RS51164B - Postupak za smanjenje količine amiloida - Google Patents

Postupak za smanjenje količine amiloida

Info

Publication number
RS51164B
RS51164B YUP-577/02A YUP57702A RS51164B RS 51164 B RS51164 B RS 51164B YU P57702 A YUP57702 A YU P57702A RS 51164 B RS51164 B RS 51164B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
analog
epitope
nucleic acid
use according
Prior art date
Application number
YUP-577/02A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Birk
Martin Roland Jensen
Klaus Gregorius Nielsen
Original Assignee
H. Lundbeck A/S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by H. Lundbeck A/S. filed Critical H. Lundbeck A/S.
Publication of YU57702A publication Critical patent/YU57702A/sh
Publication of RS51164B publication Critical patent/RS51164B/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

Upotreba agensa odabranog od:a) najmanje jednog analoga životinjskog autologa Aβ (beta amiloid) ili APP (amiloid prekursor protefn) popileptida gde je uveden najmanje jedan izolovan strani T epitop pomagač (TH epitop) umetanjem, dodavanjem, delecijom ili supstitucijom amino kiselina, pri čemu strani TH epitop nema D-amino kiseline i uveden je u autologi Ap ili APP kao što je šematski dato za epitope P2 i P30 na slici 1,b) sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira najmanje jedan analog definisan pod a), ic) nepatogeni mikroorganizam ili virus koji nosi fragment nukleinske kiseline definisan pod b),za dobijanje leka koji sadrži agens za lečenje i/ili prevenciju i/li ublažavanje Alzheimer-ove bolesti ili drugih bolesti i stanja koja su okarakterisana depozitima Aβ kod životinja.Prijava sadrži još 6 nezavisnih i 34 zavisna patentna zahteva.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na poboljšanja u terapiji i prevenciji Alzheimer-ove bolesti (AD) i drugih bolesti koje karakteriše taloženje amiloida, npr. koje karakterišu naslage amiloida u centralnom nervnom sistemu (CNS). Određenije, ovaj pronalazak daje postupak za deregulaciju( smanjenje količine)(neželjenih) taloga amiloida omogućavanjem stvaranja antitela protiv relevantnih proteina ili njihovih komponenti kod osoba koje pate od ili su u opasnosti da pate od bolesti sa patologijom u kojoj učestvuje taloženje amiloida. Ovaj pronalazak daje takođe postupke za dobijanje polipetida koji su korisni u ovom postupku, kao i za modifikovane polipeptide kao takve. Ovim pronalaskom su takođe obuhvaćeni fragmenti nukleinske kiseline koji kodiraju modifikovane polipeptide, kao i vektori u koje su ugrađeni ovi fragmenti nukleinskih kiselina i ćelije domaćina i sojevi ćelija koje se time transformišu. Ovaj pronalazak takođe daje postupak za identifikaciju analoga naslaga polipeptida koji su korisni u postupku iz ovog pronalska, kao i za preparate koji sadrže modifikovane polipeptide ili koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju modifikovane peptide.
Amiloidoza je vanćelijsko taloženje nerastvomih fibrila proteina koje vodi oštećenju i oboljenju tkiva (Pepys, 1996; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). Fibrili se formiraju kada se normalno rastvomi proteini i peptidi samo-povezuju na abnormalan način (Kelly, 1997).
Amiloid je povezan sa ozbiljnim bolestima, uključujući sistemsku amiloidozu, AD, pojavu dijabetesa u zrelom dobu, Parkinson-ovu bolest, Huntington-ovu bolest, prikrivenu-povremenu demenciju i encefalopatije povezane sa prenosnim sunđerastim oblikom priona (kuru i Creutzfeldt-Jakob-ova bolest kod humanih bića, a bolest ludih krava i BSE kod ovaca i goveda), a formiranje amiloidnog plaka, na primer kod Alzeimer-ove bolest, izgleda da je blisko povezano sa napredovanjem bolesti kod humanih bića. Na modelima životinja, povećano izlučivanje ili izlučivanje modifikovanih oblika proteina koji se nalaze u naslagama, kao što je protein p-amiloid, pokazano je da izaziva razne simptome bolesti, npr. simptome slične Alzheimer-ovim. Nema specifičnog tretmana za taloženje amiloida i ove bolesti su obično fatalne.
Podgrupe amiloidnih fibrila mogu biti divlje vrste, varijante ili skraćeni proteini, a slični fibrili se mogu formiratiin vitroiz oligopeptida i denaturisanih proteina (Bradbury et al., 1960; Filshie et a!., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Priroda polipeptidne komponente ovih fibrila defmiše karakter amiloidoze. U prkos velikim razlikama u veličini, urođenoj strukturi i funkciji amiloidnih proteina, svi amiloidni fibrili su neodređene dužine, nisu razgranati, prečnika su 7 do 12 nm, i pokazuju karakteristično obojenje sa kongocrvenim (Pepys, 1966). Oni su karakteristika poprečne p strukture (Pauling i Corey, 1951), u kojoj je polipeptidni lanac organizovan u p-slojevima. Mada amiloidni proteini imaju vrlo različite prekursorske strukture, oni mogu da podlegnu strukturnoj konverziji, možda po sličnoj shemi, u pogrešan oblik koji je gradivni element protovlakna spirale p-sloja.
Ova jasna shema vlakna vodi u amiloidoze koje se nazivaju (3-fibrilozama (Glenner, 1980 a i b), a fibrilni protein AD je nazvan p-proteinom, pre nego što je bila poznata njegova sekundarna struktura (Glenner i Wong, 1984). Karakteristična p-poprečna difrakciona shema, zajedno sa pojavom fibrila i svojstvima bojenja, danas su prihvaćeni kao dijagnostički znakovi prepoznavanja amiloida i ukazuju da fibrili, mada formirani od sasvim različitih proteinskih prekursora, imaju jedan stepen strukturne sličnosti i čine strukturnu superfamiliju, bez obzira na prirodu njihovih prekursorskih proteina (Šunde M., Serpell L.C., Bartlam M., Fraser P.E., Pepys, M.B., Blake C.C.F.J,Mol. Biol.1997, 273(3). 729-739, 31. oktobar).
Jedna od najraširenijih i dobro poznatih bolesti gde je predloženo da amiloidne naslage u centralnom nervnom sistemu imaju centralnu ulogu u napredovanju bolesti je AD.
AD
Alzheimer-ova bolest (AD) je ireversibilno, progresivno oštećenje mozga koje se odigrava postepeno i dovodi do gubitka memorije, pramena u ponašanju i ličnosti i opadanja mentalnih sposobnosti. Ti gubici su povezani sa umiranjem moždanih ćelija i raskidanjem veza između njih. Tok ove bolesti varira od osobe do osobe, i ima ubrzano pogoršanje. U prošeku pacijenti od AD žive 8 do 10 godina nakon uspostvljanja dijagnoze, mada bolest može da traje i do 20 godina.
AD napreduje u fazama, od rane, blage zaboravnosti do teškog gubitka mentalne funkcije. Ovaj gubitak je poznat kao demencija. Kod većine ljudi sa AD, prvi simptomi se javljaju posle 60., ali nisu retki ni raniji počeci. Najraniji simptomi često su gubitak skorašnje memorije, pogrešno rasuđivanje i izmene u ličnosti. Često ljudi u početnim fazama AD manje jasno razmišljaju i zaboravljaju imena poznatih ljudi i uobičajenih predmeta. Kasnije, tokom bolesti oni mogu da zaborave kako da obave čak i proste zadatke. Konačno, ljudi sa AD gube sve sposobnosti rezonovanja i postaju zavisni od drugih ljudi u pogledu svakodnevne nege. Najzad, bolest postane toliko iznurujća da pacijenti padaju u krevet i postaju podložni razvoju drugih oboljenja i infekcija. Najčešće, ljudi sa AD umiru od pneumonije.
Mada rizik razvoja AD raste sa starošću, AD i demencija nisu deo normalnog starenja. AD i ostali poremećaji demencije su izazvani bolestima koje utiču na mozak. Kod normalnog starenja, nema gubitka velikog broja nervnih ćelija u mozgu. Nasuprot, AD razara tri ključna procesa: komunikaciju između nervnih ćelija, metabolizam i obnovu. Ovo razaranje konačno izaziva prestanak funkcionisanja nervnih ćelija, gubitak veza sa drugim nervnim ćelijama i smrt.
Pre svega, AD uništava neurone u delovima mozga koji kontroliše memoriju, a naročito u hipokampusu i srodnim strukturama. Čim nervne ćelije u hipokampusu prestanu da ispravno funkcionišu, gubi se kratkoročna memorija, pa se često gubi sposobnost osobe da obavlja jednostavne i poznate zadatke. AD napada takođe cerebralni korteks, a naročito delove koji su odgovorni za jezik i rasuđivanje. Konačno bivaju uključeni i mnogi drugi delovi mozga, sve ove regije mozga atrofiraju (naboraju se), a pacijent od AD postaje bolestan, inkontinentan, poptuno bespomćan i bez reagovanja na spoljašnji svet (izvor National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
UdarAD
AD je najčešći uzrok demencije među ljudima starosti 65 godina i starijim. Ona predstavlja glavni zdravstveni problem, zbog njenog ogromnog udara na pojedince, porodice, sistem zdravstvene nege i društvo u celini. Naučnici procenjuju da danas do 4 miliona ljudi pati od te bolesti, a rasprostranjenost se udvostručava svakih 5 godina iznad starosti od 65. Procenjuje se takođe, da će se svake godine dogoditi novih 360.000 slučajeva (učestalost), mada će taj broj rasti pošto populacija stari (Brookmever et al., 1998).
AD predstavlja težak ekonomski teret za društvo. Nedavno ispitivanje u Sjedinjenim Državama je procenilo da je godišnji trošak za brigu oko pacijenta od AD 18.408 dolara za pacijenta sa blagom AD, 30.096 dolara za pacijenta se umemom AD, a 36192 dolara za pacijenta sa teškom AD. Godišnji nacionalni trošak brige o pacijentima od AD u SAD se ceni na nešto iznad 50 milijardi dolara (Leon etal., 1998).
Približno 4 miliona Amerikanaca imaju 85 godina ili više, i u većini industrijalizovanih zemalja ova starosna grupa je jedan od najbrže rastućih segmenata populacije. Procenjuje se da će ova grupa u SAD brojati približno 8,5 miliona 2030. godine; neki od eksperata koji izučavaju trendove u stanovništvu smatraju da taj broj može biti čak i veći. Pošto sve više ljudi živi duže, broj ljudi koje napadaju bolesti starenja, uključujući AD, će nastaviti da raste. Na primer, neka ispitivanja pokazuju sa skoro polovina ljudi koji su stari 85 ili više godina imaju neki oblik demencije. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Glavne karakteristike AD
Abnormalne strukture u mozgu su znaci upozorenja na AD: amiloidni plakovi i neurofibrilami čvorići (NFT). Plakovi su guste, većinom nerastvorne naslage proteina i ćelijskog materijala izvan i okolo neurona u mozgu. Čvorići su nerastvoma uvrnuta vlakna koja izgrađuju unutrašnjost neurona.
Postoje dva tipa AD: familijama ili porodična AD (FAD), koja sledi izvesnu shemu nasleđa, i sporadična AD, gde se ne zapaža očigledna shema nasleđa. Zbog razlika u starosti kada se javlja, AD se još opisuje kao ona koja se rano javlja (događa se ljudima mlađim od 65) ili koja se kasno javlja (događa se onima koji imaju 65 ili su stariji). AD koja se rano javlja je retka (oko 10% slučajeva) i obično napada ljude starosti 30 do 60. Neki oblici AD koja se rano javlja se nasleđuju i dešavaju se u porodicama. AD koja se rano javlja takođe često napreduje brže od uobičajenijeg oblika koji se kasno javlja.
Sve do sada poznate FAD rano se javljaju, i do sada je poznato svih 50% slučajeva FAD kojima su uzrok defekti u tri gena, locirana na tri različita hromozoma. To su mutacije gena APP na 21. hromozomu; mutacije gena na 14. hromozomu, zvane presenilin 1; i mutacije gena na 1. hromozomu, zvane presenilin 2. Međutim, do sada nema dokaza da bilo koja od ovih mutacija igra glavnu ulogu u uobičajenijem, sporadičnom ili ne-familijarnom obliku AD sa kasnim javljanjem (National Institute on Aging Progress Report on Alzhemier's Disease, 1999).
Amiloidni plakovi
U AD, amiloidni plakovi se prvo stvaraju u delovima mozga koji služe za memorisanje i druge kognitivne funkcije. Oni se sastoje od većinom nerastvornih naslaga beta-amiloida (u nastavku će se označavati kao Ap), proteinskog fragmenta većeg proteina, koji se zove amiloidni prekursor proteina (APP, sekvencija aminokiselina je data u SEQ ID NO: 2), izmešanog sa delovima neurona i sa ne-nervnim ćelijama, kao što su mikroglie i astrociti. Nije poznato da li sami amiloidni plakovi predstavljaju glavni uzrok AD ili su oni proizvod procesa AD. Sigurno je da promene u APP proteinu mogu da prouzrokuju AD, kao što je to pokazano u naslednom obliku AD, izazvanom mutacijama u genu APP, a stvaranje Ap plaka izgleda da je blisko povezano sa napredovanjem bolesti kod humanih bića (Lippa C.F. et al., 1998).
APP
APP je jedan od mnogih proteina koji su povezani sa ćelijskim membranama. Nakon nastanka, APP biva utisnut u membranu nervnih ćelija, delom unutar, a delom izvan ćelije. Nedavna ispitivanja, korišćenjem transgenskih miševa, pokazuju da APP igra značajnu ulogu u rastu i preživljavanju neurona. Na primer, neki oblici i količine APP mogu da zaštite neurone i od kratkoročnog i dugoročnog oštećenja, i mogu da učine da su oštećeni neuroni u stanju da se bolje oporave i da pomognu delovima neurona da rastu posle povrede mozga. Dok je APP utisnut u ćelijsku membranu, proteaze deluju na određena mesta u APP, cepajući ga na fragmente proteina. Jedna proteaza pomaže cepanje APP uz stvaranje Ap oblika, a druga proteaza čepa APP u sredini amiloidnog frgamneta, tako da ne može da se formira Ap. Formirani Ap je dve različite dužine, kraći od 40 (ili 41) aminokiselina Ap je relativno rastvoran i sporo daje agregate, a nešto duži, od 42 aminokiseline, "lepljivi" Ap, brzo formira nerastvome skupine. Dok se Ap formira, još nije tačno poznato kako se kreće kroz ili oko nervnih ćelija. U finalnim fazama ovog procesa, "lepljivi" Ap se gomilaju u duga vlakna izvan ćelije, zajedno sa fragmentima mrtvih ili umirućih neurona i mikroglia i astrocita, formirajući plakove u moždanom tkivu, koji su karakteristični za AD.
Postoje izvesni dokazi da ukoliko je verovatnije da se dešavaju mutacije u APP da će Ap biti izbačen iz prekursora APP, prouzrokujući tako stvaranje ili više ukupnog Ap, ili relativno više "lepljivog" oblika. Takođe, izgleda da mutacije presenilinskih gena mogu da doprinesu degeneraciji neurona najmanje na dva načina: modifikovanjem proizvodnje Ap ili direktnijim startovanjem smrti ćelija. Drugi istraživači predlažu da mutirani presenilini 1 i 2 mogu biti uključeni u ubrzavanje koraka apoptoze.
Može se očekivati da kako bolest napreduje da će se formirati sve više i više plaka, ispunjavajući sve više i više mozak. Ispitivanja pokazuju da je moguće da se istovremeno sa Ap javlja agregacija i de-agregacija, u nekoj vrsti dinamičke ravnoteže. Ovo rađa nadu da je moguće raskinuti plakove, čak i nakon što su formirani. (National Institute on Aging Progress Report on Alzhemimer's Disease, 1999).
Smatra se da je Ap toksičan prema neuronima. U ispitivanjima kulture tkiva, istraživači su opazili porast smrti hipokampalnih neuronskih ćelija koje su proizvedene pojačanim izlučivanjem mutiranih oblika humanog APP, u poređenju sa neuronima kod kojih se dešava pojačano izlučivanje normalnih humanih APP (Luoetal., 1999).
Dalje, pojačano izlučivanje ili izlučivanje modifikovanih oblika Ap proteina na modelima životinja, pokazalo se da izaziva simptome nalik Alzheimer-ovim (Hsiao K. et al., 1998).
Uzimajući da povećanje generisanja Ap, njegova agregacija u plakove i neurotoksičnost koja iz toga proizilazi, mogu da dovedu do AD, postoji terapeutsko interesovanje za ispitivanje uslova pod kojima agregacija Ap u plakove može da se uspori ili čak blokira.
Presenilini
Mutacije u presenilinu-1 (S-180) ubrajaju se u skoro 50% svih slučajeva familijarne AD (FAD) sa ranim javljanjem. Identiifikovano je oko 30 mutacija koje dovode do AD. Pojava AD varira sa ovim mutacijama. Mutacije u presenilinu-2 čine mnogo manji deo slučajeva FAD, ali su ipak značajan faktor. Nije poznato da li presenilini učestvuju u sporadičnoj ne-familijamoj AD. Funkcija presenilina nije poznata, ali izgleda da oni učestvuju u procesiranju APP koji daje Ap-42 (duži, lepljivi oblik peptida, SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714), zato što pacijenti od AD sa mutacijama presenilina imaju povišen sadržaj ovih peptida. Nije jasno da li presenilini imaju takođe ulogu u izaziivanju generisanja NFT. Neki predlažu da presenilini mogu takođe da imaju direktniju ulogu u degeneraciji neurona ili smrti neurona. Presenilin-1 je smešten na 14. hromozomu, dok je presenilin-2 vezan na 1. hromozomu. Ukoliko neka osoba poseduje mutiranu verziju bar jednog od ovih gena, skoro je izvesno da će se kod njega ili nje javiti rani početak AD.
Postoji izvesna neizvesnost da li je presenilin-1 identičan hipotetičkoj gama-sekretazi koja je uključena u procesiranje APP (Naruše et al., 1998).
Apolipoprotein E
Apolipoprotein E je obično povezan sa holesterolom, ali se takođe nalazi u plakovima i skupinama mozgova sa AD. lako izgleda da alele 1-3 nisu uključene u AD, postoji značajna korelacija između prisustva alele APOE-e4 i razvoja kasne AD (Strittmatter et al., 1993). Međutim, to je faktor rizika, a ne direktni uzrok, kao što je u slučaju presenilina i mutacija APP, i on nije ograničen samo na familijarnu AD.
Načini na koje ApoE e4 protein povećava verovatnoću razvoja AD nisu sa sigurnošću poznati, ali jedna moguća teorija je da olakšava izgradnju Ap, a ova doprinosi smanjenju starosne dobi za javljanje AD, ili prisustvo ili odsutvo određenih APOE alelea može da utiče na način na koji neuroni reaguju na povredu (Buttini et al., 1999).
Pokazano je takođe da je Apo A1 amiloigen. Nedirnuti apo A1 može sam da formira fibrile nalik amiloiduin vitno,koji su pozitivni na bojenje sa kongocrvenim (Wisniewski T., Golabek A.A., Kida E., Wisniewski K.E., Frangione B:,Am. J. Pathol.1995,147(21 238-244).
Izgleda da postoje neki kontradiktorni rezultati koji ukazuju da postoji pozitivan efekat alele APOE-e4 u smanjivanju simptoma mentalnog gubitka, u poređenju sa drugim aleleama (Stem, Brandt,Annals ofNeurology1997, 41).
Neurofibrilami čvorići
Ovaj drugi znak raspoznavanja AD se sastoji od abnormalnih kolekcija uvrnutih vlakana koja se nalaze unutar nervnih ćelija. Glavna komponenta čvorića je jedan oblik proteina nazvan tau (t). U centralnom nervnom sistemu tau proteini su poznati po njihovoj sposobnosti da vezuju i pomažu stabilizaciju mikrotubula, koje su jedan od konstituenata unutrašnje ćelijske potporne strukture, ili skeleta. Međutim, kod AD tau je hemijski izmenjen, a ovaj izmenjeni tau ne može više da stabilizuje mikrotubule, izazivajući njihovo podleganje dezintegraciji. Ovaj kolaps transportnog sistema može prvo da dovede do pogrešnih komunikacija između nervnih ćelija, a može kasnije da dovede do smrti neurona.
Kod AD, hemijski promenjen tau se uvija u uparena spiralna vlakna dva vlakna tau koja su obavijena jedno oko drugog. Ova vlakna su glavna supstanca koja se nalazi u neurofibrilamim čvorićima. U jednom skorašnjem ispitivanju, istraživači su pronašli neurofibrilame promene na manje od 6% neurona u zdravim mozgovima u određenom delu hipokampusa, na više od 43% ovih neurona kod ljudi koji su umrli usled blage AD, a na 71% ovih neurona kod ljudi koji su umrli od teškog oblika AD. Kada je ispitivan gubitak neurona, nađena je slična progresija. Dokaz ove vrste podupire ideju da stvaranje čvorića i gubitak neurona napreduju zajedno tokom AD (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Taupatije i čvorići
Nekoliko neurodegenerativnih bolesti, različitih od AD, karakteriše agregacija tau u nerastvorna vlakna u neuronima i glii, što dovodi do disfunkcije i smrti. Nedavno, nekoliko grupa istraživača, koji su izučavali familije sa raznim naslednim demencijama, različitimod AD, prvo su našli mutacije u tau genu na 17. horomozomu (Clark et al., 1998; Hutton et al., 1998; Poorkaj et al., 1998; Spillantini et al., 1998). U takvim familijama, mutacije na tau genu izazivaju umiranje neuronskih ćelija i demenciju. Ovi poremećaji, kojima su neke karakteristike slične sa AD, ali se razlikuju u nekoliko značajnih pogleda, se zajednički nazivaju "fronto temporalna demencija i parkinsonizam povezani sa 17. hromozomom" (FTDP-17). To su bolesti kao što je Parkinson-ova bolest, neki oblici amiotrofne lateralne skleroze (ALS), kortikobazalna degeneracija, progresivna supranukleama paraliza i Pick-ova bolest, a svima je karakteristična abnormalna agregacija tau proteina.
Druge neurološke bolesti slične AD
Postoje značajne paralele između AD i drugih neuroloških bolesti, uključujući bolesti priona (kao što je kuru, Creutzfeld-Jacob-ova bolest i goveđi encefalitis sunđerastog oblika), Parkinson-ova bolest, Huntington-ova bolest i fronto-temporalna demencija. Sve one uključuju naslage abnormalnih proteina u mozgu. AD i bolesti priona izazivaju demenciju i smrt, a obe su povezane sa stvaranjem nerastvomih amiloidnih fibrila, ali iz membranskih proteina koji se razlikuju jedan od drugog.
Nučnici koji proučavaju Parkinson-ovu bolest, drugi najčešći neurodegenrativni poremećaj posle AD, otkrili su prvi gen povezan sa bolešću. Taj gen kodira protein, nazvan sinuklein, koji je, interesantno, nađen takođe u amiloidnim plakovima mozgova pacijenata sa AD (Lavedan C,Genome Res.1998, 8(9), 871-80). Istraživači su otkrili takođe da genetski defekti kod Huntington-ove bolesti, sledećeg progresivnog neurodegenrativnog poremećaja koji izaziva demenciju, prouzrokuju da Huntington-ov protein formira nerastvome fibrile, vrlo slične fibrilama Ap kod AD i proteinskim fibrilama prionske bolesti (Scherzinger E. et al,PNAS U. S. A.1999, 96(8), 4604-9).
Naučnici su takođe otkrili nove gene koji su, kada mutiraju, odgovorni za familijarnu Britansku demenciju (FBD), retku naslednu bolest koja izaziva teške poremećaje pokreta i progresivnu demenciju, sličnu onoj koja se opaža kod AD. U biohemijskim analizama amiloidnih fibrila nađenih u FBD plakovima, nađen je jedinstveni peptid, nazvan Abri (Vidal et al., 1999). Mutacija određene tačke duž ovog gena dovodi do stvaranja dužeg od normalnog proteina Bri. Abri peptid, koji je otsečen sa mutiranog kraja Bri proteina, taloži se kao amiloidni fibrili. Smatra se da ovi plakovi dovode do neuronske disfunkcije i demencije koja karakteriše
FBD.
Imunizacija sa Ap
Imuni sistem normalno učestvuje u čišćenju stranih proteina i proteinskih čestica u organizmu, ali se naslage povezane sa gore-pomenutim bolestima sastoje uglavnom od vlastitih-proteina, čineći tako ulogu imuno sistema u kontofi tih bolesti manje očiglednom: Dalje, ove naslage su locirane u odeljku (CNS) koji je normalno odvojen od imuno sistema, a ove obe činjenice nagoveštavaju da će bilo koja vakcina ili imunoterapeutski pristup biti neuspešan.
Ipak, naučnici su nedavno pokušali sa imunizacijom miševa sa vakcinom sačinjenom od heterolognog humanog Ap i supstance poznate da ekscituje imuno sistem (Schenk et al., 1999, i WO 99/27944). Ova vakcina je testirana na modelu AD na parcijalnim transgenskim miševima, sa humanim mutiranim genom za APP umetnutim u DNA miša. Ovi miševi, kada su postali stariji, proizvodili su modifikovani APP protein i razvili amiloidne plakove. Ovaj model miševa je upotrebljen za proveru da li vakcinacija protiv modifikovanog transgenskog humanog APP ima efekta na stvaranje plaka. U prvom eksperimentu, jednoj grupi transgenskih miševa su mesečno davane injekcije vakcine, počevši od starosti od 6 nedelja, a završavajući sa 11 meseci. Druga grupa transgenskih miševa nije primala injekcije i služila je kao kontrolna grupa. U starosti od 13 meseci, miševi u kontrolnoj grupi su imali plakove koji su pokrivali 2 do 6% njihovih mozgova. Nasuprot, imunizovani miševi virtuelno nisu imali plakove.
U drugom eksperimentu, istraživači su počeli sa injekcijama u 11. mesecu, kada se već razvio izvesni plak. Tokom 7-mo mesečnog perioda, kontrolni transgenski miševi su imali 17-struko povećanje količine plaka u njihovim mozgovima, dok su oni koji su primali vakcinu imali 99% smanjenje, u poređenju sa 18 meseci starim kontrolnim transgenskim miševima. Kod nekih miševa, neke od prethodno postojećih naslaga plaka, izgleda da su uklonjene ovim tretmanom. Nađeno je takođe, da su se druga oštećenja povezana sa plakom, kao što je inflamacija i procesi abnormalnih nervnih ćelija, smanjili kao rezultat imunizacije.
Dakle, ovo gore je preliminarno ispitivanje na miševima, a naučnici treba da pronađu, na primer, da li vakcinisani miševi ostaju zdravi u ostalom pogledu i da li je memorija onih koji su vakcinisani normalna. Poreci toga, zato što model miša nije potpuno reprezentativan za AD (ove životnje ne stvaraju neurofibrilarne čvoriće, niti umiru mnogi od njihovih neurona), potrebna su dodatna ispitivanja da utvrde da li humana bića imaju sličnu ili različitu reakciju od miševa. Sledeći aspekt za razmatranje je da li ovaj postupak možda može da "izleći" taloženje amiloida, ali da ne uspe da zaustavi razvoj demencije.
Isto tako, glavni izazov predstavljaju tehnički detalji. Na primer, neverovatno je da je čak moguće, koristeći ovu tehnologiju, kreirati vakcinu koja omogućava humanim bićima da stvore antitela protiv njihovih vlastitih proteina. Tako, brojni detalji u pogledu sigurnosti i efikasnosti treba da se reše pre nego što mogu da se razmatraju bilo kakvi testovi na humanim bićima.
Tako, rad Schenk-a et al. pokazuje da ukolko je bilo moguće da se generiše jak imuni odgovor prema vlastitim proteinima u proteinskim naslagama centralnog nervnog sistema, kao što su plakovi formirani u AD, moguće je sprečiti i formiranje ovih naslaga, a takođe i očistiti već stvorene plakove.
Predmet ovog pronalaska je davanje novih terapija protiv stanja koja karakteriše taloženje amiloida, kao što je AD. Sledeći predmet je razvoj autovakcine protiv amiloida, sa ciljem dobijanja novog tretmana AD i drugih patoloških poremećaja u kojima učestvuje taloženje amiloida,
Ovde je opisana upotreba tehnologije autovakcinacije za generisanje jakog imuno odgovora protiv inače neimunogenih vlastitih proteina uključenih u patologiju koja je povazana sa amiloidnim naslagama. Time se generiše jak imuno odgovor protiv ili amiloida, ili protiv jedne ili više komponenti uključenih u naslage, ili protiv jednog ili više proteina odgovornih za stvaranje amiloida. Opisano je takođe i dobijanje tih vakcina za prevenciju, moguće lečenje ili ublažavanje simptoma onih bolesti koje su povezane sa amiloidnim naslagama. Dakle, u najširem i najopštijem obimu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak zain vivoderegulaciju amiloida kod životinja, uključujući humano biće, postupak koji se sastoji u efikasnoj prezentaciji životinjskom imuno sistemu imunološki efikasne količine: - najmanje jednog amiloidogenog polipeptida ili njegove subsekvencije, formulisanog tako da imunizacija životinje sa amiloidogenim polipeptidom ili njegovom subsekvencijom izaziva proizvodnju antitela protiv amiloidogenog polipeptida, i/ili - najmanje jednog amiloidnog analoga, pri čemu se uvodi modifikacija amiloidogenog polipeptida koja za rezultat daje imunizaciju životinje sa analogom, koja izaziva stvaranje antitela protiv amiloidogenog polipeptida.
Dakle, ovim pronalaskom je obuhvaćena upotreba: 1) antigena i njihovih fragmenata koji se nalaze u prirodi, formulisanih tako da startuju imuno odgovor, kao i 2) analoga tih antigena koji se nalaze u prirodi, a ti analozi su u stanju da izazovu reaktivno ukrštene imuno odgovore.
Ovaj pronalazak se odnosi takođe na analoge amiloidogenih polipeptida, kao i na fragmente nukleinskih kiselina koji kodiraju njihov subniz. Takođe, deo ovog pronalaska su imunogeni preparati koji sadrže analoge fragmenata nukleinskih kiselina.
Ovaj prostupak se odnosi takođe na postupak za identifikaciju imunološki efikasnih analoga amiloidogenih polipeptida, kao i na postupak za dobijanje preparata koji sadrže te analoge.
Opis slike
Slika 1: Shematski opis varijanata Autovac-a, koji se izvode iz amiloidnog prekursorskog proteina sa namerom generisanja odgovora antitetla protiv Ap proteina Ap-43 (ili C-100). Na vrhu slike prikazan je shematski APP, a preostali shematski konstrukti pokazuju da su modeli epitopa P2 i P30 supstituisani ili umetnuti u različite krateže APP. Na slici crna šara pokazuje sekvenciju signala APP, dvosmema ukrštena šara je vanćelijski deo APP, tamne vertikalne crte su transmembranski domen APP, svetle vertikalne crte su unutarćelijski domen APP, grube kose crte pokazuju epitop P30, fine kose crte pokazuju epitop P2. Boks uokviren punom linijom pokazuje Ap-42/43, a boks uokviren zajedno punom linijom i isprekidanom linijom pokazuje C-100. "Abeta" označava Ap.
Definicije
U nastavku koristi se niz naziva u ovoj prijavi i u zahtevima, koji će biti definisani i detaljno objašnjeni da bi se razjasnili dometi i granice ovog pronalaska.
Nazivi "amiloid" i "amiloidni protein" koji se ovde naizmenično koriste označavaju klasu proteinskih nerazgranatih fibrila neodređene dužine. Amiloidni fibrili pokazuju karakteristično obojenje sa kongocrvenimi, dele poprečnu-p strukturu kojom je polipetidni lanac organizovan u p-slojeve. Amiloid se obično izvodi iz amiloidogenih proteina koji imaju vrlo različite prekursorske strukture, ali koji mogu da podlegnu strukturnoj konverziji u pogrešno naborani oblik koji je gradivni blok spirale protovlakna p-sloja. Normalno, prečnik amiloidnih fibrila varira između oko 7 i oko 12 nm.
Naziv "amiloidogeni protein" je namenjen da označi polipeptid koji učestvuje u formiranju amiloidnih naslaga, bilo tako što je deo naslaga kao takvih, ili što je deo biosintetske sheme koja vodi stvaranju naslaga. Dakle, primeri amiloidogenih proteina su APP i Ap, ali takođe i proteini koji učestvuju u metabolizmu istih, mogu biti amiloidogeni proteini. Ovde se detaljno diskutuju brojni amiloidogeni polipeptidi.
Ovde je namera da "amiloidni polipeptid" označava polipeptid koji sadrži sekvenciju aminokiselina gore diskutovanih amiloidogenih proteina, koja se izvodi iz humanih ili drugih sisara (ili njihovih krateža, koji dele bitnu količinu epitopa B-ćelije sa nedirnutim amiloidogenim proteinom) - amiloidogeni polipeptod, prema tome, može da sadrži npr. bitne delove prekursora amiloidogenog polipeptida (u slučaju Ap, jedanod mogućih amiloidnih polipeptida bi mogao biti izveden iz APP). Unutar granica ovog naziva se nalaze takođe neglikozilovani oblici amiloidogenih polipeptida, koji se dobijaju u prokariotskom sistemu, kao i oblici koji imaju promenljive sheme glikozilovanja zahvaljujući upotrebi npr. kvasaca ili drugih ne-sisarskih eukaritoskh sistema ekspresije. Međutim, treba pomenuti da kada se koristi naziv "amiloidogeni polipeptid", namera je da je polipeptid koji je u pitanju normalno ne-imunogen, kada se prezentira životinji koja treba da se tretira. Drugim rečima, amiloidogeni polipeptid je vlastiti-protein, ili je neki analog takvog vlastitog proteina, koji kod životinje koja je u pitanju normalno neće izazvati imuno odgovor protiv amiloidogenog.
"Analog amiloidogenog proteina" je amiloidogeni polipeptid koji je podvrgnut promenama njegove primame strukture. Takva pramena može da bude, npr. u obliku spajanja amiloidnog polipeptida sa podesnim fuzionim partnerom (tj. pramena primame strukture izričito obihvata adicije sa C- i/ili N-kraja ostataka aminokiselina) i/ili ona može biti u obliku umetanja i/ili izbacivanja i/ili supstitucije skevencije aminokiselina amiloidogenog polipetida. Takođe, ovim terminom su obuhvaćeni derivatizovani amiloidogeni molekuli, videti diskusiju niže o modifikacijama amiloidogenih polipeptida. U slučaju da je amiloidogeni polipeptid neki amiloid ili neki njegov prekursor, analog se može konstruisati tako da je manje sposoban ili čak nesposoban da izazove antitela protiv normalnih prekursora proteina amiloida, izbegavajući time neželjene interferencije sa (fiziološki normalnim) oblikom polipeptida bez agregacije, koji je prekursor amiloidnog proteina.
Treba takođe dodati da se može zamisliti da kod humanog bića upotreba vakcine stranog-analoga (npr. pseći ili svinjski analozi) humanog amiloidogenog polipetida, proizvodi željeni imunitet protiv amiloidogenog polipeptida. Ovakva upotreba stranih-analoga za imunizaciju je takođe razmatrani deo ovog pronalaska.
Naziv "polipeptid" u ovom kontekstu namera je da označi kratke peptide od 2 do 10 ostataka aminokiselina, oligopeptide od 11 do 100 ostataka aminokiselina i polipeptide sa više od 100 ostataka aminokiselina. Pored toga, namera je da ovaj naziv obuhvati takođe proteine, tj. funkcionalne bimolekule koji sadrže najmanje jedan polipeptid; kada sadrže najmanje dva polipeptida , oni mogu da formiraju komplekse, da budu kovalentno vezani, ili da budu ne-kovalentno vezani. Polipeptid(i) u proteinu može biti glikozilovan i/ili lipidovan i/ili da sadrži veštačke grupe.
Nazivi "T-limfocit" i "T-ćelija" se naizmenično koriste za limfocite timusnog porekla, koji su odgovorni za razne imuno odgovore posredovane ćelijama, kao i za pomoćnu aktivnost u humoralnom imuno odgovoru. Slično, nazivi "B-limfocit" i "B-ćelija" se naizmenično koriste za limfocite koji proizvode antitela.
Naziv "subsekvencija" označava konsekutivnu deonicu od najmanje 3 aminokiseline ili, ukoliko je relevatno, od najmanje 3 nukeotida, koji se izvode direktno iz sekvencije aminokiselina ili sekvencije nukleinskih kiselina amiloida koji se nalazi u prirodi.
Naziv "životinja" je u ovom kontekstu obično namenjen označavanju životinjskih vrsta (poželjno sisarskih), kao što suHomo sapiens, Canis domesticusitd., a ne samo pojedinačnoj životinji. Međutim, ovaj naziv označava takođe populaciju takvih životinskih vrsta, zato što je važno da svi pojedinci imunizovani u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska, sadrže suštinski isti amiloidogeni polipetid, koji omogućuje imunizaciju životinja sa istim imunogenom, odnosno imunogenima. Ako, na primer, postoji genetska varijanta amiloidogenog polipeptida u različitim humanim populacijama, moglo bi biti potrebno da se koriste različiti imunogeni u ovim različitim populacijama da bi se na optimalan način raskinula autotolerancija prema amiloidogenom polipeptidu u svakoj populaciji. Verziranoj osobi je jasno da je životinja u ovom kontekstu živo biće koje ima imuno sistem. Poželjno je da je životinja kičmenjak, kao što je sisar.
Pod nazivom" in vivoderegulacija amiloida" ovde se označava smanjenje ukupne količine nataloženog amiloida relevantnog tipa u živom organizmu. Deregulacija se može postići posredstvom nekoliko mehanizama. Od ovih najjednostavnija je prosta interferencija amiloida sa antitelom koje se vezuje tako da spreči pogrešnu agregaciju. Međutim, unutar obima ovog pronalaska je takođe vezivanje antitela koje dovodi do uklanjanja amiloida pomoću ćelija čistača (kao što su makrofage i druge fagocitske ćelije) i interferiranje antitela sa drugim amiloidogenim polipeptidima koje vodi stvaranju amiloida.
Izrazom "ostvarujući prezentaciju ... u imuno sistemu" namera je da se označi da je imuno sistem životinje podvrgnut imunogenom izazovu na kontrolisan način. Kao što sledi iz opisa u nastavku, takav izazov imuno sistema se može ostvariti na brojne načine od kojih su najznačajnije vakcinacija sa polipeptidom sadržanom u "farmacinu" (tj, vakcini koja se ordinira radi tretiranja ilii ublažavanja bolesti koja je u toku) ili vakcinacija sa nukleinskom kiselinom kao "farmacinom". Važan rezultat koji treba da se postigne je da se imuno kompetentne ćelije u životinji suprotstave sa antigenom, na imunološki efikasan način, pri čemu je precizan način postizanja tog rezultata manje značajan za inventivnu ideju koja leži u osnovi ovog pronalaska.
Naziv "imunogeno efikasna količina" ima uobičajeno značenje u stanju tehnike, tj. količina imunogena koja je u stanju da izazove imuno odgovor koji značajno angažuje patogene agense, deleći imunološka svojstva sa imunogenom.
Kada se koristi izraz da je amiloidogeni polipeptid "modifikovan", on ovde označava hemijsku modifikaciju polipeptida, koji čini kičmu amiloidogenog polipeptida. Takva modifikacija može na primer biti derivatizacija (npr. alkilovanje) izvesnih ostataka aminokiselina u sekvenciji amiloidogenog polipeptida, ali kao što će biti jasno iz opisa u nastavku, poželjne modifikacije sadrže promene primame strukture sekvencije aminokiselina.
Kada se razmatra "autotolerancija prema amiloidogenom polipeptidu" podrazumeva se da, pošto je amiloidogeni polipeptid vlastiti protein u populaciji koja treba da se vakciniše, normalni pojedinci u ovoj populaciji ne povećavaju imuno odgovor protiv amiloidogenog polipeptida; on se ne može isključiti, mada ti slučajni pojedinci u populaciji životinja mogu biti u stanju da proizvedu antitela protiv vlastitog amiloidogenog polipeptida, npr. kao deo autoimunog poremećaja. U bilo kom odnosu, životinja će biti normalno autotolerantna samo prema njenom vlastitom amiloidogenom polipeptidu, ali se ne može isključiti da bi analozi, koji se izvode iz drugih životinjskih vrsta, ili iz populacije koja ima različit fenotip, mogli takođe biti tolerisani od strane pomenute životinje.
"Epitop strane T-ćelije" (ili: "epitop stranog T-limfocita") je peptid koji je u stanju da se veže za MHC molekul i koji stimuliše T-ćelije u životinjskoj vrsti. Poželjni epitopi strane T-ćelije u ovom pronalsku su "promiskuitetni" epitopi, tj. epitopi koji se vezuju za značajnu frakciju određene klase MHC molekula u životinjskoj vrsti ili populaciji. Poznat je veoma ograničen broj takvih promiskuitetnih epitopa T-ćelije, i oni će se diskutovati detaljno u nastavku. Promiskuitetni epitopi T-ćelije se označavaju takođe i kao "univerzalni" epitopi T-ćelije. Treba primetiti, da u cilju da bi imunogeni koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom bili efikasni u što je moguće većoj frakciji životinjske populacije, može biti neophodno da se: 1) umetne nekoliko stranih epitopa T-ćelije u isti analog, ili 2) da se pripremi nekoliko analoga, gde svaki analog ima umetnut različit promiskuitetni epitop. Treba primetiti takođe da koncept epitopa strane T-ćelije obuhvata takođe kriptovane epitope T-ćelije, tj. epitope koji se izvode iz vlastitog proteina i koji ispoljavaju imunogeno ponašanje samo ako postoje u izolovanom obliku, a bez da su deo pomenutog vlastitog proteina.
"Strani epitop T helpera limfocita" (strani THepitop) je epitop strane T ćelije, koji vezuje klasu II MHC molekula, a može se prezentirati na površini ćelije koja prezentuje antigen (APC) vezan za klasu II MHC molekula.
"Funkcionalni deo" (bio)molekula u ovom kontekstu namera je da označi deo molekula koji je odgovoran za najmanje jedan od biohemijskih ili fizioloških efekata koje izaziva molekul. Dobro je poznato da mnogi enzimi i drugi efektorski molekuli imaju aktivno mesto koje je odgovorno za efekte koje izaziva taj molekul. Drugi delovi molekula mogu da služe za stabilizovanje ili u svrhu povećanja rastvorljivosti i mogu biti izostavljeni, ukoliko te svrhe nisu relevantne u kontekstu određene realizacije ovog pronalaska. Na primer, moguće je da se koriste neki citokini kao modifikacioni ostatak u amiloidogenom polipeptidu (videti detaljno razmatranje niže) i u tom slučaju pitanje stabilnosti može biti irelevantno, zato što neophodnu stabilnost može da pruži kuplovanje sa amiloidogenim peptidom.
Naziv "adjuvant" ima uobičajeno značenje u stanju tehnike tehnologije vakcina, tj. to je supstanca ili sastav materijala koji: 1) sam nije su stanju da pojača specifični imuno odgovor protiv imunogena u vakcini, ali koji je 2) u stanju da pojača imuno odgovor protiv imunogena. Ili, drugim rečima, vakcinacija sa samim adjuvantom ne daje imuno odgovor protiv imunogena, vakcinacija sa imunogenom može ili ne mora da dovede do imuno odgovora protiv imunogena, ali kombinovana vakcinacija sa imunogenom i adjuvantom izaziva imuno odgovor protiv imunogena koji je jači nego što ga izaziva sam imunogen.
"Targetiranje" molekula u ovom kontekstu namera je da označi situaciju u kojoj će se molekul, nakon unošenja u životinju, pojaviti prvenstveno u nekom tkivu (ili tkivima) ili će biti prvenstveno povezan sa nekim ćelijama ili tipivima ćelija. Ovaj efekat se može ostvariti na brojne načine, uključujući formulaciju molekula u preparat koji olašava targetiranje, ili unošenjem u molekul gupa koje olakšavaju targetiranje. Ova pitanja će se detaljno razmotriti niže.
"Stimulacija imuno sistema" označava da supstanca ili sastav materijala pokazuje obično ne-specifičan imunostimulatomi efekat. Brojni andjuvanti ili navodni adjuvanti (kao što su neki citokini) imaju sposobnost da stimulišu imuno
sistem. Rezultat upotrebe imunostimulatornog agensa je povećana "budnost" imuno sistema, što znači da istovremena ili naknadna imunizacija sa imunogenom indukuje značajno efikasniji imuno odgovor, u poređenju sa izolovanom upotrebom imunogena.
Poželjne realizacije deregulacije amiloida
Poželjno je da je amiloidogeni polipeptid, koji se koristi kao imunogen u postupku iz ovog pronalska, modifikovani molekul u kome je prisutna najmanje jedna izmena u sekvenciji aminokiselina amiloidogenog polipeptida, zato što su na taj način šanse dobijanja svih značajnih raskidanja autotolerancije prema amiloidogenom polipeptidu uveliko olakšane, to je npr. očigledno iz rezultata prikazanih u Primeru 2 u nastavku, gde se poredi imunizacija sa divljim tipom Ap sa imunizacijom varijante molekula Ap. Treba napomenuti da uporeba modifikovanog molekula ne isključuje mogućnost upotrebe tako modifikovanog amiloidogenog polipeptida u formulaciji koja dodatno olakšava raskidanje autotolerancije protiv amiloidogenog polipeptida, npr. formulacije koje sadrže adjuvante.
Pokazano je (Dalum I. et al.,J. Immunol.1996, 157, 4796-4804) da su kod normalnih pojedinaca fiziološki prisutni potencijalno samo-reaktivni vlastiti proteini koji prepoznaju B-limfocite. Međutim, da bi ovi B-imfociti bili izazvani da stvarno proizvode antitela reaktivna sa relevantnim vlastitim proteinima, neophodna je asistencija T-helper limfocita (TH-ćelije ili TH-limfociti) koji proizvode citokin. Normalno, ova pomoć se ne pruža, zato što T-limfociti obično ne prepoznaju epitope T-ćelija izvedene iz vlastitih proteina, kada ih prezentiraju ćelije koje prezentiraju antigen (APC). Međutim, obezbeđujući element "stranca" vlastitom proteinu (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T-ćelije koje prepoznaju strani element se aktiviraju nakon prepoznavanja stranog epitopa na APC (kao što je, na početku, mononukleama ćelija). Poliklonalni B-limfociti (koji su takođe APC-i) koji su u stanju da prepoznaju vlastite epitope na modifikovanom vlastitom proteinu, takođe usvajaju antigen i zatim prezentiraju njegov strani epitop(e) T-ćeiije, a aktivirani T-limfociti naknadno obezbeđuju pomoć citokina ovim samo-reaktivnim poliklonalnim B-limfočitima. Pošto su antitela, koja su proizvedena sa ovim poliklonalnim B-limf očitima, reaktivna sa različitim epitopima na modifikovanom polipeptidu, uključujući i one koji su prisutni u urođenom polipeptidu, indukuje se antitelo koje je ukršteno-reaktivno sa ne-modifikovanim vlastitim proteinom. U zaključku, T-limfociti mogu da se dovedu do dejstva ukoliko populacija poliklonalnih B-limfocita prepozna potpuno strani antigen, dok je u stvari samo insertovani epitop(i) stran za domaćina. Na taj način, antitela su u stanju da izazovu ukršteno reagovanje sa ne-modifikovanim vlastitim antigenima.
U stanju tehnike je poznato nekoliko načina modifikovanja peptidnog vlastitog gena sa ciljem ostvarivanja raskidanja autotolerancije. Dakle, u skladu sa ovim pronalaskom, ova modifikacija može da obuhvati:
- uvođenje najmanje jednog stranog epitopa T-ćelije, i/ili
- uvođenje najmanje jednog prvog ostatka koji ostvaruje targetiranje modifikovanog molekula na ćeliju koja prezentira antigen (APC), i/ili - uvođenje najmanje jednog drugog ostatka, koji stimuliše imuno sistem, i/ili - uvođenje najmanje jednog trećeg ostatka koji optimizuje prezentaciju modifikovanog amiloidogenog polipeptida u imuno sistem.
Međutim, sve ove modifikacije treba da se obave zadržavajući znatnu frakciju originalnih epitopa B-limfocita u amiloidogenom epitopu, zato što se time pojačava prepoznavanje B-limfocita od strane urođenog molekula.
U jednoj poželjnoj realizaciji, sporedne grupe u obliku stranih epitopa T-ćelije, (ili gore pomenutih prvog, drugog i trećeg ostatka), unose se kovalentno ili ne-kovalentno. Ovo znači da su istezanja ostataka aminokiseline, izvedena iz amiloidogenog polipeptida, derivatizovana bez menjanja primame sekvencije aminokiselina, ili bar bez uvođenja promena u peptidne veze između pojedinačnih aminokiselina u lancu.
Alternativna i poželjna realizacija koristi supstituciju aminokiseline i/ili uklanjanje i/ili umetanje i/ili adiciju (koje se mogu ostvariti rekombinantnim sredstvima ili pomoću sinteze peptida; modifikacije koje sadrže duža istezanja aminokiselina dovode do spajanja polipeptida). Jedna posebno poželjna verzija ove realizacije je tehnika opisana u WO 95/05849, koja opisuje postupak deregulacije vlastitih proteina imunizacijom sa analozima vlastitih proteina, gde je jedan broj sekvencija aminokiselina supstituisan sa odgovarajućim brojem sekvencija aminokiselina, od kojih svaka sadrži strani epitop imunodominantne T-ćelije, dok se istovremeno održava ukupna tercijarna strktura vlastitog proteina u ovom analogu. Međutim, za svrhe ovog pronalaska dovoljno je ako modifikacija (koja može biti umetanje, adicija, izbacivanje ili supstitucija) dovodi do stranog epitopa T-ćelije, a istovremeno čuva znatan broj epitopa B-ćelije u amiloidogenom polipeptidu. Međutim, da bi se dobio maksimum efikasnosti izazvanog imuno odgovora, poželjno je da se u modifikovanom molekulu održi ukupna tercijarna struktura amiloidogenog polipeptida.
Sledeća formula opisuje molekulske konstrukte uopšteno pokrivene ovim pronalaskom;
(MODi)8i(amiloidei)ni(MOD2)s2(amiloide2)n2 (MODx)«(amiloidex)nx(I)
gde amiloidei-amiloidocje x epitopa B-ćelije koji sadrže subsekvencije amiloidogenog polipeptida koje su nezavisno identuične ili nisu identične, a koje sadrže ili ne sadrže strane bočne grupe, x je ceo broj >3, n1-nx su x celih brojeva >0 (bar jedan je >1), MODi-MODx su x modifikacija uvedenih između očuvanih epitopa B-ćelije, a si-sxsu x celih brojeva >0 (najmanje jedan je >1, ukoliko bočne grupe nisu uvedene u sekvencije amiloidex). Dakle, za data opšta funkcionalna ograničenja u pogledu imunogenosti ovih konstrukata, ovaj
pronalazak dozvoljava sve vrste permutacija originalne sekvencije amiloidnog polipeptida, i sve vrste modifikacija. Dakle, u ovaj pronalazak su uključeni modifikovani amiloidogeni polipeptidi dobijeni ispuštanjem delova sekvencije amiloidogenog polipeptida, koji na primer pokazuju štetne efketein vivoili ispuštanjem svih delova koji su normalno unutarćelijski, pa bi tako mogli dovesti do neželjeneih imunoloških reakcija.
Jedna poželjna verzija gore navedenih konstrukata su, ako su prihvatljvi, oni gde epitop B-ćelije, koji sadrži subsekvenciju amiloidnog proteina, nije vanćelijski izložen prekursoru polipeptida iz koga se izvodi amiloid. Pravljenjem takvog izbora amiloidnih epitopa, osigurava se da se ne generišu antitela koja bi bila reaktivna sa ćelijama koje stvaraju prekursor amiloida, a time imuno odgovora, koji kada se generiše postaje ograničen na imuno odgovor protiv neželjenih amiloidnih naslaga. Ukoliko je primenljiv, sličan izbor može da se načini za amiloidogene poilpeptide koji su različiti od amiloida. U takvim slučajevima će, npr. biti korisno indukovanje imuniteta protiv epitopa alimoidogenih polipetida koji su izloženi samo vanćelijskoj fazi, kada su oslobođeni bilo kakvog kuplovanja za ćeliju iz koje su proizvedeni.
Održavanje znatne frakcije epitopa B-ćelije ili čak ukupne tercijarne strukture proteina podvrgnutog modifikovanju, kao što je ovde opisano, može se postići na nekoliko načina. Jedan je jednostavno pripremanje poliklonalnog antiseruma usmerenog protiv amiloidogenog polipeptida (npr. antiserum pripemljen u zecu), pa zatim upotrebom tog antiseruma kao reagensa za testiranje (npr. u kompetitivnom ELISA) protiv modifikovanih proteina koji se proizvode. Modifikovane verzije (analozi) koje reaguju u istoj meri sa antiserumom kao i amiloidogeni polipeptid, mora se smatrati da imaju istu ukupnu tercijarnu strukturu kao i amiloidogeni polipeptid, dok analozi pokazuju ograničenu (ali još uvek značajnu i specifičnu) reaktivnost sa takvim antiserumom, smatrajua da zadržavaju značajnu frakciju prvobitnih epitopa B-ćelije.
Alternativno, može se dobiti selekcija monoklonalnih antitela reaktivnih sa određenim epitopima na amiloidogenom polipeptidu i korisiti kao test panel. Ovaj pristup ima prednost dopuštanja: 1) mapiraja epitopa amiloidogenog polipeptida, i 2) mapiranja epitopa koji se održavaju u pripremljenim analozima.
Naravno, treći pristup bi bio razdvajanje 3-dimenzionalne strukture amiloidogenog polipeptida, ili biološki aktivnog njegovog krateža (videti gore) i poređenje ovog sa rešenom trodimenzionalnom strukturom pripemljenih analoga. Trodimenzionalna struktura sa može rešiti pomoću ispitivanja difrakcije X-zraka i NMR-spektroskopije. Dalje informacije koje se odnose na tercijarnu strukturu mogu se u izvesnoj meri dobiti iz ispitivanja cirkularnog dihroizma, koja imaju prednost jer zahtevaju samo polipetid u čistom obliku (dok difrakcija X-zraka zahteva dobijanje kristalizovanog polipeptida, a NMR zahteva dobijanje izotopskih varijanti polipeptida) da bi se dobile korisne informacije o tercijarnoj strukturi datog molekula. Međutim, konačno su ipak neophodni difrakcija X-zraka i/ili NMR da bi se dobili zaključni podaci, pošto cirkulami dihroizam može da pruži samo indirektne dokaze o korektnoj 3-dimezionalnoj strukturei, preko informacija i elementima sekundarne strukture.
Jedna poželjna realizacija ovog pronalaska koristi višestruke prezentacije epitopa B-limfocita amiloidogenog polipeptida (tj. formula I, gde je najmanje jedan epitop B-ćelije prisutan u dva položaja). Ovaj efekat se može postići na razne načine, npr. jednostavno dobijanjem spojenih polipeptida koji sadrže strukturu (amiloidogeni polipeptid)m, gde je m ceo broj >2, pa se zatim unesu ovde razmatrane modifikacije u najmanje jednu amiloidnu sekvenciju. Poželjno je da uvedene modifikacije obuhvate najmanje jedna duplikat epitopa B-limfocita i/ili uvođenje haptena. Ove realizacije, uklučujući višestruko prezentiranje odabranih epitopa, naročito su poželjne u situacijama gde su samo manji delovi amiloidogenih polipetida korisni kao konstituenti u agensu vakcine.
Kaošto je pomenute gore, uvođenje stranog epitopa T-ćelije može se obaviti najmanje jednim umetanjem, adicijom, izbacivanjem ilii supstituicijom aminokiselina. Naravno, normalna situacija će biti uvođenje više od jedne izmene u sekvenciji aminokislina (npr. umetanjem ili supstitucijom kompletnog epitopa T-ćelije), značajan cilj koji treba dostići je da analog, kada se procesira pomoću ćelije koja prezentira antigen (APC), da takav strani imunodminantni epitop T-ćelije, koji je prezentiran u kontekstu klase II MCH molekula na površini APC. Dakle, ako sekvencija aminokiselina amiloidogenog polipeptida u odgovarajućim položajima sadrži brojne ostatke aminokiselina, koji se takođe mogu naći u stranom THepitopu, tada uvođenje stranog THepitopa može da se ostvari davanjem preostalih aminokiselina stranog epitopa pomoću umetanja, adicije, izbacivanja i supstituicije aminokiseline. Drugim rečima, nije potrebno da se uvodi kompletan THepitop umetanjem ili supstitucijom da bi se ispunila svrha ovog pronalaska.
Poželjno je da broj umetanja, izbacivanja, supstitucija ili adicija aminokiselina . bude najmanje 2, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 umetanja supstitucija, adicija ili izbacivanja. Poželjno je pored toga, da broj ubacivanja, supstituicja, adicija ili izbacivanja aminokiselina nije veći od 150, kao što je najviše 100, najviše 90, najviše 80 i najviše 70. Naročito je poželjno da broj susptitucija, umetanja, izbacivanja ili adicija ne prelazi 60, a naročito taj broj ne treba da je veći od 50, ili čak 40. Najpoželjnije je da taj broj nije veći od 30. U pogledu adicija aminokiselina, treba primetiti, kada je nastali konstrukt u obliku spojenog polipeptida.da je ovaj broj često je veći od 150.
Poželjne realizacije ovog pronalaska obuhvataju modifikaciju uvođenjem najmanje jednog stranog imunodominantnog epitopa T-ćelije. Podrazumeva se da pitanje imuno dominacije epitopa T-ćelije zavisi od životinjske vrste u pitanju. Kako se ovde koristi, naziv "imunodominacija" se jednostavno odnosi na epitope koji u vakcinisanom pojedincu/populaciji izazivaju značajan imuno odgovor, ali dobro je poznata činjenica da epitop T-ćelije, koji je imunodominantan kod jednog pojedinca/populacije nije neophodno dominantan i kod drugog pojedinca iste vrste, čak i ako je u stanju da se vezuje za MHC-II molekule u pomenutom pojedincu. Stoga, u svrhu ovog pronalaska, imuno dominantni epitop T-ćelije je epitop T-ćelije koji će biti efikasan u davanju pomoći T-ćeliji , kada je prisutan u antigenu. Tipično, imuno dominantni epitopi T-ćelije imaju prirođeno svojstvo da će suštinski uvek biti prezentirani vezani uz klasu II MHC molekula, nezavisno od polipeptida u kome se pojavljuju.
Sledeći značajan aspekt je pitanje restrikcije MHC epitopa T-ćelije. Obično, epitopi T-ćelije koji se nalaze u prirodi su MHC ograničeni, tj. neki peptidi koji izgrađuju epitop T-ćelije će se efikasno vezati samo za subniz klase II MHC molekula. Za uzvrat, u većini slučajeva to ima efekat da će upotreba jednog specifičnog epitopa T-ćelije dati za rezultat komponentu vakcine koja je efikasna samo u delu populacije, a zavisno od tog dela, može biti potrebno da se uključi više epitopa T-ćelije u isti molekul, ili alternativno, da se pripremi multikomponentna vakcina, gde su komponente varijante amiloidogenog polipeptida koje se razlikuju jedna od druge prema prirodi uvedenog epitopa T-ćelije.
Ukoliko je MHC restrikcija upotrebljenih T-ćelija potpuno nepoznata (na primer, u situaciji kada vakcinisana životinja ima slabo definisan sastav MHC), frakcija populacije koju pokriva specifični preparat vakcine može se odrediti pomoću sledeće formule: gde je pi frekvencija populacije onih koji su odgovorili na i-ti strani epitop T-ćelije prisutan u preparatu vakcine, a n je ukupan broj stranih epitopa T-ćelije u preparatu vakcine. Dakle, preparat vakcine koja sadrži 3 strana epitopa T-ćelije, a koji imaju frekvencije odgovora u populaciji od 0,8, 0,7 i 0,6, respektivno, daće:
tj. 97,6 procenata populacije će statistički pojačati odgovor na vakcinu, koji je posredovan sa MHC-II.
Gornja formula se ne primenjuje u situacijama gde je manje više poznata precizna shema restrikcije MHC za korišćene peptide. Ako, na primer, neki peptid vezuje samo humane molekule MHC-II kojie kodiraju HLA-DR alele DR1, DR3, Dr5 i DR7, tada će upotreba ovog peptida, zajedno sa drugim peptidom koji vezuje preostale molekule MHC-II, kodirane sa HLA-DR alelama, obaviti 100% pokrivanje populacije u pitanju. Slično, ukoliko drugi peptid vezuje samo DR3 i DR5, dodavanje ovog peptida neće uopšte povećati pokrivenost. Ukoliko se izračunavanje odgovora populacije bazira samo na MHC restrikciji epitopa T-ćelije u vakcini, frakcija populacije koja je pokrivena specifičnim preparatom vakcine može se odrediti pomoću sledeće formule:
gde je <pjzbir frekvencija u populaciji alalnih haplotipova koje kodiraju molekuli MHC, vezujući bilo koji od epitopa T-ćelije u vakcini, a koji pripadaju j-toj od 3 poznate HLA lokacije (DP, DR i DQ); u praksi, prvo se odredi koji molekuli MHC prepoznaju svaki epitop T-ćelije u vakcini, a zatim se ovi navedu po tipu (DP, DR ili DQ), pa se zatim, pojedinačne frekvencije raznih navedenih alaličkih haplotipova sumiraju za svaki tip, dajići tako <pi, q>2 i cp3.
Može se desiti da vrednost piu formuli II prevazilazi odgovarajuću teorijsku vrednostp, : gde je vjzbir frekvencija u populaciji aleličkog haplotipa koji kodiraju molekuli MHC, koji vezuju i-ti epitop T-ćelije u vakcini, a pripadaju j-toj od tri poznate lokacije HLA (DP, DR, DQ). To znači da je u 1 - p*populacija, frekvencija onih koji odgovaraju fzaostaii= (pi-Pi) / (1 -pi). Stoga, formula II se može podesiti tako da daje formulu (V):
gde je član (l-^Vreostaii-i) jednak nuli ako je negativan. Treba napomenuti da formula V zahteva da svi epitopi imaju haplotip mapiran protiv identičnih nizova haplotipova.
Stoga, kada se biraju epitopi T-ćelije koji treba da se uvedu u analog, značajno je da se uključi sve znanje o epitopima koje stoji na raspolaganju: 1) frekvencija onih u svakoj populaciji koji odgovaraju na svaki epitop, 2) podaci o MHC restrikciji, i 3) frekvencija u populaciji relevantnih haplotipova.
Postoji jedan broj "promiskuitetnih" epitopa T-ćelije koji se nalaze u prirodi, koji su aktivni u velikoj propociji pojedinaca životinjske vrste ili životinjske populacije, i poželjno je da se ovi uvedu u vakcinu, čime se smanjuje potreba za velikim brojem različitih analoga u istoj vakcini.
U skladu sa ovim pronalaskom promiskuitetni epitop može biti humani epitop T-ćelije koji se nalazi u prirodi, kao što su epitopi tetanusnog anatoksina (npr. epitopi P2 i P30), anatoksin difterije, hemaglutinin virusa gripa (HA) i antigen CS
P. falcipamm.
Tokom godina identifikovan je niz drugih promiskuitetnih epitopa T-ćelije. Posebno su identifikovani peptidi koji su u stanju da vezjuu velike proporcije molekula HLA-DR, kodirani raznim HLA-DR aleleama i svi oni su mogući epitopi T-ćelije koji se mogu uvesti u analoge koji se koriste u skaldu sa ovim pronalaskom. Videti takođe, epitope koji su razmatrani u sledećim citatima, koji su ovde priključeni kroz citiranje: VVO 98/23635 (Frazer I.H. et al., priznat Univerzitetu u Kvinslendu); Southowood S. et al.J. Immunol.1998, 160, 3363-3373; Sinigaglia F. et al.,Nature,1998, 336, 778-780; Chicz R.M. et al.,J. Exp. Med.1993, 178, 27-47; Hammer J. et al.,Cell,1993, 74, 197-203; i Falk K. et al.,Immunogenetics1994, 39, 230-242. Poslednji citat se odnosi takođe na HLA-Dq i -DP ligande. Svi epitopi navedeni u ovih 5 citata relevantni su kao kandidati prirodnih epitopa, koji se mogu upotrebiti u ovom pronalasku, kao što su epitopi koji dele iste motive sa ovima.
Alternativno, epitop može biti bilo koji veštački epitop T-ćelije koji je u stanju da vezuje veliku proporciju molekula klase II MHC. U ovom kontekstu peptidi pan DR epitopa ("PADRE"), koji su opisani u VVO 95/07707 i u odgovarajućem radu: Alexander J. et al,lmmunity 1994,1, 751-761 (oba opisa su ovde priključeni kroz citat) su interesantni kandidati za epitope, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Treba napomenuti da najefikasniji peptidi PADRE, opisani u tim radovima, nose D-aminokiseline na C- i N-krajevima, kako bi se poboljšala stabilnost prilikom ordiniranja. Međutim, prvenstveni cilj ovog pronalaska je ugrađivanje relevantnih epitopa kao dela modifikovanog amiloidogenog polipeptida, koji bi se zatim enzimatski razbio unutar lizozomatskog odeljka APC, dozvoljavajua naknadnu prezentaciju u kontekstu molekula MHC-II, pa stoga nije umesno ugrađivati D-aminokiseline u epitope koji se koriste u ovom pronalasku.
Jedan posebno poželjanj PADRE peptid je onaj koji ima sekvenciju aminokiselina AKFVAAVVTLKAAA, ili njenu imunološki efikasnu subsekvenciju. Ovaj i drugi epitopi koji imaju isti nedostatak restrikcije MHC, su poželjni epitopi T-ćelije koji bi mogli biti prezentirani u analozima koji se koriste u ovde pronađenom postupku. Ti super-promiskuitetni epitopi dozvoljavaju najjednostavnije realizacijae ovog pronalaska, pri čemu se samo jedan modifikovani amiloidogeni polipeptid prezentira u imuno sistem vakcinisane životinje.
Kao što je pomenuto gore, modifikacija amiloidogenog polipeptida može takođe da uključi uvođenje prvog ostatka, koji targetira modifikovani amiloidogeni polipeptid na APC ili B-limfocitu. Na primer, prvi ostatak može bit specifičan partner za vezivanje uz B-limfocit antigena specifične površine ili za APC antigena specifične površine. U stanju tehnike su poznati mnogi takvi specifični porvšinski antigeni. Na primer, ostatak može da bude ugljeni hidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu, ili APC (npr. manan ili mananoza). Alternativno, drugi ostatak može biti hapten. Takođe i fragment antitela, koji specifično prepoznaje površinu molekula na APC ili limfocitima, može da se upotrebi kao prvi ostatak (površinski molekul može biti npr. FCy receptor makrofage ili monocita, kao što je FCyRI ili, alternativno, bilo koji drugi specifični površinski marker, kao što je CD40 ili CTLA-4). Treba napomenuti da svi ovi primeri molekula za targetiranje mogu da se koriste takođe kao deo adjuvanta, videti niže.
Kao alternativa ili dodatak targetiranju modifikovanog amiloidogenog polipeptida na određeni tip ćelije, kako bi se postigao pojačani imuno odgovor, moguće je da se povisi nivo pružanja odgovora imuno sistema uključujući gore pomenuti drugi ostatak, koji stimuliše imuno sitem. Tipični primeri takvih drugih ostataka su citokini, i proteini toplotnog šoka ili molekulski pratioci, kao i njihovi efikasni delovi.
Podesni citokini koji se mogu upotrebiti u skladu sa ovim pronalaskom su oni koji će normalno funkcionisati takođe kao adjuvanti u preparatu vakcine, na primer interferon y (IFN^), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) i faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF); alternativno, funkcionalni deo molekula citokina može biti dovoljan kao drugi ostatak. U pogledu upotebe takvih citokina kao adjuvantskih supstanci, videti diskusiju u nastavku.
U skladu sa ovim pronalaskom, podesni proteini toplotnog šoka ili molekulski pratioci, koji se koriste ka drugi ostatak, mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (poznat takođe kao gp06, videti VVearsch P.A. et al.Biochemistry1998, 37, 5709-19) i CRT (calreticulin).
Alternativno, drugi ostatak može biti toksin, kao što je listeriolicin (LLO), lipid A i toplotno-labilni enterotoksin. Takođe, interesantne mogućnosti predstavljaju brojni mikobakterijski derivati, kao što je MDP (muramildipeptid), CFA (komplet Freund-ovog adjuvanta) i diestri trehaloze TDM i TDE.
Značajna realizacija ovog pronalaska je takođe mogućnost uvođenja trećeg ostatka, koji pojačava prezentaciju modifikovanog amiloidogenog polipeptida u imuno sistem. Stanje tehnike pokazuje nekoliko primera ovog sastojka. Na primer, poznato je da se može korostiti palmitoil lipidaciono sidrište u proteinuBorrelia burgdoferiOspA, za davanje vlastitih adjuvantnih polipeptida (videti npr. VVO 96/40718) - izgleda da lipidovani proteini formiraju strukture nalik miceli, sa jezgrom koje čine delovi polipeptida gde su sidrišta lipidacije, dok ostali delovi molekula vire odatle, što dovodi do višestrukog prezentiranja antigenskih determinanti. Dakle, upotreba ovog i sličnih pristupa, uz upotrebu različitih sidrišta za lipidaciju (npr. miristil grupa, famezil grupa, geranil-gerani grupa, GPI-sidrište, i N-acildigliceridna grupa) su poželjne realizacije ovog pronalaska, posebno zato što obezbeđivanje ovakvih sidrišta za lipidaciju kod rekombinantno proizvedenih proteina je vrlo jednostavno i zahteva samo upotrebu npr. signalne skevencije koja se nalazi u prirodi, kao fuzionog partnera modifikovanog amiloidogenog polipeptida. Sledeća mogućnost je upotreba frgamenta C3d komplementarnog faktora C3 ili samog C3 (videti Dempsev et al.,Science,1996, 271, 348-350 i Lou i Kohler,Nature Biotechnology1998,16, 458-462).
Alternativna realizacija, koja takođe vodi poželjnoj prezentaciji u imuno sistem višestrukih (npr. najmanje 2) kopija značajnih regiona epitopa amiloidogenog polipeptida, je kovalentno kuplovanje amiloidogenog polipeptida, njegove subsekvencije ili varijanti, sa nekim molekulima. Na primer, mogu se koristiti polimeri, npr. ugljenihidrati, kao što je dekstran, videti Lees A. et al.,Vaccine1994, 12, 1160-1166; Lees A. et al.,J. Immunol.1990, 145, 3594-3600, a takođe korisna alternativa su manoza i manan. Korisni konjugacioni partneri su takođe integralni membranski proteini iz npr.E. colii drugih bakterija. Tradicionalni noseći molekuli, kao što je ključaonica-limpet-hemocijanin (KLH), tetanusni anatoksin, difterijski anatoksin i goveđi serum albumin (BSA) takođe su poželjni i korisni knjugacioni partneri.
Poželjne realizacije kovalentnog kuplovanja amiloidogenog polipeptida sa polihidroksipolimerima, kao što je ugljeni hidrat, uključuju upotrebu najmanje jednog stranog epitopa T-helpera, koji seodvojenokupluje sa polihidroksipolimerom (tj. strani epitop T-helpera i amiloidogeni polipeptid se ne spajaju jedan sa drugim, nego se radije vežu za polihidroksipolimer, koji onda služi kao noseći skelet). Ponovo, ovakva realizacija je najpoželjnija kada se podesni regioni amiloidogenog polipeptida, koji nose podesan epitop B-ćelije, sastoje od kratkih peptidnih istezanja - to je zato što je ovaj pristup veoma povoljan način za postizanje višestrukih prezentacija odabranih epitopa u dobijenom imunogenom agensu.
Naročito je poželjno da je kuplovanje stranog epitopa T-helpera i amiloidogenog (poli)peptida uz pomoć amidne veze, koja se može otcepiti sa peptidazom. Ova strategija ima efekat da su APC u stanju da pokupe konjugat i zatim ga prezentuju stranom epitopu T-ćelije u kontekstu klase II MHC.
Jedan način postizanja kuplovanja peptida (i amiloidogenog polipeptida i stranog epitopa) je da se aktivira podesan polihidroksipolimer sa tresil grupama; tako je npr. moguće dobiti tresilovane polisaharide, kako je opisano u WO 00/05316 i US 5,874,469 (oba su ovde priključena kroz citat), pa ih kuplovati sa amiloidogenim peptidima i epitopima T-ćelije, dobijanjem pomoću konvencionalnih tehnika sinteze peptida u čvrstoj i tečnoj fazi. Dobijeni proizvod se sastoji od polihidroksipolimeme kičme (npr dekstranska kičma) koja ima, spojene sa njom, preko njenih N-krajeva ili drugih raspoloživih azotnih ostataka, amiloidogene polipeptide i strane epitope T-ćelije. Ukoliko se želi, moguće je sintetizovati amiloidogene polipeptide tako da se zaštite sve raspoložive amino gupe, izuzev jedne na N-kraju, a zatim se dobijeni zaštićeni peptid kupluje sa tresilovanim dekstranskim ostatkom, i konačno se deprotektuje dobijeni konjugat. Specifičan primer ovog pristupa je opisan u primerima niže.
Umesto upotrebe u vodi rastvomih molekula polisaharida, kako je opisano u WO 00/05316 i US 5,874,469, isto tako je moguće korišćenje umreženih molekula polisaharida, pri čemu se dobije zrnasti konjugat polipeptida i polisaharida - smatra se da ovo vodi poboljšanoj prezentaciji polipeptida imuno sistemu, zato što su ostvarena dva cilja, dobijanje efekta lokalnog taloženja prilikom injektiranja konjugata i dobijanje čestica koje su privlačni targeti za APC. Pristup koji koristi ovakve zrnaste sisteme takođe je detaljno opisan u primerima.
Razmatranja koja spadaju u odabrane oblasti uvođenja modifikacija u amiloidogene peptide su: a) očuvanje poznatih i predviđenih epitopa B-ćelije; b) očuvanje tercijarne strukture; c) izbegavanje epitopa B-ćelije prezentovanih "ćelijama proizvođačima" itd. U svakom slučaju, kao što je gore diskutovano, relativno je jednostavno proveriti set mdifikovanih amiloidogenih molekula koji su podvrgnuti uvođenju epitopa T-ćelije na raznim lokacijama.
Pošto najpoželjnije realizacije ovog pronalaska obuhvataju deregulaciju humanog Ap, poželjno je stoga da amiloidni polipeptid koji je gore diskutovan, bude humani Ap polipeptid. U ovoj realizaciji, naročito je poželjno da humani amiloidogeni polipetid bude modifikovan supstitucijom najmanje jedne sekvencije aminokiselina u SEQ ID NO: 2, sa najmanje jednom sekvencijom aminokiselina jednake ili različite dužine i da sadrži strani epitop TH. Poželjni primeri modifikovanih amiliodogenih APP i Ap su shematski pokazani na Slici 1, koristeći kao primere epitope P2 i P30. Princip takvih konstrukata je diskutovan detaljno u primeru.
Specifično, THkoji sadrži (ili kompletira) sekvenciju aminokiselina koja se uvodi u SEQ ID NO: 2, može se uvesti na bilo koju aminokiselinu u SEQ ID NO: 2. To znači da je uvođenje moguće posle bilo koje aminokiseline 1-770, a poželjno posle bilo koje od aminokiselina 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 u SEQ ID NO: 2. To se može kombinovati sa izbacivanjem bilo koje ili svih aminokiselina 1-71, ili bilo koje od aminokiselina 715-770. Pored toga, kada se koristi tehnika supstitucije, bilo koja od aminokiselina 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 i 714 u SEQ ID NO: 2 se može izbaciti u kombinaciji sa ubacivanjem.
Formulacija amiloidogenog polipeptida i
modifikovanih amiloidogenih polipeptida.
Kada se ostvaruje prezentacija amiloidogenog polipeptida ili modifikovanog amiloidogenog polipeptida u imuno sistem životinje pomoću njegovog ordiniranja životinji, formulacija polipeptida sledi principe koji su opšte prihvaćeni u stanju tehnike.
Pripremanje vakcine koja sadrži sekvenciju peptida kao aktivni sastojak, je obično dobro poznatau stanju tehnike, kao što je na primerima dato u U.S.
Patent No. 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 i 4,578,770, koji su svi ovde priključeni kroz citat. Tipično, te vakcine se dobijaju u obliku pogodnom za injekcije, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije; mogu se takođe dobiti čvrsti oblici, podesni za rastvaranje ili suspendovanje u tečnosti, pre davanja injekcije. Preparat može takođe biti emulgovan. Aktivni imunogeni sastojak se često pomeša sa dodacima koji su farmaceutski prihvatljvi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Podesni dodaci su na primer, voda, rastvor soli, dekstroza, glicerin, etanol i slično, a vakcina može da sadrži male količine pomoćnih supstanci, kao što je sredstvo za kvašenje ili emulgovanje, sredstvo za puferovanje pH, ili adjuvanti koji pojačavaju efikasnost vakcina; videti detaljnu diskusiju o adjuvantima niže.
Vakcine se konvencionalno ordiniraju parenteralno, na primer injekcijama, bilo subkutano, intrakutano, intradermalno, subdermalno ili intramuskulamo. Ostale formulacije koje su podesne za druge načine ordiniranja su supozitorije i, u nekim slučajevima, oralne, bukalne, sublingvalne, intraperitonealne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakranijalne formulacije. Za supozitorije tradicionalna veziva i nosači su na primer, polialkilenglikoli i trigliceridi; takve supozitorije se mogu oblikovati iz smeša koje sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0,5% do 10%, poželjno 1-2%. Oralne formulacije sadrže normalno korišćene dodatke, kao što su na primer, manitol, laktoza, škrob, magnezijum-stearat, natrijum-saharinat, celuloza, magnezijum-karbonat, i slično, farmaceutskog kvaliteta. Ovi preparati imaju oblik rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa uzdržanim oslobađanjem ili prahova, a sadrže 10-95% aktivnog sastojka, poželjno 25-70%. Za oralne formulacije, interesantan partner u formulacijama (a takođe i mogući konjugacioni partner) je toksin kolere.
Polipeptidi se mogu formulisati u vakcinu u neutralnom ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama peptida), koje se formiraju sa neorganskim kiselinama, kao što su na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama, kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slične. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama se mogu takođe izvesti iz neorganskih baza, kao što su na primer, natrijum-, kalijum, amonijum-, kalcijum- ili feri-hidroksid, i organskih baza, kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2-etilaminoetanol, histidin, prokain i slično. Vakcine se ordiniraju na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze, i u takvoj količini koja je terapeutski efikasna i imunogena. Količina koja treba da se ordinira zavisi od subjekta koji treba da se tretira, uključujući npr. kapacitet imuno sistema pojedinca za povećanje imuno odgovora, i od stepena zaštite koji se želi. Podesni opsezi doza su reda od nekoliko stotina mikrograma aktivnog sastojka po vakcinaciji, sa poželjnim opsegom od oko 0,1 ug do 2000 ug (podrazumevaju se čak i veće količine, u opsegu 1-10 mg), kao što je u opsegu od oko 0,5 ug, pa do 1000 ug, poželjno u opsegu od 1 ug do 500 ug, a naročito u opsegu od oko 10 ug, pa do 100 ug. Podesni režimi za početno ordiniranje i udarne doze su takođe varijabilni, ali su tipizirani početnim ordiniranjem, koje slede naknadne inokulacije ili druga ordiniranja.
Način primene može široko da varira. Primenljivi su bilo koji od konvencionalnih postupaka ordiniranja vakcine. To su oralna primena na čvrstoj, fiziloški prihvatjivoj osnovi ili u fiziološki prihvatljivoj disperziji, parenteralno, injekcijama i slično. Doziranje vakcine će zavisiti od puta ordiniranja i variraće u skladu sa starošću osobe koja treba da se vakciniše i formulacijom antigena.
Neki od polipeptida vakcine su dovoljno imunpgeni u vakcini, ali za neke druge imuno odgovor će biti pojačan, ukoliko vakcina sadrži još adjuvantnu supstancu.
Poznati su razni postupci postizanja adjuvantnog efekta vakcine. Opšti principi su detaljno opisani u The Theon/and Practical Application of Adjuvants", urednici Duncan E.S. i Stewart-Trull, John-Wiley & Sons Ltd, (ISBN 0-471-95170-6), 1995, a takođe u "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", urednici Gregoriadis et al., Plenum Press, New York, 1995, (ISBN 0-306-45283-9), obe su ovde priključene kroz citat.
Naročito je poželjno koristiti adjuvant za koga se može pokazati da olakšava raskidanje autotolerancije prema auto-antigenima; ustvari, ovo je bitno u slučajevima kada se koristi nemodifikovani amiloidogeni polipeptid kao aktivni sastojak u autovakcini. Neograničen proj primera podesnih adjuvanata se bira iz grupe koju čine: imuno-targetirajući adjuvant, imuno-modulišući adjuvant, kao što je toksin, citokin i mikobakterijski derivat; uljane formulacije; polimer; adjuvant koji formira micele; saponin; matrica imunostimulacionog kompleksa (ISCOM matrica); čestica; DDA; aluminijumski adjuvanti; DNA adjuvanti; y-inulin i enkapsulirani adjuvant. Obično, treba napomenuti da se gornji opisi, koji se odnose na jedinjenja i agense koji su korisni u prvom, drugom i trećem ostatku u analozima, takođe odnosi, sa potrebnim izmenama, i na njihovu upotrebu u adjuvantu vakcine iz ovog pronalaska.
Primena adjuvanata obuhvata upotrebu agenasa kao što su aluminijum-hidroksid ili fosfat (stipsa), koji se obično koriste kao 0,05 do 0,1% rastvor u puferovanom rastvoru soli, smeša sa sintetskim polimemim šećerima (npr. Carbopol<®>) se koristi kao 0,25% rastvor, agreagacija proteina u vakcini tretiranjem sa toplotom, sa temperaturama koje se kreću između 70° i 101°C, u periodu od 30 s do 2 min, respektivno, a takođe su moguće agreagacije sa sredstvima za umrežavanje. Mogu se takođe koristiti agreagcija reaktivacijom sa antitelima tretiranim pepsinom (fragmenti Fab) do albumina, smeša sa ćelijama bakterija, kao što suC. parvumili endotoksinima, ili lipopolisaharidnim komponentama gram-negativnih bakterija, emulzija u fiziološki prihvatljivom uljanom tečnom nosaču, kao što je manid mono-oleat (Aracel A), ili emulzija sa 20% rastvorom perfluorougljenika (Fluosol-DA) upotrebljenog kao blok zamena. Smeša sa uljima, kao što je skvalen i IFA je takođe poželjna.
U skladu sa ovim pronalaskom, interesantan kandidat za adjuvanta je DDA (dimetildioktadecilamonijumbromid), kao što je i DNA i y-inulin, ali takođe su interesantni Freund-ov kompletni i nekompletni adjuvant, kao i saponiniquillaja,kao što je Qui1A i QS21, kao i RIBI. Dalje mogućnosti su monofosforil-lipid A (MPL), gore pomenuti C3 i C3d, i muramildipeptid (MDP).
Poznato je takođe da formulacije lipozoma poseduju efekte adjuvanta, pa su stoga lipozomski adjuvanti poželjni u skladu sa ovim pronalaskom.
Takođe, adjuvanti tipa matričnog imunostimulacionog kompleksa (matrica ISCOM<®>) su poželjan izbor u skladu sa ovim pronalaskom, a narčito od kada je pokazano da je ovaj tip adjuvanata u stanju da nad-reguliše ekspresiju klase II MHC iz APC. Matrica ISCOM<®>se sastoji od (opciono frakcionisanih) saponina (triterpenoidi) izQuillaja saponaria,holesterola i fosfolipida. Kada se pomeša sa imunogenim proteinom, dobijena zrnasta formulacija je ono što je poznato kao ISCOM čestica, gde saponin čini 60-70 mas%, holesterol i fosfolipid 10-15 mas%, a protein 10-15 mas%. Detalji koji se odnose na sastav i upotrebu imunostimulacionih kompleksa mogu se naći, na primer u gore pomenutim udžbenicima koji se bave adjuvantima, a takođe i u Morein B. et al.,Clin. Immunoter.1995, 3, 461-475, kao i u Barr I.G. i Mitchell G. F.,Immunol. and Cell Biol.1996, 74, 8-25 (oba su ovde priključena kroz citat), gde se daju korisne instrukcije za pripemanje kompletnih imunostimulacionih kompleksa.
Sledeća veoma interesantna (a time i poželjna) mogućnost za postizanje adjuvantskog efekta je korišćenje tehnike koja je opisana kod Goselin et al., 1992 (koji je ovde priključen kroz citat). Ukratko, prezentacija relevantnog antigena, kao što je antigen iz ovog pronalaska, može se pojačati konjugovanjem tog antigena sa antitelima (ili fragmentima antigena koji vezuju antitelo) protiv Fcy receptora na monociti/makrofage. Pokazano je da naročito konjugati između antigena i anti-FCyRI pojačavaju imunogenicitet za svrhe vakcinacije.
Druge mogućnosti su upotreba targetiranja i imuno modulatorskih supstanci (tj. citokina) koje su pomenute gore kao kandidati za prvi i drugi ostatak u modifikovanim verzijama amiloidogenih polipeptida. U vezi sa tim, mogućnosti su sintetski izazivači citokina, kao što je poli I.C.
Podesni mikrobakterijski derivati se biraju iz grupe koju čine muramildipeptid, kompletni Freund-ov adjuvant, RIBI i diestar trehaloze, kao što je TDM i TDE.
Podesni imuno targetirajući adjuvanti se biraju iz grupe koju čine ligand CD40 i antitela CD40 ili njihovi specifični vezivni fragmenti (videti diskusiju gore), manoza, fragment Fab i CTLA-4.
Pogodni polimemi adjuvanti se biraju iz grupe koju čine ugljeni hidrat, kao što su dekstran, PEG, škrob, manan i manoza; plastični polimeri, kao što je lateks, npr. perlice lateksa.
Još jedan interesantan način modulisanja imuno odgovora je uključivanje imunogena (opciono zajedno sa adjuvantima i farmaceutski prihvatljivim nosačima i tečnim nosačima) u "virtuelni limfni čvor" (VLN) (zaštićen medicinski uređaj koji je razvila firma ImmunoTherapv, Ine, 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). Ovaj VLN (uređaj sa tankim cevčicama) imitira strukturu i funkciju limfnog čvora. Ubacivanje VLN pod kožu kreira mesto sterilne inflamacije sa gomilanjem citokina i hemokina. T- i B-ćelije, kao i APC, brzo odgovaraju na signale opasnosti, sakupljaju se na mestu inflamacije i akumuliraju se unutar porozne matrice VLN. Pokazano je da se neophodna doza antigena, potrebna da podigne imuno odgovor prema antigenu, smanjuje kada se koristi VLN i ova imuno zaštita, praćena sa vakcinacijom uz upotrebu VLN, prevazilazi konvencionalnu imunizaciju sa upotrebom RIBI kao adjuvanta. Ova tehnologija je između ostalog, opisana ukratko u Gelber C. et al., pod naslovom "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", u "From the Laboratorv to the Clinic. Book of Abstracts" October /\ 2m- 15* 1998, Seascape Resort, Aptos, Califomia".
Formulacija vakcina sa mikročesticama pokazano je u mnogim slučajevima da povećava imunogenicitet proteinskih antigena, pa je stoga sledeća poželjna realizacija ovog pronalska. Mikročestice se prave ili ko-formulisanjem antigena sa polimerom, lipidom, ugljenim hidratom ili drugim molekulima koji su podesni za pravljenje čestica, ili mikročestice mogu biti homogene čestice koje sadrže samo antigen.
Primeri polimera zasnovanih na mikročesticama su čestice zasnovane na PLGA i PVP (Gupta, R.K. et al., 1998), gde su polimeri antigen kondenzovani u čvrstu česticu. Čestice na bazi lipida se mogu napraviti kao micele lipida (takozvani lipozomi) koje zarobljavaju antigen unutar micele (Pietrobon, P.J., 1995). Čestice na bazi karbohidrata se tipično prave od pogodnih degradibilnih ugljenih hidrata, kao što su škrob ili hitosan. Karbohidrat i antigen se pomešaju i kondenzuju u čestice u procesu koji je sličan onom koji se koristi za polimeme čestice (Kas, H.S. etal., 1997).
Čestice koje se sastoje samo od antigena, mogu se napraviti raznim tehnikama raspršivanja ili sušenja smrzavanjem. Naročito pogodna za svrhu ovog pronalaska je tehnologija super kritičnih fluida, koja se koristi za pravljenje veoma uniformnih čestica kontrolisane veličine (York, P., 1999, i Shekunov B. Et al., 1999).
Očekuje se da se vakcina treba ordinirati 1 -6 puta godišnje, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 puta na godinu, osobi kojoj je to potrebno. Prethodno je pokazano memorijski imunitet izazvan upotrebom poželjnih autovakcina u skladu sa ovim pronalaskom nije permanentan, pa stoga imuno sistem treba periodično da se izazove sa amiloidogenim polipeptidom ili modifikovanim amiloidogenim polipeptidima.
Usled genetskih varijacija različite osobe mogu reagovati imuno odogovorima varijabilne jačine na isti polipeptid. Stoga, vakcina u skladu sa ovim pronalaskom može da sadrži nekoliko različitih polipeptida da bi se povećao imuno odgovor, videti takođe diskusiju gore koja se odnosi na izbor pri uvođenjima stranog epitopa T-ćelije. Vakcina može da sadrži dva ili više polipetida, gde su svi polipeptidi definisani gore.
Prema tome, vakcina može da sadrži 3-20 različitih modifikovanih ili nemodifikovanih polipeptida, kao što je 3-10 različitih polipeptida.
Vakcinacija nukleinskom kiselinom.
Kao alternativa klasičnom ordiniranju vakcine na bazi peptida, tehnologija vakcinacije nukleinskom kiselinom (poznata takođe kao "imunizacija nukleinskom kiselinom", "genetska imunizacija" i "genska imunizacija") nudi niz atraktivnih karakteristika.
Prvo, nasuprot tradicionalnom pristupu vakcini, vakcinacija sa nukelinskom kiselinom ne zahteva sirovinu koja zahteva proizvodnju na velikoj skali imunogenog agensa (npr. u obliku fermentacije mikroorganizama na industrijskoj skali, koji stvaraju modifikovane amiloidogene polipeptide). Pored toga, nema potrebe za uređajima za prečišćavanje i za shemama ponovnog sklapanja imunogena. I konačno, pošto se vakcinacija sa nukleinskom kiselinom oslanja na biohemijski aparat vakcinisanog pojedinca u cilju proizvodnje izlučenog proizvoda unete nukleinske kiseline, očekuje se da se dogodi optimalno post-translacionalno procesiranje proizvoda izlučivanja; ovo je naročito značajno u slučaju autovakcinacije, zato što, kao što je pomenuto gore, treba da se u modifikovanom molekulu očuva znatan udeo originalnih epitopa B-ćelije, a zato što epitopi B-ćelija u principu mogu biti sačinjeni od delova bilo koga (bio)molekula (npr. ugljenog hidrata, lipida, proteina itd). Stoga, urođene sheme glikozilovanja i lipidovanja imunogena mogu biti od značaja za celokupnu imunogenost, a to se najbolje obezbeđuje kada se ima domaćin koji proizvodi imunogen.
Dakle, poželjna realizacija ovog pronalaska se sastoji u izazivanju prezentacije modifikovanog amiloidogenog polipeptida u imuno sistem, uvođenjem nukleinske kiseline (ili kiselina) koja kodira modifikovani amiloidogeni polipeptid u životinjskim ćelijama, čime se dobija da ćelijein vivoizlučuju uvedenu nukleinsku kiselinu (ili kiseline).
U ovoj realizaciji, poželjno je da je uvedena nukleinska kiselina DNA, koja može biti u obliku ogoljene DNA, DNA formulisane sa nenaelektrisanim lipidima, DNA formulisane u lipozomima, DNA ubačene u virusni vektor, DNA formulisane sa proteinomili peptidom koji olakšava transfekciju, DNA formulisane sa targetiranim proteinom ili polipeptidom, DNA formulisane sa agensima za taloženje kalcijuma, DNA kuplovane sa inertnim molekulom-nosačem, DNA enkapsulirana u polimer, npr. u PLGA (videti tehnologija mikroenkapsulacije, koja je opisana u WO 98/31398), ili u hitin ili hitosan, i DNA formulisane sa adjuvantom. U ovom kontekstu napominje se da se praktično sva razmatranja koja se u tradicionalnoj formulaciji vakcine odnose na upotrebu adjuvanata, primenjuju i kod DNA vakcina. Dakle, svi opisi ovde koji se odnose na upotrebu adjuvanata u kontekstu vakcina baziranih na polipeptidima, primenjuju se uz, odgovarajuće izmene, na njihovu upotrebu u tehnologiji vakcinacije sa nukleinskom kiselinom.
Putevi ordiniranja i sheme ordiniranja vakcina baziranih na polipeptidu, koji su detaljno opisani gore, primenljivi su takođe na vakcine sa nukleinskom kiselinom iz ovog pronalaska, i sve gornje diskusije koje se odnose na puteve ordiniranja i sheme ordiniranja polipeptida, uz odgovarajuće izmene važe za nukleinske kiseline. Ovome treba dodati da je pogodno da se vakcine sa nukleinskom kiselinom ordiniraju intravenozno i intraarterijalno. Pored toga, dobro je poznato u stanju tehnike da vakcine sa nukleinskom kiselinom mogu da se ordiniraju upotrebom takozvanog genskog pištolja, pa se stoga takođe ovaj i njemu ekvivalentni načini ordiniranja smatraju delom ove prijave. Najzad, objavljena je takođe i upotreba VLN u ordiniranju nukleinskih kiselina, koja daje dobre rezultate, pa je stoga i ovaj posebni način ordiniranja naročito poželjan.
Pored toga, nukleinska kiselina (ili kiseline), koja se koristi kao agens za imunizaciju, može da sadrži regione koji kodiraju prvi, drugi i treći ostatak, npr. u obliku imunomodulatornih supstanci opisanih gore, kao što su citokini, koji su diskutovani kao korisni adjuvanti. Poželjna verzija ove realizacje obuhvata postojanje regiona kodiranja za analog i regiona kodiranja za imunomodulator u različitim okvirima čitanja, ili bar pod kontrolom različitih promotera. Time se izbegava da se stvara analog ili epitop kao fuzioni partner imunomodulatora. Alternativno, mogu se koristiti i dva odvojena fragmenta nukleotida, ali je to manje poželjno zbog prednosti obezbeđivanja ko-ekspresije, kada su oba regiona kodiranja u istom molekulu.
U skladu sa tim, ovaj pronalazak se odnosi na preparat koji izaziva proizvodnju antitela protiv amiloidogenog polipeptida, preparat koji se sastoji od: - fragmenta nukleinske kiseline ili vektora iz ovog pronalaska (videti diskusiju o vektorima u nastavku), i - farmaceutski i imunološki prihvatljivog tečnog nosača i/ili nosača i/ili adjuvanta, kao što je diskutovano gore.
Pod normalnim okolnostima, uvodi se varijanta, koja kodira nukleinsku kiselinu u obliku vektora, pri čemu je izlučivanje pod kontrolom virusnog promotera. Za detaljniju diskusiju o vektorima u skladu sa ovim pronalaskom, videti diskusiju niže. Takođe, dostupni su opisi koji se odnose na formulaciju i upotrebu vakcina sa nukleinskom kiselinom, videti Donnellv J.J. et al.,Annu. Rev. Immunol.1997, 15, 617-648, i Donnellv J.J. et al.,Ufe Sciences,1997, 60, 163-172. Oba ova navoda su priključeni ovde kroz citat.
Žive vakcine
Treća alternativa za ostvarivanje prezentacije modifikovanog amiloidogenog peptida u imuni sistem, je upotreba tehnologije žive vakcine. Kod žive vakcinacije, prezentacija u imuno sistem se ostvaruje ordiniranjem životinji ne-patogenih mikroorganizama, koji su bili transformisani sa fragmentom nukleinske kiseline koji kodira modifikovani amiloidogeni polipeptid, ili sa vektorom ugrađenim u takav fragment nukleinske kiseline. Ne-patogeni mikroorganizam može da bude bilo koji oslabljen bakterijski soj (oslabljen kanalisanjem ili pomoću uklanjanja patogenih proizvoda ekspresije tehnologijom rekombinantne DNA), npr.Mycobacterium bovisBCG, ne-patogeniStreptococcusspp.,E. coli, Salmonellaspp.,Vibrio cholerae, Shigella,itd. Pregledni članci sa preparatima i stanjem tehnike živih vakcina se mogu npr. naći u Saliou P.,Rev. Prat.1995, 45, 1492-1496 i VValker P.D.,Vaccine1992, 10, 977-990, oboje priključeni ovde korz citat. Za detalje oko fragmenata i vektora nukleinske kiseline koji se koriste u živim vakcinama, videti diskusiju niže.
Kao alternativa bakterisjkim živim vakcinama, fragment nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, koji se diskutuje u nastavku, može da se ugradi u ne-virulentni vektor virusne vakcine, kao što je soj vaccinia, ili bilo koji drugi podesan virus iz familijePoxviridae.
Normalno, životinji se ne-patogeni mikroorganizam ili virus ordinira samo jedanput, a u nekim slučajevima može biti potrebno da se tokom života mikroogranizam ordinira više od jedanput, kako bi se održao zaštitni imunitet. Podrazumeva se čak da su sheme imunizacije, kao što su one koje su detaljno opisane gore za vakcinaciju sa polipeptidom, korisne i kada se koriste žive ili virusne vakcine.
Alternativno, živa ili virusna vakcinacija se kombinuje sa prethodnom ili naknadnom vakcinacijom sa polipeptidom i/ili nukleinskom kiselinom. Na primer, moguće je izazvati primarnu imunizaciju sa živom ili virusnom vakcinacijom, koju zatim sledi udarna imunizacija, koja koristi pristup preko polipeptida ili nukleinske kiseline.
Mikroorganizam ili virus se može ransformisati sa nukleinskom kiselinom (ili kiselinama) koje sadrže regione koji kodiraju prvi, drugi i/ili treći ostatak, npr. u obliku imunomodulatomih supstanci koje su opisane gore, kao što su citokini, koji su diskutovani kao korisni adjuvanti. Poželjna verzija ove realizacije obuhvata postojanje regiona kodiranja za analog i regiona kodiranja za imunomodulator u različitim okvirima očitavanja, ili bar pod kontrolom različitih promotera. Tako se izbegava da se analog ili epitopi stvaraju kao fuzioni partneri imunomodulatora. Alternativno, mogu se koristiti dva odvojena fragmenta nukleotida, kao agensi za transformaciju. Naravno, postojanje prvog i/ili drugog i/ili trećeg ostatka u istom okviru očitavanja može dati kao proizvod ekspresije analog iz ovog pronalaska, pa je takva realizacija izuzetno poželjna, u skladu sa ovim pronalaskom.
Upotreba postupka iz ovog pronalska u tretiranju bolesti.
Kao što je jasno iz diskusije gore, postupak iz ovog pronalaska omogućuje kontrolu bolesti koju karakterišu naslage amiloida. U tom kontekstu AD je ključni cilj pronađenog postupka, ali takođe i druge bolesti koje karakterišu naslage amiloida su izvedivi ciljevi. Dakle, značajna realizacija postupka iz ovog pronalska za deregulaciju aktivnosti amiloida se sastoji od tretiranja i/ili prevencije i/ili ublažavanja AD ili ostalih bolesti koje karakteriše taloženje amiloida, postupak koji se sastoji u deregulaciji amiloida, u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska, do te mere da se značajno smanji količina amiloida.
Naročito je poželjno da je smanjenje amiloida rezultat inverzije ravnoteže između stvaranja amiloida i degradacije/uklanjanja amiloida, tj. da dovede do toga da brzina degradacije/uklanjanja amiloida prevaziđe brzinu stvaranja amiloida. Pažljivim kontrolisanjem broja i imunoloških udara imunizacije pojedinca kome je ista potrebna, moguće je tokom vremena uspostaviti ravnotežu, čiji je rezultat ukupno smanjenje naslaga amiloida, bez postojanja previše štetnih efekata.
Alternativno, ukoliko kod pojedinca postupak iz ovog pronalaska ne može da ukloni ili smanji postojeće naslage amiloida, postupak iz ovog pronalaska se može koristiti za dobijanje klinički značajnog smanjenja formiranja novog amiloida, čime se značajno produžava vreme tokom koga stanje bolesti ne čini pojedinca nemoćnim. Trebalo bi da je moguće praćenje brzine taloženja amiloida, ili merenjem koncentracije amiloida u serumu (za koji se smatra da je u ravnoteži sa istaložeim materijalom), ili koršćenjem skenirajuće tomografije emisije pozitrona (PET), videti Small G.W. et al.,Ann. N. Y. Acad. Sci.1996, 802, 70-78.
Druge bolesti i stanja, gde bi ovaj način i postupci mogli da se upotrebe prilikom tretmana ili ublažavanja na analogan način, pomenuti su gore (sistemska amiloidoza, pojava dijabetesa u starosti, Parkinson-ova bolest, Huntignton-ova bolest, fronto-temporalna demencija i prelazni encefalitis sunđerastog oblika povezan sa prionom) ili su navedene niže u odeljku pod naslovom "Ostale amiloidne bolesti i proteini povezani sa njima".
Peptidi, polipeptidi i preparati ovog pronalaska.
Iz prethodnog teksta je jasno da je ovaj pronalazak zasnovan na konceptu imunizacije pojedinaca protiv amiloidogenog antigena sa ciljem dobijanja smanjene količine patološki-povezanih naslaga amiloida. Poželjan put za dobijanje takve imunizacije je upotreba modifikovanih verzija amiloidogenog polipeptida, čime se dobijaju molekuli koji ranije nisu bili opisani u stanju tehnike.
Smatra se da modifikovani molekuli koji se ovde diskutuju imaju stepen inventivnosti sami po sebi, pa se stoga značajan deo ovog pronalaska odnosi na analog, koji se izvodi iz životinjskog amiloidogenog polipeptida, pri čemu je uvedena modifikacija čiji je rezultat da imunizacija životinje sa analogom izaziva stvaranje antitela koja reaguju specifično sa nemodifikovanim amiloidogenim polipeptidom. Poželjno je da je priroda modifikacije saglasna sa tipovima modifikacija opisanih gore, kada su diskutovane razne realizacije postupka iz ovog pronalaska pri upotrebi modifikovanog amiloidogenog polipeptida. Dakle, bilo koji opis koji se ovde daje, a odnosi se na modifikovane amiloidogene molekule, relevantan je u svrhu opisivanja amiloidogenih analoga iz ovog pronalaska, pa se bilo koji od ovih opisa, uz odgovarajuće izmene, odnosi na opis ovih analoga.
Treba napomenuti da poželjni modifikovani amiloidogeni molekuli sadrže modifikacije dajući polipeptide koji imaju sekvenciju sa najmanje 70% identiteta amiloidogenog proteina, ili njegove subsekvencije, u dužini od najmanje 10 aminokiselina. Veći identiteti sekvencije su poželjni, npr. najmanje 75% ili čak 80, 85, 90 ili 95%. Ovaj identitet sekvencije za proteine i nukleinske kiseline se može izračunavati kao što sledi: (Nref- Ndif)-100 / Nref, gde je Ndif ukupan broj ne-identičnih ostataka u dve sekvencije, kada se poravnaju, i gde je Nrefbroj ostataka u jednoj sekvenciji. Dakle, Sekvencija DNA AGTCAGTC će imati identitet sekvencije od 75% sa sekvencijom AATCAATC (Ndrf=2 i Nref=8).
Ovaj pronalazak se odnosi takođe i na preparate koji su korisni u izvođenju postupka iz ovog pronalaska. Dakle, ovaj pronalaza se odnosi na imunogeni preparat koji se sastoji od imunogeno efikasne količine amiloidogenog polipeptida koji je vlastiti-protein u životinji, a pomenuti amiloidogeni polipeptid je forrnulisan zajedno sa imunološki prihvatljivim adjuvantom, tako da se razbije autotolerancija životinje prema amiloidogenom polipeptidu, a ovaj preparat sadrži još farmaceutski i imunološki prihvatljiv razblaživač, i/ili tečni nosač, i/ili nosač, i/ili dodatak. Drugim rečima, ovaj deo pronalaska se odnosi na formulacije amiloidogenih polipeptida koji se nalaze u prirodi, opisane u vezi sa realizacijama postupka iz ovog pronalaska.
Ovaj pronalazak se odnosi takođe na imunogeni peparat koji sadrži imunološki efikasnu količinu gore definisanog analoga, pomenuti preparat sadrži još farmaceutski i imunološki prihvatljiv razblaživač, i/ili tečni nosač, i/ili nosač, i/ili dodatak i opciono adjuvant. Drugim rečima, ovaj deo pronalaska se odnosi na formulacije modifikovanog amiloidogenog polipeptida, u suštini opisanog gore. Izbor adjuvanata, nosača i tečnih nosača je u skladu sa onim što je diskutovano gore u odnosu na formulacije modifikovanog i nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida za upotrebu za deregulaciju amiloida u pronađenom postupku.
Poiipeptidi se dobijaju u skladu sa postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike. Duži poiipeptidi se normalno dobijaju pomoću tehnologije rekombinantnog gena, uključujući uvođenje sekvencije nukleinske kiseline koja kodira analog u podesan vektor, transformacijom podesne ćelije domaćina sa vektorom, izlučivanjem ćelije domaćina sekvencije nukleinske kiseline, regenerisanjem proizvoda izlučivanja iz ćelija domaćina ili bistrog sloja njihove kulture, i naknadnim prečišćavanjem i opcionom dodatnom modifikacijom, npr. ponovnim savijanjem ili derivatizacijom.
Poželjno je da se kraći peptidi dobijaju dobro poznatim tehnikama sinteze peptida na čvrstoj- ili u tečnoj fazi. Međutim, nedavni napredak u ovoj tehnologiji pružio je mogućnost proizvodnje polipeptida i proteina celokupne dužine ovim načinom, pa je stoga isti unutar obima ovog pronalaska, za dobijanje dugih konstrukata sintetskim putem.
Fragmenti i vektori nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.
Iz gornjeg opisa je jasno da se modifikovani amiloidogeni poiipeptidi mogu dobiti pomoću tehnologije rekombinantnog gena, ali takođe i pomoću hemijske sinteze ili polusinteze; poslednje dve opcije su naročito relevantne kada se modifikacija sastoji od kuplovanja sa nosačem proteina (kao što je KLH, anatoksin difterije, anatoksin tetanusa i BSA) i ne-proteinskim molekulima, kao što su polimeri ugljenih hidrata, i naravno takođe, kada se modifikacija sastoji od adicije bočnih lanaca ili bočnih grupa na peptidni lanac izveden iz amiloidogenog polipeptida.
Za potrebe tehnologije rekombinantnog gena i naravno, za potrebe imunizacije nukleinskom kiselinom, fragmenti nukleinske kiseline koji kodiraju modifikovani amiloidogeni polipeptid su značajni hemijski proizvodi. Dakle, značajan deo ovog pronalaska se odnosi na fragment nukleinske kiseline koji kodira analog amiloidogenog polipeptida, tj. polipeptid izveden iz amiloidogenog polipeptida, koji sadrži ili prirodnu sekvenciju kojoj je umetnut ili ubačen fuzioni partner, ili, poželjno polipeptid izveden iz amiloidogenog polipeptida u koji je uveden strani epitop T-ćelije pomoću umetanja i/ili adicije, poželjno supstitucijom i/ili izbacivanjem. Fragmenti nukleinske kiseline iz ovog pronalaska su fragmenti ili DNA ili RNA.
Fragmenti nukleinske kiseline iz ovog pronalaska se normalno umeću u podesne vektore, da formiraju klonirajuće ili ekspresione vektore koji nose fragmente nukleinske kiseline iz ovog pronalaska; ovi novi vektori su takođe deo ovog pronalaska. Detalji koji se odnose na konstrukciju ovih vektora u ovom pronalasku, biće diskutovani u kontekstu transformisanih ćelija i mikroorganizama, u nastavku. Vektori, zavisno od namene i tipa primene, mogu biti u obliku plazmida, faga, kosmida, mini-hromozoma ili virusa, ali takođe i ogoljene DNA, koja se izlučuje samo prolazno u nekim ćelijama, i predstavlja zanačajan vektor. Poželjni klonirajući i ekspresioni vektori iz ovog pronalaska su u stanju da se autonomno repliciraju, čime omogućavaju visok broj kopija za potrebe ekspresije na visokom nivou ili replikacije na visokom nivou za naknadno kloniranje.
Opšta skica vektora iz ovog pronalaska se sastoji od sledećih karakteristika u smeru 5'-»3' i operabilnom povezivanju: promotor za obavljanje izlučivanja fragmenta nukleinske kisleine iz ovog pronalaska, opciono sekvencije nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid koji omogućava izlučivanje (u vanćelijsku fazu ili, tamo gde treba, u periplazmu) ili integraciju u membranu fragmenta polipeptida, fragmenta nukleinske kiseline iz ovog pronalaska i opciono, sekvencije nukleinske kiseline koja kodira terminator. Kada se radi sa ekspresionim vektorima u sojevima proizvođača ili sojevima ćelija, u svrhu genetske stabilnosti transformisane ćelije poželjno je da se vektor, kada se uvede u ćeliju domaćina, integriše u genom ćelije domaćina. Nasuprot, kada se radi sa vektorima koji se koriste za obavljanje ekspresijein vivou životinjama (tj. kada se korosti vektor u vakcinaciji sa DNA) iz razloga bezbednosti je poželjno da se vektor onemogući za integrisanje u genom ćelije domaćina; tipično, koriste se ogoljena DNA ili ne-integrisani virusni vektori, čiji izbor je dobro poznat osobi verziranoj u stanje tehnike.
Vektori iz ovog pronalaska se koriste za transformisanje ćelija domaćina za proizvodnju modifikovanog amiloidogenog peptida iz ovog pronalaska. Tako transformisane ćelije, koje su takođe deo ovog pronalaska, mogu biti kultivisane ćelije ili sojevi ćelija koji se koriste za propagaciju fragmenata i vektora nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, ili se koriste za rekombinantnu proizvodnju modifikovanih amiloidogenih polipeptida iz ovog pronalaska. Alternativno, transformisane ćelije mogu biti podesni sojevi žive vakcine, pri čemu fragment nukleinske kiseline (jedna pojedinačna ili višestruka kopija) biva umetnut, tako da izazove lučenje ili integraciju modifikovanog amiloidogenog polipeptida u membranu zida ćelije bakterije.
Poželjne transformisane ćelije iz ovog pronalaska su mikroorganizmi, kao što su bakterije (kao što su vrsteEscherichia[npr.E. coli], Bacillus[npr.Bacillus subtilis], SalmonellailiMycobacterium[poželjno ne-patogena, npr.M. bovisBCG]), kvasci (kao što jeSacharomyces cerevisiae),i protozoe. Alternativno, transformisane ćelije se izvode iz višećelijskih organizama, kao što su gljivice, ćelije insekata, ćelije biljaka, ili ćelije sisara. Najpoželjnije su ćelije koje se izvode iz humanih bića, videti diskusiju o sojevima ćelija i vektorima, niže. Skorašnji rezultati su pokazali veliku nadu u pogledu upotrebe komercijalno dostupnog soja ćelijaDrosophilia melanogaster(Schneider-ov soj ćelija 2 (S2) i vektorski sistem, koji se dobija iz firme Invitrogen) za rekombinantnu proizvodnju peptida u laboratorijama podnosioca ove prijave, pa je stoga ovaj sistem izlučivanja naročito poželjan.
Za potrebe kloniranja i/ili optimizovanog izlučivanja poželjno je da je transformisana ćelija u stanju da replicira fragment nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. Ćelije koje izlučuju nukleinski fragment su poželjne korisne realizacije ovog pronalaska; one se mogu koristiti na maloj skali ili na velikoj skali, za pripremanje modifikovanog amiloidogenog polipeptida, ili u slučaju nepatogenih bakterija, kao konstituenti vakcine u živoj vakcini.
Kada se proizvode modifikovani molekuli iz ovog pronalaska pomoću transformisanih ćelija, pogodno je, mada daleko od toga da je to bitno, da se proizvod ekspresije ili prebaci u medijum kulture ili da se zadrži na površini transformisane ćelije.
Kada se identifikuje ćelija koja je efikasan proizvođač, poželjno je da se na osnovu nje uzgaji stabilan soj ćelija koje nose vektor iz ovog pronalaska i koje izlučuju fragment nukleinske kiseline koji kodira modifikovani amiloidogeni polipeptid. Poželjno je da ovaj stabilni soj ćelija izlučuje ili nosi analog iz ovog pronalaska, olakšavajući tako njegovo prečišćavanje.
Obično, plazmid vektori koji sadrže replikon i kontrolnu sekvenciju, a koji su izvedeni iz vrsta kompatibilnih sa ćelijama domaćina, se koriste povezani sa domaćinima. Vektor obično nosi mesto za replikaciju, kao i markerske sekvencije koje su u stanju da obezbede selekciju fenotipa u transformisanim ćelijama. Na primer,E. colise tipično transformiše korišćenjem pBR322, plazmida izvedenog iz vrstaE. coli(videti, npr. Bolivar et al., 1977). Plazmid pBR322 sadrži gene za rezistenciju prema ampicilinu i tetraciklinu i tako pruža jednostavan način za identifikaciju transformisanih ćelija. Plazmid pBR, ili drugi mikrobski plazmidi ili fage, takođe mora da sadrže, ili da se modifikuju da bi sadržali, promotere koje može za ekspresiju koristiti prokariotski mikroorganizam.
Oni promoteri koji se najčešće koriste u konstrukciji rekombinantne DNA su B-laktamaza (penicilinaza) i promoterski sistemi laktoze (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) i promoterski sistem triptofana (trp)
(Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Dok su ovi najčešće korišćeni, otkiveni
su i koriste se i drugi mikrobski promoteri, a detalji koji se odnose na njihove sekvencije nukleotida su objavljeni, omogućavajući verziranoj osobi da ih funkcionalno poveže sa plazmid vektorima (Siebwenlist et al., 1980). Neki geni iz prokariota se mogu izlučivati efikasno uE. coliiz njihovih vlastitih promotorskih sekvencija, sprečavajući potrebu za dodavanjem drugog promotera veštačkim putem.
Pored prokariota, mogu se koristi eukaritoski mikrobi, kao što su kulture kvasca, a i ovde promoter treba da je u stanju da izaziva ekspresiju. Obični pekarski kvasac, iliSaccharomyces cerevisiae,je načešće korišćeni među eukariotskim mikroorganizmima, mada su na raspolaganju i brojni drugi sojevi. Za ekspresiju uSaccharomycesobično se koristi, na primer, plazmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al. 1979; Tschemper et al., 1980). Ovaj plazmid već sadrži trpi gen, koji obezbeđuje selekcioni marker za mutirani soj kvasca, koji je izgubio sposobnost da raste u triptofanu, na primer ATCC No 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisustvo trpi lezije, kao kakrakteristika genoma kvaščevih ćelija domaćina, zatim pruža efikasnu sredinu za detekciju transformacije, rastom u odsustvu triptofana.
Podesne promotorske sekvencije u vektorima kvasca su promoteri za 3-fosfoglicerat kinazu (Hitzman et al., 1980) ili druge glikolitičke sisteme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofluktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza. Pri konstrukciji pogodnih plazmida za izlučivanje, terminacione sekvencije koje su povezane sa ovim genima su takođe povezane u vektoru 3' ekspresije sekvencije za koju se želi da bude izlučena da bi se obezbedilo poliadenilovanje mRNA i terminacija.
Drugi promoteri, koji imaju dodatnu pogodnost transkripcije kontrolisane uslovima rasta su region promotera za alkoholdehidrogenazu 2, izicitohrom C, kiselu fosfatazu, enzime za razgradnju koji su povezani sa metabolizmom azota i gore pomenta gliceralđehid-3-fosfat dehidrogenaza, i enzimi odgovorni za iskorišćenje altoze i galaktoze. Pogodan je svaki plazmid vektor koji sadrži promoter kompatibilan sa kvascem, i sekvencije početka replikacije i terminacije.
Pored mikroorganizama, kao domaćini se mogu koristiti takođe i kulture ćelija koje se izvode iz višećelijskih organizama. U principu, svaka takva kultura ćelija je upotrebljiva, bilo da je iz kulture kičmenjaka ili beskičmenjaka. Međutim, najveći interes je za ćelije kičmenjaka, a poslednjih godina propagacija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura (Tissue Culture, 1973). Primeri takvih korisnih ćelijskih sojeva domaćina su VERO i HeLa ćelije, sojevi ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), i W138, BHK, COS-7 293,Spodoptera frugiperda(SF) ćelije (komercijalno dostupne kao kompletni ekspresioni sistemi, npr. iz firme Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA i iz firme Invitrogen) i sojevi ćelja MDCK. U ovom pronalasku je naročito poželjan soj ćelija S2, koji je dostupan iz firme Invitrogen, P Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandija).
Ekspresioni vektori za te ćelije obično sadrže (ako je potrebno) početak replikacije, promoter lociran ispred gena koji treba da se izluči, zajedno sa bilo kojim potrebnim mestima za vezivanje ribozoma, mestima spajanja RNA, mestom za poliadenilovanje i transkripcionim sekvencijama terminatora.
Za upotrebu u ćelijama sisara, kontrolne funkcije na ekspresionim vektorima često obezbeđuje virusni materijal. Na primer, obično kirišćeni promoteri se izvode iz polioma, Adenovirusa 2, a najčešće iz Simian Virusa 40 (SV40). Rani i kasni promoteri virusa SV40 su naročito korisni, zato što se oba jednostavno dobijaju iz virusa, kao fragment koji sadrži takođe replikaciju SV40 virusnog porekla (Fiers et al., 1978). Mogu se takođe koristiti manji i veći fragmenti SV40, pod uslovom da su uključeni u sekvenciju od približno 250 bp, polazeći od mestaHind\\\prema mestuBg1\lociranom na virusnom početku replikacije. Dalje, moguće je takođe, a često i poželjno, da se koristi promoter ili kontrolne sekvencije normalno povezane sa željenom sekvencijom gena, pod uslovom da su kontrolne sekvencije kompatibilne sa sistemima ćelije domaćina.
Početak replikacije može se obezbediti ili konstrukcijom vektora da obuhvati egzogeni početak, kao što se može izvesti iz SV40 ili drugog virusa (npr. Polvoma, Adeno, VSV, BPV) ili se može obezbediti pomoću mehanizma replikacije hromozomalnih ćelija domaćina. Ukoliko je vektor integrisan u hromozom ćelije domaćina, poslednje je obično dovoljno.
Identifikacija korisnih analoga.
Verziranoj osobi je jasno da moguće vavriante ili modifikacije amiloidogenih polipeptida koji se nalaze u prirodi nemaju sposobnost da izazovu antitela u životinji, a unakrsno su reaktivne sa prirodnim oblikom. Međutim, nije teško da se uspostavi efikasan standardni test za modifikovane amiloidogene molekule koji ispunjavaju minimum zahteva za imunološku reaktivnost koja se ovde diskutuje. Dakle, sledeći deo ovog pronalaska se odnosi na postupak za identifikaciju modifikovanog amiloidogenog polipeptida koji je u stanju da izaziva antitela protiv nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida u životinjskoj vrsti, gde je nemodifikovani amiloidogeni polipeptid (ne-imunogeni) vlastiti-protein, postupak koji se sastoji od: - pripemanja, pomoću sinteze peptida ili tehnika genetskog inženjeringa, seta uzajamno odvojenih modifikovanih amiloidogenih polipeptida, pri čemu se aminokiseline dodaju, umeću, izbaciju ili supstituišu u sekvenciju aminokiselina amiloidogenog polipeptida životinjske vrste, dajući pri tome sekvencije aminokiselina u setu, koje sadrže epitope T-ćelije koji su strani toj životinjskoj vrsti, ili pripremanja seta fragmenata nukleinske kiseline koji kodiraju set uzajamno odvojenih modifikovanih amiloidognih polipeptida, - testiranje članova seta modifikovanih amiloidogenih polipetida ili fragmenata nukleinske kiseline u pogledu njihove sposobnosti da u životinjskoj vrsti izazovu proizvodnju antitela protiv nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida, i
- identifikovanje i opciono izolovanje člana (ili članova) iz seta modifikovanih amiloidogenih polipeptida koji značajno izaziva proizvodnju antitela protiv nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida u ovoj vrsti, ili identifikovanje ili opciono izolovanje proizvoda ekspresije polipeptida kodiranih sa članovima seta fragmenata nukleinske kiseline, koji značajno izazivaju proizvodnju antitela protiv nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida u životinjskoj vrsti.
U ovom kontekstu "set uzajamno odvojenih modifikovanih amiloidogenih polipeptida" je kolekcija ne-identično modifikovanih amiloidogenih polipeptida koji su npr. izabrani na bazi kriterijuma koji su diskutovani gore (npr. u kombinaciji sa ispitivanjem cirkulamog dihroizma, spektara NMR i spektara difrakcije X-zraka). Ovaj set može da se sastoji od samo nekoliko članova, ali se podrazumeva da taj set može da sadrži i nekolko stotina članova.
Test članova ovog seta može konačno da se obavljain vivo,ali mogu se primeniti brojni testoviin vitro,koji sužavaju broj modifikovanih molekula koji će služiti svrsi ovog pronalaska.
Pošto je cilj uvođenja stranih epitopa T-ćelije da se pomogne odgovor B-celija preko pomoći T-ćelija, preduslov je da je proliferacija T-ćelije izazvana modifikovanim amiloidogenim polipeptidom. Proliferacija T-ćelije se može testirati standardizovanim testovima proliferacijein vitro.Ukratko, uzorak obogaćen T-ćelijama, dobijen iz subjekta, se posle toga drži u kulturi. Kultivisane T-ćelije se dovedu u dodir sa APC subjekta, koji je prethodno uzeo modifikovani molekul, pa se procesira da bi prezentirao njegove epitope T-ćelije. Proliferacija T-ćelija se prati i poredi sa podesnom kontrolom (npr. T-ćelije u kulturi koja je u kontaktu sa APC koji ima procesiran nedirnut, urođeni amiloidogeni polipeptid). Alternativno, proliferacija se može meriti određivanjem koncentracije relevantnih citokina, koje oslobađaju T-ćelije kao odgovor na njihovo prepoznavanje stranih T-ćelija.
Pošto je veoma verovatno da je bar jedan modifikovani amiloidogeni polipeptid, bilo koga tipa iz seta, sposoban da izazove proizvodnju antitela protiv amiloidogenog polipeptida, moguće je pripremiti imunogeni preparat koji sadrži najmanje jedan modifikovani amiloidni polipeptid, koji je u stanju da izazove antitela protiv nemodifikovanog amiloidogenog polipeptida u životinjskoj vrsti, u kojoj je nemodifikovani amiloidogeni polipeptid vlastiti-protein, postupkom koji se sastoji od mešanja člana (ili članova) seta koji značajno izazivaju proizvodnju antitela u životinjskoj vrsti, koja su reaktivna sa amiloidogenim polipeptidom, sa farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili tečnim nosačem, i/ili razblaživačem, i/ili dodatkom, opciono u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvantom.
Gornji aspekti ovog pronalaska koji se osnose na test setova polipeptida, pogodno je da se obavljaju prvo pripremanjem brojnih uzajamno odvojenih sekvencija nukleinske kiseline ili vektora iz ovog pronalaska, umetanjem ovih u ogovarajuće ekspresone vektore, transformisanjem pogodnih ćelija domaćina (ili životinja domaćina) sa ovim vektorima, i ostvarivanjem ekspresije sekvencija nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. Ovi koraci mogu da slede nakon izolovanja proizvoda ekspresije. Poželjno je da se sekvencije nukleinske kiseline i/ili vektora pripremaju postupcima koji sadrže primenu tehnike molekularne amplifikacije, kao što je PCR, ili pomoću sinteze nukleinske kiseline.
Specifični amiloidogeni targeti.
Pored proteina APP, ApoE4 i Tau koji su najčešće povezani sa Alzheimer-ovom bolešću, postoji duga lista drugih proteina koji su na nekin način povezani sa AD, ili preko njihovog direktnog prisustva u plakovima ili čvorićima mozgova sa AD, ili njihovom jasnom genetskom povezanošću sa povećanjem rizika od razvijanja AD. Većina, ako ne i svi, ovi antigeni su, zajedno sa gore diskutovanim Ap, APP, presenilinom i ApoE4, navodni targeti proteina iz ovog pronalaska.
Alfal-antihimotripsin (ACT)je glavna komponenta SP i predloženo je da igra značajnu ulogu u patogenezi lezija u AD i cerebrovaskularnoj amiloidozi (CA)
{ Acta Nuropathol.1998, 96, 828-36). On stupa u interakciju sa Apin vitroi stimuliše i formiranje i raskidanje fibrila Ap-42{ JBC1998, 273, 28360-4).
Alfa2-makroglobulinje pronađen imuno-obojenjem u jezgrima plaka u mozgovima sa AD. Transmembranski fragment iz beta-subjedinice je nađen u jezgrima plaka, dok je rastvomi alfa fragment nađen u plakovima izvan ćelije.Acta Neuropatol.1998, 96, 628-36,i Brain. Res.1997, 77Z, 223-227.
ABAD (Ap-peptid koji vezuje alkohol dehldrogenazu)vezuje se sa Ap unutar ćelije. To je neuronski enzim u normalnim ćelijama, ali se pojačano izlučuje u neuronima koji su napadnuti sa AD. Ap je toksičniji za ćelije koje pojačano izlučuju ABAD. ABAD je povezan sa X-hromozomom. Yan,Nature,1997, 389.
APLP1 i -2 ( protein 1 i -2 nalik amiloidnom prekursoru):Oba proteina pripadaju proteinima APP homologne super-familije, ali im nedostaje Ap peptidni region. Ipak, postoji značajno bojenje APLP u neuritičkim plakovima.Acta Neuropathol 1997,94, 519-524.
AMY117je novo-otkriveni protein u lezijama, nalik plaku u mozgovima ljudi sa AD, koji je izgleda obilan, široko rasprostranjen i "visoko specifičan" za tu bolest. Sumnja se da protein AMY117 može da igra presudnu ulogu u razvoju i napredovanju AD, formiranjem ovih plakova. Interesantno je da plakovi koji sadrže AMY117 nisu ko-lokalizovani sa onim akoji sadrže Ap, definišući time novu karkaterističnu manifestaciju AD, pored dobro poznatih plakova koji sadrže Ap i čvorića koji sadrže Tau. Nađeno je da su plakovi pozitivni na AMY117 obilni u mozgovima sporadičnih slučajeva AD i u mozgovima ljudi sa Down-ovim sindromom, ali su "retki ili odsustvuju" u mozgovima kontrola i drugih neurodegenrativnih bolesti( Am. J. Pathol.1997,15_1, 69-80).
Bax:Monokionalna antitela detektuju Bax kao komponentu senilnih plakova u mozgovima sa AD. On je takođe pojačano izlučen u distrofičnom neuritisu.Acta Neuropathol.1998, 95, 407^12.
Bcl-2ima nejasnu ulogu. Pojačano se izlučuje u glijalnim ćelijama koje okružuju plakove.Acta Neuropathol.1998, 95, 407-412.
Bleomicin hidrolazaje možda beta-sekretaza. Imunoreaktivnost protiv bleomicin hidrolaze je nađena u SP kod AD( Brain Res.1999, 830, 200-202). Izvesni genotip bleomicin hidrolaze je povezan u nekim slučajevima sa povećanim rizikom od razvijanja AD, dok u drugim korelacija nije pronađena{ Ann. Neurol.1998, 44, 808-811, iAnn. Neurol.1999, 46, 136-137).
BRI/ABRI:ABRI je fragment od 4 kD navodnog transmembranskog proteina, koji kodira BRI gen na 13- hromozomu, a pronađen je u amiloidnim plakovima ljudi sa familijarnom britanskom demencijom (FBD). Ovi pacijenti imaju mutaciju u zaustavnom kodonu gena BRI koji kreira okvir očitavanja koji nije više otvoren. Oslobađanje 34 amino kiseline sa karboksi kraja izmenjenog proteina generiše amiloidnu subjedinicu ABRI. Antitela protiv ABRI prepoznaju i parenhimalne i vaskulame lezije u mozgu pacijenata od FBD. ABRI peptid se taloži kao amiloidni fibrili, a nastali plakovi smatra se da dovode do neuronske disfunkcije i demencije koja karakteriše FBD (Vidal, R. et al.,Nature1999, 399).
Hromogranin Aje detektovan u nekim difuznim amiloidnim naslagama i u distrofičnim neuritima koji ih okružuju( Brain Res.1991, 539, 143-50).
Clusterin/apoJ:Ovo je gen koji se često izoluje diferencijalnim ispitivanjima u laboratoriji, iz raznih oblasti molekularne biologije, zato što se povećano izlučuje u brojnim slučajevima degenerativnih bolesti, kao što su AD i scrapie (Michel D., Chatelain G., North S., Brun G.,Bichem J.1997, 328(1), 45-50.
CRF (faktor oslobađanja kortikotropina) vezujući proteinpovezuje 41 aa CRF peptid, koji je značajan regulacioni faktor u odgovrima na stres u mozgu. Kao i većina CRF vezan je sa CRF vezujućim proteinom, uklanjanje CRF vezujućeg proteina (imunoterapijom) može da dovde do povećanog sadržaja slobodne CRF, za koju se smatra da ima pozitivan efekat protiv AD. Behan,J. Neurochemistry1997, 68, 2053-2060.
EDTF (toksični faktor izvedenizendotelijuma):Protein koji proizvode mikro-krvni sudovi kod pacijenata sa AD. Toksičan je specifično prema neuronskim ćelijama. WO 99/24468.
Heparansulfat proteoglikanipokazano je da se ko-lokalizuju sa Ap u SP-ima. Ispitivanja na pacovima pokazuju da je heparansulfat glikozaminoglikan neophodan pri stvaranju amiloidnog vlakna( Neuron1994, 12, 219-234, iActa Neuropathol.1998, 96, 628-36).
Humani protein-2 medijator odgovora na kolapsinje protein od 65 kDa, koga monoklonalno antitelo prepoznaje u neurofibrilamim čvorićima. Ugradnja u čvoriće može da osiromaši rastvomi protein i da dovede do abnormalnog neuritskog izrastanja, ubrzavajući tako degeneraciju neurona.JBC1998, 273. 9761-8.
Huntungtin (protein Huntington-ovebolesti): Kod HD protein Huntingtin se širi sa N-kraja sa poliglutaminom. Ovaj oblik Huntingtina je nađen takođe u mozgovima od NFT i AD i u Pick-ovoj bolesti( Exp. Neurol.1998, 150, 213-222).
ICAM-Ise akumulira u SP.Acta neuropathol.1998, 96, 628-36, iAm. J. Pathol.1994, 144, 104-16.
IL-6je povezan sa neurofirilamim promenama i nađen je u centru plakova. Predložen je kao starterski događaj u AD. Jako je pojačan u astrocitima sa aktivnim peptidom 25-35 iz Ap.Brain Res.1997, 777, 223,227, ii Behav,Brain Res.1996, 78, 37-41.
Antigen CD68 povezan sa lizozomomse prepoznaje kao antitelo KP-1 u NFT i SP. Dakle, lizozomi mogu igrati ulogu u stvaranju čvorića i plakova.Dement. Geriatr. Cogn. Disord.1998, 9, 13-19.
P21 rasučestvuje kao primarni korak u povišenju faktora rasta i mitogena, koji se zapažaju u ranim fazama razvoja AD.Neuroscience,1999, 91, 1-5.
PLC-delta 1 (izoenzim fbsfolipaza C delta 1)je abnormlano akumuliran u NET i neuritima koji okružuju jezgra plaka. Unutarćelijski je.Alzheimer Dis. Assoc. Disord.1955,9, 15-22.
Serumska komponenta amiloida P (SAP)je normalni konstituent plazme koji je prisutan u svim tipovima amiloidnih naslaga, uključujući one kod AD( JBS1995, 270. 26041-4). Opažen je i kod SP i kod NFT. U nekim ispitivanjima je pokazano da promoviše agregaciju Ap i sprečava proteolizu fibrila[ Biochem. Biophys. Res. Commun.1995, 211 349v-53, iPNAS1995, 92, 4299-4303) dok druga studija pokazuje da SAP inhibira stvaranje Ap fibrila( JBC1995, 270, 26041-4).
Sinaptofizinje otkriven u nekim difuznim naslagama amiloida i u okruženju distrofičnih neurita( Brain Res.1991, 539, 143-50).
Sinuklein (alfa-sinukein ili NACP):beta komponenta koja nije A, u AD amiloidu (NAC) je identifikovana biohemijski kao druga glavna komponenta u amiloidu prečišćenom iz moždanog tkiva pacijenata od AD. NAC, koji se izvodi iz njegovog prekursora, dugog 140 aminokiselina, NACP, dugačak je najmanje 35 aminokiselina (NAC35), mada njegov amino kraj nije definitivno određen. NAC monoklonalno antitelo imunoboji SP u mozgovima od AD, ali ne reaguje sa NACP (lwai A., Yoshimoto M., Masliah E., Saitoh, T.,Biochemistry1995, 34(22), 10139-10145). NAC vlastiti-oligomeri u prisustvu Ap. Novi dokaz ukazuje na potencijalnu ulogu ovog molekula u sinaptićkom oštećenju i neurotoksičnosti, preko stvaranja fibrila nalik-amiloidu i mitohondrijalne disfunkcije.Brain Pathol.1999, 9(4), 707-20,FEBS Leti.1998, 421, 73-76. Deo NACP ima visoku homologiju sa C-krajem amiloidnog frgamenta APP i sa regionom proteina scrapie priona (prPSc). Sinuclein je glavni uzročni faktor Parkinson-ove bolesti{ Chem. Biol.1995, 2. 163- 9).
TGF-b1 (transformacioni faktor rasta b1):Povećano izlučivanje TGF-b1 sa mutantom APP kod TG miševa ubrzava taloženje Ap. Dakle, veruje se da TGF-b1 učestvuje u počinjanju ili promociji formiranja amiloidnog plaka (Wyss-Coray,Nature1997, 389).
Ostale amiloidne bolesti i proteini povezani sa njima.
Pored gore pomenutih proteina koji su potencijalni učesnici u AD i bolestima sličnim AD (Huntington-ova, Parkinson-ova, FBD i drugi oblici demencije), postoji relativno veliki broj bolesti, različitih od AD, gde formiranje amiloida učestvuje u startovanju bolesti ili u izazivanju simptoma bolesti. Mada proteini koji učestvuju u tim bolestima variraju po prirodi, oni dele iste karakteristike koje definišu amiloid, videti gore. U Tabeli koja sledi naveden je broj ovakvih amiloidnih poremećaja i proteini koji ih izazivaju.
Raznovrsnost proteina amiloidnog fibrila
Ovi proteini su, kao i proteini koji učestvuju u AD, avi potencijalni ciljevi za strategiju imunizacije koja se ovde predlaže.
Podrazumeva se da većina metoda za imunizovanje protiv amiloidogenih polipeptida treba da bude ograničena na imunizaciju koja vodi antitelima koja su unakrsno reaktivna sa urođenim amiloidogenim polipeptidom. Ipak, u nekim slučajevima postoji interes da se izazove ćelijski imunitet u obliku CTL odgovora protiv ćelija koje predstavljaju epitope MH klase I iz amiloidogenih polipeptida - to može biti umesno u onim slučajevima u kojima smanjenje broja ćelija koje proizvode amiloidogene polipeptide ne pravi ozbiljan štetan efekat. U takvim slučajevima, gde su poželjni odgovori CTL, poželjno je da se koristi znanje iz PCT/DK99/00525 podnosioca ove prijave (koji odgvara USSN 09/413,186). Opisi ova dva dokumenta su priključeni ovde kroz citat.
U primerima koji slede i nemaju organičenja, težiše je stavljeno na razvijanje autovakcine zasnovane na Ap protiv AD. Međutim, principi koji su izneti ovde jednako važe za bilo koji protein.
Primer 1
Pristup autovakcinacije za imunizaciju protiv AD
Činjenica da Ap protein nokautiranih miševa ne pokazuje bilo kakve abnormalnosti ili štetne sporedne efkete, ukazuje da će uklanjanje ili sniženje količina Ap biti sigurno, Sheng H. (1996).
Objavljeni eksperimenti u kojima su transgenske životinje imunizovane protiv transgenskog humanog Ap proteina ukazuju da ukoliko bi bilo moguće raskinuti vlastitu toleranciju, da bi se deregulacija Ap mogla dobiti auto-reaktivim antitelima. Ovi eksperimenti dalje ukazuju da takva deregulacija Ap potencijalno bi mogla sprečiti formiranje plaka i čak počistiti već stvorene Ap plakove iz mozga, videti Schenk et al. (1999). Ali, tradicionalno nije moguće podići antitela protiv vlastitih proteina.
Objavljeni podaci tako ne pružaju način za razbijanje istinske vlastite tolerancije prema istinskim vlastitim proteinima. Niti podaci pružaju informacije kako osigurati da imuno reakcija bude usmerena samo ili prvenstveno prema naslagama Ap, a ne prema ćelijskoj membrani vezanoj sa Ap prekursorskim proteinom (APP), ako se ovo smatra neophodnim. Imuno odgovor generisan upotrebom postojeće tehnologije nesumnjivo bi generisao imuno odgovor prema vlastitim proteinima na neregulisan način, pa bi mogla da se generiše neželjena i preterana auto-reaktivnost prema delovima Ap proteina. Dakle, korišćenjem strategija imunizacije bilo bi najverovatnije nemoguće generisati jake imuno odgovore prema vlastitim proteinima, a pored toga to ne bi bilo sigurno usled potencijalne ukrštene reaktivnosti prema vezanom APP u membrani, koji je prisutan u velikom broju ćelija u CNS.
Ovaj pronalazak pruža način efikasnog generisanja jakog, regulisanog imuno odgovora prema pravim vlastitim proteinima koji bi potencijalno mogli da formiraju plakove i izazovu ozbiljnu bolest u CNS ili u drugim delovima tela. Sigurna i efikasna terapeutska vakcina humanog Ap proteina, za tretiranje AD, će se razviti korišćenjem ove tehnologije.
U svetlu ovoga moguće je anticipirati da bi AD, bolest za koju se predviđa da će paralizovati sistem zdravstvene nege u sledećem stoleću, mogla da se leći, ili tako opisane vakcine bi mogle bar da učine efikasan terapeutski pristup tretmanu simptoma i napredovanja ove bolesti.
Ova tehnika predstavlja potpuno nov imunološki pristup blokiranju taloženja amiloida kod AD i isto tako kod drugih neuroloških bolesti.
U sledećoj tabeli pokazano je 35 razmotrenih konstrukata. Sve date pozicije u ovoj tabeli su relativne prema polaznom metioninu iz APP (prva aminokiselina u SEQ ID NO: 2) i uključuju i polaznu u završnu aminokiselinu, npr. fragment 672-714 obuhvata obe aminokiseline, 672. i 714. Polazna i krajnja pozicija za P2 i P30 pokazuje da epitop supstituiše deo fragmenta APP na pokazanim pozicijama (obe pozicije su obuhvaćene supstitucijom) u većini konstrukata, uvedeni epitopi supstituišu fragment dužine epitopa. Posebno izdajamo konstrukte 2, 3 i 34, odnosno: analog koji se od N- do C- kraja sastoji od aminokiselinskih ostataka 630-634 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:6, pa zatim SEQ ID NO:4 nakon čega slede aminokiselinski ostaci 671-714 u SEQ ID NO:2 , zatim analog koji se od N- do C-kraja sastoji od aminokiselinskih ostataka 672-713 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:6, nakon čega slede aminokiselinski ostaci 729-734 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:4 nakon čega slede aminokiselinski ostaci 750-770 u SEQ ID NO:2 i analog koji se od N- do C-kraja sastoji od aminokiselinskih ostataka 672-714 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:4, nakon čega slede aminokiselinski ostaci 672-714 u SEQ ID NO:2 pa zatim SEQ ID NO:6, nakon čega slede aminokiselinski ostaci 672-714 u SEQ ID NO:2, respektivno.
Zvezdice u ovoj tabeli imaju sledeća značenja:
<*>) Samo jedna pozicija za P2 i P30 ukazuje da je epitop bioumetnutu derivat APP na naznačenjoj poziciji (epitop počinje na aminokiselini sa C-kraja, susednoj datoj poziciji).<**>) Konstrukt 34 sadrži tri identična fragmenta APP razdvojena sa P30 i P2, respektivno.<***>) Konstrukt 35 sadrži devet identičnih fragmenata APP, razdvojenih naizmenično sa epitopima P30 i P2.
Deo APP, protiv koga je najinteresantnije generisati odgovor, je 43 aminokiselina jezgra peptida Ap (Ap-43^ odgovara u SEQ ID NO: 2, ostacima 672-714), a to je glavni konstituent amiloidnih plakova u mozgovima sa AD. Ovaj fragment APP je deo svih kinstrukcija koje su navedene gore.
Varijante 1 i 2 sadrže deo APP uzlazno do Ap-43, gde su smešteni model-epitopi P2 i P30. Varijante 1 i 3-8, sve sadrže fragment C-100 za koga je pokazano da je nervnotoksičan - fragment C-100 odgovara ostacima aminokiselina 714-770 u SEQ ID NO: 2. U varijantama 3-5 epitopi supstituišu deo fragmenta C-100, dok su u varijantama 6-8 bili umetnuti u C-100.
Varijante 9-35 sadrže samo jezgro proteina Ap-43. U varijanata 9-13, P2 i P30 su spojeni na svaki od krajeva Ap-43; u 14-21 P2 i P30 supstituišu deo Ap-43; u 22-33 P2 i P30 su umetnuti u Ap-43; 34 sadrži tri identična fragmenta Ap-43 razdvojena sa P30 i P2, respektivno; 35 sadrži 9 ponavljanja Ap-43 razmaknutih naizmenično sa epitopima P2 i P30.
Za detalje videti Sliku 1 i gornju tabelu.
Sledea tip konstrukta je posebno poželjan. Pošto je jedan od ciljeva ovog pronalaska da se izbegne destrukcija ćelija koje proizvode APP, dok je uklanjanje Ap poželjno, čini se izvedivim pripremanje konstrukata autovakcine koji sadrže samo delove Ap koji nisu izloženi vanćeljskoj fazi, kada su prisutni u APP. Dakle, takvi konstrukti treba da sadrže najmanje jedan epitop B-ćelije, koji se izvodi iz fragmenta aminokiselina koga definišu aminokiseline 700-714 u SEQ ID NO:2. Pošto se predviđa da je tako kratak fragment polipeptida slabo imunogen, poželjno je da se takav konstrukt autovakcine sastoji od nekolko kopija epitopa B-ćelije, npr. u obliku konstrukta koji ima strukturu pokazanu u Formuli I u detaljnom opisu ovog pronalaska, videti gore. U toj verziji Formule I, članovi amiloidei-amiloid« su x epitopa B-ćelije koji sadrže sekvencije aminokiselina koji se izvode iz aminokiselina 700-714 u SEQ ID NO:2. Poželjna alternativa je gornja detaljna mogućnost kuplovanja amiloidogenog (poli)peptida i odabranog stranog epitopa T-helpera, preko amidne veze na polisahardinom molekulu nosača - na taj način postaje moguća višestruka prezentacija "slabog" epitopa, sačinjenog od aminokiselina 700-714 u SEQ ID NO:2, a takođe postaje moguće da se izabere optimalan odnos između epitopa B-ćelije i T-ćelije.
Primer 2
Imunizacija transgenskih miševa sa Ap i modifikovanim proteinima
u skladu sa ovim pronalaskom
Konstrukcija hAB43+-34 koji kodira DNA.Gen hAB43+-34 se konstruiše u nekoliko koraka. Prvo se generiše PCR fragment sa prajmerima ME#801 (SEQ ID NO: 10) i ME#802 (SEQ ID NO: 11), korišćenjem prajmera ME#800 (SEQ ID NO: 9) kao šablona. ME#800 kodira humani Abeta-43 fragment sa optimizovanim kodonimaE. coli.ME#801 i 802 dodaju odgovarajuća restrikciona mesta tom fragmentu.
PCR fragment se prečisti, digestira saAfcoliHind\\\,ponovo prečisti i klonira, u digestiran saNco\- Hind\\\i prečišćen, pET28b+ ekspesioni vektorE. coli.Dobijeni plazmid koji kodira divlji tip humanog Ap-43 je nazvan pAB1.
U sledećem koraku epitop T-helpera, P2 se doda sa C-kraja molekula. Prajmer ME#806 (SEQ ID NO: 12) sadrži sekvenciju koja kodira epitop P2, generišući tako spajanje P2 i Abeta-43 pomoću PCR reakcije.
Kloniranje se obavlja pravljenjem PCR fragmenta sa prajmerima ME#178 (SEQ ID NO: 8) i ME#806, koristeći pAB1 kao šablon. Fragment se prečisti, digestira saNco\iHindlH,ponovo prečisti i klonira u, digestiran i prečišćen saNco\-HindlU,vektor pET28b+. Dobijeni plazmid je nazvan pAB2.
Na analogan način je napravljen sledeći plazmid, okupljanjem kodirajuće sekvencije Ap-43 sa drugim epitopom T helpera, P30, dodavanjem sa N-kraja. Ovo je obavljeno pravljenjem PCR fragmenta sa prajmerima ME#105 (SEQ IDN0.7) i ME#807 (SEQ ID NO. 13), koristeći pAB1 kao šablon.
Ovaj fragment se prečisti, digestira saA/coliHindUl,ponovo prečisti, pa klonira u, digestiran i prečišćen saNco\- Hind\\\,vektor pET28b+. Dobijeni plazmid je nazvan pAB3.
U tećem koraku, drugo ponavljanje Ap-43 se doda sa C-kraja epitopu P2 plazmida pAB2, pomoću prajmera ME#809 (SEQ ID NO: 14). ME#809 u isto vreme kreira mesto BamH\, odmah posle ponavljanja Ap-43. Napravi se fragment PCR sa prajmerima ME#178 i ME#809, koristeć pAB2 kao šablon. Ovaj fragment se digestira sa A/col iHind\\\,prečisti i klonira u, digestiran i prečišćen saNco\- Hind\\\,vektor pET28b+. Ovaj plazmid je nazvan pAB4.
Konačno, epitop P30 - ponovljena sekvencija Ap-43 iz pAB3 se klonira u plazmid pAB4. Ovo se obavi pravljenjem PCR fragmenta sa prajmerima ME#811 (SEQ ID NO: 16) i ME#105, koristeći pAB3 kao šablon. Ovaj fragment se pečisti i koristi kao prajmer u narednom PCR, sa ME#810 (SEQ ID NO: 15), koristea pB3 kao šablon. Dobijeni fragment se prečisti, digestira sa BamHI iHind\\\i klonira u, saBam\- Hind\\\digestiranim i prečišćenim, plazmid pAB4. Dobijeni plazmid, pAB5, kodira molekul hAB43+-34.
Sve procedure PCR i kloniranja se obavljaju u suštini kako je opisano u Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Mainatis, T:, "Molecular cloning: a laboratorv manual", 1989, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv, N.Y.
Za sve procedure kloniranja korišćene su ćelije K-12E. coli,soja Top-10 F'
(Stratagene, USA). Vektor pET28b+ je poručen iz firme Novagen, USA. Svi prajmeri su sintetizovani u firmi DNA Technologv, Danska.
Ekspresijai prečišćavanje hAB43+-34. Protein hAB43+-34 kodiran sa pAB5 se izlučuje u ćelijamaE. coliBL21-Gold (Novagen), kao što je propisao dostavljač sistema pET28b+ (Novagen).
Izlučeni protein hB43+-34 se prečisti do čistoće veće od 85% pranjem inkluzionih tela, posle koga sledi katjon-izmenjivačka hromatografija, korišćenjem stanice za prečišćavanje BioCad (perSeptive Biosvstems, USA), u prisustvu 6M uree. Ova urea se zatim ukloni stupnjevitom dijalizom sa rastvorima koji sadrže opadajuće količine uree. Krajnji pufer je bio 10 mM Tris, sa pH 8,5.
Ispitivanjeimunizacije. U ovom ispitivanju su korišćeni miševi transgenski za humani APP (prekursorski protein Alzheimer-ove bolesti). Ovi miševi, nazvani TgRND8+, izlučuju mutirani oblik APP, što dovodi do visoke koncentracije Ap-40 i Ap-42 u mozgu miševa (Janus, C, et al.).
Ovi miševi (8-10 miševa u grupi) su imunizovani ili sa Abeta-42 (SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714, sintetizovani standardnom strategijom Fmoc) ili sa hAB43+-34 varijantom (konstrukt 34 u Tabeli u Primeru 1, proizveden rekombinantno), četiri puta u intervalima od dve nedelje. Doze su bile ili 100 mg za AB, ili 50 mg za hAB43+-34. Miševima je uzeta krv 43. dana (posle tri injekcije), i posle 52. (posle četvrte injekcije), a serumi su korišćeni za određivanje nivoa specifičnih titara anti-Ap-42, korsteći direktno Ap-42 ELISA.
Sledeća tabela pokazuje srednje relativne titre anti-Abeta-42
Jasno je da su titri antitela, dobijeni kada je imunizacija obavljena sa Ap varijantom hAB43+-34 približno 4 puta i 7,5 puta veći posle 3. i 4. imunizacije, respektivno, nego titri dobijeni kada se koristi neizmenjen divlji tip Ap-42 kao imunogen. Ova činjenica otvara dalju perspektivu, kada se razmotri činjenica da je količina varijante upotrebljene za imunizaciju bila samo 50% od količine sekvencije divljeg tipa upotrebljene za imunizaciju.
Primer 3
Sinteza vakcine A/ 3 peptid kopoiimer korišćenjem aktiviranog
poli- hidroksipolimera kao agensa za ukršetno vezivanje
Uvod. Tradicionalna konjugat vakcina se sastoji od (poli)peptida kuplovanog kovalentno na proteinski nosač. Peptid sadrži epitop(e) B-ćelije, a proteinski nosač daje epitope T-helpera. Međutim, većina proteinskih nosača je normalno irelevantna kao izvor epitopa T-helpera, zato što samo manji deo ukupne sekvencije sadrži relevantne epitope T-helpera. Ti epitopi se mogu definisati i sintetizovati kao peptidi sa npr. 12-15 aminokiselina. Ukoliko su ovi peptidi povezani kovalentno sa peptidima koji sadrže epitope B-ćelije, npr. preko viševalentnog aktiviranog poli-hidroksipolimera, može se dobiti molekul vakcine koji sadrži samo relevantne delove. Dalje, moguće je dobiti konjugat vakcine koji sadrži optimizovan odnos epitopa B-ćelije i T-ćelije.
Sinteza aktiviranog poli-hidroksipolimera.Poli-hidroksipolimeri kao što su dekstran, škrob, agaroza itd. se mogu aktivirati sa 2,2,2-trifluoroetansulfonil-hloridom (tresilhloridom), ili uz pomoć homogene sinteze (dekstran) rastvaranjem u N-metilpirolidinonu (NMP) ili pomoću heterogene sinteze (škrob, agaroza, umreženi dekstran), npr u acetonu.
Doda se 225 mL suvog N-metilpirolidinona (NMP), pod anhidrovanim uslovima, u smrazvanjem osušeni dekstran koji je rastvoran u vodi (4,5 g, 83 mmol, klinički kvalitet, Mw (srednja) 78000) u balon od 500 mL okruglog dna, opremljen magnetom za mešanje. Balon se stavi u uljano kupatilo na 60°C, uz magnetno mešanje. Temperatura se tokom 20 min podigne na 92°. Kada se dekstran rastvori balon se odmah ukloni iz uljanog kupatila, a temperatura u kupatilu se snizi na 40°C. Balon se ponovo stavi u uljano kupatilo, uz magnetno mešanje, pa se u kapima dodaje tresilhlorid (2,764 mL, 25 mmol). Posle 15 min u kapima se dodaje suv piridin (bezvodni, 2,020 mL, 25 mmol). Balon se ukloni iz uljanog kupatila i meša 1 h na sobnoj temperaturi. Proizvod (dekstran aktiviran tresilom, TAD) se istaloži u 1200 mL hladnog etanola (99,9%). Dekantira se bistri sloj, a talog se sakupi u polipropilensku epruvetu od 50 mL i centrifugira sa 2000 o/min. Talog se rastvori u 50 mL 0,5% sirćetne kiseline, 2 puta dijalizuje, prema 5000 mL 0,5% sirćetne kiseline i suši smrzavanjem. TAD se može skladištiti na -20°C, kao prah osušen smrzavanjem.
Nerastvomi poli-hidroksipolimer, kao što je agaroza ilii umreženi dekstran, može se aktivirati tresilom pravljenjem suspenzije poli-hidroksipolimera u npr. acetonu, pa se obaviti sinteza kao sinteza na čvrstoj fazi. Aktivirani poli-hidroksipolimer se može sakupiti filtriranjem. Pogodne metode su objavljene u npr. Nilsson K. i Mosbach K.,Methods in Enzymology1987, 135, 67, i u Hermansson G.T. et al, "Immobilized Affinitv Ligand Techniques", 1992, Academic Press, Inc., str. 87.
Sinteza vakcina A beta peptid kopolimeriRastvori se TAD (10 mg) u 100 uL H20 i 1000 uL karbonatnog pufera pH 9,6, koji sadrži 5 mg A<b->42 (SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714), 2,5 mg P2 (SEQ ID NO: 4), pa se doda 2,5 mg P30 (SEQ ID N: 6). AB-42 i peptidi P2 i P30, svi imaju zaštićene lizinske grupe; one su obliku 1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)etil (Dde) zaštićenih lizinskih grupa. Peptidi se dobijaju standardnom strategijom Fmoc, gde je konvencionalni Fmoc-Lys(Boc)-OH zamenjen sa Fmoc-Lys-(Dde)-OH (dobijen iz firme Novabiochem, cat. No. 04.12.1121), tj. e-amino grupa u lizinu je zaštićena sa Dde, umesto sa Boe.
Odnos između epitopa B-ćelije (AB) i epitopa T-helpera (P2 i P30) u finalnom proizvodu može se varirati korišćenjem različitih koncentracija ovih peptida u koraku sinteze. Pored toga, na finalni proizvod može da se zakači npr. manoza (tako da se targetira konjugat u APC), dodavanjem aminovane manoze u karbonatni pufer, u koraku sinteze.
Ukoliko se koristi aktivirani poli-hidroksipolimer za kombinovanje peptida koji sadrže epitop B-ćelije i epitope T-helpera, kuplovanje na polimer se može obaviti kao sinteza na čvrstoj fazi, a finalni proizvod sakupiti i prečistiti pranjem i filtriranjem.

Claims (41)

1. Upotreba agensa odabranog od: a) najmanje jednog analoga životinjskog autologa Af3 (beta amiloid) ili APP (amiloid prekursor protein) popileptida gde je uveden najmanje jedan izolovan strani T epitop pomagač (THepitop) umetanjem, dodavanjem, delecijom ili supstitucijom amino kiselina, pri čemu strani THepitop nema D-amino kiseline i uveden je u autologi A{3 ili APP kao što je šematski dato za epitope P2 i P30 na slici 1, b) sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira najmanje jedan analog definisan pod a), i c) nepatogeni mikroorganizam ili virus koji nosi fragment nukleinske kiseline definisan pod b), za dobijanje leka koji sadrži agens za lečenje i/ili prevenciju i/li ublažavanje Alzheimer-ove bolesti ili drugih bolesti i stanja koja su okarakterisana depozitima Ap kod životinja
2. Upotreba prema Zahtevu 1, naznačena time, što uvođenje dovodi do toga da je sačuvana frakcija Ap ili APP epitopa B-ćelija i to da je uvedena bar jedna prva grupa koja utiče na ciljanje analoga na antigen-prezentujuću ćeliju (APC) ili na B-limfocit, i/ili uvedena bar jedna druga grupa koja sitmuliše imuni sistem i/ili uvedena bar jedna treća grupa koja optimizuje prezentaciju autologa imunom sistemu.
3. Upotreba prema Zahtevu 2, naznačena time, što je analog modifikovan uvođenjem bočnih grupa, kovalentnim ili nekovalentnim vezanjem za odgovarajuće hemijske grupe u Ap, APP, ili njihove sekvence, prve i/ili druge i/ili treće grupe.
4. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, naznačena time, što analog obuhvata duplikaciju najmanje jednog Ap ili APP epitopa B-ćelija i/ili uvođenje haptena.
5. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, gde strani epitop T-ćelija je imunodominantan kod životinja.
6. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, gde strani epitop T-ćelije je promiskuitetan, kao što je strani epitop T-ćelije koji se bira između prirodnog promiskuitetnog epitopa T-ćelije i veštačke peptidne sekvence koja vezuje MHC-II.
7. Upotreba prema zahtevu 6, gde je prirodni epitop T-ćelije odabran od epitopa anatoksina tetanusa, kao što je P2 ili P30, epitopa anatoksina difterije, epitopa hemaglutinina virusa gripa, i epitopaP. falciparumCS.
8. Upotreba prema jednom od zahteva 2-7, gde je prvi ostatak specifičan vezujući partner za specifične površine antigena B-limfocita, ili za specifične površine antigena APC, kao što je hapten ili ugljeni hidrat, za koji postoji receptor na B-limfocitu ili na APC.
9. Upotreba prema jednom od zahteva 2-8, gde je drugi ostatak odabran od citokina, kao što je interferon y (IFN-y) ili njegov efikasni deo, Flt3L ili njegov efikasni deo, interleukin 1 (IL-1) ili njegov efikasni deo, interleukin 2 (IL-2) ili njegov efikasni deo, interleukin 4 (IL-4) ili njegov efikasni deo, interleukin 6 (IL-6) ili njegov efikasni deo, interleukin 12 (IL-12) ili njegov efikasni deo, interleukin 13 (IL-13) ili njegov efikasni deo, interleukin 15 (IL-15) ili njegov efikasni deo, stimulacioni faktor kolonije granulocit-makrofaga (GM-CSF) ili njegov efikasni deo, hormon i protein toplotnog šoka, kao što je HSP70 ili njegov efikasni deo, HSP90 ili njegov efikasni deo, HSC70 ili njegov efikasni deo, GRP94 ili njegov efikasni deo, i kalretikulin (CRT) ili njegov efikasni deo.
10. Upotreba prema jednom od zahteva 2-9, gde je treći ostatak po prirodi lipid, kao što je palmitoil grupa, miristil grupa, femezil grupa, geranil-geranil grupa, GPI -anker i N-acildigliceridna grupa, ili što je treći ostatak, polihidroksipolimer, kao stoje polisaharid.
11. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, gde je autolog Ap ili APP modifikovan tako da se očuvaju epitopi B-ćelije koji nisu izloženi vanćelijskoj fazi, kada je prisutan u ćelijski -vezanom obliku autologa APP.
12. Upotreba prema zahtevu 11 pri čemu su Ap ili APP tako modifikovani tako da nedostaje najmanje jedan epitop B-ćelije koji je izložen vanćelijskoj fazi, kada je prisutan u ćelijski- vezanom obliku autologa APP.
13. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, koja obuhvata supstituciju najmanje jedne aminokiselinske sekvence unutar autologa Ap ili APP sa sekvencom aminokiselina jednake ili različite dužine, koja tom analogu daje strani epitop TH.
14. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, gde analog obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinama 672-714 u SEQ ID NO: 2, pri čemu je umetnuta sekvenca aminokiselina koja daje strani epitop THu analogu, ili što analog obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinama 672-714 u SEQ ID NO: 2, gde je najmanje jedna aminokiselinska sekvenca supstituisana aminokiselinskom sekvencom jednake ili različite dužine, tako da daje strani epitop Th-
15. Upotreba prema jednom od zahteva 1-13, pri čemu se analog od N- do C-kraja sastoji od aminokiselinskih ostataka 672-714 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:4, nakon čega slede aminokiselinski ostaci 672-714 u SEQ ID NO:2 pa zatim SEQ ID NO:6, nakon čega slede aminokiselinski ostaci 672-714 u SEQ ID NO:2.
16. Upotreba prema jednom od zahteva 1-13, pri čemu se analog N- do C-kraja sastoji od aminokiselinskih ostataka 630-634 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:6, pa zatim SEQ ID NO:4 nakon čega slede aminokiselinski ostaci 671-714 u SEQ ID NO:2.
17. Upotreba prema jednom od zahteva 1-13, pri čemu se analog od N- do C-kraja sastoji od aminokiselinskih ostataka 672-713 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:6, nako nečga slede aminokiselinsk ostaci 729-734 u SEQ ID NO:2, zatim SEQ ID NO:4 nakon čega slede aminokiselinski ostaci 750-770 u SEQ ID NO:2.
18. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, pri čemu su najmanje dve kopije analoga kovalentno ili nekovalentno vezane za molekul nosača koji može da ostvari prezentacije višestrukih kopija antigenskih determinanti.
19. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, pri čemu su analozi formulsani sa adjuvansom koji olakšava raskidanje autotolerancije prema auto-antigenima.
20. Upotreba prema jednom od prethodnih zahteva, pri čemu se efikasna količina analoga administrira životinji, putem odabranim od parenteralnog, kao što su intrakutani, subkutani i intramuskulami; peritonealnog; oralnog; bukalnog; sublingvalnog; epiduralnog ; spinalnog; analnog i intrakranijalnog.
21. Upotreba prema zahtevu 20, naznačena time, što je efikasna analoga između 0,5 ug i 2000 pg.
22. Upotreba prema Zahtevu 20 ili 21, gde se analog nalazi u uređaju virtuelnog limfnog čvora (VLN).
23. Upotreba prema jednom od zahteva 1-17, gde smanjenje količine obuhvata uvođenje nukleinske kiseline (ili kiselina) koja kodira analog u ćelije životinje, čime se postižein vi% oekspresija ćelija uvedene nukleinske kiseline (ili kiselina).
24. Upotreba prema zahtevu 23, pri čemu je uvedena nukleinska kiselina (ili kiseline) odabrana od tzv. gole DNK, DNK formulisane sa naelektrisanim ili nenaelektrisanim lipidima, DNK formulisane u lipozome, DNK uključene u viralni vektor, DNK formulisane sa proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNK formulisane sa ciljnim proteinom ili polipeptidom, DNA formulisane sa agensima za taloženje kalcijuma, DNK kuplovane u molekul inertnog nosča, DNK enkapsulirane u hitin ili hitosan i DNK formulisane sa adjuvansom.
25. Upotreba prema zahtevu 24, pri čemu se nukleinska kiselina (ili kiseline) nalazi u uređaju VLN.
26. Upotreba prema jednom od Zahteva 21 do 25, koje obuhvata najmanje jednu administraciju/uvođenje godišnje, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 6 i najmanje 12 adminsitracija/uvođenja.
27. Upotreba prema jednom od zahteva 1-17, gde lečenje, prevencija i/ili ublažavanje obuhvata administriranje ne-patogenih mikroorganizama ili virusa koji nose fragment nukleinskih kiselina koji kodira i eksprimira analog.
28. Analog amiloidogenog polipeptida koji je izvođen iz autologa Ap (beta amiloid) ili APP (amiloidni perkursor protein ) životinje, naznačen time, što se uvodi najmanje jedan izolovan strani THepitop (T pomagač) kao što je prikazano za epitope P2 i P30 na Slici 1, tako da imunizacija životinje sa analogom indukuje proizvodnju antitela protiv amiloidogenog polipetida.
29. Analog prema zahtevu 28, naznačen time, što je modifikacija definisana prema jednom od zahteva 2-17.
30. Imunogena kompozicija koja sadrži imunogeno efikasnu količinu analoga prema zahtevu 28 ili 29, kao i faramaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili vehikulum i po izboru adjuvans.
31. Fragment nukleinske kiseline, naznačen time, što kodira analog prema zahtevu 28 ili 29.
32. Vektor, naznačen time, što nosi fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 31, kao što je vektor koji je sposoban za autonomnu replikaciju.
33. Vektor prema zahtevu 32, naznačen time, što je odabran iz grupe koju čine plazmid, faga, kosmid, mini-hromozom i virus.
34. Vektor prema zahtevu 32 ili 33, naznačen time, što u smeru 5'->3' i u operabilnoj vezi sadrži promoter za vođenje ekspresije fragmenta nukleinske kiseline prema zahtevu 31, po izboru sekvence nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid koji omogućuje sekreciju ili integraciju u membranu polipeptidnog fragmenta, fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 31, i po izboru terminator.
35. Vektor prema jednom od zahteva 32-34, koji je, kada se uvede u ćeliju domaćina, u stanju ili nije u stanju da se integriše u genom ćelije domaćina.
36. Vektor prema zahtevu 34 ili 35, naznačen time, što vodi ekspresiju u eukariotskoj ćeliji i/ili u prokariotskoj ćeliji.
37. Transformisana ćelija koja nosi vektor prema jednom od zahteva 32-37, naznačena time, što je u stanju da replicira fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 31.
38. Transformisana ćelija prema zahtevu 37, naznačena time što predstavlja mikroorganizam odabran od bakterije, kvasca, protozoe, ili ćelija izvedena iz višećelijskog organizma odabranog od gljivice, ćelije insekta, kao što je S2ili SF ćelija, ćelije biljke i ćelije sisara.
39. Transformisana ćelija prema zahtevu 37 ili 38, naznačena time, što eksprimira fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 31, kao što je transformisana ćelija koja izlučuje ili nosi na svojoj površini analog prema zahtevu 28 ili 29.
40. Kompozicija za izazivanje proizvodnje antitela na Ap ili APP kod životinja gde su ovi proteini, analozi, naznačena time, što sadrži - fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 31 ili vektor prema jednom od zahteva 32 do 36, i - farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač, i/ili vehikulum, i/ili adjuvans.
41. Stabilan ćelijski soj koji nosi vektor prema jednom zahteva 32-36, i koji eksprimira fragment nukleinske kiseline prema zahtevu 31, i koji po izboru izlučuje ili nosi analog prema zahtevu 28 ili 29 na svojoj površini.
YUP-577/02A 2000-02-21 2001-02-19 Postupak za smanjenje količine amiloida RS51164B (sr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000265 2000-02-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU57702A YU57702A (sh) 2005-09-19
RS51164B true RS51164B (sr) 2010-10-31

Family

ID=8159174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-577/02A RS51164B (sr) 2000-02-21 2001-02-19 Postupak za smanjenje količine amiloida

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20030086938A1 (sr)
EP (2) EP1632242A3 (sr)
JP (1) JP5025871B2 (sr)
CN (1) CN1279971C (sr)
AR (1) AR027947A1 (sr)
AT (1) ATE306933T1 (sr)
BR (1) BR0108566A (sr)
CO (1) CO5280094A1 (sr)
DE (1) DE60114157T2 (sr)
DK (1) DK1259251T3 (sr)
EA (1) EA008762B1 (sr)
EE (1) EE200200444A (sr)
EG (1) EG25830A (sr)
ES (1) ES2248283T3 (sr)
GC (1) GC0000355A (sr)
HK (1) HK1054865B (sr)
HU (1) HUP0300067A3 (sr)
IL (3) IL150066A0 (sr)
IS (1) IS6446A (sr)
ME (2) ME00183B (sr)
MY (1) MY131826A (sr)
NO (1) NO20023961L (sr)
NZ (1) NZ521442A (sr)
PL (1) PL204878B1 (sr)
RS (1) RS51164B (sr)
SI (1) SI1259251T1 (sr)
SK (1) SK287468B6 (sr)
WO (1) WO2001062284A2 (sr)
ZA (1) ZA200204830B (sr)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7588766B1 (en) 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
US6689753B1 (en) * 1999-11-05 2004-02-10 Axonyx, Inc. β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide
ES2248283T3 (es) * 2000-02-21 2006-03-16 Pharmexa A/S Nuevo procedimiento para reducir los niveles de amiloide.
AU783144B2 (en) * 2000-02-21 2005-09-29 H. Lundbeck A/S Novel method for down-regulation of amyloid
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7320793B2 (en) 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
DE60121729T2 (de) * 2001-04-19 2007-11-29 Dr. Hermann Schätzl Prion Proteindimere für Impfungen
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
EP1820806A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-22 Crossbeta Biosciences B.V. Affinity regions
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
EP1380290A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-14 Universitair Medisch Centrum Utrecht Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance
WO2004007538A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the ap205 coat protein
MXPA04012010A (es) 2002-07-18 2005-03-07 Cytos Biotechnology Ag Conjugados de hapteno-portador que comprende particulas similares a virus, y usos de los mismos.
DK1524994T3 (da) 2002-07-19 2011-08-15 Cytos Biotechnology Ag Vaccinesammensætninger indeholdende amyloid beta 1-6-antigen-arrays
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
KR101201120B1 (ko) 2003-12-17 2012-12-03 와이어쓰 엘엘씨 Ａβ 면역원성 펩티드 캐리어 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
ES2434732T3 (es) 2004-12-15 2013-12-17 Janssen Alzheimer Immunotherapy Anticuerpos para beta-amiloide humanizados para su uso en mejorar la cognición
ES2396555T3 (es) 2004-12-15 2013-02-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Anticuerpos que reconocen péptido beta amiloide
CN101228272A (zh) * 2005-04-20 2008-07-23 生物载体株式会社 用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗
EP1906995A2 (en) * 2005-07-13 2008-04-09 Crossbeta Biosciences B.V. Adjuvation through cross- structure
US8114832B2 (en) 2005-07-13 2012-02-14 Crossbeta Biosciences B.V. Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition
ATE554394T1 (de) * 2005-07-13 2012-05-15 Crossbeta Biosciences Bv Cross-beta-struktur-bindende verbindungen
US20070015133A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Umc Utrecht Holding B.V. Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein
CA2628703C (en) 2005-11-30 2019-10-29 Abbott Laboratories Anti-a.beta. globulomer antibodies, antigen-binding moieties thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods of producing said antibodies, compositions comprising said antibodies, uses of said antibodies and methods of using said antibodies
DK1976877T4 (en) 2005-11-30 2017-01-16 Abbvie Inc Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP2007300856A (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Hiroshi Mori アミロイドタンパク質模倣物
WO2008040759A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Pharmexa A/S Method for down-regulation of cripto
WO2008070284A2 (en) 2006-10-16 2008-06-12 Johnnie B. Byrd, Sr. Alzheimer's Center And Research Institute Amyloid beta peptides and methods of uses thereof
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
JP5558834B2 (ja) * 2007-02-23 2014-07-23 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｄｉｓｅａｓｅ）の予防および処置
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
WO2008104386A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) * 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
SI2182983T1 (sl) 2007-07-27 2014-09-30 Janssen Alzheimer Immunotherapy Zdravljenje amiloidogenih bolezni s humaniziranimi protitelesi proti abeta
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2058000A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Immunogenic compositions capable of activating T cells
EP2058001A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Enhancement of immunogenicity of antigens
LT3056214T (lt) 2008-06-27 2019-06-10 Zoetis Services Llc Naujos adjuvantų kompozicijos
US8491890B2 (en) 2008-07-09 2013-07-23 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for inhibiting diseases of the central nervous system
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
EP2258398A1 (en) 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
CN101858910B (zh) * 2010-03-25 2013-03-27 辽宁大学 一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法
CN104744591B (zh) 2010-04-15 2022-09-27 Abbvie德国有限责任两合公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
EP2603233A1 (en) 2010-08-12 2013-06-19 AC Immune S.A. Vaccine engineering
WO2012024187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
TW201223561A (en) 2010-10-26 2012-06-16 Ac Immune Sa Preparation of an antigenic construct
US20120328605A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-27 Daniel Larocque Compositions and uses
US12156912B2 (en) 2012-05-18 2024-12-03 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for inhibiting diseases of the central nervous system
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
CN104869993B (zh) 2012-10-25 2019-01-15 通用医疗公司 治疗阿尔茨海默病及相关疾病的组合疗法
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
WO2015042369A2 (en) 2013-09-19 2015-03-26 Zoetis Llc Oil-based adjuvants
HK1223541A1 (zh) 2013-10-22 2017-08-04 The General Hospital Corporation 色甘酸衍生物以及成像和治疗的相关方法
CN114081946A (zh) * 2014-03-12 2022-02-25 耶达研究与开发有限公司 降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns疾病和损伤
DK3244920T5 (da) 2015-01-16 2024-10-07 Zoetis Services Llc Mund- og klovsyge-vaccine
WO2017197253A2 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Ohio State Innovation Foundation Peptides and methods for treating neurodegenerative disorders
JP2019524865A (ja) 2016-08-31 2019-09-05 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 神経変性疾患と関連する神経炎症におけるマクロファージ／ミクログリア
CN106854233B (zh) * 2017-03-03 2020-07-17 国家纳米科学中心 一种类肽及其制备方法和应用
CN107412782B (zh) * 2017-04-27 2020-09-08 国家纳米科学中心 一种多肽聚合物纳米材料及其制备方法和应用
AU2018298422B2 (en) 2017-07-04 2023-04-06 CureVac SE Novel nucleic acid molecules
KR20210070232A (ko) 2017-07-20 2021-06-14 아즈테라피즈 인코포레이티드 크로몰린 나트륨 및 이부프로펜의 분말화된 제형
BR112020020660A2 (pt) 2018-04-10 2021-03-02 Ac Immune Sa vacinas terapêuticas anti-abeta
JP2021529771A (ja) 2018-07-02 2021-11-04 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション クロモリンナトリウムおよびα−ラクトースの粉末製剤
US12383528B2 (en) 2018-12-10 2025-08-12 The General Hospital Corporation Cromolyn esters and uses thereof
CN112210003A (zh) * 2019-07-09 2021-01-12 厦门德馨尚品医疗科技有限公司 一种重组载脂蛋白j及其类似物的晶体结构及应用
IL297023A (en) 2020-04-06 2022-12-01 Massachusetts Gen Hospital Methods for treating inflammatory conditions caused by the corona virus
WO2025088088A1 (en) 2023-10-27 2025-05-01 CureVac SE Rna composition for improving cell therapy
WO2025240977A1 (en) * 2024-05-17 2025-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions of sulfonyl-purine compounds and use thereof for modifying functional protein sites

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596792A (en) * 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) * 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) * 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) * 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
DK96493D0 (da) * 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
PT735893E (pt) * 1993-09-14 2009-03-06 Pharmexa Inc Péptidos que se ligam aos alelos pan dr para aumentar a resposta imunitária
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
CA2214247C (en) * 1995-03-14 2004-02-10 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US5874469A (en) * 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
US5854469A (en) * 1996-06-28 1998-12-29 Gabay; David Heating unit for therapeutic instrument
US5985581A (en) * 1996-07-25 1999-11-16 The Mclean Hospital Corporation Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease
IT1293511B1 (it) * 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20040062802A1 (en) * 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
PL196790B1 (pl) * 1998-09-15 2008-01-31 Pharmexa As Zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, zastosowanie fragmentu kwasu nukleinowego, zastosowanie wektora przenoszącego fragment kwasu nukleinowego, zastosowanie niepatogennej transformowanej komórki, zastosowanie kompozycji zawierającej taki fragment lub wektor, sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej
PL202399B1 (pl) * 1998-10-05 2009-06-30 Pharmexa As Zastosowanie adiuwanta i pierwszego analogu polipeptydowego antygenu związanego z komórką lub co najmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego kodującego epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką lub niepatogennego mikroorganizmu lub wirusa, który niesie fragment kwasu nukleinowego, który koduje i wyraża co najmniej jeden epitop CTL pochodzący z antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób selekcji immunogennego analogu antygenu polipeptydowego związanego z komórką, sposób wytwarzania komórki wytwarzającej analog an
TR200103018T2 (tr) * 1999-04-19 2002-02-21 Beecham Biologicals S.A. Smithkline İmmünostimülatör oligonükleotid ve saponin içeren katkı bileşikleri.
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
ES2275570T3 (es) * 1999-12-08 2007-06-16 Intellect Neurosciences, Inc. Peptidos amiloides beta quimericos.
AU783144B2 (en) * 2000-02-21 2005-09-29 H. Lundbeck A/S Novel method for down-regulation of amyloid
ES2248283T3 (es) * 2000-02-21 2006-03-16 Pharmexa A/S Nuevo procedimiento para reducir los niveles de amiloide.
ES2238049T3 (es) * 2000-05-22 2005-08-16 New York University Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides.
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
EP1485122A2 (en) * 2002-03-11 2004-12-15 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
WO2004006861A2 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Mindset Biopharmaceuticals Usa Inc. Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease

Also Published As

Publication number Publication date
HK1054865B (zh) 2007-06-01
US20030086938A1 (en) 2003-05-08
SK287468B6 (sk) 2010-10-07
SI1259251T1 (sl) 2006-04-30
AR027947A1 (es) 2003-04-16
MY131826A (en) 2007-09-28
MEP30408A (en) 2010-10-10
IL189646A0 (en) 2011-07-31
BR0108566A (pt) 2002-11-19
ES2248283T3 (es) 2006-03-16
NZ521442A (en) 2003-09-26
PL204878B1 (pl) 2010-02-26
DK1259251T3 (da) 2006-03-06
GC0000355A (en) 2007-03-31
JP2003523402A (ja) 2003-08-05
ME00183B (me) 2011-02-10
CN1416350A (zh) 2003-05-07
CN1279971C (zh) 2006-10-18
DE60114157T2 (de) 2006-06-29
NO20023961D0 (no) 2002-08-20
IL150066A0 (en) 2002-12-01
IL150066A (en) 2009-02-11
EP1259251A2 (en) 2002-11-27
EE200200444A (et) 2003-12-15
HUP0300067A2 (en) 2003-05-28
EG25830A (en) 2012-09-02
ZA200204830B (en) 2003-11-26
HUP0300067A3 (en) 2010-03-29
WO2001062284A3 (en) 2001-11-29
CO5280094A1 (es) 2003-05-30
EP1632242A2 (en) 2006-03-08
EA200200889A1 (ru) 2003-02-27
PL362889A1 (en) 2004-11-02
SK11782002A3 (sk) 2004-02-03
US20090311281A1 (en) 2009-12-17
EP1259251B1 (en) 2005-10-19
JP5025871B2 (ja) 2012-09-12
DE60114157D1 (de) 2006-03-02
ATE306933T1 (de) 2005-11-15
WO2001062284A2 (en) 2001-08-30
HK1054865A1 (en) 2003-12-19
EP1632242A3 (en) 2011-08-31
NO20023961L (no) 2002-08-20
US20070041945A1 (en) 2007-02-22
IS6446A (is) 2002-06-26
EA008762B1 (ru) 2007-08-31
YU57702A (sh) 2005-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS51164B (sr) Postupak za smanjenje količine amiloida
CA2457140C (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitope vaccine
AU783144B2 (en) Novel method for down-regulation of amyloid
RS57702B1 (sr) Proizvod za pušenje koji sadrži zapaljivi izvor toplote i držač i postupak za njegovu proizvodnju
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine
HK1247081A1 (en) Novel method for down-regulation of amyloid
HK1089386A (en) Novel method for down-regulation of amyloid
HK1096288A (en) Beta-amyloid-analogue-t-cell epitop vaccine
HK1064934B (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine