunos casos será de interés inducir inmunidad celular en la forma de respuestas contra células que presentan epítopes de la clase i de MHC a partir de polipéptidos amiloidogénicos - esto puede ser conveniente en aquellos casos en los el número de células que producen los polipéptidos amiloidogénicos no constituyen un efecto adverso grave. En los casos en los que se desean respuestas de CTL se prefiere utilizarlas enseñanzas de el documento PCT/DK99/00525 de los solicitantes (correspondiente al documento USSN 09/413.186). Las descripciones de estos dos documentos se incorporan por la presente como referencia en esta memoria descriptiva.
En el siguiente ejemplo, no limitante, se ha centrado la atención en el desarrollo de una autovacuna a base de A\beta contra la AD.
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Ejemplo 1
El planteamiento de autovacunación para inmunizar contra la AD
El hecho de que los ratones con inactivación de la proteína A\beta no muestran ninguna anormalidad o efectos secundarios adversos, sugieren que la eliminación o reducción de las cantidades de A\beta serán seguras, Zheng H.
(1996).
Los experimentos publicados en los que se inmunizan animales transgénicos contra la proteína A\beta humana transgénica sugieren que era posible romper la autotolerancia, regulación hacia debajo de A\beta se podría obtener mediante anticuerpos auto - reactivos. Estos experimentos sugieren adicionalmente que tal regulación hacia debajo de A\beta potencialmente prevendrían ambos la formación de placas, e incluso eliminar las placas de A\beta ya formadas del cerebro, véase Schenk y col., (1999). Pero, tradicionalmente no es posible generar anticuerpos contra las auto-
proteínas.
Los datos publicados no proporcionan los medios para romper la autotolerancia verdadera hacia las verdaderas autoproteínas. Ni los datos proporcionan los medios información sobre cómo asegurar que la reacción inmune se dirige solamente a predominantemente hacia los depósitos de A\beta, y no hacia la proteína precursora de A\beta unida a la membrana celular, si esto se considera necesario. Una respuesta inmune generada usando la tecnología existente presumiblemente generaría una respuesta inmune hacia las autoproteínas de una forma no regulada de manera que se puede generar auto - reactividad tan indeseada y excesiva hacia partes de la proteína A\beta. Por lo tanto, usando estrategias de inmunización existentes lo más probablemente será incapaz de generar fuertes respuestas inmunes hacia autoproteínas y además serán inseguras debido a la potencial fuerte reactividad cruzada hacia la APP unida a membranas que esté presente en un gran número de células en el SNC.
La presente invención proporciona los medios de generar de manera eficaz una fuerte respuesta inmune regulada hacia las autoproteínas verdaderas que potencialmente podrían formar placas y provocar enfermedad grave en el SNC o en otros compartimientos del cuerpo. Una vacuna terapéutica de proteína A\beta humana segura y eficaz se desarrollará usando esta tecnología para el tratamiento de la AD.
A la luz de esto, es posible anticipar que la AD, una enfermedad predicha que lesiona el sistema de atención sanitaria en el siglo siguiente, se podría curar, o las vacunas descritas podrían al menos constituir un planteamiento terapéutico eficaz para el tratamiento de los síntomas y progresión de esta enfermedad.
Esta técnica representa un planteamiento inmunológico completamente nuevo para bloquear la deposición de amiloides en al AD y otras enfermedades neurológicas también.
En la siguiente tabla, se indican 35 construcciones contempladas. Todas las posiciones proporcionadas en la tabla son relativas a la metionina de partida de la APP(primer aminoácido en la SEC ID Nº 2) e incluyen el aminoácido tanto de inicio como de final, por ejemplo, el fragmento de 672 - 714 incluye tanto el aminoácido 672 como el 714. Las posiciones de inicio como de final para P2 y P30 indican que el epítope sustituye una parte del fragmento de la APP en las posiciones indicadas (ambas posiciones incluidas en la sustitución) - en la mayoría de las construcciones, los epítopes introducidos sustituyen un fragmento de la longitud del epítope. Los asteriscos en al tabla tienen el siguiente significado:
*) Solamente una posición para P2 y P30 indica que el epítope se ha insertado en el derivado de la APP en la posición indicada (el epítope comienza en el aminoácido adyacente C - terminalmente a la posición proporcio-
nada).
**) La construcción 34 contiene tres fragmentos de APP idénticos separados por P30 y P2, respectivamente.
***) La construcción 35 contiene nueve fragmentos de APP idénticos separados por epítopes P30 y P2 alternativos.
1 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
2 
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La parte de APP contra la que es más interesante generar una respuesta es el péptido del núcleo de la A\beta de 43 aminoácidos (A\beta - 43, correspondiente a la SEC ID Nº 2, residuos 672 - 714) que es el principal constituyente de las placas amiloides en los cerebros de la AD. este fragmento de la APP es parte de todas las construcciones enumeradas anteriormente.
Las variantes 1 y 2 comprenden una porción de la corriente hacia arriba de la APP de la A\beta - 43 en la que se han situado los epítopes P2 y P30 modelos. Todas las variantes a y 3 - 8 comprenden el fragmento C-100 que se mostrado que es neurotóxico - el fragmento C-100 corresponde a los residuos de aminoácidos 714 - 770 de la SEC ID Nº 2. En las variantes 3 - 5 los epítopes sustituyen una parte del fragmento C-100 mientras que las variantes 6 - 8 se han insertado en C-100.
Las variantes 9 - 35 contienen solamente la proteína del núcleo A\beta-43. En las variantes 9 - 13, P2 y P30 se condensan a cualquier extremo de A\beta-43; en 14 - 21 P2 y P30 sustituye parte de A\beta-43; en 22 - 33 P2 y P30 se insertan en A\beta-43; 34 contiene tres fragmentos idénticos A\beta-43 espaciados por P30 y P2, respectivamente; 35 contiene 9 repeticiones A\beta-43 espaciadas por los epítopes P2 y P30 alternativos.
Véase la figura 1 y la tabla anterior para detalles.
Un tipo adicional de construcción se prefiere especialmente. Ya que un objetivo de la presente invención es evitar la destrucción de las células que producen APP mientras que se desea la eliminación de la A\beta, parece factible preparar construcciones de autovacunas que comprenden solamente partes de la A\beta que no se exponen a la fase extracelular cuando está presente en la APP. De este modo, tales construcciones necesitarían contener al menos un epítope de células B derivados del fragmento de aminoácidos definidos por los aminoácidos 700 - 714 en la SEC ID Nº 2.
Ya que tal fragmento de polipéptido corto se predice que es solamente débilmente inmunogénico se prefiere que tal construcción de autovacuna conste de varias copias del epítope de células B, por ejemplo en la forma de una construcción que tiene la estructura mostrada en la fórmula I en la descripción deseada de la presente invención, véase anteriormente. En esa versión de fórmula I, los términos amiloide_{el} - amiloide_{ex} son x epítope de células B que contienen secuencias de aminoácidos derivadas de los aminoácidos 700 - 714 de la SEC ID Nº 2. Una alternativa preferida es la posibilidad anteriormente detallada de acoplamiento del polipéptido amiloidogénico y el epítope de auxiliares T extraño mediante un enlace amida una molécula vehículo de polisacárido - de esta forma presentaciones múltiples del epítope "débil" constituido por los aminoácidos 700 - 714 de la SEC ID Nº 2 se hace posible, y se hace también posible seleccionar una relación óptima entre los epítopes de las células B y de las células T.
Ejemplo 2
Inmunización de ratones transgénicos con proteínas A\beta y modificadas de acuerdo con la invención
Construcción del ADN que codifica hAB43+-34. El gen hAB43+-34 se construyó en varias etapas. Primero se generó un fragmento de PCR con los cebadores ME nº 801 (SEC ID Nº 10) y ME nº 802 (SEC ID Nº 11) usando el cebador ME nº 800 (SEC ID Nº 9) como molde. ME nº 800 codifica el fragmento abeta-43 humano con codones optimizados de E. coli. ME nº 801 y 802 añade sitios de restricción apropiados al fragmento.
El fragmento de PCR se purificó, se digirió con NcoI y HindIII, se purificó de nuevo y se clonó en un vector de expresión de E. coli pET28b+ digerido y purificado por NcoI - HindIII. El plásmido resultante que codifica A\beta humano de tipo salvaje se llama pAB1.
En la siguiente etapa el epítope de auxiliares T, P2, se añade al extremo C de la molécula. El cebador ME nº 806 (SEC ID Nº 12) contiene la secuencia que codifícale epítope P2, de este modo generando una fusión de P2 y Abeta- 43 mediante la reacción de PCR.
La clonación se realizó preparando un fragmento de PCR con los cebadores ME nº 178 (SEC ID Nº 8) y ME nº 806 usando pAB1 como molde. El fragmento se purificó, se digirió con NcoI e HindIII, se purificó otra vez y se clonó en un vector pET28b+ digerido y purificado por NcoI - HindIII. El plásmido resultante que codifica A\beta humano de tipo salvaje se llama pAB2.
De manera análoga, se preparó otro plásmido alojando la secuencia que codifica A\beta-43 con otro epítope de auxiliares T, P30, añadido al extremo N. Esto se hizo preparando un fragmento de PCR con los cebadores ME nº 105 (SEC ID Nº 7) y ME nº 807 (SEC ID Nº 13) usando pAB1 como molde.
El fragmento se purificó, se digirió con NcoI e HindIII, se purificó otra vez y se clonó en un vector pET28b+ digerido y purificado por NcoI - HindIII. El plásmido resultante que codifica A\beta humano de tipo salvaje se llama pAB3.
En la tercera etapa, se añade una segunda repetición de A\beta-43 de manera C terminal al epítope P2 del plásmido pA42 mediante el cebador ME nº 809 (SEC ID Nº 14). ME nº 809 al mismo tiempo crea un sitio BamHI inmediatamente después de la repetición A\beta-43. Un fragmento de PCR se proparó con los cebadores ME nº 178 y ME n1 809 usando pAB2 como molde. El fragmento se digirió con NcoI e HindIII, se purificó y se clonó en un vector pET28b+ digerido y purificado por NcoI - HindIII. El plásmido resultante que codifica A\beta humano de tipo salvaje se llama pAB4.
Finalmente, el epítope P30 - secuencia de repetición A\beta-43 de pAB43 se clonó en el plásmido pAB4. Esto se realizó preparando un fragmento de PCR con los cebadores ME nº 811 (SEC ID Nº 16) y ME nº 105 usando pAB3 como molde. El fragmento se purificó y se usó como cebador en una PCR posterior con ME nº 810 (SEC ID Nº 15) usando pAB43 como molde. El fragmento resultante se purificó, se digirió con BamHI y HindIII y se clonó en el plásmido pAB4 purificado y digerido por BamHI y HindIII. El plásmido resultante pAB5, codifica la molécula hAB43+-34.
Todos los procedimientos de PCR y clonación se realizaron esencialmente como describen Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. 1989 "Molecular Cloning: a laboratory manual". 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
Para todos los procedimientos de clonación, se usaron células K-12 de E. coli, cepa Top-10 F' (Stratagene, Estados unidos). El vector pET28b+se compró a Novagen, Estados Unidos. Todos los cebadores se sintetizaron en DNA Technology, Dinamarca.
Expresión y purificación de hAB43+-34. La proteína hAB43+-34 codificada por pAB5 se expresó en células BL21-Gold de E. coli (Novagen) como describen los proveedores del sistema de pET28b+ (Novagen).
La proteína hAB43+-34 expresada se purificó a más de 85% de pureza lavando de cuerpos de inclusión seguido de cromatografía de intercambio catiónico usando una estación de trabajo de puridficación BioCad (PerSeptive Biosystems, Estados Unidos) en presencia de urea 6 M. La urea se retiró después mediante diálisis por etapas contra una solución que contenía cantidades decrecientes de urea. El tampón final era Tris 10 mM, pH 8,5.
Estudio de inmunización. Ratones transgénicos para APP humana (proteían presursoar de Alzheimer) se usaron para este estudio. Estos ratones, llamados TgRND8, expresan una forma mutada de APP que da como resultado alta concentración de A\beta-40 y A\beta-42 en cerebros de ratones (Janus, C. y col.).
Los ratones (8 - 10 ratones por grupo) se inmunizaron con o bien Abeta- 42 (SEC ID Nº 2, residuos 673 - 714, sintetizada por medio de una estrategia Fmoc convencional) o la variante hAB43+-34 (construcción 34 en la tabla del ejemplo 1, producido recombinantemente) cuatro veces a intervalos de dos semanas. Las dosis eran o bien 100 mg para A\beta o 50 mg para hAB43+-34. Se extrajo sangre de los ratones el día 43 (después de tres inyecciones) y después del día 52 (después de cuatro inyecciones) y se usaron los sueros para determinar el nivel de valoraciones específicas de anti-A\beta-42 usando un ELISA de A\beta-42 directo.
La siguiente tabla muestra las valoraciones medias relativas de anti- Abeta-42
Inmunógeno Día 43 (después de 3 inmunizaciones) Día 52 (después de 4 inmunizaciones)
A\beta-42 4000 3000
hAB43+34 16000 23000
Como es evidente, las valoraciones de anticuerpos obtenidas cuando se inmunizan con la variante hAB43+-34 A\beta son aproximadamente 4 veces y 7,5 veces mayores después de e y 4 inmunizaciones, respectivamente, que las valoraciones obtenidas cuando se usa la A\beta-42 de tipo salvaje como inmunógeno. Este hecho se pone adicionalmente en perspectiva, cuando se se considera el hecho de que la cantidad de variante usada para inmunización era solamente 50% de la cantidad de secuencia de tipo salvaje usada para inmunización.
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<160> 16
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<170> PatentIn versión 3.0
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<210> 1
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<211> 2313
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (1) .. (2313)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2098) .. (2169)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótidos que codifican región transmembrana
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (2014) .. (2313)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótidos que codifican C-100
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> (2016) .. (2144)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Abeta 42/43
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> (2014) .. (2142)
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<223> Abeta 42/43
\newpage
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<400> 1
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3
4
5
6
7 
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<210> 2
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<211> 770
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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8
9
10
11 
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<210> 3
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Clostridium tetani 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(45)
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<223> ADN que codifica el epítope P2
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<400> 3
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12 
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<210> 4
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Clostridium tetani 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu}
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<210> 5
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<211> 63
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<222> ADN
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<213> Clostridium tetani 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(63)
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<223> ADN que codifica el epítope P2
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<400> 5
13
14 
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<210> 6
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<211> 213
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<212> PRT
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<213> Clostridium tetani 
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<400> 6
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\sa{Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser}
\sac{Ala Ser His Leu Glu}
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<210> 7
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Sintético
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21 
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<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
agatctcgat cccgcgaaat t 
\hfill
21 
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<213> Sintético
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<400> 9
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15 
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<210> 10
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Sintético
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c 
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31 
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<212> ADN
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gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc 
\hfill
39 
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<211> 84
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<212> ADN
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<213> Sintético
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\vskip1.000000\baselineskip
16 
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<210> 13
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<211> 101
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<212> ADN
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<213> Sintético
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<400> 13
17 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc 
\hfill
35

Claims (38)

1. Uso de un agente seleccionado entre
a)
al menos un análogo de un péptido de A\beta (beta amiloide) o APP (proteína precursora amiloide) autólogo de animal en el que se introduce al menos un epítope de auxiliares T extraño aislado (epítope TH) por medio de inserción, adición, supresión, o sustitución de aminoácidos, en el que el epítope T_{H} extraño está libre de aminoácidos D y se introduce en A\beta o APP autólogo como se muestra esquemáticamente para los epítopes P2 y P30 en la figura 1,
b)
una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un análogo definido en a), y
c)
un microorganismo o virus no patógeno que lleva el fragmento de ácido nucleico definido en b)
para la preparación de un medicamento que contiene el agente para tratar y/o prevenir y/o mejorar de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades y afecciones caracterizadas por depósitos de A\beta en dicho animal.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la introducción tiene como resultado que una fracción sustancial de epítopes de células B o A\beta o APP se preservan y que
-
se introduce al menos un primer resto que efectúa la dirección del análogo a una célula presentadora de antígeno (APC) o un linfocito B, y/o
-
se introduce al menos un segundo resto que estimula el sistema inmune, y/o
-
se introduce al menos un tercer resto que optimiza la presentación del análogo al sistema inmune.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el análogo se modifica por la introducción como grupos laterales, mediante unión covalente o no covalente a grupos químicos adecuados en la A\beta, APP, o una subsecuencia de las mismas, del primer y/o segundo y/o del tercer resto.
4. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que el análogo incluye una duplicación de al menos un epítope de células B de A\beta o APP y/o una introducción de un hapteno.
5. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el epítope de células T extraño es inmunodominante en el animal.
6. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que el epítope de células T es promiscuo, tal como un epítope de células T que se selecciona entre un epítope de células T promiscuo y una secuencia artificial de péptidos de unión de MHC-II.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el epítope de células T natural se selecciona entre un epítope de toxoide de tétanos tal como P2 o P30, un epítope de toxoide de difteria, un epítope de hemaglutinina de virus de influenza, y un epítope CS de P. falciparum.
8. El uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 2 - 7, en el que el primer resto es un agente de unión sustancialmente específico para un antígeno de superficie específico de linfocito B o para un antígeno de superficie específico de APC tal como un hapteno o un carbohidrato para el que existe un receptor sobre el linfocito B o la APC.
9. El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 - 8, en el que el segundo resto se selecciona entre una citoquina tal como interferón \gamma (IFN-\gamma) o una parte eficaz del mismo, Flt3L o una parte eficaz del mismo, la interleuquina 1 (IL - 1) o una parte eficaz de la misma, la interleuquina 2 (IL - 2) o una parte eficaz de al misma, la interleuquina 4 (IL - 4) o una parte eficaz de la misma, la interleuquina 6 (IL - 6) o una parte eficaz de la misma, la interleuquina 12 (IL - 12) o una parte eficaz de la misma, la interleuquina 13 (IL - 13) o una parte eficaz de la misma, la interleuquina 15 (IL - 15) o una parte eficaz de la misma, y el factor estimulante de la colonia de garnulocitos - macrófagos (GM - CSF) o una parte eficaz del mismo; una hormona; y una proteína de choque térmico tal como HSP70 o una cantidad eficaz de la misma, HSP90 o una parte eficaz de la misma, HSC70 o una parte eficaz de la misma, GRP94 o una parte eficaz de la misma, y calrreticulina (CRT) o una parte eficaz de la misma.
10. El uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 2 - 9, en el que el tercer resto es de naturaleza lipídica, tal como un grupo palmitoílo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranilo - geranilo, un anclaje de GPI, y un grupo N-acil diglicérido, o en el que el tercer resto es un polihidroxipolímero tal como un polisacárido.
11. El uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la A\beta o APP autóloga se ha modificado de manera que preserve los epítopes de las células B que no están expuestos a la fase extracelular cuando están presentes en una forma unida a células de la APP autóloga.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la A\beta o APP se ha modificado de manera que carezca de al menos un epítope de células B que está expuesto a la fase extracelular cuando está presente en una forma unida a células de la APP autóloga.
13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una sustitución de al menos una secuencia de aminoácidos dentro de A\beta o APP autólogas con una secuencia de aminoácidos de longitud igual o diferente longitud que da lugar a un epítope TH extraño en el análogo.
14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análogo comprende la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 672 - 714 en la SEQ ID Nº 2, en la que se inserta una secuencia de aminoácidos que da lugar a un epítope T_{H} en el análogo, o en el que el análogo comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a loa aminoácidos 672 - 714 de la SEC ID Nº 2, en al que al menos una secuencia de aminoácidos está sustituida con una secuencia de aminoácidos de longitud igual o diferente de manera que da lugar a un epítope T_{H} extraño.
15. El uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos dos copias del análogo están covalente o no covalentemente unidas a una molécula vehículo capaz de efectuar la presentación de múltiples copias de determinantes antigénicos.
16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análogo se ha formulado con un adyuvante que facilita la rotura de autotolerancia a autoantígenos.
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una cantidad eficaz del análogo se administra al animal mediante una vía seleccionada entre la vía parenteral tal como las vías intracutánea, la subcutánea, y la intramuscular; la vía peritoneal, la vía oral; la vía bucal; la vía sublingual; la vía epidural; la vía espinal; la vía anal; y la vía intracraneal.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la cantidad eficaz está entre 0,5 \mug y 2000 \mug del análogo.
19. El uso de acuerdo con las reivindicación 17 ó 18, en el que el análogo está contenido en un dispositivo de ganglios linfáticos virtual (VLN).
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, en el que la regulación hacia abajo comprende la introducción de ácido (s) nucleico (s) que codifica (n) el análogo en las células de animal y obteniendo por lo tanto la expresión in vivo mediante las células del (de los) ácido (s) nucleico (s) introducido (s).
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, e el que el (los) ácido (s) nucleico (s) introducido (s) se selecciona (n) entre ADN desnudo, ADN formulado con lípidos cargados o no cargados, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido de dirección, ADN formulado con agentes precipitantes de calcio, ADN acoplado a una molécula vehículo inerte, ADN encapsulado en quitina o quitosan, y ADN formulado con un
adyuvante.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el (los) ácido (s) nucleico (s) está / están contenidos en un dispositivo de VLN.
23. El uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 18 - 22, que incluye al menos una administración/introducción al año, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 6, y al menos 12 administraciones/introducciones.
24. El uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, en el que el tratamiento, prevención o mejora comprende la administración de un microorganismo o virus no patógeno que lleva un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo.
25. Un análogo de un polipéptido amiloidogénico que se deriva de una A\beta (amiloide beta) o APP (proteína precursora amiloide) autóloga en el que se introduce al menos un epítope T_{H} (auxiliar T) extraño aislado como se muestra esquemáticamente para los epítopes P2 y P30 en la figura 1, de manera que la inmunización del animal con el análogo induce la producción de anticuerpos contra el polipéptido amiloidogénico.
26. Un análogo de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la modificación es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 - 14.
27. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de un análogo de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, comprendiendo adicionalmente la composición un portador y/o vehículo y opcionalmente un adyuvante farmacéutica e inmunológicamente aceptable.
28. Un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25.
29. Un vector que lleva el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27, tal como un vector que es capaz de replicación autónoma.
30. El vector de acuerdo con al reivindicación 28 que se selecciona entre el grupo constituido por un plásmido, un fago, un cósmido, un minicromosoma, y un virus.
31. El vector de acuerdo con cualquier reivindicación 28 ó 29, que comprende, en la dirección 5' \rightarrow 3' y en enlace operable, un promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido guía que permite la secreción de o integración en la membrana del fragmento polipeptídico, el fragmento de ácido nucleico de la invención, de acuerdo con al reivindicación 27, y opcionalmente un terminador.
32. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 - 30 que, cuando se introducen una célula hospedadora, es capaz o incapaz de integrase en el genoma de la célula hospedadora.
33. El vector de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31, en el que un promotor dirige la expresión en una célula eucariótica y/o en una célula procariótica.
34. Una célula transformada que lleva el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 28 - 32, tal como una célula transformada que es capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27.
35. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 33, que es un microorganismo seleccionado entre una bacteria, una levadura, un protozoo, o una célula derivada de un organismo multicelular seleccionada entre un hongo, una célula de insecto tal como una célula S_{2} o SF, una célula vegetal, y una célula de mamífero.
36. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, que expresa el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27, tal como una célula transformada, que secreta o lleva sobre su superficie, el análogo de acuerdo con la reivindicación 25 ó 26.
37. Una composición para inducir la producción de anticuerpos contra A\beta o APP en un animal en el que estas proteínas son autólogas, comprendiendo la composición
-
un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27 o un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 - 32, y
-
un portador y/o vehículo y/o adyuvante farmacéutica e inmunológicamente aceptable.
38. Una línea celular estable que lleva el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 - 32 y que expresa el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27, y que opcionalmente secreta o lleva el análogo de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25 sobre su superficie.
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